JP2002511735A

JP2002511735A - アダプター蛋白質ｆｒｓ２および関連する物質および方法

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Publication number: JP2002511735A
Application number: JP52569598A
Authority: JP
Inventors: コーハラ，ハルヒク; スピバック−クロイツマン，タリー; ラックス，アイリット; シュレジンガー，ジョーゼフ
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1997-12-01
Publication date: 2002-04-16
Also published as: US6310181B1; US7135320B2; CA2274145A1; US20020086972A1; WO1998024902A8; WO1998024902A1; EP0944720A1; AU7625498A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、新規に単離されたアダプター蛋白質ＦＲＳ２および関連する産物および方法に関する。ＦＲＳ２は細胞において蛋白質キナーゼを活性化パートナーに連結する。本発明はまた、ＦＲＳ２の部分をコードする核酸分子、ＦＲＳ２関連核酸分子を含む核酸ベクター、そのような核酸ベクターを含む組換え細胞、そのような組換え細胞から精製されるポリペプチド、そのようなポリペプチドに対する抗体、およびＦＲＳ２の天然の結合パートナーとの相互作用を増強または遮断する化合物を同定する方法に関する。また、ＦＲＳ２関連分子または化合物を用いて、生物において異常状態を診断する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】アダプター蛋白質ＦＲＳ２および関連する物質および方法序本発明は、概して、新規に単離されたアダプター蛋白質ＦＲＳ２および関連する物質および方法に関する。ＦＲＳ２は、蛋白質キナーゼを活性化パートナーに結合させる。発明の背景以下の本発明の背景の記載は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明に対する先行技術を記載または構成すると認めるものではない。細胞のシグナル伝達は、細胞外刺激が細胞の内部に中継され、続いて多様な細胞プロセスを制御する基本的メカニズムである。シグナル伝達の生化学的メカニズムの鍵となるものの１つには、蛋白質の可逆的リン酸化が関与している。ポリペプチドのリン酸化は、成熟蛋白質の構造および機能を変化させることにより、成熟蛋白質の活性を制御する。リン酸はほとんどの場合、蛋白質中のアミノ酸であるセリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシ部分（ＯＨ）に存在する。細胞のエフェクターのリン酸化を媒介する酵素は、一般に２つのクラスに分類することができる。第１のクラスは、アデノシン三リン酸から蛋白質基質にリン酸部分を転移させる蛋白質キナーゼからなる。第２のクラスは、ホスホリル蛋白質基質からのリン酸部分を加水分解する蛋白質ホスファターゼからなる。蛋白質キナーゼと蛋白質ホスファターゼの逆の機能は、シグナル伝達プロセスにおいてシグナルの流れを釣り合わせ制御する。蛋白質キナーゼは、一般に、２つの群、すなわちレセプター型および非レセプター型の蛋白質に分けられる。レセプター蛋白質キナーゼは細胞膜に拡がり、細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を有する。非レセプター蛋白質キナーゼは細胞内に存在し、蛋白質キナーゼを細胞内の異なる領域に局在化させうる他の機能的領域に結合した触媒領域を有する。蛋白質キナーゼはまた、典型的に、これらが作用するアミノ酸に基づいて３つの群に分けられる。あるものはセリンまたはトレオニンのみをリン酸化し、あるものはチロシンのみをリン酸化し、あるものはセリン、トレオニンおよびチロシンをリン酸化する。多くの蛋白質キナーゼ、特にレセプター蛋白質キナーゼは、アダプター蛋白質に結合することにより機能する。アダプター蛋白質は、蛋白質キナーゼを蛋白質キナーゼシグナルに対する細胞の反応を引き起こす他の蛋白質に連結させる。例えば、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦリガンドに結合したとき、自分自身をリン酸化する。得られるＥＧＦＲの細胞内領域のリン酸部分は、Ｇｒｂ−２等のアダプター蛋白質を結合する。次にＧｒｂ−２はグアニンヌクレオチド交換因子蛋白質（Ｓｏｓ）を結合し、このことによりＲａｓを活性化する。その結果、Ｒａｓは有糸***促進物質活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードを活性化し、細胞の増殖または分化を引き起こす。すなわち、ＳｏｓおよびＲａｓはＥＧＦＲの直接活性化パートナーであるが、ＭＡＰＫカスケードのメンバーはＥＧＦＲの間接活性化パートナーである。多くのアダプター蛋白質は、レセプター蛋白質キナーゼ上のリン酸部分に直接結合するドメインを有する。例えば、Ｇｒｂ−２は、ＥＧＦＲおよび他のレセプター蛋白質キナーゼ中のホスホチロシン部分に強く結合するＳｒｃホモロジー２ドメイン（ＳＨ２ドメイン）を有する（ＰａｗｓｏｎａｎｄＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９３，ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌ．３：４３４−４４２）。他のアダプター蛋白質、例えばＩＲＳ−１は、ホスホリルチロシン結合ドメイン（ＰＴＢドメイン）を介してレセプター蛋白質キナーゼのホスホチロシン部分に結合することができる（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２５００−２５０８）。Ｓｈｃ等のアダプターは、ＳＨ２ドメインおよびＰＴＢドメインの両方を有する（Ｂｌａｉｋｉｅｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２０３１−３２０３４）。ある種のアダプター蛋白質、例えばＳＮＴ様蛋白質は、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られていないために同定されていないホスホチロシン結合ドメインを有する（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１３：７２１−７２９）。ＥＧＦＲ以外のレセプター蛋白質キナーゼ、例えば繊維芽細胞成長因子レセプター蛋白質キナーゼ（ＦＧＦＲ）は、Ｇｒｂ−２に直接結合せずにＭＡＰＫカスケードを刺激することが明らかになっている（Ｎａｋａｆｕｋｕｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２２９６３−２２９６６）。したがって、科学者は、これらの蛋白質キナーゼの活性化のメカニズムを決定するために、蛋白質キナーゼをその活性化パートナーに結合させるアダプター蛋白質を探索している。蛋白質キナーゼ活性化メカニズムにおける蛋白質間の相互作用を増強または排除しうる化合物は、生物において変化した蛋白質キナーゼ機能により引き起こされる異常状態を防止することができるかもしれず、さらに治療することもできるかもしれないため、蛋白質キナーゼ活性化メカニズムに関与するアダプター蛋白質は薬剤の標的である。変化した蛋白質キナーゼ機能により引き起こされる異常状態の例は、癌および他の細胞増殖性疾患、例えば、関節炎、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化、血栓性細小血管症症候群、移植拒絶、糸球体症、肝硬変、糖尿病性網膜症等の眼科疾患、および再狭窄である。発明の概要本発明は、新規に同定された、ＦＲＳ２と名付けられた蛋白質キナーゼアダプター蛋白質をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、全長蛋白質の一部をコードする核酸分子、そのような核酸分子を有する核酸ベクター、そのような核酸ベクターを含む細胞、そのような核酸分子によりコードされる精製されたポリペプチド、そのような蛋白質およびポリペプチドに対する抗体、およびＦＲＳ２と天然の結合パートナーとの相互作用を増強または遮断する化合物を同定する方法に関する。また、ＦＲＳ２関連分子または化合物を用いて生物において異常状態を診断する方法も開示される。核酸分子、核酸ベクター、宿主細胞、ポリペプチドおよび抗体は、本明細書に提供される情報を、現在当該技術分野において利用されているよく知られた標準的技術と組み合わせて用いることにより製造することができる。ＦＲＳ２（繊維芽細胞成長因子レセプター蛋白質キナーゼ基質２）は、刺激された繊維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）をＧｒｂ−２／Ｓｏｓ複合体を介してＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに連結させることにより、細胞分化および細胞増殖の成長因子による刺激を制御する。したがって、ＦＲＳ２の発見に基づいて、細胞増殖性疾患および細胞分化疾患の種々の治療が提供される。本発明のＦＲＳ２アダプター蛋白質は、ヒトＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離される。本発明はまた、好ましくは哺乳動物組織由来の、より好ましくはヒト組織由来の、密接に関連したアダプター蛋白質に関する。”密接に関連した”との用語は、５０％より高いアミノ酸同一性または類似する三次元構造を表す。”アミノ酸同一性”との用語は、本明細書中で記載される。すなわち、第１の観点において、本発明は、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。核酸分子に関連して、”単離された”との用語は、天然に生ずる配列がその通常の細胞環境から除去されていることを示す。すなわち、配列は無細胞溶液中にあってもよく、異なる細胞環境中に置かれていてもよい。この用語は、その配列が存在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味するものではなく、これが染色体ＤＮＡまたは蛋白質等の非ヌクレオチド物質を本質的に含まない（少なくとも約９０−９５％純粋）ことを意味する。核酸分子に関して、”濃縮された”との用語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常な細胞または疾患細胞におけるよりも、またはその配列を取り出した細胞におけるよりも、問題とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡの有意により高い（２−５倍）割合を構成することを意味する。当業者は、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量を優先的に減少させることにより、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡの量を優先的に増加させることにより、あるいはその両方により、核酸混合物を濃縮することができる。しかし、核酸分子を濃縮することは、他のＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではなく、この用語は単に、問題とする配列の相対的な量が有意に増加していることを示す。 ”増加した”を限定する”有意に”との用語は、増加のレベルが組換えＤＮＡ技術を実施する者にとって有用であることを示し、一般に、他の核酸に対して相対的に少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上増加していることを意味する。この用語もまた、他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他のＤＮＡは、例えば、酵母または細菌ゲノム、またはクローニングベクターからのＤＮＡを含んでいてもよい。さらに、ｍＲＮＡのレベルは、ウイルス感染または腫瘍成長技術を用いる場合、他の種のｍＲＮＡに対して自然に増加するであろう。”濃縮された”との用語は、所望の核酸の比率を上昇させるようある者が介入した状況のみを包含することを意味する。組換え核酸操作の多くの方法は、これらの分子が精製された形態であることを必要とする。核酸分子に関して”精製された”との用語は、絶対的な純度（例えば均一な調製物）を必要とするものではなく、配列がその細胞環境におけるより比較的精製されていることを示す（このレベルは、天然のレベルと比較して、例えばｍｇ／ｍｌで少なくとも２−５倍高いものであるべきである）。クローンから得られる本発明のＤＮＡ分子は、総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生ずるものではなく、好ましくは部分的に精製された天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得る。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は、合成の物質（ｃＤＮＡ）の形成を含む。個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリから単離することができる。すなわち、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築および別々のｃＤＮＡクローンの単離を含む工程により、天然のメッセンジャーは約１０⁶倍精製される。すなわち、これらの技術においては、少なくとも１桁の倍率の精製，好ましくは２から３桁、より好ましくは４または５桁の倍率の精製が好ましい。 ”核酸分子”との用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーを記述する。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたは減法ハイブリダイゼーションにより天然の起源から単離してもよく、手動で合成してもよい。核酸分子は、トリエステル合成法により手動で合成してもよく、自動化ＤＮＡ合成機を使用して合成してもよい。 ”ｃＤＮＡクローニング”との用語は、小さい核酸分子であるプローブが膜に結合しているゲノムｃＤＮＡにハイブリダイズすることを表す。プローブは、ｃＤＮＡの相補的配列にハイブリダイズ（結合）する。 ”相補的”との用語は、互いに多数の好都合な相互作用を形成しうる２つのヌクレオチドを記述する。例えば、アデニンとチミジンは２つの水素結合を形成しうるため、アデニンはチミジンに対して相補的である。同様に、グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成しうるため相補的である。すなわち、核酸分子の” 相補物”は、チミンのかわりにアデニンを、アデニンの代わりにチミンを、グアニンの代わりにシトシンを、そしてシトシンの代わりにグアニンを含む分子である。相補物は親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むため、そのような相補物は高い親和性をもってその親分子に結合する。 ”ハイブリダイズ”との用語は、溶液中またはセルロースもしくはニトロセルロース等の固体支持体上で核酸プローブをＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相互作用させる方法を表す。核酸プローブがＤＮＡまたはＲＮＡ分子に高い親和性をもって結合する場合、これはＤＮＡまたはＲＮＡ分子に”ハイブリダイズ”すると言われる。上述したように、プローブとその標的との間の相互作用の強度は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性に依存して、種々の低いまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。ストリンジエンシーは、塩または変性剤の濃度を変化させることにより調節される。ストリンジエントなハイブリダイゼーション条件下では、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは、そのような条件は、２０個の連続するヌクレオチド中に１つまたは２つのミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。ｃＤＮＡは、ゲノム起源からのメッセンジャーＲＮＡのフラグメントから逆転写されうる分子である。これらのフラグメントは核酸分子のｃＤＮＡライブラリを形成する。ｃＤＮＡライブラリは、天然起源、例えば哺乳動物の血液、***または組織から構築される。 ”減法ハイブリダイゼーション”との用語は、ｃＤＮＡクローニングに類似するが、ただし刺激されていない細胞中のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを刺激されたまたは異なるタイプの細胞中のｍＲＮＡに加える方法を表す。次に、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡを沈殿させて、刺激シグナルまたは異なる細胞タイプに特異的なｍＲＮＡを濃縮することができる。 ”ＦＲＳ２ポリペプチド”との用語は、図１Ａに記載されるアミノ酸の少なくとも４００個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも４５０個の連続するアミノ酸、または最も好ましくは少なくとも５０８個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を有するポリペプチドを表すか、またはそのような配列に実質的に類似する。実質的に類似する配列は、図１Ａのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも９０％（より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９−１００％）の同一性を有する。ＦＲＳ２ポリペプチドは、好ましくはＧｒｂ−２結合活性を有し、そのような活性を有する全長ＦＲＳ２配列のフラグメントは、当該技術分野においてよく知られる技術、例えば本明細書の実施例に記載されるような配列比較およびアッセイを用いて同定することができる。 ”同一性”とは、その類似性または関係を評価する配列の特性を表す。同一性は、同一の残基の数を残基の総数で割り、その商に１００を乗じることにより評価する。すなわち、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％の同一性を有し、より低い程度に保存され、欠失、付加または置換を有する配列は、より低い程度の同一性を有する。当業者は、配列同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを認識するであろう。そのようなプログラムは、一般に、無視しなければ２つの配列の間の同一性のパーセンテージの計算を変更するであろう欠失または付加を無視することにより、最大のアライメントを達成することができる。好ましい態様は、哺乳動物起源から濃縮、単離または精製されたＦＲＳ２に関連した核酸分子に関する。これらの核酸分子は、例えば、血液、***または組織から単離することができる。 ”哺乳動物”との用語は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、好ましくは有尾および無尾の猿、より好ましくはヒト等の生物を表す。図１ＡのＦＲＳ２核酸分子は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離されるが、現在の組換えＤＮＡ技術は、他の組織中の関連する核酸分子を容易に解明することができる。別の好ましい態様は、図１Ａに記載されるアミノ酸配列の少なくとも１２個の連続するアミノ酸をコードする、ＦＲＳ２に関連した単離された核酸分子に関する。好ましくは、ＦＲＳ２配列の少なくとも３，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，１００，２００，３００，４００，５００または５０８個の連続するアミノ酸がコードされる。本発明のこの好ましい態様は、当業者に知られる日常的な組換えＤＮＡ技術を適用することにより行うことができる。本発明の別の観点は、試料中の、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を検出しうる核酸プローブを特徴とする。 ”核酸プローブ”との用語は、図１Ａに記載されるものと実質的に同様のアミノ酸配列をコードする核酸配列に相補的でありこれに結合しうる核酸分子を表す。核酸プローブまたはその相補物は、本発明において記載されるアミノ酸分子のいずれかをコードする。すなわち、核酸プローブは、図１Ａに記載される全長配列の少なくとも３，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，１００，２００，３００，４００，５００または５０８個の連続するアミノ酸をコードすることができる。核酸プローブは、１つまたは複数のレポーター分子で標識することができる。 ”レポーター分子”との用語は、核酸プローブにコンジュゲートされるか、または核酸プローブ中に含まれる分子を表す。レポーター分子は、当該技術分野において用いられる方法によりプローブを検出することを可能とする。レポーター分子は、ペルオキシダーゼ等の酵素、放射活性要素、またはアビジン分子からなる群より選択されるが、これらに限定されない。核酸プローブは、標識されていてもされていなくても、試料中の相補物にハイブリダイズするはずである。核酸プローブは、アミノ酸の保存またはユニーク領域をコードする核酸分子でありうる。これらの核酸分子は、ＦＲＳ２に関連するさらなるポリペプチドを同定およびクローニングするのに、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。 ”保存核酸領域”との用語は、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸分子中に存在し、より低いストリンジェンシー条件下で特定の核酸配列がそれにハイブリダイズしうる領域を表す。核酸分子のスクリーニングに適したより低いストリンジェンシーの条件の例は、Ａｂｅ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１３３６１（１９９２）（図面を含め、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。）に記載されている。好ましくは、保存領域は、２０ヌクレオチド中５個以下で異なっている。上述したように、蛋白質チロシンキナーゼは、その細胞外ドメインおよび触媒ドメイン中で保存領域を共有している。 ”ユニーク核酸領域”との用語は、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする全長核酸中に存在し、任意の他の天然に生ずるポリペプチドをコードする配列中に存在しない配列に関する。そのような領域は、好ましくはＦＲＳ２ポリペプチドをコードする全長核酸配列中に存在する３０または４５個の連続するヌクレオチドを含む。特に、ユニーク核酸領域は好ましくは哺乳動物起源のものである。プローブを用いる方法には、試料をハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で核酸プローブと接触させることにより、試料中におけるＦＲＳ２ＲＮＡの存在または量を検出することが含まれる。プローブとＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを、検出された核酸の配列の同定において用いることができる（例えば、Ｎｅｌｓｏｎｅｔａｌ．，ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃＤＮＡＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐ．２７５ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，１９９２）、図面を含め、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。）を参照されたい。そのような方法を実施するためのキットは、核酸プローブを保持する容器を含むように構築することができる。さらに別の観点においては、本発明は、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子および宿主細胞中において転写を開始させるのに有効なプロモーター要素を含む核酸ベクターに関する。 ”核酸ベクター”との用語は、細胞内にトランスフェクトまたはトランスフォームして、独立してまたは宿主細胞ゲノム中で複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は切断することができ、このことにより制限酵素で処理して線状化することができる。ベクターの類別、制限酵素、および制限酵素が作用するヌクレオチド配列の知識は、当業者には容易に利用可能である。本発明の核酸分子は、ベクターを制限酵素で切断し、そして２つの断片を一緒にライゲートすることにより、ベクター中に挿入することができる。発現構築物を原核生物または真核生物中に形質転換またはトランスフェクションすることを容易にする多くの技術が当業者に利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ）。”形質転換”および”トランスフェクション”との用語は、発現構築物を細胞性生物中に挿入する方法を表す。これらの方法は、種々の技術、例えば、細胞を高濃度の塩、電界または界面活性剤で処理して、宿主細胞の外膜または壁を問題とする核酸分子が透過しうるようにする技術を含む。 ”プロモーター要素”との用語は、ベクター中に取り込まれ、ベクターが適当な細胞の内部に入ったとき、転写因子および／またはポリメラーゼの結合を容易にし、続いてベクターＤＮＡの一部をｍＲＮＡに転写することができるヌクレオチド配列を表す。プロモーター要素は、ＦＲＳ２核酸分子がｍＲＮＡに転写されるように、ＦＲＳ２核酸分子の５’末端の前にある。次に、宿主細胞の機構がｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。当業者は、核酸ベクターがプロモーター要素およびＦＲＳ２核酸分子の他に多くの他の核酸要素を含みうることを認識するであろう。これらの他の核酸要素には、複製起源、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル，ペリプラズムまたはペルオキシソーム局在化シグナルまたはポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。核酸ベクターは、ＦＲＳ２ポリペプチドの天然の結合パートナーの同定に有用でありうる。 ”天然の結合パートナー”との用語は、ＦＲＳ２に結合してシグナル伝達プロセスにおけるシグナルの伝搬において役割を果たすポリペプチドを表す。”結合パートナー”との用語はまた、細胞環境中のＦＲＳ２に高い親和性をもって結合するポリペプチドを表す。高い親和性とは、１０^-6Ｍのオーダーの平衡結合定数である。しかし、天然の結合パートナーはまた、ＦＲＳ２ポリペプチドと過渡的に相互作用して、これを化学的に修飾することができる。ＦＲＳ２の天然の結合パートナーは、ｓｒｃホモロジ−２（ＳＨ２）もしくは３（ＳＨ３）ドメイン、他のホスホリルチロシン結合ドメイン（ＰＴＢおよびＰＨドメイン）、グアニンヌクレオチド交換因子、およびレセプターおよび非レセプター蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼからなる群より選択されるが、これらに限定されない。ＦＲＳ２の既知の天然の結合パートナーは、ＳＨ２を含むＧｒｂ−２である。１つの核酸ベクター中に含まれるｃＤＮＡライブラリを他の発現構築物中の所望のポリペプチドをコードする核酸分子でスクリーニングすることにより、問題とするポリペプチドの天然の結合パートナーを同定するための方法は当該技術分野において容易に利用可能である（Ｖｏｊｔｅｋｅｔａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ７４：２０５−２１４）。これらの技術はしばしば転写因子の半分を２つ用いる。このうちの一方はｃＤＮＡライブラリによりコードされるポリペプチドに融合され、他方は問題とするポリペプチドに融合される。ｃＤＮＡライブラリによりコードされるポリペプチドと、問題とするポリペプチドとの間の相互作用は、かかる相互作用が同時に転写因子の半分を２つ一緒にして相互作用を報告する遺伝子を活性化する場合に検出される。当該技術分野における標準的な組換えＤＮＡ技術を用いることにより、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子の任意のものを、そのようなスクリーニング方法において用いられる核酸ベクター中に容易に取り込ませることができる。本発明の別の観点は、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞または組織に関する。 ”組換え”との用語は、遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせを有する生物を表す。遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせは、当業者に利用可能な広範な核酸操作技術を用いて生物中に導入することができる。組換え細胞は、真核生物または原核生物でありうる。 ”真核生物”との用語は、核を含む細胞から構成される生物を表す。真核生物は、そのゲノムＤＮＡを核内に収容しない”原核生物”から区別される。原核生物には、単細胞生物、例えば細菌が含まれ、真核生物は酵母、無脊椎動物および脊椎動物により代表される。 ”生物”との用語は、少なくとも１つの細胞から構成される任意の生き物に関連する。生物は、１つの真核生物細胞ほどの単純なものであってもよく、哺乳動物ほど複雑なものであってもよい。組換え細胞は、ゲノム外の核酸ベクターを有することができる。”ゲノム外” との用語は、細胞ゲノム中に挿入しない核酸ベクターを表す。多くの核酸ベクターは、それ自身の複製起点を有するように設計されており、このため組換え細胞の複製機構を利用してベクター核酸配列をコピーし増殖させることができる。これらのベクターは、組換え細胞のゲノム配列に相同な核酸配列を有することがないように十分に小さい。すなわち、これらのベクターは、宿主ゲノムとは独立ｓｈて複製し、ゲノムと再結合することもゲノム内にインテグレートすることも必要ない。組換え細胞は、核酸ベクターの一部をゲノム内の様式で有することができる。 ”ゲノム内の”との用語は、細胞ゲノム中に取り込まれた核酸構築物を規定する。当業者に利用可能な多くの核酸ベクターは、特定の生物のゲノムＤＮＡ中の核酸配列に相同な核酸配列を含む。これらの相同配列は、ベクターのの一部をゲノムＤＮＡ中にインテグレートする組換え事象を引き起こすであろう。当業者は、ベクター中でゲノム中に取り込まれるべき部分を相同配列に隣接させることにより、ベクターのどの核酸配列を細胞ゲノム中にインテグレートさせるかを調節することができる。本発明のさらに別の観点は、単離された、濃縮されたまたは精製されたＦＲＳ２ポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドに関して”単離された”との用語は、互いにコンジュゲートしたアミノ酸のポリマーを記述し、天然起源から単離されたポリペプチドまたは合成されたポリペプチドを含む。ある観点においては、図１Ａに記載される連続するアミノ酸のほとんどを有するような、より長いポリペプチドが好ましい。本発明の単離されたポリペプチドは、これらが天然には純粋なまたは分離された状態で見いだされない点においてユニークである。”単離された”との用語の使用は、天然に生ずる配列がその通常の細胞環境から除去されていることを示す。すなわち、配列は無細胞溶液中にあってもよく、または異なる細胞環境に置かれていてもよい。この用語は、配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく、これと天然に関連している非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なくとも約９０−９５％純粋）ことを意味する。ポリペプチドに関して、”濃縮された”との用語は、正常細胞または疾患細胞におけるより、またはその配列が分離された細胞におけるより、問題とする細胞または溶液中に存在するアミノ酸の全体の有意に高い（２−５倍）割合を構成する特定のアミノ酸配列を規定する。当業者は、存在する他のアミノ酸配列の量を優先的に減少させるか、または問題とする特定のアミノ酸配列の量を優先的に増加させるか、あるいはその両方を行うことができる。しかし、”濃縮された”との用語は、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではない。濃縮されたとは、単に、問題とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味する。”有意に”との用語は、増加のレベルが、そのような増加を行った者にとって有用であることを示す。この用語はまた、他のアミノ酸と比較して、少なくとも２倍、またはより好ましくは少なくとも５−１０倍、またはそれ以上増加していることを意味する。この用語はまた、他の起源からのアミノ酸配列がないことを意味するものではない。他の起源のアミノ酸配列は、例えば、宿主生物からのアミノ酸配列を含むかもしれない。”濃縮された”とは、所望のアミノ酸配列の比率を高めるようにある者が介入した状況のみを包含することを意味する。ポリペプチドに関して”精製された”との用語は、絶対的な純度（例えば均一な調製物）を必要とするものではなく、アミノ酸配列が細胞環境におけるより比較的精製されていることを示す。好ましいアミノ酸配列の濃度は、細胞環境におけるその濃度より少なくとも２−５倍（ｍｇ／ｍｌで）高くあるべきである。少なくとも１桁の倍率の精製、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁の倍率の精製が好ましい。物質は、好ましくは９０％、９５％、または９９％の純度レベルにより示されるように、夾雑物を含まない。好ましい態様は、ＦＲＳ２ポリペプチドのユニークフラグメントであるＦＲＳ２ポリペプチドに関する。 ”ユニークフラグメント”との用語は、ＦＲＳ２中の、他のアダプター蛋白質とは異なる配列の連続するアミノ酸のストレッチを表す。ＦＲＳ２とアダプター蛋白質ＩＲＳ−１の密接に関連した領域との間の配列アライメントから、２つの配列が２つの連続するアミノ酸のみを共有することが示される。したがって、ＦＲＳ２の全長アミノ酸配列の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または５０８個の連続するアミノ酸はＦＲＳ２にユニークである。ＦＲＳ２ポリペプチドは、原核生物または真核生物組換え細胞から単離、濃縮または精製することができる。真核生物細胞は、哺乳動物を含む生物から生ずることができる。組換え細胞からのポリペプチドの単離、濃縮または精製を容易にする多くの標準技術が当業者に利用可能である。これらの方法は、典型的には、組換え細胞を溶解し、当該技術分野において知られる標準的クロマトグラフィー技術を用いて、残りの細胞ポリペプチド、核酸および脂肪酸系物質から問題とするポリペプチドを分離することを含む。本発明の文脈においては、ポリペプチドの単離、濃縮または精製は、ニトロセルロース膜上でポンシュー（Ｐｏｎｃｅａｕ）−Ｓ染色により可視化することができるか、またはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上でクマシーまたは銀染色により可視化することができるようなＦＲＳ２の収量を与える技術により達成することができる。本発明の別の観点は、ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体である抗体、または抗体フラグメントを特徴とする。抗体または抗体フラグメントは、他のポリペプチドと結合しうる領域を含むポリペプチドである。”特異的結合親和性”との用語は、特定の条件下において、それが他のポリペプチドに結合するよりもより高い親和性をもってＦＲＳ２ポリペプチドに結合する抗体を記述する。 ”ポリクローナル”との用語は、ＦＲＳ２ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体の混合物を表し、一方”モノクローナル”との用語は、ＦＲＳ２ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する１種類の抗体を表す。モノクローナル抗体はＦＲＳ２ポリペプチド上の１つの特定の領域に結合するが、抗体のポリクローナル混合物はＦＲＳ２ポリペプチドの多数の領域に結合することができる。 ”抗体フラグメント”との用語は、抗体の一部、しばしば特定の分子のための特異的結合親和性を提示する超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は、ポリペプチド標的に物理的に結合する抗体の部分である。ＦＲＳ２−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で試料を抗体で探索し、ＦＲＳ２ポリペプチドにコンジュゲートした抗体の存在および／または量を検出することにより、ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントを、試料におけるＦＲＳ２ポリペプチドの存在および／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは、ＦＲＳ２に特異的な抗体または抗体フラグメント、ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自身のコンジュゲートを含むように構築することができる。ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは、原核生物または真核生物から単離、濃縮または精製することができる。当業者に知られる日常的な方法により、原核生物および真核生物のいずれにおいても、抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分子である抗体の精製、濃縮および単離は、上に述べられている。本発明の別の観点は、ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。”ハイブリドーマ”は、抗体、例えばＦＲＳ２に対する特異的結合親和性を有する抗体を分泌しうる不死化細胞株である。本発明の別の観点は、以下のヌクレオチド配列を含む、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする：（ａ）図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補物；（ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし、天然に生ずるＦＲＳ２蛋白質をコードする；（ｄ）図１Ａに記載される配列の全長アミノ酸配列を有するＦＲＳ２ポリペプチドただし、アミノ酸残基１−１０，１１−１５２，または１５３−５０８のセグメントの１つまたはそれ以上を欠失している；（ｅ）（ｄ）の核酸配列の相補物；（ｆ）図１Ａに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１−１０，１１−１５２，１５３− ５０８を有するポリペプチド；（ｇ）（ｆ）の核酸配列の相補物；（ｈ）図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ただし、ミリスチル化領域、ホスホチロシン結合領域およびＣ末端領域からなる群より選択されるドメインの１つまたはそれ以上を欠失している；（ｉ）（ｈ）の核酸配列の相補物；（ｊ）チロシン３４９のフェニルアラニンへの変異またはチロシン３９２のフェニルアラニンの変異の１つまたは両方を含む（ａ），（ｄ）または（ｆ）のポリペプチドをコードする；または（ｋ）（ｊ）の核酸配列の相補物。 ”ミリスチル化領域”との用語は、全長ＦＲＳ２アミノ酸配列の、ミリストイル脂肪酸部分を有する部分を表す。この領域は好ましくはアミノ酸１から１０にわたる。 ”ホスホチロシン結合領域”との用語は、ＦＲＳ２アミノ酸分子の、他の蛋白質またはポリペプチド中のホスホチロシン部分に結合しうる部分を表す。この領域は、好ましくはアミノ酸１１から１５２にわたる。 ”Ｃ末端ドメイン”との用語は、ＦＲＳ２の、ホスホチロシン結合領域の末端で始まり、ＦＲＳ２のカルボキシ末端までの部分を表す。この領域は好ましくはアミノ酸１５３から５０８にわたる。ＦＲＳ２の機能的領域は、ＦＲＳ２のアミノ酸配列を既知の機能的領域を有する他のポリペプチドのアミノ酸配列と並列させることにより同定することができる。ＦＲＳ２の領域が既知の機能的領域のアミノ酸配列と高いアミノ酸同一性を共有する場合、当業者は、ＦＲＳ２がこれらの機能的領域を含むと判定することができる。機能的領域は、例えば、当業者に利用可能なコンピュータプログラムおよび配列情報を用いることにより判定することができる。シグナル伝達分子のＦＲＳ２アミノ酸配列中に存在するかもしれない他の機能的領域には、プロリンリッチ領域またはホスホリルチロシン領域が含まれるが、これらに限定されない。これらの領域は、他のシグナル伝達分子の天然の結合パートナー、例えばＳＨ２またはＳＨ３ドメインと相互作用することができる。ＦＲＳ２の２つの可能なＳＨ２結合領域の例は、チロシン３４９および３９２である。細胞中でこれらのチロシンがリン酸化されれば、Ｇｒｂ−２等のＳＨ２含有蛋白質は、これらの部位でＦＲＳ２に結合することができる。これらのチロシンをフェニルアラニンに変異させると、任意のＳＨ２含有螢白質のこれらの変異部位における結合が排除されるであろう。さらに別の態様において、本発明は前記の核酸分子を含んでいる核酸ベクターを包含している。本発明の別の態様は、前記の核酸分子を含む組換え体細胞または組織に関している。本発明のさらに別の態様においては、本発明はＦＲＳ２と天然の結合相手との間の相互作用を阻止または促進できる化合物の同定法を特色としている。これらの化合物は生物体の異常な状態を診断、予防または処置するために有用である可能性がある。本方法は以下の工程から成っている：（ａ）ＦＲＳ２ポリペプチド含有細胞に化合物を加え、そして（ｂ）ＦＲＳ２と天然の結合相手との間の相互作用の変化を検出する。用語”化合物”には、オキシインドリノン、キナゾリン、チルホスチン、キノキサリンを含む（これらに制限されるわけではない）小有機分子および天然起源の抽出物が含まれる。用語”相互作用”とは天然の結合相手へのＦＲＳ２結合を意味している。本発明はＦＲＳ２がＧｒｂ−２に結合することを開示している。従って、相互作用はＦＲＳ２アミノ酸とＧｒｂ−２のアミノ酸の間で形成される。二つの分子間の相互作用とは好適には、二つの分子がお互いに結合し、複合体を形成することに関している。用語”相互作用を阻止する”とは、二つの分子間で形成される複合体の濃度を減少させることを意味している。複合体濃度の減少は、二つの分子の内の一つへ化合物を結合させることによって、二つの分子が複合体を形成する可能性を減少させることにより達成できる。複合体中の一つの分子へ高い親和性で結合する化合物は、もし二つの分子間のアミノ酸がお互いに好適な相互作用を形成することができる可能性を化合物が減少させるとしたら、分子間に複合体が形成される可能性を減少できる。用語”相互作用を促進する”とは、二つの分子間で形成される複合体の濃度を増加させることを意味している。複合体濃度の増加は、二つの分子の内の一つへ化合物を結合させることによって、二つの分子が複合体を形成する可能性を増加させることにより達成しうる。複合体中の一つの分子へ高い親和性で結合する化合物は、もし二つの分子間のアミノ酸がお互いに好適な相互作用を形成することができる可能性を化合物が増加させるとしたら、分子間に複合体が形成される可能性を増加できる。用語”異常な状態”とは生物体の細胞または組織中の正常な機能から逸脱した生物体細胞または組織中の機能を意味している。本発明の文脈において、異常な状態とはＦＲＳ２が含まれているシグナル伝達経路の異常に関連している。異常な状態は細胞増殖に関係しうる。細胞増殖障害には線維性およびメサンギウム障害のような癌、異常血管新生および血管叢形成、遅い傷治癒速度、乾鮮、糖尿病および炎症が含まれる。異常な状態は細胞分化にも関係しうる。細胞分化障害には神経変性障害、遅い傷治癒速度および遅い組織移植治癒速度が含まれるが、これらに制限されるわけではない。異常な状態は生物体の細胞が生物体内または生物体外に存在している場合に診断、予防または処置できる。生物体外に存在している細胞は細胞培養皿中で維持または増殖できる。生物体内に存在している細胞に対しては、化合物を投与するための多くの技術が本分野に存在し、経口、非経口、経皮および注射投与が含まれる（これらに制限されるわけではない）。患者の体外の細胞に対しては、化合物を投与するための多くの技術が本分野に存在し、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術および坦体技術が含まれる（これらに制限されるわけではない）。用語”シグナル伝達経路”とは細胞外シグナルを細胞膜を通して伝達して細胞内シグナルとする分子を意味している。このシグナルは次に細胞応答を刺激できる。シグナル伝達過程に含まれているポリペプチド分子は典型的には、レセプターおよび非レセプター蛋白質キナーゼ、レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼおよび転写因子である。シグナル伝達過程に関連した用語”異常”とは、シグナル伝達経路に含まれるＦＲＳ２蛋白質または他の蛋白質を意味しており、生物体中で過剰または過少発現され、触媒活性が野生型分子よりも低いまたは高いように突然変異され、結合相手ともはや相互作用できないように突然変異され、別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されず、または結合相手と相互作用できないＦＲＳ２を含んでいる。用語”相互作用の変化を検出する”とは、本発明の文脈において、化合物がＦＲＳ２と天然の結合相手との間の相互作用を促進または阻止するかどうかを決定する方法を定義している。ＦＲＳ２と天然の結合相手との間に形成される複合体を検出できる多くの方法が本分野に存在する。一つのそのような方法がＦＲＳ２とＧｒｂ−２との間に形成される相互作用に関する実施例により本明細書に記載されている。ＦＲＳ２と天然の結合相手との間の相互作用はまた細胞形態学における相違によっても検出できる。細胞形態学の相違には細胞の増殖速度および分化速度が含まれる。これらの現象は本分野の方法により簡単に測定される。これらの方法は典型的には、顕微鏡下で細胞数または細胞の様子を時間に関して（日）観察することを含んでいる。本方法は本発明に開示されている任意の分子に利用できる。これらの分子には本発明のＦＲＳ２ポリペプチドをコードしている核酸分子、核酸ベクター、組換え体細胞、ポリペプチドまたは抗体が含まれる。本方法はインビトロ、ならびにインビボで実施できる。インビボ応用には、細胞群を生物体に導入し、続いて生物体ならびに導入した細胞の状態に対する生物体に投与された化合物の影響を決定することが含まれる。本技術には生物体へ細胞群を導入する多数の方法ならびに生物体へ化合物を投与する方法が含まれる。生物体とは好適にはカエルのような動物、より好適にはマウス、ラットまたはウサギ、および最も好適にはサル、類人猿またはヒトである。本発明の別の態様は、生物体中の細胞増殖または細胞分化に関連した異常状態を診断する方法に関している。異常状態とは、ＦＲＳ２ポリペプチドと天然の結合相手との間の相互作用により特徴付けられるシグナル伝達経路における異常に関連したものでありうる。本方法は異常な相互作用を検出する工程を含んでいる。用語”異常な相互作用を検出する”とは、その活性に異常を持つＦＲＳ２分子を同定する方法と定義される。検出は、本発明の抗体または抗体フラグメント、本発明の核酸プローブまたは本発明の化合物を使用することにより達成される。この方法を織り込んだ本分野で使用される技術には、インビトロ、インビボおよびインサイチュハイブリダイゼーション技術が含まれる。これらの技術は本発明の核酸プローブを利用する。本発明の好適な態様は、哺乳類である生物体に関連した診断法である。上に記載されている本発明の要約は制限を意図してるものではなく、本発明の他の特色および利点は以下の本発明の詳細な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１ＡはＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離されたＦＲＳ２蛋白質のアミノ酸配列である。アミノ酸配列中の四つのトリプシンペプチドには下線が引かれている。ミリスチル化配列はＮ末端で平行下線が引かれている。ＦＲＳ２蛋白質のホスホチロシン結合ドメイン（ＰＴＢドメイン）に対応する部分は図において線で囲まれている。ＦＲＳ２の推定ＳＨ２結合領域はボールド体で示されている。図１Ｂは別のアダプター蛋白質（ＩＲＳ−１）のＰＴＢドメイン配列とＦＲＳ −２のその配列を並べたものである。二次構造要素（α−ヘリックスおよびβ− シートを含む）は線で囲まれている。垂直の線は二つの蛋白質間で共有されている同一のアミノ酸を示している。二つの蛋白質でたった二つの隣接アミノ酸が同一である。発明の詳細な説明本発明は細胞中で蛋白質キナーゼを活性化蛋白質に連結するＦＲＳ２と称されるアダプター蛋白質をコードしている核酸分子の単離および特徴付けに一部基づいている。本発明はまた、ＦＲＳ２ポリペプチドの一部をコードしている核酸分子、少なくとも一つのＦＲＳ２機能性部分をコードしている核酸分子、そのような核酸分子を含んでいる核酸ベクター、そのような核酸ベクターを含んでいる組換え体細胞、そのような核酸分子によりコードされている精製ポリペプチド、そのようなポリペプチドに対する抗体、およびＦＲＳ２と天然の結合相手との間の相互作用を促進または阻止する化合物の同定法にも関している。また、ＦＲＳ２関連分子または化合物を用いて生物体の異常状態を診断する方法も開示されている。本明細書において実施例により報告されている実験は、ＦＲＳ２がＧｒｂ−２／Ｓｏｓを経てＦＧＦＲを活性化Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路に関係付けていることを示している。文献の意見は、生物体の疾患状態へ導くＦＧＦＲ機能の変化としてＦＧＦＲ−ＦＲＳ２相互作用の重要性を強調している。多くのＦＧＦＲＩおよびＦＧＦＲ２中の突然変異は重度の頭蓋顔面奇形および足、親指および足指の特徴的奇形を導く。これらの突然変異はファイファー、ジャクソン−ヴァイスおよびクルーゾン症候群の原因である（Ｍｕｅｎｋｅｅｔａｌ．，１９９４，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ８：２６９−２７４；Ｊａｂｓｅｔａｌ．，１９９４，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ８：２７５−２７９；Ｒｕｔｌａｎｄｅｔａｌ．，１９９５，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ９：１７３−１７６）。ＦＧＦＲＩ遺伝子欠損させたマウスでの実験により胎児成長および軸性原腸胚形成におけるこのレセプターの中心的役割が確認された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．８：３０３２−３０４４；Ｄｅｎｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．８：３０４５−３０５７）。骨格形成異常および軟骨異形性を導く突然変異がＦＧＦＲ３でも同定されている（Ｔａｖｏｒｍｉｎａｅｔａｌ．，１９９５，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４：２１７５−２１７７；Ｂｅｌｌｕｓｅｔａｌ．，１９９５，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１０：３５７−３５９）。ＦＧＦＲ３中の一つの突然変異はヒト小人症の最も普通の型の原因であり（Ｓｈｉａｎｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ７８：３３５−３４２）、見かけ上ＦＧＦレセプターの固有の蛋白質キナーゼ活性の構成的活性化を導く機能増大突然変異の結果である（ＷｅｂｓｔｅｒａｎｄＤｏｎｏｇｈｕｅ，１９９６，ＥＭＢＯ１５：５２０−５２７）。マウスにおけるＦＧＦＲ３遺伝子の不活性化は促進された骨成長を伴う重度の骨異形性を起こす（Ｄｅｎｇｅｔａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．８：３０４５−３０５７）。ＦＧＦレセプターのＣ．エレガンス相同体で同定された機能喪失突然変異もまた重度の発育障害を導いている（ＤｅＶｏｒｅｅｔａｌ．，１９９５，Ｃｅ１１８３：６１１−６２０）。従って、ＦＲＳ２はこれらの疾患のための薬物設計標的である。加えて、ＦＧＦＲは細胞増殖および分化経路においての重要な制御分子であるので、ＦＲＳ２は生物体の他の異常な状態のための薬物設計標的でもある。本発明の種々の他の特色および態様は：ＦＲＳ２ポリペプチドをコードしている核酸分子；核酸分子を操作するための組換え体ＤＮＡ技術；ＦＲＳ２の検出のための核酸プローブ；他の生物体におけるＦＲＳ２メッセージを検出するためのプローブに基づいた方法およびキット；ＦＲＳ２核酸分子を含むＤＮＡ構築物、およびこれらの構築物を含んでいる細胞；ＦＲＳ２ポリペプチドを単離、濃縮または精製する方法；ＦＲＳ２抗体およびハイブリドーマ；ＦＲＳ２を検出するための抗体に基づいた方法およびキット；試薬の同定；ＦＲＳ２ポリペプチドと相互作用する化合物の単離；ＦＲＳ２およびＦＲＳ２分子と相互作用する化合物の組成物；化合物の医薬処方の調剤；生物体への化合物の投与様式；複合体の精製および製造；複合体の誘導体；複合体の抗体；ＦＲＳ２蛋白質複合体の崩壊；ＦＲＳ２核酸構築物を含んでいるトランスジェニック動物；アンチセンスおよびリボザイム法、遺伝子治療；および障害の評価である。複合体になされる修飾はその複合体中の分子の修飾で示すことができることを当業者は理解している。従って、本発明は核酸分子、ポリペプチド、抗体または複合体中の化合物への任意の修飾を含んでいる。これらの特色および態様のすべてはＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８７３８（図を含んで全文が本明細書において援用される）においてＰＹＫ−２に関して詳細に説明されている。当業者はそのような記述が同様にＦＲＳ２に容易に適用でき、本発明に等しく応用可能であることを理解するであろう。実施例以下の実施例は本発明の種々の態様および特色を単に代表するものであり、制限するものではない。以下の実施例は新規蛋白質ＦＲＳ２の単離および特徴付けを示している。実施例に記述された実験で利用された材料および方法は以下の様である：細胞株：ＦＧＦＲ１を発現しているＰＣ１２細胞（Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１９−１４４２３）およびＬ６筋原細胞（Ｍｏｈａｍｍａｄｉｅｔａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５８：６８４−６８４）は以前に記載されている。ＨＥＲ１４細胞はヒトＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）を過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞である（Ｈｏｎｅｇｇｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９）。抗体およびＧＳＴ融合蛋白質：抗Ｇｒｂ２（Ｎ−ＳＨ３ドメイン）、抗Ｓｏｓ１、抗ホスホチロシン（抗ｐＹ）、抗Ｓｈｃおよび抗ＦＧＦＲは以前に記載されている（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ７０：４３１−４４３；Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１９−１４４２３）。抗ＥＧＦＲ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９）および抗ＧＳＴ（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５１９２−５２０１）抗体もまた以前に記載されている。抗ＦＲＳ２抗体は本蛋白質のＣ末端部分（ＦＲＳ２のアミノ酸４００−５０８）を含むＧＳＴ融合蛋白質に対して発生させた。Ｇｒｂ２のＧＳＴ融合蛋白質、ならびにいくつかのＧｒｂ２突然変異体の融合蛋白質、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２−ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２（Ｐ４９Ｌ）、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＦＬＶＲ（Ｒ８６Ｋ）（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ７０：４３１−４４３；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５６：３４０−３４４；Ｓｋｏｌｎｉｋｅｔａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１９５３−１９５５）は以前に記載されているように発生させた。免疫沈降およびイムノブロッティング分析：ＦＧＦＲまたはＥＧＦＲを発現しているトランスフェクトされた細胞を一夜飢餓状態にした：Ｌ６細胞は０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む増殖培地、およびＰＣ１２細胞は０．５％ＦＣＳおよび０．５％ウマ血清を含む培地。飢餓状態にした細胞は５ｎＭａＦＧＦおよび５μｇ／ｍｌヘパリン、または１６ｎＭＥＧＦで処理し、３７℃で５分間または指示された時間インキュベートした。細胞を溶解し、以前に記載されているように（Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１９−１４４２３）免疫沈降およびイムノブロッティング分析にかけた。ＦＲＳ２の精製：ＦＲＳ２は以前に記載されているように(Ｓｐｉｖａｋ−Ｋｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１９−１４４２３)、ａＦＧＦおよびヘパリンで刺激されているＮＩＨ３Ｔ３細胞から精製された。細胞を溶解し、溶解物はＧｒｂ２−ＳＨ２Ａｆｆｉｇｅｌ−１０カラム（１００ｍｇのＳＨ２蛋白質が１ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ１０に架橋されている、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と４℃で３時間インキュベートした。カラムは３回ＨＮＴＧ（２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール）で洗浄し、蛋白質は１％ＳＤＳおよび２．５％（ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で溶出した。カラムは溶出緩衝液と１００℃で１０分間インキュベートした。溶出液は次にＨＮＴＧで５０倍に希釈し、希釈した蛋白質はプロテイン−Ａセファロースに結合されたアフィニティ精製抗ホスホチロシン抗体（抗−Ｐ−Ｔｙｒ）と４℃で５時間インキュベートした。ＦＲＳ２は抗体カラムから１００ｍＭフェニルホスフェートを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で溶出した。試料は８％ＳＤＳゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターに移してＰｏｎｃｅａｕＳで染色して可視化した。蛋白質配列決定：ＦＲＳ２に対応するバンドをニトロセルロースフィルターから切り出した。ニトロセルロースフィルターは２平方ｃｍの小片に切断し、メタノールで湿らせ、２００μｌの１０ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭトリス（ｐＨ９．２）、５ｍＭＥＤＴＡを用いて５０℃で１時間還元し、１／１０容量の２５０ｍＭ４−ビニルピリジンのアセトニトリル溶液を加え、室温で３０分間アルキル化した。ニトロセルロースは次に１０％アセトニトリル水溶液で５回洗浄し、５０μｌの１００ｍＭトリス（ｐＨ８．２、１％オクチルグルコシド、１０％アセトニトリル、２００ｎｇの修飾ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む）を加え、試料は一定に振盪させながら３７℃で１８時間インキュベートした。ニトロセルロースから遊離されたペプチドを含む上清はペプチド分離のために直接逆相ＨＰＬＣに注入された。１ｘ１５０ｍｍＲｅｌｉａｓｉｌＣ−１８カラムがＭｉｃｈｒｏｍＨＰＬＣで使用された。溶液はＡ＝０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水（３：９７）、Ｂ＝０．９％アセトニトリル／水（９７：３）であった。カラムは５％Ｂで平らなベースラインが得られるまで洗浄し、続いて６０分で５から６５％Ｂとなる濃度勾配を用いて溶出した。２１４ｎｍでモニターし、ピークは深いウェルのポリプロピレンマイクロタイタープレートに集め、凍結して保存した。配列決定は製造元からの標準試薬およびプログラムを用いてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４９４で実施した。ＦＲＳ２のｃＤＮＡクローニング：一対の縮重プライマーがトリプシンペプチド＃２（ＶＹＥＮＩＮＧＬＳＩＰＳＡＳＧＶ）のアミノ酸配列に基づいて合成された。ＰＣＲは３Ｔ３細胞から単離されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡを用いてこれら二つのプライマーにより実施された。この反応の６０塩基対長生成物が配列決定され、正しいアミノ酸配列を持っていることが観察された。二回目のＰＣＲが同一のｃＤＮＡに対し、最初の６０ｂｐ反応生成物の配列から選択された一つのプライマーおよびＦＲＳ２のトリプシンペプチド＃１の配列（ＦＶＬＧＰＴＰＶＱＫ）に基づいた第二の縮重プライマーを用いて実施された：この反応は１７０塩基対生成物を与えた。三回目のＰＣＲはこの１７０ｂｐからの一つのプライマーおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターからのＴ３プライマーで実施された。この反応の１．２ｋｂ生成物はペプチド＃１の配列を含んでいた。最後に、１．２ｋｂ断片がＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から発生させたλｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のスクリーニングのためのプローブとして使用された。λ ｐ９０−１およびλｐ９０−２の二つのファージクローンが単離され、さらに分析された。これら二つのクローンの演繹されたアミノ酸配列の決定は、精製されたＦＲＳ２から単離された四つのトリプシンペプチドの配列に含まれている長い読み取り枠を明らかにした。２９３細胞における過渡的発現：２９３細胞は１０ｃｍ組織培養皿で７０％コンフルエントになるまで増殖させた。細胞はリポフェクタミン試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用し、種々の発現ベクター（図に示されているような）で過渡的にトランスフェクトした。空発現ベクターが、各々のプレートへトランスフェクトされたＤＮＡ量を一定の１０μｇに合わせるために使用された。［³Ｈ］ミリスチン酸標識：サブコンフルエントの２９３細胞を野生型ｔｐＦＲＳ２またはＧ２Ａ突然変異体でトランスフェクトした；トランスフェクション３６時間後、細胞を２％透析ＦＣＳを補給したＤＭＥＭで２度洗浄し、１００ μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ミリスチン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えた同一の培地中、３７℃で３時間インキュベートした。続いて細胞を溶解させ、抗ＦＲＳ２抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物は８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、使用説明書に従ってＥＮＴＥＮＳＩＦＹ溶液（Ｄｕｐｏｎｔ）でゲルを処理した。ゲルは乾燥させ、オートラジオグラフィーにより分析した。加えられた蛋白質を規格化するための対照として、各々の免疫沈降物の１０％をニトロセルロースフィルターに移し、抗ＦＲＳ２抗体でイムノブロットした。免疫蛍光分析：ヒーラー細胞をＦＲＳ２またはそのＧ２Ａ突然変異体のＨＡ− 標識構築物で過渡的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４−４８時間後、ポリ−Ｌ−リジンで被覆したガラスカバースリップ上に細胞を置いた。１６時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、０．２％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳを、室温で２０分間浸透させた。次に５％ヤギ血清および５％ウマ血清を含むブロッキング溶液（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）で細胞を処理し、抗ＨＡ抗体および二次フルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体で染色した。安定にＦＲＳ２を発現しているＰＣ１２細胞の発生：ＦＲＳ２ｃＤＮＡをＬＸＳＮ発現ベクター内へクローン化し、以前に記載されているようにウイルスの高力価貯蔵物が製造された。Ｒｏｚａｋｉｓ−Ａｄｃｏｃｋｅｔ．ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３６０：６８９−６９２。親細胞を、野生型ＦＲＳ２およびネオマイシン耐性遺伝子を結合させたウイルスで感染させ、ゲネチシンを補充した培地（５００μｇ／ｍｌ）で１週間選択した。Ｒａｓ（Ｎ１７）を発現するＰＣ１２細胞を、選択マーカーとしてヒスチジノールデヒドロゲナーゼを含むＦＲＳ２発現ウイルスに感染させた。続いて細胞はヒスチジノール（８００μｇ／ｍｌ）で２週間選択した。選択された培養物のプールが研究に使用された。Ｒａｓ（Ｎ１７）の発現は２μＭのデキサメタゾンで一夜処理することにより誘導された。ＰＣ１２細胞分化の分析：ＦＲＳ２ウイルスに感染したＰＣ１２細胞を６０ｍｍ組織培養皿当たり１０⁵細胞の密度で播種した。細胞は１０％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中で、２４時間増殖させた。培地にａＦＧＦ（２．５ｎＭ）およびヘパリン（５μｇ／ｍｌ）を加え、さらに４８時間インキュベートした。ＦＲＳ２およびＲａｓ（Ｎ１７）を同時に発現する細胞を２μ Ｍのデキサメタゾンの添加により処理した。神経突起成長は２００細胞の無作為群での長さを記録し、すべての処理での細胞当たりの平均の長さを決定することにより定量された。実施例１：ＦＲＳ２に結合するＧＲＢ２のＳＨ２ドメインＧｒｂ−２は二つのＳＨ３ドメインが隣接する一つのＳＨ２ドメインを含んでいる。Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ７０：４３１−４４３。チロシンリン酸化ＦＲＳ２はＧｒｂ２に結合するので、そのＳＨ２ドメインのみと相互作用する能力が試験された。Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメインのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質がＦＧＦ刺激細胞の溶解物から会合蛋白質を沈殿させるために使用された。抗ｐＹ抗体による分析は、チロシンリン酸化ＳｈｃおよびＦＲＳ２の両方がＧｒｂ２ＳＨ２ドメインとＦＧＦ依存性様式で会合していることを示した。対照的に、Ｇｒｂ２ＳＨ２の突然変異した結合欠陥形（Ｒ８６Ｋ）とのＧＳＴ融合蛋白質は両方の蛋白質を沈殿させなかった。ＦＲＳ２およびＧｒｂ２のＳＨ２ドメイン間の相互作用が直接的であるかどうかを決定するためにファーウェスタン技術が応用された。ＦＧＦ刺激または非刺激細胞からの溶解物が抗Ｇｒｂ２かまたは抗ｐＹ抗体で免疫沈降され、ＧＳＴ（対照として）、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２またはＧＳＴ−Ｇｒｂ２（Ｐ４９Ｌ）（Ｓｅｍ −５機能喪失対立遺伝子に対応するＮ末端ＳＨ３ドメイン中の点突然変異体、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５９：３４０−３４４）によるブロッティングにより分析された。ＧＳＴ−Ｇｒｂ２および突然変異したＳＨ３ドメインを持つ形の両方が直接的にチロシンリン酸化ＦＲＳ２に結合し（データは示されていない）、Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメインを含む直接相互作用のさらなる確認が得られた。実施例２：ＦＧＦ刺激細胞においてＧＲＢ２／ＦＲＳ２複合体はＳＯＳに結合されているＧｒｂ２はその二つのＳＨ３ドメインを通してグアニン−ヌクレオチド放出因子Ｓｏｓ１へ結合する。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４：２５−３０。ＦＲＳ２およびＧｒｂ２間で形成された複合体がＳｏｓ１とも相互作用するかどうかを決定するために実験が行われた。ａＦＧＦ刺激または非刺激細胞の溶解物をＦＧＦＲ１、Ｇｒｂ２またはＳｏｓ１に対する抗体で免疫沈降した。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットした。チロシンリン酸化ＦＲＳ２はＦＧＦ刺激細胞においてＧｒｂ２およびＳｏｓ１の両方と会合しているようであるが、抗ＦＧＦＲ１（または抗Ｓｈｃ）免疫沈降物では検出されなかった。この実験は、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ１およびＦＲＳ２から成る三重複合体がａＦＧＦ刺激に応答して形成されたことを示している。ファーウェスタンブロッティング実験からもまたＦＲＳ２、Ｇｒｂ２およびＳｏｓ１を含んでいる複合体の存在が確認された。実験は、Ｇｒｂ２およびＦＲＳ２間の会合はＧｒｂ２のＳＨ２ドメインにより媒介され、ＦＧＦ刺激に依存的であったことを示唆している。Ｓｏｓ１およびＧｒｂ２間の会合は構成的であり、ＳＨ３ドメインにより媒介された。実施例３：ＦＲＳ２の精製実施例１の実験はＧｒｂ２のＳＨ２ドメインがチロシンリン酸化ＦＲＳ２へ結合することを示している。この情報がＦＲＳ２精製のためのアフィニティークロマトグラフィー法の開発に使用された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をａＦＧＦで刺激して溶解し、細胞溶解物を固定化されたＧｒｂ２ＳＨ２ドメインを含んでいるａｆｆｉｇｅｌアフィニティーマトリックスに加えた。チロシンリン酸化ＦＲＳ２はＳＨ２ａｆｆｉｇｅｌマトリックスに結合され、ＳＤＳおよび還元剤存在下で煮沸することによりマトリックスから放出された。ＦＲＳ２含有試料は次に抗ホスホチロシン抗体を用いる第二のアフィニティークロマトグラフィー精製工程にかけられた。チロシンリン酸化ＦＲＳ２は抗ホスホチロシン抗体に結合され、複合体はプロテインＡ−セファロースカラムに負荷された。リン酸化ＦＲＳ２は１００ｍＭフェニルホスフェートを用いてカラムから溶出された。溶出された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ニトロセルロースへ移した後、Ｐｏｎｃｅａｕ−Ｓ染色はＦＲＳ２に対応する９２／９５ｋＤａの見かけの分子量のダブレットを明らかにした。精製されたＦＲＳ２蛋白質バンドはフィルターから切り出し、トリプシンで消化し、トリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離した。四つのトリプシンペプチドのアミノ酸配列は固相マイクロシークエンサーを用いて決定された。実施例４：ＦＲＳ２のｃＤＮＡクローニングＦＲＳ２からのペプチド配列が、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞から単離されたｍＲＮＡで調製されたｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計に使用された。１．２ｋｂＰＣＲ生成物はＦＲＳ２からの蛋白質分解性ペプチド＃１（ＦＶＬＧＰＴＰＶＱＫ）およびペプチド＃２（ＶＹＥＮＩＮＧＬＳＩＰＳＡＳＧＶ）を含んでいる。１．２ｋｂＰＣＲ生成物は次にＮＩＨ−３Ｔ３細胞からのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブとして使用された。二つの重複クローン、λｐ９０−１およびλｐ９０−２が単離された。二つのクローンのヌクレオチド配列決定は、λｐ９０−２がＦＲＳ２から単離された四つすべてのトリプシンペプチドの配列を含んでおり、およびλ ｐ９０−２はＦＲＳ２の完全長ｃＤＮＡクローンであることを示した。クローンλｐ９０−２から決定されたＦＲＳ２の演繹アミノ酸配列は図１Ａに示されている。ＦＲＳ２のコード配列はヌクレオチド番号３０８で始まっている。第一のメチオニンはコザック共通配列内にあり、１５２７塩基対の読み取り枠 (ＯＲＦ)が続き、ヌクレオチド１８３４の終止コドンで終わっている。このＯＲＦは５０８アミノ酸を含む蛋白質をコードしており、予想される分子量は５６８００ダルトンである。ＦＲＳ２の配列は分子のアミノ末端ＭＧＳＣＣＳに共通ミリスチル化配列（ＭＧＸＸＸＳ／Ｔ）を含んでいる。Ｒｅｓｈ，１９９４，Ｃｅｌｌ７６：４１１−４１３。加えて、ＦＲＳ２はＩＳＲ１のＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメインと２９％の配列同一性を持つ１２０アミノ酸配列（残基１１から１３９）を含んでいる（図１Ｂ）。Ｓｕｎｅｔ．ａｌ．，１９９１，ｎａｔｕｒｅ３５３：７３７７。ＩＳＲ１のＰＴＢドメインはインスリンレセプターの膜近傍領域中のチロシン−リン酸化ＮＰＸＸｐ配列へ結合することが示されている。Ｗｈｉｔｅｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ｃｅｌｌ５４：６４１−６４９。ＦＲＳ２はまた二つのＧｒｂ２結合可能性部位も含んでいる（ＮＹＥＮおよびＮＹＶＮ）（図１Ｂ）。ＦＲＳ２の組織発現パターンが、成体マウス組織から単離されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析により試験された。ＦＲＳ２は至る所で、および最も豊富には脳、腎臓、卵巣および精巣で発現された。ＦＲＳ２蛋白質を特徴付けるため、ＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で発現されたＦＲＳ２のＣ末端部分に対してウサギでポリクローナル抗体を生じさせた。抗ＦＲＳ２抗体はＮＩＨ−３Ｔ３細胞ならびにＰＣ１２細胞からの蛋白質を沈降させ、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて９２−９５ｋＤａのダブレットとして移動した。予測されるＦＲＳ２の分子量( ５６，８００ダルトン)とＳＤＳゲルでの移動の相違は一部、翻訳後修飾によるものであろう。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞からの溶解物中のＧｒｂ２およびＦＲＳ２間の会合も抗ＦＲＳ２抗体を使用して試験された。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞はａＦＧＦで刺激され、非刺激または刺激細胞から調製された溶解物はＧｒｂ２、ＦＲＳ２、Ｓｏｓ１、ＳｈｃまたはＦＧＦＲ１に対する抗体で免疫沈降され、続いていくつかの異なった抗体でイムノブロッティングされた。この実験は、ａＦＧＦ刺激細胞におけるＧｒｂ２とチロシンリン酸化ＦＲＳ２のリガンド依存性会合を示した。同様に、Ｓｏｓ１はａＦＧＦ刺激細胞においてのみＦＲＳ２と会合することが観察された。興味あることに、ａＦＧＦ刺激細胞の溶解物でより明白なＧｒｂ２およびＳｏｓ１の同時沈降が検出され、Ｇｒｂ２およびチロシンリン酸化ＦＲＳ２間の相互作用はＧｒｂ２およびＳｏｓ１間の複合体形成を安定化するであろうことを示唆している。ＦＧＦ刺激または非刺激細胞におけるＦＲＳ２とＦＧＦＲ間のまたはＦＲＳ２およびＳｈｃ間の会合は検出されなかった。同様に、ＦＲＳ２とＮｃｋ、ホスホリパーゼＣλ、またはｐ８５（ＰＩ−３キナーゼの制御サブユニット）のような他のシグナル伝達物質間の会合も検出されなかった。これらのことを一緒にすると、これらの実験はａＦＧＦ刺激はＦＲＳ２のチロシンリン酸化を導き、それは次にＧｒｂ２／Ｓｏｓ１と結合し、ＦＧＦ依存性三重複合体を形成することを示している。実施例５：ＦＲＳ２はミリスチル化されおよび細胞膜を標的とするＦＲＳ２のアミノ末端は推定ミリスチル化配列、続いてＩＲＳ１のＰＴＢドメインに類似のホスホチロシン結合ドメイン（ＰＴＢドメイン）を含んでいる。Ｒｅｓｈ，１９９４，Ｃｅｌｌ７６：４１１−４１３。推定ミリスチル化配列の役割は、共通配列中の鍵となるグリシン残基がアラニンに置き換えられている点突然変異体（Ｇ２Ａ）を発生させることにより試験された。野生型ＦＲＳ２または突然変異体Ｇ２Ａの合成を指示する発現ベクターがヒト２９３細胞で過渡的に発現された。トランスフェクトされた細胞は［³Ｈ］ミリスチン酸で標識され、溶解され、抗ＦＲＳ２抗体で免疫沈降され、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析された。［³Ｈ］ミリスチン酸の取り込みは野生型ＦＲＳ２では検出されたがＧ２Ａ点突然変異体では検出されなかった。ＦＲＳ２の細胞分布がトランスフェクト細胞で分析された。ヒーラー細胞が、野生型ＦＲＳ２または点突然変異体（Ｇ２Ａ）のＨＡ標識形の合成を指示する発現ベクターで過渡的にトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞は浸透化され、フルオレセイン標識抗ＨＡ抗体で標識された。共焦点蛍光顕微鏡による可視化は、野生型ＦＲＳ２は主として細胞膜に付随しているが、Ｇ２Ａ突然変異体は細胞質全体に分布していたことを示した。この実験は野生型は細胞膜を標的としていること、およびこの局在化にミリスチル化が必要とされることを示している。細胞分画法が野生型ＦＲＳ２およびＧ２Ａ突然変異体の分布研究に使用された。非処理またはａＦＧＦ処理細胞から粒子および可溶性分画が調製され、ＦＲＳ２が両方の細胞分画から免疫沈降された。分画プロトコールが膜結合蛋白質から細胞質を正しく分画したことを確認するため、ＦＧＦＲ１がマーカーとして使用された。ＦＧＦＲ１はもっぱら粒子分画で同定され、ａＦＧＦ刺激細胞ではチロシン残基がリン酸化される。内在性ＦＲＳ２は粒子分画にもっぱら付随していることが観察され、ａＦＧＦ刺激はＦＲＳ２のチロシンリン酸化およびＧｒｂ２への結合を導いていた。対照的に、ＦＲＳ２の非ミリスチル化突然変異体（Ｇ２Ａ）は可溶性分画に観察され、ＦＧＦ刺激細胞でチロシンリン酸化されていなかった。非ミリスチル化形の電気泳動的移動度はＦＧＦ刺激細胞では変化しており、ａＦＧＦが突然変異体ＦＲＳ２蛋白質のＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化を誘導しているであろうことを示唆している。本研究はＦＲＳ２がミリスチル化されていること、およびミリスチル化はＦＲＳ２の細胞膜標的化、ＦＲＳ２のチロシンリン酸化およびＧｒｂ２の供給に必須であることを示している。実施例６：ＦＲＳ２の過剰発現によるＭＡＰＫ経路の活性化ａＦＧＦ刺激に応答してＧｒｂ２を細胞膜へ補充するＦＲＳ２の能力は、その生理学的役割がＦＧＦレセプター活性化をＲａｓ／ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路へ連結するという可能性を生じさせた。この可能性を探求するため、２９３細胞において一定量のＦＧＦレセプターおよびＨＡ標識ＥＲＫ１の発現と共にＦＲＳ２を過渡的に過剰発現させて濃度を上昇させた。ＥＲＫ１の活性は基質としてミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）を用いる免疫複合体アッセイ（Ｄｉｋｉｃｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１２５−１５１２９）で測定された。ＦＲＳ２の過剰発現はＭＡＰキナーゼのチロシンリン酸化およびＭＢＰのリン酸化の比例した増加を導いた。野生型ＦＲＳ２の過剰発現はＭＡＰキナーゼの強い活性化を導いたが、非ミリスチル化突然変異体の過剰発現はＭＡＰキナーゼ活性化を劇的に減少させた。非ミリスチル化突然変異体の過剰発現によるＭＡＰキナーゼ活性化は、これらの細胞中で発現された内在性ＦＲＳ２分子により誘導されたバックグラウンド活性化を差し引いた後、野生型ＦＲＳ２の過剰発現により誘導される活性化と比較するとほとんど７０％減少していた。チロシンがリン酸化され、およびそれによってＧｒｂ２へ結合する野生型ＦＲＳ２と異なり、非ミリスチル化ＦＲＳ２突然変異体はＦＧＦＲ活性化に応答してのチロシンリン酸化が行われない。この過程におけるＲａｓの役割を試験するため、優性妨害突然変異体Ｒａｓ（Ｎ１７）存在下でのＭＡＰキナーゼ活性に対するＦＲＳ２過剰発現の影響が分析された。この実験は、Ｒａｓの優性妨害突然変異体の発現はＦＲＳ２誘導ＭＡＰキナーゼ活性化を効果的に阻止することを示した。しかしながら、ＦＲＳ２のチロシンリン酸化およびそのＧｒｂ２との会合は、優性妨害Ｒａｓ（Ｎ１７）突然変異体の発現によって影響されなかった。従ってこれらの実験は、ＦＲＳ２は活性化ＦＧＦレセプターとＲａｓ／ＭＡＰキナーゼカスケードとの間の連結物として機能しており、ＦＲＳ２はこの経路においてＲａｓの上流で作用していることを示している。実施例７：ＦＲＳ２の過剰発現はＰＣ１２細胞において神経突起成長を促進するＰＣ１２細胞を野生型ＦＲＳ２かまたは非ミリスチル化Ｇ２Ａ突然変異体の合成を指示する発現ベクターで安定にトランスフェクトした。親ＰＣ１２細胞に弱い、わずかに検出可能な神経突起成長を誘導する低濃度のａＦＧＦおよびヘパリンで細胞をインキュベートした。この実験はＦＲＳ２の過剰発現がこれらのＰＣ１２細胞におけるａＦＧＦ誘導神経突起成長の強い増強を導くことを示した。対照的に、非ミリスチル化ＦＲＳ２突然変異体はトランスフェクト細胞においてａＦＧＦ誘導神経突起成長には影響しなかった。この研究で使用されたＰＣ１２細胞株は内在性ＦＲＳ２および低レベルの内在性ＦＧＦレセプターを発現することに注目すべきである。それ故、ａＦＧＦ刺激は対照細胞の平板化、付着および弱い神経突起成長を促進した。免疫沈降およびイムノブロッティング実験により、内在性およびトランスフェクトされた野生型ＦＲＳ２は両方ともチロシンがリン酸化されていること、一方、非ミリスチル化ＦＲＳ２突然変異体ではａＦＧＦ刺激に応答してチロシンがリン酸化されないことが確認された。ＦＲＳ２誘導神経突起成長におけるＲａｓの役割がデキサメタゾン誘導可能優勢妨害突然変異体Ｒａｓ（Ｎ１７）のＰＣ１２細胞での条件付け発現により試験された。Ｒａｓ（Ｎ１７）の過剰発現は、ＦＲＳ２の発現およびＦＲＳ２のチロシンリン酸化のどちらにも影響しなかった。しかしながら、ＦＲＳ２誘導神経突起成長はＲａｓ（Ｎ１７）の過剰発現により完全に阻止され、それがＲａｓ活性化に依存していることを示している。いくつかの態様および実施例が本発明を説明するために使用されてきたが、本発明の範囲および精神から離れることなく示された態様および実施例に変更を加えることができることを当業者は理解するであろう。前に本明細書で援用されなかった文献（特許および非特許文献を含む）も、すべての目的のため、明白に本明細書において援用される。他の態様は以下の請求の範囲に包含される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月１２日（１９９９．１．１２）【補正内容】請求の範囲１．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドをコードする単離された核酸。２．ＦＲＳ２ポリペプチドが、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む。請求項１記載のＦＲＳ２ポリペプチド。３．ＦＲＳ２ポリペプチドが、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含む、請求項１記載のＦＲＳ２ポリペプチド。４．ＦＲＳ２ポリペプチドが、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも３５個の連続するアミノ酸を含む、請求項１記載のＦＲＳ２ポリペプチド。５．ＦＲＳ２ポリペプチドが、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも５０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１記載のＦＲＳ２ポリペプチド。６．ＦＲＳ２ポリペプチドが、図１Ａに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１記載のＦＲＳ２ポリペプチド。７．核酸が哺乳動物から単離されたものである、請求項１記載の核酸分子。８．核酸が、図１Ａに示される全長アミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸をコードする、請求項１記載の核酸分子。９．試料中においてＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を検出するための核酸プローブであって、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む核酸プローブ。１０．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なプロモーターを含む核酸ベクター。１１．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、組換え細胞または組織。１２．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む、単離されたＦＲＳ２ポリペプチド。１３．前記ポリペプチドが、図１Ａに示される全長アミノ酸配列中に存在する少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むフラグメントである、請求項１２記載の単離されたＦＲＳ２ポリペプチド。１４．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメント。１５．図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。１６．（ａ）図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；（ｂ）（ａ）の核酸配列の相補物である；（ｃ）図１Ａに記載される配列の全長アミノ酸配列を有するが、ただし、以下のアミノ酸残基のセグメント：１−１０、１１−１５２または１５３−５０８の１つまたはそれ以上を欠失しているがすべてを欠失しているわけではないＦＲＳ２ポリペプチドをコードする；（ｄ）（ｃ）の核酸配列の相補物である；（ｅ）図１Ａに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１−１０、１１−１５２または１５３−５０８を有するポリペプチドをコードする；（ｆ）（ｅ）の核酸配列の相補物である；（ｇ）図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するが、ただし、ミリスチル化領域、ホスホチロシン結合領域、およびＣ−末端領域からなる群より選択されるドメインの１つまたはそれ以上を欠失しているがすべてを欠失しているわけではないポリペプチドをコードする；（ｈ）（ｇ）の核酸配列の相補物である；（ｉ）チロシン３４９のフェニルアラニンへの変異またはチロシン３９２のフェニルアラニンへの変異の一方または両方を含む、（ａ）、（ｃ）、または（ｅ）のポリペプチドをコードする；または（ｊ）（ｉ）の核酸配列の相補物である；のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離された核酸分子。１７．高度にストリンジェントな条件下で、図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド分子にハイブリダイズし、このことにより、そのようなハイブリダイゼーション条件が２０個の連続するヌクレオチド中の１つまたは２つのミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する、請求項１５記載のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。１８．請求項１６記載の核酸分子を含む核酸ベクター。１９．請求項１６記載の核酸分子を含む組換え細胞または組織であって、前記核酸分子が細胞または組織に導入されている細胞または組織。２０．生物における異常な状態の診断、予防または治療に有用な、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＦＲＳ２ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用を遮断または増強することができる化合物を同定する方法であって、（ａ）化合物を前記ＦＲＳ２ポリペプチドを含有する細胞に加え；そして（ｂ）前記ＦＲＳ２ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化を検出する、の各工程を含む方法。２１．生物において異常な状態を診断する方法であって、前記異常な状態は、癌、異常血管新生および血管叢形成、遅い傷治癒速度、乾鮮、糖尿病、炎症、神経変性障害および遅い組織移植治癒速度からなる群より選択され、ここで、異常な状態は、ＦＲＳ２ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用により特徴づけられるシグナル伝達経路の異常により引き起こされ、かつ、前記ＦＲＳ２ポリペプチドは、図１Ａに示されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、該方法は、異常な相互作用を検出することを含み、抗体、核酸プローブ、または化合物媒介性検出からなる群より選択される、ことを特徴とする方法。２２．生物が哺乳動物である、請求項１５記載の方法。２３．第２のポリペプチドに結合された請求項１２記載のＦＲＳ２ポリペプチドを含む融合ペプチド。２４．前記第２のペプチドが、ＧＳＴ、ＨＡまたはマルトース結合蛋白質である、請求項２３記載の融合ペプチド。２５．請求項２４記載の融合蛋白質をコードする核酸分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コーハラ，ハルヒクアメリカ合衆国ニュージャージー州07024, フォート・リー，ウエスト・ゲイト・ドライブ 1452 (72)発明者スピバック−クロイツマン，タリーアメリカ合衆国ジョージア州30329，アトランタ，カリバー・ウッズ・ドライブ 520 (72)発明者ラックス，アイリットアメリカ合衆国ニュージャージー州07410, フェアー・ローン，レノックス・ドライブ 3401 (72)発明者シュレジンガー，ジョーゼフアメリカ合衆国ニューヨーク州10011，ニューヨーク，ウエスト，ワシントン・スクエアー 37

Claims

【特許請求の範囲】１．ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸。２．核酸分子が、哺乳動物から単離された、濃縮されたまたは精製されたものである、請求項１記載の核酸分子。３．核酸が、図１Ａに示される全長アミノ酸配列の少なくとも３個の連続するアミノ酸をコードする、請求項１記載の核酸分子。４．試料中の、ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を検出するための核酸プローブ。５．ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子および宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターを含む核酸ベクター。６．ＦＲＳ２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞または組織。７．単離された、濃縮されたまたは精製されたＦＲＳ２ポリペプチド。８．単離された、濃縮されたまたは精製されたＦＲＳ２ポリペプチドであって、図１Ａに示される全長アミノ酸配列中に存在する少なくとも３個の連続するアミノ酸を含むユニークフラグメントであることを特徴とするポリペプチド。９．ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメント。１０．ＦＲＳ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。１１．単離された、濃縮されたまたは精製された核酸分子であって、（ａ）図１Ａに示される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；（ｂ）（ａ）の核酸配列の相補物；（Ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし、かつ天然に生ずるＦＲＳ２蛋白質をコードする；（ｄ）図１Ａに記載される配列の全長アミノ酸配列を有するＦＲＳ２ポリペプチド、ただし、アミノ酸残基１−１０、１１−１５２、または１５３−５０８のセグメントの１つまたはそれ以上を欠失しており；（ｅ）（ｄ）の核酸配列の相補物；（ｆ）図１Ａに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１−１０、１１−１５２、１５３−５０８を有するポリペプチド；（ｇ）（ｆ）の核酸配列の相補物；（ｈ）図１Ａに記載される全長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ただし、ミリスチル化領域、ホスホチロシン結合領域、およびＣ末端領域からなる群より選択されるドメインの１つまたはそれ以上を欠失しており；（ｉ）（ｈ）の核酸配列の相補物；（ｊ）チロシン３４９のフェニルアラニンへの変異またはチロシン３９２のフェニルアラニンへの変異の一方または双方を含む、（ａ）、（ｄ）または（ｆ）のポリペプチドをコードする；または（ｋ）（ｊ）の核酸配列の相補物、のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子１２．請求項１１記載の核酸分子を含む核酸ベクター。１３．請求項１１記載の核酸分子を含む組換え細胞または組織。１４．生物において異常状態を診断、予防または治療するのに有用な、ＦＲＳ２と天然の結合パートナーとの間の相互作用を遮断または増強しうる化合物を同定する方法であって、（ａ）化合物をＦＲＳ２ポリペプチドを含む細胞に加え；そして（ｂ）ＦＲＳ２と天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化を検出するの各工程を含む方法。１５．生物において細胞増殖または細胞分化に関連する異常状態を診断する方法であって、該異常状態はＦＲＳ２ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用により特徴づけられるシグナル伝達経路の異常に起因しており、異常な相互作用を検出する工程を含む方法。１６．生物が哺乳動物である、請求項１５記載の方法。１７．第２のポリペプチドに結合された請求項７記載のＦＲＳ２ポリペプチドを含む融合ペプチド。１８．前記第２のペプチドが、ＧＴ、ＨＡ、マルタス（ｍｕｌｔｕｓ）結合螢白質、または前記第２のポリペプチドのいずれかのフラグメントである、請求項１７記載の融合ペプチド。１９．請求項１８記載の融合蛋白質をコードする核酸分子。