BR112020015030A2 - Proteína de fusão compreendendo a proteína il-2 e a proteína cd80 e uso da mesma - Google Patents
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Abstract
uma proteína de fusão compreendendo a proteína il-2 e a proteína cd80 é fornecida. uma proteína de fusão compreendendo o fragmento de cd80, a imunoglobulina fc e uma variante de il-2 pode ativar células imunes, tais como células matadoras naturais, e, ao mesmo tempo, controlar a atividade regulatória de células imunes de células t regulatórias. portanto, uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão como um ingrediente ativo é muito útil na indústria, pois tal composição farmacêutica pode aumentar a atividade imune no corpo e, assim, ser eficazmente usada contra doenças infecciosas, tais como câncer.
Description
“PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO A PROTEÍNA IL-2 E A PROTEÍNA CD80 E USO DA MESMA”
[001]A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 e a uma utilização das mesmas.
Especificamente, a presente invenção refere-se a uma nova proteína de fusão que apresenta eficácia terapêutica e imunopotenciadora contra o câncer.
[002]A interleucina 2 (IL-2), também chamada fator de crescimento de células T (TCGF), é uma glicoproteína globular que desempenha um papel central na produção, sobrevivência e homeostase de linfócitos. A IL-2 apresenta um tamanho de proteína de 15,5 kDa a 16 kDa e consiste de 133 aminoácidos. A IL-2 medeia várias ações imunes por meio da ligação a um receptor de IL-2 composto de três subunidades distintas.
[003]Além disso, a IL-2 é sintetizada principalmente pelas células T ativadas, em particular, por células T auxiliares CD4+. A IL-2 estimula a proliferação e diferenciação de células T e induz a produção de linfócitos T citotóxicos (CTLs) e a diferenciação de linfócitos sanguíneos periféricos em células citotóxicas e células matadoras ativadas por linfocinas (células LAK).
[004]Além disso, a IL-2 está envolvida na proliferação e diferenciação de células B, promove síntese de imunoglobulina por células B e estimula a produção, proliferação e ativação de células matadoras naturais (células NK). Portanto, a IL-2 é usada como um agente anticâncer, pelo fato de que pode aumentar as populações de linfócitos e aumentar a função das células imunes no organismo vivo.
Correntemente, a terapia com IL-2 foi aprovada e usada para pacientes com carcinoma metastático de células renais e melanoma maligno.
[005]Entretanto, a IL-2 apresenta uma função dupla nas respostas imunes, pois é importante não apenas mediar um aumento no número de células imunes e atividade das mesmas, mas também manter a tolerância imune. Além disso, foi relatado que IL-2 pode não ser ideal para inibir o crescimento do tumor. A razão é que, na presença de IL-2, morte celular induzida por ativação (AICD) pode ocorrer nos linfócitos T citotóxicos resultantes e as respostas imunes podem ser inibidas por células T regulatórias dependentes de IL-2 (células Treg) (Imai et al., Cancer Sci 98, 416 a 423, 2007).
[006]Além disso, efeitos colaterais cardiovasculares, pulmonares, renais, hepáticos, gastrointestinais, neuronais, cutâneos, hematológicos e sistêmicos graves ocorreram em pacientes que receberam imunoterapia com IL-2. Portanto, várias mutações de IL-2 foram estudadas para melhorar a eficácia terapêutica de IL-2 e minimizar seus efeitos colaterais (US 5.229.109 B). Entretanto, ainda existem muitos problemas que precisam ser resolvidos para utilizar a IL-2 para propósitos farmacológicos.
[007]Entretanto, CD80, também conhecida como B7-1, é um membro da família B7 de proteínas ligadas à membrana que estão envolvidas na regulação imune por meio da ligação ao seu ligante por via de liberação de respostas coestimuladoras e respostas coinibidoras. CD80 é uma proteína transmembrana expressada sobre a superfície de células T, células B, células dendríticas e monócitos. Sabe-se que CD80 se liga a CD28, CTLA4 (CD152) e PD-L1. CD80, CD86, CTLA4 e CD28 estão envolvidas em um sistema coestimulador-coinibidor.
Por exemplo, regulam a atividade de células T e estão envolvidas na sua proliferação, diferenciação e sobrevivência.
[008]Por exemplo, quando CD80 e CD86 interagem com CD28, sinais coestimuladores são gerados para ativar células T. Eventualmente, CD80 se liga a CTLA4 e estimula a suprarregulação de CTLA4. Como um resultado, CD80 inibe respostas de células T antes da ativação da resposta imune causada pela interação CD80/CD28. Este ciclo de retorno permite a regulação de fina de respostas imunes.
[009]Além disso, sabe-se que CD80 se liga a PD-L1, outro membro da família B7, com afinidade similar àquela com a qual CD28 se liga a PD-L1. PD-L1 é conhecida como um dos dois ligantes para proteína de morte programada-1 (PD-1) e sabe-se que PD-L1 está envolvida na regulação de células T. A ligação de CD80 a PD-L1 é outro mecanismo que pode bloquear a interação PD-1/PD-L1, o que pode prevenir a inibição de respostas de células T em tumores. Ao mesmo tempo, entretanto, um aumento nos níveis de CD80 faz com que CD80 se ligue a CD28, de modo que CTLA4 é induzida, desse modo, induzindo ou inibindo as respostas de células T.
[010]Os presentes inventores estudada para desenvolver IL-2 que é segura e eficaz. Como um resultado, os presente inventores descobriram que uma nova proteína de fusão compreendendo, em uma molécula, uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 pode ativar células imunes e regular eficazmente células Treg, desse modo, concluindo a presente invenção.
[011]De modo a obter o objetivo acima, em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80.
[012]Em outro aspecto da presente invenção, é fornecida um dímero da proteína de fusão obtido por meio da ligação de duas proteínas de fusão.
[013]Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão.
[014]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor compreendendo o polinucleotídeo.
[015]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula transformada na qual o vetor foi introduzido.
[016]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer ou uma doença infecciosa, compreendendo, como um ingrediente ativo, a proteína de fusão ou o dímero da proteína de fusão.
[017]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso da proteína de fusão para tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa.
[018]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso da proteína de fusão para a fabricação de um medicamento para tratar câncer ou uma doença infecciosa.
[019]Uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 pode não apenas ativar células imunes, devido à IL-2, mas, também, regular eficazmente células Treg, devido à CD80. Portanto, a proteína de fusão pode atacar células cancerígenas de maneira eficaz e, assim, pode ser utilmente utilizada para tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa.
[020]A Fig. 1 ilustra uma forma de realização esquemática de uma proteína de fusão.
[021]A Fig. 2 ilustra um mecanismo pelo qual a proteína de fusão regula dois tipos diferentes de células imunes; entretanto, deve ser entendido que o mecanismo pelo qual a ação da proteína de fusão é expressada não é limitado ao mesmo.
[022]A Fig. 3 ilustra um mecanismo pelo qual a proteína de fusão exibe um efeito anticâncer.
[023]A Fig. 4 ilustra uma vista esquemática da estrutura da proteína de fusão. Neste relatório, cada uma entre GI101 e mGI101 é uma forma de realização da proteína de fusão neste relatório e GI101C1, GI101C2 e mGI101C1 são exemplos para comparação com a atividade da proteína de fusão.
[024]A Fig. 5 ilustra várias modalidades da proteína de fusão neste relatório.
Proteínas derivadas de humanos e camundongos podem ser combinadas para preparar uma proteína de fusão. A proteína CD80 e proteína IL-2 podem ser ligadas entre si por intermédio de vários ligantes, exceto Fc.
[025]A Fig. 6 ilustra um resultado obtido por meio da identificação da proteína de fusão obtida (GI101) com SDS-PAGE.
[026]A Fig. 7 ilustra as quantidades da proteína de fusão (GI101), dependendo da absorvância.
[027]A Fig. 8 ilustra um resultado obtido por meio da análise da proteína de fusão obtida (GI101) por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).
[028]A Fig. 9 ilustra um resultado obtido por meio da identificação da proteína de fusão mGI101 obtida com SDS-PAGE.
[029]A Fig. 10 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação da proteína de fusão GI101C1obtida com SDS-PAGE.
[030]A Fig. 11 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação da proteína de fusão GI101C2 obtida com SDS-PAGE.
[031]A Fig. 12 ilustra um resultado obtido por meio da identificação da proteína de fusão mGI101C1obtida com SDS-PAGE.
[032]A Fig. 13 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação da proteína de fusão GI102-M45 obtida com SDS-PAGE.
[033]A Fig. 14 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação da proteína de fusão GI102-M61 obtida com SDS-PAGE.
[034]A Fig. 15 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação da proteína de fusão GI102-M72 obtida com SDS-PAGE.
[035]A Fig. 16 ilustra a afinidade de ligação entre hCTLA4 e GI101.
[036]A Fig. 17 ilustra a afinidade de ligação entre hPD-L1 e GI101.
[037]A Fig. 18 ilustra a afinidade de ligação entre hPD-L1 e hPD-1.
[038]A Fig. 19 ilustra a afinidade de ligação entre mCTLA4 e mGI101.
[039]A Fig. 20 ilustra a afinidade de ligação entre mPD-L1 e mGI101.
[040]As Figs. 21 e 22 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação da capacidade de ligação entre GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) e CTLA-4 e entre GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) e PD-L1. Foi identificado que GI-101 (hCD80-Fc- hIL-2v) apresenta alta capacidade de ligação para CTLA-4 e PD-L1.
[041]A Fig. 23 ilustra um efeito de GI101 sobre a ligação de PD-1/PD-L1.
GI101 eficazmente inibiu a ligação de PD-1/PD-L1.
[042]A Fig. 24 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre GI101 e IL-2Rα ou IL-2Rβ.
[043]A Fig. 25 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre GI101 e IL-2Rα.
[044]A Fig. 26 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre GI101 e IL-2Rβ.
[045]A Fig. 27 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rα e GI102-M45.
[046]A Fig. 28 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rα e GI102-M61.
[047]A Fig. 29 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rα e GI102-M72.
[048]A Fig. 30 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M45.
[049]A Fig. 31 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M61.
[050]A Fig. 32 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M72.
[051]As Figs. 33 e 34 ilustram os resultados obtidos por meio da medição de quantidades de IFN-γ secretado a partir de células quando as células são submetidas ao tratamento com GI101, GI101C1, GI101C2 ou IL-2 em concentrações respectivas e a incubação é realizada.
[052]As Figs. 35 e 36 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação dos efeitos de GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 (Proleucina) sobre a proliferação de células T CD8+.
[053]A Fig. 37 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação dos efeitos de GI101 e GI102 sobre a proliferação de células T CD8+ e células T CD4+.
Neste relatório, a Fig. 37A ilustra proporções de células T CD8+ e células T CD4+, a Fig. 37B ilustra a capacidade de proliferação de células T CD8+ e a Fig. 37C ilustra uma proporção de células Treg CD4+/FoxP3+.
[054]As Figs. 38 e 39 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação dos efeitos de GI101 e GI101w sobre a proliferação de células T CD8+ e células NK.
[055]As Figs. 40 e 41 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito de GI101 sobre as células T efetoras.
[056]A Fig. 42 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de efeitos de mGI101 e mGI102-M61 sobre células imunes de camundongos.
[057]As Figs. 43 e 44 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito de GI101 sobre células cancerígenas que superexpressam PD-L1.
[058]As Figs. 45 e 46 ilustram os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[059]A Fig. 47 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de mGI101 sobre camundongos transplantados com melanoma derivado de camundongo.
[060]A Fig. 48 ilustra a inibição do tumor de mGI101 sobre camundongos transplantados com melanoma derivado de camundongo.
[061]A Fig. 49 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de mGI101, dependendo de sua dose, sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[062]A Fig. 50 ilustra os resultados obtidos por meio da análise de taxa de sobrevivência de camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo que receberam mGI101.
[063]A Fig. 51 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[064]A Fig. 52 ilustra os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células T CD8+, células T IFN-γ, células T CD4+ e células Treg nos tecidos cancerígenos.
[065]A Fig. 53 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células T CD8+, células T IFN-γ, células T CD4+ e células Treg nos tecidos cancerígenos.
[066]A Fig. 54 ilustra os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, macrófagos nos tecidos cancerígenos.
[067]A Fig. 55 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, macrófagos nos tecidos cancerígenos.
[068]A Fig. 56 ilustra os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células dendríticas nos tecidos cancerígenos.
[069]A Fig. 57 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células dendríticas nos tecidos cancerígenos.
[070]A Fig. 58 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongos.
[071]A Fig. 59 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongos ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células T CD8+, células T IFN-γ, células T CD4+ e células Treg nos tecidos cancerígenos.
[072]A Fig. 60 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongos ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, macrófagos nos tecidos cancerígenos.
[073]A Fig. 61 ilustra graficamente os resultados obtidos submetendo camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongos ao tratamento com hIgG4, anticorpo anti-PD-1 ou GI101 e, depois, analisando, com FACS, células dendríticas nos tecidos cancerígenos.
[074]A Fig. 62 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de mGI102-M61 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[075]A Fig. 63 ilustra os resultados obtidos por meio da análise da taxa de sobrevivência de camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo que receberam mGI102-M61.
[076]A Fig. 64 ilustra os resultados obtidos por meio da identificação de um efeito inibitório de tumor de mGI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[077]A Fig. 65 ilustra a inibição do tumor de mGI101 em camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo.
[078]A Fig. 66 ilustra os resultados obtidos fazendo observações clínicas de 15 dias para macacos que receberam PBS ou GI101.
[079]As Figs. 67 e 68 ilustram os resultados obtidos por meio da medição dos pesos corpóreos nos dias -1, 1, 8 e 15 para macacos que receberam PBS ou GI101.
[080]A Fig. 69 ilustra consumo alimentar de 15 dias para macacos que receberam PBS ou GI101.
[081]As Figs. 70 a 72 ilustram os resultados obtidos por meio da análise do sangue nos dias -1, 1, 8 e 15 para macacos que receberam PBS ou GI101.
[082]As Figs. 73 a 79 ilustram os resultados obtidos por meio da realização de análises clínicas e químicas nos dias -1, 1, 8 e 15 dias para macacos que receberam PBS ou GI101.
[083]As Figs. 80 e 81 ilustram os resultados obtidos por meio da análise de citocinas nos dias -1, 1, 8 e 15 para macacos que receberam PBS ou GI101.
[084]As Figs. 82 a 87 ilustram os resultados obtidos por meio da análise de células imunes nos dias -1, 1, 8 e 15 para macacos que receberam PBS ou GI101.
[085]A Fig. 88 ilustra os resultados obtidos sacrificando, no dia 16, macacos que receberam PBS ou GI101 para obter tecidos do baço e analisando patologicamente os tecidos do baço.
[086]A Fig. 89 ilustra as proteínas de fusão, em cada uma das quais a proteína CD80 e a proteína IL-2 são ligadas a uma proteína portadora.
Especificamente, a Fig. 89A ilustra a proteína de fusão na qual a proteína CD80 e a proteína IL-2 são ligadas ao terminal N e ao terminal C da proteína portadora, respectivamente. Além disso, a Fig. 89B ilustra a proteína de fusão na qual a proteína CD80 e a proteína IL-2 são ligadas ao terminal C e ao terminal N da proteína portadora, respectivamente.
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO A PROTEÍNA IL-2 E A PROTEÍNA CD80
[087]Em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80.
[088]Conforme usado neste relatório, o termo “IL-2” ou “interleucina-2”, a menos que de outro modo estabelecido, refere-se a qualquer IL-2 do tipo selvagem obtida a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, por exemplo, primatas (tais como seres humanos) e roedores (tais como camundongos e ratos). A IL-2 pode ser obtida a partir de células animais e, também, inclui aquela obtida a partir de células recombinantes capazes de produzir IL-2. Além disso, a IL-2 pode ser IL-2 do tipo selvagem ou uma variante da mesma.
[089]No presente relatório descritivo, a IL-2 ou uma variante da mesma pode ser coletivamente expressada pelo termo “proteína IL-2” ou “polipeptídeo IL-2”. A IL- 2, uma proteína IL-2, um polipeptídeo IL-2 e uma variante de IL-2 se ligam especificamente a, por exemplo, um receptor de IL-2. Esta ligação específica pode ser identificada por métodos conhecidos aos técnicos no assunto.
[090]Uma forma de realização de IL-2 pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Neste relatório, a IL-2 também pode estar em uma forma madura. Especificamente, a IL-2 madura pode não conter uma sequência sinal e pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
10. Neste relatório, a IL-2 pode ser usada sob um conceito que abrange um fragmento de IL-2 do tipo selvagem no qual uma porção de terminal N ou terminal C da IL-2 do tipo selvagem é truncada.
[091]Além disso, o fragmento de IL-2 pode estar em uma forma em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos contíguos são truncados a partir do terminal N de uma proteína que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36. Além disso, o fragmento de IL-2 pode estar em uma forma em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos contíguos são truncados a partir do terminal C de uma proteína que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36.
[092]Conforme usado neste relatório, o termo “variante de IL-2” refere-se a uma forma em que uma porção de aminoácidos na IL-2 de comprimento total ou no fragmento de IL-2 descrito acima é substituída. Isto é, uma variante de IL-2 pode apresentar uma sequência de aminoácidos diferente daquela de IL-2 do tipo selvagem ou de um fragmento da mesma. Entretanto, uma variante de IL-2 pode apresentar atividade equivalente ou similar à IL-2 do tipo selvagem. Neste relatório, a “atividade de IL-2” pode, por exemplo, se referir à ligação específica a um receptor de IL-2, cuja ligação específica pode ser medida por métodos conhecidos aos técnicos no assunto.
[093]Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição de uma porção de aminoácidos na IL-2 do tipo selvagem. Uma forma de realização da variante de IL-2 obtida pela substituição de aminoácidos pode ser obtida por meio da substituição de pelo menos um ente os 38 o, 42o, 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[094]Especificamente, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição de pelo menos um entre o 38o, 42o, 45o, 61o ou 72o aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido. Além disso, quando a IL-2 está em uma forma na qual uma porção de terminal N na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 é truncada, o aminoácido em uma posição complementarmente correspondente àquela na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 pode ser substituído por outro aminoácido. Por exemplo, quando a IL-2 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, sua variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição de pelo menos um entre o 58 o, 62o, 65o, 81o ou 92o aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 por outro aminoácido. Estes resíduos de aminoácidos correspondem aos 38o, 42o, 45o, 61o e 72o resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, respectivamente. De acordo com uma forma de realização, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez aminoácidos podem ser substituídos, contanto que tal variante de IL-2 mantenha a atividade de IL-2. De acordo com outra forma de realização, um a cinco aminoácidos podem ser substituídos.
[095]Em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma na qual dois aminoácidos são substituídos. Especificamente, a variante de IL-
2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o e 42o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o e 45o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38 o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42o e 45o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 45o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 45 o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[096]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que três aminoácidos são substituídos. Especificamente, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 42o e 45o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 42o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 42o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 45o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 45o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42o, 45o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42o, 45o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[097]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que quatro aminoácidos são substituídos. Especificamente, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 42o, 45o e 61o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38 o, 42o, 45o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38 o, 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 38o, 42o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, em uma forma de realização, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição dos 42 o, 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[098]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que cinco aminoácidos são substituídos. Especificamente, a variante de IL-2 pode ser obtida por meio da substituição de cada um entre os 38o, 42o, 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 por outro aminoácido.
[099]Neste relatório, o “outro aminoácido” introduzido pela substituição pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Entretanto, com respeito à substituição de aminoácidos para a variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 38o aminoácido não pode ser substituído por arginina, o 42o aminoácido não pode ser substituído por fenilalanina, o 45o aminoácido não pode ser substituído por tirosina, o 61o aminoácido não pode ser substituído por ácido glutâmico e o 72o aminoácido não pode ser substituído por leucina.
[0100]Com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL- 2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 38 o aminoácido, arginina, pode ser substituído por um aminoácido, exceto arginina. Preferivelmente, com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 38o aminoácido, arginina, pode ser substituído por alanina (R38A).
[0101]Com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL- 2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 42o aminoácido, fenilalanina, pode ser substituído por um aminoácido, exceto fenilalanina. Preferivelmente, com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 42o aminoácido, fenilalanina, pode ser substituído por alanina (F42A).
[0102]Com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL- 2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 45 o aminoácido, tirosina, pode ser substituído por um aminoácido, exceto tirosina. Preferivelmente, com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 45o aminoácido, tirosina, pode ser substituído por alanina (Y45A).
[0103]Com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL- 2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 61o aminoácido, ácido glutâmico, pode ser substituído por um aminoácido, exceto ácido glutâmico.
Preferivelmente, com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 61o aminoácido, ácido glutâmico, pode ser substituído por arginina (E61R).
[0104]Com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL- 2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 72o aminoácido, leucina, pode ser substituído por um aminoácido, exceto leucina. Preferivelmente, com respeito à substituição de aminoácidos para uma variante de IL-2, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, o 72o aminoácido, leucina, pode ser substituído por glicina (L72G).
[0105]Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida por pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste de R38A, F42A, Y45A, E61R e L72G na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[0106]Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida por substituições de aminoácidos em duas, três, quatro ou cinco posições entre as posições selecionadas a partir do grupo que consiste de R38A, F42A, Y45A, E61R e L72G.
[0107]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que dois aminoácidos são substituídos. Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A e F42A. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A e Y45A. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A e Y45A. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, E61R e L72G.
[0108]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que três aminoácidos são substituídos. Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A e Y45A. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, Y45A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, Y45A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A, Y45A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A, Y45A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A, E61R e
L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, Y45A, E61R e L72G.
[0109]Além disso, uma variante de IL-2 pode estar em uma forma em que quatro aminoácidos são substituídos. Especificamente, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A, Y45A e E61R. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A, Y45A e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A, E61R e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, Y45A, E61R e L72G. Além disso, em uma forma de realização, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, F42A, Y45A, E61R e L72G.
[0110]Além disso, uma variante de IL-2 pode ser obtida pelas substituições, R38A, F42A, Y45A, E61R e L72G.
[0111]Preferivelmente, uma forma de realização da variante de IL-2 pode conter qualquer uma selecionada a partir das seguintes combinações de substituição (a) a (d) na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10: (a) R38A/F42A (b) R38A/F42A/Y45A (c) R38A/F42A/E61R (d) R38A/F42A/L72G
[0112]Neste relatório, quando a IL-2 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, uma substituição de aminoácidos pode estar presente em uma posição complementarmente correspondente àquela na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Além disso, mesmo quando a IL-2 é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, uma substituição de aminoácidos pode estar presente em uma posição complementarmente correspondente àquela na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[0113]Especificamente, uma variante de IL-2 pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, 22, 23 ou 24.
[0114]Além disso, uma variante de IL-2 pode ser caracterizada por apresentar baixa toxicidade in vivo. Neste relatório, a baixa toxicidade in vivo pode ser um efeito colateral causado pela ligação de IL-2 à cadeia alfa do receptor de IL-2 (IL-2Rα). Diversas variantes de IL-2 foram desenvolvidas para melhorar o efeito colateral causado pela ligação de IL-2 a IL-2Rα e tais variantes de IL-2 podem ser aquelas divulgadas na Patente U.S. No 5.229.109 e Patente Coreana No 1667096.
Em particular, variantes de IL-2 descritas no presente pedido apresentam baixa capacidade de ligação para a cadeia alfa do receptor de IL-2 (IL-2Rα) e, assim, apresentam toxicidade in vivo menor do que a IL-2 do tipo selvagem.
[0115]Conforme usado neste relatório, o termo “CD80”, também chamado “B7-1”, é uma proteína de membrana presente em células dendríticas, células B ativadas e monócitos. CD80 fornece sinais coestimuladores essenciais para a ativação e sobrevivência de células T. CD80 é conhecida como um ligante para as duas proteínas diferentes, CD28 e CTLA-4, presentes sobre a superfície de células T. CD80 é composta de 288 aminoácidos e pode apresentar especificamente a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Além disso, conforme usado neste relatório, o termo “proteína CD80” refere-se à CD80 de comprimento total ou um fragmento de CD80.
[0116]Conforme usado neste relatório, o termo “fragmento de CD80” refere- se a uma forma clivada de CD80. Além disso, o fragmento de CD80 pode ser um domínio extracelular de CD80. Uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser obtida por meio da eliminação dos 1o ao 34o aminoácidos a partir do terminal N que são uma sequência sinal de CD80. Especificamente, uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser uma proteína composta dos 35 o ao 288o aminoácidos na SEQ ID NO: 11. Além disso, uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser uma proteína composta dos 35o ao 242o aminoácidos na SEQ ID NO: 11. Além disso, uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser uma proteína composta dos 35o ao 232o aminoácidos na SEQ ID NO: 11. Além disso, uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser uma proteína composta dos 35o ao 139o aminoácidos na SEQ ID NO: 11. Além disso, uma forma de realização do fragmento de CD80 pode ser uma proteína composta dos 142o ao 242o aminoácidos na SEQ ID NO: 11. Em uma forma de realização, um fragmento de CD80 pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
[0117]Além disso, a proteína IL-2 e a proteína CD80 podem ser ligadas entre si por intermédio de um ligante ou de um portador. Especificamente, a IL-2 ou uma variante da mesma e a CD80 (B7-1) ou um fragmento da mesma podem ser ligadas entre si por intermédio de um ligante ou de um portador. Na presente descrição, o ligante e o portador podem ser permutavelmente usados.
[0118]O ligante liga duas proteínas. Uma forma de realização do ligante pode incluir 1 a 50 aminoácidos, albumina ou um fragmento da mesma, um domínio Fc de uma imunoglobulina ou semelhantes. Neste relatório, o domínio Fc da imunoglobulina refere-se a uma proteína que contém região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina e não contém regiões variáveis de cadeia pesada e leve e região constante de cadeia leve 1 (CH1) de uma imunoglobulina. A imunoglobulina pode ser IgG, IgA, IgE, IgD ou IgM e pode, preferivelmente, ser IgG4. Neste relatório, domínio Fc da imunoglobulina do tipo selvagem G4 pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
[0119]Além disso, o domínio Fc de uma imunoglobulina pode ser uma variante do domínio Fc, assim como o domínio Fc do tipo selvagem. Além disso, conforme usado neste relatório, o termo “variante do domínio Fc” pode se referir a uma forma que é diferente daquela do domínio Fc do tipo selvagem em termos de padrão de glicosilação, apresenta uma alta glicosilação em comparação ao domínio Fc do tipo selvagem ou apresenta uma baixa glicosilação em comparação ao domínio Fc do tipo selvagem ou uma forma desglicosilada. Além disso, um domínio Fc aglicosilado está incluído no mesmo. O domínio Fc ou uma variante do mesmo pode ser adaptado para apresentar um número ajustado de ácidos siálicos, fucosilações ou glicosilações, através de condições de cultura ou manipulação genética de um hospedeiro.
[0120]Além disso, a glicosilação do domínio Fc de uma imunoglobulina pode ser modificado por métodos convencionais, tais como métodos químicos, métodos enzimáticos e métodos de engenharia genética usando micro-organismos. Além disso, a variante do domínio Fc pode estar em uma forma mista de regiões Fc respectivas de imunoglobulinas, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM. Além disso, a variante do domínio Fc pode estar em uma forma em que alguns aminoácidos do domínio Fc são substituídos por outros aminoácidos. Uma forma de realização da variante do domínio Fc pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
[0121]A proteína de fusão pode apresentar uma estrutura em que, usando um domínio Fc como um ligante (ou portador), uma proteína CD80 e uma proteína IL-2 ou uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 são ligadas ao terminal N e ao terminal C do ligante ou portador, respectivamente (Fig. 89). A ligação entre o terminal N ou o terminal C do domínio Fc e CD-80 ou IL-2 pode ser opcionalmente obtida por um peptídeo ligante.
[0122]Especificamente, uma proteína de fusão pode consistir da seguinte fórmula estrutural (I) ou (II): N’-X-[ligante (1)]n-domínio Fc-[ligante (2)]m-Y-C’ (I) N’-Y-[ligante (1)]n-domínio Fc-[ligante (2)]m-X-C’ (II) Neste relatório, nas fórmulas estruturais (I) e (II), N’ é o terminal N da proteína de fusão,
C’ é o terminal C da proteína de fusão, X é uma proteína CD80, Y é uma proteína IL-2, os ligantes (1) e (2) são peptídeo ligantes e n e m são, independentemente, 0 ou 1.
[0123]Preferivelmente, a proteína de fusão pode consistir da fórmula estrutural (I). A proteína IL-2 é descrita acima. Além disso, a proteína CD80 é descrita acima. De acordo com uma forma de realização, a proteína IL-2 pode ser uma variante de IL-2 com uma a cinco substituições de aminoácidos em comparação à IL-2 do tipo selvagem. A proteína CD80 pode ser um fragmento obtido por truncamento de até cerca de 34 resíduos de aminoácidos contíguos a partir do terminal N ou terminal C da CD80 do tipo selvagem. Alternativamente, a proteína CD pode ser um domínio do tipo imunoglobulina extracelular que apresenta a atividade de ligação aos receptores de superfície de células T CTLA-4 e CD28.
[0124]Especificamente, a proteína de fusão pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 26, 28 ou 30. De acordo com outra forma de realização, a proteína de fusão inclui um polipeptídeo que apresenta uma identidade de sequência de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 26, 28 ou 30. Neste relatório, a identidade é, por exemplo, a porcentagem de homologia e pode ser determinada através de software de comparação de homologia, tal como software BlastN do National Center of Biotechnology Information (NCBI).
[0125]O peptídeo ligante (1) pode ser incluído entre a proteína CD80 e o domínio Fc. O peptídeo ligante (1) pode consistir de 5 a 80 aminoácidos contíguos, 20 a 60 aminoácidos contíguos, 25 a 50 aminoácidos contíguos ou 30 a 40 aminoácidos contíguos. Em uma forma de realização, o peptídeo ligante (1) pode consistir de 30 aminoácidos. Além disso, o peptídeo ligante (1) pode conter pelo menos uma cisteína. Especificamente, o peptídeo ligante (1) pode conter uma, duas ou três cisteínas. Além disso, o peptídeo ligante (1) pode ser derivado da dobradiça de uma imunoglobulina. Em uma forma de realização, o peptídeo ligante (1) pode ser um peptídeo ligante que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
3.
[0126]O peptídeo ligante (2) pode consistir de 1 a 50 aminoácidos contíguos, 3 a 30 aminoácidos contíguos ou 5 a 15 aminoácidos contíguos. Em uma forma de realização, o peptídeo ligante (2) pode ser (G4S)n (onde n é um número inteiro de 1 a 10). Neste relatório, em (G4S)n, n pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma forma de realização, o peptídeo ligante (2) pode ser um peptídeo ligante que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
[0127]Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um dímero obtido por meio da ligação de duas proteínas de fusão, cada uma das quais compreende uma proteína IL-2 e uma proteína CD80. A proteína de fusão compreendendo IL-2 ou uma variante da mesma e CD80 ou um fragmento da mesma é descrita acima.
[0128]Neste relatório, a ligação entre as proteínas de fusão que constituem o dímero pode ser obtida por, mas não é limitada a uma ligação dissulfeto formada por cisteínas presentes no ligante. As proteínas de fusão que constituem o dímero podem ser as mesmas proteínas de fusão ou proteínas de fusão diferentes.
Preferivelmente, o dímero pode ser um homodímero. Uma forma de realização da proteína de fusão que constitui o dímero pode ser uma proteína que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
[0129]Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL- 2 e uma proteína CD80. Especificamente, o polinucleotídeo pode conter a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8, 25, 27 ou 29. A proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 é descrita acima. No polinucleotídeo, um ou mais nucleotídeos podem ser alterados por substituição, deleção, inserção ou uma combinação das mesmas. Quando uma sequência de nucleotídeos é preparada por síntese química, métodos sintéticos bem conhecidos na técnica podem ser usados, tais como aqueles descritos em Engels e Uhlmann (Angew Chem IntEd Eng., 37: 73 a 127, 1988). Tais métodos podem incluir métodos de triéster, fosfito, fosforamidita e H-fosfato, PCR e outros métodos de autoiniciador, sínteses de oligonucleotídeos em suportes sólidos e semelhantes.
[0130]De acordo com uma forma de realização, o polipeptídeo pode conter uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta uma identidade, à SEQ ID NO: 8, 25, 27 ou 29, de pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou pelo menos cerca de 100 %.
[0131]O polinucleotídeo pode conter adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma sequência sinal ou uma sequência líder. Conforme usado neste relatório, o termo “sequência sinal” refere-se a um peptídeo sinal que direciona a secreção de uma proteína alvo. O peptídeo sinal é traduzido e depois clivado em uma célula hospedeira. Especificamente, a sequência sinal é uma sequência de aminoácidos que inicia a migração de uma proteína através da membrana do retículo endoplasmático (ER). Em uma forma de realização, a sequência sinal pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[0132]As sequências sinais são bem conhecidas na técnica quanto às suas características. Tais sequências sinais tipicamente contêm 16 a 30 resíduos de aminoácidos e podem conter mais ou menos resíduos de aminoácidos do que tais resíduos de aminoácidos. Um peptídeo sinal típico é composto de três regiões, isto é, uma região N-terminal básica, uma região hidrofóbica central e uma região C- terminal mais polar. A região hidrofóbica central contém 4 a 12 resíduos hidrofóbicos que fazem com que a sequência sinal seja imobilizada durante a migração de um polipeptídeo imaturo através da bicamada lipídica da membrana.
[0133]Depois da iniciação, as sequências sinais são clivadas no lúmen do ER por enzimas celulares, comumente conhecidas como peptidases sinais. Neste relatório, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal secretória de tPa (ativador do plasminogênio tecidual), HSV gDs (sequência sinal da glicoproteína D do Vírus do herpes simples) ou um hormônio de crescimento. Preferivelmente, uma sequência sinal secretória usada em células eucarióticas superiores, incluindo mamíferos e semelhantes, pode ser usada. Além disso, uma sequência sinal incluída na IL-2 e/ou CD-80 do tipo selvagem pode ser usada ou uma sequência sinal que foi substituída por um códon que apresenta alta frequência de expressão em uma célula hospedeira pode ser usada.
[0134]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor compreendendo o polinucleotídeo.
[0135]O vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira para ser recombinado com e inserido no genoma da célula hospedeira. Ou, o vetor é entendido como meio de ácido nucleico contendo uma sequência de polinucleotídeos que é autonomamente replicável como um epissoma. Os vetores incluem ácidos nucleicos lineares, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, vetores de
RNA, vetores virais e análogos dos mesmos. Exemplos do vetor viral incluem, mas não são limitados aos retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados.
[0136]Especificamente, o vetor pode incluir DNA plasmídico, DNA fágico e semelhantes; e plasmídeos comercialmente desenvolvidos (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP e semelhantes), plasmídeos derivados de E. coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 e semelhantes), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110, pTP5 e semelhantes), plasmídeos derivados de leveduras (YEp13, YEp24, YCp50 e semelhantes), DNA fágico (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λ gt10, λ gt11, λ ZAP e semelhantes), vetores virais de animais (retrovírus, adenovírus, vírus da vacínia e semelhantes), vetores virais de insetos (baculovírus e semelhantes). Visto que o vetor exibe níveis de expressão diferentes e modificação de uma proteína, dependendo de uma célula hospedeira, é preferido selecionar e utilizar uma célula hospedeira que seja mais adequada para o propósito.
[0137]Conforme usado neste relatório, sabe-se que o termo “expressão gênica” ou “expressão” de uma proteína alvo significa a transcrição de sequências de DNA, tradução de transcritos de mRNA e secreção de produtos de proteína de fusão ou fragmentos dos mesmos. Um vetor de expressão útil pode ser RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) ou uma variante do mesmo. Os vetores de expressão podem conter adicionalmente promotor do citomegalovírus (CMV) humano para promover transcrição contínua de um gene alvo em células de mamíferos e uma sequência sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino para aumentar o nível de estabilidade do RNA depois da transcrição.
[0138]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula transformada na qual o vetor foi introduzido.
[0139]Células hospedeiras para a célula transformada podem incluir, mas não são limitadas às células procarióticas, células eucarióticas e células de origem de mamíferos, vegetais, insetos, fúngicas ou bacterianas. Como um exemplo das células procarióticas, E. coli pode ser usada. Além disso, como um exemplo das células eucarióticas, levedura pode ser usada. Além disso, para as células de mamíferos, células CHO, células F2N, células CSO, células BHK, células de melanoma Bowes, células HeLa, células 911, células AT1080, células A549, células HEK 293, células T HEK293 ou semelhantes podem ser usadas. Entretanto, as células de mamíferos não são limitadas às mesmas e quaisquer células que são conhecidas aos técnicos no assunto que possam ser utilizáveis como células hospedeiras de mamíferos podem ser usadas.
[0140]Além disso, para a introdução de um vetor de expressão na célula hospedeira, precipitação com CaCl2, o método de Hanahan, cuja eficácia foi aumentada usando um agente redutor, tal como sulfóxido de dimetila (DMSO) na precipitação com CaCl2, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, fusão de protoplastos, agitação usando fibra de carbureto de silício, transformação mediada por Agrobactérias, transformação usando PEG, transformação mediada por sulfato de dextrano, Lipofectamina ou a seco/inibição ou semelhantes podem ser usados.
[0141]Conforme descrito acima, para a otimização de propriedades de uma proteína de fusão como um agente terapêutico ou para qualquer outro propósito, padrão de glicosilação da proteína de fusão (por exemplo, ácidos siálicos, fucosilações, glicosilações) pode ser ajustado por meio de manipulação, através de métodos conhecidos aos técnicos no assunto, genes relacionados à glicosilação possuídos por células hospedeiras.
[0142]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80, o método compreendendo cultivar as células transformadas.
Especificamente, o método de produção pode compreender i) cultivar as células transformadas para obter uma cultura; e ii) coletar a proteína de fusão a partir da cultura.
[0143]O cultivo das células transformadas pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica. Especificamente, a cultura pode ser realizada em um processo de batelada ou realizado continuamente em um processo de batelada alimentada ou batelada alimentada repetida.
[0144]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir câncer ou uma doença infecciosa e/ou para aumentar a eficácia no tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa, a composição compreendendo, como um ingrediente ativo, uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 ou um dímero da proteína de fusão onde as duas proteínas de fusão são ligadas.
[0145]A proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 ou o dímero da proteína de fusão onde as duas proteínas de fusão são ligadas é descrita acima.
[0146]O câncer pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer cervical, câncer da tireoide, câncer de laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de glândulas salivares e linfoma. Além disso, a doença infecciosa pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste de infecção por hepatite B, hepatite C, papilomavírus humano (HPV), infecção por citomegalovírus, doença respiratória viral e influenza.
[0147]Uma dose preferida da composição farmacêutica varia, dependendo da condição e peso corpóreo do paciente, gravidade da doença, forma do fármaco,
via e duração de administração e pode ser apropriadamente selecionada pelos técnicos no assunto. Na composição farmacêutica para tratar ou prevenir câncer ou uma doença infecciosa da presente invenção, o ingrediente ativo pode estar contido em qualquer quantidade (quantidade eficaz), dependendo da aplicação, forma de dosagem, propósito da combinação e semelhantes, contanto que o ingrediente ativo possa exibir atividade anticâncer ou um efeito terapêutico sobre uma doença infecciosa. Uma quantidade eficaz convencional da mesma será determinada dentro de uma faixa de 0,001 % a 20,0 % em peso, com base no peso total da composição.
Neste relatório, o termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de um ingrediente ativo capaz de induzir um efeito anticâncer ou um efeito de tratamento da doença infecciosa. Tal quantidade eficaz pode ser experimentalmente determinada no escopo do conhecimento comum dos técnicos no assunto.
[0148]Conforme usado neste relatório, o termo “tratamento” pode ser usado para significar tratamento terapêutico e profilático. Neste relatório, profilaxia pode ser usada para significar que uma condição ou doença patológica de um indivíduo é aliviada ou mitigada. Em uma forma de realização, o termo “tratamento” inclui aplicação ou qualquer forma de administração para tratar uma doença em um mamífero, incluindo um ser humano. Além disso, o termo inclui inibir ou reduzir uma doença ou progressão da doença; e inclui meios de restaurar ou reparar função prejudicado ou perdida, de modo que uma doença seja parcial ou completamente aliviada; estimular processos ineficazes; ou aliviar uma doença grave.
[0149]Conforme usado neste relatório, o termo “eficácia” refere-se à capacidade que pode ser determinada por um ou mais parâmetros, por exemplo, sobrevivência ou sobrevivência sem doença durante um determinado período de tempo, tal como um ano, cinco anos ou dez anos. Além disso, o parâmetro pode incluir a inibição do tamanho de pelo menos um tumor em um indivíduo.
[0150]Parâmetros farmacocinéticos, tais como biodisponibilidade e parâmetros subjacentes, tais como taxa de depuração, também podem afetar a eficácia. Assim, a “eficácia acentuada” (por exemplo, melhoria na eficácia) pode ocorrer, devido aos parâmetros farmacocinéticos acentuados e eficácia melhorada, que podem ser medidos comparando a taxa de depuração e o crescimento do tumor em animais de teste ou em seres humanos ou comparando os parâmetros, tais como sobrevivência, recorrência ou sobrevivência sem doença.
[0151]Conforme usado neste relatório, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um composto ou composição eficaz para prevenir ou tratar a doença em questão, que seja suficiente para tratar a doença em uma razão risco/benefício razoável aplicável ao tratamento médico e não causar efeitos adversos. Um nível da quantidade eficaz pode ser determinado, dependendo de fatores, incluindo a condição de saúde do paciente, tipo e gravidade da doença, atividade do fármaco, sensibilidade do paciente ao fármaco, modo de administração, tempo de administração, via de administração e taxa de excreção, duração do tratamento, formulação ou, simultaneamente, fármacos usados e outros fatores bem conhecidos no campo médico. Em uma forma de realização, a quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de fármaco eficaz para tratar câncer.
[0152]Neste relatório, a composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável. O portador farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer portador, contanto que o portador seja uma substância não tóxica adequada para a liberação a um paciente. Água destilada, álcool, gordura, cera e sólido inerte podem estar contidos como o portador. Um adjuvante farmaceuticamente aceitável (tampão, dispersante) também pode estar contido na composição farmacêutica.
[0153]Especificamente, incluindo um portador farmaceuticamente aceitável, além do ingrediente ativo, a composição farmacêutica pode ser preparada em uma formulação parenteral, dependendo de sua via de administração, usando métodos convencionais conhecidos na técnica. Neste relatório, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa que o portador não apresenta mais toxicidade do que o indivíduo a ser aplicado (prescrito) pode adaptar sem inibir a atividade do ingrediente ativo.
[0154]Quando a composição farmacêutica é preparada em uma formulação parenteral, pode ser feita em preparações na forma de injeções, emplastros transdérmicos, inalantes nasais ou supositórios com portadores adequados, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em um caso de ser feita em injeções, água estéril, etanol, poliol, tal como glicerol ou propileno glicol ou uma mistura dos mesmos podem ser usados como um portador adequado; e uma solução isotônica, tal como solução de Ringer, solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo trietanol amina ou água estéril para injeção e dextrose 5 % ou semelhantes, pode ser preferivelmente usada. A formulação das composições farmacêuticas é conhecida na técnica e referência pode ser especificamente feita a Remington’s Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995) e semelhantes. Este documento é considerado parte da presente descrição.
[0155]Uma dose preferida da composição farmacêutica pode variar de 0,01 µg/kg a 10 g/kg ou 0,01 mg/kg a 1 g/kg, por dia, dependendo da condição, peso corpóreo, sexo, idade do paciente, gravidade da condição do paciente e via de administração. A dose pode ser administrada uma vez ao dia ou pode ser dividida em várias vezes a dia. Tal dose não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção em qualquer aspecto.
[0156]Indivíduos aos quais a composição farmacêutica pode ser aplicada (prescrita) são mamíferos e seres humanos, com seres humanos sendo particularmente preferidos. Além do ingrediente ativo, a composição farmacêutica do presente pedido pode conter adicionalmente qualquer composto ou extrato natural, que já foi validado quanto à segurança e é conhecido por apresentar atividade anticâncer ou um efeito terapêutico sobre uma doença infecciosa, de modo a aumentar ou reforçar a atividade anticâncer.
[0157]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 para tratar câncer ou uma doença infecciosa.
[0158]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 para acentuar um efeito terapêutico sobre câncer ou uma doença infecciosa.
[0159]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um uso de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 para a fabricação de um medicamento para tratar câncer ou uma doença infecciosa.
[0160]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratar câncer ou uma doença infecciosa e/ou um método para acentuar um efeito terapêutico sobre câncer ou uma doença infecciosa, compreendendo administrar, a um indivíduo, uma proteína de fusão compreendendo uma proteína IL- 2 e uma proteína CD80 ou um dímero da proteína de fusão onde as duas proteínas de fusão são ligadas.
[0161]O indivíduo pode ser aquele que sofre de câncer ou uma doença infecciosa. Além disso, o indivíduo pode ser um mamífero, preferivelmente, um ser humano. A proteína de fusão compreendendo uma proteína IL-2 e uma proteína CD80 ou o dímero da proteína de fusão onde as duas proteínas de fusão são ligadas é descrita acima.
[0162]A via de administração, dose e frequência de administração da proteína de fusão ou dímero da proteína de fusão podem variar, dependendo da condição do paciente e da presença ou ausência de efeitos colaterais e, assim, a proteína de fusão ou dímero da proteína de fusão pode ser administrada a um indivíduo de várias maneiras e quantidades. O método de administração, dose e frequência de administração ideais podem ser selecionados em uma faixa apropriada pelos técnicos no assunto. Além disso, a proteína de fusão ou dímero da proteína de fusão pode ser administrada em combinação com outros fármacos ou substâncias fisiologicamente ativas, cujo efeito terapêutico é conhecido com respeito a uma doença a ser tratada, ou pode ser formulada na forma de preparações de combinação com outros fármacos.
[0163]Devido à atividade de IL-2, a proteína de fusão, em uma forma de realização da presente invenção, pode ativar células imunes, tais como células matadoras naturais. Assim, a proteína de fusão pode ser eficazmente usada para câncer e doenças infecciosas. Em particular, foi identificado que, em comparação ao tipo selvagem, uma variante de IL-2 com duas a cinco substituições de aminoácidos, em particular, uma variante de IL-2 que contém substituições de aminoácidos em duas, três, quatro ou cinco posições entre as posições selecionadas a partir do grupo que consiste de R38A, F42A, Y45A, E61R e L72G, apresenta baixa capacidade de ligação para a cadeia alfa do receptor de IL-2 e, assim, exibe características melhoradas com respeito aos efeitos colaterais farmacológicos da IL- 2 convencional. Assim, tal variante de IL-2, quando usada sozinha ou na forma de uma proteína de fusão, pode diminuir a incidência de síndrome do vazamento vascular (ou capilar) (VLS), um problema com a IL-2 convencionalmente conhecida.
[0164]Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhes por via dos exemplos seguintes. Entretanto, os exemplos seguintes são apenas para ilustrar a presente invenção e o escopo da presente invenção não é limitado aos mesmos.
I. Preparação da proteína de fusão
Exemplo de Preparação 1. Preparação da variante hCD80-Fc-IL-2 (2M): GI101
[0165]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano, um domínio Fc e uma variante de IL-2, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 8) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) que apresenta duas substituições de aminoácidos, nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 9.
Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO 2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI101”.
[0166]A purificação foi realizada usando cromatografia contendo resina de proteína A MabSelect SuRe. A proteína de fusão foi ligada à mesma sob uma condição de Tris 25 mM, NaCl 25 mM, pH 7,4. Depois, eluição foi realizada com NaCl 100 mM, ácido acético 100 mM, pH 3. Tris-HCl 1 M 20 % no pH 9 foi colocado em um tubo de coleta e, depois, a proteína de fusão foi coletada. Para a proteína de fusão coletada, o tampão foi trocado através de diálise com tampão PBS durante 16 horas.
[0167]Posteriormente, a absorvância no comprimento de onda de 280 nm foi medida, com o passar do tempo, com cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience), para obter uma proteína de fusão altamente concentrada. Neste relatório, a proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 6).
Foi identificado que a proteína de fusão estava contida em uma concentração de 2,78 mg/ml quando detectada com NanoDrop (Fig. 7). Além disso, os resultados obtidos por análise usando cromatografia de exclusão por tamanho são fornecidos na Fig. 8.
Exemplo de Preparação 2. Preparação da variante mCD80-Fc-IL-2 (2M): mGI101
[0168]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo uma CD80 de camundongo, um domínio Fc e uma variante de IL-2, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 14) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), uma mCD80 (SEQ ID NO: 13), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) com duas substituições de aminoácidos, nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 15. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “mGI101”.
[0169]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 9). Foi descoberto que a proteína de fusão estava contida em uma concentração de 1,95 mg/ml quando detectada por absorvância em 280 nm usando NanoDrop.
Exemplo de Preparação 3. Preparação de hCD80-Fc: GI101C1
[0170]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano e um domínio Fc, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific.
Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 16) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3) e um domínio Fc (SEQ ID NO: 4). O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHO TM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 17. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI101C1”.
[0171]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 10). Foi observado que a proteína de fusão estava contida em uma concentração de 3,61 mg/ml quando detectada por absorvância em 280 nm usando NanoDrop.
Exemplo de Preparação 4. Preparação da variante Fc-IL-2 (2M): GI101C2
[0172]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um domínio Fc e uma variante de IL-2, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific.
Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID
NO: 18) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) com duas substituições de aminoácidos, nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHO TM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 19. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI101C2”.
[0173]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 11). Foi descoberto que a proteína de fusão estava contida em uma concentração de 4,79 mg/ml quando detectada por absorvância em 280 nm usando NanoDrop.
Exemplo de Preparação 5. Preparação de mCD80-Fc: mGI101C1
[0174]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um camundongo CD80 e um domínio Fc, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific.
Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 20) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), uma mCD80 (SEQ ID NO: 13), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3) e um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 21. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125
RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “mGI101C1”.
[0175]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 12). Foi observado que a proteína de fusão estava contida em uma concentração de 2,49 mg/ml quando detectada por absorvância em 280 nm usando NanoDrop.
[0176]A proteínas de fusão preparadas nos Exemplos de Preparação 1 a 5 são resumidos na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1 Item terminal N Ligante terminal C Exemplo de fragmento de Preparação 1 domínio Fc hIL-2m hCD80 (GI101) Exemplo de fragmento de Preparação 2 domínio Fc hIL-2m mCD80 (mGI101) Exemplo de Preparação 3 fragmento de CD80 domínio Fc - (GI101C1) Exemplo de Preparação 4 - domínio Fc IL-2m (GI101C2) Exemplo de fragmento de domínio Fc - Preparação 5 mCD80
(mGI101C1) Exemplo de Preparação 6. Preparação de CD80-Fc-IL-2: GI101w
[0177]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano, um domínio Fc e uma IL-2 humana, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 31) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e IL-2 humana madura (SEQ ID NO: 10), nesta ordem, a partir do terminal N.
O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido nas células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO:
32. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI101w”. A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1.
Exemplo de Preparação 7. Preparação da variante hCD80-Fc-IL-2 (3M): GI102-M45
[0178]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano, um domínio Fc e uma variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, Y45A) (GI102-M45) com três substituições de aminoácidos, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 25) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2),
uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (SEQ ID NO: 22), nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 26. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI102-M45”.
[0179]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 13).
Exemplo de Preparação 8. Preparação da variante hCD80-Fc- IL-2 (3M): GI102-M61
[0180]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano, um domínio Fc e uma variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) com três substituições de aminoácidos, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 27) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (SEQ ID NO: 23), nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido nas células CHO (Expi-CHO TM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 28. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI102-M61”.
[0181]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 14).
Exemplo de Preparação 9. Preparação de hCD80-Fc-IL-3M: GI102-M72
[0182]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 humano, um domínio Fc e uma variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, L72G) (GI102-M72) com três substituições de aminoácidos, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 29) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (SEQ ID NO: 24), nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHOTM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 30. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “GI102-M72”.
[0183]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1. A proteína de fusão isolada e purificada foi submetida a SDS-PAGE sob condição reduzida (R) ou não reduzida (NR) e pigmentada com Coomassie Blue para verificar sua pureza (Fig. 15).
Exemplo de Preparação 10. Preparação de mCD80-Fc-IL-3M: mGI102-M61
[0184]De modo a produzir uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de CD80 de camundongo, um domínio Fc e uma variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) com três substituições de aminoácidos, um polinucleotídeo foi sintetizado através do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis da ThermoFisher Scientific. Especificamente, o polinucleotídeo contém uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 33) que codifica uma proteína de fusão que contém um peptídeo sinal (SEQ ID NO: 1), um fragmento de mCD80 (SEQ ID NO: 13), uma dobradiça de Ig (SEQ ID NO: 3), um domínio Fc (SEQ ID NO: 4), um ligante (SEQ ID NO: 5) e uma variante de IL-2 (SEQ ID NO: 23), nesta ordem, a partir do terminal N. O polinucleotídeo foi inserido no vetor pcDNA3_4. Além disso, o vetor foi introduzido em células CHO (Expi-CHO TM) para expressar a proteína de fusão da SEQ ID NO: 34. Depois que o vetor foi introduzido, a cultura foi realizada durante 7 dias em um meio de 37 °C, 125 RPM e concentração de CO2 8 %. Depois, a cultura foi coletada e a proteína de fusão foi purificada a partir da mesma. A proteína de fusão purificada foi designada “mGI102-M61”.
[0185]A purificação e coleta da proteína de fusão foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo de Preparação 1.
II. Identificação da afinidade de ligação entre proteína de fusão e seu ligante
[0186]De modo a identificar a afinidade de ligação entre a proteína de fusão e seu ligante, a afinidade de ligação foi medido usando Octet RED 384.
Exemplo Experimental 1. Identificação da afinidade de ligação entre hCTLA- 4 e GI101
[0187]O biossensor AR2G (Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092) foi previamente hidratado com 200 μl de água destilada em uma microplaca de 96 poços (GreinerBio-one, Cat: 655209). Um ligante (CTLA-4, CTLA-4/CD152 Humana, His tag, Sino Biological, Cat: 11159-H08H) a ser ligado ao biossensor AR2G foi diluído com tampão acetato 10 mM (pH 5, Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-
5095) para uma concentração de 5 μg/ml. Além disso, GI101 a ser ligada ao ligante foi diluída com tampão cinético AR2G 1X (Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18- 5095) para uma concentração de 1.000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM ou 62,5 nM.
Tampão de ativação foi preparado por meio da mistura de EDC 20 mM e s-NHS 10 mM (Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) em água destilada. 80 μl de cada reagente foram colocados em uma microplaca de 384 poços (Greiner Bio-one, Cat: 781209) e o programa foi instalado.
[0188]Como um resultado, a afinidade de ligação entre hCTLA-4 e GI101 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 16.
Exemplo Experimental 2. Identificação da afinidade de ligação entre hPD- L1/GI101 e hPD-L1/PD-1
[0189]Ni-NTA (Tris-NTA carregado com Níquel, Biossensores Ni-NTA, ForteBio, 18-5101) foi previamente hidratado com 200 μl de tampão cinético Ni-NTA 1X (tampão Kinetics 10X, ForteBio, 18-1042) em uma microplaca de 96 poços (GreinerBio-one, Cat: 655209). Um ligante (proteína PD-L1/B7-H1 Humana, His-tag, Sino biological, Cat: 10084-H08H) a ser ligado aos Biossensores Ni-NTA foi diluído com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 5 μg/ml. GI101 a ser ligada ao ligante foi diluída com tampão cinético Ni-NTA 1X em 1.000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM ou 62,5 nM. Além disso, PD-1/PDCD1 humana (PD-1/PDCD1 Humana, Fc Tag, Sino Biological, Cat: 10377-H02H) a ser ligada ao ligante foi diluída com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 2.000 nM, 1.000 nM, 500 nM, 250 nM ou 125 nM. Depois, 80 μl de cada reagente foram colocados em uma microplaca de 384 poços e o programa foi instalado.
[0190]Como um resultado, a afinidade de ligação entre hPD-L1 e GI101 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 17. Além disso, a afinidade de ligação entre hPD- L1 e hPD-1 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 18.
Exemplo Experimental 3. Identificação da afinidade de ligação entre mCTLA- 4 e mGI101
[0191]A afinidade de ligação entre mCTLA-4 e mGI101 foi examinada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 1. Neste relatório, o equipamento usado é o seguinte: Biossensor: AR2G, Ligante: mCTLA-4 (quimera Fc de CTLA-4 de Camundongo Recombinante, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Analito: mGI101 (500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, 31,3 nM).
[0192]Como um resultado, a afinidade de ligação entre mCTLA-4 e mGI101 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 19.
Exemplo Experimental 4. Identificação da afinidade de ligação entre mPD-L1 e mGI101
[0193]A afinidade de ligação entre mPD-L1 e mGI101 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 1. Neste relatório, o equipamento usado é o seguinte. Biossensor: AR2G, Ligante: mPD-L1 (quimera Fc de B7-H1/PD- L1 de Camundongo Recombinante, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Analito: mGI101 (500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, 31,3 nM).
[0194]Como um resultado, a afinidade de ligação entre mPD-L1 e mGI101 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 20.
Exemplo Experimental 5. Identificação da capacidade de ligação de GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) a CTLA-4 e PD-L1
[0195]Medições da cinética de ligação foram realizadas usando o instrumento Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) com agitação a 30 °C e
1.000 rpm. A capacidade de ligação para CTLA-4 foi medida usando o chip biossensor Amine Reactive 2 generation (AR2G) e a capacidade de ligação para PD-L1 foi medida usando o chip biossensor Tris-NTA (Ni-NTA) carregado com níquel. O chip biossensor AR2G foi ativado com uma combinação de EDC 400 mM e sulfo-NHS 100 mM. Depois, CTLA-4-His Tag humana (Sino Biological, Cat: 11159-
H08H) foi diluída com tampão acetato 10 mM (pH 5) a 5 μg/ml e carregada no chip biossensor AR2G durante 300 segundos e fixada.
[0196]Depois, a ligação de CTLA-4 a GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v), GI-101C1 (hCD80-Fc), Ipilimumabe (Bristol-Myers Squibb) e GI-101C2 (Fc-hIL-2v) em várias concentrações foi medida durante 300 segundos e a dissociação da mesma também foi medida durante 300 segundos. Por outro lado, PD-L1-His Tag humana (Sino Biological, Cat: 10084-H08H) foi diluída com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 5 µg/ml e carregada no chip biossensor Ni-NTA durante 600 segundos e fixada. Depois, a ligação de PD-L1 a GI-101, GI-101C1, hPD-1-Fc (Sino Biological, Cat: 10377-H02H) e GI101C2 em várias concentrações foi medida durante 300 segundos e a dissociação da mesma também foi medida durante 300 segundos. A análise da cinética de ligação foi realizada usando o software Octet Data Analysis HT ver. 10 fornecido pela Pall Corporation. Os resultados são ilustrados nas Figs. 21 e 22.
Exemplo Experimental 6. Identificação do efeito de GI-101 (hCD80-Fc-hIL- 2v) sobre a ligação de PD-1/PD-L1
[0197]Um experimento de bloqueio foi realizado usando o instrumento Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) com agitação a 30 °C e 1.000 rpm. PD-L1-His Tag humana (Sino Biological, Cat: 10084-H08H) foi diluída com tampão cinético Ni- NTA 1X para uma concentração de 5 µg/ml e carregada no chip biossensor Ni-NTA durante 600 segundos e fixada. De modo a prosseguir com o experimento de bloqueio, hPD-L1 fixada no chip biossensor foi ligada a GI-101 em várias concentrações (300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM e 0 nM) durante 600 segundos e, depois, novamente ligada à PD-1 humana competidora (100 nM) durante 600 segundos, de modo a medir quanto mais hPD-1 pode se ligar à mesma.
ao contrário, hPD-L1 foi ligada a hPD-1 em várias concentrações (300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM e 0 nM) durante 600 segundos e, depois, novamente ligada à GI-101 competidora (100 nM) durante 600 segundos, de modo a medir quanto mais GI-101 pode se ligar à mesma. O experimento de bloqueio foi analisado usando o menu de escaneamento de epítopos do software Octet Data Analysis HT ver. 10 fornecido pela Pall Corporation. Os resultados são ilustrados na Fig. 23.
Exemplo Experimental 7. Identificação da afinidade de ligação entre IL-2Rα ou IL-2Rβ e GI101
[0198]A capacidade de ligação para IL-2Rα foi medida usando o biossensor AR2G e a capacidade de ligação para IL-2Rβ foi medida usando os biossensores Ni- NTA (Tris-NTA carregado com Níquel, Biossensores Ni-NTA, ForteBio, 18-5101).
[0199]Um ligante (IL-2Rα-His Tag, Acro, Cat: ILA-H52H9) a ser ligado ao biossensor AR2G foi diluído com tampão acetato 10 mM (pH 5, Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) para uma concentração de 5 μg/ml. O biossensor AR2G foi ativado com um tampão preparado por meio da mistura de EDC 400 mM e sulfo-NHS 100 mM e, depois, o ligante diluído foi carregado sobre o biossensor AR2G durante 300 segundos e fixado.
[0200]Entretanto, um ligante (IL-2Rβ-His Tag, Acro, Cat: CD2-H5221) a ser ligado ao biossensor Ni-NTA foi diluído com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 5 μg/ml. O ligante diluído foi carregado sobre o biossensor Ni-NTA durante 600 segundos e fixado.
[0201]Posteriormente, GI101, GI101w ou Proleucina (Novartis, hIL-2), em várias concentrações, a ser ligada ao ligante, foi carregada sobre o mesmo durante 300 segundos. Depois, a ligação da mesma foi medida e a dissociação da mesma também foi medida durante 300 segundos. A análise da cinética de ligação foi realizada usando software Octet Data Analysis HT ver. 10 fornecido pela Pall Corporation. Os resultados são ilustrados nas Figs. 24 a 26.
[0202]Como um resultado, foi identificado que GI101 apresenta baixa capacidade de ligação para a cadeia alfa do receptor de IL-2, IL-2Rα, e alta capacidade de ligação para IL-2Rβ, em comparação a GI101w e Proleucina.
Exemplo Experimental 8. Medição da afinidade de ligação entre a proteína de fusão e o ligante
[0203]De modo a identificar a afinidade de ligação entre a proteína de fusão e seu ligante, a afinidade de ligação foi medida usando Octet RED 384.
Exemplo Experimental 8.1. Identificação da afinidade de ligação entre o receptor de IL2 alfa e GI101-M45, GI101-M61 ou GI101-M72
[0204]O biossensor AR2G (Amina Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092) foi previamente hidratado com 200 μl de água destilada (DW) em uma microplaca de 96 poços (GreinerBio-one, Cat: 655209). Um ligante (proteína IL-2 R alfa humana, His Tag, Acro, ILA-H52H9) a ser ligada ao biossensor foi diluída com tampão acetato 10 mM (pH 5) (Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) para uma concentração de 5 μg/ml. Um analito (GI101-M45, GI101-M61, GI101-M72) a ser ligado ao ligante foi diluído com tampão cinético AR2G 1X (Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) a 500 nM, 250 nM, 125 nM e 62,5 nM, respectivamente.
Tampão de ativação foi preparado por meio da mistura de EDC 20 mM e s-NHS 10 mM (Kit de reagente AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) em DW. 80 μl de cada reagente foram colocados em uma microplaca de 384 poços (Greiner Bio-one, Cat: 781209) e o programa foi instalado.
[0205]Como um resultado, a afinidade de ligação entre receptor de IL2 alfa e GI101-M45 é ilustrada na Fig. 27. Além disso, a afinidade de ligação entre o receptor de IL2 alfa e GI101-M61 é ilustrada na Fig. 28 e a afinidade de ligação entre o receptor de IL2 alfa e GI101-M72 é ilustrada na Fig. 29.
Exemplo Experimental 8.2. Identificação da afinidade de ligação de GI102- M45, GI102-M61 e GI102-M72 à IL-2Rβ
[0206]Biossensores Ni-NTA foram previamente hidratados com 200 μl de tampão cinético Ni-NTA 1X (tampão Kinetics 10X, ForteBio, 18-1042) em uma microplaca de 96 poços. Um ligante (proteína IL-2 R beta humana, His-Tag, Acro, CD2-H5221) a ser ligado ao biossensor foi diluído com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 2 μg/ml. GI102-M45, GI102-M61 ou GI102-M72 a ser ligada ao ligante foi diluída com tampão cinético Ni-NTA 1X para uma concentração de 500 nM, 250 nM, 125 nM ou 62,5 nM. 80 μl de cada reagente foram colocados em uma microplaca de 384 poços e o programa foi instalado.
[0207]Como um resultado, a afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M45 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 30, e a afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M61 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 31. Além disso, a afinidade de ligação entre IL-2Rβ e GI102-M72 foi medida, conforme ilustrado na Fig. 32.
III. Identificação da atividade imune da proteína de fusão Exemplo Experimental 9. Identificação da produção de IFN-γ causada pela proteína de fusão Exemplo Experimental 9.1. Cultura de PBMCs marcadas com CFSE
[0208]As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas a partir de um ser humano foram marcadas com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) ao reagir com corante CellTrace CFSE 1 μM a 37 °C durante 20 minutos. CFSE não ligado às células foi removido ao reagir durante 5 minutos com um meio de cultura com um volume 5 vezes da solução de reação de pigmentação e, depois, centrifugar em 1.300 rpm durante 5 minutos. As PBMCs marcadas com CFB foram recolocadas em suspensão no meio de cultura (meio RPMI1640 contendo FBS 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sódio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 μM, aminoácido não essencial 1 mM e L-glutamina 2 mM) e, depois, adicionadas a uma placa de 96 poços em 1 x 10 5 células por poço. O tratamento com 5 μg/ml de PHA (Lactina da Phaseolus Vulgaris,
feijão vermelho, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Cat. No L1668-5MG) e GI101, GI101C1, GI101C2 ou IL-2 (Aldesleucina; IL-2 recombinante humana, Novartis) foi realizado e a incubação foi realizada em uma incubadora de CO2 5 % a 37 °C durante 6 dias.
[0209]Neste relatório, o tratamento com GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 foi realizado em uma concentração de 1 nM, 10 nM ou 100 nM. As células foram analisadas por FACS e IFN-γ humano presente no meio de cultura foi medido usando um kit ELISA (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat. No 430103).
Exemplo Experimental 9.2. Análise FACS
[0210]As pelotas celulares obtidas por meio da remoção do sobrenadante foram lavadas com tampão FACS (FBS 3 %, EDTA 10 mM, HEPES 1 M, Penicilina Estreptomicina 100 unidades/mL, 10 μg/ml, piruvato de sódio 1 mM) e, depois, reagidas com bloqueador de Fc (Biolegend, Cat. No 422302) a 4 °C durante 5 minutos. Depois, o tratamento com Ab anti-CD3 APC (Biolegend, Cat. No 300412) e Ab anti-CD8a PE (Biolegend, Cat. No 300908) foi realizado e a reação foi deixada prosseguir a 4 °C durante 20 minutos. Depois, o produto resultante foi lavado com tampão FACS. As pelotas celulares foram recolocadas em suspensão em tampão FACS e, depois, analisadas usando BD LSR Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) e software FlowJo.
Exemplo Experimental 9.3. ELISA para IFN-γ Humano
[0211]A quantidade de IFN-γ humano secretado no sobrenadante de cada amostra na qual as células foram cultivadas foi medida usando um kit ELISA para IFN-γ humano (Biolegend, Cat. No 430103). Brevemente, os anticorpos anti- humanos-IFN-γ foram adicionados a uma placa de ELISA e a reação foi deixada prosseguir durante a noite a 4 °C, de modo que estes anticorpos foram revestidos sobre a mesma. Depois, o bloqueio foi realizado na temperatura ambiente durante 1 hora com uma solução de PBS à qual BSA 1 % foi adicionado. A lavagem com um tampão de lavagem (Tween-20 0,05 % em PBS) foi realizada e, depois, uma solução padrão e cada amostra foram adequadamente diluídas e adicionadas ao mesmo.
Depois, a reação foi deixada prosseguir na temperatura ambiente durante 2 horas.
[0212]Depois que a reação foi concluída, a placa foi lavada e anticorpos secundários (anticorpos de detecção) foram adicionados à mesma. A reação foi deixada prosseguir na temperatura ambiente durante 1 hora. A lavagem com um tampão de lavagem foi realizada e, depois, uma solução de Avidina-HRP foi adicionado ao mesmo. A reação foi deixada prosseguir na temperatura ambiente durante 30 minutos. Uma solução de substrato foi adicionada à mesma e reação de desenvolvimento de cor foi induzida no escuro na temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, H2SO4 foi adicionado à mesma para interromper a reação de desenvolvimento de cor e a absorvância em 450 nm foi medida com Espectrofotômetro Epoch Microplate (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA).
[0213]Como um resultado, foi descoberto que as células tratadas com GI101 exibiram um aumento notável na secreção de IFN-γ em comparação às células tratadas com GI101C1, GI101C2 ou IL-2 (Figs. 33 e 34).
Exemplo Experimental 10. Identificação do efeito de GI101 sobre a proliferação de células T CD8+
[0214]As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas a partir de um ser humano foram marcadas com CFSE ao reagir com corante CellTrace CFSE 1 μM a 37 °C durante 20 minutos. CFSE não ligado às células foi removido ao reagir durante 5 minutos com um meio de cultura com um volume 5 vezes da solução de reação de pigmentação e, depois, centrifugar em 1.300 rpm durante 5 minutos. As PBMCs marcadas com CFB foram recolocadas em suspensão no meio de cultura (meio RPMI1640 contendo FBS 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sódio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 μM, aminoácido não essencial 1 mM e L-glutamina 2 mM) e, depois, adicionadas a uma placa de 96 poços em 1 x 105 células por poço.
[0215]Posteriormente, o tratamento com 1 μg/ml de anticorpo anti-CD3ε (Biolegend Cat. No L1668-5MG) e GI101, GI101C1, GI101C2 ou Proleucina (Novartis) foi realizado e a incubação foi realizada em uma incubadora de CO2 5 % a 37 °C durante 6 dias. Neste relatório, as células foram tratadas com GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 em uma concentração de 100 nM. As células incubadas foram examinadas quanto ao seu grau de proliferação por medição, com análise FACS usando os anticorpos APC-TCRαβ e PE-CD8α, de uma proporção de células T CD8+ que não foram marcadas com CFSE.
[0216]Como um resultado, foi descoberto que GI101 ativou a proliferação de células T CD8+ in vitro em um grau similar à IL-2 do tipo selvagem Proleucina (Figs.
35 e 36).
Exemplo Experimental 11. Identificação do efeito de GI101 e GI102 sobre a proliferação de células T CD8+
[0217]PBMCs humanas foram adquiridas a partir da Allcells (Lote # 3014928, USA). Corante CellTrace CFSE 1 M foi usado, o qual foi reagido com as PBMCs humanas sob uma condição de bloqueio de luz na temperatura ambiente durante 20 minutos. As células foram marcadas com CFSE ao reagir com corante CellTrace CFSE 1 µM a 37 °C durante 20 minutos. CFSE não ligado às células foi removido ao reagir durante 5 minutos com meio de cultura com um volume 5 vezes da solução de reação de pigmentação e, depois, centrifugar em 1.300 rpm durante 5 minutos. As PBMCs marcadas com CFB foram recolocadas em suspensão no meio de cultura (meio RPMI1640 contendo FBS 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sódio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 μM, aminoácido não essencial 1 mM e L-glutamina 2 mM) e, depois, adicionadas a uma placa de 96 poços em 1 x 105 células por poço.
[0218]Posteriormente, as PBMCs marcadas com CFB foram submetidas ao tratamento com 1 μg/ml de anticorpo anti-CD3ε (OKT3, eBioscience, USA) e GI101, GI101C1, GI101C2 ou Proleucina (Novartis) e a incubação foi realizada em uma incubadora de CO2 5 % a 37 °C durante 7 dias. Neste relatório, as células foram submetidas ao tratamento com GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 em uma concentração de 10 µM.
[0219]As células incubadas foram examinadas quanto ao seu grau de proliferação pela medição, com análise FACS usando anticorpo CD4-PE anti- humano (BioLegend, USA), anticorpo CD8-PE/Cy7 anti-humano (BioLegend, USA) e anticorpo FoxP3-APC anti-humano (BioLegend, USA), uma proporção de células T CD8+ que não foram marcadas com CFSE.
[0220]Como um resultado, os grupos de tratamento GI101, GI102_M61, GI101C2 e Proleucina exibiram um aumento significante na proporção de células T CD8+, em comparação ao grupo controle (sem estímulo), o grupo de tratamento anticorpo anti-CD3 sozinho e o grupo de tratamento GI101C1. Além disso, em comparação ao grupo controle negativo (sem estímulo) e ao grupo de tratamento anti-CD3 sozinho, os grupos de tratamento GI101, GI101C2 e Proleucina exibiram um aumento significante na proliferação de células Treg CD4+/FoxP3+, ao passo que os grupos de tratamento GI102 e GI101C1 não exibiram um aumento significante na proliferação de células Treg CD4+/FoxP3+ (Fig. 37).
Exemplo Experimental 12. Identificação do efeito de GI101 ou GI101w sobre a proliferação de células T CD8+ e células NK
[0221]Camundongos C57BL/6 com 7 semanas de vida adquiridos a partir da Orient Bio (Busan, Coreia) foram divididos em 3 grupos, cada grupo contendo 3 camundongos e PBS, GI101 ou GI101w foi injetada intraperitonealmente nos mesmos. Neste relatório, GI101 e GI101w foram respectivamente preparadas em 40,5 μg em 200 μl de PBS e injetadas intraperitonealmente nos mesmos. Cinco dias depois da injeção, os baços foram removidos dos camundongos de cada grupo. As células foram isoladas dos mesmos e o número total de células foi medido usando um hematocitômetro. Os esplenócitos foram examinados quanto às proporções de células T CD8+ e células NK nos mesmos, com análise FACS usando pigmentação com anticorpo APC-CD3ε (Biolegend; 145-2C11), anticorpo PE-NK1.1 (Biolegend; PK136) e anticorpo Pacific blue-CD8α (BD; 53-6,7). Como tal, os números de células T CD8+ e células NK presentes no baço foram calculados.
[0222]Como um resultado, foi identificado que GI101 ativou a proliferação de células T CD8+ e células NK in vivo em comparação a GI101w (Figs. 38 e 39).
Exemplo Experimental 13. Identificação do efeito de GI101 sobre a função de células T
[0223]Um experimento foi realizado usando um kit de bioensaio de bloqueio de CTLA-4 (Promega Cat. No JA4005). O experimento é brevemente descrito, como segue. Células efetoras de CTLA-4 mantidas em nitrogênio líquido foram descongeladas em um banho-maria com temperatura constante de 37 °C durante 3 minutos e 0,8 ml de células efetoras de CTLA-4 foram bem misturadas com 3,2 ml de tampão de ensaio pré-aquecido (RPMI 90 % + FBS 10 %). Depois, a mistura foi adicionada a uma placa de cultura celular branca de 96 poços (SPL, Cat. No 30196) em 25 μl por poço. Depois, 25 μl de GI101 em várias concentrações foram adicionados à mesma. Para um controle negativo, 25 μl de tampão de ensaio foram adicionados à mesma. Depois, a placa de cultura celular branca foi coberta e colocada na temperatura ambiente até que as células aAPC/Raji foram preparadas.
[0224]Células aAPC/Raji mantidas em nitrogênio líquido foram descongeladas em um banho-maria com temperatura constante de 37 °C durante 3 minutos e 0,8 ml de células aAPC/Raji foi bem misturado com 3,2 ml de tampão de ensaio pré-aquecido. Depois, 25 μl da mistura foram adicionados à placa por poço e a reação foi deixada prosseguir em uma incubadora de CO2 5 % a 37 °C durante 16 horas. Depois que a reação foi concluída, o produto resultante foi deixado em repouso na temperatura ambiente durante 15 minutos e, depois, o reagente Bio-Glo foi adicionado à mesma, tendo cuidado para evitar bolhas. O reagente Bio-Glo também foi adicionado a três dos poços mais externos e os poços foram usados como espaços em branco para corrigir o sinal de fundo. A reação foi deixada prosseguir na temperatura ambiente durante 10 minutos e, depois, a luminescência foi medida com Cytation 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). A análise dos dados final foi realizada por meio do cálculo de RLU (GI101-fundo)/RLU (nenhum tratamento-fundo).
[0225]Como um resultado, foi descoberto que GI101 ligada a CTLA-4 se expressou em células T efetoras e ativou a função de células T ao invés de inibir as mesmas (Figs. 40 e 41).
Exemplo Experimental 14. Identificação do efeito de mGI101 e mGI102 sobre células imunes
[0226]Camundongos C57BL/6 com 7 semanas de vida adquiridos a partir da Orient Bio (Coreia) foram divididos em 3 grupos, cada grupo contendo 3 camundongos e PBS, 3 mg/kg, 6 mg/kg ou 12 mg/kg de GI101 ou 3 mg/kg, 6 mg/kg ou 12 mg/kg de mGI102 (mGI102-M61) foi intravenosamente administrada nos mesmos. Nos dias 1, 3, 5, 7 e 14 depois da injeção, os baços foram removidos dos camundongos de cada grupo. Posteriormente, para o tecido do baço, os números de células T CD8+ efetoras, células NK e células Treg foram calculados com análise FACS usando os anticorpos respectivos e as proporções de células T CD8+ efetoras e células NK com respeito às células Treg foram respectivamente calculadas. As informações sobre os anticorpos usados em cada ensaio celular são as seguintes:
[0227]Células T CD8+ efetoras: anticorpo CD3ε anti-camundongo PB (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), anticorpo CD8α anti-camundongo FITC (BD, #
553031, 53-6.7), anticorpo CD44 anti-camundongo PE/Cy7 (Biolegend, # 103030; IM7), anticorpo CD122 anti-camundongo APC (Biolegend, # 123214; TM-β1)
[0228]Células NK: anticorpo CD3ε anti-camundongo PB (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), NK-1.1 anti-camundongo PE (Biolegend, # 108708; PK136)
[0229]Células Treg: anticorpo CD3 anti-camundongo FITC (Biolegend, # 100204; 17A2), anticorpo CD4 anti-camundongo PB (Biolegend, # 100531; RM4-5), anticorpo CD25 anti-camundongo PE (Biolegend, # 102008; PC61), anticorpo Foxp3 anti-camundongo APC (Invitrogen, # FJK-16s, 17-5773-82).
[0230]Como um resultado, o grupo que recebeu mGI101 ou mGI102 (mGI102-M61) exibiu um aumento significante nos números de células T CD8+ e células NK nos pontos no tempo a partir de 3 dias a 14 dias depois da administração, em comparação ao grupo administração de PBS. Além disso, foi descoberto que o grupo que recebeu mGI102 exibiu um aumento significante nas proporções de células T CD8+/células Treg e células NK/células Treg ativadas nos pontos no tempo a partir de 3 dias a 14 dias depois da administração, em comparação ao grupo administração de PBS (Fig. 42).
IV. Identificação do efeito anticâncer da proteína de fusão Exemplo Experimental 15. Identificação do efeito de GI101 sobre células cancerígenas que superexpressam PD-L1
[0231]A linhagem celular de câncer NCl-H292 que superexpressa PD-L1 foi cultivada durante 3 horas em um meio de cultura contendo Mitomicina C 10 μg/ml (Sigma) e, depois, Mitomicina C foi removida por lavagem com o meio de cultura.
Posteriormente, 5 x 104 células da linhagem celular de câncer NCl-H292 tratada com Mitomicina C foram incubadas com 1 x 105 células de PBMCs humanas em uma placa de 96 poços. Neste relatório, o tratamento com 5 μg/ml de PHA (Sigma) foi realizado quanto à atividade de células T. Além disso, GI101C1 e GI101 em uma concentração de 50 nM foram reagidas com IgG1-Fc (Biolegend) ou abatacepte (=
Orencia; Bristol-Myers Squibb) em uma concentração de 50 nM durante 30 minutos a 4 °C e, depois, o produto resultante foi usado para tratar as células cancerígenas NCl-H292. Depois de 3 dias, o sobrenadante da célula incubada foi coletado e a quantidade de IFN-γ foi quantificada usando um kit ELISA (Biolegend).
[0232]Como um grupo controle positivo, PBMCs humanas estimuladas com PHA na ausência da linhagem celular de câncer NCl-H292 tratada com Mitomicina C foram usadas; e como um grupo controle negativo, PBMCs humanas estimuladas com PHA na presença da linhagem celular de câncer NCl-H292 tratada com Mitomicina C foram usadas. Um método experimental usando o kit IFN-γ ELISA foi realizado da mesma maneira que no Exemplo Experimental 9.3.
[0233]Como um resultado, GI101 ativou eficazmente a resposta imune que foi inibida pela linhagem celular de câncer que superexpressa PD-L1. Além disso, foi descoberto que GI101 inibiu a sinalização de CTLA-4 expressada em células T efetoras (Figs. 43 e 44).
Exemplo Experimental 16. Identificação do efeito anticâncer de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0234]5 x 106 células/0,05 ml de linhagem celular de câncer CT-26 derivada de camundongo foram misturadas com matriz Matrigel sem vermelho de fenol 0,05 ml (BD) e transplante de 0,1 ml da mistura foi realizado por administração subcutânea na região dorsal direita de camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de vida (Orient Bio). Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 80 mm3 a 120 mm3 foram separados. Depois, os indivíduos foram intravenosamente administrados com 0,1 ml de GI101. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração e
PBS foi administrada a um grupo controle negativo. O tamanho do tumor foi medido diariamente para identificar um efeito anticâncer.
[0235]Como um resultado, foi observado que os camundongos transplantados com linhagem celular de câncer CT-26 tratados com GI101 exibiram uma diminuição notável no tamanho do tumor em comparação ao grupo controle negativo (Figs. 45 e 46).
Exemplo Experimental 17. Identificação do efeito anticâncer de mGI101 sobre os camundongos transplantados com melanoma derivado de camundongo
[0236]Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer B16F10 (ATCC, USA) foram misturados com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o alotransplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 120 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos.
[0237]Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), hIgG4 foi administrada em uma dose de 4 mg/kg a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 foi administrado em uma dose de 5 mg/kg a um grupo controle positivo. Para grupos experimentais, mGI101 em uma dose de 1 mg/kg ou 4 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Adicionalmente, os grupos que receberam mGI101 em uma dose de 4 mg/kg e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg também foram definidos como grupos experimentais. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0238]Como um resultado, o volume inicial do tumor de todos os grupos foi de 90 mm3 e erro padrão (S.E.) de cada grupo foi de 5 mm 3 a 6 mm3. No grupo controle negativo, uma mudança no volume do tumor foi observada durante o período experimental, em que o volume do tumor aumentou de 90 mm 3 a 1.434 mm3 até 15 dias depois da administração.
[0239]No grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 1 mg/kg, o volume do tumor foi observado aumentar de 90 mm3 a 885 mm3 durante o período experimental que é o mesmo período do grupo controle negativo e uma inibição estatisticamente significante do crescimento do tumor foi observada em alguns pontos no tempo de medição (valor p: 0,5 no dia 11, valor p < 0,01 no dia 7, valor p < 0,001 no dia 3). No grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 4 mg/kg, o volume do tumor foi observado aumentar de 90 mm3 a 748 mm3 durante o período experimental que é o mesmo período do grupo controle negativo e uma inibição estatisticamente significante de crescimento do tumor foi observada em alguns pontos no tempo de medição (valor p: 0,5 no dia 9, valor p < 0,01 nos dias 7 e 11).
[0240]Além disso, a taxa de inibição do crescimento do tumor foi analisada usando, como uma referência, o grupo que recebeu mIgG em uma dose de 4 mg/kg e comparando este grupo com cada um dos outros grupos. No grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 1 mg/kg, a taxa de inibição de crescimento de 36,5 % foi observada em comparação ao grupo controle negativo e nenhuma diferença estatisticamente significante (valor p: 0,5) foi observada. No grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 4 mg/kg, uma taxa de inibição do crescimento do tumor estatisticamente significante (valor p: 0,5) foi observada em comparação ao grupo controle negativo. Um total de duas administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0241]Através disto, foi descoberto que no teste de eficácia inibitória do crescimento do tumor para B16F10, um melanoma alotransplantado em camundongos C57BL/6, mGI101 apresentou um efeito de inibição do crescimento do tumor em uma maneira dependente da dose (Figs. 47 e 48).
Exemplo Experimental 18. Identificação do efeito anticâncer de mGI101 sobre os camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0242]Os camundongos BALB/c (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer CT-26 (ATCC, USA) foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o alotransplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 28 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), hIgG4 foi administrada em uma dose de 6 mg/kg a um grupo controle negativo. Para grupos experimentais, mGI101 em uma dose de 3 mg/kg, 6 mg/kg ou 12 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0243]Como um resultado, foi descoberto que o grupo experimental que recebeu mGI101 em uma dose de 6 mg/kg ou 12 mg/kg mGI101 exibiu inibição significante do crescimento do tumor em alguns pontos no tempo de medição e no final do teste, em comparação ao grupo controle negativo (Fig. 49). Além disso, como um resultado da medição de uma taxa de sobrevivência, foi descoberto que o grupo experimental que recebeu mGI101 em uma dose de 6 mg/kg exibiu melhora significante em alguns pontos no tempo de medição e no final do teste, em comparação ao grupo controle negativo (Fig. 50).
Exemplo Experimental 19. Identificação do efeito anticâncer de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo Exemplo Experimental 19.1. Identificação do efeito inibitório do tumor
[0244]Camundongos BALB/c (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer CT-26 (ATCC, USA) foram colocadas em suspensão em PBS 0,1 ml e o alotransplante da suspensão foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 200 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), nenhum fármaco foi administrado a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg ou um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg e um anti-CTLA-4 anticorpo em uma dose de 5 mg/kg foram intravenosamente administrados aos grupos controle positivo. Para grupos experimentais, GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg ou 1 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0245]Como um resultado, nos camundongos transplantados com linhagem celular de câncer CT-26, todos os grupos que receberam anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-1 e anticorpo anti-CTLA-4 ou GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg ou
1 mg/kg exibiram inibição significante do crescimento do tumor, em comparação ao controle negativo. Em particular, o grupo experimental que recebeu GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg exibiu um efeito inibitório do tumor significante, em comparação ao grupo de tratamento com anticorpo anti-PD-1 (* p < 0,05) (Fig. 51).
Exemplo Experimental 19.2. Análise de células imunes no tecido cancerígeno
[0246]Os camundongos de cada grupo no Exemplo Experimental 19.1 foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu uma média de 200 mm 3 e os tecidos cancerígenos foram coletados. Posteriormente, os tecidos cancerígenos foram separados em um nível de célula única para analisar células imunes nos mesmos e, depois, análise FACS foi realizada em células imunes nos tecidos cancerígenos usando os seguintes anticorpos: Anti-camundongo-CD3 (Biolegend, Cat. N o 100320), Anti-camundongo-CD4 (Biolegend, Cat. No 100526), Anti-camundongo- CD8 (Biolegend, Cat. No 100750), Anti-camundongo-FoxP3 (eBioscience, Cat. No 12-5773-82), Anti-camundongo-CD25 (Biolegend, Cat. No 102049), Anti- camundongo-CD44 (eBioscience, Cat. No 61-0441-82), Anti-camundongo-PD-1 (Biolegend, Cat. No 135218), Anti-camundongo-IFN-gama (Biolegend, Cat. No 505832), Anti-camundongo-CD49b (Biolegend, Cat. No 108906), Anti-camundongo- H2 (Invitrogen, Cat. No A15443), Anti-camundongo-CD11c (Biolegend, Cat. No 117343), Anti-camundongo-CD80 (eBioscience, Cat. No 47-4801-82), Anti- camundongo-CD86 (Biolegend, Cat. No 104729), Anti-camundongo-F4/80 (eBioscience, Cat. No 47-4801-82) e Anti-camundongo-CD206 (eBioscience, Cat. N o 17-2061-80).
[0247]Como um resultado, o grupo experimental que recebeu GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg exibiu um aumento significante nas células T CD8+ em comparação ao grupo controle positivo que recebeu o anticorpo anti-PD-1 sozinho em uma dose de 5 mg/kg (* p < 0,05, Figs. 52 e 53). Além disso, todos os grupos experimentais que receberam GI101 exibiram um nível significantemente aumentado de expressão de IFN-γ em células T, em comparação ao grupo controle negativo (* p < 0,05, Figs. 52 e 53). Além disso, o grupo experimental que recebeu GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg exibiu um aumento nos macrófagos M1 em comparação ao grupo controle negativo e ao grupo controle positivo que recebeu o anticorpo anti-PD-1 sozinho (Figs. 54 e 55). Além disso, todos os grupos experimentais que receberam GI101 exibiram um nível aumentado de expressão de CD86 em macrófagos e células dendríticas (* p < 0,05, Figs. 54 a 57).
Exemplo Experimental 20. Identificação do efeito anticâncer de GI101 sobre camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongo Exemplo Experimental 20.1. Identificação do efeito inibitório do tumor
[0248]Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer LLC2 (ATCC, USA) foram colocadas em suspensão em 0,1 ml PBS e o alotransplante da suspensão foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 200 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), nenhum fármaco foi administrado a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg ou um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg e um anti-CTLA-4 anticorpo em uma dose de 5 mg/kg foram intravenosamente administrados aos grupos controle positivo. Para grupos experimentais, GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg ou 1 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0249]Como um resultado, todos os grupos experimentais exibiram um efeito inibitório do tumor significante, em comparação ao grupo controle negativo (* p < 0,05) (Fig. 58).
Exemplo Experimental 20.2. Análise de células imunes em tecido cancerígeno
[0250]Os camundongos de cada grupo no Exemplo Experimental 20.1 foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu uma média de 200 mm 3 e tecidos cancerígenos foram coletados. Posteriormente, a análise FACS foi realizada da mesmo maneira que no Exemplo Experimental 19.2 para analisar células imunes nos tecidos cancerígenos.
[0251]Como um resultado, o grupo experimental que recebeu GI101 em uma dose de 0,1 mg/kg exibiu um aumento significante nas células T CD8+, em comparação ao grupo controle positivo que recebeu o anticorpo anti-PD-1 sozinho (* p < 0,05, Fig. 59). Além disso, todos os grupos experimentais que receberam GI101 exibiram um nível significantemente aumentado de expressão de IFN-γ, em comparação ao grupo controle negativo (* p <0,05, Fig. 59). Além disso, todos os grupos experimentais que receberam GI101 exibiram um nível aumentado de expressão de CD86 em macrófagos e células dendríticas (* p < 0,05, Figs. 59 a 61).
Exemplo Experimental 21. Identificação do efeito anticâncer de mGI102-M61 sobre camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0252]Os camundongos BALB/c (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer CT-26 (ATCC, USA) foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o alotransplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 28 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), hIgG4 foi administrada em uma dose de 6 mg/kg a um grupo controle negativo. Para grupos experimentais, mGI102-M61 em uma dose de 3 mg/kg, 6 mg/kg ou 12 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração. O tamanho do tumor foi medido diariamente.
[0253]Como um resultado, foi identificado que o grupo experimental que recebeu mGI102-M61 em uma dose de 12 mg/kg exibiu inibição significante de crescimento do tumor em alguns pontos no tempo de medição e no final do teste, em comparação ao grupo controle negativo (Fig. 62). Além disso, como um resultado da medição de uma taxa de sobrevivência, foi identificado que o grupo experimental que recebeu mGI102-M61 em uma dose de 12 mg/kg exibiu melhora significante em alguns pontos no tempo de medição e no final do teste, em comparação ao grupo controle negativo (Fig. 63).
Exemplo Experimental 22. Identificação do efeito anticâncer de mGI101 em camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0254]Camundongos BALB/c (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer CT-26 (ATCC, USA) foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o alotransplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 200 mm3 a 250 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos.
[0255]Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), hIgG4 foi administrada em uma dose de 4 mg/kg a um grupo controle negativo. Para grupos experimentais, mGI101 em uma dose de 1 mg/kg, 4 mg/kg ou 6 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Adicionalmente, os grupos que receberam mCD80 em 4,9 mg/kg ou Fc-IL-2v (GI101C2) em 2,8 mg/kg foram definidos como grupos controle. Além disso, um grupo que recebeu simultaneamente mCD80 em 4,9 mg/kg e Fc-IL-2v (GI101C2) em 2,8 mg/kg foi definido como um grupo controle.
[0256]Na medição do volume do tumor, foi identificado que o grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 6 mg/kg exibiu inibição significante em alguns pontos no tempo de medição e no final do teste, em comparação ao controle negativo. Uma taxa de inibição do crescimento do tumor excelente foi observada em comparação ao grupo que recebeu uma combinação de mCD80 e Fc-IL-2v (GI101C2) (Figs. 64 e 65).
[0257]Em conclusão, no teste de eficácia inibitória do crescimento do tumor em camundongos BALB/c alotransplantados com CT-26, uma linhagem celular de câncer colorretal derivada de camundongo BALB/c, foi demonstrado que a substância de teste mGI101 apresentou eficácia inibitória do tumor sob esta condição de teste em comparação a preparações únicas de mCD80 e IL-2v; e foi identificado que mGI101 exibiu eficácia anticâncer excelente em comparação ao grupo que recebeu uma combinação de mCD80 e IL-2v (Figs. 64 e 65). Em particular, o grupo que recebeu mGI101 em uma dose de 6 mg/kg exibiu inibição significante do tamanho do tumor, em comparação ao grupo controle negativo e ao grupo que recebeu uma combinação de mCD80 e Fc-IL2v (GI101C2).
V. Avaliação da toxicidade da proteína de fusão Exemplo Experimental 23. Avaliação da toxicidade de GI101 usando macacos Exemplo Experimental 23.1. Criação de macacos e administração do fármaco
[0258]No presente experimento, nove macacos filipinos machos (macacos Cynomolgus) com idades entre 2 a 3 anos foram usados. O experimento foi realizado, de acordo com a “Act on Welfare and Management of Animals” no Japão e o “Guidance for Animal Care and Use” da Ina Research Inc. O protocolo experimental foi revisado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Ina Research Inc e, depois, aprovado pela AAALAC International (Unidade Credenciada No 001107).
[0259]O experimento foi conduzido a partir de um dia antes da administração do fármaco até 15 dias depois da administração do fármaco. Cada macaco foi observado em torno da gaiola e o estado das fezes foi adicionalmente verificado. Os pesos corpóreos foram medidos usando uma escala digital (LDS-150H, Shimadzu Corporation) um dia antes da administração do fármaco e nos dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Além disso, a quantidade de alimento remanescente foi medida a partir de um dia antes da administração do fármaco até o sacrifício dos macacos.
[0260]Neste relatório, uma seringa descartável (24G) foi preenchida com o fármaco GI101 e um total de duas administrações foram feitas por intermédio de uma via intravenosa, cada administração sendo feita em uma taxa de 0,17 ml/s.
GI101 foi administrada duas vezes, em um intervalo de uma semana, em uma dose de 5 mg/kg/dia ou 10 mg/kg/dia. Um grupo controle foi administrado com PBS (pH 7,4) da mesma maneira.
Exemplo Experimental 23.2. Observação clínica, identificação de alterações no peso corpóreo e ingestão alimentar
[0261]Observação clínica e medição das alterações no peso corpóreo e ingestão alimentar foram realizadas a partir de um dia antes da administração do fármaco até dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Como um resultado, nenhuma toxicidade foi causada por GI101 (Figs. 66 a 69).
Exemplo Experimental 23.3. Análise do sangue
[0262]Sangue foi coletado a partir dos macacos no Exemplo Experimental
23.1 um dia antes da administração do fármaco e nos dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Neste relatório, o sangue foi coletado por intermédio da veia femoral com uma seringa descartável (22G). O sangue coletado foi submetido à análise sanguínea usando o Sistema de Hematologia Automatizado XN-2000 (Sysmex Corporation) e o Analisador de Coagulação Sanguínea Automatizado CA- 510 (Sysmex Corporation) para os itens listados na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2 Parâmetro Abr. Unidade Método Equipamento Contagem sanguínea completa Contagem de glóbulos RBC 106/μL Detecção de fluxo de XN-2000 vermelhos bainha DC Concentração de HGB g/dL SLS-hemoglobina XN-2000 hemoglobina Hematócrito HCT % Detecção da altura XN-2000 do pulso RBC Volume corpuscular MCV fL HCT/RBC (Х104/μL) XN-2000 médio Х 1000 Hemoglobina MCH pg HGB/RBC (Х104/μL) XN-2000 corpuscular média Х 1000 Concentração de MCHC g/dL HGB/HCT Х 100 XN-2000 hemoglobina corpuscular média Contagem da Razão de Citometria de fluxo XN-2000 Reticulócitos RET % %
Parâmetro Abr. Unidade Método Equipamento RET # 109/L Contagem de plaquetas PLT 103/μL Citometria de fluxo XN-2000 Contagem de glóbulos WBC 103/μL Citometria de fluxo XN-2000 brancos Glóbulos brancos Citometria de fluxo XN-2000 diferenciais a)Contagem Razão Diff % WBC % 103/μL Diff WBC # Testes de coagulação Tempo da protrombina PT s Detecção de CA-510 dispersão de luz Tempo da APTT s Detecção de CA-510 tromboplastina parcial dispersão de luz ativada a) Neutrófilos (NEUT), linfócitos (LYMPH), monócitos (MONO), eosinófilos (EO) e basófilos (BASO)
[0263]Como um resultado, o grupo que recebeu GI101 em uma dose de 5 mg/kg/dia ou 10 mg/kg/dia exibiu um aumento nos números de reticulócitos, leucócitos e linfócitos no dia 15 (Figs. 70 a 72).
Exemplo Experimental 23.4. Análises clínicas e químicas
[0264]Sangue foi coletado a partir dos macacos no Exemplo Experimental
23.1 um dia antes da administração do fármaco e nos dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Neste relatório, o sangue foi coletado da mesma maneira que no Exemplo Experimental 23.3. O sangue coletado foi submetido às análises clínicas e químicas usando o Analisador Clínico Modelo 7180 (Hitachi High- Technologies Corporation) para os itens listados na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3 Parâmetro Abr. Unidade Método Aspartato AST U/L Método rastreável JSCC aminotransferase Alanina aminotransferase ALT U/L Método rastreável JSCC Fosfatase alcalina ALP U/L Método rastreável JSCC Lactato desidrogenase LD U/L Método rastreável JSCC Creatina cinase CK U/L Método rastreável JSCC
Parâmetro Abr. Unidade Método Glicose GLU mg/dL Enzimático (Gluc-DH) Bilirrubina total BIL mg/dL Enzimático (BOD) Ureia nitrogênio UN mg/dL Enzimático (urease-LEDH) Creatinina CRE mg/dL Enzimático Colesterol total CHO mg/dL Enzimático (colesterol oxidase) Triglicerídeos TG mg/dL Enzimático (GK-GPO com eliminação de glicerol livre) Fosfolipídeos PL mg/dL Enzimático (colina oxidase) Fósforo Inorgânico IP mg/dL Enzimático (maltose fosforilase) Cálcio CA mg/dL OCPC Sódio NA mEq/L Eletrodo íon-seletivo Potássio K mEq/L Eletrodo íon-seletivo Cloreto CL mEq/L Eletrodo íon-seletivo Proteína total TP g/dL Biureto Albumina ALB g/dL BCG Razão albumina-globulina UM/G - Calculado JSCC: Japan Society of Clinical Quemistry
[0265]Como um resultado, nenhuma toxicidade causada por GI101 foi detectada nas análises clínicas e químicas (Figs. 73 a 79).
Exemplo Experimental 21.5. Análise de citocinas
[0266]Sangue foi coletado a partir dos macacos no Exemplo Experimental
23.1 um dia antes da administração do fármaco e nos dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Neste relatório, o sangue foi coletado da mesma maneira que no Exemplo Experimental 23.3. Usando o instrumento Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) e o Kit de Ensaio de Painel de Pérola Magnética de Citocina de Primata Não Humano (EMD Millipore), o sangue coletado foi analisado para TNF-α, IFN-γ IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. Como um resultado, nenhuma toxicidade causada por GI101 foi detectada com respeito à análise de citocinas (Figs. 80 e 81).
Exemplo Experimental 23.6. Análise de células imunes
[0267]Sangue foi coletado a partir dos macacos no Exemplo Experimental
23.1 um dia antes da administração do fármaco e nos dias 1, 8 e 15 depois da administração do fármaco. Neste relatório, o sangue foi coletado da mesma maneira que no Exemplo Experimental 23.3. Usando um citômetro de fluxo (LSRFortessa X- 20, Becton, Dickinson e Company), o sangue coletado foi analisado quanto aos seguintes itens: 1) Ki67 + CD4: CD45+/CD3+/CD4+/Ki67+ 2) Ki67 + CD8: CD45+/CD3+/CD8+/Ki67+ 3) Ki67 + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+ 4) Ki67 + ICOS + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+/CD278+ 5) ICOS + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/CD278+ 6) Ki67 + célula NK: CD45+/CD16+ e CD56+/Ki67+.
[0268]Como um resultado, na análise de células imunes, todos os grupos que receberam GI101 exibiram, no dia 15, um aumento no números de células T, células T CD4+, células T CD8+, células T regulatórias, células NK e células T Ki67+, células T CD4+ Ki67+, células T CD8+ Ki67+, células T regulatórias Ki67+, células T regulatórias Ki67+ ICOS+, células NK Ki67+, células T regulatórias ICOS+.
[0269]Especificamente, nos linfócitos, as proporções de células T, células T CD4+, células T regulatórias aumentaram e uma proporção de células NK diminuiu, enquanto uma proporção de células T CD8+ não foi alterada. Uma proporção de células T regulatórias aumentou no dia 3 e diminuiu nos dias 8 e 15. Entretanto, a proporção foi ainda maior do que o grupo controle.
[0270]Além disso, com respeito às proporções de células imunes, que são Ki67+, nas células imunes respectivas, as proporções de células T Ki67+, células T CD4+ Ki67+, células T CD8+ Ki67+, células T regulatórias Ki67+, células T regulatórias Ki67+ ICOS+, células NK Ki67+ e células T regulatórias ICOS+ aumentaram.
[0271]Além disso, as proporções de células T Ki67+, células T CD8+ Ki67+ e células NK Ki67+ aumentaram nos dias 3, 8 e 15; as proporções de células T CD4+ Ki67+ e células T regulatórias Ki67+ aumentaram nos dias 3 e 8; e as proporções de células T regulatórias Ki67+ ICOS+ e células T regulatórias ICOS+ aumentaram apenas no dia 8 (Figs. 82 a 87).
Exemplo Experimental 23.7. Análise Patológica
[0272]No dia 16, os macacos no Exemplo Experimental 23.1 foram sacrificados e todos os órgãos e tecidos foram fixados usando formalina 10 %.
Entretanto, os testes foram fixados usando uma solução de formalina-sacarose- ácido acético (FSA) e os olhos e nervo óptico foram fixados usando formaldeído 1 %-glutaraldeído 2,5 % em tampão fosfato. A pigmentação com hematoxilina-eosina foi realizada nos órgãos e tecidos nos itens listados na Tabela 4 abaixo e observações foram feitas sob um microscópio óptico.
Tabela 4 Orgão/tecido Fixação Peso do Preparação da amostra órgão pigmentada Nota com HE Músculo papilar do ventrículo esquerdo, parede do ventrículo Coração O O - direito e áreas, incluindo a artéria coronária e a válvula aórtica Aorta (torácica) O - Esterno - Medula óssea O Descalcificada - esternal Cartilagem articular
O Fêmures - distal e haste; (R&L) descalcificada Medula óssea O (R) - Descalcificada femoral Timo O O O Baço O O O Linfonodos O - O submandibulares Linfonodos O - O mesentéricos Traqueia O - Descalcificada Brônquios Lóbulos esquerdo O O (D e E - anterior e direito Pulmões (R&L) separados) posterior
Orgão/tecido Fixação Peso do Preparação da amostra órgão pigmentada Nota com HE Língua O - Glândulas O O (D e E submandibulares (R&L) combinados)
O Glândulas parótidas - (R&L) Esôfago O - Estômago O - Cárdia, corpo e piloro Duodeno O - Jejuno O - Íleo Emplastros de O - Peyer Ceco O - Cólon O - Reto O - Fígado O O Lóbulo lateral (com esquerdo e lóbulo vesícula O medial direito, Vesícula biliar biliar O incluindo a vesícula drenada biliar pela bile) Pâncreas O O - O O (D e E Rins O (R&L) (R&L) separados) Bexiga urinária O - Hipófise O O Tireoide O O (D e E Paratireoide (R&L) separados) O O (D e E Adrenal (R&L) separados) O O (D e E Testículos (R&L) separados) O O (D e E Epidídimo (R&L) separados) Próstata O O Vesícula Seminal O O - Cérebro (frontal, parietal (incluindo gânglios basais e Cérebro O O - hipocampo) e lóbulos occipitais); cerebelo; ponte; e medula oblonga Medula espinhal O -
Orgão/tecido Fixação Peso do Preparação da amostra órgão pigmentada Nota com HE (torácica) Nervo Ciático O (L) -
O Olhos - (R&L)
O Nervos ópticos - (R&L)
O Glândulas lacrimais - (R&L) Músculo esquelético O (L) - (bíceps femoral) Pele (torácica) O - Sítio de injeção O - Descalcificada (Veia da cauda) Pele da região femoral torácica ou O - - medial com ID No O: conduzida -: Não conduzida R&L: Órgãos direitos e esquerdos/tecidos foram conduzidos. L: Órgão direito ou esquerdo/tecido (usualmente o esquerdo) foi conduzido. R: Órgão direito ou esquerdo/tecido (usualmente o direito) foi conduzido
[0273]Como um resultado, o grupo tratado com GI101 em uma dose de 5 mg/kg/dia ou 10 mg/kg/dia exibiu um aumento no peso do baço (Fig. 88). Não foram observadas alterações significantes nos outros tecidos. Em conclusão, nos grupos que receberam GI101, algumas alterações foram observadas, mas nenhuma toxicidade foi observada.
VI. Exemplo Experimental 24 para identificar o efeito anticâncer de GI102.
Identificação do efeito anticâncer de GI102-M45 Exemplo Experimental 24.1. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M45 sobre os camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0274]5 x 106 células/0,05 ml de linhagem celular de câncer CT-26 derivada de camundongo foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o transplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em
0,1 ml na região dorsal direita de camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de vida (Orient Bio). Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 80 mm3 a 120 mm3 foram separados. Depois, os indivíduos foram intravenosamente administrados com 0,1 ml de GI102-M45. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração e PBS foi administrada para um controle negativo. O tamanho do tumor foi medido diariamente para identificar um efeito anticâncer. A atividade de GI102-M45 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 16.
Exemplo Experimental 24.2. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M45 sobre os camundongos transplantados com células pulmonares derivadas de camundongo
[0275]Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer LLC2 (ATCC, USA) foram colocadas em suspensão em PBS 0,1 ml e o alotransplante da suspensão foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 200 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), nenhum fármaco foi administrado a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg ou um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg e um anti-CTLA-4 anticorpo em uma dose de 5 mg/kg foram intravenosamente administrados aos grupos controle positivo. Para grupos experimentais, GI102-M45 em uma dose de 0,1 mg/kg ou 1 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração.
O tamanho do tumor foi medido diariamente. A atividade de GI102-M45 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 20.1.
Exemplo Experimental 25. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M61 Exemplo Experimental 25.1. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M61 sobre os camundongos transplantados com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0276]5 x 106 células/0,05 ml de linhagem celular de câncer CT-26 derivada de camundongo foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o transplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita de camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de vida (Orient Bio). Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 80 mm3 a 120 mm3 foram separados. Depois, os indivíduos foram intravenosamente administrados com 0,1 ml de GI102-M61. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração e PBS foi administrada a um controle negativo. O tamanho do tumor foi medido diariamente para identificar um efeito anticâncer. A atividade de GI102-M61 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 16.
Exemplo Experimental 25.2. Identificação do efeito antitumor de GI102-M61 sobre os camundongos transplantados com células de câncer de pulmão derivadas de camundongo
[0277]Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer LLC2 (ATCC, USA) foram colocadas em suspensão em PBS 0,1 ml e o alotransplante da suspensão foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 200 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), nenhum fármaco foi administrado a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg ou um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg e um anti-CTLA-4 anticorpo em uma dose de 5 mg/kg foram intravenosamente administrados aos grupos controle positivo. Para grupos experimentais, GI102-M61 em uma dose de 0,1 mg/kg ou 1 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração.
O tamanho do tumor foi medido diariamente. A atividade de GI102-M61 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 20.1.
Exemplo Experimental 26. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M72 Exemplo Experimental 26.1. Identificação do efeito antitumor de GI102-M72 sobre os camundongos transplantado com células de câncer colorretal derivadas de camundongo
[0278]5 x 106 células/0,05 ml de linhagem celular de câncer CT-26 derivada de camundongo foram misturadas com 0,05 ml de matriz Matrigel sem vermelho de fenol (BD) e o transplante da mistura foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita de camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de vida (Orient Bio). Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 80 mm3 a 120 mm3 foram separados. Depois, os indivíduos foram intravenosamente administrados com 0,1 ml de GI102-M72. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração e PBS foi administrada a um controle negativo. O tamanho do tumor foi medido diariamente para identificar um efeito anticâncer. A atividade de GI102-M72 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 16.
Exemplo Experimental 26.2. Identificação do efeito anticâncer de GI102-M72 sobre os camundongos transplantados com células pulmonares cancerígenas de camundongo
[0279]Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 7 semanas de vida) adquiridos a partir da Orient Bio foram submetidos a um período de aclimatação de 7 dias.
Depois, 5 x 106 células de linhagem celular de câncer LLC2 (ATCC, USA) foram colocadas em suspensão em PBS 0,1 ml e o alotransplante da suspensão foi realizado por administração subcutânea em 0,1 ml na região dorsal direita dos camundongos. Depois de um determinado período de tempo do transplante de células cancerígenas, o volume do tumor foi medido e os indivíduos que atingiram cerca de 50 mm3 a 200 mm3 foram selecionados e, depois, os camundongos selecionados foram igualmente agrupados com base no tamanho do tumor e peso corpóreo, cada grupo contendo 10 camundongos. Posteriormente, usando uma seringa descartável (31G, 1 mL), nenhum fármaco foi administrado a um grupo controle negativo e um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg ou um anticorpo anti-PD-1 em uma dose de 5 mg/kg e um anti-CTLA-4 anticorpo em uma dose de 5 mg/kg foram intravenosamente administrados aos grupos controle positivo. Para grupos experimentais, GI102-M72 em uma dose de 0,1 mg/kg ou 1 mg/kg foi intravenosamente administrada aos mesmos. Um total de três administrações ocorreu uma vez a cada três dias depois da primeira administração.
O tamanho do tumor foi medido diariamente. A atividade de GI102-M72 foi identificada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 20.1.
Claims (33)
1. Proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma proteína IL-2 e uma proteína CD80.
2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína IL-2 e a proteína CD80 são ligadas entre si por intermédio de um ligante.
3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína IL-2 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína IL-2 é uma variante de IL-2.
5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de IL-2 é obtida por meio da substituição de pelo menos um selecionado a partir dos 38o, 42o, 45o, 61o e 72o aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de IL-2 é obtida por pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste de R38A, F42A, Y45A, E61R e L72G na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de IL-2 contém qualquer um selecionado a partir das seguintes combinações de substituição (a) a (d) na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10: (a) R38A/F42A (b) R38A/F42A/Y45A (c) R38A/F42A/E61R (d) R38A/F42A/L72G.
8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de IL-2 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, 22, 23 ou 24.
9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína CD80 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
10. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína CD80 é um fragmento de CD80.
11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o fragmento de CD80 consiste do 35o aminoácido ao 242o aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante é uma albumina ou um domínio Fc de uma imunoglobulina.
13. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc é do tipo selvagem ou variante.
14. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
15. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante do domínio Fc apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
16. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão consiste da seguinte fórmula estrutural (I) ou (II): N’-X-[ligante (1)]n-domínio Fc-[ligante (2)]m-Y-C’ (I) N’-Y-[ligante (1)]n-domínio Fc-[ligante (2)]m-X-C’ (II)
nas fórmulas estruturais (I) e (II), N’ é o terminal N da proteína de fusão, C’ é o terminal C da proteína de fusão, X é a proteína CD80, Y é a proteína IL-2, os ligantes (1) e (2) são peptídeo ligantes, e n e m são, independentemente, 0 ou 1.
17. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante (1) é um peptídeo ligante que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
18. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante (2) é um peptídeo ligante que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
19. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão consiste da fórmula estrutural (I).
20. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão apresenta uma identidade de sequência de 85 % ou maior à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 26, 28 ou 30.
21. Dímero da proteína de fusão, CARACTERIZADO pelo fato de que duas proteínas de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, são ligadas entre si.
22. Dímero da proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o dímero da proteína de fusão é um homodímero.
23. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20.
24. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo apresenta uma identidade de sequência de 85 % ou maior à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8, 25, 27 ou 29.
25. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 23.
26. Célula transformada, CARACTERIZADA pelo fato de que o vetor, de acordo com a reivindicação 25, foi introduzido.
27. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer ou uma doença infecciosa, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende como um ingrediente ativo: a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20; ou o dímero da proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 21 ou 22.
28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável.
29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste de câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer cervical, câncer da tireoide, câncer de laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de glândulas salivares e linfoma.
30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a doença infecciosa é qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste de hepatite B, hepatite C, infecção por papilomavírus humano, infecção por citomegalovírus, doença respiratória viral e influenza.
31. Uso da proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para o tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa.
32. Uso da proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar câncer ou uma doença infecciosa.
33. Método para tratar câncer ou uma doença infecciosa, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: administrar, a um indivíduo, a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20; ou o dímero da proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 21 ou 22.
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