JP2021512624A - 抗pd−1/抗vegf天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造 - Google Patents
抗pd−1/抗vegf天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021512624A JP2021512624A JP2020542762A JP2020542762A JP2021512624A JP 2021512624 A JP2021512624 A JP 2021512624A JP 2020542762 A JP2020542762 A JP 2020542762A JP 2020542762 A JP2020542762 A JP 2020542762A JP 2021512624 A JP2021512624 A JP 2021512624A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- substitution
- cells
- bispecific antibody
- vegf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
抗PD−1/抗VEGF天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造である。天然IgGの特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがなく、高度に安定したヘテロ二量体型抗PD−1/抗VEGF二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。その二重特異性抗体は、2つの標的分子を同時に結合でき、複雑な疾患の治療により効果的である。
Description
本発明は、抗PD−1/抗VEGF天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造に関する。具体的には、本発明は、天然IgGの特徴を有しながら、重鎖および軽鎖のミスマッチがない高度に安定なヘテロ二量体型の抗PD−1/抗VEGF二重特異性抗体及びその製造方法に関する。
モノクローナル抗体は、単一のエピトープにのみ作用する高度に特異的な抗体であり、例えば、癌、炎症及び自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く使用されている。しかし、このような治療用分子は、単独で使用すると、どれにも十分な薬効を発揮できなく、これは、疾患の複雑性によるものである。例えば、癌や炎症性疾患は、通常、複数の疾患で媒介される分子経路及びシグナル経路間のクロストークに関する。これらの場合、単一ターゲット分子は最良の治療効果を与えることができないが、複数のターゲット又は同一のターゲットの複数部位を同時にブロックする分子は、治療効果を改善させることができる。複数の単一特異性分子を使用する薬物の併用と比較しては、多重特異性、例えば、二重特異性分子を使用するマルチターゲット療法は、新しい作用メカニズムを導入することにより薬効を高め、毒性や副作用を軽減することができるとともに、単一分子として、新薬開発プロセスを簡単化し、患者及び医療従事者が使用するのに便利である。
この分野では、多くの異なる形態の二重特異性抗体または二機能性分子が報告されている。最初の二重特異性抗体は、化学的方法により二機能性カップリング試薬を使用して2つの既存のIgG分子、Fab’又は(Fab’)2断片を連結したものである。但し、このような化学的にカップリングされた二重特異性抗体は、例えば、生産の作業強度、ヘテロコンジュゲートの精製、ホモコンジュゲート及びオリジナルの単一特異性抗体又は断片の除去の複雑性及び低収率など多くの制限がある。
二重特異性抗体を作製するための他の方法は、ハイブリッドハイブリドーマ(又はクアドローマ、quadroma)技術を使用し、異なる抗体を分泌する2つのハイブリドーマ細胞株の体細胞融合により生成される。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムなペアリングにより、抗体混合物の1/10のみが必要な機能的二重特異性抗体であり、精製プロセスが複雑になり、生産収率が低下するようにする。
この分野では、多くの異なる形態の二重特異性抗体または二機能性分子が報告されている。最初の二重特異性抗体は、化学的方法により二機能性カップリング試薬を使用して2つの既存のIgG分子、Fab’又は(Fab’)2断片を連結したものである。但し、このような化学的にカップリングされた二重特異性抗体は、例えば、生産の作業強度、ヘテロコンジュゲートの精製、ホモコンジュゲート及びオリジナルの単一特異性抗体又は断片の除去の複雑性及び低収率など多くの制限がある。
二重特異性抗体を作製するための他の方法は、ハイブリッドハイブリドーマ(又はクアドローマ、quadroma)技術を使用し、異なる抗体を分泌する2つのハイブリドーマ細胞株の体細胞融合により生成される。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムなペアリングにより、抗体混合物の1/10のみが必要な機能的二重特異性抗体であり、精製プロセスが複雑になり、生産収率が低下するようにする。
国際公開2013/060867号は、まず2種の混合されているホモ二量体型抗体を還元し、その後、このような2種のホモ二量体抗体のCH3領域に非対称アミノ酸突然変異を導入することにより異なる抗体のFabアーム交換を促進し、最後にヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合を酸化して安定な二重特異性抗体を形成する、テロ二量体二重特異性抗体の大規模生産方法を記載している。
国際公開2009/089004号は、CH3−CH3接合部分のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸として突然変異させることにより、静電気力によりヘテロ二量体の形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である、ヘテロ二量体タンパク質の調製方法を記載している。
米国特許5731168号は、「空隙への突起(protuberance−into−cavity)」戦略によるヘテロ二量体IgGの製造方法を記載している。その方法は、第1の鎖のCH3領域境界での小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置き換えて「突起」を形成するとともに、第2の鎖のCH3領域境界での対応する大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に突然変異させて「空隙」を形成する。突起と空隙の相互作用は、ヘテロ二量体IgGの形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である。
国際公開2009/089004号は、CH3−CH3接合部分のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸として突然変異させることにより、静電気力によりヘテロ二量体の形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である、ヘテロ二量体タンパク質の調製方法を記載している。
米国特許5731168号は、「空隙への突起(protuberance−into−cavity)」戦略によるヘテロ二量体IgGの製造方法を記載している。その方法は、第1の鎖のCH3領域境界での小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置き換えて「突起」を形成するとともに、第2の鎖のCH3領域境界での対応する大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に突然変異させて「空隙」を形成する。突起と空隙の相互作用は、ヘテロ二量体IgGの形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である。
国際公開2012/058768号は、安定で高特異的なヘテロ二量体IgGの調製方法を記載している。その方法は、負及び正の両方の設計と、コンピューターモデルに基づくタンパク質工学技術とを組み合わせて、IgG1 CH3ドメインの複数のアミノ酸を突然変異させることにより、安定したホモ二量体の不純物の含有量が低いヘテロ二量体IgGを形成する。
プログラム細胞死−1(programmed death−1、PD−1)は、近年大きな注目を集めている免疫チェックポイント(immune checkpoint)となり、CD28ファミリーメンバーに属する。CD28ファミリーの他のメンバー、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合二量体を形成できるCTLA4と異なり、PD−1は、単量体として存在する。PD−1の構造は、主に細胞外免疫グロブリン可変領域様ドメイン、疎水性膜貫通領域、及び細胞内領域を含み、その細胞内領域は、独立した2つのリン酸化部位を含み、それぞれ免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ(ITIM)及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ(ITSM)である。PD−1は、主に活性化T細胞の表面に誘導的に発現し、B細胞、NK細胞、単球、DC細胞にも発現し、T細胞活性化の負の調節に主に関与し、免疫応答の強さ及び持続期間を調節することができる。PD−1のリガンドは、PD−L1(programmed death ligand 1)、PD−L2(programmed death ligand 2)を含み、そのリガンドは、B7ファミリーに属し、PD−L1は、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、DC細胞、及び内皮細胞、表皮細胞などを含む複数種の免疫細胞の表面に誘導的に発現するが、PD−L2は、マクロファージ、DC細胞、B細胞を含む幾つかの免疫細胞にのみ誘導的に発現する。PD−L1は、PD−1のリガンドとして機能することに加えて、CD80のリガンドとしても機能し、T細胞に負の調節シグナルを伝達し、T細胞による免疫寛容を誘導することができる(Autoimmun Rev、2013、12(11):1091−1100.Front Immunol、2013、4:481.Nat Rev Cancer、2012、12(4):252−264.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24−33.Clin Cancer Res.2012 Dec 15;18(24):6580−7.)。正常な状態には、PD−1及びPD−L1は、生体組織の自己免疫寛容を仲介して維持し、炎症反応中の免疫系の過剰な活性化による自己組織の損傷を防止し、自己免疫疾患の発生を回避するのに積極的な役割を果たし、病理学的状態には、腫瘍免疫および種々の自己免疫疾患の発生及び進行に関与する。多くの文献には、PD−L1は複数の腫瘍組織で高度に発現し、PD−1は腫瘍浸潤リンパ球で高度に発現し、且つPD−L1、PD−1の過剰発現は腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連していることが報告されている。(Anticancer Agents Med Chem.2015;15(3):307−13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014 Mar;7(1):1−17.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24−33.Immunity.2013 Jul 25;39(1):61−73.J Clin Oncol.2015 Jun 10;33(17):1974−82.)。PD−1モノクローナル抗体によるPD−1/PD−L1、PD−1/PD−L2のブロック又はPD−L1モノクローナル抗体によるPD−1/PD−L1、CD80/PD−L1のブロックは、臨床的に優れた抗腫瘍効果を示す。現在、PD−1モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部癌などを含む複数の腫瘍の治療のために米国FDAによって承認されている。PD−L1モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌及び尿路上皮癌の治療にも承認されている。しかしながら、このようなモノクローナル抗体療法から恩恵を受けることができるのは、ごく一部の癌患者のみであり、ほとんどの患者はこのようなモノクローナル抗体に反応しない(Expert Opin Ther Targets.2014 Dec;18(12):1407−20.Oncology(Williston Park).2014 Nov;28 Suppl 3:15−28.)。
プログラム細胞死−1(programmed death−1、PD−1)は、近年大きな注目を集めている免疫チェックポイント(immune checkpoint)となり、CD28ファミリーメンバーに属する。CD28ファミリーの他のメンバー、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合二量体を形成できるCTLA4と異なり、PD−1は、単量体として存在する。PD−1の構造は、主に細胞外免疫グロブリン可変領域様ドメイン、疎水性膜貫通領域、及び細胞内領域を含み、その細胞内領域は、独立した2つのリン酸化部位を含み、それぞれ免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ(ITIM)及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ(ITSM)である。PD−1は、主に活性化T細胞の表面に誘導的に発現し、B細胞、NK細胞、単球、DC細胞にも発現し、T細胞活性化の負の調節に主に関与し、免疫応答の強さ及び持続期間を調節することができる。PD−1のリガンドは、PD−L1(programmed death ligand 1)、PD−L2(programmed death ligand 2)を含み、そのリガンドは、B7ファミリーに属し、PD−L1は、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、DC細胞、及び内皮細胞、表皮細胞などを含む複数種の免疫細胞の表面に誘導的に発現するが、PD−L2は、マクロファージ、DC細胞、B細胞を含む幾つかの免疫細胞にのみ誘導的に発現する。PD−L1は、PD−1のリガンドとして機能することに加えて、CD80のリガンドとしても機能し、T細胞に負の調節シグナルを伝達し、T細胞による免疫寛容を誘導することができる(Autoimmun Rev、2013、12(11):1091−1100.Front Immunol、2013、4:481.Nat Rev Cancer、2012、12(4):252−264.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24−33.Clin Cancer Res.2012 Dec 15;18(24):6580−7.)。正常な状態には、PD−1及びPD−L1は、生体組織の自己免疫寛容を仲介して維持し、炎症反応中の免疫系の過剰な活性化による自己組織の損傷を防止し、自己免疫疾患の発生を回避するのに積極的な役割を果たし、病理学的状態には、腫瘍免疫および種々の自己免疫疾患の発生及び進行に関与する。多くの文献には、PD−L1は複数の腫瘍組織で高度に発現し、PD−1は腫瘍浸潤リンパ球で高度に発現し、且つPD−L1、PD−1の過剰発現は腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連していることが報告されている。(Anticancer Agents Med Chem.2015;15(3):307−13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014 Mar;7(1):1−17.Trends Mol Med.2015 Jan;21(1):24−33.Immunity.2013 Jul 25;39(1):61−73.J Clin Oncol.2015 Jun 10;33(17):1974−82.)。PD−1モノクローナル抗体によるPD−1/PD−L1、PD−1/PD−L2のブロック又はPD−L1モノクローナル抗体によるPD−1/PD−L1、CD80/PD−L1のブロックは、臨床的に優れた抗腫瘍効果を示す。現在、PD−1モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部癌などを含む複数の腫瘍の治療のために米国FDAによって承認されている。PD−L1モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌及び尿路上皮癌の治療にも承認されている。しかしながら、このようなモノクローナル抗体療法から恩恵を受けることができるのは、ごく一部の癌患者のみであり、ほとんどの患者はこのようなモノクローナル抗体に反応しない(Expert Opin Ther Targets.2014 Dec;18(12):1407−20.Oncology(Williston Park).2014 Nov;28 Suppl 3:15−28.)。
血管新生は、血管新生は腫瘍の進行及び転移の重要な要素であり、治療の予後に深刻な影響を及ぼす(Nat Rev Drug Discov、2007、6:273−286.Cancer Res、1999、59:856−861)。VEGFシグナル伝達経路は、主に6種類のリガンド(VEGF−A、−B、−C、−D、−E及びPGF)及び3種類の受容体(VEGFR1、VEGFR2及びVEGFR3)を含み、VEGF−A、即ち、いわゆるVEGF及びその主要な受容体であるVEGFR2は、腫瘍の血管新生における最も重要な調節因子である(Nat Med、2003、9:669−676、2003.J.Biol.Chem.、1991、266:11947−11954)。VEGFは、血管新生促進因子として、血管の透過性を高め、内皮細胞の増殖及び移動を刺激し、腫瘍の血管新生を促進し、腫瘍の成長、浸潤、転移に関与することができる。VEGFは、複数種のヒト腫瘍で発現が亢進していることが発見されているが、その発現の亢進は、腫瘍組織の血管新生の数に直接関係し、腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連し、これらの腫瘍は、乳がん、大腸がん、非小細胞性肺癌、卵巣がんなどを含む(N.Engl.J.Med.、1995、333:1757−1763.Gasparini G.J.Clin.Oncol.、1995、13:765−782.)。VEGFシグナル伝達経路の遮断は、前臨床、臨床試験でも良好な抗腫瘍効果が示されている。現在、VEGFモノクローナル抗体は、非小細胞肺癌、大腸がんなどを含む複数の腫瘍の治療に承認されている(Int.J.Cancer、2002、102:102−108.Br.J.Cancer、2001、85:584−589.Cancer Res.、2000、60:5117−5124.J.Clin.Oncol.、2003;21:60−65.J.Clin.Oncol.、2004、22:2184−2191.)
最近の研究により、VEGFは腫瘍免疫と密接に関連していることが分かった(Immunity.2013、39(1):61−73.Cancer Metastasis Rev、2011、30(1):83−95.)。腫瘍微小環境では、アップレギュレートされたVEGFは内皮細胞に作用して接着分子の発現を阻害することにより、T細胞の接着及び浸潤を阻害し、さらに、VEGFは、複数種の免疫チェックポイント分子、例えば、PD−L1、PD−L1、TIM−3、IDOなどをアップレギュレートし、エフェクターT細胞の活性化を阻害する。PD−1シグナルとVEGFシグナルを同時に阻害すると、より良い抗腫瘍効果を有し、文献で報告されている動物実験データ及び臨床データがこの戦略を初期にサポートしている(Clin Exp Immunol、2013、172(3):500−6.Sznol et al、ASCO、GU 2015)。PD−1モノクローナル抗体とVEGFR2モノクローナル抗体の併用、PD−L1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の併用は、優れた相乗効果を示している。
最近の研究により、VEGFは腫瘍免疫と密接に関連していることが分かった(Immunity.2013、39(1):61−73.Cancer Metastasis Rev、2011、30(1):83−95.)。腫瘍微小環境では、アップレギュレートされたVEGFは内皮細胞に作用して接着分子の発現を阻害することにより、T細胞の接着及び浸潤を阻害し、さらに、VEGFは、複数種の免疫チェックポイント分子、例えば、PD−L1、PD−L1、TIM−3、IDOなどをアップレギュレートし、エフェクターT細胞の活性化を阻害する。PD−1シグナルとVEGFシグナルを同時に阻害すると、より良い抗腫瘍効果を有し、文献で報告されている動物実験データ及び臨床データがこの戦略を初期にサポートしている(Clin Exp Immunol、2013、172(3):500−6.Sznol et al、ASCO、GU 2015)。PD−1モノクローナル抗体とVEGFR2モノクローナル抗体の併用、PD−L1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の併用は、優れた相乗効果を示している。
併用投与は、2つ又は複数の抗体を順次注入するか、又は抗体を同じ剤形に作製する必要がある。しかしながら、一方、抗体を順次注入すると患者のコンプライアンスを低減させ、痛みを増加させる。他方、異なる抗体の物理的および化学的性質の違いにより、異なる抗体を同じ剤形にすることは困難またはほとんど不可能である。
上記の状況を鑑みて、依然としてもPD−1及びVEGFシグナル伝達経路を同時に遮断する新規な治療薬を研究する必要がある。
上記の状況を鑑みて、依然としてもPD−1及びVEGFシグナル伝達経路を同時に遮断する新規な治療薬を研究する必要がある。
本発明は、天然IgGの構造特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがない高度に安定なヘテロ二量体型である、PD−1及びVEGFを同時に阻害できる、新規な二機能性抗体及びその製造方法を提供し、その二機能性抗体は、PD−1及びVEGFを同時に高発現する腫瘍細胞に選択的に結合する傾向があるため、高効率で特異的な殺傷効果を発揮しつつ、毒性及び副作用が低く。
本発明に係る第1の側面は、PD−1に特異的に結合できる第1の抗原結合領域とVEGFに特異的に結合できる第2の抗原結合領域とを含むヘテロ二量体型二重特異性抗体において、前記二重特異性抗体は、1つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第1のFc領域及び第2のFc領域を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してPD−1抗原結合領域及びVEGF抗原結合領域に連結され、又はその第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してVEGF抗原結合領域及びPD−1抗原結合領域に連結され、且つ、第1のFc領域及び第2のFc領域は、以下の部位に5つのアミノ酸の置換を含み、即ち
第1のFc領域の366番目及び399番目のアミノ酸の置換、第2のFc領域の351番目、407番目及び409番目のアミノ酸の置換を含み、上記アミノ酸の置換を含む第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりも、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、Kabat EUインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、ヘテロ二量体型二重特異性抗体に関する。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域及び第2のFc領域アミノ酸の置換は、以下の通りである。
a)351番目のアミノ酸の置換は、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はトリプトファンであり、
b)366番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、プロリン、トリプトファン又はバリンであり、
c)399番目のアミノ酸の置換は、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニン又はアラニンであり、
d)407番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン又はヒスチジンであり、及び
e)409番目のアミノ酸の置換は、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン又はアルギニンである。
第1のFc領域の366番目及び399番目のアミノ酸の置換、第2のFc領域の351番目、407番目及び409番目のアミノ酸の置換を含み、上記アミノ酸の置換を含む第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりも、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、Kabat EUインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、ヘテロ二量体型二重特異性抗体に関する。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域及び第2のFc領域アミノ酸の置換は、以下の通りである。
a)351番目のアミノ酸の置換は、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はトリプトファンであり、
b)366番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、プロリン、トリプトファン又はバリンであり、
c)399番目のアミノ酸の置換は、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニン又はアラニンであり、
d)407番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン又はヒスチジンであり、及び
e)409番目のアミノ酸の置換は、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン又はアルギニンである。
幾つかの実施形態において、アミノ酸の置換は、
a)第1のFc領域のT366L及びD399Rの置換、第2のFc領域のL351E、Y407L及びK409Vの置換、
b)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351G、Y407L及びK409Cの置換、
c)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351Y、Y407A及びK409Pの置換、
d)第1のFc領域のT366P及びD399Nの置換、第2のFc領域のL351V、Y407P及びK409Sの置換、
e)第1のFc領域のT366W及びD399Gの置換、第2のFc領域のL351D、Y407P及びK409Sの置換、
f)第1のFc領域のT366P及びD399Iの置換、第2のFc領域のL351P、Y407F及びK409Fの置換、
g)第1のFc領域のT366V及びD399Tの置換、第2のFc領域のL351K、Y407T及びK409Qの置換、
h)第1のFc領域のT366L及びD399Aの置換、第2のFc領域のL351W、Y407H及びK409Rの置換、を含む。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域のアミノ酸の置換は、T366L及びD399Rであり、第2のFc領域のアミノ酸の置換は、L351E、Y407L及びK409Vである。
幾つかの実施形態において、Fc領域は、IgGに由来する。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、Fab断片、scFv断片、可変領域断片Fv、及び重鎖抗体の重鎖可変領域断片VHHから選ばれる。
a)第1のFc領域のT366L及びD399Rの置換、第2のFc領域のL351E、Y407L及びK409Vの置換、
b)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351G、Y407L及びK409Cの置換、
c)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351Y、Y407A及びK409Pの置換、
d)第1のFc領域のT366P及びD399Nの置換、第2のFc領域のL351V、Y407P及びK409Sの置換、
e)第1のFc領域のT366W及びD399Gの置換、第2のFc領域のL351D、Y407P及びK409Sの置換、
f)第1のFc領域のT366P及びD399Iの置換、第2のFc領域のL351P、Y407F及びK409Fの置換、
g)第1のFc領域のT366V及びD399Tの置換、第2のFc領域のL351K、Y407T及びK409Qの置換、
h)第1のFc領域のT366L及びD399Aの置換、第2のFc領域のL351W、Y407H及びK409Rの置換、を含む。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域のアミノ酸の置換は、T366L及びD399Rであり、第2のFc領域のアミノ酸の置換は、L351E、Y407L及びK409Vである。
幾つかの実施形態において、Fc領域は、IgGに由来する。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、Fab断片、scFv断片、可変領域断片Fv、及び重鎖抗体の重鎖可変領域断片VHHから選ばれる。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、Fab断片又はscFv断片である。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、いずれもFab断片である。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、一方がFab断片であり、他方がscFvである。
幾つかの実施形態において、Fab断片は、異なる第1の重鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域、並びに異なる第1の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖可変領域を含む。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と、又は第1のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域とは、単独で存在し、還元剤が存在する場合には、形成されたホモ二量体の重量比はいずれも50%未満である。
幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22から選ばれる。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22の対応する組み合わせである。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、いずれもFab断片である。
幾つかの実施形態において、PD−1及びVEGF抗原結合領域は、一方がFab断片であり、他方がscFvである。
幾つかの実施形態において、Fab断片は、異なる第1の重鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域、並びに異なる第1の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖可変領域を含む。
幾つかの実施形態において、第1のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と、又は第1のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域とは、単独で存在し、還元剤が存在する場合には、形成されたホモ二量体の重量比はいずれも50%未満である。
幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22から選ばれる。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22の対応する組み合わせである。
本発明に係る第2の側面では、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体コードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21から選ばれる。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21の対応する組み合わせである。
本発明に係る第3の側面は、第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
幾つかの実施形態において、発現ベクターは、pCDNAに基づいて改造されたプラスミドベクターX0GCである。
本発明に係る第4の側面は、第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は第3の側面に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21から選ばれる。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21の対応する組み合わせである。
本発明に係る第3の側面は、第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
幾つかの実施形態において、発現ベクターは、pCDNAに基づいて改造されたプラスミドベクターX0GCである。
本発明に係る第4の側面は、第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は第3の側面に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293又はHEK293細胞に基づいて改造されたHEK293T、HEK293F、HEK293E;ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づいて改造されたCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHO;大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami;酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae )、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセニューラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha);昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞High5、SF9;植物細胞;哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
本発明に係る第5の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター又は第4の側面に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む組成物に関する。
本発明に係る第5の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター又は第4の側面に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む組成物に関する。
本発明に係る第6の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体を産生する方法であって、
1)第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第3の側面に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させるステップと、
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合し、その後、混合物を酸化するステップと、を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体の製造方法に関する。
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293又はHEK293細胞に基づいて改造されたHEK293T、HEK293F、HEK293F;ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づいて改造されたCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHO;大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami;酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae )、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセニューラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha);昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞High5、SF9;植物細胞;哺乳動物の乳腺細胞、体細胞ステップから選ばれる。
1)第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第3の側面に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させるステップと、
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合し、その後、混合物を酸化するステップと、を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体の製造方法に関する。
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293又はHEK293細胞に基づいて改造されたHEK293T、HEK293F、HEK293F;ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づいて改造されたCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHO;大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami;酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae )、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセニューラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha);昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞High5、SF9;植物細胞;哺乳動物の乳腺細胞、体細胞ステップから選ばれる。
幾つかの実施形態において、還元工程は、1)還元反応は、2−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン又は他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で行うステップと、2)還元剤を除去し、例えば、還元反応は、0.1mM又はそれ以上のジチオスレイトールの存在下、4℃で少なくとも3時間行うステップと、を含む。
幾つかの実施形態において、気化工程は、空気下で酸化することであり、L−デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うことも含み、例えば、酸化反応は、0.5mM又はそれ以上のL−デヒドロアスコルビン酸の存在下、4℃で少なくとも5時間行う。
幾つかの実施形態において、前記方法は、さらに、単離精製のステップを含む。
本発明に係る第7の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター及び/又は第4の側面に記載の宿主細胞及び/又は第5の側面に記載の組成物の、対象の疾患を予防及び/又は治療するための医薬品の調製における用途に関する。
幾つかの実施形態において、気化工程は、空気下で酸化することであり、L−デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うことも含み、例えば、酸化反応は、0.5mM又はそれ以上のL−デヒドロアスコルビン酸の存在下、4℃で少なくとも5時間行う。
幾つかの実施形態において、前記方法は、さらに、単離精製のステップを含む。
本発明に係る第7の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター及び/又は第4の側面に記載の宿主細胞及び/又は第5の側面に記載の組成物の、対象の疾患を予防及び/又は治療するための医薬品の調製における用途に関する。
本発明に係る第8の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター及び/又は第4の側面に記載の宿主細胞及び/又は第5の側面に記載の組成物は、対象の疾患を予防及び/又は治療するための医薬品として用いられることに関する。
本発明に係る第9の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター及び/又は第4の側面に記載の宿主細胞及び/又は第5の側面に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む疾患を予防及び/又は治療する方法に関する。
幾つかの実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
本発明に係る第9の側面は、第1の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は第2の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は第3の側面に記載の組換え発現ベクター及び/又は第4の側面に記載の宿主細胞及び/又は第5の側面に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む疾患を予防及び/又は治療する方法に関する。
幾つかの実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
幾つかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫から選ばれる。
本発明は、天然IgGの特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがなく、高度に安定したヘテロ二量体型抗PD−1/抗VEGF二重特異性抗体である、新規な抗PD−1/抗VEGF天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体を設計している。該二重特異性抗体は、PD−1及びVEGFという2つの標的分子を同時に結合でき、複雑な疾患の治療により効果的である。本発明で調製される二重特異性抗体は、PD−1シグナル経路及びVEGFシグナル経路を同時に遮断し、患者及び医療従事者が使用するのに便利であり、新薬開発のプロセスを簡単化する。
本発明は、天然IgGの特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがなく、高度に安定したヘテロ二量体型抗PD−1/抗VEGF二重特異性抗体である、新規な抗PD−1/抗VEGF天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体を設計している。該二重特異性抗体は、PD−1及びVEGFという2つの標的分子を同時に結合でき、複雑な疾患の治療により効果的である。本発明で調製される二重特異性抗体は、PD−1シグナル経路及びVEGFシグナル経路を同時に遮断し、患者及び医療従事者が使用するのに便利であり、新薬開発のプロセスを簡単化する。
定義:
共有結合とは、ヘテロ二量体型二重特異性抗体において、2つのFc領域の間で、任意のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域が共有結合によって連結されて分子を形成することを意味する。ここで、Fc領域は、1つ又は複数の共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって連結された第1の抗原結合領及び第2の抗原結合領域を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合(例えば、イミン結合又はアミド結合)によって抗原結合領域に連結されている。
抗原結合領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用できる領域であり、それは、選択性が高く、一般的に、ある標的分子の配列を認識できるが、他の分子の配列を認識できない。代表的な抗原結合領域は、抗体可変領域、抗体可変領域のバリアント、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は酵素結合ドメインが含まれる。
共有結合とは、ヘテロ二量体型二重特異性抗体において、2つのFc領域の間で、任意のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域が共有結合によって連結されて分子を形成することを意味する。ここで、Fc領域は、1つ又は複数の共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって連結された第1の抗原結合領及び第2の抗原結合領域を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合(例えば、イミン結合又はアミド結合)によって抗原結合領域に連結されている。
抗原結合領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用できる領域であり、それは、選択性が高く、一般的に、ある標的分子の配列を認識できるが、他の分子の配列を認識できない。代表的な抗原結合領域は、抗体可変領域、抗体可変領域のバリアント、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は酵素結合ドメインが含まれる。
1つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合の連結とは、第1のFc領域及び第2のFc領域が1つ又は複数のジスルフィド結合を介して互いに連結され、ヘテロ二量体断片を形成することを意味する。本発明では、1つ又は複数のジスルフィド結合は、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域が同一の細胞内で合成される時に形成されてもよく、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域が異なる細胞内でそれぞれ合成され、その後、in vitro還元酸化によって形成されてもよい。
第1のFc領域及び第2のFc領域とは、共有結合によって連結された結合断片を意味し、共有結合は、ジスルフィド結合を含み、各領域には少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、アミノ酸配列の違いがあり、少なくとも1つのアミノ酸が異なる。本発明に係る第1のFc領域及び第2のFc領域は、同じ領域の間に強い反発力が存在するが、異なる領域の間に引力が存在するため、細胞内で共発現させると、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域はヘテロ二量体を形成する傾向がある。第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ2つの宿主細胞内で発現される場合には、第1のFc領域又は第1のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形式する傾向がなく、第2のFc領域又は第2のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。本発明では、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ2つの宿主細胞内で発現され、且つ還元剤が存在する場合には、ホモ二量体の比率は、50%未満であり、即ち、単量体(1つのFc領域、又は1つのFc領域及びそれに連結された抗原結合領域)の比率は、50%より高くなる。
第1のFc領域及び第2のFc領域とは、共有結合によって連結された結合断片を意味し、共有結合は、ジスルフィド結合を含み、各領域には少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、アミノ酸配列の違いがあり、少なくとも1つのアミノ酸が異なる。本発明に係る第1のFc領域及び第2のFc領域は、同じ領域の間に強い反発力が存在するが、異なる領域の間に引力が存在するため、細胞内で共発現させると、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域はヘテロ二量体を形成する傾向がある。第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ2つの宿主細胞内で発現される場合には、第1のFc領域又は第1のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形式する傾向がなく、第2のFc領域又は第2のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。本発明では、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ2つの宿主細胞内で発現され、且つ還元剤が存在する場合には、ホモ二量体の比率は、50%未満であり、即ち、単量体(1つのFc領域、又は1つのFc領域及びそれに連結された抗原結合領域)の比率は、50%より高くなる。
免疫グロブリンは、4本のポリペプチド鎖を有する対称的な構造であり、そのうち、2つのより長い相対分子量が比較的大きい同じ重鎖は、450〜550個のアミノ酸残基を含み、相対分子量が55000〜70000Daであり、2つのより短い相対分子量が比較的小さい同じ軽鎖(L鎖)は約210個のアミノ酸残基を含み、相対分子量が約24000Daである。異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖において、N末端に近い約110個のアミノ酸配列の変化は大きく、可変領域(variable region、V領域)と称されるが、C末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定になり、定常領域(constant region、C領域)と称される。重鎖では、可変領域が重鎖の長さの約1/4を占め、定常領域が重鎖の長さの約3/4を占める。既知の5つのIgであるIgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)及びIgE(ε)のうち、前の3類のH鎖には、3つの定常領域を有し、即ち、CH1、CH2及びCH3からなる。後の2類(IgM及びIgE)のH鎖には、1つのVH領域、及び4つの定常領域であるCH1乃至CH4を有する。定常領域は、免疫グロブリン分子の骨格であるだけでなく、免疫応答を活性化する部位の1つでもある。本発明の実施例はIgGに関するが、当業者は、必要に応じて、本発明に係る抗体のクラスを既知の方法により切り替えることができることを知っている。例えば、最初にIgMである本発明に係る抗体は、本発明に係るIgG抗体にクラススイッチされることができる。さらに、クラススイッチにより1つのIgGサブクラスを別のサブクラスに変換し、例えば、IgG1からIgG2に変換することができる。従って、本発明に係る抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプスイッチングにより、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE又はIgM抗体に変換することができる。一実施形態では、本発明に係る抗体は、IgG1抗体、例えば、IgG1,κである。
本発明に係る定常領域の一部は、少なくとも第1のFc領域と第2のFc領域が相互作用する領域を含み、IgGの場合、その領域は、CH3領域に位置するアミノ酸の一部であり、少なくともGLN347、TYR349、THR350、LEU 351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439を含む。
本発明に係る定常領域の一部は、少なくとも第1のFc領域と第2のFc領域が相互作用する領域を含み、IgGの場合、その領域は、CH3領域に位置するアミノ酸の一部であり、少なくともGLN347、TYR349、THR350、LEU 351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439を含む。
共有結合又はリンカーによる抗原結合領域への第1のFc領域及び第2のFc領域のそれぞれの連結とは、第1のFc領域及び第2のFc領域がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して抗体の抗原結合断片、又は抗原を認識できる一本鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体断片バリアント、又はリガンドを認識できる受容体、又は受容体を認識できるリガンドに連結されることを意味し、ここで、前記共有結合とは、化学結合の1つであり、2つ又は複数の原子が一緒になって外殻電子を利用して理想的な条件下で電子飽和状態になることにより形成された比較的安定した化学構造を共有結合と呼び、或いは、共有結合は原子間の共有電子対による相互作用である。同一の元素の原子又は異なる元素は、いずれも共有結合によって結合されてもよく、本発明に係る第1のFc領域と第2のFc領域の間の共有結合は、1分子のアミノ酸のアミノ基ともう1分子のアミノ酸のカルボキシル基が脱水反応によって形成されるアミド結合、又はエチレングリコールやポリエチレングリコールや他の化合物やそのポリマーのアルデヒド基が1分子のアミノ酸のアミノ基と形成されるアミド結合やイミン結合を含むが、これらに限定されない。ここで、リンカーは、2つのポリペプチド鎖を共有結合を介して連結できるアミノ酸配列又は化合物又は化合物的のポリマーであり、中でも、アミノ酸配列は、小さなペプチド、例えば、GGGGSGGGGSGGGGSを含むが、これらに限定されなく、アミド結合を介して第1のFc領域や第2のFc領域、及び抗原を認識できる一本鎖抗体や抗原を認識できる他の抗体断片バリアントを連結する。
第1のFc領域と第2のFc領域が、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりもヘテロ二量体を形成する傾向があるのは、第1のFc領域及び第2のFc領域において、同じポリペプチド鎖の間で相互に反発する作用が存在するが、異なるポリペプチド鎖の間で相互に吸引する作用が存在するので、細胞内で共発現すると、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域は、ヘテロ二量体を形成する傾向があるためである。第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域をそれぞれ2つの宿主細胞内で発現すると、第1のFc領域や第1のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域はホモ二量体を形成する傾向がなく、第2のFc領域や第2のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。
第1のFc領域と第2のFc領域が、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりもヘテロ二量体を形成する傾向があるのは、第1のFc領域及び第2のFc領域において、同じポリペプチド鎖の間で相互に反発する作用が存在するが、異なるポリペプチド鎖の間で相互に吸引する作用が存在するので、細胞内で共発現すると、第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域は、ヘテロ二量体を形成する傾向があるためである。第1のFc領域及び第2のFc領域、或いは、第1のFc領域、第2のFc領域及びそれらに連結された抗原結合領域をそれぞれ2つの宿主細胞内で発現すると、第1のFc領域や第1のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域はホモ二量体を形成する傾向がなく、第2のFc領域や第2のFc領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。
Kabat EUインデックス番号付けシステムとは、Kabatらが特定の方法により抗体配列の各アミノ酸に番号を付けることを意味し、このような各残基に番号を付ける方法は、当技術分野で標準的な方法になっている。Kabatのスキームは、彼の研究に存在しない他の抗体に拡張でき、保存的アミノ酸に基づいて、目的とする抗体をKabatにより同定されたコンセンサス配列の1つと比較する。
Fc領域とは、結晶化可能フラグメント(fragment crystallizable、Fc)を指し、IgのCH2及びCH3ドメインに相当し、Igがエフェクター分子又は細胞と相互作用する部位である。
IgGは、免疫グロブリンG(Immunoglobulin G、IgG)の略語であり、血清の主要な抗体成分であり、IgG分子のr鎖の抗原性の違いにより、ヒトIgGにはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4という4つのサブタイプがある。
Fc領域とは、結晶化可能フラグメント(fragment crystallizable、Fc)を指し、IgのCH2及びCH3ドメインに相当し、Igがエフェクター分子又は細胞と相互作用する部位である。
IgGは、免疫グロブリンG(Immunoglobulin G、IgG)の略語であり、血清の主要な抗体成分であり、IgG分子のr鎖の抗原性の違いにより、ヒトIgGにはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4という4つのサブタイプがある。
不完全抗体分子とは、抗体の1本の重鎖と1本の軽鎖からなる構造を意味し、ここで、重鎖と軽鎖は共有結合によって連結されてもよく、共有結合で連結されてなくてもよく、抗原を認識する一価抗体の構造である。
Fab断片は、分子認識配列であって、抗原結合断片(fragment of antigen binding、Fab)であり、抗体分子の2本の腕に相当し、完全な軽鎖、重鎖のVH領域及びCH1ドメインからなる。
Fv断片は、抗体分子での抗原結合部位が保持される最小機能的断片であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなり、両方が非共有結合によって結合されている。
Fab断片は、分子認識配列であって、抗原結合断片(fragment of antigen binding、Fab)であり、抗体分子の2本の腕に相当し、完全な軽鎖、重鎖のVH領域及びCH1ドメインからなる。
Fv断片は、抗体分子での抗原結合部位が保持される最小機能的断片であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなり、両方が非共有結合によって結合されている。
scFv断片は、分子認識配列であって、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が遺伝子工学で改造されて得られた抗体断片の構造異性体である。膜受容の細胞外領域は、分子認識配列であり、膜受容体は、一般的に、受容体を細胞表面の膜貫通領域にアンカーするように細胞外部に位置する対応する抗原又はリガンドを認識して結合できる細胞外領域、及び細胞内でキナーゼ活性又はシグナル伝達経路を持つことができる細胞内領域を含む。細胞膜受容体のリガンドとは、膜受容体の細胞外領域で認識されて結合されたタンパク質、小さなペプチド又は化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン又は他の刺激物質によって誘導されて複数種の細胞に産生した低分子量可溶性タンパク質であり、自然免疫及び適応免疫の調節、造血、細胞増殖、APSC多能性細胞及び損傷組織の修復などの様々な機能がある。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分けられる。プロテインタグとは、目的タンパク質のN末端又はC末端に組み込まれたアミノ酸配列を指し、小さなペプチドでも長鎖アミノ酸配列でもよく、タグが組み込まれると、タンパク質の正しい折りたたみ、タンパクの単離精製、細胞内タンパク質の分解の低減に有利であることができ、一般的なタグは、HA、SUMO、His、GST、GFP、Flagを含むが、これらに限定されない。
VHH断片は、重鎖抗体の単独した可変領域(Variable domain of the heavy−chain of heavy−chain antibody)であり、抗原結合能力を有する。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体に適用可能な抗体は、限定されない。好ましくは、疾患を治療及び/又は予防するために使用できる従来技術で既知の抗体は、いずれも本発明に適用できる。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体は、1つ又は複数の置換、欠失、付加及び/又は挿入を有することができる。例えば、あるアミノ酸は、他のポリペプチド(例えば、抗原)又は細胞に結合する能力を大幅に失うことなく、タンパク質構造内の他のアミノ酸を置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の性質によって決定されるため、それらの生物学的効果または活性を大幅に失うことなく、タンパク質配列に特定のアミノ酸配列の置換を行うことができる。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体に適用可能な抗体は、限定されない。好ましくは、疾患を治療及び/又は予防するために使用できる従来技術で既知の抗体は、いずれも本発明に適用できる。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体は、1つ又は複数の置換、欠失、付加及び/又は挿入を有することができる。例えば、あるアミノ酸は、他のポリペプチド(例えば、抗原)又は細胞に結合する能力を大幅に失うことなく、タンパク質構造内の他のアミノ酸を置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の性質によって決定されるため、それらの生物学的効果または活性を大幅に失うことなく、タンパク質配列に特定のアミノ酸配列の置換を行うことができる。
多くの場合には、ポリペプチドのバリアントは、1つ又は複数の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が類似する性質を有する他のアミノ酸で置換され、ペプチド化学の分野の当業者は、ポリペプチドの二次構造および親水性特性が実質的に変化しないことを期待できることを指す。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。前記の様々な特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン;グルタミン酸及びアスパラギン酸;セリン及びトレオニン;グルタミン及びアスパラギン;並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。前記の様々な特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン;グルタミン酸及びアスパラギン酸;セリン及びトレオニン;グルタミン及びアスパラギン;並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
本発明で使用される「同一性」という用語は、当技術分野でよく知られている意味を有し、当業者は、異なる配列の同一性を測定する規則、標準もよく知られており、配列アラインメント及びギャップの導入する(必要に応じて、最大パーセンテージ同一性を得る)後、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列バリアントの残基と非バリアント型配列が同一のパーセンテージであるを意味する。本発明では、同一性制限を満たす場合には、得られたバリアント配列も親配列の生物活性を有する必要がある。上記活性を利用してバリアント配列をスクリーニングする方法及び手段は当業者にとって周知である。当業者は、本出願の開示の教示の下でそのようなバリアント配列を容易に得ることができる。具体的な実施方式では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドのバリアントは本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%、又は少なくとも約99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は99.9%のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一性を持つ。遺伝暗号の冗長性により、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列のバリアントが存在する。
本発明に係る他の実施形態において、中程度から高程度までのストリンジェントな条件下で本発明で提供されるポリヌクレオチド配列又はその断片又はその相補的配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野でよく知られている。説明を目的としては、本発明に係るポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するための適切な中程度のストリンジェントな条件には、5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液で予備洗浄し、50〜60℃、5×SSC、一晩ハイブリダイズし、さらに、65℃で20分間をかけて0.1%SDSを含有する2×、0.5×及び0.2×SSCでそれぞれ2回洗浄した。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量及び/又はハイブリダイゼーション温度を変更することにより容易に制御できることを理解している。例えば、他の実施形態において、適切な高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、上記の条件を含むが、相違点は、ハイブリダイゼーション温度を高め、例えば、60〜65℃又は65〜70℃に達することにある。
本発明に係る宿主細胞は、外来遺伝子の発現のためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明に係る宿主細胞は、外来遺伝子の発現のためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明に係るベクターは、任意のタイプの細胞又は生物体内で複製できるベクターを含み、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及びミニ染色体を含む。幾つかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖や複製に適したベクター、又は本発明に係るポリペプチドを発現するのに適したベクターである。そのようなベクターは、当技術分野で知られており、購入することができる。
「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。通常、プラスミドコンストラクトは、細菌におけるプラスミドの複製及び選択のための複製起点(例えば、ColE1複製起点)及び選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性)も含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核細胞中で抗体断片を含む本発明の抗体を発現するのに必要とする制御配列又は調節要素を含むベクターを意味する。
本発明に係るベクターは、外来遺伝子の発現に使用されるすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製開始部位、プロモーター、標的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、X0GCベクターのようなpCDNAに基づいて改造されたプラスミドベクターを含むが、これに限定されない。
本発明に係る対象は、鳥類、爬虫類、哺乳類などが含まれる。好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、霊長類を含み、好ましくは、霊長類はヒトを含む。
本発明に係る疾患は、腫瘍を含むが、これに限定されなく、好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含む。
本発明に係るベクターは、外来遺伝子の発現に使用されるすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製開始部位、プロモーター、標的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、X0GCベクターのようなpCDNAに基づいて改造されたプラスミドベクターを含むが、これに限定されない。
本発明に係る対象は、鳥類、爬虫類、哺乳類などが含まれる。好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、霊長類を含み、好ましくは、霊長類はヒトを含む。
本発明に係る疾患は、腫瘍を含むが、これに限定されなく、好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含む。
薬学的に許容される担体とは、医薬分野における従来の医薬担体を指す、例えば、希釈剤、賦形剤および水など;デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロースなどの充填剤;セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどのバインダー;グリセリンなどの湿潤剤;カルボキシメチルスターチナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロース、寒天、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤;第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤;セチルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤;カオリンや石けん粘土などの吸着担体;タルク、ステアリン酸カルシウム、マグネシウム、微粉化シリカゲル、ポリエチレングリコールなどの潤滑剤である。また、フレーバー、甘味料などの他のアジュバントを組成物に加えることができる。
以下、本発明を非限定的な実施例によってさらに説明するが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく本発明に多くの変更を加えることができ、そのような変更も本発明の範囲内にあることを知っている。
以下の実験方法は、特に断りがない限り、いずれも常法であり、使用される実験材料は、特に断りがない限り、市販として容易に入手できる。本発明の下記の実施例で使用される様々な抗体は、いずれも市販としての標準的な抗体に由来する。
以下、本発明を非限定的な実施例によってさらに説明するが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく本発明に多くの変更を加えることができ、そのような変更も本発明の範囲内にあることを知っている。
以下の実験方法は、特に断りがない限り、いずれも常法であり、使用される実験材料は、特に断りがない限り、市販として容易に入手できる。本発明の下記の実施例で使用される様々な抗体は、いずれも市販としての標準的な抗体に由来する。
実施例1 抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のベクター構築
抗ヒトPD−1抗体PD−1(Pembro)の重鎖及び軽鎖を含むX0GC発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、http://www.imgt.org/3Dstructure−DB/cgi/details.cgi?pdbcode=9798に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.9で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.10で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.11で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.12で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.13で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.14で表され、その重鎖配列は、PD−1(Pembro)−Fc1と称された。PCR法によりそれぞれ軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を増幅した。本願で使用される全てのPCR反応は、いずれもNEB社のPhusion ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ(F−530L)を使用した。PCRプライマーは、塩基対の相補性の原則及び酵素切断部位の要求に応じて一般的に設計された。反応系は、いずれも、H2O 8.9μl、5×Phusion ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼバッファー 4μl、1mM dNTP 4μl、上流プライマー 1μl、下流プライマー 1μl、Phusion ハイフィデリティ DNAポリメラーゼ 0.1μl、テンプレート1μlである。可変領域及び定常領域のPCR産物は、1.5%アガロースゲル電気泳動後、DNA回収キット(Promega、A9282、以下同じ)で対応する断片を回収した。回収された可変領域断片及び定常領域断片をテンプレートとし、可変領域の上流プライマー及び定常領域の下流プライマーを使用し、他のラウンドのPCR反応を実行し、その後、さらに対応する断片を回収し、重鎖及び軽鎖全長断片を得た。X0GCベクター及び全長断片をEcoRI(NEB、型番R3101L)及びHindIII(NEB、型番R3104L)で消化し、消化反応系は、10×バッファー3 2μl、EcoRI及びHindIIIのそれぞれ0.5μl、ゲルから回収された全長断片3μl、H2O 14.5μlである。消化反応系は、37℃の条件下で3時間反応した。消化産物は、T4DNAリガーゼ(NEB、型番M0202V)で連結され(以下同じ)、反応系は、10×リガーゼバッファー2μl、リガーゼ0.5μl、ゲルから回収された全長断片3μl、ゲルから回収されたX0GCベクター3μl、H2O 11.5μlである。連結は、室温で反応を12時間行った。連結した産物を大腸菌DH5αコンピテントセル(天根、CB104、以下同じ)に形質転換した。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
抗ヒトPD−1抗体PD−1(Pembro)の重鎖及び軽鎖を含むX0GC発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、http://www.imgt.org/3Dstructure−DB/cgi/details.cgi?pdbcode=9798に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.9で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.10で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.11で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.12で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.13で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.14で表され、その重鎖配列は、PD−1(Pembro)−Fc1と称された。PCR法によりそれぞれ軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を増幅した。本願で使用される全てのPCR反応は、いずれもNEB社のPhusion ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ(F−530L)を使用した。PCRプライマーは、塩基対の相補性の原則及び酵素切断部位の要求に応じて一般的に設計された。反応系は、いずれも、H2O 8.9μl、5×Phusion ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼバッファー 4μl、1mM dNTP 4μl、上流プライマー 1μl、下流プライマー 1μl、Phusion ハイフィデリティ DNAポリメラーゼ 0.1μl、テンプレート1μlである。可変領域及び定常領域のPCR産物は、1.5%アガロースゲル電気泳動後、DNA回収キット(Promega、A9282、以下同じ)で対応する断片を回収した。回収された可変領域断片及び定常領域断片をテンプレートとし、可変領域の上流プライマー及び定常領域の下流プライマーを使用し、他のラウンドのPCR反応を実行し、その後、さらに対応する断片を回収し、重鎖及び軽鎖全長断片を得た。X0GCベクター及び全長断片をEcoRI(NEB、型番R3101L)及びHindIII(NEB、型番R3104L)で消化し、消化反応系は、10×バッファー3 2μl、EcoRI及びHindIIIのそれぞれ0.5μl、ゲルから回収された全長断片3μl、H2O 14.5μlである。消化反応系は、37℃の条件下で3時間反応した。消化産物は、T4DNAリガーゼ(NEB、型番M0202V)で連結され(以下同じ)、反応系は、10×リガーゼバッファー2μl、リガーゼ0.5μl、ゲルから回収された全長断片3μl、ゲルから回収されたX0GCベクター3μl、H2O 11.5μlである。連結は、室温で反応を12時間行った。連結した産物を大腸菌DH5αコンピテントセル(天根、CB104、以下同じ)に形質転換した。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
本発明は、同時に、他の抗ヒトPD−1抗体PD−1(BJHM)の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを構築した。ここで、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.15で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.16で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.17で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.18で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.13で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.14で表され、その重鎖配列は、PD−1(BJHM)−Fc1と称された。抗ヒトPD−1抗体PD−1(BJHM)の重鎖可変領域配列を他の重鎖定常領域配列に連結し、ここで、その重鎖定常領域のヌクレオチド配列がSEQ ID No.19で表され、アミノ酸配列がSEQ ID No.20で表され、その重鎖配列がPD−1(BJHM)−Fc2と称された。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
抗ヒトVEGF抗体VEGF(Bevaci)重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、https://www.drugbank.ca/drugs/DB00112に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.1で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.2で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、SEQ ID No.5で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.6で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.13で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.14で表され、その重鎖配列は、VEGF(Bevaci)−Fc1と称された。抗ヒトVEGF抗体VEGF(Bevaci)の重鎖可変領域配列を他の重鎖定常領域配列に連結し、ここで、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.19で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.20で表され、その重鎖配列は、VEGF(Bevaci)−Fc2と称された。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
抗ヒトVEGF抗体VEGF(Bevaci)重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、https://www.drugbank.ca/drugs/DB00112に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.1で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.2で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、SEQ ID No.5で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.6で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.13で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.14で表され、その重鎖配列は、VEGF(Bevaci)−Fc1と称された。抗ヒトVEGF抗体VEGF(Bevaci)の重鎖可変領域配列を他の重鎖定常領域配列に連結し、ここで、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.19で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.20で表され、その重鎖配列は、VEGF(Bevaci)−Fc2と称された。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
本発明は、同時に、他の抗ヒトVEGF抗体VEGF(G631)の重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターを構築した。ここで、抗体可変領域配列は、US20060280747に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.7で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.8で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.3で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.4で表され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、SEQ ID No.21で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.22で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID No.19で表され、アミノ酸配列は、SEQ ID No.20で表され、その重鎖配列は、VEGF(G631)−Fc2と称された。抗体重鎖及び軽鎖のX0GC発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
実施例2 抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の発現
抗ヒトPD−1抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを293F細胞(FreeStyleTM293−F Cells、型番R79007、invitrogen)にそれぞれトランスフェクトし、また、それぞれ抗ヒトVEGF抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを293F細胞にもトランスフェクトした。トランスフェクションの1日前に細胞を接種し、トランスフェクション当日に細胞を遠心分離して細胞を収集し、新鮮なFreeStyleTM293発現培地(FreeStyleTM293Expression Medium、型番12338001、Gibco)に細胞を細胞密度が200×105cells/mLで再懸濁した。最終濃度が36.67ug/mLになるように、トランスフェクション容量に従ってプラスミドを加え、均一になるように軽く混合して、その後、線形PEI(ポリエチレンイミン、線形、M.W.25000、型番43896、Alfa Aesar)を加え、最終濃度は55ug/mLであり、均一になるように軽く混合した。次いで、インキュベーターに入れ、120rpmのシェーカーにて37℃で1時間インキュベートした。その後、トランスフェクション容量の19倍の新鮮な培地を加えた。120rpmのシェーカーにて37℃でインキュベートし続けた。5〜6日間トランスフェクトされた細胞培養上清を遠心収集した。
ELISA法により発現量を測定した。カラムクロマトグラフィーを使用して精製する前に、0.2μmフィルターでろ過して沈殿を除去した。この工程は4℃で行った。
抗ヒトPD−1抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを293F細胞(FreeStyleTM293−F Cells、型番R79007、invitrogen)にそれぞれトランスフェクトし、また、それぞれ抗ヒトVEGF抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを293F細胞にもトランスフェクトした。トランスフェクションの1日前に細胞を接種し、トランスフェクション当日に細胞を遠心分離して細胞を収集し、新鮮なFreeStyleTM293発現培地(FreeStyleTM293Expression Medium、型番12338001、Gibco)に細胞を細胞密度が200×105cells/mLで再懸濁した。最終濃度が36.67ug/mLになるように、トランスフェクション容量に従ってプラスミドを加え、均一になるように軽く混合して、その後、線形PEI(ポリエチレンイミン、線形、M.W.25000、型番43896、Alfa Aesar)を加え、最終濃度は55ug/mLであり、均一になるように軽く混合した。次いで、インキュベーターに入れ、120rpmのシェーカーにて37℃で1時間インキュベートした。その後、トランスフェクション容量の19倍の新鮮な培地を加えた。120rpmのシェーカーにて37℃でインキュベートし続けた。5〜6日間トランスフェクトされた細胞培養上清を遠心収集した。
ELISA法により発現量を測定した。カラムクロマトグラフィーを使用して精製する前に、0.2μmフィルターでろ過して沈殿を除去した。この工程は4℃で行った。
実施例3.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体発現産物の精製
AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィー用カラムrProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.、22ml、GE Healthcare)を使用して4℃で精製した。まず、カラムを移動相A(20mM リン酸ナトリウムバッファー、150mM 塩化ナトリウム、pH 7.4)で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記の処理後の細胞上清を5ml/minの流速でロードした後、移動相Aで平衡化を行った。サンプルは、それぞれ実施例2で発現した抗PD−1発現産物及び抗VEGF発現産物である。その後、まず、移動相B1(0.5M アルギニンを含む移動相A)で5カラムボリュームを洗浄し、その後、移動相B2(100mM クエン酸、pH 3.0)で5カラムボリュームを溶出し、目的タンパク質ピークである溶出ピークを収集し、以上の溶出ステップの流速は、いずれも5ml/minである。抗PD−1(BJHM)−Fc1の溶出ピークのクロマトグラムは、図1に示され、抗PD−1(Pembro)−Fc1、PD−1(BJHM)−Fc2、VEGF(G631)−Fc2、VEGF(Bevaci)−Fc1、VEGF(Bevaci)−Fc2の溶出ピークはそれに類似した(結果が含まれていない)。マークされた溶出ピーク(図中の灰色領域)を収集し、1M酢酸ナトリウム溶液を滴下してpHを5.0に調整した。
AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィー用カラムrProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.、22ml、GE Healthcare)を使用して4℃で精製した。まず、カラムを移動相A(20mM リン酸ナトリウムバッファー、150mM 塩化ナトリウム、pH 7.4)で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記の処理後の細胞上清を5ml/minの流速でロードした後、移動相Aで平衡化を行った。サンプルは、それぞれ実施例2で発現した抗PD−1発現産物及び抗VEGF発現産物である。その後、まず、移動相B1(0.5M アルギニンを含む移動相A)で5カラムボリュームを洗浄し、その後、移動相B2(100mM クエン酸、pH 3.0)で5カラムボリュームを溶出し、目的タンパク質ピークである溶出ピークを収集し、以上の溶出ステップの流速は、いずれも5ml/minである。抗PD−1(BJHM)−Fc1の溶出ピークのクロマトグラムは、図1に示され、抗PD−1(Pembro)−Fc1、PD−1(BJHM)−Fc2、VEGF(G631)−Fc2、VEGF(Bevaci)−Fc1、VEGF(Bevaci)−Fc2の溶出ピークはそれに類似した(結果が含まれていない)。マークされた溶出ピーク(図中の灰色領域)を収集し、1M酢酸ナトリウム溶液を滴下してpHを5.0に調整した。
実施例4.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の精製
抗PD−1/抗VEGFヘテロ二量体抗体の分子構造は、図2に示された。
上記の実施例3においてrProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.、22ml、GE Healthcare)の方法により得られた抗PD−1及び抗VEGF発現産物は、in vitroで組換えを行ってヘテロ二量体を得た。まず、上記精製で收集されたタンパク質溶液は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液をリン酸塩緩衝液(phosphate buffer saline、PBS)PBS(pH=7.4)に置き換えた。得られた抗PD−1及び抗VEGF発現産物に、それぞれ前記PBSを加えて1mg/mlに調整し、最終容量の1/200の1M DTTを加え、DTTの最終濃度はそれぞれ5mMであり、4℃の条件下で還元を行い(3〜8時間)、還元プロセスによりジスルフィド結合が開かれ、抗PD−1及び抗VEGF発現産物に含まれている一部の抗体ホモ二量体分子のヒンジ領域ジスルフィド結合も開かれ、1本の重鎖と1本の軽鎖とを含む不完全抗体分子を形成し、その構造は図3に示した。還元されたサンプルが1mM DTT還元剤が含まれた移動相バッファーを用いたSEC−HPLCにより分析された結果は、図4の図A及び図Bに示すように、抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2を例として、ホモ二量体分子の重量比はいずれも10%未満であり、それに対応して、不完全抗体分子の重量比は、いずれも90%を超えた。
抗PD−1/抗VEGFヘテロ二量体抗体の分子構造は、図2に示された。
上記の実施例3においてrProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.、22ml、GE Healthcare)の方法により得られた抗PD−1及び抗VEGF発現産物は、in vitroで組換えを行ってヘテロ二量体を得た。まず、上記精製で收集されたタンパク質溶液は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液をリン酸塩緩衝液(phosphate buffer saline、PBS)PBS(pH=7.4)に置き換えた。得られた抗PD−1及び抗VEGF発現産物に、それぞれ前記PBSを加えて1mg/mlに調整し、最終容量の1/200の1M DTTを加え、DTTの最終濃度はそれぞれ5mMであり、4℃の条件下で還元を行い(3〜8時間)、還元プロセスによりジスルフィド結合が開かれ、抗PD−1及び抗VEGF発現産物に含まれている一部の抗体ホモ二量体分子のヒンジ領域ジスルフィド結合も開かれ、1本の重鎖と1本の軽鎖とを含む不完全抗体分子を形成し、その構造は図3に示した。還元されたサンプルが1mM DTT還元剤が含まれた移動相バッファーを用いたSEC−HPLCにより分析された結果は、図4の図A及び図Bに示すように、抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2を例として、ホモ二量体分子の重量比はいずれも10%未満であり、それに対応して、不完全抗体分子の重量比は、いずれも90%を超えた。
その後、還元された抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2不完全抗体分子を等モル比で混合し、組換え反応は4℃の条件下で24時間行い、組み換え中、抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2不完全抗体分子は、CH2/CH3の非共有結合力により抗PD−1及び抗VEGF不完全抗体分子の両方を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体を形成し、その後、タンパク質溶液を限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液をリン酸塩溶液(PBS、pH=7.4)に置き換えて還元を終了し、空気又は酸化剤により酸化反応を行い、ヘテロ二量体型二重特異性抗体のジスルフィド結合を再形成した。酸化反応の条件は、酸化剤としてL−デヒドロアスコルビン酸 100mMを加え、タンパク質の最終濃度が1mg/mlであり、酸化剤の最終濃度が1mMであり、4℃の条件下で酸化し、24時間反応させた。上記酸化反応で得られたサンプルをSDS−PAGEにより分析した結果は、図5に示した。
上記抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2不完全抗体分子が還元酸化を経て得られたヘテロ二量体分子は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液を10mM リン酸ナトリウムバッファーに置き換え、pH 5.8であった。AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びイオンクロマトグラフィー用カラムSource 15S(16mm I.D.、17ml、GE Healthcare)を使用して4℃で精製した。まず、カラムを移動相A(10mM リン酸ナトリウム、pH 7.0)で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記処理されたタンパク質溶液を流速3ml/minでロードし、ロードした後、移動相Aで平衡化し、次いでA(10mM リン酸ナトリウム、pH 5.8)からB(10mM リン酸ナトリウム、pH 5.8)までの勾配で20カラムボリュームを洗浄し(0%B〜100%B、170min、流速2ml/min)、マークされた溶出した主ピークを収集し、收集されたタンパク質溶液を限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液をリン酸塩溶液(PBS、pH=7.4)に置き換え、ろ過し、滅菌し、4℃で保存した。精製産物は、SEC−HPLCによる純度の分析を行った結果を図6に示し、純度が98.6%である。RPC−HPLCによる純度の分析を行った結果は図7に示し、純度は98.8%である。
上記抗PD−1(BJHM)−Fc1及び抗VEGF(Bevaci)−Fc2不完全抗体分子が還元酸化を経て得られたヘテロ二量体分子は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液を10mM リン酸ナトリウムバッファーに置き換え、pH 5.8であった。AKTA explorer 100型タンパク質精製システム(GE Healthcare)及びイオンクロマトグラフィー用カラムSource 15S(16mm I.D.、17ml、GE Healthcare)を使用して4℃で精製した。まず、カラムを移動相A(10mM リン酸ナトリウム、pH 7.0)で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記処理されたタンパク質溶液を流速3ml/minでロードし、ロードした後、移動相Aで平衡化し、次いでA(10mM リン酸ナトリウム、pH 5.8)からB(10mM リン酸ナトリウム、pH 5.8)までの勾配で20カラムボリュームを洗浄し(0%B〜100%B、170min、流速2ml/min)、マークされた溶出した主ピークを収集し、收集されたタンパク質溶液を限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し(公称分画分子量10kDa)、溶液をリン酸塩溶液(PBS、pH=7.4)に置き換え、ろ過し、滅菌し、4℃で保存した。精製産物は、SEC−HPLCによる純度の分析を行った結果を図6に示し、純度が98.6%である。RPC−HPLCによる純度の分析を行った結果は図7に示し、純度は98.8%である。
実施例5.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の標的結合活性
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の単一の抗原と結合する能力を測定した。
ELISAの具体的な実施手順は、pH=9.6の炭酸塩緩衝液で96ウェルプレートに組換えヒトPD−1(北京義翹神州、型番10377−H08H)又はヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)又はマウスVEGF(北京義翹神州、型番50159−MNAB)を被覆し、被覆濃度は1μg/mLであり、1ウェル当たり100μLであり、4℃で一晩被覆した。PBSTで5回洗浄した。5%スキムミルク及び1%BSA含有PBSTにて300μL/ウェルでブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%BSA含有PBSTに1:10000で希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(Chemicon、型番AP309P)を加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。比色基質TMBを100μL/ウェルで加え、室温で10分間発色させた。1M H2SO4を100μL/ウェルで加え、発色を停止させた。450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の単一の抗原と結合する能力を測定した。
ELISAの具体的な実施手順は、pH=9.6の炭酸塩緩衝液で96ウェルプレートに組換えヒトPD−1(北京義翹神州、型番10377−H08H)又はヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)又はマウスVEGF(北京義翹神州、型番50159−MNAB)を被覆し、被覆濃度は1μg/mLであり、1ウェル当たり100μLであり、4℃で一晩被覆した。PBSTで5回洗浄した。5%スキムミルク及び1%BSA含有PBSTにて300μL/ウェルでブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%BSA含有PBSTに1:10000で希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(Chemicon、型番AP309P)を加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。比色基質TMBを100μL/ウェルで加え、室温で10分間発色させた。1M H2SO4を100μL/ウェルで加え、発色を停止させた。450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図8のA及びBに示すように、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体、抗PD−1(BJHM)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体、抗PD−1(BJHM)/VEGF(Bevaci)ヘテロ二量体抗体、抗VEGF(Bevaci)/PD−1(BJHM)ヘテロ二量体抗体は、いずれもヒトPD−1に対する高親和力を持ち、PD−1(Pembro)モノクローナル抗体、PD−1(BJHM)モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等またはわずかに弱くなり、中でも、PD−1(BJHM)によるヘテロ二量体は、PD−1(Pembro)によるヘテロ二量体よりもわずかに強い親和力を有した。図8のC及びDに示されるように、全ての抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体は、いずれもヒトVEGFに対する高親和力を有し、VEGF(G631)モノクローナル抗体、VEGF(Bevaci)モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。図8のEに示すように、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体は、マウスVEGFに対する高親和力を有し、VEGF(G631)モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。
実施例6.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の二標的同時結合活性
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の2つの異なる抗原と同時に結合する能力を測定した。
ELISAの具体的な実施手順は、pH=9.6の炭酸塩緩衝液で96ウェルプレートに組換えヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)を被覆し、被覆濃度は1μg/mLであり、1ウェル当たり100μLであり、4℃で一晩被覆した。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTにて300μL/ウェルでブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%BSA含有PBSTに希釈されたビオチン標識PD−1−Fc(北京韓美薬品)を0.5μg/mLで加え、1ウェル当たり100μLであり、25℃で1時間インキュベートした。1%BSA含有PBSTに1:1000で希釈されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(BD Pharmingen、型番554066)、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。比色基質TMBを100μL/ウェルで加え、室温で10分間発色させた。1M H2SO4を100μL/ウェルで加え、発色を停止させた。450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図9に示すように、PD−1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の組み合わせがPD−1、VEGFに同時結合できなく、抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のみが2つの抗原に同時結合する活性を有することを示した。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の2つの異なる抗原と同時に結合する能力を測定した。
ELISAの具体的な実施手順は、pH=9.6の炭酸塩緩衝液で96ウェルプレートに組換えヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)を被覆し、被覆濃度は1μg/mLであり、1ウェル当たり100μLであり、4℃で一晩被覆した。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTにて300μL/ウェルでブロッキングし、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。次いで、1%BSA含有PBSTに希釈されたビオチン標識PD−1−Fc(北京韓美薬品)を0.5μg/mLで加え、1ウェル当たり100μLであり、25℃で1時間インキュベートした。1%BSA含有PBSTに1:1000で希釈されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(BD Pharmingen、型番554066)、1ウェルあたり100μL加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した。比色基質TMBを100μL/ウェルで加え、室温で10分間発色させた。1M H2SO4を100μL/ウェルで加え、発色を停止させた。450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図9に示すように、PD−1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の組み合わせがPD−1、VEGFに同時結合できなく、抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のみが2つの抗原に同時結合する活性を有することを示した。
実施例7.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のVEGF中和活性
ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの増殖は、VEGFによって調節され、その初代細胞を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のVEGF中和活性を測定した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECは、PromoCell(型番:C−12203)から入手した。HUVEC細胞は、ECGM−2培地(PromoCell、型番:C−22011)、37℃、5%CO2のインキュベーターで培養された。分析用培地は、ECBM−2(PromoCell、型番:C−22211)培地であり、0.4%FBS(Hyclone、型番:SH30084.03)を含む。トリプシン消化によりHUVECを収集し、ECBM−2培地で2回洗浄し、分析用培地に再懸濁し、細胞密度は1×105個/mLであり、100μL/ウェルで96ウェルプレートに播種し、即ち、1ウェルあたり10000個の細胞である。分析用培地で希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを50μL/ウェルで加え、さらに、分析用培地で段階希釈されたヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)を50μL/ウェルで加え、最終濃度が50ng/mLであった。細胞培養用プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターに入れて3日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞培養用プレートの各ウェルにMTS(CellTiter96Aqueous One Solution、Promega、型番:G358B)40μLを加えて細胞活力を検出した。細胞培養用プレートをインキュベーターで3〜4時間インキュベートし続け、その後、490nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図10に示すように、抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体は、良好なVEGF中和活性を有し、VEGFモノクローナル抗体と同等であることを示した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの増殖は、VEGFによって調節され、その初代細胞を使用して抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のVEGF中和活性を測定した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECは、PromoCell(型番:C−12203)から入手した。HUVEC細胞は、ECGM−2培地(PromoCell、型番:C−22011)、37℃、5%CO2のインキュベーターで培養された。分析用培地は、ECBM−2(PromoCell、型番:C−22211)培地であり、0.4%FBS(Hyclone、型番:SH30084.03)を含む。トリプシン消化によりHUVECを収集し、ECBM−2培地で2回洗浄し、分析用培地に再懸濁し、細胞密度は1×105個/mLであり、100μL/ウェルで96ウェルプレートに播種し、即ち、1ウェルあたり10000個の細胞である。分析用培地で希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを50μL/ウェルで加え、さらに、分析用培地で段階希釈されたヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)を50μL/ウェルで加え、最終濃度が50ng/mLであった。細胞培養用プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターに入れて3日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞培養用プレートの各ウェルにMTS(CellTiter96Aqueous One Solution、Promega、型番:G358B)40μLを加えて細胞活力を検出した。細胞培養用プレートをインキュベーターで3〜4時間インキュベートし続け、その後、490nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図10に示すように、抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体は、良好なVEGF中和活性を有し、VEGFモノクローナル抗体と同等であることを示した。
実施例8.抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体のT細胞調節活性
混合リンパ球反応(MLR)によりT細胞免疫応答に対する抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞(DC)の取得:ヒトPBMC細胞(Lonza、型番CC−2702)を蘇生して収集した。ヒトPBMC細胞を細胞密度5×106個/mLで無血清RPMI 1640培地(Gibco、型番:22400−089)に再懸濁し、細胞培養フラスコ(Nunc、型番:156367)に播種し、37℃、CO2 インキュベーターで90分間インキュベートした。培養上清及び浮遊細胞を捨て、壁付着性細胞を完全培地(10%FBS含有RPMI 1640)で培養し、100ng/mL GM−CSF(北京義翹神州、型番10015−HNAH)及び100ng/mL IL−4(北京義翹神州、型番11846−HNAE)を加えた。3日間インキュベートし、新しい培地に交換し、さらに3日間インキュベートした。次いで、培地を100ng/mLGM−CSF、100ng/mL IL−4及び20ng/mL TNF−αを含む完全培地(10%FBS含有RPMI 1640)に交換し、1日間インキュベートした。DC細胞を得た。
混合リンパ球反応(MLR)によりT細胞免疫応答に対する抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞(DC)の取得:ヒトPBMC細胞(Lonza、型番CC−2702)を蘇生して収集した。ヒトPBMC細胞を細胞密度5×106個/mLで無血清RPMI 1640培地(Gibco、型番:22400−089)に再懸濁し、細胞培養フラスコ(Nunc、型番:156367)に播種し、37℃、CO2 インキュベーターで90分間インキュベートした。培養上清及び浮遊細胞を捨て、壁付着性細胞を完全培地(10%FBS含有RPMI 1640)で培養し、100ng/mL GM−CSF(北京義翹神州、型番10015−HNAH)及び100ng/mL IL−4(北京義翹神州、型番11846−HNAE)を加えた。3日間インキュベートし、新しい培地に交換し、さらに3日間インキュベートした。次いで、培地を100ng/mLGM−CSF、100ng/mL IL−4及び20ng/mL TNF−αを含む完全培地(10%FBS含有RPMI 1640)に交換し、1日間インキュベートした。DC細胞を得た。
ヒトT細胞の取得:このPBMCとDC細胞を誘導するPBMCが異なる個体に由来することを保証するために、ヒトPBMC細胞を蘇生して収集した。Pan T細胞分離キット(Miltenyi Biotech、型番5150414820)の取扱説明書を参照してヒトT細胞を単離した。簡単に言えば、まず、PBMCをPBS(Gibco、型番:14190−136)で1回洗浄し、さらにPBMCを107細胞あたり単離用バッファー(2mM EDTA、0.5%BSAを含有するPBS、pH=7.2)40μLで再懸濁し(以下、使用量はいずれも107細胞で計算され)、10μL Pan T cell Biotin Antibody Cocktailを加え、4℃で5分間インキュベートした。さらに、単離用バッファー30μL及びPan T cell MicroBead Cocktail 20μLを加え、4℃で10分間インキュベートした。MACS カラム(Miltenyi、型番:130−042−401)を通過させ、T細胞を得た。
收集されたヒトDC細胞及びヒトT細胞を完全培地(RPMI 1640含10%FBS)に再懸濁し、96ウェルプレートに播種し、播種されたDC細胞及びT細胞は、それぞれ1×104/ウェル、1×105/ウェルであり、混合培養された。完全培地で段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加えた。培養プレートを37℃、CO2 インキュベーターに置き5日間インキュベートした。インキュベートが完了した後、ウェルから上清を採取し、キットのマニュアルに従ってサイトカインIFN−γ(RayBiotech、型番ELH−IFNg)を検出した。
收集されたヒトDC細胞及びヒトT細胞を完全培地(RPMI 1640含10%FBS)に再懸濁し、96ウェルプレートに播種し、播種されたDC細胞及びT細胞は、それぞれ1×104/ウェル、1×105/ウェルであり、混合培養された。完全培地で段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加えた。培養プレートを37℃、CO2 インキュベーターに置き5日間インキュベートした。インキュベートが完了した後、ウェルから上清を採取し、キットのマニュアルに従ってサイトカインIFN−γ(RayBiotech、型番ELH−IFNg)を検出した。
図11に示すように、ヒトT細胞は、同種異系DC細胞の刺激下で活性化されてIFN−γを分泌した。PD−1モノクローナル抗体を加えると、T細胞の活性化が促進され、サイトカインの分泌が促進されるが、VEGFモノクローナル抗体には該活性を持たない。抗PD−1/VEGF ヘテロ二量体抗体も強いT細胞調節活性を示し、サイトカインIFN−γの分泌を著しく促進した。
実施例9.マウスにおける抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の薬物動態学研究
実験材料は、北京華阜康生物科技股ふん有限公司から購入された、6〜8週齢の雌性BALB/cマウスを選択された。マウスを環境へ1週間適応させた後に、ランダムに群分けし、各群あたり15匹である。各群は、PD−1(Pembro)モノクローナル抗体、VEGF(G631)モノクローナル抗体、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体をそれぞれ投与し、用量はいずれも20nmol/kgであり、腹腔内投与で単回投与した。0時間、投与後1時間、3時間、6時間、10時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間、216時間、264時間、336時間、408時間で眼窩から0.2mL採血し、抗凝固処理なし、血液サンプルを室温で30分間〜1時間放置し、血液凝固後、3000rpmで10分間遠心し、得られた血清サンプルを−80℃で凍結保存し、測定のために用意した。
実験材料は、北京華阜康生物科技股ふん有限公司から購入された、6〜8週齢の雌性BALB/cマウスを選択された。マウスを環境へ1週間適応させた後に、ランダムに群分けし、各群あたり15匹である。各群は、PD−1(Pembro)モノクローナル抗体、VEGF(G631)モノクローナル抗体、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体をそれぞれ投与し、用量はいずれも20nmol/kgであり、腹腔内投与で単回投与した。0時間、投与後1時間、3時間、6時間、10時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間、216時間、264時間、336時間、408時間で眼窩から0.2mL採血し、抗凝固処理なし、血液サンプルを室温で30分間〜1時間放置し、血液凝固後、3000rpmで10分間遠心し、得られた血清サンプルを−80℃で凍結保存し、測定のために用意した。
血清中のPD−1(Pembro)モノクローナル抗体、VEGF(G631)モノクローナル抗体、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体の濃度をELISA法により測定した。簡単に言えば、組換えヒトPD−1タンパク質(北京義翹神州、型番10377−H08H)又はヒトVEGF(北京義翹神州、型番11066−HNAH)をpH=9.6の炭酸塩緩衝液にて一晩4℃でプレートに被覆した。PBSTで洗浄した。非特異的結合を防ぐために、5%脱脂粉乳含有PBSTでそのプレートをブロッキングし、PBSTで洗浄した。次いで、10%混合マウス血清、1%BSAを含有するPBSTで希釈した被験血清サンプルを加え、25℃で、1時間インキュベートし、PBSTでプレートを洗浄した。5%脱脂粉乳含有PBSTに希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(Chemicon、型番AP309P)を加え、25℃で、1時間インキュベートし、PBSTでプレートを洗浄した。最後、比色基質TMBを使用して発色させ、室温で10分間発色させた。1M H2SO4を加え、発色を停止させた。450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図12に示すように、用量が20nmol/kgの抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体を1回腹腔内投与すると、マウスの体内でVEGFモノクローナル抗体よりも優れたが、PD−1モノクローナル抗体よりも弱い薬物動態特性を示した。抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体の薬物動態パラメーターは、以下の通りである。即ち、半減期t1/2は35時間であり、薬物血中濃度−時間曲線下面積AUClastは25883nM.hrであり、Cmaxは231nMであり、見かけ分布容積Vdは39mL/Kgであり、クリアランスCLは0.77mL/hr/kgであり、平均滞留時間MRTlastは73時間である。
結果は、図12に示すように、用量が20nmol/kgの抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体を1回腹腔内投与すると、マウスの体内でVEGFモノクローナル抗体よりも優れたが、PD−1モノクローナル抗体よりも弱い薬物動態特性を示した。抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体の薬物動態パラメーターは、以下の通りである。即ち、半減期t1/2は35時間であり、薬物血中濃度−時間曲線下面積AUClastは25883nM.hrであり、Cmaxは231nMであり、見かけ分布容積Vdは39mL/Kgであり、クリアランスCLは0.77mL/hr/kgであり、平均滞留時間MRTlastは73時間である。
実施例10.マウス腫瘍モデルにおける抗PD−1/VEGFヘテロ二量体抗体の抗腫瘍効果研究
実験材料は、雌性、6〜8週齢であるC57BL/6バックグラウンドのヒトPD−1遺伝子ノックインマウス(B6/JNju−hPDCD1em1Cin(E2E3)/Nju、南京生物医薬研究院)を選択した。マウスを環境に1週間適応させた後、1匹のマウスあたり5x106個のMC38マウス結腸癌細胞(基礎医学細胞センター、基礎医学研究所、中国医学科学院)を右側背中に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3になる場合には、腫瘍体積に応じて群分けし、1群あたり担癌マウス6匹であり、溶媒(PBS)、PD−1(Pembro)モノクローナル抗体35nmol/kg(5mpk)とVEGF(G631)モノクローナル抗体35nmol/kg(5mpk)の組み合わせ、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体70nmol/kg(10mpk)をそれぞれ投与し、週2回、2週間連続腹腔内投与した。投与日から週3回腫瘍体積を測定し、長径a及び短径bを測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(axb2)/2である。腫瘍体積の測定期間は、3週間であり、投与を停止した後、さらに1週間観察した。
結果は、図13に示すように、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体は、PD−1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の組み合わせよりも強い抗腫瘍効果を持ち、投与を停止した後、依然として良好な腫瘍制御効果を示している。
実験材料は、雌性、6〜8週齢であるC57BL/6バックグラウンドのヒトPD−1遺伝子ノックインマウス(B6/JNju−hPDCD1em1Cin(E2E3)/Nju、南京生物医薬研究院)を選択した。マウスを環境に1週間適応させた後、1匹のマウスあたり5x106個のMC38マウス結腸癌細胞(基礎医学細胞センター、基礎医学研究所、中国医学科学院)を右側背中に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3になる場合には、腫瘍体積に応じて群分けし、1群あたり担癌マウス6匹であり、溶媒(PBS)、PD−1(Pembro)モノクローナル抗体35nmol/kg(5mpk)とVEGF(G631)モノクローナル抗体35nmol/kg(5mpk)の組み合わせ、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体70nmol/kg(10mpk)をそれぞれ投与し、週2回、2週間連続腹腔内投与した。投与日から週3回腫瘍体積を測定し、長径a及び短径bを測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積(mm3)=(axb2)/2である。腫瘍体積の測定期間は、3週間であり、投与を停止した後、さらに1週間観察した。
結果は、図13に示すように、抗PD−1(Pembro)/VEGF(G631)ヘテロ二量体抗体は、PD−1モノクローナル抗体とVEGFモノクローナル抗体の組み合わせよりも強い抗腫瘍効果を持ち、投与を停止した後、依然として良好な腫瘍制御効果を示している。
Claims (28)
- PD−1に特異的に結合できる第1の抗原結合領域及びVEGFに特異的に結合できる第2の抗原結合領域を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体において、前記二重特異性抗体は、1つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第1のFc領域及び第2のFc領域を含み、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してPD−1抗原結合領域及びVEGF抗原結合領域に連結され、或いは、その第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してVEGF抗原結合領域及びPD−1抗原結合領域に連結され、且つ、第1のFc領域及び第2のFc領域は、以下の部位に5つのアミノ酸の置換を含み、
第1のFc領域の366番目及び399番目のアミノ酸の置換、第2のFc領域の351番目、407番目及び409番目のアミノ酸の置換、
前記のアミノ酸の置換を含む第1のFc領域及び第2のFc領域は、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりも、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、Kabat EUインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、ヘテロ二量体型二重特異性抗体。 - 第1のFc領域及び第2のFc領域のアミノ酸の置換は、以下の通りであり、
a)351番目のアミノ酸の置換は、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はトリプトファンであり、
b)366番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、プロリン、トリプトファン又はバリンであり、
c)399番目のアミノ酸の置換は、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニン又はアラニンであり、
d)407番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン又はヒスチジンであり、及び
e)409番目のアミノ酸の置換は、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン又はアルギニンである、請求項1に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。 - アミノ酸の置換は、
a)第1のFc領域のT366L及びD399Rの置換、第2のFc領域のL351E、Y407L及びK409Vの置換;
b)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351G、Y407L及びK409Cの置換;
c)第1のFc領域のT366L及びD399Cの置換、第2のFc領域のL351Y、Y407A及びK409Pの置換;
d)第1のFc領域のT366P及びD399Nの置換、第2のFc領域のL351V、Y407P及びK409Sの置換;
e)第1のFc領域のT366W及びD399Gの置換、第2のFc領域のL351D、Y407P及びK409Sの置換;
f)第1のFc領域のT366P及びD399Iの置換、第2のFc領域のL351P、Y407F及びK409Fの置換;
g)第1のFc領域のT366V及びD399Tの置換、第2のFc領域のL351K、Y407T及びK409Qの置換;
h)第1のFc領域のT366L及びD399Aの置換、第2のFc領域のL351W、Y407H及びK409Rの置換を含む、請求項1又は2に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。 - 第1のFc領域のアミノ酸の置換は、T366L及びD399Rであり、第2のFc領域のアミノ酸の置換は、L351E、Y407L及びK409Vである、請求項1に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- Fc領域は、IgGに由来する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- PD−1及びVEGF抗原結合領域は、Fab断片、scFv断片、Fv断片及びVHH断片から選ばれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- PD−1及びVEGF抗原結合領域は、いずれもFab断片である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- PD−1及びVEGF抗原結合領域は、一方が、Fab断片であり、他方がscFvである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- Fab断片は、異なる第1の重鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域、並びに異なる第1の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖可変領域を含む、請求項7に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- 第1のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と、又は第1のFc領域及びその連結されたVEGF抗原結合領域と第2のFc領域及びその連結されたPD−1抗原結合領域とは、単独で存在し、還元剤が存在する場合には、形成されたホモ二量体の重量比はいずれも50%未満である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- 二重特異性抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22から選ばれる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列は、SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及び21から選ばれる請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 発現ベクターは、pCDNAに基づいて改造されたプラスミドベクターX0GCである、請求項14に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
- ヒト胎児腎細胞HEK293又はHEK293細胞に基づいて改造されたHEK293T、HEK293E、HEK293F;ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づいて改造されたCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHO;大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami;酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセニューラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha);昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞High5、SF9;植物細胞;哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項16に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体又は請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクター又は請求項16又は17に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む、組成物。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体を産生する方法であって、
1)請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させるステップと、
2)宿主細胞内でそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合し、その後、混合物を酸化するステップとを含む、方法。 - 宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞HEK293又はHEK293細胞に基づいて改造されたHEK293T、HEK293F、HEK293F;ハムスター卵巣細胞CHO又はCHO細胞に基づいて改造されたCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHO;大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami;酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae )、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセニューラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha);昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞High5、SF9;植物細胞;哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項19に記載の方法。
- 還元工程は、1)還元反応は、2−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン又は他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で行うステップと、2)還元剤を除去するステップとを含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 酸化工程は、空気中で酸化することであり、酸化剤の存在下で酸化反応を行うことも含み、前記酸化剤はL−デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、単離精製のステップを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクター及び/又は請求項16又は17に記載の宿主細胞及び/又は請求項18に記載の組成物の、対象の疾患を予防及び/又は治療するための医薬品の調製における用途。
- 対象の疾患を予防及び/又は治療するための医薬品として用いられる、請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクター及び/又は請求項16又は17に記載の宿主細胞及び/又は請求項18に記載の組成物。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び/又は請求項12又は13に記載の単離されたポリヌクレオチド及び/又は請求項14又は15に記載の組換え発現ベクター及び/又は請求項16又は17に記載の宿主細胞及び/又は請求項18に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、疾患を予防及び/又は治療する方法。
- 対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである、請求項24に記載の用途、請求項25に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、或いは請求項26に記載の方法。
- 前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫から選ばれる、請求項24に記載の用途、請求項25に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、或いは請求項26に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810141323 | 2018-02-11 | ||
CN201810141323.0 | 2018-02-11 | ||
PCT/CN2019/074541 WO2019154349A1 (zh) | 2018-02-11 | 2019-02-02 | 抗pd-1/抗vegf天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021512624A true JP2021512624A (ja) | 2021-05-20 |
Family
ID=67549301
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020542762A Pending JP2021512624A (ja) | 2018-02-11 | 2019-02-02 | 抗pd−1/抗vegf天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11827697B2 (ja) |
EP (1) | EP3750920A4 (ja) |
JP (1) | JP2021512624A (ja) |
KR (1) | KR20200120927A (ja) |
CN (1) | CN111712522A (ja) |
AU (1) | AU2019218433A1 (ja) |
CA (1) | CA3090878A1 (ja) |
WO (1) | WO2019154349A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
BR112018013407A2 (pt) | 2015-12-30 | 2018-12-18 | Kodiak Sciences Inc | anticorpos e conjugados dos mesmos |
IL265605B1 (en) * | 2016-09-29 | 2024-02-01 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | Heterodimeric immunoglobulin structures, a pharmaceutical preparation containing them, their use and methods for their preparation |
CN109963876B (zh) | 2016-11-18 | 2023-11-14 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
WO2019153200A1 (zh) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
AU2020364071A1 (en) | 2019-10-10 | 2022-05-26 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
EP4067387A4 (en) * | 2019-11-25 | 2023-12-27 | Akeso Biopharma, Inc. | BISPECIFIC ANTI-PD-1 ANTI-VEGFA NTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF |
CN113121697B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-06-09 | 周易 | Ch3结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用 |
US20230242645A1 (en) * | 2020-01-21 | 2023-08-03 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. | A bispecific anti-pd-l1/vegf antibody and uses thereof |
CN113214400B (zh) * | 2020-01-21 | 2022-11-08 | 甫康(上海)健康科技有限责任公司 | 一种双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途 |
CN113563473A (zh) * | 2020-04-29 | 2021-10-29 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 四价双特异性抗体、其制备方法和用途 |
CN113827731B (zh) * | 2021-09-22 | 2022-08-19 | 范德里希(上海)生物科技有限公司 | Vegf抑制剂和pd-1单克隆抗体在制备用于抑制卵巢癌的药盒中的用途 |
EP4321537A1 (en) * | 2022-06-22 | 2024-02-14 | Akeso Biopharma, Inc. | Pharmaceutical composition and use thereof |
WO2024017281A1 (zh) * | 2022-07-20 | 2024-01-25 | 明慧医药(杭州)有限公司 | 多特异性抗体及其用途 |
WO2024032662A1 (zh) * | 2022-08-09 | 2024-02-15 | 上海济煜医药科技有限公司 | 一种靶向pd-1和vegf的抗体及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014511836A (ja) * | 2011-03-25 | 2014-05-19 | グレンマーク ファーマシューティカルズ, エセ.アー. | ヘテロ二量体免疫グロブリン |
JP2014533243A (ja) * | 2011-11-04 | 2014-12-11 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン |
JP2015522525A (ja) * | 2012-05-10 | 2015-08-06 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物 |
CN105175545A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-23 | 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 | 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用 |
WO2017101828A1 (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途 |
WO2017117179A1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US20050106667A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
WO2006031994A2 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Xencor, Inc. | Monomeric immunoglobulin fc domains |
PT2235064E (pt) | 2008-01-07 | 2016-03-01 | Amgen Inc | Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática |
JP6167040B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
PT2771364T (pt) | 2011-10-27 | 2019-09-10 | Genmab As | Produção de proteínas heterodiméricas |
PT2838918T (pt) * | 2012-04-20 | 2019-08-23 | Merus Nv | Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig |
US20180265874A1 (en) | 2014-10-10 | 2018-09-20 | Global Biopharma, Inc. | Methods for treating and/or preventing a tumor growth, invasion and/or metastasis |
WO2016170039A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of antibody binding to angiopoietin 2 with antibody binding to programmed death 1 polypeptide |
CN105111314B (zh) | 2015-08-13 | 2019-01-08 | 成都百世博生物技术有限公司 | 一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途 |
US10894830B2 (en) | 2015-11-03 | 2021-01-19 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding PD-1, TIM-3 or PD-1 and TIM-3 and their uses |
JP7112327B2 (ja) | 2015-12-29 | 2022-08-03 | アウトルック セラピューティクス,インコーポレイティド | ベバシズマブの緩衝された製剤 |
IL265605B1 (en) | 2016-09-29 | 2024-02-01 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | Heterodimeric immunoglobulin structures, a pharmaceutical preparation containing them, their use and methods for their preparation |
CN107446048B (zh) | 2017-09-13 | 2021-03-30 | 北京韩美药品有限公司 | 一种能够特异性地结合pd-1的抗体及其功能片段 |
-
2019
- 2019-02-02 US US16/968,677 patent/US11827697B2/en active Active
- 2019-02-02 EP EP19750554.8A patent/EP3750920A4/en active Pending
- 2019-02-02 CN CN201980012499.9A patent/CN111712522A/zh active Pending
- 2019-02-02 WO PCT/CN2019/074541 patent/WO2019154349A1/zh active Application Filing
- 2019-02-02 KR KR1020207025738A patent/KR20200120927A/ko active Search and Examination
- 2019-02-02 JP JP2020542762A patent/JP2021512624A/ja active Pending
- 2019-02-02 CA CA3090878A patent/CA3090878A1/en active Pending
- 2019-02-02 AU AU2019218433A patent/AU2019218433A1/en active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014511836A (ja) * | 2011-03-25 | 2014-05-19 | グレンマーク ファーマシューティカルズ, エセ.アー. | ヘテロ二量体免疫グロブリン |
JP2014533243A (ja) * | 2011-11-04 | 2014-12-11 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン |
JP2015522525A (ja) * | 2012-05-10 | 2015-08-06 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物 |
CN105175545A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-23 | 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 | 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用 |
WO2017101828A1 (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途 |
WO2017117179A1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MABS, vol. 5, no. 5, JPN6022053265, 2013, pages 646 - 654, ISSN: 0004945406 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3750920A1 (en) | 2020-12-16 |
CA3090878A1 (en) | 2019-08-15 |
US11827697B2 (en) | 2023-11-28 |
CN111712522A (zh) | 2020-09-25 |
EP3750920A4 (en) | 2021-11-10 |
KR20200120927A (ko) | 2020-10-22 |
WO2019154349A1 (zh) | 2019-08-15 |
AU2019218433A1 (en) | 2020-09-03 |
US20210040193A1 (en) | 2021-02-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11827697B2 (en) | Anti-PD-1/anti-VEGF natural antibody structure like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof | |
JP7231641B2 (ja) | 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗pd-l1/抗cd47二重特異性抗体、ならびにその製造方法 | |
US11591409B2 (en) | Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof | |
US11319378B2 (en) | Anti-PD-1/anti-HER2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing the same | |
CN111699201B (zh) | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构的异源二聚双特异性抗体及其制备方法 | |
US20240052037A1 (en) | Anti-pd-l1/anti-cd47 natural antibody structure-like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof | |
EA043006B1 (ru) | Анти-pd-1/анти-her2 гетеродимерное биспецифическое антитело со структурой природного антитела и способ его получения |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230313 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230619 |