CN105175545A - 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用 - Google Patents
一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体及其应用，属于分子免疫学技术领域。本发明所提供的抗VEGF-抗PD-1双功能抗体包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.4或SEQ？ID？NO.6所示。同时，本发明还提供了编码双功能抗体的基因以及双功能抗体的应用。本发明所提供的双功能抗体能够与PD-1和VEGF结合，具有很高的亲和力，同时能够有效的刺激T细胞分泌IL2和诱导T细胞分泌IFN-γ，并能显著抑制小鼠肿瘤生长，在制备抗肿瘤的药物中的应用具有巨大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体及其应用，属于分子免疫学技术领域。
背景技术
据WHO专家预测，到2020年，全球人口的肿瘤发病人数将达到2000万人，死亡人数将达到1200万人，因此，肿瘤将成为本世纪人类第一大杀手，对人类生存构成最严重的威胁。随着中国人口老龄化，患肿瘤疾病的人口会越来越多，因此开发抗肿瘤药物也成为国家健康事业的重点。
血管内皮生长因子，又叫VEGF。VEGF蛋白是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明VPF与VEGF是同一基因编码的同一蛋白。VEGF有六个等型(isoforms)：VEGF-A,-B,-C,-D,及-E；其分子量从35至44kDa不等，每个等型特异性地与三个“血管内皮生长因子受体”(VEGFR-1,-2,及-3)的特定组合相结合。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。二条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性,去除N2糖基对生物效应无影响,但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出分别VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论，即肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持。被认为是VEGF临床应用的基础。抗VEGF与VEGFR结合的单克隆抗体，可抑制血管内皮生长因子，用于治疗各类转移性癌症。
程序性死亡受体1(programmeddeath1,PD-1)为CD28超家族成员。PD-1表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡配体-1(programmeddeathligand1,PD-L1)和PD-L2。PD-L1/L2在抗原递呈细胞都表达，PD-L1在多种组织也有表达。PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，调节T细胞活化和增殖，起到类似于CTLA-4的负调节作用。华裔科学家陈列平实验室首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且调节肿瘤浸润CD8T细胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义。近年来，已有多种Anti-PD-1/PD-L1抗体在肿瘤免疫治疗的临床研究迅速开展。目前Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批准用于晚期黑色素瘤，最近Nivolumab也已被美国FDA批准用于晚期鳞状非小细胞肺癌的治疗。另外，MPDL3280A(anti-PD-L1单抗)，Avelumab(anti-PD-L1单抗)等也已进入多个晚期临床研究中，覆盖非小细胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多个瘤种。由于PD-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤，白血病以及贫血病等等。在2012年和2013年的美国癌症协会(AACR)年会以及美国临床肿瘤协会(ASCO)年会上揭晓的关于PD-1抗体药物的临床药效数据后，PD-1抗体成为全球制药行业最炙手可热的在研抗体药物。
肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫***杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗近来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点。近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，目前已在一些肿瘤类型如黑色素瘤，非小细胞肺癌等的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，并已有肿瘤免疫治疗药物获得美国FDA(FoodandDrugAdministration,FDA)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。
双功能抗体，又叫双特异性抗体，是一种非天然抗体，它能同时靶向两种不同的靶点或蛋白。双特异性抗体可以同时特异性结合两个不同的抗原，由于其特异性和双功能性在肿瘤免疫治疗中的作用越来越重要。2014年12月03日美国FDA审批安进公司研发的双特异性抗体Blincyto(Blinatumomab)上市，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。Blinatumomab为CD19、CD3双特异性抗体，Blincyto(Blinatumomab)是美国FDA审批的第一个双特性抗体。目前，开发存在的双功能抗体形式已被证明有超过40余种，但是由于生产效率低和药代动力学性能差等问题，一直以来双特异性抗体的研发困难重重。目前，国内外尚没有一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体。该双功能抗体包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示。
优选地，所述双功能抗体是抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB7，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
优选地，所述双功能抗体是抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB8，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。
本发明还提供了一种编码所述抗VEGF-抗PD-1双功能抗体的基因，该基因编码轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码重链的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。
优选地，所述基因中核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3分别编码抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB7的轻链和重链。
优选地，所述基因中核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.5分别编码抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB8的轻链和重链。
所述任一抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助***的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
所述任一抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用具体是在结合VEGF的药物、阻断VEGF信号通路、抑制肿瘤的药物中应用。
优选地，所述应用具体是在结合PD-1的药物、阻断PD-1与PDL-1结合的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达、抑制肿瘤的药物中应用。
具体地，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、***癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、***、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌等。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所用的方法是目前***的一种新的前沿方法，肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。
本发明新发现的双功能抗体BsAbB7和BsAbB8均能与PD-1结合，双功能BsAbB7亲和力为0.24nM，双功能BsAbB8亲和力为0.24nM。同时也能够与VEGF结合，双功能抗体BsAbB7亲和力为0.15nM，双功能抗体BsAbB8亲和力为0.12nM。
附图说明
图1为PD-1和VEGF抗原的SDS-PAGE电泳结果；
(其中，A为VEGF抗原；B为PD-1抗原)。
图2为BsAb7和BsAb8的SDS-PAGE电泳结果图；
(其中，A为BsAb7的SDS-PAGE电泳结果；B为BsAb8的SDS-PAGE电泳结果)。
图3为双功能抗体BsAb7和BsAb8诱导T淋巴细胞分泌IL2能力测定结果。
图4为双功能抗体BsAb7和BsAb8诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ能力测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1VEGF与PD1蛋白的制备
1、PD-1抗原的表达载体构建
从南京金斯瑞公司合成人的PD-1的cDNA，GeneID为5133，cDNAID为NM_005018.2。在合成的胞外区PD-1基因后加上Fc纯化标签，并在两端引入XbaI，BamHI两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD600为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。
2、VEGF抗原的表达载体构建
对基因VEGF(NCBIGeneID:7422)所对应的氨基酸与小鼠IgG的Fc蛋白片段mFc(Iggamma-2AchainCregion)进行融合设计得到VEGF-mFc。为提高目的基因在293F细胞表达***中的表达效率，将序列进行优化，并在两端引入XbaI，BamHI两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD600为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。
3、PD-1和VEGF抗原的表达及纯化
将测序鉴定正确的表达载体转染293F细胞(购自Invitrogen公司)，37度，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清于4000rpm离心10min，再用0.45μm滤膜过滤；滤液加入400mMNaCl；调整PH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4，pH7.4)平衡好的5mlHiTrapProteinA柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5ml/min，紫外监测为水平。BufferB(1MGlycine，pH3.5)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，并进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE电泳结果如图1所示。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS中，由此得到抗原。
实施例2双功能抗体BsAb7和BsAb8蛋白的制备
1.双功能抗体表达载体构建
人工合成抗体BsAb7的轻链的cDNA(其序列如SEQIDNO.1所示)，人工合成抗体BsAb7重链的cDNA(其序列如SEQIDNO.3所示)，人工合成抗体BsAb8重链的cDNA(其序列如SEQIDNO.5所示)，将合成的cDNA分别克隆到pTT5质粒中，并通过测序确定质粒构建正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD600为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。
2.双功能抗体BsAb7和BsAb8蛋白表达与纯化
将测序鉴定正确的BsAb7和BsAb8重链表达载体和轻链表达载体(1:1)共转染到293F细胞中，37度，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清4000rpm离心10min，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；滤液加入400mMNaCl；调整PH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4，pH7.4)平衡好的5mlHiTrapMabSelect柱(购自GE公司)；待样品上完后用PBS冲洗，流速5ml/min，紫外监测为水平。BufferB(1MGlycine，pH3.5)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，并进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE非还原电泳检测结果见图2。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS中，由此得到抗体BsAb7和BsAb8蛋白。
实施例3双功能抗体BsAb7和BsAb8对PD-1和VEGF亲和力测定
通过Biacore3000仪器(购自GE公司)分析抗PD-1/VEGF抗体BsAbB7和BsAbB8的表征亲和力及结合动力学。利用生物素标记试剂盒(Pierce公司)将重组融合蛋白与生物素共价偶联，然后流过亲和素标记的SA芯片(购自GE公司)，使反应值RU达到450左右。通过将抗体以0.0133、0.0266、0.0532、0.1064、0.2128μM的浓度和50μl/min的流速在PBS缓冲液中流动而测量结合。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用BIAevaluation软件将结合和解离曲线拟合至1∶1朗格缪尔(Langmuir)结合模型。为了使亲合力在评估结合常数时的作用最小化，仅使用对应于结合和解离期的起始数据段来进行拟合，测定的Kd、Kon和Koff值结果见表1。
表1双功能抗体BsAb7和BsAb8对PD-1、VEGF亲和常数(Kd)测定结果
| Kn(105M-1s-1) | Koff(10-5s-1) | Kd(nm) | |
| BsAb7-PD-1 | 1.02 | 2.42 | 0.24 |
| BsAb8-PD-1 | 0.96 | 2.33 | 0.24 |
| BsAb7-VEGF | 1.44 | 2.10 | 0.15 |
| BsAb8-VEGF | 1.89 | 2.31 | 0.12 |
实施例4竞争ELISA方法分别测定双功能抗体BsAb7和BsAb8与PDL-1竞争结合抗原PD-1
用PD-1-mFc包被酶标板，1％BSA封闭，分别将不同浓度的抗体BsAb7和BsAb8与PDL-1-hFc混合，37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值(见表2)。双功能抗体BsAb7和BsAb8与抗原PD-1结合结果显示，双功能抗体BsAb7和BsAb8均能有效地与PDL-1竞争结合PD-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的双功能抗体BsAb7和BsAb8的竞争ELISA结果分析，曲线模拟双功能抗体BsAb7和BsAb8的结合效率EC50分别为：2.5nM和2.9nM。
表2竞争ELISA测定双功能抗体BsAb7和BsAb8阻断PD-1/PDL-1结合能力结果
| 抗体浓度 | OD450(BsAb7) | OD450(BsAb8) |
| (原液)2μg/ml | 0.096 | 0.107 |
| 1：3 | 0.101 | 0.110 |
| 1：9 | 0.323 | 0.323 |
| 1：27 | 0.733 | 0.802 |
| 1：81 | 0.852 | 0.831 |
| 1：243 | 0.857 | 0.854 |
| 1：729 | 0.898 | 0.866 |
| 对照/0 | 0.901 | 0.899 |
实施例5双功能抗体BsAb7和BsAb8体外诱导T细胞分泌IL2
采用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&DSystems公司)，制备新鲜的的PBMC，纯化人T细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，加入25nmol、5nmol、1nmol三种不同浓度双功能抗体BsAb7和BsAb8及80ng/ml的破伤风毒素(TT)，加入25nmol、5nmol、1nmol三种浓度的同种型对照抗体作为阴性对照，培养3天后收集上清液，用Luminex仪(购自LifeTechnology公司)和细胞因子IL2检测试剂盒(购自BDBiosciences公司)检测上清IL2的分泌水平。结果如图3所示，结果表明：双功能抗体BsAb7和BsAb8均可有效刺激T细胞的功能，分泌IL2，且与抗体浓度有关，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IL2分泌。
实施例6双功能抗体BsAb7和BsAb8体外诱导T细胞分泌IFN-γ
用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&DSystems公司)，制备新鲜的的PBMC，纯化人T细胞。使用MiltenyiCD14单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF和IL-4(均购自PeproTech公司)一起培养7天后生成DC细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，每份培养物在200μl的总体积中包含10e5个纯化的T细胞和10e4个树突细胞。加入25nmol、5nmol、1nmol三种不同浓度双功能抗体BsAb7和BsAb8抗体，加入25nmol、5nmol、1nmol三种浓度的同种型对照抗体作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μl培养基用于细胞因子IFN-γ测量。利用OptEIAELISA试剂盒(购自BDBiosciences公司)来测定IFN-γ的水平。结果(如图4所示)显示双功能抗体BsAb7和BsAb8均可有效刺激T细胞的功能分泌细胞因子IFN-γ，且与浓度有关，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IFN-γ分泌。
实施例7双功能抗体BsAb7和BsAb8抑制小鼠肿瘤生长
培养人Caki-1细胞，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)/ml细胞悬液，取6-8周裸鼠，在裸鼠右前肢腋下注射1.0×106个(约0.1ml)细胞悬液，10天左右肿瘤长至直径约5mm，致瘤成功，随机均分为4组：阴性对照组(腹腔注射生理盐水组)、BsAb7组(尾静脉注射3mg/kg组)、BsAb8组(尾静脉注射3mg/kg)、阳性对照组贝伐珠单抗(尾静脉注射2mg/kg)。每3天给药1次，连续给药21天。21天后，处死裸鼠并称瘤体重量，抑瘤率＝[1-实验组平均瘤重(B、C、D组为实验组)/A组平均瘤重)]×100％。实验结果如表3所示，BsAb7和BsAb8均能抑制小鼠肿瘤生长。
表3双功能抗体BsAb7和BsAb8抑制小鼠肿瘤生长结果
| 组别 | 平均瘤重(g) | 平均抑瘤率(％) |
| 阴性对照 | 2.544±0.316 | / |
| BsAb7 | 0.932±0.224 | 63.4 |
| BsAb8 | 0.867±0.255 | 65.9 |
| 贝伐珠单抗 | 0.912±0.213 | 64.2 |
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体，包含轻链和重链，其特征在于，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示。
2.根据权利要求1所述一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体，其特征在于，是抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB7，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
3.根据权利要求1所述一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体，其特征在于，是抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB8，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。
4.一种编码权利要求1所述一种抗VEGF-抗PD-1双功能抗体的基因，其特征在于，编码轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码重链的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。
5.根据权利要求4所述基因，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3分别编码抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB7的轻链和重链。
6.根据权利要求4所述基因，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.5分别编码抗VEGF-抗PD-1双功能抗体BsAbB8的轻链和重链。
7.权利要求1-3所述任一抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助***的药物中的应用。
8.权利要求1-3所述任一抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在结合VEGF的药物、阻断VEGF信号通路、抑制肿瘤的药物中应用。
10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在结合PD-1的药物、阻断PD-1与PDL-1结合的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达的药物中应用。
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