JP2021508441A - Ｃｄ３およびｃｄ１３７に結合する改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子 - Google Patents

Ｃｄ３およびｃｄ１３７に結合する改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子 Download PDF

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Abstract

CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメイン、ならびにそれを使用する方法が提供される。2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に取得する方法もまた、提供される。

Description

本発明は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合する抗原結合分子、ならびにそれを使用する方法に関する。
抗体は、血漿中での安定性が高く、有害反応をほとんど生じないため、医薬として注目されている（Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078（非特許文献１）およびEur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396（非特許文献２））。抗体は、抗原に結合する作用、およびアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有するだけでなく、ADCC（抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（抗体依存性細胞貪食作用）、またはCDC（補体依存性細胞傷害活性）などの、エフェクター細胞によって媒介される細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。特に、IgG1サブクラスの抗体は、がん細胞に対してエフェクター機能を示すため、多数の抗体医薬が、腫瘍学の分野において開発されている。
抗体がADCC、ADCP、またはCDCを発揮するためには、そのFc領域が、エフェクター細胞（NK細胞またはマクロファージなど）上に存在する抗体受容体（FcγR）および様々な補体成分に結合しなければならない。ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーとして、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、およびFcγRIIIbのアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65（非特許文献３））。これらのアイソフォームのうち、FcγRIa、FcγRIIa、およびFcγRIIIaは、その細胞内ドメインにITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは活性化シグナルを伝達する。対照的に、FcγRIIbのみが、その細胞内ドメインにITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは抑制シグナルを伝達する。FcγRのこれらのアイソフォームはすべて、免疫複合体などによる架橋によって、シグナルを伝達することが知られている（Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47（非特許文献４））。実際に、抗体ががん細胞に対してエフェクター機能を発揮する時には、エフェクター細胞膜上のFcγR分子が、がん細胞膜上に結合した複数の抗体のFc領域によってクラスターとなり、それによってエフェクター細胞を通して活性化シグナルが伝達される。その結果、殺細胞効果が発揮される。この点において、FcγRの架橋は、がん細胞近くに位置するエフェクター細胞に限られ、これは、免疫の活性化ががん細胞に限局化されることを示している（Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81（非特許文献５））。
天然型の免疫グロブリンは、その可変領域により抗原に結合し、その定常領域によりFcγR、FcRn、FcαR、およびFcεRなどの受容体または補体に結合する。FcRn（IgGのFc領域で相互作用する結合分子）の各分子は、抗体の各重鎖に１分子ずつ結合する。したがって、IgG型の抗体１分子に対して２分子のFcRnが結合することが報告されている。FcRnなどとは異なり、FcγRは、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメインで相互作用し、IgG型の抗体１分子に対して１分子のみのFcγRが結合する（J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477）。FcγRと抗体のFc領域との間の結合には、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメイン中のいくつかのアミノ酸残基、ならびにCH2ドメインのAsn 297（EUナンバリング）に付加された糖鎖が重要であることが見出されている（Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110（非特許文献６）、Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104（非特許文献７）、およびImmunol. (1995) 86, 319-324（非特許文献８））。この結合部位を中心に、様々なFcγR結合特性を有するFc領域バリアントがこれまでに研究されて、活性化FcγRに対するより高い結合活性を有するFc領域バリアントが得られている（WO2000/042072（特許文献１）およびWO2006/019447（特許文献２））。例えば、Lazarらは、ヒトIgG1のSer 239、Ala 330、およびIle 332（EUナンバリング）をそれぞれAsn、Leu、およびGluにより置換することによって、ヒトFcγRIIIa（V158）に対するヒトIgG1の結合活性を約370倍に増加させることに成功している（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010（非特許文献９）およびWO2006/019447（特許文献２））。この改変形態は、FcγIIbに対するFcγRIIIaの比（A/I比）の点で、野生型に比べて結合活性が約9倍になっている。あるいは、Shinkawaらは、Asn 297（EUナンバリング）に付加される糖鎖のフコースを欠損させることによって、FcγRIIIaに対する結合活性を約100倍に増加させることに成功している（J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473（非特許文献１０））。これらの方法によって、天然型ヒトIgG1と比較してヒトIgG1のADCC活性を大幅に改善することができる。
天然型のIgG型抗体は、典型的には、その可変領域（Fab）により1つのエピトープを認識して結合するため、1つの抗原にしか結合することができない。一方で、がんまたは炎症においては多種類のタンパク質が関与することが知られており、これらのタンパク質は、互いにクロストークしていることがある。例えば、免疫疾患では、いくつかの炎症性サイトカイン（TNF、IL1、およびIL6）が関与していることが知られている（Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10（非特許文献１１））。また、がんによる薬剤耐性の獲得の基となる1つのメカニズムとして、他の受容体が活性化することが知られている（Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51（非特許文献１２））。このような場合、1つのエピトープを認識する通常の抗体では、複数のタンパク質を阻害することができない。
複数の標的を阻害する分子として、1つの分子で2種類以上の抗原に結合する抗体（これらの抗体を二重特異性抗体と言う）が研究されている。天然型のIgG型抗体を改良することによって、2つの異なる抗原（第１の抗原および第２の抗原）に対する結合活性を付与することができる（mAbs. (2012) Mar 1, 4(2)）。そのため、そのような抗体は、これらの2種類以上の抗原を1つの分子で中和する作用だけでなく、細胞傷害活性を有する細胞をがん細胞に架橋することによって抗腫瘍活性を高める作用を有する。二重特異性抗体の分子形として、抗体のN末端またはC末端に抗原結合部位を付加した分子（DVD-Ig、TCB、およびscFv-IgG）、抗体の2つのFab領域が異なる配列を有する分子（共通L鎖二重特異性抗体およびハイブリッドハイブリドーマ）、1つのFab領域が2つの抗原を認識する分子（Two-in-one IgGおよびDutaMab）、ならびにCH3ドメインループを別の抗原結合部位として有する分子（Fcab）が、これまでに報告されている（Nat. Rev. (2010), 10, 301-316（非特許文献１３）およびPeds(2010), 23(4), 289-297（非特許文献１４））。これらの二重特異性抗体はいずれも、そのFc領域でFcγRと相互作用するため、抗体のエフェクター機能はそれにおいて保存されている。
二重特異性抗体により認識される抗原がすべて、がんにおいて特異的に発現している抗原であれば、抗原のいずれかに結合する二重特異性抗体は、がん細胞に対して細胞傷害活性を示すため、1つの抗原を認識する従来の抗体医薬よりも効率的な抗がん効果が期待できる。しかし、二重特異性抗体により認識される抗原のうちのいずれか1つが、正常組織において発現している場合、または免疫細胞において発現している細胞である場合は、FcγRとの架橋によって正常組織の障害またはサイトカインの放出が起こる（J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52（非特許文献１５））。その結果、強い有害反応が誘導される。
例えば、T細胞に発現しているタンパク質とがん細胞に発現しているタンパク質（がん抗原）とを認識する二重特異性抗体として、カツマキソマブ（catumaxomab）が知られている。カツマキソマブは、2つのFabで、それぞれがん抗原（EpCAM）およびT細胞に発現しているCD3ε鎖に結合する。カツマキソマブは、がん抗原とCD3εに同時に結合することによって、T細胞媒介性の細胞傷害活性を誘導し、がん抗原とFcγRに同時に結合することによって、NK細胞または抗原提示細胞（例えば、マクロファージ）媒介性の細胞傷害活性を誘導する。これらの2つの細胞傷害活性を使用することにより、カツマキソマブは、腹腔内投与によって悪性腹水症に対して高い治療効果を示しており、したがって欧州で承認されている（Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。さらに、カツマキソマブの投与によって、がん細胞に対して反応する抗体が出現した例が報告され、獲得免疫が誘導されることが実証された（Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85（非特許文献１７））。この結果から、T細胞媒介性の細胞傷害活性と、FcγRを介したNK細胞またはマクロファージなどの細胞によってもたらされる作用との両方を有するこのような抗体（これらの抗体を特に三機能性抗体と言う）は、強い抗腫瘍効果と獲得免疫の誘導が期待できるため、注目されている。
しかし、三機能性抗体は、がん抗原の非存在下でも、CD3εとFcγRに同時に結合するため、がん細胞が存在しない環境でもCD3εを発現しているT細胞をFcγRを発現している細胞に架橋して、様々なサイトカインを大量に産生させる。このようながん抗原非依存的な様々なサイトカインの産生の誘導に起因して、三機能性抗体の投与は現状、腹腔内経路に限られている（Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。三機能性抗体は、重篤なサイトカインストーム様の有害反応のゆえに、全身投与が非常に困難である（Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406（非特許文献１８））。
従来技術の二重特異性抗体は、両方の抗原、すなわち、第１の抗原であるがん抗原（EpCAM）および第２の抗原であるCD3εに、FcγRへの結合と同時に結合し得るため、FcγRおよび第２の抗原であるCD3εに同時に結合することによって引き起こされるこのような有害反応は、その分子構造的に回避することができない。
近年、FcγRに対する結合活性を低下させたFc領域を用いることで、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性を引き起こす改良型抗体が提供されている（WO2012/073985）。
しかし、このような抗体でも、その分子構造的に、がん抗原に結合しつつ2つの免疫受容体、すなわち、CD3εおよびFcγRに作用することはできない。
有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、T細胞以外の細胞によって媒介される細胞傷害活性を両方とも発揮する抗体は、まだ知られていない。
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要であると説明されている（Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284（非特許文献１９））。
CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8（非特許文献２０））。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の存続性を増強することができる（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733（非特許文献２１））。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22（非特許文献２２））。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合が関与していることが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22（非特許文献２３））。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がインビボでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6（非特許文献２４））。WO2015/156268（特許文献３）は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、かつ免疫細胞を活性化することができ、それによってCD137アゴニスト抗体の肝毒性有害事象が、抗体の抗腫瘍活性を保持しつつ避けられ得ることを記載している。WO2015/156268はさらに、この二重特異性抗体を、CD3アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する別の二重特異性抗体と組み合わせて用いることによって、抗腫瘍活性をさらに高めることができ、かつこれらの有害事象が避けられ得ることを記載している。CD137、CD3、および腫瘍特異的抗原（EGFR）に対する3つの結合ドメインを有する三重特異的抗体もまた、報告されている（WO2014/116846（特許文献４））。しかし、有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、CD137を介したT細胞および他の免疫細胞の活性化活性を両方とも発揮する抗体は、まだ知られていない。
ライブラリーを用いて任意の抗原に対する結合ドメインを取得する技術は、周知である（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)（非特許文献２５）；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)（非特許文献２６））。例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、CISディスプレイ、大腸菌（E. coli）ディスプレイ、細胞ディスプレイ、および酵母ディスプレイが、ライブラリーを用いて結合ドメインを取得する技術として知られている（Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14（非特許文献２７）；Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92（非特許文献２８）；Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e127（非特許文献２９）；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10（非特許文献３０）；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8（非特許文献３１）；Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21 (4): 247-55（非特許文献３２）；Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5（非特許文献３３）；MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18（非特許文献３４）；およびMethods Mol Biol. 2012; 911: 183-98（非特許文献３５））。
2つの異なる抗原に結合する結合ドメインもまた、ライブラリー法で獲得されている（Bostrom et al., Science 323:1610-4 (2009)（非特許文献３６））。2つの異なる抗原に結合するそのようなドメインを獲得するために、いくつかの報告されている技術、例えば、異なるパンニングラウンドにおいて異なる抗原を交互に用いる方法、および、第１の抗原に対する結合ドメインを最初に取得し、次いで、第１の抗原に対する結合ドメインのランダム化によって作製されるライブラリーから第２の抗原に対する結合ドメインを取得する方法がある。しかし、それらの戦略は、回収されたポリヌクレオチドを増幅するために、第１の抗原結合ドメインの回収後に遺伝子増幅工程を必要とする。
ダブルラウンド（double round）選択と呼ばれる、1つの抗原に対する選択圧が、核酸を増幅する介在工程を伴わずに連続して2回かけられるファージディスプレイ法が、報告されている（Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992)（非特許文献３７））。しかし、2つ以上の異なる抗原に対して連続して2回以上選択圧をかけることによる、2つ以上の異なる抗原に対する結合ドメインをより効率的に収集するための方法は、知られていない。
WO2000/042072 WO2006/019447 WO2015/156268 WO2014/116846
Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65 Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47 Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81 Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110 Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104 Immunol. (1995) 86, 319-324 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010 J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473 Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10 Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51 Nat. Rev. (2010), 10, 301-316 Peds (2010), 23 (4), 289-297 J. Immunol. (1999) Aug 1, 163 (3), 1246-52 Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36 (6), 458-67 Future Oncol. (2012) Jan 8 (1), 73-85 Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56 (9): 1397-406 Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284 Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8 Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733 Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22 Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22 Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991) Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14 Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92 Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e127 Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10 Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8 Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21 (4): 247-55 Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5 MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18 Methods Mol Biol. 2012; 911: 183-98 Bostrom et al., Science 323:1610-4 (2009) Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992)
腫瘍特異的抗原（EGFR）結合ドメイン、CD137結合ドメイン、およびCD3結合ドメインを含む三重特異性抗体が、既に報告されている（WO2014116846）。しかし、このような分子形式を有する抗体は、3つの異なる抗原に同時に結合し得るため、本発明者らは、それらの三重特異性抗体が、CD3とCD137に同時に結合することによって、CD3ε発現T細胞とCD137発現細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、DCなど）との間の架橋をもたらし得ると推測した。
さらに、CD8およびCD3εに対する二重特異性抗体は、それらを架橋するため、CD8陽性T細胞の間で相互の細胞傷害活性を誘導することが既に報告された（Wong, Clin. Immunol. Immunopathol. 1991, 58(2), 236-250）。したがって、本発明者らは、T細胞上で発現している分子およびCD3εに対する二重特異性抗体もまた、その分子を発現する細胞とCD3εを発現する細胞とを架橋するため、T細胞の間で相互の細胞傷害活性を誘導するであろうと推測した。
2つの異なる抗原に結合する抗原ドメインを獲得するために、いくつかの以前に報告された技術、例えば、異なるパンニングラウンドにおいて異なる抗原を代替的に用いる方法、および、第１の抗原に対する結合ドメインを最初に獲得し、次いで、第１の抗原に対する結合ドメインのランダム化によって作製されるライブラリーから第２の抗原に対する結合ドメインを獲得する方法がある。しかし、それらの戦略は、第１の抗原に対する結合ドメインを回収し、次いで、第１の抗原に対する結合ドメインをコードする回収されたヌクレオチドを増幅する工程、およびさらに、第２の抗原にも結合することができる結合ドメインを回収して、その核酸を増幅する工程を必要とする。本発明者らは、この工程の結果として、各パンニングラウンド工程が、結局、その中で用いられた様々な抗原のうちの1つに対して他の抗原よりも強い結合を示す結合ドメインを、様々な抗原の各々に対して結合を示す結合ドメインよりも特異的に濃縮することになり、そのため、所望の分子が効率的に回収されることを阻止するだろうと考えた。
選択のためにFACS（蛍光活性化細胞選別）を用いることができる細胞ディスプレイ、酵母ディスプレイ、または細菌ディスプレイなどのいくつかの方法論においては、2つ以上の異なる抗原に対して同時に2つ以上の選択圧をかけることが可能であると理解されている。しかし、本発明者らは、FACSを用いることができないファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、またはCISディスプレイなどの方法論においては、2つ以上の異なる抗原に対して同時に2つ以上の選択圧をかけることが難しかったと考える。
本発明は、CD3およびCD137に結合する抗原結合ドメイン、ならびにそれを使用する方法を提供する。本発明はまた、2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に取得する方法も提供する。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子である。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、T細胞受容体およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、T細胞受容体とCD137に同時には結合しない抗体可変領域；ならびに、T細胞受容体およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域を含む抗原結合分子である。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、がん組織において特異的に発現している分子に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子である。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域である。いくつかの態様において、本発明の抗体可変領域は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域である。
いくつかの態様において、本発明はまた、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない可変領域である、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインも提供する。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、抗体Fc領域を含む。さらなる態様において、本発明の抗原結合分子は、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較してFcγRに対する結合活性が低下している抗体Fc領域を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）可変領域は、配列番号：９１のアミノ酸配列を含むCD3εの細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子は、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（２）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）抗原結合分子は、CD137に対する結合についてCD137リガンドと競合しない、および
（２）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性は誘導しない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD137に対する結合について、以下からなる群より選択される抗体と競合する：
（a）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（b）配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５３のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（c）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５６のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（d）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５８のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、ならびに
（e）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、配列番号：９２に記載される重鎖可変ドメイン配列および／または配列番号：９３に記載される軽鎖可変ドメイン配列からなる鋳型配列中に1個または複数個のアミノ酸の改変を導入することによって生じたアミノ酸配列を含み、該1個または複数個のアミノ酸は、以下の位置：
H鎖：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、および100g（Kabatナンバリング）；ならびに
L鎖：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、および96（Kabatナンバリング）
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含み、
改変された重鎖可変ドメイン配列のHVR-H3は、
アミノ酸98位のAla、Pro、Ser、Arg、His、またはThr；
アミノ酸99位のAla、Ser、Thr、Gln、His、またはLeu；
アミノ酸100位のTyr、Ala、Ser、Pro、またはPhe；
アミノ酸100a位のTyr、Val、Ser、Leu、またはGly；
アミノ酸100b位のAsp、Ser、Thr、Leu、Gly、またはTyr；
アミノ酸100c位のVal、Leu、Phe、Gly、His、またはAla；
アミノ酸100d位のLeu、Phe、Ile、またはTyr；
アミノ酸100e位のGly、Pro、Tyr、Gln、Ser、またはPhe；
アミノ酸100f位のTyr、Ala、Gly、Ser、またはLys；
アミノ酸100g位のGly、Tyr、Phe、またはVal（Kabatナンバリング）
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、（a）配列番号：４１、３０、４６、もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；（b）配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、５６、もしくは５７のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列、を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。さらなる態様において、本発明の抗原結合分子は、完全長IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体である。
本発明はまた、本発明の抗原結合分子をコードする単離された核酸も提供する。本発明はまた、本発明の核酸を含む宿主細胞も提供する。本発明はまた、抗体が作製されるように本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法も提供する。
本発明はまた、本発明の抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤も提供する。
本発明の抗原結合分子は、薬としての使用のためであり得る。本発明の抗原結合分子は、様々な種類のがんの処置における使用のためであり得る。
本発明の抗原結合分子は、薬の製造において使用されてもよい。いくつかの態様において、薬は、様々な種類のがんの処置のためである。
本発明はまた、様々な種類のがんを有する個体を処置する方法も提供する。いくつかの態様において、方法は、個体に、本発明の抗原結合分子の有効量を投与する工程を含む。
本発明者らは、2つの異なる抗原（CD3およびCD137）に対して結合活性を有するが、これらの抗原に同時には結合しない抗体可変領域と、これらの抗原とは異なる抗原（第３の抗原）に結合する可変領域とを含む抗原結合分子を調製することに成功し、それが、3つの異なる抗原に対するその結合活性の使用を通して、この抗原結合分子によって誘導される活性を増強させることを見出した。加えて、本発明者らは、多重特異性抗原結合分子を医薬として用いた場合に有害反応の原因となると考えられる、異なる細胞上で発現している抗原に対する従来の多重特異性抗原結合分子の結合から生じる異なる細胞間の架橋を回避することができる、抗原結合分子を調製することに成功した。
本発明者らはまた、2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に取得する方法を開発することにも成功した。
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、Fab、scFv、Fab'2、VHH、VH、またはVLである。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋するためのスキャフォールドとを融合させることによって形成される、融合ポリペプチドである。
いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、バクテリオファージである。いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、リボソーム、RepAタンパク質、またはDNAピューロマイシンリンカーである。
いくつかの態様において、上記の工程（b）および（c）において、酸性溶液、塩基性溶液、DTT、またはIdeSである溶出溶液を用いて溶出が行われる。
いくつかの態様において、本発明の上記の工程（b）および（c）において用いられる溶出溶液は、EDTAまたはIdeSである。
いくつかの態様において、本発明の、目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングするための方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（b）'工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を翻訳する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の、目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインを作製するための方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
（e）工程（d）において選択された候補抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、Fc領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結する工程、
（f）上記の工程（d）において取得されたポリヌクレオチドが機能的に連結されているベクターが導入された細胞を培養する工程、ならびに
（g）上記の工程（f）において培養された細胞の培養液から、抗原結合分子を収集する工程
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の工程（a）において提供されるライブラリーは、デザインライブラリーである。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、上記の方法によって調製される抗体である。
より具体的には、本発明は、以下に関する。
[１]CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、抗体可変領域；ならびに
CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域
を含む、抗原結合分子。
[２]第３の抗原が、がん組織において特異的に発現している分子である、[１]の抗原結合分子。
[３]CD3とCD137に同時には結合しない可変領域が、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない可変領域である、[１]または[２]の抗原結合分子。
[４]抗体Fc領域をさらに含む、[１]〜[３]のいずれかの抗原結合分子。
[５]前記Fc領域が、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較してFcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、[４]の抗原結合分子。
[６]以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する、[１]〜[５]のいずれかの抗原結合分子：
（１）可変領域が、配列番号：９１のアミノ酸配列を含むCD3εの細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。
[７]CD137に対する結合について、以下からなる群より選択される抗体と競合する、[１]〜[６]のいずれかの抗原結合分子：
（a）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（b）配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５３のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（c）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５６のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（d）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５８のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、ならびに
（e）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体。
[８]配列番号：９２に記載される重鎖可変ドメイン配列および／または配列番号：９３に記載される軽鎖可変ドメイン配列からなる鋳型配列中に1個または複数個のアミノ酸の改変を導入することによって生じたアミノ酸配列を含み、
該1個または複数個のアミノ酸が、以下の位置：
H鎖：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、および100g（Kabatナンバリング）；ならびに
L鎖：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、および96（Kabatナンバリング）
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含み、
改変された重鎖可変ドメイン配列のHVR-H3が、
アミノ酸98位のAla、Pro、Ser、Arg、His、またはThr；
アミノ酸99位のAla、Ser、Thr、Gln、His、またはLeu；
アミノ酸100位のTyr、Ala、Ser、Pro、またはPhe；
アミノ酸100a位のTyr、Val、Ser、Leu、またはGly；
アミノ酸100b位のAsp、Ser、Thr、Leu、Gly、またはTyr；
アミノ酸100c位のVal、Leu、Phe、Gly、His、またはAla；
アミノ酸100d位のLeu、Phe、Ile、またはTyr；
アミノ酸100e位のGly、Pro、Tyr、Gln、Ser、またはPhe；
アミノ酸100f位のTyr、Ala、Gly、Ser、またはLys；
アミノ酸100g位のGly、Tyr、Phe、またはVal（Kabatナンバリング）
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む、
[１]〜[７]のいずれかの抗原結合分子。
[９]（a）配列番号：４１、３０、４６、もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；
（b）配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、５６、もしくは５７のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または
（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列
を含む、[１]〜[８]のいずれかの抗原結合分子。
[１０][１]〜[９]のいずれかの抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
[１１]目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法であって、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程
を含み、
工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない、方法。
[１２]前記抗原結合ドメインが、
抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋するために抗原結合ドメインをスキャフォールドと融合させることによって形成される、融合ポリペプチド
である、[１１]の方法。
[１３]前記スキャフォールドがバクテリオファージである、[１２]の方法。
[１４]工程（b）と（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を翻訳することを含む工程をさらに含む、[１２]の方法。
[１５]前記スキャフォールドが、リボソーム、RepAタンパク質、またはDNAピューロマイシンリンカーである、[１２]または[１４]の方法。
CD3およびCD137に結合するが、これらの抗原に同時には結合しない抗体の概念図である。 CD3とCD137に同時には結合しないため、架橋を引き起こさない抗体の概念図である。一方、CD3、CD137、および第３の抗原に対する三機能性抗体は、T細胞とCD137陽性細胞との架橋を引き起こす。 CD3およびCD137に結合するが、2つの細胞を同時には連結しない抗体の概念図である。 第３の抗原陽性細胞と、CD3およびCD137を発現するT細胞とを架橋する抗体の概念図である。 第３の抗原陽性細胞と、CD137を発現する細胞とを架橋する抗体の概念図である。 dual scFv VHリボソームディスプレイライブラリーの設計および構築フローの模式図である。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイで取得されたクローンのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。黒色のクローンは、CD137およびCD3の両方に対して結合を示す陽性scFvとして同定された。 図７−１の続き。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイで取得されたIgGのECL解析の結果を示すグラフである。Y軸は、CD137、CD3の両方、およびプレート自体に対する反応を意味する。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイで取得されたクローンのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。キャンペーン3は、ダブルラウンド選択でのリボソームディスプレイパンニングを意味する。 図９−１の続き。 図９−２の続き。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイで取得されたクローンのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。 dual scFv VLリボソームディスプレイライブラリーおよびdual Fab VLリボソームディスプレイライブラリーの設計の模式図である。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイ親和性成熟で取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するリボソームディスプレイ親和性成熟で取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3またはヒトFcを、競合物として用いた。 ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されている、C3NP1-27、CD3εペプチド抗原の設計を示す。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、CD3に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのビーズELISAにおけるCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、図１６と同じプレートELISAにおけるCD3に対する特異性を意味する。 ヒトCD137アミノ酸配列とカニクイザルCD137アミノ酸配列との比較データを示す。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのカニクイザルCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、CD3eに対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3またはヒトFcを、競合物として用いた。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイパンニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ヒトCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パンニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパンニング前のプールであり、R1〜R6は、それぞれラウンド1〜ラウンド6のファージディスプレイパンニング後のパンニングアウトプットプールを意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイパンニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、カニクイザルCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パンニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパンニング前のプールであり、R1〜R6は、それぞれラウンド1〜ラウンド6のファージディスプレイパンニング後のパンニングアウトプットプールを意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイパンニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、CD3に対する特異性を意味する。X軸は、パンニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパンニング前のプールであり、R1〜R6は、それぞれラウンド1〜ラウンド6のファージディスプレイパンニング後のパンニングアウトプットプールを意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。 図２３−１の続き。 図２３−２の続き。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を、競合物として用いた。 各クローンのエピトープドメインを同定するための、CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ヒトCD137の各ドメインに対するELISAの反応を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイ親和性成熟で取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。 CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を、競合物として用いた。 図２８−１の続き。 図２８−２の続き。 図２８−３の続き。 図２８−４の続き。 抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化B細胞からのIL-6分泌のメカニズムを示す。 活性化B細胞から分泌されるIL-6の産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD137媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを呈する。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。 抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化Jurkat T細胞におけるルシフェラーゼ発現のメカニズムを示す。 活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを呈する。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。 各固定化抗体の存在下でヒトPBMC由来T細胞からのサイトカイン（IL-2、IFN-γ、およびTNF-α）放出を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、分泌された各サイトカインの濃度を意味し、X軸は、固定化された抗体の濃度を意味する。対照抗CD137抗体（B）、対照抗CD3抗体（CE115）、陰性対照抗体（Ctrl）、およびdual抗体のうちの1つ（L183L072）を、アッセイのために用いた。 各二重特異性抗体でのGPC3陽性標的細胞（SK-pca60およびSK-pca13a）に対するT細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、細胞増殖抑制（CGI）の比を意味し、X軸は、各二重特異性抗体の濃度を意味する。抗GPC3/Dual二重特異性抗体（GC33/H183L072）、陰性対照/Dual二重特異性抗体（Ctrl/H183L072）、抗GPC3/抗CD137二重特異性抗体（GC33/B）、および陰性対照/抗CD137二重特異性抗体（Ctrl/B）を、このアッセイのために用いた。5倍量のエフェクター（E）細胞を、腫瘍（T）細胞に加えた（ET5）。 三重特異性抗体（mAb AB）の設計および構築手順を示す。 調製された三重特異性抗体の命名規則を示す。 GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/dual-Fab抗体の同時結合のBiacore解析の結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各抗原に対する結合レスポンスを意味する。最初に、ヒトCD3（hCD3）をアナライトとして用い、次いで、hCD3（破線として示す）またはヒトCD137（hCD137）とhCD3の混合物（実線として示す）もアナライトとして用いた。 各抗体のCD137陽性CHO細胞またはJurkat細胞に対するFACS解析の結果を示す一連のセンサーグラフである。図３５（a）および（c）は、ヒトCD137陽性CHO細胞に対する結合の結果であり、図３５（b）および（d）は、親CHO細胞に対する結果である。図３５（a）および（b）において、実線は、抗GPC3/dual抗体（GC33/H183L072）の結果を示し、塗りつぶしは、対照抗体（Ctrl）の結果を示す。図３５（c）および（d）において、実線、暗灰色での塗りつぶし、および薄灰色での塗りつぶしは、それぞれ、GPC3/CD137xCtrl三重特異性抗体、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体、およびCtrl/CtrlxCD3三重特異性抗体の結果を示す。図３５（e）および（f）は、Jurkat CD3陽性細胞に対する結合の結果である。図３５（e）において、実線および塗りつぶしは、それぞれ、抗GPC3/dual抗体（GC33/H183L072）および対照抗体（Ctrl）の結果を示す。図３５（f）において、実線、暗灰色での塗りつぶし、および薄灰色での塗りつぶしは、それぞれ、GPC3/CtrlxCD3三重特異性抗体、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体、およびCtrl/CD137xCtrl三重特異性抗体の結果を示す。 活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、GPC3陽性標的細胞SK-pca60に対する様々な抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを呈する。6種類の三重特異性抗体、抗GPC3/Dual-Fab抗体（GPC3/H183L072）、および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。X軸は、各抗体の用いた濃度を意味する。 活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、ヒトCD137陽性CHO細胞および親CHO細胞に対する様々な抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを呈する。6種類の三重特異性抗体、抗GPC3/Dual-Fab抗体（GPC3/H183L072）、および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。X軸は、各抗体の用いた濃度を意味する。 各可溶性抗体の存在下でヒトPBMCからのサイトカイン（IL-2、IFN-γ、およびTNF-α）放出を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、分泌された各サイトカインの濃度を意味し、X軸は、用いた抗体の濃度を意味する。Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体、および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。 CD3eに対するCE115の細胞ELISAの結果を示すグラフである。 EGFR_ERY22_CE115の分子形を示す図である。 EGFR_ERY22_CE115のTDCC（SK-pca13a）の結果を示すグラフである。 結合量の比が0.8未満の抗体の例示的なセンサーグラムである。縦軸は、RU値（レスポンス）を図示する。横軸は、時間を図示する。
態様の説明
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子である。
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、T細胞受容体およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、T細胞受容体とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、T細胞受容体およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子である。
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、がん組織において特異的に発現している分子に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子である。
1つの局面において、本発明の抗原結合ドメインは、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域である。1つの局面において、本発明の抗体可変領域は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域である。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD3に対するそのアゴニスト活性によってT細胞を活性化することができ、かつ、標的細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導することができ、CD137およびCD3に対するその共刺激アゴニスト活性によってT細胞の活性化、生存、およびメモリーT細胞への分化を強化することができる。一方、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないため、CD137とCD3との架橋により引き起こされる有害作用を回避することができる。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子はまた、CD137を発現する免疫細胞を活性化し、CD137に対するアゴニスト活性によって標的細胞への免疫応答を強化することもできる。
本発明において、「抗体可変領域」とは、通常、4つのフレームワーク領域（FR）およびそれが隣接する3つの相補性決定領域（CDR）によって構成されるドメインを含む領域を意味し、またその部分配列も、その部分配列が抗原の一部または全部に結合する活性を有する限り含む。特に、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体重鎖可変ドメイン（VH）を含む領域が好ましい。本発明の抗体可変領域は、任意の配列を有してもよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、およびこれらの非ヒト抗体のいずれかのヒト化によって得られたヒト化抗体、およびヒト抗体などの、任意の抗体に由来する可変領域であってもよい。「ヒト化抗体」は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも呼ばれ、非ヒト哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のCDRへ移植することによって取得される。CDRを同定するための方法は、当技術分野において公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；およびChothia et al., Nature (1989) 342: 877）。そのための一般的な遺伝子組換え手法もまた、当技術分野において公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023およびWO 96/02576参照）。
「CD3とCD137（4-1BB）に同時には結合しない」本発明の「抗体可変領域」とは、本発明の抗体可変領域が、CD3と結合している状態ではCD137に結合できず、逆に可変領域が、CD137と結合している状態ではCD3に結合できないことを意味する。ここで、「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、可変領域が、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗体可変領域は、これらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型の抗体可変領域に由来する可変領域が含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
本発明において、1つのアミノ酸改変が、単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が、組み合わせて用いられてもよい。
複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わせる改変の数は、特に限定されず、発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができる。組み合わせる改変の数は、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
組み合わせる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。
可変領域中の1個または複数個のアミノ酸残基が、抗原結合活性が維持される限り、改変されるアミノ酸残基として許容される。可変領域中のアミノ酸を改変する場合、結果として生じた可変領域は、対応する未改変の抗体の結合活性を好ましくは維持し、好ましくは、例えば、改変前よりも50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは100％以上高い結合活性を有するが、本発明による可変領域はそれらに限定されない。結合活性は、アミノ酸改変によって上昇していてもよく、例えば、改変前の結合活性の2倍、5倍、または10倍であってもよい。
アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。また、アミノ酸改変時に、抗原結合活性を上昇させるアミノ酸がさらに導入されてもよい。
本明細書において用いられる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列（「相補性決定領域」もしくは「CDR」）が超可変であり、かつ/または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原に接触する残基（「抗原接触部」）を含有する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。概して、抗体は、6つのHVR：VHにおける3つ（H1、H2、H3）およびVLにおける3つ（L1、L2、L3）を含む。本明細書における例示的なHVRは、以下を含む：
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ。
特に示されない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、上記のKabat et al.に従って、本明細書においてナンバリングされる。
本発明において、「ループ」とは、免疫グロブリンのβバレル構造の維持に関与しない残基を含有する領域を意味する。
本発明において、アミノ酸改変とは、置換、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせを意味する。本発明において、アミノ酸改変は、アミノ酸変異と互換的に用いられ、それと同じ意味で用いられ得る。
アミノ酸残基の置換は、例えば、以下の（a）〜（c）のいずれかを改変する目的で、別のアミノ酸残基での置き換えによって実施される：（a）シート構造またはらせん構造を有する領域のポリペプチドバックボーン構造；（b）標的部位の電荷もしくは疎水性；および（c）側鎖のサイズ。
アミノ酸残基は、一般的な側鎖の性質に基づいて以下のグループに分類される：（1）疎水性残基：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、およびIle；（2）中性親水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、およびGln；（3）酸性残基：AspおよびGlu；（4）塩基性残基：His、Lys、およびArg；（5）鎖の配向に影響する残基：GlyおよびPro；ならびに（6）芳香族残基：Trp、Tyr、およびPhe。
これらのグループの各々内でのアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれ、一方、これらのグループのうちの1つにおけるアミノ酸残基の別のグループにおけるアミノ酸残基による置換は、非保存的置換と呼ばれる。
本発明による置換は、保存的置換であってもよく、または非保存的置換であってもよい。あるいは、保存的置換と非保存的置換とが組み合わされてもよい。
アミノ酸残基の改変にはまた、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域において、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸のランダム改変によって得られたものからの、CD3およびCD137に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができない可変領域の選択；ならびに、所望の抗原に対して結合活性を有することが以前に知られているペプチドを上述の領域に挿入する改変も含まれる。
本発明の抗体可変領域において、上述の改変は、当技術分野において公知の改変と組み合わされてもよい。例えば、可変領域のN末端グルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は、当業者によく知られている修飾である。したがって、その重鎖のN末端にグルタミンを有する本発明の抗体は、このN末端グルタミンがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含有してもよい。
そのような抗体可変領域は、例えば、抗原結合、薬物動態、安定性、または抗原性を改善するために、アミノ酸改変をさらに有してもよい。本発明の抗体可変領域は、抗原に対してpH依存的な結合性を有し、それによって抗原に繰り返し結合することができるように、改変されてもよい（WO2009/125825）。
また、例えば、第３の抗原に結合するそのような抗体可変領域に対して、標的組織特異的な化合物の濃度に従って抗原結合活性を変化させるアミノ酸改変が加えられてもよい（WO2013/180200）。
可変領域は、例えば、結合活性の増強、特異性の改善、pIの低下、pH依存的な抗原結合特性の付与、結合の熱安定性の改善、溶解性の改善、化学修飾に対する安定性の改善、糖鎖に由来する不均一性の改善、免疫原性の低下のためのインシリコ予測もしくはインビトロT細胞ベースアッセイの使用によって同定されたT細胞エピトープの回避、または制御性T細胞を活性化するためのT細胞エピトープの導入を目的として、さらに改変されてもよい（mAbs 3:243-247, 2011）。
本発明の抗体可変領域が「CD3およびCD137に結合することができる」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。
これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
具体的には、例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子の、CD3およびCD137に結合することができる領域、例えば、Fab領域から構成される低分子抗体、またはその一価抗体（通常の抗体が有する2つのFab領域のうち1つが欠けている抗体）を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3またはCD137と混合し、混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加する。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それによって、CD3またはCD137に対する被験抗原結合分子の上述の領域の結合を確認することができる。
あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA，またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本発明の抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上にCD3またはCD137をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、CD3またはCD137の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。
あるいは、CD3またはCD137を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化してもよく、次に、評価したい抗体サンプルを相互作用させる。本発明の抗原結合分子の抗体可変領域がCD3またはCD137に対する結合活性を有するかどうかを、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルを上回る、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて確認することができる。
ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
本発明の抗原結合分子が「CD3とCD137に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子がCD3およびCD137の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、CD3またはCD137のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化されたCD3またはCD137のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子のCD3またはCD137のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される（実施例５−５、７−５、８−９、９−４参照）。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3、および標識されていないCD137を準備する。被験抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識されたCD3との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていないCD137の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていないCD137の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識されたCD137および標識されていないCD3を用いて、同様に実施され得る。
ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合するCD137の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないCD137は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされたCD137およびタグ付けされていないCD3を用いて、同様に解析され得る。
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、CD3とCD137に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有するCD3および蛍光アクセプターを有するCD137が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、CD3とCD137に同時に結合するものと確認される。他方で、CD3、CD137、および被験抗原結合分子の混合が、CD3と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたCD3を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第２の抗原の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第２の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。
また、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
具体的には、CD3およびCD137に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現しているCD3およびCD137に同時には結合できないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。CD3を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、CD137を発現する細胞をプレートに添加する。CD137を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。
あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合したCD3を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合したCD137を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。
あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ぺプチドタグを付加したCD3を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。CD137を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子およびCD137を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。
結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、CD137を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、CD137またはCD3のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。
本発明において、「Fc領域」とは、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも言う））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
いくつかの態様において、「抗原結合分子」は、本発明の「抗体可変領域」を含む限り、特に限定されない。抗原結合分子は、さらに、およそ5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質を含み得る。ペプチドまたはタンパク質は、生物に由来するペプチドまたはタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドなどが用いられてもよい。
いくつかの態様において、本発明の「抗原結合分子」は、「抗体可変領域」を含む分子に特に限定されるわけではない。ある特定の態様において、可変領域を含む抗体以外である抗原結合分子が、2つの異なる抗原に結合することができ、例えば、アフィボディなどが、当業者に一般的に知られている方法によって取得されてもよい（PLoS One. 2011;6(10):e25791；PLoS One. 2012;7(8):e42288；J Mol Biol. 2011 Aug 5;411(1):201-19；Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Aug 23;108(34):14067-72）。
本発明の抗原結合分子の好ましい例には、抗体Fc領域を含む抗原結合分子が含まれ得る。
例えば、天然型IgGに由来するFc領域を、本発明の「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本発明において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356〜358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。
抗体Fc領域は、例えば、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMタイプのFc領域として見出される。例えば、天然型ヒトIgG抗体に由来するFc領域を、本発明の抗体Fc領域として用いることができる。例えば、天然型IgGの定常領域、具体的には、天然型ヒトIgG1を起源とする定常領域（配列番号：ＹＹ００４）、天然型ヒトIgG2を起源とする定常領域（配列番号：ＹＹ００５）、天然型ヒトIgG3を起源とする定常領域（配列番号：ＹＹ００６）、または天然型ヒトIgG4を起源とする定常領域（配列番号：ＹＹ００７）に由来するFc領域を、本発明のFc領域として用いることができる。天然型IgGの定常領域にはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。
本発明のFc領域は、特に好ましくは、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である。ここで、Fcγ受容体（本明細書においてFcγRとも言う）とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域に結合することができる受容体を指し、Fcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）；ならびに、任意の未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプも含まれるが、それらに限定されない。FcγRには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。FcγRは、これらの分子に限定されず、任意の生物に由来してもよい。マウスFcγRには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、およびFcγRIII-2（CD16-2）、ならびに任意の未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。そのようなFcγ受容体の好ましい例には、ヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）、および／またはFcγRIIIb（CD16）が含まれる。
FcγRは、ITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）を有する活性型受容体およびITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）を有する抑制型受容体の形態で見出される。FcγRは、活性型FcγR（FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、およびFcγRIIIb）と抑制型FcγR（FcγRIIb）とに分類される。
FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3およびNP_000557.1に記載されている；FcγRIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1およびAAH20823.1に記載されている；FcγRIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1およびAAI46679.1に記載されている；FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1およびAAH33678.1に記載されている；ならびにFcγRIIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1およびAAI28563.1に記載されている（RefSeq登録番号）。FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン（H型）またはアルギニン（R型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990）。FcγRIIbには、FcγRIIbの232番目のアミノ酸がイソロイシン（I型）またはスレオニン（T型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)）。FcγRIIIaには、FcγRIIIaの158番目のアミノ酸がバリン（V型）またはフェニルアラニン（F型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)）。FcγRIIIbには、2種類の遺伝子多型（NA1型およびNA2型）が存在する（J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)）。
Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることは、FACS、ELISA形式、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、または表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などの、周知の方法によって確認することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAScreen法は、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたFcγ受容体を、アクセプタービーズに結合させる。競合する変異Fc領域を有する抗原結合分子の非存在下では、野生型Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない変異Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体との相互作用について、野生型Fc領域を有する抗原結合分子と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合親和性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いた抗原結合分子（例えば、抗体）のビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、Fcγ受容体をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているとは、被験抗原結合分子が、上記の解析方法に基づいて、Fc領域を含む対照抗原結合分子の結合活性と比較して、例えば、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合活性を示すことを意味する。
IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFc領域を有する抗原結合分子を、対照抗原結合分子として適宜用いることができる。Fc領域の構造は、配列番号：９４（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、配列番号：９５（RefSeq登録番号AAB59393.1のN末にA付加）、配列番号：９６（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末にA付加）、または配列番号：９７（RefSeq登録番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載されている。ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域のバリアントを有する抗原結合分子を試験物質として用いる場合には、このある特定のアイソタイプの抗体のFc領域を有する抗原結合分子を対照として用いて、バリアントにおける変異の、Fcγ受容体に対する結合活性への効果を試験する。Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることがこのように確認されたFc領域バリアントを有する抗原結合分子が、適宜調製される。
例えば、231A〜238S欠失（WO 2009/011941）、C226S、C229S、P238S、(C220S)（J.Rheumatol (2007) 34, 11）、C226S、C229S（Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）、C226S、C229S、E233P、L234V、またはL235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）（これらのアミノ酸はEUナンバリングに従って定義される）バリアントが、そのようなバリアントとして当技術分野において公知である。
その好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位のアミノ酸のいずれかの置換による、ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。Fc領域の起源である抗体のアイソタイプは、特に限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を起源とするFc領域が、適宜用いられ得る。天然型ヒトIgG1抗体を起源とするFc領域が、好適に用いられる。
例えば、EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（a）L234F、L235E、およびP331S、
（b）C226S、C229S、およびP238S、
（c）C226SおよびC229S、ならびに
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A
のいずれかによる、または231〜238位のアミノ酸配列の欠失による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S、
（f）V234A、
（g）G237A、
（h）V234AおよびG237A、
（i）A235EおよびG237A、ならびに
（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれかによる、IgG2抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（k）F241A、
（l）D265A、および
（m）V264A
のいずれかによる、IgG3抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（n）L235A、G237A、およびE318A、
（o）L235E、ならびに
（p）F234AおよびL235A
のいずれかによる、IgG4抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、および331位のアミノ酸のいずれかの、カウンターパートのIgG2またはIgG4のFc領域における対応するEUナンバリングの位置のアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数の、異なるアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
その他の好ましい例には、EUナンバリングに従って定義される265位の構成アミノ酸の、異なるアミノ酸での置換による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。265位のアミノ酸がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
本発明の「抗原結合分子」の1つの好ましい形態は、例えば、本発明の抗体可変領域を含む多重特異性抗体であることができる。
多重特異性抗体の会合には、抗体H鎖の第２の定常ドメイン（CH2）または第３の定常ドメイン（CH3）の間の界面に電荷反発を導入することによって意図されないH鎖間の会合を抑制する技術を、適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に電荷反発を導入することによって意図されないH鎖間の会合を抑制する技術において、H鎖定常ドメイン間の界面で互いに接触するアミノ酸残基の例には、1つのCH3ドメインにおけるEUナンバリング356位の残基、EUナンバリング439位の残基、EUナンバリング357位の残基、EUナンバリング370位の残基、EUナンバリング399位の残基、およびEUナンバリング409位の残基、ならびにもう1つのCH3ドメインにおけるそれらのパートナー残基が含まれ得る。
より具体的には、例えば、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体として、2つのH鎖CH3ドメインを含む抗体を調製することができる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。
抗体は、さらに、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗体として、調製することができる。
ペア（１）〜（３）に記載される各アミノ酸残基は、会合したH鎖においてそのパートナーの近くに位置している。当業者は、所望のH鎖CH3ドメインまたはH鎖定常ドメインについて、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、ペア（１）〜（３）の各々に記載されるアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、その位置のアミノ酸残基を適宜改変することができる。
上記の抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」の各々は、好ましくは、例えば、以下の群（a）および（b）のいずれかに含まれるアミノ酸残基から選択される：
（a）グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）；ならびに
（b）リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
上記の抗体において、「同種の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のすべてが、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であることを意味する。「反対の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基の中の少なくとも1つのアミノ酸残基が、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であってもよく、一方、残りのアミノ酸残基は、他の群に含まれるアミノ酸残基であることを意味する。
好ましい態様において、抗体は、第１のH鎖CH3ドメインと第２のH鎖CH3ドメインとがジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明に従って改変されるアミノ酸残基は、上述の抗体可変領域または抗体定常領域におけるアミノ酸残基に限定されない。当業者は、ポリペプチドバリアントまたは異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、界面を構成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、その位置のアミノ酸残基を改変することができる。
本発明の多重特異性抗体の会合はまた、当技術分野において公知の代替技術によって実施することもできる。1つの抗体H鎖の可変ドメインに存在するアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖によって置換し（ノブ）、もう1つのH鎖の可変ドメインに存在するそのパートナーのアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖によって置換する（ホール）。アミノ酸配列の異なるFcドメインのポリペプチドが効率的に会合するように、ノブをホール中に配置することができる（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
この技術に加えて、当技術分野において公知のさらなる代替技術が、本発明の多重特異性抗体を形成させるために用いられてもよい。1つの抗体H鎖のCH3の一部を、その対応するIgA由来の配列に変換し、もう1つのH鎖のCH3におけるその相補的な部分を、その対応するIgA由来の配列に変換する。結果として生じた鎖交換操作ドメインCH3を用いることにより、配列が異なるポリペプチド間の効率的な会合を、相補的CH3会合によって引き起こすことができる（Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010）。当技術分野において公知のこの技術の使用によって、目的の多重特異性抗体も、効率的に形成させることができる。
あるいは、多重特異性抗体は、例えば、WO2011/028952に記載されているような抗体のCH1-CL会合およびVH-VL会合を用いた抗体調製技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されているような別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術（Fabアーム交換）、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されているような抗体重鎖CH3ドメイン間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されているような2種類の軽鎖および1種類の重鎖から構成される二重特異性抗体を調製する技術、またはChristoph et al.（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）に記載されているような1本のH鎖および1本のL鎖からなる抗体の半分子を各々が発現する2つの細菌細胞株を用いて二重特異性抗体を調製する技術によって、形成され得る。これらの会合技術に加えて、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖を、それぞれ、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖に会合させる、公知の異種軽鎖会合技術であるCrossMabテクノロジー（Scaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 11187-11192）もまた、本発明によって提供される多重特異性または多重パラトピック抗原結合分子を調製するために用いることができる。別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術の例には、重鎖CH3ドメインにおける特定のアミノ酸を置換したモノクローナル抗体を還元条件下に置くことによって抗体のヘテロ二量体化を促進して、所望の二重特異性抗体を取得することを含む方法が含まれ得る。この方法にとって好ましいアミノ酸置換部位の例には、CH3ドメインにおけるEUナンバリング392位の残基およびEUナンバリング397位の残基が含まれ得る。さらに、二重特異性抗体はまた、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体の使用によって、調製することもできる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。二重特異性抗体はまた、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗体の使用によって、調製することもできる。
目的の多重特異性抗体を効率的に形成させることができない場合であっても、本発明の多重特異性抗体は、産生された抗体の中から目的の多重特異性抗体を分離、精製することによって取得され得る。例えば、以前に報告された方法には、2種類のホモ二量体および目的のヘテロ二量体化抗体をイオン交換クロマトグラフィーによって別々に精製できるように、2種類のH鎖の可変ドメインにアミノ酸置換を導入して、等電点の差を付与することが含まれる（WO2007114325）。プロテインAに結合することができるマウスIgG2aのH鎖およびプロテインAに結合することができないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量体化抗体を精製するためにプロテインAを用いる方法が、ヘテロ二量体を精製するための方法として以前に報告されている（WO98050431およびWO95033844）。あるいは、IgGのプロテインA結合部位を構成するEUナンバリング435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA結合の強度を提供する、TyrおよびHisなどのアミノ酸に置換してもよく、結果として生じたH鎖を、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させるために用いる。結果として、ヘテロ二量体化抗体のみを、プロテインAカラムの使用によって効率的に精製することができる。
これらの技術の複数、例えば2つ以上を、組み合わせて用いてもよい。また、これらの技術は、会合させたい2つのH鎖に適宜別々に適用させることもできる。本発明の抗原結合分子は、このように改変された形態に基づくがそれとは別に、同一のアミノ酸配列を有する抗原結合分子として調製されてもよい。
アミノ酸配列の改変は、当技術分野において公知の様々な方法によって行うことができる。行われてもよいこれらの方法の例には、部位特異的変異誘発（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275；Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367；およびKunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発などの方法が含まれ得るが、それらに限定されない。
本発明の「抗原結合分子」は、単一のポリペプチド鎖中に本発明の「抗体可変領域」を構成する重鎖および軽鎖の両方を含むが、定常領域を欠いている抗体断片であってもよい。そのような抗体断片は、例えば、ダイアボディ（diabody）（Db）、一本鎖抗体、またはsc(Fab')2であってもよい。
Dbは、2本のポリペプチド鎖によって構成される二量体である（例えば、Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)；EP404,097；およびW093/11161）。これらのポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上のL鎖可変ドメイン（VL）およびH鎖可変ドメイン（VH）が互いにペア形成できないほど短い、例えば、およそ5残基のリンカーを通して連結されている。
この短いリンカーのために、同じポリペプチド鎖上にコードされるVLおよびVHは、一本鎖Fvを形成することができず、その代わりに、別のポリペプチド鎖上の、それぞれVHおよびVLと二量体化して、2つの抗原結合部位を形成する。
一本鎖抗体の例には、sc(Fv)2が含まれる。sc(Fv)2は、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して連結された4つの可変ドメイン、すなわち、2つのVLおよび2つのVHによって構成される1つの鎖を有する一本鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。これらの2つのVHおよびVLは、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。その好ましい例には、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374において開示されるような、同じ抗原中に存在する2種類のエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2が含まれる。sc(Fv)2は、当業者に概して知られている方法によって調製することができる。例えば、sc(Fv)2は、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して2つのscFvを接続することによって調製することができる。
本明細書に記載されるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの構成の例には、2つのVHおよび2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端から開始してVH、VL、VH、およびVL（すなわち、[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]）の順序で整列している抗体が含まれる。2つのVHと2つのVLの順序は、上記の構成に特に限定されず、任意の配置の順序であってもよい。その例にはまた、以下の配置も含まれ得る：
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]、
[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]、
[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]、
[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]、および
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]。
sc(Fv)2の分子形態はまた、WO2006/132352においても詳細に記載されている。その中の記載に基づいて、当業者は、本明細書において開示される抗原結合分子を調製するために、所望のsc(Fv)2を適宜調製することができる。
本発明の抗原結合分子は、PEGなどの担体ポリマーまたは抗がん剤などの有機化合物とコンジュゲートされてもよい。また、所望の効果を生じることを目的とした糖鎖付加配列の挿入によって、本発明の抗原結合分子に糖鎖を好適に付加することができる。
例えば、遺伝子工学によって導入することができる任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996において開示されるリンカー）を、抗体可変ドメインを連結するためのリンカーとして用いることができる。本発明において、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは、特に限定されず、目的に従って当業者が適宜選択することができる。長さは、好ましくは5アミノ酸以上であり（上限は、特に限定されず、通常30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下である）、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2が3つのペプチドリンカーを含有する場合、用いられるこれらのペプチドリンカーのすべては、同じ長さを有してもよく、または異なる長さを有してもよい。
ペプチドリンカーの例には、
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１６２）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：１６３）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１６４）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：１６５）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１６６）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：１６７）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１６８）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：１６９）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１６４）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：１６５）)n、
（ここで、nは1以上の整数である）が含まれ得る。しかし、ペプチドリンカーの長さまたは配列は、目的に従って当業者が適宜選択することができる。
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられる架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベラート（DSS）、ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート（BS3）、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート）（DTSSP）、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)（EGS）、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)（スルホ-EGS）、ジスクシンイミジルタルトラート（DST）、ジスルホスクシンイミジルタルトラート（スルホ-DST）、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（BSOCOES）、またはビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（スルホ-BSOCOES）である。
これらの架橋剤は、市販されている。
4つの抗体可変ドメインを連結するためには、3つのリンカーが通常必要である。用いられるこれらのリンカーのすべては、同じリンカーであってもよく、または異なるリンカーであってもよい。
F(ab')2は、2本の軽鎖、ならびに、鎖間ジスルフィド結合が2本の重鎖の間で形成されるように定常領域（CH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分）を含有する2本の重鎖を含む。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するF(ab')2は、好ましくは、例えば、所望の抗原結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムに吸着したFc断片を除去することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびフィシンが含まれ得る。
本発明の抗原結合分子は、上述のアミノ酸改変に加えて、追加的な改変をさらに含有することができる。追加的な改変は、例えば、アミノ酸置換、欠失、および修飾、ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。
例えば、本発明の抗原結合分子は、分子の意図される機能を実質的に変化させることなく、さらに任意に改変することができる。そのような変異は、例えば、アミノ酸残基の保存的置換によって行うことができる。あるいは、本発明の抗原結合分子の意図される機能を変化させる改変であっても、そのような改変によって変化した機能が本発明の目的の範囲内である限り、実施されてもよい。
本発明によるアミノ酸配列の改変にはまた、翻訳後修飾も含まれる。具体的には、翻訳後修飾とは、糖鎖の付加または欠失を指すことができる。例えば、IgG1型の定常領域を有する本発明の抗原結合分子は、EUナンバリング297位に、糖鎖で修飾されたアミノ酸残基を有することができる。修飾における使用のための糖鎖構造は、限定されない。概して、真核細胞が発現する抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。したがって、以下の細胞が発現する抗体は、通常、いくつかの糖鎖で修飾されている：
哺乳動物の抗体産生細胞；および
抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞。
ここで、真核細胞には、酵母および動物細胞が含まれる。例えば、CHO細胞またはHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターでの形質転換のための典型的な動物細胞である。他方、本発明の抗体には、その位置に糖鎖修飾がない抗体も含まれる。糖鎖で修飾されていない定常領域を有する抗体は、これらの抗体をコードする遺伝子の、大腸菌などの原核細胞における発現によって取得することができる。
本発明による追加的な改変は、より具体的には、例えば、Fc領域における糖鎖へのシアル酸の付加であってもよい（mAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27）。
本発明の抗原結合分子が、Fc領域を有する場合、例えば、FcRnに対する結合活性を改善するアミノ酸置換（J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56；J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24；Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69；Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9；WO2006/019447；WO2006/053301；およびWO2009/086320）、または抗体の不均一性もしくは安定性を改善するためのアミノ酸置換（(WO2009/041613)）を加えてもよい。
本発明において、「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体バリアント、抗体断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの任意の抗体をも含む。
本発明の抗体は、その抗原の種類、その起源などによって限定されず、任意の抗体であってもよい。抗体の起源の例には、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、およびウサギ抗体が含まれ得るが、特にそれらに限定されることはない。
抗体は、当業者によく知られている方法によって調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）によって産生させてもよい。あるいは、モノクローナル抗体を、ファージディスプレイ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)；およびMarks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、モノクローナル抗体を、単一のB細胞クローンから単離してもよい（N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)）。
ヒト化抗体はまた、再構成ヒト抗体とも呼ばれる。具体的には、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体のCDRを移植したヒト抗体からなるヒト化抗体が、当技術分野において公知である。ヒト化抗体を取得するための一般的な遺伝子組換え手法もまた、公知である。具体的には、例えば、オーバーラップ伸長PCRが、マウス抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、当技術分野において公知である。
連結された3つのCDRおよび4つのFRを各々が含む抗体可変ドメインをコードするDNA、およびヒト抗体定常ドメインをコードするDNAを、可変ドメインDNAが定常ドメインDNAとインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入して、ヒト化抗体発現用ベクターを調製することができる。インサートを有するこれらのベクターを宿主に移入して、組換え細胞を樹立する。次いで、ヒト化抗体をコードするDNAの発現のために組換え細胞を培養して、ヒト化抗体を培養細胞の培養物中に産生させる（欧州特許公開番号EP 239400および国際公開番号WO1996/002576参照）。
必要な場合は、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、FRのアミノ酸残基を置換してもよい。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植において用いられるPCR法の応用によって、FRのアミノ酸配列を変異させることができる。
所望のヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子のすべてのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開番号WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、およびWO1996/033735参照）を免疫動物として用いるDNA免疫によって、取得することができる。
加えて、ヒト抗体ライブラリーを用いたパンニングによって、ヒト抗体を取得する技術も公知である。例えば、ヒト抗体V領域を、ファージディスプレイ法によってファージの表面上に、一本鎖抗体（scFv）として発現させる。抗原結合scFvを発現するファージを、選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析して、抗原結合ヒト抗体のV領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原結合scFvのDNA配列を決定した後、V領域配列を、所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させ、次いで、適切な発現ベクターに挿入して、発現ベクターを調製することができる。発現ベクターを、ヒト抗体をコードする遺伝子の発現のために上記に列挙される好ましい発現細胞に移入して、ヒト抗体を取得する。これらの方法は、当技術分野において既知である（国際公開番号WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、およびWO1995/015388参照）。
ファージディスプレイ技術に加えて、例えば、無細胞翻訳システムを用いた技術、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術、およびエマルジョンを用いた技術が、ヒト抗体ライブラリーを用いたパンニングによって、ヒト抗体を取得するための技術として公知である。例えば、終止コドンの除去などにより、リボソームを介してmRNAと翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むリボソームディスプレイ法、ピューロマイシンなどの化合物を用いて、翻訳されたタンパク質を遺伝子配列に共有結合させることを含むcDNAもしくはmRNAディスプレイ法、または核酸結合タンパク質を用いて、遺伝子と翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むCISディスプレイ法を、無細胞翻訳システムを用いた技術として用いることができる。ファージディスプレイ法、および大腸菌ディスプレイ法、グラム陽性細菌ディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、哺乳動物細胞ディスプレイ法、ウイルスディスプレイ法などを、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術として用いることができる。例えば、エマルジョンに封入された遺伝子および翻訳関連分子を用いたインビトロウイルスディスプレイ法を、エマルジョンを用いた技術として用いることができる。これらの方法は、当技術分野において既知である（Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92；Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e127；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8；Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21 (4): 247-55；Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5；MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18；およびMethods Mol Biol. 2012; 911: 183-98）。
本発明の第３の抗原に結合する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることができる。本発明の第３の抗原に結合する可変領域は、がん組織において特異的に発現する分子を認識する可変領域であることができる。
本明細書において、「第３の抗原」は、特に限定されず、任意の抗原であってもよい。抗原の例には、17-IA、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、アディポネクチン、ADPリボシルシクラーゼ-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アレルゲン、α1-アンチケモトリプシン（antichemotrypsin）、α1-アンチトリプシン、α-シヌクレイン、α-V/β-1 アンタゴニスト、アミニン（aminin）、アミリン、アミロイドβ、アミロイド免疫グロブリン重鎖可変領域、アミロイド免疫グロブリン軽鎖可変領域、アンドロゲン、ANG、アンジオテンシノーゲン、アンジオポエチンリガンド-2、抗Id、アンチトロンビンIII、炭疽、APAF-1、APE、APJ、アポA1、アポ血清アミロイドA、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン（Artemin）、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドA、心房性ナトリウム利尿ペプチドB、心房性ナトリウム利尿ペプチドC、av/b3インテグリン、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽菌（Bacillus anthracis）防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-ミクログロブリン、βラクタマーゼ、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、Bリンパ球刺激因子（BlyS）、BMP、BMP-2（BMP-2a）、BMP-3（オステオゲニン）、BMP-4（BMP-2b）、BMP-5、BMP-6（Vgr-1）、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BMPR-II（BRK-3）、BMPs、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ウシ成長ホルモン、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、Bリンパ球細胞接着分子、C10、C1インヒビター、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a（補体5a）、CA125、CAD-8、カドヘリン-3、カルシトニン、cAMP、炭酸脱水酵素-IX、癌胎児性抗原（CEA）、癌関連抗原、カルジオトロフィン-1、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/エオタキシン、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/エオタキシン-2、CCL25/TECK、CCL26/エオタキシン-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受容体、CINC、CKb8-1、クローディン18、CLC、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）毒素、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補体因子3（C3）、補体因子D、コルチコステロイド結合グロブリン、コロニー刺激因子-1受容体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/ラングカイン（Lungkine）、CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β、CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、シスタチンC、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、崩壊促進因子、Delta様タンパク質リガンド4、des(1-3)-IGF-1（脳IGF-1）、Dhh、DHICAオキシダーゼ、Dickkopf-1、ジゴキシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、DKl、DNAM-1、Dnアーゼ、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EGF様ドメイン含有タンパク質7、エラスターゼ、エラスチン、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、エンドシアリン、エンドセリン受容体、エンドトキシン、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシニ（eotaxini）、EpCAM、エフリンB2/EphB4、Epha2チロシンキナーゼ受容体、上皮成長因子受容体（EGFR）、ErbB2受容体、ErbB3チロシンキナーゼ受容体、ERCC、EREG、エリスロポエチン（EPO）、エリスロポエチン受容体、E-セレクチン、ET-1、Exodus-2、RSVのFタンパク質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受容体、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-塩基性、フィブリン、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子-10、フィブロネクチン、FL、FLIP、Flt-3、FLT3リガンド、葉酸受容体、卵胞刺激ホルモン（FSH）、フラクタルカイン（CX3C）、フリーの重鎖、フリーの軽鎖、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受容体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15（MIC-1）、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14/CDMP-1）、GDF-6（BMP-13/CDMP-2）、GDF-7（BMP-12/CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDNF、ゲルソリン、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gHエンベロープ糖タンパク質、GITR、グルカゴン、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド1受容体、Glut 4、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、糖タンパク質ホルモン受容体、糖タンパク質IIb/IIIa（GP IIb/IIIa）、グリピカン-3、GM-CSF、GM-CSF受容体、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF（G-CSF）、GRO/MGSA、成長ホルモン放出因子、GRO-β、GRO-γ、H. ピロリ（H. pylori）、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、ヘパリン補因子II、肝増殖因子（hepatic growth factor）、炭疽菌防御抗原、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、E型肝炎、ヘプシジン、Her1、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV）gB糖タンパク質、HGF、HGFA、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、HIVエンベロープタンパク質、例えばGP120、HIV MIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖タンパク質、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（hGH）、ヒト血清アルブミン、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）、ハンチンチン、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受容体、IL-11、IL-11受容体、IL-12、IL-12受容体、IL-13、IL-13受容体、IL-15、IL-15受容体、IL-16、IL-16受容体、IL-17、IL-17受容体、IL-18（IGIF）、IL-18受容体、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-2、IL-2受容体、IL-20、IL-20受容体、IL-21、IL-21受容体、IL-23、IL-23受容体、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体、IL-31、IL-31受容体、IL-3受容体、IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-5受容体、IL-6、IL-6受容体、IL-7、IL-7受容体、IL-8、IL-8受容体、IL-9、IL-9受容体、免疫グロブリン免疫複合体、免疫グロブリン、INF-α、INF-α受容体、INF-β、INF-β受容体、INF-γ、INF-γ受容体、I型IFN、I型IFN受容体、インフルエンザ、インヒビン、インヒビンα、インヒビンβ、iNOS、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2、インスリン様成長因子結合タンパク質、インテグリン、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα4/β1、インテグリンα-V/β-3、インテグリンα-V/β-6、インテグリンα4/β7、インテグリンα5/β1、インテグリンα5/β3、インテグリンα5/β6、インテグリンασ（αV）、インテグリンαθ、インテグリンβ1、インテグリンβ2、インテグリンβ3（GPIIb-IIIa）、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン（kalliklein）、カリクレイン（Kallikrein）11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、カリスタチン、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ケラチノサイト増殖因子2（KGF-2）、KGF、キラー免疫グロブリン様受容体、kitリガンド（KL）、Kitチロシンキナーゼ、ラミニン5、LAMP、LAPP（アミリン、膵島アミロイドポリペプチド）、LAP（TGF-1）、潜伏関連ペプチド、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受容体、LECT2、Lefty、レプチン、黄体形成（leutinizing）ホルモン（LH）、ルイス-Y抗原、ルイス-Y 関連抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受容体、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物質、黄体形成（Luteinizing）ホルモン、リンホタクチン、リンホトキシンβ受容体、リゾスフィンゴ脂質受容体、Mac-1、マクロファージ-CSF（M-CSF）、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、マスピン、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I（MCAF）、M-CSF、MDC、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、メグシン（megsin）、Mer、METチロシンキナーゼ受容体ファミリー、メタロプロテアーゼ（METALLOPROTEASES）、膜糖タンパク質OX2、メソテリン、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、微生物タンパク質、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、単球誘引タンパク質、単球コロニー抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、ムチン（Mud）、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、ミエリン関連糖タンパク質、骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-I）、NAIP、ナノボディ、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-カドヘリン、NCAM、ネプリライシン、神経細胞接着分子、ニューロセルピン、神経成長因子（NGF）、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-6、ニューロピリン1、ニュールツリン、NGF-β、NGFR、NKG20、N-メチオニルヒト成長ホルモン、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受容体、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質3型（NS3）、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受容体、骨誘導因子、オステオポンチン、OX40L、OX40R、酸化LDL、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤成長因子、胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）、胎盤性ラクトゲン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1、血小板増殖因子、plgR、PLP、様々なサイズのポリグリコール鎖（例えば、PEG-20、PEG-30、PEG40）、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシトニン
、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシン、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）F、Ret、レチキュロン（reticulon）4、リウマチ因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、スクレロスチン、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン1-リン酸受容体1、ブドウ球菌リポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子（SCF）、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン-1、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質-72）、TARC、TB、TCA-3、T-細胞受容体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、Pan特異的TGF-β、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-βRl（ALK-5）、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、トロンビン、トロンボポエチン（TPO）、胸腺間質性リンホプロテイン（Thymic stromal lymphoprotein）受容体、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2/DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2/TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R/TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF/TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF12A、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ/TRADE）、TNFRSF19L（RELT)、TNFRSF1A（TNF Rl CD120a/p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b/p75-80）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRSF25（DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII/TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35/TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6 （Fas Apo-1/APT1/CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68/TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8 （CD30）、TNFRSF9（4-1 BB CD137/ILA）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFSF10 （TRAIL Apo-2リガンド/TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンドODF/OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド/DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド/LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンドAITRリガンド/TL6）、TNFSF1A（TNF-aコネクチン（Conectin）/DIF/TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa/TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC/p33）、TNFSF4（OX40リガンドgp34/TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンドCD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP）、TNFSF6（FasリガンドApo-1リガンド/APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンドCD70）、TNFSF8（CD30リガンドCD153）、TNFSF9（4-1 BBリガンドCD137リガンド）、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝産物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、トランスフォーミング成長因子（TGF）、例えばTGF-αおよびTGF-β、膜貫通糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP-2、栄養膜糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子（TNF）、腫瘍関連抗原CA 125、ルイスY関連糖質を発現する腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VAP-1、血管内皮増殖因子（VEGF）、バスピン（vaspin）、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1（flt-1）、VEFGR-2、VEGF受容体（VEGFR）、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VitB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ウィルブランド因子（vWF）、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/リンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、ならびにXPDが含まれる。
T細胞上で特異的に発現している分子の具体例には、CD3およびT細胞受容体が含まれる。特に、CD3が好ましい。例えば、ヒトCD3の場合には、本発明の抗原分子が結合するCD3中の部位は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の配列中に存在する任意のエピトープであってもよい。特に、ヒトCD3複合体におけるε鎖の細胞外領域中に存在するエピトープが好ましい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、およびε鎖の構造のポリヌクレオチド配列は、配列番号：１７０（NM_000073.2)、１７２（NM_000732.4）、および１７４（NM_000733.3）に示され、そのポリペプチド配列は、配列番号：１７１（NP_000064.1)、１７３（NP_000723.1）、および１７５（NP_000724.1）に示される（RefSeq登録番号を括弧内に示す）。
本発明の抗原結合分子に含まれる抗体の2つの可変領域のうちの1つは、上述の「CD3」および「CD137」とは異なる「第３の抗原」に結合する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する細胞または臓器上に特異的に発現している分子である。第３の抗原は、好ましくは、細胞または臓器上に全身的には発現していない分子である。第３の抗原は、好ましくは、例えば、腫瘍細胞特異的抗原であり、また、細胞の悪性化に伴って発現する抗原、および細胞の悪性形質転換中に細胞表面またはタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も含む。その具体例には、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓がん抗原、卵巣がん抗原（CA125）、前立腺酸リン酸（prostatic acid phosphate）、前立腺特異的抗原（PSA）、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラノーマ抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原CD20、CD33、メラノーマ特異的抗原（例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、およびガングリオシドGM3）、腫瘍特異的移植抗原（TSTA）、T抗原、ウイルスにより誘導される腫瘍抗原（例えば、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、結腸CEA、腫瘍胎児性抗原α-フェトプロテイン（例えば、腫瘍胎児性栄養膜糖タンパク質5T4および腫瘍胎児性膀胱腫瘍抗原）、分化抗原（例えば、ヒト肺がん抗原L6およびL20）、線維肉腫抗原、ヒトT細胞白血病関連抗原Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えば、EGFR（上皮成長因子受容体））、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1、胎児赤血球において見出されるI抗原などの分化抗原、成人赤血球において見出される初期内胚葉I抗原、移植前の胚または胃がんにおいて見出されるI（Ma）、乳腺上皮において見出されるM18、M39、骨髄細胞において見出されるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸がんにおいて見出されるD156-22、TRA-1-85（血液型H）、精巣および卵巣がんにおいて見出されるSCP-1、結腸がんにおいて見出されるC14、肺がんにおいて見出されるF3、胃がんにおいて見出されるAH6、Yハプテン、胚性がん細胞において見出されるLey、TL5（血液型A）、A431細胞において見出されるEGF受容体、膵臓がんにおいて見出されるE1シリーズ（血液型B）、胚性がん細胞において見出されるFC10.2、胃がん抗原、腺癌において見出されるCO-514（血液型Lea）、腺癌において見出されるNS-10、CO-43（血液型Leb）、A431細胞のEGF受容体において見出されるG49、結腸がんにおいて見出されるMH2（血液型ALeb/Ley）、結腸がんにおいて見出される19.9、胃がんムチン、骨髄細胞において見出されるT5A7、メラノーマにおいて見出されるR24、胚性がん細胞において見出される4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、4細胞期〜8細胞期の胚において見出されるSSEA-3およびSSEA-4、皮膚T細胞リンパ腫関連抗原、MART-1抗原、シアリルTn（STn）抗原、結腸がん抗原NY-CO-45、肺がん抗原NY-LU-12バリアントA、腺癌抗原ART1、腫瘍随伴関連脳-精巣がん抗原（腫瘍神経抗原MA2および腫瘍随伴性神経抗原）、神経腫瘍学的腹部抗原2（NOVA2）、血液細胞がん抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-C1（がん／精巣抗原CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b、MAGE-X2、がん-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40、ならびにこれらのポリペプチドの任意の断片、ならびにその修飾された構造（前述の修飾されたリン酸基、糖鎖など）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シアリルSSEA-1（SLX）、HER2、PSMA、CEA、ならびにCLEC12Aが含まれる。
4-1BBとも呼ばれる、本明細書における「CD137」という用語は、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。TNFスーパーファミリーまたはTNF受容体スーパーファミリーに属する因子の例には、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLが含まれる。
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）可変領域は、配列番号：９１のアミノ酸配列を含むCD3εの細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子は、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカインの放出を誘導しない。
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）可変領域は、配列番号：９１のアミノ酸配列を含むCD3εの細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子は、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカインの放出を誘導しない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（２）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）抗原結合分子は、CD137に対する結合についてCD137リガンドと競合しない、および
（２）抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性は誘導しない。
1つの局面において、本発明の「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」とは、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子を指し、ここで0％の活性化とは、CD137を発現する非活性化細胞のバックグラウンドレベル（例えば、IL6分泌など）である。様々な具体例において、本発明の医薬組成物としての使用のためのCD137アゴニスト抗体は、細胞の活性を少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。
1つの局面において、本発明の「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」とはまた、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子を指し、ここで100％の活性化とは、生理学的条件下で等モル量の結合パートナーによって達成される活性化のレベルである。様々な具体例において、本発明の医薬組成物としての使用のためのCD137アゴニスト抗体は、細胞の活性を少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。いくつかの態様において、本明細書において用いられる「結合パートナー」とは、CD137に結合することが知られており、かつCD137を発現する細胞の活性化を誘導する分子である。さらなる態様において、結合パートナーの例には、WO2005/035584A1に記載されているウレルマブ（Urelumab）（CAS登録番号934823-49-1）およびそのバリアント、WO2012/032433A1に記載されているウトミルマブ（Utomilumab）（CAS登録番号1417318-27-4）およびそのバリアント、ならびに様々な公知のCD137アゴニスト抗体が含まれる。ある特定の態様において、結合パートナーの例には、CD137リガンドが含まれる。さらなる態様において、抗CD137アゴニスト抗体によるCD137を発現する細胞の活性化は、IL6分泌を特徴決定するELISAを用いて判定され得る（例えば、本明細書における実施例１０−２参照）。結合パートナーとして用いられる抗CD137抗体および測定のための抗体濃度は、実施例１０−２を参照とすることができ、ここで100％の活性化とは、抗体によって達成される活性化のレベルである。さらなる態様において、配列番号：６９の重鎖アミノ酸配列および配列番号：７１の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を、結合パートナーとして、測定のために30 ug/mLで用いることができる（例えば、本明細書における実施例１０−２参照）。
非限定的な態様として、本発明は、Fc領域を含む「CD137アゴニスト抗体」を提供し、該Fc領域は、抑制性Fcγ受容体に対する結合活性が増強している。
非限定的な態様として、CD137アゴニスト活性は、その表面上にCD137を発現することが公知である、B細胞を用いて確認することができる。非限定的な態様として、HDLM-2 B細胞株を、B細胞として用いることができる。CD137の活性化の結果として、IL-6の発現が誘導されるため、CD137アゴニスト活性は、産生されるヒトインターロイキン-6（IL-6）の量によって評価することができる。この評価において、IL-6の量を用いることにより0％バックグラウンドレベルとしての非活性化B細胞からのIL-6発現の増加量を評価することによって、評価される分子が、何％のCD137アゴニスト活性を有するかを判定することが可能である。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化は誘導しない。抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下でT細胞と第３の抗原を発現する細胞とを共培養すること、および、T細胞のCD3活性化をアッセイすることによって判定することができる。T細胞活性化は、例えば、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する組換えT細胞を用いること、および、T細胞の活性化の指標として、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性を検出することによって、アッセイすることができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下で第３の抗原を発現する細胞と共培養した時に、抗原結合分子の用量に依存した様式でのレポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性の検出は、抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導することを示す。同様に、抗原結合分子が、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導しないかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下でT細胞とCD137を発現する細胞とを共培養すること、および、上記のようにT細胞のCD3活性化をアッセイすることによって判定することができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性がないか、または検出限界よりも下であるか、または陰性対照のものよりも下であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定される。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、第３の抗原の分子を発現する細胞に対する同じ抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でサイトカインの放出を誘導しないかどうかは、例えば、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCと抗原結合分子とをインキュベートすること、ならびに、当技術分野において公知の方法を用いて、PBMCから培養上清中に放出されたIL-2、IFNγ、およびTNFαなどのサイトカインを測定することによって判定することができる。第３の抗原を発現する細胞の非存在下で抗原結合分子とインキュベートしたPBMCの培養上清において、有意なレベルのサイトカインが検出されないか、または有意なサイトカイン発現の誘導が起こらないならば、抗原結合分子は、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCからのサイトカイン放出を誘導しないと判定される。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、第３の抗原の分子を発現する細胞の存在下で達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なサイトカイン発現の誘導が起こらない」とはまた、サイトカイン濃度増加のレベルが、抗原結合分子を添加する前の各サイトカインの濃度の最大でも5倍、2倍、または1倍であることを指す。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD137に対する結合について、以下からなる群より選択される抗体と競合する：
（a）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（b）配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５３のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（c）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５６のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
（d）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５８のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、ならびに
（e）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する：
［１］配列番号：９８のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：９９のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［２］配列番号：１００のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：１０１のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［３］配列番号：１０２のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：１０３のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［４］配列番号：１０４のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：１０５のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［５］配列番号：１０６のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：１０７のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［６］配列番号：１０８のアミノ酸配列を重鎖可変領域として、および配列番号：１０９のアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む、抗体；
［７］配列番号：１１０のアミノ酸配列を重鎖定常領域として、および配列番号１１１のアミノ酸配列または配列番号：１１２のアミノ酸配列を軽鎖定常領域として含む、［１］〜［６］のいずれか1つの抗体；ならびに
［８］［１］〜［７］のいずれか1つの抗体の活性と同等の活性を有する抗体；ならびに
［９］［１］〜［７］のいずれか1つの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
［８］の抗体において、「同等の活性」とは、［１］〜［７］のいずれか1つの抗体の結合活性の70％以上、好ましくは80％以上、およびより好ましくは90％以上である、CD137アゴニスト活性を指す。
試験抗体が、ある特定の抗体と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2つの抗体間の競合に基づいて評価することができる。抗体間の競合は、クロスブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）などによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするために用いるCD137タンパク質を、候補競合抗体の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、本発明の抗CD137抗体をそれに添加する。ウェル中のCD137タンパク質に結合した本発明の抗CD137抗体の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗体（試験抗体）の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する試験抗体の親和性が高ければ高いほど、CD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した本発明の抗CD137抗体の量は少なく、かつCD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した試験抗体の量は多い。
ウェルに結合した抗体の量は、抗体を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗体は、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。抗体は、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
さらに、試験抗体が、本発明の抗CD137抗体の種とは異なる種に由来する定常領域を有する場合、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識された抗体の使用によって測定することができる。あるいは、抗体が、同じ種に由来するが異なるクラスに属するならば、ウェルに結合した抗体の量を、個々のクラスを区別する抗体を用いて測定することができる。
候補抗体が、候補競合抗体の非存在下で行われる対照実験において得られる結合活性と比較して少なくとも20％、好ましくは少なくとも20％〜50％、およびさらにより好ましくは少なくとも50％、抗CD137抗体の結合をブロックすることができるならば、候補競合抗体は、本発明の抗CD137抗体と実質的に同じエピトープに結合する抗体、または同じエピトープへの結合について競合する抗体のいずれかである。
別の態様において、試験抗体が別の抗体と競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
エピトープの空間的立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる（Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, G. E. Morris (ed.), Vol. 66 (1996)参照）。
試験抗体が、CD137リガンドと共通のエピトープを共有するかどうかもまた、同じエピトープに対する試験抗体とCD137リガンドとの間の競合に基づいて評価することができる。抗体とCD137リガンドとの間の競合は、上述のクロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。別の態様において、試験抗体がCD137リガンドと競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の好都合な例には、以下からなる群より選択される抗体が結合するヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
ヒトCD137タンパク質における
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：８１）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：７６）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：７９）を含む領域を認識する抗体、および
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：７４）を含む領域を認識する抗体。
標的とされるがん抗原に応じて、当業者は、がん特異的抗原結合ドメインに含まれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域について、がん抗原に結合する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を適宜選択することができる。抗原結合ドメインが結合するエピトープが、複数の異なる抗原に含有されている場合、該抗原結合ドメインを含有する抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
「エピトープ」とは、抗原における抗原決定基を意味し、本明細書において開示される抗原結合分子中の様々な結合ドメインが結合する抗原部位を指す。したがって、例えば、エピトープを、その構造に従って定義することができる。あるいは、エピトープを、該エピトープを認識する抗原結合分子の抗原結合活性に従って定義してもよい。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合、エピトープを、該エピトープを形成するアミノ酸残基によって特定化することができる。あるいは、エピトープが糖鎖である場合、エピトープは、その特異的な糖鎖構造によって特定化することができる。
直鎖状エピトープとは、その一次アミノ酸配列が認識されるエピトープを含有するエピトープである。そのような直鎖状エピトープは、典型的には、その特異的配列中に少なくとも3個、および最も一般的には少なくとも5個、例えば、約8〜10個または6〜20個のアミノ酸を含有する。
直鎖状エピトープとは対照的に、「立体構造エピトープ」とは、エピトープを含有する一次アミノ酸配列が、認識されるエピトープの唯一の決定基ではないエピトープである（例えば、立体構造エピトープの一次アミノ酸配列は、エピトープを規定する抗体によって必ずしも認識されない）。立体構造エピトープは、直鎖状エピトープと比較してより多くの数のアミノ酸を含有し得る。立体構造エピトープを認識する抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子がフォールディングして三次元構造を形成する時に、立体構造エピトープを形成するアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖が整列し、エピトープが抗体によって認識可能になる。エピトープの立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴分光法、部位特異的スピン標識、および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、それらに限定されない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.)参照。
試験抗原結合分子によるがん特異的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法の例を、以下に示す。以下の実施例に従って、別の結合ドメインによる標的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法もまた、適宜実施することができる。
例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、抗原分子中の直鎖状エピトープを認識するかどうかは、例えば、以下に述べるように確認することができる。例えば、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドを、上記の目的で合成する。ペプチドは、化学合成することができ、または、細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードするがん特異的抗原のcDNA中の領域を用いて、遺伝子操作技術によって取得することができる。次いで、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子を、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドに対するその結合活性について評価する。例えば、固定化された直鎖状ペプチドを抗原として用いて、ELISAにより、ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性を評価することができる。あるいは、直鎖状ペプチドに対する結合活性を、該直鎖状ペプチドががん特異的抗原発現細胞に対する抗原結合分子の結合を阻害するレベルに基づいて、評価することができる。直鎖状ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性は、これらの試験によって実証することができる。
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原分子が、立体構造エピトープを認識するかどうかは、以下のように確認することができる。例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、接触時にがん特異的抗原発現細胞に強く結合するが、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む固定化された直鎖状ペプチドには実質的に結合しない。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、抗原として抗原発現細胞を用いたELISAまたは蛍光活性化細胞選別（FACS）の抗原発現細胞に対する結合活性と比較して、結合活性が80％以下、概して50％以下、好ましくは30％以下、および特に好ましくは15％以下であることを意味する。
ELISA形式において、抗原発現細胞に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性を、酵素反応によって生じたシグナルのレベルを比較することによって、定量的に評価することができる。具体的には、抗原発現細胞が固定化されたELISAプレートに、試験抗原結合分子を添加する。次いで、細胞に結合した試験抗原結合分子を、試験抗原結合分子を認識する酵素標識された抗体を用いて検出する。あるいは、FACSを用いる場合は、試験抗原結合分子の希釈系列を調製し、抗原発現細胞に対する抗原結合力価を決定して、抗原発現細胞に対する試験抗原結合分子の結合活性を比較することができる。
緩衝液などに懸濁した細胞の表面上に発現している抗原に対する試験抗原結合分子の結合は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。公知のフローサイトメーターには、例えば、以下のデバイスが含まれる：
FACSCanto（商標）II
FACSAria（商標）
FACSArray（商標）
FACSVantage（商標） SE
FACSCalibur（商標）（すべてBD Biosciencesの商品名である）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC（すべてBeckman Coulterの商品名である）。
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性をアッセイするための適している方法には、例えば、以下の方法が含まれる。最初に、抗原発現細胞を、試験抗原結合分子と反応させ、次いで、これを、FITC標識された二次抗体で染色し、FACSCalibur（BD）を用いる。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって得られた蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した抗体の量を反映する。すなわち、結合した試験抗原結合分子の量によって表される試験抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、別の抗原結合分子と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2つの分子間の競合に基づいて評価することができる。抗原結合分子間の競合は、クロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。
具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングしている抗原を、候補競合抗原結合分子の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、試験抗原結合分子をそれに添加する。ウェル中の抗原に結合した試験抗原結合分子の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗原結合分子の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する競合抗原結合分子の親和性が高ければ高いほど、抗原でコーティングされたウェルに対する試験抗原結合分子の結合活性は低い。
抗原を介してウェルに結合した試験抗原結合分子の量は、抗原結合分子を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗原結合分子は、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。抗原結合分子はまた、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することもできる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
候補競合抗原結合分子が、競合抗原結合分子の非存在下で実施される対照実験における結合活性と比較して少なくとも20％、好ましくは少なくとも20〜50％、およびより好ましくは少なくとも50％、抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合をブロックすることができる場合、試験抗原結合分子は、競合抗原結合分子が結合する同じエピトープに実質的に結合するか、または同じエピトープへの結合について競合すると判定される。
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が結合するエピトープの構造が、既に同定されている場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、エピトープを形成するペプチド中へのアミノ酸変異の導入によって調製されるペプチドに対する2つの抗原結合分子の結合活性を比較することによって、評価することができる。
そのような結合活性を測定するための方法として、例えば、変異が導入されている直鎖状ペプチドに対する試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性は、上記のELISA形式での比較によって測定される。ELISA法の他にも、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子をカラムに通過させること、および次いで、溶出液中の溶出された抗原結合分子を定量することによって、カラムに結合した変異体ペプチドに対する結合活性を決定することができる。例えば、GST融合ペプチドの形態で、変異体ペプチドをカラムに吸着させるための方法が、公知である。
あるいは、同定されたエピトープが立体構造エピトープである場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、以下の方法によって評価することができる。最初に、抗原結合ドメインが標的とする抗原を発現する細胞、および変異が導入されたエピトープを有する抗原を発現する細胞を調製する。これらの細胞をPBSなどの適切な緩衝液に懸濁することによって調製される細胞懸濁液に、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を添加する。次いで、細胞懸濁液を緩衝液で適宜洗浄し、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を認識することができるFITC標識された抗体をそれに添加する。標識された抗体で染色された細胞の蛍光強度および数を、FACSCalibur（BD）を用いて決定する。試験抗原結合分子および対照抗原結合分子は、適している緩衝液を用いて適宜希釈し、所望の濃度で用いる。例えば、それらを、10μg/ml〜10 ng/mlの範囲内の濃度で用いてもよい。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって決定された蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した標識された抗体の量を反映する。すなわち、結合した標識された抗体の量によって表される試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、配列番号：９２に記載される重鎖可変ドメイン配列および／または配列番号：９３に記載される軽鎖可変ドメイン配列からなる鋳型配列中に1個または複数個のアミノ酸の改変を導入することによって生じたアミノ酸配列を含み、改変される1個または複数個のアミノ酸は、以下の位置：
H鎖：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、および100g（Kabatナンバリング）；ならびに
L鎖：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、および96（Kabatナンバリング）
から選択され、
改変された重鎖可変ドメイン配列のHVR-H3は、
アミノ酸98位のAla、Pro、Ser、Arg、His、またはThr；
アミノ酸99位のAla、Ser、Thr、Gln、His、またはLeu；
アミノ酸100位のTyr、Ala、Ser、Pro、またはPhe；
アミノ酸100a位のTyr、Val、Ser、Leu、またはGly；
アミノ酸100b位のAsp、Ser、Thr、Leu、Gly、またはTyr；
アミノ酸100c位のVal、Leu、Phe、Gly、His、またはAla；
アミノ酸100d位のLeu、Phe、Ile、またはTyr；
アミノ酸100e位のGly、Pro、Tyr、Gln、Ser、またはPhe；
アミノ酸100f位のTyr、Ala、Gly、Ser、またはLys；
アミノ酸100g位（Kabatナンバリング）のGly、Tyr、Phe、またはVal
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、（a）配列番号：４１、３０、４６、もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；（b）配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、５６、もしくは５７のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列を含む。
本発明の抗原結合分子は、当業者に一般に知られている方法によって作製することができる。例えば、抗体を、以下に示す方法によって調製することができるが、本発明の抗体を調製するための方法は、それに限定されない。ポリペプチドをコードする単離された遺伝子の適切な宿主中への移入による抗体調製のために、宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが、当技術分野において公知である。これらの発現系のすべてを、本発明の抗原結合分子の単離に適用することができる。宿主細胞として真核細胞を用いる場合には、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞を、適宜用いることができる。具体的には、動物細胞の例には、以下の細胞が含まれ得る：
（１）哺乳類細胞、例えばCHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、COS（サル腎臓細胞株）、骨髄腫細胞（Sp2/O、NS0など）、BHK（ベビーハムスター腎臓細胞株）、HEK293（剪断されたアデノウイルス(Ad)5 DNAを伴うヒト胎児腎臓細胞株）、PER.C6細胞（アデノウイルス5型(Ad5) E1AおよびE1B遺伝子で形質転換されたヒト胎児網膜細胞株）、Hela、およびVero（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）；
（２）両生類細胞、例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；ならびに
（３）昆虫細胞、例えばsf9、sf21、およびTn5。
抗体はまた、大腸菌（mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225）または酵母（WO2000023579）を用いて調製することもできる。大腸菌を用いて調製された抗体は、糖鎖が付加されていない。他方、酵母を用いて調製された抗体は、糖鎖が付加されている。
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードする、抗体重鎖をコードするDNA、および抗体の軽鎖をコードするDNAを発現させる。可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖または軽鎖をコードするDNAは、例えば、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメインをコードするDNAを取得すること、および、該ドメイン中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の異なるアミノ酸をコードするように、適宜置換を導入することによって、取得することができる。
あるいは、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換されたタンパク質をコードするDNAを、予め設計し、化学合成して、可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAを取得してもよい。アミノ酸置換部位および置換の種類は、特に限定されない。アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
アミノ酸改変は、置換に限定されず、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせであってもよい。
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAはまた、別々の部分DNAとして作製することができる。部分DNAの組み合わせの例には、可変ドメインをコードするDNAと定常ドメインをコードするDNA；およびFabドメインをコードするDNAとFcドメインをコードするDNAが含まれるが、それらに限定されない。同様に、軽鎖をコードするDNAもまた、別々の部分DNAとして作製することができる。
これらのDNAは、以下の方法によって発現させることができる：例えば、重鎖可変ドメインをコードするDNAを、重鎖定常ドメインをコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、重鎖発現ベクターを構築する。同様に、軽鎖可変ドメインをコードするDNAを、軽鎖定常ドメインをコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖および軽鎖の遺伝子を、単一のベクターに組み込んでもよい。
目的の抗体をコードするDNAは、発現制御領域、例えば、エンハンサーおよびプロモーターの制御下で発現するように、発現ベクターに組み込む。次に、結果として生じた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。この場合には、適切な宿主と発現ベクターを、組み合わせて用いることができる。
ベクターの例には、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、およびpCR-Scriptが含まれる。これらのベクターに加えて、例えば、pGEM-T、pDIRECT、またはpT7も、cDNAのサブクローニングおよび切り出しの目的で用いることができる。
特に、本発明の抗体を作製する目的でベクターを用いるためには、発現ベクターが有用である。例えば、宿主がJM109、DH5α、HB101、またはXL1-Blueなどの大腸菌である場合は、発現ベクターは、大腸菌における効率的な発現を可能にするプロモーター、例えば、lacZプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWard et al., Nature (1989) 341, 544-546；およびFASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBetter et al., Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターを有することが不可欠である。そのようなベクターの例には、上述のベクター、ならびにpGEX-5X-1（Pharmacia製）、「QIAexpress system」（Qiagen N.V.製）、pEGFP、およびpET（この場合、宿主は好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21である）が含まれる。
ベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列を含有してもよい。大腸菌のペリプラズムにおける産生の場合には、pelBシグナル配列（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4397）を、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列として用いることができる。ベクターは、例えば、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法、またはDEAE-デキストラン法の使用によって、宿主細胞に移入することができる。
大腸菌用の発現ベクターに加えて、本発明のポリペプチドを作製するためのベクターの例には、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen Corp.製）、pEGF-BOS (参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、およびpCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL製）、およびpBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1およびpMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、およびpAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen Corp.製）、pNV11、およびSP-Q01）、ならびに枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608およびpKTH50）が含まれる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、またはHEK293細胞などの動物細胞における発現を目的として、ベクターは、細胞内発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMulligan et al., Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CAGプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGene. (1991) 108, 193）、またはCMVプロモーターを有することが不可欠であり、より好ましくは、形質転換された細胞をスクリーニングするための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）によりマーカーとして働くことができる薬剤耐性遺伝子）を有する。このような性質を有するベクターの例には、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。加えて、遺伝子コピー数を増加させる目的で、EBNA1タンパク質を共発現させてもよい。この場合、複製起点OriPを有するベクターを用いる（Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203；およびBiotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7）。
遺伝子を安定的に発現させ、かつ細胞内の遺伝子コピー数を増加させるように意図される例示的な方法には、核酸合成経路が欠損したCHO細胞を、それを相補するものとして働くDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOI）で形質転換すること、および遺伝子増幅においてメトトレキセート（MTX）を用いることが含まれる。遺伝子を一過性に発現させるように意図される例示的な方法には、SV40 T抗原遺伝子をその染色体上に有するCOS細胞を用いて、SV40の複製起点を有するベクター（pcDなど）で細胞を形質転換することが含まれる。ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）などに由来する複製起点もまた、用いることができる。宿主細胞系において遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、またはジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子などの選択マーカーを含有することができる。
抗体は、例えば、形質転換された細胞を培養すること、次いで、分子形質転換された細胞内からまたはその培養液から抗体を分離することによって、回収することができる。抗体は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、C1q、FcRn、プロテインAおよびプロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いることによって、分離し、精製することができる。
ノブ-イントゥ-ホールテクノロジー（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）または電荷反発の導入によってH鎖間の意図されない会合を抑制する技術（WO2006/106905）などの上述の技術を、多重特異性抗体を効率的に調製するための方法に適用することができる。
本発明は、さらに、本発明の抗原結合分子を作製するための方法を提供し、具体的には、2つの異なる抗原（第１の抗原および第２の抗原）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域（この可変領域を第１の可変領域と言う）；ならびに、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域（この可変領域を第２の可変領域と言う）を含む抗原結合分子を作製するための方法であって、第１の可変領域の多様なアミノ酸配列を含有する抗原結合分子ライブラリーを調製する工程を含む、方法を提供する。
その例には、以下の工程を含む作製方法が含まれ得る：
（i）各々がCD3またはCD137に結合するその抗体可変領域において少なくとも1個のアミノ酸が改変された抗原結合分子のライブラリーを調製する工程であって、該改変された可変領域の少なくとも1個のアミノ酸が互いに異なる、工程；
（ii）調製されたライブラリーから、CD3およびCD137に対する結合活性を有するが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域を含む抗原結合分子を選択する工程；
（iii）工程（ii）において選択された抗原結合分子の可変領域をコードする核酸、および第３の抗原に結合する抗原結合分子の可変領域をコードする核酸を含む宿主細胞を培養して、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、第３の抗原に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子を発現させる工程；ならびに
（iv）宿主細胞培養物から抗原結合分子を回収する工程。
この作製方法において、工程（ii）は、以下の選択工程であってもよい：
（v）調製されたライブラリーから、CD3およびCD137に対する結合活性を有するが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない可変領域を含む抗原結合分子を選択する工程。
工程（i）において用いられる抗原結合分子は、これらの分子が抗体の可変領域を各々含む限り、特に限定されない。抗原結合分子は、Fv、Fab、もしくはFab'などの抗体断片であってもよく、またはFc領域を含有する抗体であってもよい。
改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
本発明において、1つのアミノ酸改変が、単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が、組み合わせて用いられてもよい。
複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わせる改変の数は、特に限定されず、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
組み合わせる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。
アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
アミノ酸残基の改変にはまた、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域中の上述の領域におけるアミノ酸のランダム改変；および、CD3またはCD137に対する結合活性を有することが以前に知られているペプチドの上述の領域への挿入も含まれる。本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるがこれらの抗原に同時には結合することができない可変領域を、このように改変された抗原結合分子の中から選択することによって、取得することができる。
可変領域が、CD3およびCD137に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができないかどうか、およびさらに、可変領域が、CD3およびCD137のいずれか一方が細胞上に存在し、他方の抗原が単独で存在するか、抗原の両方が各々単独で存在するか、または抗原の両方が同じ細胞上に存在する場合には、CD3およびCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているこれらの抗原に同時には結合することができないかどうかもまた、上述の方法に従って確認することができる。
本発明者らはまた、2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に取得する方法を開発することにも成功した。
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
上記の方法において、抗原結合ドメインを抗原と接触させる工程の数は、特に限定されない。いくつかの態様において、本発明のスクリーニングの方法は、目的の抗原の数が2つ以上である場合、3つ以上の接触させる工程を含んでもよい。さらなる態様において、本発明のスクリーニングの方法は、抗原結合ドメインを目的の抗原の1つまたは複数の各々と接触させる、2つ以上の工程を含んでもよい。この場合、抗原結合ドメインを、任意の順序で各抗原と接触させることができる。例えば、抗原結合ドメインを、各抗原と連続的に2回以上接触させてもよく、または、最初に1つの抗原と1回以上接触させ、次いで、同じ抗原と再び接触させる前に他の抗原と接触させてもよい。本発明のスクリーニングの方法が、抗原結合ドメインを抗原と接触させる、3つ以上の工程を含む場合でも、該方法は、任意の連続的な2つの接触させる工程の間に、収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、Fab、scFv、Fab'2、VHH、VH、またはVLである。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインをスキャフォールドと融合させて、抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋することによって形成される、融合ポリペプチドである。
いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、バクテリオファージである。いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、リボソーム、RepAタンパク質、またはDNAピューロマイシンリンカーである。
いくつかの態様において、溶出は、上記の工程（b）および（c）において、酸溶液、塩基溶液、DTT、またはIdeSである溶出溶液を用いて行われる。
いくつかの態様において、本発明の上記の工程（b）および（c）において用いられる溶出溶液は、EDTAまたはIdeSである。
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（b）’工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を翻訳する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインを作製するための方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
（e）工程（d）において選択された候補抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、Fc領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結する工程、
（f）上記の工程（d）において取得されたポリヌクレオチドが機能的に連結されているベクターが導入された細胞を培養する工程、ならびに
（g）上記の工程（f）において培養された細胞の培養液から、抗原結合分子を収集する工程
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、上記の方法によって調製される抗体である。
1つの局面において、本発明のスクリーニングの方法によって、目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に獲得することが可能になる。
本明細書において、「ライブラリー」とは、複数の抗原結合分子、もしくは抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプチド、またはこれらの配列をコードする核酸もしくはポリヌクレオチドを指す。ライブラリー中に含まれる、複数の抗原結合分子、または抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプチドは、配列が互いに異なり、単一の配列を有さない抗原結合分子、または抗原結合分子を含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、本発明のライブラリーは、デザインライブラリーである。さらなる態様において、デザインライブラリーは、WO2016/076345において開示されるデザインライブラリーである。
本発明の1つの態様において、本発明の抗原結合分子と異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを調製することができる。1つの態様において、融合ポリペプチドは、例えば、ウイルスコートタンパク質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、およびpVI、ならびにそのバリアントからなる群より選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合した、本発明の抗原結合分子を含むことができる。
1つの態様において、本発明の抗原結合分子は、ScFv、Fab断片、F(ab)2、またはF(ab')2であることができる。別の態様において、本発明は、これらの抗原結合分子のいずれかおよび異種ポリペプチドを各々含む、配列が互いに異なる複数の融合ポリペプチドから本質的になるライブラリーを提供する。具体的には、本発明は、例えば、ウイルスコートタンパク質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、およびpVI、ならびにそのバリアントからなる群より選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合した、これらの抗原結合分子のいずれかを各々含む、配列が互いに異なる複数の融合ポリペプチドから本質的になるライブラリーを提供する。本発明の抗原結合分子は、二量体化ドメインをさらに含み得る。1つの態様において、二量体化ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領ドメインとウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との間に位置することができる。この二量体化ドメインには、少なくとも1つの二量体化配列、および／または1個または複数個のシステイン残基を含む配列が含まれ得る。この二量体化ドメインは、好ましくは、重鎖可変ドメインまたは定常ドメインのC末端に連結することができる。二量体化ドメインは、抗体可変ドメインがウイルスコートタンパク質成分との融合ポリペプチド成分として調製される（二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンが存在しない）かどうかに応じて、または、抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに調製される（例えば、二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンが存在する）かどうかに応じて、様々な構造をとることができる。抗体可変ドメインが、主にウイルスコートタンパク質成分との融合ポリペプチドとして調製される場合は、1つまたは複数のジスルフィド結合および／または単一の二量体化配列によって二価提示がもたらされる。
本明細書に記載されるような配列が互いに異なる複数の抗原結合分子における、「配列が互いに異なる」という用語は、ライブラリー中の個々の抗原結合分子が、別個の配列を有することを意味する。具体的には、ライブラリー中の別個の配列の数は、ライブラリー中の配列が異なる独立クローンの数を反映し、「ライブラリーサイズ」と言ってもよい。通常のファージディスプレイライブラリーのライブラリーサイズは、106〜1012であり、リボソームディスプレイ法などの当技術分野においての公知の技術の適用によって、1014まで拡大することができる。しかし、ファージライブラリーのパンニング選択において使用されるファージ粒子の実際の数は、通常、ライブラリーサイズよりも10〜10,000倍大きい。この過剰倍数は、「ライブラリー当量数」とも呼ばれ、10〜10,000の個々のクローンが、同じアミノ酸配列を有し得ることを表す。したがって、本発明において記載される「配列が互いに異なる」という用語は、ライブラリー当量数を除外したライブラリー中の個々の抗原結合分子が、別個の配列を有することを意味し、より具体的には、ライブラリーが、106〜1014、好ましくは107〜1012、より好ましくは108〜1011、特に好ましくは108〜1010の、配列が互いに異なる抗原結合分子を有することを意味する。
本明細書に記載されるような「ファージディスプレイ」とは、ファージ、例えば、繊維状ファージの粒子表面上に、バリアントポリペプチドをコートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として提示する手法を指す。ランダム化されたタンパク質バリアントの大きなライブラリーを、標的抗原に高親和性で結合する配列について迅速にかつ効率的にスクリーニングすることができるため、ファージディスプレイは有用である。ファージ上でのペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを、特異的結合特性を有するものについてスクリーニングするために用いられてきた。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために用いられている（Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. (1992) 3, 355-362；およびその中で引用されている参照文献）。一価ファージディスプレイは、各ファージ粒子が融合タンパク質の1個または0個のコピーを提示するように、タンパク質またはペプチドのライブラリーを遺伝子IIIまたはその一部に融合させること、および融合タンパク質を、野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で低レベルで発現させることを含む。一価ファージは、多価ファージよりも低いアビディティー効果を有し、そのため、ファージミドベクターを用いて内在性のリガンド親和性に基づいてスクリーニングされ、これは、DNA操作を単純化する（Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216）。
「ファージミド」とは、細菌の複製起点、例えばColE1、およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターを指す。当技術分野において公知の任意のバクテリオファージ、例えば、繊維状バクテリオファージまたはλ型（lambdoid）バクテリオファージに由来するファージミドを、適宜用いることができる。通常、プラスミドはまた、抗生物質耐性についての選択マーカーも含有する。これらのベクターにクローニングされたDNA断片は、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを保有する細胞が、ファージ粒子の産生に必要なすべての遺伝子を所有している時、プラスミドの複製パターンは、ローリングサークル複製にシフトして、1本のプラスミドDNA鎖のコピーおよびパッケージファージ粒子を形成する。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成することができる。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合によって異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子またはその断片を含む、ファージミドが含まれる。
「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含み、かつ複製することができる、二本鎖複製型バクテリオファージを意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、繊維状バクテリオファージ、例えば、M13、f1、fd、もしくはPf3ファージまたはその誘導体、またはλ型ファージ、例えば、λ、21、phi80、phi81、82、424、434、もしくは任意の他のファージまたはその誘導体である。
「コートタンパク質」という用語は、少なくともその一部がウイルス粒子の表面上に存在する、タンパク質を指す。機能上の観点からは、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルスの構築過程でウイルス粒子に結合し、他の宿主細胞のウイルス感染までそれと結合したままである、任意のタンパク質である。コートタンパク質は、より大きいコートタンパク質であってもよく、またはより小さいコートタンパク質であってもよい。より小さいコートタンパク質は、通常、好ましくは、1ビリオンあたり少なくともおよそ5個、より好ましくは少なくともおよそ7個、さらに好ましくは少なくともおよそ10個またはそれよりも多いタンパク質コピーで、ウイルスキャプシドに存在するコートタンパク質である。より大きいコートタンパク質は、1ビリオンあたり数十、数百、または数千のコピーで存在し得る。より大きいコートタンパク質の例には、繊維状ファージp8タンパク質が含まれる。
本明細書に記載されるような「リボソームディスプレイ」とは、それによってバリアントポリペプチドをリボソーム上に提示する手法を指す（Nat. Methods 2007 Mar;4(3):269-79、Nat. Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92、Methods Mol. Biol. 2004;248:177-89）。好ましくは、リボソームディスプレイ法は、バリアントポリペプチドをコードする核酸が、大腸菌secMのような適切なリボソーム失速配列を有する（J. Mol. Biol. 2007 Sep14;372(2):513-24）か、または終止コドンを有さないことを必要とする。好ましくは、バリアントポリペプチドをコードする核酸はまた、スペーサー配列も有する。本明細書において用いられる場合、「スペーサー配列」という用語は、バリアントポリペプチドに融合して、バリアントポリペプチドが翻訳後にリボソームトンネルを通過するようにさせる、かつバリアントポリペプチドがその機能を発現することを可能にするペプチドをコードする、一連の核酸を意味する。インビトロ翻訳システムのいずれか、例えば、大腸菌S30システム、PUREsystem、ウサギ網状赤血球ライセートシステム、または小麦胚芽無細胞翻訳システムを、リボソームディスプレイに用いることができる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、当技術分野において公知の方法（例えば、EP266032に記載されている手法などの固相手法を用いたホスホトリエステル、ホスファイト、もしくはホスホラミダイト化学；またはFroeshler et al., Nucl. Acids. Res. (1986) 14, 5399-5407に記載されているデオキシヌクレオチドH-ホスホナート中間体を介した方法）によって化学合成される、短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、下記のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. (1989) 28, 716-734に記載されている。遺伝子の全核酸配列が公知である場合、またはコード鎖に対して相補的な核酸配列が利用可能である場合は、これらの方法が用いられる。あるいは、標的アミノ酸配列が公知である場合は、各アミノ酸残基をコードする公知のかつ好ましい残基を用いて、可能な核酸配列が適宜推測され得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムを用いて、または沈殿法によって精製することができる。
「核酸の増幅」という用語は、核酸のモル数を増加させる実験手順を指す。非限定的な態様として、核酸には、一本鎖RNA（ssRNA）、二本鎖DNA（dsDNA）、または一本鎖DNA（ssDNA）が含まれる。非限定的な態様として、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法が、核酸を増幅する方法として一般的に用いられるが、核酸を増幅できる任意の方法を用いることができる。あるいは、核酸ベクターを宿主細胞中に導入すると、核酸を宿主細胞において増幅させることができる。非限定的な態様として、エレクトロポレーション、ヒートショック、ベクターを有するファージもしくはウイルスの感染、または化学試薬を、核酸を細胞中に導入するために用いることができる。あるいは、DNAの転写、またはmRNAの逆転写およびその後のその転写もまた、核酸を増幅することができる。非限定的な態様として、ファージミドベクターの大腸菌中への導入が、結合ドメインをコードする核酸を増幅するために一般的に用いられるが、PCRもまた、ファージディスプレイ技術において用いることができる。リボソームディスプレイ、cDNAディスプレイ、mRNAディスプレイ、およびCISディスプレイにおいては、PCR法または転写が、核酸を増幅するために一般的に用いられる。
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」という用語は、互いに連結された2つのセグメントを有するポリペプチドを指す。ポリペプチド中のこれらのセグメントは、特性が異なる。この特性は、例えば、インビトロまたはインビボの活性などの生物学的性質であり得る。あるいは、この特性は、単一の化学的または物理的性質、例えば、標的抗原に対する結合または反応の触媒作用であり得る。これらの2つのセグメントは、単一のペプチド結合を通して直接、または1個または複数個のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介してのいずれかで連結されてもよい。通常、これらの2つのセグメントおよびリンカーは、同じリーディングフレームに位置する。好ましくは、ポリペプチドの2つのセグメントは、異種のまたは異なるポリペプチドから得られる。
「抗原結合ドメインをスキャフォールドと融合させることによって形成される融合ポリペプチド」における「スキャフォールド」という用語は、抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋する分子を指す。非限定的な態様として、ファージディスプレイにおけるファージコートタンパク質、リボソームディスプレイにおけるリボソーム、mRNAまたはcDNAディスプレイにおけるピューロマイシン、CISディスプレイにおけるRepAタンパク質、ウイルスディスプレイにおけるウイルスコートタンパク質、哺乳動物細胞ディスプレイにおける哺乳動物細胞膜アンカータンパク質、酵母ディスプレイにおける酵母細胞膜アンカータンパク質、細菌ディスプレイまたは大腸菌ディスプレイにおける細菌細胞膜アンカータンパク質などを、各ディスプレイ方法論においてスキャフォールドとして用いることができる。
本発明において、「1個または複数個のアミノ酸」という用語は、特定の数のアミノ酸に限定されず、2種類以上のアミノ酸、5種類以上のアミノ酸、10種類以上のアミノ酸、15種類以上のアミノ酸、または20種類のアミノ酸であってもよい。
融合ポリペプチドの提示に関して、抗原結合分子の可変領域の融合ポリペプチドを、細胞、ウイルス、リボソーム、DNA、RNA、またはファージミド粒子の表面上に様々な形態で提示することができる。これらの形態には、一本鎖Fv断片（scFv）、F(ab)断片、およびこれらの断片の多価形態が含まれる。多価形態は、好ましくは、ScFv、Fab、およびF(ab')の二量体であり、これらを、本明細書においてそれぞれ、(ScFv)2、F(ab)2、およびF(ab')2と言う。多価形態の提示が好ましく、それは、恐らく1つには、提示される多価形態が、通常、低親和性クローンの同定を可能にし、かつ／または、選択の過程において稀なクローンのより効率的な選択を可能にする複数の抗原結合部位を有するためである。
抗体断片を含む融合ポリペプチドをバクテリオファージの表面上に提示するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、WO1992001047および本明細書に記載されている。他の関連した方法が、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、および1993019172に記載されている。当業者は、これらの方法を適宜用いることができる。他の公開文献（H.R.Hoogenboom & G.Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388、WO1993006213、およびWO1993011236）は、ファージの表面上に提示された様々な抗原に対する人工的に再配置された可変領域遺伝子レパートリーを用いた、抗体の同定を開示している。
scFvの形態での提示のためにベクターを構築する場合、このベクターは、抗原結合分子の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む。概して、抗原結合分子の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成分をコードする核酸配列と融合している。抗原結合分子の軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を通して抗原結合分子の重鎖可変ドメインの核酸に連結される。ペプチドリンカーは、概して、およそ5〜15個のアミノ酸を含有する。任意で、例えば、精製または検出に有用なタグをコードする追加的な配列が、抗原結合分子の軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列もしくは抗原結合分子の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列、またはその両方の3'末端と融合していてもよい。
F(ab)の形態での提示のためにベクターを構築する場合、このベクターは、抗原結合分子の可変ドメインおよび抗原結合分子の定常ドメインをコードする核酸配列を含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列と融合している。抗原結合分子の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常CH1ドメインをコードする核酸配列と融合している。概して、重鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列と融合している。重鎖可変ドメインおよび定常ドメインは、好ましくは、ウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合産物として発現させ、一方、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインは、重鎖-ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現させる。重鎖と軽鎖とは、共有結合または非共有結合を通して互いと会合していてもよい。任意で、例えば、精製または検出に有用なポリペプチドタグをコードする追加的な配列が、抗原結合分子の軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列もしくは抗原結合分子の重鎖定常ドメインをコードする核酸配列、またはその両方の3'末端と融合していてもよい。
宿主細胞へのベクター移入に関して、上記のように構築されたベクターを、増幅および／または発現のために宿主細胞に移入する。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、当技術分野において公知の形質転換法によって、宿主細胞に移入することができる。ベクターが、ウイルスなどの感染性粒子である場合、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのインサートを有する複製可能な発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクション、および当技術分野において公知の手法によるファージ粒子の産生によって、融合タンパク質がファージ粒子の表面上に提示される。
複製可能な発現ベクターは、様々な方法の使用によって、宿主細胞に移入することができる。非限定的な態様において、ベクターは、WO2000106717に記載されているようにエレクトロポレーションによって細胞に移入することができる。細胞を、37℃で、任意でおよそ6〜48時間（または600 nmでのODが0.6〜0.8に達するまで）、標準的な培養培地において培養する。次に、培養培地を遠心分離し、（例えば、デカンテーションによって）培養上清を除去する。精製の初期段階では、細胞ペレットを、好ましくは緩衝液（例えば、1.0 mM HEPES（pH 7.4））中に再懸濁する。次に、懸濁液を再び遠心分離して、上清を除去する。得られた細胞ペレットを、例えば、5〜20％ V/Vに希釈されたグリセリン中に再懸濁する。上清の除去のために、懸濁液を再び遠心分離して、細胞ペレットを得る。細胞ペレットを、水または希釈されたグリセリン中に再懸濁する。結果として生じた懸濁液の測定された細胞密度に基づいて、最終細胞密度を、水または希釈されたグリセリンを用いて所望の密度に調整する。
好ましいレシピエント細胞の例には、エレクトロポレーションに応答することができる大腸菌株SS320（Sidhu et al., Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363）が含まれる。大腸菌株SS320は、稔性エピソーム（F'プラスミド）またはXL1-BLUEをMC1061細胞中に移入するのに十分な条件下での、MC1061細胞とXL1-BLUE細胞とのカップリングによって調製された。大腸菌株SS320は、寄託番号98795で、ATCC（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia）に寄託されている。この株におけるファージ複製を可能にする任意のF'エピソームを、本発明において用いることができる。適切なエピソームは、ATCCに寄託されている株から取得してもよく、または市販の製品として取得してもよい（TG1、CJ236、CSH18、DHF'、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18など）。
エレクトロポレーションにおけるより高いDNA濃度（およそ10倍）の使用によって、形質転換頻度が改善し、宿主細胞を形質転換するDNAの量が増加する。高い細胞密度の使用もまた、効率を改善する（およそ10倍）。移入されるDNAの量の増加によって、より大きな多様性、およびより多くの数の配列が異なる独立クローンを有するライブラリーが生じ得る。形質転換された細胞は、通常、抗生物質を含有する培地上での増殖の有無に基づいて選択される。
本発明は、さらに、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、DNAまたはRNAなどの任意の形態であってもよい。
本発明は、さらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。ベクターの種類は、ベクターを受ける宿主細胞に従って、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述のベクターのいずれかを用いることができる。
本発明は、さらに、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述の宿主細胞のいずれかを用いることができる。
本発明はまた、本発明の抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の抗原結合分子に薬学的に許容し得る担体を添加することによって、当技術分野において公知の方法に従って製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、水または任意の他の薬学的に許容し得る溶液を伴う無菌性溶液または懸濁液の非経口注射の形態で用いることができる。例えば、医薬組成物は、抗原結合分子を、薬理学的に許容し得る担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などとの適切な組み合わせで、一般に認められた製薬実施に要求される単位剤形で混合して、製剤化され得る。担体の具体例には、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセタート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、サッカライド、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、および無機塩が含まれ得る。そのような調製物における活性成分の量は、指示された範囲内の適切な用量が達成され得るように決定される。
注射用の無菌組成物は、注射用蒸留水などのビヒクルを用いて、従来の製薬実施に従って製剤化することができる。注射用の水溶液の例には、生理食塩水、グルコースならびに他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウム）を含有する等張液が含まれる。これらの溶液は、適切な溶解補助剤、例えば、アルコール（具体的には、エタノール）もしくはポリアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート80（商標）もしくはHCO-50と組み合わせて用いられ得る。
油性溶液の例には、ゴマ油および大豆油が含まれる。これらの溶液は、溶解補助剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いられ得る。溶液は、さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、ならびに酸化防止剤と混合され得る。このように調製された注射液は、通常、適切なアンプル中に充填される。本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与される。その剤形の具体例には、注射剤、鼻腔内投与剤、経肺投与剤、および経皮投与剤が含まれる。注射の例には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれ、それを通して医薬組成物を全身にまたは局所に投与することができる。
投与方法は、患者の年齢および症状に応じて適宜選択することができる。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の用量は、例えば、1用量につき体重1kgあたり0.0001〜1000 mgの範囲内で選択することができる。あるいは、用量は、例えば、1患者あたり0.001〜100000 mgの範囲内で選択することができるが、必ずしもこれらの数値に限定されない。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などに応じて変動するが、当業者は、用量および方法を適宜選択することができる。
本発明はまた、本発明の抗原結合分子を投与する工程を含む、がんを処置するための方法、がんの処置における使用のための本発明の抗原結合分子、がんの治療剤の作製における本発明の抗原結合分子の使用、および、本発明の抗原結合分子を使用する工程を含む、がんの治療剤を作製するためのプロセスも提供する。
本明細書において用いられるアミノ酸の三文字表記および対応する一文字表記は、以下のように定義される：アラニン：AlaおよびA、アルギニン：ArgおよびR、アスパラギン：AsnおよびN、アスパラギン酸：AspおよびD、システイン：CysおよびC、グルタミン：GlnおよびQ、グルタミン酸：GluおよびE、グリシン：GlyおよびG、ヒスチジン：HisおよびH、イソロイシン：IleおよびI、ロイシン：LeuおよびL、リジン：LysおよびK、メチオニン：MetおよびM、フェニルアラニン：PheおよびF、プロリン：ProおよびP、セリン：SerおよびS、スレオニン：ThrおよびT、トリプトファン：TrpおよびW、チロシン：TyrおよびY、ならびにバリン：ValおよびV。
本明細書に記載される局面の1つまたはその2つ以上の任意の組み合わせもまた、当業者の技術常識に基づいて技術的矛盾が生じない限り、本発明に含まれることを、当業者は理解すべきである。
本明細書において引用される参照文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、以下の実施例に関連してさらに例示される。しかし、本発明は、以下の実施例によって限定されるようには意図されない。
［実施例１］CD3およびCD137に結合するが、CD3とCD137に同時には結合しない改変された免疫グロブリン可変（Fab）領域の概念
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要と記載されている（Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284）。
CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8）。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の存続性を増強することができることも理解されている（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733）。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22）。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合に関与することが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22）。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がインビボでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6）。WO2015/156268は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、免疫細胞を活性化することができ、それによってCD137アゴニスト抗体の肝毒性有害事象が、抗体の抗腫瘍活性を保持しつつ避けられ得ることを記載している。WO2015/156268はさらに、この二重特異性抗体を、CD3アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する別の二重特異性抗体と組み合わせて用いることによって、抗腫瘍活性をさらに高めることができ、かつこれらの有害事象が避けられ得ることを記載している。CD137、CD3、および腫瘍特異的抗原（EGFR）に対する3つの結合ドメインを有する三重特異的抗体もまた、報告されている（WO2014/116846）。しかし、この分子は、CD3εとCD137に同時に結合するため、腫瘍特異的抗原発現細胞の非存在下でさえも、CD3ε発現T細胞とCD137発現細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、DCなど）とを架橋することが予想される（図２）。実際に、CD3およびCD8に対する二重特異性抗体は、CD8陽性T細胞を架橋し、それらの細胞の間で細胞傷害活性を誘導したことが報告された（Wong, Clin. Immunol. Immunopathol. 1991, 58(2), 236-250）。したがって、CD3とT細胞上で発現している抗原との架橋は、T細胞の架橋を誘導し、T細胞を互いに死滅させることも予想される。
カツマキソマブは、T細胞に発現しているタンパク質およびがん細胞に発現しているタンパク質（がん抗原）を認識する二重特異性抗体として知られており、2つのFabで、それぞれがん抗原（EpCAM）およびT細胞に発現しているCD3ε鎖に結合して、がん抗原の非存在下でさえもCD3εとFcγRに同時に結合し、そのため、がん細胞がない環境においてさえもCD3ε発現T細胞をFcγR発現細胞に架橋して、様々なサイトカインを大量に産生することが知られている。このようながん抗原非依存的な様々なサイトカインの産生の誘導により、三機能性抗体の投与は現状、腹腔内経路に限られている（Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。したがって、三機能性抗体は、重篤なサイトカインストーム様の有害反応により、全身投与が非常に困難である（Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406（非特許文献１８））。
一方、従来の多重特異性抗体は、複数の抗原に同時に結合する。抗原の組み合わせによっては、複数の抗原に同時に結合することが好ましくない場合も存在する。有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、CD137を介したT細胞および他の免疫細胞の活性化活性とを両方とも発揮する抗体は、まだ知られていない。
したがって、そのような好ましくない架橋反応を制御するための可能性がある方法は、dual binding Fabであり、これは、その一部分を通してCD3に結合し、かつ第１の抗原に対するこの結合に関与しない異なる部分を通してCD137に結合する、1つの可変（Fab）領域である（図１）。図１に示すように、1つの可変（Fab）領域において近位に位置づけられる2つの部分が、それぞれの抗原に対する結合に必須であるとすると、CD3に対する結合は、CD137に対する結合を阻害し、一方、CD137に対する結合もまた、CD3に対する結合を阻害する。したがって、そのようなdual binding Fabの性質を有する改良型抗体は、CD3とCD137に同時には結合することができず、そのため、恐らくCD3とCD137との間の架橋反応を引き起こさない（図２）。また、dual binding Fabは、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、CD3およびCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているこれらの抗原には同時には結合せず、これらの2つの細胞を架橋しないと考えられる（図３）。他方、別の可変（Fab）領域に結合する抗原（第３の抗原）は、T細胞上のCD3およびCD137との架橋反応を起こしてもよく（図４）、またはCD137陽性免疫細胞上のCD137との架橋反応を起こしてもよい（図５）。この抗体に関して、FcγRに結合するFc領域が、定常領域として用いられてもよく、またはFcγRに対する結合活性が低下しているFc領域が、定常領域領域として用いられてもよい。
そのようなdual CD3/CD137 binding Fabの性質の使用により、例えば、がん抗原を発現しているがん細胞をT細胞の抗体媒介性リダイレクションによって損傷する技術を、さらに、T細胞、NK細胞、および／または他の免疫細胞の活性化の機能とともに提供することができ、それによって、より高い抗がんポテンシャルを達成することができる。
簡潔に述べると、以下の性質を付与するように、可変（Fab）領域をdual binding Fabとして改良することができれば、図１に示すような作用を有する抗体を開発することができる：
１．CD3に対する結合活性を有する；
２．CD137に対する結合活性を有する；および
３．CD3とCD137に同時には結合しない。
「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、可変領域が、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合も含まれる。
同様に、以下の性質を付与するように、可変（Fab）領域をdual binding Fabとして改良することができれば、例えば、図３、４、および５のいずれにも示すような作用を有する抗体を開発することができる：
１．T細胞上のCD3に対する結合活性を有する；
２．CD137発現細胞上のCD137に対する結合活性を有する；および
３．CD3とCD137に同時には結合しない。
［実施例２］リボソームディスプレイのためのdual scFvライブラリーの構築
参考実施例３において合成された抗体ライブラリー断片を用いて、リボソームディスプレイのためのdual scFvライブラリーを構築した。dualライブラリーは、H鎖は（参考実施例４中の）表３８に示すように多様化しているが、L鎖は元の配列GLS3000（配列番号：１）に固定したライブラリーとして調製した。
リボソームディスプレイdual抗体ライブラリーの設計を、図６に示す。scFvライブラリーをリボソーム上に効率的に提示するために、バクテリオファージλgpD遺伝子および大腸菌secM遺伝子の一部を、スペーサー遺伝子として用いた（配列番号：２）。GLS3000のVL断片を、そのスペーサー遺伝子およびGly/Serリッチリンカー遺伝子と、PCRによってアセンブルした（配列番号：３）。合成された抗体VHライブラリー断片を、次いで、3'末端でVLスペーサー遺伝子に、および5'末端で5'非翻訳領域（UTR）を伴うT7プロモーター（配列番号：４）に、PCR増幅によって融合させた。
［実施例３］dual scFvライブラリーからのCD3εおよびヒトCD137に結合するscFvドメインの取得
（３−１）ヒトCD137に結合するscFvドメインの取得
ヒトCD137に結合するscFvドメインを、実施例２において設計および構築されたdual scFvライブラリーから同定した。ビオチン標識された、ヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと呼ばれる、配列番号：１６）を、抗原として用いた。
実施例２において構築されたscFvリボソームディスプレイライブラリーを、インビトロ転写（T7 RiboMAX（商標） Express Large scale RNA production system, P1320, Promega）に用いて、mRNA scFvライブラリーを調製した。合成されたmRNAを、RNeasy mini kit（カタログ番号74104, QIAGEN）によって精製した。得られたmRNAライブラリーを、DnaK GroE MixおよびDS supplement（PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefrontier）を伴うPUREfrex1.0（PF001-0.25, Genefrontier）無細胞インビトロ翻訳システムによって翻訳した。その後、WBTH緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、70 mM Mg-酢酸、0.1％ Tween、2.5 mg/mLヘパリン）を添加して翻訳を停止し、ブロッキング緩衝液（200 mL milliQ 中1パックの、SuperBlock Dry Blend Blocking buffer in TBS（カタログ番号37545, Pierce）も添加した。パンニング法は、磁気ビーズでの一般的なパンニング法を参照して行った（Nat Methods. 2007 Mar;4(3):269-79；Methods Mol Biol. 2012;805:261-86)。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-cortedもしくはFG NeutrAvidinビーズ）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 StreptavidinもしくはDynabeads MyOne Streptavidin T1ビーズ）であった。
具体的には、250 pmolのビオチン標識された抗原および2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメイン（これらにおいて、「フリーの」とは「ビオチン標識されていない」ことを意味する）を、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを3回、WBT緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、50 mM Mg-酢酸、0.1％ Tween）で洗浄した。溶出緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、50 mM EDTA、および50 μg/mL 出芽酵母（S. cerevisiae）RNA（SIGMA））の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase （Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。パンニングと呼ばれるこのサイクルを、数回繰り返した。パンニングの第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいては、150〜50 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを用い、溶出緩衝液（EDTA溶出キャンペーンと名づける）またはFabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）のいずれかを用いてmRNAを回収した。その手順においては、5 uLの10単位/μL Fabricatorを95 uLのWBT緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。次いで、100μLの溶出緩衝液を、回収されたmRNAに添加して、50℃で10分間インキュベートした。
（３−２）CD3εまたはCD137に対するscFvドメインの結合（scFv ELISA）
scFvドメインの結合をELISAによって評価するために、配列番号：１４８および１５１のプライマーでのPCRによって、ラウンド5および6において回収されたDNAライブラリーにFLAG-タグを付加した。得られたscFv-FLAG DNA断片を、TOPO TA cloning kit dual promoter（Invitrogen）ベクター中にライゲーションし、DH5α大腸菌を形質転換した。大腸菌の各シングルコロニー由来のVH配列を解析した。次いで、ラウンド5およびラウンド6におけるEDTA溶出キャンペーンおよびIdeS溶出キャンペーンの両方から、互いに異なるVH配列を有する5〜7クローンを採集した。各scFv-FLAG遺伝子を、配列番号：１４８および１５１のプライマーで各コロニーから増幅した。PUREfrex1.0ssを、各々の増幅されたscFv遺伝子に添加し、37℃で2時間インキュベートした。2％スキムミルク緩衝液の添加後に、scFvを含有する溶液を、以下の手順によってELISAに供した：StreptaWell 96マイクロタイタープレート（F. Hoffmann-La Roche Ltd.）を、ビオチン化CD3εペプチド（配列番号：６）またはビオチン化ヒトCD137-Fcで、室温で30分間コーティングした。プレートの各ウェルを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、250μLの2％スキムミルク-TBSで1時間以上ブロッキングした。2％スキムミルク-TBSの除去後に、調製されたscFv溶液を各ウェルに添加し、各ウェルに含有される抗原にscFvが結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、MONOCLONAL ANTI-FLAG（登録商標） M2, ANTIBODY（SIGMA、TBSで1000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、Goat Anti-Mouse IgG, IgA, IgM (H+L), HRP Conjugate（Invitrogen、TBSで2000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。結果を図７に示す。scFvの大部分は、CD3εまたはCD137のいずれかに結合したが、図７において黒色で描いたIdeS溶出キャンペーン由来の2つのscFvは、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示した。換言すると、第２の抗原（ヒトCD137）に対する結合活性を示すクローンを、dual scFvライブラリーの使用によって選択することに成功した。
（３−３）CD3εまたはCD137に対するIgGの結合の解析
11クローン（dBBDu_001〜011）を、さらに評価するために選択した。これらのクローンをIgGに変換し（各クローンのVHおよびVL配列を、それぞれ、ヒトH鎖およびL鎖の定常ドメインに連結する）、CD3εおよびCD137に対するその結合活性を評価した。各クローンのVH断片を、ライブラリー中のH鎖に特異的に結合するプライマーを用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、ヒトIgG1のCH1遺伝子にアセンブルし、動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。GLS3000を軽鎖として用い、その発現プラスミドは、参考実施例４−２に示すように調製した。
各分子の抗原結合を、電気化学発光法（ECL法）によって試験した。具体的には、TBSTと称する0.1％ Tween 20を含有するTBS溶液で18 pmol/mLに希釈したビオチン化CD3εペプチドまたはビオチン化ヒトCD137、および2μg/mLに調整した各抗体溶液、および18 pmol/mLに調整したSULFO-TAG標識された（MESO SCALE DIAGNOSTICS、ルテニウム(II)トリス-ビピリジン, N-ヒドロキシスクシンイミド）抗ヒトIgG抗体（Invitrogen #628400）を、Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96ウェルラウンドプレート（Nunc）に25μL/ウェルで各々添加して、混合し、次いで、抗体-抗原複合体が形成するように、プレートを1時間、室温でインキュベートした。0.5％ BSAを含有するTBST溶液を、ストレプトアビジンプレート（MSD K.K., L15SA-1）に150μL/ウェルで添加し、プレートを一晩、4℃でインキュベートした。ブロッキング溶液の除去後に、各ウェルを3回、250μLのTBST溶液で洗浄した。抗体-抗原複合体溶液を、それに75μL/ウェルで添加し、ビオチン-抗ヒトIgG Abがストレプトアビジンプレートに結合するように、プレートを室温で1時間インキュベートした。抗体-抗原複合体溶液の除去後に、各ウェルを3回、TBST溶液で洗浄し、READ緩衝液（MSD K.K.）をそれに150μL/ウェルで添加して、その後Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いてsulfo-tagの発光シグナルの検出を行った。
それらの11クローンの中で、クローン011（配列番号：５）は、CD3εおよびヒトCD137の両方に対する明らかな結合を示し、いくつかの他のクローンもまた、CD3εおよびヒトCD137の両方に対する結合を示し（図８）、したがって、この結果は、2つの異なる抗原に結合するそれらのdual抗体を、この設計されたdual scFvライブラリーで取得できたことを証明する。
［実施例４］ダブルラウンド選択でのdual scFvライブラリーからのCD3εおよびヒトCD137に結合するscFvドメインの取得
（４−１）ヒトCD137に結合するscFvドメインを取得する効率を改善するためのパンニング戦略
実施例３において、CD3εおよびCD137に結合するscFvドメインを取得することに成功したが、獲得効率はそれほど高くなかった。それを改善するための考慮すべき戦略の1つは、異なる抗原を異なるパンニングラウンドで用いることになる代替的パンニングである。この方法によって、CD3εおよびヒトCD137の両方に対する選択圧を、各々の異なるラウンドにおいてdual scFvライブラリーにかけることができたが、同時ではなかった。この欠点を解決するために、本発明者らは、1ラウンドにおいて1つの抗原に対して2回のパンニングを実施すると報告された、ダブルラウンド選択を用いた（1ラウンドとは、ファージディスプレイにおいては大腸菌からのファージの回収〜大腸菌へのファージ感染、リボソームディスプレイにおいてはインビトロ転写〜PCR増幅を意味する）（J Mol Biol. 1992 Aug 5;226(3):889-96）。彼らは、各パンニングラウンドにおいて1種類の抗原のみを用いたが、本発明者らは、2つの異なる抗原を各パンニング手順において用いるダブルラウンド選択によって、2つの異なる抗原特異的な抗体をより効率的に回収することができると考えた。
（４−２）ダブルラウンド選択でのヒトCD137に結合するscFvドメインの取得
パンニング条件を表１に示した。キャンペーン1および2は、代替的パンニング条件であり、キャンペーン3は、ダブルラウンド選択をラウンド3、5、および7において実施したダブルラウンド選択条件であった。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。表１において、CD3はビオチン標識されたCD3ペプチドでのパンニングを意味し、CD137はビオチン標識されたヒトCD137-Fcでのパンニングを意味し、ダブルはダブルラウンド選択を意味する。
（表１）
Figure 2021508441
実施例２において構築されたscFvリボソームディスプレイライブラリーを、インビトロ転写（T7 RiboMAX（商標） Express Large scale RNA production system, P1320, Promega）に用いて、mRNA scFvライブラリーを調製した。合成されたmRNAを、RNeasy mini kit（カタログ番号74104, QIAGEN）によって精製した。得られたmRNAライブラリーを、DnaK GroE MixおよびDS supplement（PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefrontier）を伴うPUREfrex1.0（PF001-0.25, Genefrontier）無細胞インビトロ翻訳システムによって翻訳した。その後、WBTH緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、70 mM Mg-酢酸、0.1％ Tween、2.5 mg/mLヘパリン）を添加して翻訳を停止し、ブロッキング緩衝液（200 mL milliQ 中1パックの、SuperBlock Dry Blend Blocking buffer in TBS（カタログ番号37545, Pierce）も添加した。パンニング法は、磁気ビーズでの一般的なパンニング法を参照して行った（Nat Methods. 2007 Mar;4(3):269-79；Methods Mol Biol. 2012;805:261-86)。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-cortedもしくはFG NeutrAvidinビーズ）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 StreptavidinもしくはDynabeads MyOne Streptavidin T1ビーズ）であった。
具体的には、250 pmolのビオチン標識された抗原および2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメイン（ビオチン標識された抗原がヒトCD137-Fcであった場合）を、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを2または3回、WBT緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、50 mM Mg-酢酸、0.1％ Tween）で洗浄した。溶出緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、50 mM EDTA、および50 μg/mL 出芽酵母RNA（SIGMA））の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。このサイクルを、数回繰り返した。パンニングの第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいては、150〜50 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたは250 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを用いた。
キャンペーン3のラウンド3、5、および7において、ダブルラウンド選択を実施した。具体的には、250 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを6〜10回（パンニングラウンドに応じて）、WBT緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、その後、再びPUREfrex1.0（GeneFrontier）によって翻訳した。250 pmolまたは100 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcおよび2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメインを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを3〜10回（パンニングラウンドに応じて）、WBT緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。
（ＸＸ−２）CD3εまたはCD137に対するscFvドメインの結合（scFv ELISA）
scFvドメインの結合をELISAによって評価するために、配列番号：１４９および１５１のプライマーでのPCRによって、ラウンド6および7において回収されたDNAライブラリーにFLAG-タグを付加した。得られたscFv-FLAG DNA断片を、TOPO TA cloning kit dual promoter（Invitrogen）中にライゲーションし、DH5α大腸菌を形質転換した。大腸菌の各シングルコロニー由来のVH配列を解析した。次いで、ラウンド6および7における各パンニングキャンペーンから、互いに異なるVH配列を有するいくつかのクローンを採集した。各scFv-FLAG遺伝子を、配列番号：１４９および１５１のプライマーで各コロニーから増幅した。PUREfrex1.0ssを、各々の増幅されたscFv遺伝子に添加し、37℃で2時間インキュベートした。2％スキムミルク緩衝液の添加後に、scFvを含有する溶液を、以下の手順によってELISAに供した：StreptaWell 96マイクロタイタープレート（F. Hoffmann-La Roche Ltd.）を、ビオチン化CD3εペプチドまたはビオチン化ヒトCD137-Fcで、室温で30分間コーティングした。プレートの各ウェルを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、250μLの2％スキムミルク-TBSで1時間以上ブロッキングした。2％スキムミルク-TBSの除去後に、調製されたscFv溶液を各ウェルに添加し、各ウェルに含有される抗原にscFvが結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、MONOCLONAL ANTI-FLAG（登録商標） M2, ANTIBODY（SIGMA、TBSで1000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、Goat Anti-Mouse IgG, IgA, IgM (H+L), HRP Conjugate（Invitrogen、TBSで2000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。結果を図９に示す。キャンペーン1および2におけるscFvはすべて、CD3εまたはCD137のいずれかに結合した。他方、キャンペーン3における多くのscFvは、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示した。換言すると、CD3εおよび第２の抗原（ヒトCD137）の両方に対する結合活性を示すクローンを取得する効率を、2つの異なる抗原を各パンニングラウンドにおいて用いるダブルラウンド選択によって改善することに成功した。
（４−３）ダブルラウンド選択でヒトCD137に結合するより多くのscFvドメインを取得するための追加的なパンニング
ヒトCD137およびCD3εに結合するずっとより多くのscFvドメインを作製するために、パンニングの追加的なラウンドを、キャンペーン2および3で実施した。ラウンド8において、従来の選択およびダブルラウンド選択の両方を、キャンペーン2ラウンド7アウトプットライブラリーに対して用い、ダブルラウンド選択のみを、キャンペーン3ラウンド7アウトプットライブラリーに対して実施した。各パンニング手順は、実施例４−２と同じであった。
（４−４）ダブルラウンド選択およびIdeS溶出でのヒトCD137に結合するscFvドメインの取得
パンニング条件を表２に示した。キャンペーン4および5は、代替的パンニング条件であり、キャンペーン6は、ダブルラウンド選択をラウンド3、5、および7において実施したダブルラウンド選択条件であった。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。表２において、CD3はビオチン標識されたCD3ペプチドでのパンニングを意味し、CD137はビオチン標識されたヒトCD137-Fcでのパンニングを意味し、ダブルはダブルラウンド選択を意味する。
（表２）
Figure 2021508441
実施例２において構築されたscFvリボソームディスプレイライブラリーを、インビトロ転写（T7 RiboMAX（商標） Express Large scale RNA production system, P1320, Promega）に用いて、mRNA scFvライブラリーを調製した。合成されたmRNAを、RNeasy mini kit（カタログ番号74104, QIAGEN）によって精製した。得られたmRNAライブラリーを、DnaK GroE MixおよびDS supplement（PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefrontier）を伴うPUREfrex1.0（PF001-0.25, Genefrontier）無細胞インビトロ翻訳システムによって翻訳した。その後、WBTH緩衝液（50 mM トリス-酢酸、150 mM NaCl、70 mM Mg-酢酸、0.1％ Tween、2.5 mg/mLヘパリン）を添加して翻訳を停止し、ブロッキング緩衝液（200 mL milliQ 中1パックの、SuperBlock Dry Blend Blocking buffer in TBS（カタログ番号37545, Pierce）も添加した。パンニング法は、磁気ビーズでの一般的なパンニング法を参照して行った（Nat Methods. 2007 Mar;4(3):269-79；Methods Mol Biol. 2012;805:261-86)。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-cortedもしくはFG NeutrAvidinビーズ）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 StreptavidinもしくはDynabeads MyOne Streptavidin T1ビーズ）であった。
具体的には、250 pmolのビオチン標識された抗原および2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメイン（ビオチン標識された抗原がヒトCD137-Fcであった場合）を、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを2または3回、WBT緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAおよびそのmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。このサイクルを、数回繰り返した。パンニングの第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいては、150〜50 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたは250 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを用いた。第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいて抗原がビオチン標識されたヒトCD137-Fcであった場合、FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）を用いてmRNAを回収した。その手順においては、5μLの10単位/μL Fabricatorを95μLのWBT緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。次いで、100μLの溶出緩衝液を、回収されたmRNAに添加して、50℃で10分間インキュベートした。抗原がビオチン標識されたCD3εペプチドであった場合は、溶出緩衝液のみを、ラウンド1と同じように用いた。
キャンペーン6のラウンド3、5、および7において、ダブルラウンド選択を実施した。具体的には、250 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを6〜10回（パンニングラウンドに応じて）、WBT緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。Ribosome（GeneFrontier）を、回収されたmRNAに添加し、そのmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、その後、再びPUREfrex1.0（GeneFrontier）によって翻訳した。250 pmolまたは100 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcおよび2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメインを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。SuperBlockでブロッキングされた磁気ビーズの添加後に、抗原-scFv複合体を、4℃で15分間、磁気ビーズに付着させた。ビーズを3〜10回（パンニングラウンドに応じて）、WBT緩衝液で洗浄した。5μLの10単位/μL Fabricatorを95μLのWBT緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。次いで、100μLの溶出緩衝液を、回収されたmRNAに添加して、50℃で10分間インキュベートした。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。
（４−５）ダブルラウンド選択およびIdeS溶出でヒトCD137に結合するより多くのscFvドメインを取得するための追加的なパンニング
ヒトCD137およびCD3εに結合するずっとより多くのscFvドメインを作製するために、パンニングの追加的なラウンドを、実施例４−３と同じように、キャンペーン4、5、および6で実施した。従来の選択およびダブルラウンド選択の両方を、キャンペーン5およびキャンペーン6両方のラウンド7アウトプットライブラリーに対して用い、ダブルラウンド選択を、キャンペーン4ラウンド6アウトプットライブラリーに対して実施した。各パンニング手順は、実施例４−４と同じであった。
（４−６）CD3εまたはCD137に対するscFvドメインの結合（scFv ELISA）
scFvドメインの結合をELISAによって評価するために、配列番号：１４９および１５１のプライマーでのPCRによって、実施例４−３、４、および５におけるラウンド6〜8において回収されたDNAライブラリーにFLAG-タグを付加した。得られたscFv-FLAG DNA断片を、TOPO TA cloning kit dual promoter（Invitrogen）中にライゲーションし、DH5α大腸菌を形質転換した。大腸菌の各シングルコロニー由来のVH配列を解析した。次いで、各パンニングキャンペーンから、互いに異なるVH配列を有するいくつかのクローンを採集した。各scFv-FLAG遺伝子を、配列番号：１４９および１５１のプライマーで各コロニーから増幅した。PUREfrex1.0ssを、各々の増幅されたscFv遺伝子に添加し、37℃で2時間インキュベートした。2％スキムミルク緩衝液の添加後に、scFvを含有する溶液を、以下の手順によってELISAに供した：StreptaWell 96マイクロタイタープレート（F. Hoffmann-La Roche Ltd.）を、ビオチン化CD3εペプチドまたはビオチン化ヒトCD137-ヒトIgG1 Fc融合物で、室温で30分間コーティングした。プレートの各ウェルを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、250μLの2％スキムミルク-TBSで1時間以上ブロッキングした。2％スキムミルク-TBSの除去後に、調製されたscFv溶液を各ウェルに添加し、各ウェルに含有される抗原にscFvが結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、MONOCLONAL ANTI-FLAG（登録商標） M2, ANTIBODY（SIGMA、TBSで1000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、Goat Anti-Mouse IgG, IgA, IgM (H+L), HRP Conjugate（Invitrogen、TBSで2000倍希釈）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。
結果を図１０に示す。多くのscFvが、各パンニングキャンペーンにおいて、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示した。
（４−７）抗体形式のIgG1への変換および各IgG1分子の調製
11プール（表３に示す）を、さらに評価するために選択した。これらのプールに含まれるscFvをIgGに変換し（各クローンのVHおよびVL配列を、それぞれ、ヒトH鎖およびL鎖の定常ドメインに連結する）、CD3εおよびCD137に対するその結合活性を評価した。各プールのVH断片を、ライブラリー中のH鎖に特異的に結合するプライマー（配列番号：１５２および１５３）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。GLS3000（配列番号：１）を軽鎖として用い、その発現プラスミドは、参考実施例４−２に示すように調製した。
（表３）
Figure 2021508441
（４−８）取得された抗体のそのCD3εおよびヒトCD137結合活性についての評価
調製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその結合能力を評価した。
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチドまたはビオチン標識されたヒトCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。1％スキムミルク/TBSで2倍希釈したIgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々10μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１１に示す。
多くのクローンは、IgG1形式でも、CD3εおよびヒトCD137の両方に対する結合を示した。次いで、大腸菌の各シングルコロニー由来のVH配列を解析した。合計で、19の異なるHCDR3配列が、CD3εおよびヒトCD137の両方に結合するこれらの抗体に含有されており、かつその中に多くのHCDR1または2配列のバリアントが存在していた。
これは、2つの異なる抗原であるCD3εおよびヒトCD137に結合する抗体が、参考実施例４に記載されるように鋳型としてCD3結合抗体を用いて構築された、合理的に設計されたライブラリーから取得され、ダブルラウンド選択が、そのような抗体を取得する効率をずっとより改善できたことを示唆する。従来の代替的パンニングにおいては、選択圧が各パンニングラウンドにおいて変化し、そのために理想的なクローンの凝縮がどんどん遅くなるか、または理想的なクローンの喪失が起こる可能性がある。2つの異なる抗原でのダブルラウンド選択を用いることによって、各パンニングラウンドにおける選択圧を均一にすることができ、そのため、理想的なクローンが円滑にかつより直接的に集まる傾向がある。
［実施例５］設計された軽鎖ライブラリーを有するdual scFvライブラリー由来のCD3εおよびヒトCD137に結合する抗体ドメインの親和性成熟
（５−１）取得された重鎖を伴う軽鎖ライブラリーの構築
CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する多くの抗体が、実施例４において取得されたが、ヒトCD137に対するその親和性はまだ低かったため、その親和性を改善する親和性成熟を実施した。
それを達成するために、参考実施例４に記載される設計された軽鎖ライブラリーを、CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する1つの候補抗体の重鎖と組み合わせた。実施例４に記載されるこれらの19の抗体の中で、本発明者らは、dBBDu_115（配列番号：７）と名づけた抗体を、CD3εおよびヒトCD137の両方に対するそのより良好な結合のために、親和性成熟用の候補抗体として選択した。
本発明者らは、VL-GSリンカー-VH scFv形式およびFab形式の、2つの異なる抗体形式のライブラリーを構築した。リボソームディスプレイdual抗体ライブラリーの設計を、図１２に示す。実施例２と同じように、scFvまたはFabライブラリーをリボソーム上に効率的に提示するために、バクテリオファージλgpD遺伝子および大腸菌secM遺伝子の一部を、スペーサー遺伝子として用いた。
参考実施例４に記載される合成された抗体VLライブラリー断片を、3'末端でGly/Serリッチリンカー-dBBDu_115 VH-スペーサー遺伝子（配列番号：８）と、および5'末端で5'非翻訳領域を伴うT7プロモーター（配列番号：４）と、PCR増幅によって融合させて、VL-VH scFv形式ライブラリーを創出した。
参考実施例４に記載される合成された抗体VLライブラリー断片を、3'末端CL-スペーサー遺伝子（配列番号：９）と、および5'末端で5'非翻訳領域を伴うT7プロモーター（配列番号：４）と、PCR増幅によって融合させて、Fab形式ライブラリーを創出した。dBBDu_115のVH遺伝子断片をまた、3'末端でCH1遺伝子（配列番号：１０）と、および5'末端で5'非翻訳領域を伴うT7プロモーター（配列番号：４）と、PCR増幅によって融合させて、Fab形式のH鎖断片を創出した。
（５−２）CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する抗体ドメインの取得
パンニング条件を表４に示した。この表４において、ダブルはダブルラウンド選択を意味し、CD137Fcはビオチン標識されたヒトCD137-Fcに対する従来のパンニングを意味する。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
（表４）
Figure 2021508441
実施例５−１において構築されたscFvリボソームディスプレイライブラリー、Fab軽鎖リボソームディスプレイライブラリーおよびFab重鎖を、インビトロ転写（T7 RiboMAX（商標） Express Large scale RNA production system, P1320, Promega）に用いて、mRNAライブラリーおよび重鎖mRNAを調製した。合成されたmRNAを、RNeasy mini kit（カタログ番号74104, QIAGEN）によって精製した。得られたmRNAライブラリーおよびFab重鎖を、DnaK GroE MixおよびDS supplement（PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefrontier）を伴うPUREfrex1.0（PF001-0.25, Genefrontier）無細胞インビトロ翻訳システムによって翻訳した。その後、WBTH緩衝液を添加して翻訳を停止し、ブロッキング緩衝液（2x c-block-e, Beacle）も添加した。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-cortedもしくはFG NeutrAvidinビーズ）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 StreptavidinもしくはDynabeads MyOne Streptavidin T1ビーズ）であった。
具体的には、60 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、4℃で60分間、磁気ビーズに添加し、次いで、c-block-e（Beacle）を添加して、4℃で60分間、ビーズをブロッキングした。この抗原でコーティングされた磁気ビーズおよび2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメインを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で75分間接触させた。ビーズを、WBT緩衝液と2分間（キャンペーン10）または10分間（キャンペーン5、6、および9）インキュベートし、次いで、WBT緩衝液を捨てた。この洗浄手順を、WBT緩衝液で10回繰り返した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。パンニングと呼ばれるこのサイクルを、数回繰り返した。
パンニングの第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcの量を、表５に示すように変更し、洗浄の数もまた、表６に示すように変更した。キャンペーン6、9、および10における第２ラウンドおよびその後のラウンドにおいて抗原がビオチン標識されたヒトCD137-Fcであった場合、FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）を用いてmRNAを回収した。その手順においては、5μLの10単位/μL Fabricatorを95μLのWBT緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。次いで、100μLの溶出緩衝液を、回収されたmRNAに添加して、50℃で10分間インキュベートした。
（表５）ビオチン標識されたヒトCD137-Fcの量（pmol）
Figure 2021508441
（表６）洗浄の数
Figure 2021508441
いくつかのキャンペーンにおいて、ダブルラウンド選択を実施した。具体的には、150 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、4℃で60分間、磁気ビーズに添加し、次いで、c-block-e（Beacle）を添加して、4℃で60分間、ビーズをブロッキングした。この抗原でコーティングされた磁気ビーズを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。ビーズを、WBT緩衝液で10回洗浄した。溶出緩衝液の添加後に、ビーズを50℃で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、その後、再びPUREfrex1.0（GeneFrontier）によって翻訳した。ビオチン標識されたCD137-Fcを、4℃で60分間、磁気ビーズに添加し、次いで、c-block-e（Beacle）を添加して、4℃で60分間、ビーズをブロッキングした。この抗原でコーティングされた磁気ビーズおよび2 nmolのフリーのヒトIgG Fcドメインを、調製されたリボソームディスプレイライブラリー溶液に添加し、それによってライブラリー溶液と4℃で60分間接触させた。ビーズを、WBT緩衝液と10分間インキュベートし、次いで、WBT緩衝液を捨てた。この洗浄手順を、WBT緩衝液で10回繰り返した。キャンペーン6、9、および10においては、5μLの10単位/μL Fabricatorを95μLのWBT緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、mRNA溶液を回収した。次いで、100μLの溶出緩衝液を、回収されたmRNAに添加して、50℃で10分間インキュベートした。回収されたmRNAを、High Pure RNA Isolation kit（Roche）を用いて精製した。精製されたmRNAライブラリーを、配列番号：１４７のプライマーおよびSuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNA逆転写物に変換し、次いで、配列番号：１４８のプライマーおよびKOD-FX polymerase（TOYOBO）でのPCRによって増幅した。配列番号：１４９および１５０のプライマーでのPCRによって、増幅されたDNAライブラリーにT7プロモーター遺伝子を付加した。
（５−３）抗体形式のIgG1への変換および各IgG1分子の調製
実施例５−２に記述された親和性成熟パンニング由来のscFvまたはFabドメインライブラリーの軽鎖遺伝子を、IgGに変換し、CD3εおよびCD137に対するその結合活性を評価した。キャンペーン5、6、および9のプールのVL-CL断片を、ライブラリー中のL鎖に特異的に結合するプライマー（配列番号：１５４および１５５）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVL-CL断片を、動物発現プラスミド中に組み込み、DH5α大腸菌株を形質転換した。得られたプラスミドをまた、キャンペーン10由来の軽鎖発現ベクターの構築にも用いた。VL領域遺伝子を、得られた発現ベクターから制限酵素SfiIおよびKpnIで排除した。キャンペーン10のプールのVL断片を、ライブラリー中のVL領域に特異的に結合するプライマー（配列番号：１５４および１５６）を用いたPCRによって増幅した。調製されたVL断片を、消化された発現ベクター中に導入した。採集したコロニー数を、表７に示す。調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。実施例４において構築されたdBBDu_115重鎖発現プラスミドもまた、完全長IgGを発現させるために用いた。
（表７）
Figure 2021508441
（５−４）取得された抗体のそのCD3εおよびヒトCD137結合活性についての評価
調製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその結合能力を評価した。
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc領域を含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。2％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、20μg/mLのIgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々10μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１３に示す。
（５−５）取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
5つの抗体（表８に示す）を、さらに評価するために選択した。これらの抗体を、実施例５−３および参考実施例１に従って発現させ、精製した。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
（表８）
Figure 2021508441
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたはビオチン標識されたヒトFcと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その後、磁気ビーズを、TBSによって1回洗浄した。100 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのヒトCD3εまたは62.5 pmolのフリーのヒトFc（本実施例において、「フリーの」とは「ビオチン標識されていない」ことを意味する）またはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１４および表９に示す。
（表９）
Figure 2021508441
ヒトCD137-Fcに対する結合の、フリーのCD3εペプチドによる阻害が、すべての試験された抗体において観察されたが、フリーのFcドメインによっては観察されなかった。この結果は、それらの取得された抗体が、CD3εペプチドの存在下ではヒトCD137-Fcに結合できなかったこと、換言すると、これらの抗体は、ヒトCD137とCD3εペプチドに同時には結合しないことを意味する。したがって、2つの異なる抗原であるCD137およびCD3εに結合することができるが、同時には結合しないFabドメインを、設計されたライブラリーおよびリボソームディスプレイダブルラウンド選択で取得するのに成功したことが証明された。
［実施例６］dual FabファージディスプレイライブラリーからのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
（６−１）GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
参考実施例４において合成された抗体ライブラリー断片を用いて、ファージディスプレイのためのdual Fabライブラリーを構築した。dualライブラリーは、H鎖は参考実施例４に示すように多様化しているが、L鎖は元の配列GLS3000（配列番号：１）に固定したライブラリーとして調製した。FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えること、および（参考実施例４中の）表３８に示すようにCDRをさらに多様化させることによってCE115HA000から生じたH鎖ライブラリー配列を、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託して、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。得られた抗体ライブラリー断片を、PCRによって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入した。GLS3000を、L鎖としては選択した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌へ移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（国際特許出願の国内公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（国際特許出願番号WO2015046554の国内公表参照）。
（６−２）ダブルラウンド選択でのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、実施例６−１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（図１５、C3NP1-27と呼ばれる；アミノ酸配列：配列番号：１４５、Genscriptが合成）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびSS-ビオチン化されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ss-ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。ss-ヒトCD137-Fcは、ヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137に対してEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation Kit（PIERCE, カタログ番号21445）を用いることによって調製した。ビオチン化は、取扱説明書に従って実施した。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パンニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパンニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
具体的には、ファージ溶液を、250 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび495μLのTBSを添加し、室温で15分間インキュベートし、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
このパンニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パンニングの第２ラウンドにおいては、250 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パンニングの第３ラウンドおよび第６ラウンドにおいては、62.5 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パンニングの第４、第５、および第７ラウンドにおいては、62.5 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
（６−３）ファージによって提示されたFabドメインの、CD3εまたはヒトCD137に対する結合
ファージを含有する培養上清を、上記の方法によって得られた大腸菌の各96シングルコロニーから、一般的な方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に従って回収した。ファージを含有する培養上清を、以下の手順によってELISAに供した：ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner, カタログ番号781990）を、ビオチン標識された抗原（ビオチン標識されたCD3εペプチドまたはビオチン標識されたヒトCD137-Fc）を含有する10μLのTBSで、4℃で一晩または室温で1時間コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、80μLのTBS/2％スキムミルクで1時間以上ブロッキングした。TBS/2％スキムミルクの除去後に、調製された培養上清を各ウェルに添加し、ファージに提示された抗体が各ウェルに含有される抗原に結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、HRP/Anti M13（GE Healthcare 27-9421-01）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。結果を図１６に示す。
図１６に示すように、クローンはすべて、ヒトCD3εに対する結合を示したが、ヒトCD137に対するパンニング手順を5回実施したにもかかわらず、ヒトCD137に対する結合を示さなかった。これは、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレートでのこのファージELISA解析の感受性がより低いことに依存している可能性があり、したがって、ストレプトアビジンコーティングビーズでのファージELISAもまた実施した。
（６−４）ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137に対する結合（ファージビーズELISA）
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、0.625 pmolのss-ヒトCD137-Fcを磁気ビーズに添加して、室温で10分間以上インキュベートし、次いで、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライした。各々12.5μLのFabを提示するファージ溶液を、12.5μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で30分間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１７に示す。
いくつかのクローンは、ヒトCD137に対する明らかな結合を示した。この結果は、ヒトCD3εおよびCD137の両方に結合するいくつかのFabドメインがまた、ファージディスプレイパンニング戦略で、この設計されたライブラリーから取得されたことを示した。それでもなお、ヒトCD137に対する結合は、CD3εペプチドと比較してまだ弱かった。各々のヒトCD137結合クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１５７および１５８）を用いたPCRによって増幅して、DNA配列を解析した。結果は、結合クローンがすべて、同じVH配列を有することを示し、これは、1つのFabクローンのみが、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示したことを意味した。これを改善するために、次の実験において、ダブルラウンド選択をまたファージディスプレイ戦略に適用した。
［実施例７］ダブルラウンド選択法でのdual Fabファージディスプレイライブラリーからの、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
（７−１）GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン（配列番号：１７）をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015/046554参照）。
（７−２）ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、実施例７−１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27：配列番号：１４５）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
ヒトCD137およびCD3εに結合するずっとより多くのFabドメインを作製するために、ダブルラウンド選択をまた、ファージディスプレイパンニングに、パンニングラウンド2およびその後のラウンドで適用した。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パンニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパンニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
具体的には、パンニングラウンド1で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。DAライブラリーまたはDXライブラリーのファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、8 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインも添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で2回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで1回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンの添加後に、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
このパンニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、パンニング手順の次のラウンドからは、CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する抗体を提示するファージを回収するためにダブルラウンド選択を実施した。
具体的には、パンニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
このパンニング手順の第１サイクルにおいて、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパンニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたCD3εを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、抗体を提示するファージをヒトCD137からCD3εに移すために、37℃で30分間、室温で60分間、4℃で一晩、次いで室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
パンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンドにおいては、洗浄の数をTBSTで5回、次いでTBSで2回に増加させた。ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、C3NP1-27抗原を、ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原の代わりに用い、溶出は、CD3εペプチドとビオチンとの間のジスルフィド結合を切断するためにDTT溶液で実施した。正確には、TBSで2回洗浄した後、500μLの25 mM DTT溶液を添加して、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを、回収されたファージ溶液に添加して、室温で15分間インキュベートした。
（７−３）取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
ラウンド3およびラウンド4でのDAおよびDXライブラリーの各パンニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。29のVH配列が取得されたため、そのすべてをIgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１５７および１５８）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。GLS3000を軽鎖として用い、その発現プラスミドは、参考実施例４−２に示すように調製した。
調製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137（配列番号：１４６）およびカニクイザル（cyno（カニクイザル）と呼ばれる）CD137（配列番号：１８）に対するその結合能力を評価した。図１８は、ヒトCD137とカニクイザルCD137との間のアミノ酸配列の差を示す。それらの間では8個の残基が異なっている。
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表１０および図１９に示す。その中で、クローンDXDU01_3#094、DXDU01_3#072、DADU01_3#018、DADU01_3#002、DXDU01_3#019、およびDXDU01_3#051は、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対する結合を示した。他方、ヒトCD137に対して最も強い結合を示したDADU01_3#001は、カニクイザルCD137に対する結合を示さなかった。
（表１０）
Figure 2021508441
（７−４）取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD3εに対する結合
各抗体をまた、ELISAに供して、CD3εに対するその結合能力も評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300/TBSを含むブロッキング緩衝液を添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した後、100 ngの精製されたIgGを各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄し、TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表１１および図２０に示す。すべてのクローンは、CD3εペプチドに対する明らかな結合を示した。これらのデータから、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも結合するFabドメインを、実施例６において実施された従来のファージディスプレイパンニング手順よりも高いヒット率で、設計されたDual Fab抗体ファージディスプレイライブラリーによりダブルラウンド選択手順で効率的に取得できたことがわかる。
（表１１）
Figure 2021508441
（７−５）取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
6つの抗体（DXDU01_3#094（#094）、DADU01_3#018（#018）、DADU01_3#002（#002）、DXDU01_3#019（#019）、DXDU01_3#051（#051）、およびDADU01_3#001（#001 またはdBBDu_126））を、さらに評価するために選択した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（重鎖が配列番号：１９、軽鎖が配列番号：２０）（Bと省略される）を、対照抗体として用いた。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたはビオチン標識されたヒトFcと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その後、磁気ビーズを、TBSによって1回洗浄した。100 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのヒトCD3εペプチドまたは62.5 pmolのフリーのヒトFcまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図２１および表１２に示す。
（表１２）
Figure 2021508441
ヒトCD137-Fcに対する結合の、フリーのCD3εペプチドによる阻害が、すべての試験された抗体において観察されたが、対照抗CD137抗体においては観察されず、かつ阻害は、フリーのFcドメインによっては観察されなかった。この結果から、それらの取得された抗体が、CD3εペプチドの存在下ではヒトCD137-Fcに結合できなかったこと、換言すると、これらの抗体は、ヒトCD137とCD3εに同時には結合しないことが実証される。したがって、2つの異なる抗原であるCD137およびCD3εに結合することができるが、同時には結合しないFabドメインを、設計されたライブラリーおよびファージディスプレイダブルラウンド選択で取得するのに成功したことが証明された。
［実施例８］ダブルラウンド代替的選択またはクアドラプルラウンド選択での、dual Fabライブラリーからの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
（８−１）カニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得する効率を改善するためのパンニング戦略
実施例７において、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得することに成功したが、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137に対するよりも弱かった。それを改善するための考慮すべき戦略の1つは、異なる抗原を異なるパンニングラウンドで用いることになる、ダブルラウンド選択を伴う代替的パンニングである。この方法によって、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対する選択圧を、好ましい抗原の組み合わせであるCD3εとヒトCD137、CD3εとカニクイザルCD137、またはヒトCD137とカニクイザルCD137で、各ラウンドにおいてdual Fabライブラリーにかけることができた。それを改善するためのもう1つの戦略は、1つのパンニングラウンドにおいてすべての必要な抗原を用いることができる、トリプルまたはクアドラプルラウンド選択である。
実施例７のダブルラウンド選択手順において、抗体を提示するファージを第１抗原から第２抗原に移動させるために、一晩のインキュベーションを用いた。この方法は良好に働いたが、第１抗原に対する親和性が第２抗原に対するよりも強い場合、移動がほとんど起きない可能性がある（例えば、このdualライブラリーにおいて第１抗原がCD3εであった場合）。これに対処するために、塩基溶液での結合ファージの溶出もまた実施した。各パンニング手順のキャンペーン名および条件を、表１３に記載する。
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、実施例６−１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27；アミノ酸配列：配列番号：１４５）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3εとビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3δとのヘテロ二量体（CD3ed-Fcと名づける、アミノ酸配列：配列番号：２１、２２）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたカニクイザルCD137（カニクイザルCD137と名づける）を、抗原として用いた。
（表１３）
Figure 2021508441
（８−２）ダブルラウンド選択および代替的パンニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
キャンペーンDU05と名づけたパンニング条件を、ダブルラウンド選択および代替的パンニングで、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、表１３に示すように実施した。
ヒトCD137-Fcを偶数のラウンドにおいて用い、カニクイザルCD137-Fcを奇数のラウンドにおいて用いた。ダブルラウンド選択の詳細なパンニング手順は、実施例７に示すものと同じであった。DU05キャンペーンにおいては、ダブルラウンド選択をパンニングの第１ラウンドから実施した。
（８−３）塩基溶出ダブルラウンド選択および代替的パンニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
実施例７に示す異なる抗原での以前のダブルラウンド選択においては、IdeSまたはDTTが、抗体とビオチンとの間のリンカー領域を切断したため、抗体を提示するファージは、その第１抗原との複合体として溶出され、したがって第１抗原もまた、ダブルラウンド選択の第２サイクルに持ってこられ、第２抗原と競合する。第１抗原の持ち込みを抑制するために、結合抗体の抗原からの解離を誘導し、かつ従来のファージディスプレイパンニングにおいて非常に普及している方法である、塩基緩衝液での溶出もまた実施した（キャンペーンDS01と名づける）。
パンニングラウンド1の詳細なパンニング手順は、実施例７に示すものと同じであった。ラウンド1においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcでの従来のパンニングを実施した。
パンニングラウンド1において、ヒトCD137に結合するFabを提示するファージが蓄積されたため、パンニングラウンド2からは、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、塩基溶出ダブルラウンド選択を実施した。
具体的には、パンニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.1M トリエチルアミンF（TEA, Wako 202-02646）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、500μLの0.1 M TEAを添加して、ビーズを室温で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。100μLの1Mトリス-HCl（pH 7.5）を添加して、ファージ溶液を15分間中和した。
このパンニング手順の第１サイクルにおいて、CD3εに結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD137にも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパンニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
パンニングの第４ラウンドおよび第６ラウンドのダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcの代わりに用いた。パンニングのラウンド4からラウンド6を通して、250 pmolのビオチン標識されたヒトまたはカニクイザルのCD137-Fcを、ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいて用いた。
（８−４）クアドラプルラウンド選択での、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
以前のダブルラウンド選択においては、パンニングの1ラウンドにおいて2つの異なる抗原しか用いることができなかった。この限界を突破するために、クアドラプルラウンド選択をまた実施した（表１３に示す、キャンペーンMP09およびMP11との名称）。
MP09およびMP11両方のパンニングラウンド1、ならびにMP09のパンニングラウンド2において、ダブルラウンド選択を実施した。
具体的には、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。268 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
このパンニング手順の第１サイクルにおいて、カニクイザルCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパンニング手順に進んだ。IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
MP09のパンニングキャンペーンの第２ラウンドにおいては、表１３に示すように、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクルパンニング抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、トリプシンによる溶出を伴って、第２サイクルパンニング抗原として用いた。
クアドラプルパンニングを、MP09キャンペーンのパンニングラウンド3およびラウンド4において、ならびにMP11キャンペーンのパンニングラウンド2およびラウンド3において実施した。
MP09キャンペーンのパンニングラウンド3およびMP11キャンペーンのラウンド2において、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。250 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。クアドラプルラウンド選択の第３サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
クアドラプルラウンド選択の第４サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
MP09キャンペーンのパンニングラウンド4およびMP11キャンペーンのラウンド3においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクル抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、第３サイクル抗原として用いた。
（８−５）ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合（ファージELISA）
Fabを提示するファージ溶液を、実施例８−２、８−３、および８−４におけるパンニング手順を通して調製した。最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたCD3εペプチドを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、各々250 nLのFabを提示するファージ溶液を、24.75μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図２２に示す。
ヒトCD137、カニクイザルCD137、およびCD3εの各抗原に対する結合が、各パンニングアウトプットファージ溶液において観察された。この結果は、塩基溶出を伴うダブルラウンド選択が、IdeS溶出法を伴う以前のダブルラウンド選択と同様に働いたこと、および、代替的パンニングを伴うダブルラウンド選択がまた、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを取得するために良好に働いたことを示した。これらの方法は、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを収集するが、それでもなお、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137と比較してまだ弱かった。他方、MP09またはMP11キャンペーンにおいては、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合が、同じラウンド時点で観察され、かつカニクイザルCD137に対するその結合は、他のキャンペーンよりも高かった。この結果から、クアドラプルラウンド選択が、3つの異なる抗原に結合するFabドメインをより効率的に濃縮できることが実証された。
（８−６）取得されたFabドメインを有するIgGの調製
各パンニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。32クローンを、そのVH配列がすべての解析されたプールの中で2回よりも多く出現したため、選択した。そのVH遺伝子を、PCRによって増幅し、IgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ライブラリー中のH鎖に特異的に結合するプライマー（配列番号：１５７および１５８）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをクローン変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
各パンニングアウトプットプールのVH遺伝子もまた、IgG形式に変換した。ファージミドベクターライブラリーを、各パンニングアウトプットプールDU05、DS01、およびMP11の大腸菌から調製し、NheIおよびSalI制限酵素で消化して、VH遺伝子を直接抽出した。抽出されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを大腸菌中に導入し、各パンニングアウトプットプールから、192または288コロニーを採集して、そのVH配列を解析した。MP09および11キャンペーンにおいては、異なるVH配列を有するクローンを、可能な限り採集した。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをバルク変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
（８−７）取得された抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
調製されたバルク変換IgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。2％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、IgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図２３に示す。
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パンニング手順から取得されたため、代替的パンニングを伴うダブルラウンド選択、塩基溶出を伴うダブル選択、およびクアドラプルラウンド選択のいずれもが、すべて期待されたように働いたことがわかる。特に、ヒトCD137に結合したクアドラプルラウンド選択由来のすべてのクローンの大部分は、他の2つのパンニング条件と比較して、カニクイザルCD137に対して同等レベルの結合を示した。それらのパンニング条件においては、恐らくCD3εおよびヒトCD137の両方に対する結合を示したクローンの取得がより少なく、それは主に、このキャンペーンにおいて、互いに同じVH配列を有するクローンを故意に採集することを可能な限りしなかったためである。各タンパク質に対してより良好な結合を示し、かつ互いに異なるVH配列を有した54クローンを、選択してさらに評価した。
（８−８）精製されたIgG抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
精製されたIgG抗体の結合能力を評価した。実施例８−５における32のクローン変換IgG、および実施例８−６において選択された54のバルク変換IgGを用いた。
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチド、2.5 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、2.5 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、または0.625 pmolのビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図２４に示す。多くのクローンが、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対して同等レベルの結合を示し、CD3εに対する結合もまた示した。
（８−９）取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
実施例８−７においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した37の抗体を、さらに評価するために選択した。実施例７−３において取得された7つの抗体もまた、評価した（これら7つのクローンを、表１４におけるように改名した）。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。実施例７−５に記載されるBと名づけた抗ヒトCD137抗体を、対照抗体として用いた。
（表１４）
Figure 2021508441
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、125、12.5、もしくは1.25 pmolのフリーのCD3εペプチドまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図２５および表１５に示す。
（表１５）
Figure 2021508441
Figure 2021508441
対照抗CD137抗体B以外のすべての試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
（８−１０）CD3εおよびヒトCD137に対して取得されたFabドメインを有するIgGのヒトCD137エピトープの評価
実施例８−８における21の抗体を、さらに評価するために選択した（表１７）。精製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137のその結合エピトープを評価した。
エピトープを解析するために、WO2015/156268に記載されているように、断片化ヒトCD137と抗体のFc領域との融合タンパク質を作製し、そのドメインは、Cys-Cysによって形成される構造によって分けられ、CRDと呼ばれる（表１６参照）。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、表１６に示すアミノ酸配列を含み、それぞれの遺伝子断片は、完全長ヒトCD137-Fc融合タンパク質（配列番号：１６）をコードするポリヌクレオチドからPCRによって取得し、当業者に知られている方法によって動物細胞における発現用のプラスミドベクターに組み込んだ。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を、WO2015/156268に記載されている方法によって抗体として精製した。
（表１６）
Figure 2021508441
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ヒトCD137ドメイン1-Fc、ヒトCD137ドメイン1/2-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3/4-Fc、ヒトCD137ドメイン3/4-Fc、およびヒトFcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図２６に示す。
各クローンは、ヒトCD137の異なるエピトープドメインを認識した。ドメイン1/2のみを認識する抗体（例えば、dBBDu183、dBBDu205）、ドメイン1/2およびドメイン2/3の両方を認識する抗体（例えば、dBBDu193、dBBDu 202、dBBDu222)、ドメイン2/3、2/3/4、および3/4のいずれもを認識する抗体（例えば、dBBDu139、dBBDu217), ヒトCD137ドメインを広く認識する抗体（dBBDu174）、ならびに各々の分離したヒトCD137ドメインには結合しない抗体（例えば、dBBDu126）。この結果から、いくつかのヒトCD137エピトープに対する多くのdual binding抗体を、この設計されたライブラリーおよびダブルラウンド選択手順により取得できることが実証される。
dBBDu126の実際のエピトープ領域は、このELISAアッセイによって決定することができないが、dBBDu126は、実施例７−３に記載されるようにカニクイザルCD137と交差反応できないため、ヒトとカニクイザルとが異なる残基を有する位置を認識すると推定することができる。図１８に示すように、ヒトとカニクイザルとの間には8つの異なる位置があり、カニクイザルCD137／ヒトCD137ハイブリッド分子に対する結合アッセイおよび結合複合体の結晶構造解析によって、75E（ヒトにおいては75G）が、カニクイザルCD137に対するdBBDu126の結合を干渉する原因として同定された。結晶構造からも、dBBDu126は、ヒトCD137のCRD3領域を主に認識することが明らかである。
（表１７）
Figure 2021508441
［実施例９］設計された軽鎖ライブラリーを有するdual Fabライブラリー由来のCD3εおよびヒトCD137に結合する抗体ドメインの親和性成熟
（９−１）取得された重鎖を伴う軽鎖ライブラリーの構築
CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する多くの抗体が、実施例８において取得されたが、ヒトCD137に対するその親和性はまだ低かったため、その親和性を改善する親和性成熟を実施した。
13のVH配列、dBBDu_179、183、196、197、199、204、205、167、186、189、191、193、および222を、親和性成熟のために選択した。それらのうち、dBBDu_179、183、196、197、199、204 、および205は、同じCDR3配列を有するが、異なるCDR1または2配列を有するため、これら7つのファージミドを混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製した。dBBDu_191、193、および222の3つのファージミドもまた混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製したが、それらは異なるCDR3配列を有していた。軽鎖ライブラリーのリストを、表１８に示す。
（表１８）
Figure 2021508441
参考実施例４に記載される合成された抗体VLライブラリー断片を、配列番号：１５９および１６０のプライマーでのPCR法によって増幅した。増幅されたVL断片を、SfiIおよびKpnI制限酵素によって消化して、13のVH断片を各々有するファージミドベクター中に導入した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌に移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染、およびそれに続く、0.002％アラビノースとの25℃で一晩のインキュベーションによって作製した。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015046554参照）。
（９−２）ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、実施例９−１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パンニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパンニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。
具体的には、ファージ溶液を、100 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、10分間TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、10分間、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび400μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
このパンニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パンニングの第２ラウンドにおいては、160 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、2分間TBSTで7回、次いで2分間TBSで3回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パンニングの第３ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
パンニングの第４ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
（９−３）取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
各パンニングアウトプットプールのFab遺伝子を、IgG形式に変換した。調製された哺乳動物発現プラスミドを大腸菌中に導入し、各パンニングアウトプットプールから、96コロニーを採集して、そのVHおよびVL配列を解析した。それぞれ、ライブラリー2におけるVH配列の大部分は、dBBDu_183に集中しており、ライブラリー6におけるVH配列の大部分は、dBBDu_193に集中していた。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例１の方法による動物細胞における発現に用いた。
調製されたIgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。1％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、10 ng/μLのIgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図２７に示す。
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パンニング手順から取得された。より良好な結合を示した96クローンを選択し、さらに評価した。
（９−４）取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
実施例９−３においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した96の抗体を、さらに評価するために選択した。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。250 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのCD3εまたは62.5 pmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置させた。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図２８および表１９に示す。大部分の試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
（表１９）
Figure 2021508441
Figure 2021508441
Figure 2021508441
（９−５）取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する親和性の評価
実施例９−４において取得された各IgGの、ヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合を、Biacore T200を用いて確認した。実施例９−４における結果により、16の抗体を選択した。センサーチップCM3（GE Healthcare）に、アミンカップリングによって適切な量のsure protein A（GE Healthcare）を固定化した。選択された抗体をチップにより捕捉して、抗原としてのヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する相互作用を可能にした。用いたランニング緩衝液は、20 mmol/l ACES、150 mmol/l NaCl、0.05％(w/v) Tween20、pH 7.4であった。すべての測定を25℃で実施した。抗原は、ランニング緩衝液を用いて希釈した。
ヒトCD137に関しては、4000、1000、250、62.5、および15.6 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、各濃度の抗原を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
カニクイザルCD137に関しては、4000、1000、および250 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
ヒトCD3edに関しては、1000、250、および62.5 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で120秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で30秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で30秒間ロードした。
結合速度定数ka（1/Ms）および解離速度定数kd（1/s）などのカイネティックパラメータを、測定によって得られたセンサーグラムに基づいて算出した。解離定数KD（M）を、これらの定数から算出した。各パラメータは、Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いて算出した。結果を表２０に示す。
（表２０）
Figure 2021508441
Figure 2021508441
Figure 2021508441
［実施例１０］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製およびそのヒトCD137アゴニスト活性の評価
（１０−１）抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、以下の手順によって作製した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（H鎖が配列番号：１９、L鎖が配列番号：２０）（Bと省略される）コードする遺伝子を、対照抗体として用いた。抗体の抗ヒトGPC3側は、重鎖可変領域H0000（配列番号：６６）および軽鎖可変領域GL4（配列番号：６７）を共有した。実施例９および表２０に記載される16のdual-Ig Fabを、候補dual-Ig抗体として用いた。これらの分子について、H鎖とL鎖との間の会合を調節するため、および二重特異性抗体を効率的に取得するために、Schaeferら（Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192）によって報告されたCrossMab技術を用いた。より具体的には、ヒトGPC3に対するFabのVHドメインおよびVLドメインを交換することによって、これらの分子を作製した。異種会合の促進のために、ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーを、抗体H鎖の定常領域に対して用いた。ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーとは、ノブがホール中に配置されるように、H鎖のうちの1つのCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置換し（ノブ）、かつもう1つのH鎖のCH3領域中のアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置換する（ホール）ことによる、H鎖のヘテロ二量体化の促進を通して、目的のヘテロ二量体化抗体の調製を可能にする技術である（Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383）。以後、ノブ修飾が導入されている定常領域をKnと示し、ホール修飾が導入されている定常領域をH1と示す。さらに、WO2011/108714に記載されている修飾を用いて、Fcγ結合を低下させた。具体的には、234、235、および297位（EUナンバリング）のアミノ酸をAlaに置換する修飾を導入した。446位のGlyおよび447位のLys（EUナンバリング）を、抗体H鎖のC末端から除去した。ヒスチジンタグを、Kn Fc領域のC末端に付加し、FLAGタグを、H1 Fc領域のC末端に付加した。上述の修飾を導入することによって調製された抗ヒトGPC3 H鎖は、GC33(2)H-G1dKnHS（配列番号：６８）であった。調製された抗ヒトCD137 H鎖は、BVH-G1dHIFS（配列番号：６９）であった。抗体L鎖GC33(2)L-k0（配列番号：７０）およびBVL-k0（配列番号：７１）を、それぞれ、抗ヒトGPC3側および抗CD137側に共通して用いた。Dual抗体のH鎖およびL鎖もまた、表２０に示す。BVH-G1dHIFSおよびBVL-k0と同じように、それぞれ、各dual抗体クローンのVHを、G1dHIFS（配列番号：８３）CH領域に融合させ、各dual抗体クローンのVLを、k0（配列番号：８４）CL領域に融合させた。表２２に示す組み合わせを有する抗体を発現させて、目的の二重特異性抗体を取得した。無関連である抗体を、対照として用いた（Ctrlと省略される）。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例１」に従って精製した。
（１０−２）抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD137アゴニスト作用の評価
ヒトCD137についてのアゴニスト活性を、ELISAキット（R&D systems, DY206）を用いたサイトカイン産生に基づいて評価した。抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3ε結合ドメインの作用を避けるために、CD3εもGPC3も発現しないが、CD137を構成的に発現するB細胞株HDLM-2を用いた。HDLM-2を、20％ FBSを含有するRPMI-1640培地に8×105細胞/mlの密度で懸濁した。GPC3を発現するマウスがん細胞株CT26-GPC3（参考実施例５）を、同じ培地に4×105細胞/mlの密度で懸濁した。同じ体積の各細胞懸濁液を混合し、混合された細胞懸濁液を、96ウェルプレート中に200 ul/ウェルの体積で播種した。抗GPC3/Ctrl抗体、抗GPC3/抗CD137抗体、および実施例１０−１において調製された8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体を、各々30μg/ml、6μg/ml、1.2μg/ml、0.24μg/mlで添加した。細胞を、37℃および5％ CO2の条件下で3日間培養した。培養上清を収集し、上清中に含有されるヒトIL-6の濃度をHuman IL-6 DuoSet ELISA（R&D systems, DY206）で測定して、HDLM-2の活性化を評価した。ELISAは、キットの製造業者（R&D systems）により提供される説明書に従うことによって行った。
結果として（図２９および表２１）、8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体のうち7つは、抗体濃度に依存して、抗GPC3/抗CD137抗体と同様にHDLM-2のIL-6産生の活性化を示した。表２１において、Ctrlと比較したアゴニスト活性とは、Ctrlの存在下でのバックグラウンドレベルを超えるhIL-6分泌の増加レベルを意味する。この結果に基づいて、これらのDual-Fab抗体は、ヒトCD137に対してアゴニスト活性を有すると考えられた。
（表２１）
Figure 2021508441
［実施例１１］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のヒトCD3εアゴニスト活性の評価
（１１−１）抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/Ctrl二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、実施例１０−１において作製し、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体もまた、同じ構築物として調製した。参考実施例２において作製されたCE115 VH（配列番号：７２）およびCE115 VL（配列番号：７３）を、抗ヒトCD3ε抗体の重鎖および軽鎖に用いた。組み合わせを有する抗体を表２２に示す。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例１」に従って精製した。
（表２２）
Figure 2021508441
（１１−２）抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD3アゴニスト作用の評価
ヒトCD3に対するアゴニスト活性を、GloResponse（商標） NFAT-luc2 Jurkat Cell Line（Promega, CS#176401）をエフェクター細胞として用いることによって評価した。Jurkat細胞は、ヒト急性T細胞白血病に由来するヒトTリンパ球細胞の不死化された細胞株であり、それ自体上でヒトCD3を発現する。NFAT luc2_jurkat細胞においては、CD3活性化からのシグナルによって、ルシフェラーゼの発現が誘導された。細胞膜上にヒトGPC3を発現するSK-pca60細胞株（参考実施例５）を、標的細胞として用いた。
5.00E+03個のSK-pca69細胞（標的細胞）および3.00E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞（エフェクター細胞）を両方とも、白底96ウェルアッセイプレート（Costar, 3917）の各ウェルに添加し、次いで、0.1、1、または10 mg/Lの濃度の、10μLの各抗体を各ウェルに添加して、5％ CO2の存在下、37℃で24時間インキュベートした。発現したルシフェラーゼを、Bio-Glo luciferase assay system（Promega, G7940）で、付属の説明書に従って検出した。検出には2104 EnVIsionを用いた。結果を図３０に示す。
大部分のDual Fabクローンは、明らかなCD3εアゴニスト活性を示し、そのうちのいくつかは、CE115抗ヒトCD3ε抗体と同等レベルの活性を示した。Dual-Fabドメインに対するCD137結合活性の付加は、CD3εアゴニスト活性の喪失を誘導しなかったこと、ならびに、Dual-Fabドメインが、1つのドメインのみによって、ヒトCD3εおよびCD137の2つの異なる抗原に対する結合だけではなく、ヒトCD3εおよびCD137の両方のアゴニスト活性も示したことが実証された。
重鎖dBBDu_186を有するいくつかのDual-Fabドメインは、他のものよりも弱いCD3εアゴニスト活性を示した。これらの抗体はまた、実施例９−５のbiacore解析において、ヒトCD3εに対してより弱い親和性を示した。このDual Fabライブラリー由来のDual-FabのCD3εアゴニスト活性は、ヒトCD3εに対するその親和性のみに依存することが実証され、これは、CD3εアゴニスト活性がこのライブラリー設計において保持されていたことを意味する。
［実施例１２］PBMC T細胞サイトカイン放出アッセイにおけるDual-Fab抗体のヒトCD3ε/ヒトCD137相乗活性の評価
（１２−１）抗体調製
WO2005/035584A1に記載されている抗CD137抗体（Bと省略される）、実施例１０−１に記載されるCtrl抗体、および実施例１２に記載される抗CD3εCE115抗体を、単一抗原特異的な対照として用いた。表２０に記載されるDual-FabであるH183L072（重鎖：配列番号：３０、軽鎖：配列番号：５１）を、さらなる評価のために選択し、 FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させて、「参考実施例１」に従って精製した。
（１２−２）PBMC T細胞アッセイ
CD3εおよびCD137の活性化に対するDual-Fab抗体の相乗効果を調べるために、cytometric bead array（CBA） Human Th1/T2 Cytokine kit II（BD Biosciences #551809）を用いて、総サイトカイン放出を評価した。CD137の活性化に関連して、IL-2（インターロイキン-2）、IFNγ（インターフェロンγ）、およびTNFα（腫瘍壊死因子-α）を、凍結状態で購入した凍結ヒト末梢血単核細胞（PBMC）（STEMCELL）より単離されたT細胞から、評価した。
（１２−２−１）凍結ヒトPBMCの調製およびT細胞の単離
PBMCを含有するクライオバイアルを、37℃の水浴に置いて、細胞を解凍した。次いで、細胞を、9 mLの培地（標的細胞を培養するために用いられる培地）を含有する15 mL falconチューブ中に分注した。次いで、細胞懸濁液を、1,200 rpmで5分間、室温での遠心分離に供した。上清を穏やかに吸引し、再懸濁のために新鮮な温めた培地を添加して、ヒトPBMC溶液として用いた。T細胞を、Dynabeads Untouched Human T cell kit（Invitrogen #11344D）を用いて製造業者の説明書に従って単離した。
（１２−２−２）サイトカイン放出アッセイ
30μg/mLおよび10μg/mLの、実施例１２−１において調製された抗体を、maxisorp 96ウェルプレート（Thermofisher #442404）上に一晩コーティングした。1.00E+05個のT細胞を、抗体を含有する各ウェルに添加して、37℃で72時間インキュベートした。プレートを、1,200 rpmで5分間遠心分離して、上清を収集した。製造業者の説明書に従ってCBAを行い、結果を図３１に示す。
dual-FabであるH183L072抗体のみが、T細胞によるIL-2分泌を示した。抗CD137（B）も抗CD3ε抗体（CE115）も、単独でT細胞からのIL-2の誘導をもたらさなかった。加えて、抗CD137抗体単独は、サイトカインの検出をもたらさなかった。抗CD3ε抗体と比較すると、Dual-Fab抗体は、TNFαのレベルの増加およびIFNγの同様の分泌をもたらした。これらの結果は、dual-Fab抗体が、T細胞の機能的活性化のためにCD3εおよびCD137の両方の相乗的活性化を惹起できたことを示唆する。
［実施例１３］抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の細胞傷害活性の評価
（１３−１）抗GPC3/dual-Fabおよび抗GPC3/CD137二重特異性抗体の調製
実施例１１に記載される抗GPC3またはCtrl抗体、およびDual-Fab（H183L072）または抗CD137抗体を使用し、Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26; 110(13): 5145-5150に記載されている方法に従うFabアーム交換（FAE）を用いて、抗GPC3/dual-Fab、抗GPC3/CD137、Ctrl/H183L072、およびCtrl/CD137抗体の4つの抗体を生成した。4つの抗体すべての分子形式は、従来のIgGと同じ形式である。抗GPC3/ H183L072は、GPC3、CD3、およびCD137に結合することができる三重特異性抗体であり、抗GPC3/CD137は、GPC3およびCD137に結合することができる二重特異性抗体であり、Ctrl/H183L072およびCtrl/CD137 は、対照として用いた。生成した4つの抗体はすべて、Fcγ受容体に対して減弱した親和性を有し（L235R、G236R、S239K）、かつ脱グリコシル化した（N297A）サイレントFcからなる。
（１３−２）T細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）アッセイ
細胞傷害活性を、参考実施例（２−５−２）に記載されるようにxCELLigence Real-Time Cell Analyzer（Roche Diagnostics）を用いた細胞増殖抑制の比率によって評価した。両方ともGPC3を発現するトランスフェクタント細胞株である1.00E+04個のSK-pca60またはSK-pca13aを、標的（Tと省略される）細胞として用い（それぞれ、参考実施例５および２）、実施例（１２−２−１）に記載されるように調製された5.00E+04個の凍結ヒトPBMCエフェクター（Eと省略される）細胞と共培養した。これは、腫瘍細胞に対して5倍量のエフェクター細胞を加えたことを意味し、そのためここではET 5と記載する。抗GPC3/H183L072抗体およびGPC3/CD137抗体を、0.4、5、および10 nMで添加した一方、Ctrl/H183L072抗体およびCtrl/CD137抗体は、各ウェル10 nMで添加した。細胞傷害活性の測定は、参考実施例２−５−２に記載されるのと同様に実施した。反応は、5％二酸化炭素ガスの条件下、37℃で実施した。PBMCの添加の72時間後に、細胞増殖抑制（CGI）率（％）を、参考実施例２−５−２に記載される式を用いて決定し、図３２に示すようにグラフにプロットした。実施例１１−２においてJurkat細胞に対してCD3活性化を示した抗GPC3/H183L072 dual-Fab抗体は、GPC3発現細胞の強い細胞傷害活性を、すべての濃度で両方の標的細胞株においてもたらしたが、CD3活性化を示さなかった対照/H183L072 dual-Fab抗体および抗GPC3/CD137抗体はもたらさず、Dual-Fab三重特異性抗体が細胞傷害活性をもたらし得ることが示唆された。
［実施例１４］抗GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体のオフターゲット細胞傷害活性の評価
（１４−１）抗GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体の調製
標的依存性細胞傷害活性およびサイトカイン放出を調べるために、CrossMabおよびFAEテクノロジーを利用することによって、三重特異性抗体を生成した（図３３）。各アームが2つの結合ドメインを有し、1つの分子中に4つの結合ドメインをもたらす四価IgG様分子である抗体A（mAb A）を、上述のCrossMabで生成した。二価IgGである抗体B（mAb B）は、従来のIgGと同じ形式である。mAb AおよびmAb Bの両方のFc領域は、Fcγ受容体に対して減弱した親和性を有し（L235R、G236R、S239K）、かつ脱グリコシル化し（N297A）、かつFAEに適用可能であるサイレントなFcγRである。6つの三重特異性抗体を構築した。6つの三重特異性抗体における各Fv領域の標的抗原を、表２３に示す。mAb A、mAb B、およびmAb ABの結合ドメインの各々の命名規則を、図３４に示す。6つの三重特異性抗体であるmAb ABの各々を生成するためのmAb AおよびmAb Bのペア、ならびにその配列番号を、それぞれ表ｘｘ１９および表ｘｘ２０に示す。WO2005/035584A1に記載された抗体CD3D(2)_i121（AN121と省略される）を、抗CD3ε抗体として用いた。6つの三重特異性抗体をすべて発現させて、上記の方法によって精製した。
（表２３）抗体の各アームの標的
Figure 2021508441
（表２４）
Figure 2021508441
（表２５）
Figure 2021508441
（１４−２）GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体の結合の評価
三重特異性抗体のヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて37℃で評価した。抗ヒトFc抗体（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗Fcセンサー表面上に抗体を捕捉させ、次いで、組換えヒトCD3またはCD137を、フローセルにわたってインジェクトした。すべての抗体およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、各サイクルに3M MgCl2で再生させた。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定した。
三重特異性抗体の組換えヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、表２６に示す。
（表２６）
Figure 2021508441
（１４−３）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fabの、ヒトCD137およびCD3に対する同時結合の評価
Biacoreタンデムブロッキングアッセイ（Biacore in-tandem blocking assay）を行って、三重特異性抗体またはDual-Fab抗体のCD3およびCD137の両方に対する同時結合を特徴決定した。アッセイは、Biacore T200機器（GE Healthcare）上で、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において25℃で行った。抗ヒトFc抗体（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗Fcセンサー表面上に抗体を捕捉させ、次いで、8μM CD3をフローセルにわたってインジェクトし、その後、8μM CD3の存在下での8μM CD137の同一のインジェクションを行った。第２のインジェクションに対する結合レスポンスの増加は、異なるパラトープに対する結合を示し、したがって同時の結合相互作用を示したが、第２のインジェクションに対する結合レスポンスの増強がないことまたはその減少は、同じかまたはオーバーラップするかまたは隣接するパラトープに対する結合を示し、したがって同時ではない結合相互作用を示した。
このアッセイの結果を、図３５に示し、そこでは、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体は、CD3およびCD137に対する同時結合特性を示したが、抗GPC3/Dual-Fab抗体は示さなかった。
（１４−４）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の、ヒトCD137発現CHO細胞またはJurkat細胞に対する結合の評価
図３６は、FACS解析によって判定された、三重特異性抗体およびDual-Fab抗体の、参考実施例５において生成されたhCD137トランスフェクタント、親CHO細胞に対する結合、またはJurkat細胞（実施例１１−２参照）上に発現しているhCD3に対する結合を示す。簡潔に述べると、三重特異性抗体およびDual-Fab抗体を、各細胞株と2時間、室温でインキュベートして、FACS緩衝液（PBS中、2％ FBS、2mM EDTA）で洗浄した。次いで、Goat F(ab')2 anti-Human IgG, Mouse ads-PE（Southern Biotech, カタログ2043-09）を添加し、30分間4℃でインキュベートして、FACS緩衝液で洗浄した。データの獲得を、FACS Verse（Becton Dickinson）で行い、その後、FlowJo software（Tree Star）を用いた解析を行った。
図３６は、50 nMの抗GPC3/H183L072（黒線）抗体が、Ctrl抗体（灰色塗りつぶし）と比べて、hCD137トランスフェクタント上のhCD137に特異的に結合する（図３６ａ）が、CHO親細胞に対しては結合が観察されない（図３６ｂ）ことを示す。同様に、2 nMの抗GPC3/CD137xCD3（暗灰色塗りつぶし）および抗GPC3/CD137xCtrl（黒線）三重特異性抗体は、Ctrl/CtrlxCD3三重特異性対照抗体（薄灰色、塗りつぶし）と比べて、トランスフェクタント細胞上のhCD137に対する特異的結合を示した（図３６ｃ）。CHO親細胞においては非特異的結合は観察されなかった（図３６ｄ）。
50 nMの、図３６ｅにおける抗GPC3/H183L072（黒線）抗体および図３６ｆにおけるGPC3/CD137xCD3（暗灰色塗りつぶし）またはGPC3/CD137xCtrl（黒線）三重特異性抗体は両方とも、それぞれの対照（薄灰色塗りつぶし）と比べて、Jurkat細胞上に発現しているCD3に結合することが示された。
（１４−５）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の、ヒトGPC3発現細胞に対するT細胞上のCD3活性化の評価
三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の両方の形式が、標的依存性の様式でエフェクター細胞を活性化することができるかどうかを調べるために、実施例１１−２に記載されるようにNFAT-luc2 Jurkatルシフェラーゼアッセイを実施した。5.00E+03個のSK-pca60細胞（実施例５参照）を、標的細胞として用いて、0.1、1、および10 nMの三重特異性抗体またはDual-Fab抗体の存在下で24時間、2.50E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞と共培養した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を、Bio-Glo luciferase assay system（Promega, G7940）で、製造業者の説明書に従って検出した。発光（単位）は、GloMax（登録商標） Explorer System（Promega #GM3500）を用いて検出し、捕捉された値を、Graphpad Prism 7を用いてプロットした。図３７に示すように、GPC3/CD137xCD3、GPC3/CtrlxCD3、または抗GPC3/H183L072などの抗GPC3結合および抗CD3結合の両方から構成される三重特異性抗体のみが、標的抗体の存在下で、Jurkat細胞の用量依存的な活性化をもたらした。注目すべきことに、実施例（１４−４）におけるFACS解析によるJurkat細胞に対する抗GPC3/H183L072抗体の結合はより弱かったにもかかわらず、抗GPC3/H183L072抗体は、GPC3/CD137xCD3またはGPC3/CtrlxCD3抗体と同様の程度のJurkat活性化を惹起することができた。全体的に、三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体は両方とも、エフェクター細胞の標的依存性の活性化をもたらすことができる。
（１４−６）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の、ヒトCD137発現細胞に対するT細胞上のCD3活性化の評価
三重特異性抗体形式および抗GPC3/Dual-Fab抗体が両方とも、hCD137発現細胞とhCD3発現エフェクター細胞との架橋をもたらすことができるかどうかを調べるために、5.00E+03個のhCD137発現CHOを、実施例（１４−５）に記載されるように、0.1、1、および10 nMの三重特異性抗体の存在下で24時間、2.50E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞と共培養した。図３８は、すべての三重特異性抗体によって、親CHO細胞と共培養した時にはJurkat細胞の非特異的な活性化がないことを示した。しかし、GPC3/CD137xCD3およびCtrl/CD137xCD3三重特異性抗体は両方とも、hCD137発現CHO細胞の存在下でJurkat細胞を活性化できることが観察された。抗GPC3/H183L072抗体は、hCD137発現CHO細胞と共培養した時にJurkat細胞の活性化をもたらさなかった。10 nMの抗GPC3/H183L072抗体は、10 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約0.96％の発光を示し、1 nMの抗GPC3/H183L072抗体は、1 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約1.93％の発光を示した。実施例１４−５において評価されたGPC3陽性細胞に対するCD3活性化と比較した場合、10 nMまたは1 nMの抗GPC3/H183L072抗体を用いた時には、約1.36％または1.89％の発光が、CD137陽性細胞に対して検出されたが、10および1 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体は、それぞれ、GPC3陽性細胞に対するものと比較して約127.77％および107.22％の発光を、CD137陽性細胞に対して示した。
まとめると、CD3とCD137に同時に結合する三重特異性形式の抗GPC3/CD137xCD3は、CD3とCD137に同時には結合しない抗GPC3/Dual-Fab形式とは異なり、標的または腫瘍抗原の結合とは独立して、hCD137発現細胞に対するJurkat細胞活性化をもたらし、オフターゲット細胞傷害活性を生じ得ることが示唆される。実施例１３、１４−５、および１４−６に示すそれらの結果から、CD3とCD137に同時には結合しない抗体のみが、標的抗原発現細胞を特異的に死滅させ得ることがわかる。
（１４−７）Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体およびCtrl/Dual-Fab抗体の、PBMCからのオフターゲットサイトカイン放出の評価
オフターゲット毒性についての三重特異性抗体形式とDual-Fab抗体との比較をまた、ヒトPBMC溶液を用いて評価した。簡潔に述べると、実施例（１２−２−１）に記載されるように調製された2.00E+05個のPBMCを、80、16、および3.2 nMの三重特異性抗体またはDual-Fab抗体と、標的細胞の非存在下で48時間インキュベートした。上清におけるIL-2、IFNγ、およびTNFαを、実施例（１２−２−２）に記載されるようなサイトカイン放出アッセイを用いて測定した。図３９に示すように、Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体は、PBMCからのIL-2、IFNγ、およびTNFαの放出をもたらし得るが、Ctrl/Dual-Fab抗体はもたらさない。80 nM Ctrl/Dual-Fab抗体は、80 nM Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約50％のIL-2濃度を示し、16 nMの抗体を用いた時には、10％未満のIL-2濃度が観察された。IFNγおよびTNFαについて言うと、Ctrl/Dual-Fab抗体は、各抗体濃度において、Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体でのものの10％未満のIL-2濃度を示した。
これらの結果は、Ctrl/CD137xCD3三重特異性形式が、標的細胞の非存在下でPBMCの非特異的活性化をもたらしたことを示唆する。最後に、データは、Dual-Fab形式が、オフターゲット毒性を伴わずに標的特異的エフェクター細胞活性化を付与できることを示した。
〔参考実施例〕
〔参考実施例１〕抗体発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
アミノ酸置換またはIgG変換を、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene Corp.）、PCR、またはIn fusion Advantage PCRクローニングキット（Takara Bio Inc.）等を用いて当業者に一般に公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを当業者に一般に公知の方法によって配列決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎がん細胞由来HEK293H株（Invitrogen Corp.）またはFreeStyle293細胞（Invitrogen Corp.）に一過性に導入し、抗体を発現させた。rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて当業者に一般に公知の方法によって、各抗体を得られた培養上清から精製した。精製抗体の濃度について、分光光度計を用いて280 nmで吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
〔参考実施例２〕抗ヒトおよび抗カニクイザルCD3ε抗体CE115の作製
（２−１）ヒトCD3を発現する細胞およびカニクイザルCD3を発現する細胞で免疫したラットを用いたハイブリドーマの作製
各SDラット（雌、免疫開始時6週齢、Charles River Laboratories Japan, Inc.）を、ヒトCD3εγまたはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞で以下の通り免疫した：0日目（初回免疫日を0日目と定義した）に、フロイント完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、ヒトCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。14日目に、フロイント不完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、カニクイザルCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。その後、1週間おきに合計4回、ヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞またはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞を5×107個、交互にラットに腹腔内投与した。CD3εγの最終投与1週間後（49日目）に、ブースターとしてヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞をラットに静脈内投与した。その3日後に、ラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞SP2/0とを、PEG1500（Roche Diagnostics K.K.）を用いた常法に従い融合した。融合細胞、すなわちハイブリドーマを、10％FBSを含むRPMI1640培地（以下、10％ FBS/RPMI1640と称す）中で培養した。
融合の翌日に、（１）融合細胞を半流動培地（Stemcell Technologies, Inc.）に懸濁した。ハイブリドーマを選択培養するとともに、コロニー化を実施した。
融合後9日目または10日目に、ハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10％ FBS/RPMI1640、2重量％ HAT 50×濃縮物（Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.）、および5重量％ BM-Condimed H1（Roche Diagnostics K.K.））を含む96-ウェルプレートに、1コロニー/ウェルで播種した。3〜4日の培養後、各ウェルの培養上清を回収し、培養上清中のラットIgG濃度を測定した。ラットIgGを含むことが確認された培養上清について、ヒトCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞またはヒトCD3εγを発現しない付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、ヒトCD3εγに特異的に結合する抗体を産生するクローンについてスクリーニングした（図40）。さらに、カニクイザルCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、サルCD3εγとの交差反応性についてもクローンを評価した（図40）。
（２−２）抗ヒトおよび抗サルCD3εキメラ抗体の作製
各ハイブリドーマ細胞から、RNeasy Mini Kits（Qiagen N.V.）を用いてトータルRNAを抽出し、SMART RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences）を用いてcDNAを合成した。作製したcDNAをPCRで用いて、抗体の可変領域遺伝子をクローニングベクターに挿入した。各DNA断片のヌクレオチド配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Inc.）およびDNAシーケンサーABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems, Inc.）を用いて、それに含まれる添付説明書に記載の方法に従い決定された。CE115 H鎖可変ドメイン（配列番号：113）およびCE115 L鎖可変ドメイン（配列番号：114）のCDRおよびFRは、Kabatナンバリングに従って決定された。
ヒト抗体IgG1鎖定常ドメインに連結させたラット抗体H鎖可変ドメインを含むキメラ抗体H鎖をコードする遺伝子、およびヒト抗体カッパ鎖定常ドメインに連結させたラット抗体L鎖可変ドメインを含むキメラ抗体L鎖をコードする遺伝子を、動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。作製した発現ベクターを用いて、CE115キメラ抗体の発現および精製を行った（参考実施例1）。
（２−３）EGFR_ERY22_CE115の作製
次に、がん抗原（EGFR）に対するIgGを基本骨格として用いて、一方のFabをCD3ε結合ドメインに置き換えた形の分子を作製した。この操作において、基本骨格とするIgGのFcとして、上述した場合と同様に、FcgR（Fcγ受容体）に対する結合活性が減弱されたサイレント型Fcを用いた。EGFR結合ドメインとして、セツキシマブの可変領域を構成するセツキシマブ-VH（配列番号：115）およびセツキシマブ-VL（配列番号：116）を用いた。抗体H鎖定常ドメインとして、C末端のGlyおよびLysを除去したIgG1に由来するG1d、D356KおよびH435Rの変異を導入したG1dに由来するA5、およびK439Eの変異を導入したG1dに由来するB3を用い、それぞれセツキシマブ-VHと組み合わせ、セツキシマブ-VH-G1d（配列番号：117）、セツキシマブ-VH-A5（配列番号：118）、およびセツキシマブ-VH-B3（配列番号：119）を参考実施例１の方法に従って作製した。抗体H鎖定常ドメインをH1と名づけた場合、可変ドメインとしてセツキシマブ-VHを持つ抗体のH鎖に対応する配列はセツキシマブ-VH-H1で表した。
この文脈において、アミノ酸の改変は、例えば、D356Kで表す。最初のアルファベット（D356KのDに該当）は、改変前のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。このアルファベットに続く数字（D356Kの356に該当）は、この改変残基のEUナンバリング位置を意味する。最後のアルファベット（D356KのKに該当）は、改変後のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。
EGFRに対するFabのVHドメインとVLドメインとの間の交換によって、EGFR_ERY22_CE115（図41）を作製した。具体的には、前述の方法と同様の方法で付加した適切な配列によるプライマーを用いて、PCR法等の当業者に一般に公知の方法により、EGFR ERY22_Hk（配列番号：120）、EGFR ERY22_L（配列番号：121）、CE115_ERY22_Hh（配列番号：122）、またはCE115_ERY22_L（配列番号：123）をコードする各ポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
発現ベクターは以下の組み合わせでFreeStyle 293-F細胞に導入され、各目的分子を一過性に発現させた：
・目的分子：EGFR_ERY22_CE115
・発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EGFR ERY22_Hk、EGFR ERY22_L、CE115_ERY22_Hh、およびCE115_ERY22_L。
（２−４）EGFR_ERY22_CE115の精製
得られた培養上清をAnti FLAG M2カラム（Sigma-Aldrich Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma-Aldrich Corp.）で溶出した。目的分子を含む画分をHisTrap HPカラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、イミダゾールの濃度勾配で溶出した。目的分子を含む画分を限外濾過によって濃縮した。その後、この画分をSuperdex 200カラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加した。単量体画分のみを溶出液から回収し、各精製目的分子を得た。
（２−５）ヒト末梢血単核球を用いた細胞傷害活性の測定
（２−５−１）ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の作製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5,000単位、Novo Nordisk A/S）を予め100μL充填した注射器を用いて、各健常人ボランティア（成人）から50 mLの末梢血を採取した。末梢血をPBS（-）で2倍希釈し、次いで4等分し、そして15 mLのFicoll-Paque PLUSを予め充填しかつ予め遠心操作を行ったLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227290、Greiner Bio-One GmbH）に加えた。該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分、室温）の後、単核球画分層が分取された。10％FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地（Sigma-Aldrich Corp.；以下10％FBS/D-MEMと呼ぶ）で単核球画分中の細胞を1回洗浄した。その後、該細胞を10％FBS/D-MEMで4×106細胞/mLの細胞密度に調整した。このように調製した細胞溶液を、ヒトPBMC溶液として以後の試験に用いた。
（２−５−２）細胞傷害活性の測定
細胞傷害活性は、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（Roche Diagnostics）を用いて、細胞増殖抑制率に基づいて評価された。標的細胞には、SK-HEP-1細胞株にヒトEGFRを強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株を用いた。SK-pca13aをディッシュから剥離し、100μL/ウェル（1×104細胞/ウェル）でE-Plate 96プレート（Roche Diagnostics）に播種し、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用いて生細胞のアッセイを開始した。翌日、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレートを取り出し、各濃度（0.004、0.04、0.4、および4 nM）に調整した各抗体50μLを該プレートに添加した。室温にて15分間反応させた後、前述の（2-5-1）で調製したヒトPBMC溶液50μL（2×105細胞/ウェル）をそれに加えた。このプレートをxCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに再セットし、生細胞のアッセイを開始した。反応は、5％CO2および37℃の条件下でヒトPBMCの添加の72時間後に行われた。細胞増殖抑制率（％）を下式によりセルインデックス値から決定した。抗体の添加直前のセルインデックス値を1として、それに対して正規化した後の数値を、この算出でセルインデックス値として用いた。
細胞増殖抑制率（％）＝（A−B）×100／（A−1）
式中、Aは、抗体を追加していないウェル（標的細胞およびヒトPBMCのみ）の平均セルインデックス値を表し、Bは、各抗体を追加したウェルの平均セルインデックス値を表す。試験は三連で実施した。
ヒト血液から調製したPBMCをエフェクター細胞として用いて、CE115を含むEGFR_ERY22_CE115の細胞傷害活性を測定した。結果として、極めて強い活性が確認された（図42）。
〔参考実施例３〕CD3および第２の抗原に結合する抗体の作製のための抗体改変
（３−１）第２の抗原に結合できるペプチドの挿入部位および長さの試験
一方の可変領域（Fab）を通じてがん抗原に結合することができかつもう一方の可変領域を通じて第１の抗原CD3および第２の抗原に結合することができるが、CD3および第２の抗原に同時に結合することができない、Dual binding Fab分子を取得するための試験を実施した。CD3ε結合抗体CE115の重鎖のループにGGSペプチドを挿入し、一方のFabにEGFR結合ドメインを持ちかつもう一方のFabにCD3結合ドメインを持つ各ヘテロ二量化抗体を参考実施例1に従って作製した。
具体的には、CDR2中のK52BとS52cとの間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/124/123）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：126）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/125/123）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：128）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE33 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/127/123）を作製した。同様に、FR3中のD72とD73との間（ループ）にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/129/123）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：126）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/130/123）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：128）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/131/123）を作製した。加えて、CDR3中のA99とY100との間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/132/123）、この位置にGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/133/123）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：120/121/134/123）を作製した。
（３−２）GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3εへの結合の確認
作製した各抗体のCD3εへの結合活性をBiacore T100を用いて確認した。ビオチン化CD3εエピトープペプチドをストレプトアビジンによってCM5チップに固定化し、作製した抗体をそれにアナライトとして注入し、その結合親和性を解析した。
その結果を表27に示す。CD3εに対するCE35、CE36、CE37、CE38、およびCE39の結合親和性は、親抗体であるCE115と同等であった。このことは、第２の抗原に結合するペプチドがこれらのループ中に挿入できることを示した。結合親和性は、GGSGGSGGSを挿入したCE36またはCE39では低下しなかった。このことは、これらの部位への少なくとも9アミノ酸までのペプチドの挿入はCD3εに対する結合活性に影響を与えないことを示した。
（表２７）
Figure 2021508441
これらの結果によって、このようなペプチド挿入CE115を用いて、第２の抗原に結合する抗体を取得することにより、CD3および第２の抗原に結合できるが、これらの抗原に同時には結合しない抗体を作製できることが示された。
この文脈において、挿入または置換で使用するためのペプチドのアミノ酸配列を、部位特異的変異誘発法（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1985）82, 488-492）またはオーバーラップ伸長PCR法などの当技術分野において公知の方法に従ってランダムに改変し、上述の方法に従って各改変体の結合活性等を比較して、アミノ酸配列の改変後であっても目的の活性を示すことのできる挿入または置換部位、ならびにこの部位のアミノ酸の種類および長さを決定することによって、ライブラリーを作製することができる。
〔参考実施例４〕CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のためのライブラリー設計
（４−１）CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のための抗体ライブラリー（Dual Fab Libraryとも呼ぶ）
第１の抗原としてCD3（CD3ε）を選択する場合、CD3（CD3ε）および任意の第２の抗原に結合する抗体を取得する方法の例として、以下の6つの方法が挙げられる：
１．第１の抗原に結合するFabドメインに第２の抗原に結合するペプチドまたはポリペプチドを挿入する工程を伴う方法（この方法には、WO2016076345A1の実施例３または４に示されたペプチド挿入、ならびにAngew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5; 52（32）: 8295-8に例示されるG-CSF挿入方法が含まれる）、ここで、結合するペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドを提示するライブラリーから取得されてもよく、または天然に存在するタンパク質の全体またはその一部を使用してもよい；
２．WO2016076345A1の実施例５で示されたような、Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
３．CD3に結合することが既知のFabドメインから部位特異的変異誘発法によって作製した抗体の使用によってCD3に対する結合活性を維持するアミノ酸を同定する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、同定されたアミノ酸が出現する抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
４．Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および指標として抗原に対する結合活性を用いることによって、抗体ライブラリーから任意の第２の抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程をさらに伴う3の方法；
５．糖鎖付加配列（例えば、NxSおよびNxT、式中、xはP以外のアミノ酸である）が出現するように抗体を改変し、糖鎖受容体が認識する糖鎖をそれに付加する（例えば、ハイマンノース型糖鎖をそれに付加することによって、ハイマンノース受容体によって認識される；ハイマンノース型糖鎖は抗体発現時にキフネンシンの添加によって得られることが公知である（mAbs. 2012 Jul-Aug; 4（4）: 475-87））工程をさらに伴う、1、2、3、または 4の方法；および
６．種々のアミノ酸に改変可能であると認められるループまたは部位にCys、Lys、または非天然アミノ酸を挿入することまたはこれらの部位をCys、Lys、または非天然アミノ酸と置換することによって、共有結合によりそれぞれが第２の抗原に結合するドメイン（ポリペプチド、糖鎖、またはTLRアゴニストに代表される核酸）をそれに付加する工程をさらに伴う1、2、3、または4の方法（この方法は、抗体薬物コンジュゲートに代表され、共有結合によるCys、Lys、または非天然アミノ酸への結合のための方法である（mAbs 6: 1, 34-45; January/February 2014; WO2009/134891 A2;およびBioconjug Chem. 2014 Feb 19; 25（2）: 351-61に記載されている））。
第１の抗原および第２の抗原に結合するが、これらの抗原に同時には結合しないDual binding Fabが、これらの方法のいずれかの使用によって得られ、当業者に一般に公知の方法、例えば、共通L鎖、CrossMab、またはFabアーム交換法によって、任意の第３の抗原に結合するドメイン（もう一方の可変領域と呼び、実施例1に記載されている）と組み合わせることができる。
（４−２）部位特異的変異誘発法を用いたCD3（CD3ε）結合抗体の1アミノ酸改変抗体の作製
CD3（CD3ε）結合抗体のテンプレート配列としてVHドメインCE115HA000（配列番号：135）およびVLドメインGLS3000（配列番号：136）を選択した。各ドメインを、参考実施例1により抗原結合に関与すると推定される部位でのアミノ酸改変に供した。また、pE22Hh（L234A、L235A、N297A、D356C、T366S、L368A、およびY407Vの改変、C末端のGK配列の欠失、ならびにDYKDDDDK配列（配列番号：161）の付加による天然IgG1 CH1およびそれ以降の配列に由来する配列；配列番号：137）をH鎖定常ドメインとして用い、カッパ鎖（配列番号：138）をL鎖定常ドメインとして用いた。改変部位を表28に示す。CD3（CD3ε）結合活性評価のために、各1アミノ酸改変抗体をワンアーム抗体（Fabドメインの1つを欠く天然に存在するIgG抗体）として取得した。具体的には、H鎖改変の場合、定常ドメインpE22Hhに連結させた改変H鎖、およびKn010G3（C220S、Y349C、T366W、およびH435Rの改変を有する216位からC末端までの天然に存在するIgG1アミノ酸配列；配列番号：139）をH鎖として用い、カッパ鎖に3'側で連結させたGLS3000をL鎖として用いた。L鎖改変の場合、カッパ鎖に3'側で連結させた改変L鎖をL鎖として用い、pE22Hhに3'側で連結させたCE115HA000、およびKn010G3をH鎖として用いた。これらの配列をFreeStyle 293細胞で発現させかつ精製した（参考実施例1の方法を利用した）。
（表２８）
Figure 2021508441
（４−３）CD3に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
（参考実施例4-2）で構築、発現および精製した各1アミノ酸改変体をBiacore T200（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて評価した。アミンカップリング法によって、適切な量のCD3εホモ二量体タンパク質をセンサーチップCM4（GE Healthcare Japan Corp.）の上に固定化した。次いで、適切な濃度を有する抗体をアナライトとしてそれにインジェクトし、センサーチップ上でCD3εホモ二量体タンパク質と相互作用させた。次いで、10 mmol/Lグリシン-HCl（pH 1.5）のインジェクトによって、センサーチップを再生した。アッセイを25℃で行い、HBS-EP+（GE Healthcare Japan Corp.）をランニングバッファーとして用いた。アッセイ結果から、アッセイにおいて得られた結合量およびセンサーグラムについてシングルサイクルカイネティックモデル（1:1 binding RI＝0）を用いて解離定数KD（M）を算出した。各パラメータをBiacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて算出した。
（４−３−１）H鎖の改変
表29は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000の結合量に対する各H鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、CE115HA000を含む抗体の結合量をXと定義し、H鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図43に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表30は、CE115HA000に対する各H鎖改変体の解離定数 KD（M）の比（＝CE115HA000のKD値/改変体のKD値）を示す。
表29に示されたZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
（表２９）
Figure 2021508441
（表３０）
Figure 2021508441
（４−３−２）L鎖の改変
表31は、対応する未改変の抗体であるGLS3000の結合量に対する各L鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、GLS3000を含む抗体の結合量をXと定義し、L鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図43に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表32は、GLS3000に対する各L鎖改変体の解離定数KD（M）の比を示す。
表31において示されるZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変抗体であるGLS3000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
（表３１）
Figure 2021508441
（表３２）
Figure 2021508441
（４−４）ECM（細胞外マトリックス）に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）は、細胞外構成成分であり、インビボで様々な部位に存在する。そのため、ECMに強く結合する抗体は、血中動態が悪くなる（半減期が短くなる）ことが知られている（WO2012093704 A1）。よって、ECM結合が増強されていないアミノ酸が、抗体ライブラリー中に出現するアミノ酸として選択されることが好ましい。
各抗体を、（参考実施例4-2）に記載された方法によりH鎖改変体またはL鎖改変体として取得した。次に、そのECM結合を参考実施例6の方法に従って評価した。各改変体のECM結合値（ECL反応）を、同一プレート内でまたは同一実施日に得られた抗体MRA（H鎖: 配列番号：140、L鎖: 配列番号：141）のECM結合値で割り、その結果生じる値を表33（H鎖）および34（L鎖）に示す。表33および34に示すように、いくつかの改変はECM結合を増強する傾向を有することが確認された。
表33（H鎖）および34（L鎖）に示す値のうち、複数の改変によるECM結合増強の作用を考慮し、10倍までを有効値としてDual Fab Libraryに採用した。
（表３３）
Figure 2021508441
（表３４）
Figure 2021508441
（４−５）ライブラリーの多様性を増強するためのペプチドの挿入部位および長さについての試験
参考実施例3は、CD3（CD3ε）への結合を失うことなく、GGS配列を用いてペプチドを各部位に挿入できることを示した。Dual Fab Libraryでループ延長が可能となれば、その結果生じるライブラリーはより多種類の分子を含み（またはより広範な多様性を有し）、多様な第２の抗原に結合するFabドメインの取得が可能になる可能性がある。したがって、ペプチド挿入を原因とする結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CD3εに対する結合活性を増強するV11L/D72A/L78I/D101Q改変をCE115HA000配列に加えて、pE22Hhにさらに連結させた。参考実施例3と同様に、この配列へのGGSリンカーの挿入によって分子を作製し、そのCD3結合を評価した。Kabatナンバリングで99位と100位との間にGGS配列を挿入した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。具体的には、上述のGGSリンカーを含むH鎖およびKn010G3（配列番号：139）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：138）に連結させたGLS3000（配列番号：136）をL鎖として採用した。これらの配列は、参考実施例1に従って発現および精製を行った。
（４−６）GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3に対する結合の確認
GGSペプチドを挿入した改変抗体のCD3εに対する結合を、参考実施例3に記載の方法によりBiacoreを用いて確認した。表35に示すように、結果は、ループにGGSリンカーを挿入できることが明らかにした。特に、GGSリンカーは、抗原結合に重要であるH鎖CDR3領域に挿入することができ、CD3εへの結合は、3、6、および9アミノ酸挿入のいずれの結果でも維持された。この試験はGGSリンカーを用いて実施されたが、GGS以外の種々のアミノ酸が出現する抗体ライブラリーも許容され得る。
（表３５）
Figure 2021508441
（４−７）NNSヌクレオチド配列を用いたH鎖CDR3への挿入についてのライブラリーの試験
（参考実施例4〜6）は、GGSリンカーを用いて3、6、または9アミノ酸を挿入できることを示し、3、6、または9アミノ酸の挿入を有するライブラリーを作製して、ファージディスプレイ法によって代表される通常の抗体取得法の使用によって第２の抗原に結合する抗体を取得できると推論した。よって、NNSヌクレオチド配列（全種類のアミノ酸の出現を可能にする）を用いて6アミノ酸挿入部位に種々のアミノ酸が出現する場合にも、CDR3への6アミノ酸の挿入がCD3への結合を維持できるかどうかについて試験を実施した。結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CE115HA000のものより高いCD3ε結合活性を有するCE115HA340配列（配列番号：144）のCDR3中の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸が挿入されるようにNNSヌクレオチド配列を用いて、プライマーを設計した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。具体的には、上述の改変H鎖およびKn010G3（配列番号：139）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：138）に連結させたGLS3000（配列番号：136）をL鎖として採用した。これらの配列を参考実施例1に従って発現および精製した。得られた改変抗体を、（参考実施例4〜6）に記載された方法によってその結合について評価した。結果を表36に示す。結果は、アミノ酸を延長した部位に種々のアミノ酸が出現した場合であっても、CD3（CD3ε）に対する結合活性が維持されることを明らかにした。表37は、参考実施例6に記載された方法により非特異的結合の増強の有無をさらに評価する結果を示す。結果として、CDR3の伸長したループに正電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸が多く含まれる場合に、ECMへの結合は増強された。したがって、正電荷を持つ側鎖を有する3個以上のアミノ酸がループ内に出現するべきではないことが望まれた。
（表３６）
Figure 2021508441
（表３７）
Figure 2021508441
（４−７）Dual Fab Libraryの設計および構築
参考実施例4に記載の試験に基づき、CD3および第２の抗原に結合する抗体を取得するための抗体ライブラリー（Dual Fab Library）を以下のように設計した：
ステップ１：CD3（CD3ε）への結合能を維持するアミノ酸を選択する（CD3への結合量がCE115HA000の80％以上を確保する）；
ステップ２：改変前と比較してMRAの10倍以内のECM結合を保持するアミノ酸を選択する；
ステップ３：H鎖CDR3内の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸を挿入する。
Fabの抗原結合部位は、ステップ１のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。Fabの抗原結合部位は、ステップ１および３のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。ステップ２を行わないライブラリー設計であっても、取得された分子をECM結合についてアッセイおよび評価することが可能である。
このように、Dual Fab Libraryでは、FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えかつ表38に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来する配列をH鎖として用い、表39に示すようにCDRを多様化することによるGLS3000に由来する配列をL鎖として用いた。これらの抗体ライブラリー断片は、当業者に一般に公知のDNA合成方法によって合成することができる。Dual Fab Libraryは、（1）H鎖が表38に示したように多様化され、L鎖が元の配列GLS3000または参考実施例4に記載されたCD3ε結合を増強させたL鎖に固定されているライブラリー、（2）H鎖が元の配列（CE115HA000）または参考実施例4に記載されたCD3ε結合を増強させたH鎖に固定され、L鎖が表39に示したように多様化されているライブラリー；および（3）H鎖が表38に示したように多様化され、L鎖が表39に示したように多様化されているライブラリーとして作製される可能性がある。FR（フレームワーク）にV11L/L78I 変異を加えかつ表38に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来するH鎖ライブラリー配列は、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託し、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。取得した抗体ライブラリー断片は、PCR法によって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入された。GLS3000をL鎖として選択した。構築したファージディスプレイ用ファージミドをエレクトロポレーションによって大腸菌に移入し、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を作製した。
表39に基づき、発明者らは、表40に示すようにGLS3000について新たな多様化ライブラリーを設計した。L鎖ライブラリー配列は、GLS3000に由来し、表40に示すように多様化した（DNAライブラリー）。DNAライブラリーはDNA合成会社によって構築された。次いで、種々のGLS3000由来配列を含むL鎖ライブラリーおよび種々のCE115HA000由来配列を含むH鎖ライブラリーをファージミドに挿入し、ファージディスプレイライブラリーを構築した。
（表３８）
Figure 2021508441
（表３９）
Figure 2021508441
（表４０）
Figure 2021508441
〔参考実施例５〕実験細胞株
当業者に周知の方法によって、ヒトGPC3遺伝子をマウス結腸がん細胞株CT-26（ATCC No. CRL-2638）の染色体に組み込み、高発現CT26-GPC3細胞株を取得した。製造者推奨の方法によってQIFIキット（Dako）を用いて、ヒトGPC3（2.3×105/細胞）の発現レベルを決定した。ヒトGPC3遺伝子を維持するために、これらの組換え細胞株を、CT26-GPC3用に200μg/mlでジェネティシン（GIBCO）を加えることによるATCC推奨培地中で培養した。培養後、2.5 g/Lトリプシン-1 mM EDTA（ナカライテスク）を用いて、これらの細胞を剥離し、次いで、各実験に用いた。
当業者に周知の方法によって、ヒトCD137遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-DG44の染色体に組み込み、高発現CHO-hCD137細胞株を取得した。製造者推奨の方法によってPE抗ヒトCD137（4-1BB）抗体（BioLegend, Cat. No. 309803）を用いて、ヒトCD137の発現レベルをFACS解析により決定した。
〔参考実施例６〕ECM（細胞外マトリックス）に対する抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）に対する各抗体の結合を、WO2012093704 A1を参照して以下の手法により評価した：ECMフェノールレッドフリー（BD Matrigel #356237）をTBSで2 mg/mLに希釈し、氷上で冷却したECLアッセイ用のプレート（L15XB-3、MSD K.K.、高結合）の各ウェルの中心に5μL/ウェルで液滴添加した。次いで、プレートをプレートシールで覆い、4℃で一晩静置した。ECM固定化プレートを室温に戻した。ECLブロッキングバッファー（0.5％BSAおよび0.05％Tween 20を追加したPBS）を150μL/ウェルでプレートに加え、プレートを室温で2時間以上または4℃で一晩静置した。次いで、各抗体サンプルをPBS-T（0.05％Tween 20を追加したPBS）で9μg/mLに希釈した。二次抗体をECLDB（0.1％BSAおよび0.01％Tween 20を追加したPBS）で2μg/mLに希釈した。20μLの抗体溶液および30μLの二次抗体溶液を、10μL/ウェルで分注したECLDBを含む丸底プレートの各ウェルに添加し、遮光しながら室温で1時間撹拌した。ECLブロッキングバッファーを、ECLブロッキングバッファーを含むECMプレートを反転させることによって除去した。このプレートに対して、前述の抗体および二次抗体の混合溶液を50μL/ウェルで添加した。次いで、プレートを、遮光しながら、室温で1時間静置した。プレートを反転させることによってサンプルを除去し、次いで、READバッファー（MSD K.K.）を150μL/ウェルでプレートに添加し、続いて、Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いてsulfo-tagの発光シグナルを検出した。
本発明は、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時に結合しない抗原結合ドメイン、およびそれを用いる方法を提供する。本発明によるそのような抗原結合ドメインを含む抗体結合分子は、医薬として、特に、様々な種類のがんを処置するのに有用である可能性がある。

Claims (15)

  1. CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、抗体可変領域；ならびに
    CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域
    を含む、抗原結合分子。
  2. 第３の抗原が、がん組織において特異的に発現している分子である、請求項１に記載の抗原結合分子。
  3. CD3とCD137に同時には結合しない可変領域が、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない可変領域である、請求項１または２に記載の抗原結合分子。
  4. 抗体Fc領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  5. 前記Fc領域が、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較してFcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項４に記載の抗原結合分子。
  6. 以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合分子：
    （１）可変領域が、配列番号：９１のアミノ酸配列を含むCD3εの細胞外ドメインに結合する、
    （２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
    （３）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化は誘導しない、および
    （４）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。
  7. CD137に対する結合について、以下からなる群より選択される抗体と競合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合分子：
    （a）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
    （b）配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５３のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
    （c）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５６のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、
    （d）配列番号：３０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：５８のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体、ならびに
    （e）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、抗体。
  8. 配列番号：９２に記載される重鎖可変ドメイン配列および／または配列番号：９３に記載される軽鎖可変ドメイン配列からなる鋳型配列中に1個または複数個のアミノ酸の改変を導入することによって生じたアミノ酸配列を含み、
    該1個または複数個のアミノ酸が、以下の位置：
    H鎖：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、および100g（Kabatナンバリング）；ならびに
    L鎖：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、および96（Kabatナンバリング）
    から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含み、
    改変された重鎖可変ドメイン配列のHVR-H3が、
    アミノ酸98位のAla、Pro、Ser、Arg、His、またはThr；
    アミノ酸99位のAla、Ser、Thr、Gln、His、またはLeu；
    アミノ酸100位のTyr、Ala、Ser、Pro、またはPhe；
    アミノ酸100a位のTyr、Val、Ser、Leu、またはGly；
    アミノ酸100b位のAsp、Ser、Thr、Leu、Gly、またはTyr；
    アミノ酸100c位のVal、Leu、Phe、Gly、His、またはAla；
    アミノ酸100d位のLeu、Phe、Ile、またはTyr；
    アミノ酸100e位のGly、Pro、Tyr、Gln、Ser、またはPhe；
    アミノ酸100f位のTyr、Ala、Gly、Ser、またはLys；
    アミノ酸100g位のGly、Tyr、Phe、またはVal（Kabatナンバリング）
    から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  9. （a）配列番号：４１、３０、４６、もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；
    （b）配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、５６、もしくは５７のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または
    （c）（a）のVH配列および（b）のVL配列
    を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
  11. 目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法であって、
    （a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
    （b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
    （c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
    （d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程
    を含み、
    工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない、方法。
  12. 前記抗原結合ドメインが、
    抗原結合ドメインと、該抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋するためにのスキャフォールドとを融合させることによって形成される、融合ポリペプチド
    である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記スキャフォールドがバクテリオファージである、請求項１２に記載の方法。
  14. 工程（b）と（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を翻訳することを含む工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記スキャフォールドが、リボソーム、RepAタンパク質、またはDNAピューロマイシンリンカーである、請求項１２または１４に記載の方法。
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