CN103435697A - 流感病毒的中和抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及流感病毒的中和抗体。本发明涉及鉴定、生产和设计针对甲型流感病毒的中和抗体的方法和手段，还涉及产生的中和抗体。特别是，本发明涉及针对各种甲型流感病毒亚型的中和抗体，例如包括针对H1、H2、H3、H5、H7和H9中两种或多种(例如所有H1、H2、H3和H5亚型)的中和抗体，还涉及用于制备所述抗体的方法和手段。更具体地，本发明涉及能够中和甲型流感病毒亚型的多于一种，优选所有的分离物的抗体。

Description

流感病毒的中和抗体
本申请是申请日为2007年05月15日、中国申请号为200780025877.4、发明名称为“流感病毒的中和抗体”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及鉴定、生产和设计(engineer)针对甲型流感病毒(influenza Aviruses)的中和抗体的方法和手段，还涉及产生的中和抗体。特别是，本发明涉及针对各种甲型流感病毒亚型的中和抗体，包括针对H1、H2、H3、H5、H7和H9中两种或更多种(例如所有H1、H2、H3和H5亚型)的中和抗体，还涉及用于制备所述抗体的方法和手段(means)。更具体地，本发明涉及能够中和多于一种，优选所有的甲型流感病毒亚型的分离物的抗体。
发明背景
流行性感冒(flu)是一种由流感病毒引起的传染性呼吸***疾病。其引起轻度至重度疾病，且有时可导致死亡。在美国，每年有5-20%人口感染流行性感冒，住院约200,000例，引起约36,000例死亡。
流感病毒在由咳嗽和喷嚏产生的呼吸飞沫(respiratory droplet)中传播，其通常在人与人之间传播。对流感表面抗原(特别是血凝素)的免疫力使感染的可能性和(如果感染发生)疾病的严重性减少。虽然流感疫苗是可用的，但因为针对一种类型流感病毒或亚型的抗体对另一种类型或亚型的流感赋予有限的保护或没有保护，所以有必要在每年的流感疫苗中并入一种或多种新菌株。
流感病毒是分段的负链RNA病毒(segmented negative-strand RNAviruses)，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)。甲型流感病毒由9种结构蛋白组成，且另外编码一种具有调节功能的非结构NS1蛋白。非结构NS1蛋白在生殖周期中大量合成，定位在受感染细胞的胞质溶胶(cytosol)和核中。病毒基因组的分段性质允许在细胞与不同病毒株混合感染期间发生遗传重排列(genetic reassortment)(基因组节段的交换)的机制。根据其表面上显示的不同血凝素(hemagglutinin)(HA)和神经氨酸酶(neuraminidase)(NA)病毒蛋白质，将甲型流感病毒进一步划分成不同亚型。
通过两种病毒表面糖蛋白，血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)，来鉴定甲型流感病毒亚型。每种流感病毒亚型通过其H和N蛋白质的组合来鉴定。存在16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。甲型流感病毒可感染人类、禽类、猪、马和其它动物，但野生鸟类是这些病毒的天然宿主。当前在人类中传播的仅是某些甲型流感亚型(即，H1N1、H1N2和H3N2)，但在禽类中(特别是野生水禽(wild waterfowl)和岸禽(shorebird)中)已经鉴定出16H和9NA亚型的所有组合。此外，有越来越多的证据表明H5和H7流感病毒也可引起人类疾病。
甲型流感病毒的HA包括两个结构上不同的区域，即球状头区(globularhead region)和干区(stem region)。球状头区包含受体结合部位，其负责病毒附着到靶细胞，并参与HA的血凝活性。干区包含融合肽，其对于病毒包膜和细胞的内体膜之间的膜融合是必要的，因而与融合活性有关(Wiley等,Ann.Rev.Biochem.,56:365-394(1987))。
大流行(pandemic)是指全球性疾病暴发。当新的甲型流感病毒有以下情况时，发生流感大流行：(1)在人群中出现对其有很少或没有免疫性，(2)开始引起严重的疾病，然后(3)很容易在世界各地人对人传播。在20世纪中，已有3次这样的流感大流行。第一次在1918年，“西班牙流感”流感大流行，造成在美国至少500,000人死亡，全世界高达4000万人死亡。这次大流行是由甲型流感H1N1亚型引起的。第二次在1957年，“亚洲流感”流感大流行，由甲型流感H2N2亚型引起，造成在美国至少70,000人死亡，全世界100-200万人死亡。最近地在1968年，“香港流感”流感大流行，由甲型流感H3N2亚型引起，导致美国大约34,000人死亡，全世界700,000人死亡。
1997年，香港报道了首例甲型流感H5N1病例。这是第一次这种禽类病毒直接感染人类，但没有产生大流行，因为没有观察到人对人的传播。
Lu等,Resp.Res.7:43(2006)(doi:10.1186/1465-992-7-43)报道，从用灭活的H5N1病毒接种的马制备抗-H5N1IgGs和H5N1-特异性F(ab’)2片段，其被描述用于保护以H5N1病毒感染的BALB/c小鼠。
Hanson等,Resp.Res.7:126(doi:10.1186/1465-9921-7-126)描述了特异于甲型流感H5病毒血凝素的嵌合单克隆抗体用于被动免疫小鼠的用途。
考虑到某些甲型流感病毒引起的呼吸系疾病的严重性，及潜在的大流行威胁，迫切需要有效的预防和治疗方法。本发明通过提供针对病毒各种H亚型的甲型流感中和抗体来满足这一需要，所述亚型包括但不限于甲型流感病毒的H1和H3亚型，以及H5亚型。本发明进一步提供能够中和给定的甲型流感病毒亚型的多于一种(优选全部)分离物(菌株)的抗体，所述分离物包括但不限于获自各种人类和非人类物种的分离物和来自各种流感流行和/或大流行的受害者和/或存活者的分离物。
可将所述中和抗体用于预防和/或治疗流感病毒感染，包括在流行或大流行的情况下受感染或有感染危险的人群的被动免疫。
发明内容
在一个方面，本发明涉及中和抗体，其中和甲型流感病毒亚型的多于一种分离物或者甲型流感病毒的多于一种亚型。
在一个实施方案中，所述抗体中和甲型流感病毒亚型的基本上所有分离物，如H5、H7和H9亚型的一种或多种。
在另一个实施方案中，所述抗体中和特定的甲型流感病毒亚型的多于一种分离物，如H5、H7和H9亚型的一种或多种分离物。
在又一个实施方案中，所述抗体中和甲型流感病毒的多于一种亚型和至少一种亚型的多于一种分离物。
在进一步的实施方案中，由本文的抗体所中和的至少一种亚型和/或分离物具有感染人类的能力。
在另一个实施方案中，至少一种分离物来自于禽类，包括例如野禽(wild-fowls)和家禽(chicken)。
在具体的实施方案中，本文的抗体中和甲型流感病毒的H5N1亚型。优选地，所述抗体中和该甲型流感病毒亚型的多于一种分离物，或者甚至更优选地，基本上所有分离物。
在另一个实施方案中，本文的抗体中和H5N1亚型和至少一种额外的选自下组的亚型：H1N1、H1N2和H3N2亚型。
在另外的实施方案中，本文的抗体中和额外的亚型的多于一种分离物，优选基本上所有分离物。
在另一个实施方案中，本发明的中和抗体结合H5蛋白。优选地，所述抗体结合H5蛋白的多于一种变体，或者甚至更优选地，H5蛋白的基本上所有变体。
在另外的实施方案中，本文的抗体与H5蛋白及至少一种额外的H蛋白，如H1、H2和/或H3蛋白结合。
在不同的方面，本发明涉及含有本文所述的中和抗体的组合物。
在进一步的方面，本发明涉及鉴定抗体的方法，所述抗体能够中和单个甲型流感病毒亚型的多于一种分离物或多个甲型流感病毒亚型。该方法包括在抗体文库中鉴定抗体(所述抗体与甲型流感病毒亚型的第一和第二分离物反应，或者与甲型流感病毒的第一和第二亚型反应)，以及使鉴定的抗体进行连续交替轮次的选择(successive alternating rounds of selection)(分别根据它们结合第一和第二分离物，或第一和第二亚型的能力)。
在一个实施方案中，已通过至少两轮单独的抗体富集(enrichment ofantibodies)(分别与第一分离物和第二分离物反应)鉴定了与第一和第二甲型流感病毒亚型分离物都反应的抗体，并重组经鉴定的抗体。
在另一个实施方案中，使可与第一和第二甲型流感亚型分离物都反应的抗体在进行分别根据其结合第一和第二分离物的能力的连续交替轮次的选择之前进行诱变。如果需要，可以根据其结合多于一种甲型流感亚型的能力额外选择能结合第一和第二分离物的抗体。
通常可以将所述富集技术的应用类似地应用于抗体，不管它们所结合的靶物(target)。本发明特别包括所述一般的富集/选择方法作为一部分。
在进一步的方面，本发明涉及由本发明的中和抗体所共享的序列的集合。
在还更进一步的方面，本发明涉及治疗受试者中甲型流感感染的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的中和抗体或抗体组合物。
在另一个方面，本发明涉及预防甲型流感感染的方法，其包括向处于发生甲型流感感染风险的受试者施用有效量的本发明的中和抗体。
在不同的方面，本发明涉及产生不同多功能抗体集合的方法，其包括：(a)比对至少两个功能上不同的抗体的CDR序列，(b)鉴定在比对的CDR序列之间保守的氨基酸残基，和(c)使用简并寡核苷酸探针，在至少一个比对的CDR序列中进行多个非保守氨基酸残基的诱变，所述探针编码至少在功能上不同的抗体中被诱变产生比对的CDR序列的多个变体的非保守位置存在的氨基酸残基，如果需要，用一个或多个变体重复步骤(b)和(c)，直到抗体集合达到所需程度的多样性和/或大小。
在具体的实施方案中，比对的CDR序列具有一样的长度。
在另一个实施方案中，保守的氨基酸残基被保留在至少两个比对的CDR序列中。
在进一步的方面，本发明涉及一种抗体集合，其包括多个在至少一种性质上彼此不同的中和抗体。
本发明进一步涉及独特地鉴定集合中核酸的方法，其包括用独特的条码标记核酸，所述条码连接于或并入所述集合中存在的核酸的序列中。
本发明涉及下述各项。
1.一种中和抗体，其中和甲型流感病毒亚型的多于一种分离物和/或甲型流感病毒的多于一种亚型。
2.项1的中和抗体，其中和甲型流感病毒H1亚型的多于一种分离物。
3.项1的中和抗体，其中和甲型流感病毒H3亚型的多于一种分离物。
4.项1的中和抗体，其中和甲型流感病毒H1和H3亚型。
5.项4的中和抗体，其中和甲型流感病毒H1和/或H3亚型的多于一种分离物。
6.项1的中和抗体，其中和甲型流感病毒亚型的基本上所有分离物。
7.项1或项6的中和抗体，其中所述亚型选自下组：H5、H7和H9亚型。
8.项7的中和抗体，其中所述亚型是H5亚型。
9.项8的中和抗体，其中所述抗体中和甲型流感病毒H5亚型的基本上所有分离物。
10.项7的中和抗体，其中所述亚型是H7亚型。
11.项10的中和抗体，其中所述抗体中和甲型流感病毒H7亚型的基本上所有分离物。
12.项7的中和抗体，其中所述亚型是H9亚型。
13.项12的中和抗体，其中所述抗体中和甲型流感病毒H9亚型的基本上所有分离物。
14.项7的中和抗体，其进一步中和甲型流感病毒的至少一种额外的H亚型。
15.项14的中和抗体，其中所述额外的H亚型选自下组：H1、H2和H3亚型。
16.项15的中和抗体，其中和所述甲型流感病毒的额外的H亚型的多于一种分离物。
17.项1的中和抗体，其中和甲型流感病毒的H5N1亚型。
18.项17的中和抗体，其中和甲型流感病毒的H5N1亚型的多于一种分离物。
19.项18的中和抗体，其中至少一种所述分离物具有感染人类的能力。
20.项19的中和抗体，其中至少一种所述分离物已从人类受试者获得。
21.项20的中和抗体，其中所述人类受试者是患病的。
22.项20的中和抗体，其中所述人类受试者从甲型流感病毒的H5N1亚型的感染中恢复。
23.项19的中和抗体，其中至少一种所述分离物已从非人动物获得。
24.项23的中和抗体，其中所述非人动物是禽类。
25.项24的中和抗体，其中所述非人动物是野禽。
26.项24的中和抗体，其中所述非人动物是家禽。
27.项18的中和抗体，其中和甲型流感病毒的H5N1亚型的基本上所有分离物。
28.项17的中和抗体，其中和H5N1亚型和选自下组的至少一种额外的亚型：H1N1、H2N2和H3N2亚型。
29.项28的中和抗体，其中和甲型流感病毒的H5N1亚型的多于一种分离物。
30.项29的中和抗体，其中和甲型流感病毒的H5N1亚型的基本上所有分离物。
31.项30的中和抗体，其中和所述额外的亚型的多于一种分离物。
32.项31的中和抗体，其中和所述额外的亚型的基本上所有分离物。
33.项1的中和抗体，其中所述抗体与H5蛋白结合。
34.项33的中和抗体，其中所述抗体与H5蛋白的多于一种变体结合。
35.项34的中和抗体，其中所述抗体与H5蛋白的所有变体结合。
36.项35的中和抗体，其中所述抗体与至少一种额外的H蛋白结合。
37.项36的中和抗体，其中所述额外的H蛋白选自下组：H1、H2和H3蛋白。
38.项37的中和抗体，其中所述抗体与所述额外的H蛋白的多于一种变体结合。
39.项38的中和抗体，其中所述抗体与所述额外的H蛋白的基本上所有变体结合。
40.一种组合物，其包含根据项1-39中任一项的中和抗体。
41.一种用于鉴定抗体的方法，所述抗体能够中和甲型流感病毒亚型的多于一种分离物或甲型流感病毒的多于一种亚型，该方法包括鉴定在抗体文库中与所述甲型流感病毒亚型的第一和第二分离物都反应的抗体或与所述甲型流感病毒亚型的第一和第二亚型反应的抗体，以及使鉴定的抗体经连续交替轮次的选择，分别基于它们结合所述第一和第二分离物，或所述第一和第二亚型的能力。
42.项41的方法，其包括至少两轮选择。
43.项41的方法，其中所述第一和第二分离物是所述甲型流感病毒H5N1亚型的不同分离物。
44.项41的方法，其中通过对分别与第一分离物和第二分离物反应的抗体的至少两轮单独富集，来鉴定所述与第一和第二甲型流感病毒亚型分离物都反应的抗体，并重组鉴定的抗体。
45.项41的方法，其中所述可与所述第一和所述第二甲型流感亚型分离物都反应的抗体在进行所述分别基于它们结合所述第一和第二分离物的能力的连续交替轮次的选择之前进行诱变。
46.项41的方法，其中所述抗体文库是噬菌体展示文库。
47.项46的方法，其中通过生物淘选进行选择。
48.项41的方法，其中所述甲型流感病毒亚型是H5N1亚型。
49.项48的方法，其中所述第一分离物是H5N1病毒的2006土耳其(Turkish)分离物。
50.项48的方法，其中所述第一分离物是H5N1病毒的2003/2004越南(Vietnam)分离物。
51.项48的方法，其中所述第二分离物是H5N1病毒的2003/2004越南(Vietnam)分离物。
52.项50的方法，其中所述第二分离物是H5N1病毒的1997香港(HongKong)分离物。
53.项48的方法，其中所述第一和所述第二分离物源于不同物种。
54.项53的方法，其中至少一种所述物种是人类。
55.项53的方法，其中至少一种所述物种是禽类。
56.项41的方法，其中所述能够结合所述第一和所述第二分离物的抗体是基于它们结合多于一种甲型流感亚型的能力而另外选择的。
57.一种序列的集合，所述序列由通过项41至56中任一项的方法鉴定的中和抗体共享。
58.一种序列的集合，所述序列包含图11、图12、图13和图14A至14D中所示的一种或多种独特的重链和/或轻链序列或者基于所述序列的共有序列或变体序列。
59.一种可通过项41至56中任一项的方法鉴定的中和抗体或其片段。
60.项59的中和抗体或其片段，其包含选自图11、图12、图13和图14A至14D中所示的独特序列的重链和/或轻链序列或者基于所述序列的共有序列或变体序列。
61.项59或项60的中和抗体或抗体片段，其能够赋予禽类或哺乳动物受试者针对甲型流感病毒感染的被动免疫。
62.项61的中和抗体或抗体片段，其中所述哺乳动物受试者是人。
63.项62的中和抗体或抗体片段，其中所述甲型流感病毒感染是由选自下组的病毒引起的：H5N1、H1N1、H2N2和H3N2亚型。
64.一种用于预防和/或治疗受试者中甲型流感感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的项40的组合物。
65.一种用于治疗受试者中甲型流感感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的项59的中和抗体。
66.项64或项65的方法，其中所述受试者是人类患者。
67.一种用于预防甲型流感感染的方法，其包括向有发生甲型流感感染风险的受试者施用有效量的项40的组合物。
68.一种用于预防甲型流感感染的方法，其包括向有发生甲型流感感染风险的受试者施用有效量的项59的中和抗体。
69.项67或项68的方法，其中所述受试者是人类患者。
70.一种用于产生不同多功能抗体集合的方法，其包括(a)比对至少两个功能上不同的抗体的CDR序列，(b)鉴定在比对的CDR序列之间保守的氨基酸残基，和(c)使用简并寡核苷酸探针，在至少一个比对的CDR序列中进行多个非保守氨基酸残基的诱变，所述探针编码至少在功能上不同的抗体中在经诱变产生比对的CDR序列的多个变体的非保守位置存在的氨基酸残基，并且，如果需要，用一个或多个所述变体重复步骤(b)和(c)，直到所述抗体集合达到所需程度的多样性或大小。
71.项70的方法，其中比对的CDR序列具有一样的长度。
72.项70的方法，其中步骤(c)中产生的经诱变的变体保留所有在至少两个比对的CDR序列中存在的保守残基。
73.项70的方法，其中步骤(c)中产生的经诱变的变体保留所有在所有比对的CDR序列中存在的保守残基。
74.项70的方法，其中所述功能上不同的抗体与靶抗原上的不同表位结合。
75.项70的方法，其中所述功能上不同的抗体与不同靶抗原结合。
76.项75的方法，其中所述不同靶抗原是相同抗原的变体。
77.项70的方法，其中所述功能上不同的抗体具有不同的结合亲合力。
78.项70的方法，其中所述功能上不同的抗体具有不同的生物学性质。
79.项70的方法，其中所述功能上不同的抗体与甲型流感病毒结合。
80.项79的方法，其中至少两种所述功能上不同的抗体与相同甲型流感病毒上的不同表位结合。
81.项79的方法，其中所述功能上不同的抗体与不同甲型流感病毒亚型结合。
82.项79的方法，其中至少两种所述功能上不同的抗体与相同甲型流感病毒亚型的不同分离物结合。
83.项79的方法，其中至少两种所述功能上不同的抗体与相同甲型流感病毒亚型的不同分离物和不同甲型流感病毒亚型结合。
84.项70至83中任一项的方法，其中至少两种所述功能上不同的抗体具有不同的结合亲合力。
85.项70至83中任一项的方法，其中至少两种所述功能上不同的抗体在它们中和其所结合的甲型流感病毒的能力上不同。
86.一种抗体集合，其包含在至少一种性质上相互不同的多个中和抗体。
87.项86的抗体集合，其包含至少约100个中和抗体。
88.项87的抗体集合，其由项70至83中任一项的方法制备。
89.一种用于独特地鉴定集合中的核酸的方法，其包括用独特的条码标记所述核酸，所述条码连接于或整合入所述集合中存在的核酸的序列中。
90.项89的方法，其中所述条码是长度为1个至约24个核苷酸的非编码核苷酸序列。
91.项90的方法，其中所述非编码核苷酸序列连接于标记的核酸序列的3′非编码区。
92.项89的方法，其中所述条码是整合入标记的核酸序列中的一个或多个沉默突变的编码序列。
93.项89的方法，其中所述条码是肽或多肽序列。
附图简述
图1A至1J显示15种已知的血凝素(H)蛋白质亚型的氨基酸序列。
图2显示典型的淘选富集流程图，用于增加对两个不同靶(A和B)的反应强度。每一轮富集增加库(pool)对各靶的反应强度。
图3显示用于选择与靶A和靶B交叉反应的克隆的策略，其中每个连续轮增强所得的库对两个靶的反应强度。
图4显示用于增加对两个不同靶(靶A和靶B)反应强度的策略，通过重组平行发现库(parallel discovery pool)以产生/增加交叉反应性。重组抗体文库的每轮选择增加所得的库对两个靶的反应强度。
图5显示用于增加对靶B的交叉反应性而维持对靶A的反应性的策略。首先，选择与靶A反应的克隆，然后制备与靶A反应的克隆的诱变文库，如所示进行选择，得到显示与靶A和靶B强反应性的一个或多个抗体克隆。
图6显示代表性的诱变方法，用于通过“目的诱变(destinationalmutagenesis)”方法产生不同的多功能抗体集合。
图7显示获自土耳其(Turkish)H5N1禽流感暴发的6名人类存活者的血样的H5血凝素(HA)血清学结果。数据表明存在针对HA抗原的抗体。
图8显示用12名当地供者的血清样本得到的血清学结果，对H5抗原(A/Vietnam(越南)/1203/2004)以及H1N1(A/New Caledonia(新喀里多尼亚)/20/99)和H3N2(A/Panama(巴拿马)/2007/99)病毒进行试验。
图9显示在抗体噬菌体文库构建中使用的独特的条码方法(barcodingapproach)。
图10显示获自土耳其禽流感存活者的汇合文库(pooled library)的5个不同克隆的对H5蛋白和H5N1病毒的scFv ELISA试验结果。
图11显示序列比对，比较来自报道的土耳其分离物的H5血凝素蛋白质的序列和从洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Laboratory)序列数据库下载的一种越南(Vietnamese)分离物。
图12和图13显示在土耳其供者的汇合抗体文库中鉴定的独特克隆的重链可变区序列，连同相应的轻链和种系起源序列(germline origin sequences)。图12显示的序列(3-23个重链克隆)源于3轮淘选后所有土耳其供者所有重链和轻链的汇合文库。图13显示的序列(3-30个重链克隆)源于两轮淘选后所有土耳其供者所有重链和轻链的汇合文库。
图14A至14D显示经4轮淘选后，从各土耳其供者的抗体文库鉴定的额外的独特H5N1特异性抗体重链可变区序列。
图15和图16显示使用目的诱变创建不同的抗体重链和轻链文库，利用通过分析土耳其禽流感存活者血清和骨髓而鉴定的抗体重链(图15)和轻链(图16)序列。
图17和图18显示ELISA结果，证实某些获自H5N1越南病毒scFv抗体的Fab片段与HA蛋白的土耳其和印尼(Indonesian)变体的交叉反应性。
发明详述
A.定义
除非另外限定，本文使用的技术术语和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,NY1994)为本领域技术人员提供许多用于本申请中的术语的一般指导。
本领域技术人员将认识到与本文所述类似或等同的许多方法和材料，这些方法和材料可用于实施本发明。实际上，本发明绝不限于所述的方法和材料。就本发明而言，下列术语定义如下。
术语“甲型流感亚型”或“甲型流感病毒亚型”可互换使用，指的是甲型流感病毒变体，其特征在于血凝素(H)和神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白质的各种组合，因此通过H数和N数的组合来标记，例如H1N1和H3N2。所述术语特别包括各亚型内的所有菌株(strain)(包括灭绝的菌株)，其通常由突变产生并显示不同的病原谱(pathogenic profile)。所述菌株还称为病毒亚型的不同“分离物”，包括所有过去、现在和将来的分离物。因此，在上下文中，可互换使用术语“菌株”和“分离物”。
术语“流行性感冒(流感)”用来指由流感病毒引起的传染性疾病。
在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)以最广义使用，并包括对特定抗原显示结合特异性的多肽以及免疫球蛋白和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种多肽例如由淋巴***以低水平产生，和由骨髓瘤以增加的水平产生。在本申请中，术语“抗体”具体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过共价二硫键与重链连接，但不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键数目不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变区(VH)，随后是许多恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)，在其另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区对齐，而轻链可变区与重链的可变区对齐。人们相信，特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变区之间的界面，Chothia等,J.Mol.Biol.186:651(1985);Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592(1985)。
关于抗体链的术语“可变的”用来指抗体链的部分，其在抗体中在序列上大量不同，并参与每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。所述变异性集中在轻链和重链可变区中称为高变区(hypervariable region)的3个部分中。可变区保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采取β-折叠构型，由3个高变区连接，其形成环状连接(并在某些情况下形成部分的)β-折叠结构。每条链中的高变区通过FR紧密相邻地结合在一起，并与来自其它链的高变区结合，促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991),pages647-669)。在抗体与抗原的结合中不直接涉及恒定区，但其显示多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞毒性作用中抗体的参与。
当在本文使用时，术语“高变区”指的是负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基30-36(L1)、46-55(L2)和86-96(L3)以及重链可变区中的30-35(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)；MacCallum等.J Mol Biol.1996.)。“框架”或“FR”残基是那些如本文定义的除高变区残基之外的可变区残基。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体归为不同种类。有5种主要类别的抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，可将其中几种进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
相应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。
基于其恒定区的氨基酸序列，可将来自任意脊椎动物物种的抗体的“轻链”归为两种显然不同的类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、单链抗体分子、双特异抗体(diabody)和多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”用来指由B细胞的单个克隆合成的抗体分子。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，不应解释成需要通过任意特定方法产生抗体。因而，可通过由Kohler和Milstein,Nature256:495(1975);Eur.J.Immunol.6:511(1976)首次描述的杂交瘤方法，用重组DNA技术制备单克隆抗体，或者也可从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
术语“多克隆抗体”用来指由B细胞群体合成的抗体分子的群体。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL区之间进一步包括多肽接头，其使得sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述参见Plückthun于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。单链抗体在例如WO88/06630和WO92/01047中公开。
术语“双特异抗体”指的是有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括重链可变区(VH)，其连接到相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变区(VL)。通过使用接头(其太短以至于不能允许在相同链上两个区域之间配对)，所述区域被迫与另一链的互补区配对，并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更全面地描述双特异抗体。
术语“双特异性抗体(bispecific antibody)”指的是对两种不同类型抗原显示特异性的抗体。如本文使用的术语具体包括但不限于显示对靶抗原和对有利于传递到特定组织的其它靶物的结合特异性的抗体。类似地，多特异性抗体具有两种或多种结合特异性。
词语“线性抗体”用来指包括一对串连的Fd段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单一特异性的，例如由Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)描述。
术语“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制流感病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点。还可以通过定向到病毒体(virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集。可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)，抑制来自受感染细胞的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。
术语“抗体谱(antibody repertoire)”在本文中以最广义使用，指的是抗体或抗体片段的集合，所述抗体或抗体片段可用于筛选特殊的性质，如结合能力、结合特异性、胃肠道转运能力、稳定性、亲和性等。该术语具体包括抗体文库，例如包括所有形式的组合库，例如抗体噬菌体展示文库，包括但不限于来自任何来源的单链Fv(scFv)和Fab抗体噬菌体展示文库，包括未免疫的
Figure BDA00003402909100141
、合成和半合成文库。
“噬菌体展示文库”是蛋白质表达文库，其将克隆的蛋白质序列集合表达为与噬菌体外壳蛋白的融合物。因而，短语“噬菌体展示文库”在本文指的是噬菌体(例如丝状噬菌体)的集合，其中所述噬菌体表达外部(external)(通常为异源)蛋白质。外部蛋白质自由地与和噬菌体接触的其它部分相互作用(结合)。每种展示外部蛋白质的噬菌体都是噬菌体展示文库的“成员”。
“抗体噬菌体展示文库”指的是展示抗体或抗体片段的噬菌体展示文库。抗体文库包括噬菌体群体或编码所述噬菌体群体的载体的集合，或者携带所述噬菌体或载体集合的细胞。该文库可以是单价的，每个噬菌体颗粒平均展示一个单链抗体或抗体片段，或者是多价的，每个病毒颗粒平均展示两个或更多个抗体或抗体片段。术语“抗体片段”包括但不限于单链Fv(scFv)片段和Fab片段。优选的抗体文库包括平均超过106，或超过107，或超过108，或超过109个不同成员。
术语“丝状噬菌体”指的是能够在其表面展示异源多肽的病毒颗粒，包括但不限于f1、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可以包含选择性标记，如四环素(例如“fd-tet”)。各种丝状噬菌体展示***是本领域技术人员众所周知的(参见例如Zacher等,Gene9:127-140(1980)，Smith等,Science228:1315-1317(1985)；及Parmley和Smith,Gene73:305-318(1988))。
术语“淘选(panning)”用来指在对承载(carry)对靶点有高亲和性和特异性的化合物(例如抗体)的噬菌体的鉴定和分离中的多轮筛选过程。
如本文使用的术语“非人动物”例如包括但不限于哺乳动物，如非人类灵长类(primates)、啮齿类(rodents)(例如小鼠和大鼠)以及非啮齿类动物如兔(rabbits)、猪(pigs)、绵羊(sheep)、山羊(goats)、牛(cows)、猪(pigs)、马(horses)和驴(donkeys)。其还包括禽类(birds)(例如鸡(chickens)、火鸡(turkeys)、鸭(ducks)、鹅(geese)等)。如本文使用的术语“非灵长类动物”指的是除了灵长类外的哺乳动物，包括但不限于上面具体列出的哺乳动物。
短语“功能上不同的抗体”及其语法变体用来指在至少一种性质上彼此不同的抗体，包括但不限于结合特异性、结合亲合力和任何免疫学或生物学功能，如中和靶物的能力、生物活性的程度或质量等。
短语“保守的氨基酸残基”用来指在彼此对齐的两个或更多个氨基酸序列之间相同的氨基酸残基。
B．通用技术
用于执行本发明的方法的技术是本领域众所周知的，在标准实验室教科书中描述，所述教材包括例如Ausubel等,Current Protocols of MolecularBiology,John Wiley and Sons(1997)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,J.Sambrook和D.W.Russell编,Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；Antibody Phage Display:Methods and Protocols,P.M.O’Brian和R.Aitken编,Humana Press,于:Methods inMolecular Biology,Vol.178；Phage Display:A Laboratory Manual,C.F.BarbasIII等编,Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001；以及Antibodies,G.Subramanian编,Kluwer Academic,2004。例如，可以使用定点诱变来进行诱变(Kunkel等,Proc.Natl.Acad.Sci USA82:488-492(1985))。
在以下的说明中，参考某些类型的抗体文库说明本发明，但本发明不限于使用任何特定类型的抗体文库。重组单克隆抗体文库可以基于免疫片段或未免疫片段
Figure BDA00003402909100161
来自免疫抗体文库的抗体通常用VH和VL基因库构建，将所述VH和VL基因库从源B细胞克隆至适当的载体表达以产生随机组合库，其随后可被选择和/或筛选。其它类型的文库可以包括来自对与抗原结合的克隆不明显存在偏好的基因来源的抗体片段。因而，天然抗体文库源于天然的、非免疫的、重排的V基因。合成的抗体文库完全通过体外方法构建，将完全或特定简并的区域引入一个或多个V基因的CDR。半合成文库组合天然的和合成的多样性，经常创建半合成文库以增加天然多样性并维持所需水平的功能多样性。因而，所述文库可以例如通过改组天然的CDR区而创建(Soderlind等,Nat.Biotechnol.18:852-856(2000))，或者通过将来自人B细胞的天然重排的CDR序列与合成的CDR1和CDR2多样性组合而创建(Hoet等,Nat.Biotechnol.23:455-38(2005))。本发明包括未免疫的、合成的和半合成的抗体文库，或其任何组合的使用。
同样地，本发明的方法不受任何用于抗体展示的特定技术所限制。尽管参考噬菌体展示说明本发明，但是本发明的抗体也可用其它展示和富集技术来鉴定，例如核糖体或mRNA展示(Mattheakis等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026(1994)；Hanes和Pluckthun,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4937-4942(1997))、微生物细胞展示如细菌展示(Georgiou等,NatureBiotech.15:29-34(1997))或酵母细胞展示(Kieke等,Protein Eng.10:1303-1310(1997))、在哺乳动物细胞上展示、芽孢展示、病毒展示如逆转录病毒展示(Urban等,Nucleic Acids Res.33:e35(2005)、基于蛋白质-DNA连锁(protein-DNA linkage)的展示(Odegrip等,Proc.Acad.Natl.Sci.USA101:2806-2810(2004)；Reiersen等,Nucleic Acids Res.33:e10(2005))，以及微珠展示(Sepp等,FEBS Lett.532:455-458(2002))。
在核糖体展示中，通过核糖体连接抗体和编码mRNA，使核糖体在翻译mRNA的末端停止，不释放多肽。选择总体上是基于三元复合体。
在mRNA展示文库中，用嘌呤霉素(puromycin)在抗体和编码mRNA之间建立共价键，用作衔接分子(Wilson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750-3755(2001))。关于该技术用于展示抗体，参见例如Lipovsek和Pluckthun,J.Immunol.Methods.290:51-67(2004)。
微生物细胞展示技术包括在酵母上表面展示，所述酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Boder和Wittrup,Nat.Biotechnol.15:553-557(1997))。因而，举例来说，可通过与α-凝集素酵母粘着受体(α-agglutinin yeastadhesion receptor)(其定位在酵母细胞壁上)融合将抗体展示在酿酒酵母(S.cerevisiae)的表面上。该方法提供通过流式细胞术选择谱的可能性。通过用荧光标记的抗原和抗-表位标记试剂将细胞染色，可根据细胞表面上抗原结合和抗体表达的水平来将酵母细胞分类。也可将酵母展示平台与噬菌体组合(参见例如Van den Beucken等,FEBS Lett.546:288-294(2003))。
关于选择和筛选抗体文库技术的综述，参见例如Hoogenboom,NatureBiotechnol.23(9):1105-1116(2005)。
C.优选实施方案的详细说明
本发明涉及中和甲型流感亚型的多于一种菌株(分离物)(包括灭绝的菌株的分离物)的单克隆抗体以及针对多于一种甲型流感亚型(包括特征为存在H5血凝素的亚型)的中和抗体的选择、生产和使用。在具体的实施方案中，本发明涉及中和多于一种甲型流感亚型和/或一种或多种亚型的多于一种分离物，或多于两种分离物，或多于三种分离物，或多于四种分离物，或多于五种分离物等，最优选所有分离物的单克隆抗体的选择、生产和使用。
甲型流感病毒的病毒体包含8个线性负义单链RNA区段。总基因组长度为13600个核苷酸，而所述8个区段长度分别为2350个核苷酸；2350个核苷酸；2250个核苷酸；1780个核苷酸；1575个核苷酸；1420个核苷酸；1050个核苷酸；和900个核苷酸。甲型流感病毒的宿主特异性和减毒作用已归因为病毒血凝素(H,HA)、核蛋白(NP)、基质(M)，以及非结构(NS)基因单独或与病毒基因结合(参见例如Rogers等,Virology 127:361-373(1983)；Scholtissek等,Virology 147:287-294(1985)；Snyder等,J.Clin.Microbiol.24:467-469(1986)；Tian等,J.Virol.53:771-775(1985)；Treanor等,Virology171:1-9(1989)。
甲型流感病毒和它们的表面蛋白(包括血凝素和神经氨酸酶蛋白)的核苷酸和氨基酸序列可以从GenBank和其它序列数据库得到，所述其它数据库例如由洛斯阿拉莫斯国家实验室理论生物学与生物物理学研究组(Theoretical Biology and Biophysics Group of Los Alamos National Laboratory)维护的流感序列数据库(Influenza Sequence Database)。甲型流感病毒血凝素15种已知的H亚型(H1-H15)的氨基酸序列示于图1A至1J(SEQ ID NOS:1-15)。最近从瑞典红嘴鸥(black-headed gulls)分离到另外一种甲型流感病毒血凝素亚型(H16)，并由Fouchier等,J.Virol.79(5):2814-22(2005)报道。每种H亚型的各种各样的菌株也是已知的。例如，图1A至1J中命名为H5A/HongKong/156/97的HA蛋白的序列是由1997年5月在香港从人分离的甲型流感H5N1病毒确定的，显示其与Suarez等,J.Virol.72:6678-6688(1998)中获自其它相关H5N1分离物的几种另外的菌株序列相比较。
流感病毒神经氨酸酶的催化位点和抗原位点的结构已由Colman等,Nature 303:41-4(1983)公开，神经氨酸酶序列可从GenBank和其它序列数据库得到。
已知由受感染个体的免疫应答产生的病毒特异性抗体通常通过与病毒血凝素相互作用从而中和病毒(Ada等,Curr.Top.Microbiol.Immunol.128:1-54(1986)；Couch等,Annu.Rev.Micobiol.37:529-549(1983))。已经确定并公开了流感病毒血凝素的三维结构和流感病毒血凝素与中和抗体之间的复合物的晶体结构，参见例如Wilson等,Nature289:366-73(1981)；Ruigrok等,J.Gen.Virol.69(Pt 11):2785-95(1988)；Wrigley等,Virology 131(2):308-14(1983)；Daniels等,EMBO J.6:1459-1465(1987)；和Bizebard等,Nature376:92-94(2002)。
根据本发明，从一种或多种抗体文库鉴定出具有所需性质的抗体，所述抗体文库可来自于许多种来源并且可以是不同类型的。
综合(comprehensive)人类流感抗体文库
可以由从各种先前发生的流感、季节性暴发流行和大流行(包括1968香港流感(H3N2)、1957亚洲流感(H2N2)、1918西班牙流感(H1N1)和2004/2005禽流感(H5N1))康复者获得的抗体来创建综合人类流感抗体文库。为了制备所述文库，从已知或怀疑已受流感病毒感染的个体收集血液或骨髓样品。外周血样品(特别是来自地理上远距离来源的外周血样品)在运输和使用之前可能需要使之稳定化。为此目的的试剂盒是众所周知的且在商业上可得到，例如BD
Figure BDA00003402909100191
CPTTM细胞制备管可用于离心纯化淋巴细胞，胍、Trizol或RNAlater用于稳定样品。一旦得到稳定化的淋巴细胞或全骨髓，利用本领域已知的免疫球蛋白寡聚引物进行RT-PCR以挽救(rescue)重链和轻链谱。根据本领域已知的方法，将PCR谱产物与接头寡聚物组合以产生scFv文库，在与m13pIII蛋白质相应的框中(in frame with)直接克隆。
在通常的方案中，可用众所周知的血清学试验来检测人血清中的抗体，包括例如用众所周知的血凝素抑制(HAI)试验(Kendal,A.P.,M.S.Pereira和J.J.Skehel.1982.Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.U.S.Department of Health and Human Services,Public HealthService,Centers for Disease Control,Atlanta,Georgia)，或者微量中和试验(Harmon等,J.Clin.Microbiol.26:333-337(1988))。如果已经确认血清样品包含流感中和抗体，则该检测步骤可能不是必要的。接着用本领域已知的方法处理来自全血的淋巴细胞或骨髓中存在的淋巴细胞。用Tri BD试剂(Sigma)从新鲜的或RNAlater稳定化的组织提取总RNA。随后，用Oligotexpurification(Qiagen)将分离的供体总RNA进一步纯化为mRNA。接着，根据AccuScript反转录酶(Stratagene)的规程，使用随机的九聚体寡核苷酸和或寡聚(dT)18(oligo(dT)18)引物产生第一链cDNA合成。简言之，将100ng mRNA、0.5mM dNTPs和300ng随机的九聚物和或500ng寡聚(dT)18引物在Accuscript RT缓冲液(Stratagene)中于65℃温育5分钟，之后迅速冷却至4℃。然后，向每个反应中加入100mM DTT、Accuscript RT和RNAse Block，于42℃温育1小时，通过在70℃加热15分钟灭活反转录酶。获得的cDNA可用作抗体重链和轻链V基因RT-PCR扩增的模板，然后可将其克隆入载体，或者，如果噬菌体展示文库是预期的，则将其克隆入噬菌粒载体。该步骤产生抗体重链和轻链可变区克隆的谱(VH和VL文库)，其可以根据筛选目的保持分离或组合。
可用类似于上述的方式恢复、稳定和挽救来自较早的流行或大流行(如1918西班牙流感)存活者的外周淋巴细胞的免疫球蛋白谱。对于另外的H1和H3文库，可以从适当时间接种的当地来源的供者回收谱。作为一种额外的选择，可以从商业来源购买商业上可得到的骨髓总RNA或mRNA，以产生适合H1和H3抗体筛选的文库，根据供者的背景也适用于H2抗体筛选。
通用抗体文库(UAL)—合成的人-样谱
在本发明的方法中，可以用通用抗体文库代表合成的人源抗体谱，所述通用抗体文库可以用本领域已知的方法制备或由商业来源获得。因而，举例来说，在2003年12月11日公开的美国专利申请公开号20030228302中，描述了通用免疫球蛋白文库，包括所述文库的亚类，其全部公开内容由此通过引用明示地(expressly)并入本文。简言之，该专利公开描述感兴趣的原型免疫球蛋白的文库，其中单个预定的氨基酸已在感兴趣的免疫球蛋白的一个或多个互补决定区中一个或多个位点被取代。所述文库的亚类包括突变的免疫球蛋白，其中预定的氨基酸已在免疫球蛋白的6个互补决定区的一个或多个中的一个或多个位点以所有可能的组合被置换。所述突变可以例如通过走查突变(walk-through mutagenesis)产生，如美国专利Nos.5,798,208、5,830,650、6,649,340和美国专利申请公开号20030194807中所述，它们的全部公开内容由此通过引用明示地并入本文。在走查突变中，产生免疫球蛋白文库，其中单个预定的氨基酸至少一次被并入免疫球蛋白中感兴趣的一个限定的区域或几个限定的区域的每个位点，例如并入免疫球蛋白的一个或多个互补决定区(CDRs)或框架(FR)区。产生的突变的免疫球蛋白与原型免疫球蛋白不同，因为它们具有并入免疫球蛋白的一个或多个区域(例如CDRs或FR区)内一个或多个位点的单个预定的氨基酸，代替原型免疫球蛋白中相同的一个位点或多个位点存在的“天然的”或“野生型”氨基酸。突变的免疫球蛋白的组包括感兴趣的限定区域的每个位点的各突变免疫球蛋白；因而，对于感兴趣的限定区域(例如CDR或FR)中每个位点，每个突变的免疫球蛋白或者具有在原型免疫球蛋白中发现的氨基酸，或者具有预定的氨基酸，且所有突变的免疫球蛋白的混合物包含所有可能的变体。
可将有各种突变的抗体重链和轻链的特定子文库组合，从而为本发明的抗体提供框架构建体，之后在重链和轻链的CDRs中都引入多样性。该多样性可以通过本领域已知的方法实现，例如通过Kunkel诱变(Kunkelmutagenesis)，为了进一步增加多样性，可将其重复几次。因此，举例来说，可以通过多轮Kunkel诱变，将多样性分别或同时引入重链和轻链CDR1和CD2区域。如果需要，可以根据CDR长度分离各种Kunkel克隆，和/或可以例如通过用模板特异性限制酶消化来移除靶向CDR(例如CDR1或CDR3)中缺乏多样性的克隆。这些步骤一旦完成，文库的大小应该超过约109个成员，但有更少成员的文库也是有用的。
在具体的实施方案中，免疫抗体文库和通用抗体文库都被用于鉴定本发明的中和抗体。这两种类型的文库从根本上不同。根据具体情况，通用抗体文库是具有预测的结合蛋白质和肽的能力的人-样抗体的回顾性合成的集合，而免疫谱将包含特异地识别禽类H5血凝素，和/或H1、H2或H3血凝素的序列。因而，理论上将免疫谱优化以识别靶向的流感亚型的关键组分。作为这些差异的结果，这两种方法产生不同组的抗体，从而为鉴定所需的中和抗体提供更有效的方法。
超免疫非人灵长类抗体文库
在这种方法中，从超免疫非人灵长类(例如短尾猴(macaque)或狒狒(baboons))挽救抗体文库。具体地，用甲型流感病毒的各种亚型或用各种血凝素(H)蛋白质免疫非人灵长类。用甲型流感病毒亚型或血凝素免疫动物，将出现识别所述甲型流感病毒亚型或血凝素的抗体效价的动物处死，收获它们的脾脏。收集经免疫的动物的血液或骨髓，如上所述收集并扩增产生的抗体用于综合流感抗体文库。
分离本发明的中和抗体的策略
不管抗体文库的类型或使用的文库，可以通过受控制的交叉反应选择和/或定向组合的和/或诱变的工程发现并优化具有双重特异性(例如显示与两种不同甲型流感亚型和/或与相同亚型的两个菌株(分离物)，和/或与人类和非人类分离物的反应性)的抗体。
在图2中显示的典型的富集方案中，将包括对两种靶(命名为靶A和靶B)显示交叉反应性的抗体的文库进行多轮富集。如果富集是基于与靶A的反应性，则每轮富集将增加库对靶A的反应强度。同样地，如果富集是基于与靶B的反应性，则每轮富集将增加库对靶B的反应强度。虽然图2提及淘选，其是筛选噬菌体展示文库时使用的选择方法(见下文)，但该方法同样适用于上述任何类型的文库、本领域其它另外已知的文库，且适用于任何类型的展示技术。靶A和靶B包括与抗体结合的任何靶物，包括但不限于流感病毒的各种分离物、类型和亚型。
由于本发明的目标是鉴定有多种特异性的中和抗体，故已制定了交叉反应发现选择方案(cross-reactive discovery selection)。为了简单，在显示选择有双重特异性的抗体的图3中说明该方案。在此情况下，对于包括显示与两个靶(靶A和靶B)的反应性的抗体的抗体文库，首先选择与靶之一(例如靶A)的反应性，然后是选择与另一个靶(例如靶B)的反应性。每个连续选择轮都增强所得的库对两个靶的反应强度。因此，该方法对于鉴定有双重特异性的抗体特别有用。当然，通过包括对另外的靶的额外轮富集，可以将这种方法进行扩展以鉴定对更多的靶显示反应性的抗体。此外，如果筛选的文库是噬菌体展示文库，则通过交叉反应淘选进行选择，但也可使用其它文库和其它选择方法。
上面讨论的两种方法的组合包括对分别针对靶A和靶B的反应性的两轮单独富集，将获得的两个库重组，以及随后的交叉反应选择轮次，如上所述。该方法在图4中说明。正如在完全交叉反应选择中，重组文库的每轮选择增加所得的库对两个靶的反应强度。
在图5显示的进一步的实施方案中，首先鉴定克隆，其显示与靶A的强反应性，并具有与靶B的可检测的交叉反应性。根据该克隆，制备诱变的文库，然后在交替轮中选择该文库分别与靶B和靶A的反应性。该方案将产生保持与靶A的强反应性并具有与靶B增加的反应性的抗体。正如上文，如果筛选的文库是噬菌体展示文库，选择是通过淘选进行的，但按照相同的策略也可以使用其它文库、其它展示技术以及其它选择方法。
如上所述，靶A和靶B可以例如是甲型流感病毒的两种不同亚型、相同甲型流感病毒的两个不同菌株(分离物)、来自两个不同物种的亚型或分离物，其中一个物种优选人类。因而，举例来说，靶A可为H5N1病毒2004越南(Vietnam)分离物的一种分离物，而靶B可为H5N1病毒1997香港(HongKong)分离物。强调的是，这些例子仅仅是说明性的，可以以类似方式鉴定、选择和优化对任意两个或多个靶具有双重特异性或多特异性的抗体。
或者，如果使用允许分离不连续框架和CDR长度的抗体文库(如UAL)以发现针对靶A的抗体，那么能够筛选B抗原，并且文库可局限于类似参数的不同集合。一旦发现针对B抗原的抗体，那么可以将基于各抗体A和抗体B的嵌合或诱变抗体用于设计双重特异性集合。
噬菌体展示
在具体的实施方案中，本发明利用噬菌体展示抗体文库从功能上发现具有多(包括双重)特异性的中和单克隆抗体。所述抗体可例如为能够中和多于一种甲型流感病毒亚型和/或相同亚型的多于一种菌株(分离物)的单克隆抗体，所述甲型流感病毒亚型包括H5、H7和/或H9亚型，如H5和H1；H5和H2；H5和H3；H5、H1和H2；H5、H1和H3；H5、H2和H3；H1、H2和H3等亚型。
为了产生噬菌体抗体文库，将获自任何来源的cDNA文库(包括上述文库)克隆入噬菌粒载体。
因而，举例来说，将如上所述通过RT-PCR从淋巴细胞或骨髓挽救的抗体重链和轻链谱的集合重新装配成与m13pIII蛋白质融合的scFv文库。所述组合文库将包含约超过106，或超过107，或超过108，或超过109个不同成员，优选超过107个不同成员或以上。关于质量控制，对随机克隆测序以评估总体谱复杂性。
同样地，在来自未经免疫的或经免疫的人类，或者超免疫非人灵长类抗体文库的重链和轻链可变区的最初PCR挽救之后，使PCR产物与接头寡核苷酸组合，以产生scFv文库，从而在与m13pIII蛋白质相应的框中直接克隆。该文库将包含约超过106，或超过107，或超过108，或超过109个不同成员，优选超过107个不同成员或以上。作为质量控制步骤，将随机克隆测序以评估总谱的大小和复杂性。
抗体噬菌体展示文库可以包含不同形式的抗体，例如单链Fv(scFv)或Fab形式。关于综述参见例如Hoogenboom,Methods Mol.Biol.178:1-37(2002)。
筛选
用于鉴定具有所需中和性质的抗体的筛选方法已在上文描述。可以根据直接与所需血凝素蛋白结合估计反应性。
血凝素(HA)蛋白生产
可以用重组DNA技术生产血凝素(HA)蛋白。在该方法中，将HA基因克隆入适当的载体，优选在杆状病毒(baculovirus)感染的昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞)中表达的杆状病毒表达载体。
将编码HA蛋白的核酸***带有或没有C-末端表位标签(如多聚-组氨酸(六聚组氨酸标签))的杆状病毒表达载体，如Bac-to-Bac(Invitrogen)。多聚-组氨酸标签可为容易通过镍螯合层析法纯化做准备。
通常，克隆包括从个别合成的寡聚物通过组装PCR(assembly PCR)制备参比cDNAs。相应的分离物变体HA蛋白或者通过将适当的突变寡聚物代入另外的组装PCR，或者通过诱变技术(例如通过Kunkel诱变)而制备。对于H5，存在两簇HA蛋白序列，即1997和2004亚型分离物。因此，对每簇制备单一的参比蛋白。同样地，对于1918西班牙流感(Spanish flu)(H1)、1958亚洲流感(Asian Flu)(H2)、1968香港流感(Hong Kong Flu)(H3)以及当前的H1、H2、H3分离物，产生参比蛋白。
通过使用脂质转染剂(lipofectin)(可从Gibco-BRL商业上得到)将上述杆粒(Bacmid)转染入Sf9细胞(ATCC CRL 1711)，从而产生重组杆状病毒。在28℃温育4-5天后，收获释放的病毒并用于进一步扩增。如O'Reilley等,Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual(Oxford:OxfordUniversity Press,1994)所述进行病毒感染和蛋白质表达。
然后可以例如通过如下Ni2+-螯合亲和层析来纯化表达的多聚-组氨酸标记的HA多肽。如Rupert等,Nature362:175-179(1993)所述从重组的病毒感染的Sf9细胞收集上清液。制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(从Qiagen商业上可得到)，柱床体积5mL，用25mL水洗涤，用25mL加样缓冲液平衡。将经过滤的细胞提取物以每分钟0.5mL加样到柱上。用加样缓冲液将柱洗至基线A280，在该点开始级分收集。然后，用次级洗涤缓冲液(secondary wash buffer)(50mM磷酸盐;300mM NaCl,10%甘油,pH6.0)洗柱，其洗脱非特异性结合的蛋白质。重新达到A280基线后，用0-500mM咪唑梯度在次级洗涤缓冲液中洗脱(develop)柱。收集1-mL级分，通过SDS-PAGE和银染色或用Ni2+-NTA-缀合于碱性磷酸酶(Qiagen)的Western印迹进行分析。汇合包含洗脱的His10-标记的HA多肽的级分，并相对加样缓冲液透析。
或者，可以利用已知的层析技术进行IgG-标记的(或Fc-标记的)HA多肽的纯化，所述已知的层析技术包括例如蛋白A或蛋白G柱层析。
作为使用Sf9细胞的替代，还可以在其它重组宿主细胞、原核生物、酵母或高等真核生物中产生HA蛋白。合适的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰阴性或革兰阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中所公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。各种大肠杆菌菌株是可公开得到的，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)；和K5 772(ATCC 53,635)。
除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是含有编码HA多肽的核酸的载体合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是通常使用的低等真核宿主微生物。但许多其它属、种和菌株是通常可得的并在本文中有用，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse,Nature 290:140(1981)；1985年5月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利No.4,943,529;Fleer等,Bio/Technology9:968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等,J.Bacteriol.737(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.Fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.Bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.Drosophilarum)(ATCC 36,906;Van den Berg等,Bio/Technology8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.Thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.Marxianus)；西洋蓍霉属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070;Sreekrishna等,J.Basic Microbiol.28:265-278(1988))；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)(Case等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公开的EP394,538)；以及丝状真菌例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(1991年1月10日公开的WO 91/00357)，和曲霉菌属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289(1983);Tilburn等,Gene26:205-221(1983);Yelton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)Kelly和Hynes,EMBO J.4:475-479(1985)。本文中甲基营养酵母(Methylotropic yeasts)是适合的，包括但不限于能够在甲醇上生长的选自以下属的酵母：汉逊酵母属(Hansenula)、念珠菌属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。可在C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs 269(1982)中发现作为该类酵母的示例的特定种的列表。
用于表达HA蛋白的合适的宿主细胞包括多细胞生物的细胞。无脊椎动物细胞的例子包括上述昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9，以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更特别的例子包括由SV40(COS-7,ATCCCRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(悬浮培养生长的HEK 293或亚克隆的HEK 293细胞(Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；以及小鼠***肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)。选择适当宿主细胞被认为在本领域技术之内。
血凝素(HA)蛋白淘选
将HA蛋白固定在微量滴定孔或磁珠的表面上，以淘选上述文库。在具体的实施方案中，用0.2M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)洗脱HA特异性结合克隆之前，使每个文库在4℃结合H5蛋白2小时，然后用冷PBS充分洗涤。通过感染易感宿主大肠杆菌来pH中和并扩增回收的噬菌体。随后，可以诱导噬菌粒产生，以重复阳性克隆的富集及随后的克隆分离用于分类(triage)。一旦充分富集，通过感染将全库转移至非琥珀抑制子大肠杆菌菌株如HB2151，以表达可溶性scFv蛋白。或者，可以将所述库亚克隆入单体scFv表达载体如pBAD，并表达重组的可溶性scFv蛋白，用于体外分析和表征，如下所述。
表征
首先检验H5克隆对如上所述产生的H5蛋白的结合亲合力。在特定的例子中，检验了与2004H5蛋白(Refseq AAS65618,Isolate;A/Thailand/2(SP-33)/2004(H5N1))的结合，平行试验检验与1997H5蛋白(RefseqAAF74331,Isolate;A/Hong Kong/486/97(H5N1))的结合，但其它分离物也可以单独或以任意组合使用。用2004和1997H5蛋白得到的阳性克隆将分成两种主要类型：2004选择性和2004/1997非选择性。用于中和的代表性功能试验包括使用与红血细胞结合的全病毒的血凝抑制试验。由于安全性问题，优选用重组蛋白质和红血细胞的可选的血凝试验。为了消除对全血的需要，可在气道上皮细胞上进行血凝素结合抑制试验。结合试验可以以任意配置(configuration)进行，其包括但不限于任何基于流式细胞计量或细胞ELISA(cELISA)的试验。使用cELISA是有利的，因为其避免使用昂贵的流式细胞术设备，并且能够提供更自动化的克隆评估和更大的数据收集。另一方面，流式细胞术可以提供更高的灵敏度、一致性和速度。
可以检验H1克隆与任何H1蛋白的结合，包括与当前的2004 H1的结合，平行检验与1918和1976蛋白质的结合。阳性克隆将分成两个主要类型：2004选择性和2004非选择性。关键还是使用类似于上述的方法学检验中和。
可以以类似的方式表征其它HA蛋白，如H2和H3。
优化
对于流感流行和大流行(包括与由禽类(H5)病毒引起的人类感染有关的潜在大流行)的有效处理，需要有效中和H蛋白(如H5蛋白)的当前分离物以及未来突变的抗体。为了实现这个目标，需要鉴定结合靶向血凝素亚型的所有已知分离物的各种H(例如H5)中和克隆。
如果需要，可以通过本领域已知的方法进一步改进交叉反应性，例如通过精确突变(Look Through Mutagenesis)(LTM)，如2005年6月23日公开的美国专利申请公开号20050136428中所述，其全部内容由此通过引用明示地并入本文。
审核突变(Look Through Mutagenesis)(LTM)是多维诱变方法，同时评估并优化所选氨基酸的组合突变。该方法集中于在一个或多个互补性决定区(CDR)域内精确分布，研究氨基酸侧链化学作用的协同贡献。LTM在CDR内产生一个位置系列的(a positional series of)单突变，其中用许多选定的氨基酸之一***地取代每个野生型残基。将突变的CDRs组合，以产生组合的单链可变片段(scFv)文库，其复杂性和大小增加，而不抑制所有变体的定量展示。阳性选择后，将性质改进的克隆测序，将那些有益的突变绘图。为了鉴定HA结合性质改进的协同突变，可以用混合的DNA探针来生产表达所有有益置换(permutation)的组合文库(组合的有益突变，CBMs)，对其进行阳性选择，分析以鉴定一组优化的scFv候选者。可以以与Fv和其它抗体文库类似的方式进行该方法。
还可以如上所述通过走查突变(WTM)进行诱变。
另有一种有用的诱变方法，其有意地设计本文抗体与多于一种甲型流感亚型和/或相同亚型的多于一种分离物的交叉反应性，该方法在本文称为“目的”诱变。可将目的诱变用于合理设计基于一个或多个抗体克隆的抗体集合，优选为不同反应性的。在本发明的上下文中，将目的诱变用于编码由相似序列上类似位点限定的单个或多个残基，所述相似序列如抗体的各CDRs中的那些序列。在此情况下，利用寡聚物简并性产生这些集合以获得在相应位置中发现的残基范围。预期在该集合内，亲本克隆间或甚至亲本克隆外的那些将存在特异性的连续体(continuum)。目的诱变的目标在于，在两个或多个分离的(discrete)实体或集合间产生不同多功能抗体集合或文库。就流感来说，可以利用该方法从而使用识别两种不同表位的两种抗体、分离物，或亚型及两种功能性质转变入单个抗体。举例来说，第一种甲型流感抗体可对甲型流感病毒H5亚型的越南(Vietnam)分离物特异，而第二种抗体对H5亚型的泰国(Thailand)或土耳其(Turkish)分离物特异。为了创建目的诱变文库，首先获得并比对两种抗体的CDR序列。接着，用单个密码子将保守特性的所有位点固定到匹配的残基。在非保守位点并入简并密码子以编码两种残基。在某些情况下，所述简并密码子将仅编码在该位点的两个亲本残基。但在某些情况下，产生额外的副产物。可以调控(dial in)副产物产生的水平以根据大小限制或目标强制副产物产生或消除其产生。
因而，举例来说，如果两种抗体的第一位点分别为苏氨酸和丙氨酸，在最初两个位点中有A/G-C-的简并密码子将仅编码苏氨酸或丙氨酸，与第三个位点的碱基无关。如果例如，下一个位点残基是赖氨酸和精氨酸，简并密码子A-A/G-A/G将仅编码赖氨酸或精氨酸。但如果使用了简并密码子A/C-A/G-A/G/C/T，那么也将产生天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸副产物。
为了方便起见，仅使用具有相匹配的CDR长度的抗体是更简单的。强制使用有相匹配的CDR长度的抗体的一种方式是对第二抗原筛选大小受限的文库，基于CDR长度和可能甚至是由最初发现的抗体赋予的框架限制。但有人指出，使用等长的CDRs仅仅是方便，而不是要求。很容易看到，虽然该方法将用于创建甲型流感病毒中和抗体的大的功能上不同的文库，但其适用范围更广。可将该诱变技术用于生产任何抗体的功能上不同的文库或集合。因而，本文包括图6，使用TNF-α抗体和CD11a抗体的CDRs作为诱变的亲本序列，以说明目的诱变方法的用途。
其它例示性诱变方法包括饱和诱变(saturation mutagenesis)和易错聚合酶链反应(error prone PCR)。
饱和诱变(Hayashi等,Biotechniques 17:310-315(1994))是一种技术，其中在蛋白质中的特定位置所有20个氨基酸被取代，分析相应于各变体的克隆特定的表型(还参见美国专利Nos.6,171,820；6,358,709和6,361,974)。
易错PCR(Leung等,Technique1:11-15(1989);Cadwell和Joyce,PCRMethod Applic.2:28-33(1992))是一种改良的聚合酶链式反应(PCR)技术，其将随机点突变引入克隆的基因。可将所得的PCR产物克隆以产生随机突变体文库，或者如果将T7启动子并入适当的PCR引物内，则可将所得的PCR产物直接转录。
其它诱变技术也是众所周知的，例如描述于In Vitro Mutagenesis Protocols,J.Braman,Ed.,Humana Press,2001。
在目前情况下，一个主要的目标是设计一种抗体(或多种抗体)以有效地处理当前的H5(或H7或H9)分离物以及未来的突变。为设计能够识别新分离物中的突变的有耐受性的抗体，应鉴定结合许多种H5分离物(包括例如近来的2004分离物和先前的1997分离物)的H5中和克隆。可以预期如果克隆根据2004分离物选择，其将以较低程度结合/中和1997分离物。该情况下，目标是在改进(或至少维持)2004分离物结合的背景下，显著地改进1997识别。因此，首先对改进1997参比蛋白进行选择，然后对2004蛋白选择。这样做对新菌株提供更大的选择压力，而对第二参数维持压力。
优化可以基于任何上述文库，或本领域已知的任何其它类型文库，单独或任意组合。在具体的实施方案中，可通过筛选三种类型LTM文库；三重(triple)诱变的轻链文库、三重诱变的重链文库以及六重诱变的(轻链+重链)文库开始优化。基本上如上所述淘选H5，尽管可能需要较小的修饰。例如，在甘氨酸-HCl洗脱之前，人们可以用以下方法中的一种或两种通过每轮增加洗涤严格性(washing stringencies)来选择改进的结合：在室温或37℃充分洗涤，或在过量可溶性亲本scFv存在下长时间温育。这些选择修饰应改进所得克隆中的解离速率(off-rate)动力学。3-4轮选择后，我们将测序随机克隆，并用ELISA检测结合。对改进的克隆进行序列分析后，将所有容许的改进的突变组合入组合的有益诱变(CBM)文库，以选择对两种亚型H5分离物结合的协同改进。通过合成简并寡核苷酸以代表在所有位置所有改进的和原始的亲本残基，从而制得CBM文库。在增加的严格性下选择所得的文库，类似于LTM筛选。充分选择之后，将库亚克隆入pBAD表达载体，以从大肠杆菌表达并纯化单体scFv蛋白，用于如上所述的结合和中和试验。
可以以类似方式优化H1中和抗体。在该情况下，人们可以利用来自1918、1976和当前的任何参比蛋白序列或者作为起点或者作为终点来选择和优化。
另外，用中和抗体克隆检验型间识别(intertype recognition)。型间识别的例子是从H5来源的或优化的克隆巧合的(coincidental)或设计的H1结合。
一旦已鉴定了具有所需性质的中和抗体，则可能期望鉴定优势表位(dominant epitope)或由大多数所述抗体识别的表位。用于表位作图的方法是本领域众所周知的，并且例如在Morris,Glenn E.,Epitope Mapping Protocols,Totowa,N.J.ed.,Humana Press,1996;和Epitope Mapping:A Practical Approach,Westwood和Hay,eds.,Oxford University Press,2001中公开。
通过应用区别不同抗体集合的独特的条码，可以大大促进抗体文库的处理，所述文库如来自不同供体的文库或特征为与病毒(包括但不限于流感病毒)亚型的不同分离物的反应性的文库。条码优选被选择，以使它们能够连同标记的克隆一起增殖。
因而，所述条码可以是长度约1-24个非编码核苷酸的非编码DNA序列，其可以通过测序或特定的PCR引物去卷曲(deconvoluted)。以这种方式，核酸集合(如抗体谱)可以在克隆步骤被连接。
在另一个例子中，条码是沉默突变的编码序列。如果文库利用识别中断的回文序列(例如Sfi GGCCNNNNNGGCC)的限制酶，则可以并入不同的核苷酸代替“N’s”以区别不同克隆的集合，如抗体文库。这种条码方法优点在于谱在扩增步骤被连接。
在不同的例子中，条码是编码序列，其编码免疫学上不同的肽或与噬菌体颗粒融合的蛋白质序列。实例包括例如与pIII、pVIII、pVII或pIX噬菌体的表位(例如Myc、HA、FLAG)融合物。表位可以单独或以各种组合使用，并可以以顺式(在文库-编码质粒上)或以反式(特别修饰的辅助噬菌体)构型提供。
其它可能的条码的例子包括但不限于用半抗原或荧光生色团的化学和酶学噬菌体修饰(对于噬菌体文库)。所述标记对于单轮选择是优选的。
虽然在本文说明了条码用于区别抗体文库，但普通技术人员将理解，所述方法通常可广泛适用于独特地标记和区别核酸分子和核酸的集合。
中和抗体的产生
一旦具有所需中和性质的抗体得以鉴定，可以用本领域众所周知的方法生产所述抗体(包括抗体片段)，所述方法包括例如杂交瘤技术或重组DNA技术。
在杂交瘤方法中，将小鼠或其它适当宿主动物(如仓鼠)免疫，以抽取产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合于用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种并在适当的培养基中生长，所述培养基优选包含一种或多种抑制非融合的、亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合，通过选择的抗体生成细胞支持稳定高水平抗体生产，以及对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA得到)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),Rockville,Maryland USA得到)的那些细胞系。也已描述了人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);和Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
分析杂交瘤细胞正在其中生长的培养基中定向针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，用免疫沉淀法或体外结合测定(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以例如通过分离编码所需抗体链的DNA和使用用于共表达的编码序列共转染重组宿主细胞(使用众所周知的重组表达载体)，来生产重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，例如上述那些细胞。
对于待用于制备人源化抗体中的人可变区(包括轻和重)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适合(best-fit)”方法，针对已知的人可变区序列的全库筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后将最接近于啮齿类序列的人类序列作为人源化抗体的人类框架区(FR)(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987))。重要的是，被人源化的抗体保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学性质。为了达到这个目的，根据优选的方法，通过以下方法制备人源化抗体：利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的(conceptual)人源化产物。
另外，可以根据本领域已知的方法生产人抗体。例如，可以制得转基因动物(例如小鼠)，其一旦免疫，就能够在缺乏内源性免疫球蛋白产生时产生人抗体全谱。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993);Bruggermann等,Year in Immuno.7:33(1993);和美国专利Nos.5,591,669、5,589,369和5,545,807。
中和抗体的用途
本发明的流感中和抗体可以用于预防和/或治疗甲型流感感染。对于治疗应用，通常以药物组合物的形式使用抗体或其它分子，通过使用抗体或基于抗体的运输序列促进所述抗体或其它分子的传递。通常可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.(Easton,Pa.1990)中找到技术和配方。也参见Wang和Hanson"Parenteral Formulations of Proteinsand Peptides:Stability and Stabilizers,"Journal of Parenteral Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42-2S(1988)。
抗体通常以冻干配方或水溶液的形式配制。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度对于受者是无毒的，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲苄基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯己双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯类(alkylparabens)如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇(cyclohexanol)；3-戊醇和间甲酚(m-cresol))；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
也可将抗体包埋到例如通过凝聚技术或界面聚合(分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)(poly-(methylmethacylate))微囊)在胶体药物传递***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊)中或在粗乳状液中制备的微囊剂中。所述技术在Remington's PharmaceuticalSciences,见上文中公开。
还可将本文公开的中和抗体配制成免疫脂质体。用本领域已知的方法制备含有所述抗体的脂质体，如描述于Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545;以及1997年10月23日公开的WO97/38731。在美国专利No.5,013,556中公开循环时间增加的脂质体。
可以通过反相蒸发法用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。通过限定孔径的滤器挤出脂质体，以产生有所需直径的脂质体。可以通过二硫互换(disulfideinterchange)反应，将本发明抗体的Fab'片段缀合于如Martin等J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述的脂质体。脂质体内任选地包含化学治疗剂。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
对于疾病的预防或治疗，抗体的合适剂量将取决于待治疗感染的类型、疾病的严重性和病程(course)，以及是否为预防或治疗目的施用抗体。将抗体合适地施用于患者，一次(at one time)或经一系列治疗。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至约15mg/kg抗体是施用于患者的通常初始候选剂量，不论例如通过一次或多次分别施用，还是通过连续输注施用。
通过以下非限制性实施例说明本发明进一步的细节。
实施例
来自较早禽流感爆发存活者的抗体文库及中和抗体的制备
材料和方法
骨髓规程和血清制备
通过标准静脉穿刺术(venopuncture)得到血液，使其凝块，并处理以回收血清。血清于-20℃贮藏3-4天，直到将其通过干冰运送。通过注射局部***使供者麻醉，从每个H5N1存活者的髋骨(pelvic bone)移出5ml骨髓。接着将这5ml骨髓放入含45ml RNAlater(Ambion)的无菌50-ml管中。将混合物轻轻颠倒大约8-20次，直到没有可见凝块(clump)，骨髓和RNAlater良好混合。然后将样品在2-10℃冷藏过夜。过夜冷藏后，将样品于-20℃贮藏3-4天，直到将其通过干冰运送。一旦收到，就将含有RNAlater/骨髓和血清的管贮藏于-80℃直至对其进行处理。
血清学：HA ELISA
通过室温过夜温育，用100μl溶于1X ELISA板包被溶液的100ng/mLH5血凝素(Protein Sciences,A/Vietnam/1203/2004)包被ELISA板(Thermo,Immulon 4HBX 96W)。第二天，用300μl PBS/0.05%Tween-20(PBST)洗板3次。洗涤后，加入300μl封闭溶液(blocking solution)(溶于PBS/0.05%Tween-20的4%脱脂乳粉)，并在室温温育1小时。封闭步骤之后，用300μlPBS/0.05% Tween-20洗板3次。接着，将在PBS/0.05% Tween中1:20,000稀释的100μl血清样品在室温温育1-2小时，然后用300μl PBS/0.05%Tween-20洗涤3次。将在PBS/0.05% Tween中1:5,000稀释的100μl抗-人Fc-HRP缀合物在室温温育1-2小时，然后用300μl PBS/0.05%Tween-20洗涤3次。这次最终洗涤之后，加入100μl生色底物溶液(TMB1 Substrate,BioFx)，足量时间后，通过加入100μl STOP溶液(BioFx)终止。在平板读取器(Molecular Devices Thermomax微孔板阅读器，应用Softmax Pro软件)上读取了450nm的吸光度，记录数据，随后用Excel(Microsoft)绘图。
骨髓：RNA提取和mRNA纯化
通过离心法除去RNA later从而回收骨髓(20ml RNA later中～2.5ml)(之前贮藏于-80℃)，然后重悬于含300μl乙酸的11.25ml TRI BD试剂(Sigma)。然后剧烈涡旋沉淀。接着，加入1.5ml BCP(1-溴-3-氯丙烷,Sigma)，通过涡旋混合，在室温温育5分钟，然后在4℃12000x g离心15分钟。小心移除水相而不扰乱界面。接着添加25ml异丙醇使总RNA从水相析出，在室温温育10分钟，并在4℃12000x g离心10分钟。随着异丙醇的加入，由于残留的RNAlater而形成两相，导致析出的RNA沉降在界面。为了去除残留的RNAlater并允许最大程度回收RNA，加入溶于水的50%异丙醇的5ml等分试样并混合直到无显著的相分离，在该点通过于4℃12000x g离心10分钟来沉淀RNA。用75%EtOH洗涤RNA沉淀，将其转入无RNA酶的1.6ml微量离心管，再通过离心回收。最后，将RNA沉淀物重悬于100μl 1mMNa-磷酸盐(pH8.2)中，读取A260和A280来估计RNA纯度。
在反转录之前，按照Qiagen Oligotex mRNA纯化试剂盒从总RNA纯化mRNA。简言之，用无RNA酶的水使50-200μg骨髓RNA达250μl，并与250μl OBB缓冲液和Oligotex悬浮液混合，之后在70℃温育3分钟。使Oligotex颗粒的寡聚dT30和mRNA聚腺苷酸尾之间的杂交在室温进行10分钟。然后将杂交悬液转移至旋转柱(spin column)并离心1分钟。用400μl缓冲液OW2洗涤旋转柱两次。然后通过离心用20μl热(70℃)缓冲液OEB洗脱纯化的mRNA两次。通常产量为500ng-1.5μg总RNA。
利用N9和Oligo dT对骨髓mRNA反转录
通过将75-100ng mRNA与2μl 10X Accuscript RT缓冲液(Stratagene)、0.8μl 100mM dNTPs以及或者N9(300ng)或者寡聚dT引物(100ng)混合在一起，然后加水使最终体积至17μl，来完成反转录(RT)反应。将混合物65℃加热5分钟，然后使其冷却至室温。接着将2μl DTT、0.5μl RNase Block(Stratagene)、0.5μl AccuScript RT(Stratagene)加入每个反应。然后，将N9引发的反应在室温温育10分钟，将寡聚-dT引发的反应在冰上温育10分钟。最后，将两个反应在42℃温育60分钟，然后70℃温育15分钟以破坏酶。
从源自骨髓的cDNA PCR
基本上利用先前描述的方法和简并引物(O’Brien,P.M.,Aitken R.Standard protocols for the construction of scFv Libraries.Antibody Phage Display–Methods and Protocols,vol178,59-71,2001,Humana Press)，基于人种系V和J区，从骨髓cDNA扩增了抗体重链和轻链谱。
简言之，将利用Oligo dT引发的cDNA(来自75ng mRNA用于λ轻链)和N9引发的cDNA(来自75ng mRNA用于κ轻链，来自100ng mRNA用于重链)的PCR反应与以下混合在一起：5μl 10X扩增缓冲液(Invitrogen)、1.5μldNTPs(10mM)、1μl MgSO4(50mM)、2.5μl V区引物(10uM)和2.5μl J区引物(10uM)-10uM用于VH、0.5μl Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen)和无菌dH2O至终体积50μl。PCR参数如下：步骤1-95℃5分钟，步骤2-95℃30秒，步骤3-58℃30秒，步骤4-68℃1分钟，步骤5-步骤2-4循环40次，步骤6-68℃5分钟。用Qiagen PCR Cleanup试剂盒提纯轻链PCR产物。用Qiagen GelExtraction试剂盒从1.5%琼脂糖凝胶中凝胶纯化重链PCR产物，然后再扩增。重链再扩增如下进行：混合10μl 10X扩增缓冲液(Invitrogen)、3μl dNTPs(10mM)、2μl MgSO4(50mM)、5μl各VH引物(10uM)和JH引物(10uM)、5μl重链初级PCR产物、1μl Platinum Pfx，用水将体积调整至100μl。循环参数如下：步骤1-95℃ 5分钟，步骤2-95℃ 30秒，步骤3-58℃ 30秒，步骤4-68℃ 1分钟，步骤5-步骤2-4循环20次，步骤6-68℃ 5分钟。用QiagenExtraction试剂盒从1.5%琼脂糖-TAE凝胶中提纯了再扩增的重链PCR产物。
抗体噬菌体文库构建
使用插在非翻译区末端pIII终止密码子之后的独特的识别性3-核苷酸条码，构建了对每个个体禽流感存活者单独的抗体文库。
轻链克隆：
用NotI和BamHI消化每个供体汇合的κ轻链和汇合的λ轻链各1μg，并用Qiagen Gel Extraction试剂盒将其从1.5%琼脂糖-TAE凝胶中凝胶纯化。用NotI和BamHI消化每种载体5μg，并用Qiagen Gel Extraction试剂盒将其从1%琼脂糖-TAE凝胶中凝胶纯化。用200ng凝胶纯化的κ或λ***片段和1μg凝胶纯化的载体在60μl中室温1小时或14℃过夜进行文库连接。用Edge BioSystem Perfroma旋转柱将连接物除盐。在80μl TG-1或XL-1Blue等分试样中以5次电穿孔转化文库，各自在1ml SOC中回收，汇合并在37℃生长(outgrow)1小时。在该生长后通过将来自每个转化体的等分试样铺板来测定转化体的总量。通过37℃在200ml2YT+50μg/ml氨苄青霉素+2%葡萄糖中过夜生长来扩增剩余的电穿孔物。利用Qiagen High Speed Maxiprep试剂盒从这些过夜培养物通过质粒纯化来回收随后的轻链文库。
重链克隆：
以40Unit过量/μg DNA用SfiI和XhoI消化供体特异性重链(VH1、VH2,5,6库、VH3和VH4)各1.5-2μg，并使用Qiagen Gel Extraction试剂盒将其从1.5%琼脂糖-TAE凝胶中凝胶纯化。以40Unit/μg DNA用SfiI和XhoI消化的各轻链文库载体15μg，并用Qiagen Gel Extraction试剂盒将其从1%琼脂糖-TAE凝胶中凝胶纯化。通过组合1.2μg SfiI/XhoI消化的、凝胶纯化的重链供体集合和5μg每种轻链文库(κ和λ)在14℃过夜，从而建立文库连接。然后用Edge BioSystem Perfroma旋转柱将文库连接物除盐，然后在80μl TG-1等分试样中通过每个文库20次电穿孔将文库连接物转化，各自在1ml SOC中回收，汇合并在37℃生长1小时。还是在该生长后，用每个转化体的等分试样测定转化体的总数，同时将剩余物转移到1L2YT+50μg/ml氨苄青霉素+2%葡萄糖，使其在37℃以剧烈通气生长至OD600为～0.3。然后以5:1的多重性感染(MOI)加入M13K07辅助噬菌体，并在37℃无搅拌温育1小时。接着通过离心收获细胞，重悬于1L 2YT+50μg/ml氨苄青霉素、70μg/ml卡那霉素，使细胞在37℃以剧烈通气过夜生长，以使scFv噬菌粒产生。第二天早上通过离心收集细胞并收集含噬菌粒的上清液。通过加入0.2倍体积20% PEG/5MNaCl溶液并冰上温育1小时，使噬菌粒从上清液析出。然后通过离心收获噬菌粒文库储备物(stock)，并重悬于20ml无菌PBS。通过额外的离心移除残余的细菌，并将最终的噬菌粒文库于-20℃贮藏在PBS+50%甘油中。
噬菌粒淘选和扩增
用ELISA包被溶液(BioFX)中的100ng/mL H5血凝素蛋白(ProteinSciences,A/Vietnam/1203/2004)100μl通过室温过夜培养来包被ELISA板(Immulon 4HBX平底,Nunc)。第二天，用300μl PBST洗板3次。洗涤后，加入300μl封闭溶液(PBS/0.05% Tween-20中4%脱脂乳粉)并在冰上温育30分钟。封闭步骤之后，用300μl PBST洗板3次。就在噬菌体淘选之前，用Millipore Amicon Ultra柱从冷冻噬菌粒储备物除去甘油，然后在4%脱脂乳粉中封闭15分钟。接着，将噬菌粒的100μl等分试样分到8个孔(总噬菌体～1x1012CFU)，在4℃温育2小时后用300μl PBST洗涤6-8次。在100μl/孔洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl,pH2.2,1mg/ml BSA)中室温10分钟后，收集噬菌粒。然后通过向每毫升洗脱液中加入56.25μl 2M Tris碱来中和洗脱液。中和后，用0.5ml中和的噬菌体在2-YT中在37℃不振摇感染5ml TG1细胞(OD600～0.3)30分钟。该步骤后，将一些细胞铺于LB AMP Glucose平板上以测定总噬菌粒回收率。将剩余的接种物置入10ml2-YTAG(终浓度2%葡萄糖和50ug/ml氨苄青霉素)，并在37℃以剧烈通气生长至OD600～0.3。接着，用M13K07辅助噬菌体以5:1的MOI感染培养物，并在37℃不振摇温育30-60分钟。通过离心收集细胞并重悬于25ml 2-YTAK(氨苄青霉素50μg/ml，卡那霉素70μg/ml)，将细胞转至新鲜培养瓶，并在37℃不振摇生长。随后的几轮被类似地回收和扩增。
scFv ELISA
来自生物淘选的噬菌体的大肠杆菌HB2151转化细胞的各克隆于37℃在1ml2YT+100μg/ml AMP中过夜生长。第二天早上，通过离心收获细胞，重悬于1.5ml胞质裂解缓冲液(1ml BBS(Teknova)+0.5ml10mg/ml溶菌酶+EDTA至10mM终浓度)。通过离心再沉淀细胞并收集含胞质裂解物的scFv。将scFv裂解物与稀释缓冲液(PBS/0.05%BSA)1:1组合，加100μl至之前已经用抗原包被的孔中，并用稀释缓冲液封闭。在室温将该样品温育2小时，然后用PBS/0.05% Tween洗涤3次。接着将稀释缓冲液中的1:5000稀释的生物素抗-组氨酸小鼠(Serotec)100μl加入每孔并在室温温育1小时。这次温育后，用PBS/0.05% Tween将孔洗涤3次，然后向每孔加入100μl1:2500抗生蛋白链菌素:HRP(Serotec)，并在室温温育1小时，然后用PBS/0.05% Tween洗涤3次。这次最终洗涤后，加入100μl生色底物溶液(TMB1Substrate,BioFx)，在足量时间后，通过加入100μl STOP溶液(BioFx)来终止。在平板读取器(Molecular Devices Thermomax微孔板读器，具有Softmax Pro软件)上读取450nm的吸光度，记录数据，随后用Excel(Microsoft)绘图。
测序
为了推出重链和轻链序列，使各克隆生长并提取质粒DNA(Qiagen)。对质粒DNA进行了标准DNA测序。
血凝素抑制(HAI)试验
基本上按照Rogers等,Virology131:394-408(1983)的方法，每孔使用4HAU(血凝单位)的病毒或蛋白在圆底微孔板(Corning)中进行血凝抑制。对于HAI测定，在每个微量滴定孔中将纯化的单链可变片段(scFv)的25μl样品与含4HAU检验病毒的25μl PBS混合。室温预孵化15分钟后，加入25μl0.75%人红细胞并混合。在室温温育60分钟后通过目测确定HAI抗体活性。
结果
在2006年1月土耳其发生H5N1禽流感爆发，大约爆发4个月后，从其中6名存活者收集骨髓和血液样本。对于所有6名存活者，根据由土耳其***(Turkish Ministry of Health)核准的体格检查、临床实验室检验和分子诊断测定来进行禽流感的初次诊断。这些存活者中4名另外由世界卫生组织(WHO)确认。用上述血清学方案分析血清样本，以证实存在对H5血凝素(A/Vietnam/1203/2004)的抗体。如图7所示，所有6名患者(分别称为SLBH1-H6)的血液样本表明存在对H5抗原的抗体。此证实之后，从这些个体的骨髓样本提取RNA，利用如上所述的规程纯化并反转录骨髓mRNA。然后如上所述从骨髓cDNA扩增抗体重链和轻链谱，对每个存活者分别克隆各抗体重链和轻链噬菌体文库，其使用上述三-核苷酸条码以区别各文库。
还从2006年因流感症状而治疗的12名当地供者收集了骨髓和血液样本。如上所述进行血清学，以证实存在分别针对H1、H3和H5血凝素的抗体。如图8所示，所有血清样本对于针对H1和/或H3血凝素的抗体检测为阳性，其中某种亚型的优势取决于甲型流感病毒亚型，特定供者大多数他的或她的整个一生暴露于所述甲型流感病毒亚型。有趣的是，还存在其血清包含显著水平的H5血凝素抗体的供者(图8中供者SLB1和SLB5)。此证实之后，从供者的骨髓样本提取RNA，利用如上所述的规程纯化并反转录骨髓mRNA。然后如上所述从骨髓cDNA扩增抗体重链和轻链谱，对每个供者分别克隆各抗体重链和轻链噬菌体文库，其使用上述三-核苷酸条码以区别各文库。
如图9所示，使用可用的4个核苷酸中的3个允许产生64个独特的条码。
从由土耳其禽流感存活者的骨髓样本制备的汇合抗体文库的三轮淘选后得到的48个随机克隆中，用ELISA检验40个与H5血凝素蛋白(ProteinSciences,A/Vietnam/1203/2004)的结合，以及与灭活的越南H5N1病毒(CBER,A/Vietnam/1203/2004)的结合。将克隆测序。在40个克隆中，发现5个是不同的。如图10所示，所有5个不同的克隆(克隆F5和G1具有相同的序列)与H5蛋白和越南H5N1病毒都结合。图11显示序列比对，其比较来自土耳其供者的H5血凝素蛋白序列和用在上述实验中的越南分离物的H5血凝素序列。这些实验的结果显示，尽管序列不同，但检验到抗体与土耳其和越南H5蛋白和病毒都结合，因此显示了与H5N1病毒的多于一种分离物的交叉反应性。
从通过第二轮淘选产生的12个克隆中鉴定了4个额外的独特克隆。
图12和图13显示在土耳其供者的汇合抗体文库中鉴定的独特克隆的重链可变区序列，连同相应的轻链和种系起源序列。特别地，图12显示的序列(3-23个重链克隆)源于3轮淘选后所有土耳其供者的所有重链和轻链的汇合文库。图13显示的序列(3-30个重链克隆)源于两轮淘选后所有土耳其供者的所有重链和轻链的汇合文库。
利用上述ELISA规程，在4轮淘选后，从各土耳其供者的抗体文库鉴定了额外的独特H5N1特异性抗体重链可变区序列。图14A至14D中显示这些H5N1 ELISA阳性克隆的序列。
图15和图16显示使用目的诱变创建不同的抗体重链和轻链文库，其使用通过分析如上所述的土耳其禽流感存活者的血清和骨髓而鉴定的抗体重链(图15)和轻链(图16)序列。
图17和图18显示ELISA结果，其证实某些获自H5N1越南(Vietnam)病毒scFv抗体的Fab片段与HA蛋白质的土耳其(Turkish)和印尼(Indonesian)变体的交叉反应性。
尽管在上述说明中参考某些实施方式说明了本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。事实上，除本文指出和描述的那些之外，根据上述说明，本发明的各种修饰将对本领域技术人员将是显而易见的，并且落入所附的权利要求范围内。
说明书各处引用的所有参考文献由此通过引用明示地并入本文。
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Claims (10)

1.一种中和抗体，其中和甲型流感病毒亚型的多于一种分离物和/或甲型流感病毒的多于一种亚型。
2.一种组合物，其包含根据权利要求1的中和抗体。
3.一种用于鉴定抗体的方法，所述抗体能够中和甲型流感病毒亚型的多于一种分离物或甲型流感病毒的多于一种亚型，该方法包括鉴定在抗体文库中与所述甲型流感病毒亚型的第一和第二分离物都反应的抗体或与所述甲型流感病毒亚型的第一和第二亚型反应的抗体，以及使鉴定的抗体经连续交替轮次的选择，分别基于它们结合所述第一和第二分离物，或所述第一和第二亚型的能力。
4.一种序列的集合，所述序列由通过权利要求3的方法鉴定的中和抗体共享。
5.一种序列的集合，所述序列包含图11、图12、图13和图14A至14D中所示的一种或多种独特的重链和/或轻链序列或者基于所述序列的共有序列或变体序列。
6.一种用于预防和/或治疗受试者中甲型流感感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求2的组合物。
7.一种用于预防甲型流感感染的方法，其包括向有发生甲型流感感染风险的受试者施用有效量的权利要求2的组合物。
8.一种用于产生不同多功能抗体集合的方法，其包括(a)比对至少两个功能上不同的抗体的CDR序列，(b)鉴定在比对的CDR序列之间保守的氨基酸残基，和(c)使用简并寡核苷酸探针，在至少一个比对的CDR序列中进行多个非保守氨基酸残基的诱变，所述探针编码至少在功能上不同的抗体中在经诱变产生比对的CDR序列的多个变体的非保守位置存在的氨基酸残基，并且，如果需要，用一个或多个所述变体重复步骤(b)和(c)，直到所述抗体集合达到所需程度的多样性或大小。
9.一种抗体集合，其包含在至少一种性质上相互不同的多个中和抗体。
10.一种用于独特地鉴定集合中的核酸的方法，其包括用独特的条码标记所述核酸，所述条码连接于或整合入所述集合中存在的核酸的序列中。
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