JP2021507921A - 高サイトカイン血症および重篤なインフルエンザの処置または予防のための方法および化合物 - Google Patents

高サイトカイン血症および重篤なインフルエンザの処置または予防のための方法および化合物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用される、化学式Ｉ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、（化学式Ｉ）式中、Ｒは、１つ以上のハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである。また、化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含む、高サイトカイン血症の処置または予防に使用される組成物、ならびに、処置または予防を必要とするヒト患者における高サイトカイン血症を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量の化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を患者に投与することを含む方法が提供される。また、本発明は、高サイトカイン血症の処置または予防に使用される、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤等を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、高サイトカイン血症、および、特に重篤なインフルエンザに関連する高サイトカイン血症の処置または予防のための方法および化合物に関する。また、本発明は、高サイトカイン血症、および、重篤なインフルエンザに関連する高サイトカイン血症の処置または予防のための医薬組成物を提供する。
高サイトカイン血症は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦなどの炎症誘発性サイトカインの循環レベルの急上昇として規定される(Croft, M., Therole of TNF superfamily members in T-cell function and diseases, Nat RevImmunol, 2009; 9: 271-85)。
高サイトカイン血症、または「サイトカインストーム」、または「サイトカインカスケード」は、感染疾患、非感染疾患、自己免疫反応、および薬物有害反応を含む各種状態に関連する。炎症は、ウイルス、損傷細胞、または刺激物質などの有害な刺激に対する複合的な身体組織生体反応の一部である。炎症は、免疫系、血管、および多数のタンパク質に関与する防御反応である。炎症の目的は、細胞損傷の初期原因を排除して、死んだ細胞および瀕死の細胞を取り除き、組織修復を開始することである。通常の場合では、炎症は一時的であり、損傷組織の修復は、通常、発症の２〜３日後に開始する。
炎症反応が過剰になり、高レベルの炎症誘発性タンパク質（サイトカイン）が放出され、これが肺および他の組織の血管を損傷し得、組織への液体滲出をもたらす（浮腫）と、高サイトカイン血症が発症する。炎症反応は、防御的というよりも破壊的となる。この過剰な炎症反応は、通常の炎症反応が異常な反応となる、移行期、転換点、またはしきい値といった臨界点が存在する、非線形のプロセスとして示され得る。
多様な抗炎症薬剤および付随する手法が、高サイトカイン血症を標的とする狙いで採り入れられている。これらは、コルチコステロイド、アスピリン、モノクローナル抗体(MAbs)、抗サイトカイン剤および抗ケモカイン剤、血漿交換法、ならびにスタチンによる処置を含む。これらの取り組みにもかかわらず、これらの手法のいずれも効果を示さず、一部は結果を悪化させた(Brun-Buisson etal., Early corticosteroids in severe influenza A/H1N1 pneumonia and acute respiratory distress syndrome, Am J Respir Crit Care Med. 2011 May1;183(9):1200-6)。本発明の治療手法は、炎症反応を取り除くのではなく下げることで、宿主本来の防御反応を保ちながら、過剰な炎症反応によって生じる傷害作用を小さくする、ということで反応のバランスをとることを目的とする。
高サイトカイン血症は、パンデミックである１９１８〜１９１９年のＨ１Ｎ１スペインかぜ、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ、およびパンデミックである２００９年のＨ１Ｎ１インフルエンザという、３つの主要なインフルエンザウイルスの重篤な感染に見受けられる。ヒトＨ１Ｎ１と比較すると、Ｈ５Ｎ１ウイルスは、ヒト呼吸器初代上皮細胞における炎症誘発性サイトカインのより強力な誘導因子であり、このサイトカインの超誘導は、Ｈ５Ｎ１の疾患重症度に寄与すると考えられる。インフルエンザにおける厳密な高サイトカイン血症の機構は知られていないが、内皮細胞は、「サイトカインストーム」の中心となる制御因子として特定されている(Teijaro JR etal., Endothelial Cells are Central Orchestrators of Cytokine Amplification during Influenza Virus Infection, Cell, 2011; 146: 980-991)。
インフルエンザは、成人で５％〜１０％、および子供で２０％〜３０％と推定される年間罹患率で、世界的に発生している。病気により、主に高リスクグループ(幼若者、高齢者、または慢性疾患)では、入院や死に至り得る。世界的に、これらの例年の流行は、約３百万〜５百万の重症例、および約２５万〜５０万の死亡につながると推定される。(WHO factsheet number 211: https://web.archive.org/web/20160613040907/http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/参照)
北米において、季節性インフルエンザでは、年間で、６５歳を超えている１０万人あたり２３０〜１６７０人で入院が極端に多くなり、３万２千人の呼吸器性／心血管性死亡、および４万３千人の総死亡となる。慢性的病態（例えば、肺疾患、心血管疾患、肝臓疾患、腎臓疾患、および神経疾患、糖尿病、または免疫抑制）を有する人は、入院および死亡のリスクが３０倍を超えて増加する。
流行する季節性インフルエンザの亜型のなかでも、Ｈ３Ｎ２は、通常、重症および入院の原因としてより多い(See Lee, N. etal., Outcomes of adults hospitalised with severe influenza, Thorax, 2010; 65:510-515)。
インフルエンザ・パンデミック時には、状況はさらに悪化し得る。２００９の初めに、新しいインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１ウイルス(pH1N1)が発生し、急速にパンデミックを引き起こした。一部の個体群では最大で２０〜４０％の人に影響があり、入院や死亡が極端に多くなったと推定されている。米国では、ｐＨ１Ｎ１の重篤な感染のため、１９万５千人〜４０万３千人が入院し、２０１０年４月までに８，８７０人〜１８，３００人が亡くなった。ｐＨ１Ｎ１ウイルスは、地域社会において、季節性インフルエンザウイルスと共に引き続き流行している。
大部分の患者が、ｐＨ１Ｎ１により軽度の上気道感染症を発症するが、一部の患者は、例えば肺炎などの重度の下気道合併症を発症するに至る、または、数日後(>2日)に回復もしくは改善しない症状を呈するまでに移行する。季節性インフルエンザに対して、若年者や以前より健康な人もまた、例えば肺炎や急性呼吸促迫症候群(ARDS)などの重度の呼吸器合併症を発症し得る。入院する成人のなかでも９〜３４％が、高死亡率(14-46%)と関連し得る進行性呼吸不全のため、集中治療を必要とし得、とりわけ、いくつかの症状（例えば、肺炎、ＡＲＤＳ、多臓器不全）は、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザのものと極めて類似する(Lee, N. et al.,Cytokine response patterns in severe pandemic 2009 H1N1 and seasonal influenza among hospitalised adults, PloS One, 2011; 6: e26050参照)。
特許文献１(SmithKline Beecham Corp)は、有効量のＣＢＳＰ／ｐ３８阻害剤をヒトに投与することを含む、インフルエンザ誘発肺炎の処置方法を記載している。
ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、細胞増殖プロセス、細胞分化、アポトーシス、および炎症に対する細胞応答を含む種々の細胞プロセスを調節する、***促進因子活性化タンパク質キナーゼサブファミリーを含む。ｐ３８ＭＡＰキナーゼはサイトカイン受容体によって調節され、細菌性またはウイルス性病原体に反応して活性化される。
特許文献２は、免疫疾患、自己免疫疾患、および炎症疾患、心血管疾患、感染疾患、骨吸収障害、神経変性疾患、シクロオキシゲナーゼ−２の誘導に関連する増殖性疾患およびプロセスを含む、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、および／またはＩＬ−８によって媒介される疾患の処置または防止のための特定のピラゾロピリジン誘導体の使用を公開している。
特許文献３(SmithKline Beecham Corp)は、ＡＲＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、およびインフルエンザ誘発肺炎を含む、広範囲のＣＢＳＰ／ｐ３８キナーゼ媒介疾患を処置するための、置換した２，４，８−三置換−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン化合物および組成物の使用を記載している。
特許文献４(Butcher)は、あらゆるタイプ、原因、または病因の閉塞性、拘束性または炎症性の気道疾患を処置するための、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］−Ｎ’−｛２−［（３−｛２−［（２−ヒドロキシエチル）スルファニル］フェニル｝［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピリジン−６−イル）スルファニル］ベンジル｝尿素であるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の多形性形態の使用を公開している。
また、特許文献５(Westfalische Wilhelms-Universitat Munster)は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染の共感染、または細菌感染のみの予防および／または処置のための方法に使用される、ＭＥＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、および／またはＮＦ−κＢを記載している。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、Ｍｉｈａｒａ Ｋ等(A potent and selective p38 inhibitor protects against bone damage in murine collagen-induced arthritis: a comparison with neutralization of mouse TNFalpha., Br. J.Pharmacol., 2008 (May);154(1):153-64)、およびＧａｌａｎ−Ａｒｒｉｅｒｏ Ｉ等(Early treatment with UR13870, a novel inhibitor of p38α mitogenous activated protein kinase,prevents hyperreflexia and anxiety behaviors, in the spared nerve injury modelof neuropathic pain. Neurosci. Lett. 2015 (Sep) 14;604:69-74)によって公開されている。
一般に、以下に詳述するように、多くの種々の抗炎症剤が、インフルエンザ感染に関連する炎症を処置するために、本技術分野において提示されている。
世界保健機関(WHO)は、下気道疾患、中枢神経系(CNS)障害、重篤な脱水症状の臨床的および／または放射線医学的徴候を示す、または腎不全、多臓器不全、および敗血症性ショックなどの二次性合併症（他の合併症は横紋筋融解症および心筋炎を含み得る）を示す患者におけるインフルエンザ；基礎となる慢性疾患を悪化させるインフルエンザ；臨床管理のための入院を必要とする他の状態または臨床症状があるインフルエンザ；ならびに、以下の進行性疾患の徴候および症状のいずれかがあるインフルエンザを重篤なインフルエンザと定義する。
息切れ（活動中もしくは休息時）、呼吸困難、頻呼吸、チアノーゼの発症、血痰もしくは色のついた痰、胸痛、および低血圧；子供における呼吸促迫もしくは強制呼吸；ならびにパルスオキシメトリもしくは動脈血ガス分析により示される低酸素症といった、酸素障害または心肺機能不全を示唆する症状および徴候。
精神状態の変化、無意識、眠気、もしくは目覚めの困難、反復性もしくは持続性のけいれん（発作）、混乱、重度の虚弱、または麻痺といったＣＮＳ合併症を示唆する症状および徴候。
実験室内試験または臨床徴候（例えば、回復の徴候なく２、３日を超えた持続性または反復性の高熱、および他の症状）に基づく、持続性もしくは増殖性ウイルス複製、または侵襲的二次性細菌感染症のエビデンス。
身体的または精神的活動の低下、めまい、尿排出量の低下、および嗜眠として現れる重篤な脱水症状。（パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）２００９および他のインフルエンザウイルスの薬理学的管理のためのＷＨＯガイドライン、２０１０年２月改訂、Part I提案、ｐ．５を参照。）
合併症のないインフルエンザは、上気道の軽度炎症である。炎症は、ウイルス、毒素、または刺激物質などの有害刺激損傷細胞に対する複合的な身体組織生体反応の一部であり、免疫系、血管、および多くのタンパク質に関与する防御反応である。炎症の目的は、細胞損傷の初期原因を排除して、死んだ細胞および瀕死の細胞を取り除き、組織修復を開始することである。合併症のないインフルエンザにおいて、炎症は一時的であり、損傷を受けた上気道の上皮細胞株の修復は、症状の発症後約２〜３日で開始される。
合併症のないインフルエンザに対して、重篤なインフルエンザにおける炎症反応は、それぞれ過剰になるまたは延長される。その反応は、防御的というよりも破壊的となる。血液中の高レベルの炎症誘発性タンパク質（サイトカイン）は、インフルエンザ患者における乏しい臨床成果の初期徴候である(Lee, N. et al.2011)。これらの患者において、過剰な炎症反応は、肺および他の組織における血管の損傷を引き起こして、組織への液体の漏れをもたらし得る（浮腫）。肺における流体および免疫細胞の蓄積は、肺炎、急性肺損傷、およびＡＲＤＳ、また重篤な場合は呼吸不全を引き起こし得る。重篤なインフルエンザにおけるこの過剰な炎症反応は、通常の炎症反応が異常なまたはより破壊的な反応となる移行期または転換点といった臨界点が存在する非線形のプロセスとして示され得る。重篤なインフルエンザにおいて、患者は、感染後約３日目におけるピークの症状後に回復に向かうのではなく、他の呼吸器系合併症の発症に進行し、そのプロセスは過剰な炎症反応により引き起こされる。
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＳＭ等(Endothelial activation and dysfunction in the pathogenesis of influenza A virus infection, Virulence,2013; 4(6): 537-542)は、重篤なインフルエンザの発症に先行する中心的な特徴としての内皮活性化および機能障害を裏付けるエビデンスを考察する。
重度、中等度、および軽度の症状があるインフルエンザ感染患者と、病因が不明の熱がある患者とのトランスクリプトームプロファイルを比較するために遺伝子発現マイクロアレイを用いて、Ｈｏａｎｇら(Patient-based transcriptome-wide analysis identify interferon and ubiquination pathways as potential predictors of influenza A disease severity, PloS One 2014, 9:e111640e)は、インフルエンザ感染患者が、臨床成果にかかわらず、病因不明の患者と比較して、抗ウイルスおよびサイトカイン反応のより強い誘導、およびＮＫおよびＴ細胞反応のより強い抑制を示すこと、ならびにインターフェロンおよびユビキチン化シグナリングが、中等度および軽度の結果を有する患者と比較して、最も重度の結果を有する患者において強く抑制されることを報告した。これは、重篤なインフルエンザではないインフルエンザ感染患者に対して、重篤なインフルエンザのため入院している患者からの血清中のサイトカインレベルが高いことを示す、本発明者ら自身のデータと合致する（下記実施例５を参照）。
Ｈｏａｎｇ等は、２０１４年に中等度および重度の患者においてｐ３８ＭＡＰＫシグナリングがアップレギュレートされることを発見した。ＭＭＰ９、ＳＯＣＳ３、ＩＦＩＴＭ、ＴＬＲ１０、ＲＩＧ−Ｉ、ＣＤ２４４、およびＮＣＲ３がさらなる研究の候補遺伝子として提示された。しかしながら、個々のサイトカインを標的とすることは、必要とされる広い抗炎症作用を有しにくく、炎症反応系における重複性は、複数のサイトカインを同時にノックアウトすることが治療を有効にするために必要とされる可能性があるということを意味する。
特許文献６(Liang et al.)は、インフルエンザ感染に関連する合併症または症状の重症度、強さ、または期間を少なくするための方法を記載し、その方法は、インフルエンザ感染を有する対象を診断することと、有効量のシステアミン化合物と第２のウイルス治療剤とを対象に同時に投与することとを含む。インフルエンザウイルス感染症に関連する合併症は、鼻炎、細菌感染症、心臓の合併症、神経性合併症、筋炎、腎不全、肺繊維症、喘息増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪、蓄膿症、または心不全を含み得る。第２のウイルス治療剤は、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ファムシクロビル、オセルタミビルリン酸塩、ザナミビル、バラシクロビル、鎮咳剤、粘液溶解剤、去痰剤、解熱剤、鎮痛剤、および鼻充血除去剤からなる群から選ばれ得る。
重篤なインフルエンザのための免疫調節療法は、Ｈｕｉ等(Adjunctive Therapies and Immunomodulatory Agents in the Management of Severe Influenza,Antiviral Research, 2013; 98: 410-416)、ＨｕｉおよびＬｅｅ(Adjunctive Therapies and Immunomodulatory Agents for Severe Influenza, Influenza and Other Respiratory Viruses, 2013; 7 (suppl. 3): 52-59) ならびにＬｉｕ等(Cellular & Molecular Immunology, 2015;1-8, doi:10.1038/cmi.2015.74)によって考察されている。
Ｄａｒｗｉｓｈ等(Immunomodulatory Therapyfor Severe Influenza, Expert Rev Anti Infect Ther., 2011 (Jul); 9(7): 807-22,doi: 10.1586/eri.11.56)は、インフルエンザウイルスおよび宿主の病原性決定要因について記載し、重篤なインフルエンザにおける臨床成果を改善する手段として宿主の炎症反応を標的とする免疫調節療法の使用を裏付ける証拠を提示し、抗ＴＮＦ療法、スタチン、グルココルチコイド、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、マクロライド、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼアゴニスト、および高移動度群ボックス１アンタゴニストを含む重篤なインフルエンザにおける宿主の炎症反応を標的とする治験の免疫調整剤における試験データを考察し、終末器官損傷および機能不全を媒介する有害なインフルエンザ誘発宿主反応に対する間葉系間質（幹）細胞およびアンジオポエチン−１療法の使用の根拠をもって結論づけている。
Fedson DS (Confronting an influenza pandemic with inexpensive generic agents: can it be done?, Lancet Infect. Dis., 2008; 8:571-76)は、スタチン、フィブラート、クロロキン、および他のジェネリック剤がＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡパンデミックの影響を緩和できるか否かを決定するための研究を提示する。また、Fedson DS(Confronting the next influenza pandemic with anti-inflammatory and immunomodulatory agents: why they are needed and how they might work, Influenza and Other Respiratory Viruses, 2009; 3(4): 129-142)、およびFedson DS (Treating influenza with statins and other immunomodulatory agents, Antiviral Research,2013; 99(3): 417-435)も参照される。
Ａｎ ＳＣ等 (Triple combinations of neuraminidase inhibitors,statins and fibrates benefit the survival of patients with lethal avian influenza pandemic, Medical Hypotheses, 2011; 77(6):1054-157)は、共に抗炎症および免疫調節作用ならびに他の複数の生物活性を有するスタチンとフィブラートとが、初期炎症媒介物質（例えば多くのサイトカイン／ケモカイン）または後期媒介物質（例えば高移動度群ボックスタンパク質１）のいずれかの産生を阻害することを介してＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルス感染を処置するためにノイラミニダーゼ阻害剤と組み合わせた場合に相乗作用を示し、抗ウイルス耐性の発生の阻害を伴う抗ウイルス活性さえも示し得るという仮説を述べている。
Bermejo-Martin JF等(Macrolides for the treatment of severe respiratory illness caused by novel H1N1 swine influenza viral strains, JInfect Developing Countries, 2009; 3(3): 159-161)が記載するように、マクロライドは、抗菌活性を有し、顕著な抗炎症特性も有する分子である。マクロライドは、白血球に刺激性および阻害性作用の両方を及ぼす。これらの作用は、白血球の活性化状態に関連すると考えられ、殺菌および局所的炎症の回復を促進する。新規のＨ１Ｎ１豚インフルエンザ遺伝子再集合インフルエンザウイルスにより引き起こされた重篤な疾患の処置におけるマクロライドの使用は、肺炎および致死的結果を引き起こす全身性炎症反応を抑制するために、特に抗ウイルス剤と組み合わせることが提案される。
Ｓａｔｏ Ｋ等(Therapeutic Effect of Erythromycin on Influenza Virus-induced Lung Injury in Mice, Am J Respir Crit Care Med, 1998; 157: 853-857)は、マウスのインフルエンザウイルス誘発肺炎における、慢性下気道感染の処置に用いられる強力な抗炎症作用を有する抗生剤であるエリスロマイシン（ＥＭ）の使用を評価した。そこでは、３．３ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量でのＥＭの投与（腹腔内、感染後１〜６日）がインフルエンザウイルスに感染したマウスの生存率を顕著に改善し、感染後２０日目にウイルス感染マウスの生存率が動物に投与されたＥＭの用量依存的に増加したことを発見し、具体的にコントロール群では１４％であり、１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄでＥＭが投与された動物では４２％であり、３．３ｍｇ／ｋｇ／ｄでＥＭが投与された動物では５７％であった。
Ｂoｒｇｅｌｉｎｇ等(Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase impairs influenza virus-induced primary and secondary host gene responses and protects mice from lethal H5N1 infection, J Biol Chem. 2014 Jan3;289(1):13-27)は、ごく初期段階のインフルエンザ感染におけるインターフェロンシグナリングを制御するためのＳＢ２０２１９０、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の使用、およびサイトカイン過剰発現の抑制という結果を記載している。ＳＢ２０２１９０は、ウイルスへの暴露と同時に投与される。ＳＢ２０２１９０の投与と同時になされるウイルス感染の作用は、インフルエンザ感染マウスにおいて感染後最大２日まで分析される。データは、インフルエンザウイルス感染症の発症時に（すなわち、ウイルスへの暴露と同時に）投与された場合の、サイトカイン発現におけるＳＢ２０２１９０の作用に限定される。ウイルスへの暴露後の時点における、最初のＳＢ２０２１９０投与の作用は研究されておらず、臨界点（または転換点）に達し、且つサイトカイン反応が過大および過剰になったときのＳＢ２０２１９０の作用はまず考慮されていない。
本発明の時点では、高サイトカイン血症、特に重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症を抑えるための処置に対する対処されていない要求が未だ存在している。
国際公開第０１／１９３２２号 国際公開第２００４／０７６４５０号 国際公開第０２／０５９０８３号 米国特許出願公開第２０１１／００３８４８号明細書 国際公開第２０１５／１７３７８８号 米国特許出願公開第２０１０／０１５１０４２号明細書
特に実施例に関して以下に記載されるように、本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼが、軽度または中等度インフルエンザの患者と比較して、重篤なインフルエンザの患者において顕著に活性である多数の細胞シグナリング経路でアップレギュレートされることを発見した。特に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼが３つを超えるノードを含む多様な非代謝シグナリング経路に関与することを見いだし、ノードの１００％が軽度インフルエンザの患者に対して重篤なインフルエンザ患者においてアップレギュレートされ、ノードの少なくとも７５％がＨ１Ｎ１感染または中等度インフルエンザの患者に対して重篤なインフルエンザ患者においてアップレギュレートされていることを見いだした。
ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、重篤なインフルエンザの病理においてすべて重要である種々の細胞型（上皮、内皮、および免疫）におけるシグナリングカスケードの上流に位置するノードである。重篤なインフルエンザにおける急速で進行性の特性のため、シグナリングカスケードの上流のタンパク質を標的とすることが、炎症媒介物質の産生を急速に抑えて疾病の進行を抑制するために必要とされる。
しかしながら、９５経路における他の多くの標的可能なノードが重篤なインフルエンザの処置のための潜在的標的として発明者等によって同定されたが、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、インフルエンザ感染上皮細胞から産生された炎症媒介物質の作用をシミュレートするウイルス条件培地において処理された内皮細胞からのサイトカイン、特にＩＰ１０の放出における用量依存的ノックダウン作用を示す一方、他の有望な潜在的標的は同様の作用を示さないことを予想外に見いだした。特に、下記の実施例４に示すように、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が内皮細胞においてＩＰ１０を用量依存的に阻害すること、ならびに副腎皮質ホルモンおよびマクロライドと同等である免疫細胞からの炎症媒介物質の放出を阻害する効果を示す一方、次の最も有望な標的、すなわち***促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MEK)が内皮細胞からのＩＰ１０放出を阻害することに有効でなく、実際により高い薬剤濃度においてＩＰ１０のレベルを増大させると認められる。
さらに、重篤なインフルエンザウイルス感染症は、本明細書において説明するように高サイトカイン血症によって特徴づけられることがあるので、以下に提示される実施例およびデータは、ｐ３８ＭＡＰＫ経路がより一般に高サイトカイン血症に関与する、すなわち、重篤なインフルエンザウイルス感染症以外の病態に関連する高サイトカイン血症に関与するという仮説を裏付けている。
従って、本発明の一態様によると、高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が提供される。高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんの１つ以上に関連し得る。
本発明の他の態様によると、ヒト患者における重篤なインフルエンザの処置または予防に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によると、高サイトカイン血症の処置もしくは予防に使用されるおよび／またはヒト患者における重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様において、処置または予防を必要とする対象（例えばヒト患者または動物）における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザを処置または予防する方法を提供し、該方法は、薬学的有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を対象（例えばヒト患者または動物）に投与することを含む。高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんの１つ以上に関連し得る。
特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗炎症作用および／または免疫調節作用を有する。
特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞および／または上皮細胞（例えば内皮細胞および／または免疫細胞）からの炎症誘発性媒介物質放出を阻害することによって、ヒト患者における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザの処置または予防に使用することができる。好適には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞および／または上皮細胞（例えば内皮細胞および／または免疫細胞）からの炎症誘発性媒介物質放出の阻害に有効な量で投与することができる。
より具体的に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞および／または上皮細胞（例えば内皮細胞および／または免疫細胞）からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害することによって、ヒト患者における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザの処置または予防に使用することができる。好適には、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞および／または上皮細胞（例えば内皮細胞および／または免疫細胞）からの炎症誘発性サイトカイン放出の阻害に有効な量で投与することができる。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞からの、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＭＩＰ−１ａの１つ以上、またはすべて（例えばIL1-β, IL-6,IL-8, IL-10, IP10, TNFα および／またはRANTESの１つ以上、またはすべて）の放出を阻害することができる。特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はＩＬ−１０の放出を阻害することができる。
好適に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞からの、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＭＩＰ−１ａの１つ以上、またはすべて（例えば内皮細胞および／または免疫細胞からのIL1-β, IL-6,IL-8, IL-10, IP10, TNFα および／またはRANTESの１つ以上、またはすべて）の放出の阻害に有効な量で投与することができる。特に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞からのＩＬ−１０放出の阻害に有効な量で投与することができる。
一部の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、本発明に従って、内皮細胞および／または免疫細胞からのＩＰ１０放出を阻害することによって、ヒト患者における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザの処置または予防に使用することができる。
有利には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／または免疫細胞からのサイトカイン放出を用量依存的に阻害することができる。
また、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞からのサイトカイン放出におけるその阻害作用と共に、典型的に下気道において内皮細胞に近接して位置する、免疫細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害するように作用することができる。好適に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、内皮細胞からのサイトカイン放出の阻害に有効な量で投与することができる。特に、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、内皮細胞からのサイトカイン放出の阻害、および免疫細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出の阻害に有効な量で投与することができる。
好適に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、以下の化学式Ｉのものである、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、
（化学式Ｉ）
式中、Ｒは、ハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシの１つ以上によって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである。
例えば、Ｒはハロ、ＮＲ１Ｒ２、もしくはヒドロキシルの１つ、２つ、もしくは３つによって置換されていてもよく、またはハロ、ＮＲ１Ｒ２、もしくはヒドロキシルの１つもしくは２つによって置換されていてもよく、またはハロ、ＮＲ１Ｒ２、もしくはヒドロキシルの１つによって置換されていてもよい。Ｒが、１つを超える（例えば２つまたは３つの）ハロ、ＮＲ１Ｒ２、および／またはヒドロキシルによって置換されていてもよいというとき、それらの置換基はそのリストから独立的に選ぶことができる。
Ｒ１および／またはＲ２が、１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであるとき、それぞれのＣ１−３アルキルは、例えば、１つ、２つ、もしくは３つのＦによって置換されていてもよく、１つもしくは２つのＦによって置換されていてもよく、１つもしくは３つのＦによって置換されていてもよく、１つのＦによって置換されていてもよく、または３つのＦによって置換されていてもよい。
一部の実施形態において、Ｒはメチルまたはエチルである。他の実施形態において、Ｒはプロピルであってもよい。
Ｒは、１つ以上のフッ化物原子によって置換されていてもよい。
一部の実施形態において、Ｒはヒドロキシによって置換されていてもよい。例えば、Ｒは、ω−置換アルキル、すなわちω−ヒドロキシアルキルであってもよい。このように、一実施形態において、Ｒは３−プロパノールであってもよい。
好適に、Ｒ１およびＲ２は独立的にＨおよびＣＨ３から選ぶことができる。
一部の実施形態において、Ｒは、ハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシの１つ以上によって置換されたＣ１−３アルキルであってもよく、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである。例えば、Ｒは、ハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシの１つ、２つ、または３つによって置換されたＣ１−３アルキルであってもよく、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ、２つ、もしくは３つのＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである。
一部の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩのものであってもよい、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であってもよい。
（化学式ＩＩ）
あるいは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、以下の化学式ＩＩＩのものであってもよい、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であってもよい。
（化学式ＩＩＩ）
本発明における化学式ＩＩおよびＩＩＩの化合物、ならびにそれらの化合物の合成は、国際公開第２００４／０７６４５０号に公開されている（それぞれ実施例１８および８を参照）。国際公開第２００４／０７６４５０号の内容は参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化合物が化学式ＩＩＩの化合物ではない、すなわち以下の構造を有する化合物ではないという条件で、化学式Ｉのものであってもよい、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であってもよい。
（化学式ＩＩＩ）
本明細書において「重篤なインフルエンザ」とは、インフルエンザウイルスにより引き起こされるとともに、下気道の臨床疾患および／または下気道の炎症および／または高サイトカイン血症（例えば肺または全身）を引き起こす病気を意味する。上術のように、患者が一般に例えば鼻づまり、くしゃみ、鼻漏、発熱（熱）、ならびに咳および痰の発生などの上気道および下気道の臨床的に許容できる症状を有し、患者が通常は治療介入の必要なく自然に回復するような合併症のない（軽度または中等度の）インフルエンザと、重篤なインフルエンザは区別される。重篤なインフルエンザにおいて、ウイルス感染に対する患者の炎症反応はひどく過剰になるまたは延長され、患者は、入院を必要とし得、死に至ることもある、より重篤な気道の症状または臨床合併症を発症する。そのような場合において、早期の治療介入は極めて重要である。ＷＨＯによる重篤なインフルエンザの定義により示されるように、広範囲の合併症は、上気道（鼻道、鼻洞、喉）および下気道（肺）のインフルエンザウイルス感染症により引き起こされ得る。したがって、重篤なインフルエンザの種々の患者は、病気の広範囲の種々の症状または徴候を示し得る。重篤なインフルエンザの特徴であるとして以下に記載される種々の症状または徴候は、病気の２日後、典型的には病気の２〜９日以内に観察または検出可能となり得る。
例えば、重篤なインフルエンザは、高サイトカイン血症により特徴づけられ得る。一般に、高サイトカイン血症は、上昇レベルの１つ以上のサイトカインに関与し得る。
一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−６、エオタキシン、ＩＰ１０、ＭＣＰ１、ＭＣＰ４、ＶＥＧＦ、およびＭＩＰ−１ａの１つ以上（例えばＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−６、エオタキシン、ＩＰ１０、ＭＣＰ１、ＭＣＰ４、およびＶＥＧＦの１つ以上）を含み得る。特に、一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＰ１０、ＩＬ−７、およびＭＩＰ−１ａの１つ以上（例えば、ＩＬ−８、エオタキシン、ＩＰ１０、およびＩＬ−７の１つ以上）を含み得る。
一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＰ１０の１つ以上を含み得る（Lee N. et al.,2011; Lee N. et al., Viral clearance and inflammatory response patterns inadults hospitalised for pandemic 2009 influenza A (H1N1) virus pneumonia,Antiviral Therapy, 2011; 16: 237-47を参照。）。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＩＬ−６のレベルをその血漿における基準範囲（＜３．１ｐｇ／ｍｌ）の約１．５または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては約１０、１５、または３０倍より大きく、約５４倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約４．７ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−６レベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、季節性インフルエンザの場合に約４．７ｐｇ／ｍｌより大きく、またパンデミックインフルエンザの場合に約７．８ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−６レベルを上昇させることに関与する。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＩＬ−８のレベルをその血漿における基準範囲（＜５．０ｐｇ／ｍｌ）の約１または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては約４倍より大きく、約８、１０、または１２倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約５．０ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−８レベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、季節性インフルエンザの場合に約５．０ｐｇ／ｍｌより大きく、またパンデミックインフルエンザの場合に約１１．６ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−８レベルを上昇させることに関与し得る。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＩＰ−１０のレベルをその血漿における基準範囲（２０２〜１４８０ｐｇ／ｍｌ）の約１または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては１．１倍より大きく、１．５倍より大きく、または約２、３、４、５、６、７、もしくは８倍より大きく、約１０、２０、または３０倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約８３５ｐｇ／ｍｌより大きくＩＰ−１０レベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、パンデミックインフルエンザの場合に約８３５ｐｇ／ｍｌより大きく、また季節性インフルエンザの場合に約１４７６ｐｇ／ｍｌより大きくＩＰ−１０レベルを上昇させることに関与し得る。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＭＣＰ−１のレベルをその血漿における基準範囲（＜１０．０〜５７．０ｐｇ／ｍｌ）の約１または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては約４倍より大きく、約５．５倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約５２．９ｐｇ／ｍｌより大きくＭＣＰ−１レベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、パンデミックインフルエンザの場合に約５２．９ｐｇ／ｍｌより大きく、また季節性インフルエンザの場合に約６４．８ｐｇ／ｍｌより大きくＭＣＰ−１レベルを上昇させることに関与し得る。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ｓＴＮＦＲ−１のレベルをその血漿における基準範囲（４８４〜１４０７ｐｇ／ｍｌ）の約１または２倍より大きく、約２．５倍以上まで、上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約１０９９．４ｐｇ／ｍｌより大きくｓＴＮＦＲ−１レベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、季節性インフルエンザの場合に約１０９９．４ｐｇ／ｍｌより大きく、またパンデミックインフルエンザの場合に約１２５０．７ｐｇ／ｍｌより大きくｓＴＮＦＲ−１レベルを上昇させることに関与し得る。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＭＩＧのレベルをその血漿における基準範囲（４８．０〜４８２．０ｐｇ／ｍｌ）の約１または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては１．１倍より大きく、１．５倍より大きく、または約２倍より大きく、約１５、４０、または５０倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約１０３．８ｐｇ／ｍｌより大きくＭＩＧレベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、季節性インフルエンザの場合に約１０３．８ｐｇ／ｍｌより大きく、またパンデミックインフルエンザの場合に約１１８．７ｐｇ／ｍｌより大きくＭＩＧレベルを上昇させることに関与し得る。
一部の実施形態において、高サイトカイン血症は、ＩＬ−１７Ａのレベルをその血漿における基準範囲（＜１０．０ｐｇ／ｍｌ）の約１、１．５または２倍より大きく上昇させること、一部の実施形態においては４倍より大きく、５倍より大きく、または６倍より大きく、約７倍以上まで上昇させることに関与し得る。したがって、高サイトカイン血症は、約５．０ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−１７Ａレベルを上昇させることに関与し得る。より具体的には、高サイトカイン血症は、パンデミックインフルエンザの場合に約５．０ｐｇ／ｍｌより大きく、また季節性インフルエンザの場合に約９．３ｐｇ／ｍｌより大きくＩＬ−１７Ａレベルを上昇させることに関与し得る。
重篤なインフルエンザは、一部の実施形態において、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１、ｓＴＮＦＲ−１、および／またはＭＩＰ−１ａ、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１、および／またはｓＴＮＦＲ−１）の持続的活性化によって特徴づけることができる。本発明は、本明細書に開示するように使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／もしくは免疫細胞および／もしくは上皮細胞からの、例えば内皮細胞および免疫細胞からの、または内皮細胞、免疫細胞、および上皮細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害する。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、さらなる薬剤と組み合わせて投与することができる。特に、また、本発明は、抗微生物剤（抗ウイルス剤など）、または抗がん剤、および好ましくは抗微生物剤（抗ウイルス剤など）と組み合わせて投与されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／もしくは免疫細胞および／もしくは上皮細胞からの、例えば内皮細胞および免疫細胞からの、または内皮細胞、免疫細胞、および上皮細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害する。
また、本発明は、本明細書に記載するように処置または予防を必要とする対象（例えばヒト患者または動物）における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザを処置または予防する方法（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）を処置もしくは予防する方法、ならびに／または、重篤なインフルエンザの処置もしくは予防する方法）を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／もしくは免疫細胞および／もしくは上皮細胞からの、例えば内皮細胞および免疫細胞からの、または内皮細胞、免疫細胞、および上皮細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害する。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、さらなる薬剤と組み合わせて投与することができる。特に、また、本発明は、本明細書に記載するように処置または予防を必要とする対象（例えばヒト患者または動物）における高サイトカイン血症および／または重篤なインフルエンザを処置または予防する方法を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗微生物剤（抗ウイルス剤など）、または抗がん剤、好ましくは抗微生物剤（抗ウイルス剤など）と組み合わせて投与され、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、内皮細胞および／もしくは免疫細胞および／もしくは上皮細胞からの、例えば内皮細胞および免疫細胞からの、または内皮細胞、免疫細胞、および上皮細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出を阻害する。
サイトカインのレベルは、患者の全血、血清、血漿、鼻洗浄液、鼻汁、または気管支肺胞洗浄液で検出することができる。サイトカインのレベルは、当業者には既知である任意の適切な技術を用いて定量することができる。好適には、酵素結合免疫吸着法(ELISA)または蛍光自動細胞選別法(FACs)を用いることができる。一例として、例えばＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣから入手されるもののような化学発光免疫アッセイ系(http://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)を、その速さおよび感度用に採用することができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、顕著に多い総白血球数を伴い得る。重篤なインフルエンザの患者は、軽度または中等度のインフルエンザの患者よりも顕著に多い好中球絶対数を有し得る。一般に、病気の２〜９日後の重篤なインフルエンザ患者は、２．１〜２４．５×１０３／μｌの範囲の好中球数を有し得る（比較として、病気の１〜９日後の中等度インフルエンザ患者は０．６２〜１０．８８×１０３／μｌの範囲の好中球数を有し得、または、病気の３〜８日後の軽度インフルエンザ患者は０．５〜６．５×１０３／μｌの範囲の好中球数を有し得る。）。一部の実施形態において、血小板絶対数は、病気の２〜９日後の重篤なインフルエンザ患者において例えば２７〜２５０×１０３／μｌと顕著に低くなり得る（比較として、病気の１〜９日後の中等度インフルエンザ患者は５５〜３４５×１０３／μｌの範囲の血小板数を有し得、または、病気の３〜８日後の軽度インフルエンザ患者は７９〜３７０×１０３／μｌの範囲の血小板数を有し得る。）(Hoang et al.,2014)。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、低酸素血症または心配機能低下の症状または徴候により特徴づけることができる。一部の実施形態において、患者は、経皮的方法により室内気において≦９２％の動脈血酸素飽和度を有し得る。一般に、低酸素血症または心配機能低下の症状または徴候は、呼吸困難、頻呼吸、チアノーゼ、低血圧（年齢および性別での正常範囲は以下に示される）および頻脈の１つ以上を含み得る。
一部の実施形態において、患者は、頻呼吸（１２歳以上で呼吸数≧３０、６〜１２歳で呼吸数≧４０、３〜６歳で呼吸数≧４５、１〜３歳で呼吸数≧５０）を有し得る。
一部の実施形態において、患者は、呼吸の不快感または呼吸困難の徴候（全文を話すことができない、息を切らす、呼吸補助筋を用いる）を有するまたは示し得る。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、放射線学的肺浸潤があるまたはない下気道障害との併存疾患により特徴づけることができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、精神状態の変化、無意識、眠気、目覚めの困難、反復性けいれん、混乱、筋肉痛、重度の虚弱、麻痺、および知覚障害（例えば手足の刺痛、正常な痛覚の欠如）を含む例えば脳炎、脊髄炎、または横紋筋融解症などのＣＮＳおよび／または末梢神経筋障害を示唆する症状または徴候により特徴づけることができる。
またさらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、重篤な脱水症状により特徴づけることができる。ＷＨＯは、成人で９％を超える体重減少（子供では１５％を超える減少）を重篤な脱水症状と定義する(K. Sinha and M.Davenport (eds.), Handbook of Pediatric Surgery,doi:10.1007/978-1-84882-132-3_2.1, Springer-Verlag London Limited 2010)。本発明によると、重篤なインフルエンザは、９％を超える、例えば１０〜１５％の体液喪失に関与し得る。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、異常なレベルの疲労および／または嗜眠により特徴づけることができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、放射線学的肺浸潤の存在により特徴づけることができる。
またさらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、持続的ウイルス感染または複製のエビデンスに関与する。一部の実施形態において、患者は、標準的な実験室内の方法を用いてアッセイされ得る、または持続性のもしくは悪化する症状の特定により診断され得る、一定のまたは増大するウイルス複製を２日を超えて示し得る。一部の実施形態において、患者は、一定のまたは増大するウイルス複製を３、４、５、またはそれ以上の日数示し得る。したがって、一部の実施形態において、本発明に係る重篤なインフルエンザは、回復の徴候がなく２、３、４、５日またはそれ以上の間、持続または反復される症状により特徴づけることができる。持続または反復される症状は、熱（すなわち１００°Ｆ／３８℃を超える温度）、嗜眠、疼痛、うっ血、咳、鼻づまり、鼻漏、または上気道うっ血、もしくは炎症を含むことができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、二次性細菌感染により特徴づけることができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、下気道障害または炎症により特徴づけることができる。
さらに、またはあるいは、重篤なインフルエンザは、単一臓器不全もしくは多臓器不全（例えば呼吸不全もしくは腎不全）または敗血症性ショックにより特徴づけることができる。
一部の実施形態において、患者は、幼児（すなわち１歳未満）もしくは高齢者（すなわち６５歳以上）であってもよく、または妊婦であってもよい。
一部の実施形態において、ヒト患者は、その患者を重篤なインフルエンザに罹り易くする１つ以上の併存基礎疾患を有し得る。例えば、患者は、免疫不全であるか、またはＣＯＰＤ、重篤な遺伝性貧血、喘息、もしくは糖尿病、慢性の肝不全もしくは腎不全、肥満、もしくは心血管障害もしくは病態に罹患し得る。
したがって、一部の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は予防的に患者に投与されてもよく、特にその場合、患者は前段落に記載するような「高リスク」群または「リスク」群にある。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、高サイトカイン血症が発症した後に、例えば患者が入院した後に、患者に投与されてもよい。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、通常の炎症反応が異常な反応となる臨界点（しきい値または転換点）後に投与されてもよい。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、高サイトカイン血症発症を予防するため、すなわち臨界点に達する前に投与されてもよい。臨界点はサイトカインのしきい値レベルによって特徴づけられる。サイトカインのしきい値レベルは、部分的に、患者に対応したものであり得る。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、免疫反応誘発の少なくとも８時間後、例えば、免疫反応誘発の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７時間後に最初に投与されてもよい。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、免疫反応誘発の少なくとも４８時間後、免疫反応誘発の少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１３２時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１５６時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１８０時間、少なくとも１９２時間、少なくとも２０４時間、少なくとも２１６時間、少なくとも２２８時間、少なくとも２４０時間後に最初に投与されてもよい。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、免疫反応誘発後、複数の時点で複数のときに投与されてもよい。免疫反応は、例えば病原体への暴露によって、例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症を引き起こすインフルエンザウイルス感染によって誘発され得、または、免疫反応は、がんによって誘発され得、もしくは自己免疫性反応によって誘発され得る。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、または１０ｍｇ〜４００ｍｇの用量で投与されてもよい。１〜１０日間、例えば２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間、単一用量または複数回用量で１日あたり１０００ｍｇ以下を投与してもよい。
また、本発明は、さらなる薬剤と組み合わせて投与されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供する。特に、また、本発明は、抗ウイルス剤などの抗微生物剤、または抗がん剤、好ましくは抗ウイルス剤などの抗微生物剤と組み合わせて投与されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供する。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤がさらなる薬剤（例えば抗ウイルス剤などの抗微生物剤、または抗がん剤）と組み合わせて投与されるとき、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびさらなる薬剤は共に投与されてもよく、または、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびさらなる薬剤は連続して投与されてもよく、または、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびさらなる薬剤は個別に投与されてもよい。特に、さらなる薬剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤より前に投与されてもよい。
好ましくは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびさらなる薬剤（例えば抗ウイルス剤などの抗微生物剤、または抗がん剤）は、例えば、共に投与するための、例えば共に経口投与するための単一投与剤形で、共に投与されてもよい。また、単一投与剤形は、「単位用量」または「単位投与剤形」とも呼ばれ得る。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびさらなる薬剤を含む単一投与剤形は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とさらなる薬剤との混合物、およびまた任意で薬学的に許容される賦形剤などの不活性成分を含む。共に経口投与するための単一投与剤形は、例えば、錠剤、散剤、またはカプセル剤であってもよい。
また、本発明は、本明細書に記載するように使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、全身性または非全身性、好ましくは全身性、特に経口での投与がなされる。
また、本発明は、本明細書に記載するように使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）医薬組成物を提供し、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。
抗ウイルス剤（例えば、ノイラミニダーゼ阻害抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビルリン酸塩））と組み合わせて投与されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤）を提供する本発明の実施形態は、特に本発明の実施形態として好ましいものであり、これは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が抗ウイルス剤（例えば、ノイラミニダーゼ阻害抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビルリン酸塩））の作用を妨害せず、抗ウイルス剤（例えば、ノイラミニダーゼ阻害抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビルリン酸塩））がｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の作用を妨害しないということを、驚いたことに発明者らが見いだしたためである。
本発明の他の態様において、対象（例えばヒト患者または動物）における本明細書に記載するような処置の方法（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防の方法、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防の方法）を提供し、該方法は、処置または予防を必要とする対象に治療有効量のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を投与することを含み、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、対象（例えばヒト患者または動物）に全身性または非全身性、好ましくは全身性、特に経口での投与がなされる。
図１は、シグナリング経路の識別を示す。 図２Ａ−Ｂは、ＩＬ−１、ＴＮＦα、およびＩＬ−６刺激経路における遺伝子活性のマッピングを示す。これらのサイトカインは、インフルエンザウイルス感染細胞によって産生され、インフルエンザに感染した、特に重篤なインフルエンザにより入院したヒトの血液において増加すると分かっている。網掛け線は遺伝子発現レベルを示し、右上から左下への斜線はアップレギュレートを示し（例えばＴＮＦ−α）、および左上から右下への斜線（例えばＬＢＰ）はダウンレギュレートを示し、アップレギュレートおよびダウンレギュレートの両方がなされる遺伝子は格子状網掛けによって示される。線の間隔は、アップまたはダウンレギュレーションの強度を示し、線の間隔がより密であればより強い活性化を示す。マップは、ＩＰＡを用いて作製した。経路を通る「ルート」は、形質膜から核にまで及ぶタンパク質の単一の連続するつながりとして定義される。 図３は、図２のＩＬ−６経路におけるルートのスコアリングの例を示す。 図４は、重篤なインフルエンザの病理に関与する３つの重要な細胞型を示す。 図５は、ヒト上皮細胞におけるインフルエンザ「スープ」の作製、および電気化学発光分析を示す模式図である。感染細胞の「スープ」は、臨床サンプルに見られる重要なサイトカインを含む。 図６は、ウイルススープの適用を受けたリン酸化ｐ３８およびＨＳＰ２７のウェスタンブロット、およびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＰＨ７９７８０４を使用した上皮細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。ウイルススープの適用による炎症性サイトカイン産生の電気化学発光分析、および上皮細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。 図７は、ウイルススープの適用を受けたリン酸化ＨＳＰ２７のウェスタンブロット、および内皮細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。ウイルススープの適用による炎症性サイトカイン産生の電気化学発光分析、および内皮細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。 図８は、ウイルススープの適用を受けたリン酸化ＨＳＰ２７のウェスタンブロット、および免疫細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。ウイルススープの適用による炎症性サイトカイン産生の電気化学発光分析、および免疫細胞におけるＰ３８阻害作用を示す。Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の濃度増加に応じた免疫細胞の細胞生存度を示す。 図９は、ＬＰＳ、ＣＤ−３、およびウイルススープの適用による炎症性サイトカイン産生の電気化学発光分析を示す。免疫細胞のウイルススープ誘発炎症性サイトカインにおけるＰ３８阻害作用を示す。 図１０は、７０％ＨＢＥＣウイルススープにより刺激されたＨＵＶＥＣによるＩＰ１０産生におけるｐ３８およびＭＥＫ阻害剤の作用を示す。分泌サイトカインレベルは電気化学発光によりアッセイした。統計的有意性は、ダネットの多重比較ポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて算出した。 図１１は、免疫細胞からのＩＬ−１ｂの産生における化合物の作用を示す。ドットプロットにおける各点は、個々の実験を表す。統計的有意性は、ダネットの多重比較ポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて算出した。 図１２は、免疫細胞からのＴＮＦαの産生における化合物の作用を示す。ドットプロットにおける各点は、個々の実験を表す。統計的有意性は、ダネットの多重比較ポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて算出した。 図１３は、内皮細胞からのＩＰ１０の産生における化合物の作用を示す。ドットプロットにおける各点は、個々の実験を表す。統計的有意性は、ダネットの多重比較ポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて算出した。 図１４は、内皮細胞からのＩＬ８の産生における化合物の作用を示す。ドットプロットにおける各点は、個々の実験を表す。統計的有意性は、ダネットの多重比較ポストホック検定を伴う一元配置分散分析を用いて算出した。 図１５は、インフルエンザウイルスに感染させた２８人の健常なボランティア（−１日目から２８日目までサンプル回収、白抜きのドット）、および重篤なインフルエンザにより入院した３０人の個人（黒塗りのドット）におけるサイトカインレベルを示す。重篤な患者からの血液サンプルを入院後２４〜７２時間に回収した。感染させた健常なボランティア（Ｄ２およびＤ３）と入院患者（インフルエンザＡまたはＢ）とのサイトカインレベルの差の統計的有意性は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて算出した。 図１６は、ＭＳＤ分析によって測定したＨＢＥＣ細胞の炎症媒介物質産生におけるＨＢＥＣウイルススープの作用、および化学式ＩＩＩの化合物の阻害作用を示す。 図１７は、内皮細胞においてＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＨＢＥＣウイルススープで処理したＨＵＶＥＣ細胞による炎症性サイトカイン産生、および化学式ＩＩＩの化合物の阻害作用を示す。 図１８は、免疫細胞においてＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＡ５４９ウイルススープで処理した免疫細胞における炎症性サイトカイン産生、および化学式ＩＩＩの化合物の阻害作用を示す。 図１９は、Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤をオセルタミビルと組み合わせた作用を示す。 図２０は、内皮細胞においてＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＨＢＥＣウイルススープで処理したＨＵＶＥＣ細胞による炎症性サイトカイン産生、および化学式ＩＩの化合物の阻害作用を示す。 図２１は、免疫細胞においてＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＡ５４９ウイルススープで処理した免疫細胞における炎症性サイトカイン産生、および化学式ＩＩの化合物の阻害作用を示す。 図２２は、オセルタミビルの抗ウイルス特性における化学式ＩＩの化合物をオセルタミビルと組み合わせた作用を示す。 図２３は、化学式ＩＩの化合物の抗炎症特性における化学式ＩＩの化合物をオセルタミビルと組み合わせた作用を示す。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ひとつの確立された活性剤群である（例えばZarubin and Han,Cell Research (2005) 15, 11-18.doi:10.1038/sj.cr.7290257を参照）。当業者は、広範囲のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を入手可能である（例えば、参照することにより本明細書に援用されるLee, et al.,Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy, Immunopharmacol., 2000;47(2-3): 185-201. doi:10.1016/S0162-3109(00)00206-X参照）。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の例は、ＶＸ−７４５、ＶＸ−７０２、ＲＯ−４４０２２５７、ＳＣＩＯ−４６９、ＢＩＲＢ−７４６、ＳＤ−０００６、ＰＨ−７８７８０４、ＡＭＧ−５４８、ＳＢ−６８１３２３(ディルマピモド)、ＬＹ２２２８８２０、ＧＷ−８５６５５３、ＲＷＪ６７６５７、およびＢＣＴ−１９７を含む(参照することにより本明細書に援用されるXing, L., MAPK inase 2015, Vol. 4:5508)。これらは、ヒトにおける試験に至ったｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の例である。
本発明の好ましいｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式Ｉで表され、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、
（化学式Ｉ）
式中、Ｒは上述のとおりである。
化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有することができる。
（化学式ＩＩ）
化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有することができる。
（化学式ＩＩＩ）
化学式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は類似の構造を有し、すべてｐ３８ＭＡＰＫ活性部位と相互作用してｐ３８ＭＡＰＫ媒介シグナリングを阻害すると考えられる。化学式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの阻害剤は、特に、ｐ３８αおよびｐ３８βを阻害すると考えられる。
化学式Ｉの化合物は、以下に記載されるものなど、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤として特定の利点を有することができる。化学式Ｉの範囲内の特定の化合物は、特に好ましい薬物動態特性（および、特に、化合物を特に経口投与に適するようにする好ましい薬物動態特性）、ならびに／または、低副作用プロファイルおよび／もしくは低毒性を有することによる好ましい特性を有することができる。そうした化合物は、Ｒが置換されたＣ１−３アルキル基である、および／または、Ｒが置換されたもしくは置換されていないプロピル部分である化学式Ｉの化合物、例えば、Ｒがプロパン−３−オールである化学式ＩＩの化合物を含む。
本発明に従ったｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の使用は、高サイトカイン血症の処置または予防を目的とする。上述のように、高サイトカイン血症は過剰な炎症反応によって特徴づけられ、通常の反応が異常な反応となるとともに、高サイトカイン血症が発症する臨界点（すなわち、しきい値または転換点）が存在する。臨界点はサイトカインのしきい値レベルによって特徴づけられる。サイトカインのしきい値レベルは、部分的に、患者に対応したものであり得る。
高サイトカイン血症は、多くの感染病態および非感染病態に関連し得る。特に、高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんに関連し得る。
特に、本発明に従ったｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の使用は、その防御作用および疾患回復促進作用を保ちながら、制御不能な炎症の傷害作用を鈍化する目的で、重篤なインフルエンザの患者における炎症反応を除くというよりも抑えることを目的とする。炎症をすべて除くことは、重篤なインフルエンザにおける死亡率を高める可能性があるが、この爆発的プロセスを抑えることは、宿主本来の防御活性を保ちながら、過剰な炎症反応に起因する傷害作用に対する防御となると考えられる。したがって、本発明は、それら要素全体をノックアウトするよりも「システムのバランスを取り戻す」ことを目的とする。
特に、重篤なインフルエンザに関連する高サイトカイン血症の患者における炎症反応を抑えることで「システムのバランスを取り戻す」ことに有用なｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式Ｉの化合物、ならびに特に、Ｒが置換されたＣ１−３アルキル基である、および／または、Ｒが置換されたもしくは置換されていないプロピル基である化学式Ｉの化合物、例えば、Ｒがプロパン−３−オールである化学式ＩＩの化合物を含む。そうした化合物は、例えば以下の図１７、１８、２０、および２１における実施例６および８の結果に示すように、重篤なインフルエンザの患者において炎症反応を抑えることに非常に有効であり得るが、免疫反応全体を除くわけではない。
さらに、以下の実施例６〜実施例８において、単純な（TNFaとIL-6）および複合的な（HBECまたはA459ウイルススープ）刺激を与えて、内皮細胞および免疫細胞においてインフルエンザ感染上皮細胞によって産生された炎症媒介物質の相互作用をシミュレートしたとき、化学式ＩＩの化合物は、内皮細胞および免疫細胞における免疫反応を抑えることにおいて、化学式ＩＩＩの化合物よりも一貫してより良好な作用を示した。したがって、所定の実施形態において、化学式Ｉの化合物は、好ましくは、Ｒが置換されたＣ１−３アルキル基である、および／または、Ｒが置換されたもしくは置換されていないプロピル部分であるものであり、より好ましくは、化学式Ｉの化合物は化学式ＩＩの化合物である。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗微生物剤と組み合わせて投与することができる。抗微生物剤は、抗菌剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、および／または、抗微生物モノクローナル抗体のうちの任意の１つ以上であり得る。抗微生物モノクローナル抗体は、微生物病を処置または予防しようとするために使用される任意のモノクローナル抗体である。
特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗ウイルス剤と組み合わせて投与することができる。抗ウイルス剤は、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ファムシクロビル、バラシクロビル、鎮咳剤、粘液溶解剤、去痰剤、解熱剤、鎮痛剤、および／または鼻充血除去剤、またはそれらの薬学的に許容される塩のうちの任意の１つ以上であり得る。好ましくは、抗ウイルス剤は、オセルタミビルリン酸塩、ザナミビル、ペラミビル、および／またはラニナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤である。好ましい態様において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、オセルタミビル、またはその薬学的に許容される塩（例えばオセルタミビルリン酸塩）と組み合わせて投与される。理論に縛られることを望まないが、オセルタミビルリン酸塩がインフルエンザ感染を処置する（抗ウイルス作用を有する）一方、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は高サイトカイン血症に対する免疫調節作用を有するという仮説が立てられる。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗ウイルス剤（ノイラミニダーゼ阻害抗ウイルス剤（例えばオセルタミビルリン酸塩）など）、より具体的には、化学式Ｉのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびノイラミニダーゼ阻害抗ウイルス剤（例えばオセルタミビルリン酸塩）が、互いの活性を大きく妨害しない、すなわち、抗ウイルス剤はｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の抗炎症抑制作用を打ち消さず、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は抗ウイルス剤の抗ウイルス作用を打ち消さないということが、本発明者らによって驚いたことに見いだされている。例えば、以下の図２２および図２３における実施例９の結果は、オセルタミビルを化学式ＩＩの化合物と組み合わせたとき、オセルタミビル単独で見受けられるレベルまでＴＣＩＤ５０が下がり、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤治療が、実質的にその抗ウイルス活性に影響を与えることなくオセルタミビルと組み合わせて用いられ得るということを示し（図２２）、また、オセルタミビルが化学式ＩＩの化合物の抗炎症特性に与える作用は観察されないということを示した（図２３）、ということを提示している。
上述されるように、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害化合物の抗炎症特性は、重篤なインフルエンザに関連する高サイトカイン血症の処置に使用されるときに身体において炎症の「システムのバランスを取り戻す」ように本発明に従って使用することができるので、これらの薬剤の非妨害性は特に有利である。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の抗炎症特性の任意の増加または減少により、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害化合物のバランス作用が喪失し得る、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の抗炎症特性の減少は、制御不能な炎症の傷害作用を十分に鈍化しないかもしれず、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の抗炎症特性の増加は、身体の炎症反応の必要とされる防御作用および疾患回復促進作用を排除し得る。また、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤化合物は、抗ウイルス剤の抗ウイルス作用に不利に影響しないということは有利である。
ゆえに、他の実施形態において、本発明は、本発明において使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、重篤なインフルエンザの処置のために抗ウイルス剤を投与している患者に投与される。そうした実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、例えば、抗ウイルス剤の投与の７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、１６時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間内に投与されてもよい。抗ウイルス剤は、上述のようなもの（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明において使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗ウイルス剤の投与を含む重篤なインフルエンザの処置を受けている患者に投与される。そうした実施形態において、患者は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での処置前に、抗ウイルス剤を、少なくとも１時間（例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも２時間（例えば、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも４時間（例えば、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも８時間（例えば、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも１２時間（例えば、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも１日間（１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも２日間（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、または、３日間（例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）投与することを含む重篤なインフルエンザの処置を受けていてもよい。抗ウイルス剤は、上述のようなもの（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。
他の実施形態において、本発明は、本発明に記載されるようにヒト患者の高サイトカイン血症を処置または予防する方法（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）を処置もしくは予防する方法、および／または重篤なインフルエンザを処置もしくは予防する方法）を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、重篤なインフルエンザの処置のために抗ウイルス剤を投与している患者に投与される。そうした実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、例えば、抗ウイルス剤の投与の７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、１６時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間内に投与されてもよい。抗ウイルス剤は、上述のようなもの（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。
抗ウイルス剤がオセルタミビルまたはその塩である実施形態において、特に、抗ウイルス剤がオセルタミビルリン酸塩である実施形態において、オセルタミビルまたはその塩（例えばオセルタミビルリン酸塩）は、約１ｍｇ〜２００ｍｇ、例えば、５ｍｇ〜１００ｍｇ（例えば５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４５、５０、７５、または１００ｍｇ）、好ましくは６ｍｇ〜７５ｍｇ（好ましくは６、１２、３０、４５、または７５ｍｇ）の用量で投与されてもよい。単一用量または複数回用量の抗ウイルス剤が、例えば１日につき１用量、または１日につき２用量など、１日に投与されてもよい。
抗ウイルス剤がオセルタミビルまたはその塩である実施形態において、特に、抗ウイルス剤がオセルタミビルリン酸塩である実施形態において、オセルタミビルまたはその塩（例えばオセルタミビルリン酸塩）は、約１〜７５０μｇ／Ｌ、好ましくは５〜６００μｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００μｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜５００μｇ／Ｌ、およびより好ましくは５０〜５００μｇ／Ｌ、例えば１００〜４００μｇ／Ｌのオセルタミビルカルボキシレート血漿レベルを得る用量として投与されてもよい。上述のようなオセルタミビルカルボキシレートの血漿レベルを得るため、単一用量または複数回用量の抗ウイルス剤が、例えば１日につき１用量、または１日につき２用量など、１日に投与されてもよい。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明に記載されるようにヒト患者の高サイトカイン血症を処置または予防する方法（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）を処置もしくは予防する方法、および／または重篤なインフルエンザを処置もしくは予防する方法）を提供し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗ウイルス剤の投与を含む重篤なインフルエンザの処置を受けている患者に投与される。そうした実施形態において、患者は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での処置前に、抗ウイルス剤を、少なくとも１時間（例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも２時間（例えば、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも４時間（例えば、４時間、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも８時間（例えば、８時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも１２時間（例えば、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも１日間（１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、少なくとも２日間（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）、または、３日間（例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、もしくは１０日間）投与することを含む重篤なインフルエンザの処置を受けていてもよい。抗ウイルス剤は、上述のようなもの（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗がん剤と組み合わせて投与することができる。抗がん剤は、がんを処置または予防しようとするために使用される任意の薬剤である。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、経口、または経表皮、経口腔、経鼻腔内、もしくは吸入によって（エアロゾル）、もしくは経鼻腔内および吸入によっての両方を含む経局所、または非経口（例えば経静脈内、経皮下）、または経局所および非経口の組合せなどの全身性または非全身性の投与がなされ得る。
本明細書で使用するとき、「経局所」は非全身性投与を含む。これは、化合物を表皮もしくは口腔に外用塗布すること、ならびに／または、そうした化合物を耳、目、および鼻に滴注することを含む。
本明細書で使用するとき、「全身性投与」は、経口、静脈内、腹腔内、および筋肉内の投与、皮下、鼻腔内、直腸内、または膣内の投与を指す。
特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は静脈内投与することができる。好ましくは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は経口投与される。経口投与により、局所的作用ではなく全身性作用を可能とする。これは、高サイトカイン血症（特に重篤なインフルエンザに関連する高サイトカイン血症）に関連する、および／または影響されるすべての細胞型を、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤で処置することを可能にし得るので有利である（すなわち内皮細胞、上皮細胞、および／または免疫細胞）。さらに、経口剤、例えば錠剤は、摂取が容易であるので、患者のコンプライアンス向上に関与する。経口投与は、吸入などの他の投与経路が困難であるとき、例えば、患者が肺合併症に罹患するとき、特に有利である。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の最適な個々の投与量および投与間隔は、処置される病態の特徴および程度、投与の形態、経路、および部位、処置される特定の患者によって決定され得、そうした最適条件は従来の技術によって決定することができるということが、当業者に認識され得る。また、最適な処置の方針、すなわち所定の日数において１日につき投与されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の用量数は、従来の治療決定試験の方針を用いて当業者によって確認可能であるということが当業者に理解される。しかしながら、その重要なシグナリングの役割から、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを標的とすることは望ましくない副作用を引き起こし得る。任意のそうした副作用を最小化するため、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、最長で１〜５日の期間、好ましくは１〜３日間、本発明に従って患者に投与されてもよい。一部の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は１日または２日間のみ投与することができる。また、任意の有害な副作用を最小化するため、１日１回の処置が好ましい。
本発明のさらに他の態様において、ヒト患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用される医薬組成物が提供され、該組成物は、化学式Ｉ、化学式ＩＩ、および／または化学式ＩＩＩ、薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含む。
特に、ヒト患者における重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される医薬組成物が提供され、該組成物は、任意で１つ以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせた、化学式Ｉ、化学式ＩＩ、および／または化学式ＩＩＩ、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物を有するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含む。希釈剤および担体は、非経口、経口、局所、経粘膜、および経直腸の投与に適するものを含むことができる。
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、化学式Ｉ、化学式ＩＩ、および／または化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤）を含む医薬組成物は、さらなる薬剤をさらに含む、またはさらなる薬剤と組み合わせて投与することができる。さらなる薬剤は、抗微生物剤、または抗がん剤であり得る。特に、さらなる薬剤は、抗ウイルス剤、より具体的にはオセルタミビルまたは薬学的に許容されるその塩（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される塩または溶媒和物」という用語は、対象の化合物における所望の生物学的活性を保持するとともに、望ましくない毒性学的作用を最小にする塩または溶媒和物を指す。これらの薬学的に許容される塩は、化合物の最終的な単離および精製時にその場で、または、その遊離酸形態もしくは遊離塩基形態の精製化合物をそれぞれ適切な塩基もしくは酸と個別に反応させて、調製することができる。
本発明の化合物は、結晶または非晶質（アモルファス）形態で、またはそれらの混合物として存在することができる。結晶形態である本発明の化合物について、溶媒分子を結晶化時に結晶格子に導入するように薬学的に許容される溶媒和物が形成され得るということを、当業者は理解する。溶媒和物は、エタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、エタノールアミン、およびエチルアセテートなどの非水性溶媒に関与し得、または、結晶格子に導入される溶媒として水に関与し得る。水が結晶格子に導入される溶媒である溶媒和物は、一般に「水和物」として表される。水和物は、化学量論的水和物、および実質的な量の水を含む組成物を含む。本発明はすべてのそうした溶媒和物を含む。
その種々の溶媒和物を含む、結晶形態で存在する本発明の特定の化合物は、多形を示し得る（すなわち、種々の結晶構造を取る能力）。これらの種々の結晶形態は、一般に「多形体」として既知である。本発明はすべてのそうした多形体を含む。多形体は、同じ化学組成を有するが、結晶固体状態のパッキング、幾何学的配置、および記述における特性において異なる。したがって、多形体は、形状、密度、硬度、変形性、安定性、および融解の特性などの種々の物性を有し得る。多形体は、典型的に、同定に使用され得る種々の融点、ＩＲスペクトル、およびＸ線粉末回折パターンを示す。種々の多形体は、例えば、化合物の作製に使用される反応条件または試薬を変える、または調整することで作製することができる。例えば、温度、圧力、または溶媒を変えることにより多形体となり得る。さらに、ある多形体を、所定の条件下で自然に他の多形体に変換することができる。
本発明の医薬組成物は、例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、または関節周囲の投与用に、特に液剤または懸濁剤の形態で調製され、経口投与用に、特に錠剤またはカプセル剤の形態で調製され、例えば肺または鼻腔内投与といった局所投与用に、特に散剤、点鼻剤、もしくはエアロゾル、および経皮投与の形態で調製され、例えば口腔、舌下、もしくは膣粘膜への粘膜投与用、および直腸投与用に、例えば坐剤の形態で調製され得る。
組成物は、単位投与剤形で簡便に投与され、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985))に記載されるような医薬分野で既知の方法のいずれかにより調製することができる。非経口投与用の製剤は、賦形剤として滅菌水もしくは生理食塩水、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性の油、水素化されたナフタレン等を含むことができる。経鼻投与用の製剤は、固体であってもよく、例えばラクトースもしくはデキストランといった賦形剤を含んでもよく、または点鼻剤もしくは定量スプレーの形態で使用される水性液剤もしくは油性液剤あってもよい。口腔投与では、典型的な賦形剤は、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、およびアルファ化デンプン等を含む。
特に、医薬組成物は経口投与用に製剤化することができる。経口投与に適する組成物は、１つ以上の生理学的に適合する担体および／または賦形剤を含んでもよく、固体剤形または液体剤形であってもよい。錠剤およびカプセル剤は、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、もしくはポリビニルピロリドンといった結合剤、ラクトース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、もしくはグリシンなどの充填剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、もしくはシリカなどの潤滑剤、およびラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤と共に調製され得る。液体組成物は、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、糖シロップ、ゼラチン、カルボキシメチル−セルロース。もしくは食用脂といった懸濁化剤、レシチン、もしくはアカシアなどの乳化剤、アーモンド油、ココナッツ油、タラ肝油、もしくはピーナッツ油などの植物油、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの保存剤などの従来の添加剤を含むことができる。液体組成物は、単位投与剤形を提供するために、例えばゼラチンでカプセル化されてもよい。
固体の経口投与剤形は、錠剤、ツーピースのハードシェルカプセル剤、および軟ゼラチン(SEG)カプセル剤を含むことができる。
ドライシェル製剤は、典型的に、約４０％〜６０％の濃度のゼラチン、約２０％〜３０％の濃度の可塑剤（グリセリン、ソルビトール、またはプロピレングリコールなど）、および約３０％〜４０％の濃度の水を含む。また、保存剤、色素、乳濁剤、および香料などの他の材料が存在してもよい。液体の充填材料は、（ミツロウ、水添ヒマシ油、もしくはポリエチレングリコール４０００などの懸濁化剤と共に）溶解、可溶化、もしくは分散させた固体薬剤、または鉱物油、植物油、トリグリセリド、グリコール、および界面活性剤などのビヒクル、もしくはビヒクルの組合せ内の液体薬剤を含むことができる。
一部の実施形態において、本発明の組成物は局所的に肺に投与することができる。したがって、一部の実施形態において、本発明の組成物は、任意で１つ以上の局所的に許容可能な希釈剤または担体と組み合わせられたｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含むことができる。肺への局所投与は、エアロゾル製剤の使用によりなされ得る。エアロゾル製剤は、典型的に、クロロフルオロカーボン(CFC)またはヒドロフルオロカーボン(HFC)などの適切なエアロゾル噴射剤に懸濁または溶解させた活性成分を含む。適切なＣＦＣ噴射剤は、トリクロロモノフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、およびジクロロジフルオロメタンを含む。適切なＨＦＣ噴射剤は、テトラフルオロエタン(HFC-134a)、およびヘプタフルオロプロパン(HFC-227)を含む。噴射剤は、一般に、総吸入組成物の４０重量％〜９９．５重量％、例えば４０重量％〜９０重量％を含む。製剤は、共溶媒（例えばエタノール）および界面活性剤（例えばレシチン、およびソルビタントリオレエート等）を含む賦形剤を含むことができる。エアロゾル製剤は、缶にパッケージングされ、適切な用量が（例えばBespak, Valoisまたは3Mにより提供されるような）定量バルブにより送達される。
また、肺への局所投与は、水性液剤または水性懸濁剤などの非加圧製剤の使用によってもなされ得る。これは、ネブライザーによって投与することができる。また、肺への局所投与は、加圧式定量吸入器(pMDI)または乾燥粉末製剤の使用によってもなされ得る。乾燥粉末製剤は、典型的に１〜１０ミクロンの質量中央径(MMAD)の微細形態でｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含み得る。製剤は、通常、例えば１００μｍ以上の質量中央径(MMAD)の大きい粒子径である、ラクトースなどの局所的に許容可能な希釈剤を典型的に含み得る。乾燥粉末の送達システムの例は、ＳＰＩＮＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＨＡＬＥＲ、ＴＵＲＢＯＨＡＬＥＲ、ＤＩＳＫＵＳおよびＣＬＩＣＫＨＡＬＥＲを含む。
本発明のさらに他の態様において、処置または予防を必要とするヒト患者における高サイトカイン血症を処置または予防する方法が提供され、該方法は、化学式Ｉ、化学式ＩＩ、または化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有する、治療有効量または予防有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を患者に投与することを含む。特に、重篤なインフルエンザウイルス感染症を処置または予防する方法が提供される。
該方法は、さらなる薬剤と組み合わせたｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を投与することを含むことができる。さらなる薬剤は、抗微生物剤、または抗がん剤であり得る。特に、さらなる薬剤は、抗ウイルス剤、より具体的にはオセルタミビルまたは薬学的に許容されるその塩（例えばオセルタミビルリン酸塩）であり得る。特に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は経口投与することができる。
本明細書における本発明の記載は、本発明において使用される（例えば、高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）の処置もしくは予防に使用される、および／または重篤なインフルエンザの処置もしくは予防に使用される）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤に関する限り、ヒトおよび動物における本発明の処置の方法（例えば、処置もしくは予防を必要とする対象（例えばヒト患者）における高サイトカイン血症（例えば重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）を処置もしくは予防する方法、および／または処置もしくは予防を必要とする対象（例えばヒト患者）における重篤なインフルエンザを処置もしくは予防する方法）に関する本明細書に示される本発明の種々の態様に等しく適用可能である、ということが理解される。
［実施例１：トランスクリプトーム分析によるｐ３８ＭＡＰＫの同定］
インフルエンザに感染したヒトのボランティアおよび患者から採取した血液サンプルからのトランスクリプトームデータのバイオインフォマティクス分析を、合併症がない（軽度および中等度）および重篤なインフルエンザ（PHE Guidance on Use of Anti-Viral Agents for the Treatment and Prophylaxis of Seasonal Influenza (2015-16), version 6.0, September 2015を参照）の両方におけるインフルエンザ感染に応答してヒト宿主において活性化されたシグナリング経路のマッピングに用いた。ヒトのウイルス感染研究を行い、それらの研究からのトランスクリプトームデータを前者のマッピングに用い、現場でのサンプリング研究(Hoang, L.T. etal., 2014)からのトランスクリプトームデータを後者のマッピングに用いた。両方のデータセットを比較することにより識別されるシグナリング経路の比較は、軽度および中等度インフルエンザに対する重篤なインフルエンザにおける高い活性を示すシグナリング経路の識別を可能とした。個々の経路の要素の更なる分析は、これらの多くの活性経路における重要な「ノード」としてｐ３８ＭＡＰＫを同定した。
健常なヒトボランティアにインフルエンザＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）(Zaas, A.K. etal., Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infection in humans, Cell Host Microbe,2009; 17: 207-217 and Davenport, E.E. et al., Transcriptomic profiling facilitates classification of response to influenza challenge, J. Mol. Med.,2015; 93: 105-114)またはインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）（内部研究であり公開されていない）を鼻腔内に感染させた。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）全血サンプルを、その後のトランスクリプトーム分析のために種々の時点でボランティアから採取した。インフルエンザＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの感染、症例定義、サンプル採取、ＲＮＡ精製およびマイクロアレイ分析の方法は、Zaas et al., 2009およびDavenport et al.,2015に詳述されるとおりである。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）の感染、症例定義、およびサンプル採取の方法は、上記Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ株について記載したとおりであり、ＲＮＡ精製およびマイクロアレイ分析はAffymetrix HGU133Plus 2.0アレイを用い、Ａｌｍａｃ(https://web.archive.org/web/20160317153848/http://www.almacgroup.com/)により行われた。重篤なインフルエンザの患者の募集、血液サンプル採取、ＲＮＡ精製およびマイクロアレイ分析の方法は、Hoang et al.,2014に詳述されているとおりである。
Zaas et al., 2009、Davenport et al., 2015、およびHoang et al.,2014の研究のマイクロアレイデータファイルを、それぞれ、受託番号ＧＳＥ５２４２８、ＧＳＥ６１７５４、およびＧＳＥ６１８２１を用いてGene Expression Omnibus(GEO)データベース(https://web.archive.org/web/20160622040853/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)からダウンロードした。未発表の研究のマイクロアレイデータ(.CEL)ファイルを、バイオインフォマティクス分析のためにＡｌｍａｃからダウンロードし、ローカルに保存した。４つすべてのトランスクリプトームデータセットを、データ操作、計算、および図形表示のソフトウェアファシリティのためのＲ(version 3.0.2.)統合スイートを用いて処理および分析した(https://web.archive.org/web/20160623011408/http://www.R-project.org)。生マイクロアレイデータの品質評価を、本技術分野における標準の統計方法を用いて行った（例えばHeber, S. and Sick, B., Quality assessment of affymetrix genechip data, Omics, 2006; 10:358-368）。アフィメトリックスデータセットをロバストマルチアレイアベレージ（ＲＭＡ）法[https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/affy/man/affy.pdf]を用いて正規化し、イルミナデータセットをLumi package[https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/lumi/man/lumi.pdf]を用いて正規化した。両方のパッケージをＲ環境で実行した。プローブセットおよび遺伝子名の注釈を容易にするために、アフィメトリックスチップデフィニションファイル(version 17.1.0)をブレインアレイのウェブサイト(https://web.archive.org/web/20160623112758/http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/Database/CustomCDF/17.1.0/ensg.asp)からダウンロードし、イルミナチップデフィニションファイル(illuminaHumanv4.db)をバイオコンダクターのウェブサイト(https://web.archive.org/web/20151209032754/http://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/illuminaHumanv4.db.html)からダウンロードした。
後者のファイルをDavenport et al., 2015およびHoang et al.,2014からのマイクロアレイデータと共に用いた。
Normalised Zaas et al., 2009, Davenport etal., 2015、およびPerthのデータセットを、それぞれバイオコンダクターのInSilicoMergingパッケージのCOMBATモジュールを用いて、Hoang et al.,2014データセットと結合した(https://web.archive.org/web/20150905151657/http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/inSilicoMerging.html)。結合されたデータセットの差次的遺伝子発現分析を、Ｒにおけるlimmaパッケージを用いて行った(https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/limma/inst/doc/usersguide.pdf)。一対比較のために、Zaas et al.,2009,Davenport et al., 2015、およびPerthのデータセットにおける感染させたボランティアのデータのみを、それぞれ１１、１４、および５の対象と同等にして用いた。Hoang et al.,2014のデータセットから、そのデータセットにおけるＨ３Ｎ２に感染した３人の重篤なインフルエンザ患者のデータのみを用いた。それぞれの結合させたデータセットについて、２つの一対比較を行って、ウイルス感染後に基準レベルに対してアップレギュレートされ、また重篤な患者のサンプルにおいてさらにアップレギュレートされた遺伝子を同定した。
Perth:−１日目対３日目、および３日目対Hoang et al., 2014重篤。
Zaas et al., 2009:−１日目対６０時間、および６０時間対Hoang et al.,2014重篤。
Davenport et al., 2015:０日目対４８時間、および４８時間対Hoang et al.,2014重篤。
経路にマッピングすることができるアップレギュレートされる遺伝子数を最大化するため、０を超える倍率変化を示すすべての遺伝子を同定した。６つの得られた遺伝子リストのそれぞれをキアゲンのIngenuity（登録商標）Pathway Analysis(IPA, QIAGEN Redwood City,https://web.archive.org/web/20131021061639/http://www.ingenuity.com/)の使用によって分析した。これにより、６５０のシグナリング経路を同定し、これは、２９７の代謝経路の除外後に３５３に減らされた。図１は、このプロセスを要約する。
重篤なインフルエンザの病因とこれらのシグナリング経路のそれぞれとの関連を調べるため、手動スコアリング手法を考案し、「合併症がない」インフルエンザのデータセットに対する合併症があるインフルエンザのデータセットにおいてこれらの経路内の顕著に活性化した「ルート」を同定した。この文脈において「ルート」は、形質膜から核にまで及ぶ標準的な経路におけるタンパク質の連続するつながりとして定義される。結果として、標準的な経路はその多くの異なるルートを有し得る。このスコアリング手法を用いて、ＩＰＡの標準的経路内のルートを、形質膜から核まで方向的にマッピングし、ＩＰＡの「オーバーレイ」機能を用いて遺伝子活性を示した。このプロセスを示すため、この方法を用いて同定された３つの経路の例を図２Ａ−Ｂに示す。
同定された３５３の経路のそれぞれのルートを、ＩＬ−１の標準的経路を通るルートを図３に例示するように遺伝子活性について手動でスコア化した。
すべてにおいて、＞７５％のアップレギュレートされたノードを示す４９１のルートを同定した（下記表２に例示する）。これらのうちの３つを超えるノードを含む９５のルートを、Hoang et al.,2014の重篤なインフルエンザデータセット対Zaas etal., 2009,Davenport et al., 2015 およびPerthデータセットにおける基準（Ｄ−１またはＤ０）でルート内のすべてのノードの１００％がアップレギュレートされたルートの中から同定した（表３）。これらの９５のルートうちの２４は、Hoang et al.,2014 (Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１−軽度および中等度)およびZaas et al., 2009（Ｈ１Ｎ１−Ｄ−１および６０時間；表４）からの軽度および中程度のＨ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１インフルエンザデータセット由来の経路と比較して＞７５％のアップレギュレートがなされたことを示した。
９５のルートの調査は、多数の潜在的に標的化可能なノードを浮き彫りにするものであり、その十分に特徴づけられた炎症における役割、ならびにインビトロおよびエクスビボ研究において用いられる高品質で臨床的に試験された小分子阻害剤が利用可能性であることから、その中からｐ３８ＭＡＰＫが選択された。
表２は、ルートスコアリング分析の例を示す。
表３は、Hoang et al., 2014の重篤なインフルエンザデータセット対Zaas et al., 2009, Davenport etal., 2015およびPerthの基準データセットで１００％のアップレギュレートがなされたノードを含む９５のルートを示す。
表４は、Ｈ３Ｎ２とＨ１Ｎ１との間のルートスコアの比較を示す。
［実施例２：重篤なインフルエンザに関連する重要な細胞型の炎症媒介物質の放出におけるｐ３８ＭＡＰＫの阻害の作用］
２つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤をインビトロおよびエクスビボ実験に用いた：１）PH797804、ＡＴＰ競合性の強力、選択的、かつ代謝的に安定なｐ３８の阻害剤(HopeHR1, et al., Anti-inflammatory properties of a novel N-phenyl pyridinone inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase:preclinical-to-clinical translation, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2009 (Dec);331(3): 882-95)、ならびに２）ディルマピモド(SB-681323 - Betts JC1, etal., Gene expression changes caused by the p38 MAPK inhibitor dilmapimod in COPD patients: analysis of blood and sputum samples from a randomized,placebo-controlled clinical trial, Pharmacol.Res. Perspect., 2015 (Feb); 3(1):e00094)。これらの化合物の構造は以下のとおりである。
ディルマピモド
PH797804
ｐ３８ＭＡＰＫの阻害の実験的試験を、重篤なインフルエンザの病理における重要なプレーヤーとなる３つの細胞型である上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞で行った（図４）。これらの実験において、インフルエンザ感染上皮細胞から産生される炎症媒介物質の作用をシミュレートするため、細胞を単純なおよび／または複合的な刺激で前処理した。前者の場合、内皮細胞および免疫細胞を刺激するため、腫瘍壊死因子(TNFa)とインターロイキン６(IL-6)とを用いた。後者の場合、上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞を刺激するため、インフルエンザウイルス感染Ａ５４９（腺がんヒト肺胞基底上皮細胞）、またはヒト気管支初代上皮細胞(HBEC)のいずれかを由来とする条件培地（ウイルス「スープ」）を使用した。
［上皮細胞］
Ａ５４９細胞（腺がんヒト肺胞基底上皮細胞）またはＨＢＥＣ（ヒト気管支上皮細胞）を、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスに感染させ、ウイルス条件培地（またはウイルススープ）を回収した。本明細書に記載される試験において、インフルエンザ感染上皮細胞から産生される炎症媒介物質の作用をシミュレートするため、対象の上皮細胞または他の細胞型（内皮および免疫）のいずれかにウイルススープの適用を行った。
感染のため、インフルエンザ(H3N2)ウイルスの高力価ストックを、明らかに正常な成犬の雌のコッカースパニエルの腎臓由来（September, 1958, by S.H. Madin and N.B. Darby）のＭＤＣＫ−ＲＶＬ細胞(MDCK (NBL-2)としてATCCから入手可能(ATCC（登録商標） CCL-34))への感染により作製した。その株は高二倍体であり、２つのモードの染色体数分布が存在する。一貫した識別可能なマーカー染色体は存在しない。１つの正常なＸ染色体は、ほとんどの範囲において存在する。細胞は免疫ペルオキシダーゼ染色によりケラチンに陽性である。ＭＤＣＫ−ＲＶＬ細胞をＴ１７５フラスコに播種し、８５〜９０％コンフルエントにまで増殖させた。翌日、細胞を感染培地で２回洗浄した。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ストックを−８０℃から取り出し、氷上で解凍した。細胞を、感染培地内において０．０１ＭＯＩでウイルスストックに１時間感染させた。インキュベーション期間の最後に、非結合ウイルスを細胞から除いた。細胞を感染培地で１回洗浄し、感染培地を加え、５％ＣＯ２／空気のインキュベーターにおいて３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベーション後、フラスコを−８０℃で１日間凍結した。翌日、フラスコを室温で解凍し、ウイルス上清を遠心分離し(2000g, 10分)、共にプールした。ウイルスストックを分注し、−８０℃で保管した。
ウイルス「スープ」をＡ５４９細胞株およびヒト気管支初代上皮細胞(HBEC)を用いて調製した。Ａ５４９スープの調製のため、細胞をＴ１７５フラスコに播種し、８５〜９０％コンフルエントを得るように増殖させた。細胞を感染培地で２回洗浄した。インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)−ＷＧＣストックを−８０℃から取り出し、氷上で解凍した。細胞を、感染培地内において０．０１ＭＯＩでウイルスストックに１時間感染させた。インキュベーション期間の最後に、非結合ウイルスを細胞から除き、細胞を感染培地で１回洗浄してから、感染培地を加えた。細胞を、５％ＣＯ２／空気のインキュベーターにおいて３７℃で48時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地（「ウイルススープ」）をすべてのフラスコから回収し、遠心分離し(2000g, 10分)、共にプールした。ウイルススープを分注し、−８０℃で保管した。ＨＢＥＣウイルススープの調製のため、細胞を、気管支上皮細胞増殖培地(BECGM; Lonza)において継代Ｐ−３またはＰ−４まで培養した。感染のため、細胞をＢＥＣＧＭで２回洗浄し、感染培地において０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに１時間感染させた(BECGMは１ml TPCKトリプシンあたり1.06 USP/NF 単位を含む）。そして、細胞に感染培地を加え、５％ＣＯ２／空気において３７℃で４８時間インキュベーションした。そして、ＨＢＥＣウイルススープをＡ５４９スープと同様の方法で処理した。
ウイルススープを作製するためにウイルス増殖動態を最適化した。多段階増殖曲線を決定するため、Ａ５４９細胞またはＨＢＥＣを０．０１のＴＣＩＤ５０／ｃｅｌｌのＭＯＩで３７℃において１時間ウイルスに感染させた。インキュベーション後、細胞を洗浄し、それぞれ感染培地を加えた。サンプルを、７２時間の種々の時点でウイルス力価およびサイトカインの測定のために採取した。ウイルス力価をＭＤＣＫ細胞におけるＴＣＩＤ５０により得て、炎症媒介物質の存在を、販売者により推奨される方法(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)を用いてＭＳＤ化学発光アッセイにより評価した。
実験的試験の前に、Ａ５４９およびＨＢＥＣの両方のスープ調製物を、販売者により推奨される方法(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)を用いて炎症媒介物質の存在について電気化学発光により評価した。両方のスープ調製物が以下の上昇レベルのサイトカインを含むことを見いだした(IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα および RANTES; 図５）。
ｐ３８ＭＡＰＫ自体、および下流のシグナリング標的であるＨＳＰ２７のリン酸化状態のウェスタンブロットにより測定されるｐ３８の活性化におけるＡ５４９ウイルススープの適用の作用を試験するため、インビトロデータをＡ５４９細胞から生成した。ウェスタンブロットのため、コンフルエントの細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上でプロテアーゼ阻害剤(Sigma-P8340)、ホスファターゼ阻害剤カクテル２および３(SigmaP5726およびP0044)、ならびにホスファターゼ阻害剤のＮａ３ＶＯ４およびＮａＦを含むＲＩＰＡ内に溶解した。タンパク質濃度を、Pierce BCA Protein Assay Kitを用いて測定し、２−メルカプトエタノールを含む４×Laemmliサンプルバッファー(BIO-RAD 161-0747)内で同一濃度の各サンプルを作製した。サンプルを１２％ゲルに泳動させ、ニトロセルロースに転写した。メンブレンは５％ミルク粉末を用いてブロッキングし、ｐ３８ＭＡＰＫウサギ抗体(Cell Signalling Technologies, cat. no. 9212S )およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫウサギ抗体(Cell Signalling Technologies, cat. no. 9211S)、またはＨＳＰ２７抗体(Cell signalling Technologies, cat. no. 2402)およびリン酸ＨＳＰ２７抗体(Cell signalling Technologies, cat. no. 9709)でハイブリダイゼーションした。二次抗体は、それぞれ、抗ウサギＨＲＰ(Cell signalling Technologies catalogue no. CS7074P2)および抗マウスＨＲＰ(Cell signalling, catalogue no. 7076S)であった。メンブレンは、再プロービングのために、Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Life technologies#46430)を用いてストリップした。メンブレンをAmersham ECL Prime ウェスタンブロッティング検出試薬 (GE/Amersham #RPN2232)で処理し、ChemiDoc Touchmaging System (BIO-RAD)を用いて画像化した。Image Labソフトウェアを用いて分析を行った。
これらの酵素の両方におけるリン酸化の誘導を検出して、ｐ３８ＭＡＰＫがＡ５４９ウイルススープの適用後に活性化されること示した（図６）。さらに、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ディマピモドおよびＰＨ７９７８０４）とのインキュベーションは、我々のＡ５４９ウイルススープによるｐ３８ＭＡＰＫおよびＨＳＰ２７の両方のリン酸化の誘導を用量依存的に阻害することを示し、この誘導はこれらの上皮細胞内のｐ３８ＭＡＰＫ依存的なプロセスであることを確認した。
また、電気化学発光により測定されるＡ５４９細胞の炎症性サイトカイン産生におけるＡ５４９ウイルススープの作用も調べた。図６に示すように、Ａ５４９スープは、コントロールである非感染Ａ５４９スープと比較して重要な炎症性サイトカイン(IL-6およびIP-10)の産生の誘導が拡大することを見いだした。Ａ５４９ウイルススープの適用前に、Ａ５４９細胞に２つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を適用することで、ＩＬ−６およびＩＰ−１０の両方の放出が著しく抑えられた（図６は、p38 MAPK阻害剤PH 797804のデータを示す）。これらのデータは、Ａ５４９細胞へのＡ５４９ウイルススープの適用に応じた炎症媒介物質の放出がｐ３８ＭＡＰＫ依存性プロセスであることを示す。
［内皮細胞］
内皮細胞におけるインフルエンザ感染上皮細胞から産生された炎症媒介物質の相互作用をシミュレートするため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)へのＨＢＥＣウイルススープの適用を行った。
ｐ３８ＭＡＰＫの下流のシグナリング標的であるＨＳＰ２７のリン酸化状態のウェスタンブロットにより測定されるｐ３８の活性化におけるＨＢＥＣウイルススープの適用の作用を試験するため、インビトロデータをＨＵＶＥＣ細胞から生成した。ＨＳＰ２７におけるリン酸化の誘導を検出して、ｐ３８ＭＡＰＫがＨＢＥＣウイルススープの適用後に活性化されること示した（図７）。さらに、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ディマピモドおよびＰＨ７９７８０４）とのプレインキュベーションは、ＨＢＥＣウイルススープによるＨＳＰ２７のリン酸化の誘導を用量依存的に阻害することを示し、この誘導はこれらの内皮細胞内のｐ３８ＭＡＰＫ依存的なプロセスであることを確認した。
また、電気化学発光(方法を参照)により測定されるＨＵＶＥＣ細胞の炎症性サイトカイン産生におけるＨＢＥＣウイルススープの作用も調べた。図７に示すように、ＨＢＥＣウイルススープは、コントロールであるＨＢＥＣ非感染スープと比較して重要な炎症性サイトカイン(IL-6およびIP-10)の産生の誘導が拡大することを見いだした。ＨＢＥＣウイルススープの適用前に２つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と共にＨＵＶＥＣ細胞をインキュベートすることで、ＨＢＥＣウイルススープ誘導によるＩＬ−６およびＩＰ−１０の両方の放出が著しく抑えられることが分かった（図７）。これらのデータは、ＨＵＶＥＣ内皮細胞におけるＨＢＥＣウイルススープの適用に応じた炎症媒介物質の放出がｐ３８ＭＡＰＫ依存性プロセスであることを示す。
［免疫細胞］
免疫細胞におけるインフルエンザ感染上皮細胞から産生された炎症媒介物質の相互作用をシミュレートするため、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)におけるＡ５４９ウイルススープの適用を行った。ＰＢＭＣを製造者の推奨にしたがって単離した(Boyum, A., Separation of leucocytes from blood and bone marrow,Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 21, suppl. 97)。
ｐ３８ＭＡＰＫの下流のシグナリング標的であるＨＳＰ２７のリン酸化状態のウェスタンブロット(方法は上記参照)により測定されるｐ３８の活性化におけるＡ５４９ウイルススープの適用の作用を試験するため、エクスビボデータを免疫細胞から生成した。ＨＳＰ２７におけるリン酸化の誘導を検出して、ｐ３８ＭＡＰＫがＡ５４９ウイルススープの適用後に活性化されること示した（図８）。さらに、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ディマピモドおよびＰＨ７９７８０４）とのプレインキュベーションは、Ａ５４９ウイルススープによるＨＳＰ２７のリン酸化の誘導を用量依存的に阻害することを示し、この誘導はこれらの免疫細胞内のｐ３８ＭＡＰＫ依存的なプロセスであることを確認した（図８）。
また、電気化学発光により測定される免疫細胞の炎症性サイトカイン産生におけるＡ５４９ウイルススープの作用（上記参照）も調べた。図８に示すように、Ａ５４９ウイルススープは、コントロールであるＡ５４９非感染スープと比較して重要な炎症性サイトカイン(TNFα, IL-l-β, IL-6およびCXCL8)の産生の誘導が拡大することを見いだした。Ａ５４９ウイルススープの適用前に免疫細胞においてｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ディマピモドおよびＰＨ７９７８０４）をプレインキュベートすることで、Ａ５４９ウイルススープ誘導によるＴＮＦα、ＩＬ−ｌ−β、ＩＬ−６、およびＣＸＣＬ８の放出が著しく抑えられることが分かった（図８）。これらのデータは、免疫細胞におけるＡ５４９ウイルススープの適用に応じた炎症媒介物質の放出がｐ３８ＭＡＰＫ主導性プロセスであることを示す。
追加のエクスビボデータを免疫細胞から生成し、それにより、Ａ５４９ウイルススープに応じた炎症媒介物質の誘導を既知の炎症刺激剤(抗CD3およびLPS)と比較した。Ａ５４９ウイルススープによるＴＮＦα、ＩＬ−ｌ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の誘導は、これらの既知の炎症刺激剤と比較して大きいことを見いだした（図９）。
［実施例３：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤活性］
化合物の酵素阻害活性は、ドナーおよびアクセプタフルオロフォア(Z-LYTE,Invitrogen)の両方を用いて標識された合成ペプチドを用いて蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)により測定することができる。
組換型リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫγ(MAPK12:Millipore)をＨＥＰＥＳバッファー内に希釈し、所望の最終濃度で候補化合物と混合し、室温で２時間インキュベートした。次に、ＦＲＥＴペプチド(2 μM)およびＡＴＰ(100 μM)を酵素／化合物混合物に加え、１時間インキュベートした。発光試薬（プロテアーゼ）を加え１時間後に蛍光マイクロプレートリーダーで検出した。サイト特異的プロテアーゼは非リン酸化ペプチドのみを切断し、ＦＲＥＴシグナルを除去する。各反応物のリン酸化レベルを、フルオレセイン発光（アクセプタ）に対するクマリン発光（ドナー）の比を用いて算出し、高い比は高いリン酸化を示し、低い比は低いリン酸化レベルを示す。各反応物の阻害率を非阻害コントロールに対して算出して、濃度−反応曲線から５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。
ｐ３８ＭＡＰＫα(MAPK14: Invitrogen)では、酵素活性は、下流の分子であるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化／リン酸化を測定することにより間接的に評価される。ｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質は、その不活性標的ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２(Invitrogen)および候補化合物と室温で２時間混合される。次に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のリン酸化標的であるＦＲＥＴペプチド(2 μM)とＡＴＰ(10 μM)を酵素／化合物混合物に加え、１時間インキュベートした。次に、発光試薬を加え、混合物を１時間インキュベートしてから、蛍光法により検出してアッセイプロトコルを終えた。
［実施例４：Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害(p38i)対他の潜在的標的の阻害］
上記実施例１に記載のように、トランスクリプトームおよびバイオインフォマティクスにより提示された９５経路のルートにおける多数の標的可能なノードが同定された。実施例２における化合物プロファイリング実験は、ｐ３８ｉが重篤なインフルエンザの病理に関連する細胞型における炎症媒介物質の放出の産生を低減することに有効であることを示す。これは、試験した９つの他のノード：ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＫＣ、ＳＲＣ、ＢｔＫ、およびｍＴｏｒでは該当しないと分かった。これらの９つのノードの薬剤阻害は、上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞においてｐ３８ｉと同等の有効性の阻害プロファイルを与えなかった。
一例として、ｐ３８ｉと、ＭＥＫ阻害剤のレファメチニブ(Iverson C et al., RDEA119/BAY 869766: a potent, selective,allosteric inhibitor of MEK1/2 for the treatment of cancer. Cancer Res., 2009;69: 6839-6847)およびセルメチニブ(Huynh H et al., Targeted inhibition of the extracellular signal-regulated kinase pathway with AZD6244(ARRY-142886) in the treatment of hepatocellular carcinoma, Molecular Cancer Therapeutics, 2007; 6:138-146)による***促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MEK)阻害(MEKi)とを比較するデータを添付の図面の図１０に示す。
レファメチニブ
セルメチニブ
レファメチニブおよびセルメチニブはいずれも、ＨＢＥＣウイルススープにより刺激された内皮細胞におけるＩＰ１０の産生の用量依存的阻害を示さず、実際には高い薬剤濃度でＩＰ１０のレベルを増大させると認められた（図１０を参照）。
多数の潜在的薬剤標的が、重篤なインフルエンザについて提示されている(例えばLiu Q et al., 2015およびFedson DS, 2009)。また、ｐ３８ｉを、これらの提示された標的の選択のため薬剤化合物と比較した。
これらの実験のために、内皮細胞（ＨＢＥＣウイルススープで刺激されたＨＵＶＥＣ）または免疫細胞（上記実施例２に記載されるようなＡ５４９ウイルススープで刺激されたＰＢＭＣおよび顆粒球）において、ＰＨ７９７８０４を、４つの薬剤濃度（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ）で、副腎皮質ホルモン（メチルプレドニゾロン）、マクロライド（アジスロマイシン）、ＰＰＡＲアゴニスト（ピオグリタゾン）、ＰＤＥ４阻害剤（ロフルミラスト）、ＮＦκＢ阻害剤（ＥＶＰ４５９３）、およびスタチン（プラバスタチン）に対して評価した。
内皮細胞からのＩＰ−１０、ＩＬ−８、およびＭＣＰ−１の産生、ならびに免疫細胞からのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの産生における薬剤化合物の投与の作用を、電気化学発光を用いてアッセイした。免疫細胞において、副腎皮質ホルモンおよびマクロライド剤の処置が、アッセイした４つすべてのサイトカインを用量依存的に阻害することを示す一方、ｐ３８ｉでは４つのうち３つのみの用量依存的阻害を示した。試験した他の薬剤の阻害プロファイルは不定であり、副腎皮質ホルモン、マクロライド、またはｐ３８ｉのプロファイルとは一致しなかった。結果を下記表５に要約する。
表５は、重篤なインフルエンザにおける文献で提示された標的に対する薬剤化合物の阻害作用のｐ３８ｉとの比較を示す。ＰＭＢＣｓおよび顆粒球を実施例２に記載のように単離し、Ａ５４９ウイルススープで刺激した。分泌サイトカインレベルを電気化学発光によりアッセイし、ＩＣ５０およびｉＭａｘ値を、科学的２Ｄグラフ化および統計ソフトウェアパッケージ(GraphPad PRISM version 6.07 software)を用いた非線形回帰適合を用いて用量反応から算出した。データが用量依存的阻害を示さない場合、ＩＣ５０およびｉＭａｘ値を算出しなかった（空白ボックス）。
試験した化合物におけるＩＬ１−ｂおよびＴＮＦαの阻害プロットを図１１および図１２に示す。
内皮細胞では、免疫細胞とは対照的に、ｐ３８およびＮＦκＢ阻害剤のみがアッセイした３つのサイトカインの用量依存的阻害を示した。試験した他の薬剤は同等の阻害作用を示さなかった。結果を下記表６に要約する。
表６は、重篤なインフルエンザにおける文献で提示された標的に対する薬剤化合物の阻害作用のｐ３８ｉとの比較を示す。ＨＵＶＥＣ細胞をＨＢＥＣウイルススープにより刺激した。分泌サイトカインレベルを電気化学発光によりアッセイし、ＩＣ５０およびｉＭａｘ値を、科学的２Ｄグラフ化および統計ソフトウェアパッケージ(GraphPad PRISM version 6.07 software)を用いた非線形回帰適合を用いて用量反応から算出した。データが用量依存的阻害を示さない場合、ＩＣ５０およびｉＭａｘ値を算出しなかった。
ＩＰ１０およびＩＬ８の阻害プロットを図１３および図１４に示す。
免疫細胞実験において得られた結果に基づいて、他の薬剤に対するｐ３８ｉの優位性は予想外であり、特にメチルプレドニゾロンは、潜在的な恩恵または害について不確実であるが、種々の炎症疾患（例えば喘息）を処置するために臨床の場で一般に用いられているとともに、重篤なインフルエンザに対して一般に処方されている(Rodrigo C et al., Corticosteroids as adjunctive therapy in the treatment of influenza, Cochrane Database of Systematic Reviews, 2016, Issue 3.Art. No.: CD010406. DOI: 10.1002/14651858.CD010406.pub2)。ＮＦκＢはｐ３８の下流であるので、見受けられるその阻害プロファイルは予想外ではない。
［実施例５：重篤なインフルエンザにより入院する患者の血清中の多数のサイトカインのレベルは、重篤なインフルエンザではないインフルエンザに感染した人と比較して顕著に上昇した］
２０１５年のインフルエンザシーズン時に重篤なインフルエンザに罹って入院した３０人の対象からの血清サンプルのサイトカインレベル、およびインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２ Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ウイルスの鼻腔内摂取後に感染した２８人の健康な対象からの血清サンプルのサイトカインレベルを、電気化学発光を用いてアッセイした。前者の場合、対象の入院後２４〜７２時間に回収した血液サンプルから調製した血清サンプルを分析した。後者の場合、１２の所定の間隔において（−１日目から２８日目）回収した血液サンプルからの血清を分析した。８つのサイトカインであるＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−１６、エオタキシン、ＩＰ１０、ＭＣＰ１、ＭＣＰ４、およびＶＥＧＦでは、感染させた健康な対象と比較して入院の対象において顕著な上昇が観察された。これらのうちの４つの結果を図１５に示す。
結果は、それらの血清サイトカインプロファイルに関して、入院の対象を感染させた健康な対象と区別できることを示す。
［実施例６：重篤なインフルエンザまたは持続性インフルエンザに関連する重要な細胞型の炎症媒介物質の放出における化合物ＩＩＩでのｐ３８ＭＡＰＫ阻害の作用］
化学式ＩＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤をインビトロおよびエクスビボ実験に用いた(国際公開第2004/076450号の実施例８(J. Uriach Y Compania S.A.))。
化学式ＩＩＩの阻害剤によるｐ３８ＭＡＰＫ阻害の実験的試験を、重篤なインフルエンザおよび持続性インフルエンザの病理における重要なプレーヤーとなる３つの細胞型である上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞で行った（図４）。これらの実験において、インフルエンザ感染上皮細胞から産生される炎症媒介物質の作用をシミュレートするため、細胞を単純なおよび／または複合的な刺激で前処理した。前者の場合、内皮細胞および免疫細胞を刺激するため、腫瘍壊死因子(TNFa)とインターロイキン６(IL-6)とを用いた。後者の場合、上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞を刺激するため、インフルエンザウイルス感染Ａ５４９（腺がんヒト肺胞基底上皮細胞）、またはヒト気管支初代上皮細胞(HBEC)のいずれかを由来とする条件培地（ウイルス「スープ」）を使用した。
［上皮細胞］
条件培地（ウイルススープ）の作製のため、Ａ５４９細胞またはＨＢＥＣをインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスの高力価ストックに感染させた。ウイルスストックを、メイディン・ダービー・イヌ腎臓の感染によって作製した[MDCK細胞、the American Type Culture CollectionからMDCK(NBL-2)として入手可能(ATCC（商標登録）CCL-34)]。ＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む最小必須培地(MEM)において、８５〜９０％コンフルエントまで培養した。細胞を感染培地で２回洗浄した(１ml TPCKトリプシンあたり1.06USP/NF 単位を含む改良ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]）。細胞を、感染培地内において０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに１時間感染させた。インキュベーション期間の最後に、感染培地で１回洗浄することで、非結合ウイルス粒子を細胞から除いた。そして、細胞に新しい感染培地を加え、５％ＣＯ２／空気において３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞のフラスコを−８０℃で２４時間凍結し、室温で解凍し、ウイルス上清を遠心分離してから(2000g, 10分)、共にプールし、分注して、−８０℃で保管した。
調製したウイルスストックを、ウイルススープの作製に使用した。多段階増殖曲線を決定することで、ウイルス増殖動態を最適化した。Ａ５４９細胞またはＨＢＥＣを、０．０１のＭＯＩで３７℃において１時間ウイルスに感染させた。インキュベーション後、細胞を洗浄し、感染培地を加えた。ＭＤＣＫ細胞においてＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス力価を測定するため、サンプルを７２時間の種々の時点で採取し、炎症媒介物質の存在を、販売者により推奨される方法(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)を用いてＭＳＤ化学発光アッセイにより評価した。
Ａ５４９ウイルススープの調製のため、細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭにおいて、８５〜９０％コンフルエントまで培養した。細胞を感染培地で２回洗浄して、感染培地内において０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに１時間感染させた。インキュベーション期間の最後に、感染培地で１回洗浄することで非結合ウイルスを細胞から除いてから、感染培地を加えた。細胞を、５％ＣＯ２／空気において３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベーション後、ウイルススープを培養フラスコから回収し、遠心分離し(2000g, 10分)、共にプールした。ウイルススープを分注し、−８０℃で保管した。ＨＢＥＣウイルススープの調製のため、細胞を、気管支上皮細胞増殖培地(BECGM; Lonza)において継代Ｐ−３またはＰ−４まで培養した。感染のため、細胞をＢＥＣＧＭで２回洗浄し、感染培地において０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに１時間感染させた(BECGMは１ml TPCKトリプシンあたり1.06 USP/NF 単位を含む）。そして、細胞に感染培地を加え、５％ＣＯ２／空気において３７℃で４８時間インキュベーションした。そして、ＨＢＥＣウイルススープをＡ５４９スープと同様の方法で処理した。
実験的試験の前に、Ａ５４９およびＨＢＥＣの両方のスープ調製物における炎症誘発性媒介物質のレベルを、ＭＳＤ化学発光分析により測定した。両方のスープ調製物が上昇レベルの炎症誘発サイトカインを含むことを見いだし(IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα および RANTES; 図5）、ウェスタンブロット分析によってｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化および下流のシグナリングタンパク質ＨＳＰ２７のリン酸化の両方を示すことで、ｐ３８ＭＡＰＫシグナリングの誘発を示した（図５）。ウェスタンブロットのため、ウイルススープで処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上でプロテアーゼ阻害剤(Sigma-P8340)、ホスファターゼ阻害剤カクテル２および３(SigmaP5726およびP0044)、ならびにホスファターゼ阻害剤のオルトバナジン酸ナトリウムおよびフッ化ナトリウム(共にwww.sigmaaldrich.com)を含むＲＩＰＡバッファー内に溶解した。タンパク質濃度を、Pierce BCA Protein Assay Kitを用いて測定した(www.thermofisher.com)。２−メルカプトエタノールを含む４×Laemmliサンプルバッファー(BIO-RAD 161-0747)内の同等の濃度の各サンプルを、トリス−グリシン−ＳＤＳバッファー内の１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析してから、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンは５％ミルク粉末を用いてブロッキングし、ｐ３８ＭＡＰＫウサギ抗体(Cell Signalling Technologies, cat. no. 9212S )およびリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫウサギ抗体(Cell Signalling Technologies, cat. no. 9211S)、またはＨＳＰ２７抗体(Cell signalling Technologies, cat. no. 2402)およびリン酸ＨＳＰ２７抗体(Cell signalling Technologies, cat. no. 9709)でハイブリダイゼーションした。二次抗体は、それぞれ、抗ウサギＨＲＰ(Cell signalling Technologies catalogue no. CS7074P2)または抗マウスＨＲＰ(Cell signalling, catalogue no. 7076S)であった。メンブレンは、再プロービングのために、Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Life technologies#46430)を用いてストリップした。メンブレンをAmersham ECL Prime ウェスタンブロッティング検出試薬 (GE/Amersham #RPN2232)で処理し、ChemiDoc Touchmaging System (BIO-RAD)を用いて画像化した。Image Labソフトウェアを用いて分析を行った。
ＨＢＥＣ細胞の炎症媒介物質産生におけるＨＢＥＣウイルススープの作用をＭＳＤ分析によって測定した。図１６に示すように、ＨＢＥＣスープは、ＩＬ−６およびＩＰ−１０によって例示されるように重要な炎症性サイトカインの産生を誘導した。ＨＢＥＣウイルススープ適用前の化学式ＩＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でのＨＢＥＣの処理により、両方のサイトカインの放出が抑えられた（図１６）。
［内皮細胞］
インフルエンザ感染上皮細胞により産生された炎症媒介物質の内皮細胞との相互作用をシミュレートするため、単純な（TNFaとIL-6）および複合的な（HBECウイルススープ）刺激の両方を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に与えた。
ＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＨＢＥＣウイルススープのいずれかで処理したＨＵＶＥＣ細胞による炎症性サイトカイン産生を調べた。図１７に示すように、両方の刺激は、ＩＬ−８およびＩＰ−１０によって例示されるように重要な炎症性サイトカインの産生を誘導した。しかしながら、刺激前の化学式ＩＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でのＨＵＶＥＣ細胞の処理により、これが抑えられることが示された（図１７）。
［免疫細胞］
免疫細胞におけるインフルエンザ感染上皮細胞から産生された炎症媒介物質の相互作用をシミュレートするため、単純な（TNFaとIL-6）および複合的な（A549ウイルススープ）刺激の両方を、単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)に与えた。ＰＢＭＣを製造者の推奨にしたがってヒト血液から単離した(Boyum,A., Separation of leucocytes from blood and bone marrow, Scand. J. Clin. Lab.Invest., 1968, 21, suppl. 97)。
ＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＡ５４９ウイルススープのいずれかで処理した免疫細胞における炎症性サイトカイン産生を調べた。図１８に示すように、両方の刺激は、ＴＮＦαとＩＬ−８によって例示されるように重要な炎症性サイトカインの産生を誘導した。しかしながら、刺激前の化学式ＩＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でのＰＢＭＣの処理により、これが抑えられることが分かった（図１８）。
［実施例７：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と抗ウイルス剤オセルタミビルとの組合せ］
重篤なインフルエンザの良好な治療は、抗ウイルス剤によるウイルス感染フェーズ（フェーズ１）と、免疫調節剤による後の（感染後）炎症フェーズ（フェーズ２）との両方を有効に標的化することによって決まるとみられる。入院している、重篤である、合併症がある、もしくは進行性の病気のある、または、インフルエンザ合併症の高いリスクのある、確定インフルエンザの、またはインフルエンザの疑いのあるいずれの患者にも、抗ウイルス処置が、できるだけ早く行われることが推奨されているので[https://www.cdc.gov/flu/professionals/antivirals/summary-clinicians.htm]、免疫調節剤と抗ウイルス剤とが同時に与えられると考えられることから、免疫調節剤が抗ウイルス剤の作用を妨げないことが重要である。この可能性を検討するため、オセルタミビルを２つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（PH797804およびディルマピモド）のいずれかと組み合わせた作用を、オセルタミビルのＨＢＥＣにおけるウイルス感染抑制能において、これらの２つの薬剤が有する作用を検討することによって調べた。
ＨＢＥＣを、０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに感染させ、ウイルス感染におけるＰＨ７９７８０４またはディルマピモドのいずれかとの組み合わせたオセルタミビルの作用を検討した。この実施例において用いられるオセルタミビルは、オセルタミビルカルボキシレートの形態であり、これは、オセルタミビルおよび薬学的に許容されるその塩の活性代謝物（例えば、これはオセルタミビルリン酸塩の活性代謝物である）である。ウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した[WHO manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza;http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf ]。オセルタミビル処置はＴＣＩＤ５０を低下させたが、ＰＨ７９７８０４またはディルマピモド処置のいずれもこの作用を示さなかった。オセルタミビルをＰＨ７９７８０４またはディルマピモドのいずれかと組み合わせたとき、オセルタミビル単独で見受けられるレベルまでＴＣＩＤ５０が下がり、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤治療が、その抗ウイルス活性に影響を与えることなくオセルタミビルと組み合わせて用いることができるということを示した（図１９）。
臨床の場において、抗ウイルス治療によるウイルス量の低下（フェーズ１）は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いてウイルスＲＮＡレベルを測定することでモニタリングされ得、炎症におけるｐ３８阻害作用（フェーズ２）は、例えば血清サンプルのＭＳＤ分析によって、重篤なインフルエンザの患者に見受けられるものなど（実施例５）の炎症媒介物質のレベルを測定することでモニタリングされ得る、と考えられる。
［実施例８：重篤なまたは持続性のインフルエンザに関連する重要な細胞型の炎症媒介物質放出における化学式ＩＩの化合物によるｐ３８阻害作用］
化学式ＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤をインビトロおよびエクスビボ実験に用いた(国際公開第2004/076450号の実施例１８(J. Uriach Y Compania S.A.))。上述のように、この化合物の化学構造は以下のとおりである。
（化学式ＩＩ）
化学式ＩＩの阻害剤によるｐ３８ＭＡＰＫ阻害の実験的試験を、内皮細胞および免疫細胞で行った。これらの実験において、細胞を、ＴＮＦαとＩＬ−６、または［００１９０］〜［００１９３］において上述するように調製したウイルススープで前処理した。
［内皮細胞］
ＴＮＦαとＩＬ−６、またはＨＢＥＣウイルススープのいずれかで処理したＨＵＶＥＣ細胞による炎症性サイトカイン産生を、ＭＳＤ分析によって測定した。図２０に示すように、両方の刺激は、ＩＬ−８およびＩＰ−１０によって例示されるように重要な炎症性サイトカインの産生を誘導した。しかしながら、刺激前の化学式ＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でのＨＵＶＥＣ細胞の処理により、これが抑えられることが示された（図２０）。
［免疫細胞］
免疫細胞におけるインフルエンザ感染上皮細胞から産生された炎症媒介物質の相互作用をシミュレートするため、単純な（TNFaとIL-6）および複合的な（A549ウイルススープ）刺激の両方を、単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)に与えた。ＰＢＭＣを製造者の推奨にしたがってヒト血液から単離した(Boyum,A., Separation of leucocytes from blood and bone marrow, Scand. J. Clin. Lab.Invest., 1968, 21, suppl. 97)。
ＭＳＤ分析によって測定したときのＴＮＦαとＩＬ−６、またはＡ５４９ウイルススープのいずれかで処理した免疫細胞における炎症性サイトカイン産生を調べた。図２１に示すように、両方の刺激は、ＭＩＰ−１αとＩＬ−８(刺激としてTNFaとIL-6)、およびＴＮＦαとＩＬ−８(刺激としてA549ウイルススープ)によって例示されるように重要な炎症性サイトカインの産生を誘導した。しかしながら、刺激前の化学式ＩＩのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でのＰＢＭＣの処理により、これが抑えられることが分かった（図２１）。
［実施例９：化学式ＩＩの化合物剤と抗ウイルス剤オセルタミビルとの組合せ］
同時に与えられると考えられる抗ウイルス剤の作用を免疫調節剤が妨げないことが重要であることから、化学式ＩＩの化合物のオセルタミビルとの組合せの作用を、オセルタミビルのＨＢＥＣにおけるウイルス感染抑制能において、この薬剤化合物が有する作用を検討することによって、調べた。反対に、この組み合わせが化学式ＩＩの化合物の抗炎症特性において有し得る作用も検討した。
ＨＢＥＣを、０．０１ＭＯＩでインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９(H3N2)ウイルスストックに感染させ、ウイルス感染における化学式ＩＩの化合物との組み合わせたオセルタミビルの作用を検討した。この実施例において用いられるオセルタミビルは、オセルタミビルカルボキシレートの形態であり、これは、オセルタミビルおよび薬学的に許容されるその塩の活性代謝物（例えば、これはオセルタミビルリン酸塩の活性代謝物である）である。ウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した[WHO manual for the laboratory diagnosis and virologicalsurveillance of influenza;http:/lwhqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090 eng.pdf]。オセルタミビル処置単独ではＴＣＩＤ５０を低下させる一方、化学式ＩＩの化合物単独での処置はＴＣＩＤ５０を有意に低下させなかった。オセルタミビルを化学式ＩＩの化合物と組み合わせたとき、オセルタミビル単独で見受けられるレベルまでＴＣＩＤ５０が下がり、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤治療が、オセルタミビルの抗ウイルス活性に影響を与えることなくオセルタミビルと組み合わせて用いることができるということを示した（図２２）。反対に、オセルタミビル単独では、化学式ＩＩの化合物の抗炎症特性における作用は観察されなかった（図２３）。
臨床の場において、抗ウイルス治療によるウイルス量の低下は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いてウイルスＲＮＡレベルを測定することでモニタリングされ得、炎症におけるｐ３８阻害作用は、例えば血清サンプルのＭＳＤ分析によって、重篤なインフルエンザの患者に見受けられるものなど（実施例５）の炎症媒介物質のレベルを測定することでモニタリングされ得る、と考えらえる。
［略語］
ATP アデノシン三リン酸
A549 腺がんヒト肺胞基底上皮細胞
BECGM 気管支上皮細胞増殖培地
Btk ブルトン型チロシンキナーゼ
CXCL8 インターロイキン8
CD3 分化群タンパク質３
DMEM ダルベッコ改変イーグル培地
ERK 細胞外シグナル調節キナーゼ
FRET 蛍光共鳴エネルギー移動
GSK グラクソスミスクライン
HBEC ヒト気管支上皮細胞
HEPES ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
HSP27 熱ショックタンパク質２７
HUVEC ヒト血管内皮細胞
IC50 最大半数阻害濃度
iMax 最大阻害率(％として)
IL1-b インターロイキン１β
IL-6 インターロイキン６
IL-8 インターロイキン８
IPA インジェヌイティー パスウェイ分析
IP-10 インターフェロンγ誘導タンパク質１０
JAK/STAT ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達兼転写活性化因子
JNK ｃ−Ｊｕｎ Ｎ端末キナーゼ
LPS リポ多糖
MAPKAP-K2 ＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ２
MOI 感染多重度
MCP-1 単球走化性タンパク質−１
MDCK メイディン・ダービー・イヌ腎臓
MEK ***促進因子活性化タンパク質キナーゼキナーゼ
MEKi ＭＥＫ阻害（薬剤による）
MEM 最小必須培地
mTOR ラパマイシンの機構的標的
MSD メソスケールディスカバリー
NFκB 活性化Ｂ細胞の核内因子κ軽鎖エンハンサー
P38 MAPK Ｐ３８***促進因子活性化タンパク質キナーゼ
P38i Ｐ３８阻害（薬剤による）
PBMC 末梢血単核細胞
PBS リン酸緩衝食塩液
PDE4 ホスホジエステラーゼ４
PKC タンパク質キナーゼ
PPAR ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体
RANTES 活性化調節された発現および分泌正常Ｔ細胞
RIPA 放射性免疫沈降アッセイ
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SRC Ｓｒｃキナーゼ
TCID50 組織培養感染量
TNFa/TNFα 腫瘍壊死因子α
TPCK トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン
USP/NF 米国薬局方および国民医薬品集

Claims (88)

  1. ヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるための、化学式Ｉ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であって、
    （化学式Ｉ）
    式中、Ｒは、１つ以上のハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである、化学式Ｉ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  2. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項１に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
    （化学式ＩＩ）
  3. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項１に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
    （化学式ＩＩＩ）
  4. 前記高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんの１つ以上に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  5. 重篤なインフルエンザウイルス感染症の処置もしくは予防に使用されるための請求項４に記載されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、または、前記高サイトカイン血症が重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する請求項４に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  6. 高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるためのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗微生物剤。
  7. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤である、請求項６に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗微生物剤。
  8. 前記抗微生物剤は、抗菌剤、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、および／または、抗微生物モノクローナル抗体である、請求項６または７に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗微生物剤。
  9. 前記抗微生物剤は抗ウイルス剤である、請求項６、７、または８に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  10. 前記抗ウイルス剤は、アマンタジン；リマンタジン；リバビリン；イドクスウリジン；トリフルリジン；ビダラビン；アシクロビル；ガンシクロビル；ホスカルネット；ジドブジン；ジダノシン；ザルシタビン；スタブジン；ファムシクロビル；オセルタミビルリン酸塩、ザナミビル、ペラミビル、もしくはラニナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；バラシクロビル；鎮咳剤；粘液溶解剤；去痰剤；解熱剤；鎮痛剤；ならびに／または鼻充血除去剤、である、請求項９に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  11. 請求項５に記載の使用のための請求項１０に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗ウイルス剤。
  12. 前記抗ウイルス剤は、オセルタミビルまたは薬学的に許容されるその塩、例えばオセルタミビルリン酸塩である、請求項１１に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗ウイルス剤。
  13. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および前記抗微生物剤は、共に、連続して、または個別に投与される、請求項６〜１２のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗微生物剤。
  14. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および前記抗微生物剤は、共に投与するため単一投与剤形、例えば共に経口投与するため単一投与剤形で提供される、請求項６〜１３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗微生物剤。
  15. 高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および抗がん剤。
  16. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤である、請求項１５に記載のＭＡＰＫ阻害剤および抗がん剤。
  17. 前記阻害剤は、経口、または経表皮、経口腔、経鼻腔内、もしくは吸入によって（エアロゾル）、もしくは経鼻腔内および吸入によっての両方を含む経局所、または非経口（例えば経静脈内、経皮下）、または経局所および非経口の組合せなどの全身性または非全身性の投与がなされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  18. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は経口投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  19. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は静脈内投与される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  20. 前記高サイトカイン血症は、上昇レベルの、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ１０、およびＭＩＰ−１ａから選ばれる１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＰ１０から選ばれる１つ以上のサイトカイン）に関与する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  21. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は抗炎症作用および／または免疫調節作用を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  22. 内皮細胞および／または免疫細胞からの炎症誘発性媒介物質の放出を阻害する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  23. 内皮細胞および／または免疫細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  24. 内皮細胞および／または免疫細胞からの、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＰ−１ａの１つ以上（例えば、内皮細胞および／または免疫細胞からの、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、および／またはＲＡＮＴＥＳの１つ以上）の放出を阻害する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  25. 内皮細胞および／または免疫細胞からのＩＬ−１０の放出を阻害する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  26. 内皮細胞および／もしくは免疫細胞からのＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、およびＲＡＮＴＥＳの放出を阻害する、または、内皮細胞および／もしくは免疫細胞からのＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＰ−１ａの放出を阻害する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  27. 内皮細胞および／または免疫細胞からのＩＰ１０の放出を阻害する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  28. 内皮細胞および／または免疫細胞からのサイトカイン放出を用量依存的に阻害する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  29. 内皮細胞および／または免疫細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  30. 上皮細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  31. 上皮細胞、内皮細胞、および免疫細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  32. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、低酸素血症または心配機能低下の症状または徴候によって特徴づけられる、請求項４〜３１のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  33. 前記低酸素血症または心配機能低下の症状または徴候は、呼吸困難、頻呼吸、チアノーゼ、低血圧、および低酸素症の１つ以上を含む、請求項４〜３２のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  34. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、頻呼吸（１２歳以上で呼吸数≧３０、６〜１２歳で呼吸数≧４０、３〜６歳で呼吸数≧４５、１〜３歳で呼吸数≧５０）によって特徴づけられる、請求項４〜３３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  35. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、任意の呼吸の不快感または呼吸困難によって特徴づけられる、請求項４〜３４のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  36. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、放射線学的肺浸潤がない下気道障害との併存疾患により特徴づけられる、請求項４〜３５のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  37. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、ＣＮＳおよび／または末梢神経筋障害を示唆する症状または徴候により特徴づけられる、請求項４〜３６のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  38. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、重篤な脱水症状により特徴づけられる、請求項４〜３７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  39. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、疲労および／または嗜眠により特徴づけられる、請求項４〜３８のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  40. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、放射線学的肺浸潤の存在により特徴づけられる、請求項４〜３９のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  41. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、持続的ウイルス感染のエビデンスに関与する、請求項４〜４０のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  42. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、侵襲的二次性細菌感染症に関与する、請求項４〜４１のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  43. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、下気道障害または炎症に関与する、請求項４〜４２のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  44. 前記重篤なインフルエンザウイルス感染症は、単一臓器不全もしくは多臓器不全、または敗血症性ショックにより特徴づけられる、請求項４〜４３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  45. 前記患者は、幼児もしくは高齢者である、または妊婦である、請求項４〜４４のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  46. １つ以上の併存基礎疾患は前記患者を重篤なインフルエンザウイルス感染症に罹り易くする、請求項４〜４５のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  47. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、高サイトカイン血症が発症した後、前記患者に投与される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  48. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、免疫反応誘発の少なくとも８時間後、前記患者に最初に投与される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  49. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、免疫反応誘発の少なくとも４８時間後、前記患者に最初に投与される、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  50. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、インフルエンザウイルス感染の少なくとも８時間後、前記患者に最初に投与される、請求項４〜４９のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  51. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、インフルエンザウイルス感染の少なくとも４８時間後、前記患者に最初に投与される、請求項４〜５０のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  52. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、最長で１〜５日の期間、前記患者に投与される、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  53. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、１日あたり１回、前記患者に投与される、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  54. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの用量で投与される、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  55. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および前記抗微生物剤または前記抗がん剤は、共に投与される、請求項６〜５４のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  56. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および前記抗微生物剤または前記抗がん剤は、連続的に投与される、請求項６〜１３または１５〜５４のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  57. 前記抗微生物剤または前記抗がん剤は、前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の前に投与される、請求項６〜１３、１５〜５４、または５６のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  58. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、重篤なインフルエンザの処置のために抗ウイルス剤を投与している患者に投与される、請求項４〜５７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  59. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、前記抗ウイルス剤の投与の７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、１６時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間内に投与される、請求項５８に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  60. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、抗ウイルス剤の投与を含む重篤なインフルエンザの処置を受けている患者に投与される、請求項４〜５７のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  61. 前記患者は、前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での処置前に、抗ウイルス剤を少なくとも１時間（好ましくは少なくとも１２時間）投与することを含む重篤なインフルエンザの処置を受けている、請求項６０に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  62. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、約１〜７５０μｇ／Ｌ（例えば、５〜６００μｇ／Ｌ、１０〜５００μｇ／Ｌ、２５〜５００μｇ／Ｌ、５０〜５００μｇ／Ｌ、または１００〜４００μｇ／Ｌ）のオセルタミビルカルボキシレート血漿濃度を有する患者に投与される、請求項４〜６１のいずれか１項に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤。
  63. ヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるための医薬組成物であって、化学式Ｉ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物の少なくとも１つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含み、
    （化学式Ｉ）
    式中、Ｒは、１つ以上のハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである、組成物。
  64. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項６３に記載の医薬組成物。
    （化学式ＩＩ）
  65. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項６３に記載の医薬組成物。
    （化学式ＩＩＩ）
  66. 前記高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんの１つ以上により発症する、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  67. 重篤なインフルエンザウイルス感染症の処置もしくは予防に使用される請求項６６に記載される医薬組成物、または、前記高サイトカイン血症が重篤なインフルエンザウイルス感染症に関連する請求項６６に記載の医薬組成物。
  68. ヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるための医薬組成物であって、少なくとも１つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と抗微生物剤とを含む医薬組成物。
  69. 前記医薬組成物は、請求項６３〜６５のいずれかに記載されるものである、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記抗微生物剤は抗ウイルス剤である、請求項６８または６９に記載の医薬組成物。
  71. 前記抗ウイルス剤は、オセルタミビルまたは薬学的に許容されるその塩、例えばオセルタミビルリン酸塩である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. ヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症の処置または予防に使用されるための医薬組成物であって、少なくとも１つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と抗がん剤とを含む医薬組成物。
  73. 前記医薬組成物は、請求項６３〜６５のいずれかに記載されるものである、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 前記医薬組成物は経口投与用に製剤化される、請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  75. 処置または予防を必要とするヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量である、化学式Ｉ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を前記患者に投与することを含み、
    （化学式Ｉ）
    式中、Ｒは、１つ以上のハロ、ＮＲ１Ｒ２、またはヒドロキシによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立的にＨ、ハロ、または１つ以上のＦによって置換されていてもよいＣ１−３アルキルである、方法。
  76. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項７５に記載の方法。
    （化学式ＩＩ）
  77. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、化学式ＩＩＩ、または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である、請求項７５に記載の方法。
    （化学式ＩＩＩ）
  78. 前記高サイトカイン血症は、重篤なインフルエンザウイルス感染症、移植片対宿主病(GVHD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、敗血症、エボラ、天然痘、全身性炎症反応症候群(SIRS)、細菌感染症、およびがんの１つ以上により発症する、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 重篤なインフルエンザウイルス感染症の処置もしくは予防のための請求項７５〜７８のいずれか１項に記載される方法、または、前記高サイトカイン血症が重篤なインフルエンザウイルス感染症により発症するものである請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  80. 抗微生物剤を投与することをさらに含む、請求項７５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 処置または予防を必要とするヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を前記患者に投与することを含み、抗微生物剤を投与することをさらに含む、方法。
  82. 前記抗微生物剤は抗ウイルス剤である、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記抗ウイルス剤は、オセルタミビルまたは薬学的に許容されるその塩、例えばオセルタミビルリン酸塩である、請求項８２に記載の方法。
  84. 抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項７５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  85. 処置または予防を必要とするヒト患者または動物患者における高サイトカイン血症を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を前記患者に投与すること、および治療有効量または予防有効量の抗がん剤を前記患者に投与することを含む、方法。
  86. 前記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は経口投与される、請求項７５〜８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 処置または予防を必要とするヒト対象または動物対象（例えば、ヒト患者）における高サイトカイン血症を処置または予防する方法であって、治療有効量もしくは予防有効量である、請求項１〜６２のいずれかに記載のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、または請求項６３〜７４のいずれかに記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  88. 請求項１〜６２のいずれかに記載の高サイトカイン血症を処置または予防するための、請求項８７に記載される、処置または予防を必要とするヒト対象または動物対象（例えば、ヒト患者）における高サイトカイン血症を処置または予防する方法。

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