CN116115604A

CN116115604A - 美伐他汀的新用途

Info

Publication number: CN116115604A
Application number: CN202310075853.0A
Authority: CN
Inventors: 肖璇; 祝成亮; 李莹; 陈婷; 彭锐; 蔡菡
Original assignee: Renmin Hospital of Wuhan University
Current assignee: Renmin Hospital of Wuhan University
Priority date: 2023-02-07
Filing date: 2023-02-07
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开了美伐他汀的新用途，涉及药物技术领域，具体涉及美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途。本发明首次发现式(I)化合物美伐他汀可抑制呼吸道合胞病毒增殖及感染宿主细胞，可用作治疗呼吸道合胞病毒感染方面的疾病。美伐他汀是小分子化合物，其CC₅₀为62.61μM，能够剂量依赖的抑制呼吸道合胞病毒复制，其IC₅₀(半数抑制浓度)为0.67μM，选择指数(SI)约为93，表明美伐他汀是低毒高效的抗呼吸道合胞病毒的药物。

Description

美伐他汀的新用途

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种美伐他汀的新用途，尤其涉及美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒科的肺病毒属(Pneumovirus)，只有一种血清型。病毒形态为球形，直径为120～300nm，有包膜，基因组为非分节段的单负链RNA。主要引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及较大儿童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。到目前为止，尚且没有任何特效药物能够治愈呼吸道合胞病毒引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染。因此，要完全战胜新冠病毒，相应的抗呼吸道合胞病毒药物的研发也是至关重要的。

美伐他汀，英文名：Mevastatin，CAS：73573-88-3，其结构式如下式(I)所示，

美伐他汀是一种强效的、竞争性及选择性HMG-CoA(HMG辅酶A)还原酶抑制剂，与底物HMG-CoA竞争结合位点(Ki＝1nM)，比HMG-CoA底物本身结合亲合力高10000倍。Mevastatin诱导细胞周期阻断，使细胞周期停滞在G0/G1早期和G2/M晚期，同时伴随着cdk4，cdk6和cyclin D1的下调，以及细胞周期抑制剂p21和p27的上调。Mevastatin还可以诱导细胞凋亡，抑制TNF诱导的NF-κB活化(IC50约为17μM)。另外，mevastatin可以抑制类异戊二烯生物合成，降低血浆中胆固醇水平，因此，mevastatin可作为潜在药物用于治疗冠心病和动脉粥样硬化，以及心血管疾病的研究。但未见其抗呼吸道合胞病毒的报道。

发明内容

本发明提供的一种美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途。

进一步的，所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞病毒增殖。

进一步的，所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞感染宿主细胞。

第二方面，本发明提供了一种治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物，所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐。

进一步的，所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

进一步的，所述药物剂型选自片剂、胶囊剂、口服液体剂、口服颗粒剂、口服散剂或注射剂。

第三方面，本发明提供了一种制备治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物的方法，将有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

第四方面，本发明提供了一种抑制呼吸道合胞病毒增殖的方法，给予需要抑制的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。

第五方面，本发明提供了一种抑制呼吸道合胞病毒感染宿主细胞的方法，给予需要防止感染的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现式(I)化合物美伐他汀可抑制呼吸道合胞病毒增殖及感染宿主细胞，可用作治疗呼吸道合胞病毒感染方面的疾病。

美伐他汀是小分子化合物，其CC₅₀为62.61μM，能够剂量依赖的抑制呼吸道合胞病毒复制，其IC₅₀(半数抑制浓度)为0.67μM，选择指数(SI)约为93，表明美伐他汀是低毒高效的抗呼吸道合胞病毒的药物。

附图说明

图1为本发明实施例提供的美伐他汀细胞毒性检测示意图；

图2为本发明实施例提供的在Hela细胞中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平图；

图3为本发明实施例提供的在Hela细胞培养液上清中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平图；

图4为本发明实施例提供的在Hela细胞内，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平图；

图5为本发明实施例提供的在Hela细胞外，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

本发明实施例涉及如下：

美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途。

在一些实施例中，所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞病毒增殖。

在一些实施例中，所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞感染宿主细胞。

本发明提供了一种治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物，所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

可以理解的是，本发明实施例的药物可以添加不同的药物学可以接受的辅料从而制备成合适的临床剂型，这些临床剂型包括但不限于如下的剂型：片剂(包括但不限于包衣片剂)、胶囊剂，口服液体剂、口服颗粒剂、口服散剂、注射剂(包括但不限于冻干粉针或者注射用乳剂)。这些药物学可以接受的辅料包括但不限于稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂等。进一步地：稀释剂，如淀粉、蔗糖、纤维素类、无机盐类等；润湿剂，如水、乙醇等；黏合剂，如淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇等；崩解剂，如淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、跑腾崩解剂等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇等；色香味调节剂，如色素、香料、甜味剂、胶浆剂、矫臭剂等，具体如品红、木糖醇；溶剂，如水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油、乙酸乙酯等；增溶剂，如吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物等；助溶剂，如有机酸(如枸橼酸)及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以、甘油等；乳化剂，如司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、***胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅、皂土等；助悬剂，如甘油、糖浆、***胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇、触变胶等；抗氧剂，如亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类等；金属络合剂，如乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物等；惰性气体，如氮气、二氧化碳等；防腐剂，如尼泊金类、有机酸及其盐(如苯甲酸钠)、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油等；局部止痛剂，如苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因等；pH调节剂，如盐酸、硫酸、磷酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸、枸橼酸盐等；等渗或等张调节剂，如葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇等。可以理解的是，本发明实施例所述的稀释剂也可以叫填充剂，在药物制剂中发挥作用相同；本发明实施例所述的水为满足药剂要求的水，例如注射用水、纯化水等，油为注射用油；本发明实施例所述的防腐剂也可以称作抗菌剂，在制剂中发挥抑制微生物生长、延长保质期等作用；本发明实施例的润滑剂含有助流剂、抗黏剂等；本发明实施例所述的糖可以是糖粉或者是糖浆，糖的种类也不限于葡萄糖；本发明实施例所述的香料包括但不限于香精。

可以理解是，本发明实施例所涉及的药物，基于不同的辅料、制备不同的剂型，相应地，给药方式也可以是多样的。

本发明还提供了一种制备治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物的方法，将有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

本发明还提供了一种抑制呼吸道合胞病毒增殖的方法，给予需要抑制的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。

本发明还提供了一种抑制呼吸道合胞病毒感染宿主细胞的方法，给予需要防止感染的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

目前，抗呼吸道合胞病毒药物体外筛选的细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用细胞培养筛选法检测式(I)所示化合物美伐他汀对呼吸道合胞病毒感染Hela细胞的影响，基于对上清和细胞内病毒核酸拷贝数的检测定量分析式(I)化合物抗呼吸道合胞病毒活性。

实施例1：式(I)化合物(美伐他汀)抗呼吸道合胞病毒活性的评价

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

HeLa细胞购自ATCC(货号：HTB-037)。

式(I)化合物(CAS:73573-88-3)购于Sigma公司。

1.2试剂

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；CCK8细胞活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaq^TM Universal

Green Supermix)购自Bio-Rad公司。

1.3实验仪器

定量RCP仪(Bio-Rad CFX96 Touch^TM Real-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪购自PerkinElmer公司。

1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。

2.实验方法与结果

2.1细胞培养

37℃，5％ CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90％汇合度后传代，传代比例1/3–1/4。

2.2病毒培养

200μl/管分装并置-70℃冻存备用。

2.3式(I)化合物的细胞毒性检测

Hela细胞按6×10³细胞/孔(100μl)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(DMEM+2％血清)将药物以100.0μM为最高浓度按照2倍梯度稀释共计6个梯度(100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM，)进行处理，每梯度3个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入10μl含有CCK8试剂，置细胞培养箱中继续培养1h，1h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。

结果显示如图1所示，式(I)化合物美伐他汀对Hela细胞的CC₅₀为62.61微摩尔/升。在小于6.25μM范围内对Hela细胞完全没有细胞毒性，说明式(I)化合物有比较安全的适用范围，即式(I)化合物的给药剂量按照细胞实验用量为0.25～4.0μM。

2.4基于荧光定量PCR检测式(I)化合物抑制呼吸道合胞病毒复制的效率。

2.4.1.以下实验均在BSL-2实验室中进行：

将Hela细胞按1.0×10⁴细胞/孔接种于48孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入1.0MOI病毒液和各浓度梯度药物共500μl于37℃细胞培养箱中培养。药物以4.0μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释5个梯度，每梯度设置3个复孔。培养120h后取各实验孔上清和细胞提取RNA，逆转录为cDNA,然后进行荧光定量PCR检测。实验设置空白对照组、阳性对照组(利巴韦林)、阴性对照组(病毒感染后无药物处理)和实验药物组。

2.4.2.120h后收样，用Trizol收取细胞上清与细胞，病毒灭活后带出生物安全二级(BSL-2)实验室。用于RNA提取。

2.4.3按天漠科技公司TR205-50试剂盒说明提取样品中的RNA。

2.4.4得到的RNA按庄盟ZR102反转录试剂盒说明逆转录为cDNA。

2.4.5通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测基因组复制水平。定量RCR引物针对呼吸道合胞病毒的N基因序列，定量RCR引物如下：

5'-TGACAGCAGAAGAACTAGGGC-3'；

5'-TGGGTGATGTGAATTTGCCCT-3'。

选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对GADPH的定量RCR引物如下：

5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；

5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。

2.4.6定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以组作为标准组进行归一计算，计算公式：病毒复制抑制率＝1-药物组/阴性对照组×100％。结果通过GraphPadPrism 8软件计算出平均值、标准差及IC50。

2.4.7利用步骤(2.4.6)中的计算结果绘制式(I)化合物抑制呼吸道合胞病毒的复制的结果图。结果如图2和图3所示。

图2结果显示：在Hela细胞中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平,其对呼吸道合胞病毒复制的IC₅₀(半数抑制浓度)为0.67微摩尔/升。

图3结果显示：在Hela细胞培养液上清中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平,其对呼吸道合胞病毒复制的IC₅₀(半数抑制浓度)为0.75微摩尔/升。

2.5基于酶联免疫吸附实验(ELISA)检测式(I)化合物抑制呼吸道合胞病毒复制的效率。

2.5.1.以下实验均在BSL-2实验室中进行：

将Hela细胞按1.0×10⁴细胞/孔接种于48孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入1.0MOI病毒液和各浓度梯度药物共500μl于37℃细胞培养箱中培养。药物以4.0μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释5个梯度，每梯度设置3个复孔。培养120h后取各实验孔上清和细胞进行酶联免疫吸附实验(ELISA)检测。实验设置空白对照组、阳性对照组(利巴韦林)、阴性对照组(病毒感染后无药物处理)和实验药物组。

2.5.2.120h后收样，收取细胞上清与细胞，病毒灭活后带出生物安全二级(BSL-2)实验室。

2.5.3.在收取的细胞中加入细胞裂解液100μl(50mM Tris,0.5％NP-40,1mM EDTA和100mM NaCl)，4℃摇床上裂解1小时，转移到1.5毫升EP管中，然后在离心机上4℃，12000rpm离心10分钟，收取上清。

2.5.4.按百济神州SEK11049(呼吸道合胞病毒抗原检测试剂盒)的说明书检测上述细胞上清和细胞裂解液上清。

2.5.5.用上一步测定的OD₄₅₀值按计算公式：病毒复制抑制率(％)＝1-药物组OD₄₅₀值/阴性对照组OD₄₅₀值×100％。结果通过GraphPad Prism 8软件绘出抑制曲线。

2.5.6利用步骤(2.5.5)中的计算结果绘制式(I)化合物抑制呼吸道合胞病毒的复制的结果图。结果如图4和图5所示。

图4和图5结果显示：在Hela细胞内和细胞外中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制呼吸道合胞病毒的复制水平。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.美伐他汀或其药学上可接受的盐在制备治疗抗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞病毒增殖。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述美伐他汀或其药学上可接受的盐抑制呼吸道合胞感染宿主细胞。

4.一种治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物，其特征在于：所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物，其特征在于：所述药物包括美伐他汀或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求4所述的治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物，其特征在于：所述药物剂型选自片剂、胶囊剂、口服液体剂、口服颗粒剂、口服散剂或注射剂。

7.一种制备治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的药物的方法，其特征在于：将有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合。

8.一种抑制呼吸道合胞病毒增殖的方法，其特征在于：给予需要抑制的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。

9.一种抑制呼吸道合胞病毒感染宿主细胞的方法，其特征在于：给予需要防止感染的对象有效量的美伐他汀或其药学上可接受的盐。