JP2021100406A - リボ核酸の無細胞生産 - Google Patents

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Abstract

【課題】リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための方法、およおび細胞溶解物を提供する。【解決手段】ＲＮＡの無細胞生産のための細胞溶解物の生産方法であって、プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結された、ヌクレアーゼを発現する核酸を含み、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化又は細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される細胞を培養し、細胞溶解物を生産し、ＲＮＡ解重合を生じる条件下で細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−一リン酸を含む第１の細胞溶解物を生産すること、を含む方法である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで、２０１５年３月３０日に出願された米国仮出願第６２／１４０，４０７号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子のＤＮＡ配列を用いて遺伝子を「オフ」にする細胞機構を指し、このプロセスは「サイレンシング」と呼ばれる。動物、植物および真菌を含む広範囲の生物において、ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘発される。精製された組換え酵素および精製されたヌクレオチド三リン酸を用いて、生細胞およびin vitroにおいて二本鎖ＲＮＡ（例として、治療用ｄｓＲＮＡ）が生産されている（例えば、欧州特許第１６３１６７５Ａ１号および米国特許公報第ＵＳ２０１４／０２７１５５９Ａ１号参照）。しかしながら、かかるシステムを使用するｄｓＲＮＡの大規模生産は、困難であり、非効率的であり、高価である。
本明細書において、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡの無細胞生産（生合成とも呼ばれる）のためのプラットフォームが提供される。本開示の方法、組成物（例えば、細胞および細胞溶解物）、およびシステムは、一リン酸および二リン酸リボヌクレオチドモノマーへのポリマーＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび／またはｒＲＮＡ）の無細胞（例えば細胞溶解物を使用した）分解を含むプロセスに基づく。ＲＮＡ分解の後、一リン酸および二リン酸リボヌクレオチドモノマーをリボヌクレオチドに変換し、次いでリボヌクレオチド三リン酸を重合して所望のＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を形成する。
したがって、本開示は、リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物を生産する方法を提供する。該方法は、（ａ）所望の細胞密度へ細胞を培養することであって、細胞がプロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結された、ヌクレアーゼ（例えば、ＳＩヌクレアーゼ、ＮｕｃＡ、ＮＰａｓｅ、ＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、またはＮａｓｅＲ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸を含み、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＲ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、および／またはＲＮａｓｅＴ）が遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化され、（ｂ）（ａ）で生産された細胞を溶解すること、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および（ｃ）ＲＮＡ解重合およびＮＭＰおよびＮＤＰリン酸化を生じる条件下で第１の細胞溶解物をインキュベートすること、それによってヌクレオチド５’−一リン酸（またはヌクレオチド５’−一リン酸およびヌクレオチド５’−二リン酸の混合物）を含む第１の細胞溶解物を生産すること、を含み得る。
いくつかの態様において、該方法は、（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸であって、同族のプロテアーゼ（例えば、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）が少なくともペリプラズム標的化配列に連結され、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼ（例えば、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼ、ヌクレオシドリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびポリリン酸キナーゼ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｖ）ＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含み、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化され、を含む細胞を培養すること；および（ｅ）、第２の細胞溶解物を生産するためにステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解することをさらに含む。
いくつかの態様において、該方法は、ステップ（ｂ）で生産された第１細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２細胞溶解物、およびポリリン酸および／またはグルコースを組み合わせること、それにより混合物を生産すること、およびＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）の生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすることをさらに含む。
いくつかの態様において、該方法は、（ａ）細胞を所望の細胞密度へ培養することであって、細胞が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化され、（ｂ）（ａ）で生産された細胞を溶解して第１の細胞溶解物を生産すること、および（ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下で第１の細胞溶解物をポリリン酸および／またはグルコースと共にインキュベートすること、それによってヌクレオチド５’−三リン酸の混合物を含む第１の細胞溶解物を生産することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識配列を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸であって、同族のプロテアーゼが、ペリプラズム標的化配列に連結され、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含み、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内の標的化タンパク質分解を介して不活性化され、を含む細胞を培養すること、および（ｅ）第２の細胞溶解物を生産するためにステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解することをさらに含む。
いくつかの態様において、該方法は、ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、およびポリリン酸および／またはグルコースを組み合わせること、ＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすることをさらに含む。
本明細書では、またプロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレオチドキナーゼならびにヌクレオチド５’−一リン酸およびヌクレオチド５’−二リン酸の混合物を含む、操作された細胞および細胞溶解物が提供される。
本明細書においてＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡテンプレートを含む操作された細胞および細胞溶解物がさらに提供される。
本開示のいくつかの態様は、リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法を提供し、該方法は、（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせることであって、第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ヌクレオチド５’−一リン酸を含み、第２の細胞溶解物が（ｉｉｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｉｖ）ヌクレオチドキナーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含み、それによって反応混合物を形成すること、および（ｂ）目的のＲＮＡ（例えば、目的の二本鎖ＲＮＡ）の生産をもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
いくつかの態様において、該方法は、（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせることであって、第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレアーゼ、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼおよびポリリン酸および／またはグルコース、（ｉｉｉ）ヌクレオチド５’−三リン酸を含み、および、第２の細胞溶解物が、（ｉｖ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含み、それにより反応混合物を形成すること、および（ｂ）目的のＲＮＡ（例えば、目的の二本鎖ＲＮＡ）の生産をもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
本明細書で提供される態様のいずれか１つにおいて、細胞溶解物または反応混合物は、ヌクレアーゼ活性を有さなくてもよい。
本発明のいくつかの態様の詳細は、添付の図面および詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）生合成のためのプロセスの例のフローチャートを示す。この例では、ある集団の細胞は、ペリプラズムに隔離された操作されたＲＮＡ特異的ヌクレアーゼ、および少なくとも１つの操作されたプロテアーゼ標的化内因性ＲＮａｓｅを発現する。別の集団の細胞は、操作されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ペリプラズムに隔離された操作された部位特異的プロテアーゼ、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性ＲＮａｓｅ、および所望のＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡテンプレートを発現する。
図２は、ヌクレオチド一リン酸／ヌクレオチド二リン酸（ＮＭＰ／ＮＤＰ）のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）へのポリリン酸触媒変換の模式図を示す。
図３は、操作されたＤＮＡテンプレートのｄｓＲＮＡ生産物への変換の模式図を示す。
図４は、中間の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を介したｄｓＲＮＡ生産物への操作されたＤＮＡテンプレートの変換の模式図を示す。
本明細書では、いくつかの態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための方法、組成物およびシステムが提供される。本明細書で提供される方法は、概念的には、（１）細胞内ポリマーＲＮＡのヌクレオチドモノマーへの分解−ヌクレオチド一リン酸（ＮＭＰ）およびヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）の組み合わせ、（２）ＮＭＰおよびＮＤＰのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）への変換であり、ポリマーＲＮＡの形成のための「構成単位」として機能する、および（３）ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡを生産するためのＮＴＰの重合、の３つの概念を含む。いくつかの態様において、ある集団の細胞を操作して、該方法のステップ１および２に必要な生産物を生産し、別の集団の細胞は、該方法のステップ３に必要な生産物（例えば、酵素および核酸テンプレート）を生産するように操作される。次いで、各細胞集団から生産された細胞溶解物は、ＲＮＡの無細胞生産のために組み合わされる。他の態様において、ある集団の細胞を操作して、ステップ１に必要な生産物を生産する一方、別の集団の細胞を操作してステップ２および３に必要な生産物（例えば、酵素および核酸テンプレート）を生産する。次いで、各細胞集団から生産された細胞溶解物はＲＮＡの無細胞生産のために組み合わされる。
本明細書に記載されるＲＮＡ生産プロセスは、概念的に「ステップ」で記載されるが、プロセスのステップは、別個に（例えば、別個の細胞溶解物または別個の反応混合物中で）実施される必要はないことを理解されたい。例えば、プロセスのステップ１に必要な生産物をある細胞集団で発現させ、プロセスのステップ２に必要な生産物を別の細胞集団で発現させ、プロセスのステップ３に必要な生産物をさらに別の細胞集団で発現させてもよい。代替的にプロセスのステップ１および２に必要な生産物をある細胞集団で発現させ、ステップ３に必要な生産物を別の細胞集団で発現させてもよい。さらに、プロセスのステップ１に必要な生産物をある細胞集団で発現させ、プロセスのステップ２および３に必要な生産物を別の細胞集団によって発現させてもよい。
また、ステップ１、２および３を逐次実行する必要はないこともまた理解されたい。例えば、１つまたは１つ以上のステップのための生産物を発現する細胞の集団を、細胞の無細胞ＲＮＡ生産プロセスの１つまたは１つ以上のステップのための生産物を発現する異なる細胞集団と並行して培養してもよい。
ステップ１：ヌクレオチド５’−一リン酸（５’−ＮＭＰ）および／またはヌクレオチド５’−二リン酸（５’−ＮＤＰ）の無細胞生産
本開示のいくつかの側面は、ヌクレオチドモノマー−ヌクレオチド一リン酸（ＮＭＰ）およびヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）の組合せへの細胞内ポリマーＲＮＡの分解のための方法および組成物を提供する。Escherichia coli(E.coli)細胞は、２５重量％までのＲＮＡを含有し得る。このＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡの３つの形態のうちの１つで、オリゴマー状態で、殆ど全てが存在する。このＲＮＡは解重合されて、ＲＮＡ生合成のための構成単位として働くことができるモノマーリボヌクレオチドを生産することができる
解重合の化学的手段は、３’−ＮＭＰおよび５’−ＮＭＰの混合物の製造をもたらす。３’−ＮＭＰはｄｓＲＮＡ合成に使用することができず、したがって化学的解重合は最終ＲＮＡ生産物の全体的な収率を低下させる。ＲＮＡの化学的解重合の代替法は、本明細書に記載のヌクレアーゼを用いた酵素的解重合である。本開示にしたがって使用され得るヌクレアーゼの非限定的な例を表１に列挙する。
Figure 2021100406
５’−ＮＭＰへのＲＮＡの酵素解重合のための既存のプロセス（例えば、ＥＰ１５８７９４７Ｂ１、米国特許第３，２２３，５９２号、および書に米国特許第２，８４４，５１４号に記載されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）は、典型的には、外因性ヌクレアーゼと溶解Saccharomyces cerevisiae細胞を混合し、混合物をインキュベートしてモノマーＮＭＰを生産することを含む。これらのＮＭＰは、典型的には最終生産物であり、例えば食品生産物中の香味添加剤として使用される。
対照的に、本開示は、操作された細胞（例えば、操作されたE.coli細胞）が、細胞のペリプラズムにおいて、例えば１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、表１を参照）を発現する酵素的解重合を含む。ペリプラズムのヌクレアーゼ発現は、細胞傷害性のＲＮＡ解重合が細胞増殖中に起こらないことを確実にする。細胞溶解時に、ペリプラズムで発現されたヌクレアーゼがペリプラズムから放出され、細胞性ポリマーＲＮＡ（例えば、２つ以上の連続したリボヌクレオチドを含むＲＮＡ）に接触し、それによりポリマーＲＮＡを５’−ＮＭＰおよび／または５’−ＮＤＰへ解重合させる。本明細書において「モノマー」と呼ばれる、得られる５’−ＮＭＰおよび／または５’−ＮＤＰは、目的の特定のＲＮＡ（ＲＮＡ生産物と呼ばれる）の重合のための出発物質として、例えば、溶解物成分の精製や分離をせずに（または有意な精製や分離をせずに）ｄｓＲＮＡが用いられる。しかしながら、本明細書で提供されるように、ＲＮＡの生産に続いて、ＲＮＡは、治療剤としての使用のために精製され得ることが理解されるべきである。
本開示は、いくつかの態様において、ＲＮＡ重合における５’−ＮＭＰおよび／または５’−ＮＤＰモノマーの直接的使用を意図する。しかしながら、いくつかの条件下では、活性ヌクレアーゼの存在は、所望のｄｓＲＮＡ生産物の解重合をもたらし得る。したがって、モノマーの精製を必要とせずに後続のＲＮＡ重合反応においてモノマーを基質として使用するために、細胞ヌクレアーゼ（単数または複数）（例えば、過剰発現したヌクレアーゼ）を機能的に不活性化する手段が本明細書で提供される。いくつかの態様において、例えば、２０１２年３月１日に公開された米国特許公報第２０１２／００５２５４７Ａ１号および２０１５年２月１２日に公開された国際公開第ＷＯ２０１５／０２１０５８Ａ２号に記載されているように、標的化タンパク質分解によって、ＲＮＡ解重合後のヌクレアーゼの機能的不活性化を達成することができ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。標的化／誘導性タンパク質の不活性化の他の手段もまた本明細書において意図される。
ステップ２：５’−ＮＭＰおよび５’−ＮＤＰの５’−ＮＴＰへの無細胞変換
本開示のいくつかの側面は、ポリマーＲＮＡの形成のための「構成単位」として働くＮＭＰおよびＮＤＰのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）への変換のための方法および組成物を提供する。５’−ＮＭＰおよび５’−ＮＤＰを５’−ＮＴＰへ変換するための精製タンパク質または細胞抽出物を含むプロセスは公知である（例えば、米国特許第６，０２２，７１３号であり、参照により本明細書に組み込まれる）。本開示にしたがって、５’−ＮＭＰを５’−ＮＤＰに変換するために使用され得るＮＭＰキナーゼの非限定的な例を表２に列挙する。当業者には理解されるように、任意の酵素または他の所望のキナーゼ活性を有する薬剤を本発明で使用することができる。いくつかの態様において、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がリン酸供与体である。
Figure 2021100406
本開示にしたがってＮＤＰをＮＴＰに変換するために使用され得るＮＤＰキナーゼの非限定的な例を表３に列挙する。ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（Ｎｄｋ）のリン酸供与体はＡＴＰまたはＧＴＰであり、ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｋ）のリン酸供与体はホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）であり、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）のリン酸供与体はポリリン酸である。本開示のポリリン酸触媒プロセスの説明については、図２を参照されたい。当業者には理解されるように、所望のキナーゼ活性を有する任意の酵素または他の薬剤を本発明にしたがって使用することができる。
Figure 2021100406
本開示の細胞溶解物は、（１）ＮＭＰをＮＤＰへ、（２）ＮＤＰをＮＴＰへ、および（３）ＮＴＰをｄｓＲＮＡへ、無細胞酵素変換するために使用される。いくつかの態様において、ＮＭＰ、ＮＤＰおよび／またはＮＴＰを分解する細胞溶解物（単数または複数）の酵素を除去／消去または不活性化することが有利である。本開示にしたがって、除去または不活性化され得る酵素の非限定的な例を表４に列挙する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、表４に列挙される酵素の少なくとも１つ（例えば、１、２、３または４）を発現しないか、または不活性または不活性化形態を発現する細胞を設計することを意図する。
Figure 2021100406
（１）ＮＭＰをＮＤＰへ、（２）ＮＤＰをＮＴＰへ、および（３）ＮＴＰをｄｓＲＮＡへ、の酵素的変換は、いくつかの場合、高エネルギーリン酸供与体原料（例えば、ポリリン酸）を必要とする。いくつかの態様において、ポリリン酸を分解する細胞溶解物酵素を除去／消去または不活性化することが有利である。かかる酵素の非限定的な例は、E.coliエキソポリホスファターゼである（ＥＣ３．６．１．１．１；ポリリン酸ｎ＋Ｈ２Ｏ→ポリリン酸ｎ−１＋Ｐｉ）。したがって、いくつかの態様において、本開示は、エキソポリホスファターゼを発現しないか、または不活性または不活性化形態のエキソポリホスファターゼを作製することを意図する。本開示は例えばプロテアーゼ標的化を通じた他のホスファターゼ酵素の不活性をもまた意図する。
いくつかの態様において、酵素の活性（例えば、ヌクレアーゼ）は、宿主のゲノムから同族遺伝子を欠失させること（遺伝子「ノックアウト」と呼ばれる）によって細胞から除去される。ただし、活性は細胞生存性にとって必須ではない。
いくつかの態様において、酵素の活性は、例えば、２０１２年３月１日に公開された米国特許公報第２０１２／００５２５４７Ａ１号、および、２０１５年２月１２日に公開された国際公開第ＷＯ２０１５／０２１０５８Ａ２号に記載されているように、例えば標的タンパク質の分解を使用した制御可能な様式で阻害または低減され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。）標的化酵素の不活性化の他の手段も本明細書において意図される。
ステップ３：リボ核酸（ＲＮＡ）および／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の無細胞生産
本開示のいくつかの態様は、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡを生産するためのＮＴＰの重合のための方法および組成物を提供する。酵素的に誘導された５’−ＮＴＰは、ＲＮＡ転写生産物を生産するＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに重合される。本開示にしたがって使用され得るＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例を表５に列挙する。
Figure 2021100406
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いたｄｓＲＮＡの生産
本開示のいくつかの側面は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の無細胞生産を対象とする。いくつかの態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、ＲＮＡをコードする配列（例えば、ＲＮＡ転写物）に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡテンプレートによってコードされる。いくつかの態様において、ＲＮＡは、ヒンジドメインを介して連結された２つの相補的ドメインを含む。図３に示す例を参照すると、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）テンプレートの相補的ドメイン（ドメイン１およびドメイン３）が互いに結合すると、ヒンジドメイン（ドメイン２）はループ様構造を形成する。
２つの核酸ドメイン（例えば、別個のヌクレオチド配列）は、それらが互いにワトソン−クリック相互作用（またはハイブリダイゼーションとも呼ばれる）を介して二本鎖核酸分子を形成するように互いに塩基対合または結合する場合、互いに「相補的」である。本明細書中で使用される場合、「結合」は、例えば、生理学的条件下での静電、疎水性、イオンおよび／または水素結合相互作用に起因する、少なくとも２つの分子または同じ分子の２つの領域間の会合を指す。いくつかの態様において、相補的ドメインは、４〜１０００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを有する。例えば、相補ドメインは、４〜１０、４〜２０、４〜３０、４〜５０、４〜６０、４〜７０、４〜８０、４〜９０、４〜１００、４〜２００、４〜３００、４〜４００または４〜５００または４〜１０００ヌクレオチドの長さを有することができる。いくつかの態様において、相補的ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、相補的ドメインは、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの態様において、２つの相補的ドメインの１つは標的特異的であり、本明細書において（＋）相補的ドメインと呼ばれる。すなわち、相補的ドメインは、目的の標的核酸と相補的（例えば一致する）となるように設計することができる。したがって、いくつかの態様において、（＋）相補的ドメインは標的核酸に相補的であるように設計され、（−）相補的ドメインは（＋）相補的ドメインに相補的であるように設計される。
本開示の核酸の文脈における「ヒンジドメイン」とは、「相補的ドメイン」を分離する１本鎖領域をいう。典型的には、ヒンジドメインは非特異的であり、これは、標的核酸などの別の核酸に結合するようには設計されていないことを意味する。ヒンジドメインは、相補的ドメインの結合の際にループ状構造を形成して二本鎖領域を形成する。いくつかの態様において、ヒンジドメインは、４〜５００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを有する。例えば、ヒンジドメインは、４〜１０、４〜２０、４〜３０、４〜５０、４〜６０、４〜７０、４〜８０、４〜９０、４〜１００、４〜２００、４〜３００個、４〜４００個または４〜５００個のヌクレオチドの長さを有することができる。いくつかの態様において、ヒンジドメインは、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドの長さを有する。
本開示の「二本鎖ＲＮＡ」は、一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含まない完全に二本鎖の分子、および部分的な二本鎖の分子を含み、これらは二本鎖領域および一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含む。図３の下部に示されたｄｓＲＮＡ生産物は部分的に二本鎖分子と考えられ、図４の下部に示されたｄｓＲＮＡ生産物は完全な二本鎖分子と考えられる。
いくつかの態様において、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡの無細胞生産は、Ｔ１遺伝子からコードされる高度にプロセッシブなＤＮＡ依存性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって触媒され得るが、本開示にしたがって他のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが使用され得る。したがって、いくつかの態様において、操作されたＤＮＡテンプレートは、目的のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＴ７特異的プロモーターを含む。典型的には、プロモーターはコード配列のすぐ５’に位置する。いくつかの態様において、操作されたＤＮＡテンプレートは、Ｔ７特異的転写ターミネーターを含む。転写ターミネーターは、典型的にはコード配列のすぐ３’に位置する。図３に示すように、ドメイン１、ドメイン２およびドメイン３をコードする配列は、転写プロモーターおよび転写ターミネーターによって各末端に隣接している。同様に、図４に示すように、ドメイン１をコードする配列は、転写プロモーターおよび転写ターミネーターによって各末端に隣接している。
いくつかの態様において、ＤＮＡテンプレート（例えば、５’プロモーターおよび３’ターミネーターを含む）は、コード領域の外側のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む発現ベクター上に位置する。かかる態様において、ベクターのエンドヌクレアーゼ制限部位を切断する同族の制限エンドヌクレアーゼを発現するように細胞を操作して、ＤＮＡテンプレートの線状化をもたらすことができる。線状化は、例えば、所望のＲＮＡ分子の「ラン・オフ転写（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」を可能にし、全体的な収率を改善する。いくつかの態様において、同族の制限エンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである。他の制限エンドヌクレアーゼは公知であり、本開示にしたがって使用することができる。非限定的な例には、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎＦＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｓｍａｌ、Ｈａｅｌｌ１、Ｈｇａｌ、Ａｌｕ１、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａｄ、Ｓａｉｌ、Ｓｅａｌ、Ｓｐｅｌ、ＳｐｈＩ、Ｓｔｕｌ、ＸｂａＩ、Ｆｏｋ１、ＡｓｃＩ、ＡｓａＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、Ｐａｄ、Ｓｄａｌ、ＳｇｆＬ、ＳｆｉＩ、Ｐｍｅｌが含まれる。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いたｄｓＲＮＡの生産
いくつかの態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、単一標的ドメイン（例えば、目的の標的核酸に相補的なドメイン）を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡテンプレートによってコードされる。図４に示す例を参照すると、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の生産後、目的のｄｓＲＮＡを合成するためにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）を使用することができる。いくつかの態様において、ファージφ６から単離されたＲｄＲＰを用いてｄｓＲＮＡを合成する。ファージφ６は、シュードモナス属のメンバーに感染する二本鎖ＲＮＡウイルスである。ファージφ６は、最もよく研究されているｄｓＲＮＡウイルスの１つである。このファージは、ＲＮＡテンプレートを用いてＲＮＡを合成し、ｄｓＲＮＡ分子を生産することができるＲｄＲＰをコードする。φ６ＲｄＲＰはプライマー分子の存在しないＲＮＡを重合することができるため、ポリメラーゼはテンプレートＲＮＡのみを必要とする(Wright, S. et al, 2012. Journal of Virology. Mar;86(5):2837-49; Van Dijk, AA., et al, 2004. Gen Virol. May;85(Pt 5)、参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書において他のウイルス性ＲｄＲＰも意図される。
いくつかの態様において、単一標的ドメインを含むＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートは、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、次いで得られたＲＮＡ転写物は、例えば、ファージφ６ＲｄＲＰなどのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートとして機能し、相補的ＲＮＡ分子を合成し、ｄｓＲＮＡを生成する（例えば、図４）。
宿主ＲＮＡポリメラーゼの阻害
上記の細胞リボ核酸の溶解および解重合は、典型的には、５’−リボヌクレオチドのプールを生じる。天然ＲＮＡポリメラーゼと異種Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはφ６ＲｄＲＰとの間のこれらのリボヌクレオチドのプールに対する競合は、いくつかの場合において、所望のＲＮＡ生産物の収率を低下させる可能性がある。それにもかかわらず、ＲＮＡポリメラーゼはインタクトな細胞の生存に必須である。したがって、天然ＲＮＡポリメラーゼ機能を破壊するための少なくとも２つの方法がここに提供される。例えば、本明細書の他の箇所に記載されているように、標的化タンパク質分解は、天然ＲＮＡポリメラーゼの主要成分の少なくとも１つの活性を破壊し、ＲＮＡポリメラーゼ活性の十分な破壊をもたらすために使用され得る。天然ＲＮＡポリメラーゼ機能を破壊する別の例として、Ｔ７ファージタンパク質Ｇｐ２を発現させることができる。Ｇｐ２は、Ｔ７ファージによるE.coliの感染後に翻訳される第２のＴ７ファージタンパク質である。このタンパク質は、宿主ＲＮＡポリメラーゼ機能を破壊し、したがって、天然のＲＮＡポリメラーゼとファージポリメラーゼとの間の競合を除去する(Bae, B. et al, 2013. Proc Natl Acad Sci U SA. Dec 3;110(49): 19772-7)。
宿主リボヌクレアーゼの不活性化による生産物収率の改善
ＲＮＡの無細胞生産の一側面（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、合成中および合成後の生産物分解の阻害／防止である。すべての生きている生物において、ＲＮＡ分子を切断して処理する能力は、生存に不可欠である。リボヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅと呼ばれる多くの天然のE.coli酵素は、様々な親和性でＲＮＡ分子の解重合を触媒する。ＲＮａｓｅＤを含むこれらのＲＮａｓｅのいくつかは、ｔＲＮＡ成熟に関与し、基質特異性が高く、ＲＮａｓｅを含む他のものは、広範囲のＲＮＡポリマーを解重合することができる。ＲＮａｓｅの非限定的な例、ならびにそれらの同族遺伝子、予測された活性および配列の例を表６に示す。
いくつかの態様において、目的のＲＮＡ生産物を解重合または他の方法で分解する内因性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性の５０％〜１００％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）は、操作された細胞から生産された細胞溶解物中で不活性化または欠失されるように操作される。これは、当該技術分野で公知の任意の手段によって達成され得る。いくつかの態様において、これは、ＲＮａｓｅが細胞生存性にとって必須でないならば、ＲＮａｓｅをコードする内因性遺伝子の染色体欠失によって達成される。細胞のゲノムから欠失され得る遺伝子の例を表６に列挙する。いくつかの態様において、ＲＮａｓｅが細胞生存に必須である場合、細胞は、標的化タンパク質分解（例えば、タンパク質分解）に感受性になるように操作された内因性ＲＮａｓｅを含むように操作され得る（例えば、それらの天然／内因性プロモーターから発現される）。本明細書で提供されるプロテアーゼ標的化され得るＲＮａｓｅ／ヌクレアーゼの例を表７に列挙する。いくつかの態様において、前述のアプローチの組み合わせが使用される。代替的に、または追加的に、ヌクレアーゼ阻害剤を使用してもよい（例えば、細胞溶解物または反応混合物に添加する）。ｐｎｐおよびｒｎｂの同時の欠失は細胞にとって致死的であることに留意すべきである。したがって、本開示はまた、コードされた酵素の一方または両方のプロテアーゼ標的化を意図する。
Figure 2021100406
Figure 2021100406
E.coliのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素は、ｄｓＲＮＡおよびいくつかの一本鎖ｍＲＮＡ分子を優先的に切断する(Robertson, HD and J.J. Dunn. 1974. J Biol Chem. Apr 25;250(8):3050-6.; Lybecker, M. et al. 2014. The double-stranded transcriptome of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U SA. Feb 25; 111(8):3134-9、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。無細胞系におけるこの酵素の存在は、生産物が容易に切断されるので、高濃度のｄｓＲＮＡを蓄積する能力を制限し得る。ＲＮａｓｅＩＩＩ、ｒｎｃをコードする遺伝子は、細胞生存にとって必須ではないので、本開示は、いくつかの態様において、目的のＲＮＡの無細胞生産の前に、操作された細胞におけるｒｎｃの染色体欠失／突然変異、またはＲＮａｓｅＩＩＩのプロテアーゼ標的化を意図する(Takiff, H.E. et al. 1989. J Bacteriol. May;171(5):2581-90、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
同様に、広範な基質エキソリボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩは、E.coliの生存能力にとって必須ではない。インタクトなE.coli細胞のペリプラズム空間に局在するＲＮａｓｅＩは、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含む広範囲のＲＮＡ分子の解重合を触媒する(Neu, H.C. and L.A. Heppel. 1964. J Biol Chem. Nov;239:3893-900)。生理学的条件下で、この酵素のペリプラズムの局在化は、酵素が細胞内のＲＮＡ安定性にほとんど影響を与えないことを意味する。しかしながら、本開示の無細胞の方法におけるペリプラズムと細胞質の混合は、ＲＮａｓｅＩが細胞ＲＮＡにアクセスすることを可能にする。その存在は、ｓｓＲＮＡ中間体の分解を通じて生産物を有意に減少させる可能性がある。したがって、本開示は、いくつかの態様において、ｒｎａ、ＲＮａｓｅＩをコードする遺伝子の染色体欠失／変異、またはＲＮａｓｅＩのプロテアーゼ標的化を意図する（Kaplan, R. and D. Apirion. 1974. J Biol Chem. Jan 10;249(1): 149-51、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＲＮａｓｅＲおよびＲＮａｓｅＴの２つの他の広範な基質エキソリボヌクレアーゼは、ｄｓＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡならびに小さく構造化されていないＲＮＡ分子の解重合を触媒する（Cheng and Deutscher. 2002; Cheng and Deutscher. 2005; Vincent and Deutscher. 2009; Viswanathan et al., 1998）。ＲＮａｓｅＲおよびＲＮａｓｅＴ、ｒｎｒおよびｒｎｔをそれぞれコードする遺伝子は、細胞生存に必須ではない。したがって、本開示は、いくつかの態様において、ｒｎｒおよび／またはｒｎｔの染色体欠失／変異、またはＲＮａｓｅＲおよび／またはＲＮａｓｅのプロテアーゼ標的化を意図する。
生存しているE.coli細胞内のＲＮＡ、特にｍＲＮＡのターンオーバーの中心的な構成要素は、デグラドソームと呼ばれる一群の酵素である（Bandyra, K. and B.F. Luisi, 2013. RNA Biol. Apr;10(4):627-35; A.J. Carpousis, 2002. Biochem Soc Trans.Apr;30(2): 150-5、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。このデグラドソームは、２つのリボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅＥおよびＰＮＰａｓｅ、ＲＮＡヘリカーゼ、およびＲＮＡ分解において役割を果たすいくつかの他のタンパク質を含む。ＲＮａｓｅＥは、ｒＲＮＡ成熟およびｍＲＮＡのターンオーバーを制御するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。理論に縛られることなく、ＲＮａｓｅＥは、細胞のｍＲＮＡプールを絶えず切り替えるために、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅＩＩなどのエキソリボヌクレアーゼと協力して働くことができる。このモデルでは、ＲＮａｓｅＥは、最初に標的ＲＮＡ分子を内部で切断し、続いて、より小さいＲＮＡ断片はモノマーに分解される。ＲＮａｓｅＥ、ｒｎｅをコードする遺伝子の破壊は、E.coliにおいて致死的である(Goldblum, K. and D. Apririon, 1981. J Bacteriol. Apr; 146(1): 128-32、参照により本明細書に組みこまれる）。したがって、本開示は、いくつかの態様において、ＲＮａｓｅＲおよび／またはＲＮａｓｅのプロテアーゼ標的化を意図する。いくつかの態様において、本開示は、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅＩＩの一方のみのプロアーゼ標的化を意図する。
上記のように、ｐｎｐ遺伝子によってコードされるE.coli ＰＮＰａｓｅは、３’→５’プロセッシビティーを有するエキソリボヌクレアーゼとして働くデグラドソームに関連する(A.J. Carpousis, 2002)。ＰＮＰａｓｅは、ｍＲＮＡ分解ならびにｔＲＮＡ成熟およびターンオーバーにおいて役割を果たす。同様に、ｒｎｂ遺伝子によってコードされるＲＮａｓｅＩＩは、ｍＲＮＡとｔＲＮＡの両方を３’→５’方向に解重合する。２つの遺伝子のどちらも必須ではないが、両方の遺伝子の同時の破壊は合成的に致死的である。したがって、本開示は、いくつかの態様において、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅＩＩのプロテアーゼ標的化を意図する。
操作された細胞および核酸
本開示の「操作された細胞」は、少なくとも１つの操作された（例えば、組換えまたは合成）核酸を含むか、または天然に存在する対応物とは構造的および／または機能的に異なるように改変された細胞である。いくつかの態様において、操作された細胞は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個の操作された核酸を含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、２〜５、２〜１０、または２〜２０個の操作された核酸を含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の改変された核酸を含む。操作された核酸を含む細胞は、「操作された細胞」と考えられることを理解されたい。
いくつかの態様において、「細胞」または「操作された細胞」の培養物は、均質な集団または細胞の異種集団を含む。例えば、細胞の培養物は、本開示の少なくとも１つの操作された核酸を発現する、各タイプの細胞の２つ以上のタイプの細胞を含み得る。
用語「核酸」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指し、いくつかの場合においてホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「骨格」）を含み得る。核酸（例えば、核酸の成分または部分）は、天然に存在するかまたは操作され得る。「天然に存在する」核酸は、ヒトの介入がない場合に天然界に存在する細胞中に存在する。「操作された核酸」には、組換え核酸および合成核酸が含まれる。「組換え核酸」は、核酸分子を（例えば、同じ種または異なる種からのもの）を連結することによって構築され、典型的には生きた細胞中で複製することができる分子を指す。「合成核酸」は、化学的にまたは他の方法で修飾されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対を形成することができるものを含む、化学的にまたは合成または増幅された他の手段による分子を指す。組換え核酸および合成核酸には、上記のいずれかの複製から生じる分子も含まれる。操作された核酸は、天然に存在する核酸の部分を含み得るが、全体として、操作された核酸は天然発生せず、ヒトの介入を必要とすることを理解すべきである。いくつかの態様において、本開示の生産物をコードする核酸は、組換え核酸または合成核酸である。他の態様、生産物をコードする核酸は天然に存在する。他の態様において、生産物をコードする核酸は天然に存在する。
本明細書で提供される生産物（例えば、タンパク質または核酸）をコードする操作された核酸は、「プロモーター」に作動可能に連結され、残りの核酸の転写の開始および速度が制御される核酸の制御領域である。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動し、または転写を駆動する。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るものとして、遺伝子または配列に天然に関連し得る。かかるプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。
いくつかの態様において、コードする核酸配列は、組換えまたは異種プロモーターの制御下に位置し得て、異種プロモーターはその天然環境においてコードされた配列と通常は関連していないプロモーターを指す。かかるプロモーターには、他の遺伝子のプロモーターが含まれ得る；他の細胞から単離されたプロモーター；当該技術分野で知られている遺伝子工学の方法によって発現を変化させる異なる転写制御領域および／または突然変異の異なる要素を含むものなどの「天然に存在しない」合成プロモーターまたはエンハンサーが含まれる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて配列を生産することができる。
プロモーターは、その核酸の転写開始および／または発現を制御（「駆動」）するように制御する核酸に関して正確な機能的位置および配向にある場合、「作動可能に連結されている」と考えられる。
本開示の操作された核酸は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含み得る。「構成的プロモーター」は、細胞内で常に活性であるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」は、誘導物質または誘導物質の存在下で、影響を受けたとき、または接触したときに転写活性を開始または促進するプロモーターを指す。本開示にしたがって使用するための誘導性プロモーターには、本明細書に記載されるか、または当業者に公知の任意の誘導性プロモーターが含まれる。誘導制御プロモーターの例には、限定されるものでなく、アルコール制御プロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、病原性制御プロモーター、温度／熱誘導性、および光制御プロモーターなどの化学的／生化学的に制御されたおよび物理的に制御されるプロモーターが含まれる。
誘導因子または誘導剤は、誘導性プロモーターからの転写活性を制御するように誘導性プロモーターに接触する内因性または通常は外因性の条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学的または非化学的化合物）またはタンパク質であり得る。したがって、核酸の「転写を制御するシグナル」は、誘導性プロモーターに作用する誘導物質シグナルを指す。転写を制御するシグナルは、使用される制御システムに応じて、転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化は、転写を駆動するプロモーターに直接作用するか、またはプロモーターが転写を駆動することを妨害するリプレッサーを不活性化によって間接的にプロモーターに作用させることを含み得る。逆に、転写の失活は、転写を妨げるようにプロモーターに直接作用するか、またはプロモーターに次いで作用するリプレッサーを活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含み得る。
本開示の操作された核酸は、転写ターミネーターを含み得る。「転写ターミネーター」は、転写を停止させる核酸配列である。ターミネーターは、単方向または双方向であってもよい。これは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。ターミネーター配列は、上流のプロモーターによる下流の核酸配列の転写活性化を妨げる。したがって、特定の態様において、ＲＮＡ転写物の生産を終結させるターミネーターが意図される。最も一般的に使用されるタイプのターミネーターは順方向のターミネーターである。通常転写される核酸配列の下流に配置される場合、順方向の転写ターミネーターは、転写を中止させる。いくつかの態様において、通常、順方向鎖および逆方向鎖の両方で転写を終結させる双方向性転写ターミネーターが提供される。いくつかの態様において、逆方向性転写ターミネーターが提供され、逆方向性転写ターミネーターは、通常、逆方向鎖のみで転写を終結させる。原核生物系では、ターミネーターは通常、２つのカテゴリー（１）ｒｈｏ非依存性ターミネーターおよび（２）ｒｈｏ依存性ターミネーターに分類される。Ｒｈｏ非依存性ターミネーターは、一般に、Ｇ−Ｃ塩基対に富むステムループを形成し、その後にウラシル塩基のストリングを形成するパリンドローム配列から構成される。
本開示にしたがって使用するためのターミネーターには、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知の転写ターミネーターが含まれる。ターミネーターの非限定的な例には、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子のターミネーター配列、および、例えば、ＴＯターミネーター、ＴＥターミネーターラムダＴ１などのウイルスターミネーター配列、および、細菌系で見出されたＴ１Ｔ２ターミネーターが含まれる。いくつかの態様において、終結シグナルは、転写トランケーションまたは翻訳され得ない配列、例えば、配列トランケーションに起因するものであり得る。
本開示の酵素は、ゲノムに位置する核酸（「ゲノム的に位置する核酸」と呼ぶ）またはエピソーム的に位置する核酸（「エピソーム的に位置する核酸」と呼ぶ）によってコードされ得る。細胞においてゲノムに位置する核酸は、細胞のゲノムに位置する核酸である。細胞においてエピソームに位置する核酸は、プラスミドなどの細胞における自律複製エピソームに位置する核酸である。ゲノム的に位置する核酸およびエピソーム的に位置する核酸は、細胞の内因性（例えば、細胞内に由来するもの）または細胞の外因性（例えば、細胞外に由来するもの）であり得る。典型的には、外因性核酸は、操作された核酸（例えば、組換えまたは合成）である。
操作された核酸は、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマーまたはリポソーム）または非化学的（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、インペイルフェクション(impalefection)、光学トランスフェクション、ハイドロダイナミック））および形質導入（例えば、ウイルス形質導入）を含むが、これらに限定されない。
操作された細胞は、いくつかの態様において、選択マーカーを発現する。選択マーカーは、典型的には、細胞のトランスフェクション後に（または外来核酸を細胞に導入するために使用される他の手順にしたがって）操作された核酸を取り込んで発現した操作細胞を選択するために使用される。したがって、生産物をコードする核酸はまた、選択マーカーをコードし得る。選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子を含む。本開示にしたがって他の選択マーカーを使用し得る。
核酸（例えば、操作された核酸）によりコードされた生産物が細胞内で生産される場合、操作された細胞は生産物を「発現する」。遺伝子発現は、タンパク質などの生産物（例えば、酵素）を合成するために核酸の形態の遺伝子指示書が使用されるプロセスを指すことは、当該技術分野で周知である。
いくつかの態様において、本開示のタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）は、本明細書で提供されるように、プロテアーゼ認識配列および／またはペリプラズム標的化配列を含むように操作され得る。
天然に存在する核酸によってコードされる酵素または他のタンパク質は、「内因性酵素」または「内因性タンパク質」と指し得る。
操作された細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの態様において、操作された細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または他のタイプの細胞である。
本開示の操作された細菌細胞には、限定されないが、操作されたEscherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.およびPantoea spp.が含まれる。
本開示の操作された酵母細胞には、限定されないが、操作されたSaccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、YarrowiaおよびPichiaが含まれる。
いくつかの態様において、本開示の操作された細胞は、Escherichia coli細胞,Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisae細胞またはLactobacillus brevis細胞である。いくつかの態様において、本開示の操作された細胞は、操作されたEscherichia coli細胞である。
細胞培養
典型的には、操作された細胞は培養される。「培養」とは、典型的にはその天然環境の外で、制御された条件下で細胞を増殖させるプロセスを指す。例えば、操作された細菌細胞などの操作された細胞は、液体の「培養培地」とも指される液体栄養培地中の細胞懸濁液として増殖させることができる。
一般に使用される細菌性Escherichia coli増殖培地の例には、限定されることなく、LB(Luria Bertani)Miller broth(1%NaCl)：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および１％LB(Luria Bertani)Lennox Broth（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（Super Optimal Broth)：２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化リプレッサーを有するSuper Optimal Broth）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコース； ２倍YT broth（２ｘ酵母エキスおよびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ(Terrific Broth)培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母抽出物、７２ｍＭ K2HPO4、１７ｍＭ KH2PO4および０．４％グリセロール；およびＳＢ(Super Broth)培地：３．２％ペプトン、２％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌを含む。
高密度Escherichia coli細菌増殖培地の例としては、DNAGro(登録商標)培地、ProGro(登録商標)培地、AutoX(登録商標)培地、DetoX(登録商標)培地、InduX(登録商標)培地、およびSecPro(登録商標)培地を含む。
いくつかの態様において、操作された細胞は、生産物（例えば、タンパク質および／または核酸）の発現を生じる条件下で培養される。かかる培養条件は、発現される特定の生産物および生産物の所望の量に依存し得る。
いくつかの態様において、操作された細胞は、３０℃〜４０℃の温度で培養される。例えば、操作された細胞は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養することができる。典型的には、操作された細菌細胞などの操作された細胞は３７℃の温度で培養される。
いくつかの態様において、操作された細胞を１２時間〜７２時間またはそれ以上の期間培養する。例えば、操作された細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間の期間にわたって培養され得る。典型的には、操作された細菌細胞などの操作された細胞は、１２〜２４時間の期間培養される。いくつかの態様において、操作された細胞は、３７℃の温度で１２〜２４時間培養される。
いくつかの態様において、操作された細胞は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定された光学密度が５〜２５になるまで（例えば、液体細胞培養培地において）培養される。いくつかの態様において、操作された細胞は、５、１０、１５、２０または２５のＯＤ６００まで培養される。
いくつかの態様において、操作された細胞は、１ｘ１０４〜１×１０６生存細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度まで培養される。いくつかの態様において、操作された細胞は、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、または１ｘ１０８生存細胞／ｍｌの密度まで培養される。いくつかの態様において、操作された細胞は、２×１０５３×１０７の生存細胞／ｍｌの密度まで培養される。
いくつかの態様において、操作された細胞は、バイオリアクター内で培養される。バイオリアクターは、単回使用（使い捨て）、オートクレーブ可能、または滅菌可能な培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグなどの細胞が培養される容器を単に指す。バイオリアクターは、ガラス製であってもよいし、ポリマー系であってもよいし、他の物質からなるものであってもよい。
バイオリアクターの例としては、限定することなく、攪拌タンク（例えば、十分な混合）バイオリアクターおよびチューブラー（例えば、プラグフロー）バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、膜攪拌タンク、スピンフィルター攪拌タンク、振動ミキサー、流動床リアクターおよび膜バイオリアクターが挙げられる。バイオリアクターを操作するモードは、バッチプロセスまたは連続プロセスであり得て、培養される操作された細胞に依存する。バイオリアクターは、供給物および生産物の流れがシステムから連続的に供給され回収されるときに、連続的である。バッチ式バイオリアクターは、連続的な再循環流を有し得るが、栄養素または製品の収穫物の連続的な供給がない。断続的な収穫およびフェッドバッチ（またはバッチフィード）培養では、バッチ培地と組成が類似している培地中で、より低い生存細胞密度で細胞を接種する。細胞は、栄養素がいくらか枯渇し、細胞が定常増殖期に近づくまで、外的操作なしで指数関数的に増殖し得る。この時点で、断続的な収穫バッチ供給プロセスの場合、細胞および生産物の一部を採取し、取り出された培地に新鮮な培地を補充する。このプロセスは数回繰り返されてもよい。組換えタンパク質および抗体の生産のために、フェッドバッチ法を用い得る。細胞は指数関数的に増殖しているが、栄養素は枯渇しはじめ、追加の栄養素を供給するために、濃縮された供給物培地（例えば、１０〜１５倍濃縮基礎培地）を連続的にまたは断続的に添加して、細胞濃度および生産期の長さをさらに増加させる。培養培地（ブロス）を除去することなく、新鮮な培地を細胞濃度に比例して添加することができる。培地の添加に対応するために、バイオリアクターの全容量（例えば、最大容量の約４０％〜５０％）よりもずっと少ない容量でフェッドバッチ培養を開始する。
本開示のいくつかの方法は、ｄｓＲＮＡの大規模生産を対象とする。大規模な生産方法では、操作された細胞は、５リットル（Ｌ）〜５０リットル（Ｌ）以上の容量で液体培養培地中で増殖させることができる。いくつかの態様において、操作された細胞は、液体培養培地中で１０Ｌ以上の（またはそれに等しい）体積で増殖され得る。いくつかの態様において、操作された細胞は、液体培養培地中で、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、または５０Ｌ以上である。いくつかの態様において、操作された細胞は、５Ｌ〜１０Ｌ、５Ｌ〜１５Ｌ、５Ｌ〜２０Ｌ、５Ｌ〜２５Ｌ、５Ｌ〜３０Ｌ、５Ｌ〜３５Ｌ、５Ｌ〜４０Ｌ、５Ｌ〜４５Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌ、１０Ｌ〜２０Ｌ、１０Ｌ〜２５Ｌ、２０Ｌ〜３０Ｌ、１０Ｌ〜３５Ｌ、１０Ｌ〜４０Ｌ、１０Ｌ〜４５Ｌ、１０Ｌ〜５０Ｌ、１５Ｌ〜２０Ｌ、１５Ｌ〜２５Ｌ、１５Ｌ〜３０Ｌ、１５Ｌ〜３５Ｌ、１５Ｌ〜４０Ｌ、１５Ｌ〜４５Ｌ、または１５〜５０Ｌの容量の液体培養培地で増殖させることができる。
細胞溶解物
典型的には、操作された細胞の培養に続いて、細胞を溶解させる。「溶解」は、例えば、ウイルス、酵素、機械または浸透圧機構によって細胞を分解するプロセスを指す。「細胞溶解物」は、例えば、細胞小器官、膜脂質、タンパク質、および核酸を含む、溶解した細胞の内容物（例えば、溶解された操作された細胞）を含む流体を指す。本開示の細胞溶解物は、本明細書で提供されるように、操作された細胞の任意の集団を溶解することによって生産され得る。
「溶解」と呼ばれる細胞溶解の方法は、当該技術分野で公知であり、そのいずれも本開示にしたがって使用することができる。かかる細胞溶解法には、限定されないが、物理的溶解および化学的（例えば、界面活性剤に基づく）溶解が含まれる。
細胞溶解は、慎重に制御された細胞環境を妨害し、タンパク質分解および未制御の内因性プロテアーゼおよびホスファターゼによる修飾を生じ得る。したがって、いくつかの態様において、プロテアーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤を溶解試薬に添加してもよく、またはこれらの活性を遺伝子不活性化またはプロテアーゼ標的化によって除去してもよい。
細胞溶解物は、いくつかの態様において、少なくとも１つの栄養素と組み合わせてよい。例えば、細胞溶解物は、Ｎａ２ＨＰ０４、ＫＨ２Ｐ０４、ＮＨ４Ｃ１、ＮａＣｌ、ＭｇＳ０４、ＣａＣｌ２と組み合わせ得る。他の栄養素の例は、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロチン酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、水酸化アンモニウムを限定することなく含む。
細胞溶解物は、いくつかの態様において、少なくとも１つの補因子と組み合わされ得る。例えば、細胞溶解物は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素（例えば、無機イオンおよび補酵素）の活性に必要な他の非タンパク質化学化合物と組み合わせ得る。
いくつかの態様において、細胞溶解物は、ＲＮＡ解重合を生じる条件下でインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞溶解物は、ｄｓＲＮＡの生産を生じる条件下でインキュベートされる。
本開示の方法は、ＲＮＡ解重合および／またはｄｓＲＮＡの生産を生じる条件下で（少なくとも１つの）細胞溶解物をインキュベートすることを含む。細胞溶解物は、４℃〜４５℃またはそれ以上の温度でインキュベートし得る。例えば、操作された細胞は、温度４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５°Ｃの温度でインキュベートし得る。いくつかの態様において、細胞溶解物を４〜６℃、２５℃、または３７℃の温度でインキュベートする。いくつかの態様において、細胞溶解物を１５℃〜４５℃の温度でインキュベートする。
いくつかの態様において、細胞溶解物は、３０分（ｍｉｎ）〜４８時間（ｈｒ）またはそれ以上の時間インキュベートされる。例えば、操作された細胞は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、または４８時間である。いくつかの態様において、細胞溶解物を２時間〜４８時間インキュベートされる。いくつかの態様において、細胞溶解物は、３７℃の温度で２４時間インキュベートされる。
１回の反応に使用される細胞溶解物の容量は変わり得る。いくつか態様において、細胞溶解物の体積は１〜１５０μｍである。例えば、細胞溶解物の体積は、１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３、１５ｍ３、２０ｍ３、２５ｍ３、３０ｍ３、３５ｍ３、４０ｍ３、４５ｍ３、５０ｍ３、５５ｍ３、６０ｍ３、６５ｍ３、７０ｍ３、７５ｍ３、８０ｍ３、８５ｍ３、９０ｍ３、９５ｍ３、１００ｍ３、１０５ｍ３、１１０ｍ３、１１５ｍ３、１２０ｍ３、１２５ｍ３、１３０ｍ３、１３５ｍ３、１４０ｍ３、１４５ｍ３、または１５０ｍ３でよい。いくつかの態様において、細胞溶解物の体積は、２５μｍ〜１５０μｍ、５０μｍ〜１５０μｍ、または１００μｍ〜１５０μｍである。
いくつかの態様において、ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）活性を有さない細胞溶解物または反応混合物である。細胞溶解物または反応混合物がヌクレアーゼを含まない場合、または細胞溶解物または反応におけるヌクレアーゼ活性の量がタンパク質（例えば酵素）を検出するために使用される標準的なアッセイによって検出できない場合、細胞溶解物または反応混合物は「ヌクレアーゼ活性がない」とみなされる。酵素アッセイの非限定的な例には、連続アッセイ（例えば、分光光度計、蛍光測定、比色測定、化学発光、光散乱、およびマイクロスケール熱泳動）および不連続アッセイ（例えば、ラジオメトリックおよびクロマトグラフィー）が含まれる。他の酵素アッセイも本明細書において意図される。
プロテアーゼ標的化
本開示の改変された細胞は、ＲＮＡ解重合に必要なヌクレアーゼ（単数または複数）を発現し（例えば、内因的に発現する）、所望のＲＮＡ産物を分解し得る。本明細書で提供される方法によって生産されるＲＮＡの分解を防止または低減するために、ヌクレアーゼが「標的化」および切断され得るように、それらのタンパク質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を含むように、内因性ヌクレアーゼおよび／ＲＮＡ生産中の不活性化のために使用される。（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年３月１日に公開された米国特許公報第２０１２／００５２５４７Ａ１号および２０１５年２月１２日に公開された国際公開第２０１５／０２１０５８号Ａ２を参照）。部位特異的プロテアーゼ認識配列を含むヌクレアーゼは、「プロテアーゼ標的化ヌクレアーゼ」と呼ばれる。プロテアーゼ標的化ヌクレアーゼの切断は、細胞溶解物中の同族の部位特異的プロテアーゼとヌクレアーゼとの接触の結果として生じる。したがって、特定の集団の操作された細胞は、プロテアーゼ標的化ヌクレアーゼまたは他のプロテアーゼ標的化リボヌクレアーゼ（単数または複数）をコードする操作された核酸を含み得る。他の酵素のプロテアーゼ標的化も本明細書中で意図される。
以下に詳細に記載されるように、本開示のプロテアーゼ標的化ヌクレアーゼ（例えば、表１、表６および表７に記載されるヌクレアーゼまたは他のリボヌクレアーゼ）は、またペリプラズム標的化配列をも含み得る。細胞増殖期の間にペリプラズムへのプロテアーゼ標的化ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼが細胞増殖に必要とされる細胞ＲＮＡを分解するのを防ぐ。
いくつかの態様において、本開示の細胞は、同族のプロテアーゼをコードする操作された核酸を含む。いくつかの態様において、同族のプロテアーゼは、下記のように、ペリプラズム標的化配列を含む。いくつかの態様において、ある集団（例えば、第１の培養）の細胞は、プロテアーゼ標的化ヌクレアーゼをコードする操作された核酸を含み、異なる集団（例えば、第２の培養）の細胞は、ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識配列を切断する同種のプロテアーゼをコードする操作された核酸を含む。
本開示にしたがって使用することができるプロテアーゼの例には、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Armillaria mellea、アスタシン、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、ガン凝固促進剤、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＢｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポダミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームＰｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター、ナルジシントロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（TEV）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲンアクチベーター、Ｖ８、べノンビンＢ、べノンビンＢＢおよびＸａａ-Ｐｒｏアミノペプチダーゼを限定することなく、含む。
ペリプラズム標的
いくつかの態様において、操作された細胞のヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）または他の酵素（例えば、プロテアーゼ）は、細胞のペリプラズムへのヌクレアーゼまたは他の酵素の隔離に関与するペリプラズム標的化配列を含む。「ペリプラズム標的化配列」は、それが連結されるタンパク質である細胞のペリプラズムを標的とするアミノ酸配列である。ペリプラズム標的化配列に連結されたタンパク質は、タンパク質が発現される細胞のペリプラズムに隔離される。
ペリプラズム標的化配列は、例えば、細菌分泌タンパク質のＮ末端に由来し得る。配列は約１５〜約７０個のアミノ酸の長さで変化する。ペリプラズム標的化配列の一次アミノ酸配列は様々であるが、一般に、以下の成分を含む共通の構造を有する：（ｉ）Ｎ末端部分は可変長であり、一般に正味の正電荷を有する；（ｉｉ）約６〜約１５アミノ酸の中心疎水性コアが続き、（ｉｉｉ）最終成分は、シグナルペプチダーゼのための切断部位を規定する４〜６個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様において、本開示のペリプラズム標的化配列は、グラム陰性菌において分泌されるタンパク質に由来し得る。分泌されたタンパク質は、細菌によって、または細菌に感染するバクテリオファージによってコードされ得る。分泌タンパク質のグラム陰性菌ソースの例としてはEscherichia、Pseudomonas, Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonasのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示にしたがって使用するためのペリプラズム標的化配列の例としては、以下からなる群から選択される配列が挙げられるが、これらに限定されない。
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(配列番号１);
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA(配列番号２);
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA(配列番号３);
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA(配列番号４);
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号５);
MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号６);
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA(配列番号７);
MKQALRVAFGFLILWASVLHA(配列番号８);
MRVLLFLLLSLFMLPAFS(配列番号９);および
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA(配列番号１０).
例
第１集団の操作された細胞は、ペリプラズムに局在する表６および表７に列挙されたものを含むが、これに限定されず、プロテアーゼ標的化ヌクレアーゼを発現する。第２集団の操作された細胞は、少なくとも１つのＮＭＰおよび／またはＮＤＰキナーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにペリプラズムに局在する部位特異的プロテアーゼを発現する。さらに、第２集団の細胞は、目的のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを含み、ＤＮＡテンプレートは、そのＤＮＡテンプレートの転写を制御する遺伝子エレメント（例えば、５’プロモーター、３’ターミネーター）に隣接している。各集団の細胞は、表６および表７に列挙されたものを含むがこれらに限定されず、不活性化またはプロテアーゼ標的化ＲＮａｓｅ、またはかかるＲＮａｓｅをコードする遺伝子の染色体欠失を含むように操作される。
第１の集団の細胞は、炭素源およびエネルギー源としてのグルコースおよび／または他の糖または炭素系分子を用いた従来の発酵手段を用いて高い細胞密度へ増殖させる。適切な細胞密度に達すると、誘導因子分子の添加または他の手段を介してヌクレアーゼの発現が誘導される。十分なレベルのタンパク質発現に達するまで、タンパク質誘導を継続する。増殖および誘導後、必要に応じてバイオマスを濃縮する。続いて、バイオマスを溶解し、細胞オリゴマーＲＮＡ分子へのヌクレアーゼのアクセスを可能にする。適切なＲＮＡ解重合が起こるまで（例えば、２時間〜２４時間）、この物質を優先的に３７℃でインキュベートする。
第２の集団の細胞は、第１の集団の細胞と同様の様式で増殖、誘導および濃縮される。得られたバイオマスを溶解し、第１集団の細胞からの溶解物と混合する。細胞溶解物を混合することにより、第１集団の細胞および両方の細胞集団からの様々な標的ＲＮａｓｅで発現されたヌクレアーゼのタンパク質分解的不活性化が可能になる。最初の集団の細胞におけるオリゴマーＲＮＡのヌクレアーゼ媒介の解重合から得られたモノマーのＮＭＰおよび／またはＮＤＰは、続いて、表２および表３に列挙されるヌクレオチドキナーゼの少なくとも１つの活性によってＮＴＰに変換される。ポリリン酸を反応物に添加して、ポリリン酸キナーゼを介してＮＭＰおよびＮＤＰのリン酸化に必要なＡＴＰを生成させる。得られたＮＴＰは、所望の配列特異的ｄｓＲＮＡ分子を生じるテンプレートとして上記の染色体外ＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用によってオリゴマー化される。
他の態様
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの文章は、文脈から逆のまたはそうでないことが明らかでない限り、１つまたは１つ以上を意味し得る。群の１つまたは１つ以上のメンバー間に「または」を含むクレームまたは説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかである場合を除き、群の１つ、１つ以上または全てが、所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、グループの完全に１つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する態様を含む。本発明は、グループメンバーの１つ以上または全てが所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する態様を含む。
さらに、本発明は、列挙された請求項の１つ以上の制限、要素、句および説明的な用語が別の請求項に導入されるすべての変形、組み合わせおよび置換を含む。例えば、別のクレームに依存するクレームは、同じ基本クレームに依存する他のクレームに見出される１つ以上の制限を含むように変更することができる。要素がリストとして提示される場合、例えば、マーカッシュ群様式では、要素の各サブグループもまた開示され、任意の要素（単数または複数）をグループから削除することができる。本発明または本発明の態様が特定の要素および／または特徴を含むものと一般的に言及される場合、本発明の特定の態様または本発明の態様は、一般に、かかる要素および／または特徴を含む。簡潔にするために、これらの態様は本明細書において、言葉として具体的に記載されていない。また、用語「含む（comprising）」および「含有する（containing）」は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含むことができることにも留意されたい。範囲が指定されている場合は、終点が含まれる。さらに、当業者の文脈および理解から他に指示されない限り、または明白でない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる態様において記載された範囲内の任意の特定の値または部分の範囲であり、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、その範囲の下限の１０分の１であることを意味する。
この出願は、種々の発行された特許、公開された特許出願、雑誌論文、および他の刊行物を参照している。組み込まれた参考文献と本明細書の間に矛盾がある場合、明細書が支配するものとする。さらに、先行技術に含まれる本発明の任意の特定の態様は、特許請求の範囲のいずれか１以上のものから明白に除外され得る。かかる態様は、当業者に知られているとみなされるので、除外することが明示的にここに記載されていなくても除外され得る。本発明の任意の特定の態様は、先行技術の存在に関係なく、任意の理由で、任意の請求項から除外され得る。
当業者であれば、本明細書に記載された特定の態様に対する多くの等価物を日常的な実験を用いて認識し、確認することができるであろう。本明細書に記載された本態様の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されたものである。当業者であれば、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、この説明に対する様々な変更および修正を行うことができることを理解するであろう。

Claims (45)

  1. リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物の生産方法であって、該方法が
    （ａ）所望の細胞密度へ細胞を培養すること、ここで、細胞が、プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結された、ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
    （ｂ）（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
    （ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−一リン酸を含む第１の細胞溶解物を生産すること、
    を含む、前記方法。
  2. ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターが誘導性である、請求項１に記載の方法。
  3. （ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼがペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｖ）ＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
    を含む細胞を培養すること；および
    （ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること、
    をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ｄ）（ｉ）、（ｄ）（ｉｉ）または（ｄ）（ｉｉｉ）のプロモーターの少なくとも１つが誘導性である、請求項３に記載の方法。
  5. ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩおよびＲＮａｓｅＲからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 細胞が、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性リボヌクレアーゼおよび／または内因性リボヌクレアーゼをコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＲ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＴ、ＲＮａｓｅＥおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. ヌクレオチドキナーゼが、ヌクレオチド一リン酸キナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ヌクレオチド一リン酸キナーゼが、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、およびアデニル酸キナーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. ヌクレオチドキナーゼが、ヌクレオチド二リン酸キナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  11. ヌクレオチド二リン酸キナーゼが、ヌクレオシドリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. ポリリン酸を分解する少なくとも１つの内因性酵素が、細胞内で遺伝的に不活性化される、請求項１に記載の方法。
  13. ポリリン酸を分解する内因性酵素の少なくとも１つが、ヌクレオシドモノホスファターゼ（別名５’−ヌクレオチダーゼ）、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ、ヌクレオシド三リン酸ホスホヒドロラーゼ、およびエキソポリホスファターゼからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 細胞が、ポリリン酸を分解する少なくとも１つのプロテアーゼ標的化酵素および／またはポリリン酸を分解する酵素をコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１５に記載の方法。
  17. 操作されたＤＮＡテンプレートの配列が、ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. プロモーターが、Ｔ７プロモーターであり、Ｔ７転写ターミネーターが、ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列の３’末端に位置する、請求項１７に記載の方法。
  19. ステップ（ｄ）の細胞が、ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターをそれぞれ含む、少なくとも２つの操作された核酸を含み、操作された核酸の１つがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、操作された核酸の１つがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがΦ６ＲｄＲＰである、請求項１９に記載の方法。
  21. 操作されたＤＮＡテンプレートの配列が、単一の標的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. プロモーターが、Ｔ７プロモーターであり、Ｔ７転写ターミネーターが、単一の標的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列の３’末端に位置する、請求項２１に記載の方法。
  23. 操作されたＤＮＡテンプレートが、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む発現ベクター上に位置する、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. エンドヌクレアーゼ切断部位が、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ切断部位である、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップ（ｄ）の細胞が、エンドヌクレアーゼ切断部位を切断するエンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 細胞が、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性ＲＮＡポリメラーゼおよび／または内因性ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ステップ（ａ）および／またはステップ（ｄ）の細胞が、Ｔ７ファージＧｐ２タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む操作された核酸をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. ステップ（ａ）および／またはステップ（ｄ）の細胞が、糖の存在下で培養される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 糖が、グルコースである、請求項２８に記載の方法。
  30. ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、およびポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；および
    ＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
    をさらに含む、請求項３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物の生産の方法であって、該方法が
    （ａ）細胞を所望の細胞密度へ培養すること、ここで、細胞が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
    （ｂ）ステップ（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
    （ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下でポリリン酸の存在下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−三リン酸の混合物を含む第１の細胞溶解物を生産すること
    を含む、前記方法。
  33. （ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識配列を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼが、ペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、を含む細胞を培養すること；および
    （ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること
    をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、および任意にポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；およびＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
    をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法によって生産される、細胞溶解物。
  37. プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ；
    ヌクレオチドキナーゼ；および
    ヌクレオチド５’−一リン酸
    を含む、細胞溶解物。
  38. ＲＮＡポリメラーゼ；および
    ＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡテンプレート；
    を含む、細胞溶解物。
  39. 請求項３７に記載の細胞溶解物および請求項３８に記載の細胞溶解物を含む、組成物。
  40. 細胞溶解物がヌクレアーゼ活性を有さない、請求項３７または３８に記載の細胞溶解物。
  41. リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が
    （ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
    第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ヌクレオチド５’−一リン酸を含み、および
    第２の細胞溶解物が、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｉｖ）ヌクレオチドキナーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、、および
    （ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
    を含む、前記方法。
  42. 目的のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
  43. リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が、
    （ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
    第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼ、および（ｉｉｉ）ヌクレオチド５’−三リン酸含み、および
    第２の細胞溶解物が、（ｉｖ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、および
    （ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
    を含む、前記方法。
  44. 目的のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。
  45. 第１の細胞溶解物および／または第２の細胞溶解物がヌクレアーゼ活性を有さない、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
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