CN105219822A - 一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外合成谷胱甘肽的方法。通过表达出谷胱甘肽合成双功能酶和多聚磷酸激酶并在其催化下，实现以四聚磷酸、六偏磷酸盐作为磷酸供体再生ATP，以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸为底物在谷胱甘肽合成双功能酶催化条件下生成谷胱甘肽。与现有的生产谷胱甘肽的方法相比，本发明中应用的谷胱甘肽合成双功能酶的产物抑制作用低，反应体系产生的谷胱甘肽含量高；反应过程使用的磷酸供体四聚磷酸、六偏磷酸等钠、钾盐价格便宜且常见易得，用它作为多聚磷酸激酶的底物再生ATP大大降低了生产成本；氨基酸比例低至Gly:Gys:Gly＝2:1:2，体系中剩余氨基酸量少，易于后期产物分离。

Description

一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽是一种具有多种生物学功能的化合物，由L-半胱氨酸，L-谷氨酸和甘氨酸三种氨基酸通过肽键缩合得到。它不仅能清除体内自由基，还具有保护肝脏，提高机体免疫力的作用，因此谷胱甘肽被广泛应用于生物医药和食品领域，国内外医药市场对谷胱甘肽的需求也日趋增长。

截止日前，工业生产谷胱甘肽的方法主要有发酵法，酶催化合成法，化学合成法以及生物萃取法四种。发酵法的工艺过程中产品分离以及后处理比较麻烦，化学合成法成本高、操作复杂、反应过程繁琐，萃取法产量太低，而酶法相比其他几种方法具有反应过程可控性强、催化反应专一性强以及后期处理简单等优点。

酶法生产谷胱甘肽是通过在反应体系中添加少量三磷酸腺苷(ATP)，在L-半胱氨酸，L-谷氨酸和甘氨酸三种氨基酸三种氨基酸底物的条件下，利用r-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种合成谷胱甘肽的关键酶催化来合成谷胱甘肽。这两种酶分别催化生成谷胱甘肽过程中的两步反应。

现在很多研究中使用谷胱甘肽合成双功能酶来催化产生谷胱甘肽，谷胱甘肽合成双功能酶是兼具r-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种催化位点的酶。并使用多聚磷酸激酶在底物多聚磷酸盐和ADP的条件下，催化ATP再生，使生成谷胱甘肽的反应成本降低。但是已报道的以生产谷胱甘肽为目的所应用的谷胱甘肽合成双功能酶都存在明显的产物抑制效应，进而导致产物产量很难提高。这样既不易于工业生产时对产物的后期分离，又不能很好的满足市场需求。

本研究方法提供了一种通过利用Pasteurellamultocida来源的谷胱甘肽合成双功能酶生产谷胱甘肽的方法。Pasteurellamultocida来源这种谷胱甘肽合成双功能酶的产物抑制作用弱，K_m值大，适合在较高的氨基酸底物浓度条件下，高产量的生产谷胱甘肽。

本研究方法提供了一种利用谷氨酸棒状杆菌来源的聚磷酸激酶利用六偏磷酸盐为底物，用于催化再生ATP.谷氨酸棒状杆菌来源的聚磷酸激酶利用的六偏磷酸盐比较常见易得，用六偏磷酸盐作为磷酸供体，方便了ATP再生过程。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明利用的谷胱甘肽合成双功能酶产物抑制效应弱，利于提高谷胱甘肽的产量。

(2)使用聚磷酸激酶以常见的四聚磷酸、六偏磷酸盐为磷酸供体为体系源源不断的提供ATP，降低生产成本。

(3)采用充氮气无氧振荡反应方式，防止生成的谷胱甘肽氧化，保存产物中的谷胱甘肽，提高谷胱甘肽产量。

(4)本发明中的底物比例低至Gly:Gys:Gly＝(1-3):1:(1-3)，体系中剩余氨基酸减少，易于产物分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异源表达的谷胱甘肽合成双功能酶和聚磷酸激酶，以高浓度的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物，以六偏磷酸盐提供磷酸基团在聚磷酸激酶的催化条件下生成ATP提供能量，最终产生高产量的谷胱甘肽。

本发明首先构建基因工程菌，异源表达来自Pasteurellamultocida中的谷胱甘肽合成双功能酶基因。即将基因GS克隆至原核表达载体pET22b中得到谷胱甘肽合成双功能酶基因表达载体，即重组质粒pET22b-gs。同时我们也将来自谷氨酸棒状杆菌中的聚磷酸激酶(PPK)基因克隆至原核表达载体pET28a中，得到重组质粒pET28a-ppk。然后将分别将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得谷胱甘肽合成双功能酶和聚磷酸激酶。

经表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的谷胱甘肽合成双功能酶释放出来，获得粗酶液。在六偏磷酸盐提供磷酸供体的条件下，以三种底物氨基酸为底物在粗酶液催化下进行反应生成谷胱甘肽。为了防止反应时反应体系中的氧气使底物氨基酸或者谷胱甘肽发生氧化进而降低谷胱甘肽的产量，实验采用充氮气无氧振荡反应方式，保存产物中的谷胱甘肽，提高谷胱甘肽产量。为了进一步提高谷胱甘肽的产量并易于后期产物分离，本实验在Gly:Gys:Gly＝2:1:2的比例条件下把底物浓度提高到200mM。

本发明提供的方法，以能利用常见的六偏磷酸盐为底物的谷氨酸棒状杆菌来源的聚磷酸激酶催化再生ATP，利用Pasteurellamultocida来源的产物抑制作用比较低的谷胱甘肽合成双功能酶，在底物氨基酸浓度较高的条件下生产谷胱甘肽。为高产量低成本地生产谷胱甘肽提供了一种工业化路线。

附图说明

图1：DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为谷胱甘肽合成双功能酶基因gs的PCR产物，右侧为DNA大小标准品。

图2：构建好的表达载体pET22b-gs，将gs基因克隆到pET22b载体上，基因的两端有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，其编号为质粒1。

图3：DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚磷酸激酶基因ppk的PCR产物，右侧为DNA大小标准品。

图4：pET28a-ppk质粒图谱，将ppk基因克隆到pET28a载体上，基因的两端有NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，其编号为质粒2。

图5：诱导表达谷胱甘肽合成双功能酶GS蛋白电泳图。泳道1为pET22b空质粒表达后破胞上清，泳道2为GS酶表达后破胞上清。

图6：诱导表达多聚磷酸激酶PPK蛋白电泳图。泳道1为pET28a空质粒表达后破胞上清，泳道2为PPK酶表达后破胞上清。

图7：20mM反应体系有氧静置反应与充氮气无氧反应进程对比。

图8：50mM反应体系中分别添加10mM、20mM、30mM、40mM、50mMATP时，各时段的转化率对比。“10hGS”为50mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能量，反应10h后取样检测得到的转化率。“22hGS”为50mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能量，反应10h后取样检测得到的转化率。“10hGS+PPK”为50mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反应10h后取样检测的转化率。“22hGS+PPK”为50mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反应22h后取样检测的转化率。

图9：不同浓度的四聚磷酸作为磷酸供体参与耦合反应，24h后用四氧嘧啶法测得的GSH转化率。

具体实施方式

1、克隆巴斯德菌(Pasteurellamultocida)菌株GS谷胱甘肽合成双功能酶基因以及谷氨酸棒状杆菌中ppk多聚磷酸激酶基因。

2、巴斯德菌(Pasteurellamultocida)菌株GS谷胱甘肽合成双功能酶基因以及谷氨酸棒状杆菌中ppk聚磷酸激酶基因重组载体构建。

3、诱导表达谷胱甘肽合成双功能酶基因GS以及多聚磷酸激酶PPK。将构建好的重组表达载体pET22b-GS质粒转入大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)，在IPTG作用下诱导表达。

4、超声破碎表达菌体，提取粗酶液进行反应。合成反应中的酶添加量采用考马斯亮蓝测蛋白法进行标定。

5、酶法合成谷胱甘肽。在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg²⁺存在下，以谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸为底物，六偏磷酸盐或四聚磷酸为磷酸供体，通过谷胱甘肽合成双功能酶和多聚磷酸激酶合成谷胱甘肽。

6、谷胱甘肽的检测。采用四氧嘧啶法测定反应液中GSH的含量，在pH7.2的缓冲条件下，反应产物与四氧嘧啶结合，20min后测定结合物在305nm下的吸光度值。由GSH标准曲线计算出样品中GSH的含量。

下面结合实施例对本发明具体方法进一步说明：

实施例1

1Pasteurellamultocida菌株谷胱甘肽合成双功能酶基因gs的克隆以及重组载体构建

1.1Pasteurellamultocida菌株GS基因的克隆

利用全基因合成的方法合成Pasteurellamultocida菌株中的谷胱甘肽合成双功能酶GS基因DNA。以该基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(NdeⅠ和EcoRⅠ)与保护碱基。

PCR扩增谷胱甘肽合成双功能酶GS基因所用引物如下：

上游引物：5’-GCATATGATGGCCAAGAAGGAC-3’

下游引物：5’-GCTCGAGTTACTTGGCGAG-3’

PCR体系反应体系含有0.2μL基因组DNA，上下游引物各0.5μL，Extaq混合液10μL，加双蒸水补至20μL。反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，循环30次，72℃10min，4℃保存。这样即可克隆扩增到目的谷胱甘肽合成双功能酶GS基因，核酸电泳图见图1。

1.2重组载体质粒1的构建

将克隆的GS基因与pET22b载体(购于Novagen公司)分别用内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，37℃酶切3h，载体与外源基因片段按摩尔比1:3的比例，利用NEB的T4DNA连接酶16℃连接过夜，用该连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性LB琼脂平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落，在LB液体培养基中过夜培养，并进行菌落PCR验证。试剂盒提取质粒，进行质粒双酶切验证，测序结果正确后可获得阳性重组载体。测定序列如序列1所示，该序列编码如序列2所示的氨基酸序列。所构建的重组载体质粒1的图谱如图2所示。

实施例2

1谷氨酸棒状杆菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因的克隆与重组载体构建

利用全基因合成的方法合成大肠杆菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因。以该菌株全基因为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(NcoⅠ和EcoRⅠ)与保护碱基。

PCR扩增多聚磷酸激酶基因ppk所用引物如下：

上游引物：5’-GCATATGATGACCGCCACCGATTC-3’

下游引物：5’-GAAGCTTCCGGTTGGTAGCTGTGAC-3’

PCR体系反应体系含有0.2μL基因组DNA，上下游引物各0.5μL，Extaq混合液10μL，加双蒸水补至20μL。反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，循环30次，72℃10min，4℃保存。这样即可克隆扩增到目的多聚磷酸激酶基因ppk，核酸电泳图见图3。

1.2重组载体质粒2的构建

将克隆的PPK基因与pET28a载体(购于Novagen公司)分别用内切酶(NcoⅠ和EcoRⅠ)进行双酶切，37℃酶切3h，载体与外源基因片段按摩尔比1:3的比例，利用NEB的T4DNA连接酶16℃连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于带有卡那霉素抗性LB琼脂平板上，37℃过夜培养后，挑取单菌落，在LB液体培养基中过夜培养，并进行菌落PCR验证。试剂盒提取质粒，进行质粒酶切验证，测序结果正确后可获得阳性重组载体。测定序列如序列3所示，该序列编码如序列4所示的氨基酸序列。所构建的重组载体质粒2的图谱如图4所示。

实施例3

将构建好表达载体即pET22b-gs质粒化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，使用LB培养基，37℃培养生长至OD600约为0.4-1.0后，以0.1mM–1mM的IPTG诱导，在30℃培养下进行胞内表达。将对照空载体pET22b化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，与上述相同条件进行诱导表达，将表达后的重组蛋白进行蛋白电泳验证表达结果，其蛋白电泳如图5所示。

实施例4

将构建好表达载体即pET28a-ppk质粒化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，在IPTG的诱导下进行胞内表达。将载体pET28a化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，与上述相同条件进行诱导表达，将表达后的粗酶液进行蛋白电泳验证表达结果，其蛋白电泳如图6所示。

实施例5

采用四氧嘧啶法测定反应液中GSH的含量，具体操作如下：在96孔板中加入175ul浓度为0.24mM，PH为7.2的磷酸盐缓冲液，25ul浓度为7.5g/L的甘氨酸溶液，1g/L的四氧嘧啶25ul，稀释后的样品25ul，空白孔加入25ul去离子水。振荡混合并精确计时20min后测样品在305nm下的吸光度值。由GSH标准曲线计算出样品中GSH的含量，并算出转化率。

实施例6

在50ml螺口瓶和50ml离心管中配制20mM反应体系，命名为实验组1和实验组2，两个体系中均包括80mM的谷氨酸，20mM的半胱氨酸，120mM的甘氨酸，2mlGS酶粗酶液(含蛋白1.36mg)，1.5mlPPK酶粗酶液(含蛋白0.49mg)，100mM的六偏磷酸盐，20mM的MgCl₂，0.5MTris-HCl(pH8.0)，5.6mMATP，总体积为10ml。实验组1充氮气后封闭后放置温度为30度的摇床震荡反应，实验组2静止于30℃恒温箱反应。两组反应均在1h、2h、3h、6h、9h、23h处取样，样品稀释20倍后检测在305nm波长处的吸光度值,两种反应条件下的转化率对比如图7所示，无氧震荡反应的最高转化率为63.75％，有氧静置反应的最高转化率为52.20％。

实施例7

在螺口瓶中配制50mM反应体系5个，体系均包括200mM的谷氨酸，50mM的半胱氨酸，300mM的甘氨酸，3mlGS酶粗酶液(含蛋白2.76mg)，4ml去离子水，200mM的六偏磷酸盐，30mM的MgCl₂。各体系的区别在于，加入的ATP浓度分别为10mM，20mM、30mM、40mM、50mM，对应的加入pH8.0的Tris-HCl浓度为0.3M、0.6M、0.6M、0.9M、0.9M调节PH为8.0。反应体系总体积为10ml。充氮气后封闭后，放置于温度为30℃的摇床振荡反应。在反应10h、22h时取样，样品稀释60倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。换算后的转化率见图8，ATP浓度为20mM时GSH转化率为23.35％。

实施例8

在螺口瓶中配制50mM反应体系5个，体系均包括200mM的谷氨酸，50mM的半胱氨酸，300mM的甘氨酸，3mlGS酶粗酶液(含蛋白2.76mg)，4mlPPK酶粗酶液(含蛋白2.24mg)，200mM的六偏磷酸盐，30mM的MgCl₂。各体系的区别在于，加入的ATP浓度分别为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM，对应的加入pH8.0的Tris-HCl浓度为0.3M、0.6M、0.6M、0.9M、0.9M调节PH为8.0。反应体系总体积为10ml。充氮气后封闭后，放置于温度为30℃的摇床振荡反应。在反应10h、22h时取样，样品稀释60倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。换算后的转化率见图8所示，ATP浓度为20mM时GSH转化率为80.91％。

实施例9

在螺口瓶中配制4个反应体系，体系中氨基酸的比例均为Gly:Gys:Gly＝2:1:2，其中Gys的量分别为20mM、50mM、100mM、200mM。向体系中加入4mlGS酶粗酶液(含蛋白3.68mg)，30mM的MgCl₂。各体系的区别在于，加入的ATP浓度分别为30mM、75mM、150mM、300mM，对应的加入pH8.0的Tris-HCl浓度为0.3M、0.6M、0.9M、1.2M调节PH为8.0。反应体系总体积为10ml。充氮气后封闭后，放置于温度为30℃的摇床振荡反应。在反应10h时取样，样品稀释60倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。换算后的转化率分别为86.23％，87.98％，75.41％，63.30％。

实施例10

在螺口瓶中配制3个反应体系，体系均包括100mM的谷氨酸，50mM的半胱氨酸，100mM的甘氨酸，3mlGS酶粗酶液(含蛋白2.76mg)，4mlPPK酶粗酶液(含蛋白2.24mg)，200mM的六偏磷酸盐，30mM的MgCl₂，20mM的ATP。各体系的区别在于分别加入不同浓度的PH为9.0的Tris-HCl调节体系PH为7.0、8.0、9.0，反应体系总体积为10ml。充氮气后封闭后，放置于温度为30℃的摇床振荡反应。在反应10h时取样，样品稀释60倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。换算后的转化率分别为75％，81％，79％。

实施例11

在螺口瓶中配制5个反应体系，体系中氨基酸的比例均为Gly:Gys:Gly＝2:1:2，其中Gys的量分别为50mM。向体系中加入3mlGS酶粗酶液(含蛋白2.76mg)，4mlPPK酶粗酶液(含蛋白2.24mg)，30mM的MgCl₂，20mM的ATP。各体系的区别在于，加入的四聚磷酸的浓度分别为10mM，30mM，50mM，100mM，200mM。各反应体系充氮气封闭后，放置于温度为30℃的摇床振荡反应。在反应24h时取样，样品稀释50倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。计算转化率得如图9所示。由图分析得四聚磷酸在浓度为10～50mM时能作为多聚磷酸激酶的底物参与谷胱甘肽合成的耦合反应，最高转化率为78.3％，对应GSH产量为12.02g/L。

Claims (14)

1.一种通过以Pasteurellamultocida来源的谷胱甘肽合成双功能酶和谷氨酸棒状杆菌来源的多聚磷酸激酶生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括：

步骤1、克隆谷胱甘肽合成双功能酶基因至表达载体，得到重组质粒，经IPTG诱导表达。

步骤2、克隆多聚磷酸激酶基因至表达载体，得到重组质粒，经IPTG诱导表达。

步骤3、将细胞破碎后得到的重组谷胱甘肽合成双功能酶和多聚磷酸激酶，在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg²⁺存在下，以谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸为底物，多聚磷酸钠为磷酸供体，通过谷胱甘肽合成双功能酶和多聚磷酸激酶催化生成谷胱甘肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于谷胱甘肽合成双功能酶GS的如序列1所示的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于谷胱甘肽合成双功能酶GS的如序列2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于多聚磷酸激酶PPK的如序列3所示的核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于多聚磷酸激酶PPK的如序列4所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应体系以Pasteurellamultocida来源的谷胱甘肽合成双功能酶GS催化生产谷胱甘肽。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反应体系以谷氨酸棒状杆菌来源的多聚磷酸激酶PPK催化再生ATP，ATP再生次数达5次以上。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应体系由常见的六偏磷酸盐或者其钠盐、钾盐作为多聚磷酸激酶的底物。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应体系由常见的四聚磷酸或者其钠盐、钾盐作为多聚磷酸激酶的底物。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应过程采用充氮气无氧振荡反应。

11.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应体系底物浓度可达到200mM。

12.根据权利要求1所述方法，其特征在于三种氨基酸比例可降低到Gly:Gys:Gly＝(1-3):1:(1-3)。

13.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应温度范围为30～37度。

14.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应的PH范围比较广泛，为7～9。