JP2021083344A

JP2021083344A - ビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤

Info

Publication number: JP2021083344A
Application number: JP2019213263A
Authority: JP
Inventors: 奥村　健一; Kenichi Okumura; 健一奥村; 舞花北澤; Maika Kitazawa; 南梅ヶ谷; Minami Umegaya; 信親竹末; Nobuchika Takesue; 静野場; Shizuka Noba
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2021-06-03

Abstract

【課題】本発明は、ビール様発泡性飲料において、飲料の品質に対する影響を抑えつつ、ビール有害菌である乳酸菌の増殖を抑制することができる乳酸菌増殖抑制剤、並びに当該抗菌剤を使用したビール様発泡性飲料及びその製造方法を提供する。【解決手段】リゾチームを有効成分とすることを特徴とする、ビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤、リゾチームを含有し、ホップを原料としない、ビール様発泡性飲料、及びリゾチームを原料とし、ホップを原料としない、ビール様発泡性飲料の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ビール様発泡性飲料における乳酸菌の増殖を抑制する抗菌剤、並びに当該抗菌剤を使用したビール様発泡性飲料及びその製造方法に関する。

ビールは、微生物が生育しにくい飲料であることが知られている。これは、ビールのｐＨが低いこと、溶存酸素が少ないこと、アルコールを含有することなどに加え、ホップの使用によるところがある。ホップは、ビールに特有の苦味や香りを付与するほか、その苦味成分が抗菌活性を示し、ビールを変敗させる乳酸菌の増殖を抑える機能がある。

消費者嗜好の多様化から、ビール様発泡性飲料に用いられる素材や製造方法も多様になってきており、ホップを使用しないビール様発泡性飲料の開発も検討されている。ただし、ホップを使用しないビール様飲料では、ホップを使用するビール様飲料に比べて、微生物リスクが増大する恐れがある。なお、ホップを使用する場合においても、ホップ耐性のある乳酸菌が増殖してしまう可能性がある。

微生物リスクを低減させる方法としては、環境管理のほか、加熱殺菌を行うことが考えられる。ただし、発酵貯酒中にビール有害菌が増殖した場合は、不快臭の発生や粘質化等の品質劣化が生じ、後工程での加熱殺菌では対応できない場合がある。また、加熱殺菌を行うと、ビール様発泡性飲料に好ましくない香味が生じる恐れがある。例えば、特許文献１には、原材料にホップを用いないビールテイスト飲料では、ホップの抗菌作用を利用できないため、微生物の殺菌が必要となる場合があり、例えば加熱工程が行われること、原材料にホップを用いないビールテイスト飲料において、リナロール、２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３（２Ｈ)−フラノンおよび２-アセチルピラジンからなる群から選ばれる１以上を含有させることで、加熱工程による不快な香りがマスキングされることが記載されている。

一方で、リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）は、糖質加水分解酵素の一種であり、細菌の細胞壁のムコ多糖類を加水分解することから、溶菌酵素とも呼ばれている。リゾチームは、その静菌作用や保存安定化作用を目的として、食品添加物としても用いられている。

特開２０１８−０２３２９５号公報

Ellis, ‘Lysozyme Assays’, "Technique in Fish Immunology", SOS Publications (Publisher), 1990, Chapter12, p.101-103.

環境管理や加熱殺菌処理以外に微生物リスクを低減させる方法としては、当該微生物に対する抗菌剤を、飲料や製造工程の途中製品中に添加する方法が考えられる。しかし、酵母による発酵工程を経て製造されるビール様飲料において、単に、抗菌素材を添加しただけでは、ビールの有害菌である乳酸菌だけではなく、発酵に必要な酵母の増殖も抑制してしまう。この場合、発酵不良による弊害が生じる。

本発明は、ビール様発泡性飲料において、飲料の品質に対する影響を抑えつつ、ビール有害菌である乳酸菌の増殖を抑制することができる乳酸菌増殖抑制剤、並びに当該抗菌剤を使用したビール様発泡性飲料及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、リゾチームが、ビール様発泡性飲料における乳酸菌の増殖に対する抑制作用は強いが、ビール酵母の増殖に対する阻害作用は弱いことを見出し、本発明を完成させた。

本発明に係る乳酸菌増殖抑制剤、ビール様発泡性飲料、及びビール様発泡性飲料の製造方法は、下記［１］〜［９］である。
［１］リゾチームを有効成分とすることを特徴とする、ビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤。
［２］リゾチームを含有し、ホップを原料としないことを特徴とする、ビール様発泡性飲料。
［３］リゾチームの含有量が、２５〜２５００Ｕ／ｍＬである、前記［２］のビール様発泡性飲料。
［４］さらに、乳化剤を含有する、前記［２］又は［３］のビール様発泡性飲料。
［５］発酵ビール様発泡性飲料である、前記［２］〜［４］のいずれかのビール様発泡性飲料。
［６］リゾチームを原料とし、ホップを原料としないことを特徴とする、ビール様発泡性飲料の製造方法。
［７］リゾチームの含有量が、２５〜２５００Ｕ／ｍＬであるビール様発泡性飲料を製造する、前記［６］のビール様発泡性飲料の製造方法。
［８］発酵工程を有する、前記［６］又は［７］のビール様発泡性飲料の製造方法。
［９］リゾチームと乳化剤を共に、煮沸処理後発酵工程前の糖化液、又は発酵工程以降の発酵液に添加する、前記［８］のビール様発泡性飲料の製造方法。

本発明に係るビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤は、乳酸菌の増殖に対する抑制効果は高いが、ビール酵母の増殖に対する阻害作用は比較的弱い。このため、当該乳酸菌増殖抑制剤を用いることにより、非発酵ビール様発泡性飲料のみならず、発酵ビール様発泡性飲料であっても、発酵不良等による品質劣化を抑えつつ、微生物リスクを低減することができる。

実施例１において、S. pastorianus（Ａ）又はL. brevis（Ｂ）を播種したリゾチーム含有無ホップ麦汁の培養液の６００ｎｍの吸光度を経時的に測定した結果を示したグラフである。実施例３において、リゾチーム含有無ホップ麦汁に酵母と乳酸菌を接種した発酵液の浮遊酵母数（細胞／ｍＬ）及び外観エキス（％）の測定結果を示した図である。実施例３において、リゾチーム含有無ホップ麦汁に酵母と乳酸菌を接種した発酵液の乳酸菌の生菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）の測定結果を示した図である。

本発明及び本願明細書においては、「ビール様発泡性飲料」とは、ビールらしさを有する、炭酸ガスを含有する飲料を意味する。また、「ビールらしさ」とは、製品名称・表示にかかわらず、香味上ビールを想起させる呈味のことを意味する。つまり、ビール様発泡性飲料とは、発泡性飲料のうち、アルコール含有量、麦芽及びホップの使用の有無、発酵の有無に関わらず、ビールと同等の又はそれと似た風味・味覚及びテクスチャーを有し、高い止渇感・ドリンカビリティーを有する飲料を意味する。

本発明に係るビール様発泡性飲料は、アルコール飲料であってもよく、アルコール含量が１容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。また、麦芽を原料とする飲料であってもよく、麦芽を原料としない飲料であってもよく、発酵工程を経て製造される飲料であってもよく、発酵工程を経ずに製造される飲料であってもよい。具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒、麦芽を使用しない発泡性アルコール飲料、ローアルコール発泡性飲料、ノンアルコールビール等が挙げられる。その他、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造された飲料を、アルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類又はスピリッツであってもよい。アルコール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたアルコールを含有する溶液であり、例えば、原料用アルコールであってもよく、スピリッツ、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等の蒸留酒等を用いることができる。

本発明に係るビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤（以下、「本発明に係る乳酸菌増殖抑制剤」ということがある。）は、リゾチームを有効成分とすることを特徴とする。本発明において用いられるリゾチームは、多糖類に対する加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではなく、動植物や微生物から抽出・精製されたものであってもよく、リコンビナントタンパク質であってもよく、化学合成品であってもよい。特に、食品由来で安全に使用できることから、卵白リゾチームが好ましい。

本発明において用いられるリゾチームは、１種類であってもよく、アミノ酸配列や翻訳後修飾の異なる２種類以上のリゾチームの混合物であってもよい。また、本発明において用いられるリゾチームとしては、市販のものを用いることもできる。市販されているリゾチームとしては、リゾチームの精製品であってもよく、リゾチーム以外の成分を含有する飲食品用の添加剤であってもよい。リゾチームとその他の成分を含有する食品添加剤としては、例えば、リゾチームと乳化剤とを組み合わせた製剤や、リゾチームとグリシンと有機酸を組み合わせた製剤が挙げられる。

本発明に係る乳酸菌増殖抑制剤をビール様発泡性飲料へ添加することにより、当該ビール様発泡性飲料の飲料中における乳酸菌の増殖を抑制することができる。乳酸菌はビール様発泡性飲料における主たる有害菌であり、乳酸菌の増殖を充分に抑制できれば、微生物リスクはかなり低減できる。当該乳酸菌増殖抑制剤のビール様発泡性飲料への添加量は、飲料中における乳酸菌の増殖を抑制する効果（乳酸菌抑制効果）を得るために十分な量であればよい。例えば、当該乳酸菌増殖抑制剤は、飲料中のリゾチームの含有量を、飲料全量に対して、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０００１〜０．０１％（ｗ／ｖ）とすることで、発酵不良による品質劣化を抑制しつつ、充分な乳酸菌抑制効果を得ることができる。飲料中のリゾチームの含有量は、その有効活性量が飲料全量に対して、好ましくは２５Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは２５〜２５００Ｕ／ｍＬとすることも好ましい。

ビール様発泡性飲料等におけるリゾチームの含有量は、飲料中のリゾチームの酵素活性量を測定する際に使用される一般的な方法によって測定することができる。リゾチームの濃度や有効活性量は、例えば、Micrococcus lysodeikticusの乾燥菌体を基質とし、溶菌の程度を、光電比色計を用いて測定する濁度法（Turbidimetric method）によって測定できる（例えば、非特許文献１参照。）。

本発明に係る乳酸菌増殖抑制剤による乳酸菌抑制効果は高く、このため、本発明に係る乳酸菌増殖抑制剤は、特に、ホップを原料としないビール様発泡性飲料、すなわち、ホップに由来する抗菌成分を含まないビール様発泡性飲料に、好適に使用できる。当該乳酸菌増殖抑制剤を添加することで、ホップを原料としないビール様発泡性飲料でも微生物リスクを充分に低減させることができる。

本発明に係るビール様発泡性飲料は、リゾチームを含有させる以外は、一般的な発酵ビール様発泡性飲料や非発酵ビール様発泡性飲料と同様にして製造できる。そこで、一般的な発酵ビール様発泡性飲料と非発酵ビール様発泡性飲料の製造方法を説明する。

発酵工程を経て製造される発酵ビール様発泡性飲料は、一般的には、仕込（発酵原料液調製）、発酵、貯酒、濾過の工程で製造することができる。

仕込工程（発酵原料液調製工程）として、穀物原料及び糖質原料からなる群より選択される１種以上から発酵原料液を調製する。具体的には、発酵原料と原料水とを含む混合物を加温し、澱粉質を糖化して糖液を調製した後、得られた糖液を煮沸し、その後固体分の少なくとも一部を除去して発酵原料液を調製する。

まず、穀物原料と糖質原料の少なくともいずれかと原料水とを含む混合物を調製して加温し、穀物原料等の澱粉質を糖化させて糖液を調製する。糖液の原料としては、穀物原料のみを用いてもよく、糖質原料のみを用いてもよく、両者を混合して用いてもよい。穀物原料としては、例えば、大麦や小麦、これらの麦芽等の麦類、米、トウモロコシ、大豆等の豆類、イモ類等が挙げられる。穀物原料は、穀物シロップ、穀物エキス等として用いることもできるが、粉砕処理して得られる穀物粉砕物として用いることが好ましい。穀物類の粉砕処理は、常法により行うことができる。穀物粉砕物としては、麦芽粉砕物、コーンスターチ、コーングリッツ等のように、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。本発明においては、用いられる穀物粉砕物は、麦芽粉砕物であることが好ましい。麦芽粉砕物を用いることにより、ビールらしさがよりはっきりとした発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。麦芽粉砕物は、大麦、例えば二条大麦を、常法により発芽させ、これを乾燥後、所定の粒度に粉砕したものであればよい。また、本発明において用いられる穀物原料としては、１種類の穀物原料であってもよく、複数種類の穀物原料を混合したものであってもよい。例えば、主原料として麦芽粉砕物を、副原料として米やトウモロコシの粉砕物を用いてもよい。糖質原料としては、例えば、液糖等の糖類が挙げられる。

当該混合物には、穀物原料等と水以外の副原料を加えてもよい。当該副原料としては、例えば、ホップ、食物繊維、酵母エキス、果汁、苦味料、着色料、香草、香料等が挙げられる。また、必要に応じて、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ等の糖化酵素やプロテアーゼ等の酵素剤を添加することができる。

糖化処理は、穀物原料等由来の酵素や、別途添加した酵素を利用して行う。糖化処理時の温度や時間は、用いた穀物原料等の種類、発酵原料全体に占める穀物原料の割合、添加した酵素の種類や混合物の量、目的とする発酵ビール様発泡性飲料の品質等を考慮して、適宜調整される。例えば、糖化処理は、穀物原料等を含む混合物を３５〜７０℃で２０〜９０分間保持する等、常法により行うことができる。

糖化処理後に得られた糖液を煮沸することにより、煮汁（糖液の煮沸物）を調製することができる。糖液は、煮沸処理前に濾過し、得られた濾液を煮沸処理することが好ましい。また、この糖液の濾液に替わりに、麦芽エキスに温水を加えたものを用い、これを煮沸してもよい。煮沸方法及びその条件は、適宜決定することができる。

煮沸処理前又は煮沸処理中に、香草等を適宜添加することにより、所望の香味を有する発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。例えば、ホップを煮沸処理前又は煮沸処理中に添加し、ホップの存在下で煮沸処理することにより、ホップの風味・香気成分、特に苦味成分を効率よく煮出することができる。ホップの添加量、添加態様（例えば数回に分けて添加するなど）及び煮沸条件は、適宜決定することができる。

煮沸処理後に得られた煮汁には、沈殿により生じたタンパク質等の粕が含まれている。そこで、煮汁から粕等の固体分の少なくとも一部を除去する。粕の除去は、いずれの固液分離処理で行ってもよいが、一般的には、ワールプールと呼ばれる槽を用いて沈殿物を除去する。この際の煮汁の温度は、１５℃以上であればよく、一般的には５０〜１００℃程度で行われる。粕を除去した後の煮汁（濾液）は、プレートクーラー等により適切な発酵温度まで冷却する。この粕を除去した後の煮汁が、発酵原料液となる。

次いで、発酵工程として、冷却した発酵原料液に酵母を接種して、発酵を行う。冷却した発酵原料液は、そのまま発酵工程に供してもよく、所望のエキス濃度に調整した後に発酵工程に供してもよい。発酵に用いる酵母は特に限定されるものではなく、通常、酒類の製造に用いられる酵母の中から適宜選択して用いることができる。上面発酵酵母であってもよく、下面発酵酵母であってもよいが、大型醸造設備への適用が容易であることから、下面発酵酵母であることが好ましい。

さらに、貯酒（後発酵）工程として、得られた発酵液を、貯酒タンク中で熟成させ、０℃程度の低温条件下で貯蔵し安定化させた後、濾過工程として、熟成後の発酵液を濾過することにより、酵母及び当該温度域で不溶なタンパク質等を除去して、目的の発酵ビール様発泡性飲料を得ることができる。当該濾過処理は、酵母を濾過除去可能な手法であればよく、例えば、珪藻土濾過、平均孔径が０．４〜１．０μｍ程度のフィルターによるフィルター濾過等が挙げられる。

リゾチームは、発酵ビール様発泡性飲料の製造工程のうち、任意の工程で原料として添加することができる。例えば、仕込工程において発酵原料液に添加してもよく、発酵工程において発酵液に添加してもよく、貯酒工程において発酵液に添加してもよい。加熱処理による失活にリスクを抑えられるため、リゾチームは、仕込工程における煮沸処理後に添加することが好ましい。中でも、麦汁の煮沸処理後は、低温になり微生物リスクが高まる。このため、リゾチームは、煮沸処理後発酵工程前の糖化液、又は発酵工程以降の発酵液に添加することが好ましく、発酵温度まで冷却された麦汁に添加しておくことが特に好ましい。すなわち、リゾチームの添加時期としては、仕込工程の煮沸処理後冷却完了時点から貯酒工程までのいずれかの時点が好ましく、煮沸処理後の冷却完了時点から発酵工程開始前までのいずれかの時点がより好ましい。

発酵原料液は、熱凝固性蛋白質を析出しやすくし、かつ、アルコール発酵に適したｐＨにするため、ｐＨを５．０〜６．０に調整される。また、発酵後にはｐＨが４．０〜４．５になる。リゾチームは、ｐＨが４．０〜６．０の範囲で、乳酸菌の増殖を抑制できる。

発酵工程を経ずに製造される非発酵ビール様発泡性飲料は、一般的には、各原料を混合する方法（調合法）によって製造できる。例えば、具体的には、各原料を混合することにより、調合液を調製する調合工程と、得られた調合液に炭酸ガスを加えるガス導入工程と、により製造することができる。

まず、調合工程において、原料を混合することにより、調合液を調製する。調合工程においては、炭酸ガス以外の全ての原料を混合した調合液を調製することが好ましい。各原料を混合する順番は特に限定されるものではない。原料水に、全ての原料を同時に添加してもよく、先に添加した原料を溶解させた後に残る原料を添加する等、順次原料を添加してもよい。また、例えば、原料水に、固形（例えば粉末状や顆粒状）の原料及びアルコールを混合してもよく、固形原料を予め水溶液としておき、これらの水溶液、及びアルコール、必要に応じて原料水を混合してもよい。

原料としては、苦味料、酸味料、甘味料、カラメル色素、香味料、エタノール（原料アルコール）、乳化剤、多糖類、水溶性食物繊維、タンパク質若しくはその分解物等が挙げられる。

酸味料としては、乳酸、クエン酸、グルコン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、アジピン酸、及びフマル酸等が挙げられる。これらの酸味料は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

苦味料としては、ホップ、イソα酸、テトライソα酸、β酸の酸化物、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナリンジン、クワシン、キニーネ、モモルデシン、クエルシトリン、テオブロミン、カフェイン、ゴーヤ、センブリ茶、苦丁茶、ニガヨモギ抽出物、ゲンチアナ抽出物、キナ抽出物等が挙げられる。これらの苦味料は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

原料として用いるホップは、生ホップであってもよく、乾燥ホップであってもよく、ホップペレットであってもよく、ホップ加工品であってもよい。ホップ加工品としては、ホップから苦味成分を抽出したホップエキスであってもよく、イソ化ホップエキス、テトラハイドロイソフムロン、ヘキサハイドロイソフムロン等のホップ中の苦味成分をイソ化した成分を含むホップ加工品であってもよい。

甘味料としては、ショ糖、ブドウ糖、果糖、異性化液糖、及び高甘味度甘味料等が挙げられる。高甘味度甘味料としては、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、ネオテーム、ステビア、及び酵素処理ステビア等が挙げられる。これらの甘味料は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

香味料としては、ビール抽出物、ビール香料、ホップ香料等が挙げられる。これらの香味料は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

乳化剤としては、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリプロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート等が挙げられる。

多糖類としては、でんぷん、デキストリン等が挙げられる。デキストリンは、でんぷんを加水分解して得られる糖質であって、オリゴ糖（３〜１０個程度の単糖が重合した糖質）よりも大きなものを指す。これらの多糖類は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

水溶性食物繊維とは、水に溶解し、かつヒトの消化酵素により消化されない又は消化され難い炭水化物を意味する。水溶性食物繊維としては、例えば、大豆食物繊維（可溶性大豆多糖類）、ポリデキストロース、難消化性デキストリン、ガラクトマンナン、イヌリン、グアーガム分解物、ペクチン、アラビアゴム等が挙げられる。これらの水溶性食物繊維は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

調合工程において調製された調合液に、不溶物が生じた場合には、ガス導入工程の前に、当該調合液に対して濾過等の不溶物を除去する処理を行うことが好ましい。不溶物除去処理は、特に限定されるものではなく、濾過法、遠心分離法等の当該技術分野で通常用いられている方法で行うことができる。本発明においては、不溶物は濾過除去することが好ましく、珪藻土濾過により除去することがより好ましい。

次いで、ガス導入工程として、調合工程により得られた調合液に炭酸ガスを加える。これにより、非発酵ビール様発泡性飲料を得る。炭酸を加えることによって、ビールと同様の爽快感が付与される。なお、炭酸ガスの添加は、常法により行うことができる。例えば、調合工程により得られた調合液、及び炭酸水を混合してよく、調合工程により得られた調合液に炭酸ガスを直接加えて溶け込ませてもよい。

炭酸ガスを添加した後、得られた非発酵ビール様発泡性飲料に対して、さらに濾過等の不溶物を除去する処理を行ってもよい。不溶物除去処理は、特に限定されるものではなく、当該技術分野で通常用いられている方法で行うことができる。

リゾチームは、非発酵ビール様発泡性飲料の製造工程のうち、任意の工程で原料として添加することができる。例えば、調合工程において、他の原料と一緒に調合液に添加してもよく、炭酸ガスを導入した後、不溶物除去処理前又はその後に添加してもよい。

本発明に係る発泡性飲料が容器詰飲料である場合、本発明に係る発泡性飲料を充填する容器としては、特に限定されるものではない。具体的には、ガラス瓶、缶、可撓性容器等が挙げられる。可撓性容器としては、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＥＶＯＨ（エチレン・ビニルアルコール共重合体）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等の可撓性樹脂を成形してなる容器が挙げられる。可撓性容器は、単層樹脂からなるものであってもよく、多層樹脂からなるものであってもよい。

次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。

［参考例１］
ビール酵母（Saccharomyces pastorianus：以下、「S. pastorianus」）と、乳酸菌の環境単離株（Lactobacillus brevis：以下、「L. brevis」）について、ホップを含有させた麦汁と、ホップなしで調製された麦汁における増殖性を調べた。

＜微生物の前培養と菌液調製＞
S. pastorianusは、ＣＰ加ポテトデキストロース寒天培地（栄研化学社製）に接種し、L. brevisはＭＲＳ液体培地（de Man, Rogosa and Sharpe、Merck社製）に接種し、それぞれ２５℃で３日間培養した。
前培養した菌体を、１ｍＬ当たりの菌数が約１０^５個となるように滅菌生理食塩水に懸濁させたものを、菌液とした。

＜麦汁の調製＞
麦芽４０ｋｇと水１６０Ｌとの混合物を、５８℃で２０分間保持してタンパク質の分解処理を行った後、６４℃で２０分間保持して麦芽由来成分を糖化した。糖化処理後の混合物を濾過し、ホップを含まない清澄な麦汁を得た。

得られた麦汁をオートクレーブで加熱殺菌（１２１℃、１５分間）した後、濾紙でトルーブを除去した。除去後の麦汁を、５ＮのＨＣｌ又はＮａＯＨを用いてｐＨ５．２５±０．０５に調整した後、フィルター除菌（孔径０．４５μｍ）したものを、無ホップ麦汁とした。
オートクレーブで加熱殺菌時にホップを添加した以外は同様にして調製し、フィルター除菌したものを、ホップ含有麦汁とした。

＜微生物の培養＞
無ホップ麦汁又はホップ含有麦汁に、S. pastorianus又はL. brevisを、９６ウェルプレートにウェル当たり１０^３個／１００μＬとなるように播種し、２５℃で培養し、６００ｎｍの吸光度を経時的に測定した。吸光度は、「VICTOR Nivo Multimode Plate Reader」（製造元：PerkinElmer社、S/N：HH35L3517059、励起フィルター：600/10 nm）を用いて測定した。バックグラウンドの測定として、微生物未接種サンプルを使用した。

この結果、S. pastorianusはいずれの麦汁でも増殖が観察されたが、L. brevisは無ホップ麦汁では吸光度が増大し増殖が確認されたが、ホップ含有麦汁では増殖が確認されなかった。

［実施例１］
参考例１で使用したS. pastorianus及びL. brevisのリゾチーム存在下における増殖能を調べた。

＜リゾチーム含有無ホップ麦汁の調製＞
リゾチーム（２００００〜２５００００Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ、MP Biomedicals社製）を、終濃度０．１％（ｗ／ｖ）となるように無ホップ麦汁に添加した。さらに、無ホップ麦汁で希釈することによって、リゾチームの終濃度が０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、又は０．１％（ｗ／ｖ）のリゾチーム含有無ホップ麦汁（それぞれ、リゾチームの最大酵素活性として、２５、１２５、２５０、１２５０、２５００、１２５００、又は２５０００Ｕ／ｍＬ）を調整した。

＜抗菌性能の測定＞
参考例１と同様にして調製したS. pastorianus又はL. brevisの菌液（菌数：約１０^５個／１ｍＬ）を、９６ウェルプレート（８行×１２列）に、ウェル当たり１０μＬずつ接種し、各濃度に調整したリゾチーム含有無ホップ麦汁を９０μＬ加え、２５℃で７日間、嫌気条件で培養した。コントロールとして、リゾチーム無添加（０．００％（ｗ／ｖ））の無ホップ麦汁を用いて同様に培養した。接種菌液の生菌数（試験菌数）は、ＣＰ加ポテトデキストロース寒天培地又はＭＲＳ寒天培地を用いた平板塗抹培養法により測定し、接種菌液の生菌数に換算し算出した。
また、各ウェル中の溶液は、参考例１と同様にして経時的に６００ｎｍの吸光度を測定し、微生物の増殖を調べた。

図１に、リゾチームを、終濃度２５、１２５、２５０、１２５０、２５００、１２５００、又は２５０００Ｕ／ｍＬ含有する無ホップ麦汁の培養液の吸光度の測定結果を示す。図１において、（Ａ）はS. pastorianusを播種したサンプルの結果であり、（Ｂ）はL. brevisを播種したサンプルの結果である。

この結果、L. brevisを播種した全てのサンプルにおいて、リゾチームを含有させた無ホップ麦汁では、リゾチームを含有させていないコントロールの無ホップ麦汁の結果と比べて吸光度の増加が抑えられており、L. brevisの増殖が抑制されていることが確認された。また、この増殖抑制効果は、リゾチームの含有量に依存する傾向が観察された。一方で、S. pastorianusを播種したサンプルでは、リゾチームを２５〜２５００Ｕ／ｍＬ含有する無ホップ麦汁では、吸光度の増加が確認され、S. pastorianusの増殖が可能であることが確認された。

これらの結果から、適量のリゾチームは、酵母による発酵工程を経て製造される発酵ビール様発泡性飲料に添加されるビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤の有効成分として特に好適であることが明らかである。

［実施例２］
乳酸菌の増殖及び酵母によるアルコール発酵に対する、リゾチームの影響を調べた。酵母と乳酸菌は、実施例１と同様に、参考例１で使用したS. pastorianus及びL. brevisを用いた。また、リゾチームとしては、食品添加用のリゾチーム製剤「アートフレッシュ５０／５０」（組成：リゾチーム５０％、ショ糖脂肪酸エステル５０％、三栄源社製）を用いた。

＜抗菌性能の測定（２００ｍＬスケール）＞
まず、リゾチーム製剤を終濃度０．００１、０．０００５％（ｗ／ｖ）（リゾチーム終濃度として、０．０００５、０．０００２５％（ｗ／ｖ））となるように含有させた無ホップ麦汁を調製した。各リゾチーム含有無ホップ麦汁２００ｍＬに、前培養した酵母を１０^３個／ｍＬとなるように添加し、さらに前培養した乳酸菌を１０^４個／ｍＬとなるように添加した。酵母と乳酸菌を添加したリゾチーム含有無ホップ麦汁を、発酵栓をして１０．５℃で７日間、好気条件で培養した。対照として、リゾチーム無添加（０％（ｗ／ｖ））の無ホップ麦汁についても同様に培養した。接種菌液の生菌数（試験菌数）は、ＣＰ加ポテトデキストロース寒天培地又はＭＲＳ寒天培地を用いた平板塗抹培養法により測定し、接種菌液の生菌数に換算して算出した。

アルコール発酵は、１分子の糖から２分子のエタノールと２分子の二酸化炭素が生成される［Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６（１８０ｇ）→２Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ（４６ｇ×２）＋２ＣＯ_２（４４g×２）］。従って、アルコール発酵により生成されたアルコールの濃度（ｇ／Ｌ）は、下記式（１）により表すことができる。また、エタノールの比重は０．７８９ｇ／ｍＬであるから、体積濃度に換算すると下記式（２）のようになる。そこで、培養中の三角フラスコの重量を測定することにより炭酸ガス減少量を求め、生成したアルコール濃度（％（ｖ／ｖ））を推定した。

式（１）：［発酵液のアルコール濃度（ｇ／Ｌ）］＝（（４６／４４）×［炭酸ガス減少量（g）］）／［培養液量（Ｌ）］
式（２）：［発酵液のアルコール濃度（％（ｖ／ｖ））］＝（０．１３２５×［炭酸ガス減少量（g）］）／［培養液量（Ｌ）］

７日間（１６８時間）培養後の培養液の一部をサンプリングし、ガス減重法によりアルコール濃度を測定した。測定結果を表１に示す。表１に示すようにリゾチームを含有させたサンプルでは、リゾチーム無添加のサンプルよりもアルコール濃度がやや低いものの、充分なアルコール濃度の発酵液が得られた。この結果から、乳酸菌の増殖を効果的に抑制可能な程度の量のリゾチームの存在下でも、問題なく酵母によるアルコール発酵が行われることが確認された。

［実施例３］
リゾチーム存在下で、大量培養によりアルコール発酵を行った。酵母と乳酸菌は、実施例２と同様に、参考例１で使用したS. pastorianus及びL. brevisを用いた。また、リゾチームとしては、実施例２で用いたリゾチーム製剤を用いた。

＜麦汁の調製＞
コーンスターチ２２ｋｇと水６６ｋｇを混合し、加熱させて膨潤させた（混合物１）。これとは別に、麦芽４４ｋｇと水１１０ｋｇの混合物を、５５℃で３０分間保持して、タンパク質の分解処理を行った（混合物２）。次いで、混合物２に混合物１を加え、６４．５℃で５０分間保持して、麦芽及びコーンスターチ由来成分を糖化した。糖化処理後の混合物を濾過し、ホップを含まない清澄な麦汁を得た。

得られた麦汁を８０分間煮沸させた後、調製湯を加えた。次いで、この煮沸した麦汁に、リゾチーム製剤を終濃度０．０００２％（ｗ／ｖ）（リゾチーム終濃度として０．０００１％（ｗ／ｖ））となるように添加・撹拌した後、濾紙でトルーブを除去した。除去後の麦汁を、約８℃まで冷却した後、発酵タンクへ移し替え、酵母及び乳酸菌の菌数が、２０×１０^６個／１ｍＬ及び１．０×１０^５個／１ｍＬとなるように添加し、１０．５℃で１４日間培養した（試験サンプル）。対照として、リゾチーム無添加（０％（ｗ／ｖ））の無ホップ麦汁についても同様に培養した（対照サンプル）。接種菌液の生菌数（試験菌数）は、ＣＰ加ポテトデキストロース寒天培地又はＭＲＳ寒天培地を用いた平板塗抹培養法により測定し、接種菌液の生菌数に換算して算出した。培養開始前（培養０日目）から経時的に発酵液の一部をサンプリングし、浮遊酵母数及び外観エキスを測定した。また、培養０、７、及び１４日後に、アクチジオン添加ＭＲＳ寒天培地を用いて生菌数を測定し、供試菌の増殖を調べた。発酵７日毎にサンプリングを行い、L.brevisの生菌数を観測した。測定結果を図３に示す。図中、培養時間が０日目の乳酸菌濃度とは、初発菌数を示す。

試験サンプルの発酵液の浮遊酵母数（細胞／ｍＬ）及び外観エキス（％）の測定結果を図２に示す。図２に示すように、リゾチーム終濃度として０．０００１％を含む麦汁において、S. pastorianusは対照サンプルと変わりなく増殖し、発酵７日目には外観エキス２％以下となるまでエキスを消費した。また、図３に示すように、リゾチーム終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）を含む麦汁の発酵・熟成期間において、L. brevisの生菌量は、ゆるやかに減少した。これらの結果から、適量のリゾチーム存在下で、プラントスケールでアルコール発酵を行っても、乳酸菌の増殖を抑制しつつ、リゾチーム非存在下と同様に発酵ビール様発泡性飲料が製造できることが示唆された。

＜官能評価＞
得られた試験サンプルと対照サンプルについて、まず、濾過にて清澄化し、１．２倍希釈後に、容器に充填した。次いで、リゾチーム添加により香味に変化があるか否か調べるため、両サンプルについて、３点試験法による官能評価を実施した。官能評価は、１３名の専門パネルにより、「ＢＣＯＪ官能評価法２００２」に記載の方法に従って実施した。評価結果を表２に示す。

表２に示すように、１３名のパネルのうち、試験サンプルと対照サンプルを正しく識別したパネルは２名であり、２つのサンプル間に有意な差は認められなかった。すなわち、リゾチーム存在下でアルコール発酵を行っても、リゾチーム非存在下と同様に香味に優れた発酵ビール様発泡性飲料が製造できた。

Claims

リゾチームを有効成分とすることを特徴とする、ビール様発泡性飲料用乳酸菌増殖抑制剤。
リゾチームを含有し、ホップを原料としないことを特徴とする、ビール様発泡性飲料。
リゾチームの含有量が、２５〜２５００Ｕ／ｍＬである、請求項２に記載のビール様発泡性飲料。
さらに、乳化剤を含有する、請求項２又は３に記載のビール様発泡性飲料。
発酵ビール様発泡性飲料である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のビール様発泡性飲料。
リゾチームを原料とし、ホップを原料としないことを特徴とする、ビール様発泡性飲料の製造方法。
リゾチームの含有量が、２５〜２５００Ｕ／ｍＬであるビール様発泡性飲料を製造する、請求項６に記載のビール様発泡性飲料の製造方法。
発酵工程を有する、請求項６又は７に記載のビール様発泡性飲料の製造方法。
リゾチームと乳化剤を共に、煮沸処理後発酵工程前の糖化液、又は発酵工程以降の発酵液に添加する、請求項８に記載のビール様発泡性飲料の製造方法。