JP2020505017A - 抗pd−1モノクローナル抗体、その製造方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1)重鎖相補性決定領域としてSEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:13で表されるアミノ酸配列を有するCDRH1、SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:14で表されるアミノ酸配列を有するCDRH2、SEQ ID NO:3又はSEQ ID NO:15で表されるアミノ酸配列を有するCDRH3、及び
2)軽鎖相補性決定領域としてSEQ ID NO:4又はSEQ ID NO:16で表されるアミノ酸配列を有するCDRL1、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:17で表されるアミノ酸配列を有するCDRL2、SEQ ID NO:6又はSEQ ID NO:18で表されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含む。
ヒト全血は、上海市長海病院より入手し、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll密度遠心法を利用してヒト全血から分離した。人CD14+単核細胞及びCD4+T細胞は、MiltenyiBiotec社製の磁気細胞ソーティングシステムで分離し、分離された細胞は、AIM−V培地を用いて37℃、5%のCO2インキュベータで通常のとおりにして培養を行った。
ELISAコーティング液は、炭酸ナトリウム1.59g、炭酸水素ナトリウム2.93gをpH7.0の純水で1000mlとなるように調製した。PBSTは、リン酸二水素カリウム0.2g、リン酸水素二ナトリウム・12水和物2.9g、塩化ナトリウム8.0g、塩化カリウム0.2g、Tween−20 1mlをpH7.0の純水で1000mlとなるように調製した。ELISA発色剤Aは、酢酸ナトリウム13.6g、クエン酸1.6g及び30%の過酸化水素水0.3mlをpH7.0の純水で500mlとなるように調製した。ELISA発色剤Bは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム0.2g、クエン酸0.95g、グリセリン50ml、及びTMB0.15gを3mlのDMSO溶かしたものをpH7.0の純水で500mlとなるように調製した。ELISA停止剤は、98%の濃硫酸111mlをpH7.0の純水で1000mlとなるように調製した。
ヒトPD−1のcDNAは、Origene社より購入した(カタログ番号:SC117011)。プライマーを設計した後、PD−1遺伝子のcDNAをテンプレートとして細胞外コーディング領域を増幅し、ヒトIgG1遺伝子のcDNAをテンプレートとしてFcコーディング領域を増幅した。上記増幅で得られたPCR断片を回収し、Overlap PCRを利用して上記断片を1つの組換え断片に繋いた。プライマー設計時に、5’末端にシグナルペプチド(MGVKVLFALICIAVAEA)のコーディング領域を導入し、更に、両端に予定の制限酵素認識サイトを導入した。そして、Avr IIとPac Iを用いてpCHO1.0ベクター及び上記組換えPCR断片を消化し、消化産物を精製した後にライゲーションしてTOP10コンピテント細胞に導入し、LB(Amp)平板培地で塗布して一晩培養した。細菌コロニーをピックアップし、拡大培養してプラスミドを抽出し、Avr IIとPac Iでプラスミドを消化して遺伝子断片の挿入があるか否かを確認した。そして、陽性プラスミドについて配列測定を行い、配列が完全に正しいクローンを選んでCHO細胞に導入した。PD−1リガンドであるPD−L1のcDNAは、北京Sino Biological Inc社より購入し、カタログ番号がHG10084−Mであった。同様に、上記方法を利用してPD−L1細胞外領域とヒト抗体Fc領域との融合遺伝子発現ベクターを構築した。
実施例1で得られたヒトPD−1−hFc抗原を、生理食塩水で濃度が50μg/75μlとなるように希釈し、同量のフロイント完全アジュバント(Sigma社製)と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、4〜5週齢のBalb/cマウス(上海霊暢バイオテック会社より購入、動物製造許可証:SCXK(滬)2013−0018)に皮下経由で多箇所に注射した。3週後、PD−1−hFc抗原を生理食塩水で濃度が50μg/75μlとなるように希釈し、同量のフロイント不完全アジュバント(Sigma社製)と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、マウスに皮下経由で多箇所に注射することで免疫を行い、2週後には再び同じ免疫を繰り返した。3回の免疫が終わってから7日目にマウスから血液を1滴採取し、血清を分離してELISAで血清抗体価を測定した。
実施例2で得られた安定型モノクローナル細胞株をHybridoma−SFM無血清培地(Life Technologies社製)で7日間培養し、Protein Gアフィニティーカラム(GE社製)を用いて培養上清液からラット由来抗ヒトPD−1モノクローナル抗体を精製した。精製済みの抗体に対して濃度を測定し、ELISA法でPD−1とPD−L1の相互作用に対するラット由来抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の阻害効果を検討した。
Histopaqueを用いてヒト血液から末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell、PBMC)を分離し、そして付着法を利用してPBMCにおける単核細胞サブセットを分離し、IL−4とGM−CSFを併用することで単核細胞から誘導樹状細胞へ分化誘導した。7日後、上記誘導樹状細胞を消化して集めた。別のトナーの血液から上記と同様にしてPBMCを分離し、そこからMACSマグネットとCD4 MicroBeads(Miltenyiバイオテック社製)を用いてCD4陽性T細胞を分離した。誘導樹状細胞(104個/ウェル)と分離されたCD4陽性T細胞(105個/ウェル)とを比例に従って均一に混ぜ合わせた後、各ウェル当たり150μlずつ96ウェルプレートに接種した。数時間後、上記96ウェルプレートにAIM−V培地で希釈したラット由来抗ヒトPD−1抗体を50μl加え、同時に、市販の抗体であるOpdivoとKeytrudaを陽性対照物とし、PD−1に結合しない無関連の抗体を陰性対照物とした。96ウェルプレートを37℃、4日間インキュベートし、標準操作法に従ってIL−2とIFN−gammaの分泌、及びリンパ球の増殖状況を確認した。IL−2とIFN−gammaの分泌は、標準的な二重抗体サンドイッチ法(測定用抗体は、BD Biosciences社から購入)を利用して測定し、リンパ球の増殖は、Cell Titer−Glo(登録商標)法(測定関連試薬は、Promega社から購入)を利用して測定した。陽性対照抗体であるOpdivoは、Bristol−Myers Squibb社製であり(LOT番号が4M59291であり、EXPがSEP2016である)、陽性対照抗体であるKeytrudaは、Merk社製であった(LOT番号とEXPが、K013835/070C12015である)。本実施例で使用する培地は、AIM−V(Life Technologies社製)であった。データ読み取りは、多機能プレートリーダー(Molecular Device社製)を用い、GraphPad Prism6を用いてデータを解析してEC50を算出した。上記精製済のラット由来抗ヒトPD−1モノクローナル抗体に対してMLR評価を行い、MLR強度の増強効果が特に著しい抗体を選んで次の実験に用いた。
実施例3及び実施例4の測定結果に基づき、番号が1−15及び1−25であるクローン(mAb1−15及びmAb1−25)を選んでリード抗体とした。Trizol(Life Technologies社製)でクローン1−15及びクローン1−25に対応するハイブリドーマのモノクローナル細胞株からトータルRNAを抽出し、逆転写キット(Takara社製)を用いてmRNAをcDNAに逆転写し、文献に記載されているプライマーペア(Roland Kontermann及びStefan Duebel編集の「Antibody Engineering」、第1版、プライマーペアの配列は、第323頁に記載されている)を用い、PCR法によりラット由来抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、PCR産物をpMD18−Tベクターに導入して可変領域の遺伝子配列を測定した。
SEQ ID NO:23
GAAGTGAACCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCGTTACACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAATAGGTACGACGTGGACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO:24
EVNLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYDVDWFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:25
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAT
SEQ ID NO:26
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELN
SEQ ID NO:27
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAAACTCCGGAGAAGCGGCTGGAGTGGGTCGCTACCATTAGTGGTGGTGGTCGTTACACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACACCCACTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCCTCTATTTTTGTGCAAGTCCTTACGGCGGTTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:28
EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCVASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNARNTHYLQMSSLRSEDTALYFCASPYGGYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO:29
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCGGGAGCTAGAGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGTCAAAGTATTAGCAACTTCCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATATGCTTCTCAGTCCATTTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAGCAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCTCATACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO:30
DIVLTQSPATLSVTPGARVSLSCRASQSISNFLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSISSVETEDFGMYFCQQSNSWPHTFGAGTKLELK
実施例5における重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、KABAT法則に従って抗体1−15及び抗体1−25(mAb1−15及びmAb1−25)の3つの抗原相補性決定領域(complementarity−determining region,CDR)及び4つのフレーム領域(frame region,FR)を確定した。
SEQ ID NO:13
SYDMS
SEQ ID NO:14
TISGGGRYTYYPDSVKG
SEQ ID NO:15
RYDVDWFAY
SEQ ID NO:16
RASQSISNNLH
SEQ ID NO:17
YASQSIS
SEQ ID NO:18
QQSNSWPLT
SEQ ID NO:1
SYDMS
SEQ ID NO:2
TISGGGRYTYYPDTVKG
SEQ ID NO:3
PYGGYFDV
SEQ ID NO:4
RASQSISNFLH
SEQ ID NO:5
YASQSIS
SEQ ID NO:6
QQSNSWPHT
SEQ ID NO:31
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGAGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGGCGGCGGCAGGTACACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAACAGGTACGACGTGGACTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:19
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCANRYDVDWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:32
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCAGCAACAACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTTCTGCCAGCAGAGCAACAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:21
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:33
GAAGTCAAACTCGTGGAGTCCGGCGGAGGCCTCGTTCAACCAGGTGGATCTCTTCGTTTGTCCTGCGCAGCATCAGGATTCGCTTTCTCCAGCTACGACATGAGCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGAAAGAGGCTGGAATGGGTTGCTACTATCAGCGGCGGTGGTAGATATACTTATTACCCCGATACCGTAAAGGGGAGGTTCACCATTAGTCGCGATAACGCCAAAAATTCACACTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGTCCCTATGGCGGGTATTTTGACGTGTGGGGCCAGGGGACACTGGTGACTGTGAGTTCT
SEQ ID NO:7
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:34
GAGATCGTCCTTACCCAATCACCAGCAACCTTGTCACTGTCACCAGGTGAAAGAGCAACCCTCAGTTGTAGGGCTAGTCAGAGTATCTCCAACTTCCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTCGGTTGCTCATTAAGTACGCCTCTCAATCTATCAGCGGAATCCCCGCTCGCTTTTCTGGCTCTGGCTCCGGGACTGATTTCACTCTGACAATTTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTTGCCGTTTATTTTTGCCAGCAGAGCAATAGCTGGCCCCATACATTCGGGCAGGGCACAAAAGTGGAGATAAAA
SEQ ID NO:9
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:35
GCAAGTACCAAGGGACCTAGTGTTTTCCCTCTTGCACCTTGCTCCAGGTCAACATCAGAGTCCACAGCTGCTCTTGGATGTCTCGTTAAGGACTACTTCCCAGAGCCAGTTACCGTATCCTGGAACTCCGGAGCTTTGACAAGCGGCGTTCATACATTCCCAGCTGTGTTGCAGAGTTCTGGGTTGTACAGTTTGAGCTCAGTGGTGACCGTGCCTTCATCTTCTTTGGGCACTAAGACCTACACCTGCAACGTGGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTGGATAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCACCATGTCCTCCATGTCCAGCCCCTGAATTTTTGGGCGGGCCTTCTGTCTTTCTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGATACCCTGATGATCAGCCGCACACCCGAAGTCACTTGTGTGGTCGTGGATGTGTCTCAGGAAGATCCCGAAGTGCAGTTTAACTGGTATGTCGATGGCGTGGAAGTGCATAATGCCAAAACTAAGCCCCGCGAAGAACAGTTCAACAGCACTTATCGGGTCGTGTCTGTGCTCACAGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAATGGGAAAGAATATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTCCCCAGCAGCATCGAGAAGACTATTAGCAAAGCCAAAGGGCAGCCACGGGAACCCCAGGTGTACACTCTGCCCCCCTCTCAGGAGGAGATGACTAAAAATCAGGTCTCTCTGACTTGTCTGGTGAAAGGGTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACTCCCCCCGTCCTGGACTCTGACGGCAGCTTTTTCCTGTATTCTCGGCTGACAGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGGAGGGCAATGTCTTTAGTTGCAGTGTCATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACACAGAAAAGCCTGTCTCTGAGTCTGGGCAAA
SEQ ID NO:36
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:37
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGAGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGGCGGCGGCAGGTACACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAACAGGTACGACGTGGACTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCAAGTACCAAGGGACCTAGTGTTTTCCCTCTTGCACCTTGCTCCAGGTCAACATCAGAGTCCACAGCTGCTCTTGGATGTCTCGTTAAGGACTACTTCCCAGAGCCAGTTACCGTATCCTGGAACTCCGGAGCTTTGACAAGCGGCGTTCATACATTCCCAGCTGTGTTGCAGAGTTCTGGGTTGTACAGTTTGAGCTCAGTGGTGACCGTGCCTTCATCTTCTTTGGGCACTAAGACCTACACCTGCAACGTGGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTGGATAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCACCATGTCCTCCATGTCCAGCCCCTGAATTTTTGGGCGGGCCTTCTGTCTTTCTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGATACCCTGATGATCAGCCGCACACCCGAAGTCACTTGTGTGGTCGTGGATGTGTCTCAGGAAGATCCCGAAGTGCAGTTTAACTGGTATGTCGATGGCGTGGAAGTGCATAATGCCAAAACTAAGCCCCGCGAAGAACAGTTCAACAGCACTTATCGGGTCGTGTCTGTGCTCACAGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAATGGGAAAGAATATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTCCCCAGCAGCATCGAGAAGACTATTAGCAAAGCCAAAGGGCAGCCACGGGAACCCCAGGTGTACACTCTGCCCCCCTCTCAGGAGGAGATGACTAAAAATCAGGTCTCTCTGACTTGTCTGGTGAAAGGGTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACTCCCCCCGTCCTGGACTCTGACGGCAGCTTTTTCCTGTATTCTCGGCTGACAGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGGAGGGCAATGTCTTTAGTTGCAGTGTCATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACACAGAAAAGCCTGTCTCTGAGTCTGGGCAAA
SEQ ID NO:20
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SEQ ID NO:38
CGCACTGTGGCTGCCCCCAGTGTTTTCATATTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGTCCGGCACAGCCTCTGTTGTATGTCTGCTGAATAATTTTTATCCACGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGGAACTCTCAAGAGAGTGTGACAGAGCAGGACAGTAAAGACAGCACCTATAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGTCTAAAGCCGACTATGAAAAACACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGGCTCAGCTCTCCCGTTACCAAGAGCTTTAACCGAGGCGAATGT
SEQ ID NO:39
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:40
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCAGCAACAACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTTCTGCCAGCAGAGCAACAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGCACTGTGGCTGCCCCCAGTGTTTTCATATTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGTCCGGCACAGCCTCTGTTGTATGTCTGCTGAATAATTTTTATCCACGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGGAACTCTCAAGAGAGTGTGACAGAGCAGGACAGTAAAGACAGCACCTATAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGTCTAAAGCCGACTATGAAAAACACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGGCTCAGCTCTCCCGTTACCAAGAGCTTTAACCGAGGCGAATGT
SEQ ID NO:22
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:11
GAAGTCAAACTCGTGGAGTCCGGCGGAGGCCTCGTTCAACCAGGTGGATCTCTTCGTTTGTCCTGCGCAGCATCAGGATTCGCTTTCTCCAGCTACGACATGAGCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGAAAGAGGCTGGAATGGGTTGCTACTATCAGCGGCGGTGGTAGATATACTTATTACCCCGATACCGTAAAGGGGAGGTTCACCATTAGTCGCGATAACGCCAAAAATTCACACTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGTGCCAGTCCCTATGGCGGGTATTTTGACGTGTGGGGCCAGGGGACACTGGTGACTGTGAGTTCTGCAAGTACCAAGGGACCTAGTGTTTTCCCTCTTGCACCTTGCTCCAGGTCAACATCAGAGTCCACAGCTGCTCTTGGATGTCTCGTTAAGGACTACTTCCCAGAGCCAGTTACCGTATCCTGGAACTCCGGAGCTTTGACAAGCGGCGTTCATACATTCCCAGCTGTGTTGCAGAGTTCTGGGTTGTACAGTTTGAGCTCAGTGGTGACCGTGCCTTCATCTTCTTTGGGCACTAAGACCTACACCTGCAACGTGGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTGGATAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCACCATGTCCTCCATGTCCAGCCCCTGAATTTTTGGGCGGGCCTTCTGTCTTTCTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGATACCCTGATGATCAGCCGCACACCCGAAGTCACTTGTGTGGTCGTGGATGTGTCTCAGGAAGATCCCGAAGTGCAGTTTAACTGGTATGTCGATGGCGTGGAAGTGCATAATGCCAAAACTAAGCCCCGCGAAGAACAGTTCAACAGCACTTATCGGGTCGTGTCTGTGCTCACAGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAATGGGAAAGAATATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTCCCCAGCAGCATCGAGAAGACTATTAGCAAAGCCAAAGGGCAGCCACGGGAACCCCAGGTGTACACTCTGCCCCCCTCTCAGGAGGAGATGACTAAAAATCAGGTCTCTCTGACTTGTCTGGTGAAAGGGTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAGACAACTCCCCCCGTCCTGGACTCTGACGGCAGCTTTTTCCTGTATTCTCGGCTGACAGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGGAGGGCAATGTCTTTAGTTGCAGTGTCATGCATGAGGCCCTGCACAATCACTATACACAGAAAAGCCTGTCTCTGAGTCTGGGCAAA
SEQ ID NO:8
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:12
GAGATCGTCCTTACCCAATCACCAGCAACCTTGTCACTGTCACCAGGTGAAAGAGCAACCCTCAGTTGTAGGGCTAGTCAGAGTATCTCCAACTTCCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTCGGTTGCTCATTAAGTACGCCTCTCAATCTATCAGCGGAATCCCCGCTCGCTTTTCTGGCTCTGGCTCCGGGACTGATTTCACTCTGACAATTTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTTGCCGTTTATTTTTGCCAGCAGAGCAATAGCTGGCCCCATACATTCGGGCAGGGCACAAAAGTGGAGATAAAACGCACTGTGGCTGCCCCCAGTGTTTTCATATTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGTCCGGCACAGCCTCTGTTGTATGTCTGCTGAATAATTTTTATCCACGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCTGGGAACTCTCAAGAGAGTGTGACAGAGCAGGACAGTAAAGACAGCACCTATAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGTCTAAAGCCGACTATGAAAAACACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGGCTCAGCTCTCCCGTTACCAAGAGCTTTAACCGAGGCGAATGT
SEQ ID NO:10
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本実施例では、MLR(混合リンパ球反応)方法を利用してmAb1−15−HumanizedとmAb1−25−Humanizedの生体活性を比較した。ここで、市販のOpdivo及びKeytrudaを陽性対照抗体とし、具体的には、実施例4でも述べたようにIL−2分泌、IFN−γ分泌及び細胞増殖に対する促進活性を評価することで行った。図1−3に示すように、ヒトIgG4同型の対照抗体はヒトPD−1を認識せず、MLRに対して明らかな影響が示さないが、陽性対照抗体であるOpdivo及びKeytrudaは、MLRを促進することでIL−2分泌量が多くなり、EC50がそれぞれ24.63ng/ml及び18.37ng/mlであった(表1)。一方、本発明のmAb1−15−Humanized及びmAb1−25−Humanizedは、上記陽性対照抗体と同様にMLRのIL−2分泌を促進することができ、EC50がそれぞれ16.51ng/ml及び10.73ng/mlであった。また、mAb1−15−Humanizedとその関連キメラ抗体mAb1−15−Chimericは、MLRのIL−2分泌に対する促進活性がほぼ同じく(それぞれ16.51ng/ml、23.56ng/mlでる)、mAb1−25−Humanizedとその関連キメラ抗体mAb1−25−Chimericも、MLRのIL−2分泌に対する促進活性がほぼ同じであり(それぞれ10.73ng/ml、9.953ng/mlである)、本発明に係るラット由来抗体のヒト化操作がその目的を達成していることが実証された。更に、以上で述べたように、MLRのIL−2分泌に対する促進活性からして、本発明のmAb1−25−Humanizedが2つの陽性対照抗体OpdivoとKeytrudaを遥かに上回ることが確認できた。
Ab1−15−Humanized及びmAb1−25−HumanizedとPD−1との結合特性については、Biacore T200(GE healthcare社製)を用いて測定した。具体的には、Amine Coupling Kit(GE healthcare社製)を用いてCM5センサーチップ(GE healthcare社製)を活性化させ、そしてProtein A/G融合タンパク質(Thermo Pierce社製)をチップに固定し、固定量が2000RUであった。FC3(Flow cell 3)を参考セルとし、FC4(Flow cell 4)を試料セルとした。FC4セルを用いてmAb1−15−Humanized、mAb1−25−Humanized、陽性対照抗体(Opdivo及びKeytruda)等をそれぞれ捕捉し、濃度が異なるヒトPD−1(北京Sino Biological Inc社製)を注入した。サイクリング条件として、FCの全セルに速度50μl/分間で測定試料を4分間注入し、解離時間20分間、速度10μl/分間で6Mの塩酸グアニジニウムを30秒間注入して表面を再生させ、最後にBiacore T200 Evaluation Software Ver 1.0を利用して捕捉抗体のシグナルと非捕捉抗体のシグナルの差、及び相互作用の結合特性を算出した。実験結果は、表2に示す。
CD28、CTLA−4、ICOS等のタンパク質分子は、PD−1と同じファミリーに属し、配列においても相同性があり、これらのタンパク質分子に対して本発明の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体が交差反応性を示すかどうかを確認するため、以下の実験を行った。ELISAプレートに、ヒトPD−1−hFc、CD28−hFc、CTLA−4−hFc、ICOS−hFc等のタンパク質分子(そのうち、ヒトPD−1−hFcは、実施例1に記載の方法で調製し、CTLA−4細胞外配列は、http://www.uniprot.org/uniprot/P16410を参考にして調製し、CTLA−4−hFcは、実施例1に記載のヒトPD−1−hFc製造方法と同様にして調製し、CD28−hFc及びICOS−hFcは、北京Sino Biological Inc社より購入した)をそれぞれ同じ濃度でコーティングし、コーティング濃度2μg/ml、各ウェル当たり100μlずつ、4℃で一晩コーティングした。PBST(0.5%のTween−20を含むPBS)でプレートを2回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに1%のBSAを含むコーティング緩衝液を200μl加えてブローキングを行い、常温で4時間ブローキングしてから叩いて液体を完全に除き、−20℃の冷蔵庫に保存して次に備えた。検出時には、ELISAプレートの各ウェルに、希釈によって濃度勾配を形成したmAb1−25−Humanizedを100μlずつ加え、各濃度に平行して3つのウェルを設け、室温で1時間インキュベートした。そして、ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。PBSTで1:5000倍希釈したHRP標識のヤギ抗人Fab抗体(Sigma社製)を100μl加え、室温で1時間インキュベートした後、ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに発色液(使用に先立って、ELISA発色剤Aと発色剤Bを1:1の体積比で混ぜ合わせる)を100μl加えて発色させ、各ウェル当たりに2MのH2SO4停止剤を100μl加えて反応を停止させ、プレートリーダー(Molecular Device)を利用して波長450nmで各ウェルのOD値を測定した。
ヒトPD−1トランスジェニックマウス(遺伝的背景がC57BL/6である)及びMC38マウス大腸癌細胞は、上海南方モデル生物研究センターから購入した。該トランスジェニックマウスにおいてマウスの相同部分をヒト由来PD−1遺伝子の細胞外部分で置き換えたため、本発明の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体は、該トランスジェニックマウスのPD−1分子に結合可能となり、免疫系を活性化させて腫瘍抑制効果を奏することができる。具体的には、血清濃度10%のDMEM(血清と培地は何れもGibco社製である)を培地としてMC38を体外培養し、マウス1匹当たり1×106個の細胞となるようにMC38細胞をヒトPD−1トランスジェニックマウスに接種した。接種した腫瘍細胞が体積約100mm3まで生長すると、ランダムに動物を幾つかの組に分けた。このとき、ブランク対照組としてマウス16匹に生理食塩水のみを注射し、mAb1−25−Humanized抗体組として1mg/kg、3mg/kg、10mg/kgと3つの投与組を設け、各投与量にマウス8ずつであった。また、Keytruda陽性対照組としては、投与量を10mg/kgとし、マウスが8匹であった。そして、既定の投与計画に従って週に2回、3週間続けて投与を行い、毎週2回の頻度で腫瘍体積を測定した。各組の経時的な腫瘍生長グラフは、図5に示す。
Claims (12)
- 重鎖相補性決定領域としてCDRH1、CDRH2及びCDRH3と、軽鎖相補性決定領域としてCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含み、
前記CDRH1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:13で表され、前記CDRH2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:14で表され、前記CDRH3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3又はSEQ ID NO:15で表され
前記CDRL1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:4又はSEQ ID NO:16で表され、前記CDRL2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:17で表され、前記CDRL3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:6又はSEQ ID NO:18で表される
ことを特徴とする、抗ヒトPD−1モノクローナル抗体。 - 前記抗ヒトPD−1モノクローナル抗体において、
重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:7又はSEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:24又はSEQ ID NO:28で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:9又はSEQ ID NO:21又はSEQ ID NO:26又はSEQ ID NO:30で表される、請求項1に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体。 - 前記抗ヒトPD−1モノクローナル抗体において、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20で表され、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:10又はSEQ ID NO:22で表される、請求項2に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
- 前記ヌクレオチド分子において、
抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:23又はSEQ ID NO:27又はSEQ ID NO:31又はSEQ ID NO:33で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:25又はSEQ ID NO:29又はSEQ ID NO:32又はSEQ ID NO:34で表される、請求項4に記載のヌクレオチド分子。 - 前記ヌクレオチド分子において、
抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:11で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:12で表され、又は
抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:37で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列がSEQ ID NO:40で表される、請求項4に記載のヌクレオチド分子。 - 請求項4〜5の何れか1項に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体を製造する方法であって、
発現条件において、請求項8に記載のホスト細胞を培養して抗ヒトPD−1モノクローナル抗体を発現させる工程aと、
前記工程aで発現させる抗ヒトPD−1モノクローナル抗体を分離精製する工程bと
を含むことを特徴とする、抗ヒトPD−1モノクローナル抗体の製造方法。 - 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、組成物。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗ヒトPD−1モノクローナル抗体又は請求項10に記載の組成物の薬物製造における用途であって、
前記薬物は、腫瘍、自己免疫疾患、治療感染症及び/又は抗移植拒否反応を治療するための薬物であることを特徴とする、用途。 - 前記腫瘍は、大腸癌であることを特徴とする、請求項11に記載の用途。
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