CN115925947B - 一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟 - Google Patents

一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种亲和力成熟方法及抗人PD‑L1单域抗体的亲和力成熟,属于生物医药及抗体工程领域。本发明的抗体亲和力成熟方法，具体为CDR区全覆盖的单点饱和突变与哺乳***超高通量表达筛选***相结合的方法；所述的CDR区全覆盖的单点饱和突变的方法，具体为通过等比的引物混合物对抗体CDRs区的每一个氨基酸进行无偏差全覆盖的突变。本发明具有如下技术效果：1）本发明的亲和力成熟方法，具有提高抗体亲和力的技术效果，这一效果在实施例7得到了验证。2）本发明的抗人PD‑L1单域抗体与母本抗体相比，亲和力大幅提高，最多提高10倍以上，且亲和力成熟后的抗体仍具有阻断PD‑L1与PD‑1结合的活性，这一效果在实施例7和9得到了验证。

Description

一种亲和力成熟方法及抗人PD-L1单域抗体的亲和力成熟
技术领域
本发明属于生物医药及抗体工程领域，具体而言，涉及一种抗体亲和力成熟方法。
背景技术
目前抗体的开发主要源于小鼠杂交瘤技术和体外抗体库技术，通过抗原设计和抗体筛选初步获得候选抗体，然后通过一系列相关的生物性质检测和功能验证，最终得到有应用价值的抗体。在实际开发过程中，经过常规筛选方法得到的抗体有许多性能需要改进，例如亲和力、免疫原性、半衰期等，其中抗体亲和力成熟是最重要的改进方向之一。发展抗体亲和力成熟技术，不仅有助于改善抗体的特异性和效力，减少抗体药的用药剂量，降低毒副作用，也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点功能。
近年来,随着人类对体内抗体亲和力成熟研究的逐步深入，同时抗体工程研究的迅速兴起，使得体外抗体亲和力成熟研究逐渐成为一个研究热点。体外抗体亲和力成熟是属于体外功能蛋白质分子进化的范畴。它的研究策略多是在基于对体内抗体亲和力成熟规律认识的基础上提出的，大多模拟体内抗体亲和力成熟的方式。目前主要采用以下几种：
应用易错PCR(error-prone PCR)法引进点突变，这种方法的关键在于如何选择合适的突变频率。一般有益突变的频率很低，绝大多数突变为有害的。如果突变频率太高，则几乎无法筛选到有益突变；突变频率也不能太低，否则未发生任何突变的野生型将占突变群体的优势类型，也很难筛选到理想的突变体。
DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。
CDR区重组，即利用抗体恒定区高度保守，可变区中只有与抗原结合密切相关的CDR区呈现出高度变异性，而其他部位也是相对保守的的结构特点，提出只对抗体的CDR区进行重点突变(主要是随机突变)的策略对抗体的亲和力进行改造，收到了良好的效果。
链改组又称链替换技术。这是一种非常简便的抗体体外亲和力成熟技术。依据抗体可变区随机配对的原理,将抗体的一条链保持不变,替换另一条链,筛选高亲和力的抗体分子。不过,这项技术的缺点也很明显:必须对抗原有比较明确的认识,而且要在一个比较完善的初级抗体库或抗体的基础上才能采用此项技术。
PD-1全称为程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-L1全称为程序性死亡受体-配体1，是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。PD-1位于T细胞，能够与基质细胞中的PD-L1结合，两者的结合作为介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起到负调节作用，因此破坏PD-L1/PD-1之间的相互作用，在释放免疫***对癌细胞的杀伤力方面展现出巨大的潜力。
PD-1-PD-L1免疫疗法是当前备受瞩目的新一代抗肿瘤疗法，旨在利用人体自身的免疫***对抗肿瘤细胞。通过PD-1或PD-L1抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别，从而恢复T细胞的正常识别和防御攻击功能，杀死肿瘤细胞。迄今为止，FDA已经批准了7种用于PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂：4种抗PD-1单抗和3种PD-L1单抗，包括2021年4月批准的PD-1单抗Dostarlimab。2022年2月10日在Nature review上发表的一份题为“Challenges andopportunities in the PD1/PDL1 inhibitor clinical trial landscape”的报告更新了PD-1/PD-L1临床试验的最新情况，包括临床上批准的治疗方法的使用以及新兴模式的总结。
但在临床的使用过程中发现，PD-1/PD-L1疗法虽然卓有成效，但个体差异却很大，部分患者获得了显著的效果，但部分患者无效，而且与其他癌症疗法类似，它也有副作用，而且可能是严重的不良反应，甚至是危及生命的。这通常是由导致自身免疫反应过度活跃引起的。提高PD-L1单域抗体的亲和力将提高PD-L1单域抗体的特异性，高亲和力的PD-L1单域抗体将提升肿瘤的治疗与检测效果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，是在目前已有的突变技术上进行改进升级扬长避短，采用在CDRs采用无偏差、全覆盖的单点定点突变技术，并结合抗体高通量哺乳***表达体系，建立的一种高效率且更简便的抗体亲和力成熟***。
本发明的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种抗体亲和力成熟方法，所述方法能够筛选出高亲和力的抗体。
所述的方法涉及单点饱和突变技术和哺乳细胞高通量表达，所述的单点饱和突变技术通过等比的引物混合物对抗体全部CDRs区氨基酸进行无偏差全覆盖的单点饱和突变。
本发明中，将无偏差即18种氨基酸(20种氨基酸除去本身和半胱氨酸，半胱氨酸产生的二硫键会影响后续工艺)等概率出现，全覆盖即抗体的所有CDRs区的氨基酸都进行突变的突变技术和高通量的抗体哺乳***表达技术进行结合，有望建立更高效率且更简便的抗体亲和力成熟***。
具体来说，
本发明的称之为FCMES-AM的亲和力成熟方法，具体为CDR区全覆盖的单点饱和突变与哺乳***超高通量表达筛选***相结合的方法。
进一步地，所述的CDR区全覆盖的单点饱和突变的方法，具体为通过等比的引物混合物对抗体CDRs区的每一个氨基酸进行无偏差全覆盖的突变方法。
进一步地，所述的哺乳***超高通量表达筛选***的方法，具体步骤包括：1)使用96孔细胞培养板，每个孔只表达一个氨基酸突变的单一抗体，同时表达数千个微孔，覆盖CDR区的所有突变点；2)使用亲和力筛选ELISA方法，对所有表达的上清做亲和力筛选，得到高亲和力的突变热点。
进一步地，所述的哺乳***超高通量表达筛选***的方法，使用的表达筛选细胞为哺乳动物表达细胞，消除了常规展示***中展示***蛋白对抗体检测的影响。
哺乳***表达在蛋白的折叠，翻译后修饰以及密码子偏好等方面具有很多优势，这也使得哺乳***表达的抗体具有同人源抗体相同或者类似的修饰，且哺乳***表达的抗体被分泌至上清中，以脱离于细胞的形式独立存在，这也消除了常规展示***中展示***蛋白对抗体检测的影响。
进一步地，所述的亲和力筛选ELISA的方法，具体为通过均一性捕获表达上清中的抗体，以消除浓度差异的影响，进而实现通过显色差异来反映亲和力差异的一种ELISA方法。
进一步地，本发明所述的抗体亲和力成熟方法，包括如下步骤：
1)通过上述单点饱和突变技术构建抗体的突变子并验证；
2)将突变子重组至表达载体中；
3)高通量抽提质粒并转染哺乳动物细胞表达；
4)通过正交ELISA及夹心ELISA筛选突变热点；
5)通过易错PCR进行热点组合；
6)通过夹心ELISA对热点组合抗体进行相对亲和力排序；
7)选择亲和力提高的抗体进行表达并检测亲和力。
进一步地，所述步骤1)包括构建抗体的CDRs中的所有氨基酸的突变子，每个氨基酸的单点饱和突变具体过程如下：利用引物A1和引物A2扩增突变点前的抗体基因片段A，利用引物B1和引物B2引入突变并扩增突变点后的抗体基因片段B，其中引物B1与引物A2存在重叠序列，且引物B1包括无偏差的18种氨基酸的突变引物等比混合而成的引物，这18条引物在突变点处设计突变碱基：通过引物A2和B1的重叠序列将基因片段A和片段B进行拼接，通过带有重组臂的巢式PCR引物扩增VHH抗体基因片段，得到突变子。
进一步地，所述步骤2)中的表达载体可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。作为本发明的一种优选，表达载体可选pcDNA3.4，酶切位点为HindIII和BamHI。
进一步地，所述步骤3)中的表达细胞可采用真核细胞作为宿主细胞，优选哺乳动物细胞，进一步优选为人胚肾HEK293细胞。通过96孔细胞培养板整板表达实现高通量表达。
进一步地，所述步骤4)中的正交ELISA及夹心ELISA方法，通过正交ELISA来筛选包被人二抗浓度及抗原的浓度，筛选条件为信号值在0.3左右时所对应的包被人二抗浓度及抗原浓度，当有一个以上0.3左右的信号值时，选择人二抗浓度最低的值。夹心ELISA筛选明显高于母本信号值的突变热点。
进一步地，所述步骤5)中热点组合的方法为易错PCR，如果是全长抗体则构建为scFv的形式。筛选标准为明显高于母本信号值的突变热点组合。
进一步地，所述步骤7)中的表达细胞可采用真核细胞作为宿主细胞，优选哺乳动物细胞，进一步优选为人胚肾HEK293细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种高亲和力的抗人PD-L1单域抗体，所述单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的氨基酸序列为下述(1)-(15)中的任意一组：
(1)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CDR3；
(2)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CDR3；
(3)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的CDR3；
(4)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的CDR3；
(5)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的CDR3；
(6)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的CDR3；
(7)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的CDR3；
(8)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示的CDR3；
(9)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示的CDR3；
(10)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示的CDR3；
(11)氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示的CDR3；
(12)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的CDR3；
(13)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示的CDR3；
(14)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示的CDR3；
(15)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的CDR3。
优选地，所述的单域抗体的互补决定区CDR的氨基酸序列选择上述第(12)组或第(15)组.：
(12)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的CDR3；
(15)氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的CDR3。
优选地，上述所有CDRs的氨基酸序列，可以替换为与本发明的所述任意一个CDRs氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列，或任意一个CDRs的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
进一步地，所述单域抗体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42或SEQID NO：45所示。
优选地，所述单域抗体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：45所示。
在本发明的第三方面，提供了一种核酸，所述核酸编码如第二方面所述的抗体。
在本发明的第四方面，提供了一种重组载体，所述重组载体包含如第三方面所述的核酸。
可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明的抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
作为本发明的一种优选，表达载体为pcDNA3.4。
在本发明的第五方面，提供了一种转化体，所述转化体包含如第三方面所述核酸、和/或第四方面所述载体，能够表达如第二方面所述的抗体。
优选地，所述转化体可以采用真核细胞或原核细胞作为宿主细胞，优选哺乳动物细胞，进一步优选为人胚肾HEK293细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其包含如第二方面所述的抗体、和/或如第三方面所述核酸、和/或如第四方面所述载体、和/或第五方面所述转化体。
优选地，所述药物组合物中还可以包含药学上可接受的辅料，辅料可以是药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂或其它生物活性物质中的一种或几种。
在本发明的第七方面，提供了如第二方面所述的抗体、和/或如第三方面所述核酸、和/或如第四方面所述载体、和/或如第五方面所述转化体、和/或如第六方面所述组合物作为肿瘤免疫检查点抑制剂在制备治疗或缓解肿瘤的药物中的用途。所述的肿瘤可以是黑素瘤、肝细胞癌。PD1-PDL1免疫疗法是一种广谱的抗肿瘤方法，能够治疗多种类型的肿瘤疾病，有效改善患者总生存期。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
本发明中涉及的术语定义如下：
术语“抗体”，是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。
术语“重链”，是指免疫球蛋白中分子量较大的、含440个氨基酸的肽链。
术语“可变区”，是指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。
术语“互补决定区”，抗体的重链和轻链可变区内的高变区构成抗体分子的抗原结合点，因为抗原结合点是与抗原表位结构相互补的，所以高变区又称为抗体分子的互补决定区。
术语“骨架区”，互补决定区以外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区。
术语“单域抗体”，单域抗体(single domain antibody，sdAb)，又称纳米抗体，仅有一个重链可变区结构域(VHH)。该结构域最初发现于骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种抗体HCAb，通过基因手段，扩增出其中的VHH片段。单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
术语“亲和力成熟”，抗体体外亲和力成熟技术主要是模拟体内亲和力成熟过程，采取各种策略对抗体基因进行相应突变，构建突变抗体库，通过亲和筛选获得高亲和力抗体。
本发明具有如下技术效果：
1)本发明的亲和力成熟方法，具有提高抗体亲和力的技术效果，这一效果在实施例7得到了验证。
2)本发明的抗人PD-L1单域抗体与母本抗体相比，亲和力大幅提高，最多提高10倍以上，且亲和力成熟后的抗体仍具有阻断PD-L1与PD-1结合的活性，这一效果在实施例7和9得到了验证。
附图说明
图1为实施例1中的PCR过程。
图2为实施例1中的B378737图谱。
图3为实施例1中的pcDNA3.4图谱。
图4为实施例2中的质粒琼脂糖凝胶电泳图。
图5为实施例4的部分热点筛选结果。
图6为实施例6的相对亲和力排序ELISA结果。a和b都是亲和力成熟后的抗体的相对亲和力排序ELISA结果，是两板ELISA的结果。
图7为实施例7还原条件下的SDS-PAGE结果。
图8为实施例7的Biocore 8K亲和力检测结果。其中a为母本抗体B378737的结合动力曲线，b为亲和力成熟后的抗体B378737-ZH-1的结合动力曲线，c为亲和力成熟后的抗体B378737-ZH-4的结合动力曲线。
图9为实施例8的亲和力成熟过程总结。
图10为亲和力成熟抗体阻断活性验证。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
以抗人PD-L1单域抗体的亲和力成熟为例，详细说明本发明技术。
抗人PD-L1单域抗体(B378737)筛选过程如下：通过人PD-L1免疫羊驼(Vicugnapacos)后，提取羊驼PBMC细胞，获得抗体基因片段，基于噬菌体展示技术筛选到抗人PD-L1单域抗体(B378737)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示。
实施例1无偏差全覆盖单点饱和突变的突变子构建与验证
根据Kabat方案标注抗体B378737的FR区和CDR区，核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示，3个CDRs共有26个氨基酸，以CDR1第一个氨基酸即甘氨酸G突变为其他18种氨基酸为例介绍无偏差全覆盖单点饱和突变的过程。
图1为DNA全突变的PCR思路及过程，简单概述为：通过引物B378737-F1(A)/B37873-31-R1(A)扩增突变点前的片段A，通过引物B37873-31-F1(B)/B37873-R1(B)引入突变并扩增突变点后的片段B，其中B37873-31-F1(B)为18条引物等比混合而成的引物，这18条引物在突变点G处设计突变碱基，通过引物B37873-31-R1(A)和B37873-31-F1(B)的重叠序列将片段A和片段B进行拼接，通过带有重组臂的巢式PCR引物B37873-F2(C)/B37873-R2(C)扩增VHH抗体片段C。PCR引物序列见表2。
B378737质粒图谱见图2，是把B378737抗体的编码基因与载体pcDNA3.4连接后得到，酶切位点为not1/xba1。
将巢式PCR的产物割胶回收后与载体pcDNA3.4(HindIII/BamHI)进行重组，pcDNA3.4图谱见图3。
重组子用热激法转入TOP10的感受态中，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜，其他25个氨基酸的突变构建方法同上。
随机挑取一个氨基酸(如31G)突变构建后的88个单克隆送测序。测序后的结果分析见表3。测序结果表明送测的88个克隆包含了设计的全部18种氨基酸，突变覆盖率达到100％，***阳性率为90％,突变成功。
表2：PCR引物序列
表3 31G氨基酸突变结果
实施例2高通量质粒抽提
将CDRs区的26个氨基酸按如上方案突变后共得到26个转化平板，每个平板随机挑取88个单克隆至96深孔板的1-11列，12A-12D挑母本B378737的单克隆作为阳性对照，12E-12F在后续实验作为阴性对照，12G-12H在后续实验作为空白对照，再挑一整板B378737的单克隆用来做后续的正交ELISA。用600uL氨苄抗性的2×YT培养基220rpm培养过夜,次日通过碱裂解和醇沉法提取质粒，具体过程如下：4000r离心5min弃上清，每孔加入加有RNase A的悬浮液S1震荡均匀，每孔加裂解液S2使菌液澄清，每孔加入中和液S3震荡混匀，4000rpm离心10min，将每孔上清过滤后与异丙醇混匀，4000r离心10min后弃上清，每孔加入70％乙醇洗涤，4000r离心5min弃上清，风晾3-5min使乙醇挥发，每孔加入150uL去离子水溶解质粒，随机抽取5个孔的质粒测浓度并跑琼脂糖凝胶电泳，结果见图4，结果表明质粒条带完整且大小正确，质粒提取成功。
实施例3高通量表达
以下试剂体积均为对96孔细胞培养板的一个孔而言，用15uL Hybridoma培养基稀释10uL(约500ng)质粒，用Hybridoma培养基稀释转染试剂，将稀释后的转染试剂加入到稀释好的质粒中，15分钟后加入200uL传至第三代的HEK293细胞，Hybridoma和DMEM等比混合，1.2％FBS，37℃,5％CO2培养96h，随机抽取5个孔的表达上清测浓度，结果见表4。结果表明抗体平均表达量为10ug/mL，抗体表达成功。
表4表达上清种抗体浓度检测结果
样品名称 浓度ug/mL
B378737-31G-1 12.9
B378737-31G-8 8.2
B378737-31G-37 9.2
B378737-31G-81 8.5
B378737-31G-88 9.3
实施例4突变热点筛选
按照表5梯度稀释包被Goat-anti-human IgG Fc，4℃包被过夜，次日倒掉包被液，洗板5次，1％BSA室温封闭1h,洗板5次，每孔加入50uL B378737表达上清,室温孵育1h,洗板5次，加入梯度稀释的生物素标记的PDL1/His蛋白，室温孵育1h,洗板5次，加入SA-HRP，室温孵育0.5h，洗板10次，TMB显色4min后终止，读取450nm的吸光值，结果见表5。选取Goat-anti-human IgG Fc浓度为1.0ug/mL，Bio-PDL1浓度为4ng/mL作为后续热点筛选的所用的浓度，样本为突变子表达上清，其他过程同上，筛选出明显高于母本信号值的突变子质粒送测序，其中部分热点筛选结果见图5，表7中为热点及热点组合的测序结果，其中带下划线标记的为突变位置。
表5正交ELISA过程及结果
实施例5突变热点组合
将实施例4筛出的11条突变分子质粒等比混合，取20ng混合质粒作为模板按照表6过程进行易错PCR做热点组合，胶回收后构建重组载体，次日挑10板96孔单克隆，后续按照实施例2-4进行操作，将高于明显高于母本信号值的热点组合的质粒送测序，热点组合测序结果见表7。
表6易错PCR体系及程序
表7热点及热点组合的测序结果
/>
表7中，可变区的氨基酸序列是所有VHH的测序结果，下划线的氨基酸是热点，有两个及上的热点的就是组合。
实施例6相对亲和力排序
将实施例4筛选出的11个单点突变分子和实施例5筛出来的4个热点组合分子的表达上清做相对亲和力排序。具体过程为：1ug/mL包被Goat-anti-human IgG Fc，4℃包被过夜，次日倒掉包被液,洗板5次，1％BSA室温封闭1h，洗板5次，每孔加入50uL 2倍稀释的表达上清，室温孵育1h,洗板5次,加入梯度稀释的生物素标记的PDL1/His，首孔5ug/mL，3倍稀释，末孔空白，室温孵育1h,洗板5次，加入SA-HRP，室温孵育0.5h,洗板10次，TMB显色4min后终止显色，读取450nm的吸光值，结果见图6中的a和b。
从图6中的a和b可以看出：不论是单点突变的抗体还是多点突变的抗体，其相对亲和力排序均高于母本序列。
实施例7抗体分子的表达纯化及亲和力检测
挑出实施例6中相对亲和力最高的2条分子B378737-ZH-1、B378737-ZH-4进行通过HEK-293细胞小量表达和纯化，具体如下：将构建成功的重组载体转染至HEK-293细胞。取对数生长期HEK-293细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5×106cell/mL，37℃、5％CO2培养箱中600rpm培养，2h后进行转染。培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。分管收集，每管约500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。将高浓度蛋白吸至透析袋中透析，收集纯化好的抗体，其还原条件下的SDS-PAGE结果如图7。Biacore 8K检测结果见图8。从图8中的a、b和c可以看出，与母本抗体B378737相比，B378737-ZH-1、B378737-ZH-4的亲和力分别提高了10倍、12倍，可以认为亲和力成熟成功。
实施例8亲和力成熟方法总结
实施例8的亲和力成熟过程见图9。通过设计并合成无偏差的18种氨基酸的突变引物实现对CDR区所有氨基酸的单点饱和突变，通过哺乳***高通量表达及表达上清的ELISA检测实现对突变热点的筛选，通过易错PCR完成对突变热点的组合，最后通过抗体的表达纯化和生物分子相互作用分析***检测亲和力提高情况，整个过程由江苏百英生物科技有限公司的FC-MES亲和力成熟平***立开发并完成。
实施例9ELISA验证亲和力成熟后抗体的阻断活性
用ELISA验证实施例7亲和力成熟成功的抗体B378737-ZH-1、B378737-ZH-4的阻断活性并与母本抗体B378737作比较。具体过程为：5ug/mL包被PDL1/His，4℃包被过夜，次日倒掉包被液，洗板5次，1％BSA室温封闭1h，洗板5次，每孔加入100uL抗体，首孔100nM，3倍稀释，12个点，末孔空白，室温孵育1h，洗板5次，每孔加入100uL浓度为10μg/mL的生物素标记的PD1/His，室温孵育1h，洗板5次，加入SA-HRP，室温孵育0.5h，洗板10次，TMB显色4min后终止显色，读取450nm的吸光值，结果见图10。结果表表明亲和力成熟后的抗体仍具有阻断PDL1与PD1结合的活性，且阻断活性与母本抗体相当。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.高亲和力的抗人PD-L1单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的氨基酸序列为下述（1）-（15）中的任意一组：
（1）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CDR3；
（2）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CDR3；
（3）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的CDR3；
（4）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的CDR3；
（5）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的CDR3；
（6）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的CDR3；
（7）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的CDR3；
（8）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示的CDR3；
（9）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示的CDR3；
（10）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示的CDR3；
（11）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示的CDR3；
（12）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的CDR3；
（13）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示的CDR3；
（14）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示的CDR3；
（15）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的高亲和力的抗人PD-L1单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的互补决定区CDR的氨基酸序列选自第（12）组或第（15）组：
（12）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示的CDR3；
（15）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的高亲和力的抗人PD-L1单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：45所示。
4.根据权利要求3所述的高亲和力的抗人PD-L1单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：45所示。
5.核酸，其编码如权利要求1-4任意一项所述的抗人PD-L1单域抗体。
6.重组载体，其含有如权利要求5所述的核酸。
7.转化体，其含有如权利要求5所述的核酸或如权利要求6所述的重组载体。
8.如权利要求1-4所述抗人PD-L1单域抗体、和/或如权利要求5所述核酸、和/或如权利要求6所述重组载体、和/或如权利要求7所述转化体在制备治疗或缓解肿瘤的药物中的用途。
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