CN113150154B

CN113150154B - 抗人pdl1单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN113150154B
Application number: CN202110407095.9A
Authority: CN
Inventors: 陈明久; 马志清; 彭则羽
Original assignee: Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
Current assignee: Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113150154A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人PDL1单克隆抗体及其应用，同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。本发明能特异识别人PDL1的单克隆抗体，该抗体与人PDL1结合的亲和力强于现有抗人PDL1单克隆抗体，序列新颖。

Description

抗人PDL1单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及了一种高亲和力且具有功能性的抗人PDL1的单克隆抗体或抗体片段。本发明同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。还提供了包括本发明抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体、药物组合物以及诊断和治疗方法。

背景技术

程序性死亡配体1(PD-L1)，也称为分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)，是一种40kDa的I型跨膜蛋白。PDL1是PD-1的表面糖蛋白配体，PD-1是由活化的T细胞和B细胞表达的关键免疫检查点受体，并介导免疫抑制。PDL1与慢性感染、妊娠、同种异体移植、自身免疫性疾病和癌症期间的免疫***反应的抑制有关。在抗原呈递细胞和人类癌细胞，例如头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤和脑瘤、甲状腺、胸腺、食道、肺、乳腺、胃肠道、结肠直肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺皮质、膀胱、尿路上皮、卵巢和皮肤上，都发现了PDL1(Katsuya Y.et al.(2015)."Immunohistochemical status of PD-L1 in thymoma and thymic carcinoma".Lung Cancer.88(2):154–159；Nakanishi J.et al.(2007)."Overexpression of B7-H1(PD-L1)significantly associates with tumor grade and postoperative prognosisin human urothelial cancers".Cancer Immunol Immunother.56(8):1173–1182；NomiT.et al.(2007)."Clinical significance and therapeutic potential of theprogrammed death-1ligand/programmed death-1pathway in human pancreaticcancer".Clin Cancer Res.13(7):2151–2157；Fay AP et al.(2015)."Programmed deathligand-1expression in adrenocortical carcinoma:an exploratory biomarkerstudy".J Immunother Cancer.3:3；Strome SE et al.(2003)."B7-H1blockade augmentsadoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma".Cancer Res.63(19):6501–6505；Jacobs JF.et al.(2009)."Regulatory T cells and the PD-L1/PD-1pathway mediate immune suppression in malignant human brain tumors".NeuroOncol.11(4):394–402；Wilmotte R.et al.(2005)."B7-homolog 1expression by humanglioma:a new mechanism of immune evasion".Neuroreport.16(10):1081–1085)。PDL1在正常组织中很少表达，但在肿瘤部位可诱导表达(Dong H.et al.(2002)."Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:apotential mechanism of immuneevasion".Nat Med.8(8):793–800；Wang.et al.(2016)."PD-L1 expression in humancancers and its association with clinical outcomes".Onco Targets Ther.9:5023–5039)。PDL1通过与PD-1结合而下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman.et al.(2000)."Prolactin:structure,function,and regulation of secretion".Physiol Rev.80(4):1523-631；Latchman.et al.(2001)."PD-L2 is a second ligand for PD-1and inhibitsT cell activation".Nat Immunol.2(3):261-268)。由PDL1激活的PD-1可能为肿瘤的发展和生长提供免疫耐受的环境。PDL1还通过与另一种受体B7.1(B7-1，CD80)相互作用来负调节T细胞功能。

PDL1/PD-1相互作用的抑制能够提供有效的抗肿瘤活性。已知多种抗PDL1的抗体(例如WO 2013/079174和WO 2017/118321)，并且许多破坏PD-1信号传导的抗体已进入临床开发阶段。这些抗体属于以下两个主要类别：靶向PD-1的抗体(nivolumab,Bristol-MyersSquibb；pembrolizumab,Merck,Whitehouse Station,NJ；pidilizumab,CureTech,Yavne,Israel)和靶向PDL1的抗体(MPDL3280A,Genentech,South San Francisco,CA；MEDI4736,MedImmune/AstraZeneca；BMS-936559,Bristol-Myers Squibb；MSB0010718C,EMD Serono,Rockland,MA)(Postow MA.et al.(2015)."Immune Checkpoint Blockade in CancerTherapy".J Clin Oncol.33(17):1974-82)。靶向PDL1与靶向PD-1可能导致不同的生物学效应。PD-1抗体可防止PD-1与它的两个配体PDL1和PDL2相互作用。尽管PD-1与PDL2相互作用的影响仍然未知，但PDL1抗体不会阻止PD-1与PDL2相互作用。然而，PDL1抗体不仅会阻止PDL1与PD-1的相互作用，还会阻止与B7-1的相互作用(Butte MJ.et al.(2007)."Programmed death-1ligand 1interacts specifically with the B7-1 costimulatorymolecule to inhibit T cell responses".Immunity.27(1):111-122)，这被认为会对T细胞产生负信号。阻断PDL1已显示出令人鼓舞的早期数据，目前正在测试四种临床抗PDL1mAb：atezolizumab和MEDI4736(均为人IgG1的Fc空变体)、MSB001078C(IgG1)和BMS-936559(IgG4)(Chester C.et al.(2016)."4-1BB agonism:adding the accelerator to cancerimmunotherapy".Cancer Immunol Immunother.65(10):1243-8)。

迄今为止，还没有证明令人满意的方法能够在癌症患者中诱导有效的免疫反应。在该领域中需要创造改善的PDL1/PD-1相互作用的治疗调节剂和方法以克服癌症患者中观察到的免疫抑制机制。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种抗人PDL1单克隆抗体及其用途，该抗体具有高亲和力和功能性，其优于现有的抗人PDL1单克隆抗体。

为了达到上述目的，本发明提供一种抗人PDL1单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：重链和轻链；

所述的重链和轻链均包括可变区，所述可变区包括互补决定区；

所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3表示；

所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3表示；

所述的CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。

重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示。

一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人PDL1单克隆抗体；

该核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体的轻链可变区。

一种表达载体，该表达载体含有所述的核苷酸分子。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述的表达载体。

一种抗人PDL1单克隆抗体的制备方法，该制备方法包含如下步骤：

步骤1：制备含有表达所述的抗PDL1单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；

步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；

步骤4：分离纯化，获得所述的抗体。

本发明还涉及包括前述的抗人PDL1单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为鼠IgG的恒定区，优选地为IgG2的恒定区。

所述的重链和轻链都包括恒定区，重链恒定区如SEQ ID NO：11所示；轻链恒定区如SEQ ID NO：12所示。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明能特异识别人PDL1的单克隆抗体，该抗体与人PDL1结合的亲和力强于现有抗人PDL1单克隆抗体，序列新颖。

附图说明

图1为捕获ELISA测定抗体对人PDL1蛋白的结合能力；

图2为间接ELISA测定抗体对食蟹猴PDL1蛋白的交叉反应；

图3为流式细胞术测评抗体与细胞膜表面PDL1蛋白的结合；

图4为配体受体结合阻断ELISA；

图5为参照抗体阻断ELISA；

图6为流式细胞术测评抗体阻断PD1蛋白与细胞膜表面PDL1蛋白的结合；

图7为PDL1单克隆抗体功能测评实验。

具体实施方式

下文将通过实施例的方式进行本发明进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。

一、抗体的获得：

实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗PDL1的小鼠单克隆抗体

1.1动物免疫

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为重组人PDL1-Fc蛋白(公司自产，***氨基酸序列为FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)。使用重组人PDL1带his标签的蛋白(ACRO,Cat#PD1-H5229)作为测定血清效价和杂交瘤筛选的检测抗原。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5ml EP管中，振荡器混匀。用PBS配制人PDL1-Fc抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液，而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠进行腹腔注射，终免后进行细胞融合。

1.2杂交瘤融合和筛选

细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC,Cat#CRL-1581)处于对数生长期。处死免疫小鼠于无菌环境取脾，根据文献中方法使用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；Kohler G,and Milstein C,"Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefinedspecificity,"Nature,256:495-497(1975))。融合后的细胞铺96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用人PDL1-Fc蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下，用60μl含有1μg/ml的山羊抗小鼠IgG F(ab’)₂特异性片段(Jackson Immunoresearch Laboratories,Inc.,Cat#115-005-072)的PBS溶液包被酶标板，4℃过夜。而后用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1xPBST)洗板1次后，加入200μl/孔含有5％脱脂奶粉的PBST溶液，置于37℃封闭2h。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清，37℃孵育40min，而后洗板4次。加入100μl/孔的生物素标记人PDL1 Fc蛋白溶液(1：1000稀释在含2.5％脱脂奶粉的1x PBST中)，37℃孵育40min后洗板4次，拍干。而后以100μl/孔加入1：5000稀释在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,Cat#016-030-084)，37℃孵育40min后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)显色底物，室温显色5-15min，而后用1M的硫酸溶液终止，测定450nm处各孔的吸光值。挑出ELISA结合阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别PDL1抗原的杂交瘤(结果见表1，其中D7D4A4B6是本发明得到的杂交瘤，该杂交瘤表达本发明所制得的抗人PDL1单克隆抗体)，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。而后小量表达生产小鼠单克隆抗体，纯化后的抗体进行下一步的功能测评分析。

表1融合杂交瘤上清检测ELISA数据

二、体外分析方法：

实施例2用于测定PDL1单克隆抗体功能活性的体外分析方法

2.1基于捕获ELISA测定抗体的结合能力

用1xPBS配制山羊抗小鼠IgG F(ab')₂特异的二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,Cat#115-005-072)，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37℃包被2h。包被结束后，用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1x PBST)洗板1次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的1x PBST溶液置于37℃封闭2h。再次洗板，加入100μl/孔的稀释抗体溶液以及PDL1-Benchmark(即Tecentriq抗体，购自Roche)后，37℃孵育40min，而后洗板4次。以100μl/孔加入生物素标记人PDL1 Fc蛋白溶液(1:10000稀释在含2.5％脱脂奶粉的1xPBST中)，37℃孵育40min，而后洗板4次。以100μl/孔加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,Cat#016-030-084)，37℃孵育40min，而后洗板4次，拍干。添加100μl/孔的ELISA显色底物TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)，室温显色3-10min，而后用1M的硫酸溶液终止显色，测定450nm处各孔的吸光值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果如图1。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体能够识别人PDL1抗原，且结合活性与PDL1-Benchmark相当。

2.2间接ELISA测定抗体与食蟹猴PDL1抗原的交叉反应能力

用1x carbonate/bicarbonate buffer配制食蟹猴PDL1抗原(Sino BiologicalInc,Cat#90251-C08H)，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37℃包被2h。包被结束后，用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1x PBST)洗板4次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的1x PBST溶液置于37℃封闭2h。再次洗板，加入100μl/孔的梯度稀释抗体溶液后，37℃孵育40min，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Fcγ特定片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,Cat#115-035-071)，37℃孵育40min，而后洗板4次，拍干。添加100μl/孔的ELISA显色底物TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)，室温显色3-10min，而后用1M的硫酸溶液终止显色，测定450nm处各孔的吸光值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果如图2。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体与食蟹猴PDL1抗原发生交叉反应，且结合活性优于PDL1-Benchmark。

2.3流式细胞术测评抗体结合细胞膜表面PDL1抗原的结合能力

收集处于对数生长期的膜表面过表达人PDL1蛋白的GS-C2/PDL1细胞系(Genscript)，用PBS洗细胞2次后用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS溶液)重悬细胞。调节密度，以1x10⁵个细胞/孔铺板于96孔U底板中，300g离心5min，倾去上清，添加以10％FBSDMEM梯度稀释的PDL1抗体溶液及对照抗体后，4℃孵育40min。300g离心5min，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次，添加100μL/孔R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')₂FragmentGoat Anti-Mouse IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch,Cat#115-116-148，1：1000稀释)，4℃孵育40min后，300g离心5min，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次。而后每孔加100μL的PBS重悬，吹匀细胞后上机检测。使用BD公司Canto II型号流式细胞仪测定每孔细胞的平均荧光强度MFI值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体结合细胞的EC₅₀浓度值(即达到该抗体最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值)，结果如图3。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体可特异性结合细胞膜表面的人PDL1蛋白，且结合活性与PDL1-Benchmark相当。

2.4PDL1抗体阻断活性检测

2.4.1配体受体结合阻断ELISA

通过竞争ELISA方法测评PDL1抗体对PD1/PDL1结合的阻断能力。简述如下，用1xcarbonate/bicarbonate buffer配制人PDL1 Fc抗原，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37℃包被2h。包被结束后，用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1x PBST)洗板1次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的1x PBST溶液置于37℃封闭2h。再次洗板，加入100μl/孔的梯度稀释抗体溶液后，37℃孵育40min，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：4000稀释的生物素标记的人PDL1 Fc抗原，37℃孵育40min，洗板4次，拍干。而后以100μl/孔加入1∶10000稀释在1x PBST溶液中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育40min后，洗板4次,拍干。添加TMB显色和1M硫酸终止反应，测定450nm处的吸收值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体阻断PD1/PDL1结合的IC50浓度值，结果如图4。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体能够特异性阻断PD1与PDL1的结合，且其阻断能力与PDL1-Benchmark相当。

2.4.2参照抗体阻断ELISA

通过竞争ELISA方法测评PDL1抗体阻断参照抗体/PDL1抗原结合的阻断能力。简述如下，用1x PBS配制参照抗体(PDL1-Benchmark)，使其终浓度为1μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4℃包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1x PBST)洗板1次后，加入200μl/孔的含5％脱脂奶粉的PBST溶液，置于37℃封闭2h，再次洗板4次。把PDL1抗体或对照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人PDL1 Fc蛋白溶液中，配好后室温预孵40min。而后把已孵育的抗体和PDL1 Fc biotin的溶液以100μl/孔加到包被好参照抗体的板上，37℃孵育40min后，再次洗板4次。而后以100μl/孔加入1∶10000稀释在含5％脱脂奶粉的1x PBST溶液中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素中，37℃孵育40min，洗板4次,拍干。添加TMB显色和1M硫酸终止反应，测定450nm处的吸收值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体阻断参照抗体与PDL1结合的IC₅₀浓度值，结果如图5。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体能够特异性阻断PDL1蛋白结合其参照抗体PDL1-Benchmark，且其阻断能力与PDL1-Benchmark相当，提示本发明的D7D4A4B6单克隆抗体结合抗原的表位和PDL1-Benchmark相近。

2.4.3流式细胞术测评抗体阻断PD1蛋白与细胞膜表面PDL1蛋白的结合

收集处于对数生长期的膜表面过表达人PDL1蛋白的GS-C2/PDL1细胞系(Genscript)，用PBS洗细胞2次后，用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS溶液)重悬细胞。调节密度，以1x10⁵个细胞/孔铺板于96孔U底板中，300g离心5min，倾去上清，把稀释在FACS缓冲液中的PDL1抗原及对照抗体以100μl/孔加入到膜表面过表达人PDL1蛋白的GS-C2/PDL1的细胞板上。4℃孵育40min，300g离心5min，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次，加入100μL/孔生物素标记的人PD1 Fc(1:1500稀释在FACS缓冲液中)。4℃孵育40min后，300g离心5min，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次，每孔加入100μL的SA-PE(JacksonImmunoresearch,Cat#016-110-084，1∶500稀释)，4℃孵育40min，300g离心5min，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次。而后每孔加100μL的PBS重悬，吹匀细胞后上机检测。使用BD公司Canto II型号流式细胞仪测定每孔细胞的平均荧光强度MFI值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体阻断PD1/PDL1结合的IC50浓度值，结果如图6。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体可特异性阻断人PD1蛋白结合细胞膜表面的人PDL1配体，其阻断能力与PDL1-Benchmark相当，提示本发明的D7D4A4B6是与参照抗体相当且具有PD1/PDL1阻断活性的功能抗体。

2.5PDL1单克隆抗体功能测评实验

收集处于对数生长期的GS-C2/PDL1细胞系(Genscript，抗原呈递细胞)，用DPBS(Hyclone，Cat#SH30028.02)洗细胞后，完全生长培养基(购自Gibco，含10％胎牛血清的F-12K培养基)重悬细胞。调节密度，以20μl/孔(约1x10⁴个细胞)铺板于384-well assayplates，37℃，5％CO₂培养箱过夜培养。次日，准备处于对数生长期的GS-J2/PD1细胞系(Genscript，效应细胞)，200g离心5min，倾去上清。用assay buffer(购自Gibco，含1％胎牛血清的RPMI 1640培养基)重悬细胞。调节细胞密度为7.5x10⁵细胞/ml。弃去PDL1细胞上清，加入20μl PDL1抗体或对照抗体(梯度稀释在2倍浓度的assay buffer)以及20μlPD1细胞(7.5x10⁵细胞/ml)，37℃，5％CO₂培养箱培养6h。培养结束后，移出384孔细胞培养板至室温。5-10min后，每孔加入30μl luciferase substrate reagent。室温静置5min，使用PHERAStarPlus仪器检测生物发光强度。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果如图7。从图中可以看出，本发明的D7D4A4B6单克隆抗体能够逆转GS-J2/PD-1细胞中PD-1-PD-L1相互作用诱导的萤光素酶表达的降低，其效果与PDL1-Benchmark相当。

实施例3 DNA克隆和测序，抗PDL1小鼠单克隆抗体的可变区测序

使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme，Cat#RC101)从培养的小鼠单克隆细胞株中提取总RNA。过程简述如下，离心收集1.5x10⁶的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。向细胞沉淀中加入500μl Buffer RL1，并吹打混匀。将处理好的细胞转移到gDNA-Filter Columns中(gDNA-Filter Columns已放入收集管中)，13,000g室温离心2min，保留收集管内上清液。加入1.6倍体积Buffer RL2，轻柔混匀。混合液转移至RNAPureColumns中，13,000g室温离心1min，弃废液。向RNAPure Columns中加入500μl Buffer RW1，13,000g室温离心1min，弃废液。加入700μl Buffer RW2，13,000g室温离心1min，弃废液。再加入700μl Buffer RW2，13,000g室温离心1min，弃废液。13,000g离心2min，以彻底去RNAPure Columns中残留的Buffer RW2。将吸附柱转移至新的RNase-free CollectionTubes 1.5ml离心管中，向吸附柱中央部位悬空滴加50μl的RNase-free ddH2O。室温放置2min，13,000g室温离心1min，洗脱RNA。

紧接着，选用Takara的逆转录cDNA试剂盒(Cat#6210A)把总RNA变为CDNA。实验体系配制如下，5μl总RNA+0.5μl Oligo(dT)Primer+0.5μl Random 6mers+1.0μl dNTPMixture+3.0μl RNase-free ddH₂O(共10μl)。先置于65℃5min预变性，而后放冰上2min。进一步加入4μl 5x PrimeScript II Buffer+0.5μl RNase Inhibitor+1.0μl PrimeScriptII RTase+4.5μl RNase-free ddH₂O(共20μl体系)，配好后混匀，使用PCR仪运行40℃50min后，转70℃运行10min，完成cDNA合成。

cDNA进一步在3’端加Poly G，反应体系配制如下：5μl cDNA+33.5μl ddH₂O+5μl10x TdT Buffer+5μl CoCl+1μl dGTP+0.5μl Terminal TransPerase(共50μl体系)，配好后混匀，使用PCR仪运行37℃30min后，转70℃10min，完成Poly G加尾。

进一步，以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，选用诺唯赞的试剂盒(Cat#P525-03)，配制PCR反应体系：25μl 2x Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)+2.0μl BSJ-Pri3 AntisenseP-mIgG1(核苷酸序列为GCATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTT)+2.0μl BSJ-Pri1Universal C1(核苷酸序列为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATCCCCCCCCCCCCCCCC)+1.25μl加Poly G尾的cDNA+19.75μl ddH₂O(共50μl体系)。对于扩增抗体轻链可变区序列，先用Takara的试剂盒(Cat#R010A)，配制PCR反应体系：10μl 5x PrimeSTAR Buffer+0.5μl PrimeSTAR+1.25μl BSJ-Pri1 Universal C1(核苷酸序列为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATCCCCCCCCCCCCCCCC)+1.25μl BSJ-Pri19(核苷酸序列为GCACACGACTGAGGCACCTCCAGATGTT)+4μl aberrant-L-R2(核苷酸序列为TCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGC)+4μl dNTP+1.25μl加Poly G尾的cDNA+27.75μl ddH₂O(共50μl体系)。

抗体重链可变区PCR扩增的温度循环如下：

98℃*5min+(98℃*10s+62℃*10s+72℃*1min)*2Cycle+

(98℃*10s+60℃*10s+72℃*1min)*4Cycles+

(98℃*10s+58℃*10s+72℃*1min)*10Cycles+

(98℃*10s+56℃*10s+72℃*1min)*20Cycles+

72℃*10min+4℃*∞

抗体轻链可变区PCR扩增的温度循环如下：

98℃*5min+(98℃*10s+64℃*10s+72℃*1min)*2Cycle+

(98℃*10s+62℃*10s+72℃*1min)*6Cycles+

(98℃*10s+60℃*10s+72℃*1min)*12Cycles+

(98℃*10s+58℃*10s+72℃*1min)*16Cycles+

72℃*10min+4℃*∞

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约500bp，Vkappa轻链约500bp)，用TIANGEN的凝胶DNA回收试剂盒(Cat#DP209-03)进行DNA的抽提。简述如下：凝胶称重，加入等倍体积溶液PN，而后50℃孵育10min直到凝胶完全溶解。将所得的溶液移至CA2吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置至少2min，12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。加入600μl的漂洗液PW到柱中，而后12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。再次加入600μl的漂洗液PW到柱中，静置5min，12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。并再次12,000rpm室温离心2min，去除柱中液体残留，并室温放置至少2min以彻底晾干残留液体。吸附柱放到一个干净的离心管，加入35μl的洗脱缓冲液EB，室温放置至少2min。12,000rpm离心2min，获得制备的DNA样品。纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列如表2所示，PDL1小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列如表3所示，PDL1小鼠单克隆抗体的核苷酸序列如表4所示。

表2 PDL1小鼠单克隆抗体的可变区氨基酸序列和CDR区

表3 PDL1小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列如下：

表4 PDL1小鼠单克隆抗体的编码DNA序列如下：

综上所述，本发明的能特异识别人PDL1的单克隆抗体A1E7F8G7，该抗体与人PDL1结合的亲和力更强，序列新颖，且能特异阻断人PD1和人PDL1结合，是新的抗人PDL1的单克隆功能抗体。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司

<120> 抗人PDL1单克隆抗体及其用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Phe Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly His Gly Phe Tyr Ala Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ala Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Tyr Thr Met His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Phe Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly His Gly Phe Tyr Ala Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ala Tyr Leu His

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctgctgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgccagg cttctggata cacattcact gactacacca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaagg gccttgagtg gattggaggt tttaatccta actatggtac tactagctac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctcaag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgt aagaggacat 300

ggtttctacg cctatgttat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgca gggccagcca gagaattagc gcctatctac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcattctca gtatcaacag tgtggaacct 240

gaagatgtcg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 11

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

85 90 95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

130 135 140

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

165 170 175

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

180 185 190

Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

195 200 205

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

210 215 220

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys

245 250 255

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser

260 265 270

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser

290 295 300

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly

305 310 315 320

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 13

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60

tcctccgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 120

tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180

ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 240

acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300

gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360

cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420

atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480

gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540

catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 600

gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 660

atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 720

ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780

ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840

aaggacaccg caccagtcct ggactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 900

atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960

ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgactaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

Claims

1.一种抗人PDL1单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含重链和轻链；

所述重链和轻链均包括可变区，所述可变区包括互补决定区；

所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的抗人PDL1单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的抗人PDL1单克隆抗体，其特征在于，所述的重链和轻链都包括恒定区，重链恒定区如SEQ ID NO：11所示；轻链恒定区如SEQ ID NO：12所示。

4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1~3任一项所述的抗人PDL1单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列包括SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10；

序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体的轻链可变区。

6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。

8.根据权利要求1~3任一项所述抗人PDL1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

制备含有表达如权利要求1~3任一项所述的抗人PDL1单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

用得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；

分离纯化，获得抗人PDL1单克隆抗体。

9.包括权利要求1所述的抗人PDL1单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。