JP2020178694A - Cell compositions derived from dedifferentiated and reprogrammed cells - Google Patents

Abstract

To provide transplant devices comprising pancreatic cell compositions induced from dedifferentiated and reprogrammed pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells, and methods for producing pancreatic cell culture compositions in vitro.SOLUTION: Disclosed is a transplant device comprising a semipermeable membrane and a population of pancreatic progenitor cells derived from mammalian dedifferentiated and genetically reprogrammed pluripotent stem cells enclosed in the semipermeable membrane. Also disclosed is an in vitro method for producing primate pancreatic progenitor cells comprising: (a) obtaining a population of primate cells comprising foregut endodermal cells; (b) culturing the population of primate cells comprising the foregut endodermal cells in a medium containing an ErbB receptor tyrosine kinase activating agent thereby producing primate pancreatic progenitor cells.SELECTED DRAWING: None

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第１３／７６１，０７８号、
表題ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦＥ
ＲＥＮＴＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬＳの優先権を主張し、それは
、２０１０年４月２２日に出願された米国特許出願第１２／７６５，７１４号、表題ＣＥ
ＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴ
ＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬＳの一部継続出願であり、それは、米
国特許法第１１９（ｅ）条の下で、２００９年４月２２日に出願された米国特許仮出願第
６１／１７１，７５９号、表題ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＤＥＲＩＶＥＤ
ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬＳ
の優先権を主張する非仮出願であり、それらの開示は参照により完全に本明細書に組み込
まれる。 (Cross-reference of related applications)
This application is filed on February 6, 2013, U.S. Patent Application No. 13 / 761,078,
Title CELL COMPOSITIONS DRIVEED FROM DEDIFFE
Claims priority to RENTIATED REPROGRAMMED CELLS, which is U.S. Patent Application No. 12 / 765,714 filed April 22, 2010, entitled CE.
LL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENT
It is a partial continuation application of IATED REPROGRAMMED CELLS, which is a US Patent Provisional Application No. 61 / 171,759, entitled CELL, filed April 22, 2009 under Article 119 (e) of the US Patent Act. COMPOSITIONS DRIVEED
FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS
These are non-provisional applications claiming priority, and their disclosure is incorporated herein by reference in its entirety.

配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１３年
１月２８日に作成された、ＣＹＴＨＥＲＡ０６８Ｐ１．ＴＸＴという名称のサイズが８．
９２Ｋｂのファイルで提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照により本明
細書に完全に組み込まれる。 Sequence Listing This application is filed with an electronic format sequence listing. The sequence listing was created on January 28, 2013, CYTHERA068P1. The size of the name TXT is 8.
It is provided as a 92Kb file. Information on the electronic format of the sequence listing is fully incorporated herein by reference.

本発明は、一般に、細胞培養物の単離、維持および使用に関する。より具体的には、本
発明は、人工多能性幹細胞から導出された細胞組成物に関する。 The present invention generally relates to the isolation, maintenance and use of cell cultures. More specifically, the present invention relates to cell compositions derived from induced pluripotent stem cells.

多能性細胞の重要な用途は、細胞療法でのそれらの使用である。多能性幹細胞には、ヒ
ト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞が含まれるが、これらに限定され
ない。さらに他のタイプの多能性細胞が存在し、例えば、脱分化したマウスおよびヒトの
幹細胞、すなわち分化した体性成体細胞は脱分化して多能性様幹細胞になる。ＥＳ細胞に
類似した多能性および成長能力を有する細胞を確立するために誘導されるこれらの脱分化
した細胞は、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」、「胚性幹細胞様細胞」、「ＥＳ様細胞」
またはそれらの同等物とも呼ばれる。そのような細胞は、潜在的に存続可能な代替多能性
細胞である。ｉＰＳ細胞の治療的適用には、糖尿病および他の疾患を治療するための前臨
床研究でこれらの細胞が安定であり、適当な安全性プロファイルを示すことを実証するこ
とが必要である。多能性状態への分化したヒト体性細胞のリプログラミングは、患者およ
び疾患特異的幹細胞を可能にする。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．らＣｅｌｌ、１〜１２、２
００７およびＪｕ，Ｊ．らＳｃｉｅｎｃｅ ２００７を参照されたい。Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉらおよびＪｕらは、ｉＰＳ細胞を生成するために４つの遺伝子を成体および胎児／新生
児の線維芽細胞に各々導入した：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−ｍｙｃ、Ｔａ
ｋａｈａｓｈｉら；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８、Ｊｕら。いずれ
の場合にも、ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳ細胞形態、マーカー発現、長期にわたる増殖、正常な
核型および多能性などの、ｈＥＳ細胞の一部の特徴を有していた。 An important use of pluripotent cells is their use in cell therapy. Pluripotent stem cells include, but are not limited to, human embryonic stem (hES) cells and human embryonic reproductive (hEG) cells. Yet other types of pluripotent cells are present, for example, dedifferentiated mouse and human stem cells, i.e. differentiated somatic adult cells, dedifferentiate into pluripotent-like stem cells. These dedifferentiated cells, which are induced to establish cells with pluripotency and growth potential similar to ES cells, are "induced pluripotent stem (iPS) cells", "embryonic stem cell-like cells", "ES-like cells"
Or they are also called their equivalents. Such cells are potentially viable alternative pluripotent cells. Therapeutic application of iPS cells requires demonstrating that these cells are stable and exhibit a suitable safety profile in preclinical studies for the treatment of diabetes and other diseases. Reprogramming of differentiated human somatic cells into pluripotent states enables patient and disease-specific stem cells. Takahashi, K.K. Cell, 1-12, 2
007 and Ju, J. et al. See Science 2007. Takahash
i et al. And Ju et al. Introduced four genes into adult and fetal / neonatal fibroblasts, respectively, to generate iPS cells: Oct4, Sox2, Klf4 and c-myc, Ta.
kahashi et al .; Oct4, Sox2, Nanog and Lin28, Ju et al. In each case, iPS cells had some characteristics of hES cells such as hES cell morphology, marker expression, long-term proliferation, normal karyotype and pluripotency.

ｉＰＳ細胞は関連する倫理論争なしで細胞療法に基づく再生医療を提供することができ
るが、ｉＰＳ細胞の分化特性、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化潜在能力および分化効率
はなお不明であり、ｉＰＳ細胞のための指向性分化方法は実証されていない。したがって
、ｉＰＳ細胞の詳細な分化特性および指向性分化効率を判定し、実証する必要性がある。 Although iPS cells can provide regenerative medicine based on cell therapy without related ethical controversy, the differentiation characteristics of iPS cells, such as in vitro differentiation potential and efficiency, are still unknown and for iPS cells. No directional differentiation method has been demonstrated. Therefore, it is necessary to determine and demonstrate the detailed differentiation characteristics and directional differentiation efficiency of iPS cells.

本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞、例えば人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞な
どの脱分化したリプログラミングされた細胞から導出された細胞組成物を提供する。 The embodiments described herein provide cell compositions derived from pluripotent cells, such as dedifferentiated reprogrammed cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells.

一実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養
物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は胚体内胚葉細胞であり、胚
体細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、
胚体内胚葉細胞は、それから導出される腸管または器官の細胞に分化することができる多
分化能細胞である。 One embodiment provides a composition comprising human cells and a method of making an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are embryonic embryonic follicle cells and the embryonic cells are dedifferentiated. Derived from genetically reprogrammed cells. In one aspect
Germ layer cells in the embryo are pluripotent cells that can differentiate into cells of the intestinal tract or organ derived from it.

別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培
養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメオボ
ックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の前腸内胚葉細胞であり、ＰＤＸ１陽性の前腸内胚葉細胞
は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ
１陽性の前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６に関して共
陽性である。 Another embodiment provides a composition comprising human cells and a method of making in vitro cell cultures comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are pancreatic-duodenal homeobox factor 1 (PDX1) positive. Preintestinal endoderm cells, PDX1-positive preintestinal endoderm cells are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX
1-positive foregut endoderm cells are co-positive for PDX1, SOX9, PROX1 and HNF6.

さらなる実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細
胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメ
オボックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の膵臓前駆細胞であり、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞
は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ
１陽性の膵臓前駆細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して共陽性である。 A further embodiment provides a composition comprising human cells and a method of making an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are pancreatic-duodenal homeobox factor 1 (PDX1) positive pancreas. Progenitor cells, PDX1-positive pancreatic progenitor cells, are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX
1-positive pancreatic progenitor cells are co-positive for PDX1 and NKX6.1.

さらなる別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％はＮｅｕｒｏｇｅ
ｎｉｎ３（ＮＧＮ３）陽性の内分泌先駆細胞であり、ＮＧＮ３内分泌先駆細胞は脱分化し
た遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＮＧＮ３陽性の内
分泌先駆細胞は、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４およびＮＫＸ２．２に関して共陽性である。
本明細書に記載される細胞培養組成物のさらなる実施形態は、脱分化した遺伝的にリプ
ログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナ
ーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物を含む。
本明細書に記載される追加の実施形態は、インスリンを生成する方法に関する。一部の
そのような実施形態では、この方法は、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされ
た細胞から導出された少なくとも前腸内胚葉細胞培養物および／または少なくともＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ
ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む膵臓内
胚葉細胞集団を生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の膵臓内胚葉細胞集団または
ステップ（ａ）の細胞亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリ
ン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してイ
ンスリンを分泌する、ステップとを含む。
本明細書に記載されるさらなる他の実施形態は、インスリンを生成する方法であって、
（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメ
ンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップ
と、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地で
ステップ（ａ）の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉
細胞および／または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ
）ステップ（ｂ）の細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、
それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと
、（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞集団またはステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ ｖｉｖｏ
で移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリ
ン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップとを含む方法に
関する。本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少な
くともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細
胞を含む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それによ
り、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞
集団を生成することに関する。
本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少なくとも
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含
む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤
と接触させ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟
することが可能な細胞集団を生成することに関する。
本明細書で使用される場合、語句「少なくとも前腸内胚葉細胞」、「少なくともＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉細胞」および「少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」は、細胞集団
の細胞のいくつかまたは一部が、膵島細胞へのそれらの分化の中で、ｉＰＳＣから前腸内
胚葉細胞またはそれ以上、ｉＰＳＣからＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞またはそれ以上、お
よび／またはｉＰＳＣからＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞またはそれ以上に分化しているこ
とを意味する。
本明細書で使用される場合、細胞集団の細胞に言及するとき、語句「いくつか」および
／または「一部」は、細胞集団が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５
％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少な
くとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６
０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％を超える
指定された細胞型の細胞を含むことを意味する。 Yet another embodiment is a composition comprising human cells and an in vitro comprising human cells.
o Provides a method for making cell cultures, at least about 15% of human cells are Neuroge
Nin3 (NGN3) -positive endocrine precursor cells are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells. In one aspect, NGN3-positive endocrine precursor cells are co-positive for NGN3, PAX4 and NKX2.2.
A further embodiment of the cell culture composition described herein comprises differentiated cells derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells and an ERBB receptor tyrosine kinase activator in vitro. Includes human pancreatic endoderm cell culture.
Additional embodiments described herein relate to methods of producing insulin. In some such embodiments, the method is (a) at least foregut endoderm cell cultures and / or at least PDX derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells.
1 Negative foregut endoderm cell culture with ERBB receptor tyrosine kinase activator in
The step of contacting with a vitro to generate a pancreatic endoblast cell population containing endocrine cells and non-secretory cell subpopulations, and (b) the pancreatic endoplasmic cell population of step (a) or the cell subpopulation of step (a). The steps include transplanting the population in vivo and maturing to obtain insulin secretory cells, wherein the insulin secretory cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Yet another embodiment described herein is a method of producing insulin.
(A) In vitro contact of dedifferentiated, genetically reprogrammed cells with a first medium containing an agent that activates TGFβ receptor family members, and (b) TGFβ receptor family members. In vitro culturing the cells of step (a) in a second medium lacking an agent that activates the cells, thereby producing at least anterior endoderm cells and / or at least PDX1-negative anterior endoderm cells. And (c
) Contact the cells of step (b) with the ERBB receptor tyrosine kinase activator and
Thereby, a step of generating a cell population including endocrine cells and a non-endocrine cell subpopulation, and (d) the cell population of step (c) or the cell subpopulation of step (c) are in vivo.
The present invention relates to a method including a step of transplanting and maturing in an insulin-secreting cell, thereby obtaining an insulin-secreting cell, wherein the insulin-secreting cell secretes insulin in response to a glucose stimulus. Yet another embodiment described herein comprises a population comprising at least foregut endometrial cells, at least PDX1-negative foregut endometrial cells and / or at least PDX1-positive pancreatic endometrial cells with ERBB receptor tyrosine kinase activity. It relates to contacting with a chemical agent, thereby producing a cell population capable of maturing into glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.
Yet another embodiment described herein comprises a population comprising at least pro-intestinal endoderm cells, at least PDX1-negative pro-intestinal endoderm cells and / or at least PDX1-positive pancreatic endoderm cells, with ERBB receptor tyrosine kinase activity. It relates to contacting a chemical agent and a ro kinase inhibitor to generate a cell population capable of maturing into glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.
As used herein, the terms "at least foregut endoderm cells", "at least PDX"
"1 negative preintestinal endoplasmic cells" and "at least PDX1-positive pancreatic endoblasts" are cells of the cell population from iPSC to anterior intestinal endometrial cells during their differentiation into pancreatic islet cells. Or more, it means that iPSC is differentiated into PDX1-negative progenitor endoblasts or higher, and / or iPSC is differentiated into PDX1-positive pancreatic endoblasts or higher.
As used herein, when referring to cells in a cell population, the terms "some" and / or "partial" mean that the cell population is at least 5%, at least 10%, at least 15.
%, At least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 6
It is meant to include cells of the specified cell type greater than 0%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least 95%.

脱分化したリプログラミングされた細胞、または本明細書でｉＰＳ細胞とも呼ばれる細胞の凝集懸濁培養の写真画像である。It is a photographic image of agglutination suspension culture of dedifferentiated reprogrammed cells, or cells also referred to herein as iPS cells.

ＯＣＴ４（図２Ａ）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（図２Ｂ）、ＣＥＲ１（図２Ｃ）、ＧＳＣ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ１（図２Ｆ）、ＨＮＦ６（図２Ｇ）、ＰＤＸ１（図２Ｈ）、ＰＴＦ１Ａ（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）、ＮＧＮ３（図２Ｋ）およびＩＮＳ（図２Ｌ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに標準化される。グラフは、データセット中の最も低いデータポイントからの上方制御倍率を表す。OCT4 (Fig. 2A), BRACHYURY (Fig. 2B), CER1 (Fig. 2C), GSC (Fig. 2D), FOXA2 (Fig. 2E), FOXA1 (Fig. 2F), HNF6 (Fig. 2G), PDX1 (Fig. 2H), PTF1A (Fig. 2A) FIG. 2I is a bar graph showing the relative gene expression levels of NKX6.1 (FIG. 2J), NGN3 (FIG. 2K) and INS (FIG. 2L). Expression levels are standardized to mean expression levels of housekeeping gene, cyclophilin G and TATA binding protein (TBP) expression. The graph represents the upward control factor from the lowest data point in the dataset.

（３Ａ）ＰＤＸ−１；（３Ｂ）ＮＫＸ６．１；（３Ｃ）ＰＴＦ１Ａ；および（３Ｄ）Ｄａｐｉに特異的な抗体を使用したステージ４分化からのヒトｉＰＳ細胞培養物の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の顕微鏡写真である。(3A) PDX-1; (3B) NKX6.1; (3C) PTF1A; and (3D) Dapi-specific antibodies of immunocytochemistry (ICC) of human iPS cell cultures from stage 4 differentiation. It is a micrograph.

（図４Ａ）グルカゴン、（図４Ｂ）インスリン、（図４Ｃ）ソマトスタチンおよび（図４Ｄ）Ｄａｐｉに特異的なリガンドを使用した、ステージ４分化からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の写真である。In a photograph of immunocytochemistry (ICC) of iPS cell culture from stage 4 differentiation using glucagon, (Fig. 4B) insulin, (Fig. 4C) somatostatin and (Fig. 4D) Dapi-specific ligands. is there. Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイで提供されるアレイ位置図およびアレイキーを示す図である。図５Ａの位置図は、ＲＴＫ抗体の座標または位置を示す。ＲＴＫファミリーおよび抗体のアイデンティティまたは名前は、図５Ｂのキーに記載される。したがって、現像したフィルムで観察される陽性シグナルは、図５Ａのように透明画をオーバレイし、図５ＢのＲＴＫの名前でオーバレイ（図５Ａ）の上の座標を参照することによってシグナルを同定することによって、同定することができる。FIG. 5 shows an array location diagram and array key provided by the Proteome Profiler ™ Human Phosphor RTK Antibody Array from R & D Systems. The location diagram of FIG. 5A shows the coordinates or location of the RTK antibody. The RTK family and antibody identities or names are described in the key of FIG. 5B. Therefore, the positive signal observed on the developed film should be identified by overlaying the transparent image as shown in FIG. 5A and referring to the coordinates above the overlay (FIG. 5A) under the name of RTK in FIG. 5B. Can be identified by. ４つの異なる条件（実施例５に記載されるように、図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）下のｉＰＳ細胞導出膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）のＲＴＫアレイ分析を示す図である。特定のＲＴＫのチロシンリン酸化が、高強度から低強度のシグナルの同定によって観察される。ＩＧＦ １Ｒ／ＩＲおよびＥＲＢＢ（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーが同定されるか、四角で囲まれる。FIG. 5 shows RTK array analysis of iPS cell-derived pancreatic endoderm cells (PECs) under four different conditions (FIGS. A, B, C and D, as described in Example 5). Tyrosine phosphorylation of a particular RTK is observed by identification of high to low intensity signals. IGF 1R / IR and ERBB (EGFR) family members are identified or boxed. 表９に示すように、実験Ｅ２３１４、Ｅ２３５６およびＥ２３８０（図７Ａ）、Ｅ２３４７（図７Ｂ）ならびにＥ２３５４（図７Ｃ）の移植されたマウスの血清中のヒトＣペプチドおよびインスリンの濃度を示すグラフである。空腹時、ならびに腹腔内グルコース投与の３０分および６０分後に、ヒトＣペプチドの血清レベルについてＰＥＣを移植したマウスを指示された移植後時点で分析した。図７Ｃで、細胞封入デバイス（Ｅｎｃａｐｔｒａ（登録商標）ＥＮ２０またはＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でＰＥＣを封入し、一部の場合には、デバイスは微穿孔を有した（ｐＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。そのようなデバイスは、米国特許第８，２７８，１０６号に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。As shown in Table 9, it is a graph showing the concentrations of human C-peptide and insulin in the sera of transplanted mice of Experiments E2314, E2356 and E2380 (FIG. 7A), E2347 (FIG. 7B) and E2354 (FIG. 7C). .. Mice transplanted with PEC for serum levels of human C-peptide were analyzed at the indicated post-transplant time points on an empty stomach and 30 and 60 minutes after intraperitoneal glucose administration. In FIG. 7C, PEC was encapsulated with a cell encapsulation device (Encaptra® EN20 or EN20, ViaCite, San Diego, CA) and in some cases the device had microperforations (pEN20, ViaCite, San). Diego, CA). Such devices are described in US Pat. No. 8,278,106, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. 実験＃２３４７のＳＴＺ処置マウスの血中グルコース分析の結果を示すグラフである。図８Ａは、１３匹の各マウスの血中グルコースを示し（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）、図８Ｂは、各処置の合わせた平均測定値を示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。ＳＴＺによる処置（０日目）の最大１４日前までにｉＰＥＣ移植片を移植した１３匹のマウスについて、同じマウスについてＳＴＺ処置の後、および移植片を外植した後の、ランダムな非絶食血中グルコースレベルの測定値を示す。ＳＴＺ処置動物は、移植片の移植から約２６週後にＳＴＺを与えられた（０日目）。移植片移植から２８週後、ＳＴＺ処置の開始からおよそ２週後に、ｉＰＥＣ移植片を外植した（取り出した）。各動物につき、非絶食血中グルコース測定値を経時的に収集した。It is a graph which shows the result of the blood glucose analysis of STZ-treated mouse of experiment # 2347. FIG. 8A shows the blood glucose of each of the 13 mice (baseline with and without heregulin), and FIG. 8B shows the combined mean measurements of each treatment (baseline with and without helegrin). In 13 mice transplanted with an iPEC graft up to 14 days prior to STZ treatment (day 0), in random non-fasting blood after STZ treatment for the same mouse and after explantation of the graft. The measured value of glucose level is shown. STZ-treated animals were given STZ approximately 26 weeks after graft implantation (day 0). Grafts 28 weeks after transplantation and approximately 2 weeks after the start of STZ treatment, iPEC grafts were explanted (removed). Non-fasting blood glucose measurements were collected over time for each animal.

本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の詳細な
説明を参照することによって容易に理解することができる。しかし、本化合物、組成物、
および方法の開示および記載の前に、本発明は、特定の細胞型、特定のフィーダー細胞層
、特定の条件、または特定の方法などに限定されず、それ自体変わり得ることが理解され
るべきである。多数の改変および変形が当業者には明らかであろう。本明細書において使
用される用語は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定的なものではな
いことも理解されるべきである。 The present invention can be readily understood by reference to the following detailed description of preferred embodiments and examples of the invention contained herein. However, this compound, composition,
And prior to disclosure and description of methods, it should be understood that the invention is not limited to a particular cell type, a particular feeder cell layer, a particular condition, or a particular method, etc., and can vary in itself. is there. Numerous modifications and modifications will be apparent to those skilled in the art. It should also be understood that the terms used herein are merely to describe a particular embodiment and are not limiting.

定義
本明細書で表される数値範囲は、記載されている終点を含み、示された数値範囲の終点
間の全ての整数を記載するものであることが理解されよう。 Definitions It will be appreciated that the numerical range represented herein includes all the integers between the end points of the indicated numerical range, including the end points described.

特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用に従って
理解される。また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、別段に特定さ
れていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の分量、材料の
百分率または割合、反応条件を表す数、および他の数値は全て、全ての場合に「約」とい
う用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反する指示
がない限り、以下の明細書および添付されている特許請求の範囲に記載されている数値パ
ラメータは、本発明によって得られるべき所望の性質に応じて変動し得る近似値である。
最低限、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各数値
パラメータは、少なくとも、報告されている有意な桁数に照らして、および通常の丸め技
法を適用することによって解釈されるべきである。 Unless otherwise stated, the terms used herein will be understood in accordance with conventional use by those skilled in the art. Also, with respect to the purposes of the present specification and the accompanying claims, unless otherwise specified, the amounts of the components used in the present specification and the claims, the percentages or proportions of the materials, and the reaction conditions are expressed. It should be understood that numbers, and all other numbers, are all modified by the term "about". Therefore, unless otherwise indicated, the numerical parameters described in the following specification and the appended claims are approximate values that may vary depending on the desired properties to be obtained by the present invention. ..
At a minimum, and without attempting to limit the application of the doctrine of equivalents to the claims, each numerical parameter applies, at least in light of the significant number of digits reported, and the usual rounding techniques. Should be interpreted by.

本明細書に記載の実施形態の実施には、別段に特定されていない限り、細胞生物学、分
子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が使用さ
れる。 Unless otherwise specified, conventional techniques of cell biology, molecular biology, genetics, chemistry, microbiology, recombinant DNA, and immunology are used to implement the embodiments described herein. Will be done.

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈ
ｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることを理解するべきで
ある。したがって、例えば、「細胞」への言及には１つまたは複数のそのような異なる細
胞が含まれ、「方法」への言及には、本明細書に記載される方法に代えて改変または置換
することができる、当業者に公知である同等のステップおよび方法への言及が含まれる。 Within the scope of this specification and the accompanying claims, the singular forms "a", "an" and "th"
It should be understood that "e" includes the plural unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, a reference to a "cell" includes one or more such distinct cells, and a reference to a "method" is modified or replaced in place of the method described herein. References to equivalent steps and methods known to those of skill in the art can be included.

「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、個々の細胞、細胞系、またはその
ような細胞から導出される培養物を指す。「培養物」とは、同じまたは異なる種類の単離
された細胞を含む組成物を指す。 As used herein, the term "cell" refers to an individual cell, cell line, or culture derived from such cells. "Culture" refers to a composition comprising the same or different types of isolated cells.

本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」という句は、卵細胞と***細胞の融合か
ら生成する細胞などの、生物体を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞を指す
。受精卵の最初の数回の***によって生成する細胞も全能性であり得る。これらの細胞は
、胚および胚体外細胞系列に分化することができる。例えばＥＳ細胞などの多能性幹細胞
は、いかなる胎児または成体の細胞型も生じ得る。しかし、これらは、胚体外組織に発達
する能力を欠くので、単独では胎児または成体動物に発達することはできない。胚体外組
織は、一部において、胚体外内胚葉から導出され、遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌ ｅｎ
ｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜）および近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｅｎｄｏｄｅｒ
ｍ）（卵黄嚢の一部を形成する）にさらに分類することができる。遠位内胚葉および近位
内胚葉はどちらも胚の発生を支持するが、それら自体は胚構造を形成しない。胚体外中胚
葉および胚体外外胚葉を含めた他の胚体外組織も存在する。 As used herein, the phrase "totipotent stem cell" refers to a cell capable of differentiating into all the cells that make up an organism, such as cells produced from the fusion of an egg cell and a sperm cell. The cells produced by the first few divisions of a fertilized egg can also be totipotent. These cells can differentiate into embryonic and extraembryonic cell lineages. Pluripotent stem cells, such as ES cells, can give rise to any fetal or adult cell type. However, they lack the ability to develop into extraembryonic tissues and therefore cannot develop into fetal or adult animals by themselves. Extraembryonic tissue is, in part, derived from extraembryonic endoderm and distal endoderm (parietal en).
doderm (Reichert's membrane) and proximal endoderm (visceral endoderm)
It can be further classified into m) (which forms part of the yolk sac). Both the distal endoderm and the proximal endoderm support embryonic development, but they do not themselves form embryonic structures. There are also other extraembryonic tissues, including extraembryonic mesoderm and extraembryonic ectoderm.

一部の実施形態では、「多能性細胞」を、内胚葉系列、より詳細には、膵臓内胚葉型細
胞に分化させるための出発材料として使用する。本明細書で使用される場合、「多能性」
または「多能性細胞」またはその等価物とは、細胞培養物中で増殖することができ、かつ
多分化能の性質を示す種々の系列限定的な細胞集団に分化することができる細胞を指し、
例えば、多能性ＥＳ細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はどちらも、３種の胚細胞系
列のそれぞれを生じ得る。しかし、多能性細胞は、生物体全体を生成することはできない
場合がある。すなわち、多能性細胞は全能性ではない。 In some embodiments, "pluripotent cells" are used as a starting material for differentiating into endoderm lineages, more specifically pancreatic endoderm-type cells. As used herein, "pluripotency"
Alternatively, "pluripotent cell" or an equivalent thereof refers to a cell that can proliferate in a cell culture and differentiate into various lineage-limited cell populations exhibiting pluripotency properties. ,
For example, pluripotent ES cells and induced pluripotent stem (iPS) cells can both give rise to each of the three embryonic cell lineages. However, pluripotent cells may not be able to produce the entire organism. That is, pluripotent cells are not totipotent.

ある特定の実施形態では、出発材料として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥ
Ｇ細胞、ｉＰＳ細胞、さらには単為発生細胞などを含めた幹細胞である。本明細書で使用
される場合、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体から始まり、もはや発生
した配偶子細胞以外の多能性または全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の様
々な発生ステージを指す。「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」という用語は、配偶子融合によ
って導出された胚に加えて、体細胞核移植によって導出された胚も指す。さらに別の実施
形態では、多能性細胞は胚から導出されたまたは直接導出されたものではなく、例えば、
ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞から導出され
たものである。 In certain embodiments, the pluripotent cells used as starting materials are hES cells, hE.
Stem cells including G cells, iPS cells, and parthenogenetic cells. As used herein, an "embryonic" is an organism that begins with a single zygote and ends with a multicellular structure that no longer contains a developed multicellular or totipotent cell other than a gamete cell. Refers to various developmental stages of the body. The term "embryonic" refers to embryos derived by somatic cell nuclear transfer in addition to embryos derived by gamete fusion. In yet another embodiment, pluripotent cells are not derived or directly derived from the embryo, eg, for example.
iPS cells are derived from non-pluripotent cells, such as pluripotent cells or terminally differentiated cells.

ヒト多能性幹細胞は、分化を導く遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコア調
節複合体を形成する転写因子Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２などのいくつか
の転写因子および細胞表面タンパク質、ならびに糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびケ
ラタン硫酸抗原、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１などの細胞表面抗原が存在す
ると定義または特徴付けることもできる。 Human pluripotent stem cells form several transcription factors such as the transcription factors Oct-4, Nanog, and Sox-2, which form a core regulatory complex that ensures suppression of genes that lead to differentiation and maintenance of pluripotency. Cell surface proteins and cell surface antigens such as glycolipids SSEA3, SSEA4 and keratin sulfate antigens, Tra-1-60 and Tra-1-81 can also be defined or characterized.

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰ
ＳＣ」という句は、非多能性細胞、一般には成体の体細胞、または、例えば線維芽細胞、
造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化した細胞から、リプログラミン
グ因子と称される特定の遺伝子または遺伝子産物を挿入することによって人工的に調製さ
れた多能性幹細胞の一種を指す。その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる、
Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇ
ら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：３１８−３２４（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、
４５１：１４１−１４６（２００８）を参照されたい。人工多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞
などの天然のヒト多能性幹細胞と、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、ク
ロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成
、ならびに発生能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）を含めた多
くの点で実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細胞により、胚の使用を伴うことなく多能性
幹細胞の供給源がもたらされる。 As used herein, "induced pluripotent stem cells" or "iPS cells" or "iP"
The phrase "SC" refers to non-pluripotent cells, generally adult somatic cells, or, for example, fibroblasts.
A type of pluripotent stem cell artificially prepared by inserting a specific gene or gene product called a reprogramming factor from the final differentiated cells such as hematopoietic cells, muscle cells, neurons, and epidermal cells. .. The disclosure is incorporated herein by reference in its entirety.
Takahashi et al., Cell, 131: 861-872 (2007); Wernig
Et al., Nature, 448: 318-324 (2007); Park et al., Nature, et al.
451: 141-146 (2008). Induced pluripotent stem cells are native human pluripotent stem cells such as hES cells and expression of certain stem cell genes and proteins, chromatin methylation patterns, doubling time, germ layer formation, teratoma formation, viable chimera. They are substantially similar in many respects, including formation, as well as development and differentiation potential. Human iPS cells provide a source of pluripotent stem cells without the use of embryos.

ｉＰＳ細胞を生成するために様々な方法を用いることができ、それらは本明細書におい
て下でさらに詳細に記載される。しかし、全ての方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａ
ｎｏｇおよび任意選択でＬｉｎ−２８をコードする発現カセット、またはＳｏｘ−２、Ｏ
ｃｔ−４、Ｋｌｆ４および任意選択でｃ−ｍｙｃをコードする発現カセット、またはＳｏ
ｘ−２、Ｏｃｔ−４および任意選択でＥｓｒｒｂをコードする発現カセットなどの特定の
リプログラミング因子を用いる。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同
じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリ
プログラミングベクターの中にあってもよい。Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミ
リーの特定のメンバー（Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３およびＳｏｘ−１５）は、
その不在により誘導を不可能にする、誘導プロセスに関与する大事な転写制御因子である
。Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つ
であり、多能性の維持で重要な役割をする。例えば、通常Ｏｃｔ−３／４＋の細胞、例え
ば割球および胚性幹細胞中のＯｃｔ−３／４の不在は、自発的な栄養芽細胞分化につなが
り、一方、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化潜在能力をもたらす
。さらに、「Ｏｃｔ」ファミリーの他の遺伝子、例えばＯｃｔ１およびＯｃｔ６は多能性
を誘導せず、したがって、この多能性誘導プロセスはＯｃｔ−３／４に帰することができ
る。Ｏｃｔ−３／４に類似の多能性の維持に関連する遺伝子の別のファミリーは、Ｓｏｘ
ファミリーである。しかし、Ｓｏｘファミリーは多能性細胞型に限定的でなく、多分化能
および単能性幹細胞にも関連する。Ｓｏｘファミリーは誘導プロセスでも働くことが見出
されている。上記Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６による初期研究では、Ｓｏｘ２が使用
された。それ以来、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８遺伝子によっても
ｉＰＳ細胞が生成されている。Ｋｌｆファミリーの遺伝子（Ｋｌｆ−１、Ｋｌｆ２、Ｋｌ
ｆ４およびＫｌｆ５）のＫｌｆ４は、当初はマウスｉＰＳ細胞の生成の因子として、上記
Ｙａｍａｎａｋａら２００６によって同定された。本明細書において、Ｓ．Ｙａｍａｎａ
ｋａからのヒトｉＰＳ細胞は、ｈＩＰＳ細胞の細胞療法適用を探索するために使用した。
しかし、上記Ｙｕら２００７は、Ｋｌｆ４が必要とされないこと、および実際ヒトｉＰＳ
細胞を生成することができなかったことを報告した。Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２およびＫｌｆ５
を含むＫｌｆファミリーの他のメンバーは、ｉＰＳ細胞を生成することが可能である。最
後に、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃ）、がんと結びつけ
られているがん原遺伝子；ｃ−ｍｙｃは、マウスおよびヒトのｉＰＳ細胞の生成と結びつ
けられた因子であったが、上記Ｙｕら（２００７）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生
成のために必要とされなかったことを報告した。 Various methods can be used to generate iPS cells, which are described in more detail below herein. However, all methods are Sox-2, Oct-4, Na
An expression cassette encoding Lin-28 with nog and optionally, or Sox-2, O
An expression cassette encoding ct-4, Klf4 and optionally c-myc, or So
Specific reprogramming factors such as x-2, Oct-4 and optionally an expression cassette encoding Esrrb are used. Nucleic acids encoding these reprogramming factors may be in the same expression cassette, different expression cassettes, the same reprogramming vector, or different reprogramming vectors. Specific members of the Oct-3 / 4 and Sox gene families (Sox-1, Sox-2, Sox-3 and Sox-15)
It is an important transcriptional regulator involved in the induction process, which makes induction impossible due to its absence. Oct-3 / 4 (Pou5f1) is a member of the family of octameric (“Oct”) transcription factors and plays an important role in maintaining pluripotency. For example, the absence of Oct-3 / 4 in normal Oct-3 / 4 + cells, such as blastomeres and embryonic stem cells, leads to spontaneous vegetative cell differentiation, while the presence of Oct-3 / 4 is It provides pluripotency and differentiation potential of embryonic stem cells. In addition, other genes in the "Oct" family, such as Oct1 and Oct6, do not induce pluripotency, so this pluripotency induction process can be attributed to Oct-3 / 4. Another family of genes associated with maintaining pluripotency similar to Oct-3 / 4 is Sox.
It is a family. However, the Sox family is not limited to pluripotent cell types, but is also associated with pluripotent and unipotent stem cells. The Sox family has also been found to work in the induction process. Sox2 was used in the initial study by Takahashi et al., 2006. Since then, iPS cells have also been generated by the Sox1, Sox3, Sox15 and Sox18 genes. Genes of the Klf family (Klf-1, Klf2, Kl
Klf4 of f4 and Klf5) was initially identified by Yamanaka et al. 2006 as a factor in the generation of mouse iPS cells. In the present specification, S. Yamana
Human iPS cells from ka were used to explore the cytotherapeutic application of hIPS cells.
However, Yu et al. 2007 said that Klf4 is not required, and in fact human iPS.
He reported that he was unable to generate cells. Klf1, Klf2 and Klf5
Other members of the Klf family, including, are capable of producing iPS cells. Finally, the Myc family (C-myc, L-myc and N-myc), protooncogenes associated with cancer; c-myc is a factor associated with the production of mouse and human iPS cells. However, Yu et al. (2007) reported that c-myc was not required for the production of human iPS cells.

本明細書で使用される場合、「多分化能」または「多分化能細胞」またはその等価物は
、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。すなわち、多
分化能細胞は１つまたは複数の胚細胞の運命に傾倒し、したがって、多能性細胞とは対照
的に、３種の胚細胞系列のそれぞれ、ならびに胚体外細胞を生じさせることができない。
多分化能体細胞は、多能性細胞よりも分化しているが、最終分化はしていない。したがっ
て、多能性細胞の発生能は多分化能細胞よりも高い。体細胞をリプログラミングすること
またはｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができる発生能決定因子としては、こ
れだけに限定されないが、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ
、Ｒｅｘｌ、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘｌ５、Ｍｙｂｌ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰ
Ａ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはこれらの組合せなどの因子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質」とし
ては、これだけに限定されないが、ＥＲＢＢ受容体に結合する少なくとも１６種の異なる
ＥＧＦファミリーリガンド：ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＧまたはＡＲＥＧ（アンフィレ
ギュリン）、およびＴＧＦ−アルファ（形質転換成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータ
セルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ）、およびＥｒｅｇ（エピレギュリン）
）、ニューレグリン−１、−２、−３および−４（またはヘレグリン−１、−２、−３お
よび−４などのニューグレリン（またはヘレグリン）が挙げられる。しかし、本発明では
、４種のＥＲＢＢ受容体のいずれか１つまたはこれらの組合せに結合して、内因性キナー
ゼドメインの活性化およびその後のリン酸化を導くホモ二量体受容体複合体およびヘテロ
二量体受容体複合体の形成を誘導することができる任意のリガンドが意図されている。表
１１も参照されたい。
本明細書に記載されるインスリンの生成方法の一部の実施形態は、グルコース刺激に応
答してインスリンを分泌するインスリン生成細胞にｉｎ ｖｉｖｏで成熟することができ
る膵臓内胚葉細胞を動物に提供することによって、糖尿病の動物を処置するか、動物の血
液中のグルコース濃度を制御することを含むことができる。 As used herein, "pluripotent" or "pluripotent cell" or an equivalent thereof refers to a cell type capable of giving rise to a limited number of other specific cell types. That is, pluripotent cells are devoted to the fate of one or more embryonic cells and thus, in contrast to pluripotent cells, can give rise to each of the three embryonic cell lineages, as well as extraembryonic cells. Can not.
Pluripotent somatic cells are more differentiated than pluripotent cells, but not finally differentiated. Therefore, the developmental potential of pluripotent cells is higher than that of pluripotent cells. Developmental potential determinants that can be used to reprogram somatic cells or give rise to iPS cells are, but are not limited to, Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella.
, Rexl, ZNF206, Soxl5, Mybl2, Lin28, Nanog, DPP
Factors such as A2, ESG1, Otx2 or combinations thereof can be mentioned.
As used herein, "ERBB receptor tyrosine kinase activator" includes, but is not limited to, at least 16 different EGF family ligands that bind to the ERBB receptor: EGF (epidermal growth factor). , AG or AREG (amphiregulin), and TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), and Ereg (epidermal growth factor).
), Neuregulin-1, -2, -3 and -4 (or neuregulin (or heregulin) such as heregulin-1, -2, -3 and -4. However, in the present invention, there are four types. Formation of homodimer and heterodimeric receptor complexes that bind to any one or a combination of ERBB receptors leading to activation of the endogenous kinase domain and subsequent phosphorylation Any ligand capable of inducing is intended. See also Table 11.
Some embodiments of the insulin-producing methods described herein provide animals with pancreatic endoblasts that can mature in vivo into insulin-producing cells that secrete insulin in response to glucose stimulation. This can include treating diabetic animals or controlling glucose levels in the animal's blood.

本明細書に記載される一態様は、適当な条件の下で培養されるときに異なる細胞系統に
選択的に、および一部の態様では選択的、可逆的に発達することが可能である、多能性ま
たは先駆細胞の集団を含む。本明細書で使用される場合、「集団」という用語は、同じ識
別特徴を有する複数の細胞の細胞培養物を指す。「細胞系列」という用語は、最も早期の
先駆細胞から完全成熟細胞（すなわち特殊化した細胞）までの細胞型の発達の全ステージ
を指す。「先駆細胞」または「前駆細胞」とは、細胞分化経路内の、より成熟した細胞に
分化することができる任意の細胞であってよい。そのように、先駆細胞は、多能性細胞で
あってもよく、部分的に分化した多分化能細胞または可逆的に分化した細胞であってもよ
い。「先駆細胞集団」という用語は、より成熟または分化した細胞型に発達することがで
きる細胞の群を指す。先駆細胞集団は、多能性の細胞、幹細胞系列に制限された細胞（す
なわち、外胚葉系列の全てには発達できない細胞、または、例えばニューロン系列の細胞
にのみ発達することができる細胞）、および可逆的に幹細胞系列に制限された細胞を含み
得る。したがって、「前駆細胞」または「先駆細胞」という用語は、「多能性細胞」また
は「多分化能細胞」であり得る。 One aspect described herein is capable of selectively developing into different cell lines when cultured under suitable conditions, and selectively and reversibly in some aspects. Includes a population of pluripotent or pioneering cells. As used herein, the term "population" refers to a cell culture of multiple cells with the same distinguishing characteristics. The term "cell lineage" refers to all stages of cell type development, from the earliest precursor cells to fully mature cells (ie, specialized cells). A "pioneer cell" or "progenitor cell" can be any cell within the cell differentiation pathway that can differentiate into a more mature cell. As such, the precursor cell may be a pluripotent cell, a partially differentiated pluripotent cell, or a reversibly differentiated cell. The term "pioneering cell population" refers to a group of cells that can develop into a more mature or differentiated cell type. Pioneer cell populations include pluripotent cells, cells restricted to stem cell lineages (ie, cells that cannot develop into all of the ectodermal lineage, or, for example, cells that can only develop into neurons lineage) It may contain cells that are reversibly restricted to the stem cell lineage. Thus, the term "progenitor cell" or "pioneer cell" can be "pluripotent cell" or "pluripotent cell".

本明細書で使用される場合、「リプログラミング」、「リプログラミングされた」とい
う用語またはそれと同等の用語は、培養またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、リプログラミン
グなしで同じ条件下でそれが有するであろう能力よりも測定可能な程度高い、少なくとも
１つの新しい細胞型の後代を形成する能力を細胞に付与するプロセスを指す。本明細書に
記載される特定の実施形態では、体細胞は、多能性細胞に「リプログラミングされる」。
特定の態様では、十分な増殖の後に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養に
おいて、測定可能な程度の割合の細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示すると
き、体細胞はリプログラミングされている。リプログラミングなしでは、そのような体細
胞は、新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成しないだろう。リプログ
ラミングなしでも体細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成する
ことができた場合は、これらの体細胞からの新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示す
る後代の割合は、リプログラミング前よりも測定可能な程度高い。 As used herein, the terms "reprogramming", "reprogrammed" or equivalent will have the ability in culture or in vivo under the same conditions without reprogramming. Refers to the process of imparting a cell the ability to form a progeny of at least one new cell type, which is measurable above. In certain embodiments described herein, somatic cells are "reprogrammed" into pluripotent cells.
In certain embodiments, somatic cells are reprogrammed when a measurable proportion of cells exhibit new pluripotent cell phenotypic features in in vivo or in vitro cell culture after sufficient proliferation. Has been done. Without reprogramming, such somatic cells would not produce progeny that present phenotypic features of new pluripotent cell types. If somatic cells could generate progeny that present new pluripotent cell phenotypic features without reprogramming, then the new pluripotent cell phenotypic features from these somatic cells The proportion of progeny presented is measurable higher than before reprogramming.

本明細書で使用される場合、語句「分化プログラミング」は、培養またはｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいて、分化リプログラミングなしで同じ条件下でそれが有するであろうよりも、新
しい分化状態の少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成するように細胞を変化させる
プロセスを指す。このプロセスには、分化、脱分化および分化転換が含まれる。したがっ
て、本明細書で使用される場合、語句「分化」は、より特殊化していない細胞がより特殊
化した細胞型になるプロセスを指す。対照的に、語句「脱分化」は、部分的または最終的
に分化した細胞がより初期の発達段階、例えば多能性または多分化能を有する細胞に戻る
細胞プロセスを指す。さらに対照的に、語句「分化転換」は、１つの分化細胞型を別の分
化細胞型に転換するプロセスを指す。 As used herein, the phrase "differentiation programming" refers to culture or in vivo.
In o, it refers to the process of altering a cell to form a progeny of at least one new cell type in a new state of differentiation than it would have under the same conditions without differentiation reprogramming. This process includes differentiation, dedifferentiation and transdifferentiation. Thus, as used herein, the phrase "differentiation" refers to the process by which a less specialized cell becomes a more specialized cell type. In contrast, the phrase "dedifferentiation" refers to the cellular process in which partially or finally differentiated cells return to earlier developmental stages, such as pluripotent or pluripotent cells. In further contrast, the phrase "transdifferentiation" refers to the process of transdifferentiating one differentiated cell type into another.

本明細書で使用される場合、「多能性細胞から発達する」、「多能性細胞から分化する
」、「多能性細胞から成熟する」または「多能性細胞から生成する」、「多能性細胞から
導出された」、「多能性細胞から分化する」という用語および等価の表現は、例えば、そ
の開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７
／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡ
ＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて移植されたＰＤＸ１膵臓
内胚葉細胞から成熟する内分泌細胞の場合では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ
において多能性細胞から分化した細胞型が生成することを指す。そのような用語は全て、
少なくとも２種の異なる細胞系列に分化する潜在性を有するステージから特殊化および最
終分化した細胞になるまでの細胞の進行を指す。そのような用語は、本出願の目的に関し
て互換的に使用することができる。本明細書に記載の実施形態では、そのような分化を可
逆的なものにし、したがって、多能性または少なくとも２種以上の細胞系列に分化する能
力を選択的に取り戻すことができるような培養条件が意図されている。 As used herein, "develop from pluripotent cells", "differentiate from pluripotent cells", "mature from pluripotent cells" or "produce from pluripotent cells", " The terms "derived from pluripotent cells", "differentiate from pluripotent cells" and equivalent expressions are, for example, International Patent Application No. PCT / US2007, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.
/ 015536, title "METHODS OF PRODUCING PANCREA"
In the case of endocrine cells that mature from PDX1 pancreatic endoderm cells transplanted in vivo as described in "TIC HORMONES", in vitro or in vivo.
Refers to the generation of cell types differentiated from pluripotent cells. All such terms
Refers to the progression of cells from a stage that has the potential to differentiate into at least two different cell lines to specialized and finally differentiated cells. Such terms can be used interchangeably for the purposes of this application. In the embodiments described herein, culture conditions are such that such differentiation can be reversible and thus pluripotency or the ability to selectively differentiate into at least two or more cell lineages. Is intended.

「フィーダー細胞」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長し、少なくとも１種の因子
を細胞培養中に分泌し、また、培養物中の別の目的の細胞の成長を支持するために使用す
ることができる細胞培養物を指す。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」は
、「フィーダー細胞」という用語と互換的に使用され得る。フィーダー細胞は、培養皿の
表面がフィーダー細胞で、重なり合って増幅する前の完全な層で覆われた単層を含んでも
よく、細胞のクラスターを含んでよい。好ましい実施形態では、フィーダー細胞は、接着
性の単層を含む。 The term "feeder cell" can be used to grow in vitro, secrete at least one factor into a cell culture, and support the growth of another cell of interest in the culture. Refers to cell culture. As used herein, "feeder cell layer" may be used interchangeably with the term "feeder cell". The feeder cells may include a monolayer in which the surface of the culture dish is the feeder cells and is covered with a complete layer before being overlapped and amplified, and may contain clusters of cells. In a preferred embodiment, the feeder cells include an adhesive monolayer.

本明細書で使用される場合、「クラスター」、「凝集塊」または「凝集体」という用語
は互換的に使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞を一般に指す。クラ
スターは、より小さいクラスターに解離することができる。この解離は本来一般的に手動
である（例えば、パスツールピペットを使用する）が、他の解離手段が企図される。凝集
懸濁多能性または多分化能細胞培養物は、実質的に、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０
６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬ
ＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０
８２３５６、表題ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ Ｃ
ＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩ
ＯＮ ＴＨＥＲＥＯＦに記載されている通りであり、それらは参照により本明細書に完全
に組み込まれる。 As used herein, the terms "cluster,""aggregate," or "aggregate" can be used interchangeably and generally refer to a group of cells that have not dissociated into a single cell. Clusters can be dissociated into smaller clusters. This dissociation is generally manual in nature (eg, using a Pasteur pipette), but other dissociation means are contemplated. Aggregate-suspend pluripotent or pluripotent cell cultures are substantially the internationally available PCT / US2007 / 0
62755, title COMPOSITIONS AND METHODS FOR CUL
TURING DIFFERENTIAL CELLS and PCT / US2008 / 0
82356, title STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION C
OMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATI
As described in ON THEREOF, they are fully incorporated herein by reference.

同様に、多能性細胞培養物または多能性凝集懸濁培養物をフィーダー細胞の使用を伴わ
ない規定された条件において成長させる実施形態は「フィーダーフリー」である。フィー
ダーフリー培養方法では、多能性細胞培養物のスケーラビリティおよび再現性が増し、例
えばフィーダー細胞または他の動物を供給源とする培養物構成成分に由来する感染因子に
よるコンタミネーションのリスクが低下する。フィーダーフリー方法は、Ｂｏｄｎａｒら
に対する米国特許第６，８００，４８０号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅ
ｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡された）にも記載されている。しかし、
米国特許第６，８００，４８０号特許とは対照的に、本明細書に記載の実施形態は、多能
性細胞培養物、多分化能細胞培養物または分化した細胞培養物のいずれであるかにかかわ
らず、フィーダーフリーであり、内在性または外因性の細胞外マトリックスをさらに含有
しない；すなわち、本明細書に記載の培養物は、フィーダーフリーであるだけでなく、細
胞外マトリックスフリーでもある。例えば、米国特許第６，８００，４８０号では、線維
芽細胞を培養し、線維芽細胞をｉｎ ｓｉｔｕで溶解し、次いで、溶解後に残ったものを
洗浄することによって細胞外マトリックスが調製される。あるいは、米国特許第６，８０
０，４８０号では、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロ
シン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、
ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される単離
されたマトリックス構成成分または構成成分の組合せからも細胞外マトリックスが調製さ
れ得る。本明細書に記載の実施形態では、フィーダー層または線維芽細胞層を成長させ、
細胞を溶解して細胞外マトリックスを生成することによって細胞外マトリックスを生成す
ることもなく、最初にコラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メ
ロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン
、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される細
胞外マトリックス構成成分または細胞外マトリックス構成成分の組合せを用いて組織培養
容器をコーティングする必要もない。したがって、多能性細胞、多分化能細胞および分化
した細胞用の本明細書に記載の凝集懸濁培養物には、外因的に添加された細胞外マトリッ
クスまたはマトリックス構成成分である細胞外マトリックスコーティングを生成するフィ
ーダー層、溶解したフィーダー細胞または線維芽細胞は必要なく、参照により本明細書に
完全に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、表題ＭＥＴＨＯＤＳ
ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥ ＰＬＵＲＩＰ
ＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＭＥＤＩＡ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＨＵＭＡＮ Ｓ
ＥＲＵＭに記載の通り、可溶性ヒト血清構成成分の使用により、フィーダー細胞またはフ
ィーダー単層の必要性を克服し、同様に、フィーダー細胞もしくは線維芽細胞または外因
的に添加された細胞外マトリックス構成成分に由来する内在性の細胞外マトリックスの必
要性も克服される。 Similarly, an embodiment in which a pluripotent cell culture or a pluripotent agglutinating suspension culture is grown under defined conditions without the use of feeder cells is "feeder-free". Feeder-free culture methods increase the scalability and reproducibility of pluripotent cell cultures and reduce the risk of contamination by infectious agents derived from, for example, feeder cells or other animal-sourced culture components. The feeder-free method is described in US Pat. No. 6,800,480 (Geron Corporation, Me) to Bondnar et al.
It is also described in nlo Park, transferred to California). But,
In contrast to US Pat. No. 6,800,480, the embodiments described herein are either pluripotent cell cultures, pluripotent cell cultures or differentiated cell cultures. Regardless, they are feeder-free and do not further contain endogenous or exogenous extracellular matrix; that is, the cultures described herein are not only feeder-free, but also extracellular matrix-free. For example, in US Pat. No. 6,800,480, extracellular matrix is prepared by culturing fibroblasts, lysing fibroblasts in situ, and then washing what remains after lysis. Alternatively, U.S. Pat. No. 6,80
In No. 0,480, collagen, placental matrix, fibronectin, laminin, melosine, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, aglycan,
Extracellular matrix can also be prepared from isolated matrix components or combinations of components selected from biglycan, thrombospondin, vitronectin, and decorin. In the embodiments described herein, the feeder layer or fibroblast layer is grown.
Collagen, placenta matrix, fibronectin, laminin, melosine, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, aggrecan, biglican first without producing extracellular matrix by lysing cells to produce extracellular matrix It is also not necessary to coat the tissue culture vessel with an extracellular matrix component or a combination of extracellular matrix components selected from, chondroitin, bitronectin, and decorin. Therefore, the aggregated suspension cultures described herein for pluripotent cells, pluripotent cells and differentiated cells have an extracellular matrix or extracellular matrix coating that is a matrix component added exogenously. No feeder layer, lysed feeder cells or fibroblasts are required to produce, and the international application PCT / US2008 / 080516, entitled METHODS, is incorporated herein by reference.
AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIP
OTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN S
As described in ERUM, the use of soluble human serum components overcomes the need for feeder cells or feeder monolayers, as well as to feeder cells or fibroblasts or exogenously added extracellular matrix components. The need for an intrinsic extracellular matrix of origin is also overcome.

好ましい実施形態では、培養方法は、動物を供給源とする産物を含まない。別の好まし
い実施形態では、培養方法はゼノフリーである。さらに好ましい実施形態では、本明細書
に記載の培養方法はヒト細胞治療薬の商業的な製造のための１つまたは複数の条件または
要件を満たすかまたはそれを上回っていた。 In a preferred embodiment, the culture method does not include animal-sourced products. In another preferred embodiment, the culture method is xenofree. In a more preferred embodiment, the culturing methods described herein meet or exceed one or more conditions or requirements for the commercial production of human cell therapies.

多能性細胞の集団をある特定の補足的な成長因子の存在下でさらに培養して、異なる細
胞系列であるか、またはそれに発達することになる細胞の集団を得ることができ、または
、異なる細胞系列に発達することが可能になるように選択的に逆行させることができる。
「補足的な成長因子」という用語は、その最も広範な文脈で使用され、多能性細胞の成長
を促進するため、細胞の生存を維持するため、細胞の分化を刺激するため、および／また
は、細胞の分化の逆行を刺激するために有効である物質を指す。さらに、補足的な成長因
子は、フィーダー細胞からその培地中に分泌される物質であってよい。そのような物質と
しては、これだけに限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体、お
よびタンパク質が挙げられる。成長因子は、細胞の発生および維持ならびに組織の形態お
よび機能を制御する細胞間シグナル伝達ポリペプチドも含んでよい。好ましい実施形態で
は、補足的な成長因子は、幹細胞因子（ｓｔｅｅｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）（ＳＣＦ
）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン
−６（ＩＬ−６）と可溶性インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の組合せ、線維芽
細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およ
び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。 Populations of pluripotent cells can be further cultured in the presence of certain complementary growth factors to obtain or differ populations of cells of different cell lineages or will develop into them. It can be selectively retrograde so that it can develop into a cell lineage.
The term "complementary growth factor" is used in its broadest context to promote the growth of pluripotent cells, to maintain cell survival, to stimulate cell differentiation, and / or , Refers to substances that are effective in stimulating the retrograde differentiation of cells. In addition, the complementary growth factor may be a substance secreted from the feeder cells into the medium. Such substances include, but are not limited to, cytokines, chemokines, small molecules, neutralizing antibodies, and proteins. Growth factors may also include intercellular signaling polypeptides that control cell development and maintenance as well as tissue morphology and function. In a preferred embodiment, the complementary growth factor is a stem cell factor (SCF).
), Oncostatin M (OSM), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), Combination of Interleukin-6 (IL-6) and Soluble Interleukin-6 Receptor (IL-6R), Fibroblast Growth Factor ( It is selected from the group consisting of FGF), bone-forming protein (BMP), tumor necrosis factor (TNF), and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).

本明細書に記載の細胞を生成するためのある特定のプロセスでは、成長因子を、添加後
に細胞培養物または細胞集団から除去する。例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤ
Ｆ−８、またはＧＤＦ−１１などの成長因子を添加し、それらを添加してから約１日以内
、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日
以内、約９日以内または約１０日以内に除去することができる。一部の実施形態では、分
化因子を細胞培養物から除去することはしない。 In certain processes for producing the cells described herein, growth factors are removed from the cell culture or cell population after addition. For example, Activin A, Activin B, GD
Add growth factors such as F-8 or GDF-11, and within about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days after adding them. It can be removed within, within about 7 days, within about 8 days, within about 9 days or within about 10 days. In some embodiments, the differentiation factor is not removed from the cell culture.

分化プロセスの効率は、これだけに限定されないが、細胞の成長条件、成長因子濃度お
よび培養ステップのタイミングを含めたある特定のパラメータを改変することによって調
整することができるので、本明細書に記載の分化手順により、約５％、約１０％、約１５
％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５
％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５
％、または約９５％超の、人工多能性細胞を含む多能性細胞から多分化能細胞または分化
した細胞、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵
臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３
／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣ
Ｇ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞への変換をもたらすことができる。前原
条（ｐｒｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ）細胞または中内胚葉細胞の単離を使用す
るプロセスでは、実質的に純粋な前原条細胞または中内胚葉細胞集団を回収することがで
きる。 The efficiency of the differentiation process is described herein as it can be adjusted by modifying certain parameters, including, but not limited to, cell growth conditions, growth factor concentrations and timing of culture steps. Depending on the differentiation procedure, about 5%, about 10%, about 15
%, About 20%, About 25%, About 30%, About 35%, About 40%, About 45%, About 50%, About 55
%, About 60%, About 65%, About 70%, About 75%, About 80%, About 85%, About 90%, About 95
Permanent cells or differentiated cells from pluripotent cells, including artificial pluripotent cells, such as endoderm, preintestinal germ layer, PDX1-positive preintestinal germ layer, PDX1 positive Pancreatic endoderm or PDX1 / NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursor or NGN3
/ NKX2.2 co-positive endocrine precursors and hormone-secreting endocrine cells or INS, GC
It can result in conversion to G, GHRL, SST, PP alone positive endocrine cells. Processes that use the isolation of preprimitive strake cells or endoderm cells can recover substantially pure preprimitive streak or endoderm cell populations.

多能性幹細胞から導出された様々な細胞組成物が、本明細書に記載される。一実施形態
は、ｉＰＳ細胞およびそれから導出された細胞を含む。本明細書に記載される実施形態に
関連するが異なるさらに他のプロセスおよび組成物は、２００３年１２月２３日に出願の
米国特許仮出願第６０／５３２，００４号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲ
Ｍ；２００４年４月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号、表題ＰＤ
Ｘ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月９日に出願の米国特許
仮出願第６０／５８６，５６６号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ
ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶ
Ｅ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／５８７，
９４２号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ Ｆ
ＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；
２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩ
ＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第
１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２
００５年６月２３日に出願の米国特許出願第１１／１６５，３０５号、表題ＭＥＴＨＯＤ
Ｓ ＦＯＲ ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩ
ＡＴＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年１０月２７日に出願
の米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ Ｄ
ＯＲＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年
１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲＳ
ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００６年３月２日に出願の米国特許
仮出願第６０／７７８，６４９号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＣＥＬＬ
Ｓ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年７月２６日に出願
の米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ
ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年１０月
１８日に出願の米国特許仮出願第６０／８５２，８７８号、表題ＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴ
ＯＦ ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ，ＩＭＭＡＴＵＲＥ ＰＡ
ＮＣＲＥＡＴＩＣ ＩＳＬＥＴ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＡＴＵＲＥ ＰＡＮＣＲＥＡＴ
ＩＣ ＩＳＬＥＴ ＣＥＬＬＳ ＵＳＩＮＧ ＮＣＡＭ；２００６年１０月２７日に出願
の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯ
ＲＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００７年３
月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲ
ＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳ
ＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７
年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ
ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ；２００７年９月１３
日に出願の米国特許出願第６０／９７２，１７４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥ
ＡＴＭＥＮＴ ＦＯＲ ＤＩＡＢＥＴＥＳ；２００７年９月２４日に出願の米国特許出願
第１１／８６０，４９４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＤＥ
ＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７年１０月３日に
出願の米国特許出願第６０／９７７，３４９号、表題ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＭＡＲ
ＫＥＲＳ ＯＦ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ Ｃ
ＡＮＣＥＲ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ；および２００８年４月８日に出願の米国特許出願第
１２／０９９，７５９号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲ
ＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ；および２００８年４月２１日を出願の米国特許出願第１
２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤ
ＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥ
Ｄ ＦＯＲＭ ＨＵＭＡＮＥ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳに見出すこと
ができ、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Various cell compositions derived from pluripotent stem cells are described herein. One embodiment includes iPS cells and cells derived from them. Yet other processes and compositions that relate to, but differ from, the embodiments described herein are described in US Patent Provisional Application No. 60 / 532,004, filed December 23, 2003, entitled DEFINITIVE ENDODER.
M; US Patent Provisional Application No. 60 / 566,293 filed April 27, 2004, title PD
X1 EXPRESSING ENDORERM; US Patent Provisional Application No. 60 / 586,566, filed July 9, 2004, entitled CHEMOKINE CELL SURFACE
RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIV
E ENDORERM; US Patent Provisional Application No. 60/587, filed July 14, 2004,
No. 942, title CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR F
OR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDORERM;
U.S. Patent Application No. 11 / 021,618 filed December 23, 2004, entitled DEFI
NITIVE ENDOREM, and US Patent Application No. 11 / 115,868, filed April 26, 2005, entitled PDX1 EXPRESSING ENDOREM; 2
U.S. Patent Application No. 11 / 165,305 filed June 23, 2005, entitled Method
S FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTI
ATING DEFINITIVE ENDODERM; US Patent Provisional Application No. 60 / 730,917, filed October 27, 2005, entitled PDX1-EXPRESSING D
ORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDORERM; US Patent Provisional Application No. 60 / 736,598 filed on November 14, 2005, entitled MARKERS
OF DEFINITIVE ENDOREM; US Patent Provisional Application No. 60 / 778,649, filed March 2, 2006, entitled INSULIN-PRODUCING CELL
S AND METHOD OF PRODUCTION; U.S. Patent Provisional Application No. 60 / 833,633, filed July 26, 2006, entitled INSULIN-PRODUCING
CELLS AND METHOD OF PRODUCTION; U.S. Patent Provisional Application No. 60 / 852,878 filed on October 18, 2006, entitled ENRICHMENT
OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PA
NCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREAT
IC ISLET CELLS USING NCAM; US Patent Application No. 11 / 588,693, filed October 27, 2006, entitled PDX1-EXPRESSING DO
RSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDORERM; 2007 3
U.S. Patent Application No. 11 / 681,687 filed on March 2, entitled ENDOCRINE PR
ECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESS
ING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION; 2007
U.S. Patent Application No. 11 / 773,944 filed July 5, 2014, entitled METHODS OF
PRODUCING PANCREATIC HORMONES; September 13, 2007
U.S. Patent Application No. 60 / 972,174 filed on the same day, entitled METHODS OF TRE
ATMENT FOR DIABETES; US Patent Application No. 11 / 860,494, filed September 24, 2007, entitled METHODS FOR INCREASING DE
FINITIVE ENDORERM PRODUCTION; U.S. Patent Application No. 60 / 977,349 filed on October 3, 2007, entitled CELL SURFACE MAR
KERS OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS AND C
ANCER STEM CELLS; and US Patent Application No. 12 / 099,759 filed April 8, 2008, entitled METHODS OF PRODUCING PANCR
EATIC Hormone; and US Patent Application No. 1 filed April 21, 2008
2 / 107,020, title METHODS FOR PURIFYING ENDOD
ERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVE
It can be found in D FORM HUMANE EMBRYONIC STEM CELLS, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.

ｈＥＳ細胞から導出された内胚葉系列細胞を生成するための一般的な方法は、上記の関
連する米国特許出願、ならびにＤ’Ａｍｏｕｒら、２００５ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．２３：１５３４−４１、およびＤ’Ａｍｏｕｒら、２００６ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．２４（１１）：１３９２−４０１に記載され、それらの開示は参照により本
明細書に完全に組み込まれる。Ｄ’Ａｍｏｕｒらにより、５段階の分化プロトコル：ステ
ージ１（大部分は胚体内胚葉生成がもたらされる）、ステージ２（大部分はＰＤＸ１陰性
前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ３（大部分はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉生成が
もたらされる）、ステージ４（大部分は膵臓内胚葉または膵臓内分泌前駆体生成がもたら
される）およびステージ５（大部分はホルモン発現内分泌細胞生成がもたらされる）が記
載されている。 Common methods for producing endoderm lineage cells derived from hES cells are described in the relevant US patent application described above, as well as D'Amour et al., 2005 Nat Biotechn.
ol. 23: 1534-41, and D'Amour et al., 2006 Nat Biote
chnor. 24 (11): 1392-401, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference. According to D'Amour et al., A five-step differentiation protocol: stage 1 (mostly resulting in endoderm generation), stage 2 (mostly resulting in PDX1-negative foregut germ layer production), stage 3 (mostly resulting in PDX1-negative foregut germ layer production) Describes PDX1-positive foregut germ layer production), stage 4 (mostly resulting in pancreatic endoderm or pancreatic endocrine precursor production) and stage 5 (mostly resulting in hormone-expressing endocrine cell production) Has been done.

「栄養外胚葉」という用語は、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、Ｈ
ＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲ
ＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集
団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、Ｐ
ＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比
較して相対的に高い多分化能細胞を指す。 The term "nutritional ectoderm" refers to HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, H.
CG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ER
Expression of markers selected from the group consisting of BB genes is HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, P in non-nutritive ectoderm cells or cell populations.
Refers to pluripotent cells that are relatively high relative to the expression levels of SG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERBB.

「胚体外内胚葉」は、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲ
Ｃ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発
現レベルが、非胚体外内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢ
Ｄ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能
細胞を指す。 "Extraembryonic endoderm" includes SOX7 gene, SOX17 gene, THBD gene, and SPARC.
The expression levels of markers selected from the group consisting of the C gene, DAB1 gene, or AFP gene are SOX7, SOX17, THB in non-embryonic endoderm cells or cell populations.
Refers to pluripotent cells that are relatively high relative to the expression level of D, SPARC, DAB1, or AFP.

「前原条細胞」という用語は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマー
カー遺伝子の発現レベルが、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１
７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い多分化能細胞
を指す。 The term "maehara strip cell" means that the expression levels of the FGF8 marker gene and / or the NODAL marker gene are BRACHURY low, FGF4 low, SNAI1 low, SOX1.
Refers to pluripotent cells that are relatively high compared to 7 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

「中内胚葉細胞」という用語は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙマーカー遺伝子、ＦＧＦ４、ＳＮ
ＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子の発現レベルが、ＳＯＸ１７
低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い
多分化能細胞を指す。 The term "middle endoderm cell" refers to the brachyury marker gene, FGF4, SN.
The expression level of AI1, MIXL1 and / or WNT3 marker genes is SOX17.
Refers to pluripotent cells that are relatively high compared to low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

「胚体内胚葉（ＤＥ）」という用語は、腸管または腸管から導出された器官の細胞に分
化することができる多分化能内胚葉系列細胞を指す。ある特定の実施形態によると、胚体
内胚葉細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞で
ある。本発明の一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ある特定のマーカーを発現する
、またはある特定のマーカーを有意に発現することができない。一部の実施形態では、Ｓ
ＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、Ｖ
ＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１から選択される１種また
は複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現される。他の実施形態では、ＯＣＴ４
、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、
ＳＯＸ７およびＨＮＦ４アルファから選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚
葉細胞において発現されないまたは有意には発現されない。胚体内胚葉細胞集団およびそ
れを生成する方法は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶ
Ｅ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願にも記載され、それは本明細書に完
全に組み込まれる。 The term "intra-embryonic germ layer (DE)" refers to pluripotent endoderm lineage cells that can differentiate into cells of the intestinal tract or organs derived from the intestinal tract. According to certain embodiments, the germ layer cells in the embryo are mammalian cells, and in a preferred embodiment, the germ layer cells in the embryo are human cells. In some embodiments of the invention, germ layer cells in the embryo are unable to express certain markers or significantly express certain markers. In some embodiments, S
OX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, V
One or more markers selected from WF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 are expressed in embryonic germ layer cells. In other embodiments, OCT4
, Alpha-fetoprotein (AFP), thrombomodulin (TM), SPARC,
One or more markers selected from SOX7 and HNF4alpha are not or significantly not expressed in embryonic germ layer cells. A population of germ layer cells in the embryo and a method for producing it are described in US Patent Application No. 11 / 021,618, entitled DEFINITIV.
It is also described in E ENDODERM, filed December 23, 2004, which is fully incorporated herein.

さらに他の実施形態は、「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」または「前腸内胚葉細胞」と
呼ばれる細胞培養物、またはその同等物に関する。一部の実施形態では、前腸内胚葉細胞
は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）およびＦ
ＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７またはＳＯＸ１を実質的に
発現しない。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団およびその生成方法も、２００６年１０月
２７日に出願の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｎｇ ｄｏｒｓａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍに
記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Yet another embodiment relates to a cell culture, or equivalent, referred to as "PDX1-negative foregut endoderm cells" or "foregut endoderm cells". In some embodiments, the foregut endoderm cells are SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4alpha (HNF4A) and F.
It expresses the OXA1 marker but does not substantially express PDX1, AFP, SOX7 or SOX1. The PDX1-negative foregut endoderm cell population and methods for its generation are also described in US Patent Application No. 11 / 588,693, entitled PDX1-express, filed October 27, 2006.
It is described in the ing dosal and ventral foregut endoderm, which is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される他の実施形態は、「ＰＤＸ１陽性の背側に偏った前腸内胚葉細胞
」（背側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）または単に「ＰＤＸ１陽性内胚葉」の細胞培養
物に関する。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、表１から選択される１つ
または複数のマーカーおよび／または表２から選択される１つまたは複数のマーカーを発
現し、これらも同様に、２００６年１０月２７日に出願の関連する米国特許出願第１１／
５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮ
ＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米
国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｎｄｏ
ｄｅｒｍに記載され、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
Other embodiments described herein are "PDX1-positive dorsal biased foregut endoderm cells" (dorsal PDX1-positive foregut endoderm cells) or simply "PDX1-positive endoderm cells". Regarding the culture. In some embodiments, PDX1-positive endoderm cells express one or more markers selected from Table 1 and / or one or more markers selected from Table 2, and they likewise. Related US Patent Application No. 11 / filed on October 27, 2006
No. 588,693, Title PDX1 EXPRESSING DOSAL AND VEN
TRAL FOREGUT ENDOREM, and US Patent Application No. 11 / 115,868, filed April 26, 2005, entitled PDX1-expressing endo.
Described in derm, these are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される方法によって生成されるものなどのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞
は、完全に分化した膵臓ホルモン分泌または内分泌細胞、例えばインスリン生成β細胞を
生成するために使用することができる前駆体である。本発明の一部の実施形態では、ＰＤ
Ｘ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するように、ＰＤＸ１を
実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞；本明細書では胚体内
胚葉とも呼ばれる）を分化させることによって生成される。 PDX1-positive progenitor endoderm cells, such as those produced by the methods described herein, can be used to produce fully differentiated pancreatic hormone-secreting or endocrine cells, such as insulin-producing β-cells. It is a precursor. In some embodiments of the invention, PD
X1-positive preintestinal germ layers are endoderm cells that do not substantially express PDX1 (PDX1-negative endoderm cells; also referred to herein as embryonic germ layers) so as to form PDX1-positive preintestinal endoderm cells. ) Is generated.

本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅ
ｐｉｔｈｅｌｉａｌ）」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）
」（全て「ＰＥ」と省略することができる）「膵臓前駆体」、「ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚
葉または膵臓内胚葉細胞（「ＰＥＣ」）などのその等価物は全て、先駆または前駆膵臓細
胞である。本明細書に記載のＰＥＣは、ステージ４分化（約１２〜１４日目）後の前駆細
胞集団であり、少なくとも２つの主要な別個の集団：ｉ）ＮＫＸ６．１を発現するが、Ｃ
ＨＧＡを発現しない（またはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ−）膵臓前駆細胞；およびｉｉ）Ｃ
ＨＧＡを発現する複数ホルモン性（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）内分泌細胞（ＣＨＧＡ陽
性、ＣＨＧＡ＋）を含む。理論に束縛されることなく、ＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧ
Ａを発現しない細胞集団は、ＰＥＣのより活性かつ治療的な構成成分であると仮定され、
一方、ＣＨＧＡ陽性複数ホルモン性内分泌細胞の集団はｉｎ ｖｉｖｏでグルカゴン発現
膵島細胞にさらに分化および成熟すると仮定される。それらの開示はともに参照により本
明細書に完全に組み込まれる、Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｍ
ａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃ
ｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓ
ｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０−７５６、２
０１１年７月３１日オンライン出版およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）、Ａ Ｓｃａｌａ
ｂｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ ７（５）：１−１７、ｅ３７００４を
参照されたい。
さらに、時には、膵臓内胚葉細胞は、すぐ上に記載されているＰＥＣを指すのではなく
、一般に少なくともステージ３およびステージ４型細胞を指して使用される。使用および
意味は文脈から明らかになろう。このように多能性幹細胞、ならびに少なくともｈＥＳ細
胞およびｈＩＰＳ細胞から導出される膵臓内胚葉は、他の内胚葉系の系列細胞型とは、Ｐ
ＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ
およびＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの発現が差次的または高いレベルで
あるが、膵臓内分泌細胞の特質である遺伝子、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲ
Ｌ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１およびＧＬＵＴ１は実質的に発現しないことに基づい
て区別される。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は他の非膵臓
構造（例えば、十二指腸）に分化することができる。一実施形態では、本明細書に記載さ
れるＮＧＮ３発現内分泌前駆体は、成熟した膵臓系列細胞、例えば膵臓内分泌細胞に分化
する。膵臓内胚葉または内分泌前駆細胞集団およびその方法は、米国特許出願第１１／７
７３，９４４号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉ
ｃ ｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００７年７月５日出願、および米国特許出願第１２／１０７，
０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮ
Ｄ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＯＲＭ
ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願
にも記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 As used herein, "pancreatic germ layer", "pancreatic epithelium"
"Panthelic epithelium", "pancreatic epithelium"
"(All may be abbreviated as" PE ")" Pancreatic precursors "," PDX-1-positive pancreatic endoderm or pancreatic endoderm cells ("PEC") and all their equivalents are precursor or precursor pancreatic cells. Is. The PECs described herein are progenitor cell populations after stage 4 differentiation (about 12-14 days) and express at least two major distinct populations: i) NKX6.1, but C.
Pancreatic progenitor cells that do not express HGA (or CHGA negative, CHGA-); and ii) C
Includes polyhormonal endocrine cells (CHGA positive, CHGA +) that express HGA. Expressing NKX6.1 without being bound by theory, but CHG
A cell population that does not express A is hypothesized to be a more active and therapeutic component of PEC.
On the other hand, a population of CHGA-positive multihormonal endocrine cells is assumed to further differentiate and mature into glucagon-expressing islet cells in vivo. Both of these disclosures are fully incorporated herein by reference, Kelly et al. (2011) Cell-surface m.
arcers for the isolation of pancreasic c
well type derived from embryombryonics
tem cells, Nat Biotechnology. 29 (8): 750-756, 2
July 31, 011 Online Publishing and Schulz et al. (2012), A Scala
ble System for Production of Fundamental
Pancreas Progenitors from Human Embryo
See nic Stem Cells, PLOS One 7 (5): 1-17, e37004.
Moreover, sometimes pancreatic endoderm cells are commonly used to refer to at least stage 3 and stage 4 type cells, rather than to the PECs listed directly above. Use and meaning will be clear from the context. Thus, pluripotent stem cells, and at least pancreatic endoderm derived from hES cells and hIPS cells, are different from other endoderm lineage cell types.
DX1, NKX6.1, PTF1A, CPA1, cMYC, NGN3, PAX4, ARX
And genes selected from the NKX 2.2 markers, which have differential or high levels of expression but are characteristic of pancreatic endocrine cells, such as CHGA, INS, GCG, GHR.
L, SST, MAFA, PCSK1 and GLUT1 are distinguished based on their substantial non-expression. In addition, some "endocrine progenitor cells" expressing NGN3 can differentiate into other non-pancreatic structures (eg, duodenum). In one embodiment, the NGN3 expression endocrine precursors described herein differentiate into mature pancreatic lineage cells, such as pancreatic endocrine cells. Pancreatic endoderm or endocrine progenitor cell populations and methods thereof are described in US Patent Application No. 11/7
No. 73,944, title Methods of producing pancreati
hormones, filed July 5, 2007, and US Patent Application No. 12/107,
No. 020, title METHODS FOR PURIFYING ENDORERM AN
D PANCREATIC ENDORERM CELLS DERIVED FORM
HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS are also described in the April 21, 2008 application, the disclosures of which are incorporated herein by reference.

本明細書で使用される場合、「内分泌先駆細胞」は、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ
３）を発現し、限定されずに膵島ホルモン発現細胞などの内分泌系の細胞にさらに分化す
ることができる、胚体内胚葉系列の多分化能細胞を指す。内分泌先駆細胞は、より低い特
異性で分化した胚体内胚葉系列細胞、例えばＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞と比較して、同
じくらい多くの異なる細胞、組織および／または器官タイプには分化することができない
。 As used herein, "endocrine precursor cells" are neurogenin 3 (NEUROG).
It refers to a pluripotent cell of the germ layer lineage in the embryo that expresses 3) and can further differentiate into endocrine cells such as islet hormone-expressing cells without limitation. Endocrine pioneer cells cannot differentiate into as many different cell, tissue and / or organ types as those with lower specificity differentiated endoderm lineage cells, such as PDX1-positive pancreatic endoderm cells. ..

本明細書で使用される場合、「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」またはそ
の同等物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性細胞から誘導された、複数ホルモン性または単一
ホルモン性であってもよい細胞を指す。したがって、内分泌細胞は、ヒト膵島細胞の機能
の少なくとも一部を有する、１つまたは複数の膵臓ホルモンを発現することができる。膵
島ホルモン発現細胞は、成熟していても未熟であってもよい。未熟な膵島ホルモン発現細
胞は、特定のマーカーの差次的発現に基づくか、それらの機能的能力、例えばグルコース
応答性に基づいて、成熟した膵島ホルモン発現細胞から区別することができる。 As used herein, "islet hormone-expressing cells", "pancreatic endocrine cells" or their equivalents are multihormonal or monohormonal, in vitro induced from pluripotent cells. Refers to good cells. Thus, endocrine cells can express one or more pancreatic hormones that have at least some of the function of human islet cells. The islet hormone-expressing cells may be mature or immature. Immature islet hormone-expressing cells can be distinguished from mature islet hormone-expressing cells based on the differential expression of specific markers or based on their functional capacity, such as glucose responsiveness.

本明細書に記載の実施形態では、限定培地、馴化培地、フィーダーフリー培地、無血清
培地などを含めた多くの幹細胞培地培養物または成長環境が想定される。本明細書で使用
される場合、「成長環境」または「環境」という用語またはその等価物は、未分化の幹細
胞または分化した幹細胞（例えば、霊長類胚性幹細胞）がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する環
境である。環境の特徴は、細胞を培養する培地、および存在する場合には支持構造（例え
ば、固体表面上の基質など）を含む。多能性細胞を培養または維持するためおよび／また
は多能性細胞を分化させるための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題Ｃ
ＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＥＦＵＬ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵ
ＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ ＣＥＬＬＳ、２００７年２月２３日出願；米
国特許出願第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ
ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ
ＴＨＥＲＥＯＦ、２００７年１２月２０日出願；および米国特許出願第１１／８７５，０
５７号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅ
ｒ−ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ、２００７年１０月１９日出願にも記載され、それ
らの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 In the embodiments described herein, many stem cell medium cultures or growth environments are envisioned, including limited media, conditioned media, feeder-free media, serum-free media, and the like. As used herein, the term "growth environment" or "environment" or its equivalent is used in an environment in which undifferentiated or differentiated stem cells (eg, primate embryonic stem cells) proliferate in vitro. is there. Environmental features include media for culturing cells and, if present, support structures (eg, substrates on solid surfaces). Methods for culturing or maintaining pluripotent cells and / or for differentiating pluripotent cells are described in PCT / US2007 / 062755, entitled C.
OMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTU
RING DIFFERENTIABLE CELLS, filed February 23, 2007; US Patent Application No. 11 / 993,399, entitled EMBRYONIC STEM CELL
CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
THEREOF, filed December 20, 2007; and US Patent Application No. 11 / 875,0
No. 57, title Methods and compositions for fede
r-free pluripotent stem cell media conta
It is also described in the ining human serum, filed October 19, 2007, and their disclosure is incorporated herein by reference in its entirety.

「本質的に」または「実質的に」という用語は、ある成分または細胞が、最小または少
ない量で任意の細胞凝集懸濁液タイプ、例えば本明細書に記載される懸濁液中の細胞凝集
体中に存在することが、「本質的または実質的に均一」、「本質的または実質的にホモ細
胞性」であること、あるいは、「本質的にｈＥＳ細胞」、「本質的または実質的に胚体内
胚葉細胞」、「本質的または実質的に前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性前膵臓内胚葉細胞」、「
本質的または実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または前駆細胞」、「本質的または実質的
にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞」、「本質的または実質的に膵臓内分泌先駆細胞」、「
本質的または実質的に膵臓内分泌細胞」等で構成されることを意味する。 The term "essentially" or "substantially" refers to a component or cell in any cell aggregation suspension type, eg, a cell coagulation in a suspension described herein, in minimal or small amounts. What is present in the aggregate is "essentially or substantially uniform", "essentially or substantially homocellular", or "essentially hES cells", "essentially or substantially homocellular". "Intra-embryonic germ layer cells", "essentially or substantially anterior endoderm cells", "essentially or substantially PDX"
1-negative foregut endoderm cells ”,“ essentially or substantially PDX1-positive prepancreatic endoderm cells ”,“
"Essentially or substantially PDX1-positive endoderm or progenitor cells", "essentially or substantially PDX1-positive endoderm end cells", "essentially or substantially pancreatic endocrine precursor cells", "
It means that it is composed of "essentially or substantially pancreatic endocrine cells" and the like.

細胞培養中または細胞集団内の細胞に関して、「を実質的に含まない」という用語は、
細胞培養物または細胞集団が含まれないと特定された細胞型が、細胞培養物または細胞集
団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６
％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在
することを意味する。 With respect to cells in cell culture or within a cell population, the term "substantially free"
Cell types identified as free of cell cultures or populations account for less than about 10%, less than about 9%, less than about 8%, about 7% of the total number of cells present in the cell culture or population. Less than, about 6
It means that it is present in an amount of less than%, less than about 5%, less than about 4%, less than about 3%, less than about 2% or less than about 1%.

細胞培養物は、含有する血清が減少しているまたは血清を実質的に含まないまたは血清
を含まない培地中で成長させることができる。ある特定の培養条件下で、血清濃度は約０
％（ｖ／ｖ）から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲とすることができる。例えば、いくつかの分
化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ
）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）
未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未
満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％未満（ｖ／ｖ）、約
２％未満（ｖ／ｖ）、約３％未満（ｖ／ｖ）、約４％未満（ｖ／ｖ）、約５％未満（ｖ／
ｖ）、約６％未満（ｖ／ｖ）、約７％未満（ｖ／ｖ）、約８％未満（ｖ／ｖ）、約９％未
満（ｖ／ｖ）または約１０％（ｖ／ｖ）未満であってよい。いくつかのプロセスでは、血
清を用いずに、または血清代替物を用いずに前原条細胞を成長させる。さらに他のプロセ
スでは、Ｂ２７の存在下で前原条細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サ
プリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってよい。 Cell cultures can be grown in serum-depleted or serum-free or serum-free medium. Under certain culture conditions, serum concentration is about 0
It can range from% (v / v) to about 10% (v / v). For example, in some differentiation processes, the serum concentration of the medium is less than about 0.05% (v / v), about 0.1% (v / v).
), Less than about 0.2% (v / v), less than about 0.3% (v / v), about 0.4% (v / v)
Less than, less than about 0.5% (v / v), less than about 0.6% (v / v), less than about 0.7% (v / v), less than about 0.8% (v / v), Less than about 0.9% (v / v), less than about 1% (v / v), less than about 2% (v / v), less than about 3% (v / v), less than about 4% (v / v) ), Less than about 5% (v /
v), less than about 6% (v / v), less than about 7% (v / v), less than about 8% (v / v), less than about 9% (v / v) or about 10% (v / v) ) May be less than. In some processes, preprotozoan cells are grown without serum or serum substitutes. In yet another process, Maehara streaks are grown in the presence of B27. In such a process, the concentration of B27 supplement may range from about 0.1% (v / v) to about 20% (v / v).

さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で未成熟膵島ホルモン発現細胞を成長させる
。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２
０％（ｖ／ｖ）までの範囲であってもよく、約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度であっても
よい。ある特定のプロセスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０
．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ
）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％
（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ
）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９
％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）であ
る。あるいは、添加するＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の強度
の倍数として測定することができる。例えば、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）から５０×ストック溶液として入手可能である。十分な量のこのストッ
ク溶液を十分な体積の成長培地に添加することにより、所望の量のＢ２７が補充された培
地を生成する。例えば、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに添加す
ることにより、５×Ｂ２７が補充された成長培地を生成することになる。培地中のＢ２７
サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×
、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×
、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．
９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×
、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１
５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×および約２０×超であってよ
い。 Yet another process is to grow immature islet hormone-expressing cells in the presence of B27. In such a process, the concentration of B27 supplement is from about 0.1% (v / v) to about 2
It may be in the range up to 0% (v / v) and may be in a concentration greater than about 20% (v / v). In one particular process, the concentration of B27 in the medium was about 0.1% (v / v), about 0.
.. 2% (v / v), about 0.3% (v / v), about 0.4% (v / v), about 0.5% (v / v)
), About 0.6% (v / v), about 0.7% (v / v), about 0.8% (v / v), about 0.9%
(V / v), about 1% (v / v), about 2% (v / v), about 3% (v / v), about 4% (v / v)
), About 5% (v / v), about 6% (v / v), about 7% (v / v), about 8% (v / v), about 9
% (V / v), about 10% (v / v), about 15% (v / v) or about 20% (v / v). Alternatively, the concentration of the B27 supplement to be added can be measured as a multiple of the strength of a commercially available B27 stock solution. For example, B27 is Invitrogen (Carl)
It is available as a 50x stock solution from sbad, CA). A sufficient amount of this stock solution is added to a sufficient volume of growth medium to produce a medium supplemented with the desired amount of B27. For example, adding 10 ml of a 50 × B27 stock solution to 90 ml of growth medium will produce a growth medium supplemented with 5 × B27. B27 in medium
Supplement concentrations are about 0.1x, about 0.2x, about 0.3x, about 0.4x, about 0.5x
, About 0.6 ×, about 0.7 ×, about 0.8 ×, about 0.9 ×, about 1 ×, about 1.1 ×, about 1.2 ×
, About 1.3x, about 1.4x, about 1.5x, about 1.6x, about 1.7x, about 1.8x, about 1.
9x, about 2x, about 2.5x, about 3x, about 3.5x, about 4x, about 4.5x, about 5x, about 6x
, About 7x, about 8x, about 9x, about 10x, about 11x, about 12x, about 13x, about 14x, about 1
It may be 5x, about 16x, about 17x, about 18x, about 19x, about 20x and more than about 20x.

本明細書で使用される場合、例えば成長因子、分化因子などの「外因的に添加された」
化合物とは、培養物または馴化培地に関しては、培養物または培地にすでに存在していて
もよい任意の化合物または成長因子を補うために培養物または培地に添加される成長因子
を指す。例えば、一部の実施形態では、細胞培養物および／または細胞集団は、外因的に
添加されたレチノイドを含まない。 As used herein, for example, "extrinsically added" growth factors, differentiation factors, etc.
Compound refers to a growth factor added to the culture or medium to supplement any compound or growth factor that may already be present in the culture or medium, with respect to the culture or conditioned medium. For example, in some embodiments, the cell culture and / or cell population does not contain exogenously added retinoids.

本明細書で使用される場合、「レチノイド」とは、レチノール、レチナールまたはレチ
ノイン酸ならびにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。好ましい実施形態では、レ
チノイドはレチノイン酸である。 As used herein, "retinoid" refers to retinol, retinal or retinoic acid and derivatives of any of these compounds. In a preferred embodiment, the retinoid is retinoic acid.

「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子
ファミリーのメンバー」は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧ
Ｆ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１
３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧ
Ｆ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３からなる群から選択されるＦＧＦを意
味する。一部の実施形態では、「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」
または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」とは、公知の線維芽細胞成長因子フ
ァミリーのメンバーとの相同性および／またはそれと同様の機能を有する任意の成長因子
を意味する。 "FGF family growth factors", "fibroblast growth factors" or "members of the fibroblast growth factor family" are FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FG.
F6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF1
3, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FG
It means FGF selected from the group consisting of F20, FGF21, FGF22 and FGF23. In some embodiments, "FGF family growth factor", "fibroblast growth factor"
Alternatively, "member of the fibroblast growth factor family" means any growth factor having homology and / or similar function to a known member of the fibroblast growth factor family.

本明細書で使用される場合、「発現」は、材料または物質の生成ならびに材料または物
質の生成のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を決定することと
は、発現されるマーカーの相対量または絶対量を検出することまたは単にマーカーが存在
するかしないかを検出することを指す。 As used herein, "expression" refers to the production of a material or substance and the level or amount of production of the material or substance. Thus, determining the expression of a particular marker refers to detecting the relative or absolute amount of the expressed marker, or simply detecting the presence or absence of the marker.

本明細書で使用される場合、「マーカー」は、観察または検出することができる任意の
分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の遺伝子の転
写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質
、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または小分子（例えば、分子量が１０，００
０ａｍｕ未満の分子）を挙げることができる。 As used herein, "marker" refers to any molecule that can be observed or detected. For example, markers include, but are not limited to, nucleic acids such as transcripts of specific genes, gene polypeptide products, non-gene product polypeptides, glycoproteins, carbohydrates, glycolipids, lipids, lipoproteins or small molecules ( For example, the molecular weight is 10:00
Molecules less than 0 amu) can be mentioned.

本明細書に記載の大多数のマーカーについて、公式のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＨＵＧＯ）遺伝子記号が提供される。ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏ
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより開発されるそのような記号により、命
名されたヒト遺伝子および遺伝子産物のそれぞれに対して特有の略語が提供される。当業
者はこれらの遺伝子記号を容易に認識することができ、また、対応する独特のヒト遺伝子
および／またはタンパク質配列と容易に関連付けることができる。 For the majority of the markers described herein, the official Human Genome Or
The ganization (HUGO) gene symbol is provided. HUGO Gene No
Such symbols, developed by the mencrature Committee, provide specific abbreviations for each of the named human genes and gene products. Those skilled in the art can easily recognize these gene symbols and can easily associate them with the corresponding unique human gene and / or protein sequences.

ＨＵＧＯによる名称によると、以下の遺伝子記号は次のように定義される：ＧＨＲＬ−
グレリン；ＩＡＰＰ−島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ−インスリン；ＧＣＧ−グルカ
ゴン；ＩＳＬ１−ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６−ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４−
ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３−ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２
−２−ＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６−１−ＮＫＸ６転写
因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１−インスリンプロモーター 因子１（Ｐ
ＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１−ワンカットドメイン、ファミリーメンバー１（ＨＮＦ６）；
ＨＬＸＢ９−ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２−転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ
）；ＦＯＸＡ１−フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ−肝細胞成長因子；ＩＧＦ１−イ
ンスリン様成長因子１；ＰＯＵ５Ｆ１−ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＯＣＴ
４）；ＮＡＮＯＧ−Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボ
ックス２；ＣＤＨ１−カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ−ｂｒａｃ
ｈｙｕｒｙホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４−線維芽細胞成長因子４；ＷＮＴ３−無翅
型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー３；ＳＯＸ１７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）
−ボックス１７；ＧＳＣ−グースコイド；ＣＥＲ１−（ケルベロス１、システインノット
スーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４−ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチー
フ）受容体４；ＦＧＦ１７−線維芽細胞成長因子１７；ＦＯＸＡ２−フォークヘッドボッ
クスＡ２；ＳＯＸ７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；ＳＯＸ１−ＳＲＹ（性決定
領域Ｙ）−ボックス１；ＡＦＰ−アルファ−フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ−分泌タンパ
ク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；およびＴＨＢＤ−トロンボモジュ
リン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ−神経系細胞接着分子；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＺＩＣ１−
Ｚｉｃファミリーメンバー１；ＮＥＦ３−神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ−ソマ
トスタチン；ＭＡＦＡ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ−ｖ−
ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＣＨＧＡ−クロ
モグラニンＡ（副甲状腺分泌型タンパク質１）。 According to the name by HUGO, the following genetic symbols are defined as: GHRL-
Ghrelin; IAPP-island amyloid polypeptide; INS-insulin; GCG-glucagon; ISL1-ISL1 transcription factor; PAX6-paired box gene 6; PAX4-
Paired box gene 4; NEUROG3-neurogenin 3 (NGN3); NKX2
-2-NKX2 transcription factor-related locus 2 (NKX2.2); NKX6-1-NKX6 transcription factor-related locus 1 (NKX6.1); IPF1-insulin promoter factor 1 (P)
DX1); ONECUT1-one-cut domain, family member 1 (HNF6);
HLXB9-Homeobox B9 (HB9); TCF2-transcription factor 2, liver (HNF1b)
); FOXA1-forkhead box A1; HGF-hepatocyte growth factor; IGF1-insulin-like growth factor 1; POU5F1-POU domain, class 5, transcription factor 1 (OCT)
4); NANOG-Nanog homeobox; SOX2-SRY (sex-determining region Y) -box 2; CDH1-cadherin type 1, type 1, E-cadherin (ECAD); T-brac
hyury homologue (BRACH); FGF4-fibroblast growth factor 4; WNT3-wingless MMTV integration site family, member 3; SOX17-SRY (sex-determining region Y)
-Box 17; GSC-Gouscoid; CER1- (Kerberos 1, cysteine knot superfamily, homolog (CER); CXCR4-chemokine (C-X-C motif) receptor 4; FGF17-fibroblast growth factor 17; FOXA2- Forkhead Box A2; SOX7-SRY (Sex Determining Region Y) -Box 7; SOX1-SRY (Sex Determining Region Y) -Box 1; AFP-Alpha-Fet Protein; SPARC-Secret Protein, Acidic, Cytone Rich (Osteonectin) ; And THBD-thrombomodulin (TM), NCAM-neural cell adhesion molecule; SYS-synaptophidin; ZIC1-
Zic Family Member 1; NEF3-Neurofilament 3 (NFM); SST-Somatostatin; MAFA-v-maf Myo-Aponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A; MAFB-v-
maf muscle aponeurosis fibrosarcoma oncogene homolog B; SYS-synaptophysin; CHGA-chromogranin A (parathyroid secretory protein 1).

非ＨＵＧＯ遺伝子記号に対応する完全遺伝子名、ならびに本明細書で使用することがで
きる他の略記号を以下に提供する：ＳＳ−ソマトスタチン（ＳＯＭ）；ＰＰ−膵臓ポリペ
プチド；Ｃペプチド−接続ペプチド；Ｅｘ４−エキセンディン４；ＮＩＣ−ニコチンアミ
ドおよびＤＡＰＴ−Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−
Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；ＲＡ−レチノイン酸；ＲＰＭＩ−Ｒｏｓｗｅ
ｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地；ＣＭＲＬ−Ｃｏｎｎａｕ
ｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ培地；ＦＢＳ−ウシ胎児血清；Ｎ
ＢＰ １０−ＮＣＡＭ結合タンパク質１０；ＰＴＦ１ａ−膵臓特異的転写因子１ａ。 The complete gene name corresponding to the non-HUGO gene symbol, as well as other abbreviations that can be used herein, are provided below: SS-somatostatin (SOM); PP-pancreatic polypeptide; C-peptide-connecting peptide; Ex4-exendin 4; NIC-nicotinamide and DAPT-N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl]-
S-Phenylglycine t-Butyl ester; RA-retinoic acid; RPMI-Roswee
ll Park Memorial Institute Medium; CMRL-Connau
ght Medical Research Labs Medium; FBS-Fetal Bovine Serum; N
BP 10-NCAM binding protein 10; PTF1a-pancreas-specific transcription factor 1a.

多能性細胞から種々の多分化能および／または分化した細胞への進行は、遺伝子、また
は遺伝子マーカーの相対的な発現量、特定の細胞の特性を、第２の遺伝子または対照遺伝
子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現と比較して決定することによってモニタリング
することができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが
存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの
発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定すること
によって決定することができる。そのようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は定性
的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成するマーカーの発現を
定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用することによるものである
。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。当技術分野で公知の他の方法も
、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝
子の発現産物は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出
することができる。 Progression from pluripotent cells to various pluripotent and / or differentiated cells determines the relative expression of the gene, or gene marker, the characteristics of a particular cell, a second gene or control gene, eg, house. It can be monitored by determining by comparison with the expression of the keeping gene. In some processes, the expression of a particular marker is determined by detecting the presence or absence of the marker. Alternatively, the expression of a particular marker can be determined by measuring the level of presence of the marker in cells of a cell culture or cell population. In such a process, the measurement of marker expression may be qualitative or quantitative. One method of quantifying the expression of markers produced by a marker gene is by using quantitative PCR (Q-PCR). Methods of performing Q-PCR are well known in the art. Other methods known in the art can also be used to quantify marker gene expression. For example, the expression product of a marker gene can be detected by using an antibody specific for the marker gene product of interest.

いくつかのプロセスでは、以下の遺伝子の高発現により、細胞のある特定の集団が示さ
れる。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＦＰまたはＴＨＢＤにより胚体外内胚葉が示さ
れ、ＮＯＤＡＬおよび／またはＦＧＦ８により前原条が示され、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆ
ＧＦ４、ＳＮＡＩ１および／またはＷＮＴ３により中内胚葉が示され、ＣＥＲ、ＧＳＣ、
ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２により胚体内胚葉細胞が示され、ＳＯＸ１７、
ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａにより前腸内胚葉（またはＰＤＸ
１陰性内胚葉）が示され、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１によりＰＤＸ
１陽性内胚葉が示され、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦＡ１、ＣＰＡおよびｃＭＹＣに
より膵臓上皮（ＰＥまたは膵臓前駆体）が示され、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮ
ＫＸ２．２により内分泌先駆細胞が示され、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰ
Ｐにより種々の内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現がＭＡＦＢ遺伝子発現に対して
相対的に高いことにより、インスリン分泌内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現に対
するＭＡＦＢの相対的な高発現により、グルカゴン分泌内分泌細胞が示される。 In some processes, high expression of the following genes indicates a particular population of cells. For example, SOX17, SOX7, AFP or THBD indicate the ectoderm, NODAL and / or FGF8 indicates the Maehara streaks, brachyury, F.
Medium endoderm is indicated by GF4, NSAI1 and / or WNT3, CER, GSC,
CXCR4, SOX17 and FOXA2 show germ layer cells in the embryo, SOX17,
Foregut endoderm (or PDX) by FOXA2, FOXA1, HNF1B and HNF4A
1 negative endoderm) is shown and PDX by PDX1, HNF6, SOX9 and PROX1
1 positive endoderm is shown, PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA and cMYC show pancreatic epithelium (PE or pancreatic precursor), NGN3, PAX4, ARX and N
KX2.2 indicates endocrine precursor cells, INS, GCG, GHRL, SST and P
Various endocrine cells are indicated by P, insulin secretory endocrine cells are indicated by the relative high MAFA gene expression relative to MAFB gene expression, and glucagon secretion due to the relative high expression of MAFB relative to MAFA gene expression. Endocrine cells are shown.

用語線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、
同義である。 The terms fibroblast growth factor 7 (FGF7) and keratinocyte growth factor (KGF) are
It is synonymous.

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するための方法
本明細書に記載の実施形態は、いかなる１つの型のｉＰＳ細胞にも、いかなる１つのｉ
ＰＳ細胞の生成方法にも限定されない。種々の方法が存在するので、実施形態は限定的な
ものではない、またはｉＰＳ細胞の生成の効率のレベルに左右される。本明細書に記載の
実施形態はｉＰＳ細胞の内胚葉系列細胞への分化およびその使用にあてはまる。 Methods for Generating Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells The embodiments described herein are for any type of iPS cell and for any one i.
It is not limited to the method of producing PS cells. As there are various methods, the embodiments are not limited or depend on the level of efficiency of iPS cell production. The embodiments described herein apply to the differentiation of iPS cells into endoderm lineage cells and their use.

アデノウイルス、プラスミド、またはＣｒｅ−ｌｏｘＰ３もしくはｐｉｇｇｙ ＢＡＣ
転位を使用したリプログラミング因子の切除を使用する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
を生じさせるためのウイルスによる方法、ウイルスによらない方法および非組込み型ウイ
ルスによる方法が記載されている。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｔａｄ
ｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２、９４５−９４９（２００８）；Ｏｋｉｔ
ａ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２、９４９−９５３（２００８）；Ｋａｊｉ，Ｋ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ ４５８、７７１−７７５（２００９）；Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅ
ｌｌ １３６、９６４−９７７（２００９）；およびＷｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ４５８、７６６−７７０（２００９）を参照されたい。同様に、それらもまた参照
により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２
０１００００３７５７号（２０１０年１月７日公開）およびＳｈｉらに対するＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２００９／０３７４２９も参照されたい。しかし、これらの方法のリプログラミング効
率は低く（＜０．００３％）、切除にもかかわらずベクター配列が残留する可能性があり
、それにより、それらの治療への適用が限定される。例えば、上記の転写因子の宿主ゲノ
ムへのウイルスによる組み込みおよび過剰発現は腫瘍形成に関連付けられており、導入遺
伝子の発現が残留することは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を区別する潜在的な特徴である
。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｏｌｄｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ １３６
：９６４−９７７（２００９）；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：１４９１−
１５００（２００５）；およびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ １２１：
４６５−４７７（２００５）を参照されたい。 Adenovirus, plasmid, or Cre-loxP3 or piggy BAC
Induced pluripotent stem cells (iPSC) using reprogramming factor excision using translocation
A virus-based method, a non-virus-based method, and a non-embedded virus-based method are described. Stad, incorporated herein by reference.
tfeld, M. et al. Et al., Science 322, 945-949 (2008); Okit
a, K. Et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K. et al. Et al., Nature 458, 771-775 (2009); Soldner, F. et al. Et al., Ce
ll 136, 964-977 (2009); and Woltjen, K. et al. Et al. Natu
See re 458, 766-770 (2009). Similarly, they are also fully incorporated herein by reference, Mack, A. et al. US Patent Application Publication No. 2
PCT / U for No. 0100003757 (released January 7, 2010) and Shi et al.
See also S2009 / 037429. However, the reprogramming efficiency of these methods is low (<0.003%), and vector sequences may remain despite excision, which limits their therapeutic application. For example, viral integration and overexpression of the above transcription factors into the host genome has been associated with tumorigenesis, and residual transgene expression is a potential feature that distinguishes ES cells from iPS cells. .. Solder, F. et al., Which is incorporated herein by reference. Et al., Cell 136
: 964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24: 1491-
1500 (2005); and Hochedlinger, K. et al. Et al., Cell 121:
See 465-477 (2005).

本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法はエプスタイン・バーウ
イルス由来のエピソームベクターを含む。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｙ
ｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４、７９７−８０１（２００９）およびＭａｃｋ，Ａ．
らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号、２０１０年１月７日公開を参
照されたい。これらの方法では、癌遺伝子ＳＶ４０を含めた７種の因子の組合せを有する
３つの別々のプラスミドが必要である。 In another embodiment of the invention, the method for producing an iPSC comprises an Epstein-Barr virus-derived episomal vector. Y, which is fully incorporated herein by reference.
u, J. Et al., Science 324, 797-801 (2009) and Mack, A. et al.
See U.S. Patent Application Publication No. 20100003757, published January 7, 2010. These methods require three separate plasmids with a combination of seven factors, including the oncogene SV40.

本発明の別の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法は、マウス細胞およびヒ
ト胎児細胞および新生児細胞由来のタンパク質に基づくｉＰＳＣを含む。参照により本明
細書に完全に組み込まれる、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、３
８１−３８４（２００９）；およびＫｉｍ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４
、４７２−４７６（２００９）を参照されたい。これらの方法体系は、化学的処理（例え
ば、Ｚｈｏｕら、２００９、上記の場合ではバルプロ酸）または多数回の処理（Ｋｉｍら
、２００９、上記）を使用して実現される。 In another embodiment of the invention, methods for producing iPSCs include iPSCs based on proteins derived from mouse cells and human fetal cells and neonatal cells. Zhou, H. et al., Which is incorporated herein by reference. Et al., Cell Aspect Cell 4, 3
81-384 (2009); and Kim, D. et al. Et al., Cell Stem Cell 4
, 472-476 (2009). These methodologies are realized using chemical treatments (eg, Zhou et al., 2009, valproic acid in the above case) or multiple treatments (Kim et al., 2009, supra).

本発明の別の実施形態では、細菌の複製開始点および抗生物質耐性遺伝子を欠くスーパ
ーコイルＤＮＡ分子であるミニサークルベクターまたはプラスミドを使用することができ
る。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｍｏｌ． Ｔ
ｈｅｒ． ８、４９５−５００（２００３）；Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｈｕｍ． Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒ． １６、１２６−１３１（２００５）；およびＪｉａ，Ｆら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｄｖａｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｎｌｉｎｅ ７
Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０を参照されたい。これらの方法体系では、外因性サイレンシ
ング機構の活性化が低いので、より高いトランスフェクション効率およびより長期の異所
性発現でｉＰＳＣが生じる。 In another embodiment of the invention, a minicircle vector or plasmid, which is a supercoiled DNA molecule lacking a bacterial replication origin and an antibiotic resistance gene, can be used. Chen, Z. et al., Fully incorporated herein by reference. -Y. Et al., Mol. T
her. 8, 495-500 (2003); Chen, Z. et al. -Y. Et al., Hum. Ge
ne Ther. 16, 126-131 (2005); and Jia, F et al., Natu
re Methods Publication PublicationOnline 7
See February 2010. In these method systems, the activation of exogenous silencing mechanisms is low, resulting in iPSCs with higher transfection efficiency and longer-term ectopic expression.

本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者、ＡＬＳ、脊椎筋ジストロフィーおよび
パーキンソン患者を含めた種々の疾患のヒト患者からｉＰＳ細胞を生じさせることができ
る。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｅｈｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０
６（３７）：１５７６８−７３（２００９）；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１：
１２１８−２１（２００８）；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：２７７−８０（２
００９）；Ｐａｒｋら、Ｃｅｌｌ １３４：８７７−８８６（２００８）；およびＳｏｌ
ｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ １３６：９６４−９７７を参照されたい。特定の疾患を有する患
者からｈＩＰＳ細胞を生成することの少なくとも１つの利点は、導出された細胞がヒト疾
患の遺伝子型および細胞応答を含有することである。現存するヒトｉＰＳ細胞株の少なく
とも一部が列挙されている表３も参照されたい。この情報は、文献および例えばＮａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ
ＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた
公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞
株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載の組成物および方法の複数の実施形態では、これだけに限定されないが
、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２１２、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２５、（少なくとも本出願の出願時
に、ＶｉａＣｙｔｅ Ｉｎｃ．、３５５０ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｔｐｍｉｃｓ Ｃｏｕｒ
ｔ、Ｓａｎ Ｄｅｉｇｏ ＣＡ ９２１２１から市販されていた）、ＢＧＯ１、ＢＧ０２
およびＭＥＬ１を含めたｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞、ならびにｉＰＳＣ−４８２ｃ
７およびｉＰＳＣ−６０３（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ならびにｉＰＳＣ−Ｇ４
（以下「Ｇ４」）およびｉＰＳＣ−Ｂ７（以下、「Ｂ７」）（Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎ
ａｋａ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｋｙｏｔｏ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含めた種々の分化可能な霊長
類多能性幹細胞の使用が意図されており、Ｇ４およびＢ７を使用した試験は、本明細書に
詳しく記載されている。ある特定のこれらのヒト多能性幹細胞はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）などの国際登録機関に登録され、ＮＩ
Ｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている（例えば、Ｃ
ｙＴ４９の登録番号は００４１である）。他の入手可能な細胞株はｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙのワールドワイドウェブにも見出
すことができる。さらに他の細胞株、例えば、ＢＧ０１およびＢＧＯ１ｖは、それぞれＷ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ＷＩＳＣ）Ｂａ
ｎｋの関係団体であるＷｉＣｅｌｌ（登録商標）（カタログ名、ＢＧ０１）およびＡＴＣ
Ｃ（カタログ番号ＳＣＲＣ−２００２）によって第三者に販売および配布されている。本
明細書に記載の他の細胞株はＷｉＣｅｌｌ（登録商標）またはＡＴＣＣなどの生物学的リ
ポジトリによって登録または配布されていない場合があるが、そのような細胞株は原理研
究者、研究室および／または施設から直接または間接的に公に入手可能である。細胞株お
よび試薬の公開要求は、例えば生命科学の当業者にとっては通例である。一般には、これ
らの細胞または材料の譲渡は、細胞株または材料の所有者と受取人の間の標準の材料譲渡
契約を介する。これらの型の材料譲渡は、特に生命科学における研究環境では頻繁に生じ
る。実際、出願人は、ＣｙＴ４９（２００６）、ＣｙＴ２０３（２００５）、Ｃｙｔ２１
２（２００９）、ＣｙＴ２５（２００２）、ＢＧ０１（２００１）、ＢＧ０２（２００１
）、ＢＧ０３（２００１）およびＢＧＯｌｖ（２００４）を含めた細胞が導出され特徴付
けられた時から、営利および非営利産業パートナーおよび共同研究者とのそのような契約
を通じて常套的に細胞の譲渡を受けてきた。前記の一覧の各細胞株の隣の括弧内の年は、
細胞株または材料が公的に入手可能かつ不死のものになった（例えば細胞バンクが作製さ
れた）年を示し、したがって、組成物を作製するためおよび本明細書に記載の方法を実施
するためにこれらの細胞株が樹立された時から別の胚の破壊は実施または要求されていな
い。
２００６年８月、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、ｈＥＳＣは単一の割球から誘導するこ
とができ、したがって胚を無傷にしておき、それらの破壊を引き起こさないことを実証し
た。顕微操作技術を使用して各胚から生検を実施し、十九（１９）個のＥＳ細胞様増生お
よび二（２）個の安定したｈＥＳＣ系が得られた。これらのｈＥＳＣ系は六（６）カ月以
上も未分化状態に維持することができ、正常な核型、ならびにＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３
、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇおよびアルカリ性ホ
スファターゼを含む多能性のマーカーの発現を示した。これらのｈＥＳＣは、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで全て三つ（３つ）の胚性胚葉の誘導体を分化、形成すること、およびｉｎ ｖｉ
ｖｏでテラトーマの形で形成することができる。胚の破壊なしで新しい幹細胞系を作製す
るこれらの方法は、ヒト胚を使用することの倫理上の懸念に対処する。その開示が参照に
より本明細書に完全に組み込まれる、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００６）Ｎａｔｕｒ
ｅ ４４４：４８１〜５頁、Ｅｐｕｂ ２００６年８月２３日を参照。しかし、Ｋｌｉｍ
ａｎｓｋａｙａらは、誘導したｈＥＳＣ系を他のｈＥＳＣと共培養した。後に、２００８
年に、Ｃｈｕｎｇ Ｙ．らは、ｈＥＳＣとの共培養なしで単一の割球から再びｈＥＳ細胞
系を得ることができた。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ Ｙ．ら
、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００８、２（２）、１１３〜１１７頁を参照。した
がって、本明細書に記載される組成物および方法、特に人工多能性幹細胞または遺伝的に
脱分化した多能性幹細胞に関連するようなそのような組成物および方法は、ヒト胚の破壊
を必要としない。
表３および表４は、それぞれ、ある特定のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの包括的ではない一
覧であり、研究目的および／または商業目的で世界的に利用可能であり、本発明の方法お
よび組成物での使用に適している。表３および表４の情報は、文献および例えばＮａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕ
ＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含め
た公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細
胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載のヒトｉＰＳＣ（少なくともｉＰＳＣ−６０３およびｉＰＳＣ−４８２
−ｃ７）はＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ
．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により提供されたものである。
In yet another embodiment of the invention, iPS cells can be generated from human patients with a variety of diseases, including diabetic patients, ALS, spinal muscular dystrophy and Parkinson patients. Maehr et al., PNAS USA 10 which is fully incorporated herein by reference.
6 (37): 15768-73 (2009); Dimos et al., Science, 321:
1218-21 (2008); Evert et al., Nature 457: 277-80 (2)
009); Park et al., Cell 134: 877-886 (2008); and Sol
See dner et al., Cell 136: 964-977. At least one advantage of generating hIPS cells from a patient with a particular disease is that the derived cells contain the genotype and cellular response of the human disease. See also Table 3, which lists at least some of the existing human iPS cell lines. This information can be found in the literature and, for example, Nati.
onal Institutes of Health (NIH) Stem Cell
Registry, the Human Embryonic Stem Cell
Registry and University of Massachusetts M
medical School, Worcester, Massachusetts, US
It is obtained from a publicly available database, including the International Stem Cell Registry in A. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained.
A plurality of embodiments of the compositions and methods described herein include, but are not limited to, CyT49, CyT212, CyT203, CyT25, (at least at the time of filing of this application, ViaCite Inc., 3550 General Operations Course).
(commercially available from t, San Diego CA 92121), BGO1, BG02
And human pluripotent stem cells such as hESC including MEL1 and iPSC-482c
7 and iPSC-603 (Cellular Dynamics Internationali)
onal, Inc. , Madison, Wisconsin), and iPSC-G4
(Hereinafter “G4”) and iPSC-B7 (hereinafter “B7”) (Shinya Yaman
aka, Center for iPS Cell Research, Kyoto U
The use of a variety of differentiable primate pluripotent stem cells, including induced pluripotent stem (iPS) cells such as niversity), is intended and studies using G4 and B7 are described in detail herein. Has been done. Certain of these human pluripotent stem cells are National In
Registered with international registration agencies such as status of Health (NIH), NI
It is listed in the H Human Stem Cell Registry (eg C).
The registration number of yT49 is 0041). Other available cell lines are stem cells.
nih. It can also be found on the worldwide web of gov / research / registry. Still other cell lines, such as BG01 and BGO1v, are W, respectively.
isconsin International Stem Cell (WISC) Ba
WiCell® (catalog name, BG01) and ATC, which are affiliated organizations of nk.
Sold and distributed to third parties by C (Catalog No. SCRC-2002). Other cell lines described herein may not be registered or distributed by a biological repository such as WiCell® or ATCC, but such cell lines are found in Principles Researchers, Labs and /. Or it is publicly available directly or indirectly from the facility. Publication requests for cell lines and reagents are customary, for example, to those skilled in the art of life sciences. Generally, the transfer of these cells or materials is via a standard material transfer agreement between the owner and recipient of the cell line or material. Transfers of these types of materials occur frequently, especially in research environments in life sciences. In fact, the applicants are CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt21.
2 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001)
), BG03 (2001) and BGOlv (2004) have been routinely transferred through such contracts with commercial and non-profit industry partners and collaborators since the time the cells were derived and characterized. I came. The year in parentheses next to each cell line in the above list is
Indicates the year in which the cell line or material became publicly available and immortal (eg, the cell bank was created), and thus to make the composition and to carry out the methods described herein. No other embryo destruction has been performed or required since the establishment of these cell lines.
In August 2006, Klimanskaya et al. Demonstrated that hESCs can be derived from a single blastomere and thus leave embryos intact and do not cause their destruction. Biopsy was performed on each embryo using micromanipulation techniques to obtain nineteen (19) ES cell-like proliferations and two (2) stable hESC systems. These hESC systems can remain undifferentiated for more than 6 (6) months, with normal karyotype, as well as Oct-4 and SSEA-3.
, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog and alkaline phosphatase showed the expression of pluripotent markers. These hESCs are in vi
Differentiate and form all three (three) embryonic germ layer derivatives in tro, and in vi
It can be formed in the form of a teratoma with vo. These methods of creating new stem cell lines without embryo destruction address the ethical concerns of using human embryos. Klimankaya et al. (2006) Nature, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
e 444: pp. 481-5, Epub August 23, 2006. But Klim
Anskaya et al. Co-cultured the induced hESC system with other hESCs. Later, 2008
In the year, Chung Y. We were able to obtain the hES cell line again from a single blastomere without co-culture with hESC. Chung Y. et al., Which is incorporated herein by reference. Et al., Cell Stem Cell 2008, 2 (2), pp. 113-117. Therefore, the compositions and methods described herein, in particular those such as those associated with induced pluripotent stem cells or genetically dedifferentiated pluripotent stem cells, cause destruction of human embryos. do not need.
Tables 3 and 4, respectively, are non-comprehensive lists of certain iPSCs and hESCs, are available worldwide for research and / or commercial purposes, and are used in the methods and compositions of the present invention. Suitable for. The information in Tables 3 and 4 can be found in the literature and, for example, Nati.
onal Institutes of Health (NIH) Human Stem
Cell Registry, Human Embryonic Stem Cell
Registry and University of Massachusetts
Medical School, Worcester, Massachusetts, U
It is obtained from publicly available databases including the International Stem Cell Registry in SA. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained.
The human iPSCs described herein (at least iPSC-603 and iPSC-482).
-C7) is Cellular Dynamics International, Inc.
.. (Madison, Wisconsin, USA).

別の利点は、そのようなｈＩＰＳ細胞が免疫学的に適合した自己細胞集団であり、患者
に特異的な細胞により、疾患の起源および進行を試験することが可能になることである。
したがって、疾患の根本原因を理解することが可能であり、それにより、疾患に対する予
防的処置および治療的処置の開発を導く洞察がもたらされ得る。 Another advantage is that such hIPS cells are an immunologically matched autologous cell population, and patient-specific cells allow the origin and progression of the disease to be tested.
Therefore, it is possible to understand the root cause of the disease, which can provide insights that guide the development of prophylactic and therapeutic treatments for the disease.

多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
一部の実施形態は、胚体内胚葉細胞および最終的には、これだけに限定されないが、前
腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌先駆細胞および／または膵島ホルモン発現細胞を含めた任
意の内胚葉系列由来細胞型を、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を出発材料として使用して導出
するための方法を対象とする。これらのｈＥＳ細胞は、桑実胚、胚内部細胞塊または胚の
生殖***から得られるものを起源とする細胞であってよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分
野で公知の方法を使用して、培養物中、実質的な分化を伴わずに多能性の状態で維持する
ことができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，
６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２
００，８０６号および同第６，２５１，６７１号に記載され、その開示は参照により本明
細書に完全に組み込まれる。 Pluripotent Human Embryonic Stem (hES) Cells Some embodiments are endoderm endoderm cells and, ultimately, but not limited to, preintestinal endoderm, pancreatic endoderm, endocrine precursor cells and / or pancreatic islets. A method for deriving any endoderm lineage-derived cell type, including hormone-expressing cells, using human germ layer stem (hES) cells as a starting material is targeted. These hES cells may be cells originating from a morula, an inner cell mass of an embryo, or a reproductive ridge of an embryo. Human embryonic stem cells can be maintained in a pluripotent state in culture without substantial differentiation using methods known in the art. Such methods include, for example, U.S. Pat. Nos. 5,453,357 and 5,
670, 372, 5,690,926, 5,843,780, 6,2
00,806 and 6,251,671 are described, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

いくつかのプロセスでは、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞は、フィーダー層上で維持
される。そのようなプロセスでは、多能性細胞を多能性の状態で維持することを可能にす
る任意のフィーダー層を使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａ
ｔｉｏｎ）に一般に使用されるフィーダー層の１つは、マウス線維芽細胞の層である。つ
い最近、多能性細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）において使用するためのヒト線維
芽細胞フィーダー層が開発された（その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる
米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号）。代替のプロセスでは、フィーダー層
を使用せずに多能性細胞を維持することが可能になる。多能性細胞をフィーダーフリー条
件下で維持する方法は、米国特許出願公開第２００３／０，１７５，９５６号に記載され
ており、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 In some processes, pluripotent stem cells, such as hES cells, are maintained on the feeder layer. In such a process, any feeder layer can be used that allows pluripotent cells to remain pluripotent. Culture of human embryonic stem cells (cultiva)
One of the feeder layers commonly used for (tion) is a layer of mouse fibroblasts. Most recently, a human fibroblast feeder layer has been developed for use in culture of pluripotent cells (the disclosure of which is incorporated herein by reference in US Patent Application Publication No. 2002/0072117. ). The alternative process makes it possible to maintain pluripotent cells without the use of a feeder layer. Methods for maintaining pluripotent cells under feeder-free conditions are described in US Patent Application Publication No. 2003 / 0,175,956, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の多能性細胞は、血清を含むまたは含まない、細胞外マトリックスを含
むまたは含まない、ＦＧＦを含むまたは含まない培養物中で維持することができる。いく
つかの多能性細胞の維持手順では、血清代替物を使用する。多能性細胞または多分化能細
胞を培養し、分化させるためのこれらおよび他の方法は、それぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ２００
７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬ
ＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥ Ｐ
ＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＭＥＤＩＡ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＨＵ
ＭＡＮ ＳＥＲＵＭに記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The pluripotent cells described herein can be maintained in cultures with or without serum, with or without extracellular matrix, with or without FGF. Serum substitutes are used in some pluripotent cell maintenance procedures. These and other methods for culturing and differentiating pluripotent cells or pluripotent cells are PCT / US200, respectively.
7/062755, filed February 23, 2007, title COMPOSITIONS AND
METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELL
S and PCT / US2008 / 080516, filed October 20, 2008, title ME
THODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE P
LURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HU
Described in MAN SERUM, they are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の発明は全てのｈＥＳ細胞株、および少なくとも、表４に列挙されてい
るものと共に有用である。この情報は、文献および例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ
、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ
、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベー
スから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得
られた時に定期的に更新されている。本出願の出願日現在、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｓ
ｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに掲載された２５４個のｉＰＳＣ系、および１２１
１個のｈＥＳＣ系があった。以下の表４は列挙されているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの全て
を含むものではなく、潜在的に入手可能な多能性幹細胞の例である。
The inventions described herein are useful with all hES cell lines, and at least those listed in Table 4. This information can be found in the literature and, for example, the National Inst.
itutes of Health (NIH) Stem Cell Registry
, Human Embryonic Stem Cell Registry and Un
Iversity of Massachusetts Medical School
, Worcester, Massachusetts, Internati, USA
It is obtained from publicly available databases, including the onal Stem Cell Registry. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained. As of the filing date of this application, International S
254 iPSC systems published in tem Cell Registry, and 121
There was one hESC system. Table 4 below does not include all of the listed hESCs and iPSCs and is an example of potentially available pluripotent stem cells.

多能性脱分化体細胞
最近、ある特定の核リプログラミング因子を使用した試験により、多能性幹細胞または
多能性様幹細胞を患者自身の体細胞から導出することが可能になった。これらの細胞は人
工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とも称される。本発明では、Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａ
、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された種々のｉＰＳ細胞株について記載
されている。しかし、他のｉＰＳ細胞株、例えばＪａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａ１．
に記載されているものは本発明によるものである。参照により本明細書に完全に組み込ま
れる、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９
８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８
８２を参照されたい。したがって、本明細書で使用される場合、「人工多能性幹（ｉＰＳ
）細胞」とは、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｐＰＳ（霊長類多能
性幹）細胞、単為発生細胞などと同様の性質を有する細胞を意味する。 Pluripotent dedifferentiated somatic cells Recently, tests using certain nuclear reprogramming factors have made it possible to derive pluripotent stem cells or pluripotent-like stem cells from the patient's own somatic cells. These cells are also referred to as induced pluripotent stem (iPS) cells. In the present invention, Shinya Yamanaka
, Various iPS cell lines provided by Kyoto University are described. However, other iPS cell lines, such as James Thomason et al., A1.
Is according to the present invention. US Patent Application Publication No. 20090047263, International Publication WO2005 / 8059, which is incorporated herein by reference.
8. U.S. Patent Application Publication No. 20080233610 and International Publication WO 2008/118
See 82. Therefore, as used herein, "artificial pluripotent stem (iPS)"
) Cell ”means a cell having properties similar to other pluripotent stem cells such as hES cells, hEG cells, pPS (primate pluripotent stem) cells, parthenogenetic cells and the like.

核プログラミング因子は、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開Ｗ
Ｏ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開
ＷＯ２００８／１１８８２に記載されており、卵、胚、またはＥＳ細胞を使用せずに、分
化した細胞のリプログラミングを誘導するために使用される。本発明で使用され、記載さ
れているものと同様の核リプログラミング因子を使用することによって体細胞から誘導さ
れたｉＰＳ細胞を調製するための方法は特に限定されない。好ましい実施形態では、体細
胞および人工多能性幹細胞が増殖し得る環境で核リプログラミング因子を体細胞と接触さ
せる。本明細書に記載のある特定の実施形態の利点は、卵、胚、または胚性幹（ＥＳ）細
胞の不在下で核リプログラミング因子を体細胞と接触させることによって人工多能性幹細
胞を調製することができることである。核リプログラミング因子を使用することによって
、体細胞の核をリプログラミングしてｉＰＳ細胞または「ＥＳ様細胞」を得ることができ
る。 Nuclear programming factors are described in US Patent Application Publication No. 20090047263, International Publication W.
O2005 / 80598, US Patent Application Publication No. 20080233610 and WO 2008/11882, used to induce reprogramming of differentiated cells without the use of eggs, embryos, or ES cells. .. The method for preparing iPS cells derived from somatic cells by using nuclear reprogramming factors similar to those used and described in the present invention is not particularly limited. In a preferred embodiment, the nuclear reprogramming factor is contacted with the somatic cells in an environment in which somatic cells and induced pluripotent stem cells can proliferate. The advantage of certain embodiments described herein is the preparation of induced pluripotent stem cells by contacting nuclear reprogramming factors with somatic cells in the absence of eggs, embryos, or embryonic stem (ES) cells. Is what you can do. By using nuclear reprogramming factors, the nuclei of somatic cells can be reprogrammed to obtain iPS cells or "ES-like cells".

本明細書に記載の多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞であるかｉＰＳ細胞であるかにかかわら
ず、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステー
ジ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０
；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン
；．β．ＩＩＩ−チューブリン；．アルファ．−平滑筋アクチン（アルファ．−ＳＭＡ）
；線維芽細胞成長因子４（Ｆｇｆ４）、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフ
ィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎ
ａｔ１）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２
；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣ
ＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（
Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴなどのテロメラーゼ；サイレント
Ｘ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ−ボックス含有タンパ
ク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４
；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤ
Ｆ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｌｕｒｉｐ
ｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２）（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレイクポ
イント１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ １）（Ｔｃｌ１）
；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４などの任意の数の多能性細胞マーカーを発現し
得る。本発明は本明細書において列挙されているマーカーに限定されず、細胞表面マーカ
ー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）
、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびその一部を含めた他の遺伝子産物などの
マーカーを包含することが理解される。 The pluripotent stem cells described herein, whether hES cells or iPS cells, are not limited to, but are limited to alkaline phosphatase (AP); ABCG2; stage-specific embryo antigen-1 (SSEA-). 1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60
TRA-1-81; Tra-2-49 / 6E; ERAs / ECAT5, E-cadherin ;. β. III-Tubulin ;. alpha. -Smooth muscle actin (alpha.-SMA)
Fibroblast growth factor 4 (Fgf4), Crypto, Dax1; Zinc finger protein 296 (Zfp296); N-acetyltransferase-1 (N)
at1); (ES cell-related transcript 1 (ECAT1); ESG1 / DPPA5 / ECAT2
ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; EC
AT15-1; ECAT15-2; Fthl17; All4; Undifferentiated embryonic cell transcription factor (
Utf1); Rex1; p53; G3PDH; Telomerase such as TERT; Silent X chromosome gene; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box-containing protein 15 (Fbx15); Nanog / ECAT4; Oct3 / 4; Sox2; Klf4
C-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GD
F3; CYP25A1; developmental pluripotency-related 2 (developmental supplement)
Otency-associated 2) (DPPA2); T-cell lymphoma breakpoint 1 (Tcl1)
Any number of pluripotent cell markers such as DPPA3 / Stella; DPPA4 can be expressed. The present invention is not limited to the markers listed herein, but cell surface markers, antigens, and ESTs, RNAs (including microRNAs and antisense RNAs).
, DNA (including genes and cDNAs) and other gene products including parts thereof are understood to include markers.

一実施形態では、本明細書で使用されるｉＰＳ細胞株は、以下の核リプログラミング因
子遺伝子を含有する：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘ
ファミリー遺伝子。ある１つのｉＰＳ細胞株では、以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔ３／４
、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２のそれぞれが提供される。以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔフ
ァミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子、例えば、Ｏ
ｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃのそれぞれの他のｉＰＳ細胞株遺伝子産物を使用
した。したがって、核リプログラミング因子はＭｙｃファミリー遺伝子を含んでもよく含
まなくてもよいことが理解される。 In one embodiment, the iPS cell line used herein contains the following nuclear reprogramming factor genes: Oct family genes, Klf family genes, and Sox.
Family gene. In one iPS cell line, the following three genes: Oct3 / 4
, Klf4, and Sox2, respectively. The following three genes: Oct family genes, Klf family genes, and Myc family genes, such as O
Other iPS cell line gene products of ct3 / 4, Klf4 and c-Myc were used. Therefore, it is understood that nuclear reprogramming factors may or may not contain Myc family genes.

本明細書に記載されており、当技術分野でも公知の核リプログラミング因子は、分化し
た成体の体細胞からｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができ、また、これはリ
プログラミングされる体細胞の型に限定されない、すなわち、任意の種類の体細胞をリプ
ログラミングまたは脱分化させることができる。体細胞のリプログラミングには卵および
／または胚が必要ないので、ｉＰＳ細胞は哺乳動物細胞であってよく、したがって、患者
または疾患に特異的な多能性幹細胞を生じさせる機会がもたらされる。 Nuclear reprogramming factors described herein and known in the art can be used to generate iPS cells from differentiated adult somatic cells, which are also reprogrammed bodies. It is not limited to the cell type, that is, any type of somatic cell can be reprogrammed or dedifferentiated. Since somatic cell reprogramming does not require eggs and / or embryos, iPS cells can be mammalian cells, thus providing an opportunity to produce patient- or disease-specific pluripotent stem cells.

多能性幹細胞の凝集懸濁液
個々の細胞をポリマー足場、マトリックスおよび／またはゲルに播種することに基づく
、以前に公知の組織工学の方法とは対照的に、本明細書に記載の実施形態では、多能性幹
細胞から形成された細胞凝集懸濁液、単一細胞懸濁液またはそれから導出された分化した
単一細胞懸濁液を使用することができる。幹細胞凝集懸濁液の処理および／または製造な
らびにその細胞の分化の方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５および
ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２，３５６に記載され、それらは参照により完全に本明細書
に組み込まれる。 Aggregation Suspension of Pluripotent Stem Cells The embodiments described herein as opposed to previously known tissue engineering methods based on seeding individual cells into a polymer scaffold, matrix and / or gel. In, cell aggregation suspensions formed from pluripotent stem cells, single cell suspensions or differentiated single cell suspensions derived from them can be used. Methods for the treatment and / or production of stem cell aggregation suspensions and their cell differentiation are described in international applications PCT / US2007 / 062,755 and PCT / US2008 / 082,356, which are fully referenced herein. Is incorporated into.

一実施形態では、多能性幹細胞培養物、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞培養物の単細胞
懸濁液から、多能性幹細胞凝集懸濁液を生成する方法が提供される。多能性幹細胞は線維
芽細胞フィーダーで最初に培養することができるか、またはフィーダーフリーであっても
よい。ｈＥＳ細胞を単離し、それらをヒトフィーダー細胞の上で培養する方法は、米国特
許第７，４３２，１０４号に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる
。 In one embodiment, there is provided a method of producing a pluripotent stem cell agglutination suspension from a single cell suspension of a pluripotent stem cell culture, such as an hES or iPS cell culture. Pluripotent stem cells can be first cultured in fibroblast feeders or may be feeder-free. Methods for isolating hES cells and culturing them on human feeder cells are described in US Pat. No. 7,432,104, which is fully incorporated herein by reference.

本明細書で使用される場合、「単一細胞懸濁液」という用語またはその等価物は、多能
性、多分化能もしくは最終分化した単一細胞懸濁液、または多能性細胞もしくは多分化能
細胞から任意の機械的手段または化学的手段によって導出された単一細胞懸濁液を指す。
一次組織、付着した培養物中の細胞、および凝集体から細胞クラスターを解離させて単一
細胞懸濁液を形成するためのいくつかの方法、例えば、物理的な力（細胞スクレーパー、
口径が狭いピペットを通しての粉砕、細針穿刺吸引、ボルテックスによる脱凝集および細
かいナイロンメッシュまたはステンレス鋼メッシュを通した強制的な濾過などの機械的解
離）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ（商標）などの酵素による
解離）、またはその両方の組合せが存在する。さらに、多能性細胞、多分化能細胞または
分化した細胞の単一細胞への解離を支持することができる方法および培養培地条件は、多
ウェルプレートアッセイのための増殖、細胞選別、および規定された播種のために有用で
あり、また、培養順およびクローン増殖の自動化を可能にする。 As used herein, the term "single cell suspension" or its equivalent refers to pluripotent, pluripotent or terminally differentiated single cell suspensions, or pluripotent cells or perhaps. Refers to a single cell suspension derived from a potency cell by any mechanical or chemical means.
Several methods for dissociating cell clusters from primary tissues, cells in adherent cultures, and aggregates to form a single cell suspension, such as physical forces (cell scrapers,).
Mechanical dissociation such as crushing through a narrow caliber pipette, fine needle puncture suction, vortex deagglomeration and forced filtration through a fine nylon or stainless steel mesh), enzymes (eg trypsin, collagenase, acutase ™). Enzymatic dissociation such as), or a combination of both. In addition, methods and culture medium conditions that can support the dissociation of pluripotent cells, pluripotent cells or differentiated cells into single cells are defined for proliferation, cell selection, and cell selection for multiwell plate assays. It is useful for seeding and also allows automation of culture order and clonal growth.

他の実施形態は、分化培地、例えば作用物質、好ましくはＴＧＦβファミリーの受容体
を活性化することが可能であるＴＧＦβファミリーメンバー、例えばアクチビンＡ、アク
チビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＮｏｄａｌを含有する分化培地に、多能性幹
細胞凝集懸濁液を直接に生成する方法を提供する。内胚葉の生成のための成長因子は、国
際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５，６８６に記載され、それは参照により完全に
本明細書に組み込まれる。分化培地で細胞凝集懸濁液を生成する方法は、同様に本明細書
に記載される、多能性幹細胞培地、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５に記載
されるヘレグリンをベースとしたＤＣ−ＨＡＩＦ培地に基づくＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標
）ｈＥＳ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞凝集懸濁培養物の生成を提供する他の
方法から区別することができる。 Other embodiments include differentiation media, such as agents, preferably TGFβ family members capable of activating receptors on the TGFβ family, such as activin A, activin B, GDF-8, GDF-11 and Nodal. Provided is a method for directly producing a pluripotent stem cell aggregation suspension in the containing differentiation medium. Growth factors for endoderm production are described in International Application No. PCT / US2008 / 065,686, which is fully incorporated herein by reference. Methods for producing cell aggregation suspensions in differentiation media are also described herein in pluripotent stem cell media, such as Helegrin-based DC-HAIF described in PCT / US2007 / 062,755. It can be distinguished from other methods that provide the production of cell aggregation suspension cultures with medium-based StemPro® hES SFM (Invitrogen).

本明細書に記載の実施形態は、多能性接着培養物から、多能性細胞を、未分化の状態で
の増殖を可能にする接着性成長培養条件で培養し、接着性多能性細胞培養物を単一細胞懸
濁培養物に解離させ、単一細胞懸濁培養物を、単一細胞懸濁培養物を単一細胞懸濁培養物
から懸濁液中の多能性由来細胞凝集体が形成されるまでの期間にわたって撹拌することに
よって懸濁液中のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第１の分化培養条件と接触さ
せ、それにより、懸濁液中の多能性由来細胞凝集体を生じさせることによって懸濁液中の
多能性細胞凝集体を生じさせるための方法に関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸
濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍ〜１６０ｒｐｍで回転させることによって実施する。本
明細書に記載のある特定の他の実施形態では、多能性幹細胞の凝集、成長、増殖、増大お
よび／または細胞塊を容易にするためにｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。 In the embodiments described herein, pluripotent cells are cultured from pluripotent adherent culture under adhesive growth culture conditions that allow proliferation in an undifferentiated state. Dissociate the culture into a single cell suspension culture, and pluripotency-derived cell cohesion in suspension of the single cell suspension culture and the single cell suspension culture from the single cell suspension culture. Contact with a first differentiation culture condition that allows the formation of hES-derived cell aggregates in the suspension by stirring for a period of time until aggregate formation, thereby pluripotency in the suspension. It relates to a method for producing pluripotent cell aggregates in a suspension by producing derived cell aggregates. In a preferred embodiment, stirring the single cell suspension culture is performed by rotating at about 80 rpm to 160 rpm. In certain other embodiments described herein, rho-kinase inhibitors are used to facilitate aggregation, growth, proliferation, growth and / or cell clumps of pluripotent stem cells.

本明細書に記載される実施形態は、未分化状態での増大を可能にする接着性成長培養条
件でｈＥＳ細胞を培養し；未分化ｈＥＳ細胞をｈＥＳ細胞の分化に適する第１の分化培養
条件と接触させて、接着性多能性由来細胞をもたらし；接着性のｈＥＳ由来細胞を単一細
胞懸濁培養物に解離させ；単一細胞懸濁培養物が懸濁状の多能性由来細胞凝集体を形成す
るそのような時期まで単一細胞懸濁培養物を撹拌することによって、単一細胞懸濁培養物
を、懸濁状のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第２の分化培養条件と接触させ、
それにより懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成することによって、多能性由来単一細胞
懸濁液から懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成する方法にも関する。好ましい実施形態
では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍの回転によって実施
される。 The embodiments described herein are for culturing hES cells under adhesive growth culture conditions that allow growth in an undifferentiated state; undifferentiated hES cells are a first differentiated culture condition suitable for differentiation of hES cells. Contact with to yield adherent pluripotency-derived cells; dissociate adherent hES-derived cells into single-cell suspension cultures; single-cell suspension cultures are suspension-like pluripotency-derived cells A second that allows the single cell suspension culture to form suspended hES-derived cell aggregates by stirring the single cell suspension culture until such time of aggregation formation. Contact with differentiation culture conditions
It also relates to a method for producing suspended pluripotent-derived cell aggregates from a pluripotent-derived single cell suspension by thereby producing suspended pluripotent-derived cell aggregates. In a preferred embodiment, stirring the single cell suspension culture is performed by rotation at about 80 rpm to 160 rpm.

好ましい実施形態では、製造規模の懸濁培養は、細胞密度を最大にしながら細胞生存力
を維持する方法として、培地の連続潅流を利用する。この関係において、培地交換は、接
着細胞および懸濁凝集体に異なった影響を及ぼす流体剪断を培養物に寄与する。培地が細
胞表面を接線方向に越流するので、固定された接着細胞は流体剪断応力を受ける。対照的
に、凝集体は剪断力の負荷に応答して自由に転がるので、懸濁凝集体が受ける凝集体表面
を横切る剪断応力はかなりより弱い。長期間の剪断応力は接着性の多能性細胞に有害であ
り、最適な生存および機能のために懸濁凝集形式が好ましいと予想される。したがって、
多能性幹細胞および／または多能性幹細胞から導出された多分化能前駆細胞の生成のため
の効率的な製造プロセスの必要性、ならびに剪断速度および剪断応力に関する上記の観察
された機構に基づき、本明細書に記載される実施形態は、初めて、懸濁液形式、特に細胞
凝集懸濁液形式の、多能性幹細胞から導出された多能性幹細胞および／または多分化能前
駆細胞の生成のための製造方法を提供する。 In a preferred embodiment, production-scale suspension cultures utilize continuous perfusion of medium as a method of maintaining cell viability while maximizing cell density. In this context, medium exchange contributes fluid shear to the culture, which has different effects on adherent cells and suspension aggregates. As the medium overflows tangentially over the cell surface, the immobilized adherent cells are subjected to fluid shear stress. In contrast, the agglomerates roll freely in response to the load of shear forces, so the shear stress across the aggregate surface that the suspended agglomerates receive is significantly weaker. Long-term shear stress is detrimental to adhesive pluripotent cells, and suspension aggregation forms are expected to be preferred for optimal survival and function. Therefore,
Based on the need for an efficient production process for the production of pluripotent stem cells and / or pluripotent progenitor cells derived from pluripotent stem cells, and the above-mentioned observed mechanisms of shear rate and shear stress. The embodiments described herein are, for the first time, the production of pluripotent stem cells and / or pluripotent progenitor cells derived from pluripotent stem cells in suspension form, especially in cell aggregation suspension form. To provide a manufacturing method for.

さらに別の実施形態では、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中、
さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養した。これは
、血清を含まないが、ＦＧＦなどの外因的に添加された成長因子を含有する培地中でｈＥ
Ｓ細胞を培養することが必要なＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対する米国特許第７，００５，２
５２号とは区別される。一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に
含まない培地中で、かつ／または、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（Ｆ
ＧＦ）の不在下で培養する。 In yet another embodiment, the hES cell agglutination suspension is placed in a medium that is substantially free of serum.
In addition, the cells were cultured in the absence of exogenously added fibroblast growth factor (FGF). It is serum-free, but hE in medium containing exogenously added growth factors such as FGF.
Thomson, J. et al., Who need to culture S cells. U.S. Pat. No. 7,005,2
It is distinguished from No. 52. In some embodiments, the iPS cell agglutination suspension is added to the fibroblast growth factor (F) in a serum-free medium and / or in addition.
Incubate in the absence of GF).

サイズおよび形状の両方が異なるかもしれない既知の方法によって生成される細胞凝集
体と対照的に、本明細書に記載される細胞凝集体および方法はサイズおよび形状の狭い分
布を有し、すなわち、細胞凝集体はサイズおよび／または形状が実質的に均一である。細
胞凝集体のサイズ均一性は、分化性能および培養均一性のために重要である。基本的な物
質輸送分析を凝集体に適用すると、等しい透過性を仮定する限り、大きな凝集体の中央へ
の酸素および栄養素の拡散は、より小さい凝集体への拡散と比較して遅くなると予想され
る。膵臓系列細胞への凝集ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の分化は特定の成長因子の一時的適
用に依存するので、異なる径の凝集体の混合物による培養物は、細胞凝集体の均一な（サ
イズおよび形状）培養物と比較して非同期化される可能性がある。細胞凝集体のこの混合
物は異質性をもたらし、結果として分化性能が劣り、最終的に製造、規模拡大および生産
に適合しない可能性がある。したがって、本明細書で使用される場合、語句「実質的に均
一」または「サイズおよび形状が実質的に均一」またはその同等物は、凝集体の均一性の
広がり程度を指し、約２０％以下である。別の実施形態では、凝集体の均一性の広がり程
度は、約１５％、１０％または５％以下である。 In contrast to cell aggregates produced by known methods that may differ in both size and shape, the cell aggregates and methods described herein have a narrow distribution of size and shape, i.e. Cell aggregates are substantially uniform in size and / or shape. Cellular aggregate size uniformity is important for differentiation performance and culture uniformity. Applying basic material transport analysis to aggregates, the diffusion of oxygen and nutrients into the center of large aggregates is expected to be slower than the diffusion into smaller aggregates, assuming equal permeability. To. Since the differentiation of aggregated ES cells or iPS cells into pancreatic lineage cells depends on the temporary application of specific growth factors, cultures with a mixture of aggregates of different diameters are uniform (size and shape) of cell aggregates. May be desynchronized compared to cultures. This mixture of cell aggregates results in heterogeneity, resulting in poor differentiation performance and may ultimately be incompatible with production, scaling and production. Thus, as used herein, the phrase "substantially uniform" or "substantially uniform in size and shape" or its equivalent refers to the degree of spread of agglomerate homogeneity, about 20% or less. Is. In another embodiment, the degree of spread of agglomerate uniformity is about 15%, 10% or 5% or less.

凝集体当たりの細胞の正確な数は重要ではないが、各凝集体のサイズ（したがって、凝
集体当たりの細胞の数）は酸素および栄養分が中心細胞に拡散する最大限度によって限定
されること、およびこの数は細胞型およびその細胞型の栄養素の要件に応じても変動し得
ることが当業者には理解されよう。細胞凝集体は、凝集体当たり最小数の細胞（例えば、
２つまたは３つの細胞）を含んでもよく、凝集体当たり何百ものまたは何千もの細胞を含
んでもよい。一般には、細胞凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明
の目的上、細胞凝集体は、一般には約５０ミクロンから約６００ミクロンまでのサイズで
あるが、細胞型に応じて、サイズはこの範囲を下回ることも上回ることもある。一実施形
態では、細胞凝集体は、約５０ミクロンから約２５０ミクロンまでのサイズ、または約７
５〜２００ミクロンのサイズであり、約１００〜１５０ミクロンのサイズであることが好
ましい。 The exact number of cells per aggregate is not important, but the size of each aggregate (and therefore the number of cells per aggregate) is limited by the maximum extent to which oxygen and nutrients diffuse into the central cells, and It will be appreciated by those skilled in the art that this number may vary depending on the cell type and the nutrient requirements of that cell type. Cell aggregates are the minimum number of cells per aggregate (eg,
It may contain (2 or 3 cells) and may contain hundreds or thousands of cells per aggregate. In general, cell aggregates contain hundreds to thousands of cells per aggregate. For the purposes of the present invention, cell aggregates are generally in size from about 50 microns to about 600 microns, but depending on the cell type, the size may be below or above this range. In one embodiment, the cell aggregates are in size from about 50 microns to about 250 microns, or about 7.
It has a size of 5 to 200 microns, preferably about 100 to 150 microns.

さらに他の方法では胚様体（ＥＢ）の作製が記載されている。本明細書で使用される場
合、「胚様体」、「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｂｏｄｙ）」という用語またはその等
価物は、ＥＳ細胞が単層培養物中で過成長した際、または、未定義の培地中の懸濁培養物
中で維持された、または非定方向プロトコルによって多数の胚葉組織に分化した際に生じ
る分化した細胞および未分化の細胞の凝集体を指す。すなわち、ＥＢは、本明細書に記載
の多能性幹細胞の単一細胞懸濁液から形成されることもなく、ＥＢは、多能性由来多分化
能細胞の接着培養物から形成されることもない。これらの特徴単独により、本発明は胚葉
体から明白に区別される。 Yet another method describes the production of an embryoid body (EB). As used herein, the terms "embryonic body", "aggregate body" or their equivalents are undefined when ES cells overgrow in a monolayer culture. Refers to agglomerates of differentiated and undifferentiated cells that occur when differentiated into multiple germ layer tissues by a non-orthogonal protocol or maintained in a suspension culture in medium. That is, EB is not formed from a single cell suspension of pluripotent stem cells as described herein, and EB is formed from an adherent culture of pluripotent-derived pluripotent cells. Nor. These features alone make the invention distinct from the germ layer.

分化した細胞と未分化の細胞の混合物であり、一般にはいくつかの胚葉由来の細胞から
なり、ランダムな分化をたどる胚様体とは対照的に、本明細書に記載の細胞凝集体は、基
本的にまたは実質的に均一な細胞であり、多能性、多分化能、二分化能、または単能性型
の細胞、例えば、胚細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分
泌細胞などの凝集体として存在する。 The cell aggregates described herein are a mixture of differentiated and undifferentiated cells, generally consisting of several germ layer-derived cells, as opposed to embryoid bodies that follow random differentiation. Basically or substantially homogeneous cells, pluripotent, pluripotent, dichotomous, or monophasic cells such as embryonic cells, endoderm, preintestinal endoderm, PDX1-positive pancreas It exists as an aggregate of endoderm, pancreatic endocrine cells, etc.

本明細書に記載される実施形態は、大規模製造に容易に適用することができるプロセス
を使用して、サイズおよび形状が実質的に均一である細胞凝集体を繰り返し生成すること
が可能な費用効率の高い製造プロセスまたは方法を提供することによって、上記の問題に
対処する。特定の一実施形態では、分化可能な細胞は、本発明の細胞培地を用いて懸濁培
養で増殖させる。別の特定の実施形態では、分化可能な細胞は懸濁状態で維持および増殖
することができ、すなわち、それらは未分化のままであるか、さらに分化することを阻止
される。細胞培養との関連で「増殖させる」という用語は、当技術分野で使用されるよう
に使用され、細胞の増殖および細胞数の増加、好ましくは存続可能な細胞数の増加を指す
。具体的な実施形態では、約１日、すなわち約２４時間を超えて培養することによって、
細胞を培養懸濁液で増殖させる。より具体的な実施形態では、少なくとも１、２、３、４
、５、６、７日、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週の間培養することによ
って、細胞を懸濁培養で増殖させる。 The embodiments described herein are costs capable of repeatedly producing cell aggregates of substantially uniform size and shape using a process that can be readily applied to large scale production. Address the above issues by providing an efficient manufacturing process or method. In one particular embodiment, the differentiateable cells are grown in suspension culture using the cell medium of the invention. In another particular embodiment, the differentiateable cells can be maintained and proliferated in suspension, i.e. they remain undifferentiated or are prevented from further differentiating. The term "proliferate" in the context of cell culture is used as used in the art and refers to cell proliferation and cell number increase, preferably viable cell number increase. In a specific embodiment, by culturing for more than about 1 day, i.e. about 24 hours.
The cells are grown in culture suspension. In a more specific embodiment, at least 1, 2, 3, 4
Cells are grown in suspension culture by culturing for 5, 6, 7 days, or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 weeks.

本発明のさらに他の実施形態は、分化した多能性幹細胞培養物、例えば、上記ｄ’Ａｍ
ｏｕｒ２００５および２００６に記載されるステージ１、２、３、４および５からの細胞
を含む、本明細書に記載される多能性細胞から生成される細胞から形成される細胞凝集懸
濁液を生成する方法を提供する。したがって、本明細書に記載される細胞凝集体を作製す
る方法はいかなる１つの多能性または多分化能細胞または細胞ステージにも限定されず、
むしろ、使用方法および細胞型最適化の必要性によってどの方法が好ましいかが決定され
る。 Yet another embodiment of the invention is a differentiated pluripotent stem cell culture, eg, d'Am above.
Produces a cell aggregation suspension formed from cells produced from pluripotent cells described herein, including cells from stages 1, 2, 3, 4 and 5 described in our 2005 and 2006. Provide a way to do it. Thus, the methods of making cell aggregates described herein are not limited to any one pluripotent or pluripotent cell or cell stage.
Rather, the method of use and the need for cell type optimization determine which method is preferred.

多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および他の多能性細胞源、例えば胚性生
殖または単為生殖生物細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養物を生成するための本明細
書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉ
ｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｌ ｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５、および２００８年
１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅ
ｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／
０８０，５１６に記載されている通りであり、それらは参照により完全に本明細書に組み
込まれる。 To generate aggregate suspension cultures of pluripotent cells, such as hES or iPS cells, and cells derived from other pluripotent cell sources, such as embryonic or parthenogenetic cells. The method described is substantially the title Compossi filed on February 23, 2007.
tensions and methods for culturing difference
The titles filed for PCT / US2007 / 062,755, which are titanium cells, and October 20, 2008, are Methods and complications.
for feeder-free pluripotent stem cell me
PCT / US2008 / which is a dia contouring human serum
As described in 080,516, they are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の方法では、例えば、Ｂｏｄｎａｒらに対するものであり、Ｇｅｒｏｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第６，８００，４８０号に記載の通り最
初に培養容器を細胞外マトリックスでコーティングする必要は全くない。本明細書に記載
の一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞は、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細
胞が、実質的に、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００８年１０月２０日に出
願の、表題がＭｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅ
ｒ−ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍである米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０
，５１６に記載されるように可溶性ヒト血清を使用して培養されるのと同じ方法で培養す
ることができる。 The methods described herein are, for example, for Bodnar et al., Geron.
There is no need to first coat the culture vessel with extracellular matrix as described in US Pat. No. 6,800,480, which was assigned to Corporation. In some embodiments described herein, the iPS cells are October 20, 2008, in which other pluripotent stem cells, such as hES and iPS cells, are substantially incorporated herein by reference. The title of the application on the day is Methods and compositions for fede
r-free pluripotent stem cell media conta
US patent application PCT / US2008 / 080 which is ining human serum
, 516 can be cultivated in the same manner as cultivated using soluble human serum.

本明細書に記載の方法では、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対するものであり、Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に譲渡さ
れた、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，００５，２５２号に記載
の通り単に線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される外因的に添加された線維
芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は全く必要ない。 In the methods described herein, Thomason, J. et al. For Wiscon
An extrinsic source, as described in US Pat. No. 7,005,252, which is assigned to sin Alumni Research Foundation (WARF) and is incorporated herein by reference, simply from a source other than the fibroblast feeder layer. No fibroblast growth factor (FGF) added is required.

多分化能および分化した細胞組成物
本明細書に記載の方法によって生成する細胞組成物は、多能性幹細胞、前原条、中内胚
葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または
ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２
共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、
ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞を含む細胞培養物を含み、培養物中の細胞の少なくとも
約５〜９０％が、生成された前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性
前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、
内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内
分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞である。 Pluripotent and differentiated cell compositions The cell compositions produced by the methods described herein are pluripotent stem cells, Maehara streaks, mesendoderm, endoderm endoderm, anterior endoderm, PDX1-positive intraintestinal Germ layer, PDX1-positive endoderm or PDX1 / NKX6.1 co-positive pancreatic germ layer, endocrine precursor or NGN3 / NKX2.2
Co-positive endocrine precursors and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL,
Containing cell cultures containing SST, PP alone positive endocrine cells, at least about 5 to 90% of the cells in the culture were generated Maehara, middle endoderm, endoderm, anterior intestinal germ layer, PDX1 positive Anterior intestinal germ layer, PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1 / NKX6.1 co-positive pancreatic germ layer,
Endocrine precursors or NGN3 / NKX2.2 co-positive endocrine precursors, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP-only positive endocrine cells.

本明細書に記載の一部の実施形態は、幹細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性細胞と、前
原条、中内胚葉または胚体内胚葉などの多分化能細胞の両方、ならびに、ＰＤＸ１陽性前
腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内
分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分
泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞などの、より
分化しているが、なお潜在的に多分化能である細胞を含む細胞集団および細胞培養物など
の組成物に関する。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、多能性幹細胞および他の
多分化能細胞または分化した細胞の混合物を含む組成物を生成することができる。一部の
実施形態では、約９５の多能性細胞ごとに少なくとも約５の多分化能細胞または分化した
細胞を含む組成物が生成する。他の実施形態では、約５の多能性細胞ごとに少なくとも約
９５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。さらに、他の比の多分
化能細胞または分化した細胞と多能性細胞を含む組成物が考えられる。例えば、約１，０
００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含
む組成物、約１００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分
化した細胞を含む組成物、約１０，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能
細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の
多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５００の多能性細胞ごとに少なくとも
約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００の多能性細胞ごとに少な
くとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０の多能性細胞ごとに
少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５の多能性細胞ごと
、および約１までの多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞
を含む組成物、および約１の多能性細胞ごとに少なくとも約１，０００，０００の多分化
能細胞または分化した細胞を含む組成物が考えられる。 Some embodiments described herein include both pluripotent cells such as stem cells and iPS cells and pluripotent cells such as Maehara, middle endoderm or endoderm, and PDX1-positive anterior gut. Endoderm, PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1 / NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursor or NGN3 / NKX2.2 co-positive endocrine precursor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP Concerning compositions such as cell populations and cell cultures containing more differentiated but still potentially pluripotent cells, such as solitary positive endocrine cells. For example, the methods described herein can be used to generate compositions containing pluripotent stem cells and other pluripotent cells or mixtures of differentiated cells. In some embodiments, for every about 95 pluripotent cells, a composition comprising at least about 5 pluripotent cells or differentiated cells is produced. In other embodiments, for every 5 pluripotent cells, a composition comprising at least about 95 pluripotent cells or differentiated cells is produced. In addition, other ratios of pluripotent cells or compositions comprising differentiated cells and pluripotent cells are conceivable. For example, about 1,0
A composition containing at least about 1 pluripotent cell or differentiated cell for every 100,000 pluripotent cells, at least about 1 pluripotent cell or differentiated cell for every 100,000 pluripotent cells Composition containing at least about 1 pluripotent cell or differentiated cell for every 10,000 pluripotent cells, at least about 1 pluripotent cell for every 1000 pluripotent cells Or a composition containing differentiated cells, at least about 1 pluripotent cell for every about 500 pluripotent cells or a composition containing differentiated cells, at least about 1 pluripotency for every about 100 pluripotent cells Compositions containing pluripotent cells or differentiated cells, composition containing at least about 1 pluripotent cells or differentiated cells for every 10 pluripotent cells, about 5 pluripotent cells, and up to about 1. A composition comprising at least about 1 pluripotent cell or differentiated cell per pluripotent cell, and at least about 1,000,000 pluripotent cells or differentiated cells per pluripotent cell. A composition containing the above is conceivable.

本明細書に記載の一部の実施形態は、少なくとも約５％の多分化能細胞または分化した
細胞から少なくとも約９９％の多分化能細胞または分化した細胞までを含む細胞培養物ま
たは細胞集団に関する。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団は哺乳動物細胞
を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、
ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５
％〜少なくとも約９９％が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。
他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少
なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少
なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少
なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少
なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、ま
たは９９％超が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。細胞培養物
または細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む複数の実施形態では、細胞培養中のヒトフィ
ーダー細胞を考慮せずに上記の百分率を算出する。 Some embodiments described herein relate to cell cultures or cell populations comprising at least about 5% pluripotent cells or differentiated cells to at least about 99% pluripotent cells or differentiated cells. .. In some embodiments, the cell culture or cell population comprises mammalian cells. In a preferred embodiment, the cell culture or cell population comprises human cells. For example
One particular embodiment is a cell culture containing human cells, at least about 5 of human cells.
% To at least about 99% relate to cell cultures that are pluripotent cells or differentiated cells.
Another embodiment is a cell culture containing human cells, wherein at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30% of human cells. At least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 55%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, For cell cultures in which at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 98%, at least about 99%, or more than 99% are pluripotent or differentiated cells. In a plurality of embodiments in which the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentage is calculated without considering the human feeder cells in the cell culture.

多能性、多分化能または分化細胞は、前原条、内胚葉系中胚葉、胚体内胚葉の細胞、な
らびにそれらから導出される細胞、組織および／または器官に分化すること、またはさら
に分化することが可能である。内胚葉系中胚葉細胞は、中胚葉細胞および／または胚体内
胚葉細胞、ならびにこれらの系列のいずれかから導出される細胞、組織および／または器
官に分化することが可能である。一部の実施形態では、前原条細胞は、内胚葉系中胚葉中
間体を通して、中胚葉または胚体内胚葉系列のいずれかの最終分化細胞に変換される。例
えば、そのようなプロセスは、ヒト内胚葉由来組織、例えば膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲
状腺、上皮小体、胸腺、咽頭、胆嚢および膀胱の効率的な生成のための基礎を提供するこ
とができる。重要なことに、前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の生成は、機
能的インスリン生成β細胞への多能性幹細胞の分化での初期段階である。別の例として、
前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の分化は、ヒト中胚葉由来組織、例えば血
球、心血管組織、骨格組織ならびに他の構造および結合組織の効率的な生成のための基礎
を提供することができる。 Pluripotent, pluripotent or differentiated cells differentiate into or further differentiate into Maehara streaks, endoderm mesoderm, endoderm cells, and cells, tissues and / or organs derived from them. Is possible. Endodermal mesodermal cells can differentiate into mesodermal cells and / or endoderm cells, as well as cells, tissues and / or organs derived from any of these lineages. In some embodiments, preprotozoan cells are converted through endoderm mesodermal intermediates to terminally differentiated cells of either the mesoderm or the endoderm lineage. For example, such a process provides the basis for the efficient production of human endoderm-derived tissues such as pancreas, liver, lung, stomach, intestine, thyroid, epithelial body, thymus, pharynx, gallbladder and bladder. be able to. Importantly, the production of preprotozoan cells and / or endoderm mesodermal cells is an early step in the differentiation of pluripotent stem cells into functional insulin-producing β-cells. As another example
Differentiation of progenitor cells and / or endoderm mesoderm cells provides the basis for the efficient production of human mesoderm-derived tissues such as blood cells, cardiovascular tissue, skeletal tissue and other structural and connective tissues. be able to.

本明細書に記載の組成物および方法には、いくつかの有用な特徴がある。例えば、多分
化能細胞、例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞
集団、ならびにそのような細胞培養物および細胞集団を生成するための方法は、ヒト発生
の初期をモデリングするために有用である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法
は、真性糖尿病などの病態への治療介入としても機能し得る。例えば、前原条細胞および
／または中内胚葉細胞は限られた数の組織のみの供給源として機能するので、純粋な組織
または細胞の型の発生において使用することができる。前原条細胞を生成するためのいく
つかのプロセスでは、出発材料として使用される多能性細胞は、多能性幹細胞、例えばｈ
ＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である。 The compositions and methods described herein have some useful features. For example, cell cultures and cell populations containing pluripotent cells, such as preprotozoan cells and / or mesoendoderm cells, and methods for producing such cell cultures and cell populations are early in human development. Is useful for modeling. In addition, the compositions and methods described herein can also serve as therapeutic interventions for conditions such as diabetes mellitus. For example, preprotozoan cells and / or mesoendoderm cells serve as a source for only a limited number of tissues and can be used in the development of pure tissue or cell types. In some processes for producing pre-progenitor cells, pluripotent cells used as starting materials are pluripotent stem cells, eg h
ES cells, hEG cells or iPS cells.

栄養外胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、栄養外胚葉細胞を
含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に
記載の方法によって生成する栄養外胚葉細胞集団または細胞培養物では、ＨＡＮＤ１、Ｅ
ｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬ
Ｘ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの
発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２
、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴ
Ｓ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して実質的に高い。 Nutrient Ectoderm Cells The methods described herein can be used to produce compositions containing vegetative ectoderm cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, in vegetative ectoderm cell populations or cell cultures produced by the methods described herein, HAND1, E.
omes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DL
Expression of markers selected from the group consisting of X3, PSX1, ETS2, and ERBB genes is HAND1, Eomes, MASH2 in non-nutritive ectoderm cells or cell populations.
, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ET
Substantially high compared to the expression levels of S2 and ERBB.

前原条細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、前原条細胞を含む
組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載
の方法によって生成する前原条細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子お
よび／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子を、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ
１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して実質的に発
現する。 Maehara streaks cells The methods described herein can be used to produce compositions containing preprotozoan cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, the Maehara cell population or cell culture produced by the methods described herein will generate FGF8 marker genes and / or NODAL marker genes, BRACHURY low, FGF4 low, NSAI
It is substantially expressed as compared to 1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

胚体外細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、胚体外細胞を含む
組成物を生成することができる。原始内胚葉細胞、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞
は胚体外細胞である。原始内胚葉細胞は近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞を生じる。
近位内胚葉細胞は、卵黄嚢の一部を形成する内胚葉細胞である。近位内胚葉細胞は、栄養
分の取り込みおよび輸送の両方において機能する。遠位内胚葉細胞は、ライヘルト膜とし
て公知の胚体外組織と近接している。遠位内胚葉細胞の役割のうちの１つは、基底膜の構
成成分の生成である。まとめると、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は、多くの場合
、胚体外内胚葉と称されるものを形成する。名称に示されている通り、胚体外内胚葉細胞
は発生の間に形成される胚構造を生じない。対照的に、本明細書に記載の胚体内胚葉細胞
および他の内胚葉系列または膵臓の系列細胞は、胚性であるまたは胚細胞から導出された
ものであり、胚発生の間に形成される腸管から導出された組織を生じる。本明細書に記載
の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する胚体外細胞集団または細
胞培養物では、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子
、ＤＡＢ１遺伝子、ＦＴＮＦ４ａｌｐｈａ遺伝子またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択
されるマーカーの発現が、少なくとも、他の細胞型または細胞集団、例えば胚体内胚葉で
は発現されないＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰ
の発現レベルと比較して実質的に高い。 Extraembryonic cells The methods described herein can be used to generate compositions containing extraembryonic cells that are substantially free of other cell types. Primitive endoderm cells, proximal endoderm cells and distal endoderm cells are extraembryonic cells. Primitive endoderm cells give rise to proximal endoderm cells and distal endoderm cells.
Proximal endoderm cells are endoderm cells that form part of the yolk sac. Proximal endoderm cells function in both nutrient uptake and transport. Distal endoderm cells are in close proximity to extraembryonic tissue known as the Reichert membrane. One of the roles of distal endoderm cells is the production of components of the basement membrane. Taken together, proximal endoderm cells and distal endoderm cells often form what is referred to as extraembryonic endoderm. As the name implies, extraembryonic endoderm cells do not give rise to the embryonic structure formed during development. In contrast, the embryonic germ layer cells and other endoderm lineages or pancreatic lineage cells described herein are embryonic or derived from embryonic cells and are formed during embryogenesis. It gives rise to tissue derived from the intestinal tract. In some embodiments described herein, in the extraembryonic cell population or cell culture produced by the methods described herein, the SOX7 gene, SOX17 gene, THBD gene, SPARC gene, DAB1 gene, FTNF4alpha gene. Alternatively, expression of a marker selected from the group consisting of AFP genes is not expressed at least in other cell types or cell populations, such as embryonic embryos, SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, or AFP.
It is substantially higher than the expression level of.

中内胚葉（ｍｅｎｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、中内胚葉細胞を含
む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記
載の方法によって生成する中内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１
、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子からなる群から選択されるマーカー
の発現が、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と
比較して実質的に高い。 Medium endoderm cells The methods described herein can be used to generate compositions containing medium endoderm cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, the endoderm cell population or cell culture produced by the methods described herein is FGF4, NSAI1.
, MIXL1 and / or WNT3 marker genes are selected from the group, and the expression of markers is substantially higher compared to SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

スクリーニング方法
一部の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、ヒト多能性幹細胞、人工多能性
幹細胞、前原条細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または膵臓前
駆細胞、内分泌先駆細胞、および／または内分泌細胞などの多能性細胞、多分化能細胞お
よび／または分化した細胞などのある特定の細胞集団を得る。次いで、細胞集団に候補分
化因子をもたらす。候補分化因子をもたらす前またはそれとほぼ同時である第１の時点で
、マーカーの発現を決定する。あるいは、候補分化因子をもたらした後にマーカーの発現
を決定することができる。第１の時点の後であり、かつ候補分化因子を細胞集団にもたら
すステップの後である第２の時点で、同じマーカーの発現を再度決定する。候補分化因子
が膵臓先駆細胞の分化を促進することができるかどうかを、第１の時点におけるマーカー
の発現と第２の時点におけるマーカーの発現を比較することによって決定する。第２の時
点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるマーカーの発現と比較して増加または減
少した場合、当該候補分化因子は膵臓前駆細胞の分化を促進することができることになる
。 Screening Method In some embodiments, a screening method is used to use human pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells, anterior striatum cells, mesoendoderm cells, endoderm endoderm cells, preintestinal germ layers or PDX1 negative pre-derm. Pluripotent cells such as intestinal germ layer, PDX1-positive preintestinal germ layer or PDX1-positive pancreatic endoderm cell or pancreatic precursor cell, endocrine precursor cell, and / or endocrine cell, pluripotent cell and / or differentiated cell, etc. To obtain a specific cell population of. It then brings candidate differentiation factors to the cell population. The expression of the marker is determined before or at about the same time as the candidate differentiation factor. Alternatively, marker expression can be determined after the candidate differentiation factor has been introduced. The expression of the same marker is redetermined at a second time point, which is after the first time point and after the step of bringing the candidate differentiation factor to the cell population. Whether a candidate differentiator can promote the differentiation of pancreatic precursor cells is determined by comparing the expression of the marker at the first time point with the expression of the marker at the second time point. If the expression of the marker at the second time point is increased or decreased as compared with the expression of the marker at the first time point, the candidate differentiating factor can promote the differentiation of pancreatic progenitor cells.

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、ヒト胚体内胚葉、ＰＤＸ
−１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉、または膵
臓前駆体または内分泌先駆細胞を含む細胞集団または細胞培養物を利用する。例えば、細
胞集団は、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞の実質的に精製された集団であ
ってよい。例えば、細胞集団はヒト膵臓前駆細胞の濃縮された集団であってよく、細胞集
団内のヒト細胞の少なくとも約５０％〜９７％がヒト膵臓前駆細胞であり、残りは、内分
泌先駆体または内分泌細胞および他の細胞型で構成される。 In some embodiments of the screening methods described herein, human embryonic germ layer, PDX.
A cell population or cell culture containing a -1 negative foregut endoderm, a PDX-1-positive foregut endoderm, a PDX-1-positive pancreatic endoderm, or a pancreatic precursor or endocrine precursor is utilized. For example, the cell population may be a substantially purified population of PDX-1-positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cells. For example, the cell population may be an enriched population of human pancreatic progenitor cells, with at least about 50% to 97% of the human cells in the cell population being human pancreatic progenitor cells and the rest being endocrine precursors or endocrine cells. And other cell types.

本明細書に記載のスクリーニング方法の複数の実施形態では、細胞集団を候補（試験）
分化因子と接触させる、または他のやり方で候補（試験）分化因子をもたらす。候補分化
因子は、上記の細胞のいずれか、例えばヒト膵臓前駆細胞の分化を促進する潜在性を有し
得る任意の分子を含んでよい。本明細書に記載の一部の実施形態では、候補分化因子は、
細胞の１種または複数種の型に対する分化因子であることが分かっている分子を含む。代
替の実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが分かっていない分子を含
む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト膵臓前駆細胞の分化を促進することが
分かっていない分子を含む。 In a plurality of embodiments of the screening methods described herein, a cell population is a candidate (test).
Contact with the differentiation factor or otherwise bring about a candidate (test) differentiation factor. Candidate differentiation factors may include any of the above cells, eg, any molecule that may have the potential to promote the differentiation of human pancreatic progenitor cells. In some embodiments described herein, the candidate differentiator is
Includes molecules that are known to be differentiators for one or more types of cells. In alternative embodiments, candidate differentiation factors include molecules that are not known to promote cell differentiation. In a preferred embodiment, the candidate differentiation factor comprises a molecule that is not known to promote the differentiation of human pancreatic progenitor cells.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は小分
子を含む。好ましい実施形態では、小分子は約１０，０００ａｍｕ以下の分子量を有する
分子である。 In some embodiments of the screening methods described herein, the candidate differentiator comprises a small molecule. In a preferred embodiment, the small molecule is a molecule having a molecular weight of about 10,000 amu or less.

本明細書に記載される他の実施形態では、候補分化因子は、大分子、例えばポリペプチ
ドを含む。ポリペプチドは、限定されずに、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質
タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成
長因子を含む、任意のポリペプチドであってもよい。好ましいポリペプチドには、成長因
子が含まれる。 In other embodiments described herein, candidate differentiation factors include large molecules, such as polypeptides. The polypeptide may be any polypeptide, including, but not limited to, glycoproteins, lipoproteins, extracellular matrix proteins, cytokines, chemokines, peptide hormones, interleukins or growth factors. Preferred polypeptides include growth factors.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、ア
ンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激物質、ＩＬ−１６、サイモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／Ａ
ｐｏ−２、プレＢ細胞コロニー促進因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活
性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞
促進因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質８（骨形成タンパク質
２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧ
Ｉ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症
タンパク１−アルファ）、グリア芽細胞腫細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝癌
由来成長因子、ニューロメディンＵ−２５先駆体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、
血管内皮細胞成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ先駆体、胸腺樹状
細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキ
ン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、インターロイキン−４（ＩＬ４）
、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキ
ン−７（ＩＬ７）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−９（ＩＬ９）
、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）、インタ
ーロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マ
クロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、
ビタミンＤ３、上皮成長因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺
ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６
、ＦＧＦ−７／ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、
血小板由来成長因子−ＢＢ、β神経成長因子、アクチビンＡ、トランスフォーミング成長
因子β１（ＴＧＦβ１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェ
ロン−γ、腫瘍壊死−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球促進
活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ２、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニ
ューロトロフィン（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−
３、ニューロトロフィン４／５、線毛神経栄養因子、神経膠由来のネキシン、デキサメタ
ゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−ア
ザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサン
チン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チ
アゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホル
モン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロ
ラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、副腎皮質刺
激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑
制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシ
トニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依
存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチ
リン、血管作用性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン
、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、ア
ンジオテンシンＩＩ、カルシトリオール（ｃａｌｃｔｒｉｏｌ）、心房性ナトリウム利尿
ペプチドおよびメラトニン、チロキシン、トリヨードサイロニン、カルシトニン、エスト
ラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾル、コルチコステ
ロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロスチエン（ａｎｄｒ
ｏｓｔｉｅｎｅ）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエ
タノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリ
シンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、
β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオンおよび
ＴＷＳ１１９からなる群から選択される１つまたは複数の成長因子を含む。 In some embodiments of the screening methods described herein, candidate differentiators are ampphiregulin, B lymphocyte stimulants, IL-16, thymopoietin, TRAIL / A.
po-2, pre-B cell colony-promoting factor, endothelial differentiation-related factor 1 (EDF1), endothelial monosphere-activating polypeptide II, macrophage migration-inhibiting factor (MIF), natural killer cell-promoting factor (NKEFA), bone morphogenetic protein 2 , Bone morphogenetic protein 8 (bone morphogenetic protein 2), bone morphogenetic protein 6, bone morphogenetic protein 7, connective tissue growth factor (CTGF), CG
I-149 protein (neuroendocrine differentiation factor), cytokine A3 (macrophage inflammatory protein 1-alpha), glial blastoma cell differentiation-related protein (GBDR1), liver cancer-derived growth factor, neuromedin U-25 precursor, vascular endothelial Cell Growth Factor (VEGF),
Vascular endothelial cell growth factor B (VEGF-B), T cell-specific RANTES precursor, thymus dendritic cell-derived factor 1, transtransferase, interleukin-1 (IL1), interleukin-2 (IL2), interleukin-3 (IL3), Interleukin-4 (IL4)
, Interleukin-5 (IL5), Interleukin-6 (IL6), Interleukin-7 (IL7), Interleukin-8 (IL8), Interleukin-9 (IL9)
, Interleukin-10 (IL10), Interleukin-11 (IL11), Interleukin-12 (IL12), Interleukin-13 (IL13), Granulocyte Colony Stimulator (G-CSF), Granulocyte Macrophage Colony Stimulator (GM-CSF), Macrophage Colony Stimulator (M-CSF), Erythropoetin, Thrombopoetin,
Vitamin D3, epidermal growth factor (EGF), brain-derived neurotrophic factor, leukemia suppressor, thyroid hormone, basic fibroblast growth factor (bFGF), aFGF, FGF-4, FGF-6
, FGF-7 / keratinocyte growth factor (KGF), platelet-derived growth factor (PDGF),
Platelet-derived growth factor-BB, β-nerve growth factor, activin A, transforming growth factor β1 (TGFβ1), interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tumor necrosis-α, tumor necrosis factor-β, burst-promoting activity (BPA), erythropoiesis activity (EPA), PGE2, insulin growth factor-1 (IGF-1), IGF-II, neurotropin growth factor (NGF), neurotrophin-
3. Neurotrophin 4/5, peptidic neuronutrient factor, peptide-derived nexin, dexamethasone, β-mercaptoethanol, retinoic acid, butylhydroxyanisole, 5-azacitidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, isobutyl Xanthin, indomethacin, β-glycerol phosphate, nicotine amide, DMSO, thiazolidinedione, TWS119, oxytocin, vasopresin, melanin cell stimulating hormone, corticostimulating hormone, lipotropin, thyroid stimulating hormone, growth hormone, prolactin, luteinizing hormone, human villi Gonadotropin, follicular stimulating hormone, corticostimulatory hormone releasing factor, gonadotropin releasing factor, prolactin releasing factor, prolactin inhibitor, growth hormone releasing factor, somatostatin, thyroid stimulating hormone releasing factor, calcitonin gene-related peptide, parathyroid hormone, glucagon-like peptide 1. Glucose-dependent insulin-secreting polypeptide, gastrin, secretin, cholecystokinin, motilin, vasoactive small intestine peptide, substance P, pancreatic polypeptide, peptide tyrosine, neuropeptide tyrosine, insulin, glucagon, placenta lactogen, relaxin , Angiotensin II, calcitriol, atrial sodium diuretic peptide and melatonin, tyrosin, triiodosylonin, calcitonine, estradiol, estron, progesterone, testosterone, cortisol, corticosterone, aldosterone, epinephrine, norepinephrine, androstiene. andr
osteone), calcitriol, collagen, dexamethasone, β-mercaptoethanol, retinoic acid, butylhydroxyanisole, 5-azacitidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, isobutylxanthin, indomethacin,
Includes one or more growth factors selected from the group consisting of β-glycerol phosphate, nicotinamide, DMSO, thiazolidinedione and TWS119.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、１
つまたは複数の濃度で細胞集団に提供される。一部の実施形態では、候補分化因子は、細
胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであるよ
うに、細胞集団に提供される。一部の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の
濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態では、細胞周囲の培地
中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌである。さらに他
の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌから約
１０μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度
は、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌである。 In some embodiments of the screening methods described herein, the candidate differentiation factor is 1
It is provided to the cell population in one or more concentrations. In some embodiments, the candidate differentiater is provided to the cell population such that the concentration of the candidate differentiater in the pericellular medium is from about 0.1 ng / ml to 10 mg / ml. In some embodiments, the concentration of candidate differentiation factor in the pericellular medium is from about 1 ng / ml to about 1 mg / ml. In other embodiments, the concentration of candidate differentiator in the pericellular medium is from about 10 ng / ml to about 100 μg / ml. In yet another embodiment, the concentration of the candidate differentiation factor in the pericellular medium is from about 100 ng / ml to about 10 μg / ml. In a preferred embodiment, the concentration of the candidate differentiation factor in the pericellular medium is from about 5 ng / ml to about 1000 μg / ml.

一部の実施形態では、本明細書に記載されるスクリーニング方法のステップは、第１の
時点および第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を判定することを含む。これら
の実施形態のいくつかでは、第１の時点は候補分化因子を細胞集団に提供する前かほぼ同
じ時期であってもよい。あるいは、一部の実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を
細胞集団に提供する後である。一部の実施形態では、第１の時点で複数のマーカーの発現
が判定される。 In some embodiments, the steps of the screening method described herein include determining the expression of at least one marker at the first and second time points. In some of these embodiments, the first time point may be before or at about the same time the candidate differentiation factor is donated to the cell population. Alternatively, in some embodiments, the first time point is after providing the candidate differentiation factor to the cell population. In some embodiments, the expression of the plurality of markers is determined at the first time point.

少なくとも１種のマーカーの発現を第１の時点で決定することに加えて、本明細書に記
載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、第
１の時点の後であり、かつ細胞集団に候補分化因子をもたらした後である第２の時点で決
定することが意図されている。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方
で同じマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方
で複数種のマーカーの発現を決定する。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時
点の両方で同じ複数種のマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、それぞれが第
１の時点の後であり、かつそれぞれが細胞集団に候補分化因子をもたらした後である複数
の時点でマーカーの発現を決定する。ある特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲによってマー
カーの発現を決定する。他の実施形態では、免疫細胞化学によってマーカーの発現を決定
する。 In addition to determining the expression of at least one marker at the first time point, in some embodiments of the screening methods described herein, the expression of at least one marker at the first time point. It is intended to be determined later and at a second time point after bringing the candidate differentiator to the cell population. In such an embodiment, the expression of the same marker is determined at both the first and second time points. In some embodiments, the expression of multiple markers is determined at both the first and second time points. In such an embodiment, the expression of the same multiple markers is determined at both the first and second time points. In some embodiments, marker expression is determined at multiple time points, each after a first time point and each after bringing a candidate differentiator to the cell population. In certain embodiments, Q-PCR is used to determine marker expression. In other embodiments, immunocytochemistry determines the expression of the marker.

本明細書に記載のスクリーニング方法のある特定の実施形態では、第１の時点および第
２の時点において発現が決定されるマーカーは、膵臓前駆細胞から膵島組織を構成する最
終分化した細胞の先駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。そのような細胞
としては、未成熟膵島ホルモン発現細胞を挙げることができる。 In certain embodiments of the screening methods described herein, the markers whose expression is determined at the first and second time points are precursors of the final differentiated cells that make up the islet tissue from pancreatic progenitor cells. It is a marker related to differentiation into cells. Examples of such cells include immature islet hormone-expressing cells.

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、細胞集団に候補分化因子
をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間に十分
な時間を経過させることができる。細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の
時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間の十分な時間は、約１時間の短さか
ら約１０日間の長さまでであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカー
の発現を、細胞集団に候補分化因子をもたらした後に多数回決定する。一部の実施形態で
は、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、
少なくとも約１６時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間
、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間
、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１
日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくと
も約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくと
も約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、または少なくとも約８週間であ
る。 In some embodiments of the screening methods described herein, sufficient time can be allowed between the step of bringing the candidate differentiator to the cell population and the step of determining the expression of the marker at a second time point. .. The sufficient time between the step of bringing the candidate differentiator to the cell population and the step of determining the expression of the marker at the second time point may be as short as about 1 hour to as long as about 10 days. In some embodiments, the expression of at least one marker is determined multiple times after bringing the candidate differentiation factor to the cell population. In some embodiments, sufficient time is at least about 1 hour, at least about 6 hours, at least about 12 hours,
At least about 16 hours, at least about 1 day, at least about 2 days, at least about 3 days, at least about 4 days, at least about 5 days, at least about 6 days, at least about 7 days, at least about 8 days, at least about 9 days, At least about 10 days, at least about 11
Days, at least about 12 days, at least about 13 days, at least about 14 days, at least about 1 week, at least about 2 weeks, at least about 3 weeks, at least about 4 weeks, at least about 5 weeks, at least about 6 weeks, at least about 7 Weeks, or at least about 8 weeks.

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、第２の時点におけるマーカーの発現が第
１の時点におけるこのマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決
定する。少なくとも１種のマーカーの発現の増加または減少により、候補分化因子が内分
泌先駆細胞の分化を促進することができることが示される。同様に、複数種のマーカーの
発現を決定する場合、第２の時点における複数種のマーカーの発現が第１の時点における
この複数種のマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。
マーカーの発現の増加または減少は、第１の時点および第２の時点での細胞集団における
マーカーの量、レベルまたは活性を測定することまたは他のやり方で評価することによっ
て決定することができる。そのような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺
伝子発現との比較的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。第２の時点に
おけるマーカーの発現が第１の時点と比較して増加するある特定の実施形態では、増加の
量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍
、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍
、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００
倍または少なくとも約１００倍超である。一部の実施形態では、増加の量は、２倍未満で
ある。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して減少する実施形態では
、減少の量は、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１
、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なく
とも約５０分の１、少なくとも約６０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくとも約８
０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１または少なくとも約１０
０分の１未満である。一部の実施形態では、減少の量は２分の１を下回らない。 In some embodiments of the methods described herein, it is further determined whether the expression of the marker at the second time point is increased or decreased compared to the expression of the marker at the first time point. Increased or decreased expression of at least one marker indicates that the candidate differentiator can promote the differentiation of endocrine precursor cells. Similarly, when determining the expression of multiple markers, it is further determined whether the expression of the multiple markers at the second time point increased or decreased compared to the expression of the multiple markers at the first time point. decide.
Increased or decreased expression of the marker can be determined by measuring the amount, level or activity of the marker in the cell population at the first and second time points or by assessing it in some other way. Such a determination may be comparative or absolute with other markers, such as housekeeping gene expression. In certain embodiments where marker expression at the second time point is increased compared to the first time point, the amount of increase is at least about 2-fold, at least about 5-fold, at least about 10-fold, at least about 20-fold. , At least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 60 times, at least about 70 times, at least about 80 times, at least about 90 times, at least about 100 times
Double or at least about 100 times more. In some embodiments, the amount of increase is less than double. In embodiments where marker expression at the second time point is reduced compared to the first time point, the amount of reduction is at least about one-half, at least about one-fifth, and at least about one-tenth.
, At least about 1/20, at least about 1/30, at least about 1/40, at least about 1/50, at least about 1/60, at least about 1/70, at least about 8
1/0, at least about 1/90, at least about 1/100, or at least about 10
It is less than 1/0. In some embodiments, the amount of reduction is no less than half.

多分化能細胞または分化した細胞の生成のモニタリング
多能性細胞から多分化能細胞、多分化能細胞から膵臓前駆体またはホルモン内分泌細胞
などのさらに多分化能の細胞または分化した細胞への進行は、内分泌細胞における島ホル
モンの発現およびプロインスリンからインスリンおよびＣペプチドへのプロセシングなど
の、遺伝子マーカーおよび表現型マーカーを含めた特定の細胞に特有のマーカーの発現を
決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特
定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する
。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカ
ーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ある特定の
プロセスでは、未成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、ならびに多能性細
胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌先駆体、胚体外内胚葉、
中胚葉、外胚葉、成熟膵島ホルモン発現細胞および／または他の細胞型に特有のマーカー
の有意な発現の欠如を決定する。 Monitoring the production of pluripotent or differentiated cells Progression from pluripotent cells to pluripotent cells, from pluripotent cells to more pluripotent or differentiated cells such as pancreatic precursors or hormone endocrine cells Can be monitored by determining the expression of specific cell-specific markers, including genetic and phenotypic markers, such as islet hormone expression in endocrine cells and processing from proinsulin to insulin and C peptides. .. In some processes, the expression of a particular marker is determined by detecting the presence or absence of the marker. Alternatively, the expression of a particular marker can be determined by measuring the level of presence of the marker in cells of a cell culture or cell population. For example, in certain processes, the expression of markers specific to immature pancreatic islet hormone-expressing cells, as well as pluripotent cells, endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive foregut endoderm, endocrine precursor, extraembryonic Germ,
Determines the significant lack of expression of markers specific to mesoderm, ectoderm, mature islet hormone-expressing cells and / or other cell types.

他の胚体内胚葉系列の分化の程度がより低い細胞型の生成のモニタリングに関連して記
載されている通り、ブロット転写法および免疫細胞化学などの定性的技法または半定量的
技法を使用して、マーカーの発現を測定することができる。あるいは、マーカーの発現は
、Ｑ−ＰＣＲなどの技法を使用することによって正確に定量化することができる。さらに
、ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くは分泌タンパク質で
あることが理解されよう。このように、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカー含有量を測定す
るための技法を利用することができる。 Using qualitative or semi-quantitative techniques such as blot transcription and immunocytochemistry, as described in connection with monitoring the generation of other cell types with a lower degree of differentiation of the germ layer lineage. , The expression of the marker can be measured. Alternatively, marker expression can be accurately quantified by using techniques such as Q-PCR. Furthermore, at the polypeptide level, it will be understood that many of the markers for islet hormone-expressing cells are secretory proteins. Thus, techniques for measuring extracellular marker content such as ELISA can be utilized.

例えば、一実施形態では、ＰＤＸ１はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉と関連したマーカー遺伝
子である。このように、本発明の一部の実施形態では、ＰＤＸ１の発現が判定される。他
の実施形態では、限定されずにＳＯＸ１７、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１などの
、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉で発現される他のマーカーの発現も判定される。ＰＤＸ１は特
定の他の細胞型（すなわち、内臓内胚葉および特定の神経外胚葉）が発現することもでき
るので、本発明の一部の実施形態は、内臓内胚葉および／または神経外胚葉と関連したマ
ーカー遺伝子発現の不在または実質的な不在を実証することに関する。例えば、一部の実
施形態では、限定されずにＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭ
を含む、内臓内胚葉および／または神経細胞で発現されるマーカーの発現が判定される。 For example, in one embodiment, PDX1 is a marker gene associated with PDX1-positive foregut endoderm. As described above, in some embodiments of the present invention, the expression of PDX1 is determined. In other embodiments, expression of other markers expressed in PDX1-positive foregut endoderm, such as, but not limited to, SOX17, HNF6, SOX9 and PROX1, is also determined. Some embodiments of the present invention are associated with visceral endoderm and / or neuroectoderm, as PDX1 can also express certain other cell types (ie, visceral visceral germ layer and specific neuroectoderm). It relates to demonstrating the absence or substantial absence of marker gene expression. For example, in some embodiments, SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 and / or NFM, without limitation.
Expression of markers expressed in visceral germ layers and / or neurons is determined, including.

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されるＰＤＸ１陽性前腸
内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１またはＮＦＭマーカー遺伝
子を発現する細胞を実質的に含まない。特定の実施形態では、本明細書に記載されるプロ
セスによって生成されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、近位内胚葉、遠位内胚葉
および／または神経細胞を実質的に含まない。 In some embodiments, the PDX1-positive foregut germ layer cell culture produced by the methods described herein substantially comprises cells expressing the SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 or NFM marker genes. Absent. In certain embodiments, the PDX1-positive foregut endoderm cell culture produced by the processes described herein is substantially free of proximal endoderm, distal endoderm and / or neurons.

本明細書に記載される多能性細胞（例えば、上記Ｄ’Ａｍｏｕｒら２００６に記載され
るステージまたはステップ１〜５の結果として生成される細胞）の発達の進行は、発達経
路に沿う各ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来の細胞型の特徴であるマーカーの発現を判定する
ことによって監視することができる。一部のプロセスでは、ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来
の細胞型の同定および特徴づけは、特定のマーカーの発現または複数のマーカーの異なる
発現レベルおよびパターンによる。すなわち、１つまたは複数のマーカーの存在または不
在、高発現または低発現は細胞型の特徴を表し、それを特定する。さらに、特定のマーカ
ーは一過性の発現を有することができ、それによりそのマーカーは発達の１つのステージ
の間に高度に発現され、発達の別のステージでは弱く発現される。特定のマーカーの発現
は、標準化または規格化された対照マーカーと比較して細胞培養物または細胞集団の細胞
にそのマーカーが存在するレベルを測定することによって判定することができる。そのよ
うなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であっても定量的であってもよい。マ
ーカー遺伝子によって生成されるマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣ
Ｒ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲの実施方法は、当技術分野で周知である。 The progression of development of pluripotent cells described herein (eg, cells produced as a result of the stages or steps 1-5 described in D'Amour et al. 2006 above) is each hES along the developmental pathway. It can be monitored by determining the expression of markers that are characteristic of cell types of origin or iPS origin. In some processes, identification and characterization of hES-derived or iPS-derived cell types depends on the expression of a particular marker or different expression levels and patterns of multiple markers. That is, the presence or absence of one or more markers, high or low expression, characterizes and identifies the cell type. In addition, certain markers can have transient expression, whereby the marker is highly expressed during one stage of development and weakly expressed at another stage of development. Expression of a particular marker can be determined by measuring the level at which the marker is present in cells of a cell culture or cell population compared to a standardized or standardized control marker. In such a process, the measurement of marker expression may be qualitative or quantitative. One way to quantify the expression of markers produced by a marker gene is quantitative PC.
By using R (Q-PCR). Methods of performing Q-PCR are well known in the art.

本発明の一部の実施形態では、マーカーの存在、不在および／または発現レベルは、定
量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって判定される。例えば、特定の遺伝子マーカー、例えば
ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＣＤＸ２、
ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４アルファ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ
、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１および本明細書に記載される他の
マーカーによって生成される転写産物の量は、定量的Ｑ−ＰＣＲによって判定される。 In some embodiments of the invention, the presence, absence and / or expression level of the marker is determined by quantitative PCR (Q-PCR). For example, specific genetic markers such as SOX17, CXCR4, OCT4, AFP, TM, SPARC, SOX7, CDX2,
MIXL1, GATA4, HNF3β, HNF4alpha, GSC, FGF17, VWF
, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1 and the amount of transcripts produced by the other markers described herein are determined by quantitative Q-PCR.

他の実施形態では、免疫組織化学的検査を使用して、上記の遺伝子によって発現される
タンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲを免疫組織化学的な技法ま
たはフローサイトメトリー技法と併せて使用して、細胞型を有効かつ正確に特徴付け、同
定し、目的の細胞型におけるそのようなマーカーの量および相対的割合の両方を決定する
ことができる。一実施形態では、Ｑ−ＰＣＲにより、細胞が混在する集団を含有する細胞
培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを数量化することができる。しかし、Ｑ−ＰＣＲでは
、目的のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞で共発現されるかどうかをもたらすまたは
認定することはできない。別の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲをフローサイトメトリー法と併
せて使用して細胞型を特徴付け、同定する。したがって、本明細書に記載の方法と、例え
ば上記のものなどを組み合わせて使用することによって、内胚葉系列型細胞を含めた種々
の細胞型の完全な特徴付けおよび同定を実現および実証することができる。 In other embodiments, immunohistochemical tests are used to detect proteins expressed by the genes described above. In yet another embodiment, Q-PCR is used in combination with immunohistochemical or flow cytometry techniques to effectively and accurately characterize and identify cell types and such in the cell type of interest. Both the amount and relative proportion of markers can be determined. In one embodiment, Q-PCR can be used to quantify the level of RNA expression in a cell culture containing a population of mixed cells. However, Q-PCR cannot provide or determine whether the marker or protein of interest is co-expressed in the same cell. In another embodiment, Q-PCR is used in combination with flow cytometry to characterize and identify cell types. Therefore, the methods described herein can be used in combination with, for example, those described above to achieve and demonstrate complete characterization and identification of various cell types, including endoderm lineage cells. it can.

例えば、好ましい一実施形態では、膵臓前駆体または膵臓内胚葉またはＰＤＸ−１陽性
膵臓内胚葉は、Ｑ−ＰＣＲおよび／またはＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤ
Ｘ１、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよび／またはｃＭＹＣを発現するが、そのよ
うな細胞は、ＰＤＸ１陽性発現細胞と同定されるためには、ＩＣＣによって実証される通
り少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１を共発現し、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、または
ＣＥＲを含めた他のマーカーを発現しない。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉ
ｖｏで成熟ホルモン分泌膵臓細胞を適切に同定するために、例えばインスリン分泌細胞に
おいて、Ｃ−ペプチド（成熟かつ機能性のβ細胞におけるプロインスリンの適切なプロセ
シングの産物）およびインスリンが共発現されることがＩＣＣによって実証される。 For example, in a preferred embodiment, the pancreatic precursor or pancreatic endoderm or PDX-1-positive pancreatic germ layer is at least PD as demonstrated by Q-PCR and / or ICC.
It expresses X1, Nkx6.1, PTF1A, CPA and / or cMYC, but such cells co-exist at least PDX1 and Nkx6.1 as demonstrated by the ICC to be identified as PDX1-positive expressing cells. It is expressed and does not express SOX17, CXCR4, or other markers including CER. Similarly, in vitro or in vitro
Co-expression of C-peptide (a product of proper processing of proinsulin in mature and functional β-cells) and insulin, for example, in insulin-secreting cells, in order to properly identify mature hormone-secreting pancreatic cells in vo. Is demonstrated by ICC.

さらに、当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用
することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に
特異的な抗体を使用することによって検出することができる（例えば、ウエスタンブロッ
ト、フローサイトメトリー分析など）。ある特定のプロセスでは、ｈＥＳ由来細胞に特有
のマーカー遺伝子の発現ならびにｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の
欠如。ｈＥＳ由来細胞型を特徴付け、同定するためのさらに別の方法は、上に示されてい
る関連出願に記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 In addition, other methods known in the art can also be used to quantify marker gene expression. For example, expression of a marker gene product can be detected by using an antibody specific for the marker gene product of interest (eg, Western blot, flow cytometric analysis, etc.). In certain processes, expression of marker genes specific to hES-derived cells as well as significant lack of expression of marker genes specific to hES-derived cells. Yet another method for characterizing and identifying hES-derived cell types is described in the related applications shown above, which are fully incorporated herein by reference.

増幅アッセイで使用するのに適する増幅プローブ／プライマー組合せは、以下の通りで
ある：インスリン（ＩＮＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０００２０７）：プライマーＡＡ
ＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１）；ＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣ
ＣＡＣＡ（配列番号２）；Ｎｋｘ６．１（ＮＭ＿００６１６８）：プライマーＣＴＧＧＣ
ＣＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡ（配列番号３）；ＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡ
ＡＣＡＡ（配列番号４）；Ｐｄｘ１（ＮＭ＿０００２０９）：プライマーＡＡＧＴＣＴＡ
ＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧ（配列番号５）；ＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣ（配列
番号６）；Ｎｇｎ３（ＮＭ＿０２０９９９）：プライマーＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴ
ＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号７）；ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴ（
配列番号８）；ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）（ＮＭ＿０２１７８４）：プライマーＧＧＧＡ
ＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡ（配列番号９）；ＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧ
ＡＧＴＡ（配列番号１０）；グルカゴン（ＧＣＧ）（ＮＭ＿００２０５４）：プライマー
ＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号１１）；ＴＧＡＴＣＴＧ
ＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号１２）；ＨＮＦ６（ＮＭ＿０３０７１
２）：プライマーＣＧＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴ（配列番号１３）；ＧＴＧＴＴ
ＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号１４）；ＨＮＦ４アルファ（ＮＭ＿００
０４５７）：プライマーＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡ（配列番号１５）；
ＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧ（配列番号１６）；Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２
２４５４）：プライマーＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号１７）；ＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮ（配列番号１８）；ＨＬｘＢ９（ＮＭ＿００５
５１５）：プライマーＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣ（配列番号１９）；ＡＣＴＴＣ
ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡ（配列番号２０）；Ｎｋｘ２．２（ＮＭ＿００２５０９）
：プライマーＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号２１）；ＧＧＧＡＣ
ＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＴ（配列番号２２）；ＰＴＦ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１
）：プライマーＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ（配列番号２３）；ＧＧＣ
ＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴ（配列番号２４）；ＳＳＴ（ＮＭ＿００１０４８）：
プライマーＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号２５）；ＴＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号２６）；ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）：プラ
イマーＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２７）；ＴＣＴＧＣ
ＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＴＡ（配列番号２８）；Ｏｃｔ４プライマー：ＴＧＧＧＣＴＣＧ
ＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号２９）；ＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧ
（配列番号３０）；ＭＩＸＬ１プライマーＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ（
配列番号３１）ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧ（配列番号３２）；ＧＡＴＡ４
プライマーＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧ（配列番号３３）ＣＧＧＧＡＧＧＡ
ＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴ（配列番号３４）；ＧＳＣプライマーＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧ
ＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号３５）ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧ
（配列番号３６）；ＣＥＲプライマーＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴ（配
列番号３７）ＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ（配列番号３８）；
ＡＦＰプライマーＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号３９）Ｃ
ＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４０）；ＳＯＸ１プライマー
ＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号４１）ＣＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴ
ＧＣＧＡＧＴＴＧ（配列番号４２）；ＺＩＣ１プライマーＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧ
ＧＴＣＴＴＣ（配列番号４３）ＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ（配列番号４
４）；ＮＦＭプライマーＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号４５）ＴＧＣ
ＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴ（配列番号４６）。他のプライマーは、ＦＧＦ１７（
Ｈｓ００１８２５９９＿ｍ１）、ＶＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＣＭＫＯＲ１
（Ｈｓ００６０４５６７＿ｍ１）、ＣＲＩＰ１（Ｈｓ００８３２８１６＿ｇ１）、ＦＯＸ
Ｑ１（Ｈｓ００５３６４２５＿ｓ１）、ＣＡＬＣＲ（Ｈｓ００１５６２２９＿ｍ１）およ
びＣＨＧＡ（Ｈｓ００１５４４４１＿ｍ１）を含め、ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎを通して入手
できる。 Suitable amplification probe / primer combinations for use in amplification assays are as follows: Insulin (INS) (GenBank NM_000207): Primer AA
GAGGCCATCAAGCAGATCA (SEQ ID NO: 1); CAGGAGGCGCATC
CACA (SEQ ID NO: 2); Nkx6.1 (NM_006168): Primer CTGGC
CTGTACCCCTCATCA (SEQ ID NO: 3); CTTCCCGTCTTTGTCCA
ACAA (SEQ ID NO: 4); Pdx1 (NM_000209): Primer AAGTCTA
CCAAAGCTCACGCG (SEQ ID NO: 5); GTAGGCCGCCGCCTGC (SEQ ID NO: 6); Ngn3 (NM_020999): Primer GCTCATCGCTCTCT
ATTCTTTTGC (SEQ ID NO: 7); GGTTGAGGCGGTCATCCTTTCT (SEQ ID NO: 7)
SEQ ID NO: 8); FOXA2 (HNF3B) (NM_021784): Primer GGGA
GCGGTGGAAGATGGA (SEQ ID NO: 9); TCATGTTGCTCACGGAGG
AGTA (SEQ ID NO: 10); Glucagon (GCG) (NM_002054): Primer AAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT (SEQ ID NO: 11); TGATCTG
GATTTCTCCTCTGTGTCT (SEQ ID NO: 12); HNF6 (NM_03071)
2): Primer CGCTCCGCTTAGCAGCAT (SEQ ID NO: 13); GTGTT
GCCTCATCCCTTCCCAT (SEQ ID NO: 14); HNF4 alpha (NM_00)
0457): Primer GAAGAAGGAAGCCGTCCAGA (SEQ ID NO: 15);
GACCTTCGAGTGGCTGATCCG (SEQ ID NO: 16); Sox17 (NM_02)
2454): Primer GGCGCAGCAGAATCCAGA (SEQ ID NO: 17); NN
NNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 18); HLxB9 (NM_005)
515): Primer CACCGCGGGGCATGATC (SEQ ID NO: 19); ACTTC
CCCAGGAGGTTCGA (SEQ ID NO: 20); Nkx2.2 (NM_002509)
: Primer GGCCTTCAGTACTCCCCTGCA (SEQ ID NO: 21); GGGAC
TTGGAGCTTGAGTCCT (SEQ ID NO: 22); PTF1a (NM_178161)
): Primer GAAGGTCATCATCTGCCATCG (SEQ ID NO: 23); GGC
CATAATCAGGGTCGCT (SEQ ID NO: 24); SST (NM_001048):
Primer CCCCAGACTCCGTCAGTTTC (SEQ ID NO: 25); TCCGTC
TGGTTGGGTTCAG (SEQ ID NO: 26); PAX6 (NM_000280): Primer CCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG (SEQ ID NO: 27); TCTGC
GCGCCCCTAGTTA (SEQ ID NO: 28); Oct4 primer: TGGGCTCCG
AGAAGGATGTG (SEQ ID NO: 29); GCATAGGTCGCTGCTTGATCG
(SEQ ID NO: 30); MIXL1 primer CCGAGTCCAGGATCCAGGTA (SEQ ID NO: 30)
SEQ ID NO: 31) CTCTGACGCCGAGACTTGG (SEQ ID NO: 32); GATA4
Primer CCTCTTGCAATGCGGAAAG (SEQ ID NO: 33) CGGGAGGA
AGGCTCTCACT (SEQ ID NO: 34); GSC primer GAGGAGAAAAGTG
GAGGTCTGGTT (SEQ ID NO: 35) CTCTGATGAGGACCGCTTCTG
(SEQ ID NO: 36); CER primer ACAGTGCCCTTCAGCCAGACT (SEQ ID NO: 37) ACACTACTTTTTCACAGCCTTCCGT (SEQ ID NO: 38);
AFP Primer GAGAAAACCACCACTGGAGATAGACA (SEQ ID NO: 39) C
TCATGGCAAAAGTTCTTCCAGAA (SEQ ID NO: 40); SOX1 primer ATGCACCGCTACGACATGG (SEQ ID NO: 41) CTCATGTAGCCCT
GCGAGTTG (SEQ ID NO: 42); ZIC1 primer CTGGCTGTGGCAAG
GTCTTC (SEQ ID NO: 43) CAGCCCTCAAACTCGCACTT (SEQ ID NO: 4)
4); NFM primer ATCGAGGAGCGCCACAAAC (SEQ ID NO: 45) TGC
TGGATGGGTGTCCTGGT (SEQ ID NO: 46). Other primers are FGF17 (
Hs0018259_m1), VWF (Hs001699795_m1), CMKOR1
(Hs00604567_m1), CRIP1 (Hs00832816_g1), FOX
It is available through ABI Taqman, including Q1 (Hs00536425_s1), CALCR (Hs00156229_m1) and CHGA (Hs00154441_m1).

Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（ステージ１〜４）の生成およびイン
スリン生成の要約
特定の内胚葉系列および膵臓内胚葉系列細胞の生成のための方法が本明細書で提供され
、関連出願、例えば２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号
、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯ
ＮＥＳの別の箇所で述べられ、それは２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／
６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮ
ＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴ
ＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願であり、それらは参照により本明
細書に完全に組み込まれる。 Summary of PDX1-positive pancreatic endoderm (stages 1-4) production and insulin production in vivo Methods for the generation of specific endoderm and pancreatic endoderm lineage cells are provided herein and related applications, eg, US Patent Application No. 11 / 773,944 filed on July 5, 2007, entitled METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMO
Described elsewhere in NES, it is U.S. Patent Application No. 11 / filed March 2, 2007.
No. 681,687, title ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, PAN
CREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND MET
It is a partial continuation application of HODS OF PRODUCTION, which are fully incorporated herein by reference.

簡単に述べると、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に関する本発明の
定方向分化法は、少なくとも４つまたは５つのステージで説明することができる。ステー
ジ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、約２〜５日、好ましくは２日また
は３日かかる。多能性幹細胞は、ＲＰＭＩ、ＴＧＦスーパーファミリーメンバー成長因子
、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）、ＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路アクチベータ、例えばＷｎｔ３ａ（２
５ｎｇ／ｍｌ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ−２７６３２
（１０μΜ）を含む培地に懸濁させ、成長、生存および増殖を増強するだけでなく細胞間
接着を促進する。約２４時間後に、培地を、血清、例えば０．２％ＦＢＳなど、およびＴ
ＧＦβスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤ
Ｆ−８またはＧＤＦ−１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲ
ＯＣＫ阻害剤を含有するＲＰＭＩを含む培地と交換し、さらに２４時間（１日目）〜４８
時間（２日目）置く。あるいは、アクチビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間置い
た後、その後の２４時間、アクチビンを単独で含む培地（すなわち、培地はＷｎｔ３ａを
含まない）で細胞を培養する。重要なことに、胚体内胚葉の生成には、低血清含有量、お
よびそれにより、低インスリンまたはインスリン様成長因子含有量の細胞培養条件が必要
である。本明細書に完全に組み込まれるＭｃＬｅａｎら（２００７）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ｓ ２５：２９−３８を参照されたい。ＭｃＬｅａｎらにより、ステージ１においてｈＥ
Ｓ細胞をわずか０．２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンと接触させることは、胚体内胚葉の
生成にとって有害であり得ることも示された。また別の当業者により、多能性細胞から胚
体内胚葉へのステージ１分化が実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒら（２００５）に
記載の通り改変された。例えば、少なくとも、Ａｇａｒｗａｌら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ
ｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌｓ（２００８）２６：１１１７−１１２７；Ｂｏｒｏｗｉａｋら、Ｓｍａｌｌ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ Ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏｕｓｅおよびＨｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：３４８−
３５８；およびＢｒｕｎｎｅｒら、Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕ
ｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ、（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９：１
０４４−１０５６。他の内胚葉系列細胞を導出するためには胚体内胚葉の適切な分化、特
定化、特徴付けおよび同定が必要である。このステージにおける胚体内胚葉細胞は、ＳＯ
Ｘ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を共発現し、少なくともＨＮＦ４アルファ、ＨＮ
Ｆ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１
、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ま
たはＰＰは評価できるほどには発現しない。 Briefly, the directional differentiation method of the present invention for pluripotent stem cells such as hES cells and iPS cells can be described in at least 4 or 5 stages. Stage 1 is the production of embryonic germ layers from pluripotent stem cells, which takes about 2-5 days, preferably 2 or 3 days. Pluripotent stem cells include RPMI, TGF superfamily member growth factors such as activin A, activin B, GDF-8 or GDF-11 (100 ng / m).
l), Wnt family member or Wnt pathway activator, eg Wnt3a (2)
5 ng / ml), or rho-kinase or ROCK inhibitor, eg Y-27632
Suspended in medium containing (10 μΜ), it not only enhances growth, survival and proliferation, but also promotes cell-cell adhesion. After about 24 hours, medium, serum, such as 0.2% FBS, and T.
GFβ superfamily member growth factors such as activin A, activin B, GD
F-8 or GDF-11 etc. (100 ng / mL), or rho-kinase or R
Replace with medium containing RPMI containing an OCK inhibitor for an additional 24 hours (day 1) to 48
Set the time (2nd day). Alternatively, the cells are placed in a medium containing activin / Wnt3a for about 24 hours and then cultured for the next 24 hours in a medium containing activin alone (ie, the medium does not contain Wnt3a). Importantly, embryonic germ layer production requires cell culture conditions with low serum content and thus low insulin or insulin-like growth factor content. McLean et al. (2007) Stem Cell, fully incorporated herein.
See s 25: 29-38. HE in Stage 1 by McLean et al.
It has also been shown that contacting S cells with insulin at a concentration of only 0.2 μg / mL can be detrimental to germ layer production. Yet another person skilled in the art has substantially modified stage 1 differentiation of pluripotent cells into embryonic germ layers as described herein and D'Amour et al. (2005). For example, at least Agarwal et al., Efficient
Differentiation of Fundamental Hepatocyte
s from Human Embryonic Stem Cells, Stem C
ells (2008) 26: 1117-1127; Borowiak et al., Small M
olecules Effectively Direct Endodermal D
offsetion of Mouse and Human Embryoni
c Stem Cells, (2009) Cell Stem Cell 4: 348-
358; and Brunner et al., Distinct DNA methylation
patterns differentiated differentiated hu
man embryonic stem cells and developing
human fetus liver, (2009) Genome Res. 19: 1
044-1056. Appropriate differentiation, specification, characterization and identification of germ layer in the embryonic body is required to derive other endoderm lineage cells. Germ cells in the embryonic body at this stage are SO
Co-expressing X17 and HNF3β (FOXA2), at least HNF4alpha, HN
F6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1
, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, or PP are not expressed to the extent that they can be evaluated.

ステージ２はステージ１から胚体内胚葉細胞培養物をとり、懸濁培養物をＩＴＳの１：
１０００希釈液中の０．２％ＦＢＳなどの低い血清レベル、２５ｎｇのＫＧＦ（またはＦ
ＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害剤を有するＲＰＭＩと２４時間（２日目から３日目）イ
ンキュベートして、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進することによって、前
腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を生成する。２４時間後に（３日目〜４日目）、
培地を、ＴＧＦβ阻害剤を含まないが、その代わりに、細胞の成長、生存および増殖を増
強するためにＲＯＣＫ阻害剤をなお含む同じ培地と交換し、さらに２４時間（４日目〜５
日目）〜４８時間（６日目）置く。前腸内胚葉を適切に特定化するための重要なステップ
はＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。したがって、２．５μＭのＴＧＦβ阻害剤
番号４またはＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的
な阻害剤である５μＭのＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤をステージ２細胞培養物
に添加することができる。ステージ２で生成した前腸内胚葉またはＰＤＸ１−陰性前腸内
胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４アルファを共発現し、胚体内胚葉、
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞または内分泌先駆体ならびに単一または複数
ホルモン型細胞の特質である、少なくともＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）も
、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ
６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳ
Ｔ、またはＰＰも評価できるほどには共発現しない。 In stage 2, the germ layer culture in the embryo is taken from stage 1, and the suspension culture is used as ITS 1:
Low serum levels such as 0.2% FBS in 1000 dilutions, 25 ng KGF (or F)
Foregut endoderm or PDX1 by incubating with GF7) or RPMI with an ROCK inhibitor for 24 hours (day 2-3) to enhance growth, survival, proliferation and promote cell-cell adhesion. Produces a negative preintestinal germ layer. After 24 hours (3rd-4th days),
The medium was replaced with the same medium that did not contain the TGFβ inhibitor but instead contained the ROCK inhibitor to enhance cell growth, survival and proliferation for an additional 24 hours (Days 4-5).
(Day) ~ 48 hours (6th day). An important step in properly identifying the foregut endoderm is the removal of TGFβ family growth factors. Therefore, TGFβ inhibitors such as 2.5 μM TGFβ inhibitor No. 4 or 5 μM SB431542, which is a specific inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK), a TGFβ type I receptor, are added to stage 2 cell cultures. can do. Foregut endoderm or PDX1-negative foregut endoderm cells generated in stage 2 co-express SOX17, HNF1β and HNF4alpha, and endoderm,
PDX1-positive pancreatic germ layers or pancreatic progenitor cells or endocrine precursors and at least SOX17 and HNF3β (FOXA2), which are characteristic of single or multihormonal cells, are also HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX.
6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SS
N or PP is also not co-expressed to the extent that it can be evaluated.

ステージ３（５〜８日目）では、ステージ２から前腸内胚葉細胞培養物を取得し、１％
Ｂ２７、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、０．２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）など
のレチノイドまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢなどのレチノイン酸類似体、および５０ｎｇ／ｍ
Ｌのノギン中、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩにより、約２４時間（７日目）〜４８時間（８日
目）にわたってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成する。具体的には、出願人らは、およ
そ２００３年からＤＭＥＭ−高グルコースを使用しており、その時点の全ての特許および
非特許開示物では、「ＤＭＥＭ−高グルコース」などの言及がなくてもＤＭＥＭ−高グル
コースが使用されている。これは、一部において、Ｇｉｂｃｏなどの製造者が、例えばＤ
ＭＥＭ（Ｃａｔ番号１１９６０）およびＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８
２９）などのように、ＤＭＥＭをそのように名付けていなかったことが理由である。本出
願の出願日時点で、ＧｉｂｃｏはさらなるＤＭＥＭ製品を提供しているが、従来通り、例
えばＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９−０１８）など、それらの高グ
ルコースを含有するある特定のＤＭＥＭ産物に「高グルコース」と付けていないことに注
目すべきである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの場合に、高グルコー
スを含有するＤＭＥＭを意味すると推定することができ、これは、この分野における研究
開発を行っている他者には明らかなことであった。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤またはｒｈｏ
キナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２などを使用して、成長、生存、増殖を増強するこ
とおよび細胞間接着を促進することができる。ステージ３で生成したＰＤＸ１陽性前腸細
胞は、ＰＤＸ１およびＨＮＦ６、ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸを共発現し、上のステ
ージ１およびステージ２に記載されている胚体内胚葉細胞もしくは前腸内胚葉（ＰＤＸ１
陰性前腸内胚葉）細胞またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーは評価できるほ
どには共発現しない。 In stage 3 (5th to 8th days), foregut endoderm cell cultures were obtained from stage 2 and 1%.
B27, 0.25 μM KAAD cyclopamine, retinoids such as 0.2 μM retinoic acid (RA) or retinoic acid analogs such as 3 nM TTNPB, and 50 ng / m.
PDX1-positive foregut endoderm cells are generated in L noggin by DMEM or RPMI for about 24 hours (7th day) to 48 hours (8th day). Specifically, Applicants have been using DMEM-high glucose since about 2003, and all patents and non-patent disclosures at that time do not even mention "DMEM-high glucose". DMEM-high glucose is used. This is partly due to manufacturers such as Gibco, for example D.
MEM (Cat number 11960) and Knockout DMEM (Cat number 108)
The reason is that DMEM was not so named, such as 29). As of the filing date of this application, Gibco offers additional DMEM products, but as usual, certain DMEM products containing their high glucose, such as Knockout DMEM (Cat No. 10829-018), are "high". It should be noted that it is not labeled as "glucose". Therefore, in each case where DMEM is described, it can be presumed to mean DMEM containing high glucose, which was obvious to others conducting research and development in this field. .. In addition, ROCK inhibitors or rho
Kinase inhibitors such as Y-27632 can be used to enhance growth, survival, proliferation and promote cell-cell adhesion. PDX1-positive foregut cells generated in stage 3 co-express PDX1 and HNF6, as well as SOX9 and PROX, and are the endoderm or foregut endoderm (PDX1) described in stages 1 and 2 above.
Markers indicating negative foregut endoderm cells or PDX1-positive foregut endoderm cells are not co-expressed to the point of evaluation.

ステージ４（８〜１４日目）では、ステージ３から培地を取得し、それを、１％ｖｏｌ
／ｖｏｌのＢ２７サプリメント、それに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび５０ｎｇ／
ｍＬのＥＧＦ、および時にはさらに５０ｎｇ／ｍＬのノギン中、ＤＭＥＭを含有する培地
と交換する。再び、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進するために、Ｙ−２７
６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ステージ４から生成されるＰＤＸ
１陽性膵臓内胚葉細胞は、少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１、ならびにＰＴＦ１Ａ
を共発現し、上においてステージ１、２および３で記載される胚体内胚葉または前腸内胚
葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞の指標となるマーカーをあまり発現しない。 In stage 4 (8-14 days), medium is obtained from stage 3 and 1% vol.
/ Vol B27 supplement plus 50 ng / mL KGF and 50 ng /
Replace with medium containing DMEM in mL EGF, and sometimes in an additional 50 ng / mL noggin. Again, Y-27 to enhance growth, survival, proliferation and promote cell-cell adhesion
ROCK inhibitors such as 632 can be used. PDX generated from stage 4
1-positive pancreatic endoderm cells are at least PDX1 and Nkx6.1, and PTF1A.
Co-expresses and does not express much of the markers that are indicators of endoderm or foregut endoderm (PDX1-negative foregut endoderm) cells described above in stages 1, 2 and 3.

あるいは、ステージ４からの細胞は、約１〜６日間（１５日目から２０日目）の１体積
／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭ含有培地で、ステージ５でさらに分化させて
、内分泌先駆体もしくは前駆体型の細胞および／または単一および複数ホルモン性の膵臓
内分泌型の細胞をステージ４細胞から生成することができる。ステージ５から生成される
内分泌先駆細胞は、少なくともＮＧＮ３およびＰＡＸ４ならびにＮｋｘ２．２を共発現し
、上においてステージ１、２、３および４で記載される、胚体内胚葉または前腸内胚葉（
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞の指標となる
マーカーを感知し得るほどには発現しない。 Alternatively, cells from stage 4 are further differentiated in stage 5 with DMEM-containing medium in 1 volume / volume% B27 supplement for about 1-6 days (15th to 20th day) to be an endocrine precursor. Alternatively, precursor-type cells and / or single and multihormonal pancreatic endocrine-type cells can be generated from stage 4 cells. Endocrine precursor cells generated from stage 5 co-express at least NGN3 and PAX4 and Nkx2.2 and are described above in stage 1, 2, 3 and 4 endoderm or foregut endoderm (
PDX1-negative foregut endoderm) or PDX1-positive pancreatic endoderm or progenitor cell index markers are not perceptibly expressed.

ステージ４で生成したＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉をマクロ封入デバイスにローディングし
、完全に含有させ、患者に移植し、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞をｉｎ ｖｉｖｏで膵臓
ホルモン分泌細胞、例えばインスリン分泌性細胞に成熟させる。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉
細胞の封入およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるインスリンの生成は、米国特許出願第１２／６
１８，６５９号（‘６５９出願”）、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮ
ＣＲＥＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ
ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ」、２００９年１１月１３日出願に詳
細に記載されている。‘６５９出願は、仮特許出願第６１／１１４，８５７号、表題「Ｅ
ＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳ Ｄ
ＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ」、２００８年１１月１４日出願；および
米国特許仮出願第６１／１２１，０８４号、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ」、２００８年１２月９日出願の
優先権を主張するものである。これらの出願の各々の開示は、参照により本明細書に完全
に組み込まれる。 The PDX1-positive endoplasmic follicle generated in stage 4 is loaded into a macroencapsulation device, completely contained, transplanted into a patient, and the PDX1-positive pancreatic endoplasmic reticulum cells mature into pancreatic hormone-secreting cells, such as insulin-secreting cells, in vivo. Let me. Encapsulation of PDX1-positive pancreatic endoderm cells and insulin production in vivo are described in US Patent Application 12/6.
No. 18, 659 ('659 application "), title" ENCAPSULATION OF PAN
CREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN
"PLURIPOTENT STEM CELLS", described in detail in the November 13, 2009 application. The '659 application is a provisional patent application No. 61 / 114,857, entitled "E.
NCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS D
ERIVED FROM HES CELLS, filed November 14, 2008; and US Patent Provisional Application No. 61 / 121,084, entitled "ENCAPSULATION OF
"PANCREATIC ENDODERM CELLS" claims the priority of the application filed on December 9, 2008. The disclosure of each of these applications is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の方法、組成物およびデバイスは、現在、好ましい実施形態を表し、例
示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変化および他の使用は本
発明の主旨の範囲内に包含され、本開示の範囲によって定義されることが当業者には想起
されよう。したがって、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主
旨から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができることが当業者には明ら
かになろう。 The methods, compositions and devices described herein currently represent preferred embodiments, are exemplary and do not limit the scope of the invention. Those skilled in the art will recall that changes and other uses are within the scope of the present invention and are defined by the scope of the present disclosure. Therefore, it will be apparent to those skilled in the art that various substitutions and modifications can be made to the inventions disclosed herein without departing from the scope and gist of the invention.

例えば、多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を生成するた
めに、成長因子またはシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー
であるアクチビンＡが使用されるが、参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許
出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６８６号、表題「ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ
ＦＯＲ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２
００８年６月３日出願に記載されているものなど他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバ
ー、例えばＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１を、胚体内胚葉を生成するために使用すること
ができる。 For example, activin A, a member of the TGFβ superfamily of growth factors or signaling proteins, is used to generate embryonic embryos from pluripotent cells, such as hES and iPS cells, but by reference herein. International Patent Application No. PCT / US2008 / 0656686, entitled "GROWTH FACTORS", which is fully incorporated into
FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDODERM ", 2
Other TGFβ superfamily members, such as those described in the June 3, 2008 application, such as GDF-8 and GDF-11, can be used to generate germ layer in the embryo.

ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ１陽性前腸細胞に分化
させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかし、４−［（Ｅ）−２−（５、６、
７、８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロ
ペニル］安息香酸（またはＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまたはレチノイン酸類似体
および同様の類似体（例えば、４−ＨＢＴＴＮＰＢ）を使用することができる。 Retinoic acid (RA) is used to differentiate stage 2 PDX1-negative foregut germ layer cells into stage 3 PDX1-positive foregut cells. However, 4-[(E) -2- (5, 6,
7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-Tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] Other retinoids or retinoic acid analogs such as benzoic acid (or TTNPB) and similar analogs (eg, eg) 4-HBTNTPB) can be used.

ノギンは、例えば、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミ
リーシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活化するタンパク質である。しかし、コーデ
ィンおよびねじれ原腸形成（Ｔｗｉｓｔｅｄ Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）な
どの他のＢＭＰ４阻害剤または抗ＢＭＰ中和抗体によっても、ＢＭＰとその細胞表面受容
体の結合を妨げ、それにより、ＢＭＰシグナル伝達を有効に阻害することができる。ある
いは、ヒトノギンの遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。参照により本明細
書に組み込まれる米国特許第６，０７５，００７号を参照されたい。ノギン配列の解析に
より、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤との相同性を有するカルボキシ末端領域が示さ
れ、これにより、潜在的に他のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰの阻害に関し
て同様の効果を有し得ることが示されている。 Noggin is a protein that inactivates members of TGFβ superfamily signaling proteins, such as bone morphogenetic protein-4 (BMP4). However, other BMP4 inhibitors or anti-BMP neutralizing antibodies, such as ordin and twisted gastrulation (Tsg), also interfere with the binding of BMP to its cell surface receptors, thereby causing BMP signaling. It can be effectively inhibited. Alternatively, the human nogin gene has been cloned and sequenced. See U.S. Pat. No. 6,075,007 incorporated herein by reference. Analysis of the nogin sequence shows a carboxy-terminal region that is homologous to the Kunitz-type protease inhibitor, which could potentially have similar effects on the inhibition of BMP by other Kunitz-type protease inhibitors. It is shown.

最後に、本明細書および米国出願第１２／６１８，６５９号に記載され、参照により本
明細書に完全に組み込まれているマクロ封入デバイスは、再度、単に例示的なものであり
、本発明の範囲を限定するものではない。特に、デバイスのサイズ、デバイス内のチャン
バーまたは亜区画が複数であること、またはポートが複数であること、さらにはデバイス
のローディングおよび抽出の機構などのデバイス設計の変化は全て本発明の主旨の範囲内
に包含される。したがって、本明細書に記載の分化方法への種々の置換および改変だけで
なく、封入デバイスへの種々の置換および改変も同様に、本明細書に開示されている発明
に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく行うことができることが当業者
には明らかになろう。 Finally, the macroencapsulation devices described herein and US Application No. 12 / 618,659, which are fully incorporated herein by reference, are again merely exemplary and of the present invention. It does not limit the range. In particular, device design changes such as device size, multiple chambers or subsections within the device, or multiple ports, and device loading and extraction mechanisms are all within the scope of the present invention. Included in. Thus, not only various substitutions and modifications to the differentiation methods described herein, but also various substitutions and modifications to encapsulating devices, as opposed to the inventions disclosed herein. It will be apparent to those skilled in the art that it can be done without departing from the scope and purpose.

胚体内胚葉の生成および組成物（ステージ１）
一部のプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分
な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を多能性細胞培養物に供給することによっ
て達成される。胚体内胚葉の生成のために有益であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長
因子は、Ｎｏｄａｌ／アクチビン、ＧＤＦ−８、−９、−１０、−１１等またはＢＭＰサ
ブグループから選択される。一部の好ましい分化プロセスでは、成長因子は、Ｎｏｄａｌ
、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＢＭＰ４からなる群か
ら選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ、他のＷｎｔファミリーメンバー、およびＷ
ｎｔ経路アクチベータが胚体内胚葉細胞の生成のために有益である。ある特定の分化プロ
セスでは、前述の成長因子のいずれかの組合せを使用することができる。この方法および
他の方法は米国特許第７，５１０．８７６号に詳細に記載され、それは参照により完全に
本明細書に組み込まれる。 Germ layer production and composition (stage 1)
In some processes, in vivo germ layer differentiation is achieved by feeding pluripotent cell cultures with TGFβ superfamily growth factors in sufficient amounts to promote in vivo germ layer differentiation. .. Growth factors of the TGFβ superfamily that are beneficial for the production of endoderm embryos are selected from Nodal / activin, GDF-8, -9, -10, -11 etc. or BMP subgroups. In some preferred differentiation processes, growth factors are Nodal
, Activin A, activin B, GDF-8, GDF-11 and BMP4. In addition, growth factors Wnt3a, other Wnt family members, and W
The nt pathway activator is beneficial for the production of germ layer cells in the embryo. For certain differentiation processes, any combination of growth factors described above can be used. This method and other methods are described in detail in US Pat. No. 7,510.876, which is incorporated herein by reference in its entirety.

多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためのプロセスの一部に関して、上記の成長
因子は、成長因子が培養物中に、多能性細胞の少なくとも一部分から胚体内胚葉細胞への
分化を促進するために十分な濃度で存在するように細胞に供給される。いくつかのプロセ
スでは、上記の成長因子は、細胞培養物中に少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１
０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも
約７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少
なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ
／ｍＬ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍＬ、少なくと
も約３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０００ｎｇ
／ｍＬまたは約５０００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で存在する。 With respect to part of the process for differentiating pluripotent cells into endoderm cells, the above growth factors cause the growth factors to differentiate from at least a portion of the pluripotent cells into germ layer cells in the culture. It is supplied to the cells to be present in sufficient concentration to promote. In some processes, the above growth factors are at least about 5 ng / mL in cell culture, at least about 1.
0 ng / mL, at least about 25 ng / mL, at least about 50 ng / mL, at least about 75 ng / mL, at least about 100 ng / mL, at least about 200 ng / mL, at least about 300 ng / mL, at least about 400 ng / mL, at least about 500 ng
/ ML, at least about 1000 ng / mL, at least about 2000 ng / mL, at least about 3000 ng / mL, at least about 4000 ng / mL, at least about 5000 ng
It is present at a concentration of / mL or greater than about 5000 ng / mL.

胚体内胚葉細胞への多能性細胞の分化のためのある特定のプロセスでは、前述の成長因
子はそれらが添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、成長因子を添加してか
ら約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日
以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内にそれらを除去することができる。好
ましいプロセスでは、成長因子を添加した約４日後にそれらを除去する。 In certain processes for the differentiation of pluripotent cells into endoderm cells, the aforementioned growth factors are removed from the cell culture after they have been added. For example, within about 1 day, within about 2 days, within about 3 days, within about 4 days, within about 5 days, within about 6 days, within about 7 days, within about 8 days, about after adding the growth factor. They can be removed within 9 days or within about 10 days. The preferred process is to remove them about 4 days after adding the growth factors.

本明細書に記載されるプロセスの一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞はさらなる分化
の前に濃縮、単離および／または精製される。そのような実施形態では、胚体内胚葉細胞
は、任意の公知の方法を使用して濃縮、単離および／または精製することができる。好ま
しい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第
１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００
５年１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲ
Ｓ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭに記載される方法の１つまたは複数
を使用して濃縮、単離および／または精製され、その開示は、参照により完全に本明細書
に組み込まれる。 In some embodiments of the process described herein, germ layer cells in the embryo are concentrated, isolated and / or purified prior to further differentiation. In such embodiments, the germ layer cells in the embryo can be concentrated, isolated and / or purified using any known method. In a preferred embodiment, the endoderm cells are described in US Patent Application No. 11 / 021,618, entitled DEFINITIVE ENDODERM, filed December 23, 2004, and 200.
U.S. Patent Provisional Application No. 60 / 736,598 filed on November 14, 5
Concentrated, isolated and / or purified using one or more of the methods described in SOF DEFINITIVE ENDODERM, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化さ
れ、比較されるとき、本明細書で生成され、記載される胚体内胚葉細胞は、比較的高いレ
ベルのＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２遺伝子発現を有する。 In a preferred embodiment, when standardized and compared to the level of a control gene such as a housekeeping gene, the germ layer cells produced and described herein are at relatively high levels of CER, GSC, CXCR4, It has SOX17 and FOXA2 gene expression.

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ２）
胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するこれらの細胞のさらなる分
化によって、膵臓分化の方向に特定化することができる。本明細書に記載される分化プロ
セスの一部では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集
団は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団
へのさらなる分化のために使用することができる。 PDX1-negative foregut endoderm generation and composition (stage 2)
Germ cells in the embryo can be identified in the direction of pancreatic differentiation by further differentiation of these cells that produce PDX1-negative foregut endoderm cells. As part of the differentiation process described herein, cell cultures containing endoderm cells and enriched or purified cell populations are enriched and / or enriched cell cultures containing PDX1-negative proenteric endoderm cells. It can be used for further differentiation into a cell population.

一般的に、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団でＴＧＦβスー
パーファミリー成長因子シグナル伝達を低減、除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）または取
り除く（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）ことによって、胚体内胚葉細胞はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細
胞に分化する。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達
を低減または除去することは、外部から加えられるＴＧＦβスーパーファミリー成長因子
、例えばアクチビンＡを希釈するか、胚体内胚葉の細胞培養物または細胞集団から除去す
ることによって媒介される。他の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シ
グナル伝達は、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達をブロックする化合物
、例えばフォリスタチンおよび／またはノギンを胚体内胚葉細胞に供給することによって
低減または除去される。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグ
ナル伝達は、胚体内胚葉細胞へのヒト多能性細胞の分化の後の約１日、約２日、約３日、
約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日または約１０日を超える間
、低減または除去することができる。 In general, by reducing, eliminating or removing TGFβ superfamily growth factor signaling in cell cultures or cell populations of SOX17-positive endoderm cells, embryonic germ layer cells are PDX1-negative in the progenitor. Differentiate into germ layer cells. In some embodiments, reducing or eliminating TGFβ superfamily growth factor signaling dilutes externally applied TGFβ superfamily growth factor, such as activin A, or is a cell culture or cell population of embryonic embryos. Mediated by removing from. In other embodiments, TGFβ superfamily growth factor signaling is reduced or eliminated by feeding the embryonic germ layer cells with compounds that block TGFβ superfamily growth factor signaling, such as follistatin and / or nogin. In some embodiments, TGFβ superfamily growth factor signaling is about 1 day, about 2 days, about 3 days after differentiation of human pluripotent cells into embryonic germ layer cells.
It can be reduced or eliminated for about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days or more than about 10 days.

一部の実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害
剤を胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給することによって、前腸内胚葉細胞への
胚体内胚葉細胞の分化が増強される。そのような実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因
子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約２日、約３日、約４
日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、または約１０日を超える
日数の後に供給される。好ましい実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／また
はヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成
長因子シグナル伝達の低減または除去とほぼ同じ時期に供給される。 In some embodiments, feeding FGF family growth factors and / or hedgehog pathway inhibitors to an embryonic germ layer culture or cell population enhances germ layer differentiation into progenitor endoderm cells. Will be done. In such embodiments, the FGF family growth factor and / or hedgehog pathway inhibitor is about 1 day, about 2 days, about 1 day, about 2 days, from reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in embryonic embryonic cell culture. 3 days, about 4
It is supplied after days, about 5, about 6, about 7, about 8, about 8, about 9, about 10 days, or after more than about 10 days. In a preferred embodiment, the FGF family growth factor and / or hedgehog pathway inhibitor is supplied at about the same time as the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in the embryonic embryonic cell culture.

好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給されるＦＧＦファ
ミリー成長因子は、ＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７である。しかし、他のＦＧＦファ
ミリー成長因子またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もしくは模倣体をＦＧＦ１０およ
び／またはＦＧＦ７の代わりに、またはそれに加えて供給することができることが理解さ
れる。例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、およびＦＧＦ２３までのそれらからなる
群から選択されるＦＧＦファミリー成長因子を供給することができる。そのような実施形
態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もし
くは模倣体は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも
約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少な
くとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／
ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存
在するように細胞培養物の細胞に供給される。 In a preferred embodiment, the FGF family growth factor fed to the germ layer culture or cell population in the embryo is FGF10 and / or FGF7. However, it is understood that other FGF family growth factors or FGF family growth factor analogs or mimetics can be supplied in place of or in addition to FGF10 and / or FGF7. For example, FGF family growth factors selected from the group consisting of FGF1, FGF2, FGF3, and FGF23 can be supplied. In such embodiments, FGF family growth factors and / or FGF family growth factor analogs or mimetics are at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 75 ng / ml. About 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml
The cells of the cell culture are fed in ml, at a concentration of at least about 500 ng / ml or at least about 1000 ng / ml.

他の好ましい実施形態では、ヘッジホッグ阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。
しかし、他のヘッジホッグ阻害剤を使用することができることが理解される。そのような
阻害剤には、ＫＡＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホ
ッグ経路遮断抗体、および当業者に公知であるヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害剤
が含まれるが、これらに限定されない。単独で、またはＦＧＦファミリー成長因子と併用
されるとき、ヘッジホッグ阻害剤は少なくとも約０．０１μΜから５０μΜの濃度で供給
することができる。 In another preferred embodiment, the hedgehog inhibitor is KAAD-cyclopamine.
However, it is understood that other hedgehog inhibitors can be used. Such inhibitors include KAAD-cyclopamine analogs, jervine, jervine analogs, hedgehog pathway blocking antibodies, and any other inhibitor of hedgehog pathway function known to those of skill in the art. Not limited to. When used alone or in combination with FGF family growth factors, hedgehog inhibitors can be delivered in concentrations of at least about 0.01 μΜ to 50 μΜ.

胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための好ましいプロ
セスでは、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、胚体内胚葉へのヒト多
能性細胞の実質部分の分化から約２日の間低減または除去される（例えば、下の実施例に
記載される３日、４または５日分化プロトコルの後）。同じ頃に、胚体内胚葉細胞の細胞
培養物または細胞集団に、ノギンおよびＫＡＡＤ−シクロパミン、例えば、２ｍＭのＲＡ
または３ｎＭのＴＴＮＰＢの存在下のＤＭＥＭ培地中に５０ｎｇ／ｍｌのノギンおよび０
．２５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを供給する。 In a preferred process for the generation of a population of PDX1-negative progenitor endoderm cells from endoderm cells, TGFβ superfamily growth factor signaling is about from differentiation of parenchymal parts of human pluripotent cells into germ layer embryos Reduced or eliminated for 2 days (eg, after the 3-day, 4- or 5-day differentiation protocol described in the examples below). Around the same time, noggin and KAAD-cyclopamine, eg, 2 mM RA, were added to cell cultures or cell populations of germ layer cells in the embryo.
Or 50 ng / ml noggin and 0 in DMEM medium in the presence of 3 nM TTNPB.
.. Supply 25 μM KAAD-cyclopamine.

一部の実施形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）などのレ
チノイドを含有する培地と細胞を接触させるか、さもなければそれを細胞に供給すること
によって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞にさらに分化させることができる。一部の実施形
態では、少なくとも約１ｎＭから５０μＭの濃度で存在するように、レチノイドを細胞培
養物の細胞に供給する。そのような実施形態では、レチノイドは、胚体内胚葉細胞培養物
でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約
２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、また
は約１０日を超える日数の後に細胞に供給される。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスー
パーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約２〜３日後に、約０．０５
μΜのＲＡから約２μΜのＲＡがＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給される。 In some embodiments, PDX1-negative foregut endoderm cells are pre-PDX1-positive by contacting the cells with a medium containing a retinoid, such as retinoic acid (RA), or by supplying it to the cells. It can be further differentiated into intestinal germ layer cells. In some embodiments, the retinoids are fed to the cells of the cell culture so that they are present at a concentration of at least about 1 nM to 50 μM. In such embodiments, the retinoid is about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days from the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in the germ layer cell culture. It is fed to cells after about 6, about 7, about 8, about 9, about 10 days, or after a number of days greater than about 10 days. In a preferred embodiment, about 0.05 days after reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling.
Approximately 2 μΜ RA from μΜ RA is fed into PDX1-negative foregut endoderm cell cultures.

本明細書に記載される分化プロセスの一部では、前述の分化因子は添加された後に細胞
培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３
日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去するこ
とができる。 As part of the differentiation process described herein, the aforementioned differentiation factors are added and then removed from the cell culture. For example, the above-mentioned differentiation factors are added for about 1 day, about 2 days, and about 3 days.
It can be removed within a day, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days or about 10 days.

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化さ
れるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、比較的高い
レベルのＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａ遺伝子発現を有する。特
に、ＨＮＦ４Ａ遺伝子発現レベルは、例えば胚体内胚葉培養物からのＴＧＦβスーパーフ
ァミリー成長因子シグナル伝達（例えば、アクチビン）の除去まで実質的に増加しない。 In a preferred embodiment, when standardized to the level of a control gene such as a housekeeping gene, the PDX1-negative foregut endoderm cells produced and described herein are at relatively high levels of SOX17, FOXA1, HNF1B and Has HNF4A gene expression. In particular, HNF4A gene expression levels do not substantially increase until removal of TGFβ superfamily growth factor signaling (eg, activin), for example from embryonic germ layer cultures.

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ３）
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはＰＤＸ１陽性膵臓
内胚葉またはそれらの等価物を生成するこれらの細胞のさらなる分化によって、膵臓分化
の方向にさらに特定化することができる。本明細書に記載される分化プロセスの一部では
、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集団は、ＰＤＸ１
陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団へのさらなる分
化のために使用することができる。 PDX1-positive foregut endoderm generation and composition (stage 3)
PDX1-negative foregut endoderm cells can be further specified in the direction of pancreatic differentiation by further differentiation of PDX1-positive foregut endoderm cells or PDX1-positive pancreatic endoderm or their equivalents. .. As part of the differentiation process described herein, cell cultures containing embryonic germ layer cells as well as concentrated or purified cell populations are PDX1
It can be used for further differentiation into cell cultures and / or enriched cell populations containing positive foregut endoderm cells.

一般的に、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドをＳＯＸ１７陽性前腸内胚葉細胞を
含む細胞培養物に供給することによって、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をＰＤＸ１陽性前
腸内胚葉細胞に分化させる。分化プロセスの一部では、培養物中のＰＤＸ１陰性前腸内胚
葉細胞には、ＲＡの添加の前かそれとほぼ同じ時期に線維芽細胞成長因子ファミリーのメ
ンバーも供給される。好ましい線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ−７である。別の好ましい
プロセスでは、線維芽細胞成長因子は、任意の線維芽細胞成長因子、または線維芽細胞成
長因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相
互作用するリガンドを含む。さらに好ましいプロセスでは、ＦＧＦファミリー成長因子は
、ヘッジホッグ経路阻害剤と併用される。好ましいヘッジホッグ経路阻害剤は、ＫＡＡＤ
−シクロパミンである。特に好ましい分化プロセスでは、ＲＡ存在下でのＰＤＸ１陰性胚
体内胚葉細胞を含む細胞培養物に、ＦＧＦ−１０および／またはＫＡＡＤ−シクロパミン
が供給される。ある特定のプロセスでは、ＲＡ存在下でＢＭＰ４がＦＧＦ１０および／ま
たはＫＡＡＤ−シクロパミンとともに含まれてもよい。一部のプロセスでは、レチノイド
は、ΤＧＦβスーパーファミリー成長因子のメンバーおよび／またはＣｏｎｎａｕｇｈｔ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ培地（ＣＲＭＬ培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と併用される。 Generally, PDX1-negative foregut endoderm cells are differentiated into PDX1-positive foregut endoderm cells by supplying retinoids such as retinoic acid (RA) to cell cultures containing SOX17-positive foregut endoderm cells. As part of the differentiation process, PDX1-negative foregut endoderm cells in culture are also fed with members of the fibroblast growth factor family prior to or at about the same time as RA addition. A preferred fibroblast growth factor is FGF-7. In another preferred process, fibroblast growth factor stimulates any fibroblast growth factor, or a ligand that stimulates or otherwise interacts with the fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2 (IIIb)). Including. In a more preferred process, FGF family growth factors are used in combination with hedgehog pathway inhibitors. A preferred hedgehog pathway inhibitor is KAAD
-Cyclopamine. In a particularly preferred differentiation process, cell cultures containing PDX1-negative germ layer cells in the presence of RA are fed with FGF-10 and / or KAAD-cyclopamine. In certain processes, BMP4 may be included with FGF10 and / or KAAD-cyclopamine in the presence of RA. In some processes, retinoids are members of the ΤGFβ superfamily growth factor and / or Connaught.
Medical Research Labs Medium (CRML Medium) (In vitro)
Used in combination with gen, Carlsbad, CA).

本明細書に記載される分化プロセスの実施形態の一部に関して、レチノイドおよび／ま
たは前述の分化因子の組合せは、これらの因子がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉細胞培養物または細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分
な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。 For some of the embodiments of the differentiation process described herein, the combination of retinoids and / or the aforementioned differentiation factors is PDX to PDX1-positive foregut endoderm cells.
The cells are fed to be present in the cell culture or cell population at a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the 1-negative preintestinal germ layer cell culture or cell population.

他のプロセスでは、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ
／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎ
ｇ／ｍｌ、および５０μΜまでの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される
。本発明の一部の実施形態では、線維芽細胞成長因子または線維芽細胞成長因子２受容体
ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相互作用するリガ
ンドが、単独で、またはヘッジホッグ経路阻害剤と組み合わせて供給される。 In other processes, FGF-10 is at least about 1 ng / ml, at least about 2 ng.
/ Ml, at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 n
It is fed to the cells of the cell culture to be present in concentrations up to g / ml and 50 μΜ. In some embodiments of the invention, a ligand that stimulates or interacts with fibroblast growth factor or fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2 (IIIb)) alone or hedges. Supplied in combination with a Hog pathway inhibitor.

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための
好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または濃縮された細胞
集団に、ＦＧＦ−７、ＫＡＡＤ−シクロパミンおよびレチノイン酸（ＲＡ）、例えば２μ
ΜのＲＡ存在下のＣＭＲＬ培地中の２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−７および０．２μΜのＫＡ
ＡＤ−シクロパミンが供給される。 A preferred process for the generation of a population of PDX1-positive foregut endoderm cells from PDX1-negative foregut endoderm cells is in a cell culture of PDX1-negative foregut endoderm cells or in a concentrated cell population, FGF-7, KAAD-cyclopamine and retinoic acid (RA), eg 2μ
25 ng / ml FGF-7 and 0.2 μΜ KA in CMRL medium in the presence of Μ RA
AD-cyclopamine is supplied.

本明細書に記載される一部のプロセスでは、ＴＧＦβシグナル伝達因子、例えばアクチ
ビンＡおよび／またはアクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１等は、レチノイドおよび
／または線維芽細胞成長因子およびヘッジホッグ阻害剤と一緒に細胞培養物に供給される
。例えばそのようなプロセスでは、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢおよび／ま
たはＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−１１は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも
約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なく
とも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ
、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００
ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に供給される。 In some of the processes described herein, TGFβ signaling factors such as activin A and / or activin B, GDF-8, GDF-11 and the like are retinoids and / or fibroblast growth factors and hedgehog inhibition. It is fed to the cell culture with the agent. For example, in such a process, activin A and / or activin B and / or GDF-8 and / or GDF-11 is at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml. ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml
, At least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500
The cell culture is fed at a concentration of ng / ml or at least about 1000 ng / ml.

一部のプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性細胞からの分化
の開始から約１日、２日、３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約
１０日後、または約１０日を超える日数の後に、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供給され
る。好ましいプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性幹細胞から
の分化の開始から約３日、または４日、または５日後にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供
給される。 In some processes, the differentiation factor and / or CRMM medium is about 1 day, 2 days, 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days from the onset of differentiation from pluripotent cells. , About 8, about 9, about 10 days later, or after a number of days greater than about 10 days, are fed to PDX1-negative foregut endoderm cells. In a preferred process, differentiation factor and / or CRML medium is fed to PDX1-negative foregut endoderm cells approximately 3, 4, or 5 days after the onset of differentiation from pluripotent stem cells.

本明細書に記載されるある特定のプロセスでは、前述の分化因子は添加された後に細胞
培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３
日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去するこ
とができる。 In certain processes described herein, the aforementioned differentiation factors are added and then removed from the cell culture. For example, the above-mentioned differentiation factors are added for about 1 day, about 2 days, and about 3 days.
It can be removed within a day, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days or about 10 days.

これらおよび他の方法は、２００５年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／７
３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＲＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮ
ＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭに詳細に記載され、ＰＤＸ１陽性前腸内胚
葉細胞は、２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題
ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭに見出すことができ、その開示は参
照により完全に本明細書に組み込まれる。 These and other methods are described in US Patent Provisional Application No. 60/7, filed October 27, 2005.
No. 30, 917, title PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VEN
Described in detail in TRAL FOREGUT ENDOREM, PDX1-positive foregut endoderm cells can be found in US Patent Application No. 11 / 115,868, entitled PDX1 EXPRESSING ENDOREM, filed April 26, 2005, and disclosure thereof. Is incorporated herein by reference in its entirety.

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化さ
れ、比較されるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、
比較的高いレベルのＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣ遺伝子
発現を有する。 In a preferred embodiment, the PDX1-positive foregut endoderm cells produced and described herein, when standardized and compared to the level of a control gene such as a housekeeping gene, are:
It has relatively high levels of PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA and cMYC gene expression.

ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の生成および組成物（ステージ４）
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または「膵臓上皮」またはより一般に膵臓前駆体の生成および
組成物は、２００８年７月２日に出願の米国特許出願第１２／１６７，２２７号、表題Ｍ
ＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳに
詳細に記載され、それは米国特許第７，５３４，６０８号として２００９年５月１９日に
公布された。第１２／１６７，２２７号出願は、２００７年７月５日に出願の米国特許出
願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮ
ＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳの継続出願であり、それは２００７年３月２日に出願
の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＥＣＵＲＳＯ
Ｒ ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥ
ＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願である。
これらの出願の各々の開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。 Generation and composition of PDX1-positive pancreatic germ layer (stage 4)
The production and composition of PDX1-positive pancreatic germ layers or "pancreatic epithelium" or more generally pancreatic precursors, filed July 2, 2008, U.S. Patent Application No. 12 / 167,227, entitled M.
It is described in detail in ETHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, which was promulgated on May 19, 2009 as US Pat. No. 7,534,608. Application No. 12 / 167,227 is U.S. Patent Application No. 11 / 773,944 filed on July 5, 2007, entitled METHODS OF PRODUCING PAN.
A continuation of CREATIC HORMONES, which is US Patent Application No. 11 / 681,687, filed March 2, 2007, entitled ENDOCRINE PRECURSO.
R CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CE
This is a partial continuation application of LLS AND METHODS OF PRODUCTION.
The disclosure of each of these applications is incorporated herein by reference in its entirety.

第１２／１６７，２２７号出願の実施例２２は、本明細書ステージ１〜４に記載される
細胞培養条件の様々な改変を詳細に記載する。一般に、ステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内
胚葉型の細胞は、１体積／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭに加えてノギン、ま
たは別のＢＭＰ４特異的阻害剤を含有する培地で、約１〜３日、または約１〜４日、また
は１〜５日、または約１〜６日の間培養される。ステージ４の終わりに、ＰＤＸ１陽性膵
臓内胚葉が生成され、その細胞はＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１ならびにＰＴＦ１Ａを少な
くとも共発現する。細胞培養物は、ステージ５の単一もしくは複数ホルモン性内分泌細胞
、またはステージ１の胚体内胚葉細胞、またはステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞
、またはステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の指標となる細胞を認め得る程には発
現しない。 Example 22 of the 12 / 167,227 application describes in detail various modifications of the cell culture conditions described in Stages 1-4 herein. In general, stage 3 PDX1-positive foregut germ layer-type cells are medium containing noggin, or another BMP4-specific inhibitor, in addition to DMEM in 1 volume / volume% of B27 supplement, from about 1-3. Incubate for days, or about 1 to 4 days, or 1 to 5 days, or about 1 to 6 days. At the end of stage 4, PDX1-positive endoderm of the pancreas is generated and the cells co-express PDX1 and Nkx6.1 as well as PTF1A. Cell cultures include stage 5 single or multihormonal endocrine cells, or stage 1 embryonic endoderm cells, or stage 2 PDX1-negative preintestinal germ layer cells, or stage 3 PDX1-positive preintestinal germ layer cells. It is not expressed to the extent that the indicator cells can be recognized.

内分泌先駆細胞の生成および組成物（ステージ５）
本明細書に記載される一部の実施形態は、多能性細胞から開始して内分泌先駆細胞を生
成する方法に関する。上記の通り、内分泌先駆細胞は、最初に多能性細胞を分化させて胚
体内胚葉細胞を生成し、次に胚体内胚葉細胞をさらに分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉
細胞を生成することによって生成することができる。そのような実施形態では、ＰＤＸ１
陽性前腸内胚葉細胞は、多分化能内分泌先駆細胞にさらに分化し、それはヒト膵島ホルモ
ン発現細胞に分化することが可能である。 Endocrine Pioneer Cell Generation and Composition (Stage 5)
Some embodiments described herein relate to methods of starting with pluripotent cells to generate endocrine precursor cells. As described above, endocrine pioneer cells first differentiate pluripotent cells to produce endoderm cells in the embryo, and then further differentiate the germ layer cells in the embryo to produce PDX1-positive progenitor endoderm cells. Can be generated. In such an embodiment, PDX1
Positive progenitor endoderm cells further differentiate into pluripotent endocrine precursor cells, which are capable of differentiating into human islet hormone-expressing cells.

一実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、内分泌先駆細胞の生成に十分な時間
、レチノイン酸などのレチノイドの存在下でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のインキュベー
ションを続けることによって内分泌先駆細胞に分化する。一部の実施形態では、内分泌先
駆細胞の生成に十分な時間は、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の
後の約１時間から約１０日間である。一部の実施形態では、レチノイドは細胞培養物中に
、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の後の約１時間、約２時間、約
４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約１日、約２日、
約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、または約１０日
を超える日数維持される。 In one embodiment, PDX1-positive foregut endoderm cells become endocrine precursor cells by continuing incubation of PDX1-positive foregut endoderm cells in the presence of retinoids such as retinoic acid for a time sufficient to generate endocrine precursor cells. Differentiate. In some embodiments, sufficient time for the generation of endocrine precursor cells is from about 1 hour to about 10 days after expression of the PDX1 marker on some of the cells in the cell culture. In some embodiments, the retinoid is in the cell culture, about 1 hour, about 2 hours, about 4 hours, about 6 hours, about 1 hour, about 2 hours, about 4 hours, about 6 hours, after expression of the PDX1 marker in some of the cells in the cell culture. 8 hours, about 10 hours, about 12 hours, about 16 hours, about 1 day, about 2 days,
It is maintained for about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days, or more than about 10 days.

本明細書に記載される一部のプロセスでは、内分泌先駆細胞に細胞培養物または細胞集
団中のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分化させるために使用されるレチノイドの濃度は、
約１ｎＭから約１００μΜである。 In some of the processes described herein, the concentration of retinoids used to differentiate PDX1-positive foregut germ layer cells in cell cultures or cell populations into endocrine precursors is
It is about 1 nM to about 100 μΜ.

一部の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物また
は細胞集団へのガンマセクレターゼ阻害剤の供給によって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞
から膵臓内分泌先駆細胞への分化が媒介される。好ましい一実施形態では、ガンマセクレ
ターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ
−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。 In some preferred embodiments, the supply of a gamma secretase inhibitor to a cell culture or cell population containing human PDX1-positive preintestinal germ layer cells results in differentiation of PDX1-positive preintestinal endoderm cells into pancreatic endocrine precursor cells. Be mediated. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S.
-Phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化プロセスの開始時に、例えば多
能性ステージに供給され、膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存
する。さらに他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化の開始の後に、しか
しＰＤＸ１陽性前腸内胚葉ステージへの分化の前に加えられる。好ましい実施形態では、
ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＰＤＸ１陽性内胚葉への胚体内胚葉の変換を促進する分化
因子の供給と同じ頃に、細胞培養物または細胞集団に供給される。他の好ましい実施形態
では、細胞培養物または細胞集団中の細胞の実質的な部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞
に分化した後に、ガンマセクレターゼ阻害剤は細胞培養物または細胞集団に供給される。 In other embodiments, the gamma secretase inhibitor is fed, for example, to the pluripotent stage at the beginning of the differentiation process and remains in the cell culture throughout differentiation into islet hormone-expressing cells. In yet another embodiment, the gamma secretase inhibitor is added after the onset of differentiation, but before differentiation into the PDX1-positive foregut endoderm stage. In a preferred embodiment
The gamma secretase inhibitor is supplied to the cell culture or cell population at the same time as the supply of the differentiation factor that promotes the conversion of the endoderm into the PDX1-positive endoderm. In another preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is fed to the cell culture or population after a substantial portion of the cells in the cell culture or population have differentiated into PDX1-positive preintestinal endoblast cells.

内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化に関する一部の実施形態に関し
て、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性細胞の少なくとも一
部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に
供給される。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．０１μΜから約
１０００μΜの濃度で細胞培養物または細胞集団に存在する。好ましい実施形態では、ガ
ンマセクレターゼ阻害剤は、約０．１μΜから約１００μΜの濃度で細胞培養物または細
胞集団に存在する。 For some embodiments relating to the differentiation of PDX1-positive prone endoblasts into endocrine precursor cells, the gamma secretase inhibitor is concentrated sufficient to promote the differentiation of at least some of the PDX1-positive cells into endocrine precursor cells. Is supplied to cells to be present in cell cultures or cell populations. In some embodiments, the gamma secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration of about 0.01 μΜ to about 1000 μΜ. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration of about 0.1 μΜ to about 100 μΜ.

本明細書に記載される内分泌先駆細胞を生成するプロセスのある特定の実施形態では、
ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給された１つまたは複数の分化因子が細胞培養物か
ら除去された後に供給される。例えば、前に供給される１つまたは複数の分化因子は、ガ
ンマセクレターゼ阻害剤の添加より約１日から１０日前、または約１０日以上前に除去す
ることができる。他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給されたか、
ガンマセクレターゼ阻害剤と同じ頃に供給された１つまたは複数の分化因子を含む細胞培
養物または細胞集団に供給される。好ましい実施形態では、前に供給されたかガンマセク
レターゼ阻害剤と同じ頃に供給された分化因子としては、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シク
ロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＢＭＰ４および／
またはＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。 In certain embodiments of the process of producing endocrine precursor cells described herein,
The gamma secretase inhibitor is supplied after the previously supplied differentiation factor has been removed from the cell culture. For example, the previously supplied differentiation factor can be removed approximately 1 to 10 days prior to the addition of the gamma secretase inhibitor, or approximately 10 days or more prior to addition. In other embodiments, the gamma secretase inhibitor was previously supplied or
It is fed to a cell culture or cell population containing one or more differentiation factors that were fed around the same time as the gamma secretase inhibitor. In a preferred embodiment, the differentiation factors previously supplied or supplied at the same time as the gamma secretase inhibitor include FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A, activin B, GDF-8, GDF-11, BMP4 and /
Or RA, but is not limited to these.

本明細書に記載の本発明の一部の実施形態では、分化する細胞培養物または細胞集団に
、ガンマセレクターゼ阻害剤とほぼ同じ時間にエキセンディン４をもたらす。ある特定の
実施形態では、エキセンディン４を、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約０．１
ｎｇ／ｍＬから、１０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で存在するようにもたらす。 In some embodiments of the invention described herein, exendin 4 is delivered to the differentiating cell culture or population at about the same time as the gamma selectorase inhibitor. In certain embodiments, exendin 4 is added to the cell culture or cell population at least about 0.1.
Brings to be present at concentrations from ng / mL to 1000 ng / mL.

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの内分泌先駆細胞の生成のための好ましいプロセスで
は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団は、３μΜのＤＡＰＴおよ
び４０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン４が供給される。特に好ましい実施形態では、細胞は
ＣＭＲＬで分化する。別の特に好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞から
の内分泌先駆細胞の生成のために、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞
集団には、２μΜのＲＡの存在下で３μΜのＤＡＰＴおよび４０ｎｇ／ｍｌのエキセンデ
ィン４が供給される。 In a preferred process for the generation of endocrine precursors from PDX1-positive foregut endoderm cells, cell cultures or cell populations of PDX1-positive foregut endoderm cells are supplied with 3 μΜ DAPT and 40 ng / ml exendin 4. Will be done. In a particularly preferred embodiment, the cells differentiate with CMRL. In another particularly preferred process, due to the generation of endocrine precursor cells from PDX1-positive foregut endoderm cells, the cell culture or cell population of PDX1-positive foregut endoderm cells is 3 μΜ in the presence of 2 μΜ RA. DAPT and 40 ng / ml exendin 4 are supplied.

ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌先駆細胞に
おいて分化の状態に応じて様々な異なるレベルにわたって誘導されることが理解されよう
。そのように、本明細書に記載の一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団に
おけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆
細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉
細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中
胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡ
Ｘ４マーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍である。他の実施
形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／また
はＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞
、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵
島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞における
ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約４倍、少
なくとも約６倍〜１０，０００倍である。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細
胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内
分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性細胞様ｉＰＳ細胞およびｈＥＳ細胞、胚体
内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホル
モン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ
３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現よりもはるかに高い。 It will be appreciated that expression of the NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers is induced in endocrine precursor cells at various different levels depending on the state of differentiation. As such, in some embodiments described herein, expression of the NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers in an endocrine precursor cell or cell population is pluripotent, eg, a non-endocrine precursor cell or cell population. NGN3, NKX2.2 in germ layer stem cells, endoderm cells, PDX1-positive progenitor germ layer cells, immature pancreatic islet hormone-expressing cells, mature pancreatic islet hormone-expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesodermal cells and / or ectodermal cells And / or PA
At least about 2-fold to at least about 10,000-fold expression of the X4 marker. In other embodiments, expression of NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers in endocrine precursor cells or cell populations is such as pluripotent stem cells, endoderm germ layer cells, PDX1 positive pre-positive. At least about 4 of the expression of NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers in intestinal germ layer cells, immature pancreatic islet hormone expressing cells, mature pancreatic islet hormone expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesodermal cells and / or ectodermal cells. Double, at least about 6 to 10,000 times. In some embodiments, expression of NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers in endocrine precursor cells or cell populations is such as pluripotent cell-like iPS cells and hES cells, germ layers. NGN in endoderm cells, PDX1-positive progenitor endoderm cells, immature pancreatic islet hormone-expressing cells, mature pancreatic islet hormone-expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesodermal cells and / or ectodermal cells
3. Much higher than the expression of NKX2.2 and / or PAX4 markers.

本発明の別の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または
細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＮＧＮ３マーカー
の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ
、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大
きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜９８％において
ＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、
ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカ
ーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＧＮ３
の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ
、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大
きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。 Another embodiment of the invention is a composition such as a cell culture or cell population comprising human cells such as human endocrine precursors, wherein the expression of the NGN3 marker in at least about 2% of the human cells is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYS, CHGA
, INS, GCG, SST, GHRL, and / or compositions that are greater than the expression of the PAX6 marker. In other embodiments, expression of the NGN3 marker in at least about 5% to 98% of human cells is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA,
It is greater than the expression of the TYPE, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or PAX6 markers. In some embodiments, NGN3 in a cell culture or cell population
Expression is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYS, CHGA
, INS, GCG, SST, GHRL, and / or the percentage of human cells greater than the expression of the PAX6 marker is calculated without considering the feeder cells.

本発明の一部の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団など
の組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％超までにおいて
ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、
ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／ま
たはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関することが理解されよう。一部の実
施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜ヒト細胞の９８％においてＮＫＸ２．２およ
び／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ
、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マー
カーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＫＸ
２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ
、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰ
ＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算
出する。 Some embodiments of the invention are compositions such as cell cultures or cell populations comprising human endocrine pioneering cells, in which at least about 2% to at least about 98% of human cells are NKX2.2 and /. Or the expression of PAX4 is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1,
It will be appreciated that for compositions greater than the expression of the NFM, MAFA, SYS, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or PAX6 markers. In some embodiments, expression of NKX2.2 and / or PAX4 in at least about 5% of human cells to 98% of human cells is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA.
, SYS, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or expression of PAX6 markers. In some embodiments, NKX in a cell culture or cell population
2.2 and / or PAX4 expression is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM
, MAFA, SYS, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or P
Percentages of human cells that are greater than the expression of the AX6 marker are calculated without considering feeder cells.

本発明の追加の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞
、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む組成物、例えば細胞
培養物または細胞集団に関し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なく
とも約２％では、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、Ａ
ＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、
ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ６マーカーの発現より大きい。他の実施
形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％からｉｎ
ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の９８％で、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および
／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、
ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ
６マーカーの発現より大きい。 An additional embodiment of the invention relates to a composition comprising mammalian cells differentiated from an in vitro germ layer, such as human cells differentiated from an in vitro germ layer, such as a cell culture or cell population, in vitro. In at least about 2% of cells differentiated from the germ layer in the embryonic body, the expression of NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers is A.
FP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYS, CHGA, INS,
Greater than expression of GCG, SST, GHRL and / or PAX6 markers. In other embodiments, in vitro from at least about 5% of cells differentiated from the embryonic germ layer in vitro.
Expression of NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 markers was expressed in AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, in 98% of cells differentiated from the germ layer in vitro.
MAFA, SYS, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX
Greater than 6 marker expression.

本明細書に記載のプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まない、内分泌先駆細
胞を含む組成物を生成することができる。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載
の方法によって生成する内分泌先駆細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、Ｓ
ＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まな
い。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する細胞培養物の内分泌先
駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、Ｃ
ＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーを有意に
発現する細胞を実質的に含まない。 The processes described herein can be used to produce compositions containing endocrine precursor cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments of the invention, the endocrine precursor cell population or cell culture produced by the methods described herein is AFP, SOX7, S.
It is substantially free of cells that significantly express OX1, ZIC1 and / or NFM markers. In some embodiments, the endocrine pioneer cell populations of cell cultures produced by the methods described herein are AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYS, C.
It is substantially free of cells that significantly express the HGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or PAX6 markers.

本発明の一実施形態では、マーカーの発現に基づく内分泌先駆細胞の記述は、高ＮＧＮ
３、高ＮＫＸ２．２、高ＰＡＸ４、低ＡＦＰ、低ＳＯＸ７、低ＳＯＸ１、低ＺＩＣ１、低
ＮＦＭ、低ＭＡＦＡ；低ＳＹＰ；低ＣＨＧＡ；低ＩＮＳ、低ＧＣＧ、低ＳＳＴ、低ＧＨＲ
Ｌおよび／または低ＰＡＸ６である。 In one embodiment of the invention, the description of endocrine precursor cells based on marker expression is high NGN.
3. High NKX2.2, High PAX4, Low AFP, Low SOX7, Low SOX1, Low ZIC1, Low NFM, Low MAFA; Low SYSTEM; Low CHGA; Low INS, Low GCG, Low SST, Low GHR
L and / or low PAX6.

未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成
本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞から開始して未熟な膵島ホルモン発現細
胞を生成する方法に関する。上記の通り、未熟な膵島ホルモン発現細胞は、最初に多能性
細胞を分化させて胚体内胚葉細胞を生成し、胚体内胚葉細胞を分化させて前腸内胚葉細胞
を生成し、前腸内胚葉を分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成し、次にＰＤＸ１
陽性前腸内胚葉細胞をさらに分化させて内分泌先駆細胞を生成することによって生成する
ことができる。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞を未熟な膵島ホルモン発現細胞にさ
らに分化させることによって、そのプロセスを継続する。 Generation of Immature Islet Hormone-Expressing Cells The embodiments described herein relate to a method of producing immature islet hormone-expressing cells starting with pluripotent cells. As described above, immature pancreatic islet hormone-expressing cells first differentiate pluripotent cells to produce endoderm cells, then differentiate endoderm cells to produce progenitor endoderm cells, and then enter the anterior intestine. Germ layer is differentiated to produce PDX1-positive preintestinal germ layer cells, then PDX1
It can be produced by further differentiating positive foregut endoderm cells to produce endocrine precursor cells. In some embodiments, the process is continued by further differentiating endocrine precursor cells into immature islet hormone-expressing cells.

本発明の一部の実施形態では、細胞がＮＧＮ３を実質的に発現することを停止し、ＰＡ
Ｘ６の発現を開始するのに十分な時間、および細胞が少なくとも１つの膵島細胞ホルモン
を発現する能力を有するように、ガンマセクレターゼ阻害剤との内分泌先駆細胞の培養物
のインキュベーションを続けることによって、内分泌先駆細胞から未熟な膵島ホルモン発
現細胞への分化が進行する。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌
先駆細胞の誘導の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、
約９日、約１０日後、または約１０日以上後に除去される。好ましい一実施形態では、ガ
ンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニ
ル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。 In some embodiments of the invention, cells substantially cease to express NGN3 and PA
Endocrine by continuing incubation of a culture of endocrine precursor cells with a gamma secretase inhibitor so that the cells have sufficient time to initiate expression of X6 and the ability of the cells to express at least one islet cell hormone. Differentiation from pioneering cells into immature islet hormone-expressing cells progresses. In some embodiments, the gamma secretase inhibitor is about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days of induction of endocrine precursor cells. ,
It is removed after about 9 days, about 10 days, or about 10 days or more. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのある特定のプロセス
は、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団への、ニコチンアミド、エキセ
ンディン４、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）からなる
群から選択される１つまたは複数の因子の供給によって媒介される。一部の実施形態では
、上記の因子の全４つは、一緒に供給される。一部の実施形態では、上記の因子の１つま
たは複数は、内分泌先駆細胞の分化の前に細胞培養物に供給され、内分泌先駆細胞への細
胞培養物中の細胞の少なくとも一部の分化の間、細胞培養物に残存する。他の実施形態で
は、上記の因子の１つまたは複数は内分泌先駆細胞への細胞の実質的な部分の分化時かそ
の頃に細胞培養物に供給され、細胞の少なくとも実質的な部分が未熟な膵島ホルモン発現
細胞に分化するまで細胞培養物に残存する。本発明の一部の実施形態では、上記の因子の
１つまたは複数は、分化プロセスの開始時に、例えば多能性細胞ステージに供給され、未
熟な膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存する。 Certain processes for the production of immature islet hormone-expressing cells disclosed herein include nicotine amide, exendin 4, hepatocyte growth factor into cell cultures or cell populations containing human endocrine precursor cells. It is mediated by the supply of one or more factors selected from the group consisting of (HGF), insulin-like growth factor 1 (IGF1). In some embodiments, all four of the above factors are supplied together. In some embodiments, one or more of the above factors are fed into the cell culture prior to the differentiation of the endocrine precursors and the differentiation of at least a portion of the cells in the cell culture into the endocrine precursors. While remaining in the cell culture. In other embodiments, one or more of the above factors are fed to the cell culture during or around the differentiation of a substantial portion of the cell into endocrine precursor cells, and at least a substantial portion of the cell is an immature pancreatic islet. It remains in cell culture until it differentiates into hormone-expressing cells. In some embodiments of the invention, one or more of the above factors are fed at the beginning of the differentiation process, eg, to the pluripotent cell stage, and cell culture throughout differentiation into immature islet hormone-expressing cells. It remains in the object.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための一部のプロセスでは
、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチン酸
が、未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進する
のに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の
実施形態では、ニコチンアミドは、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭか
ら１０００ｍＭの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In some processes for the production of immature islet hormone-expressing cells disclosed herein, nicotine amide, nicotine amide adenin dinucleotide (NAD) or nicotinic acid is an endocrine precursor to immature islet hormone-expressing cells. The cells are fed so that they are present in the cell culture or population at a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the cells. In some embodiments, nicotinamide is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 0.1 mM, at least about 0.5 mM to 1000 mM.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための他のプロセスでは、
エキセンディン４が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の
分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給
される。一部の実施形態では、エキセンディン４は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なく
とも約５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在
する。 In other processes for the production of immature islet hormone-expressing cells disclosed herein,
Excendin 4 is supplied to cells in a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of endocrine precursor cells into immature islet hormone-expressing cells in a cell culture or cell population. In some embodiments, exendin 4 is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng / ml, at least about 5 ng / ml to 1000 ng / ml.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセス
では、ＨＧＦが未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化
を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給され
る。一部の実施形態では、ＨＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／
ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 Yet another process for the production of immature islet hormone-expressing cells disclosed herein is sufficient for HGF to promote the differentiation of at least some of the endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. It is fed to cells to be present in a cell culture or cell population at a concentration. In some embodiments, HGF is at least about 1 ng / ml, at least about 5 ng / ml.
It is present in cell cultures or cell populations at concentrations of ml to 1000 ng / ml.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセス
では、ＩＧＦ１が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分
化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給さ
れる。一部の実施形態では、ＩＧＦ１は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／
ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In yet another process for the production of immature islet hormone-expressing cells disclosed herein, IGF1 is sufficient to promote the differentiation of at least some of the endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. It is fed to cells to be present in a cell culture or cell population at a concentration. In some embodiments, IGF1 is at least about 1 ng / ml to 1000 ng / ml.
It is present in cell cultures or cell populations at a concentration of ml.

本明細書に記載の未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのプロセスのある特定の
実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種
または複数種を、前に供給された１種または複数種の分化因子を細胞培養物から除去した
後に供給する。他の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩ
ＧＦ１のうちの１種または複数種を、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよび
ＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前に供給された、またはほぼ同時に供給された
１種または複数種の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団に供給する。好ましい実施
形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種また
は複数種よりも前に供給される、またはほぼ同時に供給される分化因子としては、これだ
けに限定されないが、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ
、アクチビンＢ、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられる。 In certain embodiments of the process for producing the immature islet hormone-expressing cells described herein, one or more of nicotine amide, exendin 4, HGF and IGF1 are previously supplied. One or more differentiation factors are removed from the cell culture and then supplied. In other embodiments, nicotinamide, exendin 4, HGF and I
Differentiation of one or more of GF1 fed prior to or at about the same time as one or more of nicotine amide, exendin 4, HGF and IGF1 Feed a cell culture or cell population containing the factor. In a preferred embodiment, the differentiation factors fed prior to, or at about the same time as, one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF and IGF1, are, but are not limited to, DAPT. FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A
, Activin B, BMP4 and / or RA.

本発明の別の実施形態は、ヒト未成熟膵島ホルモン発現細胞などのヒト細胞を含む細胞
培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＭＡ
ＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１
、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペ
プチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ
、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成
物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ヒト細胞の少な
くとも約１０％〜ヒト細胞の９５％においてまたはヒト細胞の少なくとも約９８％におい
てＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、Ｐ
ＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／または
Ｃ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、
ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大き
い。 Another embodiment of the invention is a composition such as a cell culture or cell population comprising human cells such as human immature islet hormone expressing cells, in which MA is present in at least about 2% of the human cells.
FB, SYS, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1
, HB9, GHRL, IAPP, INS, GCG, SST, PP, and / or expression of C-peptide markers is NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP
, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or compositions with greater expression than the NFM marker. In other embodiments, in at least about 5% of human cells, in at least about 10% of human cells to 95% of human cells, or in at least about 98% of human cells, MAFB, SYS, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, P
Expression of DX1, HB9, GHRL, IAPP, INS, GCG, SST, PP, and / or C-peptide markers is NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1,
Greater than the expression of AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM markers.

一部の実施形態では、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ
６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ ＧＣＧ、ＳＳＴ、
ＰＰおよび／またはＣペプチドの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ
５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よ
り大きい場合、細胞培養物または集団中のヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞に関係な
く計算される。 In some embodiments, MAFB, SYS, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX
6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST,
Expression of PP and / or C-peptide is NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU
If greater than the expression of 5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM markers, the percentage of human cells in the cell culture or population is calculated regardless of the feeder cells.

本発明のある特定の実施形態では、未成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物およ
び／または細胞集団は、グレリン、インスリン、ソマトスタチンおよび／またはグルカゴ
ンから選択される、１種または複数種の分泌されたホルモンを含む培地も含む。他の実施
形態では、培地は、Ｃ−ペプチドを含む。好ましい実施形態では、培地中の１種または複
数種の分泌されたホルモンまたはＣ−ペプチドの濃度は、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少な
くとも約１ｐｍｏｌのグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペ
プチドから、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１０００ピコモル（ｐｍｏｌ）のグ
レリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドまでの範囲である
。 In certain embodiments of the invention, cell cultures and / or cell populations containing immature islet hormone-expressing cells are secreted by one or more selected from grelin, insulin, somatostatin and / or glucagon. Also includes media containing the hormones. In other embodiments, the medium comprises C-peptide. In a preferred embodiment, the concentration of one or more secreted hormones or C-peptides in the medium is from at least about 1 pmol of grelin, insulin, somatostatin, glucagon or C-peptide per 1 μg of intracellular DNA, 1 μg of intracellular DNA. The range is at least about 1000 picomols (pmol) per grelin, insulin, somatostatin, glucagon or C-peptide.

インスリンをｉｎ ｖｉｖｏで生成させる方法
一部の実施形態では、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏで導出された膵臓前駆細胞またはＰＤＸ
−１陽性膵臓内胚葉型細胞またはその等価物を哺乳動物対象に移植する。これらの方法は
、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ Ｐ
ＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」に詳しく記載され、それ
は参照により本明細書に完全に組み込まれる。好ましい実施形態では、哺乳動物対象はヒ
ト対象である。特に好ましい対象は、生理的に高い血中グルコース濃度に応答して十分な
レベルのインスリンを生成する対象の能力が限定される状態を有すると同定された対象で
ある。任意の特定の哺乳動物種についての生理的に高い血中グルコースレベルを構成する
血中グルコースレベルの範囲は、当業者には容易に決定することができる。認識される疾
患または状態をもたらすいかなる持続的な血中グルコースレベルも、生理的に高い血中グ
ルコースレベルとみなされる。 Method of Producing Insulin In Vivo In some embodiments, pancreatic progenitor cells or PDX derived in vitro above.
-1-Positive pancreatic endoderm cells or their equivalents are transplanted into mammalian subjects. These methods are described in International Application No. PCT / US2007 / 015536, entitled "METHODS OF P."
It is described in detail in "RODUCING PANCREATIC HORMONES", which is fully incorporated herein by reference. In a preferred embodiment, the mammalian subject is a human subject. Particularly preferred subjects are those identified as having a limited ability of the subject to produce sufficient levels of insulin in response to physiologically high blood glucose levels. The range of blood glucose levels that make up physiologically high blood glucose levels for any particular mammalian species can be readily determined by those of skill in the art. Any persistent blood glucose level that results in a perceived disease or condition is considered a physiologically high blood glucose level.

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ多能性幹細胞またはその後代、例えば
、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは膵臓前駆細胞、Ｎ
ＧＮ３陽性内分泌先駆体などの内分泌先駆体などの多分化能細胞、またはインスリン分泌
細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｉｓｔａｔｉｎ）分泌細胞、グ
レリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分
泌細胞から導出されるｉｎ ｖｉｖｏインスリン分泌細胞に関する。上記の最終分化した
細胞または多分化能細胞のいずれも、宿主、または哺乳動物に移植し、宿主血中グルコー
スレベルに応答してインスリンを分泌する細胞などの生理的に機能的なホルモン分泌細胞
に成熟させることができる。好ましい実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏで奇形腫を形
成せず、そのように形成された場合には、移植の領域に局在したままであり、容易に切除
または除去することができる。特に好ましい実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おける分化プロセスの間、または哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏで移植された際、またはｉｎ
ｖｉｖｏで機能的な島に成熟および発達する際に、いかなる核型異常も含有しない。 Further embodiments of the present invention include in vitro pluripotent stem cells or progeny such as PDX-1-positive foregut endoderm cells, PDX-1-positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cells, N.
Pluripotent cells such as endocrine precursors such as GN3-positive endocrine precursors, or functionally differentiated cells such as insulin secretory cells, glucagon secretory cells, somatistin secretory cells, grelin secretory cells, or pancreatic polypeptide secretory cells. It relates to in vivo insulin secretory cells derived from hormone secretory cells. Both of the above final differentiated or pluripotent cells are transplanted into a host or mammal to become physiologically functional hormone-secreting cells, such as cells that secrete insulin in response to host blood glucose levels. Can be matured. In a preferred embodiment, the cells do not form teratomas in vivo, and when they are formed, they remain localized in the area of transplantation and can be easily resected or removed. In a particularly preferred embodiment, the cells are transplanted in vivo during the differentiation process in vitro or in vivo, or in vivo.
It does not contain any karyotypic abnormalities as it matures and develops into a vivo-functional island.

さらに、本明細書に記載の実施形態は、工学的に操作されたまたは遺伝子組換えされた
、多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性細胞から本明細書において提供される説明に
基づいて導出された多分化能細胞または分化した細胞に関するが、ｉＰＳ細胞では、ｈＥ
Ｓ細胞およびｈＥＳ由来細胞と同様の生理機能および遺伝子マーカーの発現プロファイル
が実証されるので、ｉＰＳ細胞はｉｎ ｖｉｖｏにおける同様の生理的特性を有すること
が予測される。 Furthermore, the embodiments described herein are based on the description provided herein by pluripotent cells such as engineered or genetically modified pluripotent cells, human iPS cells. Regarding pluripotent cells or differentiated cells derived from the above, in iPS cells, hE
Since the same physiological functions and expression profiles of genetic markers as S cells and hES-derived cells are demonstrated, it is predicted that iPS cells will have similar physiological characteristics in vivo.

膵臓前駆体を封入する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載の多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞
組成物を生物学的および／または非生物学的機械デバイスに封入することができ、封入さ
れたデバイスにより、細胞組成物が宿主から分離および／または隔離される。 Methods of Encapsulating Pancreatic Progenitor In some embodiments, pluripotent cells, pluripotent cells and differentiated cell compositions described herein are encapsulated in biological and / or non-biological mechanical devices. The encapsulated device allows the cell composition to be separated and / or sequestered from the host.

封入の方法は、２００８年１１月１４日に出願の米国特許出願第６１／１１４，８５７
号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＰＲＯＧＥＮＩＴ
ＯＲＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ、および２００８年１２月１２
日に出願の米国特許出願第６１／１２１，０８６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳに詳細に記載され、それら
は参照により完全に本明細書に組み込まれ、半透膜、例えばＴｈｅｒａｃｙｔｅ（商標）
またはＧｏｒｅデバイスを使用する膵臓内胚葉細胞の封入を記載する。 The method of encapsulation is US Patent Application No. 61 / 114,857 filed on November 14, 2008.
Issue, Title ENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENIT
ORS DERIVED FROM HES CELLS, and December 12, 2008
U.S. Patent Application No. 61 / 121,086, entitled ENCAPSULATION
Described in detail in the OF PANCREATIC ENDODERM CELLS, they are fully incorporated herein by reference and are semipermeable membranes, such as Theracite ™.
Alternatively, encapsulation of pancreatic endoderm cells using a Gore device is described.

一実施形態では、ｈＥＳ由来の細胞は、生体適合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）を使用して封入される。ＰＥＧをベースとした封入は、米国特許第７，４２７，４１５
号、表題ＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ ＯＦ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ ＢＩＯＬＯＧＩ
ＣＡＬ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＤＩＳＥＡＳＥＳ；米国特許
第６，９１１，２２７号、表題ＧＥＬＳ ＦＯＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ；および米国特許第６，９１１，２２７号、
第５，５２９，９１４号、第５，８０１，０３３号、第６，２５８，８７０号、表題ＧＥ
ＬＳ ＦＯＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＡＴＥＲ
ＩＡＬＳでさらに詳細に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれ、ポ
リエチレングリコールを使用する細胞凝集体のコンフォーマルコーティングを記載する。 In one embodiment, the hES-derived cells are biocompatible polyethylene glycol (PEG).
) Is enclosed. PEG-based encapsulation is US Pat. No. 7,427,415
Issue, Title IMPLANTATION OF ENCAPSULATED BIOLOGI
CAL MATERIALS FOR TREATING DISEASES; US Pat. No. 6,911,227, title GELS FOR ENCAPSULATION OF
BIOLOGICAL MATERIALS; and US Pat. No. 6,911,227,
Nos. 5,529,914, Nos. 5,801,033, Nos. 6,258,870, Title GE
LS FOR ENCAPSULATION OF BIOLOGICAL MATER
Described in more detail in IALS, they are fully incorporated herein by reference and describe a conformal coating of cell aggregates using polyethylene glycol.

一実施形態では、封入デバイスは、多能性由来細胞、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚
葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌先駆体などの
内分泌先駆体、または、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌
細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホ
ルモン分泌細胞を、移植された細胞集団が通過するのを防ぎ、それらをデバイス内に保持
すると同時に、ある特定の分泌されたポリペプチド、例えばインスリン、グルカゴン、ソ
マトスタチン、グレリン、膵臓ポリペプチドなどの通過を可能にする半透膜の中に含有す
る。あるいは、デバイスは血管化膜などの複数の膜を有する。 In one embodiment, the encapsulation device is a pluripotent-derived cell, eg, an endocrine precursor such as a PDX-1-positive preintestinal endoplasmic cell, a PDX-1-positive pancreatic endoblast or precursor cell, an NGN3-positive endocrine precursor, or Prevents the transplanted cell population from passing through functionally differentiated hormone-secreting cells such as insulin-secreting cells, glucagon-secreting cells, somatostatin-secreting cells, grelin-secreting cells, or pancreatic polypeptide-secreting cells, and devices them. It is contained in a translucent membrane that allows the passage of certain secreted polypeptides such as insulin, glucagon, somatostatin, grelin, pancreatic polypeptides, etc., while retaining within. Alternatively, the device has multiple membranes, such as a vascularized membrane.

ヒト多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞
間接着を増強および促進するための作用物質の使用
膜を介した細胞外シグナルの伝達により細胞調節に影響を及ぼし、今度はそれにより、
細胞内の生化学的な経路をモジュレートすることができる。タンパク質のリン酸化は、細
胞内シグナルが分子から分子へ伝搬され、最終的に細胞の応答がもたらされる１つの経過
を表すものである。これらのシグナルトランスダクションカスケードは、高度に調節され
ており、多くの場合、多くのプロテインキナーゼおよびホスファターゼが存在することに
よって証明されるように、重複している。ヒトにおいて、タンパク質チロシンキナーゼは
、糖尿病、がんを含めた多くの病態の進行において重要な役割を有することが分かってい
ることが報告されており、また、多種多様な先天性の症候群に関連付けられている。セリ
ントレオニンキナーゼ、例えばＲｈｏキナーゼは、阻害された場合に、糖尿病、がん、お
よび種々の炎症性心血管障害およびＡＩＤＳを含めたヒト疾患の治療と関連し得る酵素の
クラスである。現在までに同定されている大多数の阻害剤は、ＡＴＰ結合部位で作用する
。そのようなＡＴＰ競合阻害剤は、ＡＴＰ結合部位のあまり保存されていない領域を標的
とするそれらの能力による選択性が実証されている。 Use of agents to enhance and promote growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion of human pluripotent stem cells such as hES cells and iPS cells Affect cell regulation by transduction of extracellular signals through the membrane, This time it
The intracellular biochemical pathways can be modulated. Protein phosphorylation represents a process in which intracellular signals are propagated from molecule to molecule, ultimately resulting in a cellular response. These signal transduction cascades are highly regulated and often overlap, as evidenced by the presence of many protein kinases and phosphatases. In humans, protein tyrosine kinases have been reported to play an important role in the progression of many pathologies, including diabetes and cancer, and have been associated with a wide variety of congenital syndromes. ing. Serine threonine kinases, such as Rho kinase, are a class of enzymes that, when inhibited, can be associated with the treatment of diabetes, cancer, and human diseases, including various inflammatory cardiovascular disorders and AIDS. The majority of inhibitors identified to date act at the ATP binding site. Such ATP competitive inhibitors have demonstrated selectivity due to their ability to target less conserved regions of the ATP binding site.

低分子ＧＴＰ結合性タンパク質のＲｈｏキナーゼファミリーは、ＲｈｏＡ〜ＥおよびＲ
ｈｏＧ、Ｒａｃ１およびＲａｃ２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０種
のメンバーを含む。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤もしくはＲＯＣＫ阻害剤または
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤と称され、これらは、本明細書では互換的に使用される。ＲｈｏＡ
、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同じアミノ酸配列を有し、同様の
細胞内標的を有すると思われる。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの最初の下流メディエーターと
して作動し、２つのアイソフォーム：α（ＲＯＣＫ２）およびβ（ＲＯＣＫ１）として存
在する。Ｒｈｏキナーゼファミリータンパク質は、それらのＮ末端ドメイン内に触媒（キ
ナーゼ）ドメインを有し、その中央部分にコイルドコイルドメインを有し、それらのＣ末
端領域内に推定プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを有する。ＲＯＣＫのＲｈｏ結合
性ドメインはコイルドコイルドメインのＣ末端部分に局在し、ＧＴＰと結合した形態のＲ
ｈｏとの結合により、キナーゼ活性の増強がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ媒介
性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン−１、ノルエ
ピネフリン、血小板由来成長因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、およびウ
ロテンシンＩＩなどの多くのアゴニストによって開始されるシグナルトランスダクション
において重要な役割を果たす。Ｒｈｏキナーゼは、その標的エフェクター／基質のモジュ
レーションを通じて、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織化、細胞の接着および運動性な
らびに遺伝子発現などの種々の細胞機能において重要な役割を果たす。動脈硬化症の発病
と関連すると認知されているいくつもの細胞機能の媒介においてＲｈｏキナーゼタンパク
質が果たす役割により、これらのキナーゼの阻害剤も種々の動脈硬化性心血管疾患を治療
または予防するために有用であり得、また、内皮収縮に関与する。 The Rho-kinase family of low molecular weight GTP-binding proteins includes RhoA-E and R.
Includes at least 10 members, including hoG, Rac1 and Rac2, Cdc42, and TC10. Inhibitors are often referred to as ROK or ROCK inhibitors or Rho-kinase inhibitors, which are used interchangeably herein. RhoA
, RhoB, and RhoC effector domains appear to have the same amino acid sequence and similar intracellular targets. Rho-kinase acts as the first downstream mediator of Rho and exists as two isoforms: α (ROCK2) and β (ROCK1). Rho-kinase family proteins have a catalytic (kinase) domain within their N-terminal domain, a coiled coil domain in the central portion thereof, and a putative plextrin homology (PH) domain within their C-terminal region. .. The Rho-binding domain of ROCK is localized at the C-terminal part of the coiled coil domain and is a form of R bound to GTP.
Binding to ho results in enhanced kinase activity. The Rho / Rho-kinase-mediated pathway is signal transduction initiated by many agonists such as angiotensin II, serotonin, thrombin, endoserin-1, norepinephrine, platelet-derived growth factor, ATP / ADP and extracellular nucleotides, and urotensin II. Plays an important role in. Rho-kinase plays an important role in various cell functions such as smooth muscle contraction, actin cytoskeleton organization, cell adhesion and motility, and gene expression through its target effector / substrate modulation. Due to the role played by Rho-kinase proteins in mediating a number of cell functions known to be associated with the development of arteriosclerosis, inhibitors of these kinases are also useful in treating or preventing various arteriosclerotic cardiovascular diseases. It can also be involved in endothelial contraction.

一部の実施形態では、これだけに限定されないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３
２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｈ−１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリ
ン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ）、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１（米国特
許第５，４７８，８３８号に記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる
）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導
性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体
、抗体−ｓｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアントおよびその発現ベクターなどの
、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進し、かつ／または支持する作用物質を
種々の細胞培養培地条件に添加する。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤として他の低分子化合物が
公知であるので、そのような化合物またはその誘導体も本発明において使用することがで
きる（例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願第２００５０２０
９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２０
０４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号
および同第２００３００８７９１９、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号
、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７
６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。 In some embodiments, the Rho-kinase inhibitor Y-2763, but is not limited to this.
2. Faszil (also referred to as HA1077), H-1152P and ITS (Insulin / Transtransferase / Selene; Gibco), Wf-536, Y-30141 (US Pat. No. 5,478,838, which is by reference. (Completely incorporated herein) and derivatives thereof, as well as antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), competing peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-scFV fragments, dominant negatives. Agents that promote and / or support cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion, such as variants and expression vectors thereof, are added to various cell culture medium conditions. In addition, as other low molecular weight compounds are known as ROCK inhibitors, such compounds or derivatives thereof can also be used in the present invention (eg, US Patent Application No. 1 fully incorporated herein by reference). 2005020
No. 9261, No. 20050192304, No. 2004014755, No. 20
040002508, 20040002507, 20030125444 and 2003087919, and International Patent Publication Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/0622225, 2002/07
See No. 6996 and No. 2004/039796).

本発明では、１種または２種またはそれ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せも使用すること
ができる。これらの作用物質は、一部において、解離したｈＥＳ細胞、ｉＰＳまたは分化
した細胞培養物、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓前駆体
集団、内分泌前駆体および集団などの再会合を促進することによって機能する。同様に、
作用物質は、細胞解離が行われない場合にも機能し得る。ヒト多能性幹細胞の成長、生存
、増殖および細胞間接着の増大は、細胞が懸濁液中の細胞凝集体から生成したものである
か、または接着プレート培養物（細胞外マトリックスの構成成分を含みまたは含まずに、
血清を含みまたは含まずに、線維芽細胞フィーダーを含みまたは含まずに、ＦＧＦを含み
または含まずに、アクチビンを含みまたは含まずに）から生成したものであるかとは独立
して実現された。これらの細胞集団の生存率の増加により、セルソーターを使用する精製
系が容易になり、改善され、したがって、細胞の回収の改善が可能になる。Ｙ２７６３２
などのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用により、解離した単一細胞の段階的な継代の間、また
は低温保存からのそれらの生存が促進されることにより、分化した細胞型の増幅も可能に
なり得る。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤はヒト多能性幹細胞（例えばｈＥＳ
細胞およびｉＰＳ細胞）およびそれが分化した細胞に対して試験されてきたが、Ｒｈｏキ
ナーゼ阻害剤は、他の細胞型、例えば、一般に、これだけに限定されないが、腸、肺、胸
腺、腎臓ならびに網膜色素上皮と同様の神経系細胞型を含めた上皮細胞に適用することが
できる。 In the present invention, a combination of one or more ROCK inhibitors can also be used. These agents are, in part, dissociated hES cells, iPS or differentiated cell cultures such as embryonic germ layer, proenteral endoderm, pancreatic endoderm, pancreatic epithelium, pancreatic precursor population, endocrine precursors and It works by facilitating the reunion of groups and the like. Similarly
The agent may also function in the absence of cell dissociation. Increased growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion of human pluripotent stem cells are either cell-generated from cell aggregates in suspension or adherent plate cultures (constituents of extracellular matrix). With or without
It was realized independently of whether it was produced from (with or without serum, with or without fibroblast feeder, with or without FGF, with or without activin). Increased viability of these cell populations facilitates and improves purification systems using cell sorters, thus allowing improved cell recovery. Y27632
The use of Rho-kinase inhibitors such as, may also allow amplification of differentiated cell types by promoting their survival during the stepwise passage of dissociated single cells or from cryopreservation. .. Rho-kinase inhibitors such as Y27632 are human pluripotent stem cells (eg hES)
Although cells and iPS cells) and cells in which they have differentiated have been tested, Rho kinase inhibitors have been tested on other cell types such as, in general, but not limited to, the intestine, lung, thoracic gland, kidney and epithelium. It can be applied to epithelial cells including neural cell types similar to pigment epithelium.

細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、その濃度により所望の効果が実現される、
例えば、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進が
実現される限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。種々のＲＯＣＫ
阻害剤を種々の条件下で最適化することが必要な場合があることが当業者には理解されよ
う。例えば、Ｙ−２７６３２を使用する場合、好ましい濃度は、約０．０１〜約１０００
μＭ、より好ましくは約０．１〜約１００μＭ、なおより好ましくは約１．０〜約５０μ
Ｍ、最も好ましくは約５〜２０μＭの範囲であり得る。ファスジル／ＨＡ１０７７を使用
する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の約２倍または３倍で使用することができる。Ｈ−
１１５２を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の量のおよその分数、例えば、約１
／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０または１／６０で使用することができ
る。使用するＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一部において、阻害剤の生物活性および効力なら
びにそれが使用される条件に左右される。 The concentration of the ROCK inhibitor in the cell culture medium is such that the desired effect is achieved.
For example, as long as cell growth, survival, proliferation and enhancement, increase, and / or promotion of cell-cell adhesion are achieved, it is not limited to those described in the examples below. Various ROCK
Those skilled in the art will appreciate that it may be necessary to optimize the inhibitor under a variety of conditions. For example, when using Y-27632, the preferred concentration is from about 0.01 to about 1000.
μM, more preferably about 0.1 to about 100 μM, even more preferably about 1.0 to about 50 μM
It can be in the range of M, most preferably about 5-20 μM. When Faszil / HA1077 is used, it can be used at about 2 or 3 times the above-mentioned Y-27632 concentration. H-
When using 1152, an approximate fraction of the amount of Y-27632 concentration described above, eg, about 1
It can be used at 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 or 1/60. The concentration of ROCK inhibitor used depends in part on the biological activity and efficacy of the inhibitor and the conditions under which it is used.

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理する時間および期間は、成長、生存、増殖（細胞集団）お
よび細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果に応じて限定される
場合もされない場合もある。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、実施例７によりよく記載
されている通り、驚くべき様式で分化にも影響を及ぼし得る。下記の実施例には、約１２
時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上にわたって処理されたヒト多能性幹細胞培養
物および／または分化した細胞培養物が記載されている。 The time and duration of treatment with a ROCK inhibitor may or may not be limited depending on desired effects such as enhancement, increase, and / or promotion of growth, survival, proliferation (cell population) and cell-cell adhesion. There is also. However, the addition of ROCK inhibitors can also affect differentiation in a surprising manner, as better described in Example 7. In the example below, about 12
Human pluripotent stem cell cultures and / or differentiated cell cultures that have been treated for hours, 24 hours, 48 hours, or longer are described.

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理されるヒト多能性幹細胞培養物の密度も同様に、それが、
細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望
の効果が実現される密度である限りは限定されない。播種される細胞の細胞密度は、これ
だけに限定されないが、接着培養物または懸濁培養物の使用、使用する細胞培養培地の特
定のレシピ、成長条件および培養細胞の意図された使用を含めた種々の因子に応じて調整
することができる。細胞培養物の密度の例としては、これだけに限定されないが、１ｍｌ
当たり細胞０．０１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．０５×１０^５個、１ｍｌ当たり細
胞０．１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．０×１
０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．２×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．４×１０^５個、１ｍ
ｌ当たり細胞１．６×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．８×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞
２．０×１０^５、１ｍｌ当たり細胞３．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞４．０×１０^５
個、１ｍｌ当たり細胞５．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞６．０×１０^５個、１ｍｌ当
たり細胞７．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞８．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞９．
０×１０^５個、または１ｍｌ当たり細胞１０．０×１０^５個、またはそれ以上、例えば、
１ｍＬ細胞５×１０^７個まで、またはそれ以上、または間の任意の値が挙げられ、良好な
細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を伴って培養された。 Similarly, the density of human pluripotent stem cell cultures treated with ROCK inhibitors,
It is not limited as long as the density is such that the desired effects such as enhancement, increase, and / or promotion of cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion are achieved. The cell density of seeded cells varies, including, but not limited to, the use of adherent or suspension cultures, specific recipes for the cell culture medium used, growth conditions and intended use of cultured cells. It can be adjusted according to the factors of. Examples of cell culture densities are, but are not limited to, 1 ml.
0.01 × 10 ⁵ cells per ml, 0.05 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 0.1 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 0.5 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 1.0 × 1 cell per 1 ml 1
0 ⁵ cells 1.2 × 10 ⁵ cells per ml, 1.4 × 10 cells per ml ⁵ cells, 1 m
1.6 × 10 ⁵ cells per l, 1.8 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 2.0 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 3.0 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 4.0 × 10 cells per 1 ml 10 ⁵
Pieces, 5.0 × 10 ⁵ cells per 1ml, 6.0 × 10 ⁵ cells per 1ml, 7.0 × 10 ⁵ cells per 1 ml, 1 ml per cell 8.0 × 10 ⁵ cells, 1 ml per cell 9 ..
0 x 10 ⁵ cells, or 10.0 x 10 ⁵ cells per ml, or more, eg
Any value up to 5 × 10 ⁷ 1 mL cells, or more, or between, was given and cultured with good cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion.

ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質の使用
さらに別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は
、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含み、本明細書に記載されている
。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」またはその等価
物とは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＦ−β３、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１
５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−３、ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−６
、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ
−２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンβＣ、
βΕ、βΑおよびβΒ、ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌ
ｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｅｕｒｉｎ）、パー
セフィンおよびアルテミンなどのサブファミリーを含めた３０種を超える構造的に関連す
るタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．２３（６
）：７８７−８２３を参照されたい。 Use of Agents that Activate TGFβ Receptor Family Members In yet another embodiment, agents that activate TGFβ receptor family members include members of the TGFβ superfamily of growth factors and are described herein. ing. As used herein, "TGFβ superfamily members" or their equivalents are TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, BMP-1.
5, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6
, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP
-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF11, GDF8, activin βC,
βΕ, βΑ and βΒ, BMP-14, GDF-14, MIS, activin alpha, L
It refers to more than 30 structurally related proteins, including subfamilies such as efty1, Lefty2, GDNF, Neuroturin, parsefin and artemin. Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23 (6)
): See 787-823.

ＴＧＦβファミリーメンバーは、ＴＧＦβファミリーメンバーに応答して細胞の性質の
変化を伝達する、または他のやり方で引き起こすことに関与するポリペプチドまたは相互
作用の１種または複数種を刺激する化合物であるＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子に
よって置き換えること、またはそれと併せて使用することができる。ＴＧＦβシグナル伝
達経路はＴＧＦβファミリーメンバー自体を含む。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー
は、ＩＩ型およびＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体およびＳｍａｄとして公知の細
胞内エフェクターを通じたシグナル伝達によってシグナルを核に伝達する。これらの受容
体は、協同的に作用してリガンドに結合し、シグナルを伝達するＩ型受容体およびＩＩ型
受容体として公知の２つのサブファミリーに入る（Ａｔｔｉｓａｎｏら、Ｍｏｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ １６（３）、１０６６−１０７３（１９９６））。リガンドはＩ型受容体
およびＩＩ受容体の細胞表面に結合し、リン酸化によるＩ型受容体の活性化を促進する。
この活性化された複合体が今度は細胞内Ｓｍａｄを活性化し、それが転写を調節する多サ
ブユニット複合体に集合する。ＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーは、２つのシ
グナル伝達サブグループ：ＴＧＦβ／アクチビンと機能的に関連するもの、およびＢＭＰ
／ＧＤＦサブファミリーと関連するものに分けられる。大部分のＴＧＦβリガンドは、最
初にＩＩ型受容体に結合し、次いで、このリガンド／ＩＩ型受容体複合体がＩ型受容体を
動員またはリン酸化すると考えられている（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｌ Ｓ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒ
ｅｖ １５：３１０−３２５（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ：
Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、１６９−１７８（２０００））。ＩＩ型受容体キナー
ゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化および活性化することにより、次いで、Ｓｍａｄタ
ンパク質をリン酸化および活性化する。ＴＧＦβ／アクチビンリガンドはＴＧＦβおよび
アクチビンＩＩ型受容体に結合し、このアクチビン型経路を通じてＳｍａｄ−２、Ｓｍａ
ｄ−３、ＮｏｄａｌおよびＬｅｆｔｙシグナルを活性化することができる。ＢＭＰ／ＧＤ
ＦリガンドはＢＭＰ ＩＩ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ
８を活性化することができる。Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒら、Ｃｅｌｌ ９５、７３７−７４０
（１９９８）を参照されたい。リガンド刺激の際、Ｓｍａｄは核内に移動し、転写複合体
の構成成分として機能する。 A TGFβ family member is a TGFβ signal, a compound that stimulates one or more of the polypeptides or interactions involved in transmitting or otherwise inducing changes in cell properties in response to TGFβ family members. It can be replaced by or used in conjunction with a transduction pathway activator. The TGFβ signaling pathway includes the TGFβ family members themselves. TGFβ superfamily members transmit signals to the nucleus by signaling through type II and type I serine-threonine kinase receptors and intracellular effectors known as Smads. These receptors fall into two subfamilies known as type I and type II receptors that act cooperatively to bind and signal ligands (Atticano et al., Mol Cel).
l Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). The ligand binds to the cell surface of type I and II receptors and promotes the activation of type I receptors by phosphorylation.
This activated complex in turn activates the intracellular Smad, which assembles into a multi-subunit complex that regulates transcription. Members of the TGF beta superfamily include two signaling subgroups: those functionally associated with TGFβ / activin, and BMP.
/ Divided into those related to the GDF subfamily. Most TGFβ ligands are thought to first bind to the type II receptor, and then this ligand / type II receptor complex recruits or phosphorylates the type I receptor (Mathews, LS, Endocr). R
ev 15: 310-325 (1994); Massage, Nature Rev:
Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). Type II receptor kinases then phosphorylate and activate the Smad protein by phosphorylating and activating type I receptor kinases. The TGFβ / activin ligand binds to TGFβ and activin type II receptors, and through this activin type pathway, Smad-2, Sma
d-3, Nodal and Lefty signals can be activated. BMP / GD
The F-ligand binds to the BMP type II receptor and is Smad1, Smad5, and Smad.
8 can be activated. Derynck, R et al., Cell 95, 737-740
(1998). Upon ligand stimulation, Smad migrates into the nucleus and functions as a component of the transcription complex.

ＴＧＦβシグナル伝達は、種々の機構を通じて正におよび負に調節される。陽性調節で
は、シグナルが生物学的活性のために十分なレベルまで増幅される。ＴＧＦβスーパーフ
ァミリーリガンドがＩＩ型受容体に結合し、これによりＩ型受容体が動員およびリン酸化
される。次いで、Ｉ型受容体により、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ、
例えばＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）がリン酸
化され、そこで共通のメディエーターＳｍａｄまたはｃｏ−ＳＭＡＤに結合することがで
きる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核内に蓄積され、そこで転写因子としての機
能を果たし、標的遺伝子発現の調節に関与する。例えば、成長分化因子としては１、２、
３、５、６、７、８、９、１０、１１、および１５が挙げられる。また、好ましい一実施
形態では、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１はＴＧＦβファミリーメンバーであり、同様にＴＧ
Ｆβシグナル伝達経路活性化因子（陽性調節）でもあり、ＡｃｔＲＩＩ受容体の細胞外リ
ガンド結合性ドメイン部分に結合し、次いでＡｃｔＲＩと複合体を形成し、それによりＳ
ｍａｄ７負の制御因子の阻害およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体のリン酸化を導くこと
によって作用する。Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体はＳｍａｄ４と会合して特定の遺伝子
の発現を調節する。 TGFβ signaling is regulated positively and negatively through various mechanisms. In positive regulation, the signal is amplified to a level sufficient for biological activity. The TGFβ superfamily ligand binds to the type II receptor, which mobilizes and phosphorylates the type I receptor. Then, by the type I receptor, SMAD (R-SMAD,) regulated by the receptor
For example, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, and SMAD8) are phosphorylated, where they can bind to the common mediator Smad or co-SMAD. The R-SMAD / coSMAD complex accumulates in the nucleus, where it functions as a transcription factor and is involved in the regulation of target gene expression. For example, growth differentiation factors include 1, 2,
3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 15. Also, in one preferred embodiment, GDF8 and GDF11 are members of the TGFβ family, as well as TG.
It is also an Fβ signaling pathway activator (positive regulator) that binds to the extracellular ligand-binding domain portion of the ActRII receptor and then forms a complex with ActRI, thereby forming an S
It acts by inhibiting the mad7 negative regulator and inducing phosphorylation of the Smad2 / Smad3 complex. The Smad2 / Smad3 complex associates with Smad4 to regulate the expression of specific genes.

ＴＧＦβシグナル伝達の負の調節は、細胞外、膜、細胞質および核レベルで起こる。Ｔ
ＧＦβによって開始されるシグナル伝達を抑圧するために、シグナル伝達を妨害すること
ができる。これは、ＴＧＦβ受容体およびＳＭＡＤタンパク質相互作用をブロックするか
それと競合するタンパク質などの、ＴＧＦβ受容体（複数可）とＳＭＡＤタンパク質の間
の相互作用と拮抗またはそれを阻止する、当技術分野で公知である任意の手段によって達
成することができる。あるいは、シグナル伝達経路に沿うシグナル伝達を阻止するために
、当技術分野で公知である任意の手段によって、ＴＧＦβ受容体またはＳＭＡＤタンパク
質の転写または翻訳を変化させることができる。様々なＴＧＦβメンバータンパク質の正
および負の調節は、下の因子のいくつかのより詳細な記載によってさらに例示される。 Negative regulation of TGFβ signaling occurs at the extracellular, membrane, cytoplasmic and nuclear levels. T
Signal transduction can be interrupted to suppress signal transduction initiated by GFβ. It is known in the art to antagonize or block the interaction between the TGFβ receptor (s) and the SMAD protein, such as proteins that block or compete with the TGFβ receptor and SMAD protein interactions. Can be achieved by any means that is. Alternatively, transcription or translation of the TGFβ receptor or SMAD protein can be altered by any means known in the art to block signal transduction along the signaling pathway. The positive and negative regulation of various TGFβ member proteins is further illustrated by some more detailed descriptions of the factors below.

任意の作用物質の使用と同様に、細胞培養培地中の任意のＴＧＦβスーパーファミリー
メンバーの濃度は、その濃度により、例えばＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーが活性化
されることなどの所望の効果を実現することができる限りは、下記の実施例に記載されて
いるものに限定されない。例えば、アクチビン、例えば、アクチビンＡおよび／またはア
クチビンＢ、またはＧＤＦ８およびＧＤＦ−１１を使用する場合、好ましい濃度は、約１
０〜約３００ｎＭ、より好ましくは約５０〜約２００ｎＭ、なおより好ましくは約７５〜
約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１００〜１２５ｎＭの範囲であり得る。当業者は、任意
の濃度を容易に試験することができ、当技術分野における標準の技法を使用して、そのよ
うな濃度の有効性を決定すること、例えば、任意の細胞型について遺伝子マーカー（ｇｅ
ｎｅ ｍａｋｅｒ）パネルの発現および非発現を決定することによって分化を評価するこ
とができる。 Similar to the use of any agonist, the concentration of any TGFβ superfamily member in the cell culture medium is such that the concentration achieves the desired effect, for example, activation of the TGFβ receptor family member. To the extent possible, it is not limited to those described in the examples below. For example, when using activin, such as activin A and / or activin B, or GDF8 and GDF-11, the preferred concentration is about 1.
0 to about 300 nM, more preferably about 50 to about 200 nM, even more preferably about 75 to
It can be in the range of about 150 nM, most preferably about 100-125 nM. One of ordinary skill in the art can easily test any concentration and use standard techniques in the art to determine the effectiveness of such concentration, eg, a genetic marker for any cell type ( ge
Differentiation can be assessed by determining the expression and non-expression of the ne marker) panel.

ヒト多能性幹細胞を分化させるために使用されるこれらおよび他の成長因子は、２００
８年６月３日に出願の米国特許出願第１２／１３２，４３７号、表題ＧＲＯＷＴＨ ＦＡ
ＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤ
ＥＲＭでさらに詳細に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 These and other growth factors used to differentiate human pluripotent stem cells are 200
U.S. Patent Application No. 12 / 132,437 filed June 3, 2008, entitled GROWTH FA
CTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDOD
Described in more detail in ERM, it is incorporated herein by reference in its entirety.

本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される、単に例示するためのもので
あり、限定するものではないある特定の実施例を参照することにより、さらなる理解を得
ることができる。 Although the present invention has been described in general, further understanding can be gained by reference to certain specific embodiments provided herein, which are merely exemplary and not limiting.

上述のものが本発明の好ましい実施形態に関連すること、および本発明の範囲を逸脱し
ないでそこに多数の変更を加えることができることも理解するべきである。本発明は以下
の実施例でさらに例示されるが、それらはその範囲に制限を加えるものと決して解釈され
てはならない。逆に、様々な他の実施形態、改変形およびその同等物を用いることができ
ることを明らかに理解するべきであり、それらは、本明細書の説明を読んだ後ならば、本
発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しないで、当業者が思いつくこと
ができる。 It should also be understood that the above are relevant to preferred embodiments of the invention and that numerous modifications can be made therein without departing from the scope of the invention. The present invention is further illustrated in the examples below, but they should never be construed as limiting their scope. On the contrary, it should be clearly understood that various other embodiments, variants and their equivalents can be used, which, after reading the description herein, are the spirit of the invention and / Or those skilled in the art can come up with it without departing from the scope of the attached claims.

（実施例１）
胚体内胚葉および内胚葉中間体を経た膵臓の前駆体および内分泌細胞へのヒトｉＰＳ細
胞の分化
膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞などの膵臓細胞型の集団を生
成するために、約２週（または１４日）にわたる四（４）ステージ手順を使用して、懸濁
凝集体でヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を分化させた。本明細書で用いたヒトｉＰＳ細
胞系は、Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ、京都大学、日本およびＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＣＤＩ）によって提供された。 (Example 1)
Differentiation of human iPS cells into pancreatic precursors and endocrine cells via germ layer and endoderm intermediates To generate a population of pancreatic cell types such as pancreatic precursors, endocrine precursors and hormone-expressing endocrine cells. Human induced pluripotent stem (iPS) cells were differentiated with suspended aggregates using a two-week (or 14-day) four (4) stage procedure. The human iPS cell line used herein is S.I. Yamanaka, Kyoto University, Japan and Cellular Dynami
cs International, Inc. Provided by (CDI).

本明細書に記載されるｉＰＳ細胞は、Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａによって最初に
、その後ＣＤＩによって提供された。未分化ｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清代替
物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２において、有糸***不活性化マウス胚線維芽細胞上で、ま
たは好ましくはフィーダーフリー（線維芽細胞フィーダー細胞層なし）で増殖させた。ア
キュターゼを使用して未分化ｉＰＳ細胞を単細胞に解離させることによって分化を開始し
、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。細胞は、１：５０００希釈のインスリ
ン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ
３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ−２７６３２を
１０μΜで含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳに、１ミリリットルにつき細胞
数１，０００，０００〜２，０００，０００で再懸濁させ、回転プラットホームの上に置
いた超低付着６ウェルプレートに入れ、約１００ｒｐｍで回転させた。培養物は、分化プ
ロセスの残りの間、培地を毎日交換し、１００ｒｐｍで回転させた。ｉＰＳＣの成長、継
代および増殖は、実質的に米国特許第７，９６１，４０２号および第８，２１１、６９９
号に記載されている通りであり、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The iPS cells described herein were first donated by Shinya Yamanaka and then by CDI. Undifferentiated iPS cells proliferate in DMEM / F12 containing a 20% knockout serum substitute on mitotic inactivated mouse embryonic fibroblasts, or preferably feeder-free (without fibroblast feeder cell layer). I let you. Differentiation was initiated by dissociating undifferentiated iPS cells into single cells using Accutase, and cell samples were taken for RNA isolation and analysis. The cells were 1: 5000 diluted insulin-transferrin-selenium (ITS), activin A (100 ng / mL), wnt.
RPMI + 0.2 volume / volume% FBS containing 3a (50 ng / mL) and rho-kinase or ROCK inhibitor Y-27632 at 10 μΜ, reconstituted at 1,000,000 to 2,000,000 cells per milliliter It was suspended and placed in an ultra-low adhesion 6-well plate placed on a rotating platform and rotated at about 100 rpm. Cultures were changed daily and rotated at 100 rpm for the rest of the differentiation process. The growth, passage and proliferation of iPSCs is substantially in US Pat. Nos. 7,961,402 and 8,211,699.
As stated in the issue, its disclosure is incorporated herein by reference in its entirety.

多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および多能性細胞から導出された細胞の
凝集懸濁培養物を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２
３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００
７／０６２７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏ
ｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅ
ｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されている通りであり、それら
は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The methods described herein for producing aggregated suspension cultures of pluripotent cells, such as hES or iPS cells, and cells derived from pluripotent cells, are substantially February 2, 2007.
The title filed on the 3rd is Compositions and methods for
PCT / US200, which is a patenting differential cells
Titles filed on 7/062755 and October 20, 2008 are Methods
and compositions for feeder-free purlipo
tent stem cell media contouring human se
As described in PCT / US2008 / 080516, which is rum, they are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される方法は、例えば、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属す
る、Ｂｏｄｎａｒらへの米国特許第６，８００，４８０号に記載のように、培養容器を細
胞外マトリクスで先ずコーティングすることによって促進することができる。他の多能性
幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞を培養するための他の方法と同様に、この方法は
、実質的に２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍ
ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔ
ｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍである、
参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５
１６に記載されるように、可溶性ヒト血清を使用して培養することができる。 The methods described herein are facilitated by first coating the culture vessel with extracellular matrix, for example, as described in US Pat. No. 6,800,480 to Bodnar et al., Which belongs to Geron Corporation. can do. Like other methods for culturing other pluripotent stem cells, such as hES and iPS cells, this method was substantially filed on October 20, 2008 with the title Methods and com.
positions for feeder-free pluripotent st
em cell media contouring human serum,
US Patent Application PCT / US2008 / 0805, which is fully incorporated herein by reference.
As described in 16, soluble human serum can be used for culturing.

本明細書に記載される方法は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に帰属する、参照により本明細書に完全に組み込ま
れるＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．への米国特許第７，００５，２５２号に記載されるように、線
維芽細胞フィーダー層だけ以外の供給源から供給される、外部から加えられた線維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）によって促進することができる。 The methods described herein are Wisconsin Alumni Research.
Thomason, J. et al., Which belongs to Foundation (WARF) and is fully incorporated herein by reference. Promoted by externally added fibroblast growth factor (FGF) sourced from sources other than the fibroblast feeder layer alone, as described in US Pat. No. 7,005,252 to. Can be done.

回転の最初の約２４時間の間に、互いに付着した単細胞は細胞凝集体を形成し、ＲＮＡ
の単離と分析のために十分な細胞試料をとった。細胞凝集体は、直径が約６０ミクロンか
ら１２０ミクロンであった。ｉＰＳ細胞試料を回転プラットホームに置いてから約１日（
または２４時間）後に、培養に、１：５０００希釈のＩＴＳ、アクチビンＡ（１００〜２
００ｎｇ／ｍＬ）、およびＷｎｔ３ａ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋
０．２体積／体積％ＦＢＳを約１日間（０日目から１日目まで）、およびさらに１日間、
またはＷｎｔ３ａのないこと以外は同じ培地を（１日目から２日目）与えた。ＲＮＡの単
離および分析のために毎日の細胞試料をとった。２日間の分化の後、培養物に、１：１０
００希釈のＩＴＳ、ＫＧＦ（またはＦＧＦ７、２５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦβ阻害剤ｎ
ｏ．４（２．５μＭ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳを１日間（または
２４時間、２日目から３日目まで）与えた。次の２日間（３日目から５日目）、ＴＧＦβ
阻害剤を培地から除いたこと以外は同じ成長因子カクテル培地をｉＰＳ細胞凝集懸濁液に
与えた。再び、このステージ（ステージ２または５日目）の終わりに、ＲＮＡ単離のため
に細胞試料をとった。ステージ３（５日目から８日目）については、ＴＴＮＰＢ［４−［
Ｅ−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタ
レニル）−１−プロペニル］安息香酸］（３ｎＭ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５
μΜ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプ
リメントに細胞培養培地を代えた。再び、このステージ（ステージ３または８日目）の終
わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。ステージ４（８日目から１４日
目）については、ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（
５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプリメントに培地を代え
た。再び、ステージ４（または１４日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞
試料をとった。 During the first approximately 24 hours of rotation, single cells attached to each other form cell aggregates and RNA.
Sufficient cell samples were taken for isolation and analysis of. Cell aggregates were approximately 60 to 120 microns in diameter. Approximately 1 day after placing the iPS cell sample on the rotating platform (
Or 24 hours later), in culture, 1: 5000 diluted ITS, activin A (100-2)
RPMI + containing 00 ng / mL) and Wnt3a (50-100 ng / mL)
0.2 volume / volume% FBS for about 1 day (day 0 to day 1), and another day,
Alternatively, the same medium was given (1st to 2nd day) except that Wnt3a was absent. Daily cell samples were taken for RNA isolation and analysis. After 2 days of differentiation, in culture, 1:10
00 diluted ITS, KGF (or FGF7, 25 ng / mL) and TGFβ inhibitor n
o. RPMI + 0.2 volume / volume% FBS containing 4 (2.5 μM) was given for 1 day (or 24 hours, days 2 to 3). TGFβ for the next 2 days (3rd to 5th days)
The same growth factor cocktail medium was given to the iPS cell agglutination suspension except that the inhibitor was removed from the medium. Again, at the end of this stage (stage 2 or 5), cell samples were taken for RNA isolation. For stage 3 (5th to 8th days), TTNPB [4- [
E-2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] benzoic acid] (3nM), KAAD-cyclopamine (0.25)
The cell culture medium was replaced with a DMEM + 1 volume / volume% B27 supplement containing μΜ) and noggin (50 ng / mL). Again, at the end of this stage (stage 3 or 8), cell samples were taken for RNA isolation and analysis. For stage 4 (8th-14th days), noggin (50 ng / mL), KGF (50 ng / mL) and EGF (
The medium was replaced with a DMEM + 1 volume / volume% B27 supplement containing 50 ng / mL). Again, at the end of stage 4 (or day 14), cell samples were taken for RNA isolation and analysis.

分化中の様々なマーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために、リアルタイムＰＣＲを
実施した。特異的マーカーまたは遺伝子の遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、サイ
クロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに先ず標
準化した。次に標準化した相対的な遺伝子発現は、未分化ｉＰＳ細胞での発現レベルに対
して棒グラフに表示され、したがって様々な分化マーカーの上方制御倍率を表す。ＯＣＴ
４については、遺伝子発現は、データセットの最低の試料（１４日目）を設定するために
標準化され、したがって分化中の下方制御倍率を表す。 Real-time PCR was performed to measure the gene expression of various marker genes during differentiation. Gene expression of specific markers or genes was first standardized to average expression levels of housekeeping genes, cyclophilin G and TATA binding protein (TBP) expression. The standardized relative gene expression is then displayed in a bar graph relative to the level of expression in undifferentiated iPS cells, thus representing the upregulation magnification of various differentiation markers. OCT
For 4, gene expression is standardized to set the lowest sample of the dataset (day 14) and thus represents the downregulation factor during differentiation.

図２Ａ〜Ｌは、未分化ｉＰＳ細胞中の同じ遺伝子の発現レベルと比較した、同定された
遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒ１、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＦＯ
ＸＡ１、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＩＮＳ）の相
対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子
（対照）のセットに標準化し、２つの異なる時点での遺伝子発現レベルを比較することに
より、その遺伝子または発現マーカーに上方制御か下方制御があることが示された。ＯＣ
Ｔ４（図２Ａ）については、遺伝子発現を標準化し、最低レベルの発現の試料を１に設定
した（１４日目）。したがって、図２Ａによって示されるように、ＯＣＴ４の相対的な発
現レベルは、分化中（Ｘ軸、ステージ０から４、または０日目から１４日目）の下方制御
倍率（ｙ軸）を表す。 2A-L show the identified genes (eg, Oct4, Brachyury, Cer1, GSC, FOXA2, FO) compared to the expression levels of the same gene in undifferentiated iPS cells.
It is a bar graph which shows the relative gene expression of XA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 and INS). By standardizing gene expression levels into a set of housekeeping genes (controls) and comparing gene expression levels at two different time points, it was shown that the gene or expression marker had upregulation or downregulation. .. OC
For T4 (FIG. 2A), gene expression was standardized and the sample with the lowest level of expression was set to 1 (day 14). Therefore, as shown by FIG. 2A, the relative expression level of OCT4 represents the downregulation magnification (y-axis) during differentiation (X-axis, stages 0-4, or days 0-14).

図２Ａに示すように、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）は未分化ｉＰＳ細胞において高レベル
で発現され、その後分化中（０日目から１４日目）は下方制御を示す。１４日目までには
、ＯＣＴ４発現レベルは未分化細胞で観察される発現レベルから３０００倍を超えて減少
した。対照的に、最初の２日間（１日目および２日目）中にｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（
ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、図２Ｂ）発現の一過性の上方制御があった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの
一過性の上方制御は、アクチビンＡおよびｗｎｔ３ａの適用による多能性／ｉＰＳ細胞の
内胚葉系中胚葉へ誘導された分化の結果であった。３日目のステージ１の終わりまでのＣ
ＥＲ１、ＧＳＣおよびＦＯＸＡ２の上方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｅ）、内
胚葉系中胚葉はアクチビンＡへの連続曝露によって２日目および３日目の間に胚体内胚葉
にさらに分化した。分化の６日目までのＦＯＸＡ１の上方制御、ＦＯＸＡ２発現の維持な
らびにＣＥＲ１およびＧＳＣの下方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｆ）、ステー
ジ２の間に、胚体内胚葉は腸管内胚葉に分化するようにさらに誘導された。８日目までの
ＨＮＦ６およびＰＤＸ１の上方制御によって示されるように（図２Ｇ〜Ｈ）、ステージ３
の間、レチノイド、シクロパミンおよびノギンへの曝露の結果、腸管内胚葉は後部前腸／
ＰＤＸ１発現内胚葉に分化するようにさらに誘導された。１４日目までのＰＴＦ１Ａ、Ｎ
ＫＸ６−１、ＮＧＮ３およびＩＮＳの上方制御によって示されるように（図２Ｉ〜Ｌ）、
ステージ４の間、ＫＧＦおよびＥＧＦへの曝露の結果、後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉は
、膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞に分化するようにさらに誘導
された。 As shown in FIG. 2A, OCT4 (POU5F1) is expressed at high levels in undifferentiated iPS cells and then exhibits downregulation during differentiation (day 0-14). By day 14, OCT4 expression levels were reduced by more than 3000-fold from the expression levels observed in undifferentiated cells. In contrast, during the first two days (day 1 and day 2) the brachyury gene (
BRACHYURY, FIG. 2B) There was a transient upregulation of expression. Transient upregulation of brachyury was the result of pluripotent / iPS cell endoderm-induced differentiation by application of activin A and wnt3a. C until the end of Stage 1 on the 3rd day
As indicated by the upregulation of ER1, GSC and FOXA2 (FIGS. 2C-E), endoderm mesoderm further differentiated into endoderm embryos during days 2 and 3 by continuous exposure to activin A .. During stage 2, intragerm germ layers differentiate into intestinal germ layers, as indicated by upregulation of FOXA1 up to day 6 of differentiation, maintenance of FOXA2 expression and downregulation of CER1 and GSC (FIGS. 2C–F). Further induced to do. Stage 3 as indicated by upward control of HNF6 and PDX1 up to day 8 (FIGS. 2GH-H).
During exposure to retinoids, cyclopamine and noggin, the intestinal ectoderm results in posterior foregut /
It was further induced to differentiate into PDX1-expressing endoderm. PTF1A, N until the 14th day
As indicated by the upward control of KX6-1, NGN3 and INS (FIGS. 2I-L),
As a result of exposure to KGF and EGF during Stage 4, the posterior foregut / PDX1-expressing endoderm was further induced to differentiate into pancreatic precursors, endocrine precursors and hormone-expressing endocrine cells.

（実施例２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進する
様々なｈＥＳおよびｉＰＳ細胞系を分化させる方法は、実質的にここで、および実施例
１に記載される通りである。分化の間の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および
促進するために、ステージ１、２、３、４および５について記載される培養条件に加えて
、アポトーシス阻害剤および／またはＲｈｏキナーゼもしくはＲＯＣＫ阻害剤を培地に加
えた。一般的に約１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２を、各ステー
ジで細胞培養に加えた。あるいは、少なくともステージ１および２、ならびにステージ４
および５、またはその任意の組合せでＲｈｏキナーゼ阻害剤を加えた。分化したｉＰＳ懸
濁液（凝集体）細胞培養の形態および遺伝子マーカー発現プロファイルは、ｈＥＳ細胞か
ら導出された懸濁細胞培養のそれに実質的に類似する。 (Example 2)
Rho-kinase inhibitors promote iPS cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion. Methods for differentiating various hES and iPS cell lines are substantially as described here and in Example 1. is there. In addition to the culture conditions described for stages 1, 2, 3, 4 and 5, to enhance and promote growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion during differentiation, apoptosis inhibitors and / or Rho kinase or A ROCK inhibitor was added to the medium. Generally about 10 μΜ of Rho-kinase inhibitor, such as Y-27632, was added to the cell culture at each stage. Alternatively, at least stages 1 and 2, and stage 4
And 5, or any combination thereof, Rho-kinase inhibitors were added. The morphology and gene marker expression profile of the differentiated iPS suspension (aggregate) cell culture is substantially similar to that of the suspended cell culture derived from hES cells.

図３および４は、それぞれステージ４と５からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣ
Ｃ）を示す。図３は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞など、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉
（膵臓上皮または膵臓前駆体とも呼ばれる）の特徴を示す典型的な遺伝子マーカーを発現
する、ステージ４からの細胞凝集体を示す。図３に示されていないが、ステージ４細胞は
、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）および膵臓
ポリペプチド（ＰＰ）などのステージ５細胞の特色をより示すホルモン分泌タンパク質ま
たは遺伝子マーカーを発現しない。図４は、ステージ５からのホルモン発現細胞の細胞凝
集体を示す。これらのＩＣＣ結果は、ＱＰＣＲを使用してさらに確認された。しかし、Ｑ
ＰＣＲは試料または細胞培養で発現されるＲＮＡの全レベルの全集団研究であるので、そ
れは任意の１つの細胞が複数のマーカーを発現することを確定的に示すことができない。 Figures 3 and 4 show immunocytochemistry (IC) of iPS cell cultures from stages 4 and 5, respectively.
C) is shown. FIG. 3 shows cell aggregates from stage 4 expressing typical genetic markers that characterize PDX1-positive pancreatic endoderm (also called pancreatic epithelium or pancreatic precursor), such as PDX1 / NKX6.1 co-positive cells. Shown. Although not shown in FIG. 3, stage 4 cells are hormone-secreting proteins or genes that more characteristic of stage 5 cells such as insulin (INS), glucagon (GCG), somatostatin (SST) and pancreatic polypeptide (PP). Does not express the marker. FIG. 4 shows cell aggregates of hormone-expressing cells from stage 5. These ICC results were further confirmed using QPCR. However, Q
Since PCR is a whole population study of all levels of RNA expressed in a sample or cell culture, it cannot definitively show that any one cell expresses multiple markers.

（実施例３）
ｉＰＳ導出膵臓前駆体の封入
現在まで、ｉＰＳ細胞の生成方法およびｉＰＳ細胞の生成のための供給源が報告されて
いる。しかし、特定の疾患、例えば糖尿病を治療するための細胞療法での潜在的使用のた
めの、任意の機能性分化細胞への任意のｉＰＳ細胞の分化に関する十分な記載はない。 (Example 3)
Encapsulation of iPS-derived pancreatic precursors To date, methods of iPS cell production and sources for iPS cell production have been reported. However, there is not sufficient description of the differentiation of any iPS cell into any functional differentiated cell for potential use in cell therapy to treat a particular disease, eg diabetes.

ヒトｉＰＳ細胞から導出されたステージ４のＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆
細胞培養が、グルコース感受性インスリン分泌細胞にｉｎ ｖｉｖｏで発達および成熟す
ることが完全に可能かどうか判定するために、実質的に実施例１および２に記載のような
膵臓前駆体集団を、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００９年１１月１３日に
出願された米国特許出願１２／６１８，６５９、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ Ｈ
ＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ；ならびに米国特許第７，５
３４，６０８号および第７，６９５，９６５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵ
ＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳに記載のものに実質的に類似のマク
ロ封入デバイスに加えた。簡潔には、実質的に約３×１０^６細胞数を有する、５−１０−
２０μＬの重力沈降細胞懸濁凝集体を各デバイスに加えた。 Substantially to determine if stage 4 PDX1-positive pancreatic endoplasmic or pancreatic progenitor cell cultures derived from human iPS cells are fully capable of in vivo development and maturation of glucose-sensitive insulin-secreting cells. US Patent Application 12 / 618,659, entitled ENCAPSULATION OF, filed November 13, 2009, in which the pancreatic progenitor population as described in Examples 1 and 2 is fully incorporated herein by reference.
PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM H
UMAN PLURIPOTENT STEM CELLS; and US Pat. No. 7,5
Nos. 34,608 and 7,695,965, title METHODS OF PRODUCTU
It was added to a macroencapsulation device that was substantially similar to that described in CING PANCREATIC HORMONES. Briefly, 5-10-, which has a substantially 3 × 10 ⁶ cell count.
20 μL of gravity-precipitated cell suspension aggregates were added to each device.

次に、哺乳動物、例えば免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへの移植のためにデバイス内の
封入細胞を調製したが、ラット、ブタ、サルまたはヒト患者などのより大きな動物に移植
することができる。封入細胞を移植する方法およびデバイスは、実質的に、ＧＥＬＦＯＡ
Ｍマトリックスに移植されて精巣上体の脂肪パッド（ＥＦＰ）の下に移植される膵臓前駆
細胞等、米国特許出願第１２／６１８，６５９号、米国特許第７，５３４，６０８号およ
び第７，６９５，９６５号に記載される通りである。 Encapsulation cells within the device were then prepared for transplantation into mammals, such as immunodeficient SCID / Bg mice, but can be transplanted into larger animals such as rats, pigs, monkeys or human patients. The methods and devices for transplanting encapsulated cells are substantially GELFOA
Pancreatic progenitor cells, etc. transplanted into the M-matrix and transplanted under the epididymal fat pad (EFP), US Pat. Nos. 12,618,659, US Pat. Nos. 7,534,608 and 7, As described in No. 695,965.

これらの研究で免疫抑制は必要でなかったが、デバイス内の前駆体が完全に成熟してグ
ルコース応答性になるまで、最初の中間期間の間特定の哺乳動物のために免疫抑制が必要
とされることがある。一部の哺乳動物では、免疫抑制レジメンは約１、２、３、４、５、
６週間以上であってもよく、哺乳動物次第である。 Immunosuppression was not required in these studies, but immunosuppression was required for certain mammals during the first interim period until the precursors in the device were fully matured and glucose responsive. There are times. In some mammals, immunosuppressive regimens are about 1, 2, 3, 4, 5,
It may be 6 weeks or longer, depending on the mammal.

移植された細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで分化させ、さらに成熟させた。移植された細胞が
例えば天然に存在するベータ細胞のように正常な生理機能を有するかどうか判定するため
に、ヒトＣペプチドのレベルの検査によってヒトインスリンのレベルを判定する。ヒトＣ
ペプチドはヒトプロインスリンから切断または処理され、したがって、内因性マウスＣペ
プチドでなくヒトＣペプチドの特異的検出は、インスリン分泌が移植された（外因性）細
胞から導出されたことを示す。移植片を有する動物は、それらへのアルギニンまたはグル
コース、好ましくはグルコースのボーラス注射によって、２、３または４週ごとにヒトＣ
ペプチドのレベルを検査する。その後成熟したベータ細胞（分化した多能性ｉＰＳ細胞か
ら導出された）は、天然に存在するか内因性のベータ細胞と同様に生理的に機能的で、グ
ルコース応答性であるはずである。一般的に、５０ｐＭまたは平均基礎（閾値）レベルを
上回るヒトＣペプチドの量が、移植された前駆体からの今ではベータ細胞の機能の指標で
ある。 The transplanted cells were differentiated in vivo and further matured. Human insulin levels are determined by testing for human C-peptide levels to determine if the transplanted cells have normal physiology, such as naturally occurring beta cells. Human C
The peptide was cleaved or processed from human proinsulin, and thus specific detection of human C-peptide rather than endogenous mouse C-peptide indicates that insulin secretion was derived from the transplanted (extrinsic) cells. Animals with grafts are human C every 2, 3 or 4 weeks by bolus injection of arginine or glucose, preferably glucose into them.
Test for peptide levels. Subsequent mature beta cells (derived from differentiated pluripotent iPS cells) should be as physiologically functional and glucose responsive as naturally occurring or endogenous beta cells. In general, the amount of human C-peptide above 50 pM or mean basal (threshold) level is now an indicator of beta cell function from the transplanted precursor.

参照により本明細書に完全に組み込まれるＫｒｏｏｎら（２００８）、前掲、米国特許
出願１２／６１８，６５９、米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号
および第７，９９３，９２０号に記載のものと同様に、ｈＩＰＳ細胞から導出された封入
膵臓前駆体は、天然に存在する島のそれと同様の内分泌、腺房および管細胞を有する、機
能性の膵島クラスターに成熟することが期待される。また、移植前のｈＩＰＳ細胞から導
出された精製または濃縮された膵臓前駆体も、機能性の膵島に成熟および発達し、ｉｎ
ｖｉｖｏでインスリンを生成することが予想される。様々な分化した細胞集団を精製、濃
縮するための特定の実施形態は、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１
０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ
ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲ
ＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ、現在の米国特許第８，３３８，１７０号にさらに詳細に記載
され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。凍結保存されたｈＩＰＳ細
胞から導出された膵臓前駆体は、移植の前に解凍し、培養に適合させることができ、その
結果、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟してインスリンを生成することができることがさらに予想さ
れる。ｈＩＰＳ細胞から導出された移植された膵臓前駆体を有する糖尿病誘導動物では、
低血糖を改善することができる。 Kron et al. (2008), supra, U.S. Patent Application 12 / 618,659, U.S. Pat. Nos. 7,534,608; 7,695,965 and 7,993, which are incorporated herein by reference. Similar to that described in 920, encapsulated pancreatic precursors derived from hIPS cells mature into functional islet clusters with endocrine, acinar and ductal cells similar to those of naturally occurring islets. There is expected. Purified or enriched pancreatic precursors derived from pre-transplanted hIPS cells also mature and develop into functional islets, in
It is expected that Vivo will produce insulin. Specific embodiments for purifying and concentrating various differentiated cell populations are described in US Patent Application 12/1, filed April 8, 2008.
07,020, title METHODS FOR PURIFYING ENDORERM
AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FR
OM HES CELLS, current US Pat. No. 8,338,170, is described in more detail, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. It is further expected that pancreatic precursors derived from cryopreserved hIPS cells can be thawed prior to transplantation and adapted to culture, resulting in in vivo maturation to produce insulin. To. In diabetic-inducing animals with transplanted pancreatic precursors derived from hIPS cells,
Hypoglycemia can be improved.

要約すると、マクロ封入デバイス中のｈＩＰＳ細胞から導出された完全封入膵臓前駆細
胞は、生理的に機能的な膵島に成熟し、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコースに応答してインスリ
ンを生成することが予想される。 In summary, fully encapsulated pancreatic progenitor cells derived from hIPS cells in macroencapsulation devices are expected to mature into physiologically functional islets and produce insulin in vivo in response to glucose.

（実施例４）
膵臓前駆体およびホルモン分泌細胞組成物
それぞれ表５ａ、５ｂおよび６に示すように、フローサイトメトリーを用いて、分化し
たｈＩＰＳ細胞集団を、ＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞（ステージ４）；
および内分泌または内分泌先駆細胞（ステージ５）の含有量について分析した。表５ｂは
表５ａのそれと同じデータセットであるが、比較のために表９のそれと同様に提示する。
全体のＰＤＸ１＋およびＮＫＸ６．１＋数はＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ−細
胞集団（表５ａの第５列）のそれと重複するので、表５ａ集団は互いと重複する、例えば
全細胞数は１００％を超える。表５ｂはＰＤＸ１＋だけおよび三重陰性（残留）データを
含み、それは表５ａでは示されない。ｉｎ ｖｉｖｏ機能を判定するために、これらのｉ
ＰＥＣ移植片の特定のもの、ならびに実質的に類似の処方を使用する他のものを動物に移
植したが、ヒト血清Ｃペプチドのレベルはどの潜在的治療目的のためにも十分に安定的で
なかった（データは示さず）。示す値は、所与の集団に属する全細胞の百分率である。懸
濁細胞凝集体中にある膵臓前駆体（ＮＫＸ６．１（＋）／ＰＤＸ１（＋）／クロモグラニ
ンＡ（−））の数およびＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１−／ＣＨＧＡ−の非常に小さい集団は
、ｈＥＳ細胞から導出された膵臓前駆細胞懸濁凝集体で観察されたものと一致し、２００
８年１１月４日に出願された米国特許出願１２／２６４，７６０、表題ＳＴＥＭ ＣＥＬ
Ｌ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＥＯＦに記載され、
参照により本明細書に完全に組み込まれる通り、ＥＳＣステージで凝集した。内分泌物お
よび／または内分泌先駆細胞のレベルも、参照により本明細書に完全に組み込まれる２０
０８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮ
ＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ中のｈＥＳ
由来の細胞培養物で得られたものと実質的に一致していた。ｈＥＳ由来の細胞の懸濁凝集
体と同様に、分化の特定のステージ（例えば、ステージ４）で培地中の異なる成長因子の
濃度を変化させることは、膵臓内胚葉、内分泌、ＰＤＸ１陽性の内胚葉または非膵臓細胞
型の特定の集団を増加および／または減少させるはずである。
(Example 4)
Pancreatic progenitor and hormone-secreting cell compositions As shown in Tables 5a, 5b and 6, respectively, the differentiated hIPS cell population was subjected to PDX1-positive pancreatic endoblast or pancreatic progenitor cells (stage 4) using flow cytometry.
And the content of endocrine or endocrine precursor cells (stage 5) was analyzed. Table 5b is the same data set as that of Table 5a, but is presented similarly to that of Table 9 for comparison.
Since the total PDX1 + and NKX6.1 + numbers overlap with those of the NKX6.1 + / PDX1 + / CHGA- cell population (5th column of Table 5a), the Table 5a population overlaps with each other, eg, the total cell number is 100%. Exceed. Table 5b contains only PDX1 + and triple negative (residual) data, which are not shown in Table 5a. These i's to determine the in vivo function
Specific ones of PEC grafts, as well as others using substantially similar formulations, have been transplanted into animals, but levels of human serum C-peptide are not stable enough for any potential therapeutic purpose. (Data not shown). The value shown is the percentage of all cells belonging to a given population. The number of pancreatic precursors (NKX6.1 (+) / PDX1 (+) / chromogranin A (-)) in suspended cell aggregates and a very small population of NKX6.1 + / PDX1- / CHGA- Consistent with that observed in cell-derived pancreatic progenitor cell suspension aggregates, 200
U.S. Patent Application 12 / 264,760 filed on November 4, 2008, entitled STEM CEL
L AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND
Described in METHODS OF DIFFERENTION THEREOF,
Aggregated at the ESC stage, as fully incorporated herein by reference. Endocrine and / or endocrine precursor cell levels are also fully incorporated herein by reference20.
U.S. Patent Application 12 / 107,020 filed April 8, 2008, title METHODS
FOR PURIFYING ENDORERM AND PANCREATIC EN
DODERM CELLS DERIVED FROM HES hES in CELLS
It was substantially consistent with that obtained with the cell culture of origin. Similar to suspension aggregates of hES-derived cells, varying the concentration of different growth factors in the medium at a particular stage of differentiation (eg, stage 4) can be pancreatic endoderm, endocrine, PDX1-positive endoderm. Or it should increase and / or decrease a specific population of non-pancreatic cell types.

（実施例５）
ＰＥＣ受容体チロシンキナーゼ
上記の方法は、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）をもとにした下の表７に記載される
ものと実質的に同じである。本明細書に記載されるこれらおよび他の方法は、それらの開
示は参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，９６４，４０２号；第８，
２１１，６９９号；第８，３３４，１３８号；第８，００８，０７号；および第８，１５
３，４２９号等の、出願人の多くの特許および非特許公開文書に見出すことができる。
(Example 5)
PEC Receptor Tyrosine Kinase The above method is substantially the same as that described in Table 7 below based on Schulz et al. (2012) above. These and other methods described herein are incorporated herein by reference in their disclosure. U.S. Pat. No. 7,964,402; 8,
Nos. 211,699; Nos. 8,334,138; Nos. 8,008,07; and Nos. 8,15
It can be found in many of the applicant's patents and non-patent publications, such as Nos. 3,429.

動物に移植されたｉＰＳ細胞および膵臓前駆体に上の方法を適用したとき、同じ方法を
ｈＥＳＣおよびｈＥＳ導出膵臓前駆体に適用したときと比較して、出願人は同じく安定し
た（ｒｏｂｕｓｔ）ｉｎ ｖｉｖｏ機能を一貫して得たとは限らない。ｉＰＳ細胞がｈＥ
ＳＣの形態および遺伝子発現パターンを有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚様体およびｉｎ ｖ
ｉｖｏでテラトーマを形成することができるヒト多能性幹細胞であり、それらが３つの胚
葉全てからの細胞を形成することができることを示していることを考慮すると、これは意
外であった。少なくとも、例えば上記の、Ｙｕら（２００７）；米国特許出願公開第２０
０９／００４７２６３号、国際特許出願公開ＷＯ２００５／８０５９８；米国特許出願公
開第２００８／０２３３６１０号；および国際特許出願公開ＷＯ２００８／１１８８２、
を参照。これらの参考文献は、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの定義基準を満たすことを記載する。
したがって、完全に機能性のグルコース応答性細胞にｉｎ ｖｉｖｏでさらに成熟および
発達する、ｈＥＳから導出された膵臓前駆細胞を与えるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコル
において、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの代用となることができることが予想される。しかし、上
の方法を使用する一貫しないｉｎ ｖｉｖｏ機能データを考慮し、出願人は、膵臓前駆体
および／または膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、すなわち、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣで
一貫して観察されているｉｎ ｖｉｖｏ機能の実質的に類似の安定したレベルを提供する
ことが可能であるｈｉＰＳＣ（または「ｉＰＥＣ」）からのステージ４由来の細胞に特異
的である分化培地の処方を探索しようと努めた。 When the above method was applied to iPS cells and pancreatic precursors transplanted into animals, Applicants were also robust in vivo compared to when the same method was applied to hESC and hES-derived pancreatic precursors. Not all features have been consistently obtained. iPS cells are hE
Has SC morphology and gene expression pattern, embryoid body and in vitro in vitro
This was surprising given that ivo is a human pluripotent stem cell capable of forming teratomas, showing that they are capable of forming cells from all three germ layers. At least, for example, Yu et al. (2007); US Patent Application Publication No. 20
09/0047263, International Patent Application Publication WO2005 / 80598; US Patent Application Publication No. 2008/0233610; and International Patent Application Publication WO2008 / 11882,
See. These references describe that iPS cells meet the definition criteria of ESC.
Therefore, it is expected that iPS cells can be a substitute for ESC in an in vitro differentiation protocol that provides fully functional glucose-responsive cells with in vitro further maturation and development of hES-derived pancreatic progenitor cells. Will be done. However, given inconsistent in vivo functional data using the above method, applicants have been consistently observed in pancreatic precursors and / or pancreatic endoderm cells (PECs), ie PECs derived from hESC. Attempts to search for cell-specific differentiation medium formulations from hiPSC (or "iPEC") that are capable of providing substantially similar stable levels of in vivo function. It was.

出願人は、ＰＥＣに存在する内分泌（ＣＨＧＡ＋細胞）細胞が複数ホルモン性内分泌細
胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を有する島を生成する
ＰＥＣ中の細胞の亜集団でないことを前に報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）を参
照されたい。むしろ、それは、非内分泌細胞集団（ＣＨＧＡ−細胞）、特に、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで機能性の島を実際に生成するＰＥＣであると考えられている、ＮＫＸ６．１および
ＰＤＸ−１を共発現するものである。したがって、出願人は、内分泌および非内分泌亜集
団の相対比をモジュレートするか、変化させるか、シフトすることが、後のｉｎ ｖｉｖ
ｏ機能に影響を及ぼすかどうかを探索した。 Applicants have previously stated that the endocrine (CHGA + cell) cells present in PEC are multihormonal endocrine cells and are not a subpopulation of cells in PEC that produce islets with glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. reported. See Kelly et al. (2011) above. Rather, it is a non-endocrine cell population (CHGA-cells), especially in vi.
It co-expresses NKX6.1 and PDX-1, which are considered to be PECs that actually produce functional islands in vo. Therefore, Applicants may later modulate, change, or shift the relative ratios of endocrine and non-endocrine subpopulations.
It was searched whether it affects the o function.

ｈＥＳＣで受容体−リガンドシグナル伝達を解読する以前の努力は、自己複製を促進す
る成長因子の同定に成功を収め、規定の培地培養条件の開発を可能にした。上記Ｗａｎｇ
ら（２００７）を参照されたい。Ｗａｎｇらは、ＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２との二
量体化を誘導し、その場面でｈＥＳＣの自己複製に影響を及ぼすリガンドとしてヘレグリ
ン−１βを同定した。ＥＲＢＢは受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫは、
成長因子および他の細胞外シグナル伝達分子の受容体として作用する、広く発現される膜
貫通タンパク質である。リガンド結合の結果、それらは細胞質テール中の特定の残基でチ
ロシンリン酸化を受け、ＲＴＫ媒介シグナル伝達に関与する他のタンパク質基質の結合の
ためのシグナル伝達カスケードを始動する。細胞の生存、増殖および運動性の調節を含む
いくつかの発達過程におけるＲＴＫ機能、およびがん形成でのそれらの役割は文書で十分
に立証されている。ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体は、発達中の胎児のヒト膵臓全体で
発現されることも知られていたが、特定のＥＲＢＢ受容体およびそれらのリガンドの特異
的役割は知られていない。Ｍａｒｉ−Ａｎｎｅ Ｈｕｏｔａｒｉら（２００２）ＥＲＲＢ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔ Ｃｅｌｌｓ
ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１４３（１１）：４４３７〜４４４６頁を参照されたい。 Prior efforts to decipher receptor-ligand signaling in hESC have successfully identified growth factors that promote self-renewal, allowing the development of defined medium culture conditions. Wang above
Et al. (2007). Wang et al. Identified hellegrin-1β as a ligand that binds to ERBB3 and induces dimerization with ERBB2, in which case it affects the self-renewal of hESC. ERBB is a receptor tyrosine kinase (RTK), and RTK is
A widely expressed transmembrane protein that acts as a receptor for growth factors and other extracellular signaling molecules. As a result of ligand binding, they undergo tyrosine phosphorylation at specific residues in the cytoplasmic tail, triggering a signaling cascade for the binding of other protein substrates involved in RTK-mediated signaling. RTK function in several developmental processes, including regulation of cell survival, proliferation and motility, and their role in cancer formation are well documented. The ERBB tyrosine kinase receptor has also been known to be expressed throughout the developing fetal human pancreas, but the specific role of specific ERBB receptors and their ligands is unknown. Mari-Anne Huotari et al. (2002) ERRB
Signaling Regulates Lineage Determinati
on of Developing Pancreatic Islets Cells
in Embryonic Organ Culture, Endocrinology
143 (11): 4437-4446.

上記Ｗａｎｇら（２００７）によって実証される胎児のヒト膵臓での多能性幹細胞の自
己複製およびそれらの発現、ならびにヒト胎児膵臓でのＥＲＢＢ ＲＴＫ発現でのＥＲＢ
Ｂ ＲＴＫシグナル伝達の役割のために、次に出願人は、分化の間のＰＥＣ特定化、また
は自己複製の促進による増殖、または生理的に機能する島ホルモン分泌細胞へのｉｎ ｖ
ｉｖｏ成熟を促進するいくつかの他の未知の機構を向上させる可能性がある受容体および
リガンドを同定する努力の中で、ｈＥＳＣから導出されたｉｎ ｖｉｔｒｏの膵臓内胚葉
細胞（ＰＥＣ）でＲＴＫの潜在的な活性化の調査に取りかかった。以下の変更を除いて実
質的に表８に記載のように、分化凝集体の懸濁液でＰＥＣを生成した。 Self-renewal of pluripotent stem cells in the fetal human pancreas and their expression as demonstrated by Wang et al. (2007), as well as ERB in ERBB RTK expression in the human fetal pancreas.
Due to the role of BRTK signaling, Applicants then seek PEC specification during differentiation, or proliferation by promoting self-renewal, or inv to physiologically functioning islet hormone-secreting cells.
In an effort to identify receptors and ligands that may improve some other unknown mechanisms that promote ivo maturation, RTK in in vitro pancreatic endoderm cells (PECs) derived from hESC We set out to investigate potential activation. PECs were produced in suspensions of differentiated aggregates substantially as shown in Table 8, except for the following modifications.

ＲＴＫブロット分析のために、４つのＰＥＣ試料を生成した。ｄｂ−Ｎ５０ Ｋ５０
Ｅ５０でのＰＥＣ凝集体の「定常状態」試料を、ステージ４の終わり（またはｄ１３）に
収集した。「絶食させた」試料は、ｄｂ（ＤＭＥＭ高グルコースまたは０．５×Ｂ−２７
サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース
）培地だけ（成長因子なし）を与え、ｄ１３に収集した、ｄ１２ＰＥＣ凝集体を表した。
２つの「パルス投与」試料は、ｄ１２にｄｂ培地を与えてそこで培養し、次にｄ１３に、
収集する前に１５分間、ｄｂ−Ｋ５０ Ｅ５０培地または２％ＦＢＳ含有ｄｂ培地のいず
れかを与えた。そのような条件は、ステージ４条件で活性であったＲＴＫの検出、ならび
にＫＧＦ、ＥＧＦおよびインスリン（Ｂ２７サプリメントに存在する）または血清のパル
ス投与でどのような応答を導き出すことができるか検出することを意図した。血清パルス
投与は、ＰＥＣに存在し、本ステージ４条件で活性化することができるが刺激されないＲ
ＴＫを潜在的に同定する、広域な成長因子刺激を意図した。 Four PEC samples were generated for RTK blot analysis. db-N50 K50
A "steady state" sample of PEC aggregates at E50 was collected at the end of stage 4 (or d13). The "fasted" sample is db (DMEM high glucose or 0.5 x B-27).
Only DMEM high glucose medium supplemented with supplements (Life Technologies) (without growth factors) was given to represent d12PEC aggregates collected at d13.
The two "pulse-administered" samples were fed d12 with db medium and cultured there, then at d13,
Either db-K50 E50 medium or db medium containing 2% FBS was given for 15 minutes prior to collection. Such conditions are the detection of RTKs that were active in stage 4 conditions, as well as the detection of what response can be elicited by pulse administration of KGF, EGF and insulin (present in B27 supplements) or serum. Was intended. Serum pulse administration is present in PEC and can be activated under this stage 4 condition but is not stimulated.
It was intended to stimulate a wide range of growth factors that potentially identify TK.

ＲＴＫ分析は、事実上前掲のＷａｎｇら（２００７）で前に記載される通りに実施した
。簡潔には、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイ
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ）を、製造業者の指示通りに使用した。１％ＮＰ−４０、２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２
．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロ
チニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンでタンパク質溶解物を調製した。５００μｇ
の新鮮なタンパク質溶解物を、４２個の抗ＲＴＫ抗体および５つの陰性対照抗体のための
重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）スポット、ならびに８つの抗ホスホチロシン陽性対照スポッ
トの点在するニトロセルロース膜と一晩インキュベートした（図５Ａ）。配列された抗体
はリン酸化および非リン酸化ＲＴＫの細胞外ドメインを捕捉し、結合したホスホＲＴＫは
、化学発光を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた汎
抗ホスホチロシン抗体で検出される。ＲＴＫアレイレイアウトについては図５を、ならび
にアレイ中のＲＴＫの一覧については下の表８を参照されたい。
The RTK analysis was performed virtually as previously described by Wang et al. (2007), supra. Briefly, the Proteome Profiler ™ Human Phosphor RTK Antibody Array (R & D Systems) was used as directed by the manufacturer. 1% NP-40, 2
0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% glycerol, 2
.. Protein lysates were prepared with 0 mM EDTA, 1.0 mM sodium orthovanadium acid, 10 μg / mL aprotinin, and 10 μg / mL leupeptin. 500 μg
Fresh protein lysates were incubated overnight with nitrocellulose membranes interspersed with duplicate spots for 42 anti-RTK antibodies and 5 negative control antibodies, as well as 8 antiphosphotyrosine positive control spots ( FIG. 5A). The sequenced antibody captured the extracellular domain of phosphorylated and non-phosphorylated RTKs, and the bound phosphoRTK was detected with a pan-antiphosphotyrosine antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) using chemiluminescence. To. See FIG. 5 for the RTK array layout and Table 8 below for a list of RTKs in the array.

ＲＴＫブロットの分析（図６Ａ）は、ｈＥＳＣで以前に観察されたものと同様に、イン
スリン受容体およびＩＧＦ１受容体（それぞれＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ）が全ての条件でリン酸
化され、活性化されたことを示した。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照されたい。ＥＧ
Ｆ受容体（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１としても知られる）は定常状態条件でリン酸化されたが
、それはステージ４培地中のＥＧＦの存在を考慮すると予想されていたことである。実際
、ＥＲＢＢ２の低レベルのリン酸化が、定常状態および絶食条件の両方で検出された。Ｅ
ＧＦＲおよびＥＲＢＢ２の両方のリン酸化は各パルス投与条件で上昇し、リガンドのパル
ス投与に応答する活性化を検出するアッセイの能力を確認した。リン酸化されたＶＥＧＦ
Ｒ３も全ての条件で検出され、パルス投与試料で上昇した。このことは、ＰＥＣが内因性
ＶＥＧＦＲ３リガンドを生成することを示唆し、可能性のある候補はＶＥＧＦ−Ｃおよび
Ｄであった。血清パルス投与は、低レベルのＥＲＢＢ３リン酸化を含め、さらなる受容体
を活性化するようであった。リン酸化ＥＲＢＢ２／３の検出は、ヘレグリン様ＥＧＦファ
ミリーメンバーがＰＥＣでシグナル伝達を活性化することができることを示唆する。ＴＩ
Ｅ−２は２つのアンギオポエチン受容体の１つであり、血清に応答して低いレベルでリン
酸化されるようであった。アンギオポエチン１およびアンギオポエチン４はＴｉｅ−２の
リガンドを活性化することが公知であるが、アンギオポエチン２およびアンギオポエチン
３は、場面依存性競合的アンタゴニストとして機能する。ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）も血
清パルス投与に応答してリン酸化され、肝細胞成長因子もＰＥＣでシグナル伝達を導き出
すことができることを示唆した。最後に、エフリンＢ２ ＲＴＫ（ＥＰＨＢ２）の低レベ
ルのリン酸化が検出されたが、エフリン／Ｅｐｈシグナル伝達は膜結合細胞間シグナル伝
達系であり、ＰＥＣ分化で容易に活用されるようではない。興味深いことに、ＥＲＢＢ４
はリン酸化されなかった。したがって、ＲＴＫ分析は、ＰＥＣでリン酸化されるか、また
は異なる条件、例えば血清に応答してリン酸化することができるいくつかの受容体を鮮明
にした。これらの結果は、いくつかの可溶性リガンドがＰＥＣでＲＴＫシグナル伝達を導
き出すことができ、細胞の増殖、分化および／または特定化に潜在的に影響を与え、した
がって、機能性の膵島への後のｉｎ ｖｉｖｏ成熟に潜在的に影響を及ぼすことができる
ことを示唆する。 Analysis of the RTK blot (FIG. 6A) showed that the insulin and IGF1 receptors (IR and IGF1R, respectively) were phosphorylated and activated under all conditions, similar to those previously observed on hESC. Indicated. See Wang et al. (2007) above. EG
The F receptor (EGFR, also known as ERBB1) was phosphorylated under steady-state conditions, which was expected to take into account the presence of EGF in Stage 4 medium. In fact, low levels of phosphorylation of ERBB2 were detected in both steady state and fasting conditions. E
Phosphorylation of both GFR and ERBB2 was elevated at each pulsed condition, confirming the ability of the assay to detect activation in response to pulsed ligand administration. Phosphorylated VEGF
R3 was also detected under all conditions and increased in the pulsed sample. This suggested that PEC produced an endogenous VEGFR3 ligand, with possible candidates being VEGF-C and D. Serum pulse administration appeared to activate additional receptors, including low levels of ERBB3 phosphorylation. Detection of phosphorylated ERBB2 / 3 suggests that Helegulin-like EGF family members can activate signal transduction at PEC. TI
E-2 was one of two angiopoetin receptors and appeared to be phosphorylated at low levels in response to serum. Angiopoietin 1 and angiopoietin 4 are known to activate ligands for Tie-2, whereas angiopoietin 2 and angiopoietin 3 function as scene-dependent competitive antagonists. The HGF receptor (HGFR) was also phosphorylated in response to serum pulse administration, suggesting that hepatocyte growth factor can also derive signaling with PEC. Finally, low levels of phosphorylation of ephrin B2 RTK (EPHB2) were detected, but ephrin / Eph signaling is a membrane-bound intercellular signaling system and does not appear to be readily utilized in PEC differentiation. Interestingly, ERBB4
Was not phosphorylated. Therefore, RTK analysis clarified some receptors that can be phosphorylated by PEC or phosphorylated in response to different conditions, such as serum. These results indicate that some soluble ligands can derive RTK signaling in PEC, potentially affecting cell proliferation, differentiation and / or specification, and thus later to functional islets. It suggests that it can potentially affect in vivo maturation.

（実施例６）
ヘレグリンおよびＦＧＦ２成長因子は、ｈＥＳＣ組成物から導出されたＰＥＣに影響を
及ぼす
上の実施例５に記載のように特定の条件下で特定のＲＴＫが活性化（またはリン酸化）
されることを実証したＲＴＫ分析を考慮し、また、少なくともＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ
３がＰＥＣで活性化される（ステージ１〜４から１３日間の分化後に）ようであったので
、出願人はステージ３および４の細胞に適用したときのヘレグリンの影響を判定しようと
努めた。 (Example 6)
Helegrin and FGF2 growth factors affect PECs derived from hESC compositions. Certain RTKs are activated (or phosphorylated) under certain conditions as described in Example 5 above.
Consider RTK analysis that has been demonstrated to be, and also at least ERBB2 and ERBB
Since 3 appeared to be activated by PEC (after stage 1-4 to 13 days of differentiation), Applicants sought to determine the effect of hellegrin when applied to stage 3 and 4 cells.

ヘレグリンおよびＦＧＦを使用して予備研究を実施した。これらの研究の特定のものに
、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２が含まれた。これらの予備研究は、１０ｎｇ／
ｍＬヘレグリン−１β（Ｗａｎｇら（２００７）に開示されるのと同じ濃度およびヘレグ
リン異性体）によるステージ１での１日間の多能性幹細胞の処置は、ヘレグリン−１β（
Ｈｒｇ１β）のない懸濁培養でのｈＥＳ導出細胞凝集体の凝集体サイズと比較して、懸濁
培養でｈＥＳ導出細胞凝集体の細胞凝集体サイズを増加させた。細胞凝集体サイズの増加
は、動物での後の移植および機能検査のためにより大きな細胞量をもたらす点で有利であ
る。さらに、Ｈｒｇ１βがステージ３で１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬに増加したと
き、凝集体ディスクサイズが増加した。この結果は、ＦＧＦ２の不在下での培養と比較し
て５０ｎｇ／ｍＬの別の成長因子、ＦＧＦ２がステージ３で使用されたときも観察された
。細胞凝集体サイズの増加は、ステージ３培養をＦＧＦ２曝露にさらなる日数、例えば２
日間と比較して３日間の５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２に曝露させたときも観察された。 Preliminary studies were performed using Helegrine and FGF. Specific ones of these studies included the Rho-kinase inhibitor, Y-27632. These preliminary studies are 10 ng /
Treatment of pluripotent stem cells in stage 1 with mL Helegulin-1β (the same concentration and Helegrin isomer as disclosed in Wang et al. (2007)) was performed with Helegrin-1β (
The cell aggregate size of hES-derived cell aggregates was increased in suspension culture as compared to the aggregate size of hES-derived cell aggregates in suspension culture without Hrg1β). Increased cell aggregate size is advantageous in that it results in greater cell mass for later transplantation and functional testing in animals. Furthermore, when Hrg1β increased from 10 ng / mL to 50 ng / mL in stage 3, the aggregate disc size increased. This result was also observed when another 50 ng / mL growth factor, FGF2, was used in stage 3 compared to culture in the absence of FGF2. Increased cell aggregate size can result in additional days of stage 3 culture exposure to FGF2, eg 2
It was also observed when exposed to 50 ng / mL FGF2 for 3 days compared to days.

表９は、ステージ３および／またはステージ４にＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２で処置した
ＰＥＣ細胞のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。内分泌細胞はＣＨＧＡ陽性（
またはＣＨＧＡ＋）細胞と表し、非内分泌細胞はＣＨＧＡ陰性（またはＣＨＧＡ−）細胞
と表す。内分泌物（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−）は、他のマーカーで
陽性に染色することができ、例えばＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１に陽性に染色さ
れる。試験したマーカーのいずれにも染色しない細胞は、三重陰性細胞または残留細胞（
ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１−／ＰＤＸ１）と表す。
Table 9 provides a summary of flow cytometric analysis of PEC cells treated with Hrg1β and FGF2 for stage 3 and / or stage 4. Endocrine cells are CHGA positive (
Or CHGA +) cells, and non-endocrine cells are referred to as CHGA-negative (or CHGA-) cells. Endocrine (CHGA +) and non-endocrine cells (CHGA-) can be positively stained with other markers, eg PDX1 and / or NKX6.1. Cells that did not stain any of the markers tested were triple negative cells or residual cells (
It is expressed as CHGA- / NKX6.1- / PDX1).

細胞凝集体サイズの増加がＰＥＣ亜集団に影響を及ぼすかどうか判定するために、ＰＥ
Ｃ集団の組成物をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を分化するためにＨｒｇ
１βおよびＦＧＦ２が使用されなかった対照培養と比較して、ＰＥＣ非内分泌亜集団（Ｃ
ＨＧＡ−）は、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から
６１．２％に増加し、ステージ３で５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１
％から６４．２％に増加した。内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）は、１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ
１βの処置であまり影響を受けなかったが、５０ｎｇ／ｍＬでよりそうであった。一方、
残留細胞の相対レベルは減少し、５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βでより減少した。したがっ
て、Ｈｒｇ１β処置による細胞凝集体サイズの増加は、内分泌および残留亜集団と比較し
て非内分泌亜集団の増加に大部分帰された。 PE to determine if increased cell aggregate size affects the PEC subpopulation
The composition of group C was analyzed by flow cytometry. Hrg to differentiate cells
PEC non-endocrine subpopulation (C) compared to control cultures in which 1β and FGF2 were not used
HGA-) increased from 54.01% to 61.2% with the addition of 10 ng / mL Hrg1β in stage 3 and 54.01 with the addition of 50 ng / mL Hrg1β in stage 3.
Increased from% to 64.2%. Endocrine subpopulation (CHGA +) is 10 ng / mL Hrg
Treatment with 1β was less affected, but more so at 50 ng / mL. on the other hand,
Relative levels of residual cells decreased and were more reduced at 50 ng / mL Hrg1β. Therefore, the increase in cell aggregate size due to Hrg1β treatment was largely attributed to an increase in the non-endocrine subpopulation compared to the endocrine and residual subpopulation.

ステージ３培養でのＦＧＦ２の影響も同様であったが、Ｈｒｇ１βのそれよりさらに顕
著であった。例えば、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、Ｈｒｇ１βでそうであっ
たように増加した。これらの培養でのＦＧＦ２の主要な影響は、内分泌亜集団の実質的な
減少であった。ある場合には、これらの細胞は、３日間の処置でほとんど検出不能であっ
た（３２．９％から０．３３％）。したがって、ＦＧＦ２で処置した培養の細胞凝集体サ
イズの増加は、非内分泌、一部の場合には残留細胞亜集団の増加（ステージ３の３日間で
１３．１％から２２．７％）に大部分帰された。 The effect of FGF2 on stage 3 cultures was similar, but more pronounced than that of Hrg1β. For example, the PEC non-endocrine subpopulation (CHGA-) increased as was the case with Hrg1β. The major effect of FGF2 in these cultures was a substantial reduction in the endocrine subpopulation. In some cases, these cells were almost undetectable after 3 days of treatment (32.9% to 0.33%). Therefore, the increase in cell aggregate size in FGF2-treated cultures is large to non-endocrine, in some cases increased residual cell subpopulation (13.1% to 22.7% in 3 days of stage 3). Partially returned.

したがって、ヘレグリンおよび／またはＦＧＦ２は、ＰＥＣ集団での細胞の特定化にお
いて役割を果たすようである。多能性幹細胞との関連で使用されるとき、ヘレグリン単独
で細胞再生において役割を果たすと上記のＷａｎｇら（２００７）が報告したことを考慮
すると、これは意外である。 Thus, hellegrin and / or FGF2 appear to play a role in cell identification in the PEC population. This is surprising given that Wang et al. (2007) reported above that heregulin alone plays a role in cell regeneration when used in the context of pluripotent stem cells.

（実施例７）
ヘレグリンによるｉＰＳ由来の細胞培養物の処置によってＰＥＣのｉｎ ｖｉｖｏ移植
片機能を向上させる方法
ｉＰＥＣを生成するためにｉＰＳＣに適用したときの表７による方法は、動物で安定し
たｉｎ ｖｉｖｏ機能を提供しなかったので、出願人はｉＰＥＣ生成のための他の方法を
探索した。表７に示す標準方法の変更としては、限定されずに以下のものが挙げられる：
任意のｉＰＳＣの継代回数の最適化；ＢＭＰシグナル伝達のレベルをモジュレートするこ
と；増大および分化の間のｉＰＳＣ懸濁凝集パラメータをモジュレートすること（例えば
せん断力、回転速度等）；成長因子、例えばＷｎｔ、アクチビンおよびｒｈｏキナーゼ阻
害剤の濃度、使用時期および使用期間の最適化；ならびに、分化プロトコルの１から４の
様々なステージでの、細胞の量、増殖、分化、生存等を向上させるための候補としての他
の成長因子による処置（例えばＥＲＢＢリガンド）。ステージ１〜４の間のｉＰＳＣの分
化方法をどのように最適化することができるか判断するために、これらの多くの反復実験
を単独で、または組合せで検証した。そのような最適化された分化方法は、移植したとき
に、ｈＥＳＣについて観察および報告されたものに類似した安定したグルコース応答性イ
ンスリン分泌細胞をｉｎ ｖｉｖｏでもたらしたｉＰＥＣ集団を生成する。下の表１０は
、後にｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性島細胞に成熟するｉＰＥＣにｉＰＳＣを分化さ
せることが実証された、ヘレグリンの有る無しのベースライン条件を記載する。ベースラ
イン条件は、ヘレグリンがステージ３および４で加えられたこと以外、本明細書の実施例
１、２および５ならびに表７に記載されるものに類似していた。３０ｎｇ／ｍＬのΗｒｇ
１βを使用したが、１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの濃度、または５０ｎｇ／ｍＬを
超える濃度でさえも適する。さらに、実施例２に記載の通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ
ー２７６３２の添加が分化培養で維持された。
(Example 7)
Methods of Improving PEC In Vivo Graft Function by Treatment of iPS-Derived Cell Cultures with Helegrine The methods according to Table 7 when applied to iPSCs to generate iPECs provide stable in vivo function in animals. Not so, the applicant searched for other methods for iPEC generation. Changes to the standard methods shown in Table 7 include, without limitation:
Optimizing the number of passages of any iPSC; Modulating the level of BMP signaling; Modulating iPSC suspension aggregation parameters during augmentation and differentiation (eg shearing force, rotational rate, etc.); Growth factors Optimizing concentrations, timing and duration of use, eg, Wnt, actibine and rho kinase inhibitors; and improving cell mass, proliferation, differentiation, survival, etc. at various stages of differentiation protocols 1-4. Treatment with other growth factors as candidates for (eg, ERBB ligand). Many of these iterative experiments were tested alone or in combination to determine how iPSC differentiation methods between stages 1 to 4 could be optimized. Such an optimized differentiation method produces an iPEC population that, upon transplantation, yielded stable glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo similar to those observed and reported for hESC. Table 10 below describes the baseline conditions with and without heregrine, which have been demonstrated to differentiate iPSCs into iPECs that later mature into glucose-responsive islet cells in vivo. Baseline conditions were similar to those described in Examples 1, 2 and 5 and Table 7 herein, except that heregrine was added in stages 3 and 4. 30 ng / mL Ηrg
Although 1β was used, concentrations from 10 ng / mL to 50 ng / mL, or even concentrations above 50 ng / mL, are suitable. Further, as described in Example 2, a Rho kinase inhibitor, Y
Addition of -27632 was maintained in the differentiation culture.

ステージ３および４の細胞亜集団に及ぼすヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキ
ナーゼ阻害剤の添加の影響を判定するために、ｉＰＥＣ集団をフローサイトメトリーによ
って分析した。表１１は、表１０に示す配合、ならびにアクチビン濃度を２００ｎｇ／ｍ
Ｌに増加させることによって改変した配合を使用した、様々なｉＰＥＣ集団のフローサイ
トメトリー分析の要約を提供する。さらに、表１１は、各セットの実験（ヘレグリンの有
る無しのベースライン）で用いた一般的な条件、およびｉＰＥＣ集団中の細胞型（内分泌
、非内分泌、ＰＤＸ１だけおよび三重陰性または残留細胞亜集団）の相対的百分率を示す
。表１１は、各実験で生成された細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能に関するデータも開示する。
The iPEC population was analyzed by flow cytometry to determine the effect of addition of herregulin or herregulin and rho-kinase inhibitors on stage 3 and 4 cell subpopulations. Table 11 shows the formulations shown in Table 10 and the activin concentration of 200 ng / m.
A summary of flow cytometric analysis of various iPEC populations using formulations modified by increasing to L is provided. In addition, Table 11 shows the general conditions used in each set of experiments (baseline with and without hergulin), and cell types in the iPEC population (endocrine, non-endocrine, PDX1 only and triple negative or residual cell subpopulations). ) Indicates the relative percentage. Table 11 also discloses data on the in vivo function of the cells generated in each experiment.

特定の条件において、ＰＥＣ（ｈＥＳＣ、Ｅ２３５４）およびｉＰＥＣ（Ｅ２３１４、
Ｅ２３４４、Ｅ２３４７）集団中の細胞亜集団の比は変化した。例えば、時には、ベース
ライン（ヘレグリンなし）条件と比較して、内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の百分率は減少し
、非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋）の百分率は増加した。ヘレ
グリンがこれらのＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団中の非内分泌細胞と比較した内分泌細胞の割
合の変化の原因となるようであったが、実験＃２３８０（Ｅ２３８０）では、ヘレグリン
の添加によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞のレベルは減少せずに増加した。 Under certain conditions, PEC (hESC, E2354) and iPEC (E2314,
E2344, E2347) The ratio of cell subpopulations in the population changed. For example, sometimes the percentage of endocrine (CHGA +) cells decreased and the percentage of non-endocrine cells (CHGA- / NKX6.1 + / PDX1 +) increased compared to baseline (without heregulin) conditions. Helegrine appeared to be responsible for changes in the proportion of endocrine cells compared to non-endocrine cells in these PEC and iPEC populations, but in Experiment # 2380 (E2380), the addition of Helegrin resulted in endocrine (CHGA +) cells. The level increased without decreasing.

ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団の構成の変化がｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼしたかどう
かを判定するために、表１１に記載される大部分の実験からのＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植
片を、実質的に本明細書ならびに上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）およびＫｒｏｏｎら
（２００８）、および上記の米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号
；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を含む出願人の他の特許および
非特許出版物に前述の通り、マウスに移植した。簡潔には、ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を
生分解性の半透過性細胞封入デバイスに全て封入し、そのいくつかは微穿孔を含んでいた
。デバイスは出願人によって製造され、２００９年１１月１３日に出願された米国特許第
８，２７８，１０６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ
ＣＥＬＬＳ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
で詳細に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。グルコース刺
激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを、移植の約５６日後から実施した。グルコース
投与の前（空腹時）、およびグルコース投与の３０分後および／または６０分後の組合せ
で血液を収集した。グルコース投与に応答した血清中のヒトＣペプチド濃度を測定するこ
とによって、移植片機能を評価した。 To determine whether changes in the composition of PEC and the iPEC population affected in vivo function, the PEC and iPEC grafts from most of the experiments described in Table 11 were substantially incorporated herein and Schulz et al. (2012) and Kron et al. (2008), and US Pat. Nos. 7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 and 8,278,106. The applicant's other patents and non-patent publications, including, have been transplanted into mice as described above. Briefly, PEC and iPEC populations were all encapsulated in biodegradable semi-permeable cell encapsulation devices, some of which contained microperforations. The device was manufactured by the applicant and filed on November 13, 2009, US Pat. No. 8,278,106, entitled ENCAPSULATION OF PANCREATIC.
CELLS FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS
Described in detail in, the disclosure is incorporated herein by reference in its entirety. Glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay was performed approximately 56 days after transplantation. Blood was collected before glucose administration (on an empty stomach) and in combination 30 and / or 60 minutes after glucose administration. Graft function was evaluated by measuring the concentration of human C-peptide in serum in response to glucose administration.

血清に放出されるヒトＣペプチドの量は、放出されるインスリンの量の指標となる。Ｃ
ペプチドはプロインスリンおよびプレプロインスリンのＡおよびＢ鎖を接続または連結す
る短い３１アミノ酸ペプチドであり、機能性ベータまたはインスリン分泌細胞によって分
泌される。上記Ｋｒｏｏｎら（２００８）および他によって前述される通り、ヒトＣペプ
チドの測定は、移植細胞による新規生成インスリンの放出の評価に適当である。したがっ
て、これらの動物の血清中のヒトＣペプチドのレベルは、成熟したＰＥＣおよびｉＰＥＣ
移植片のｉｎ ｖｉｖｏ機能の尺度である。ヒトＣペプチドは、移植後少なくとも８週ま
でに血清で検出された。追加の数週の移植および絶食により、グルコース刺激Ｃペプチド
レベルは増加し、Ｃペプチドのピークレベルはグルコース投与の６０分後から３０分後に
シフトし、それは、インスリン細胞の成熟に従う、グルコース投与へのより速い応答の指
標となる。機能を示すことができなかったか、不良な健康状態のために屠殺された少数の
マウスがいた。しかし、これらのマウスはさもなければ高機能を示した動物のコホート中
にあり、したがって、移植細胞が分化して機能する能力がないということよりも移植の失
敗を示唆した。 The amount of human C-peptide released into serum is an indicator of the amount of insulin released. C
The peptide is a short 31 amino acid peptide that connects or links the A and B chains of proinsulin and preproinsulin and is secreted by functional beta or insulin secreting cells. As described above by Kroon et al. (2008) and others, measurement of human C-peptide is suitable for assessing the release of newly produced insulin by transplanted cells. Therefore, the levels of human C-peptide in the sera of these animals are mature PEC and iPEC.
It is a measure of the in vivo function of the graft. Human C-peptide was detected in serum at least 8 weeks after transplantation. With additional weeks of transplantation and fasting, glucose-stimulated C-peptide levels increased and peak levels of C-peptide shifted from 60 to 30 minutes after glucose administration, which follows the maturation of insulin cells, to glucose administration. It is an indicator of faster response. There were a small number of mice that failed to function or were sacrificed due to poor health. However, these mice were in a cohort of otherwise highly functional animals, thus suggesting transplant failure rather than the inability of transplanted cells to differentiate and function.

図７Ａ〜Ｃは、Ｅ２３４４以外の表１１に示す実験の全てについての、グルコース投与
後の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。図７Ａ〜Ｃは、ベースライン対照と比較して
、ヘレグリン処置からもたらされた移植片が血清中ヒトＣペプチドのより高いレベルを一
般に有したことを示す。例えば、図７Ａでは実験２３８０において、ヘレグリンなしで調
製したもの（ベースライン）と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片の約５
倍の増加（グルコース投与の６０分後に９３３ｐＭ：２００ｐＭ）がある。実験２３５４
（図７Ｃ）はベースライン対照と比較してヘレグリン処置からもたらされた移植片で血清
Ｃペプチドのより高いレベルを示さないので、ヘレグリンは、ｈＥＳＣから生成されるＰ
ＥＣにより少ない影響を及ぼすようである。さらに、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣ（Ｃ
ｙＴ２０３）とｉＰＳＣから導出されたｉＰＥＣを比較すると、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥ
Ｃ移植片と同等の機能をｉｎ ｖｉｖｏで有する（例えば、図７Ａおよび図７Ｂ（ｉＰＳ
Ｃ移植片）を図７Ｃ（ＣｙＴ２０３ ｈＥＳＣ）と比較する）。このように、ｉＰＥＣ移
植片は、ＰＥＣ移植片と同じくらい頑強である。さらに、内分泌および非内分泌亜集団で
同じシフトを有しなかったＥ２３８０からのｉＰＥＣも優れた機能を示したので、ｉＰＥ
Ｃ集団のいくつか（例えばＥ２３１４、Ｅ２３４７およびＥ２３５４）に影響を及ぼすよ
うに見えた、内分泌細胞対非内分泌細胞の相対比は、ｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさ
ないようであった（図７Ａ〜Ｃを参照）。 7A-C show human C-peptide levels in serum after glucose administration for all of the experiments shown in Table 11 except E2344. Figures 7A-C show that grafts resulting from heregulin treatment generally had higher levels of human C-peptide in serum as compared to baseline controls. For example, in FIG. 7A, in Experiment 2380, about 5 of the grafts resulting from Helegulin treatment compared to those prepared without Helegrin (baseline).
There is a fold increase (933 pM: 200 pM 60 minutes after glucose administration). Experiment 2354
Helegrine is a P produced from hESC because (FIG. 7C) does not show higher levels of serum C-peptide in the grafts resulting from heregulin treatment compared to baseline controls.
It seems to have less effect on EC. Furthermore, PEC (C) derived from hESC
Comparing yT203) with iPEC derived from iPSC, the iPEC graft is PE.
It has the same function as the C graft in vivo (for example, FIGS. 7A and 7B (iPS).
C graft) is compared with FIG. 7C (CyT203 hESC)). Thus, the iPEC implant is as robust as the PEC implant. In addition, iPEC from E2380, which did not have the same shift in the endocrine and non-endocrine subpopulations, also showed excellent function, thus iPE.
The relative ratio of endocrine to non-endocrine cells, which appeared to affect some of the C populations (eg E2314, E2347 and E2354), did not appear to affect in vivo function (FIGS. 7A-C). See).

グルコース刺激インスリン分泌を試験することに加えて、宿主動物のベータ細胞を破壊
した場合に、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣによって維持される正常血糖と同様の正常血
糖をそれらが単独で維持することができるかどうか判定するために、成熟したｉＰＥＣ移
植片を試験した。これは、ヒトベータ細胞と比較してマウスベータ細胞に対してより強い
細胞毒性を示すベータ細胞毒素、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用して、移植された
マウスのベータ細胞を破壊することを必要とした。ＳＴＺ処置の前後に各マウスについて
、ランダムな非絶食血中グルコースを測定した。ＳＴＺ処置から１３日目のｉＰＥＣ移植
片の外植の結果、高血糖が再開した（血中グルコースの急騰を記す）が、それは内因性マ
ウス膵臓ではなくｉＰＥＣ移植片による血糖症の制御を実証する（図８Ａおよび図８Ｂを
参照する）。 In addition to testing glucose-stimulated insulin secretion, they can independently maintain normoglycemia similar to that maintained by PECs derived from hESC when the beta cells of the host animal are destroyed. Mature iPEC grafts were tested to determine if. This required disruption of transplanted mouse beta cells using streptozotocin (STZ), a beta cell toxin that is more cytotoxic to mouse beta cells compared to human beta cells. Random non-fasting blood glucose was measured for each mouse before and after STZ treatment. Hyperglycemia resumed as a result of explantation of the iPEC graft 13 days after STZ treatment (noting a surge in blood glucose), demonstrating the control of blood glucose by the iPEC graft rather than the endogenous mouse pancreas. (See FIGS. 8A and 8B).

さらに、分化のステージ１〜４の間にヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤が与えら
れたときに、相乗効果があるようであった（表１０を参照する）。例えば、ｒｈｏキナー
ゼ阻害剤なしでステージ３および４でヘレグリンによって処置したｉＰＳＣは、目にみえ
て劣る細胞量をもたらし、移植を不可能にした。ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤
の相乗効果のさらなる傍証が、実験のいくつか、例えばＥ２３５６、Ｅ２３８０で明白で
あったが、そこではｒｈｏキナーゼ阻害剤単独によるベースライン条件は、ｒｈｏキナー
ゼ阻害剤とヘレグリンによる移植片と同じくらい安定的には機能しなかった（図７Ａおよ
びＢを参照）。ヘレグリン単独の添加が提供した細胞量は移植に不十分であり、ｒｈｏキ
ナーゼ阻害剤単独の添加（ベースライン条件）は不良なｉｎ ｖｉｖｏ機能を有したので
、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤による処置は相加的でなかったようである。こ
のように、ヘレグリンだけまたはｒｈｏキナーゼ阻害剤だけの提供は、２つを組み合わせ
た合計の影響に実質的に同等でない。すなわち、単独ではいずれもｉｎ ｖｉｖｏで安定
したグルコース応答性をもたらさないが、組み合わせるとそれらはｈＥＳ由来の細胞のそ
れと同等のグルコース応答性をもたらす。したがって、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ
阻害剤の両方の提供は、それらの組み合わせた影響が各々別々の影響の合計より大きいの
で相乗的であるようであった。すなわち、ｒｈｏキナーゼ阻害剤およびヘレグリンで処置
したｉＰＥＣはｉｎ ｖｉｖｏで成熟してグルコース刺激インスリン分泌を示し、糖尿病
マウスモデルで正常血糖を維持することができた（図７Ａ〜Ｂおよび図８Ａ〜Ｂを参照さ
れたい）。 In addition, there appeared to be a synergistic effect when heregulin and rho-kinase inhibitors were given during stages 1-4 of differentiation (see Table 10). For example, iPSCs treated with heregulin at stages 3 and 4 without rho-kinase inhibitors resulted in visibly inferior cell mass, making transplantation impossible. Further evidence of the synergistic effect of rho-kinase inhibitors and rho-kinase inhibitors was evident in some of the experiments, such as E2356 and E2380, where baseline conditions with rho-kinase inhibitors alone were with rho-kinase inhibitors and heregrin. It did not function as stably as the implant (see Figures 7A and B). Treatment with heregulin and rho-kinase inhibitors is phased, as the cell mass provided by the addition of heregrin alone was insufficient for transplantation and the addition of rho-kinase inhibitor alone (baseline condition) had poor in vivo function. It seems that it was not additive. Thus, the provision of heregulin alone or rho-kinase inhibitor alone is not substantially equivalent to the combined effect of the two. That is, none of them alone provide stable glucose responsiveness in vivo, but when combined they provide glucose responsiveness comparable to that of hES-derived cells. Therefore, the provision of both heregulin and rho-kinase inhibitors appeared to be synergistic, as their combined effects were greater than the sum of the individual effects. That is, the iPEC treated with the rho-kinase inhibitor and heregulin matured in vivo and showed glucose-stimulated insulin secretion, and was able to maintain normoglycemia in the diabetic mouse model (FIGS. 7A-B and 8A-B). Please refer to).

ＥＲＢＢ機能性は、リガンド結合、受容体二量体化および受容体輸送を必要とする。各
過程での変動は、受容体およびそれらが制御する下流シグナルの差次的調節をもたらす場
合がある。例えば、異なるＥＲＢＢリガンドはＥＲＢＢ受容体に異なる親和性で結合し、
それによってＥＲＢＢ二量体構成体のパターンおよび動態力学を変化させる。表１２は、
リガンドおよび受容体結合複合体の多くの可能な異なる組合せを示す。この系の複雑性に
関するレビューは、Ｏｄａら（２００５）Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐａｔｈｗ
ａｙ ｍａｐ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、１（２００５）およびＬａ
ｚｚａｒａら（２００９）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｅｒｓｐｅ
ｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥＲＢＢ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａ
ｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ３１５（４）：７１７〜７２５頁によって提供され、その開示は参照により本明細書
に完全に組み込まれる。
ERBB functionality requires ligand binding, receptor dimerization and receptor transport. Fluctuations in each process may result in differential regulation of receptors and downstream signals they control. For example, different ERBB ligands bind to the ERBB receptor with different affinities and
This alters the pattern and dynamics of the ERBB dimer construct. Table 12 shows
Shown are many possible different combinations of ligand and receptor binding complexes. A review of the complexity of this system can be found in Oda et al. (2005) A comprehensive pastw.
ay map of epidermal growth factor receipt
or signaling, Mol. System. Biol. 1, (2005) and La
zzara et al. (2009) Quantitative modeling perspe
ctives on the ERBB system of cell reguula
tory processes, Experimental Cell Research
h 315 (4): Provided by pages 717-725, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.

Ｈｕｏｔａｒｉらは、ニューレグリン−４がグルカゴン（アルファ）細胞を代償にして
ソマトスタチン（デルタ）細胞の数を増加させることによって内分泌細胞亜集団の相対レ
ベルをモジュレートすることができること、およびニューレグリン−４は、内分泌（例え
ば、β−インスリン、α−グルカゴン、δ−ソマトスタチン、ＰＰ−膵臓ポリペプチド）
細胞に対する外分泌（例えば、アミラーゼ）細胞の比に影響を及ぼさないことを示唆した
。しかし、これらの研究は、Ｅ１２．５日目のマウスから得られたホールマウント器官組
織培養の上でニューレグリン−４をインキュベートすることによって実施された。これら
のマウス外植細胞集団は、本明細書に記載されるステージ３（例えばＰＤＸ１陰性前腸内
胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞集団よりさらに分化し
ていた。ニューレグリン−４はＥＲＢＢ４ ＲＴＫだけに結合するので、ホールマウント
マウス培養物の内分泌亜集団だけをこの関係においてニューレグリン−４によってモジュ
レートすることができる。したがって、Ｈｒｇ１はＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２／３
の二量体化を誘導することが既に示されているので、本明細書に記載されるように、異な
るＥＲＢＢリガンド、例えばＨｒｇ１によるステージ３（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）およ
び／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞の処置が、Ｈｕｏｔａｒｉにおけ
るように相対的な内分泌亜集団をモジュレートするとは予想され得ない。しかし、図６に
示すようにＰＥＣでのＥＲＢＢ２および３の低レベルの発現のために、ステージ３および
４型の細胞が低いレベルか高いレベルのＥＲＢＢ２および３を発現してＨｒｇ１に結合す
るかどうかは不明であった。 Huottari et al. Found that neuregulin-4 can modulate relative levels of endocrine cell subpopulations by increasing the number of somatostatin (delta) cells at the expense of glucagon (alpha) cells, and neuregulin-4. Is endocrine (eg, β-insulin, α-glucagon, δ-somatostatin, PP-pancreatic polypeptide)
It was suggested that it does not affect the ratio of exocrine (eg, amylase) cells to cells. However, these studies were performed by incubating neuregulin-4 on whole mount organ tissue cultures obtained from day E12.5 mice. These mouse explanted cell populations were further differentiated from the stage 3 (eg, PDX1-negative foregut endoderm) and / or stage 4 (PDX1-positive foregut endoderm) cell populations described herein. Since neuregulin-4 binds only to ERBB4 RTK, only the endocrine subpopulation of whole-mounted mouse cultures can be modulated by neuregulin-4 in this relationship. Therefore, Hrg1 binds to ERBB3 and ERBB2 / 3
Since it has already been shown to induce dimerization of, as described herein, stage 3 (PDX1-negative foregut germ layer) and / or stage 4 (PDX1-negative foregut germ layer) and / or stage 4 with different ERBB ligands, such as Hrg1. Treatment of PDX1-positive foregut endoderm cells) cannot be expected to modulate the relative endocrine subpopulation as in Huottari. However, due to the low level expression of ERBB2 and 3 in PEC as shown in FIG. 6, whether stage 3 and type 4 cells express low or high levels of ERBB2 and 3 and bind to Hrg1. Was unknown.

さらに、異なる場面で、出願人はＨｒｇ１がＥＲＲＢ２／３に結合して、多能性幹細胞
の自己複製を促進したことを記載していた（Ｗａｎｇら（２００７）を参照する）。Ｈｒ
ｇ１がステージ３および４の場面で同じ能力で作用することができる可能性があるが、出
願人はＰＥＣの生成のための大部分の細胞増大が多能性幹細胞ステージ（ステージ０）で
起こることを以前に記載した。ステージ０の間、ｈＥＳＣは約二（２）週の間成長、継代
および増殖させられる。したがって、細胞増殖または細胞増殖をもたらす自己複製のほと
んどは、ステージ１〜４の間には起こらない。上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）を参照さ
れたい。さらに、ＥＲＲＢ２／３がステージ３および４の間に存在すると仮定すると、誘
導される分化に影響を与えるのと反対に多能性幹細胞と同様の効果（自己複製）をヘレグ
リンが有すると予想し得る。そうすると、機能の差は、場面に、すなわち多能性幹細胞か
、内胚葉または膵臓系列の細胞型かに依存するようである。 Furthermore, in a different context, Applicants noted that Hrg1 bound to ERRB2 / 3 and promoted self-renewal of pluripotent stem cells (see Wang et al. (2007)). Hr
Although g1 may be able to act with the same ability in stage 3 and 4 scenes, applicants say that most cell growth for PEC production occurs at the pluripotent stem cell stage (stage 0). Was described earlier. During stage 0, hESCs are grown, passaged and propagated for about two (2) weeks. Therefore, most of the cell proliferation or self-renewal that results in cell proliferation does not occur between stages 1-4. See Schulz et al. (2012) above. Furthermore, assuming that ERRB2 / 3 is present between stages 3 and 4, it can be expected that hellegrin has the same effect (self-renewal) as pluripotent stem cells, as opposed to affecting induced differentiation. .. The difference in function then appears to depend on the context, ie, pluripotent stem cells or cell types of endoderm or pancreatic lineages.

要約すると、前腸内胚葉（ステージ３）およびＰＤＸ１発現膵臓内胚葉細胞（ステージ
３の終わりおよびステージ４）へのヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻
害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでの提供は、移植されたときにｉｎ ｖｉｖｏで成熟してグルコ
ース応答性インスリン分泌細胞に発達するＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生成した（図７お
よび８を参照する）。ヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のそのよ
うな使用は、ここで初めて報告された。そのような使用および影響は、特許または非特許
文献で前に記載されたものからは認識できない。 In summary, the in vitro provision of hellegrin or hellegrin and rho-kinase inhibitors to the anterior intestinal germ layer (stage 3) and PDX1-expressing pancreatic endoderm cells (end of stage 3 and stage 4) is upon implantation. We generated PEC and iPEC populations that matured in vivo and developed into glucose-responsive insulin-secreting cells (see Figures 7 and 8). Such use of hellegrin or hellegrin and rho-kinase inhibitors was reported for the first time here. Such uses and effects are not recognizable from those previously described in patented or non-patent literature.

本明細書に記載されるＱ−ＰＣＲ結果は免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってさらに確認す
ることができ、当業者が容易に実施することができることが理解される。 It is understood that the Q-PCR results described herein can be further confirmed by immunocytochemistry (ICC) and can be readily performed by those of skill in the art.

本明細書に記載される方法、組成物およびデバイスは、現在好ましい実施形態の代表で
あり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者は、本発明
の精神に包含され、開示の範囲によって規定される、それへの変更および他の使用を思い
つくであろう。したがって、本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で、様々な置換お
よび改変を本明細書に開示される本発明に加えることができることは、当業者には明らか
であろう。 The methods, compositions and devices described herein are representative and exemplary of currently preferred embodiments and are not intended to limit the scope of the invention. Those skilled in the art will come up with modifications and other uses to it that are embraced in the spirit of the invention and defined by the scope of disclosure. Therefore, it will be apparent to those skilled in the art that various substitutions and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the invention.

下の請求項およびこの開示全体において、語句「から事実上なる」は、語句の後に掲載
される任意の要素を含むことを意味し、掲載される要素について開示で特定される活性ま
たは作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句「から事実
上なる」は、掲載される要素は必要とされるか必須であるが、他の要素は任意選択であり
、掲載される要素の活性か作用にそれらが影響を及ぼすかどうかによって存在しても存在
しなくてもよいことを示す。さらに、数値、例えば量、濃度、百分率、割合または範囲が
列挙される実施形態では、言及される値は、「少なくとも約」その数値、「約」その数値
、または「少なくとも」その数値であってもよいことが理解される。 In the claims below and throughout this disclosure, the phrase "de facto from" means to include any element that appears after the phrase and interferes with the activity or action specified in the disclosure for the element that appears. Limited to other factors that do not or contribute. Therefore, the phrase "de facto from" means that the elements to be posted are required or mandatory, while the other elements are optional and do they affect the activity or action of the elements to be posted. Indicates that it may or may not exist depending on the situation. Further, in embodiments where numbers such as quantities, concentrations, percentages, percentages or ranges are listed, the values referred to are "at least about" that number, "about" that number, or "at least" that number. It is understood that it is also good.

実施形態
実施形態１．ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物。
実施形態２．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１に記載の細胞培
養物。
実施形態３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触して
いる、実施形態１または２に記載の細胞培養物。
実施形態４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因
子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因
子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒ
ｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３に記載の細
胞培養物。
実施形態５．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、
実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態６．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形
態５に記載の細胞培養物。
実施形態７．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態５に記載の細
胞培養物。
実施形態８．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態
１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態９．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態
１〜８のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１０．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性細胞である、実施形
態１〜９のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４であ
る、実施形態３に記載の細胞培養物。
実施形態１２．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態１〜１１のい
ずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１３．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１２に記載の細胞培養物。
実施形態１４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触し
ている、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ
阻害剤と接触している、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１６．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏ
キナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１７．ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉集団。
実施形態１８．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１７に記載の細
胞集団。
実施形態１９．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミン
グされた細胞である、実施形態１８に記載の細胞集団。
実施形態２０．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触し
ている、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長
因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長
因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅ
ｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態２０に記載
の細胞集団。
実施形態２２．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む
、実施形態１７〜２１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２３．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施
形態２２に記載の細胞集団。
実施形態２４．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態２２に記載
の細胞集団。
実施形態２５．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形
態１７〜２４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２６．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形
態１７〜２５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２７．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１
７〜２６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４であ
る、実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２９．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態
１７〜２８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３０．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態２９に記載の細胞集団。
実施形態３１．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦ
ＧＦと接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３２．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒ
ｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集
団。
実施形態３３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦ
およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜２０のいずれか１つに記載
の細胞集団。
実施形態３４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触しているヒト膵
臓内胚葉細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団。
実施形態３５．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態３４に記載の細
胞集団。
実施形態３６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミン
グされた細胞である、実施形態３５に記載の細胞集団。
実施形態３７．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長
因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長
因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅ
ｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３４〜３６
のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３８．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む
、実施形態３４〜３７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３９．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施
形態３８に記載の細胞集団。
実施形態４０．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態３８に記載
の細胞集団。
実施形態４１．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形
態３４〜４０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４２．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形
態３４〜４１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４３．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態３
４〜４２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４であ
る、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４５．ヒト膵臓内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、
実施形態３４〜４４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態４５に記載の細胞集団。
実施形態４７．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質
およびＦＧＦと接触している、実施形態３４〜４６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４８．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質
およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４７のいずれか１つに記載
の細胞集団。
実施形態４９．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質
、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４８のいずれか１
つに記載の細胞集団。
実施形態５０．インスリンを生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、そ
れにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の膵臓内胚葉をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりイ
ンスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答
してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５１．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞を
ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ、それに
より、内分泌および非内分泌亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインス
リン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答して
インスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．膵臓内胚葉細胞をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌
細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリ
ンを分泌するステップ
を含む方法。
実施形態５３．膵臓内胚葉細胞が前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活
性化作用物質と接触させることによって作製される、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長
因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長
因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅ
ｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態５０〜５２
および５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．前腸内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）とさらに接触している
、実施形態５０〜５２および５３〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触している、実施形
態５０〜５２および５３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦとさらに接触して
いる、実施形態５０〜５２および５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２
Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸
、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのド
ミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、
実施形態５７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２
Ｐ、Ｗｆ−５３６およびＹ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される
、実施形態５７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジルおよびＨ−１１
５２Ｐ、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜６０のいずれ
か１つに記載の方法。
実施形態６２．膵臓内胚葉が内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む、実施形態５０に
記載の方法。
実施形態６３．内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態
６２に記載の方法。
実施形態６４．非内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）である、実施形態６
２に記載の方法。
実施形態６５．非内分泌細胞亜集団がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態６２に記載の
方法。
実施形態６６．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態５０に
記載の方法。
実施形態６７．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態５０に
記載の方法。
実施形態６８．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメ
ンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップ
と、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステ
ップ（ａ）の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するス
テップと、
ｃ．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触
させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップ
と、
ｄ．（ｃ）の細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分
泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインス
リンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態６９．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態６８
に記載の方法。
実施形態７０．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態６８〜
６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態
６９に記載の方法。
実施形態７２．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形
態６９に記載の方法。
実施形態７３．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態６９に記載の
方法。
実施形態７４．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触さ
せる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２
Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸
、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのド
ミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、
実施形態７２〜７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．内分泌細胞と比較して膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増
加させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それに
より膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増加させるステップを含む方法。
実施形態７７．前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形態７６に
記載の方法。
実施形態７９．前腸内胚葉細胞をＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触させ
る、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８０．移植された膵臓内胚葉のグルコース応答性を向上させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それに
より膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
膵臓内胚葉をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得
るステップであって、インスリン分泌細胞が、前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナー
ゼ受容体活性化作用物質と接触させることなく作製した膵臓内胚葉から導出されたインス
リン分泌細胞よりもよくインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態８１．膵臓内胚葉細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から
導出される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．インスリンを生成する方法であって、（ａ）生細胞をＥＲＢＢチロシン
キナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）ステップａの最後に細胞
を移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリ
ン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態８３．生細胞が前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉である、実施形態８
２に記載の方法。
実施形態８４．生細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出され
る、実施形態８２〜８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団。
実施形態８６．内分泌および非内分泌細胞亜集団が多能性細胞から導出される、実施形
態８５に記載の細胞集団。
実施形態８７．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミン
グされた細胞である、実施形態８６に記載の細胞集団。
実施形態８８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長
因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長
因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅ
ｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態８５〜８７
のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態８９．非内分泌細胞はＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施
形態８５〜８８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９０．内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態８５〜８９のいずれか１つ
に記載の細胞集団。
実施形態９１．細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態８５〜９
０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９２．細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態８５〜９１の
いずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９３．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４であ
る、実施形態８５〜９２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９４．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態
８５〜９３のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９５．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態９４に記載の細胞集団。
実施形態９６．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦ
ＧＦと接触している、実施形態８５〜９５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９７．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒ
ｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９６のいずれか１つに記載の細胞集
団。
実施形態９８．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦ
およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９７のいずれか１つに記載
の細胞集団。
実施形態９９．インスリンを生成する方法であって、（ａ）脱分化した遺伝的にリプロ
グラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含
む第１の培地とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミ
リーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉または少なくともＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受
容体活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細
胞集団を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟
させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグ
ルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態１００．インスリンを生成する方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陽性細胞をＥＲ
ＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）の細
胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステ
ップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するス
テップとを含む方法。
実施形態１０１．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂまたはｃで加えられる、実施
形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂおよびｃで加えられる、実施
形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０３．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａおよびｂで加えられる、実施形態
６８または９９〜１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａまたは
ｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａおよび
ｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０６．ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟するこ
とが可能な細胞集団を生成する方法であって、少なくとも前腸内胚葉、少なくともＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉の集団、または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を、ＥＲ
ＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏで
グルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成するステッ
プを含む方法。
実施形態１０７．膵臓内胚葉を生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、そ
れにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップ
を含む方法。
実施形態１０８．前腸内胚葉細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることを
さらに含む、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含
む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触させるこ
とをさらに含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１２．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態１０
７〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１０
７〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．前腸内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態５０、７６、
１０７〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミ
ングされた細胞である、実施形態５０、７６、１０７〜１１４のいずれか１つに記載の方
法。
実施形態１１６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミ
ングされた細胞である、実施形態１に記載の細胞培養物。
実施形態１１７．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化
した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏヒト膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１８．ＥＲＲＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質がＥＧＦ成長因子ま
たはリガンドを含む、実施形態１１７に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１９．ＥＧＦ成長因子またはリガンドが、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２
およびヘレグリン−３およびヘレグリン−４からなる群から選択されるヘレグリンアイソ
フォームを含む、実施形態１１８に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２０．ヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−１およびヘレグリン−４を
含む、実施形態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２１．リガンドヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−４を含む、実施形
態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞培
養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ、
それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと
、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌
細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリ
ンを分泌する、ステップと
を含む方法。
実施形態１２３．前腸内胚葉細胞培養物をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさ
らに含む、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５
２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核
酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミ
ナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群か
ら選択される、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５
２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、
実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２６．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５
２Ｐおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメ
ンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップ
と、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステ
ップ（ａ）の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するス
テップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物
質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成
するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン
分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してイン
スリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態１２８．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態１
２７に記載の方法。
実施形態１２９．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態１２
７に記載の方法。
実施形態１３０．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１をさらに発現する、
実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含
む、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５
２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核
酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミ
ナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群か
ら選択される、実施形態１３１に記載の方法。 Embodiment 1. In vitro human pancreatic endoderm cell culture.
Embodiment 2. The cell culture according to embodiment 1, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 3. The cell culture according to embodiment 1 or 2, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator.
Embodiment 4. ERBB tyrosine kinase receptor activator is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), Er
The cell culture according to embodiment 3, which is eg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 5. Pancreatic endoderm cells include pancreatic progenitor cells and multihormonal endocrine cells,
The cell culture according to any one of embodiments 1 to 4.
Embodiment 6. The cell culture according to embodiment 5, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 7. The cell culture according to embodiment 5, wherein the multihormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 8. The cell culture according to any one of embodiments 1 to 4, wherein the pancreatic endoderm cells contain CHGA-positive and CHGA-negative cells.
Embodiment 9. The cell culture according to any one of embodiments 1-8, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm cells are CHGA-negative cells.
Embodiment 10. The cell culture according to any one of embodiments 1-9, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm cells are PDX1-positive cells.
Embodiment 11. The cell culture according to embodiment 3, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is hellegrin-4.
Embodiment 12. The cell culture according to any one of embodiments 1-11, which is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 13. The cell culture according to embodiment 12, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 14. The cell culture according to any one of embodiments 1 to 13, which is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator and FGF.
Embodiment 15. The cell culture according to any one of embodiments 1 to 15, which is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator and a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 16. ERBB Tyrosine Kinase Receptor Activator, FGF and rho
The cell culture according to any one of embodiments 1-16, which is in contact with a kinase inhibitor.
Embodiment 17. in vitro human pancreatic germ layer population.
Embodiment 18. The cell population according to embodiment 17, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 19. The cell population according to embodiment 18, wherein the pluripotent cell is a human embryonic stem cell or a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell.
20. The cell population according to any one of embodiments 17-19, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator.
21. ERBB tyrosine kinase receptor activator is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), E
The cell population according to embodiment 20, which is reg (epiregulin), neuregulin or hellegulin.
Embodiment 22. The cell population according to any one of embodiments 17-21, wherein the pancreatic endocrine cells include pancreatic progenitor cells and multihormonal endocrine cells.
23. The cell population according to embodiment 22, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 24. The cell population according to embodiment 22, wherein the multihormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 25. The cell population according to any one of embodiments 17 to 24, wherein the pancreatic endoderm cells include CHGA-positive and CHGA-negative cells.
Embodiment 26. The cell population according to any one of embodiments 17-25, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm cells are CHGA-negative cells.
Embodiment 27. Embodiment 1 where at least 50% of pancreatic endoderm cells are PDX1 positive
The cell population according to any one of 7 to 26.
Embodiment 28. The cell population according to embodiment 20, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is hellegrin-4.
Embodiment 29. The cell population according to any one of embodiments 17-28, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
30. 29. The cell population according to embodiment 29, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 31. Cell cultures include ERBB tyrosine kinase receptor activator and F
The cell population according to any one of embodiments 17 to 30, which is in contact with GF.
Embodiment 32. Cell cultures include ERBB tyrosine kinase receptor activator and r
The cell population according to any one of embodiments 17-30, which is in contact with a ho kinase inhibitor.
Embodiment 33. Cell culture is an ERBB tyrosine kinase receptor activator, FGF
And the cell population of any one of embodiments 17-20, which is in contact with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 34. An in vitro cell population containing human pancreatic endoderm cells in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator.
Embodiment 35. The cell population according to embodiment 34, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 36. The cell population according to embodiment 35, wherein the pluripotent cell is a human embryonic stem cell or a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell.
Embodiment 37. ERBB tyrosine kinase receptor activator is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), E
Embodiments 34-36, which are reg (epiregulin), epiregulin or heregulin.
The cell population according to any one of.
Embodiment 38. The cell population according to any one of embodiments 34-37, wherein the pancreatic endocrine cells comprises pancreatic progenitor cells and multihormonal endocrine cells.
Embodiment 39. The cell population according to embodiment 38, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX 6.1 but not CHGA.
Embodiment 40. The cell population according to embodiment 38, wherein the multihormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 41. The cell population according to any one of embodiments 34-40, wherein the pancreatic endoderm cells comprise CHGA-positive and CHGA-negative cells.
Embodiment 42. The cell population according to any one of embodiments 34-41, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm cells are CHGA-negative cells.
Embodiment 43. Embodiment 3 where at least 50% of pancreatic endoderm cells are PDX1 positive
The cell population according to any one of 4 to 42.
Embodiment 44. The cell population according to any one of embodiments 34 to 36, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is hellegrin-4.
Embodiment 45. Human pancreatic endoderm cells are in contact with fibroblast growth factor (FGF),
The cell population according to any one of embodiments 34 to 44.
Embodiment 46. The cell population according to embodiment 45, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 47. The cell population according to any one of embodiments 34-46, wherein human pancreatic endoderm cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator and FGF.
Embodiment 48. The cell population according to any one of embodiments 34-47, wherein human pancreatic endoderm cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator and a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 49. Any one of embodiments 34-48, wherein human pancreatic endoderm cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, FGF and rho-kinase inhibitor.
The cell population described in one.
Embodiment 50. A method of producing insulin
a. A step of contacting foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby generating a cell population containing pancreatic endoderm.
b. A method comprising step (a), in which the pancreatic endoplasmic reticulum is transplanted in vivo and matured to obtain insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 51. A method of producing insulin
a. Progenital endoderm cells derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells are contacted in vitro with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby including endocrine and non-endocrine subpopulations. And the steps to generate
b. A method comprising the step of transplanting and maturing the subpopulation in vivo in step (a) to obtain insulin secreting cells, wherein the insulin secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 52. A method of producing insulin
a. A method in which pancreatic endoplasmic cells are transplanted in vivo and matured to obtain insulin-secreting cells, which comprises the step of insulin-secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 53. 52. The method of embodiment 52, wherein the pancreatic endoderm cells are made by contacting the foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator.
Embodiment 54. ERBB tyrosine kinase receptor activator is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), E
Embodiments 50-52, which are reg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
And 53, the method according to any one of 53.
Embodiment 55. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-54, wherein the foregut endoderm cells are in further contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 56. 55. The method of embodiment 55, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 57. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-56, wherein the foregut endoderm cells are in further contact with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 58. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-57, wherein the foregut endoderm cells are in further contact with a rho-kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 59. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152
From the group consisting of antisense nucleic acids of P, Wf-536, Y-30141, ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids, competitive peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-ScFV fragments, their dominant negative variants, derivatives and expression vectors. Selected,
The method according to any one of embodiments 57-58.
Embodiment 60. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152
The method according to any one of embodiments 57-59, selected from the group consisting of P, Wf-536 and Y-30141 and derivatives thereof.
Embodiment 61. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil and H-11.
The method according to any one of embodiments 57-60, selected from the group consisting of 52P and its derivatives.
Embodiment 62. 50. The method of embodiment 50, wherein the pancreatic endoderm comprises an endocrine and non-endocrine cell subpopulation.
Embodiment 63. 62. The method of embodiment 62, wherein the endocrine cell subpopulation is CHGA-positive (CHGA +) cells.
Embodiment 64. Embodiment 6 where the non-endocrine cell subpopulation is CHGA negative (CHGA-)
The method according to 2.
Embodiment 65. 62. The method of embodiment 62, wherein the non-endocrine cell subpopulation expresses NKX 6.1.
Embodiment 66. The method of embodiment 50, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm is CHGA negative.
Embodiment 67. The method of embodiment 50, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm is PDX1 positive.
Embodiment 68. A method of producing insulin
a. In vitro contact of dedifferentiated, genetically reprogrammed cells with a first medium containing an agent that activates TGFβ receptor family members,
b. In vitro culturing the cells of step (a) in a second medium lacking an agent that activates TGFβ receptor family members, thereby producing foregut endoderm cells.
c. The step of contacting the foregut endoderm cells of (b) with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby generating a cell population containing endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
d. (C) A method comprising the step of in vivo transplantation and maturation of a cell population to obtain insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 69. Embodiment 68, where the non-endocrine cells are CHGA-negative (CHGA-) cells
The method described in.
Embodiment 70. Embodiment 68-where the endocrine cells are CHGA-positive (CHGA +) cells
The method according to any one of 69.
Embodiment 71. The method of embodiment 69, wherein the CHGA-negative (CHGA-) cells express NKX6.1.
Embodiment 72. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are contacted with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 73. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are brought into contact with FGF.
Embodiment 74. 69. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are contacted with a rho-kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 75. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152
From the group consisting of antisense nucleic acids of P, Wf-536, Y-30141, ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids, competitive peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-ScFV fragments, their dominant negative variants, derivatives and expression vectors. Selected,
The method according to any one of embodiments 72 to 74.
Embodiment 76. A method of increasing the proportion of non-endocrine cells in the pancreatic endoderm cell population compared to endocrine cells.
A method comprising contacting anterior endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby increasing the proportion of non-endocrine cells in the pancreatic endoderm cell population.
Embodiment 77. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are brought into contact with FGF.
Embodiment 78. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are contacted with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 79. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are further contacted with a FGF and rho-kinase inhibitor.
80. A method of improving the glucose responsiveness of transplanted pancreatic endoderm.
A step of contacting foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby generating a cell population containing pancreatic endoderm.
The step of in vivo transplantation and maturation of the pancreatic endoplasmic reticulum to obtain insulin-secreting cells, without the insulin-secreting cells contacting the progenitor endoblast cells with the ERBB tyrosine kinase receptor activator. A method comprising the step of secreting insulin better than the insulin secreting cells derived from the pancreatic endoplasmic reticulum produced.
Embodiment 81. 80. The method of embodiment 80, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells.
Embodiment 82. A method of producing insulin: (a) contacting live cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator and (b) at the end of step a, the cells are transplanted and matured, thereby secreting insulin. A method comprising the step of obtaining cells, wherein the insulin-secreting cell secretes insulin in response to a glucose stimulus.
Embodiment 83. Embodiment 8 where the living cells are foregut endoderm or PDX1-negative foregut endoderm
The method according to 2.
Embodiment 84. The method according to any one of embodiments 82-83, wherein the living cells are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells.
Embodiment 85. A cell population that includes endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
Embodiment 86. The cell population according to embodiment 85, wherein the endocrine and non-endocrine cell subpopulations are derived from pluripotent cells.
Embodiment 87. The cell population according to embodiment 86, wherein the pluripotent cell is a human embryonic stem cell or a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell.
Embodiment 88. ERBB tyrosine kinase receptor activator is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), E
Embodiments 85-87, which are reg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
The cell population according to any one of.
Embodiment 89. The cell population according to any one of embodiments 85-88, wherein the non-endocrine cells express NKX 6.1 but not CHGA.
Embodiment 90. The cell population according to any one of embodiments 85-89, wherein the endocrine cells express CHGA.
Embodiment 91. At least 30% of the cells are CHGA negative cells, embodiments 85-9
The cell population according to any one of 0.
Embodiment 92. The cell population according to any one of embodiments 85-91, wherein at least 50% of the cells are PDX1 positive.
Embodiment 93. The cell population according to any one of embodiments 85-92, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is hellegrin-4.
Embodiment 94. The cell population according to any one of embodiments 85-93, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 95. The cell population according to embodiment 94, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 96. Cell cultures include ERBB tyrosine kinase receptor activator and F
The cell population according to any one of embodiments 85-95, which is in contact with GF.
Embodiment 97. Cell cultures include ERBB tyrosine kinase receptor activator and r
The cell population according to any one of embodiments 85-96, which is in contact with a ho kinase inhibitor.
Embodiment 98. Cell culture is an ERBB tyrosine kinase receptor activator, FGF
And the cell population according to any one of embodiments 85-97 that are in contact with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 99. A method of producing insulin, the step of (a) in vitro contacting dedifferentiated, genetically reprogrammed cells with a first medium containing an agent that activates TGFβ receptor family members. , (B) In vitro cells of step (a) in a second medium lacking an agent that activates TGFβ receptor family members.
The steps of culturing in itro to generate at least anterior endometrial or at least PDX1-negative anterior endometrial cells and the cells of (c) and (b) were contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activator. Thereby, a step of generating a cell population including an endocrine and non-endocrine cell subpopulation and a step of transplanting and maturing the cell population of (d) and (c) in vivo, thereby obtaining insulin secretory cells. A method comprising the steps of insulin secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 100. A method of producing insulin, in which (a) PDX1-positive cells are ER
The step of contacting with a BB tyrosine kinase receptor activator and the step of transplanting and maturing the cell population of (b) and (a) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells A method comprising the step of secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 101. The method of embodiment 68 or 99, wherein the rho-kinase inhibitor is added in steps a, b or c.
Embodiment 102. The method of embodiment 68 or 99, wherein the rho-kinase inhibitor is added in steps a, b and c.
Embodiment 103. The method of any one of embodiments 68 or 99-100, wherein the rho-kinase inhibitor is added in steps a and b.
Embodiment 104. 28. The method of embodiment 68 or 99, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in steps a or c.
Embodiment 105. 28. The method of embodiment 68 or 99, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in steps a and c.
Embodiment 106. A method of generating a cell population capable of maturing into glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo, at least foregut endoderm, at least PDX.
A population of 1-negative foregut endoderm, or at least a population of PDX1-positive pancreatic endoderm cells, ER
A method comprising contacting with a BB receptor tyrosine kinase activator, thereby producing a cell population capable of maturing into glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.
Embodiment 107. A method of producing pancreatic endoderm
a. A method comprising contacting foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activator, thereby generating a cell population containing pancreatic endoderm.
Embodiment 108. 10. The method of embodiment 107, further comprising contacting the foregut endoderm cells with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 109. The method of embodiment 108, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 110. The method of any one of embodiments 107-109, further comprising contacting the foregut endoderm cells with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 111. The method of any one of embodiments 107-109, further comprising contacting the foregut endoderm cells with a rho-kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 112. Embodiment 10: At least 30% of pancreatic endoderm is CHGA negative
The method according to any one of 7 to 111.
Embodiment 113. Embodiment 10: At least 50% of pancreatic endoderm is PDX1 positive
The method according to any one of 7 to 112.
Embodiment 114. Foregut endoderm cells are derived from pluripotent cells, embodiments 50, 76,
The method according to any one of 107 to 113.
Embodiment 115. The method according to any one of embodiments 50, 76, 107-114, wherein the pluripotent cell is a human embryonic stem cell or a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell.
Embodiment 116. The cell culture according to embodiment 1, wherein the pluripotent cell is a human embryonic stem cell or a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell.
Embodiment 117. In vitro containing differentiated cells derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells and ERBB receptor tyrosine kinase activator
o Human pancreatic endoderm cell population.
Embodiment 118. The pancreatic endoderm cell population according to embodiment 117, wherein the ERRB receptor tyrosine kinase activator comprises an EGF growth factor or ligand.
Embodiment 119. EGF growth factor or ligand is Helegrin-1, Helegrin-2
And the pancreatic endoderm cell population according to embodiment 118, comprising a heregrine isoform selected from the group consisting of heregrin-3 and heregrin-4.
Embodiment 120. The pancreatic endoderm cell population according to embodiment 119, wherein the hellegrin isoform comprises hellegrin-1 and hellegrin-4.
Embodiment 121. The pancreatic endoderm cell population according to embodiment 119, wherein the ligand hellegrin isoform comprises hellegrin-4.
Embodiment 122. A method of producing insulin
a. Progenitor endoderm cell cultures derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells were contacted in vitro with the ERBB receptor tyrosine kinase activator.
The step of generating a cell population, including endocrine and non-endocrine cell subpopulations,
b. A method comprising the step of maturing the subpopulation in vivo in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 123. 12. The method of embodiment 122, further comprising contacting the foregut endoderm cell culture with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 124. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-115
From 2P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acids, RNA interference-inducing nucleic acids, competitive peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-ScFV fragments, dominant negative variants, their derivatives and their expression vectors 123. The method of embodiment 123, selected from the group of
Embodiment 125. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-115
Selected from the group consisting of 2P, Wf-536, Y-30141 and their derivatives.
The method according to embodiment 123.
Embodiment 126. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-115
12. The method of embodiment 125, selected from the group consisting of 2P and derivatives thereof.
Embodiment 127. A method of producing insulin
a. In vitro contact of dedifferentiated, genetically reprogrammed cells with a first medium containing an agent that activates TGFβ receptor family members,
b. In vitro culturing the cells of step (a) in a second medium lacking an agent that activates TGFβ receptor family members, thereby producing foregut endoderm cells.
c. The step of contacting the foregut endoderm cells of step (b) with an ERBB receptor tyrosine kinase activator, thereby producing a cell population containing endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
d. (C) A method comprising the step of maturing the cell subpopulation in vivo and thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 128. Embodiment 1 where the non-endocrine cells are CHGA-negative (CHGA-) cells
27.
Embodiment 129. Embodiment 12 where the endocrine cells are CHGA positive (CHGA +) cells
The method according to 7.
Embodiment 130. CHGA-negative (CHGA-) cells further express NKX 6.1,
The method according to embodiment 127.
Embodiment 131. The method of embodiment 127, further comprising contacting the foregut endoderm cells with a rho-kinase inhibitor.
Embodiment 132. Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-115
From 2P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acids, RNA interference-inducing nucleic acids, competitive peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-ScFV fragments, dominant negative variants, their derivatives and their expression vectors 131. The method of embodiment 131, selected from the group of

Claims (16)

脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥ
ＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉
細胞集団。 Differentiated cells and E derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells
An in vitro human pancreatic endoderm cell population comprising an RBB receptor tyrosine kinase activator. ＥＲＲＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質がＥＧＦ成長因子またはリガンドを含
む、請求項１に記載の膵臓内胚葉細胞集団。 The pancreatic endoderm cell population according to claim 1, wherein the ERRB receptor tyrosine kinase activator comprises EGF growth factor or ligand. ＥＧＦ成長因子またはリガンドが、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２およびヘレグリン
−３およびヘレグリン−４からなる群から選択されるヘレグリンアイソフォームを含む、
請求項２に記載の膵臓内胚葉細胞集団。 The EGF growth factor or ligand comprises a hellegrin isoform selected from the group consisting of hellegrin-1, hellegrin-2 and hellegrin-3 and hellegrin-4.
The pancreatic endoderm cell population according to claim 2. ヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−１およびヘレグリン−４を含む、請求項３に
記載の膵臓内胚葉細胞集団。 The pancreatic endoderm cell population according to claim 3, wherein the hellegrin isoform comprises hellegrin-1 and hellegrin-4. リガンドヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−４を含む、請求項３に記載の膵臓内
胚葉細胞集団。 The pancreatic endoderm cell population according to claim 3, wherein the ligand hellegrin isoform comprises hellegrin-4. インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞培
養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ、
それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと
、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌
細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリ
ンを分泌するステップと
を含む方法。 A method of producing insulin
a. Progenitor endoderm cell cultures derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells were contacted in vitro with the ERBB receptor tyrosine kinase activator.
The step of generating a cell population, including endocrine and non-endocrine cell subpopulations,
b. A method comprising the step of maturing the subpopulation in vivo in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation. 前腸内胚葉細胞培養物をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項
６に記載の方法。 The method of claim 6, further comprising contacting the foregut endoderm cell culture with a rho-kinase inhibitor. ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３
６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチ
ド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブ
バリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、請
求項７に記載の方法。 Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152P, Wf-53
6. Select from the group consisting of Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference-inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment, dominant negative variant, their derivatives and their expression vectors. The method according to claim 7. ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３
６、Ｙ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７に記載の
方法。 Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152P, Wf-53
6. The method of claim 7, selected from the group consisting of Y-30141 and derivatives thereof. Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐおよびそれら
の誘導体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。 The method of claim 9, wherein the Rho-kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Faszil, H-1152P and derivatives thereof. インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメ
ンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップ
と、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステ
ップ（ａ）の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するス
テップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物
質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成
するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン
分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してイン
スリンを分泌するステップと
を含む方法。 A method of producing insulin
a. In vitro contact of dedifferentiated, genetically reprogrammed cells with a first medium containing an agent that activates TGFβ receptor family members,
b. In vitro culturing the cells of step (a) in a second medium lacking an agent that activates TGFβ receptor family members, thereby producing foregut endoderm cells.
c. The step of contacting the foregut endoderm cells of step (b) with an ERBB receptor tyrosine kinase activator, thereby producing a cell population containing endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
d. (C) A method comprising the step of maturing the cell subpopulation in vivo and thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation. 非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、請求項１１に記載の方法。 11. The method of claim 11, wherein the non-endocrine cells are CHGA-negative (CHGA-) cells. 内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、請求項１１に記載の方法。 11. The method of claim 11, wherein the endocrine cells are CHGA-positive (CHGA +) cells. ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１をさらに発現する、請求項１１に記載
の方法。 11. The method of claim 11, wherein CHGA-negative (CHGA-) cells further express NKX 6.1. 前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項１１に
記載の方法。 The method of claim 11, further comprising contacting the foregut endoderm cells with a rho-kinase inhibitor. ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３
６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチ
ド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブ
バリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、請
求項１５に記載の方法。 Rho-kinase inhibitors are Y-27632, Faszil, H-1152P, Wf-53
6. Select from the group consisting of Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference-inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment, dominant negative variant, their derivatives and their expression vectors. The method of claim 15.