JP6721752B2

JP6721752B2 - Cellular composition derived from dedifferentiated reprogrammed cells

Info

Publication number: JP6721752B2
Application number: JP2019078983A
Authority: JP
Inventors: アランディー．アグルニック、; オリビアケリー、; ユキオオイ; アランロビンス、; トーマスシュルツ、
Original assignee: ヴィアサイトインコーポレイテッド
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2020-07-15
Anticipated expiration: 2034-02-06
Also published as: JP2016506736A; IL239953B; RU2754089C2; IL283088A; CA2898431A1; RU2015131279A; HK1218139A1; AU2022200075A1; JP7250731B2; JP2023017838A; AU2022200075C1; JP2020178694A; AU2019201314B2; JP2019146578A; CA3212301A1; WO2014124172A1; CA2898431C; RU2018144412A3; AU2014214879A1; IL239953A0

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第１３／７６１，０７８号、表題ＣＥＬＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤＣＥＬＬＳの優先権を主張し、それは、２０１０年４月２２日に出願された米国特許出願第１２／７６５，７１４号、表題ＣＥＬＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤＣＥＬＬＳの一部継続出願であり、それは、米国特許法第１１９（ｅ）条の下で、２００９年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／１７１，７５９号、表題ＣＥＬＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤＣＥＬＬＳの優先権を主張する非仮出願であり、それらの開示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。 (Cross-reference of related applications)
This application claims priority to US patent application Ser. No. 13/761,078, filed February 6, 2013, entitled CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, which was filed on April 22, 2010. Is a continuation-in-part application of U.S. Patent Application No. 12/765,714, filed CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, under U.S.C. §119(e), Apr. 22, 2009. No. 61/171,759, filed No. 61/171,759, which is a nonprovisional application claiming priority to the title CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties. ..

配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１３年１月２８日に作成された、ＣＹＴＨＥＲＡ０６８Ｐ１．ＴＸＴという名称のサイズが８．９２Ｋｂのファイルで提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Sequence Listing This application has been filed with a Sequence Listing in electronic format. The sequence listing is CYTHERA068P1. A file named TXT is provided in a file of 8.92 Kb. Information in the electronic format of the sequence listing is fully incorporated herein by reference.

本発明は、一般に、細胞培養物の単離、維持および使用に関する。より具体的には、本発明は、人工多能性幹細胞から導出された細胞組成物に関する。 The present invention relates generally to cell culture isolation, maintenance and use. More specifically, the present invention relates to cell compositions derived from induced pluripotent stem cells.

多能性細胞の重要な用途は、細胞療法でのそれらの使用である。多能性幹細胞には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらに他のタイプの多能性細胞が存在し、例えば、脱分化したマウスおよびヒトの幹細胞、すなわち分化した体性成体細胞は脱分化して多能性様幹細胞になる。ＥＳ細胞に類似した多能性および成長能力を有する細胞を確立するために誘導されるこれらの脱分化した細胞は、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」、「胚性幹細胞様細胞」、「ＥＳ様細胞」またはそれらの同等物とも呼ばれる。そのような細胞は、潜在的に存続可能な代替多能性細胞である。ｉＰＳ細胞の治療的適用には、糖尿病および他の疾患を治療するための前臨床研究でこれらの細胞が安定であり、適当な安全性プロファイルを示すことを実証することが必要である。多能性状態への分化したヒト体性細胞のリプログラミングは、患者および疾患特異的幹細胞を可能にする。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．らＣｅｌｌ、１〜１２、２００７およびＪｕ，Ｊ．らＳｃｉｅｎｃｅ２００７を参照されたい。ＴａｋａｈａｓｈｉらおよびＪｕらは、ｉＰＳ細胞を生成するために４つの遺伝子を成体および胎児／新生児の線維芽細胞に各々導入した：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−ｍｙｃ、Ｔａｋａｈａｓｈｉら；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８、Ｊｕら。いずれの場合にも、ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳ細胞形態、マーカー発現、長期にわたる増殖、正常な核型および多能性などの、ｈＥＳ細胞の一部の特徴を有していた。 An important use of pluripotent cells is their use in cell therapy. Pluripotent stem cells include, but are not limited to, human embryonic stem (hES) cells, human embryonic germ (hEG) cells. Still other types of pluripotent cells exist, eg, dedifferentiated mouse and human stem cells, ie differentiated somatic adult cells, dedifferentiate into pluripotent-like stem cells. These dedifferentiated cells that are induced to establish cells with pluripotency and growth potential similar to ES cells include "induced pluripotent stem (iPS) cells", "embryonic stem cell-like cells", Also called "ES-like cells" or their equivalents. Such cells are potentially viable alternative pluripotent cells. The therapeutic application of iPS cells requires demonstrating that these cells are stable and exhibit a suitable safety profile in preclinical studies to treat diabetes and other diseases. Reprogramming of differentiated human somatic cells to a pluripotent state allows patient- and disease-specific stem cells. Takahashi, K.; Cell, 1-12, 2007 and Ju, J. et al. See Science 2007 et al. Takahashi et al. and Ju et al. introduced four genes into adult and fetal/neonatal fibroblasts, respectively, to generate iPS cells: Oct4, Sox2, Klf4 and c-myc, Takahashi et al.; Oct4, Sox2, Nanog. And Lin 28, Ju et al. In each case, iPS cells had some features of hES cells such as hES cell morphology, marker expression, long-term proliferation, normal karyotype and pluripotency.

ｉＰＳ細胞は関連する倫理論争なしで細胞療法に基づく再生医療を提供することができるが、ｉＰＳ細胞の分化特性、例えばｉｎｖｉｔｒｏでの分化潜在能力および分化効率はなお不明であり、ｉＰＳ細胞のための指向性分化方法は実証されていない。したがって、ｉＰＳ細胞の詳細な分化特性および指向性分化効率を判定し、実証する必要性がある。 Although iPS cells can provide regenerative medicine based on cell therapy without related ethical controversy, the differentiation characteristics of iPS cells, such as in vitro differentiation potential and efficiency, are still unknown and The directional differentiation method of is not demonstrated. Therefore, there is a need to determine and demonstrate the detailed differentiation characteristics and directional differentiation efficiency of iPS cells.

本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞、例えば人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの脱分化したリプログラミングされた細胞から導出された細胞組成物を提供する。 Embodiments described herein provide cell compositions derived from pluripotent cells, eg, dedifferentiated reprogrammed cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells.

一実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は胚体内胚葉細胞であり、胚体細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、胚体内胚葉細胞は、それから導出される腸管または器官の細胞に分化することができる多分化能細胞である。 One embodiment provides a method of making a composition comprising human cells and an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are definitive endoderm cells and the definitive somatic cells are dedifferentiated. Derived from the genetically reprogrammed cells. In one aspect, definitive endoderm cells are pluripotent cells capable of differentiating into cells of the intestinal tract or organ from which they are derived.

別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメオボックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の前腸内胚葉細胞であり、ＰＤＸ１陽性の前腸内胚葉細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ１陽性の前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６に関して共陽性である。 Another embodiment provides a method of making a composition comprising human cells and an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are pancreatic-duodenal homeobox factor 1 (PDX1) positive. Foregut endoderm cells, PDX1-positive foregut endoderm cells, are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX1-positive foregut endoderm cells are co-positive for PDX1, SOX9, PROX1 and HNF6.

さらなる実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメオボックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の膵臓前駆細胞であり、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して共陽性である。 A further embodiment provides a method of making a composition comprising human cells and an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are pancreas-duodenal homeobox factor 1 (PDX1) positive pancreas. Progenitor cells, PDX1-positive pancreatic progenitor cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX1-positive pancreatic progenitor cells are co-positive for PDX1 and NKX6.1.

さらなる別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３（ＮＧＮ３）陽性の内分泌先駆細胞であり、ＮＧＮ３内分泌先駆細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＮＧＮ３陽性の内分泌先駆細胞は、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４およびＮＫＸ２．２に関して共陽性である。
本明細書に記載される細胞培養組成物のさらなる実施形態は、脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物を含む。
本明細書に記載される追加の実施形態は、インスリンを生成する方法に関する。一部のそのような実施形態では、この方法は、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された少なくとも前腸内胚葉細胞培養物および／または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の膵臓内胚葉細胞集団またはステップ（ａ）の細胞亜集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップとを含む。
本明細書に記載されるさらなる他の実施形態は、インスリンを生成する方法であって、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎｖｉｔｒｏで接触させるステップと、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞集団またはステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップとを含む方法に関する。本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成することに関する。
本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させ、それにより、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成することに関する。
本明細書で使用される場合、語句「少なくとも前腸内胚葉細胞」、「少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」および「少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」は、細胞集団の細胞のいくつかまたは一部が、膵島細胞へのそれらの分化の中で、ｉＰＳＣから前腸内胚葉細胞またはそれ以上、ｉＰＳＣからＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞またはそれ以上、および／またはｉＰＳＣからＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞またはそれ以上に分化していることを意味する。
本明細書で使用される場合、細胞集団の細胞に言及するとき、語句「いくつか」および／または「一部」は、細胞集団が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％を超える指定された細胞型の細胞を含むことを意味する。 Yet another embodiment provides a method of making a composition comprising human cells and an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are Neurogenin 3 (NGN3) positive endocrine precursor cells. , NGN3 endocrine precursor cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, the NGN3 positive endocrine progenitor cells are co-positive for NGN3, PAX4 and NKX2.2.
A further embodiment of the cell culture composition described herein comprises in vitro a differentiated cell derived from a dedifferentiated genetically reprogrammed cell and an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent. Includes human pancreatic endoderm cell culture.
Additional embodiments described herein relate to methods of producing insulin. In some such embodiments, the method comprises (a) at least foregut endoderm cell cultures derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells and/or at least PDX1-negative foregut endoderm. Contacting the cell culture with an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent in vitro, thereby generating a pancreatic endoderm cell population comprising endocrine cells and non-endocrine cell subpopulations, and (b) step (a) ) The pancreatic endoderm cell population or the cell subpopulation of step (a) is transplanted and matured in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells respond to glucose stimulation with insulin. The step of secreting.
Yet another embodiment described herein is a method of producing insulin, comprising: (a) an agent that activates a dedifferentiated, genetically reprogrammed cell to a TGFβ receptor family member. Contacting in vitro with a first medium containing, and (b) culturing the cells of step (a) in vitro in a second medium lacking an agent that activates a TGFβ receptor family member, which comprises: Thereby producing at least foregut endoderm cells and/or at least PDX1-negative foregut endoderm cells, and (c) contacting the cells of step (b) with an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent, whereby Producing a cell population comprising an endocrine cell and a non-endocrine cell subpopulation, and (d) transplanting and maturing the cell population of step (c) or the cell subpopulation of step (c) in vivo, thereby Obtaining insulin secreting cells, the insulin secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation. Yet another embodiment described herein provides a population comprising at least foregut endoderm cells, at least PDX1-negative foregut endoderm cells, and/or at least PDX1-positive pancreatic endoderm cells with ERBB receptor tyrosine kinase activity. It relates to contacting with a chemotherapeutic agent, thereby producing a cell population capable of maturing in vivo into glucose-responsive insulin secreting cells.
Yet another embodiment described herein provides a population comprising at least foregut endoderm cells, at least PDX1-negative foregut endoderm cells, and/or at least PDX1-positive pancreatic endoderm cells with ERBB receptor tyrosine kinase activity. It relates to contacting a chemotherapeutic agent and a rho kinase inhibitor, thereby producing a cell population capable of maturing in vivo to glucose-responsive insulin secreting cells.
As used herein, the phrases "at least foregut endoderm cells", "at least PDX1-negative foregut endoderm cells" and "at least PDX1-positive pancreatic endoderm cells" refer to any or one of the cells of a cell population. In their differentiation into islet cells, iPSC to foregut endoderm cells or higher, iPSC to PDX1-negative foregut endoderm cells or higher, and/or iPSC to PDX1-positive pancreatic endoderm cells or It means that it is further differentiated.
As used herein, the phrase “some” and/or “part” when referring to cells of a cell population refers to at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20% of the cell population. %, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, It is meant to include at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least more than 95% of the specified cell types.

脱分化したリプログラミングされた細胞、または本明細書でｉＰＳ細胞とも呼ばれる細胞の凝集懸濁培養の写真画像である。Figure 9 is a photographic image of a dedifferentiated reprogrammed cell, or an aggregated suspension culture of cells, also referred to herein as iPS cells.

ＯＣＴ４（図２Ａ）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（図２Ｂ）、ＣＥＲ１（図２Ｃ）、ＧＳＣ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ１（図２Ｆ）、ＨＮＦ６（図２Ｇ）、ＰＤＸ１（図２Ｈ）、ＰＴＦ１Ａ（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）、ＮＧＮ３（図２Ｋ）およびＩＮＳ（図２Ｌ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに標準化される。グラフは、データセット中の最も低いデータポイントからの上方制御倍率を表す。OCT4 (FIG. 2A), BRACHYURY (FIG. 2B), CER1 (FIG. 2C), GSC (FIG. 2D), FOXA2 (FIG. 2E), FOXA1 (FIG. 2F), HNF6 (FIG. 2G), PDX1 (FIG. 2H), PTF1A ( 2I), NKX6.1 (FIG. 2J), NGN3 (FIG. 2K) and INS (FIG. 2L) are bar graphs showing relative gene expression levels. Expression levels are normalized to the average expression level of housekeeping gene, cyclophilin G and TATA binding protein (TBP) expression. The graph represents the up-control fold from the lowest data point in the data set.

（３Ａ）ＰＤＸ−１；（３Ｂ）ＮＫＸ６．１；（３Ｃ）ＰＴＦ１Ａ；および（３Ｄ）Ｄａｐｉに特異的な抗体を使用したステージ４分化からのヒトｉＰＳ細胞培養物の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の顕微鏡写真である。Immunocytochemistry (ICC) of human iPS cell cultures from stage 4 differentiation using antibodies specific for (3A)PDX-1; (3B)NKX6.1; (3C)PTF1A; and (3D)Dapi. It is a micrograph.

（図４Ａ）グルカゴン、（図４Ｂ）インスリン、（図４Ｃ）ソマトスタチンおよび（図４Ｄ）Ｄａｐｉに特異的なリガンドを使用した、ステージ４分化からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の写真である。(FIG. 4A) Immunocytochemistry (ICC) of iPS cell cultures from stage 4 differentiation using ligands specific for glucagon, (FIG. 4B) insulin, (FIG. 4C) somatostatin and (FIG. 4D) Dapi. is there. Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイで提供されるアレイ位置図およびアレイキーを示す図である。図５Ａの位置図は、ＲＴＫ抗体の座標または位置を示す。ＲＴＫファミリーおよび抗体のアイデンティティまたは名前は、図５Ｂのキーに記載される。したがって、現像したフィルムで観察される陽性シグナルは、図５Ａのように透明画をオーバレイし、図５ＢのＲＴＫの名前でオーバレイ（図５Ａ）の上の座標を参照することによってシグナルを同定することによって、同定することができる。FIG. 9 shows array location diagrams and array keys provided with the Proteome Profiler™ Human Phospho RTK Antibody Array from R&D Systems. The location map of FIG. 5A shows the coordinates or location of the RTK antibody. The RTK family and antibody identities or names are listed in the key of Figure 5B. Therefore, the positive signal observed in the developed film is to identify the signal by overlaying the transparency as in FIG. 5A and referencing the coordinates above the overlay (FIG. 5A) by the name RTK in FIG. 5B. Can be identified by ４つの異なる条件（実施例５に記載されるように、図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）下のｉＰＳ細胞導出膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）のＲＴＫアレイ分析を示す図である。特定のＲＴＫのチロシンリン酸化が、高強度から低強度のシグナルの同定によって観察される。ＩＧＦ１Ｒ／ＩＲおよびＥＲＢＢ（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーが同定されるか、四角で囲まれる。FIG. 8 shows RTK array analysis of iPS cell-derived pancreatic endoderm cells (PEC) under four different conditions (FIGS. A, B, C and D as described in Example 5). Tyrosine phosphorylation of specific RTKs is observed by the identification of high to low intensity signals. IGF 1R/IR and ERBB (EGFR) family members have been identified or boxed. 表９に示すように、実験Ｅ２３１４、Ｅ２３５６およびＥ２３８０（図７Ａ）、Ｅ２３４７（図７Ｂ）ならびにＥ２３５４（図７Ｃ）の移植されたマウスの血清中のヒトＣペプチドおよびインスリンの濃度を示すグラフである。空腹時、ならびに腹腔内グルコース投与の３０分および６０分後に、ヒトＣペプチドの血清レベルについてＰＥＣを移植したマウスを指示された移植後時点で分析した。図７Ｃで、細胞封入デバイス（Ｅｎｃａｐｔｒａ（登録商標）ＥＮ２０またはＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）でＰＥＣを封入し、一部の場合には、デバイスは微穿孔を有した（ｐＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）。そのようなデバイスは、米国特許第８，２７８，１０６号に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。As shown in Table 9, there is a graph showing the concentration of human C-peptide and insulin in the serum of transplanted mice of experiments E2314, E2356 and E2380 (Fig. 7A), E2347 (Fig. 7B) and E2354 (Fig. 7C). .. Mice transplanted with PEC were analyzed for serum levels of human C-peptide at fasting and 30 and 60 minutes after ip glucose administration at the indicated post-implantation time points. In FIG. 7C, PEC was encapsulated with a cell encapsulation device (Encaptra® EN20 or EN20, ViaCyte, San Diego, CA), and in some cases the device had microperforations (pEN20, ViaCyte, San. Diego, CA). Such a device is described in US Pat. No. 8,278,106, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. 実験＃２３４７のＳＴＺ処置マウスの血中グルコース分析の結果を示すグラフである。図８Ａは、１３匹の各マウスの血中グルコースを示し（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）、図８Ｂは、各処置の合わせた平均測定値を示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。ＳＴＺによる処置（０日目）の最大１４日前までにｉＰＥＣ移植片を移植した１３匹のマウスについて、同じマウスについてＳＴＺ処置の後、および移植片を外植した後の、ランダムな非絶食血中グルコースレベルの測定値を示す。ＳＴＺ処置動物は、移植片の移植から約２６週後にＳＴＺを与えられた（０日目）。移植片移植から２８週後、ＳＴＺ処置の開始からおよそ２週後に、ｉＰＥＣ移植片を外植した（取り出した）。各動物につき、非絶食血中グルコース測定値を経時的に収集した。FIG. 9 is a graph showing the results of blood glucose analysis of STZ-treated mice of Experiment #2347. FIG. 8A shows blood glucose of each of the 13 mice (baseline with and without heregulin), and FIG. 8B shows the combined mean measurements of each treatment (baseline with and without heregulin). Random, non-fasted blood in 13 mice transplanted with iPEC grafts up to 14 days before treatment with STZ (day 0), after STZ treatment on the same mice and after explantation of the grafts. The measured glucose level is shown. STZ-treated animals received STZ approximately 26 weeks after graft implantation (day 0). Grafts 28 weeks after transplantation, approximately 2 weeks after the start of STZ treatment, iPEC grafts were explanted (removed). Non-fasting blood glucose measurements were collected over time for each animal.

本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の詳細な説明を参照することによって容易に理解することができる。しかし、本化合物、組成物、および方法の開示および記載の前に、本発明は、特定の細胞型、特定のフィーダー細胞層、特定の条件、または特定の方法などに限定されず、それ自体変わり得ることが理解されるべきである。多数の改変および変形が当業者には明らかであろう。本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。 The present invention can be readily understood by reference to the following detailed description of the preferred embodiments and examples of the invention contained herein. However, prior to disclosing and describing the present compounds, compositions, and methods, the present invention is not limited to particular cell types, particular feeder cell layers, particular conditions, or particular methods, etc., as such may vary. It should be understood that you get. Many modifications and variations will be apparent to those of ordinary skill in the art. It should also be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not limiting.

定義
本明細書で表される数値範囲は、記載されている終点を含み、示された数値範囲の終点間の全ての整数を記載するものであることが理解されよう。 Definitions It will be understood that the numerical ranges expressed herein are inclusive of the stated endpoints and describe all integers between the endpoints of the stated numerical ranges.

特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、別段に特定されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の分量、材料の百分率または割合、反応条件を表す数、および他の数値は全て、全ての場合に「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反する指示がない限り、以下の明細書および添付されている特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られるべき所望の性質に応じて変動し得る近似値である。最低限、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告されている有意な桁数に照らして、および通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。 Unless otherwise noted, terms used herein are understood according to conventional usage by those of ordinary skill in the art. Also, for the purposes of the specification and the appended claims, unless otherwise specified, represent the amounts of components, percentages or proportions of materials, reaction conditions used in the specification and claims. It should be understood that all numbers and other numerical values are modified in all cases by the term "about". Accordingly, unless indicated to the contrary, the numerical parameters set forth in the following specification and appended claims are approximations that may vary depending on the desired properties to be obtained by the present invention. .. At a minimum, and without intending to limit the application of the doctrine of equivalents to the claims, each numerical parameter is applied, at least in light of the number of significant digits reported, and by conventional rounding techniques. Should be interpreted by

本明細書に記載の実施形態の実施には、別段に特定されていない限り、細胞生物学、分子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が使用される。 The practice of the embodiments described herein employs conventional techniques of cell biology, molecular biology, genetics, chemistry, microbiology, recombinant DNA, and immunology, unless otherwise specified. To be done.

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることを理解するべきである。したがって、例えば、「細胞」への言及には１つまたは複数のそのような異なる細胞が含まれ、「方法」への言及には、本明細書に記載される方法に代えて改変または置換することができる、当業者に公知である同等のステップおよび方法への言及が含まれる。 It should be understood that in the present specification and the appended claims, the singular forms "a", "an" and "the" include the plural forms unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "a cell" includes one or more such different cells, and reference to "a method" is modified or substituted in place of the methods described herein. Included are references to equivalent steps and methods known to those of ordinary skill in the art that can be made.

「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、個々の細胞、細胞系、またはそのような細胞から導出される培養物を指す。「培養物」とは、同じまたは異なる種類の単離された細胞を含む組成物を指す。 The term "cell" as used herein refers to an individual cell, cell line, or culture derived from such a cell. "Culture" refers to a composition that contains isolated cells of the same or different types.

本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」という句は、卵細胞と***細胞の融合から生成する細胞などの、生物体を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞を指す。受精卵の最初の数回の***によって生成する細胞も全能性であり得る。これらの細胞は、胚および胚体外細胞系列に分化することができる。例えばＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、いかなる胎児または成体の細胞型も生じ得る。しかし、これらは、胚体外組織に発達する能力を欠くので、単独では胎児または成体動物に発達することはできない。胚体外組織は、一部において、胚体外内胚葉から導出され、遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜）および近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌｅｎｄｏｄｅｒｍ）（卵黄嚢の一部を形成する）にさらに分類することができる。遠位内胚葉および近位内胚葉はどちらも胚の発生を支持するが、それら自体は胚構造を形成しない。胚体外中胚葉および胚体外外胚葉を含めた他の胚体外組織も存在する。 As used herein, the phrase "totipotent stem cell" refers to a cell that has the ability to differentiate into all cells that make up an organism, such as cells produced from the fusion of egg cells and sperm cells. Cells produced by the first few divisions of a fertilized egg may also be totipotent. These cells can differentiate into embryonic and extraembryonic cell lineages. Pluripotent stem cells, such as ES cells, can give rise to any fetal or adult cell type. However, they lack the ability to develop into extraembryonic tissues and therefore cannot develop into a fetal or adult animal alone. Extraembryonic tissue is derived, in part, from the extraembryonic endoderm and further into the distal endoderm (Reichert's membrane) and proximal endoderm (which forms part of the yolk sac). Can be classified. Both distal and proximal endoderm support embryonic development, but do not themselves form embryonic structures. Other extraembryonic tissues also exist, including extraembryonic mesoderm and extraembryonic ectoderm.

一部の実施形態では、「多能性細胞」を、内胚葉系列、より詳細には、膵臓内胚葉型細胞に分化させるための出発材料として使用する。本明細書で使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」またはその等価物とは、細胞培養物中で増殖することができ、かつ多分化能の性質を示す種々の系列限定的な細胞集団に分化することができる細胞を指し、例えば、多能性ＥＳ細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はどちらも、３種の胚細胞系列のそれぞれを生じ得る。しかし、多能性細胞は、生物体全体を生成することはできない場合がある。すなわち、多能性細胞は全能性ではない。 In some embodiments, "pluripotent cells" are used as a starting material for differentiating into endoderm lineages, and more particularly into pancreatic endoderm type cells. As used herein, "pluripotent" or "pluripotent cells" or equivalents thereof refer to a variety of lineages capable of growing in cell culture and exhibiting pluripotent properties. Refers to cells capable of differentiating into a limited population of cells, eg, pluripotent ES cells and induced pluripotent stem (iPS) cells can both give rise to each of the three germ cell lineages. However, pluripotent cells may not be able to produce whole organisms. That is, pluripotent cells are not totipotent.

ある特定の実施形態では、出発材料として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞、さらには単為発生細胞などを含めた幹細胞である。本明細書で使用される場合、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体から始まり、もはや発生した配偶子細胞以外の多能性または全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の様々な発生ステージを指す。「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」という用語は、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって導出された胚も指す。さらに別の実施形態では、多能性細胞は胚から導出されたまたは直接導出されたものではなく、例えば、ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞から導出されたものである。 In certain embodiments, the pluripotent cells used as starting material are stem cells, including hES cells, hEG cells, iPS cells, as well as parthenogenic cells and the like. As used herein, an "embryonic" is an organism that begins with a single zygote and ends with a multicellular structure that no longer contains pluripotent or totipotent cells other than generated gametes. Refers to various stages of development in the body. The term "embryonic" refers to embryos derived by gamete fusion as well as embryos derived by somatic cell nuclear transfer. In yet another embodiment, the pluripotent cells are not derived or directly derived from the embryo; for example, iPS cells are derived from non-pluripotent cells, such as pluripotent cells or terminally differentiated cells. It was done.

ヒト多能性幹細胞は、分化を導く遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコア調節複合体を形成する転写因子Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２などのいくつかの転写因子および細胞表面タンパク質、ならびに糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびケラタン硫酸抗原、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１などの細胞表面抗原が存在すると定義または特徴付けることもできる。 Human pluripotent stem cells contain several transcription factors such as the transcription factors Oct-4, Nanog, and Sox-2 that form core-regulatory complexes that ensure repression of genes leading to differentiation and maintenance of pluripotency. It can also be defined or characterized as the presence of cell surface proteins and cell surface antigens such as the glycolipids SSEA3, SSEA4 and keratan sulfate antigens, Tra-1-60 and Tra-1-81.

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」という句は、非多能性細胞、一般には成体の体細胞、または、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化した細胞から、リプログラミング因子と称される特定の遺伝子または遺伝子産物を挿入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：３１８−３２４（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１：１４１−１４６（２００８）を参照されたい。人工多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞などの天然のヒト多能性幹細胞と、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）を含めた多くの点で実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細胞により、胚の使用を伴うことなく多能性幹細胞の供給源がもたらされる。 As used herein, the phrase "induced pluripotent stem cells" or "iPS cells" or "iPSCs" refers to non-pluripotent cells, generally adult somatic cells, or, for example, fibroblasts, hematopoietic cells. It refers to a kind of pluripotent stem cells artificially prepared by inserting a specific gene or gene product called a reprogramming factor from terminally differentiated cells such as cells, muscle cells, neurons, and epidermal cells. The disclosure of which is fully incorporated herein by reference, Takahashi et al., Cell, 131:861-872 (2007); Wernig et al., Nature, 448:318-324 (2007); Park et al., Nature, 451:141. -146 (2008). Induced pluripotent stem cells include natural human pluripotent stem cells such as hES cells, expression of certain stem cell genes and proteins, chromatin methylation pattern, doubling time, embryoid body formation, teratoma formation, and viable chimera. It is substantially similar in many respects, including formation, and developmental potential and differentiation potential. Human iPS cells provide a source of pluripotent stem cells without the use of embryos.

ｉＰＳ細胞を生成するために様々な方法を用いることができ、それらは本明細書において下でさらに詳細に記載される。しかし、全ての方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび任意選択でＬｉｎ−２８をコードする発現カセット、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｋｌｆ４および任意選択でｃ−ｍｙｃをコードする発現カセット、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ−４および任意選択でＥｓｒｒｂをコードする発現カセットなどの特定のリプログラミング因子を用いる。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターの中にあってもよい。Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３およびＳｏｘ−１５）は、その不在により誘導を不可能にする、誘導プロセスに関与する大事な転写制御因子である。Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持で重要な役割をする。例えば、通常Ｏｃｔ−３／４＋の細胞、例えば割球および胚性幹細胞中のＯｃｔ−３／４の不在は、自発的な栄養芽細胞分化につながり、一方、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化潜在能力をもたらす。さらに、「Ｏｃｔ」ファミリーの他の遺伝子、例えばＯｃｔ１およびＯｃｔ６は多能性を誘導せず、したがって、この多能性誘導プロセスはＯｃｔ−３／４に帰することができる。Ｏｃｔ−３／４に類似の多能性の維持に関連する遺伝子の別のファミリーは、Ｓｏｘファミリーである。しかし、Ｓｏｘファミリーは多能性細胞型に限定的でなく、多分化能および単能性幹細胞にも関連する。Ｓｏｘファミリーは誘導プロセスでも働くことが見出されている。上記Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６による初期研究では、Ｓｏｘ２が使用された。それ以来、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８遺伝子によってもｉＰＳ細胞が生成されている。Ｋｌｆファミリーの遺伝子（Ｋｌｆ−１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）のＫｌｆ４は、当初はマウスｉＰＳ細胞の生成の因子として、上記Ｙａｍａｎａｋａら２００６によって同定された。本明細書において、Ｓ．ＹａｍａｎａｋａからのヒトｉＰＳ細胞は、ｈＩＰＳ細胞の細胞療法適用を探索するために使用した。しかし、上記Ｙｕら２００７は、Ｋｌｆ４が必要とされないこと、および実際ヒトｉＰＳ細胞を生成することができなかったことを報告した。Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２およびＫｌｆ５を含むＫｌｆファミリーの他のメンバーは、ｉＰＳ細胞を生成することが可能である。最後に、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃ）、がんと結びつけられているがん原遺伝子；ｃ−ｍｙｃは、マウスおよびヒトのｉＰＳ細胞の生成と結びつけられた因子であったが、上記Ｙｕら（２００７）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生成のために必要とされなかったことを報告した。 Various methods can be used to generate iPS cells, which are described in further detail herein below. However, all methods were used for expression cassettes encoding Sox-2, Oct-4, Nanog and optionally Lin-28, or expression encoding Sox-2, Oct-4, Klf4 and optionally c-myc. Specific reprogramming factors such as cassettes or expression cassettes encoding Sox-2, Oct-4 and optionally Esrrb are used. Nucleic acids encoding these reprogramming factors may be in the same expression cassette, different expression cassettes, the same reprogramming vector, or different reprogramming vectors. Certain members of the Oct-3/4 and Sox gene families (Sox-1, Sox-2, Sox-3 and Sox-15) are key transcriptional factors involved in the induction process, whose absence precludes induction. It is a controlling factor. Oct-3/4 (Pou5f1) is one of a family of octameric (“Oct”) transcription factors that play an important role in maintaining pluripotency. For example, the absence of Oct-3/4 in cells, usually Oct-3/4+, such as blastomeres and embryonic stem cells, leads to spontaneous trophoblast differentiation, while the presence of Oct-3/4 results in Provides pluripotency and differentiation potential of embryonic stem cells. In addition, other genes of the "Oct" family, such as Oct1 and Oct6, do not induce pluripotency and thus this pluripotency induction process can be ascribed to Oct-3/4. Another family of genes associated with maintenance of pluripotency similar to Oct-3/4 is the Sox family. However, the Sox family is not limited to pluripotent cell types, but is also associated with pluripotent and unipotent stem cells. The Sox family has been found to work in the induction process. Sox2 was used in an initial study by Takahashi et al., 2006, supra. Since then, iPS cells have also been generated by the Sox1, Sox3, Sox15 and Sox18 genes. Klf4 of the Klf family of genes (Klf-1, Klf2, Klf4 and Klf5) was initially identified by Yamanaka et al 2006 as a factor in the generation of mouse iPS cells. In the present specification, S. Human iPS cells from Yamanaka were used to explore cell therapy applications for hIPS cells. However, Yu et al. 2007, supra, reported that Klf4 was not required and, in fact, was unable to generate human iPS cells. Other members of the Klf family, including Klf1, Klf2 and Klf5, are capable of producing iPS cells. Finally, the Myc family (C-myc, L-myc and N-myc), a protooncogene associated with cancer; c-myc is a factor associated with the generation of mouse and human iPS cells. However, Yu et al. (2007) reported that c-myc was not required for the generation of human iPS cells.

本明細書で使用される場合、「多分化能」または「多分化能細胞」またはその等価物は、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。すなわち、多分化能細胞は１つまたは複数の胚細胞の運命に傾倒し、したがって、多能性細胞とは対照的に、３種の胚細胞系列のそれぞれ、ならびに胚体外細胞を生じさせることができない。多分化能体細胞は、多能性細胞よりも分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞の発生能は多分化能細胞よりも高い。体細胞をリプログラミングすることまたはｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができる発生能決定因子としては、これだけに限定されないが、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｒｅｘｌ、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘｌ５、Ｍｙｂｌ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはこれらの組合せなどの因子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質」としては、これだけに限定されないが、ＥＲＢＢ受容体に結合する少なくとも１６種の異なるＥＧＦファミリーリガンド：ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＧまたはＡＲＥＧ（アンフィレギュリン）、およびＴＧＦ−アルファ（形質転換成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ）、およびＥｒｅｇ（エピレギュリン））、ニューレグリン−１、−２、−３および−４（またはヘレグリン−１、−２、−３および−４などのニューグレリン（またはヘレグリン）が挙げられる。しかし、本発明では、４種のＥＲＢＢ受容体のいずれか１つまたはこれらの組合せに結合して、内因性キナーゼドメインの活性化およびその後のリン酸化を導くホモ二量体受容体複合体およびヘテロ二量体受容体複合体の形成を誘導することができる任意のリガンドが意図されている。表１１も参照されたい。
本明細書に記載されるインスリンの生成方法の一部の実施形態は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌するインスリン生成細胞にｉｎｖｉｖｏで成熟することができる膵臓内胚葉細胞を動物に提供することによって、糖尿病の動物を処置するか、動物の血液中のグルコース濃度を制御することを含むことができる。 As used herein, "pluripotent" or "pluripotent cell" or equivalents thereof refer to a cell type capable of giving rise to a limited number of other particular cell types. That is, pluripotent cells are committed to the fate of one or more embryonic cells and, thus, in contrast to pluripotent cells, can give rise to each of the three germ cell lineages, as well as extraembryonic cells. Can not. Pluripotent somatic cells are more differentiated than pluripotent cells, but not terminally differentiated. Therefore, the developmental potential of pluripotent cells is higher than that of pluripotent cells. Developmental determinants that can be used to reprogram somatic cells or generate iPS cells include, but are not limited to, Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rexl, ZNF206, Soxl5. , Mybl2, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 or combinations thereof.
As used herein, "ERBB receptor tyrosine kinase activator" includes, but is not limited to, at least 16 different EGF family ligands that bind to the ERBB receptor: EGF (epithelial growth factor). , AG or AREG (amphiregulin), and TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), and Ereg (epiregulin)), neuregulin-1,-. 2, -3 and -4 (or neughrelin (or heregulin) such as heregulin-1, -2, -3 and -4. However, in the present invention any one of the four ERBB receptors is included. Or any combination capable of binding to these combinations and inducing the formation of homodimeric and heterodimeric receptor complexes leading to activation and subsequent phosphorylation of the endogenous kinase domain. Ligands are intended, see also Table 11.
Some embodiments of the methods of producing insulin described herein provide an animal with pancreatic endoderm cells that can mature in vivo into insulin-producing cells that secrete insulin in response to glucose stimulation. This may include treating the diabetic animal or controlling the glucose concentration in the blood of the animal.

本明細書に記載される一態様は、適当な条件の下で培養されるときに異なる細胞系統に選択的に、および一部の態様では選択的、可逆的に発達することが可能である、多能性または先駆細胞の集団を含む。本明細書で使用される場合、「集団」という用語は、同じ識別特徴を有する複数の細胞の細胞培養物を指す。「細胞系列」という用語は、最も早期の先駆細胞から完全成熟細胞（すなわち特殊化した細胞）までの細胞型の発達の全ステージを指す。「先駆細胞」または「前駆細胞」とは、細胞分化経路内の、より成熟した細胞に分化することができる任意の細胞であってよい。そのように、先駆細胞は、多能性細胞であってもよく、部分的に分化した多分化能細胞または可逆的に分化した細胞であってもよい。「先駆細胞集団」という用語は、より成熟または分化した細胞型に発達することができる細胞の群を指す。先駆細胞集団は、多能性の細胞、幹細胞系列に制限された細胞（すなわち、外胚葉系列の全てには発達できない細胞、または、例えばニューロン系列の細胞にのみ発達することができる細胞）、および可逆的に幹細胞系列に制限された細胞を含み得る。したがって、「前駆細胞」または「先駆細胞」という用語は、「多能性細胞」または「多分化能細胞」であり得る。 One aspect described herein is capable of developing reversibly selectively in different cell lines when cultured under suitable conditions, and in some aspects, selectively, reversibly. Includes a population of pluripotent or progenitor cells. As used herein, the term "population" refers to a cell culture of cells that have the same distinguishing characteristics. The term “cell lineage” refers to all stages of cell type development from the earliest precursor cells to fully mature cells (ie specialized cells). A "progenitor cell" or "progenitor cell" may be any cell within the cell differentiation pathway that is capable of differentiating into a more mature cell. As such, the precursor cells may be pluripotent cells, partially differentiated pluripotent cells or reversibly differentiated cells. The term "progenitor cell population" refers to a group of cells capable of developing into a more mature or differentiated cell type. The precursor cell population is a pluripotent cell, a cell that is restricted to the stem cell lineage (ie, a cell that cannot develop into all of the ectoderm lineage, or a cell that can develop only into cells of the neuronal lineage, for example), and It can include cells that are reversibly restricted to the stem cell lineage. Thus, the term "progenitor cell" or "progenitor cell" may be a "pluripotent cell" or a "pluripotent cell."

本明細書で使用される場合、「リプログラミング」、「リプログラミングされた」という用語またはそれと同等の用語は、培養またはｉｎｖｉｖｏにおいて、リプログラミングなしで同じ条件下でそれが有するであろう能力よりも測定可能な程度高い、少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する能力を細胞に付与するプロセスを指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、体細胞は、多能性細胞に「リプログラミングされる」。特定の態様では、十分な増殖の後に、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養において、測定可能な程度の割合の細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示するとき、体細胞はリプログラミングされている。リプログラミングなしでは、そのような体細胞は、新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成しないだろう。リプログラミングなしでも体細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成することができた場合は、これらの体細胞からの新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代の割合は、リプログラミング前よりも測定可能な程度高い。 As used herein, the term "reprogramming," "reprogrammed," or equivalent terms, refers to the ability it will have in culture or in vivo without reprogramming under the same conditions. A process that confers on a cell the ability to form progeny of at least one new cell type that is measurably higher than. In certain embodiments described herein, somatic cells are "reprogrammed" into pluripotent cells. In certain embodiments, the somatic cells are reprogrammed when, after sufficient expansion, a measurable proportion of cells exhibit the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type in in vivo or in vitro cell culture. Has been done. Without reprogramming, such somatic cells would not generate progeny that display the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type. If somatic cells were able to generate progeny that displayed the phenotypic features of the new pluripotent cell type without reprogramming, the phenotypic features of the new pluripotent cell type from these somatic cells The percentage of progeny presented is measurably higher than before reprogramming.

本明細書で使用される場合、語句「分化プログラミング」は、培養またはｉｎｖｉｖｏにおいて、分化リプログラミングなしで同じ条件下でそれが有するであろうよりも、新しい分化状態の少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成するように細胞を変化させるプロセスを指す。このプロセスには、分化、脱分化および分化転換が含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、語句「分化」は、より特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスを指す。対照的に、語句「脱分化」は、部分的または最終的に分化した細胞がより初期の発達段階、例えば多能性または多分化能を有する細胞に戻る細胞プロセスを指す。さらに対照的に、語句「分化転換」は、１つの分化細胞型を別の分化細胞型に転換するプロセスを指す。 As used herein, the phrase "differentiation programming" refers to at least one new cell type in a new differentiation state in culture or in vivo than it would have under the same conditions without differentiation reprogramming. Refers to the process of transforming cells to form progeny. This process includes differentiation, dedifferentiation and transdifferentiation. Thus, as used herein, the phrase "differentiation" refers to the process by which less specialized cells become more specialized cell types. In contrast, the phrase "dedifferentiation" refers to the cellular process by which partially or terminally differentiated cells return to earlier developmental stages, eg, cells that are pluripotent or pluripotent. In further contrast, the phrase "transdifferentiation" refers to the process of converting one differentiated cell type into another.

本明細書で使用される場合、「多能性細胞から発達する」、「多能性細胞から分化する」、「多能性細胞から成熟する」または「多能性細胞から生成する」、「多能性細胞から導出された」、「多能性細胞から分化する」という用語および等価の表現は、例えば、その開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ」に記載の、ｉｎｖｉｖｏにおいて移植されたＰＤＸ１膵臓内胚葉細胞から成熟する内分泌細胞の場合では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて多能性細胞から分化した細胞型が生成することを指す。そのような用語は全て、少なくとも２種の異なる細胞系列に分化する潜在性を有するステージから特殊化および最終分化した細胞になるまでの細胞の進行を指す。そのような用語は、本出願の目的に関して互換的に使用することができる。本明細書に記載の実施形態では、そのような分化を可逆的なものにし、したがって、多能性または少なくとも２種以上の細胞系列に分化する能力を選択的に取り戻すことができるような培養条件が意図されている。 As used herein, "developing from pluripotent cells", "differentiating from pluripotent cells", "maturing from pluripotent cells" or "producing from pluripotent cells", " The terms "derived from pluripotent cells", "differentiate from pluripotent cells" and equivalent expressions refer to, for example, International Patent Application No. PCT/US2007/, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. In the case of endocrine cells matured from PDX1 pancreatic endoderm cells transplanted in vivo, as described in No. 015536, “METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES”, a cell type differentiated from pluripotent cells in vitro or in vivo. Is generated. All such terms refer to the progression of cells from the stage with the potential to differentiate into at least two different cell lineages to specialized and terminally differentiated cells. Such terms may be used interchangeably for the purposes of this application. In the embodiments described herein, culture conditions that render such differentiation reversible and thus selectively regain pluripotency or the ability to differentiate into at least two or more cell lineages. Is intended.

「フィーダー細胞」という用語は、ｉｎｖｉｔｒｏで成長し、少なくとも１種の因子を細胞培養中に分泌し、また、培養物中の別の目的の細胞の成長を支持するために使用することができる細胞培養物を指す。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」は、「フィーダー細胞」という用語と互換的に使用され得る。フィーダー細胞は、培養皿の表面がフィーダー細胞で、重なり合って増幅する前の完全な層で覆われた単層を含んでもよく、細胞のクラスターを含んでよい。好ましい実施形態では、フィーダー細胞は、接着性の単層を含む。 The term "feeder cell" can be used to grow in vitro, secrete at least one factor into a cell culture, and also support the growth of another cell of interest in culture. Refers to cell culture. As used herein, "feeder cell layer" may be used interchangeably with the term "feeder cell". A feeder cell may comprise a monolayer, the surface of the culture dish of which is a feeder cell, covered with a complete layer before overlapping and amplification, and may comprise a cluster of cells. In a preferred embodiment, the feeder cells comprise an adherent monolayer.

本明細書で使用される場合、「クラスター」、「凝集塊」または「凝集体」という用語は互換的に使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞を一般に指す。クラスターは、より小さいクラスターに解離することができる。この解離は本来一般的に手動である（例えば、パスツールピペットを使用する）が、他の解離手段が企図される。凝集懸濁多能性または多分化能細胞培養物は、実質的に、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６、表題ＳＴＥＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＴＨＥＲＥＯＦに記載されている通りであり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 As used herein, the terms "cluster", "aggregate" or "aggregate" can be used interchangeably and generally refer to a group of cells that have not dissociated into single cells. The clusters can dissociate into smaller clusters. This dissociation is generally manual in nature (eg, using a Pasteur pipette), but other dissociation means are contemplated. Aggregated suspension pluripotent or pluripotent cell cultures are substantially described in International Publication PCT/US2007/062755, titled COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS and PCT/US2008/082356, Title STEM CELLS USGUSG REGIONS. As described in OF DIFFERENTIALATION THEREOF, which are fully incorporated herein by reference.

同様に、多能性細胞培養物または多能性凝集懸濁培養物をフィーダー細胞の使用を伴わない規定された条件において成長させる実施形態は「フィーダーフリー」である。フィーダーフリー培養方法では、多能性細胞培養物のスケーラビリティおよび再現性が増し、例えばフィーダー細胞または他の動物を供給源とする培養物構成成分に由来する感染因子によるコンタミネーションのリスクが低下する。フィーダーフリー方法は、Ｂｏｄｎａｒらに対する米国特許第６，８００，４８０号（ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡された）にも記載されている。しかし、米国特許第６，８００，４８０号特許とは対照的に、本明細書に記載の実施形態は、多能性細胞培養物、多分化能細胞培養物または分化した細胞培養物のいずれであるかにかかわらず、フィーダーフリーであり、内在性または外因性の細胞外マトリックスをさらに含有しない；すなわち、本明細書に記載の培養物は、フィーダーフリーであるだけでなく、細胞外マトリックスフリーでもある。例えば、米国特許第６，８００，４８０号では、線維芽細胞を培養し、線維芽細胞をｉｎｓｉｔｕで溶解し、次いで、溶解後に残ったものを洗浄することによって細胞外マトリックスが調製される。あるいは、米国特許第６，８００，４８０号では、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される単離されたマトリックス構成成分または構成成分の組合せからも細胞外マトリックスが調製され得る。本明細書に記載の実施形態では、フィーダー層または線維芽細胞層を成長させ、細胞を溶解して細胞外マトリックスを生成することによって細胞外マトリックスを生成することもなく、最初にコラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される細胞外マトリックス構成成分または細胞外マトリックス構成成分の組合せを用いて組織培養容器をコーティングする必要もない。したがって、多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞用の本明細書に記載の凝集懸濁培養物には、外因的に添加された細胞外マトリックスまたはマトリックス構成成分である細胞外マトリックスコーティングを生成するフィーダー層、溶解したフィーダー細胞または線維芽細胞は必要なく、参照により本明細書に完全に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、表題ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＭＥＤＩＡＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＨＵＭＡＮＳＥＲＵＭに記載の通り、可溶性ヒト血清構成成分の使用により、フィーダー細胞またはフィーダー単層の必要性を克服し、同様に、フィーダー細胞もしくは線維芽細胞または外因的に添加された細胞外マトリックス構成成分に由来する内在性の細胞外マトリックスの必要性も克服される。 Similarly, embodiments in which pluripotent cell cultures or pluripotent aggregate suspension cultures are grown in defined conditions without the use of feeder cells are "feeder-free". Feeder-free culture methods increase the scalability and reproducibility of pluripotent cell cultures and reduce the risk of contamination by infectious agents derived from, for example, feeder cells or other animal-sourced culture components. The feeder-free method is also described in US Pat. No. 6,800,480 to Bodnar et al. (assigned to Geron Corporation, Menlo Park, Calif.). However, in contrast to US Pat. No. 6,800,480, the embodiments described herein are either pluripotent cell cultures, pluripotent cell cultures or differentiated cell cultures. Feeder-free, whether or not, does not further contain endogenous or exogenous extracellular matrix; that is, the cultures described herein are not only feeder-free but also extracellular matrix-free. is there. For example, in US Pat. No. 6,800,480, the extracellular matrix is prepared by culturing fibroblasts, lysing the fibroblasts in situ, and then washing what remains after lysis. Alternatively, in US Pat. No. 6,800,480, it is selected from collagen, placental matrix, fibronectin, laminin, merosin, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, aggrecan, biglycan, thrombospondin, vitronectin, and decorin. Extracellular matrices can also be prepared from isolated matrix components or combinations of components. In the embodiments described herein, collagen, placenta matrix is first formed without growing extracellular matrix by growing a feeder layer or fibroblast layer and lysing cells to produce extracellular matrix. , An extracellular matrix component or a combination of extracellular matrix components selected from fibronectin, laminin, merosin, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, aggrecan, biglycan, thrombospondin, vitronectin, and decorin There is also no need to coat the tissue culture vessel. Thus, the aggregated suspension cultures described herein for pluripotent cells, pluripotent cells and differentiated cells include an exogenously added extracellular matrix or matrix component extracellular matrix coating. There is no need for a feeder layer, lysed feeder cells or fibroblasts to produce, International Application PCT/US2008/080516, titled METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENTS STEM CELL MEDIA MAINTAINING. The use of soluble human serum components, as described in SERUM, overcomes the need for feeder cells or feeder monolayers, as well as to feeder cells or fibroblasts or exogenously added extracellular matrix components. The need for a derived endogenous extracellular matrix is also overcome.

好ましい実施形態では、培養方法は、動物を供給源とする産物を含まない。別の好ましい実施形態では、培養方法はゼノフリーである。さらに好ましい実施形態では、本明細書に記載の培養方法はヒト細胞治療薬の商業的な製造のための１つまたは複数の条件または要件を満たすかまたはそれを上回っていた。 In a preferred embodiment, the culturing method does not include animal-sourced products. In another preferred embodiment, the culture method is xenofree. In a more preferred embodiment, the culturing methods described herein meet or exceed one or more conditions or requirements for commercial production of human cell therapeutics.

多能性細胞の集団をある特定の補足的な成長因子の存在下でさらに培養して、異なる細胞系列であるか、またはそれに発達することになる細胞の集団を得ることができ、または、異なる細胞系列に発達することが可能になるように選択的に逆行させることができる。「補足的な成長因子」という用語は、その最も広範な文脈で使用され、多能性細胞の成長を促進するため、細胞の生存を維持するため、細胞の分化を刺激するため、および／または、細胞の分化の逆行を刺激するために有効である物質を指す。さらに、補足的な成長因子は、フィーダー細胞からその培地中に分泌される物質であってよい。そのような物質としては、これだけに限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体、およびタンパク質が挙げられる。成長因子は、細胞の発生および維持ならびに組織の形態および機能を制御する細胞間シグナル伝達ポリペプチドも含んでよい。好ましい実施形態では、補足的な成長因子は、幹細胞因子（ｓｔｅｅｌｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と可溶性インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の組合せ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。 The population of pluripotent cells can be further cultured in the presence of certain complementary growth factors to obtain a population of cells that are or will develop into different cell lineages, or different It can be selectively reversed to allow it to develop into a cell lineage. The term "complementary growth factor" is used in its broadest context to promote growth of pluripotent cells, to maintain cell survival, to stimulate cell differentiation, and/or , Refers to substances that are effective to stimulate retrograde differentiation of cells. Further, the supplemental growth factor may be a substance secreted by the feeder cells into its medium. Such agents include, but are not limited to, cytokines, chemokines, small molecules, neutralizing antibodies, and proteins. Growth factors may also include intercellular signaling polypeptides that control cell development and maintenance and tissue morphology and function. In a preferred embodiment, the complementary growth factors are: stem cell factor (SCF), oncostatin M (OSM), ciliary neurotrophic factor (CNTF), interleukin-6 (IL-6). Soluble Interleukin-6 Receptor (IL-6R) Combination, Fibroblast Growth Factor (FGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP), Tumor Necrosis Factor (TNF), and Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) Is selected from the group consisting of.

本明細書に記載の細胞を生成するためのある特定のプロセスでは、成長因子を、添加後に細胞培養物または細胞集団から除去する。例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、またはＧＤＦ−１１などの成長因子を添加し、それらを添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内に除去することができる。一部の実施形態では、分化因子を細胞培養物から除去することはしない。 In one particular process for producing the cells described herein, growth factors are removed from the cell culture or cell population after addition. For example, a growth factor such as activin A, activin B, GDF-8, or GDF-11 is added, and within about 1 day, within about 2 days, within about 3 days, within about 4 days after adding them. It can be removed within about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days or about 10 days. In some embodiments, the differentiation factor is not removed from the cell culture.

分化プロセスの効率は、これだけに限定されないが、細胞の成長条件、成長因子濃度および培養ステップのタイミングを含めたある特定のパラメータを改変することによって調整することができるので、本明細書に記載の分化手順により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％超の、人工多能性細胞を含む多能性細胞から多分化能細胞または分化した細胞、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞への変換をもたらすことができる。前原条（ｐｒｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅｓｔｒｅａｋ）細胞または中内胚葉細胞の単離を使用するプロセスでは、実質的に純粋な前原条細胞または中内胚葉細胞集団を回収することができる。 The efficiency of the differentiation process can be adjusted by modifying certain parameters, including, but not limited to, cell growth conditions, growth factor concentrations and timing of culture steps, and thus are described herein. Depending on the differentiation procedure, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60. %, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, or more than about 95% of likely pluripotent cells, including induced pluripotent cells. Competent or differentiated cells such as definitive endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive foregut endoderm, PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1/NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursors or NGN3/NKX2 .2 can result in conversion to co-positive endocrine precursors and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP alone positive endocrine cells. The process using isolation of preprimitive streak cells or mesendoderm cells can recover a substantially pure population of preprimitive streak cells or mesendoderm cells.

多能性幹細胞から導出された様々な細胞組成物が、本明細書に記載される。一実施形態は、ｉＰＳ細胞およびそれから導出された細胞を含む。本明細書に記載される実施形態に関連するが異なるさらに他のプロセスおよび組成物は、２００３年１２月２３日に出願の米国特許仮出願第６０／５３２，００４号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年４月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月９日に出願の米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥＣＥＬＬＳＵＲＦＡＣＥＲＥＣＥＰＴＯＲＦＯＲＴＨＥＩＳＯＬＡＴＩＯＮＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥＣＥＬＬＳＵＲＦＡＣＥＲＥＣＥＰＴＯＲＦＯＲＴＨＥＩＳＯＬＡＴＩＯＮＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年６月２３日に出願の米国特許出願第１１／１６５，３０５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧＦＡＣＴＯＲＳＦＯＲＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＮＧＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＲＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲＳＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００６年３月２日に出願の米国特許仮出願第６０／７７８，６４９号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年７月２６日に出願の米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年１０月１８日に出願の米国特許仮出願第６０／８５２，８７８号、表題ＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴＯＦＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ，ＩＭＭＡＴＵＲＥＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＩＳＬＥＴＣＥＬＬＳＡＮＤＭＡＴＵＲＥＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＩＳＬＥＴＣＥＬＬＳＵＳＩＮＧＮＣＡＭ；２００６年１０月２７日に出願の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＲＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ；２００７年９月１３日に出願の米国特許出願第６０／９７２，１７４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＴＲＥＡＴＭＥＮＴＦＯＲＤＩＡＢＥＴＥＳ；２００７年９月２４日に出願の米国特許出願第１１／８６０，４９４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７年１０月３日に出願の米国特許出願第６０／９７７，３４９号、表題ＣＥＬＬＳＵＲＦＡＣＥＭＡＲＫＥＲＳＯＦＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＳＴＥＭＣＥＬＬＳ；および２００８年４月８日に出願の米国特許出願第１２／０９９，７５９号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ；および２００８年４月２１日を出願の米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＯＲＭＨＵＭＡＮＥＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳに見出すことができ、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Various cell compositions derived from pluripotent stem cells are described herein. One embodiment includes iPS cells and cells derived therefrom. Still other processes and compositions related to but different from the embodiments described herein are described in US Provisional Application No. 60/532,004, filed Dec. 23, 2003, entitled DEFINITIVE ENDERM; 2004. US Provisional Application No. 60/566,293, filed April 27, Title PDX1 EXPRESSING ENDORDER, US Provisional Application No. 60/586,566, filed July 9, 2004, CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR. FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDDERM; US Provisional Application No. 60/587,942 filed on July 14, 2004, entitled CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THEORATION OF ENDOMER DATE 4th of December, 200 US DEFINITION Patent Application No. 11/021,618, entitled DEFINITIVE ENDORDER, and US Patent Application No. 11/115,868, entitled PDX1 EXPRESSING ENDORDER, filed April 26, 2005; United States, filed June 23, 2005. Patent Application No. 11/165,305, Title METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM; U.S. Provisional Application No. 60/736,598 filed Nov. 14, 2005, title MARKERS OF DEFINITIVE ENDORDERM; U.S. Patent Provisional Application No. 60/778,649 filed March 2, 2006; INSULIN-PRODUCING AND METHOD OF PRODUCTION; US Provisional Application No. 60/833,633, filed on July 26, 2006, entitled INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION; October 18, 2006, US Patent provisional application No. 6 No. 0/852,878, ENRICHENT OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PANCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREATIC ISLET CELLS USING NCAM; DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDDERM; U.S. Patent Application No. 11/681,687 filed on Mar. 2, 2007, entitled ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS 7th Oct. US Patent Application No. 11/773,944, Title METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES; US Patent Application No. 60/972,174, filed September 13, 2007, Title METHODS OF TREATMENT FOR DIABETES; September 24, 2007. U.S. patent application Ser. No. 11/860,494, filed METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION; STEM CELLS AND CANCER STEM CELLS; and U.S. Patent Application No. 12/099,759, filed Apr. 8, 2008, entitled METHODS OF PRODUCTION PANCREATIC HORMONES; and U.S. Patent Application No. 12, filed Apr. 21, 2008. /107,020, titled METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMANE EMBRYONIC STEM CELLS, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. Be done.

ｈＥＳ細胞から導出された内胚葉系列細胞を生成するための一般的な方法は、上記の関連する米国特許出願、ならびにＤ’Ａｍｏｕｒら、２００５ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５３４−４１、およびＤ’Ａｍｏｕｒら、２００６ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（１１）：１３９２−４０１に記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。Ｄ’Ａｍｏｕｒらにより、５段階の分化プロトコル：ステージ１（大部分は胚体内胚葉生成がもたらされる）、ステージ２（大部分はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ３（大部分はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ４（大部分は膵臓内胚葉または膵臓内分泌前駆体生成がもたらされる）およびステージ５（大部分はホルモン発現内分泌細胞生成がもたらされる）が記載されている。 General methods for generating endoderm lineage cells derived from hES cells are described in the related US patent applications referenced above, as well as D'Amour et al., 2005 Nat Biotechnol. 23: 1534-41, and D'Amour et al., 2006 Nat Biotechnol. 24(11):1392-401, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference. D'Amour et al., a five-step differentiation protocol: stage 1 (mostly results in definitive endoderm generation), stage 2 (mostly results in PDX1-negative foregut endoderm generation), stage 3 (mostly). Results in PDX1-positive foregut endoderm production), stage 4 (most results in pancreatic endoderm or pancreatic endocrine precursor production) and stage 5 (most results in hormone-expressing endocrine cell production). Has been done.

「栄養外胚葉」という用語は、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。 The term "trophic ectoderm" means that the expression of a marker selected from the group consisting of HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERBB genes is non-trophic ectoderm. Refers to pluripotent cells that are relatively high compared to the expression levels of HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERBB in a cell or cell population.

「胚体外内胚葉」は、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現レベルが、非胚体外内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。 "Extraembryonic endoderm" means that the expression level of a marker selected from the group consisting of SOX7 gene, SOX17 gene, THBD gene, SPARC gene, DAB1 gene, or AFP gene is SOX7 in a non-embryonic endoderm cell or cell population. , SOX17, THBD, SPARC, DAB1, or AFP, relative to the expression level of which is relatively high.

「前原条細胞」という用語は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子の発現レベルが、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。 The term "preprimitive streak cell" means that the expression level of the FGF8 marker gene and/or the NODAL marker gene is relatively low compared to BRACHURY low, FGF4 low, SNAI1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low. Refers to highly pluripotent cells.

「中内胚葉細胞」という用語は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙマーカー遺伝子、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子の発現レベルが、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。 The term "mesendoderm cell" means that the expression level of the brachyury marker gene, FGF4, SNAI1, MIXL1 and/or WNT3 marker gene is relatively low compared to SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low. Refers to highly pluripotent cells.

「胚体内胚葉（ＤＥ）」という用語は、腸管または腸管から導出された器官の細胞に分化することができる多分化能内胚葉系列細胞を指す。ある特定の実施形態によると、胚体内胚葉細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。本発明の一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ある特定のマーカーを発現する、またはある特定のマーカーを有意に発現することができない。一部の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１から選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現される。他の実施形態では、ＯＣＴ４、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７およびＨＮＦ４アルファから選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現されないまたは有意には発現されない。胚体内胚葉細胞集団およびそれを生成する方法は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願にも記載され、それは本明細書に完全に組み込まれる。 The term "definitive endoderm (DE)" refers to pluripotent endoderm lineage cells that are capable of differentiating into cells of the intestine or an organ derived from the intestine. According to certain embodiments, the definitive endoderm cells are mammalian cells, and in a preferred embodiment the definitive endoderm cells are human cells. In some embodiments of the invention, definitive endoderm cells express certain markers or are incapable of significantly expressing certain markers. In some embodiments, one or more markers selected from SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 are expressed in definitive endoderm cells. .. In another embodiment, one or more markers selected from OCT4, alpha-fetoprotein (AFP), thrombomodulin (TM), SPARC, SOX7 and HNF4alpha are not expressed or are significantly expressed in definitive endoderm cells. Not done. Definitive endoderm cell populations and methods of producing them are also described in US patent application Ser. No. 11/021,618, entitled DEFINITIVE ENDODERM, filed December 23, 2004, which is fully incorporated herein.

さらに他の実施形態は、「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」または「前腸内胚葉細胞」と呼ばれる細胞培養物、またはその同等物に関する。一部の実施形態では、前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）およびＦＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７またはＳＯＸ１を実質的に発現しない。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団およびその生成方法も、２００６年１０月２７日に出願の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｄｏｒｓａｌａｎｄｖｅｎｔｒａｌｆｏｒｅｇｕｔｅｎｄｏｄｅｒｍに記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Still other embodiments relate to cell cultures termed "PDX1-negative foregut endoderm cells" or "foregut endoderm cells," or equivalents thereof. In some embodiments, the foregut endoderm cells express the SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4alpha (HNF4A) and FOXA1 markers, but do not substantially express PDX1, AFP, SOX7 or SOX1. A PDX1-negative foregut endoderm cell population and methods for its production are also described in US patent application Ser. No. 11/588,693, filed Oct. 27, 2006, titled PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm, which is incorporated by reference. It is fully incorporated herein.

本明細書に記載される他の実施形態は、「ＰＤＸ１陽性の背側に偏った前腸内胚葉細胞」（背側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）または単に「ＰＤＸ１陽性内胚葉」の細胞培養物に関する。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、表１から選択される１つまたは複数のマーカーおよび／または表２から選択される１つまたは複数のマーカーを発現し、これらも同様に、２００６年１０月２７日に出願の関連する米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｎｄｏｄｅｒｍに記載され、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。

Other embodiments described herein are "PDX1-positive dorsally biased foregut endoderm cells" (dorsal PDX1-positive foregut endoderm cells) or simply "PDX1-positive endoderm" cells. Regarding the culture. In some embodiments, PDX1-positive endoderm cells express one or more markers selected from Table 1 and/or one or more markers selected from Table 2, and these also Related US patent application Ser. No. 11/588,693, filed October 27, 2006, titled PDX1 EXPRESSING DOSAN AND VENTRAL FOREGUT ENDORDER, and US patent application Ser. No. 11/115,868, filed April 26, 2005. No., PDX1-expressing endoderm, which are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される方法によって生成されるものなどのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、完全に分化した膵臓ホルモン分泌または内分泌細胞、例えばインスリン生成β細胞を生成するために使用することができる前駆体である。本発明の一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するように、ＰＤＸ１を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞；本明細書では胚体内胚葉とも呼ばれる）を分化させることによって生成される。 PDX1-positive foregut endoderm cells, such as those produced by the methods described herein, can be used to produce fully differentiated pancreatic hormone-secreting or endocrine cells, such as insulin-producing β-cells. It is a precursor. In some embodiments of the invention, the PDX1-positive foregut endoderm cells are definitive endoderm cells that do not substantially express PDX1 (PDX1-negative definitive endoderm cells such that they form PDX1-positive foregut endoderm cells). ;, also referred to herein as definitive endoderm).

本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」（全て「ＰＥ」と省略することができる）「膵臓前駆体」、「ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓内胚葉細胞（「ＰＥＣ」）などのその等価物は全て、先駆または前駆膵臓細胞である。本明細書に記載のＰＥＣは、ステージ４分化（約１２〜１４日目）後の前駆細胞集団であり、少なくとも２つの主要な別個の集団：ｉ）ＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しない（またはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ−）膵臓前駆細胞；およびｉｉ）ＣＨＧＡを発現する複数ホルモン性（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）内分泌細胞（ＣＨＧＡ陽性、ＣＨＧＡ＋）を含む。理論に束縛されることなく、ＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない細胞集団は、ＰＥＣのより活性かつ治療的な構成成分であると仮定され、一方、ＣＨＧＡ陽性複数ホルモン性内分泌細胞の集団はｉｎｖｉｖｏでグルカゴン発現膵島細胞にさらに分化および成熟すると仮定される。それらの開示はともに参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｔｙｐｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０−７５６、２０１１年７月３１日オンライン出版およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）、ＡＳｃａｌａｂｌｅＳｙｓｔｅｍｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰａｎｃｒｅａｔｉｃＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ７（５）：１−１７、ｅ３７００４を参照されたい。
さらに、時には、膵臓内胚葉細胞は、すぐ上に記載されているＰＥＣを指すのではなく、一般に少なくともステージ３およびステージ４型細胞を指して使用される。使用および意味は文脈から明らかになろう。このように多能性幹細胞、ならびに少なくともｈＥＳ細胞およびｈＩＰＳ細胞から導出される膵臓内胚葉は、他の内胚葉系の系列細胞型とは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの発現が差次的または高いレベルであるが、膵臓内分泌細胞の特質である遺伝子、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１およびＧＬＵＴ１は実質的に発現しないことに基づいて区別される。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は他の非膵臓構造（例えば、十二指腸）に分化することができる。一実施形態では、本明細書に記載されるＮＧＮ３発現内分泌前駆体は、成熟した膵臓系列細胞、例えば膵臓内分泌細胞に分化する。膵臓内胚葉または内分泌前駆細胞集団およびその方法は、米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐａｎｃｒｅａｔｉｃｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００７年７月５日出願、および米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＯＲＭＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願にも記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 As used herein, “pancreatic endoderm”, “pancreatic epithelial”, “pancreatic epithelium” (all abbreviated as “PE”) “pancreatic precursor”, “PDX-1 positive pancreatic endoderm or its equivalent, such as pancreatic endoderm cells (“PEC”), are all precursor or precursor pancreatic cells. The PECs described herein are progenitor cell populations after stage 4 differentiation (about day 12-14) and express at least two major distinct populations: i) NKX6.1 but CHGA. Not (or CHGA negative, CHGA-) pancreatic progenitor cells; and ii) CHGA-expressing polyhormonal endocrine cells (CHGA positive, CHGA+). Without being bound by theory, a cell population that expresses NKX6.1 but not CHGA is postulated to be the more active and therapeutic component of PEC, while a population of CHGA-positive multihormonal endocrine cells. Are hypothesized to further differentiate and mature into glucagon-expressing islet cells in vivo. (2011) Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types, derived from human tembr cells, both of which are fully incorporated herein by reference. 29(8):750-756, July 31, 2011, online publication and Schulz et al. (2012), A Scalable System for Functional of Functional Progenitors 700 from7, Embryonics4, 7(5). Please refer to.
Furthermore, sometimes pancreatic endoderm cells are generally used to refer to at least stage 3 and stage 4 cells rather than to the PECs described immediately above. The use and meaning will be clear from the context. In this manner, the pancreatic endoderm derived from pluripotent stem cells, and at least hES cells and hIPS cells, PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA1, cMYC, NGN3, Genes that are characteristic of pancreatic endocrine cells, such as CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAFA, PCSK1 and, although expression of a marker selected from the PAX4, ARX and NKX2.2 markers is differentially or at high levels GLUT1 is distinguished on the basis that it is not substantially expressed. In addition, some "endocrine precursor cells" expressing NGN3 are capable of differentiating into other non-pancreatic structures (eg, duodenum). In one embodiment, the NGN3 expressing endocrine precursors described herein differentiate into mature pancreatic lineage cells, eg pancreatic endocrine cells. Pancreatic endoderm or endocrine progenitor cell populations and methods are described in US patent application Ser. No. 11/773,944, entitled Methods of producing pancreatic hornes, filed Jul. 5, 2007, and US patent application Ser. No. 12/107,020. , METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS, also filed Apr. 21, 2008, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties.

本明細書で使用される場合、「内分泌先駆細胞」は、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現し、限定されずに膵島ホルモン発現細胞などの内分泌系の細胞にさらに分化することができる、胚体内胚葉系列の多分化能細胞を指す。内分泌先駆細胞は、より低い特異性で分化した胚体内胚葉系列細胞、例えばＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞と比較して、同じくらい多くの異なる細胞、組織および／または器官タイプには分化することができない。 As used herein, an "endocrine precursor cell" expresses neurogenin 3 (NEUROG3) and can be further differentiated into cells of the endocrine system such as, but not limited to, pancreatic islet hormone-expressing cells, in the definitive body. Refers to multipotent cells of the germ layer lineage. Endocrine precursor cells are unable to differentiate into as many different cell, tissue and/or organ types as compared to less specific differentiated definitive endoderm lineage cells such as PDX1-positive pancreatic endoderm cells ..

本明細書で使用される場合、「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」またはその同等物は、ｉｎｖｉｔｒｏで多能性細胞から誘導された、複数ホルモン性または単一ホルモン性であってもよい細胞を指す。したがって、内分泌細胞は、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも一部を有する、１つまたは複数の膵臓ホルモンを発現することができる。膵島ホルモン発現細胞は、成熟していても未熟であってもよい。未熟な膵島ホルモン発現細胞は、特定のマーカーの差次的発現に基づくか、それらの機能的能力、例えばグルコース応答性に基づいて、成熟した膵島ホルモン発現細胞から区別することができる。 As used herein, a "pancreatic islet hormone-expressing cell", "pancreatic endocrine cell" or equivalent thereof is a multi-hormonal or mono-hormonal derivative derived from pluripotent cells in vitro. Refers to good cells. Thus, endocrine cells can express one or more pancreatic hormones that have at least some of the functions of human islet cells. The islet hormone-expressing cells may be mature or immature. Immature pancreatic islet hormone-expressing cells can be distinguished from mature pancreatic islet hormone-expressing cells on the basis of the differential expression of certain markers or on their functional capacity, eg glucose responsiveness.

本明細書に記載の実施形態では、限定培地、馴化培地、フィーダーフリー培地、無血清培地などを含めた多くの幹細胞培地培養物または成長環境が想定される。本明細書で使用される場合、「成長環境」または「環境」という用語またはその等価物は、未分化の幹細胞または分化した幹細胞（例えば、霊長類胚性幹細胞）がｉｎｖｉｔｒｏで増殖する環境である。環境の特徴は、細胞を培養する培地、および存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基質など）を含む。多能性細胞を培養または維持するためおよび／または多能性細胞を分化させるための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＵＳＥＦＵＬＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥＣＥＬＬＳ、２００７年２月２３日出願；米国特許出願第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＵＳＥＴＨＥＲＥＯＦ、２００７年１２月２０日出願；および米国特許出願第１１／８７５，０５７号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ、２００７年１０月１９日出願にも記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The embodiments described herein contemplate many stem cell media cultures or growth environments, including defined media, conditioned media, feeder-free media, serum-free media, and the like. As used herein, the term “growth environment” or “environment” or equivalents thereof refers to an environment in which undifferentiated stem cells or differentiated stem cells (eg, primate embryonic stem cells) proliferate in vitro. is there. Environmental features include the medium in which the cells are cultured, and supporting structures, if any, such as substrates on a solid surface. Methods for culturing or maintaining pluripotent cells and/or differentiating pluripotent cells are described in PCT/US2007/062755, entitled COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS, filed February 23, 2007; Patent application No. 11/993,399, title EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF, filed December 20, 2007; It is also described in the pluripotent stem cell media containing human serum, filed October 19, 2007, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference.

「本質的に」または「実質的に」という用語は、ある成分または細胞が、最小または少ない量で任意の細胞凝集懸濁液タイプ、例えば本明細書に記載される懸濁液中の細胞凝集体中に存在することが、「本質的または実質的に均一」、「本質的または実質的にホモ細胞性」であること、あるいは、「本質的にｈＥＳ細胞」、「本質的または実質的に胚体内胚葉細胞」、「本質的または実質的に前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性前膵臓内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または前駆細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞」、「本質的または実質的に膵臓内分泌先駆細胞」、「本質的または実質的に膵臓内分泌細胞」等で構成されることを意味する。 The term “essentially” or “substantially” means that certain components or cells are present in minimal or small amounts in any cell aggregation suspension type, such as cell aggregation in suspension as described herein. Present in the aggregate is "essentially or substantially homogenous", "essentially or substantially homocellular", or "essentially hES cells", "essentially or substantially". "Definitive endoderm cell", "essentially or substantially foregut endoderm cell", "essentially or substantially PDX1-negative foregut endoderm cell", "essentially or substantially PDX1-positive fore pancreatic endoderm cell" , "Essentially or substantially PDX1-positive pancreatic endoderm or progenitor cell", "essentially or substantially PDX1-positive pancreatic endoderm end cell", "essentially or substantially pancreatic endocrine precursor cell", "essential" Or pancreatic endocrine cells" or the like.

細胞培養中または細胞集団内の細胞に関して、「を実質的に含まない」という用語は、細胞培養物または細胞集団が含まれないと特定された細胞型が、細胞培養物または細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在することを意味する。 With respect to cells in or within a cell population, the term "substantially free of" means that a cell type identified as free of cell culture or population of cells is present in the cell culture or population of cells. Less than about 10%, less than about 9%, less than about 8%, less than about 7%, less than about 6%, less than about 5%, less than about 4%, less than about 3%, less than about 2% or It is meant to be present in an amount less than about 1%.

細胞培養物は、含有する血清が減少しているまたは血清を実質的に含まないまたは血清を含まない培地中で成長させることができる。ある特定の培養条件下で、血清濃度は約０％（ｖ／ｖ）から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲とすることができる。例えば、いくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％未満（ｖ／ｖ）、約２％未満（ｖ／ｖ）、約３％未満（ｖ／ｖ）、約４％未満（ｖ／ｖ）、約５％未満（ｖ／ｖ）、約６％未満（ｖ／ｖ）、約７％未満（ｖ／ｖ）、約８％未満（ｖ／ｖ）、約９％未満（ｖ／ｖ）または約１０％（ｖ／ｖ）未満であってよい。いくつかのプロセスでは、血清を用いずに、または血清代替物を用いずに前原条細胞を成長させる。さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で前原条細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってよい。 Cell cultures can be grown in medium that is low in serum or is substantially free of serum or serum free. Under certain culture conditions, serum concentrations can range from about 0% (v/v) to about 10% (v/v). For example, in some differentiation processes, the serum concentration of the medium is less than about 0.05% (v/v), less than about 0.1% (v/v), less than about 0.2% (v/v). , Less than about 0.3% (v/v), less than about 0.4% (v/v), less than about 0.5% (v/v), less than about 0.6% (v/v), about Less than 0.7% (v/v), less than about 0.8% (v/v), less than about 0.9% (v/v), less than about 1% (v/v), less than about 2% ( v/v), less than about 3% (v/v), less than about 4% (v/v), less than about 5% (v/v), less than about 6% (v/v), less than about 7% ( v/v), less than about 8% (v/v), less than about 9% (v/v) or less than about 10% (v/v). In some processes, preprimitive streak cells are grown without serum or without serum replacement. In yet another process, preprimitive streak cells are grown in the presence of B27. In such a process, the concentration of B27 supplement may range from about 0.1% (v/v) to about 20% (v/v).

さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で未成熟膵島ホルモン発現細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までの範囲であってもよく、約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度であってもよい。ある特定のプロセスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）である。あるいは、添加するＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の強度の倍数として測定することができる。例えば、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から５０×ストック溶液として入手可能である。十分な量のこのストック溶液を十分な体積の成長培地に添加することにより、所望の量のＢ２７が補充された培地を生成する。例えば、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに添加することにより、５×Ｂ２７が補充された成長培地を生成することになる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×および約２０×超であってよい。 In yet another process, immature pancreatic islet hormone-expressing cells are grown in the presence of B27. In such a process, the concentration of B27 supplement may range from about 0.1% (v/v) to about 20% (v/v), with concentrations greater than about 20% (v/v). May be In one particular process, the concentration of B27 in the medium is about 0.1% (v/v), about 0.2% (v/v), about 0.3% (v/v), about 0. 4% (v/v), about 0.5% (v/v), about 0.6% (v/v), about 0.7% (v/v), about 0.8% (v/v) ), about 0.9% (v/v), about 1% (v/v), about 2% (v/v), about 3% (v/v), about 4% (v/v), about 5% (v/v), about 6% (v/v), about 7% (v/v), about 8% (v/v), about 9% (v/v), about 10% (v/ v), about 15% (v/v) or about 20% (v/v). Alternatively, the concentration of B27 supplement added can be measured as a multiple of the strength of the commercially available B27 stock solution. For example, B27 is available as a 50X stock solution from Invitrogen (Carlsbad, CA). A sufficient amount of this stock solution is added to a sufficient volume of growth medium to produce medium supplemented with the desired amount of B27. For example, adding 10 ml of 50×B27 stock solution to 90 ml of growth medium will produce a growth medium supplemented with 5×B27. The concentration of B27 supplement in the medium is about 0.1×, about 0.2×, about 0.3×, about 0.4×, about 0.5×, about 0.6×, about 0.7×. , About 0.8×, about 0.9×, about 1×, about 1.1×, about 1.2×, about 1.3×, about 1.4×, about 1.5×, about 1. 6x, about 1.7x, about 1.8x, about 1.9x, about 2x, about 2.5x, about 3x, about 3.5x, about 4x, about 4.5x , About 5x, about 6x, about 7x, about 8x, about 9x, about 10x, about 11x, about 12x, about 13x, about 14x, about 15x, about 16x, about It may be 17x, about 18x, about 19x, about 20x and more than about 20x.

本明細書で使用される場合、例えば成長因子、分化因子などの「外因的に添加された」化合物とは、培養物または馴化培地に関しては、培養物または培地にすでに存在していてもよい任意の化合物または成長因子を補うために培養物または培地に添加される成長因子を指す。例えば、一部の実施形態では、細胞培養物および／または細胞集団は、外因的に添加されたレチノイドを含まない。 As used herein, an "exogenously added" compound, such as a growth factor, a differentiation factor, etc., with respect to a culture or conditioned medium, may be any that may already be present in the culture or medium. Growth factor added to the culture or medium to supplement the compound or growth factor of. For example, in some embodiments, the cell culture and/or cell population does not include exogenously added retinoid.

本明細書で使用される場合、「レチノイド」とは、レチノール、レチナールまたはレチノイン酸ならびにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。 As used herein, "retinoid" refers to retinol, retinal or retinoic acid as well as derivatives of any of these compounds. In a preferred embodiment, the retinoid is retinoic acid.

「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３からなる群から選択されるＦＧＦを意味する。一部の実施形態では、「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」とは、公知の線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーとの相同性および／またはそれと同様の機能を有する任意の成長因子を意味する。 “FGF family growth factor”, “fibroblast growth factor” or “member of fibroblast growth factor family” means FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12. , FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, and FGF23. In some embodiments, "FGF family growth factor," "fibroblast growth factor," or "member of the fibroblast growth factor family" refers to homology with known members of the fibroblast growth factor family and And/or any growth factor having a similar function.

本明細書で使用される場合、「発現」は、材料または物質の生成ならびに材料または物質の生成のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を決定することとは、発現されるマーカーの相対量または絶対量を検出することまたは単にマーカーが存在するかしないかを検出することを指す。 As used herein, "expression" refers to the production of a material or substance as well as the level or amount of production of the material or substance. Thus, determining the expression of a particular marker refers to detecting the relative or absolute amount of the expressed marker or simply detecting the presence or absence of the marker.

本明細書で使用される場合、「マーカー」は、観察または検出することができる任意の分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または小分子（例えば、分子量が１０，０００ａｍｕ未満の分子）を挙げることができる。 As used herein, "marker" refers to any molecule that can be observed or detected. For example, markers include, but are not limited to, nucleic acids such as transcripts of specific genes, polypeptide products of genes, non-gene product polypeptides, glycoproteins, carbohydrates, glycolipids, lipids, lipoproteins or small molecules ( For example, a molecule having a molecular weight of less than 10,000 amu) can be mentioned.

本明細書に記載の大多数のマーカーについて、公式のＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＨＵＧＯ）遺伝子記号が提供される。ＨＵＧＯＧｅｎｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより開発されるそのような記号により、命名されたヒト遺伝子および遺伝子産物のそれぞれに対して特有の略語が提供される。当業者はこれらの遺伝子記号を容易に認識することができ、また、対応する独特のヒト遺伝子および／またはタンパク質配列と容易に関連付けることができる。 The official Human Genome Organization (HUGO) gene symbols are provided for the majority of the markers described herein. Such symbols, developed by the HUGO Gene Nomenclature Committee, provide unique abbreviations for each of the named human genes and gene products. Those of skill in the art can readily recognize these gene symbols and can easily associate them with the corresponding unique human gene and/or protein sequences.

ＨＵＧＯによる名称によると、以下の遺伝子記号は次のように定義される：ＧＨＲＬ−グレリン；ＩＡＰＰ−島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ−インスリン；ＧＣＧ−グルカゴン；ＩＳＬ１−ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６−ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４−ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３−ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２−２−ＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６−１−ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１−インスリンプロモーター因子１（ＰＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１−ワンカットドメイン、ファミリーメンバー１（ＨＮＦ６）；ＨＬＸＢ９−ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２−転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ）；ＦＯＸＡ１−フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ−肝細胞成長因子；ＩＧＦ１−インスリン様成長因子１；ＰＯＵ５Ｆ１−ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＯＣＴ４）；ＮＡＮＯＧ−Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２；ＣＤＨ１−カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４−線維芽細胞成長因子４；ＷＮＴ３−無翅型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー３；ＳＯＸ１７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１７；ＧＳＣ−グースコイド；ＣＥＲ１−（ケルベロス１、システインノットスーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４−ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４；ＦＧＦ１７−線維芽細胞成長因子１７；ＦＯＸＡ２−フォークヘッドボックスＡ２；ＳＯＸ７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；ＳＯＸ１−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１；ＡＦＰ−アルファ−フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ−分泌タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；およびＴＨＢＤ−トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ−神経系細胞接着分子；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＺＩＣ１−Ｚｉｃファミリーメンバー１；ＮＥＦ３−神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ−ソマトスタチン；ＭＡＦＡ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＣＨＧＡ−クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌型タンパク質１）。 According to the HUGO designation, the following gene symbols are defined as follows: GHRL-ghrelin; IAPP-island amyloid polypeptide; INS-insulin; GCG-glucagon; ISL1-ISL1 transcription factor; PAX6-paired box gene. 6; PAX4-paired box gene 4; NEUROG3-neurogenin 3 (NGN3); NKX2-2-NKX2 transcription factor-related locus 2 (NKX2.2); NKX6-1-NKX6 transcription factor-related locus 1 (NKX6. 1); IPF1-insulin promoter factor 1 (PDX1); ONECUT1-one-cut domain, family member 1 (HNF6); HLXB9-homeobox B9 (HB9); TCF2-transcription factor 2, liver (HNF1b); FOXA1-forkhead Box A1; HGF-hepatocyte growth factor; IGF1-insulin-like growth factor 1; POU5F1-POU domain, class 5, transcription factor 1 (OCT4); NANOG-Nanog homeobox; SOX2-SRY (sex determination region Y)-box 2; CDH1-cadherin type 1, type 1, E-cadherin (ECAD); T-brachury homolog (BRACH); FGF4-fibroblast growth factor 4; WNT3-wingless MMTV integration site family, member 3; SOX17-SRY. (Sex determining region Y)-Box 17; GSC-Gouscoid; CER1-(Cerberus 1, cysteine knot superfamily, homologue (CER); CXCR4-chemokine (C-X-C motif) receptor 4; FGF17-fibroblast Growth factor 17; FOXA2-forkhead box A2; SOX7-SRY (sex determining region Y)-box 7; SOX1-SRY (sex determining region Y)-box 1; AFP-alpha-fetoprotein; SPARC-secreted protein, acidic, Cysteine rich (osteonectin); and THBD-thrombomodulin (TM), NCAM-nerve cell adhesion molecule; SYP-synaptophysin; ZIC1-Zic family member 1; NEF3-neurofilament 3 (NFM); SST-somatostatin; MAFA-v. -Maf muscle aponeurotic fibrosarcoma cancer gene homolog A; MAFB-v-maf myoftendial fibrosarcoma cancer gene homolog B; SYP-synaptophysin; CHGA-chromogranin A (parathyroid secretory protein 1).

非ＨＵＧＯ遺伝子記号に対応する完全遺伝子名、ならびに本明細書で使用することができる他の略記号を以下に提供する：ＳＳ−ソマトスタチン（ＳＯＭ）；ＰＰ−膵臓ポリペプチド；Ｃペプチド−接続ペプチド；Ｅｘ４−エキセンディン４；ＮＩＣ−ニコチンアミドおよびＤＡＰＴ−Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；ＲＡ−レチノイン酸；ＲＰＭＩ−ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ培地；ＣＭＲＬ−ＣｏｎｎａｕｇｈｔＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ培地；ＦＢＳ−ウシ胎児血清；ＮＢＰ１０−ＮＣＡＭ結合タンパク質１０；ＰＴＦ１ａ−膵臓特異的転写因子１ａ。 Provided below are full gene names corresponding to non-HUGO gene symbols, as well as other abbreviations that can be used herein: SS-somatostatin (SOM); PP-pancreatic polypeptide; C-peptide-connecting peptide; Ex4-Exendin 4; NIC-nicotinamide and DAPT-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; RA-retinoic acid; RPMI-Roswell Park Memorial Institute medium; CMRL-Connaught Medical Research Labs medium; FBS-fetal bovine serum; NBP10-NCAM binding protein 10; PTF1a-pancreas specific transcription factor 1a.

多能性細胞から種々の多分化能および／または分化した細胞への進行は、遺伝子、または遺伝子マーカーの相対的な発現量、特定の細胞の特性を、第２の遺伝子または対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現と比較して決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。そのようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成するマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用することによるものである。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子の発現産物は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる。 Progression from pluripotent cells to various pluripotent and/or differentiated cells may depend on the relative expression level of a gene or gene marker, the characteristics of a particular cell, a second gene or a control gene such as a house. It can be monitored by determining relative to the expression of the keeping gene. In some processes, the expression of a particular marker is determined by detecting the presence or absence of the marker. Alternatively, the expression of a particular marker can be determined by measuring the level at which the marker is present in cells of a cell culture or cell population. In such a process, the measurement of marker expression may be qualitative or quantitative. One way to quantify the expression of the marker produced by the marker gene is by using quantitative PCR (Q-PCR). Methods of performing Q-PCR are well known in the art. Other methods known in the art can also be used to quantify marker gene expression. For example, the expression product of the marker gene can be detected by using an antibody specific for the marker gene product of interest.

いくつかのプロセスでは、以下の遺伝子の高発現により、細胞のある特定の集団が示される。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＦＰまたはＴＨＢＤにより胚体外内胚葉が示され、ＮＯＤＡＬおよび／またはＦＧＦ８により前原条が示され、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１および／またはＷＮＴ３により中内胚葉が示され、ＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２により胚体内胚葉細胞が示され、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａにより前腸内胚葉（またはＰＤＸ１陰性内胚葉）が示され、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１によりＰＤＸ１陽性内胚葉が示され、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦＡ１、ＣＰＡおよびｃＭＹＣにより膵臓上皮（ＰＥまたは膵臓前駆体）が示され、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２により内分泌先駆細胞が示され、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰにより種々の内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現がＭＡＦＢ遺伝子発現に対して相対的に高いことにより、インスリン分泌内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現に対するＭＡＦＢの相対的な高発現により、グルカゴン分泌内分泌細胞が示される。 In some processes, high expression of the following genes indicates a certain population of cells. For example, SOX17, SOX7, AFP or THBD indicate extraembryonic endoderm, NODAL and/or FGF8 indicate preprimitive streak, brachyury, FGF4, SNA1 and/or WNT3 indicate mesoendoderm, CER, GSC. , CXCR4, SOX17 and FOXA2 indicate definitive endoderm cells, SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B and HNF4A indicate foregut endoderm (or PDX1-negative endoderm) and PDX1, HNF6, SOX9 and PROX1 positive. Endoderm is shown, PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA and cMYC show pancreatic epithelium (PE or pancreatic precursors), NGN3, PAX4, ARX and NKX2.2 show endocrine precursor cells, INS, GCG, GHRL, SST and PP show various endocrine cells, and MAFA gene expression is relatively high relative to MAFB gene expression, indicating insulin secreting endocrine cells, and MAFB gene expression relative to MAFA gene expression. High expression indicates glucagon-secreting endocrine cells.

用語線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、同義である。 The terms fibroblast growth factor 7 (FGF7) and keratinocyte growth factor (KGF) are synonymous.

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するための方法
本明細書に記載の実施形態は、いかなる１つの型のｉＰＳ細胞にも、いかなる１つのｉＰＳ細胞の生成方法にも限定されない。種々の方法が存在するので、実施形態は限定的なものではない、またはｉＰＳ細胞の生成の効率のレベルに左右される。本明細書に記載の実施形態はｉＰＳ細胞の内胚葉系列細胞への分化およびその使用にあてはまる。 Methods for Generating Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells The embodiments described herein are not limited to any one type of iPS cells or any one method of generating iPS cells. The embodiments are not limiting, as there are a variety of methods, or depend on the level of efficiency of iPS cell generation. The embodiments described herein apply to the differentiation of iPS cells into endoderm lineage cells and their use.

アデノウイルス、プラスミド、またはＣｒｅ−ｌｏｘＰ３もしくはｐｉｇｇｙＢＡＣ転位を使用したリプログラミング因子の切除を使用する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせるためのウイルスによる方法、ウイルスによらない方法および非組込み型ウイルスによる方法が記載されている。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２、９４５−９４９（２００８）；Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２、９４９−９５３（２００８）；Ｋａｊｉ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４５８、７７１−７７５（２００９）；Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ１３６、９６４−９７７（２００９）；およびＷｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４５８、７６６−７７０（２００９）を参照されたい。同様に、それらもまた参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号（２０１０年１月７日公開）およびＳｈｉらに対するＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３７４２９も参照されたい。しかし、これらの方法のリプログラミング効率は低く（＜０．００３％）、切除にもかかわらずベクター配列が残留する可能性があり、それにより、それらの治療への適用が限定される。例えば、上記の転写因子の宿主ゲノムへのウイルスによる組み込みおよび過剰発現は腫瘍形成に関連付けられており、導入遺伝子の発現が残留することは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を区別する潜在的な特徴である。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｏｌｄｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ１３６：９６４−９７７（２００９）；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４：１４９１−１５００（２００５）；およびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ１２１：４６５−４７７（２００５）を参照されたい。 Viral, non-viral and non-integrated methods for generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) using adenovirus, plasmids, or excision of reprogramming factors using Cre-loxP3 or piggy BAC transposition Methods with type I viruses have been described. Stadtfeld, M. et al., fully incorporated herein by reference. Et al., Science 322, 945-949 (2008); Okita, K.; Et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K.; Et al., Nature 458, 771-775 (2009); Soldner, F.; Et al., Cell 136, 964-977 (2009); and Woltjen, K.; Et al., Nature 458, 766-770 (2009). Similarly, they are also fully incorporated herein by reference, Mack, A. et al. See also U.S. Patent Application Publication No. 2010100357 (published January 7, 2010) to Shi et al. and PCT/US2009/037429 to Shi et al. However, the reprogramming efficiency of these methods is low (<0.003%) and vector sequences may remain despite excision, which limits their therapeutic application. For example, viral integration and overexpression of the above transcription factors into the host genome have been associated with tumorigenesis, and residual transgene expression is a potential feature distinguishing ES and iPS cells. .. Solder, F. et al., fully incorporated herein by reference. Et al., Cell 136:964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24:1491-1500 (2005); and Hochedlinger, K. et al. Et al., Cell 121:465-477 (2005).

本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法はエプスタイン・バーウイルス由来のエピソームベクターを含む。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４、７９７−８０１（２００９）およびＭａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号、２０１０年１月７日公開を参照されたい。これらの方法では、癌遺伝子ＳＶ４０を含めた７種の因子の組合せを有する３つの別々のプラスミドが必要である。 In another embodiment of the invention, the method for generating iPSCs comprises an Epstein-Barr virus derived episomal vector. Yu, J. et al., fully incorporated herein by reference. Et al., Science 324, 797-801 (2009) and Mack, A.; See U.S. Patent Application Publication No. 2010003357, published Jan. 7, 2010, et al. These methods require three separate plasmids with a combination of seven factors including the oncogene SV40.

本発明の別の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法は、マウス細胞およびヒト胎児細胞および新生児細胞由来のタンパク質に基づくｉＰＳＣを含む。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４、３８１−３８４（２００９）；およびＫｉｍ，Ｄ．ら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４、４７２−４７６（２００９）を参照されたい。これらの方法体系は、化学的処理（例えば、Ｚｈｏｕら、２００９、上記の場合ではバルプロ酸）または多数回の処理（Ｋｉｍら、２００９、上記）を使用して実現される。 In another embodiment of the invention, the method for generating iPSCs comprises protein-based iPSCs from mouse cells and human fetal cells and neonatal cells. Zhou, H. et al., fully incorporated herein by reference. Et al., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); and Kim, D. et al. Et al., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009). These methodologies are implemented using chemical treatments (eg Zhou et al., 2009, valproic acid in the above cases) or multiple treatments (Kim et al., 2009, supra).

本発明の別の実施形態では、細菌の複製開始点および抗生物質耐性遺伝子を欠くスーパーコイルＤＮＡ分子であるミニサークルベクターまたはプラスミドを使用することができる。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８、４９５−５００（２００３）；Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１６、１２６−１３１（２００５）；およびＪｉａ，Ｆら、ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓＡｄｖａｎｃｅＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＯｎｌｉｎｅ７Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１０を参照されたい。これらの方法体系では、外因性サイレンシング機構の活性化が低いので、より高いトランスフェクション効率およびより長期の異所性発現でｉＰＳＣが生じる。 In another embodiment of the invention, a minicircle vector or plasmid that is a supercoiled DNA molecule lacking a bacterial origin of replication and an antibiotic resistance gene can be used. Chen, Z., fully incorporated herein by reference. -Y. Et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003); Chen, Z.; -Y. Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005); and Jia, F et al., Nature Methods Advance Publication Online 7 February 2010. These methodologies result in iPSCs with higher transfection efficiency and longer ectopic expression due to lower activation of the exogenous silencing machinery.

本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者、ＡＬＳ、脊椎筋ジストロフィーおよびパーキンソン患者を含めた種々の疾患のヒト患者からｉＰＳ細胞を生じさせることができる。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｅｈｒら、ＰＮＡＳＵＳＡ１０６（３７）：１５７６８−７３（２００９）；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１：１２１８−２１（２００８）；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ４５７：２７７−８０（２００９）；Ｐａｒｋら、Ｃｅｌｌ１３４：８７７−８８６（２００８）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ１３６：９６４−９７７を参照されたい。特定の疾患を有する患者からｈＩＰＳ細胞を生成することの少なくとも１つの利点は、導出された細胞がヒト疾患の遺伝子型および細胞応答を含有することである。現存するヒトｉＰＳ細胞株の少なくとも一部が列挙されている表３も参照されたい。この情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載の組成物および方法の複数の実施形態では、これだけに限定されないが、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２１２、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２５、（少なくとも本出願の出願時に、ＶｉａＣｙｔｅＩｎｃ．、３５５０ＧｅｎｅｒａｌＡｔｐｍｉｃｓＣｏｕｒｔ、ＳａｎＤｅｉｇｏＣＡ９２１２１から市販されていた）、ＢＧＯ１、ＢＧ０２およびＭＥＬ１を含めたｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞、ならびにｉＰＳＣ−４８２ｃ７およびｉＰＳＣ−６０３（ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ならびにｉＰＳＣ−Ｇ４（以下「Ｇ４」）およびｉＰＳＣ−Ｂ７（以下、「Ｂ７」）（ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａ、ＣｅｎｔｅｒｆｏｒｉＰＳＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含めた種々の分化可能な霊長類多能性幹細胞の使用が意図されており、Ｇ４およびＢ７を使用した試験は、本明細書に詳しく記載されている。ある特定のこれらのヒト多能性幹細胞はＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）などの国際登録機関に登録され、ＮＩＨＨｕｍａｎＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている（例えば、ＣｙＴ４９の登録番号は００４１である）。他の入手可能な細胞株はｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙのワールドワイドウェブにも見出すことができる。さらに他の細胞株、例えば、ＢＧ０１およびＢＧＯ１ｖは、それぞれＷｉｓｃｏｎｓｉｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌ（ＷＩＳＣ）Ｂａｎｋの関係団体であるＷｉＣｅｌｌ（登録商標）（カタログ名、ＢＧ０１）およびＡＴＣＣ（カタログ番号ＳＣＲＣ−２００２）によって第三者に販売および配布されている。本明細書に記載の他の細胞株はＷｉＣｅｌｌ（登録商標）またはＡＴＣＣなどの生物学的リポジトリによって登録または配布されていない場合があるが、そのような細胞株は原理研究者、研究室および／または施設から直接または間接的に公に入手可能である。細胞株および試薬の公開要求は、例えば生命科学の当業者にとっては通例である。一般には、これらの細胞または材料の譲渡は、細胞株または材料の所有者と受取人の間の標準の材料譲渡契約を介する。これらの型の材料譲渡は、特に生命科学における研究環境では頻繁に生じる。実際、出願人は、ＣｙＴ４９（２００６）、ＣｙＴ２０３（２００５）、Ｃｙｔ２１２（２００９）、ＣｙＴ２５（２００２）、ＢＧ０１（２００１）、ＢＧ０２（２００１）、ＢＧ０３（２００１）およびＢＧＯｌｖ（２００４）を含めた細胞が導出され特徴付けられた時から、営利および非営利産業パートナーおよび共同研究者とのそのような契約を通じて常套的に細胞の譲渡を受けてきた。前記の一覧の各細胞株の隣の括弧内の年は、細胞株または材料が公的に入手可能かつ不死のものになった（例えば細胞バンクが作製された）年を示し、したがって、組成物を作製するためおよび本明細書に記載の方法を実施するためにこれらの細胞株が樹立された時から別の胚の破壊は実施または要求されていない。
２００６年８月、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、ｈＥＳＣは単一の割球から誘導することができ、したがって胚を無傷にしておき、それらの破壊を引き起こさないことを実証した。顕微操作技術を使用して各胚から生検を実施し、十九（１９）個のＥＳ細胞様増生および二（２）個の安定したｈＥＳＣ系が得られた。これらのｈＥＳＣ系は六（６）カ月以上も未分化状態に維持することができ、正常な核型、ならびにＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇおよびアルカリ性ホスファターゼを含む多能性のマーカーの発現を示した。これらのｈＥＳＣは、ｉｎｖｉｔｒｏで全て三つ（３つ）の胚性胚葉の誘導体を分化、形成すること、およびｉｎｖｉｖｏでテラトーマの形で形成することができる。胚の破壊なしで新しい幹細胞系を作製するこれらの方法は、ヒト胚を使用することの倫理上の懸念に対処する。その開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４４：４８１〜５頁、Ｅｐｕｂ２００６年８月２３日を参照。しかし、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、誘導したｈＥＳＣ系を他のｈＥＳＣと共培養した。後に、２００８年に、ＣｈｕｎｇＹ．らは、ｈＥＳＣとの共培養なしで単一の割球から再びｈＥＳ細胞系を得ることができた。参照により本明細書に完全に組み込まれる、ＣｈｕｎｇＹ．ら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２００８、２（２）、１１３〜１１７頁を参照。したがって、本明細書に記載される組成物および方法、特に人工多能性幹細胞または遺伝的に脱分化した多能性幹細胞に関連するようなそのような組成物および方法は、ヒト胚の破壊を必要としない。
表３および表４は、それぞれ、ある特定のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの包括的ではない一覧であり、研究目的および／または商業目的で世界的に利用可能であり、本発明の方法および組成物での使用に適している。表３および表４の情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＨｕｍａｎＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載のヒトｉＰＳＣ（少なくともｉＰＳＣ−６０３およびｉＰＳＣ−４８２−ｃ７）はＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により提供されたものである。

In yet another embodiment of the invention, iPS cells can be generated from human patients with various diseases, including diabetic patients, ALS, spinal muscular dystrophy and Parkinson's patients. Maehr et al., PNAS USA 106(37):15768-73 (2009); Dimos et al., Science 321:1218-21 (2008); Evert et al., Nature 457:277-, fully incorporated herein by reference. 80 (2009); Park et al., Cell 134:877-886 (2008); and Soldner et al., Cell 136:964-977. At least one advantage of generating hIPS cells from patients with a particular disease is that the derived cells contain the human disease genotype and cellular response. See also Table 3 which lists at least some of the existing human iPS cell lines. This information is available in the literature and, for example, in the National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry, the Human Embryonic Stem Cell Registry and in the United States of America, in the United States of America, in the United States of America. It is obtained from various databases. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained.
Embodiments of the compositions and methods described herein include, but are not limited to, CyT49, CyT212, CyT203, CyT25, (at least as of the filing of this application, ViaCyte Inc., 3550 General Attempts Court, San Degoo. CA 92121), human pluripotent stem cells such as hESCs including BGO1, BG02 and MEL1, and iPSC-482c7 and iPSC-603 (Cellular Dynamics International, Inc., Madison, Wisconsin), and iPSC-. G4 (hereinafter “G4”) and iPSC-B7 (hereinafter “B7”) (Shinya Yamanaka, Center for iPS Cell Research, Kyoto University) and other various pluripotent stem (iPS) cells that can be differentiated. The use of primate pluripotent stem cells is intended, and tests with G4 and B7 are described in detail herein. Certain of these human pluripotent stem cells are registered with international registration agencies such as the National Institutes of Health (NIH) and listed in the NIH Human Stem Cell Registry (eg, CyT49 registration number is 0041). Other available cell lines are stemcells. nih. It can also be found on the World Wide Web at gov/research/registry. Still other cell lines, such as BG01 and BGO1v, were third-classified by WiCell® (catalog name, BG01) and ATCC (catalog number SCRC-2002), which are affiliates of the Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank, respectively. Sold and distributed to people. Although other cell lines described herein may not be registered or distributed by biological repositories such as WiCell® or ATCC, such cell lines may be used by principle researchers, laboratories and/or Or it is publicly available directly or indirectly from the facility. The requirement to publish cell lines and reagents is routine, for example to those skilled in the life sciences. Generally, the transfer of these cells or materials is through a standard material transfer agreement between the owner and recipient of the cell line or material. These types of material transfers frequently occur, especially in research settings in life sciences. In fact, the Applicant has found that cells including CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt212 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) and BGOlv (2004) were included. From the time it was derived and characterized, it has routinely received cell transfers through such contracts with for-profit and non-profit industry partners and co-workers. The year in brackets next to each cell line in the above list indicates the year in which the cell line or material became publicly available and immortalized (eg, the cell bank was created), and thus the composition No disruption of another embryo has been performed or required from the time these cell lines were established to produce the cells and to practice the methods described herein.
In August 2006, Klimanskaya et al. demonstrated that hESCs can be derived from a single blastomere, thus leaving the embryos intact and not causing their destruction. Biopsies were performed from each embryo using micromanipulation techniques resulting in nineteen (19) ES cell-like outgrowths and two (2) stable hESC lines. These hESC lines can remain undifferentiated for more than six (6) months, with normal karyotype, as well as Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1- Expression of pluripotency markers including 81, Nanog and alkaline phosphatase was shown. These hESCs are capable of differentiating and forming all three (three) embryonic germ layer derivatives in vitro and forming teratomas in vivo. These methods of creating new stem cell lines without embryo destruction address the ethical concerns of using human embryos. See Klimanskaya et al. (2006) Nature 444:481-5, Epub August 23, 2006, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. However, Klimanskaya et al. co-cultured the induced hESC line with other hESCs. Later, in 2008, Chung Y. Et al. were able to obtain the hES cell line again from a single blastomere without co-culture with hESC. Chung Y. et al., fully incorporated herein by reference. Et al., Cell Stem Cell 2008, 2(2), pages 113-117. Accordingly, the compositions and methods described herein, particularly those such as those associated with induced pluripotent stem cells or genetically dedifferentiated pluripotent stem cells, are useful for the destruction of human embryos. do not need.
Tables 3 and 4 are a non-exhaustive list of certain iPSCs and hESCs, respectively, that are globally available for research and/or commercial purposes and for use in the methods and compositions of the invention. Suitable for The information in Tables 3 and 4 is in the literature and in, for example, National Institutes of Health (NIH) Human Stem Cell Registry, Human Embryonic Stem Cell History and UsasMatters, Inc., USA. It is obtained from publicly available databases. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained.
Human iPSCs described herein (at least iPSC-603 and iPSC-482-c7) are commercially available from Cellular Dynamics International, Inc. (Madison, Wisconsin, USA).

別の利点は、そのようなｈＩＰＳ細胞が免疫学的に適合した自己細胞集団であり、患者に特異的な細胞により、疾患の起源および進行を試験することが可能になることである。したがって、疾患の根本原因を理解することが可能であり、それにより、疾患に対する予防的処置および治療的処置の開発を導く洞察がもたらされ得る。 Another advantage is that such hIPS cells are an immunologically matched autologous cell population, allowing the patient-specific cells to test the origin and progression of the disease. Therefore, it is possible to understand the underlying cause of the disease, which may provide insights leading to the development of prophylactic and therapeutic treatments for the disease.

多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
一部の実施形態は、胚体内胚葉細胞および最終的には、これだけに限定されないが、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌先駆細胞および／または膵島ホルモン発現細胞を含めた任意の内胚葉系列由来細胞型を、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を出発材料として使用して導出するための方法を対象とする。これらのｈＥＳ細胞は、桑実胚、胚内部細胞塊または胚の生殖***から得られるものを起源とする細胞であってよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、培養物中、実質的な分化を伴わずに多能性の状態で維持することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号および同第６，２５１，６７１号に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Pluripotent Human Embryonic Stem (hES) Cells Some embodiments include definitive endoderm cells and ultimately, but not exclusively, foregut endoderm, pancreatic endoderm, endocrine precursor cells and/or pancreatic islets. A method for deriving any endoderm lineage-derived cell type, including hormone-expressing cells, using human embryonic stem (hES) cells as a starting material. These hES cells may be cells originating from those obtained from morula, embryonic inner cell mass or germinal ridge of the embryo. Human embryonic stem cells can be maintained in pluripotent state in culture without substantial differentiation using methods known in the art. Such methods are described, for example, in US Pat. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926, 5,843,780 and 6,200. , 806 and 6,251,671, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference.

いくつかのプロセスでは、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞は、フィーダー層上で維持される。そのようなプロセスでは、多能性細胞を多能性の状態で維持することを可能にする任意のフィーダー層を使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）に一般に使用されるフィーダー層の１つは、マウス線維芽細胞の層である。つい最近、多能性細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）において使用するためのヒト線維芽細胞フィーダー層が開発された（その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号）。代替のプロセスでは、フィーダー層を使用せずに多能性細胞を維持することが可能になる。多能性細胞をフィーダーフリー条件下で維持する方法は、米国特許出願公開第２００３／０，１７５，９５６号に記載されており、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 In some processes, pluripotent stem cells, such as hES cells, are maintained on the feeder layer. In such a process, any feeder layer that allows pluripotent cells to be maintained in a pluripotent state can be used. One of the feeder layers commonly used for culturing human embryonic stem cells is a layer of mouse fibroblasts. More recently, a human fibroblast feeder layer for use in culturing pluripotent cells was developed (US Patent Application Publication No. 2002/0072117, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference). ). An alternative process makes it possible to maintain pluripotent cells without the use of feeder layers. A method of maintaining pluripotent cells under feeder-free conditions is described in US Patent Application Publication No. 2003/0,175,956, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の多能性細胞は、血清を含むまたは含まない、細胞外マトリックスを含むまたは含まない、ＦＧＦを含むまたは含まない培養物中で維持することができる。いくつかの多能性細胞の維持手順では、血清代替物を使用する。多能性細胞または多分化能細胞を培養し、分化させるためのこれらおよび他の方法は、それぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＭＥＤＩＡＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＨＵＭＡＮＳＥＲＵＭに記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The pluripotent cells described herein can be maintained in culture with or without serum, with or without extracellular matrix, with or without FGF. Serum replacement is used in some pluripotent cell maintenance procedures. These and other methods for culturing and differentiating pluripotent or pluripotent cells are described in PCT/US2007/062755, filed Feb. 23, 2007, entitled COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS and PCT, respectively. /US2008/080516, filed Oct. 20, 2008, entitled METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENTS STEM CELL MEDIA CONTINING HUMAN SERUM, which are incorporated herein by reference in their entirety.

本明細書に記載の発明は全てのｈＥＳ細胞株、および少なくとも、表４に列挙されているものと共に有用である。この情報は、文献および例えば、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。本出願の出願日現在、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙに掲載された２５４個のｉＰＳＣ系、および１２１１個のｈＥＳＣ系があった。以下の表４は列挙されているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの全てを含むものではなく、潜在的に入手可能な多能性幹細胞の例である。

The invention described herein is useful with all hES cell lines, and at least those listed in Table 4. This information is available in the literature and, for example, in the National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry, in the Human Embryonic Stem Cell Registry and in the United States of America, in the United States of America, in the United States of America, in the United States of America. It is obtained from various databases. These databases are updated regularly as cell lines become available and registrations are obtained. As of the filing date of this application, there were 254 iPSC lines and 1211 hESC lines listed in the International Stem Cell Registry. Table 4 below does not include all of the listed hESCs and iPSCs, but is an example of potentially available pluripotent stem cells.

多能性脱分化体細胞
最近、ある特定の核リプログラミング因子を使用した試験により、多能性幹細胞または多能性様幹細胞を患者自身の体細胞から導出することが可能になった。これらの細胞は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とも称される。本発明では、ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａ、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された種々のｉＰＳ細胞株について記載されている。しかし、他のｉＰＳ細胞株、例えばＪａｍｅｓＴｈｏｍｓｏｎら、Ａ１．に記載されているものは本発明によるものである。参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２を参照されたい。したがって、本明細書で使用される場合、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｐＰＳ（霊長類多能性幹）細胞、単為発生細胞などと同様の性質を有する細胞を意味する。 Pluripotent dedifferentiated somatic cells Recently, tests using certain nuclear reprogramming factors have made it possible to derive pluripotent or pluripotent-like stem cells from the patient's own somatic cells. These cells are also called induced pluripotent stem (iPS) cells. The present invention describes various iPS cell lines provided by Shinya Yamanaka, Kyoto University. However, other iPS cell lines, such as James Thomson et al., A1. What is described in (1) is according to the present invention. See US Patent Application Publication No. 20090047263, International Publication WO2005/80598, US Patent Publication No. 200803233610 and International Publication WO2008/11882, which are fully incorporated herein by reference. Thus, as used herein, "induced pluripotent stem (iPS) cells" refers to other pluripotent stem cells, such as hES cells, hEG cells, pPS (primate pluripotent stem) cells, It means a cell having the same properties as a parthenogenetic cell.

核プログラミング因子は、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２に記載されており、卵、胚、またはＥＳ細胞を使用せずに、分化した細胞のリプログラミングを誘導するために使用される。本発明で使用され、記載されているものと同様の核リプログラミング因子を使用することによって体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を調製するための方法は特に限定されない。好ましい実施形態では、体細胞および人工多能性幹細胞が増殖し得る環境で核リプログラミング因子を体細胞と接触させる。本明細書に記載のある特定の実施形態の利点は、卵、胚、または胚性幹（ＥＳ）細胞の不在下で核リプログラミング因子を体細胞と接触させることによって人工多能性幹細胞を調製することができることである。核リプログラミング因子を使用することによって、体細胞の核をリプログラミングしてｉＰＳ細胞または「ＥＳ様細胞」を得ることができる。 Nuclear programming factors are described in US Patent Application Publication No. 20090047263, International Publication No. WO 2005/80598, US Patent Application Publication No. 20080233610 and International Publication WO2008/11882, and without the use of eggs, embryos or ES cells. , Used to induce reprogramming of differentiated cells. The method for preparing iPS cells derived from somatic cells by using nuclear reprogramming factors similar to those used and described in the present invention is not particularly limited. In a preferred embodiment, the nuclear reprogramming factor is contacted with somatic cells in an environment in which somatic cells and induced pluripotent stem cells can grow. The advantage of certain embodiments described herein is that induced pluripotent stem cells are prepared by contacting a nuclear reprogramming factor with somatic cells in the absence of egg, embryo, or embryonic stem (ES) cells. That is what you can do. Somatic cell nuclei can be reprogrammed to obtain iPS cells or "ES-like cells" by using nuclear reprogramming factors.

本明細書に記載の多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞であるかｉＰＳ細胞であるかにかかわらず、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン；．β．ＩＩＩ−チューブリン；．アルファ．−平滑筋アクチン（アルファ．−ＳＭＡ）；線維芽細胞成長因子４（Ｆｇｆ４）、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴなどのテロメラーゼ；サイレントＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ−ボックス含有タンパク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ２）（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレイクポイント１（Ｔ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ１）（Ｔｃｌ１）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４などの任意の数の多能性細胞マーカーを発現し得る。本発明は本明細書において列挙されているマーカーに限定されず、細胞表面マーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびその一部を含めた他の遺伝子産物などのマーカーを包含することが理解される。 The pluripotent stem cells described herein, whether hES cells or iPS cells, include, but are not limited to, alkaline phosphatase (AP); ABCG2; stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA- 1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-cadherin;. β. III-tubulin;. alpha. -Smooth muscle actin (alpha.-SMA); Fibroblast growth factor 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; Zinc finger protein 296 (Zfp296); N-acetyltransferase-1 (Nat1); (ES cell-related) Transcript 1 (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sall4; undifferentiated germ cell transcription factor (Utf1); Rex1; p53 G3PDH; telomerase such as TERT; silent X chromosome gene; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box containing protein 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3. Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; developmental pluripotency-associated 2 (DPPA2); The present invention is not limited to the markers listed herein and includes cell surface markers, antigens, and ESTs, RNAs (microRNAs and antisense RNAs). It is understood to include markers such as other gene products, including (including), DNA (including genes and cDNA) and parts thereof.

一実施形態では、本明細書で使用されるｉＰＳ細胞株は、以下の核リプログラミング因子遺伝子を含有する：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子。ある１つのｉＰＳ細胞株では、以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２のそれぞれが提供される。以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃのそれぞれの他のｉＰＳ細胞株遺伝子産物を使用した。したがって、核リプログラミング因子はＭｙｃファミリー遺伝子を含んでもよく含まなくてもよいことが理解される。 In one embodiment, the iPS cell line as used herein contains the following nuclear reprogramming factor genes: Oct family gene, Klf family gene, and Sox family gene. One iPS cell line provides each of the following three genes: Oct3/4, Klf4, and Sox2. The following three genes were used: Oct family gene, Klf family gene, and Myc family gene, eg, other iPS cell line gene products of Oct3/4, Klf4, and c-Myc, respectively. Therefore, it is understood that the nuclear reprogramming factor may or may not include Myc family genes.

本明細書に記載されており、当技術分野でも公知の核リプログラミング因子は、分化した成体の体細胞からｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができ、また、これはリプログラミングされる体細胞の型に限定されない、すなわち、任意の種類の体細胞をリプログラミングまたは脱分化させることができる。体細胞のリプログラミングには卵および／または胚が必要ないので、ｉＰＳ細胞は哺乳動物細胞であってよく、したがって、患者または疾患に特異的な多能性幹細胞を生じさせる機会がもたらされる。 Nuclear reprogramming factors described herein and also known in the art can be used to give rise to iPS cells from differentiated adult somatic cells, which are also reprogrammed Not limited to cell type, ie somatic cells of any kind can be reprogrammed or dedifferentiated. Since somatic cell reprogramming does not require eggs and/or embryos, iPS cells may be mammalian cells, thus providing the opportunity to give rise to patient- or disease-specific pluripotent stem cells.

多能性幹細胞の凝集懸濁液
個々の細胞をポリマー足場、マトリックスおよび／またはゲルに播種することに基づく、以前に公知の組織工学の方法とは対照的に、本明細書に記載の実施形態では、多能性幹細胞から形成された細胞凝集懸濁液、単一細胞懸濁液またはそれから導出された分化した単一細胞懸濁液を使用することができる。幹細胞凝集懸濁液の処理および／または製造ならびにその細胞の分化の方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２，３５６に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 Aggregated Suspensions of Pluripotent Stem Cells Embodiments described herein, in contrast to previously known methods of tissue engineering, which are based on seeding individual cells into polymeric scaffolds, matrices and/or gels. Can use cell aggregate suspensions formed from pluripotent stem cells, single cell suspensions or differentiated single cell suspensions derived therefrom. Methods for the treatment and/or production of stem cell aggregate suspensions and the differentiation of their cells are described in international applications PCT/US2007/062,755 and PCT/US2008/082,356, which are fully incorporated herein by reference. Be incorporated into.

一実施形態では、多能性幹細胞培養物、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞培養物の単細胞懸濁液から、多能性幹細胞凝集懸濁液を生成する方法が提供される。多能性幹細胞は線維芽細胞フィーダーで最初に培養することができるか、またはフィーダーフリーであってもよい。ｈＥＳ細胞を単離し、それらをヒトフィーダー細胞の上で培養する方法は、米国特許第７，４３２，１０４号に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 In one embodiment, a method is provided for producing a pluripotent stem cell aggregate suspension from a single cell suspension of a pluripotent stem cell culture, eg, hES or iPS cell culture. Pluripotent stem cells can be initially cultured in a fibroblast feeder or can be feeder free. Methods for isolating hES cells and culturing them on human feeder cells are described in US Pat. No. 7,432,104, which is fully incorporated herein by reference.

本明細書で使用される場合、「単一細胞懸濁液」という用語またはその等価物は、多能性、多分化能もしくは最終分化した単一細胞懸濁液、または多能性細胞もしくは多分化能細胞から任意の機械的手段または化学的手段によって導出された単一細胞懸濁液を指す。一次組織、付着した培養物中の細胞、および凝集体から細胞クラスターを解離させて単一細胞懸濁液を形成するためのいくつかの方法、例えば、物理的な力（細胞スクレーパー、口径が狭いピペットを通しての粉砕、細針穿刺吸引、ボルテックスによる脱凝集および細かいナイロンメッシュまたはステンレス鋼メッシュを通した強制的な濾過などの機械的解離）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ（商標）などの酵素による解離）、またはその両方の組合せが存在する。さらに、多能性細胞、多分化能細胞または分化した細胞の単一細胞への解離を支持することができる方法および培養培地条件は、多ウェルプレートアッセイのための増殖、細胞選別、および規定された播種のために有用であり、また、培養順およびクローン増殖の自動化を可能にする。 As used herein, the term "single cell suspension" or equivalents thereof are pluripotent, pluripotent or terminally differentiated single cell suspensions, or pluripotent cells or possibly pluripotent cells. Refers to a single cell suspension derived from competent cells by any mechanical or chemical means. Several methods for dissociating cell clusters from primary tissues, adherent cultures, and aggregates to form single cell suspensions, such as physical force (cell scraper, narrow caliber) Mechanical dissociation such as crushing through pipette, fine needle aspirate, vortex disaggregation and forced filtration through fine nylon or stainless steel mesh), enzymes (eg trypsin, collagenase, Accutase™) Dissociation due to) or a combination of both. Further, methods and culture medium conditions that can support the dissociation of pluripotent cells, pluripotent cells or differentiated cells into single cells are defined as growth, cell sorting, and defined for multi-well plate assays. It is useful for seeding and also allows automation of culture sequence and clonal expansion.

他の実施形態は、分化培地、例えば作用物質、好ましくはＴＧＦβファミリーの受容体を活性化することが可能であるＴＧＦβファミリーメンバー、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＮｏｄａｌを含有する分化培地に、多能性幹細胞凝集懸濁液を直接に生成する方法を提供する。内胚葉の生成のための成長因子は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５，６８６に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。分化培地で細胞凝集懸濁液を生成する方法は、同様に本明細書に記載される、多能性幹細胞培地、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５に記載されるヘレグリンをベースとしたＤＣ−ＨＡＩＦ培地に基づくＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞凝集懸濁培養物の生成を提供する他の方法から区別することができる。 Other embodiments include a differentiation medium such as an agent, preferably a TGFβ family member capable of activating a receptor of the TGFβ family, such as activin A, activin B, GDF-8, GDF-11 and Nodal. Provided is a method for directly producing a pluripotent stem cell aggregate suspension in a differentiation medium containing the same. Growth factors for the production of endoderm are described in International Application No. PCT/US2008/065,686, which is fully incorporated herein by reference. Methods for producing cell-aggregated suspensions in differentiation media are also described herein, pluripotent stem cell media, such as the heregulin-based DC-HAIF described in PCT/US2007/062,755. It can be distinguished from other methods that provide for the production of cell-aggregated suspension cultures with medium-based StemPro® hES SFM (Invitrogen).

本明細書に記載の実施形態は、多能性接着培養物から、多能性細胞を、未分化の状態での増殖を可能にする接着性成長培養条件で培養し、接着性多能性細胞培養物を単一細胞懸濁培養物に解離させ、単一細胞懸濁培養物を、単一細胞懸濁培養物を単一細胞懸濁培養物から懸濁液中の多能性由来細胞凝集体が形成されるまでの期間にわたって撹拌することによって懸濁液中のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第１の分化培養条件と接触させ、それにより、懸濁液中の多能性由来細胞凝集体を生じさせることによって懸濁液中の多能性細胞凝集体を生じさせるための方法に関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍ〜１６０ｒｐｍで回転させることによって実施する。本明細書に記載のある特定の他の実施形態では、多能性幹細胞の凝集、成長、増殖、増大および／または細胞塊を容易にするためにｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。 The embodiments described herein include culturing pluripotent cells from pluripotent adherent cultures in adherent growth culture conditions that allow for growth in an undifferentiated state. The culture is dissociated into single cell suspension cultures and the single cell suspension cultures are transferred from the single cell suspension cultures to pluripotent-derived cell aggregates in suspension. Contacted with a first differentiation culture condition that allows the formation of hES-derived cell aggregates in suspension by stirring for a period of time until aggregates are formed, thereby pluripotency in suspension A method for generating pluripotent cell aggregates in suspension by generating derived cell aggregates. In a preferred embodiment, stirring of the single cell suspension culture is performed by spinning at about 80 rpm to 160 rpm. In certain other embodiments described herein, a rho kinase inhibitor is used to facilitate aggregation, growth, proliferation, expansion and/or cell mass of pluripotent stem cells.

本明細書に記載される実施形態は、未分化状態での増大を可能にする接着性成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養し；未分化ｈＥＳ細胞をｈＥＳ細胞の分化に適する第１の分化培養条件と接触させて、接着性多能性由来細胞をもたらし；接着性のｈＥＳ由来細胞を単一細胞懸濁培養物に解離させ；単一細胞懸濁培養物が懸濁状の多能性由来細胞凝集体を形成するそのような時期まで単一細胞懸濁培養物を撹拌することによって、単一細胞懸濁培養物を、懸濁状のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第２の分化培養条件と接触させ、それにより懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成することによって、多能性由来単一細胞懸濁液から懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成する方法にも関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍの回転によって実施される。 Embodiments described herein culture hES cells in adherent growth culture conditions that allow expansion in an undifferentiated state; undifferentiated hES cells in a first differentiation culture condition suitable for differentiation of hES cells. Contacting with the cells to give adherent pluripotent cells; dissociating adherent hES-derived cells into single cell suspension cultures; single cell suspension cultures in suspension By agitating the single cell suspension cultures until such time to form aggregates, the single cell suspension cultures are allowed to form a second hES-derived cell aggregate in suspension. Generation of suspended pluripotent-derived cell aggregates from a pluripotent-derived single-cell suspension by contacting with differentiated culture conditions and thereby generating suspended pluripotent-derived cell aggregates It also relates to how to do it. In a preferred embodiment, agitation of the single cell suspension culture is carried out by spinning at about 80 rpm to 160 rpm.

好ましい実施形態では、製造規模の懸濁培養は、細胞密度を最大にしながら細胞生存力を維持する方法として、培地の連続潅流を利用する。この関係において、培地交換は、接着細胞および懸濁凝集体に異なった影響を及ぼす流体剪断を培養物に寄与する。培地が細胞表面を接線方向に越流するので、固定された接着細胞は流体剪断応力を受ける。対照的に、凝集体は剪断力の負荷に応答して自由に転がるので、懸濁凝集体が受ける凝集体表面を横切る剪断応力はかなりより弱い。長期間の剪断応力は接着性の多能性細胞に有害であり、最適な生存および機能のために懸濁凝集形式が好ましいと予想される。したがって、多能性幹細胞および／または多能性幹細胞から導出された多分化能前駆細胞の生成のための効率的な製造プロセスの必要性、ならびに剪断速度および剪断応力に関する上記の観察された機構に基づき、本明細書に記載される実施形態は、初めて、懸濁液形式、特に細胞凝集懸濁液形式の、多能性幹細胞から導出された多能性幹細胞および／または多分化能前駆細胞の生成のための製造方法を提供する。 In a preferred embodiment, production scale suspension cultures utilize continuous perfusion of medium as a method of maintaining cell viability while maximizing cell density. In this context, medium exchange contributes to the culture fluid shear that differentially affects adherent cells and suspension aggregates. The fixed adherent cells are subjected to fluid shear stress as the medium flows tangentially across the cell surface. In contrast, because the agglomerates are free to roll in response to shear loading, the suspension aggregates experience significantly less shear stress across the agglomerate surface. Long-term shear stress is detrimental to adherent pluripotent cells and the suspension aggregation format is expected to be preferred for optimal survival and function. Therefore, there is a need for an efficient manufacturing process for the generation of pluripotent stem cells and/or pluripotent stem cells derived pluripotent stem cells, as well as to the above observed mechanism for shear rate and shear stress. On the basis, the embodiments described herein, for the first time, of pluripotent stem cells and/or pluripotent progenitor cells derived from pluripotent stem cells in suspension format, in particular cell aggregate suspension format A manufacturing method for producing is provided.

さらに別の実施形態では、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養した。これは、血清を含まないが、ＦＧＦなどの外因的に添加された成長因子を含有する培地中でｈＥＳ細胞を培養することが必要なＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対する米国特許第７，００５，２５２号とは区別される。一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中で、かつ／または、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養する。 In yet another embodiment, the hES cell aggregation suspension was cultured in medium substantially free of serum and in the absence of exogenously added fibroblast growth factor (FGF). It is described in Thomson, J. et al., which is serum-free but which requires hES cells to be cultured in medium containing exogenously added growth factors such as FGF. No. 7,005,252 to US Pat. In some embodiments, the iPS cell aggregate suspension is in a medium substantially free of serum and/or further in the absence of exogenously added fibroblast growth factor (FGF). Incubate.

サイズおよび形状の両方が異なるかもしれない既知の方法によって生成される細胞凝集体と対照的に、本明細書に記載される細胞凝集体および方法はサイズおよび形状の狭い分布を有し、すなわち、細胞凝集体はサイズおよび／または形状が実質的に均一である。細胞凝集体のサイズ均一性は、分化性能および培養均一性のために重要である。基本的な物質輸送分析を凝集体に適用すると、等しい透過性を仮定する限り、大きな凝集体の中央への酸素および栄養素の拡散は、より小さい凝集体への拡散と比較して遅くなると予想される。膵臓系列細胞への凝集ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の分化は特定の成長因子の一時的適用に依存するので、異なる径の凝集体の混合物による培養物は、細胞凝集体の均一な（サイズおよび形状）培養物と比較して非同期化される可能性がある。細胞凝集体のこの混合物は異質性をもたらし、結果として分化性能が劣り、最終的に製造、規模拡大および生産に適合しない可能性がある。したがって、本明細書で使用される場合、語句「実質的に均一」または「サイズおよび形状が実質的に均一」またはその同等物は、凝集体の均一性の広がり程度を指し、約２０％以下である。別の実施形態では、凝集体の均一性の広がり程度は、約１５％、１０％または５％以下である。 In contrast to cell aggregates produced by known methods that may differ in both size and shape, the cell aggregates and methods described herein have a narrow distribution of size and shape, i.e., Cell aggregates are substantially uniform in size and/or shape. Size uniformity of cell aggregates is important for differentiation performance and culture uniformity. Applying the basic mass transport assay to aggregates, diffusion of oxygen and nutrients into the center of large aggregates is expected to be slow compared to diffusion into smaller aggregates, as long as equal permeability is assumed. It Since the differentiation of aggregated ES cells or iPS cells into pancreatic lineage cells depends on the transient application of certain growth factors, cultures with a mixture of aggregates of different diameters result in a uniform (size and shape) of cell aggregates. May be desynchronized as compared to culture. This mixture of cell aggregates introduces heterogeneity, which results in poor differentiation performance and may ultimately be incompatible with manufacturing, scaling and production. Thus, as used herein, the phrase "substantially uniform" or "substantially uniform in size and shape" or its equivalent refers to the extent to which the homogeneity of aggregates is spread and is about 20% or less. Is. In another embodiment, the extent of uniformity of aggregate is less than or equal to about 15%, 10% or 5%.

凝集体当たりの細胞の正確な数は重要ではないが、各凝集体のサイズ（したがって、凝集体当たりの細胞の数）は酸素および栄養分が中心細胞に拡散する最大限度によって限定されること、およびこの数は細胞型およびその細胞型の栄養素の要件に応じても変動し得ることが当業者には理解されよう。細胞凝集体は、凝集体当たり最小数の細胞（例えば、２つまたは３つの細胞）を含んでもよく、凝集体当たり何百ものまたは何千もの細胞を含んでもよい。一般には、細胞凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明の目的上、細胞凝集体は、一般には約５０ミクロンから約６００ミクロンまでのサイズであるが、細胞型に応じて、サイズはこの範囲を下回ることも上回ることもある。一実施形態では、細胞凝集体は、約５０ミクロンから約２５０ミクロンまでのサイズ、または約７５〜２００ミクロンのサイズであり、約１００〜１５０ミクロンのサイズであることが好ましい。 The exact number of cells per aggregate is not critical, but the size of each aggregate (and thus the number of cells per aggregate) is limited by the maximum extent to which oxygen and nutrients diffuse to the central cells, and Those skilled in the art will appreciate that this number can also vary depending on the cell type and the nutrient requirements of that cell type. Cell aggregates may include a minimal number of cells per aggregate (eg, 2 or 3 cells), and may include hundreds or thousands of cells per aggregate. Generally, cell aggregates contain hundreds to thousands of cells per aggregate. For purposes of the present invention, cell aggregates are generally from about 50 microns to about 600 microns in size, although depending on the cell type, the size may be below or above this range. In one embodiment, the cell aggregates are about 50 microns to about 250 microns in size, or about 75-200 microns in size, preferably about 100-150 microns.

さらに他の方法では胚様体（ＥＢ）の作製が記載されている。本明細書で使用される場合、「胚様体」、「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｂｏｄｙ）」という用語またはその等価物は、ＥＳ細胞が単層培養物中で過成長した際、または、未定義の培地中の懸濁培養物中で維持された、または非定方向プロトコルによって多数の胚葉組織に分化した際に生じる分化した細胞および未分化の細胞の凝集体を指す。すなわち、ＥＢは、本明細書に記載の多能性幹細胞の単一細胞懸濁液から形成されることもなく、ＥＢは、多能性由来多分化能細胞の接着培養物から形成されることもない。これらの特徴単独により、本発明は胚葉体から明白に区別される。 Yet another method describes the production of embryoid bodies (EBs). As used herein, the terms "embryoid body", "aggregate body" or equivalents thereof refer to when ES cells are overgrown in monolayer culture, or undefined. Refers to aggregates of differentiated and undifferentiated cells that are maintained in suspension culture in medium or that develop upon differentiation into multiple germ layer tissues by a non-directed protocol. That is, EB is not formed from a single cell suspension of pluripotent stem cells described herein, and EB is formed from an adherent culture of pluripotent-derived pluripotent cells. Nor. These features alone make the present invention clearly distinguishable from embryoid bodies.

分化した細胞と未分化の細胞の混合物であり、一般にはいくつかの胚葉由来の細胞からなり、ランダムな分化をたどる胚様体とは対照的に、本明細書に記載の細胞凝集体は、基本的にまたは実質的に均一な細胞であり、多能性、多分化能、二分化能、または単能性型の細胞、例えば、胚細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分泌細胞などの凝集体として存在する。 In contrast to an embryoid body that is a mixture of differentiated and undifferentiated cells, generally consisting of some germ layer-derived cells, that follows a random differentiation, the cell aggregates described herein, Basically or substantially homogeneous cells, which are pluripotent, pluripotent, bipotent, or unipotent type cells such as germ cells, definitive endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive pancreas It exists as an aggregate of endoderm, pancreatic endocrine cells and the like.

本明細書に記載される実施形態は、大規模製造に容易に適用することができるプロセスを使用して、サイズおよび形状が実質的に均一である細胞凝集体を繰り返し生成することが可能な費用効率の高い製造プロセスまたは方法を提供することによって、上記の問題に対処する。特定の一実施形態では、分化可能な細胞は、本発明の細胞培地を用いて懸濁培養で増殖させる。別の特定の実施形態では、分化可能な細胞は懸濁状態で維持および増殖することができ、すなわち、それらは未分化のままであるか、さらに分化することを阻止される。細胞培養との関連で「増殖させる」という用語は、当技術分野で使用されるように使用され、細胞の増殖および細胞数の増加、好ましくは存続可能な細胞数の増加を指す。具体的な実施形態では、約１日、すなわち約２４時間を超えて培養することによって、細胞を培養懸濁液で増殖させる。より具体的な実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週の間培養することによって、細胞を懸濁培養で増殖させる。 The embodiments described herein are capable of repeatedly producing cell aggregates that are substantially uniform in size and shape using a process that can be readily applied to large-scale manufacturing. The above problems are addressed by providing an efficient manufacturing process or method. In one particular embodiment, the differentiable cells are grown in suspension culture using the cell culture medium of the invention. In another particular embodiment, the differentiable cells are capable of being maintained and expanded in suspension, ie they remain undifferentiated or are prevented from further differentiation. The term "proliferating" in the context of cell culture is used as used in the art and refers to the proliferation of cells and an increase in cell number, preferably an increase in viable cell number. In a specific embodiment, cells are grown in culture suspension by culturing for about 1 day, ie, for more than about 24 hours. In a more specific embodiment, the cells are suspended by culturing for at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 weeks. Grow in suspension culture.

本発明のさらに他の実施形態は、分化した多能性幹細胞培養物、例えば、上記ｄ’Ａｍｏｕｒ２００５および２００６に記載されるステージ１、２、３、４および５からの細胞を含む、本明細書に記載される多能性細胞から生成される細胞から形成される細胞凝集懸濁液を生成する方法を提供する。したがって、本明細書に記載される細胞凝集体を作製する方法はいかなる１つの多能性または多分化能細胞または細胞ステージにも限定されず、むしろ、使用方法および細胞型最適化の必要性によってどの方法が好ましいかが決定される。 Yet another embodiment of the present invention comprises a differentiated pluripotent stem cell culture, eg, cells from stages 1, 2, 3, 4 and 5 described in d'Amour 2005 and 2006 above. A method of producing a cell aggregate suspension formed from cells produced from pluripotent cells as described in 1. Thus, the methods of making the cell aggregates described herein are not limited to any one pluripotent or multipotent cell or cell stage, but rather depending on the method of use and the need for cell type optimization. Which method is preferred is determined.

多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および他の多能性細胞源、例えば胚性生殖または単為生殖生物細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養物を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０，５１６に記載されている通りであり、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 For producing aggregate suspension cultures of cells derived from pluripotent cells, such as hES or iPS cells, and other pluripotent cell sources, such as embryonic germ or parthenogenetic cells. The method described is substantially the title filed on February 23, 2007, PCT/US2007/062,755, which is a Compositions and methods for counting differential cells, and October 20, 2008. As described in PCT/US2008/080,516, Methods and compositions for feder-free pluripotent stem cell media containing human serum, which are fully incorporated by reference herein.

本明細書に記載の方法では、例えば、Ｂｏｄｎａｒらに対するものであり、ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第６，８００，４８０号に記載の通り最初に培養容器を細胞外マトリックスでコーティングする必要は全くない。本明細書に記載の一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞は、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞が、実質的に、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００８年１０月２０日に出願の、表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍである米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０，５１６に記載されるように可溶性ヒト血清を使用して培養されるのと同じ方法で培養することができる。 In the methods described herein, it is not necessary to first coat the culture vessel with extracellular matrix as described, for example, in Bodnar et al. and assigned to Geron Corporation, US Pat. No. 6,800,480. Not at all. In some embodiments described herein, the iPS cells are substantially free of other pluripotent stem cells, such as hES and iPS cells, October 20, 2008. Soluble human serum is used as described in U.S. patent application PCT/US2008/080,516, which is filed under the title of Methods and compositions for feder-free pluripotent stem cell media containing human serum. Can be cultured in the same manner as

本明細書に記載の方法では、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対するものであり、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＡｌｕｍｎｉＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に譲渡された、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，００５，２５２号に記載の通り単に線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は全く必要ない。 The methods described herein are described in Thomson, J.; And a source other than simply a fibroblast feeder layer as described in US Pat. No. 7,005,252, assigned to the Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) and fully incorporated herein by reference. No exogenously added fibroblast growth factor (FGF) sourced from the company is required.

多分化能および分化した細胞組成物
本明細書に記載の方法によって生成する細胞組成物は、多能性幹細胞、前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞を含む細胞培養物を含み、培養物中の細胞の少なくとも約５〜９０％が、生成された前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞である。 Pluripotent and Differentiated Cellular Compositions Cellular compositions produced by the methods described herein include pluripotent stem cells, preprimitive streak, mesendoderm, definitive endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive foregut Germ layer, PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1/NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursor or NGN3/NKX2.2 co-positive endocrine precursor, and hormone secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP alone A cell culture comprising positive endocrine cells, wherein at least about 5-90% of the cells in the culture are produced progenitor strip, mesendoderm, definitive endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive foregut endoderm , PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1/NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursor or NGN3/NKX2.2 co-positive endocrine precursor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP alone positive It is an endocrine cell.

本明細書に記載の一部の実施形態は、幹細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性細胞と、前原条、中内胚葉または胚体内胚葉などの多分化能細胞の両方、ならびに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞などの、より分化しているが、なお潜在的に多分化能である細胞を含む細胞集団および細胞培養物などの組成物に関する。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、多能性幹細胞および他の多分化能細胞または分化した細胞の混合物を含む組成物を生成することができる。一部の実施形態では、約９５の多能性細胞ごとに少なくとも約５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。他の実施形態では、約５の多能性細胞ごとに少なくとも約９５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。さらに、他の比の多分化能細胞または分化した細胞と多能性細胞を含む組成物が考えられる。例えば、約１，０００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５の多能性細胞ごと、および約１までの多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、および約１の多能性細胞ごとに少なくとも約１，０００，０００の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が考えられる。 Some embodiments described herein include both pluripotent cells such as stem cells and iPS cells and pluripotent cells such as preprimitive streak, mesendoderm or definitive endoderm, and PDX1-positive foregut. Endoderm, PDX1-positive pancreatic endoderm or PDX1/NKX6.1 co-positive pancreatic endoderm, endocrine precursor or NGN3/NKX2.2 co-positive endocrine precursor, and hormone secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP Compositions such as cell cultures and cell cultures that include more differentiated but still potentially multipotent cells, such as single-positive endocrine cells. For example, the methods described herein can be used to produce a composition that includes a mixture of pluripotent stem cells and other pluripotent cells or differentiated cells. In some embodiments, a composition comprising at least about 5 pluripotent cells or differentiated cells for every about 95 pluripotent cells is produced. In other embodiments, a composition comprising at least about 95 pluripotent cells or differentiated cells for every about 5 pluripotent cells is produced. Additionally, compositions comprising other ratios of pluripotent cells or differentiated cells and pluripotent cells are contemplated. For example, a composition comprising at least about 1 pluripotent cell or differentiated cell for every 1,000,000 pluripotent cells, at least about 1 pluripotent for every 100,000 pluripotent cells. A cell or a composition comprising differentiated cells, at least about 1 pluripotent cell for every 10,000 pluripotent cells or a composition comprising differentiated cells, at least about 1 for every 1000 pluripotent cells Of pluripotent cells or differentiated cells, at least about 1 pluripotent or differentiated cell for every about 500 pluripotent cells, or at least about 100 pluripotent cells for every 100 pluripotent cells A composition comprising about 1 pluripotent cell or a differentiated cell, a composition comprising at least about 1 pluripotent cell or a differentiated cell for every about 10 pluripotent cells, and a composition comprising about 5 pluripotent cells , And at least about 1 pluripotent cells or up to about 1 pluripotent cells or differentiated cells, and at least about 1,000,000 pluripotent cells per about 1 pluripotent cells. Compositions containing cells or differentiated cells are contemplated.

本明細書に記載の一部の実施形態は、少なくとも約５％の多分化能細胞または分化した細胞から少なくとも約９９％の多分化能細胞または分化した細胞までを含む細胞培養物または細胞集団に関する。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団は哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９９％が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。細胞培養物または細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む複数の実施形態では、細胞培養中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに上記の百分率を算出する。 Some embodiments described herein relate to a cell culture or cell population comprising from at least about 5% pluripotent cells or differentiated cells to at least about 99% pluripotent cells or differentiated cells. .. In some embodiments, the cell culture or cell population comprises mammalian cells. In a preferred embodiment, the cell culture or cell population comprises human cells. For example, certain embodiments relate to cell cultures that include human cells, wherein at least about 5% to at least about 99% of the human cells are pluripotent or differentiated cells. Other embodiments are cell cultures comprising human cells, wherein the cell culture comprises at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30% of human cells. At least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 55%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, A cell culture in which at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 98%, at least about 99%, or greater than 99% are pluripotent cells or differentiated cells. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering human feeder cells in cell culture.

多能性、多分化能または分化細胞は、前原条、内胚葉系中胚葉、胚体内胚葉の細胞、ならびにそれらから導出される細胞、組織および／または器官に分化すること、またはさらに分化することが可能である。内胚葉系中胚葉細胞は、中胚葉細胞および／または胚体内胚葉細胞、ならびにこれらの系列のいずれかから導出される細胞、組織および／または器官に分化することが可能である。一部の実施形態では、前原条細胞は、内胚葉系中胚葉中間体を通して、中胚葉または胚体内胚葉系列のいずれかの最終分化細胞に変換される。例えば、そのようなプロセスは、ヒト内胚葉由来組織、例えば膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、上皮小体、胸腺、咽頭、胆嚢および膀胱の効率的な生成のための基礎を提供することができる。重要なことに、前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の生成は、機能的インスリン生成β細胞への多能性幹細胞の分化での初期段階である。別の例として、前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の分化は、ヒト中胚葉由来組織、例えば血球、心血管組織、骨格組織ならびに他の構造および結合組織の効率的な生成のための基礎を提供することができる。 Pluripotent, pluripotent or differentiated cells are those that differentiate into, or further differentiate into, preprimitive streak, endoderm mesoderm, definitive endoderm cells, and cells, tissues and/or organs derived therefrom. Is possible. Endoderm mesoderm cells are capable of differentiating into mesodermal and/or definitive endoderm cells, as well as cells, tissues and/or organs derived from any of these lineages. In some embodiments, preprimitive streak cells are converted through the endoderm mesodermal intermediates to terminally differentiated cells of either the mesoderm or definitive endoderm lineage. For example, such processes provide the basis for the efficient generation of human endoderm-derived tissues such as pancreas, liver, lung, stomach, intestine, thyroid, parathyroid gland, thymus, pharynx, gallbladder and bladder. be able to. Importantly, the generation of preprimitive streak cells and/or endodermal mesodermal cells is an early step in the differentiation of pluripotent stem cells into functional insulin-producing β cells. As another example, differentiation of preprimitive streak cells and/or endoderm mesoderm cells is due to the efficient generation of human mesoderm derived tissues, such as blood cells, cardiovascular tissue, skeletal tissue and other structures and connective tissues. Can provide the basis for.

本明細書に記載の組成物および方法には、いくつかの有用な特徴がある。例えば、多分化能細胞、例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞集団、ならびにそのような細胞培養物および細胞集団を生成するための方法は、ヒト発生の初期をモデリングするために有用である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法は、真性糖尿病などの病態への治療介入としても機能し得る。例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞は限られた数の組織のみの供給源として機能するので、純粋な組織または細胞の型の発生において使用することができる。前原条細胞を生成するためのいくつかのプロセスでは、出発材料として使用される多能性細胞は、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である。 The compositions and methods described herein have several useful features. For example, cell cultures and cell populations comprising pluripotent cells, such as preprimitive streak cells and/or mesendoderm cells, and methods for producing such cell cultures and cell populations are described in early human development. Is useful for modeling. In addition, the compositions and methods described herein can also function as a therapeutic intervention in conditions such as diabetes mellitus. For example, preprimitive streak cells and/or mesendoderm cells serve as a source for only a limited number of tissues and thus can be used in the development of pure tissues or cell types. In some processes for producing preprimitive streak cells, the pluripotent cells used as starting material are pluripotent stem cells such as hES cells, hEG cells or iPS cells.

栄養外胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、栄養外胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する栄養外胚葉細胞集団または細胞培養物では、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して実質的に高い。 Trophic ectoderm cells The methods described herein can be used to produce compositions comprising trophectoderm cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, the trophectoderm cell population or cell culture produced by the methods described herein comprises HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, The expression of a marker selected from the group consisting of DLX3, PSX1, ETS2, and ERBB genes is expressed by HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, in non-trophic ectoderm cells or cell populations. Substantially higher compared to expression levels of ETS2 and ERBB.

前原条細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、前原条細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する前原条細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子を、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して実質的に発現する。 Preprimitive streak cells The methods described herein can be used to produce compositions containing preprimitive streak cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, the preprimitive streak cell population or cell culture produced by the methods described herein comprises a FGF8 marker gene and/or a NODAL marker gene in a BRACHURY low, FGF4 low, Substantially expressed compared to SNAI1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

胚体外細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、胚体外細胞を含む組成物を生成することができる。原始内胚葉細胞、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は胚体外細胞である。原始内胚葉細胞は近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞を生じる。近位内胚葉細胞は、卵黄嚢の一部を形成する内胚葉細胞である。近位内胚葉細胞は、栄養分の取り込みおよび輸送の両方において機能する。遠位内胚葉細胞は、ライヘルト膜として公知の胚体外組織と近接している。遠位内胚葉細胞の役割のうちの１つは、基底膜の構成成分の生成である。まとめると、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は、多くの場合、胚体外内胚葉と称されるものを形成する。名称に示されている通り、胚体外内胚葉細胞は発生の間に形成される胚構造を生じない。対照的に、本明細書に記載の胚体内胚葉細胞および他の内胚葉系列または膵臓の系列細胞は、胚性であるまたは胚細胞から導出されたものであり、胚発生の間に形成される腸管から導出された組織を生じる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する胚体外細胞集団または細胞培養物では、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、ＦＴＮＦ４ａｌｐｈａ遺伝子またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、少なくとも、他の細胞型または細胞集団、例えば胚体内胚葉では発現されないＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して実質的に高い。 Extraembryonic Cells The methods described herein can be used to produce compositions containing extraembryonic cells that are substantially free of other cell types. Primitive endoderm cells, proximal endoderm cells and distal endoderm cells are extraembryonic cells. Primitive endoderm cells give rise to proximal and distal endoderm cells. Proximal endoderm cells are endoderm cells that form part of the yolk sac. Proximal endoderm cells function in both nutrient uptake and transport. Distal endoderm cells are in close proximity to the extraembryonic tissue known as Reichert's membrane. One of the roles of distal endoderm cells is in the production of basement membrane components. Collectively, proximal and distal endoderm cells form what are often referred to as extraembryonic endoderm. As the name implies, extraembryonic endoderm cells do not give rise to embryonic structures that are formed during development. In contrast, definitive endoderm cells and other endodermal or pancreatic lineage cells described herein are embryonic or derived from germ cells and are formed during embryogenesis. It produces tissue derived from the intestine. In some embodiments described herein, the extraembryonic cell population or cell culture produced by the methods described herein comprises a SOX7 gene, SOX17 gene, THBD gene, SPARC gene, DAB1 gene, FTNF4alpha gene. Or the expression of a marker selected from the group consisting of the AFP gene is at least compared to the expression level of SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, or AFP not expressed in other cell types or cell populations such as definitive endoderm. Is substantially higher.

中内胚葉（ｍｅｎｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、中内胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する中内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して実質的に高い。 Mesendoderm Cells The methods described herein can be used to produce compositions containing mesendoderm cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments described herein, the mesendoderm cell population or cell culture produced by the methods described herein is selected from the group consisting of FGF4, SNAI1, MIXL1 and/or WNT3 marker genes. The expression of the marker is substantially higher than that of SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

スクリーニング方法
一部の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、ヒト多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、前原条細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または膵臓前駆細胞、内分泌先駆細胞、および／または内分泌細胞などの多能性細胞、多分化能細胞および／または分化した細胞などのある特定の細胞集団を得る。次いで、細胞集団に候補分化因子をもたらす。候補分化因子をもたらす前またはそれとほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現を決定する。あるいは、候補分化因子をもたらした後にマーカーの発現を決定することができる。第１の時点の後であり、かつ候補分化因子を細胞集団にもたらすステップの後である第２の時点で、同じマーカーの発現を再度決定する。候補分化因子が膵臓先駆細胞の分化を促進することができるかどうかを、第１の時点におけるマーカーの発現と第２の時点におけるマーカーの発現を比較することによって決定する。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるマーカーの発現と比較して増加または減少した場合、当該候補分化因子は膵臓前駆細胞の分化を促進することができることになる。 Screening Methods In some embodiments, the screening methods are used to use human pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells, preprimitive streak cells, mesendoderm cells, definitive endoderm cells, foregut endoderm or PDX1-negative Pluripotent cells such as intestinal endoderm cells, PDX1-positive foregut endoderm or PDX1-positive pancreatic endoderm cells or pancreatic progenitor cells, endocrine precursor cells, and/or endocrine cells, pluripotent cells and/or differentiated cells, etc. To obtain a specific cell population of. The cell population is then brought to the candidate differentiation factor. Expression of the marker is determined at a first time point, which is before or at about the same time as providing the candidate differentiation factor. Alternatively, the expression of the marker can be determined after providing the candidate differentiation factor. At the second time point, after the first time point and after the step of bringing the candidate differentiation factor into the cell population, the expression of the same marker is determined again. Whether the candidate differentiation factor can promote the differentiation of pancreatic precursor cells is determined by comparing the expression of the marker at the first time point with the expression of the marker at the second time point. If the expression of the marker at the second time point is increased or decreased compared to the expression of the marker at the first time point, then the candidate differentiation factor will be able to promote the differentiation of pancreatic progenitor cells.

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、ヒト胚体内胚葉、ＰＤＸ−１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉、または膵臓前駆体または内分泌先駆細胞を含む細胞集団または細胞培養物を利用する。例えば、細胞集団は、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞の実質的に精製された集団であってよい。例えば、細胞集団はヒト膵臓前駆細胞の濃縮された集団であってよく、細胞集団内のヒト細胞の少なくとも約５０％〜９７％がヒト膵臓前駆細胞であり、残りは、内分泌先駆体または内分泌細胞および他の細胞型で構成される。 In some embodiments of the screening methods described herein, human definitive endoderm, PDX-1 negative foregut endoderm, PDX-1 positive foregut endoderm, PDX-1 positive pancreatic endoderm, or pancreatic precursor. A cell population or cell culture containing somatic or endocrine precursor cells is utilized. For example, the cell population may be a substantially purified population of PDX-1 positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cells. For example, the cell population can be an enriched population of human pancreatic progenitor cells, with at least about 50% to 97% of the human cells within the cell population being human pancreatic progenitor cells, the remainder being endocrine precursors or endocrine cells. And other cell types.

本明細書に記載のスクリーニング方法の複数の実施形態では、細胞集団を候補（試験）分化因子と接触させる、または他のやり方で候補（試験）分化因子をもたらす。候補分化因子は、上記の細胞のいずれか、例えばヒト膵臓前駆細胞の分化を促進する潜在性を有し得る任意の分子を含んでよい。本明細書に記載の一部の実施形態では、候補分化因子は、細胞の１種または複数種の型に対する分化因子であることが分かっている分子を含む。代替の実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが分かっていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト膵臓前駆細胞の分化を促進することが分かっていない分子を含む。 In embodiments of the screening methods described herein, the cell population is contacted with, or otherwise provided with, a candidate (test) differentiation factor. Candidate differentiation factors may include any molecule that may have the potential to promote the differentiation of any of the cells described above, eg, human pancreatic progenitor cells. In some embodiments described herein, the candidate differentiation factor comprises a molecule known to be a differentiation factor for one or more types of cells. In an alternative embodiment, the candidate differentiation factor comprises a molecule that is not known to promote cell differentiation. In a preferred embodiment, candidate differentiation factors include molecules that are not known to promote the differentiation of human pancreatic progenitor cells.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子は約１０，０００ａｍｕ以下の分子量を有する分子である。 In some embodiments of the screening methods described herein, the candidate differentiation factor comprises a small molecule. In a preferred embodiment, small molecules are molecules that have a molecular weight of about 10,000 amu or less.

本明細書に記載される他の実施形態では、候補分化因子は、大分子、例えばポリペプチドを含む。ポリペプチドは、限定されずに、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子を含む、任意のポリペプチドであってもよい。好ましいポリペプチドには、成長因子が含まれる。 In other embodiments described herein, the candidate differentiation factor comprises a large molecule, eg, polypeptide. The polypeptide may be any polypeptide including, without limitation, glycoproteins, lipoproteins, extracellular matrix proteins, cytokines, chemokines, peptide hormones, interleukins or growth factors. Preferred polypeptides include growth factors.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激物質、ＩＬ−１６、サイモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２、プレＢ細胞コロニー促進因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞促進因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質８（骨形成タンパク質２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症タンパク１−アルファ）、グリア芽細胞腫細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝癌由来成長因子、ニューロメディンＵ−２５先駆体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ先駆体、胸腺樹状細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−７（ＩＬ７）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−９（ＩＬ９）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ビタミンＤ３、上皮成長因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７／ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ、β神経成長因子、アクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ２、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン４／５、線毛神経栄養因子、神経膠由来のネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作用性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンＩＩ、カルシトリオール（ｃａｌｃｔｒｉｏｌ）、心房性ナトリウム利尿ペプチドおよびメラトニン、チロキシン、トリヨードサイロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾル、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロスチエン（ａｎｄｒｏｓｔｉｅｎｅ）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオンおよびＴＷＳ１１９からなる群から選択される１つまたは複数の成長因子を含む。 In some embodiments of the screening methods described herein, the candidate differentiation factor is amphiregulin, B lymphocyte stimulator, IL-16, thymopoietin, TRAIL/Apo-2, pre-B cell colony promoting factor. , Endothelial differentiation-related factor 1 (EDF1), endothelial monocyte activating polypeptide II, macrophage migration inhibitory factor (MIF), natural killer cell promoting factor (NKEFA), bone morphogenetic protein 2, bone morphogenetic protein 8 (bone morphogenetic protein 2) ), bone morphogenetic protein 6, bone morphogenetic protein 7, connective tissue growth factor (CTGF), CGI-149 protein (neuroendocrine differentiation factor), cytokine A3 (macrophage inflammatory protein 1-alpha), glioblastoma cell differentiation-related protein (GBDR1), liver cancer-derived growth factor, neuromedin U-25 precursor, vascular endothelial cell growth factor (VEGF), vascular endothelial cell growth factor B (VEGF-B), T cell specific RANTES precursor, thymus dendritic Cell-derived factor 1, transferrin, interleukin-1 (IL1), interleukin-2 (IL2), interleukin-3 (IL3), interleukin-4 (IL4), interleukin-5 (IL5), interleukin- 6 (IL6), interleukin-7 (IL7), interleukin-8 (IL8), interleukin-9 (IL9), interleukin-10 (IL10), interleukin-11 (IL11), interleukin-12 ( IL12), interleukin-13 (IL13), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, thrombopoietin, vitamin D3. , Epidermal growth factor (EGF), brain-derived neurotrophic factor, leukemia inhibitory factor, thyroid hormone, basic fibroblast growth factor (bFGF), aFGF, FGF-4, FGF-6, FGF-7/keratinocyte growth factor ( KGF), platelet-derived growth factor (PDGF), platelet-derived growth factor-BB, β nerve growth factor, activin A, transforming growth factor β1 (TGFβ1), interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tumor necrosis- α, tumor necrosis factor-β, burst promoting activity (BPA), erythrocyte promoting activity (EPA), PGE2, insulin growth factor-1 (IGF-1), IGF-II, -Neutrophin growth factor (NGF), neurotrophin-3, neurotrophin 4/5, ciliary neurotrophic factor, glomerular nexin, dexamethasone, β-mercaptoethanol, retinoic acid, butylhydroxyanisole, 5 Azacytidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, isobutylxanthine, indomethacin, β-glycerol phosphate, nicotinamide, DMSO, thiazolidinedione, TWS119, oxytocin, vasopressin, melanocyte stimulating hormone, adrenocorticotropic hormone, lipotropin, thyroid Stimulating hormone, growth hormone, prolactin, luteinizing hormone, human chorionic gonadotropin, follicle stimulating hormone, adrenocorticotropic hormone releasing factor, gonadotropin releasing factor, prolactin releasing factor, prolactin inhibitor, growth hormone releasing factor, somatostatin, thyroid stimulating hormone releasing Factor, calcitonin gene-related peptide, parathyroid hormone, glucagon-like peptide 1, glucose-dependent insulinotropic polypeptide, gastrin, secretin, cholecystokinin, motilin, vasoactive intestinal peptide, substance P, pancreatic polypeptide, peptide tyrosine , Neuropeptide tyrosine, insulin, glucagon, placental lactogen, relaxin, angiotensin II, calcitriol, atrial natriuretic peptide and melatonin, thyroxine, triiodothyronine, calcitonin, estradiol, estrone, progesterone, testosterone, cortisol , Corticosterone, aldosterone, epinephrine, norepinephrine, androstiene, calcitriol, collagen, dexamethasone, β-mercaptoethanol, retinoic acid, butylhydroxyanisole, 5-azacytidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, It includes one or more growth factors selected from the group consisting of isobutylxanthine, indomethacin, β-glycerol phosphate, nicotinamide, DMSO, thiazolidinedione and TWS119.

本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、１つまたは複数の濃度で細胞集団に提供される。一部の実施形態では、候補分化因子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであるように、細胞集団に提供される。一部の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌである。 In some embodiments of the screening methods described herein, the candidate differentiation factor is provided to the cell population at one or more concentrations. In some embodiments, the candidate differentiation factor is provided to the cell population such that the concentration of the candidate differentiation factor in the medium surrounding the cells is about 0.1 ng/ml to 10 mg/ml. In some embodiments, the concentration of the candidate differentiation factor in the medium surrounding the cells is about 1 ng/ml to about 1 mg/ml. In another embodiment, the concentration of the candidate differentiation factor in the medium surrounding the cells is from about 10 ng/ml to about 100 μg/ml. In still other embodiments, the concentration of the candidate differentiation factor in the medium surrounding the cells is from about 100 ng/ml to about 10 μg/ml. In a preferred embodiment, the concentration of the candidate differentiation factor in the medium surrounding the cells is about 5 ng/ml to about 1000 μg/ml.

一部の実施形態では、本明細書に記載されるスクリーニング方法のステップは、第１の時点および第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を判定することを含む。これらの実施形態のいくつかでは、第１の時点は候補分化因子を細胞集団に提供する前かほぼ同じ時期であってもよい。あるいは、一部の実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供する後である。一部の実施形態では、第１の時点で複数のマーカーの発現が判定される。 In some embodiments, the steps of the screening methods described herein include determining the expression of at least one marker at a first time point and a second time point. In some of these embodiments, the first time point may be before or at about the same time as providing the candidate differentiation factor to the cell population. Alternatively, in some embodiments, the first time point is after providing the cell population with a candidate differentiation factor. In some embodiments, the expression of multiple markers is determined at the first time point.

少なくとも１種のマーカーの発現を第１の時点で決定することに加えて、本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、第１の時点の後であり、かつ細胞集団に候補分化因子をもたらした後である第２の時点で決定することが意図されている。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で複数種のマーカーの発現を決定する。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じ複数種のマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、それぞれが第１の時点の後であり、かつそれぞれが細胞集団に候補分化因子をもたらした後である複数の時点でマーカーの発現を決定する。ある特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲによってマーカーの発現を決定する。他の実施形態では、免疫細胞化学によってマーカーの発現を決定する。 In addition to determining the expression of the at least one marker at the first time point, in some embodiments of the screening methods described herein, the expression of the at least one marker is determined at the first time point. It is intended to be determined at a second time point, later and after bringing the candidate differentiation factor to the cell population. In such an embodiment, expression of the same marker is determined at both the first time point and the second time point. In some embodiments, the expression of multiple markers is determined at both the first time point and the second time point. In such embodiments, the expression of the same multiple markers is determined at both the first time point and the second time point. In some embodiments, expression of the marker is determined at multiple time points, each after the first time point and after each providing the cell population with the candidate differentiation factor. In certain embodiments, marker expression is determined by Q-PCR. In other embodiments, expression of the marker is determined by immunocytochemistry.

本明細書に記載のスクリーニング方法のある特定の実施形態では、第１の時点および第２の時点において発現が決定されるマーカーは、膵臓前駆細胞から膵島組織を構成する最終分化した細胞の先駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。そのような細胞としては、未成熟膵島ホルモン発現細胞を挙げることができる。 In certain embodiments of the screening methods described herein, the markers whose expression is determined at the first time point and the second time point are precursors of terminally differentiated cells that make up islet tissue from pancreatic progenitor cells. Is a marker associated with differentiation into cells. Examples of such cells include immature pancreatic islet hormone-expressing cells.

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間に十分な時間を経過させることができる。細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間の十分な時間は、約１時間の短さから約１０日間の長さまでであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、細胞集団に候補分化因子をもたらした後に多数回決定する。一部の実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、または少なくとも約８週間である。 In some embodiments of the screening methods described herein, a sufficient amount of time can be allowed between the step of bringing the candidate differentiation factor into the cell population and the step of determining the expression of the marker at the second time point. .. The sufficient time between bringing the candidate differentiation factor to the cell population and determining the expression of the marker at the second time point can be as short as about 1 hour to as long as about 10 days. In some embodiments, the expression of at least one marker is determined multiple times after introducing the candidate differentiation factor into the cell population. In some embodiments, the sufficient time is at least about 1 hour, at least about 6 hours, at least about 12 hours, at least about 16 hours, at least about 1 day, at least about 2 days, at least about 3 days, at least about 4 hours. Days, at least about 5 days, at least about 6 days, at least about 7 days, at least about 8 days, at least about 9 days, at least about 10 days, at least about 11 days, at least about 12 days, at least about 13 days, at least about 14 days Days, at least about 1 week, at least about 2 weeks, at least about 3 weeks, at least about 4 weeks, at least about 5 weeks, at least about 6 weeks, at least about 7 weeks, or at least about 8 weeks.

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるこのマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。少なくとも１種のマーカーの発現の増加または減少により、候補分化因子が内分泌先駆細胞の分化を促進することができることが示される。同様に、複数種のマーカーの発現を決定する場合、第２の時点における複数種のマーカーの発現が第１の時点におけるこの複数種のマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。マーカーの発現の増加または減少は、第１の時点および第２の時点での細胞集団におけるマーカーの量、レベルまたは活性を測定することまたは他のやり方で評価することによって決定することができる。そのような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現との比較的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して増加するある特定の実施形態では、増加の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１００倍超である。一部の実施形態では、増加の量は、２倍未満である。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して減少する実施形態では、減少の量は、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約６０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくとも約８０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１または少なくとも約１００分の１未満である。一部の実施形態では、減少の量は２分の１を下回らない。 In some embodiments of the methods described herein, further determining whether the expression of the marker at the second time point is increased or decreased compared to the expression of this marker at the first time point. Increased or decreased expression of at least one marker indicates that the candidate differentiation factor can promote the differentiation of endocrine precursor cells. Similarly, when determining the expression of multiple markers, it is further determined whether the expression of the multiple markers at the second time point is increased or decreased compared to the expression of the multiple marker at the first time point. decide. The increase or decrease in expression of the marker can be determined by measuring or otherwise assessing the amount, level or activity of the marker in the cell population at the first and second time points. Such a determination may be relative to other markers, eg housekeeping gene expression, or absolute. In certain embodiments where the expression of the marker at the second time point is increased compared to the first time point, the amount of increase is at least about 2-fold, at least about 5-fold, at least about 10-fold, at least about 20-fold. , At least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 60 times, at least about 70 times, at least about 80 times, at least about 90 times, at least about 100 times or at least about 100 times. In some embodiments, the amount of increase is less than 2-fold. In embodiments where the expression of the marker at the second time point is reduced compared to the first time point, the amount of reduction is at least about one-half, at least about one-fifth, at least about one-tenth, at least about one-tenth. About 1/20, at least about 1/30, at least about 1/40, at least about 1/50, at least about 1/60, at least about 1/70, at least about 1/80, at least about It is less than 1/90, at least about 1/100, or at least less than about 1/100. In some embodiments, the amount of reduction is not less than half.

多分化能細胞または分化した細胞の生成のモニタリング
多能性細胞から多分化能細胞、多分化能細胞から膵臓前駆体またはホルモン内分泌細胞などのさらに多分化能の細胞または分化した細胞への進行は、内分泌細胞における島ホルモンの発現およびプロインスリンからインスリンおよびＣペプチドへのプロセシングなどの、遺伝子マーカーおよび表現型マーカーを含めた特定の細胞に特有のマーカーの発現を決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ある特定のプロセスでは、未成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、ならびに多能性細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌先駆体、胚体外内胚葉、中胚葉、外胚葉、成熟膵島ホルモン発現細胞および／または他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠如を決定する。 Monitoring the generation of pluripotent or differentiated cells Progression from pluripotent cells to pluripotent cells, or pluripotent cells to more pluripotent or differentiated cells such as pancreatic precursors or hormone endocrine cells , Can be monitored by determining the expression of islet hormones in endocrine cells and the expression of markers specific to particular cells, including genetic and phenotypic markers, such as processing of proinsulin to insulin and C-peptide. .. In some processes, the expression of a particular marker is determined by detecting the presence or absence of the marker. Alternatively, the expression of a particular marker can be determined by measuring the level at which the marker is present in cells of a cell culture or cell population. For example, in certain processes, expression of markers unique to immature pancreatic islet hormone-expressing cells, as well as pluripotent cells, definitive endoderm, foregut endoderm, PDX1-positive foregut endoderm, endocrine precursors, and extraembryonic Determine the lack of significant expression of germ layer, mesoderm, ectoderm, mature pancreatic islet hormone expressing cells and/or other cell type specific markers.

他の胚体内胚葉系列の分化の程度がより低い細胞型の生成のモニタリングに関連して記載されている通り、ブロット転写法および免疫細胞化学などの定性的技法または半定量的技法を使用して、マーカーの発現を測定することができる。あるいは、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲなどの技法を使用することによって正確に定量化することができる。さらに、ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くは分泌タンパク質であることが理解されよう。このように、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカー含有量を測定するための技法を利用することができる。 Using qualitative or semi-quantitative techniques such as blot transcription and immunocytochemistry, as described in connection with the monitoring of the production of less differentiated cell types of other definitive endoderm lineages. , The expression of the marker can be measured. Alternatively, marker expression can be accurately quantified by using techniques such as Q-PCR. Further, it will be appreciated that at the polypeptide level, many of the markers for islet hormone-expressing cells are secreted proteins. Thus, techniques such as ELISA for measuring extracellular marker content can be utilized.

例えば、一実施形態では、ＰＤＸ１はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉と関連したマーカー遺伝子である。このように、本発明の一部の実施形態では、ＰＤＸ１の発現が判定される。他の実施形態では、限定されずにＳＯＸ１７、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１などの、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉で発現される他のマーカーの発現も判定される。ＰＤＸ１は特定の他の細胞型（すなわち、内臓内胚葉および特定の神経外胚葉）が発現することもできるので、本発明の一部の実施形態は、内臓内胚葉および／または神経外胚葉と関連したマーカー遺伝子発現の不在または実質的な不在を実証することに関する。例えば、一部の実施形態では、限定されずにＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭを含む、内臓内胚葉および／または神経細胞で発現されるマーカーの発現が判定される。 For example, in one embodiment PDX1 is a marker gene associated with PDX1-positive foregut endoderm. Thus, in some embodiments of the invention, PDX1 expression is determined. In other embodiments, the expression of other markers expressed in PDX1-positive foregut endoderm, such as but not limited to SOX17, HNF6, SOX9 and PROX1, is also determined. Since PDX1 can also be expressed by certain other cell types (ie, visceral endoderm and certain neuroectodermal), some embodiments of the invention relate to visceral endoderm and/or neuroectodermal. Demonstrating the absence or substantial absence of marker gene expression. For example, in some embodiments, expression of markers expressed in visceral endoderm and/or neural cells is determined, including but not limited to SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 and/or NFM.

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１またはＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。特定の実施形態では、本明細書に記載されるプロセスによって生成されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、近位内胚葉、遠位内胚葉および／または神経細胞を実質的に含まない。 In some embodiments, the PDX1-positive foregut endoderm cell cultures produced by the methods described herein are substantially free of cells expressing a SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 or NFM marker gene. Absent. In certain embodiments, the PDX1-positive foregut endoderm cell cultures produced by the processes described herein are substantially free of proximal endoderm, distal endoderm and/or neurons.

本明細書に記載される多能性細胞（例えば、上記Ｄ’Ａｍｏｕｒら２００６に記載されるステージまたはステップ１〜５の結果として生成される細胞）の発達の進行は、発達経路に沿う各ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来の細胞型の特徴であるマーカーの発現を判定することによって監視することができる。一部のプロセスでは、ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来の細胞型の同定および特徴づけは、特定のマーカーの発現または複数のマーカーの異なる発現レベルおよびパターンによる。すなわち、１つまたは複数のマーカーの存在または不在、高発現または低発現は細胞型の特徴を表し、それを特定する。さらに、特定のマーカーは一過性の発現を有することができ、それによりそのマーカーは発達の１つのステージの間に高度に発現され、発達の別のステージでは弱く発現される。特定のマーカーの発現は、標準化または規格化された対照マーカーと比較して細胞培養物または細胞集団の細胞にそのマーカーが存在するレベルを測定することによって判定することができる。そのようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成されるマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲの実施方法は、当技術分野で周知である。 The developmental progression of the pluripotent cells described herein (eg, the cells generated as a result of the stages or steps 1-5 described in D'Amour et al 2006, supra) is dependent on the development of each hES along the developmental pathway. Can be monitored by determining the expression of markers that are characteristic of cell types derived or derived from iPS. In some processes, the identification and characterization of hES- or iPS-derived cell types depends on the expression of specific markers or the different expression levels and patterns of multiple markers. That is, the presence or absence, high expression or low expression of one or more markers is characteristic of and is characteristic of the cell type. Moreover, certain markers can have transient expression, whereby the marker is highly expressed during one stage of development and weakly expressed during another stage of development. Expression of a particular marker can be determined by measuring the level at which that marker is present in cells of a cell culture or population of cells relative to a standardized or standardized control marker. In such a process, measuring marker expression may be qualitative or quantitative. One way to quantify the expression of the marker produced by the marker gene is by using quantitative PCR (Q-PCR). Methods of performing Q-PCR are well known in the art.

本発明の一部の実施形態では、マーカーの存在、不在および／または発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって判定される。例えば、特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＣＤＸ２、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４アルファ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１および本明細書に記載される他のマーカーによって生成される転写産物の量は、定量的Ｑ−ＰＣＲによって判定される。 In some embodiments of the invention, the presence, absence and/or expression level of the marker is determined by quantitative PCR (Q-PCR). For example, specific genetic markers such as SOX17, CXCR4, OCT4, AFP, TM, SPARC, SOX7, CDX2, MIXL1, GATA4, HNF3β, HNF4alpha, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1 and the present specification. The amount of transcript produced by the other markers described in 1. is determined by quantitative Q-PCR.

他の実施形態では、免疫組織化学的検査を使用して、上記の遺伝子によって発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲを免疫組織化学的な技法またはフローサイトメトリー技法と併せて使用して、細胞型を有効かつ正確に特徴付け、同定し、目的の細胞型におけるそのようなマーカーの量および相対的割合の両方を決定することができる。一実施形態では、Ｑ−ＰＣＲにより、細胞が混在する集団を含有する細胞培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを数量化することができる。しかし、Ｑ−ＰＣＲでは、目的のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞で共発現されるかどうかをもたらすまたは認定することはできない。別の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲをフローサイトメトリー法と併せて使用して細胞型を特徴付け、同定する。したがって、本明細書に記載の方法と、例えば上記のものなどを組み合わせて使用することによって、内胚葉系列型細胞を含めた種々の細胞型の完全な特徴付けおよび同定を実現および実証することができる。 In another embodiment, immunohistochemistry is used to detect the proteins expressed by the above genes. In still other embodiments, Q-PCR is used in conjunction with immunohistochemical or flow cytometric techniques to effectively and accurately characterize and identify cell types, and to identify such cell types of interest. Both the amount and relative proportion of markers can be determined. In one embodiment, Q-PCR can quantify the level of RNA expression in cell culture containing a mixed population of cells. However, Q-PCR cannot provide or identify whether the marker or protein of interest is co-expressed in the same cell. In another embodiment, Q-PCR is used in conjunction with flow cytometry methods to characterize and identify cell types. Thus, the methods described herein can be used in combination with, for example, those described above to achieve and demonstrate the complete characterization and identification of various cell types, including endodermal lineage type cells. it can.

例えば、好ましい一実施形態では、膵臓前駆体または膵臓内胚葉またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉は、Ｑ−ＰＣＲおよび／またはＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよび／またはｃＭＹＣを発現するが、そのような細胞は、ＰＤＸ１陽性発現細胞と同定されるためには、ＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１を共発現し、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、またはＣＥＲを含めた他のマーカーを発現しない。同様に、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで成熟ホルモン分泌膵臓細胞を適切に同定するために、例えばインスリン分泌細胞において、Ｃ−ペプチド（成熟かつ機能性のβ細胞におけるプロインスリンの適切なプロセシングの産物）およびインスリンが共発現されることがＩＣＣによって実証される。 For example, in one preferred embodiment, the pancreatic precursor or pancreatic endoderm or PDX-1 positive pancreatic endoderm is at least PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA and/or as demonstrated by Q-PCR and/or ICC. Although expressing cMYC, such cells co-expressed at least PDX1 and Nkx6.1, as demonstrated by ICC, and included SOX17, CXCR4, or CER in order to be identified as PDX1-positive expressing cells. Does not express other markers. Similarly, to properly identify mature hormone-secreting pancreatic cells in vitro or in vivo, for example in insulin-secreting cells, C-peptide (the product of proper processing of proinsulin in mature and functional β-cells) and ICC demonstrates that insulin is co-expressed.

さらに、当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる（例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析など）。ある特定のプロセスでは、ｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の発現ならびにｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠如。ｈＥＳ由来細胞型を特徴付け、同定するためのさらに別の方法は、上に示されている関連出願に記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 In addition, other methods known in the art can also be used to quantify marker gene expression. For example, expression of the marker gene product can be detected by using an antibody specific for the marker gene product of interest (eg, Western blot, flow cytometric analysis, etc.). In certain processes, expression of a marker gene specific for hES-derived cells as well as significant lack of expression of a marker gene specific for hES-derived cells. Further methods for characterizing and identifying hES-derived cell types are described in the related applications set forth above, which are fully incorporated herein by reference.

増幅アッセイで使用するのに適する増幅プローブ／プライマー組合せは、以下の通りである：インスリン（ＩＮＳ）（ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿０００２０７）：プライマーＡＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１）；ＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号２）；Ｎｋｘ６．１（ＮＭ＿００６１６８）：プライマーＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡ（配列番号３）；ＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号４）；Ｐｄｘ１（ＮＭ＿０００２０９）：プライマーＡＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧ（配列番号５）；ＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣ（配列番号６）；Ｎｇｎ３（ＮＭ＿０２０９９９）：プライマーＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号７）；ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴ（配列番号８）；ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）（ＮＭ＿０２１７８４）：プライマーＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡ（配列番号９）；ＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡ（配列番号１０）；グルカゴン（ＧＣＧ）（ＮＭ＿００２０５４）：プライマーＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号１１）；ＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号１２）；ＨＮＦ６（ＮＭ＿０３０７１２）：プライマーＣＧＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴ（配列番号１３）；ＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号１４）；ＨＮＦ４アルファ（ＮＭ＿０００４５７）：プライマーＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡ（配列番号１５）；ＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧ（配列番号１６）；Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２２４５４）：プライマーＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号１７）；ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号１８）；ＨＬｘＢ９（ＮＭ＿００５５１５）：プライマーＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣ（配列番号１９）；ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡ（配列番号２０）；Ｎｋｘ２．２（ＮＭ＿００２５０９）：プライマーＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号２１）；ＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＴ（配列番号２２）；ＰＴＦ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１）：プライマーＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ（配列番号２３）；ＧＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴ（配列番号２４）；ＳＳＴ（ＮＭ＿００１０４８）：プライマーＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号２５）；ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号２６）；ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）：プライマーＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２７）；ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＴＡ（配列番号２８）；Ｏｃｔ４プライマー：ＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号２９）；ＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧ（配列番号３０）；ＭＩＸＬ１プライマーＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ（配列番号３１）ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧ（配列番号３２）；ＧＡＴＡ４プライマーＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧ（配列番号３３）ＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴ（配列番号３４）；ＧＳＣプライマーＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号３５）ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３６）；ＣＥＲプライマーＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴ（配列番号３７）ＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ（配列番号３８）；ＡＦＰプライマーＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号３９）ＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４０）；ＳＯＸ１プライマーＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号４１）ＣＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧ（配列番号４２）；ＺＩＣ１プライマーＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号４３）ＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ（配列番号４４）；ＮＦＭプライマーＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号４５）ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴ（配列番号４６）。他のプライマーは、ＦＧＦ１７（Ｈｓ００１８２５９９＿ｍ１）、ＶＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＣＭＫＯＲ１（Ｈｓ００６０４５６７＿ｍ１）、ＣＲＩＰ１（Ｈｓ００８３２８１６＿ｇ１）、ＦＯＸＱ１（Ｈｓ００５３６４２５＿ｓ１）、ＣＡＬＣＲ（Ｈｓ００１５６２２９＿ｍ１）およびＣＨＧＡ（Ｈｓ００１５４４４１＿ｍ１）を含め、ＡＢＩＴａｑｍａｎを通して入手できる。 Suitable amplification probe/primer combinations for use in the amplification assay are as follows: Insulin (INS) (GenBank NM_000207): Primer AAGAGGCCATCAAGCAGATCA (SEQ ID NO: 1); CAGGAGGGCGCATCCACCA (SEQ ID NO: 2); Nkx6.1 (NM_006168). ): primer CTGGCCTGTACCCCCTCATCA (SEQ ID NO: 3); CTTCCCGTCTTTGTCCCAACAA (SEQ ID NO: 4); Pdx1 (NM_000209): primer AAGTCTACCAAAGCTCACGCT (SEQ ID NO: 5); GGTTGAGGCGTCATCCTTTCT (SEQ ID NO: 8); FOXA2 (HNF3B) (NM_021784): primer GGGAGCGGTGAAGATGGA (SEQ ID NO: 9); TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA (SEQ ID NO: 10); glucagon (GCG) (NM_002054): primer AAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT (SEQ ID NO: 11); TGATCTGGATTTCTCCTCTGTGTCT (SEQ ID NO: 12); HNF6 (NM_030712): primer CGCTCCGCTTAGCAGCAT (SEQ ID NO: 13); GTGTTGCCCTCTATCCTTCCCAT (SEQ ID NO: 14); HNF4alpha (NM_000457): primer GAAGAAGGAAGCCGTCCAGA (SEQ ID NO: 15); GACCTCTGA; GGCGCAGGCAGAATCCAGA (SEQ ID NO: 17); NNNNNNNNNNNNNN NNNNN (SEQ ID NO: 18); HLxB9 (NM_005515): primer CACCGCGGGGCATGATCC (SEQ ID NO: 19); GGGACTTGGAGCTTGAGTCCT (SEQ ID NO:22); PTF1a (NM — 178161): primer GAAGGTCATCATCTGCCATCG (SEQ ID NO:23); GG CCATAATCAGGGTCGCT (SEQ ID NO: 24); SST (NM_001048): Primer CCCCAGACTCCGTCAGTTTC (SEQ ID NO: 25); TCCGTCTGGTTGGGTTCAG (SEQ ID NO: 26); PAX6 (NM_000280): Primer CCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG (SEQ ID NO: 27); TCTGCGCGCCCCTAGTTA (SEQ ID NO: 28); Oct4 primers: TGGGCTCGAAGAAGGATGTG (SEQ ID NO: 29); GCATAGTCGCTGCTTGATCG (SEQ ID NO: 30); MIXL1 primer CCGAGTCCAGGATGAGATGAGGATGAGAGCGAGGATGAGGAGGATGAGGAGCGAGGATGAGGAGCGAGGAGAGCGAGGAGAGAGGTAGAG (SEQ ID NO: 32); 35) CTCTGATGAGGACCGCTTCTG (SEQ ID NO: 36); CER primer ACAGTGCCCTTCAGCCAGACT (SEQ ID NO: 37) ACAACTACTTTTTCACAGCCTTCGT (SEQ ID NO: 38); AFP primer GAGAAACCCACTGGAGATGAACA (SEQ ID NO: 39) CTCATGGCAAAGTTCTTCCAGAA (SEQ ID NO: 40); SOXl primer ATGCACCGCTACGACATGG (SEQ ID NO: 41) CTCATGTAGCCCTGCGAGTTG (SEQ No. 42); ZIC1 primer CTGGCTGTGGCAAGGTCTTC (SEQ ID NO: 43) CAGCCCTACAACTCGGCACTT (SEQ ID NO: 44); NFM primer ATCGAGGAGGCGCCACAAC (SEQ ID NO: 45) TGCTGGAGTGGTGCCTGGT (SEQ ID NO: 46). Other primers include FGF17 (Hs00182599_m1), VWF (Hs00169795_m1), CMKOR1 (Hs00604567_m1), CRIP1 (Hs00832816_g1), FOXQ1 (Hs00536425_s1), CALCR (Hs00156229_m1), 41 and CHGA (Hs00156229_m1) and CHGA (Hs00156229_m1) and CHGA (Hs00156229_m1).

ＩｎｖｉｖｏにおけるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（ステージ１〜４）の生成およびインスリン生成の要約
特定の内胚葉系列および膵臓内胚葉系列細胞の生成のための方法が本明細書で提供され、関連出願、例えば２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳの別の箇所で述べられ、それは２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願であり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 Summary of PDX1-Positive Pancreatic Endoderm (Stage 1-4) Generation and Insulin Production In Vivo Methods for the generation of specific endoderm lineages and pancreatic endoderm lineage cells are provided herein and related applications, eg, US patent application Ser. No. 11/773,944, filed Jul. 5, 2007, elsewhere in the title METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, which is filed on Mar. 2, 2007, US patent application Ser. No. 681,687, ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION, which are incorporated by reference in their entireties.

簡単に述べると、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に関する本発明の定方向分化法は、少なくとも４つまたは５つのステージで説明することができる。ステージ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、約２〜５日、好ましくは２日または３日かかる。多能性幹細胞は、ＲＰＭＩ、ＴＧＦスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路アクチベータ、例えばＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ−２７６３２（１０μΜ）を含む培地に懸濁させ、成長、生存および増殖を増強するだけでなく細胞間接着を促進する。約２４時間後に、培地を、血清、例えば０．２％ＦＢＳなど、およびＴＧＦβスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤を含有するＲＰＭＩを含む培地と交換し、さらに２４時間（１日目）〜４８時間（２日目）置く。あるいは、アクチビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間置いた後、その後の２４時間、アクチビンを単独で含む培地（すなわち、培地はＷｎｔ３ａを含まない）で細胞を培養する。重要なことに、胚体内胚葉の生成には、低血清含有量、およびそれにより、低インスリンまたはインスリン様成長因子含有量の細胞培養条件が必要である。本明細書に完全に組み込まれるＭｃＬｅａｎら（２００７）ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２５：２９−３８を参照されたい。ＭｃＬｅａｎらにより、ステージ１においてｈＥＳ細胞をわずか０．２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンと接触させることは、胚体内胚葉の生成にとって有害であり得ることも示された。また別の当業者により、多能性細胞から胚体内胚葉へのステージ１分化が実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒら（２００５）に記載の通り改変された。例えば、少なくとも、Ａｇａｒｗａｌら、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（２００８）２６：１１１７−１１２７；Ｂｏｒｏｗｉａｋら、ＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅｓＥｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙＤｉｒｅｃｔＥｎｄｏｄｅｒｍａｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＭｏｕｓｅおよびＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、（２００９）ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４：３４８−３５８；およびＢｒｕｎｎｅｒら、ＤｉｓｔｉｎｃｔＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｈｕｍａｎｆｅｔａｌｌｉｖｅｒ、（２００９）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９：１０４４−１０５６。他の内胚葉系列細胞を導出するためには胚体内胚葉の適切な分化、特定化、特徴付けおよび同定が必要である。このステージにおける胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を共発現し、少なくともＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰは評価できるほどには発現しない。 Briefly, the directed differentiation method of the present invention for pluripotent stem cells such as hES cells and iPS cells can be described in at least 4 or 5 stages. Stage 1 is the generation of definitive endoderm from pluripotent stem cells, which takes about 2-5 days, preferably 2 or 3 days. Pluripotent stem cells are RPMI, TGF superfamily member growth factors such as activin A, activin B, GDF-8 or GDF-11 (100 ng/ml), Wnt family members or Wnt pathway activators such as Wnt3a (25 ng/ml). Alternatively, it is suspended in a medium containing a rho kinase or a ROCK inhibitor, such as Y-27632 (10 μM), and enhances growth, survival and proliferation, as well as promotes cell-cell adhesion. Approximately 24 hours later, the medium was added with serum such as 0.2% FBS and TGFβ superfamily member growth factors such as activin A, activin B, GDF-8 or GDF-11 (100 ng/mL), or rho kinase. Alternatively, the medium is replaced with an RPMI-containing medium containing a ROCK inhibitor, and the culture medium is allowed to stand for 24 hours (day 1) to 48 hours (day 2). Alternatively, after being placed in a medium containing activin/Wnt3a for about 24 hours, the cells are cultured for 24 hours thereafter in a medium containing activin alone (ie, the medium does not contain Wnt3a). Importantly, the production of definitive endoderm requires cell culture conditions with low serum content and thereby low insulin or insulin-like growth factor content. See McLean et al. (2007) Stem Cells 25:29-38, which is fully incorporated herein. It was also shown by McLean et al. that contacting hES cells with insulin at a concentration of only 0.2 μg/mL in stage 1 may be detrimental to definitive endoderm production. Yet another person skilled in the art has modified stage 1 differentiation of pluripotent cells to definitive endoderm substantially as described herein and in D'Amour et al. (2005). For example, at least, Agarwal et al., Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells (2008) 26: 1117-1127; Borowiak et al., Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells, (2009) Cell Stem Cell 4: 348-358; and Brunner et al., Distinct DNA methylation patterns characterized differed human human embionic stem cells and developing human venue. 19:1044-1056. Proper differentiation, specification, characterization and identification of definitive endoderm is required to derive other endoderm lineage cells. Definitive endoderm cells at this stage co-express SOX17 and HNF3β (FOXA2) and at least HNF4alpha, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2. 2, INS, GSC, GHRL, SST, or PP are not appreciably expressed.

ステージ２はステージ１から胚体内胚葉細胞培養物をとり、懸濁培養物をＩＴＳの１：１０００希釈液中の０．２％ＦＢＳなどの低い血清レベル、２５ｎｇのＫＧＦ（またはＦＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害剤を有するＲＰＭＩと２４時間（２日目から３日目）インキュベートして、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進することによって、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を生成する。２４時間後に（３日目〜４日目）、培地を、ＴＧＦβ阻害剤を含まないが、その代わりに、細胞の成長、生存および増殖を増強するためにＲＯＣＫ阻害剤をなお含む同じ培地と交換し、さらに２４時間（４日目〜５日目）〜４８時間（６日目）置く。前腸内胚葉を適切に特定化するための重要なステップはＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。したがって、２．５μＭのＴＧＦβ阻害剤番号４またはＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的な阻害剤である５μＭのＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤をステージ２細胞培養物に添加することができる。ステージ２で生成した前腸内胚葉またはＰＤＸ１−陰性前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４アルファを共発現し、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞または内分泌先駆体ならびに単一または複数ホルモン型細胞の特質である、少なくともＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）も、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰも評価できるほどには共発現しない。 Stage 2 takes definitive endoderm cell cultures from stage 1 and suspends the culture in suspension at low serum levels such as 0.2% FBS in 1:1000 dilution of ITS, 25 ng KGF (or FGF7), or ROCK. Foregut endoderm or PDX1-negative foregut endoderm by incubating with RPMI with inhibitor for 24 hours (Days 2 to 3) to enhance growth, survival, proliferation and promote intercellular adhesion To generate. After 24 hours (days 3-4), the medium was replaced with the same medium without TGFβ inhibitor but instead still with ROCK inhibitor to enhance cell growth, survival and proliferation. Then, it is left for another 24 hours (4th to 5th days) to 48 hours (6th day). An important step for proper specification of the foregut endoderm is the removal of TGFβ family growth factors. Therefore, 2.5 μM TGFβ inhibitor #4 or TGFβ inhibitors such as 5 μM SB431542, which is a specific inhibitor of the TGFβ type I receptor activin receptor-like kinase (ALK), were added to stage 2 cell cultures. can do. Foregut endoderm or PDX1-negative foregut endoderm cells generated in stage 2 co-express SOX17, HNF1β and HNF4alpha, and are definitive endoderm, PDX1-positive pancreatic endoderm or pancreatic precursor or endocrine precursors and At least SOX17 and HNF3β (FOXA2), which are characteristic of one or more hormone-type cells, are also HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, or PP also do not co-express appreciably.

ステージ３（５〜８日目）では、ステージ２から前腸内胚葉細胞培養物を取得し、１％Ｂ２７、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、０．２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢなどのレチノイン酸類似体、および５０ｎｇ／ｍＬのノギン中、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩにより、約２４時間（７日目）〜４８時間（８日目）にわたってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成する。具体的には、出願人らは、およそ２００３年からＤＭＥＭ−高グルコースを使用しており、その時点の全ての特許および非特許開示物では、「ＤＭＥＭ−高グルコース」などの言及がなくてもＤＭＥＭ−高グルコースが使用されている。これは、一部において、Ｇｉｂｃｏなどの製造者が、例えばＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１１９６０）およびＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９）などのように、ＤＭＥＭをそのように名付けていなかったことが理由である。本出願の出願日時点で、ＧｉｂｃｏはさらなるＤＭＥＭ製品を提供しているが、従来通り、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９−０１８）など、それらの高グルコースを含有するある特定のＤＭＥＭ産物に「高グルコース」と付けていないことに注目すべきである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの場合に、高グルコースを含有するＤＭＥＭを意味すると推定することができ、これは、この分野における研究開発を行っている他者には明らかなことであった。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤またはｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２などを使用して、成長、生存、増殖を増強することおよび細胞間接着を促進することができる。ステージ３で生成したＰＤＸ１陽性前腸細胞は、ＰＤＸ１およびＨＮＦ６、ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸを共発現し、上のステージ１およびステージ２に記載されている胚体内胚葉細胞もしくは前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーは評価できるほどには共発現しない。 In stage 3 (5th to 8th day), a foregut endoderm cell culture was obtained from stage 2, and 1% B27, 0.25 μM KAAD cyclopamine, 0.2 μM retinoic acid (RA) or other retinoid or 3 nM was used. DTNPB and retinoic acid analogs and 50 ng/mL noggin generate PDX1-positive foregut endoderm cells for approximately 24 hours (7 days) to 48 hours (8 days) with DMEM or RPMI. Specifically, Applicants have been using DMEM-high glucose since approximately 2003, and in all patent and non-patent disclosures at that time, even without reference to "DMEM-high glucose" and the like. DMEM-high glucose is used. This is in part because manufacturers such as Gibco did not so name DMEM, such as DMEM (Cat number 11960) and Knockout DMEM (Cat number 10829). As of the filing date of the present application, Gibco has provided additional DMEM products, but as is conventional, certain DMEM products containing those high glucose, such as Knockout DMEM (Cat No. 10829-018), were "highly enriched." It should be noted that it is not labeled "glucose". Therefore, in each case where DMEM is mentioned, it can be presumed to mean DMEM containing high glucose, which was obvious to others conducting research and development in this field. .. In addition, ROCK inhibitors or rho kinase inhibitors such as Y-27632 can be used to enhance growth, survival, proliferation and promote cell-cell adhesion. PDX1-positive foregut cells generated in stage 3 co-express PDX1 and HNF6, as well as SOX9 and PROX, and are definitive endoderm cells or foregut endoderm (PDX1-negative progenitor cells as described in stages 1 and 2 above). Markers indicative of intestinal endoderm cells or PDX1-positive foregut endoderm cells do not appreciably co-express.

ステージ４（８〜１４日目）では、ステージ３から培地を取得し、それを、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメント、それに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および時にはさらに５０ｎｇ／ｍＬのノギン中、ＤＭＥＭを含有する培地と交換する。再び、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進するために、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ステージ４から生成されるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１、ならびにＰＴＦ１Ａを共発現し、上においてステージ１、２および３で記載される胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞の指標となるマーカーをあまり発現しない。 In stage 4 (days 8-14), the medium was obtained from stage 3 and added to it with 1% vol/vol B27 supplement, plus 50 ng/mL KGF and 50 ng/mL EGF, and sometimes an additional 50 ng. Replace with medium containing DMEM in /ml Noggin. Again, ROCK inhibitors such as Y-27632 can be used to enhance growth, survival, proliferation and promote cell-cell adhesion. PDX1-positive pancreatic endoderm cells generated from stage 4 co-express at least PDX1 and Nkx6.1, and PTF1A and are definitive endoderm or foregut endoderm (PDX1) as described above in stages 1, 2 and 3. Negative foregut endoderm) does not express much marker that is an indicator of cells.

あるいは、ステージ４からの細胞は、約１〜６日間（１５日目から２０日目）の１体積／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭ含有培地で、ステージ５でさらに分化させて、内分泌先駆体もしくは前駆体型の細胞および／または単一および複数ホルモン性の膵臓内分泌型の細胞をステージ４細胞から生成することができる。ステージ５から生成される内分泌先駆細胞は、少なくともＮＧＮ３およびＰＡＸ４ならびにＮｋｘ２．２を共発現し、上においてステージ１、２、３および４で記載される、胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞の指標となるマーカーを感知し得るほどには発現しない。 Alternatively, cells from stage 4 were further differentiated at stage 5 with medium containing DMEM in 1% v/v B27 supplement for about 1-6 days (days 15-20) to further differentiate at stage 5 to produce endocrine precursors. Alternatively, precursor-type cells and/or mono- and multi-hormonal pancreatic endocrine-type cells can be generated from stage 4 cells. Endocrine progenitor cells generated from stage 5 co-express at least NGN3 and PAX4 and Nkx2.2 and are described in stages 1, 2, 3 and 4 above in definitive endoderm or foregut endoderm (PDX1-negative Foregut endoderm) or PDX1-positive pancreatic endoderm or progenitor markers are not appreciably expressed.

ステージ４で生成したＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉をマクロ封入デバイスにローディングし、完全に含有させ、患者に移植し、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞をｉｎｖｉｖｏで膵臓ホルモン分泌細胞、例えばインスリン分泌性細胞に成熟させる。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の封入およびｉｎｖｉｖｏにおけるインスリンの生成は、米国特許出願第１２／６１８，６５９号（‘６５９出願”）、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＬＩＮＥＡＧＥＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ」、２００９年１１月１３日出願に詳細に記載されている。‘６５９出願は、仮特許出願第６１／１１４，８５７号、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ」、２００８年１１月１４日出願；および米国特許仮出願第６１／１２１，０８４号、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ」、２００８年１２月９日出願の優先権を主張するものである。これらの出願の各々の開示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。 PDX1-positive pancreatic endoderm generated in stage 4 was loaded into a macroencapsulation device, completely contained, and transplanted into a patient, and PDX1-positive pancreatic endoderm cells were matured in vivo into pancreatic hormone-secreting cells such as insulin-secreting cells. Let The encapsulation of PDX1-positive pancreatic endoderm cells and the production of insulin in vivo are described in US patent application Ser. This is described in detail in the application filed on November 13, 2013. The '659 application is provisional patent application No. 61/114,857, entitled "ENCAPSURATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS", filed November 14, 2008; and US provisional application No. 61/121,084, titled. "ENCAPSURATION OF PANCREATIC ENDORDER CELLS" claims the priority of the application filed on December 9, 2008. The disclosure of each of these applications is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載の方法、組成物およびデバイスは、現在、好ましい実施形態を表し、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変化および他の使用は本発明の主旨の範囲内に包含され、本開示の範囲によって定義されることが当業者には想起されよう。したがって、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができることが当業者には明らかになろう。 The methods, compositions and devices described herein are presently representative of preferred embodiments, are exemplary, and do not limit the scope of the invention. Those skilled in the art will appreciate that variations and other uses thereof are within the spirit of the invention and are defined by the scope of the disclosure. It will therefore be apparent to those skilled in the art that various substitutions and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the invention.

例えば、多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を生成するために、成長因子またはシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであるアクチビンＡが使用されるが、参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６８６号、表題「ＧＲＯＷＴＨＦＡＣＴＯＲＳＦＯＲＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００８年６月３日出願に記載されているものなど他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー、例えばＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１を、胚体内胚葉を生成するために使用することができる。 For example, activin A, a member of the TGFβ superfamily of growth factors or signaling proteins, is used to generate definitive endoderm from pluripotent cells such as hES cells and iPS cells, which is incorporated herein by reference. International Patent Application No. PCT/US2008/065686, fully incorporated by reference, in the title "GROWTH FACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDORDER", other TGFβ superfamily members such as those described in the application filed June 3, 2008, eg GDF. -8 and GDF-11 can be used to generate definitive endoderm.

ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ１陽性前腸細胞に分化させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかし、４−［（Ｅ）−２−（５、６、７、８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（またはＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまたはレチノイン酸類似体および同様の類似体（例えば、４−ＨＢＴＴＮＰＢ）を使用することができる。 Retinoic acid (RA) is used to differentiate stage 2 PDX1-negative foregut endoderm cells into stage 3 PDX1-positive foregut cells. However, such as 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoic acid (or TTNPB) Other retinoids or retinoic acid analogs and similar analogs (eg, 4-HBTTNPB) can be used.

ノギンは、例えば、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活化するタンパク質である。しかし、コーディンおよびねじれ原腸形成（ＴｗｉｓｔｅｄＧａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）などの他のＢＭＰ４阻害剤または抗ＢＭＰ中和抗体によっても、ＢＭＰとその細胞表面受容体の結合を妨げ、それにより、ＢＭＰシグナル伝達を有効に阻害することができる。あるいは、ヒトノギンの遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０７５，００７号を参照されたい。ノギン配列の解析により、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤との相同性を有するカルボキシ末端領域が示され、これにより、潜在的に他のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰの阻害に関して同様の効果を有し得ることが示されている。 Noggin is a protein that inactivates members of the TGFβ superfamily signaling proteins, such as bone morphogenetic protein-4 (BMP4). However, other BMP4 inhibitors such as chordin and twisted gastrulation (Tsg) or anti-BMP neutralizing antibodies also interfere with the binding of BMPs to their cell surface receptors, thereby impairing BMP signaling. Can be effectively inhibited. Alternatively, the human Noggin gene has been cloned and sequenced. See US Pat. No. 6,075,007, which is incorporated herein by reference. Analysis of the Noggin sequence reveals a carboxy-terminal region with homology to Kunitz-type protease inhibitors, which potentially allows other Kunitz-type protease inhibitors to have similar effects on the inhibition of BMPs. It is shown.

最後に、本明細書および米国出願第１２／６１８，６５９号に記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれているマクロ封入デバイスは、再度、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に、デバイスのサイズ、デバイス内のチャンバーまたは亜区画が複数であること、またはポートが複数であること、さらにはデバイスのローディングおよび抽出の機構などのデバイス設計の変化は全て本発明の主旨の範囲内に包含される。したがって、本明細書に記載の分化方法への種々の置換および改変だけでなく、封入デバイスへの種々の置換および改変も同様に、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく行うことができることが当業者には明らかになろう。 Finally, the macroencapsulation device described herein and in US application Ser. No. 12/618,659, which is fully incorporated herein by reference, is again merely exemplary, and may be It does not limit the range. In particular, changes in device design, such as device size, multiple chambers or sub-compartments within the device, or multiple ports, as well as device loading and extraction mechanisms, are all within the scope of the present invention. Contained within. Thus, not only are various substitutions and modifications to the differentiation methods described herein, as well as various substitutions and modifications to the encapsulation device, made to the invention disclosed herein relative to the invention disclosed herein. It will be apparent to those skilled in the art that work can be done without departing from the scope and spirit.

胚体内胚葉の生成および組成物（ステージ１）
一部のプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を多能性細胞培養物に供給することによって達成される。胚体内胚葉の生成のために有益であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、Ｎｏｄａｌ／アクチビン、ＧＤＦ−８、−９、−１０、−１１等またはＢＭＰサブグループから選択される。一部の好ましい分化プロセスでは、成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＢＭＰ４からなる群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ、他のＷｎｔファミリーメンバー、およびＷｎｔ経路アクチベータが胚体内胚葉細胞の生成のために有益である。ある特定の分化プロセスでは、前述の成長因子のいずれかの組合せを使用することができる。この方法および他の方法は米国特許第７，５１０．８７６号に詳細に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 Generation of definitive endoderm and composition (stage 1)
In some processes, definitive endoderm differentiation is achieved by supplying pluripotent cell cultures with growth factors of the TGFβ superfamily in amounts sufficient to promote definitive endoderm differentiation. .. Growth factors of the TGFβ superfamily that are beneficial for the generation of definitive endoderm are selected from Nodal/activin, GDF-8, -9, -10, -11 etc. or the BMP subgroup. In some preferred differentiation processes, the growth factor is selected from the group consisting of Nodal, Activin A, Activin B, GDF-8, GDF-11 and BMP4. In addition, growth factor Wnt3a, other Wnt family members, and Wnt pathway activators are beneficial for the generation of definitive endoderm cells. Any combination of the aforementioned growth factors can be used in a particular differentiation process. This and other methods are described in detail in US Pat. No. 7,510.876, which is fully incorporated herein by reference.

多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためのプロセスの一部に関して、上記の成長因子は、成長因子が培養物中に、多能性細胞の少なくとも一部分から胚体内胚葉細胞への分化を促進するために十分な濃度で存在するように細胞に供給される。いくつかのプロセスでは、上記の成長因子は、細胞培養物中に少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍＬまたは約５０００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で存在する。 With respect to part of the process for differentiating pluripotent cells into definitive endoderm cells, the growth factors described above are those in which the growth factor induces differentiation of at least a portion of the pluripotent cells into definitive endoderm cells in culture. The cells are provided so that they are present at a concentration sufficient to facilitate. In some processes, the growth factor is at least about 5 ng/mL, at least about 10 ng/mL, at least about 25 ng/mL, at least about 50 ng/mL, at least about 75 ng/mL, at least about 100 ng in the cell culture. /ML, at least about 200 ng/mL, at least about 300 ng/mL, at least about 400 ng/mL, at least about 500 ng/mL, at least about 1000 ng/mL, at least about 2000 ng/mL, at least about 3000 ng/mL, at least about 4000 ng/mL. , At a concentration of at least about 5000 ng/mL or greater than about 5000 ng/mL.

胚体内胚葉細胞への多能性細胞の分化のためのある特定のプロセスでは、前述の成長因子はそれらが添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、成長因子を添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内にそれらを除去することができる。好ましいプロセスでは、成長因子を添加した約４日後にそれらを除去する。 In one particular process for the differentiation of pluripotent cells into definitive endoderm cells, the aforementioned growth factors are removed from the cell culture after they have been added. For example, within about 1 day, within about 2 days, within about 3 days, within about 4 days, within about 5 days, within about 6 days, within about 7 days, within about 8 days, after adding a growth factor, about They can be removed within 9 days or within about 10 days. A preferred process removes growth factors about 4 days after adding them.

本明細書に記載されるプロセスの一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞はさらなる分化の前に濃縮、単離および／または精製される。そのような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、任意の公知の方法を使用して濃縮、単離および／または精製することができる。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲＳＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭに記載される方法の１つまたは複数を使用して濃縮、単離および／または精製され、その開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。 In some embodiments of the processes described herein, definitive endoderm cells are enriched, isolated and/or purified prior to further differentiation. In such embodiments, definitive endoderm cells can be enriched, isolated and/or purified using any known method. In a preferred embodiment, definitive endoderm cells are described in US patent application Ser. No. 11/021,618, filed Dec. 23, 2004, entitled DEFINITIVE ENDODERM, and US Provisional Application No. 60/736,598, concentrated, isolated and/or purified using one or more of the methods described in the title MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. ..

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化され、比較されるとき、本明細書で生成され、記載される胚体内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２遺伝子発現を有する。 In a preferred embodiment, definitive endoderm cells produced and described herein when standardized and compared to the levels of control genes, such as housekeeping genes, have relatively high levels of CER, GSC, CXCR4, It has SOX17 and FOXA2 gene expression.

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ２）
胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するこれらの細胞のさらなる分化によって、膵臓分化の方向に特定化することができる。本明細書に記載される分化プロセスの一部では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団へのさらなる分化のために使用することができる。 Generation and composition of PDX1-negative foregut endoderm (stage 2)
Definitive endoderm cells can be localized in the direction of pancreatic differentiation by further differentiation of these cells, which produce PDX1-negative foregut endoderm cells. In some of the differentiation processes described herein, cell cultures containing definitive endoderm cells and enriched or purified cell populations are cell cultures containing PDX1-negative foregut endoderm cells and/or enriched cells. Can be used for further differentiation into different cell populations.

一般的に、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団でＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達を低減、除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）または取り除く（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）ことによって、胚体内胚葉細胞はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に分化する。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達を低減または除去することは、外部から加えられるＴＧＦβスーパーファミリー成長因子、例えばアクチビンＡを希釈するか、胚体内胚葉の細胞培養物または細胞集団から除去することによって媒介される。他の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達をブロックする化合物、例えばフォリスタチンおよび／またはノギンを胚体内胚葉細胞に供給することによって低減または除去される。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、胚体内胚葉細胞へのヒト多能性細胞の分化の後の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日または約１０日を超える間、低減または除去することができる。 In general, definitive endoderm cells are found in PDX1-negative foregut by reducing, eliminating or removing TGFβ superfamily growth factor signaling in cell cultures or cell populations of SOX17-positive definitive endoderm cells. Differentiate into germ layer cells. In some embodiments, reducing or eliminating TGFβ superfamily growth factor signaling dilutes exogenously added TGFβ superfamily growth factor, eg, activin A, or definitive endoderm cell cultures or cell populations. It is mediated by removing from. In other embodiments, TGFβ superfamily growth factor signaling is reduced or eliminated by providing definitive endoderm cells with a compound that blocks TGFβ superfamily growth factor signaling, such as follistatin and/or noggin. In some embodiments, TGFβ superfamily growth factor signaling is about 1, 2, 3, or 4 days after differentiation of human pluripotent cells into definitive endoderm cells. It can be reduced or eliminated for a day, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10 or more than about 10 days.

一部の実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤を胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給することによって、前腸内胚葉細胞への胚体内胚葉細胞の分化が増強される。そのような実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、または約１０日を超える日数の後に供給される。好ましい実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去とほぼ同じ時期に供給される。 In some embodiments, providing a definitive endoderm cell culture or cell population with an FGF family growth factor and/or a hedgehog pathway inhibitor enhances differentiation of definitive endoderm cells into foregut endoderm cells. To be done. In such an embodiment, the FGF family growth factor and/or hedgehog pathway inhibitor is from about 1 day, about 2 days, about 2 days, from about the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in definitive endoderm cell cultures. Delivered after 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 days or more than 10 days. In a preferred embodiment, the FGF family growth factor and/or hedgehog pathway inhibitor is provided at about the same time as the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in definitive endoderm cell culture.

好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給されるＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７である。しかし、他のＦＧＦファミリー成長因子またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もしくは模倣体をＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７の代わりに、またはそれに加えて供給することができることが理解される。例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、およびＦＧＦ２３までのそれらからなる群から選択されるＦＧＦファミリー成長因子を供給することができる。そのような実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もしくは模倣体は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。 In a preferred embodiment, the FGF family growth factor supplied to the definitive endoderm cell culture or cell population is FGF10 and/or FGF7. However, it is understood that other FGF family growth factors or FGF family growth factor analogs or mimetics can be provided in place of or in addition to FGF10 and/or FGF7. For example, an FGF family growth factor selected from the group consisting of FGF1, FGF2, FGF3, and up to FGF23 can be provided. In such embodiments, the FGF family growth factor and/or FGF family growth factor analog or mimetic is at least about 10 ng/ml, at least about 25 ng/ml, at least about 50 ng/ml, at least about 75 ng/ml, at least The cells of the cell culture are provided to be present at a concentration of about 100 ng/ml, at least about 200 ng/ml, at least about 300 ng/ml, at least about 400 ng/ml, at least about 500 ng/ml or at least about 1000 ng/ml. ..

他の好ましい実施形態では、ヘッジホッグ阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。しかし、他のヘッジホッグ阻害剤を使用することができることが理解される。そのような阻害剤には、ＫＡＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体、および当業者に公知であるヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。単独で、またはＦＧＦファミリー成長因子と併用されるとき、ヘッジホッグ阻害剤は少なくとも約０．０１μΜから５０μΜの濃度で供給することができる。 In another preferred embodiment, the hedgehog inhibitor is KAAD-cyclopamine. However, it is understood that other hedgehog inhibitors can be used. Such inhibitors include KAAD-cyclopamine analogs, jervin, jervine analogs, hedgehog pathway blocking antibodies, and any other inhibitor of hedgehog pathway function known to those of skill in the art, Not limited to. When used alone or in combination with FGF family growth factors, the hedgehog inhibitor can be provided at a concentration of at least about 0.01 μM to 50 μM.

胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための好ましいプロセスでは、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、胚体内胚葉へのヒト多能性細胞の実質部分の分化から約２日の間低減または除去される（例えば、下の実施例に記載される３日、４または５日分化プロトコルの後）。同じ頃に、胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団に、ノギンおよびＫＡＡＤ−シクロパミン、例えば、２ｍＭのＲＡまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢの存在下のＤＭＥＭ培地中に５０ｎｇ／ｍｌのノギンおよび０．２５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを供給する。 In a preferred process for the generation of a population of PDX1-negative foregut endoderm cells from definitive endoderm cells, TGFβ superfamily growth factor signaling is derived from the differentiation of a substantial portion of human pluripotent cells into definitive endoderm. Reduced or eliminated for 2 days (eg, after the 3 day, 4 day, or 5 day differentiation protocol described in the Examples below). At the same time, cell cultures or cell populations of definitive endoderm cells were treated with 50 ng/ml of noggin and 0.25 μM in DMEM medium in the presence of noggin and KAAD-cyclopamine, such as 2 mM RA or 3 nM TTNPB. Supply KAAD-cyclopamine.

一部の実施形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドを含有する培地と細胞を接触させるか、さもなければそれを細胞に供給することによって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞にさらに分化させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約１ｎＭから５０μＭの濃度で存在するように、レチノイドを細胞培養物の細胞に供給する。そのような実施形態では、レチノイドは、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、または約１０日を超える日数の後に細胞に供給される。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約２〜３日後に、約０．０５μΜのＲＡから約２μΜのＲＡがＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給される。 In some embodiments, PDX1-negative foregut endoderm cells are contacted with a medium containing a retinoid, such as retinoic acid (RA), or otherwise provided to the cells, whereby PDX1-positive It can be further differentiated into intestinal endoderm cells. In some embodiments, the retinoid is provided to the cells of the cell culture such that it is present at a concentration of at least about 1 nM to 50 μM. In such embodiments, the retinoid is from about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days from reducing or eliminating TGFβ superfamily growth factor signaling in definitive endoderm cell cultures. The cells are fed after about 6, 7, about 8, about 9, about 10 days, or after more than about 10 days. In a preferred embodiment, about 2-3 days after reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling, about 0.05 μM RA to about 2 μM RA are supplied to PDX1-negative foregut endoderm cell cultures.

本明細書に記載される分化プロセスの一部では、前述の分化因子は添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去することができる。 In some of the differentiation processes described herein, the differentiation factors described above are added and then removed from the cell culture. For example, the above-mentioned differentiation factor is added for about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days or about 10 days after addition. Can be removed within a day.

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化されるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａ遺伝子発現を有する。特に、ＨＮＦ４Ａ遺伝子発現レベルは、例えば胚体内胚葉培養物からのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達（例えば、アクチビン）の除去まで実質的に増加しない。 In a preferred embodiment, PDX1-negative foregut endoderm cells produced and described herein when standardized to levels of control genes, such as housekeeping genes, have relatively high levels of SOX17, FOXA1, HNF1B and It has HNF4A gene expression. In particular, HNF4A gene expression levels do not increase substantially until, for example, removal of TGFβ superfamily growth factor signaling (eg activin) from definitive endoderm cultures.

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ３）
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはそれらの等価物を生成するこれらの細胞のさらなる分化によって、膵臓分化の方向にさらに特定化することができる。本明細書に記載される分化プロセスの一部では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団へのさらなる分化のために使用することができる。 Generation and composition of PDX1-positive foregut endoderm (stage 3)
PDX1-negative foregut endoderm cells can be further specified in the direction of pancreatic differentiation by further differentiation of PDX1-positive foregut endoderm cells or these cells that produce PDX1-positive pancreatic endoderm or their equivalents. .. In some of the differentiation processes described herein, cell cultures containing definitive endoderm cells and enriched or purified cell populations are cell cultures containing PDX1-positive foregut endoderm cells and/or enriched cells. Can be used for further differentiation into different cell populations.

一般的に、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドをＳＯＸ１７陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給することによって、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化させる。分化プロセスの一部では、培養物中のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞には、ＲＡの添加の前かそれとほぼ同じ時期に線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーも供給される。好ましい線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ−７である。別の好ましいプロセスでは、線維芽細胞成長因子は、任意の線維芽細胞成長因子、または線維芽細胞成長因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相互作用するリガンドを含む。さらに好ましいプロセスでは、ＦＧＦファミリー成長因子は、ヘッジホッグ経路阻害剤と併用される。好ましいヘッジホッグ経路阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。特に好ましい分化プロセスでは、ＲＡ存在下でのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に、ＦＧＦ−１０および／またはＫＡＡＤ−シクロパミンが供給される。ある特定のプロセスでは、ＲＡ存在下でＢＭＰ４がＦＧＦ１０および／またはＫＡＡＤ−シクロパミンとともに含まれてもよい。一部のプロセスでは、レチノイドは、ΤＧＦβスーパーファミリー成長因子のメンバーおよび／またはＣｏｎｎａｕｇｈｔＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ培地（ＣＲＭＬ培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と併用される。 Generally, PDX1-negative foregut endoderm cells are differentiated into PDX1-positive foregut endoderm cells by supplying a retinoid such as retinoic acid (RA) to a cell culture containing SOX17-positive foregut endoderm cells. In part of the differentiation process, PDX1-negative foregut endoderm cells in culture are also fed with members of the fibroblast growth factor family before or at about the same time as the addition of RA. A preferred fibroblast growth factor is FGF-7. In another preferred process, the fibroblast growth factor comprises any fibroblast growth factor, or ligand that stimulates or otherwise interacts with the fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2(IIIb)). Including. In a more preferred process, the FGF family growth factor is combined with a hedgehog pathway inhibitor. A preferred hedgehog pathway inhibitor is KAAD-cyclopamine. In a particularly preferred differentiation process, cell cultures containing PDX1-negative definitive endoderm cells in the presence of RA are supplied with FGF-10 and/or KAAD-cyclopamine. In certain processes, BMP4 may be included with FGF10 and/or KAAD-cyclopamine in the presence of RA. In some processes, retinoids are combined with members of the TGFβ superfamily growth factor and/or Connaught Medical Research Labs medium (CRML medium) (Invitrogen, Carlsbad, CA).

本明細書に記載される分化プロセスの実施形態の一部に関して、レチノイドおよび／または前述の分化因子の組合せは、これらの因子がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物または細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。 For some of the embodiments of the differentiation process described herein, a combination of retinoids and/or the aforementioned differentiation factors is a combination of these factors into PDX1-negative foregut endoderm cell culture into PDX1-positive foregut endoderm cells. The cells are provided so that they are present in the cell culture or cell population at a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the object or cell population.

他のプロセスでは、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、および５０μΜまでの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。本発明の一部の実施形態では、線維芽細胞成長因子または線維芽細胞成長因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相互作用するリガンドが、単独で、またはヘッジホッグ経路阻害剤と組み合わせて供給される。 In other processes, FGF-10 is present at a concentration of at least about 1 ng/ml, at least about 2 ng/ml, at least about 5 ng/ml, at least about 10 ng/ml, at least about 25 ng/ml, and up to 50 μM. , Supplied to cells in cell culture. In some embodiments of the invention, a ligand that stimulates or otherwise interacts with fibroblast growth factor or fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2(IIIb)), alone or in a hedged Supplied in combination with a Hog pathway inhibitor.

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または濃縮された細胞集団に、ＦＧＦ−７、ＫＡＡＤ−シクロパミンおよびレチノイン酸（ＲＡ）、例えば２μΜのＲＡ存在下のＣＭＲＬ培地中の２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−７および０．２μΜのＫＡＡＤ−シクロパミンが供給される。 In a preferred process for the generation of a population of PDX1-positive foregut endoderm cells from PDX1-negative foregut endoderm cells, FGF-7, in a cell culture or enriched cell population of PDX1-negative foregut endoderm cells, KAAD-cyclopamine and retinoic acid (RA), for example 25 ng/ml FGF-7 and 0.2 μM KAAD-cyclopamine in CMRL medium in the presence of 2 μM RA.

本明細書に記載される一部のプロセスでは、ＴＧＦβシグナル伝達因子、例えばアクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１等は、レチノイドおよび／または線維芽細胞成長因子およびヘッジホッグ阻害剤と一緒に細胞培養物に供給される。例えばそのようなプロセスでは、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−１１は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に供給される。 In some processes described herein, TGFβ signaling factors, such as activin A and/or activin B, GDF-8, GDF-11, etc., retinoid and/or fibroblast growth factor and hedgehog inhibition. Delivered to the cell culture along with the agent. For example, in such a process activin A and/or activin B and/or GDF-8 and/or GDF-11 is at least about 5 ng/ml, at least about 10 ng/ml, at least about 25 ng/ml, at least about 50 ng/ml. ml, at least about 75 ng/ml, at least about 100 ng/ml, at least about 200 ng/ml, at least about 300 ng/ml, at least about 400 ng/ml, at least about 500 ng/ml or at least about 1000 ng/ml in cell culture. Supplied.

一部のプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性細胞からの分化の開始から約１日、２日、３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日後、または約１０日を超える日数の後に、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供給される。好ましいプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性幹細胞からの分化の開始から約３日、または４日、または５日後にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供給される。 In some processes, the differentiation factor and/or CRML medium is about 1 day, 2 days, 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days after initiation of differentiation from pluripotent cells. , About 8, 9, about 10, or more than about 10 days later, PDX1-negative foregut endoderm cells are supplied. In a preferred process, the differentiation factor and/or CRML medium is supplied to PDX1-negative foregut endoderm cells at about 3, 4, or 5 days after the initiation of differentiation from pluripotent stem cells.

本明細書に記載されるある特定のプロセスでは、前述の分化因子は添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去することができる。 In certain processes described herein, the aforementioned differentiation factors are added and then removed from the cell culture. For example, the above-mentioned differentiation factor is added for about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days or about 10 days after addition. Can be removed within a day.

これらおよび他の方法は、２００５年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＲＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭに詳細に記載され、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭに見出すことができ、その開示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。 These and other methods are described in detail in U.S. Provisional Application No. 60/730,917, filed October 27, 2005, entitled PDX1-EXPRESSING DORTAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM, which describes PDX1-positive foregut endoderm cells. Can be found in US patent application Ser. No. 11/115,868, filed Apr. 26, 2005, titled PDX1 EXPRESSING ENDORDER, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference.

好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化され、比較されるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣ遺伝子発現を有する。 In a preferred embodiment, PDX1-positive foregut endoderm cells produced and described herein when standardized and compared to the levels of control genes, such as housekeeping genes, have relatively high levels of PDX1, NKX6. .1, PTF1A, CPA and cMYC gene expression.

ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の生成および組成物（ステージ４）
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または「膵臓上皮」またはより一般に膵臓前駆体の生成および組成物は、２００８年７月２日に出願の米国特許出願第１２／１６７，２２７号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳに詳細に記載され、それは米国特許第７，５３４，６０８号として２００９年５月１９日に公布された。第１２／１６７，２２７号出願は、２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳの継続出願であり、それは２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願である。これらの出願の各々の開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。 Generation and composition of PDX1-positive pancreatic endoderm (stage 4)
The production and composition of PDX1-positive pancreatic endoderm or “pancreatic epithelium” or more generally pancreatic precursors is described in US patent application Ser. Described in detail, it was promulgated May 19, 2009 as US Pat. No. 7,534,608. No. 12/167,227 application is a continuation application of US patent application Ser. No. 11/773,944, filed July 5, 2007, entitled METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, which was filed on March 2, 2007. It is a partial continuation application of US patent application Ser. No. 11/681,687 of the application, titled ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION. The disclosure of each of these applications is fully incorporated herein by reference.

第１２／１６７，２２７号出願の実施例２２は、本明細書ステージ１〜４に記載される細胞培養条件の様々な改変を詳細に記載する。一般に、ステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉型の細胞は、１体積／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭに加えてノギン、または別のＢＭＰ４特異的阻害剤を含有する培地で、約１〜３日、または約１〜４日、または１〜５日、または約１〜６日の間培養される。ステージ４の終わりに、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉が生成され、その細胞はＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１ならびにＰＴＦ１Ａを少なくとも共発現する。細胞培養物は、ステージ５の単一もしくは複数ホルモン性内分泌細胞、またはステージ１の胚体内胚葉細胞、またはステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、またはステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の指標となる細胞を認め得る程には発現しない。 Example 22 of the 12/167,227 application details various modifications of the cell culture conditions described herein in stages 1-4. Generally, stage 3 PDX1-positive foregut endoderm-type cells are cultured in medium containing DMEM in 1 volume/volume% B27 supplement plus Noggin, or another BMP4-specific inhibitor, at about 1-3%. Cultured for 1 day, or about 1 to 4 days, or 1 to 5 days, or about 1 to 6 days. At the end of stage 4, PDX1-positive pancreatic endoderm is produced, the cells of which at least co-express PDX1 and Nkx6.1 and PTF1A. The cell cultures may be of stage 5 single or multiple hormonal endocrine cells, or stage 1 definitive endoderm cells, or stage 2 PDX1-negative foregut endoderm cells, or stage 3 PDX1-positive foregut endoderm cells. It does not appreciably express index cells.

内分泌先駆細胞の生成および組成物（ステージ５）
本明細書に記載される一部の実施形態は、多能性細胞から開始して内分泌先駆細胞を生成する方法に関する。上記の通り、内分泌先駆細胞は、最初に多能性細胞を分化させて胚体内胚葉細胞を生成し、次に胚体内胚葉細胞をさらに分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成することによって生成することができる。そのような実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、多分化能内分泌先駆細胞にさらに分化し、それはヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することが可能である。 Generation and composition of endocrine precursor cells (stage 5)
Some embodiments described herein relate to methods of generating endocrine precursor cells starting from pluripotent cells. As described above, endocrine precursor cells are first differentiated into pluripotent cells to produce definitive endoderm cells and then further differentiated into definitive endoderm cells to produce PDX1-positive foregut endoderm cells. Can be generated. In such embodiments, PDX1-positive foregut endoderm cells are further differentiated into pluripotent endocrine precursor cells, which are capable of differentiating into human pancreatic islet hormone-expressing cells.

一実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、内分泌先駆細胞の生成に十分な時間、レチノイン酸などのレチノイドの存在下でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のインキュベーションを続けることによって内分泌先駆細胞に分化する。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞の生成に十分な時間は、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の後の約１時間から約１０日間である。一部の実施形態では、レチノイドは細胞培養物中に、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の後の約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、または約１０日を超える日数維持される。 In one embodiment, PDX1-positive foregut endoderm cells become endocrine precursor cells by continuing incubation of PDX1-positive foregut endoderm cells in the presence of a retinoid such as retinoic acid for a time sufficient to generate endocrine precursor cells. Differentiate. In some embodiments, the time sufficient to generate endocrine progenitor cells is from about 1 hour to about 10 days after expression of the PDX1 marker on a portion of the cells in cell culture. In some embodiments, the retinoid is in the cell culture about 1 hour, about 2 hours, about 4 hours, about 6 hours, about 6 hours after the expression of the PDX1 marker in a portion of the cells in the cell culture. 8 hours, 10 hours, 12 hours, 16 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days , About 10 days, or more than about 10 days.

本明細書に記載される一部のプロセスでは、内分泌先駆細胞に細胞培養物または細胞集団中のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分化させるために使用されるレチノイドの濃度は、約１ｎＭから約１００μΜである。 In some processes described herein, the concentration of retinoid used to differentiate PDX1-positive foregut endoderm cells in cell cultures or cell populations into endocrine precursor cells is from about 1 nM to about 100 μΜ. Is.

一部の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団へのガンマセクレターゼ阻害剤の供給によって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞から膵臓内分泌先駆細胞への分化が媒介される。好ましい一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。 In some preferred embodiments, supplying a cell culture or cell population containing human PDX1-positive foregut endoderm cells with a gamma secretase inhibitor results in the differentiation of PDX1-positive foregut endoderm cells into pancreatic endocrine precursor cells. Mediated. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化プロセスの開始時に、例えば多能性ステージに供給され、膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存する。さらに他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化の開始の後に、しかしＰＤＸ１陽性前腸内胚葉ステージへの分化の前に加えられる。好ましい実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＰＤＸ１陽性内胚葉への胚体内胚葉の変換を促進する分化因子の供給と同じ頃に、細胞培養物または細胞集団に供給される。他の好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の細胞の実質的な部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後に、ガンマセクレターゼ阻害剤は細胞培養物または細胞集団に供給される。 In other embodiments, the gamma secretase inhibitor is provided at the beginning of the differentiation process, eg, at the pluripotent stage, and remains in cell culture throughout differentiation to islet hormone-expressing cells. In yet another embodiment, the gamma secretase inhibitor is added after initiation of differentiation but prior to differentiation to the PDX1-positive foregut endoderm stage. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is provided to the cell culture or cell population at about the same time as the supply of the differentiation factor that promotes conversion of definitive endoderm into PDX1-positive endoderm. In another preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is provided to the cell culture or cell population after a substantial portion of the cells in the cell culture or cell population have differentiated into PDX1-positive foregut endoderm cells.

内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化に関する一部の実施形態に関して、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．０１μΜから約１０００μΜの濃度で細胞培養物または細胞集団に存在する。好ましい実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．１μΜから約１００μΜの濃度で細胞培養物または細胞集団に存在する。 For some embodiments relating to the differentiation of PDX1-positive foregut endoderm cells into endocrine precursor cells, the gamma secretase inhibitor is in a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of PDX1-positive cells into endocrine precursor cells. To the cells as present in the cell culture or population of cells. In some embodiments, the gamma secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration of about 0.01 μM to about 1000 μM. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration of about 0.1 μM to about 100 μM.

本明細書に記載される内分泌先駆細胞を生成するプロセスのある特定の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給された１つまたは複数の分化因子が細胞培養物から除去された後に供給される。例えば、前に供給される１つまたは複数の分化因子は、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加より約１日から１０日前、または約１０日以上前に除去することができる。他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給されたか、ガンマセクレターゼ阻害剤と同じ頃に供給された１つまたは複数の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団に供給される。好ましい実施形態では、前に供給されたかガンマセクレターゼ阻害剤と同じ頃に供給された分化因子としては、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。 In certain embodiments of the process of producing endocrine progenitor cells described herein, the gamma secretase inhibitor is provided after the previously supplied one or more differentiation factors have been removed from the cell culture. To be done. For example, one or more of the previously supplied differentiation factors can be removed about 1 to 10 days, or about 10 days or more prior to the addition of the gamma secretase inhibitor. In other embodiments, the gamma secretase inhibitor is supplied to a cell culture or population of cells that comprises one or more differentiation factors previously supplied or about the same time as the gamma secretase inhibitor. In a preferred embodiment, the differentiation factors previously supplied or about the same time as the gamma secretase inhibitor include FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A, activin B, GDF-8, GDF-11, BMP4 and And/or RA, but is not limited thereto.

本明細書に記載の本発明の一部の実施形態では、分化する細胞培養物または細胞集団に、ガンマセレクターゼ阻害剤とほぼ同じ時間にエキセンディン４をもたらす。ある特定の実施形態では、エキセンディン４を、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬから、１０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で存在するようにもたらす。 In some embodiments of the invention described herein, the differentiating cell culture or cell population is provided with exendin 4 at about the same time as the gamma-selectase inhibitor. In certain embodiments, exendin 4 is provided at a concentration of at least about 0.1 ng/mL up to 1000 ng/mL in the cell culture or cell population.

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの内分泌先駆細胞の生成のための好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団は、３μΜのＤＡＰＴおよび４０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン４が供給される。特に好ましい実施形態では、細胞はＣＭＲＬで分化する。別の特に好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの内分泌先駆細胞の生成のために、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団には、２μΜのＲＡの存在下で３μΜのＤＡＰＴおよび４０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン４が供給される。 In a preferred process for the production of endocrine precursor cells from PDX1-positive foregut endoderm cells, a cell culture or population of PDX1-positive foregut endoderm cells is supplied with 3 μΜ DAPT and 40 ng/ml exendin-4. To be done. In a particularly preferred embodiment, the cells differentiate in CMRL. In another particularly preferred process, a cell culture or population of PDX1-positive foregut endoderm cells is produced in the presence of 3 μΜ in the presence of 2 μΜ RA for the production of endocrine precursor cells from PDX1-positive foregut endoderm cells. DAPT and 40 ng/ml exendin 4 are provided.

ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌先駆細胞において分化の状態に応じて様々な異なるレベルにわたって誘導されることが理解されよう。そのように、本明細書に記載の一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍である。他の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約４倍、少なくとも約６倍〜１０，０００倍である。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性細胞様ｉＰＳ細胞およびｈＥＳ細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現よりもはるかに高い。 It will be appreciated that expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 markers is induced in endocrine progenitor cells over a variety of different levels depending on the state of differentiation. As such, in some embodiments described herein, expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 marker in an endocrine precursor cell or cell population is reduced to a non-endocrine precursor cell or cell population, eg, pluripotent. NGN3, NKX2.2 in sex stem cells, definitive endoderm cells, PDX1-positive foregut endoderm cells, immature pancreatic islet hormone-expressing cells, mature pancreatic islet hormone-expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesoderm cells and/or ectoderm cells And/or at least about 2-fold to at least about 10,000-fold the expression of the PAX4 marker. In other embodiments, expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 marker in an endocrine precursor cell or population of cells is determined by a non-endocrine precursor cell or population of cells, eg, pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, PDX1-positive At least about 4 expression of NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 markers in intestinal endoderm cells, immature pancreatic islet hormone expressing cells, mature pancreatic islet hormone expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesoderm cells and/or ectoderm cells. Fold, at least about 6 to 10,000 times. In some embodiments, expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 marker in an endocrine precursor cell or population of cells is characterized by the non-endocrine precursor cell or population of cells, eg, pluripotent cell-like iPS cells and hES cells, embryos. NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 in endoderm cells, PDX1-positive foregut endoderm cells, immature pancreatic islet hormone-expressing cells, mature pancreatic islet hormone-expressing cells, extraembryonic endoderm cells, mesoderm cells and/or ectoderm cells Much higher than marker expression.

本発明の別の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜９８％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＧＮ３の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。 Another embodiment of the invention is a composition such as a cell culture or cell population comprising human cells such as human endocrine precursor cells, wherein expression of the NGN3 marker in at least about 2% of the human cells is AFP, SOX7, Compositions greater than the expression of SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and/or PAX6 markers. In other embodiments, expression of the NGN3 marker in at least about 5% to 98% of human cells results in AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and/or PAX6. Greater than marker expression. In some embodiments, the expression of NGN3 in a cell culture or cell population comprises AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and/or PAX6 markers. The percentage of human cells greater than expression is calculated without consideration of feeder cells.

本発明の一部の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％超までにおいてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関することが理解されよう。一部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜ヒト細胞の９８％においてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。 Some embodiments of the invention are compositions such as cell cultures or cell populations comprising human endocrine precursor cells, wherein NKX2.2 and/or at least about 2% to greater than about 98% of human cells. Alternatively, it will be appreciated that it relates to compositions in which expression of PAX4 is greater than expression of the AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and/or PAX6 markers. In some embodiments, expression of NKX2.2 and/or PAX4 in at least about 5% of human cells to 98% of human cells results in expression of AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG. , SST, GHRL, and/or PAX6 marker expression. In some embodiments, expression of NKX2.2 and/or PAX4 in the cell culture or cell population is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, The percentage of human cells that is greater than and/or the expression of the PAX6 marker is calculated without consideration of feeder cells.

本発明の追加の実施形態は、ｉｎｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞、例えばｉｎｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む組成物、例えば細胞培養物または細胞集団に関し、ｉｎｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２％では、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ６マーカーの発現より大きい。他の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％からｉｎｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の９８％で、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ６マーカーの発現より大きい。 Additional embodiments of the invention relate to compositions, such as cell cultures or cell populations, that include mammalian cells that have been differentiated from definitive endoderm in vitro, such as human cells that have been differentiated from definitive endoderm in vitro. Expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 markers was detected in at least about 2% of the cells differentiated from definitive endoderm in S. , GHRL and/or PAX6 marker expression greater than. In another embodiment, expression of the NGN3, NKX2.2 and/or PAX4 marker is present in at least about 5% of cells differentiated from definitive endoderm in vitro to 98% of cells differentiated from definitive endoderm in vitro. , AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and/or PAX6 markers.

本明細書に記載のプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まない、内分泌先駆細胞を含む組成物を生成することができる。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する内分泌先駆細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する細胞培養物の内分泌先駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。 The processes described herein can be used to produce compositions containing endocrine precursor cells that are substantially free of other cell types. In some embodiments of the invention, the endocrine precursor cell population or cell culture produced by the methods described herein is substantially free of cells that significantly express the AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and/or NFM markers. Not included. In some embodiments, the endocrine precursor cell population of the cell culture produced by the methods described herein is AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL. , And/or substantially free of cells that significantly express the PAX6 marker.

本発明の一実施形態では、マーカーの発現に基づく内分泌先駆細胞の記述は、高ＮＧＮ３、高ＮＫＸ２．２、高ＰＡＸ４、低ＡＦＰ、低ＳＯＸ７、低ＳＯＸ１、低ＺＩＣ１、低ＮＦＭ、低ＭＡＦＡ；低ＳＹＰ；低ＣＨＧＡ；低ＩＮＳ、低ＧＣＧ、低ＳＳＴ、低ＧＨＲＬおよび／または低ＰＡＸ６である。 In one embodiment of the invention, the description of endocrine progenitor cells based on the expression of markers includes high NGN3, high NKX2.2, high PAX4, low AFP, low SOX7, low SOX1, low ZIC1, low NFM, low MAFA; low MAFA; SYP; low CHGA; low INS, low GCG, low SST, low GHRL and/or low PAX6.

未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成
本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞から開始して未熟な膵島ホルモン発現細胞を生成する方法に関する。上記の通り、未熟な膵島ホルモン発現細胞は、最初に多能性細胞を分化させて胚体内胚葉細胞を生成し、胚体内胚葉細胞を分化させて前腸内胚葉細胞を生成し、前腸内胚葉を分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成し、次にＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞をさらに分化させて内分泌先駆細胞を生成することによって生成することができる。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞を未熟な膵島ホルモン発現細胞にさらに分化させることによって、そのプロセスを継続する。 Generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells The embodiments described herein relate to methods of generating immature pancreatic islet hormone-expressing cells starting from pluripotent cells. As described above, immature pancreatic islet hormone-expressing cells first differentiate pluripotent cells to produce definitive endoderm cells and differentiate definitive endoderm cells to produce foregut endoderm cells, It can be generated by differentiating the germ layer to produce PDX1-positive foregut endoderm cells and then further differentiating the PDX1-positive foregut endoderm cells to produce endocrine precursor cells. In some embodiments, the process is continued by further differentiating the endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells.

本発明の一部の実施形態では、細胞がＮＧＮ３を実質的に発現することを停止し、ＰＡＸ６の発現を開始するのに十分な時間、および細胞が少なくとも１つの膵島細胞ホルモンを発現する能力を有するように、ガンマセクレターゼ阻害剤との内分泌先駆細胞の培養物のインキュベーションを続けることによって、内分泌先駆細胞から未熟な膵島ホルモン発現細胞への分化が進行する。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌先駆細胞の誘導の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日後、または約１０日以上後に除去される。好ましい一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。 In some embodiments of the invention, the cells have sufficient time to cease to substantially express NGN3 and initiate expression of PAX6, and the ability of the cells to express at least one islet cell hormone. As would be expected, continued incubation of the culture of endocrine precursor cells with a gamma secretase inhibitor promotes differentiation of endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. In some embodiments, the gamma secretase inhibitor is about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days of induction of endocrine precursor cells. , After about 9, about 10 days, or after about 10 days or more. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのある特定のプロセスは、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団への、ニコチンアミド、エキセンディン４、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）からなる群から選択される１つまたは複数の因子の供給によって媒介される。一部の実施形態では、上記の因子の全４つは、一緒に供給される。一部の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は、内分泌先駆細胞の分化の前に細胞培養物に供給され、内分泌先駆細胞への細胞培養物中の細胞の少なくとも一部の分化の間、細胞培養物に残存する。他の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は内分泌先駆細胞への細胞の実質的な部分の分化時かその頃に細胞培養物に供給され、細胞の少なくとも実質的な部分が未熟な膵島ホルモン発現細胞に分化するまで細胞培養物に残存する。本発明の一部の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は、分化プロセスの開始時に、例えば多能性細胞ステージに供給され、未熟な膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存する。 Certain processes for the generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells disclosed herein include the addition of nicotinamide, exendin 4, hepatocyte growth factor to cell cultures or cell populations containing human endocrine precursor cells. (HGF), insulin-like growth factor 1 (IGF1), is mediated by the supply of one or more factors selected from the group consisting of: In some embodiments, all four of the above factors are supplied together. In some embodiments, one or more of the above factors are provided to the cell culture prior to differentiation of the endocrine precursor cells to differentiate at least some of the cells in the cell culture into endocrine precursor cells. While remaining in the cell culture. In another embodiment, one or more of the above factors are provided to the cell culture at or about the time that a substantial portion of the cell is differentiated into endocrine precursor cells, wherein at least a substantial portion of the cell is immature islet. It remains in the cell culture until it differentiates into hormone-expressing cells. In some embodiments of the invention, one or more of the above factors are provided at the beginning of the differentiation process, eg, at the pluripotent cell stage, throughout cell differentiation during differentiation into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. It remains in things.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための一部のプロセスでは、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチン酸が、未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ニコチンアミドは、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭから１０００ｍＭの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In some processes for the generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells disclosed herein, nicotinamide, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or nicotinic acid are endocrine precursors to immature pancreatic islet hormone-expressing cells. The cells are provided to be present in the cell culture or cell population at a concentration sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the cells. In some embodiments, nicotinamide is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 0.1 mM, at least about 0.5 mM to 1000 mM.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための他のプロセスでは、エキセンディン４が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、エキセンディン４は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In another process for the generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells disclosed herein, exendin-4 is sufficient to promote the differentiation of at least a portion of endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. Cells are provided such that they are present in the cell culture or cell population at various concentrations. In some embodiments, exendin 4 is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng/ml, at least about 5 ng/ml to 1000 ng/ml.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセスでは、ＨＧＦが未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ＨＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In yet another process for the generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells disclosed herein, HGF is sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. The cells are provided as present in the cell culture or cell population at a concentration. In some embodiments, HGF is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng/ml, at least about 5 ng/ml to 1000 ng/ml.

本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセスでは、ＩＧＦ１が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ＩＧＦ１は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。 In yet another process for the generation of immature pancreatic islet hormone-expressing cells disclosed herein, IGF1 is sufficient to promote the differentiation of at least a portion of the endocrine precursor cells into immature pancreatic islet hormone-expressing cells. The cells are provided so that they are present in the cell culture or cell population at a concentration. In some embodiments, IGF1 is present in the cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng/ml to 1000 ng/ml.

本明細書に記載の未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのプロセスのある特定の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、前に供給された１種または複数種の分化因子を細胞培養物から除去した後に供給する。他の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前に供給された、またはほぼ同時に供給された１種または複数種の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団に供給する。好ましい実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前に供給される、またはほぼ同時に供給される分化因子としては、これだけに限定されないが、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられる。 In certain embodiments of the process for producing immature pancreatic islet hormone-expressing cells described herein, one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF and IGF1 have been previously supplied. The one or more differentiation factors are removed from the cell culture and then supplied. In another embodiment, one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF and IGF1 is provided prior to one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF and IGF1. Cell cultures or cell populations containing one or more differentiating factors supplied at or about the same time. In a preferred embodiment, the differentiation factors provided prior to, or at about the same time as, one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF and IGF1 include, but are not limited to, DAPT, FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A, activin B, BMP4 and/or RA.

本発明の別の実施形態は、ヒト未成熟膵島ホルモン発現細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ヒト細胞の少なくとも約１０％〜ヒト細胞の９５％においてまたはヒト細胞の少なくとも約９８％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。 Another embodiment of the invention is a composition such as a cell culture or cell population comprising human cells such as human immature pancreatic islet hormone-expressing cells, wherein MAFB, SYP, CHGA, in at least about 2% of the human cells. The expression of NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS, GCG, SST, PP, and/or C-peptide markers is NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, Compositions with greater expression of SOX1, ZIC1 and/or NFM markers. In other embodiments, MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, in at least about 5% of human cells, in at least about 10% of human cells to 95% of human cells, or in at least about 98% of human cells. Expression of PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS, GCG, SST, PP, and/or C-peptide markers is NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and/or Greater than the expression of the NFM marker.

一部の実施形態では、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰおよび／またはＣペプチドの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現より大きい場合、細胞培養物または集団中のヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞に関係なく計算される。 In some embodiments, the expression of MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, PP and/or C peptides is NGN3, MAFA, MOX1. , CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and/or NFM markers are expressed, the percentage of human cells in the cell culture or population is calculated regardless of feeder cells.

本発明のある特定の実施形態では、未成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物および／または細胞集団は、グレリン、インスリン、ソマトスタチンおよび／またはグルカゴンから選択される、１種または複数種の分泌されたホルモンを含む培地も含む。他の実施形態では、培地は、Ｃ−ペプチドを含む。好ましい実施形態では、培地中の１種または複数種の分泌されたホルモンまたはＣ−ペプチドの濃度は、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１ｐｍｏｌのグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドから、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１０００ピコモル（ｐｍｏｌ）のグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドまでの範囲である。 In certain embodiments of the invention, the cell culture and/or cell population comprising immature pancreatic islet hormone-expressing cells is secreted from one or more secretory species selected from ghrelin, insulin, somatostatin and/or glucagon. It also includes a medium containing different hormones. In other embodiments, the medium comprises C-peptide. In a preferred embodiment, the concentration of one or more secreted hormones or C-peptides in the medium is from at least about 1 pmol ghrelin, insulin, somatostatin, glucagon or C-peptide per μg intracellular DNA to 1 μg intracellular DNA. Ranging up to at least about 1000 picomoles (pmol) of ghrelin, insulin, somatostatin, glucagon or C-peptide per.

インスリンをｉｎｖｉｖｏで生成させる方法
一部の実施形態では、上記のｉｎｖｉｔｒｏで導出された膵臓前駆細胞またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉型細胞またはその等価物を哺乳動物対象に移植する。これらの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ」に詳しく記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる。好ましい実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。特に好ましい対象は、生理的に高い血中グルコース濃度に応答して十分なレベルのインスリンを生成する対象の能力が限定される状態を有すると同定された対象である。任意の特定の哺乳動物種についての生理的に高い血中グルコースレベルを構成する血中グルコースレベルの範囲は、当業者には容易に決定することができる。認識される疾患または状態をもたらすいかなる持続的な血中グルコースレベルも、生理的に高い血中グルコースレベルとみなされる。 Methods of Producing In Vivo In Vivo In some embodiments, the in vitro derived pancreatic progenitor cells or PDX-1 positive pancreatic endoderm cells or equivalents thereof are transplanted into a mammalian subject. These methods are described in detail in International Application No. PCT/US2007/015536, entitled "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES", which is fully incorporated herein by reference. In a preferred embodiment, the mammalian subject is a human subject. Particularly preferred subjects are those who have been identified as having conditions with a limited ability of the subject to produce sufficient levels of insulin in response to physiologically high blood glucose concentrations. The range of blood glucose levels that make up physiologically high blood glucose levels for any particular mammalian species can be readily determined by one of ordinary skill in the art. Any persistent blood glucose level that results in a recognized disease or condition is considered a physiologically high blood glucose level.

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎｖｉｔｒｏ多能性幹細胞またはその後代、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは膵臓前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌先駆体などの内分泌先駆体などの多分化能細胞、またはインスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｉｓｔａｔｉｎ）分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞から導出されるｉｎｖｉｖｏインスリン分泌細胞に関する。上記の最終分化した細胞または多分化能細胞のいずれも、宿主、または哺乳動物に移植し、宿主血中グルコースレベルに応答してインスリンを分泌する細胞などの生理的に機能的なホルモン分泌細胞に成熟させることができる。好ましい実施形態では、細胞はｉｎｖｉｖｏで奇形腫を形成せず、そのように形成された場合には、移植の領域に局在したままであり、容易に切除または除去することができる。特に好ましい実施形態では、細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける分化プロセスの間、または哺乳動物にｉｎｖｉｖｏで移植された際、またはｉｎｖｉｖｏで機能的な島に成熟および発達する際に、いかなる核型異常も含有しない。 A further embodiment of the invention is endocrine such as in vitro pluripotent stem cells or progeny thereof, such as PDX-1 positive foregut endoderm cells, PDX-1 positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cells, NGN3 positive endocrine precursors. Derived from pluripotent cells such as precursors, or functionally differentiated hormone-secreting cells such as insulin-secreting cells, glucagon-secreting cells, somatostatin-secreting cells, ghrelin-secreting cells, or pancreatic polypeptide-secreting cells In vivo insulin-secreting cells. Any of the above-mentioned terminally differentiated cells or pluripotent cells is transplanted into a host or a mammal, and becomes a physiologically functional hormone-secreting cell such as a cell that secretes insulin in response to the glucose level in the host blood. Can be matured. In a preferred embodiment, the cells do not form teratomas in vivo and, if so formed, remain localized in the area of transplantation and can be easily excised or removed. In a particularly preferred embodiment, the cells are free of any karyotypic abnormalities during the differentiation process in vitro, or when transplanted into a mammal in vivo, or when they mature and develop into functional islets in vivo. Does not contain.

さらに、本明細書に記載の実施形態は、工学的に操作されたまたは遺伝子組換えされた、多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性細胞から本明細書において提供される説明に基づいて導出された多分化能細胞または分化した細胞に関するが、ｉＰＳ細胞では、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ由来細胞と同様の生理機能および遺伝子マーカーの発現プロファイルが実証されるので、ｉＰＳ細胞はｉｎｖｉｖｏにおける同様の生理的特性を有することが予測される。 Further, the embodiments described herein are based on the description provided herein from engineered or genetically modified pluripotent cells, such as human iPS cells. IPS cells have similar physiological functions and expression profiles of gene markers as hES cells and hES-derived cells, and thus iPS cells are similar to those in vivo. It is expected to have physiological properties.

膵臓前駆体を封入する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載の多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞組成物を生物学的および／または非生物学的機械デバイスに封入することができ、封入されたデバイスにより、細胞組成物が宿主から分離および／または隔離される。 Methods for Encapsulating Pancreatic Progenitors In some embodiments, encapsulating pluripotent cells, pluripotent cells and differentiated cell compositions described herein in biological and/or non-biological mechanical devices. The encapsulated device may separate and/or isolate the cellular composition from the host.

封入の方法は、２００８年１１月１４日に出願の米国特許出願第６１／１１４，８５７号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ、および２００８年１２月１２日に出願の米国特許出願第６１／１２１，０８６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳに詳細に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれ、半透膜、例えばＴｈｅｒａｃｙｔｅ（商標）またはＧｏｒｅデバイスを使用する膵臓内胚葉細胞の封入を記載する。 Encapsulation methods are described in US Patent Application No. 61/114,857, filed November 14, 2008, entitled ENCAPSURATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS, and US Patent Application No. 61, filed December 12, 2008. /121,086, entitled ENCAPSURATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS, which are fully incorporated herein by reference, and use pancreatic endoderm cells, such as semipermeable membranes, for example, Theracyte™ or Gore devices. The inclusion of is described.

一実施形態では、ｈＥＳ由来の細胞は、生体適合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して封入される。ＰＥＧをベースとした封入は、米国特許第７，４２７，４１５号、表題ＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮＯＦＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＭＡＴＥＲＩＡＬＳＦＯＲＴＲＥＡＴＩＮＧＤＩＳＥＡＳＥＳ；米国特許第６，９１１，２２７号、表題ＧＥＬＳＦＯＲＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＭＡＴＥＲＩＡＬＳ；および米国特許第６，９１１，２２７号、第５，５２９，９１４号、第５，８０１，０３３号、第６，２５８，８７０号、表題ＧＥＬＳＦＯＲＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＭＡＴＥＲＩＡＬＳでさらに詳細に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれ、ポリエチレングリコールを使用する細胞凝集体のコンフォーマルコーティングを記載する。 In one embodiment, hES-derived cells are encapsulated using biocompatible polyethylene glycol (PEG). Encapsulations based on PEG are described in US Pat. No. 6,911,227, No. 5,529,914, No. 5,801,033, No. 6,258,870, further detailed in the title GELS FOR ENCAPSULATION OF BIOLOGICAL MATERIALS, which are fully incorporated by reference. Which is incorporated herein by reference, describes a conformal coating of cell aggregates using polyethylene glycol.

一実施形態では、封入デバイスは、多能性由来細胞、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌先駆体などの内分泌先駆体、または、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞を、移植された細胞集団が通過するのを防ぎ、それらをデバイス内に保持すると同時に、ある特定の分泌されたポリペプチド、例えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、膵臓ポリペプチドなどの通過を可能にする半透膜の中に含有する。あるいは、デバイスは血管化膜などの複数の膜を有する。 In one embodiment, the encapsulation device is a pluripotent derived cell, for example, an endocrine precursor such as a PDX-1 positive foregut endoderm cell, a PDX-1 positive pancreatic endoderm or progenitor cell, an NGN3 positive endocrine precursor, or Prevent the transplanted cell population from passing through functionally differentiated hormone-secreting cells such as insulin-secreting cells, glucagon-secreting cells, somatostatin-secreting cells, ghrelin-secreting cells, or pancreatic polypeptide-secreting cells It is contained within a semipermeable membrane that allows the passage of certain secreted polypeptides, such as insulin, glucagon, somatostatin, ghrelin, pancreatic polypeptide, etc., while being retained within. Alternatively, the device has multiple membranes, such as a vascularized membrane.

ヒト多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するための作用物質の使用
膜を介した細胞外シグナルの伝達により細胞調節に影響を及ぼし、今度はそれにより、細胞内の生化学的な経路をモジュレートすることができる。タンパク質のリン酸化は、細胞内シグナルが分子から分子へ伝搬され、最終的に細胞の応答がもたらされる１つの経過を表すものである。これらのシグナルトランスダクションカスケードは、高度に調節されており、多くの場合、多くのプロテインキナーゼおよびホスファターゼが存在することによって証明されるように、重複している。ヒトにおいて、タンパク質チロシンキナーゼは、糖尿病、がんを含めた多くの病態の進行において重要な役割を有することが分かっていることが報告されており、また、多種多様な先天性の症候群に関連付けられている。セリントレオニンキナーゼ、例えばＲｈｏキナーゼは、阻害された場合に、糖尿病、がん、および種々の炎症性心血管障害およびＡＩＤＳを含めたヒト疾患の治療と関連し得る酵素のクラスである。現在までに同定されている大多数の阻害剤は、ＡＴＰ結合部位で作用する。そのようなＡＴＰ競合阻害剤は、ＡＴＰ結合部位のあまり保存されていない領域を標的とするそれらの能力による選択性が実証されている。 Use of Agents to Enhance and Promote Growth, Survival, Proliferation and Intercellular Adhesion of Human Pluripotent Stem Cells, eg, hES Cells and iPS Cells Affects Cell Regulation by Transducing Extracellular Signals Through Membranes, This in turn can modulate intracellular biochemical pathways. Protein phosphorylation represents one process by which intracellular signals are propagated from molecule to molecule, ultimately leading to cellular responses. These signal transduction cascades are highly regulated and often overlapping, as evidenced by the presence of many protein kinases and phosphatases. In humans, protein tyrosine kinases have been reported to be known to have important roles in the progression of many pathologies including diabetes and cancer, and have been associated with a wide variety of congenital syndromes. ing. Serine threonine kinases, such as Rho kinase, are a class of enzymes that, when inhibited, may be associated with the treatment of diabetes, cancer, and various human diseases including inflammatory cardiovascular disorders and AIDS. The vast majority of inhibitors identified to date act at the ATP binding site. Such ATP competitive inhibitors have demonstrated selectivity due to their ability to target the less conserved regions of the ATP binding site.

低分子ＧＴＰ結合性タンパク質のＲｈｏキナーゼファミリーは、ＲｈｏＡ〜ＥおよびＲｈｏＧ、Ｒａｃ１およびＲａｃ２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０種のメンバーを含む。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤もしくはＲＯＣＫ阻害剤またはＲｈｏキナーゼ阻害剤と称され、これらは、本明細書では互換的に使用される。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同じアミノ酸配列を有し、同様の細胞内標的を有すると思われる。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの最初の下流メディエーターとして作動し、２つのアイソフォーム：α（ＲＯＣＫ２）およびβ（ＲＯＣＫ１）として存在する。Ｒｈｏキナーゼファミリータンパク質は、それらのＮ末端ドメイン内に触媒（キナーゼ）ドメインを有し、その中央部分にコイルドコイルドメインを有し、それらのＣ末端領域内に推定プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを有する。ＲＯＣＫのＲｈｏ結合性ドメインはコイルドコイルドメインのＣ末端部分に局在し、ＧＴＰと結合した形態のＲｈｏとの結合により、キナーゼ活性の増強がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ媒介性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン−１、ノルエピネフリン、血小板由来成長因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、およびウロテンシンＩＩなどの多くのアゴニストによって開始されるシグナルトランスダクションにおいて重要な役割を果たす。Ｒｈｏキナーゼは、その標的エフェクター／基質のモジュレーションを通じて、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織化、細胞の接着および運動性ならびに遺伝子発現などの種々の細胞機能において重要な役割を果たす。動脈硬化症の発病と関連すると認知されているいくつもの細胞機能の媒介においてＲｈｏキナーゼタンパク質が果たす役割により、これらのキナーゼの阻害剤も種々の動脈硬化性心血管疾患を治療または予防するために有用であり得、また、内皮収縮に関与する。 The Rho kinase family of small GTP binding proteins comprises at least 10 members including RhoA-E and RhoG, Rac1 and Rac2, Cdc42, and TC10. Inhibitors are often referred to as ROK inhibitors or ROCK inhibitors or Rho kinase inhibitors, which are used interchangeably herein. The effector domains of RhoA, RhoB, and RhoC have the same amino acid sequence and are likely to have similar intracellular targets. Rho kinase acts as the first downstream mediator of Rho and exists as two isoforms: α (ROCK2) and β (ROCK1). Rho-kinase family proteins have a catalytic (kinase) domain in their N-terminal domain, a coiled-coil domain in their central portion, and a putative pleckstrin homology (PH) domain in their C-terminal region. .. The Rho-binding domain of ROCK is localized to the C-terminal part of the coiled-coil domain, and binding to the GTP-bound form of Rho results in enhanced kinase activity. The Rho/Rho kinase-mediated pathway is a signal transduction initiated by many agonists such as angiotensin II, serotonin, thrombin, endothelin-1, norepinephrine, platelet-derived growth factor, ATP/ADP and extracellular nucleotides, and urotensin II. Play an important role in. Rho-kinase plays an important role in a variety of cellular functions such as smooth muscle contraction, actin cytoskeletal organization, cell adhesion and motility and gene expression through modulation of its target effector/substrate. Due to the role of Rho-kinase proteins in mediating a number of recognized cellular functions associated with the development of arteriosclerosis, inhibitors of these kinases are also useful for treating or preventing various arteriosclerotic cardiovascular diseases Can also be involved in endothelial contraction.

一部の実施形態では、これだけに限定されないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｈ−１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ）、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ｓｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアントおよびその発現ベクターなどの、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進し、かつ／または支持する作用物質を種々の細胞培養培地条件に添加する。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤として他の低分子化合物が公知であるので、そのような化合物またはその誘導体も本発明において使用することができる（例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号および同第２００３００８７９１９、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。 In some embodiments, but not limited to, Rho kinase inhibitor Y-27632, Fasudil (also referred to as HA1077), H-1152P and ITS (insulin/transferrin/selenium; Gibco), Wf-536, Y. -30141 (described in US Pat. No. 5,478,838, which is fully incorporated herein by reference) and derivatives thereof, as well as antisense nucleic acids to ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA). Agents that promote and/or support cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion, such as competitive peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, antibody-scFV fragments, dominant negative variants and expression vectors thereof. Add to various cell culture medium conditions. Further, as other low molecular weight compounds are known as ROCK inhibitors, such compounds or derivatives thereof can also be used in the present invention (eg, US Patent Application No. US Pat. No. 20050209261, No. 20050192304, No. 2004014755, No. 20040002508, No. 20040002507, No. 20030125344 and No. 20030087919, and International Patent Publication Nos. 2003/062227, 2003/059913, and No. 2003/059913. See 2003/062225, 2002/076976 and 2004/039796).

本発明では、１種または２種またはそれ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せも使用することができる。これらの作用物質は、一部において、解離したｈＥＳ細胞、ｉＰＳまたは分化した細胞培養物、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓前駆体集団、内分泌前駆体および集団などの再会合を促進することによって機能する。同様に、作用物質は、細胞解離が行われない場合にも機能し得る。ヒト多能性幹細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増大は、細胞が懸濁液中の細胞凝集体から生成したものであるか、または接着プレート培養物（細胞外マトリックスの構成成分を含みまたは含まずに、血清を含みまたは含まずに、線維芽細胞フィーダーを含みまたは含まずに、ＦＧＦを含みまたは含まずに、アクチビンを含みまたは含まずに）から生成したものであるかとは独立して実現された。これらの細胞集団の生存率の増加により、セルソーターを使用する精製系が容易になり、改善され、したがって、細胞の回収の改善が可能になる。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用により、解離した単一細胞の段階的な継代の間、または低温保存からのそれらの生存が促進されることにより、分化した細胞型の増幅も可能になり得る。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤はヒト多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞）およびそれが分化した細胞に対して試験されてきたが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、他の細胞型、例えば、一般に、これだけに限定されないが、腸、肺、胸腺、腎臓ならびに網膜色素上皮と同様の神経系細胞型を含めた上皮細胞に適用することができる。 Combinations of one or more ROCK inhibitors can also be used in the present invention. These agents include, in part, dissociated hES cells, iPS or differentiated cell cultures such as definitive endoderm, foregut endoderm, pancreatic endoderm, pancreatic epithelium, pancreatic precursor populations, endocrine precursors and It works by promoting reunion of groups and the like. Similarly, the agent may function in the absence of cell dissociation. The increased growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion of human pluripotent stem cells may be due to cells being produced from cell aggregates in suspension or in adherent plate cultures (extracellular matrix components (With or without serum, with or without serum, with or without fibroblast feeders, with or without FGF, with or without activin) Was realized. The increased viability of these cell populations facilitates and improves purification systems that use cell sorters, thus allowing improved cell recovery. The use of Rho kinase inhibitors such as Y27632 also allows for the expansion of differentiated cell types by promoting their survival during stepwise passage of dissociated single cells or from cryopreservation. obtain. Although Rho kinase inhibitors such as Y27632 have been tested on human pluripotent stem cells (eg hES cells and iPS cells) and the cells into which they have differentiated, Rho kinase inhibitors have been tested on other cell types, eg, in general. , And can be applied to epithelial cells including, but not limited to, intestinal, lung, thymus, kidney and neural cell types similar to retinal pigment epithelium.

細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、その濃度により所望の効果が実現される、例えば、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進が実現される限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。種々のＲＯＣＫ阻害剤を種々の条件下で最適化することが必要な場合があることが当業者には理解されよう。例えば、Ｙ−２７６３２を使用する場合、好ましい濃度は、約０．０１〜約１０００μＭ、より好ましくは約０．１〜約１００μＭ、なおより好ましくは約１．０〜約５０μＭ、最も好ましくは約５〜２０μＭの範囲であり得る。ファスジル／ＨＡ１０７７を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の約２倍または３倍で使用することができる。Ｈ−１１５２を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の量のおよその分数、例えば、約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０または１／６０で使用することができる。使用するＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一部において、阻害剤の生物活性および効力ならびにそれが使用される条件に左右される。 The concentration of the ROCK inhibitor in the cell culture medium is such that it achieves the desired effect, eg, enhances, increases, and/or promotes cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion. Are not limited to those described in the examples below. Those skilled in the art will appreciate that it may be necessary to optimize different ROCK inhibitors under different conditions. For example, when using Y-27632, preferred concentrations are from about 0.01 to about 1000 μM, more preferably about 0.1 to about 100 μM, even more preferably about 1.0 to about 50 μM, most preferably about 5. Can range from ˜20 μM. If Fasudil/HA1077 is used, it can be used at about 2 or 3 times the Y-27632 concentration described above. When H-1152 is used, it is used in an approximate fraction of the amount of Y-27632 concentration described above, eg, about 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 or 1/60. be able to. The concentration of ROCK inhibitor used depends, in part, on the biological activity and potency of the inhibitor and the conditions under which it is used.

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理する時間および期間は、成長、生存、増殖（細胞集団）および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果に応じて限定される場合もされない場合もある。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、実施例７によりよく記載されている通り、驚くべき様式で分化にも影響を及ぼし得る。下記の実施例には、約１２時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上にわたって処理されたヒト多能性幹細胞培養物および／または分化した細胞培養物が記載されている。 The time and duration of treatment with a ROCK inhibitor may or may not be limited depending on the desired effect, such as enhancement, increase, and/or promotion of growth, survival, proliferation (cell population) and cell-cell adhesion. There is also. However, the addition of ROCK inhibitors can also affect differentiation in a surprising manner, as better described in Example 7. The examples below describe human pluripotent stem cell cultures and/or differentiated cell cultures that have been treated for about 12, 24, 48 or more hours.

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理されるヒト多能性幹細胞培養物の密度も同様に、それが、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果が実現される密度である限りは限定されない。播種される細胞の細胞密度は、これだけに限定されないが、接着培養物または懸濁培養物の使用、使用する細胞培養培地の特定のレシピ、成長条件および培養細胞の意図された使用を含めた種々の因子に応じて調整することができる。細胞培養物の密度の例としては、これだけに限定されないが、１ｍｌ当たり細胞０．０１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．０５×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．２×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．４×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．６×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．８×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞２．０×１０^５、１ｍｌ当たり細胞３．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞４．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞５．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞６．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞７．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞８．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞９．０×１０^５個、または１ｍｌ当たり細胞１０．０×１０^５個、またはそれ以上、例えば、１ｍＬ細胞５×１０^７個まで、またはそれ以上、または間の任意の値が挙げられ、良好な細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を伴って培養された。 Similarly, the density of human pluripotent stem cell cultures treated with a ROCK inhibitor has the desired effect of enhancing, increasing, and/or promoting cell growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion. Is not limited as long as it is a density at which The cell density of the seeded cells may be varied including, but not limited to, the use of adherent or suspension cultures, the particular recipe of cell culture medium used, growth conditions and the intended use of the cultured cells. Can be adjusted according to the factors of. Examples of cell culture densities include, but are not limited to, 0.01×10 ⁵ cells per ml, 0.05×10 ⁵ cells per ml, 0.1×10 ⁵ cells per ml, 1 ml 0.5×10 ⁵ cells/ml, 1.0×10 ⁵ cells/ml, 1.2×10 ⁵ cells/ml, 1.4×10 ⁵ cells/ml, 1.6×cells/ml 10 ⁵ cells/ml, 1.8×10 ⁵ cells/ml, 2.0×10 ⁵ cells/ml, 3.0×10 ⁵ cells/ml, 4.0×10 ⁵ cells/ml, 1 cell/ml 5.0×10 ⁵ cells, 6.0×10 ⁵ cells/ml, 7.0×10 ⁵ cells/ml, 8.0×10 ⁵ cells/ml, 9.0×10 ⁵ cells/ml Cells, or 10.0×10 ⁵ cells per ml, or more, such as up to 5×10 ⁷ cells per 1 mL, or more, or any value in between, and good cell growth, survival , Cultured with proliferation and cell-cell adhesion.

ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質の使用
さらに別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含み、本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」またはその等価物とは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＦ−β３、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−３、ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンβＣ、βΕ、βΑおよびβΒ、ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｅｕｒｉｎ）、パーセフィンおよびアルテミンなどのサブファミリーを含めた３０種を超える構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．２３（６）：７８７−８２３を参照されたい。 Use of an Agent that Activates a TGFβ Receptor Family Member In yet another embodiment, an agent that activates a TGFβ receptor family member comprises a member of the TGFβ superfamily of growth factors and is described herein. ing. As used herein, "TGFβ superfamily member" or its equivalent means TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF- 3, subfamily of GDF-1, GDF11, GDF8, activin βC, βΕ, βΑ and βΒ, BMP-14, GDF-14, MIS, inhibin alfa, Lefty1, Lefty2, GDNF, neurturin, persephin and artemin. Refers to more than 30 structurally related proteins, including Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6):787-823.

ＴＧＦβファミリーメンバーは、ＴＧＦβファミリーメンバーに応答して細胞の性質の変化を伝達する、または他のやり方で引き起こすことに関与するポリペプチドまたは相互作用の１種または複数種を刺激する化合物であるＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子によって置き換えること、またはそれと併せて使用することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路はＴＧＦβファミリーメンバー自体を含む。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、ＩＩ型およびＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体およびＳｍａｄとして公知の細胞内エフェクターを通じたシグナル伝達によってシグナルを核に伝達する。これらの受容体は、協同的に作用してリガンドに結合し、シグナルを伝達するＩ型受容体およびＩＩ型受容体として公知の２つのサブファミリーに入る（Ａｔｔｉｓａｎｏら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１６（３）、１０６６−１０７３（１９９６））。リガンドはＩ型受容体およびＩＩ受容体の細胞表面に結合し、リン酸化によるＩ型受容体の活性化を促進する。この活性化された複合体が今度は細胞内Ｓｍａｄを活性化し、それが転写を調節する多サブユニット複合体に集合する。ＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーは、２つのシグナル伝達サブグループ：ＴＧＦβ／アクチビンと機能的に関連するもの、およびＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーと関連するものに分けられる。大部分のＴＧＦβリガンドは、最初にＩＩ型受容体に結合し、次いで、このリガンド／ＩＩ型受容体複合体がＩ型受容体を動員またはリン酸化すると考えられている（Ｍａｔｈｅｗｓ，ＬＳ、ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ１５：３１０−３２５（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖ：ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．１、１６９−１７８（２０００））。ＩＩ型受容体キナーゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化および活性化することにより、次いで、Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する。ＴＧＦβ／アクチビンリガンドはＴＧＦβおよびアクチビンＩＩ型受容体に結合し、このアクチビン型経路を通じてＳｍａｄ−２、Ｓｍａｄ−３、ＮｏｄａｌおよびＬｅｆｔｙシグナルを活性化することができる。ＢＭＰ／ＧＤＦリガンドはＢＭＰＩＩ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８を活性化することができる。Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒら、Ｃｅｌｌ９５、７３７−７４０（１９９８）を参照されたい。リガンド刺激の際、Ｓｍａｄは核内に移動し、転写複合体の構成成分として機能する。 A TGFβ signal is a compound that stimulates one or more of the polypeptides or interactions involved in transducing or otherwise causing changes in the properties of cells in response to a TGFβ family member. It can be replaced by, or used in conjunction with, transduction pathway activators. The TGFβ signaling pathway involves the TGFβ family members themselves. Members of the TGFβ superfamily transduce signals to the nucleus by signaling through intracellular effectors known as type II and type I serine-threonine kinase receptors and Smads. These receptors enter into two subfamilies known as type I and type II receptors that act cooperatively to bind ligands and transduce signals (Attisano et al., Mol Cell Biol 16(3)). , 1066-1073 (1996)). The ligand binds to the cell surface of the type I and II receptors and promotes activation of the type I receptor by phosphorylation. This activated complex in turn activates intracellular Smad, which assembles into a multi-subunit complex that regulates transcription. Members of the TGFbeta superfamily are divided into two signaling subgroups: those functionally associated with TGFβ/activin and those associated with the BMP/GDF subfamily. Most TGFβ ligands are thought to first bind to the type II receptor and then this ligand/type II receptor complex recruits or phosphorylates the type I receptor (Mathews, LS, Endocr). Rev 15:310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). Type II receptor kinases phosphorylate and activate type I receptor kinases, which in turn phosphorylate and activate Smad proteins. TGFβ/activin ligands can bind to TGFβ and activin type II receptors and activate Smad-2, Smad-3, Nodal and Lefty signals through this activin type pathway. BMP/GDF ligands can bind to BMP type II receptors and activate Smad1, Smad5, and Smad8. See Derynck, R et al., Cell 95, 737-740 (1998). Upon ligand stimulation, Smad migrates into the nucleus and functions as a constituent of the transcription complex.

ＴＧＦβシグナル伝達は、種々の機構を通じて正におよび負に調節される。陽性調節では、シグナルが生物学的活性のために十分なレベルまで増幅される。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドがＩＩ型受容体に結合し、これによりＩ型受容体が動員およびリン酸化される。次いで、Ｉ型受容体により、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）がリン酸化され、そこで共通のメディエーターＳｍａｄまたはｃｏ−ＳＭＡＤに結合することができる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核内に蓄積され、そこで転写因子としての機能を果たし、標的遺伝子発現の調節に関与する。例えば、成長分化因子としては１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、および１５が挙げられる。また、好ましい一実施形態では、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１はＴＧＦβファミリーメンバーであり、同様にＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子（陽性調節）でもあり、ＡｃｔＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合性ドメイン部分に結合し、次いでＡｃｔＲＩと複合体を形成し、それによりＳｍａｄ７負の制御因子の阻害およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体のリン酸化を導くことによって作用する。Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体はＳｍａｄ４と会合して特定の遺伝子の発現を調節する。 TGFβ signaling is positively and negatively regulated through various mechanisms. With positive regulation, the signal is amplified to a level sufficient for biological activity. TGFβ superfamily ligands bind to the type II receptor, which recruits and phosphorylates the type I receptor. The type I receptor then phosphorylates the receptor-regulated SMAD (R-SMAD, eg SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, and SMAD8), where it binds to the common mediator Smad or co-SMAD. You can The R-SMAD/coSMAD complex accumulates in the nucleus where it functions as a transcription factor and is involved in the regulation of target gene expression. For example, growth differentiation factors include 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 15. Also, in a preferred embodiment, GDF8 and GDF11 are TGFβ family members, as well as TGFβ signaling pathway activators (positive regulation), that bind to the extracellular ligand binding domain portion of the ActRII receptor, and then It acts by forming a complex with ActRI, thereby leading to inhibition of Smad7 negative regulators and phosphorylation of the Smad2/Smad3 complex. The Smad2/Smad3 complex associates with Smad4 to regulate the expression of specific genes.

ＴＧＦβシグナル伝達の負の調節は、細胞外、膜、細胞質および核レベルで起こる。ＴＧＦβによって開始されるシグナル伝達を抑圧するために、シグナル伝達を妨害することができる。これは、ＴＧＦβ受容体およびＳＭＡＤタンパク質相互作用をブロックするかそれと競合するタンパク質などの、ＴＧＦβ受容体（複数可）とＳＭＡＤタンパク質の間の相互作用と拮抗またはそれを阻止する、当技術分野で公知である任意の手段によって達成することができる。あるいは、シグナル伝達経路に沿うシグナル伝達を阻止するために、当技術分野で公知である任意の手段によって、ＴＧＦβ受容体またはＳＭＡＤタンパク質の転写または翻訳を変化させることができる。様々なＴＧＦβメンバータンパク質の正および負の調節は、下の因子のいくつかのより詳細な記載によってさらに例示される。 Negative regulation of TGFβ signaling occurs at the extracellular, membrane, cytoplasmic and nuclear levels. Signal transduction can be interfered with in order to suppress the signal transduction initiated by TGFβ. It is known in the art to antagonize or block the interaction between TGFβ receptor(s) and SMAD proteins, such as proteins that block or compete with TGFβ receptor and SMAD protein interactions. Can be achieved by any means that is Alternatively, the transcription or translation of the TGFβ receptor or SMAD protein can be altered by any means known in the art to prevent signal transduction along the signal transduction pathway. Positive and negative regulation of various TGFβ member proteins is further exemplified by some more detailed descriptions of the factors below.

任意の作用物質の使用と同様に、細胞培養培地中の任意のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの濃度は、その濃度により、例えばＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーが活性化されることなどの所望の効果を実現することができる限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。例えば、アクチビン、例えば、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ、またはＧＤＦ８およびＧＤＦ−１１を使用する場合、好ましい濃度は、約１０〜約３００ｎＭ、より好ましくは約５０〜約２００ｎＭ、なおより好ましくは約７５〜約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１００〜１２５ｎＭの範囲であり得る。当業者は、任意の濃度を容易に試験することができ、当技術分野における標準の技法を使用して、そのような濃度の有効性を決定すること、例えば、任意の細胞型について遺伝子マーカー（ｇｅｎｅｍａｋｅｒ）パネルの発現および非発現を決定することによって分化を評価することができる。 As with the use of any agent, the concentration of any TGFβ superfamily member in the cell culture medium is such that the concentration achieves the desired effect, eg, activation of the TGFβ receptor family member. However, it is not limited to what is described in the following examples. For example, when using activin, such as activin A and/or activin B, or GDF8 and GDF-11, preferred concentrations are from about 10 to about 300 nM, more preferably from about 50 to about 200 nM, and even more preferably about 75. Can range from about 150 to about 150 nM, most preferably about 100 to 125 nM. One of skill in the art can readily test any concentration and use standard techniques in the art to determine the efficacy of such concentration, e.g., a genetic marker (for any cell type ( Differentiation can be assessed by determining expression and non-expression of the gene maker) panel.

ヒト多能性幹細胞を分化させるために使用されるこれらおよび他の成長因子は、２００８年６月３日に出願の米国特許出願第１２／１３２，４３７号、表題ＧＲＯＷＴＨＦＡＣＴＯＲＳＦＯＲＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭでさらに詳細に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。 These and other growth factors used to differentiate human pluripotent stem cells are described in US patent application Ser. No. 12/132,437 filed June 3, 2008, entitled GROWTH FACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDORDER It is described in further detail, which is fully incorporated herein by reference.

本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される、単に例示するためのものであり、限定するものではないある特定の実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。 Although the present invention has been generally described, further understanding can be obtained by reference to certain specific examples provided herein for purposes of illustration only and not for purposes of limitation.

上述のものが本発明の好ましい実施形態に関連すること、および本発明の範囲を逸脱しないでそこに多数の変更を加えることができることも理解するべきである。本発明は以下の実施例でさらに例示されるが、それらはその範囲に制限を加えるものと決して解釈されてはならない。逆に、様々な他の実施形態、改変形およびその同等物を用いることができることを明らかに理解するべきであり、それらは、本明細書の説明を読んだ後ならば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しないで、当業者が思いつくことができる。 It should also be understood that what has been described above relates to the preferred embodiments of the invention, and that numerous changes may be made therein without departing from the scope of the invention. The present invention is further illustrated in the following examples, which should in no way be construed as limiting the scope. On the contrary, it should be clearly understood that various other embodiments, modifications and equivalents thereof may be used, which are, after reading the description herein, the spirit and spirit of the invention. One of ordinary skill in the art can contemplate without departing from the scope of the appended claims.

（実施例１）
胚体内胚葉および内胚葉中間体を経た膵臓の前駆体および内分泌細胞へのヒトｉＰＳ細胞の分化
膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞などの膵臓細胞型の集団を生成するために、約２週（または１４日）にわたる四（４）ステージ手順を使用して、懸濁凝集体でヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を分化させた。本明細書で用いたヒトｉＰＳ細胞系は、Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ、京都大学、日本およびＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＣＤＩ）によって提供された。 (Example 1)
Differentiation of human iPS cells into pancreatic precursors and endocrine cells via definitive endoderm and endoderm intermediates To generate a population of pancreatic cell types such as pancreatic precursors, endocrine precursors and hormone-expressing endocrine cells, approximately Human induced pluripotent stem (iPS) cells were differentiated in suspension aggregates using a four (4) stage procedure over 2 weeks (or 14 days). The human iPS cell line used herein is S. Yamanaka, Kyoto University, Japan and Cellular Dynamics International, Inc. (CDI).

本明細書に記載されるｉＰＳ細胞は、ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａによって最初に、その後ＣＤＩによって提供された。未分化ｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清代替物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２において、有糸***不活性化マウス胚線維芽細胞上で、または好ましくはフィーダーフリー（線維芽細胞フィーダー細胞層なし）で増殖させた。アキュターゼを使用して未分化ｉＰＳ細胞を単細胞に解離させることによって分化を開始し、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。細胞は、１：５０００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ−２７６３２を１０μΜで含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳに、１ミリリットルにつき細胞数１，０００，０００〜２，０００，０００で再懸濁させ、回転プラットホームの上に置いた超低付着６ウェルプレートに入れ、約１００ｒｐｍで回転させた。培養物は、分化プロセスの残りの間、培地を毎日交換し、１００ｒｐｍで回転させた。ｉＰＳＣの成長、継代および増殖は、実質的に米国特許第７，９６１，４０２号および第８，２１１、６９９号に記載されている通りであり、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The iPS cells described herein were first provided by Shinya Yamanaka and then by CDI. Undifferentiated iPS cells are grown on mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts in DMEM/F12 containing 20% knockout serum substitute, or preferably feeder-free (without fibroblast feeder cell layer). Let Differentiation was initiated by dissociating undifferentiated iPS cells into single cells using Accutase and cell samples taken for RNA isolation and analysis. Cells were RPMI+0.2 containing insulin-transferrin-selenium (ITS), activin A (100 ng/mL), wnt3a (50 ng/mL) and rho kinase or ROCK inhibitor, Y-27632 at 10 μΜ diluted 1:5000. Resuspended in volume/volume% FBS at 1,000,000 to 2,000,000 cells per milliliter, placed in an ultra-low attachment 6-well plate on a rotating platform and spun at about 100 rpm. It was Cultures were replaced with medium daily and spun at 100 rpm for the rest of the differentiation process. Growth, passage and proliferation of iPSCs are substantially as described in US Pat. Nos. 7,961,402 and 8,211,699, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference. Incorporated.

多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および多能性細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養物を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されている通りであり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。 The methods described herein for producing an aggregated suspension culture of pluripotent cells, such as hES or iPS cells, and cells derived from pluripotent cells are substantially as of February 23, 2007. PCT/US2007/062755, in which the titles applied for on the days are Compositions and methods for culturing differential cells, and the titles applied for on October 20, 2008, are the methods and employments for composting efforts. As described in certain PCT/US2008/080516, which are fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される方法は、例えば、ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属する、Ｂｏｄｎａｒらへの米国特許第６，８００，４８０号に記載のように、培養容器を細胞外マトリクスで先ずコーティングすることによって促進することができる。他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞を培養するための他の方法と同様に、この方法は、実質的に２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍである、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されるように、可溶性ヒト血清を使用して培養することができる。 The methods described herein are facilitated by first coating a culture vessel with an extracellular matrix, for example, as described in US Pat. No. 6,800,480 to Bodnar et al. belonging to Geron Corporation. can do. Similar to other methods for culturing other pluripotent stem cells, such as hES and iPS cells, this method is essentially the method filed on October 20, 2008 entitled Methods and compositions for feeder-free. Soluble human serum can be cultured as described in US patent application PCT/US2008/080516, which is a pluripotent stem cell media containing human serum, which is fully incorporated herein by reference.

本明細書に記載される方法は、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＡｌｕｍｎｉＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に帰属する、参照により本明細書に完全に組み込まれるＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．への米国特許第７，００５，２５２号に記載されるように、線維芽細胞フィーダー層だけ以外の供給源から供給される、外部から加えられた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって促進することができる。 The methods described herein are attributed to the Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF), which is incorporated herein by reference in Thomson, J.; As described in U.S. Pat. No. 7,005,252 to F., by exogenously added fibroblast growth factor (FGF) supplied from a source other than the fibroblast feeder layer alone. You can

回転の最初の約２４時間の間に、互いに付着した単細胞は細胞凝集体を形成し、ＲＮＡの単離と分析のために十分な細胞試料をとった。細胞凝集体は、直径が約６０ミクロンから１２０ミクロンであった。ｉＰＳ細胞試料を回転プラットホームに置いてから約１日（または２４時間）後に、培養に、１：５０００希釈のＩＴＳ、アクチビンＡ（１００〜２００ｎｇ／ｍＬ）、およびＷｎｔ３ａ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳを約１日間（０日目から１日目まで）、およびさらに１日間、またはＷｎｔ３ａのないこと以外は同じ培地を（１日目から２日目）与えた。ＲＮＡの単離および分析のために毎日の細胞試料をとった。２日間の分化の後、培養物に、１：１０００希釈のＩＴＳ、ＫＧＦ（またはＦＧＦ７、２５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦβ阻害剤ｎｏ．４（２．５μＭ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳを１日間（または２４時間、２日目から３日目まで）与えた。次の２日間（３日目から５日目）、ＴＧＦβ阻害剤を培地から除いたこと以外は同じ成長因子カクテル培地をｉＰＳ細胞凝集懸濁液に与えた。再び、このステージ（ステージ２または５日目）の終わりに、ＲＮＡ単離のために細胞試料をとった。ステージ３（５日目から８日目）については、ＴＴＮＰＢ［４−［Ｅ−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］（３ｎＭ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μΜ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプリメントに細胞培養培地を代えた。再び、このステージ（ステージ３または８日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。ステージ４（８日目から１４日目）については、ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプリメントに培地を代えた。再び、ステージ４（または１４日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。 During the first approximately 24 hours of rotation, the single cells attached to each other formed cell aggregates, taking sufficient cell samples for RNA isolation and analysis. Cell aggregates were approximately 60 to 120 microns in diameter. Approximately 1 day (or 24 hours) after placing the iPS cell sample on the rotating platform, the culture was diluted with 1:5000 dilution of ITS, activin A (100-200 ng/mL), and Wnt3a (50-100 ng/mL). RPMI + 0.2% v/v% FBS containing for about 1 day (from day 0 to day 1) and for another day or the same medium (without day 1 to day 2) but without Wnt3a. It was Daily cell samples were taken for RNA isolation and analysis. After 2 days of differentiation, the cultures were diluted 1:1000 with ITS, KGF (or FGF7, 25 ng/mL) and TGFβ inhibitor no. RPMI+0.2 vol/vol% FBS containing 4 (2.5 μM) was given for 1 day (or 24 hours, 2 to 3 days). For the next 2 days (Days 3-5), the iPS cell aggregation suspension was given the same growth factor cocktail medium except that the TGFβ inhibitor was removed from the medium. Again, at the end of this stage (stage 2 or day 5), cell samples were taken for RNA isolation. For stage 3 (Days 5-8), TTNPB[4-[E-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)- The cell culture medium was replaced with DMEM+1 vol/vol% B27 supplement containing 1-propenyl]benzoic acid] (3 nM), KAAD-cyclopamine (0.25 μM) and noggin (50 ng/mL). Again, at the end of this stage (stage 3 or day 8), cell samples were taken for RNA isolation and analysis. For Stage 4 (Days 8-14), medium was replaced with DMEM+1 vol/vol% B27 supplement containing Noggin (50 ng/mL), KGF (50 ng/mL) and EGF (50 ng/mL). Again, at the end of stage 4 (or day 14), cell samples were taken for RNA isolation and analysis.

分化中の様々なマーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために、リアルタイムＰＣＲを実施した。特異的マーカーまたは遺伝子の遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに先ず標準化した。次に標準化した相対的な遺伝子発現は、未分化ｉＰＳ細胞での発現レベルに対して棒グラフに表示され、したがって様々な分化マーカーの上方制御倍率を表す。ＯＣＴ４については、遺伝子発現は、データセットの最低の試料（１４日目）を設定するために標準化され、したがって分化中の下方制御倍率を表す。 Real-time PCR was performed to measure gene expression of various marker genes during differentiation. Gene expression of specific markers or genes was first normalized to the average expression level of housekeeping gene, cyclophilin G and TATA binding protein (TBP) expression. Normalized relative gene expression is then displayed in a bar graph against expression levels in undifferentiated iPS cells, thus representing the fold upregulation of various differentiation markers. For OCT4, gene expression was normalized to set the lowest sample in the data set (day 14) and thus represents the fold downregulation during differentiation.

図２Ａ〜Ｌは、未分化ｉＰＳ細胞中の同じ遺伝子の発現レベルと比較した、同定された遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒ１、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＩＮＳ）の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子（対照）のセットに標準化し、２つの異なる時点での遺伝子発現レベルを比較することにより、その遺伝子または発現マーカーに上方制御か下方制御があることが示された。ＯＣＴ４（図２Ａ）については、遺伝子発現を標準化し、最低レベルの発現の試料を１に設定した（１４日目）。したがって、図２Ａによって示されるように、ＯＣＴ４の相対的な発現レベルは、分化中（Ｘ軸、ステージ０から４、または０日目から１４日目）の下方制御倍率（ｙ軸）を表す。 2A-L show identified genes (eg, Oct4, Brachyury, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, compared to the expression levels of the same gene in undifferentiated iPS cells. 3 is a bar graph showing the relative gene expression of NGN3 and INS). Normalizing the expression level of a gene to a set of housekeeping genes (controls) and comparing the gene expression levels at two different time points showed that the gene or expression marker had upregulation or downregulation .. For OCT4 (FIG. 2A), gene expression was standardized and the sample with the lowest level of expression was set to 1 (day 14). Thus, as shown by FIG. 2A, the relative expression levels of OCT4 represent the down-fold fold (y-axis) during differentiation (X-axis, stages 0-4, or days 0-14).

図２Ａに示すように、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）は未分化ｉＰＳ細胞において高レベルで発現され、その後分化中（０日目から１４日目）は下方制御を示す。１４日目までには、ＯＣＴ４発現レベルは未分化細胞で観察される発現レベルから３０００倍を超えて減少した。対照的に、最初の２日間（１日目および２日目）中にｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、図２Ｂ）発現の一過性の上方制御があった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの一過性の上方制御は、アクチビンＡおよびｗｎｔ３ａの適用による多能性／ｉＰＳ細胞の内胚葉系中胚葉へ誘導された分化の結果であった。３日目のステージ１の終わりまでのＣＥＲ１、ＧＳＣおよびＦＯＸＡ２の上方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｅ）、内胚葉系中胚葉はアクチビンＡへの連続曝露によって２日目および３日目の間に胚体内胚葉にさらに分化した。分化の６日目までのＦＯＸＡ１の上方制御、ＦＯＸＡ２発現の維持ならびにＣＥＲ１およびＧＳＣの下方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｆ）、ステージ２の間に、胚体内胚葉は腸管内胚葉に分化するようにさらに誘導された。８日目までのＨＮＦ６およびＰＤＸ１の上方制御によって示されるように（図２Ｇ〜Ｈ）、ステージ３の間、レチノイド、シクロパミンおよびノギンへの曝露の結果、腸管内胚葉は後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉に分化するようにさらに誘導された。１４日目までのＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６−１、ＮＧＮ３およびＩＮＳの上方制御によって示されるように（図２Ｉ〜Ｌ）、ステージ４の間、ＫＧＦおよびＥＧＦへの曝露の結果、後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉は、膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞に分化するようにさらに誘導された。 As shown in FIG. 2A, OCT4 (POU5F1) is expressed at high levels in undifferentiated iPS cells and then shows down-regulation during differentiation (Day 0 to Day 14). By day 14, OCT4 expression levels had decreased more than 3000-fold from those observed in undifferentiated cells. In contrast, there was a transient upregulation of brachyury gene (BRACHYURY, Figure 2B) expression during the first two days (Days 1 and 2). The transient upregulation of brachyury was the result of endodermal mesoderm-induced differentiation of pluripotent/iPS cells by the application of activin A and wnt3a. Endodermal mesoderm was exposed to continuous activin A on days 2 and 3 as shown by upregulation of CER1, GSC and FOXA2 by the end of stage 1 on day 3 (FIGS. 2C-E). Further differentiation into definitive endoderm during. During stage 2, definitive endoderm differentiated into intestinal endoderm, as shown by up-regulation of FOXA1 up to day 6 of differentiation, maintenance of FOXA2 expression and down-regulation of CER1 and GSC (FIGS. 2C-F). Was further induced to. During stage 3, exposure to retinoids, cyclopamine and noggin resulted in intestinal endoderm within the posterior foregut/PDX1 expression as shown by up-regulation of HNF6 and PDX1 by day 8 (FIGS. 2G-H). It was further induced to differentiate into germ layers. Exposure to KGF and EGF during stage 4, as a result of up-regulation of PTF1A, NKX6-1, NGN3 and INS by day 14 (FIGS. 2I-L) resulted in posterior foregut/PDX1 expression. The germ layers were further induced to differentiate into pancreatic precursors, endocrine precursors and hormone-expressing endocrine cells.

（実施例２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進する
様々なｈＥＳおよびｉＰＳ細胞系を分化させる方法は、実質的にここで、および実施例１に記載される通りである。分化の間の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するために、ステージ１、２、３、４および５について記載される培養条件に加えて、アポトーシス阻害剤および／またはＲｈｏキナーゼもしくはＲＯＣＫ阻害剤を培地に加えた。一般的に約１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２を、各ステージで細胞培養に加えた。あるいは、少なくともステージ１および２、ならびにステージ４および５、またはその任意の組合せでＲｈｏキナーゼ阻害剤を加えた。分化したｉＰＳ懸濁液（凝集体）細胞培養の形態および遺伝子マーカー発現プロファイルは、ｈＥＳ細胞から導出された懸濁細胞培養のそれに実質的に類似する。 (Example 2)
Rho Kinase Inhibitors Promote iPS Cell Growth, Survival, Proliferation and Intercellular Adhesion Methods for differentiating various hES and iPS cell lines are substantially as described herein and in Example 1. is there. In addition to the culture conditions described for stages 1, 2, 3, 4 and 5 in order to enhance and promote growth, survival, proliferation and cell-cell adhesion during differentiation, apoptosis inhibitors and/or Rho kinase or ROCK inhibitor was added to the medium. Generally about 10 μΜ Rho kinase inhibitor such as Y-27632 was added to the cell culture at each stage. Alternatively, the Rho kinase inhibitor was added at least at stages 1 and 2, and at stages 4 and 5, or any combination thereof. The morphology and gene marker expression profile of differentiated iPS suspension (aggregate) cell culture is substantially similar to that of suspension cell culture derived from hES cells.

図３および４は、それぞれステージ４と５からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）を示す。図３は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞など、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（膵臓上皮または膵臓前駆体とも呼ばれる）の特徴を示す典型的な遺伝子マーカーを発現する、ステージ４からの細胞凝集体を示す。図３に示されていないが、ステージ４細胞は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）などのステージ５細胞の特色をより示すホルモン分泌タンパク質または遺伝子マーカーを発現しない。図４は、ステージ５からのホルモン発現細胞の細胞凝集体を示す。これらのＩＣＣ結果は、ＱＰＣＲを使用してさらに確認された。しかし、ＱＰＣＲは試料または細胞培養で発現されるＲＮＡの全レベルの全集団研究であるので、それは任意の１つの細胞が複数のマーカーを発現することを確定的に示すことができない。 Figures 3 and 4 show the immunocytochemistry (ICC) of iPS cell cultures from stages 4 and 5, respectively. FIG. 3 shows cell aggregates from stage 4, expressing typical genetic markers characteristic of PDX1-positive pancreatic endoderm (also called pancreatic epithelium or pancreatic precursors), such as PDX1/NKX6.1 co-positive cells. Show. Although not shown in FIG. 3, stage 4 cells are hormone secretory proteins or genes that are more characteristic of stage 5 cells such as insulin (INS), glucagon (GCG), somatostatin (SST) and pancreatic polypeptide (PP). Does not express the marker. FIG. 4 shows cell aggregates of hormone expressing cells from stage 5. These ICC results were further confirmed using QPCR. However, since QPCR is a total population study of all levels of RNA expressed in a sample or cell culture, it cannot definitively show that any one cell expresses multiple markers.

（実施例３）
ｉＰＳ導出膵臓前駆体の封入
現在まで、ｉＰＳ細胞の生成方法およびｉＰＳ細胞の生成のための供給源が報告されている。しかし、特定の疾患、例えば糖尿病を治療するための細胞療法での潜在的使用のための、任意の機能性分化細胞への任意のｉＰＳ細胞の分化に関する十分な記載はない。 (Example 3)
Encapsulation of iPS-derived pancreatic precursors To date, methods for producing iPS cells and sources for producing iPS cells have been reported. However, there is not sufficient description of the differentiation of any iPS cell into any functionally differentiated cell for potential use in cell therapy to treat certain diseases, such as diabetes.

ヒトｉＰＳ細胞から導出されたステージ４のＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞培養が、グルコース感受性インスリン分泌細胞にｉｎｖｉｖｏで発達および成熟することが完全に可能かどうか判定するために、実質的に実施例１および２に記載のような膵臓前駆体集団を、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００９年１１月１３日に出願された米国特許出願１２／６１８，６５９、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＬＩＮＥＡＧＥＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳに記載のものに実質的に類似のマクロ封入デバイスに加えた。簡潔には、実質的に約３×１０^６細胞数を有する、５−１０−２０μＬの重力沈降細胞懸濁凝集体を各デバイスに加えた。 To determine whether stage 4 PDX1-positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cell cultures derived from human iPS cells are fully capable of developing and maturing glucose-sensitive insulin secreting cells in vivo, The pancreatic precursor populations as described in Examples 1 and 2 in US Patent Application No. 12/618,659, filed Nov. 13, 2009, entitled ENCAPSURATION OF PANCREATIC, which is fully incorporated herein by reference. LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLs; and macroencapsulated devices substantially similar to those described in US Pat. .. Briefly, 5-10-20 μL of gravity-precipitated cell suspension aggregates, which have substantially about 3×10 ⁶ cell numbers, were added to each device.

次に、哺乳動物、例えば免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへの移植のためにデバイス内の封入細胞を調製したが、ラット、ブタ、サルまたはヒト患者などのより大きな動物に移植することができる。封入細胞を移植する方法およびデバイスは、実質的に、ＧＥＬＦＯＡＭマトリックスに移植されて精巣上体の脂肪パッド（ＥＦＰ）の下に移植される膵臓前駆細胞等、米国特許出願第１２／６１８，６５９号、米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号に記載される通りである。 The encapsulated cells in the device were then prepared for transplantation into mammals, eg immunodeficient SCID/Bg mice, but can be transplanted into larger animals such as rat, pig, monkey or human patients. Methods and devices for implanting encapsulated cells are substantially as described in US patent application Ser. , U.S. Pat. Nos. 7,534,608 and 7,695,965.

これらの研究で免疫抑制は必要でなかったが、デバイス内の前駆体が完全に成熟してグルコース応答性になるまで、最初の中間期間の間特定の哺乳動物のために免疫抑制が必要とされることがある。一部の哺乳動物では、免疫抑制レジメンは約１、２、３、４、５、６週間以上であってもよく、哺乳動物次第である。 Although immunosuppression was not required in these studies, immunosuppression was required for certain mammals during the first interim period until the precursors within the device were fully mature and glucose-responsive. Sometimes. In some mammals, the immunosuppressive regimen may be about 1, 2, 3, 4, 5, 6 weeks or longer, depending on the mammal.

移植された細胞は、ｉｎｖｉｖｏで分化させ、さらに成熟させた。移植された細胞が例えば天然に存在するベータ細胞のように正常な生理機能を有するかどうか判定するために、ヒトＣペプチドのレベルの検査によってヒトインスリンのレベルを判定する。ヒトＣペプチドはヒトプロインスリンから切断または処理され、したがって、内因性マウスＣペプチドでなくヒトＣペプチドの特異的検出は、インスリン分泌が移植された（外因性）細胞から導出されたことを示す。移植片を有する動物は、それらへのアルギニンまたはグルコース、好ましくはグルコースのボーラス注射によって、２、３または４週ごとにヒトＣペプチドのレベルを検査する。その後成熟したベータ細胞（分化した多能性ｉＰＳ細胞から導出された）は、天然に存在するか内因性のベータ細胞と同様に生理的に機能的で、グルコース応答性であるはずである。一般的に、５０ｐＭまたは平均基礎（閾値）レベルを上回るヒトＣペプチドの量が、移植された前駆体からの今ではベータ細胞の機能の指標である。 The transplanted cells were differentiated in vivo and further matured. To determine whether the transplanted cells have normal physiology, such as naturally-occurring beta cells, human insulin levels are determined by testing human C-peptide levels. Human C-peptide was cleaved or processed from human proinsulin, thus specific detection of human C-peptide but not endogenous mouse C-peptide indicates that insulin secretion was derived from transplanted (exogenous) cells. Animals with grafts are tested for levels of human C-peptide every 2, 3 or 4 weeks by bolus injection of arginine or glucose, preferably glucose, into them. The mature beta cells (derived from the differentiated pluripotent iPS cells) should then be physiologically functional and glucose responsive, similar to naturally occurring or endogenous beta cells. In general, amounts of human C-peptide above 50 pM or the mean basal (threshold) level are now an indicator of beta cell function from transplanted precursors.

参照により本明細書に完全に組み込まれるＫｒｏｏｎら（２００８）、前掲、米国特許出願１２／６１８，６５９、米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号および第７，９９３，９２０号に記載のものと同様に、ｈＩＰＳ細胞から導出された封入膵臓前駆体は、天然に存在する島のそれと同様の内分泌、腺房および管細胞を有する、機能性の膵島クラスターに成熟することが期待される。また、移植前のｈＩＰＳ細胞から導出された精製または濃縮された膵臓前駆体も、機能性の膵島に成熟および発達し、ｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成することが予想される。様々な分化した細胞集団を精製、濃縮するための特定の実施形態は、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ、現在の米国特許第８，３３８，１７０号にさらに詳細に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。凍結保存されたｈＩＰＳ細胞から導出された膵臓前駆体は、移植の前に解凍し、培養に適合させることができ、その結果、ｉｎｖｉｖｏで成熟してインスリンを生成することができることがさらに予想される。ｈＩＰＳ細胞から導出された移植された膵臓前駆体を有する糖尿病誘導動物では、低血糖を改善することができる。 Kroon et al. (2008), supra, US patent application 12/618,659, US Pat. Nos. 7,534,608; 7,695,965 and 7,993, which are fully incorporated herein by reference. Similar to that described in No. 920, encapsulated pancreatic progenitors derived from hIPS cells mature into functional islet clusters with endocrine, acinar and ductal cells similar to those of naturally occurring islets. There is expected. It is also expected that purified or enriched pancreatic progenitors derived from pre-transplant hIPS cells will mature and develop into functional islets and produce insulin in vivo. A particular embodiment for purifying and enriching various differentiated cell populations is described in US patent application Ser. Further details are provided in CELLS, present US Pat. No. 8,338,170, the disclosure of which is fully incorporated herein by reference. It is further expected that pancreatic progenitors derived from cryopreserved hIPS cells can be thawed and adapted to culture prior to transplantation, resulting in in vivo maturation to produce insulin. R. Hypoglycemia can be ameliorated in diabetes-induced animals with transplanted pancreatic precursors derived from hIPS cells.

要約すると、マクロ封入デバイス中のｈＩＰＳ細胞から導出された完全封入膵臓前駆細胞は、生理的に機能的な膵島に成熟し、ｉｎｖｉｖｏでグルコースに応答してインスリンを生成することが予想される。 In summary, it is expected that fully encapsulated pancreatic progenitor cells derived from hIPS cells in macroencapsulated devices mature into physiologically functional islets and produce insulin in response to glucose in vivo.

（実施例４）
膵臓前駆体およびホルモン分泌細胞組成物
それぞれ表５ａ、５ｂおよび６に示すように、フローサイトメトリーを用いて、分化したｈＩＰＳ細胞集団を、ＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞（ステージ４）；および内分泌または内分泌先駆細胞（ステージ５）の含有量について分析した。表５ｂは表５ａのそれと同じデータセットであるが、比較のために表９のそれと同様に提示する。全体のＰＤＸ１＋およびＮＫＸ６．１＋数はＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ−細胞集団（表５ａの第５列）のそれと重複するので、表５ａ集団は互いと重複する、例えば全細胞数は１００％を超える。表５ｂはＰＤＸ１＋だけおよび三重陰性（残留）データを含み、それは表５ａでは示されない。ｉｎｖｉｖｏ機能を判定するために、これらのｉＰＥＣ移植片の特定のもの、ならびに実質的に類似の処方を使用する他のものを動物に移植したが、ヒト血清Ｃペプチドのレベルはどの潜在的治療目的のためにも十分に安定的でなかった（データは示さず）。示す値は、所与の集団に属する全細胞の百分率である。懸濁細胞凝集体中にある膵臓前駆体（ＮＫＸ６．１（＋）／ＰＤＸ１（＋）／クロモグラニンＡ（−））の数およびＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１−／ＣＨＧＡ−の非常に小さい集団は、ｈＥＳ細胞から導出された膵臓前駆細胞懸濁凝集体で観察されたものと一致し、２００８年１１月４日に出願された米国特許出願１２／２６４，７６０、表題ＳＴＥＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＴＨＥＲＥＯＦに記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれる通り、ＥＳＣステージで凝集した。内分泌物および／または内分泌先駆細胞のレベルも、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ中のｈＥＳ由来の細胞培養物で得られたものと実質的に一致していた。ｈＥＳ由来の細胞の懸濁凝集体と同様に、分化の特定のステージ（例えば、ステージ４）で培地中の異なる成長因子の濃度を変化させることは、膵臓内胚葉、内分泌、ＰＤＸ１陽性の内胚葉または非膵臓細胞型の特定の集団を増加および／または減少させるはずである。

(Example 4)
Pancreatic Progenitor and Hormone Secreting Cell Compositions Differentiated hIPS cell populations were analyzed for their PDX1-positive pancreatic endoderm or pancreatic progenitor cells (stage 4) using flow cytometry as shown in Tables 5a, 5b and 6, respectively. And analyzed for endocrine or endocrine precursor cell (stage 5) content. Table 5b is the same data set as that of Table 5a, but is presented similar to that of Table 9 for comparison. The total PDX1+ and NKX6.1+ numbers overlap with that of the NKX6.1+/PDX1+/CHGA− cell population (column 5 of Table 5a), so that the Table 5a populations overlap each other, eg 100% total cell count. Exceed. Table 5b contains PDX1+ only and triple negative (residual) data, which is not shown in Table 5a. Although certain of these iPEC grafts, as well as others using substantially similar formulations, were transplanted into animals to determine in vivo function, the levels of human serum C-peptide were determined to It was also not stable enough for the purpose (data not shown). The values shown are the percentage of total cells belonging to a given population. The number of pancreatic progenitors (NKX6.1(+)/PDX1(+)/chromogranin A(-)) and the very small population of NKX6.1+/PDX1-/CHGA- in suspension cell aggregates was hES. Consistent with what was observed in pancreatic progenitor cell suspension aggregates derived from cells, U.S. Patent Application No. 12/264,760, filed November 4, 2008, entitled STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHHODS OF DIFFERENTIONATION. Aggregation at the ESC stage as described in THEREOF and fully incorporated herein by reference. Levels of endocrine and/or endocrine progenitor cells are also fully incorporated herein by reference, US patent application Ser. No. 12/107,020 filed Apr. 8, 2008, entitled METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDORDER MELLS. It was substantially consistent with that obtained with hES-derived cell cultures in DERIVED FROM HES CELLS. Similar to suspension aggregates of hES-derived cells, varying the concentration of different growth factors in the medium at a particular stage of differentiation (eg, stage 4) may result in pancreatic endoderm, endocrine, PDX1-positive endoderm. Or it should increase and/or decrease a particular population of non-pancreatic cell types.

（実施例５）
ＰＥＣ受容体チロシンキナーゼ
上記の方法は、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）をもとにした下の表７に記載されるものと実質的に同じである。本明細書に記載されるこれらおよび他の方法は、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，９６４，４０２号；第８，２１１，６９９号；第８，３３４，１３８号；第８，００８，０７号；および第８，１５３，４２９号等の、出願人の多くの特許および非特許公開文書に見出すことができる。

(Example 5)
PEC Receptor Tyrosine Kinase The method described above is substantially the same as that described in Table 7 below based on Schulz et al. (2012), supra. These and other methods described herein are disclosed in US Pat. Nos. 7,964,402; 8,211,699; 8,334, the disclosures of which are fully incorporated herein by reference. No. 138; No. 8,008,07; and No. 8,153,429, which can be found in many of the applicant's patents and non-patent publications.

動物に移植されたｉＰＳ細胞および膵臓前駆体に上の方法を適用したとき、同じ方法をｈＥＳＣおよびｈＥＳ導出膵臓前駆体に適用したときと比較して、出願人は同じく安定した（ｒｏｂｕｓｔ）ｉｎｖｉｖｏ機能を一貫して得たとは限らない。ｉＰＳ細胞がｈＥＳＣの形態および遺伝子発現パターンを有し、ｉｎｖｉｔｒｏで胚様体およびｉｎｖｉｖｏでテラトーマを形成することができるヒト多能性幹細胞であり、それらが３つの胚葉全てからの細胞を形成することができることを示していることを考慮すると、これは意外であった。少なくとも、例えば上記の、Ｙｕら（２００７）；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号、国際特許出願公開ＷＯ２００５／８０５９８；米国特許出願公開第２００８／０２３３６１０号；および国際特許出願公開ＷＯ２００８／１１８８２、を参照。これらの参考文献は、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの定義基準を満たすことを記載する。したがって、完全に機能性のグルコース応答性細胞にｉｎｖｉｖｏでさらに成熟および発達する、ｈＥＳから導出された膵臓前駆細胞を与えるｉｎｖｉｔｒｏ分化プロトコルにおいて、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの代用となることができることが予想される。しかし、上の方法を使用する一貫しないｉｎｖｉｖｏ機能データを考慮し、出願人は、膵臓前駆体および／または膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、すなわち、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣで一貫して観察されているｉｎｖｉｖｏ機能の実質的に類似の安定したレベルを提供することが可能であるｈｉＰＳＣ（または「ｉＰＥＣ」）からのステージ４由来の細胞に特異的である分化培地の処方を探索しようと努めた。 When the above method was applied to iPS cells and pancreatic progenitors transplanted into animals, Applicants also found it to be robust in vivo compared to when the same method was applied to hESCs and hES-derived pancreatic progenitors. The function is not always obtained consistently. iPS cells are human pluripotent stem cells that have the morphology and gene expression pattern of hESCs and are capable of forming embryoid bodies and teratomas in vivo, which form cells from all three germ layers This was surprising given that it shows what can be done. At least, for example, Yu et al. (2007); U.S. Patent Application Publication 2009/0047263; International Patent Application Publication WO 2005/80598; U.S. Patent Application Publication 2008/0233610; and International Patent Application Publication WO 2008/11882, as described above. reference. These references describe that iPS cells meet the defining criteria of ESC. Therefore, it is expected that iPS cells can substitute for ESCs in an in vitro differentiation protocol that provides hES-derived pancreatic progenitor cells that further mature and develop in vivo into fully functional glucose-responsive cells. To be done. However, in view of inconsistent in vivo functional data using the above method, Applicants consistently observed in pancreatic progenitor and/or pancreatic endoderm cells (PEC), ie, PES derived from hESCs. Sought to find a formulation of differentiation medium that is specific to stage 4 derived cells from hiPSCs (or "iPECs") that is capable of providing substantially similar stable levels of in vivo function. It was

出願人は、ＰＥＣに存在する内分泌（ＣＨＧＡ＋細胞）細胞が複数ホルモン性内分泌細胞であり、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を有する島を生成するＰＥＣ中の細胞の亜集団でないことを前に報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）を参照されたい。むしろ、それは、非内分泌細胞集団（ＣＨＧＡ−細胞）、特に、ｉｎｖｉｖｏで機能性の島を実際に生成するＰＥＣであると考えられている、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ−１を共発現するものである。したがって、出願人は、内分泌および非内分泌亜集団の相対比をモジュレートするか、変化させるか、シフトすることが、後のｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼすかどうかを探索した。 Applicants have previously demonstrated that the endocrine (CHGA+ cells) cells present in PEC are multihormonal endocrine cells and are not a subpopulation of cells in PEC that produce islets with glucose responsive insulin secreting cells in vivo. reported. See Kelly et al. (2011) supra. Rather, it co-expresses a non-endocrine cell population (CHGA-cells), particularly NKX6.1 and PDX-1, which are believed to be the PECs that actually generate functional islets in vivo. is there. Accordingly, Applicants sought to see whether modulating, altering, or shifting the relative ratios of endocrine and non-endocrine subpopulations would affect subsequent in vivo function.

ｈＥＳＣで受容体−リガンドシグナル伝達を解読する以前の努力は、自己複製を促進する成長因子の同定に成功を収め、規定の培地培養条件の開発を可能にした。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照されたい。Ｗａｎｇらは、ＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２との二量体化を誘導し、その場面でｈＥＳＣの自己複製に影響を及ぼすリガンドとしてヘレグリン−１βを同定した。ＥＲＢＢは受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫは、成長因子および他の細胞外シグナル伝達分子の受容体として作用する、広く発現される膜貫通タンパク質である。リガンド結合の結果、それらは細胞質テール中の特定の残基でチロシンリン酸化を受け、ＲＴＫ媒介シグナル伝達に関与する他のタンパク質基質の結合のためのシグナル伝達カスケードを始動する。細胞の生存、増殖および運動性の調節を含むいくつかの発達過程におけるＲＴＫ機能、およびがん形成でのそれらの役割は文書で十分に立証されている。ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体は、発達中の胎児のヒト膵臓全体で発現されることも知られていたが、特定のＥＲＢＢ受容体およびそれらのリガンドの特異的役割は知られていない。Ｍａｒｉ−ＡｎｎｅＨｕｏｔａｒｉら（２００２）ＥＲＲＢＳｉｇｎａｌｉｎｇＲｅｇｕｌａｔｅｓＬｉｎｅａｇｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇＰａｎｃｒｅａｔｉｃＩｓｌｅｔＣｅｌｌｓｉｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４３（１１）：４４３７〜４４４６頁を参照されたい。 Previous efforts to decipher receptor-ligand signaling in hESCs have successfully identified growth factors that promote self-renewal and allowed the development of defined media culture conditions. See Wang et al. (2007) supra. Wang et al. identified heregulin-1β as a ligand that binds to ERBB3 and induces dimerization with ERBB2 and in that context affects hESC self-renewal. ERBB is a receptor tyrosine kinase (RTK), which is a widely expressed transmembrane protein that acts as a receptor for growth factors and other extracellular signaling molecules. As a result of ligand binding, they undergo tyrosine phosphorylation at specific residues in the cytoplasmic tail, triggering a signaling cascade for the binding of other protein substrates involved in RTK-mediated signaling. RTK functions in several developmental processes, including regulation of cell survival, proliferation and motility, and their role in carcinogenesis are well documented. The ERBB tyrosine kinase receptor was also known to be expressed throughout the developing fetal human pancreas, but the specific role of specific ERBB receptors and their ligands is unknown. Mari-Ane Huotari et al. (2002) ERRB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embronic Org.

上記Ｗａｎｇら（２００７）によって実証される胎児のヒト膵臓での多能性幹細胞の自己複製およびそれらの発現、ならびにヒト胎児膵臓でのＥＲＢＢＲＴＫ発現でのＥＲＢＢＲＴＫシグナル伝達の役割のために、次に出願人は、分化の間のＰＥＣ特定化、または自己複製の促進による増殖、または生理的に機能する島ホルモン分泌細胞へのｉｎｖｉｖｏ成熟を促進するいくつかの他の未知の機構を向上させる可能性がある受容体およびリガンドを同定する努力の中で、ｈＥＳＣから導出されたｉｎｖｉｔｒｏの膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）でＲＴＫの潜在的な活性化の調査に取りかかった。以下の変更を除いて実質的に表８に記載のように、分化凝集体の懸濁液でＰＥＣを生成した。 Because of the role of ERBB RTK signaling in the self-renewal of pluripotent stem cells and their expression in fetal human pancreas demonstrated by Wang et al. (2007) above, and ERBB RTK expression in human fetal pancreas, Applicants have improved PEC specification during differentiation, or proliferation by promoting self-renewal, or some other unknown mechanism that promotes in vivo maturation into physiologically functioning islet hormone-secreting cells. In an effort to identify potential receptors and ligands, we set out to investigate the potential activation of RTKs in hESC-derived in vitro pancreatic endoderm cells (PEC). PEC were generated in suspension of differentiated aggregates substantially as described in Table 8 with the following changes.

ＲＴＫブロット分析のために、４つのＰＥＣ試料を生成した。ｄｂ−Ｎ５０Ｋ５０Ｅ５０でのＰＥＣ凝集体の「定常状態」試料を、ステージ４の終わり（またはｄ１３）に収集した。「絶食させた」試料は、ｄｂ（ＤＭＥＭ高グルコースまたは０．５×Ｂ−２７サプリメント（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース）培地だけ（成長因子なし）を与え、ｄ１３に収集した、ｄ１２ＰＥＣ凝集体を表した。２つの「パルス投与」試料は、ｄ１２にｄｂ培地を与えてそこで培養し、次にｄ１３に、収集する前に１５分間、ｄｂ−Ｋ５０Ｅ５０培地または２％ＦＢＳ含有ｄｂ培地のいずれかを与えた。そのような条件は、ステージ４条件で活性であったＲＴＫの検出、ならびにＫＧＦ、ＥＧＦおよびインスリン（Ｂ２７サプリメントに存在する）または血清のパルス投与でどのような応答を導き出すことができるか検出することを意図した。血清パルス投与は、ＰＥＣに存在し、本ステージ４条件で活性化することができるが刺激されないＲＴＫを潜在的に同定する、広域な成長因子刺激を意図した。 Four PEC samples were generated for RTK blot analysis. A "steady state" sample of PEC aggregates on db-N50 K50 E50 was collected at the end of stage 4 (or d13). “Fasted” samples were fed with db (DMEM high glucose or DMEM high glucose supplemented with 0.5×B-27 supplement (Life Technologies)) medium only (no growth factors) and collected on d13, d12PEC coagulation. Represented a collection. Two "pulsed" samples were fed and cultured in db medium on d12, then on d13, either db-K50 E50 medium or db medium containing 2% FBS for 15 minutes before harvesting. .. Such conditions detect RTKs that were active in stage 4 conditions, and detect what response can be elicited by pulsed administration of KGF, EGF and insulin (present in B27 supplements) or serum. Intended. Serum pulse administration was intended for global growth factor stimulation, potentially identifying RTKs present in PEC that could be activated in this stage 4 condition but were unstimulated.

ＲＴＫ分析は、事実上前掲のＷａｎｇら（２００７）で前に記載される通りに実施した。簡潔には、ＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイ（Ｒ＆ＤＳｙｓｙｔｅｍｓ）を、製造業者の指示通りに使用した。１％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２．０ｍＭＥＤＴＡ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンでタンパク質溶解物を調製した。５００μｇの新鮮なタンパク質溶解物を、４２個の抗ＲＴＫ抗体および５つの陰性対照抗体のための重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）スポット、ならびに８つの抗ホスホチロシン陽性対照スポットの点在するニトロセルロース膜と一晩インキュベートした（図５Ａ）。配列された抗体はリン酸化および非リン酸化ＲＴＫの細胞外ドメインを捕捉し、結合したホスホＲＴＫは、化学発光を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた汎抗ホスホチロシン抗体で検出される。ＲＴＫアレイレイアウトについては図５を、ならびにアレイ中のＲＴＫの一覧については下の表８を参照されたい。

RTK analysis was performed essentially as previously described by Wang et al. (2007), supra. Briefly, Proteome Profiler™ human phospho-RTK antibody array (R&D Systems) was used as per manufacturer's instructions. Protein lysate with 1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% glycerol, 2.0 mM EDTA, 1.0 mM sodium orthovanadate, 10 μg/mL aprotinin, and 10 μg/mL leupeptin. Was prepared. 500 μg of fresh protein lysate was incubated overnight with nitrocellulose membranes interspersed with duplicate spots for 42 anti-RTK antibodies and 5 negative control antibodies, and 8 anti-phosphotyrosine positive control spots. (FIG. 5A). The sequenced antibody captures the extracellular domains of phosphorylated and non-phosphorylated RTKs, and the bound phospho-RTKs were detected with a pan-anti-phosphotyrosine antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) using chemiluminescence. It See Figure 5 for the RTK array layout, and Table 8 below for a list of RTKs in the array.

ＲＴＫブロットの分析（図６Ａ）は、ｈＥＳＣで以前に観察されたものと同様に、インスリン受容体およびＩＧＦ１受容体（それぞれＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ）が全ての条件でリン酸化され、活性化されたことを示した。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照されたい。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１としても知られる）は定常状態条件でリン酸化されたが、それはステージ４培地中のＥＧＦの存在を考慮すると予想されていたことである。実際、ＥＲＢＢ２の低レベルのリン酸化が、定常状態および絶食条件の両方で検出された。ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２の両方のリン酸化は各パルス投与条件で上昇し、リガンドのパルス投与に応答する活性化を検出するアッセイの能力を確認した。リン酸化されたＶＥＧＦＲ３も全ての条件で検出され、パルス投与試料で上昇した。このことは、ＰＥＣが内因性ＶＥＧＦＲ３リガンドを生成することを示唆し、可能性のある候補はＶＥＧＦ−ＣおよびＤであった。血清パルス投与は、低レベルのＥＲＢＢ３リン酸化を含め、さらなる受容体を活性化するようであった。リン酸化ＥＲＢＢ２／３の検出は、ヘレグリン様ＥＧＦファミリーメンバーがＰＥＣでシグナル伝達を活性化することができることを示唆する。ＴＩＥ−２は２つのアンギオポエチン受容体の１つであり、血清に応答して低いレベルでリン酸化されるようであった。アンギオポエチン１およびアンギオポエチン４はＴｉｅ−２のリガンドを活性化することが公知であるが、アンギオポエチン２およびアンギオポエチン３は、場面依存性競合的アンタゴニストとして機能する。ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）も血清パルス投与に応答してリン酸化され、肝細胞成長因子もＰＥＣでシグナル伝達を導き出すことができることを示唆した。最後に、エフリンＢ２ＲＴＫ（ＥＰＨＢ２）の低レベルのリン酸化が検出されたが、エフリン／Ｅｐｈシグナル伝達は膜結合細胞間シグナル伝達系であり、ＰＥＣ分化で容易に活用されるようではない。興味深いことに、ＥＲＢＢ４はリン酸化されなかった。したがって、ＲＴＫ分析は、ＰＥＣでリン酸化されるか、または異なる条件、例えば血清に応答してリン酸化することができるいくつかの受容体を鮮明にした。これらの結果は、いくつかの可溶性リガンドがＰＥＣでＲＴＫシグナル伝達を導き出すことができ、細胞の増殖、分化および／または特定化に潜在的に影響を与え、したがって、機能性の膵島への後のｉｎｖｉｖｏ成熟に潜在的に影響を及ぼすことができることを示唆する。 Analysis of RTK blots (FIG. 6A) showed that insulin and IGF1 receptors (IR and IGF1R, respectively) were phosphorylated and activated under all conditions, similar to those previously observed in hESCs. Indicated. See Wang et al. (2007) supra. The EGF receptor (EGFR, also known as ERBB1) was phosphorylated under steady state conditions, which was expected to account for the presence of EGF in stage 4 medium. In fact, low levels of ERBB2 phosphorylation were detected in both steady state and fasted conditions. Phosphorylation of both EGFR and ERBB2 was elevated at each pulsing condition, confirming the assay's ability to detect activation in response to pulsing ligand. Phosphorylated VEGFR3 was also detected in all conditions and was elevated in pulsed samples. This suggested that PECs produce endogenous VEGFR3 ligands, potential candidates were VEGF-C and D. Serum pulse administration appeared to activate additional receptors, including low levels of ERBB3 phosphorylation. Detection of phosphorylated ERBB2/3 suggests that heregulin-like EGF family members are able to activate signaling at PEC. TIE-2 is one of the two angiopoietin receptors and appeared to be phosphorylated at low levels in response to serum. Angiopoietin 1 and angiopoietin 4 are known to activate ligands for Tie-2, while angiopoietin 2 and angiopoietin 3 function as scene-dependent competitive antagonists. The HGF receptor (HGFR) was also phosphorylated in response to serum pulse administration, suggesting that hepatocyte growth factor may also elicit signaling at PEC. Finally, low levels of phosphorylation of the EphrinB2 RTK (EPHB2) were detected, but Ephrin/Eph signaling is a membrane-bound intercellular signaling system and does not appear to be readily utilized in PEC differentiation. Interestingly, ERBB4 was not phosphorylated. Therefore, RTK analysis revealed several receptors that could be phosphorylated on PEC or phosphorylated in response to different conditions, such as serum. These results indicate that some soluble ligands can elicit RTK signaling in PECs, potentially affecting cell proliferation, differentiation and/or specification and, thus, subsequent to functional islets. It suggests that it can potentially influence maturation in vivo.

（実施例６）
ヘレグリンおよびＦＧＦ２成長因子は、ｈＥＳＣ組成物から導出されたＰＥＣに影響を及ぼす
上の実施例５に記載のように特定の条件下で特定のＲＴＫが活性化（またはリン酸化）されることを実証したＲＴＫ分析を考慮し、また、少なくともＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３がＰＥＣで活性化される（ステージ１〜４から１３日間の分化後に）ようであったので、出願人はステージ３および４の細胞に適用したときのヘレグリンの影響を判定しようと努めた。 (Example 6)
Heregulin and FGF2 Growth Factor Affect PECs Derived from hESC Compositions Demonstrating that Specific RTKs are Activated (or Phosphorylated) Under Certain Conditions as described in Example 5 above. Applicants applied to cells of stages 3 and 4 considering that at least ERBB2 and ERBB3 appeared to be activated in PECs (after stages 1-4 of 13 days of differentiation). I tried to determine the effect of heregulin.

ヘレグリンおよびＦＧＦを使用して予備研究を実施した。これらの研究の特定のものに、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２が含まれた。これらの予備研究は、１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン−１β（Ｗａｎｇら（２００７）に開示されるのと同じ濃度およびヘレグリン異性体）によるステージ１での１日間の多能性幹細胞の処置は、ヘレグリン−１β（Ｈｒｇ１β）のない懸濁培養でのｈＥＳ導出細胞凝集体の凝集体サイズと比較して、懸濁培養でｈＥＳ導出細胞凝集体の細胞凝集体サイズを増加させた。細胞凝集体サイズの増加は、動物での後の移植および機能検査のためにより大きな細胞量をもたらす点で有利である。さらに、Ｈｒｇ１βがステージ３で１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬに増加したとき、凝集体ディスクサイズが増加した。この結果は、ＦＧＦ２の不在下での培養と比較して５０ｎｇ／ｍＬの別の成長因子、ＦＧＦ２がステージ３で使用されたときも観察された。細胞凝集体サイズの増加は、ステージ３培養をＦＧＦ２曝露にさらなる日数、例えば２日間と比較して３日間の５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２に曝露させたときも観察された。 Preliminary studies were performed using heregulin and FGF. Specific to these studies included the Rho kinase inhibitor, Y-27632. These preliminary studies showed that treatment of pluripotent stem cells for 1 day in stage 1 with 10 ng/mL heregulin-1β (same concentration and heregulin isomers as disclosed in Wang et al. (2007)) resulted in heregulin-1β. The cell aggregate size of hES-derived cell aggregates was increased in suspension culture compared to the aggregate size of hES-derived cell aggregates in suspension culture without (Hrg1β). Increasing cell aggregate size is advantageous in that it results in greater cell mass for subsequent transplantation and functional tests in animals. Moreover, aggregate disk size increased when Hrg1β increased from 10 ng/mL to 50 ng/mL in stage 3. This result was also observed when 50 ng/mL of another growth factor, FGF2, was used in stage 3 compared to cultures in the absence of FGF2. Increased cell aggregate size was also observed when stage 3 cultures were exposed to FGF2 exposure for additional days, eg, 50 ng/mL FGF2 for 3 days compared to 2 days.

表９は、ステージ３および／またはステージ４にＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２で処置したＰＥＣ細胞のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。内分泌細胞はＣＨＧＡ陽性（またはＣＨＧＡ＋）細胞と表し、非内分泌細胞はＣＨＧＡ陰性（またはＣＨＧＡ−）細胞と表す。内分泌物（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−）は、他のマーカーで陽性に染色することができ、例えばＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１に陽性に染色される。試験したマーカーのいずれにも染色しない細胞は、三重陰性細胞または残留細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１−／ＰＤＸ１）と表す。

Table 9 provides a summary of flow cytometric analysis of PEC cells treated with Hrg1β and FGF2 at stage 3 and/or stage 4. Endocrine cells are designated as CHGA positive (or CHGA+) cells and non-endocrine cells are designated as CHGA negative (or CHGA-) cells. Endocrine (CHGA+) and non-endocrine cells (CHGA-) may stain positive with other markers, for example PDX1 and/or NKX6.1. Cells that do not stain any of the tested markers are designated as triple negative cells or residual cells (CHGA-/NKX6.1-/PDX1).

細胞凝集体サイズの増加がＰＥＣ亜集団に影響を及ぼすかどうか判定するために、ＰＥＣ集団の組成物をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を分化するためにＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２が使用されなかった対照培養と比較して、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６１．２％に増加し、ステージ３で５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６４．２％に増加した。内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）は、１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの処置であまり影響を受けなかったが、５０ｎｇ／ｍＬでよりそうであった。一方、残留細胞の相対レベルは減少し、５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βでより減少した。したがって、Ｈｒｇ１β処置による細胞凝集体サイズの増加は、内分泌および残留亜集団と比較して非内分泌亜集団の増加に大部分帰された。 The composition of the PEC population was analyzed by flow cytometry to determine if the increase in cell aggregate size affected the PEC subpopulation. Compared to control cultures in which Hrg1β and FGF2 were not used to differentiate cells, the PEC non-endocrine subpopulation (CHGA-) was 54.01% to 61.% in stage 3 with the addition of 10 ng/mL Hrg1β. 2% and increased from 54.01% to 64.2% by addition of 50 ng/mL Hrg1β in stage 3. The endocrine subpopulation (CHGA+) was less affected by treatment with 10 ng/mL Hrg1β, but more so at 50 ng/mL. On the other hand, the relative level of residual cells was decreased, more at 50 ng/mL Hrg1β. Therefore, the increase in cell aggregate size by Hrg1β treatment was largely attributed to the increase in non-endocrine subpopulations compared to endocrine and residual subpopulations.

ステージ３培養でのＦＧＦ２の影響も同様であったが、Ｈｒｇ１βのそれよりさらに顕著であった。例えば、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、Ｈｒｇ１βでそうであったように増加した。これらの培養でのＦＧＦ２の主要な影響は、内分泌亜集団の実質的な減少であった。ある場合には、これらの細胞は、３日間の処置でほとんど検出不能であった（３２．９％から０．３３％）。したがって、ＦＧＦ２で処置した培養の細胞凝集体サイズの増加は、非内分泌、一部の場合には残留細胞亜集団の増加（ステージ３の３日間で１３．１％から２２．７％）に大部分帰された。 The effect of FGF2 in stage 3 cultures was similar, but even more pronounced than that of Hrg1β. For example, the PEC non-endocrine subpopulation (CHGA-) increased as it did with Hrg1β. The major effect of FGF2 in these cultures was a substantial reduction in endocrine subpopulations. In some cases these cells were almost undetectable after 3 days of treatment (32.9% to 0.33%). Therefore, the increase in cell aggregate size in cultures treated with FGF2 was largely due to non-endocrine, and in some cases to an increase in residual cell subpopulations (13.1% to 22.7% over 3 days in stage 3). Partially attributed.

したがって、ヘレグリンおよび／またはＦＧＦ２は、ＰＥＣ集団での細胞の特定化において役割を果たすようである。多能性幹細胞との関連で使用されるとき、ヘレグリン単独で細胞再生において役割を果たすと上記のＷａｎｇら（２００７）が報告したことを考慮すると、これは意外である。 Thus, heregulin and/or FGF2 appear to play a role in cell specification in the PEC population. This is surprising given the report by Wang et al. (2007) above that heregulin alone plays a role in cell regeneration when used in the context of pluripotent stem cells.

（実施例７）
ヘレグリンによるｉＰＳ由来の細胞培養物の処置によってＰＥＣのｉｎｖｉｖｏ移植片機能を向上させる方法
ｉＰＥＣを生成するためにｉＰＳＣに適用したときの表７による方法は、動物で安定したｉｎｖｉｖｏ機能を提供しなかったので、出願人はｉＰＥＣ生成のための他の方法を探索した。表７に示す標準方法の変更としては、限定されずに以下のものが挙げられる：任意のｉＰＳＣの継代回数の最適化；ＢＭＰシグナル伝達のレベルをモジュレートすること；増大および分化の間のｉＰＳＣ懸濁凝集パラメータをモジュレートすること（例えばせん断力、回転速度等）；成長因子、例えばＷｎｔ、アクチビンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の濃度、使用時期および使用期間の最適化；ならびに、分化プロトコルの１から４の様々なステージでの、細胞の量、増殖、分化、生存等を向上させるための候補としての他の成長因子による処置（例えばＥＲＢＢリガンド）。ステージ１〜４の間のｉＰＳＣの分化方法をどのように最適化することができるか判断するために、これらの多くの反復実験を単独で、または組合せで検証した。そのような最適化された分化方法は、移植したときに、ｈＥＳＣについて観察および報告されたものに類似した安定したグルコース応答性インスリン分泌細胞をｉｎｖｉｖｏでもたらしたｉＰＥＣ集団を生成する。下の表１０は、後にｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性島細胞に成熟するｉＰＥＣにｉＰＳＣを分化させることが実証された、ヘレグリンの有る無しのベースライン条件を記載する。ベースライン条件は、ヘレグリンがステージ３および４で加えられたこと以外、本明細書の実施例１、２および５ならびに表７に記載されるものに類似していた。３０ｎｇ／ｍＬのΗｒｇ１βを使用したが、１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの濃度、または５０ｎｇ／ｍＬを超える濃度でさえも適する。さらに、実施例２に記載の通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙー２７６３２の添加が分化培養で維持された。

(Example 7)
Method of Improving In Vivo Graft Function of PECs by Treatment of iPS-Derived Cell Culture with Heregulin The method according to Table 7 when applied to iPSCs to produce iPECs provides stable in vivo function in animals. Since not, Applicants searched for other methods for iPEC generation. Modifications of the standard method shown in Table 7 include, but are not limited to: optimization of the passage number of any iPSC; modulating the level of BMP signaling; during expansion and differentiation. Modulating iPSC suspension aggregation parameters (eg shear force, rotation rate, etc.); concentration of growth factors such as Wnt, activin and rho kinase inhibitors, optimization of when and when to use; and one of the differentiation protocols Treatment with other growth factors as candidates to improve cell mass, proliferation, differentiation, survival, etc. at various stages from 4 to 4 (eg ERBB ligand). Many of these replicates were tested alone or in combination to determine how the differentiation method of iPSCs during stages 1-4 could be optimized. Such an optimized differentiation method produces iPEC populations that, when transplanted, resulted in stable glucose-responsive insulin secreting cells in vivo similar to those observed and reported for hESCs. Table 10 below lists baseline conditions with and without heregulin that were demonstrated to differentiate iPSCs into iPECs that later mature into glucose-responsive islet cells in vivo. Baseline conditions were similar to those described in Examples 1, 2 and 5 herein and Table 7 except heregulin was added at

stages

3 and 4. 30 ng/mL Hrglβ was used, but concentrations from 10 ng/mL to 50 ng/mL, or even above 50 ng/mL are suitable. Furthermore, as described in Example 2, the addition of the Rho kinase inhibitor Y-27632 was maintained in the differentiation culture.

ステージ３および４の細胞亜集団に及ぼすヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の添加の影響を判定するために、ｉＰＥＣ集団をフローサイトメトリーによって分析した。表１１は、表１０に示す配合、ならびにアクチビン濃度を２００ｎｇ／ｍＬに増加させることによって改変した配合を使用した、様々なｉＰＥＣ集団のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。さらに、表１１は、各セットの実験（ヘレグリンの有る無しのベースライン）で用いた一般的な条件、およびｉＰＥＣ集団中の細胞型（内分泌、非内分泌、ＰＤＸ１だけおよび三重陰性または残留細胞亜集団）の相対的百分率を示す。表１１は、各実験で生成された細胞のｉｎｖｉｖｏ機能に関するデータも開示する。

The iPEC populations were analyzed by flow cytometry to determine the effect of addition of heregulin or heregulin and rho kinase inhibitors on

stage

3 and 4 cell subpopulations. Table 11 provides a summary of flow cytometric analysis of various iPEC populations using the formulation shown in Table 10 as well as the formulation modified by increasing activin concentration to 200 ng/mL. In addition, Table 11 shows the general conditions used in each set of experiments (baseline with and without heregulin) and cell types in the iPEC population (endocrine, non-endocrine, PDX1 alone and triple negative or residual cell subpopulations). ) Indicates the relative percentage. Table 11 also discloses data regarding the in vivo function of cells generated in each experiment.

特定の条件において、ＰＥＣ（ｈＥＳＣ、Ｅ２３５４）およびｉＰＥＣ（Ｅ２３１４、Ｅ２３４４、Ｅ２３４７）集団中の細胞亜集団の比は変化した。例えば、時には、ベースライン（ヘレグリンなし）条件と比較して、内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の百分率は減少し、非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋）の百分率は増加した。ヘレグリンがこれらのＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団中の非内分泌細胞と比較した内分泌細胞の割合の変化の原因となるようであったが、実験＃２３８０（Ｅ２３８０）では、ヘレグリンの添加によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞のレベルは減少せずに増加した。 In certain conditions, the ratio of cell subpopulations in the PEC (hESC, E2354) and iPEC (E2314, E2344, E2347) populations changed. For example, at times, the percentage of endocrine (CHGA+) cells was reduced and the percentage of non-endocrine cells (CHGA−/NKX6.1+/PDX1+) was increased compared to baseline (no heregulin) conditions. Heregulin appeared to be responsible for the change in the proportion of endocrine cells compared to non-endocrine cells in these PEC and iPEC populations, whereas in experiment #2380 (E2380), addition of heregulin resulted in a decrease in endocrine (CHGA+) cells. The level increased without decreasing.

ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団の構成の変化がｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、表１１に記載される大部分の実験からのＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片を、実質的に本明細書ならびに上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）およびＫｒｏｏｎら（２００８）、および上記の米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を含む出願人の他の特許および非特許出版物に前述の通り、マウスに移植した。簡潔には、ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生分解性の半透過性細胞封入デバイスに全て封入し、そのいくつかは微穿孔を含んでいた。デバイスは出願人によって製造され、２００９年１１月１３日に出願された米国特許第８，２７８，１０６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＣＥＬＬＳＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳで詳細に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを、移植の約５６日後から実施した。グルコース投与の前（空腹時）、およびグルコース投与の３０分後および／または６０分後の組合せで血液を収集した。グルコース投与に応答した血清中のヒトＣペプチド濃度を測定することによって、移植片機能を評価した。 To determine if alterations in the composition of the PEC and iPEC populations affected in vivo function, PEC and iPEC implants from most of the experiments described in Table 11 were used herein substantially and as described herein. Schulz et al. (2012) and Kroon et al. (2008) supra, and US Pat. Nos. 7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 and 8,278,106, supra. Were transplanted into mice as previously described in Applicants' other patents and non-patent publications including. Briefly, PEC and iPEC populations were all encapsulated in biodegradable semipermeable cell encapsulation devices, some of which contained microperforations. The device was manufactured by the applicant and is described in detail in US Pat. No. 8,278,106, filed Nov. 13, 2009, entitled ENCAPSURATION OF PANCREATIC CELLS FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. It is fully incorporated into the specification. The glucose stimulated insulin secretion (GSIS) assay was performed approximately 56 days after transplantation. Blood was collected prior to glucose administration (fasting) and 30 and/or 60 minutes after glucose administration. Graft function was assessed by measuring human C-peptide concentration in serum in response to glucose administration.

血清に放出されるヒトＣペプチドの量は、放出されるインスリンの量の指標となる。ＣペプチドはプロインスリンおよびプレプロインスリンのＡおよびＢ鎖を接続または連結する短い３１アミノ酸ペプチドであり、機能性ベータまたはインスリン分泌細胞によって分泌される。上記Ｋｒｏｏｎら（２００８）および他によって前述される通り、ヒトＣペプチドの測定は、移植細胞による新規生成インスリンの放出の評価に適当である。したがって、これらの動物の血清中のヒトＣペプチドのレベルは、成熟したＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片のｉｎｖｉｖｏ機能の尺度である。ヒトＣペプチドは、移植後少なくとも８週までに血清で検出された。追加の数週の移植および絶食により、グルコース刺激Ｃペプチドレベルは増加し、Ｃペプチドのピークレベルはグルコース投与の６０分後から３０分後にシフトし、それは、インスリン細胞の成熟に従う、グルコース投与へのより速い応答の指標となる。機能を示すことができなかったか、不良な健康状態のために屠殺された少数のマウスがいた。しかし、これらのマウスはさもなければ高機能を示した動物のコホート中にあり、したがって、移植細胞が分化して機能する能力がないということよりも移植の失敗を示唆した。 The amount of human C-peptide released into serum is an indicator of the amount of insulin released. C-peptide is a short 31 amino acid peptide that connects or links the A and B chains of proinsulin and preproinsulin and is secreted by functional beta or insulin secreting cells. As described previously by Kroon et al. (2008) and others, measurement of human C-peptide is suitable for assessing the release of newly produced insulin by transplanted cells. Therefore, the level of human C-peptide in the serum of these animals is a measure of the in vivo function of mature PEC and iPEC grafts. Human C-peptide was detected in serum by at least 8 weeks after transplantation. With additional weeks of transplantation and fasting, glucose-stimulated C-peptide levels increased and peak levels of C-peptide shifted from 60 to 30 minutes after glucose administration, which was dependent on insulin cell maturation to glucose administration. It is an indicator of faster response. There were a few mice that either failed to show function or were sacrificed because of poor health. However, these mice were in a cohort of otherwise highly functional animals, thus suggesting transplant failure rather than the inability of the transplant cells to differentiate and function.

図７Ａ〜Ｃは、Ｅ２３４４以外の表１１に示す実験の全てについての、グルコース投与後の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。図７Ａ〜Ｃは、ベースライン対照と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片が血清中ヒトＣペプチドのより高いレベルを一般に有したことを示す。例えば、図７Ａでは実験２３８０において、ヘレグリンなしで調製したもの（ベースライン）と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片の約５倍の増加（グルコース投与の６０分後に９３３ｐＭ：２００ｐＭ）がある。実験２３５４（図７Ｃ）はベースライン対照と比較してヘレグリン処置からもたらされた移植片で血清Ｃペプチドのより高いレベルを示さないので、ヘレグリンは、ｈＥＳＣから生成されるＰＥＣにより少ない影響を及ぼすようである。さらに、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣ（ＣｙＴ２０３）とｉＰＳＣから導出されたｉＰＥＣを比較すると、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同等の機能をｉｎｖｉｖｏで有する（例えば、図７Ａおよび図７Ｂ（ｉＰＳＣ移植片）を図７Ｃ（ＣｙＴ２０３ｈＥＳＣ）と比較する）。このように、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同じくらい頑強である。さらに、内分泌および非内分泌亜集団で同じシフトを有しなかったＥ２３８０からのｉＰＥＣも優れた機能を示したので、ｉＰＥＣ集団のいくつか（例えばＥ２３１４、Ｅ２３４７およびＥ２３５４）に影響を及ぼすように見えた、内分泌細胞対非内分泌細胞の相対比は、ｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないようであった（図７Ａ〜Ｃを参照）。 7A-C show human C-peptide levels in serum after glucose administration for all of the experiments shown in Table 11 except E2344. 7A-C show that grafts resulting from heregulin treatments generally had higher levels of human C-peptide in serum compared to baseline controls. For example, in FIG. 7A, in experiment 2380, an approximately 5-fold increase in grafts resulting from heregulin treatment (933 pM: 200 pM 60 minutes after glucose administration) compared to those prepared without heregulin (baseline). There is. Heregulin has less effect on PECs generated from hESCs, as experiment 2354 (FIG. 7C) does not show higher levels of serum C-peptide in grafts resulting from heregulin treatment compared to baseline controls. It seems Furthermore, comparing hESC-derived PECs (CyT203) and iPSC-derived iPECs, iPEC grafts have similar functions in vivo to PEC grafts (eg, FIGS. 7A and 7B (iPSC transplantation). (Compare one) with FIG. 7C (CyT203 hESC)). Thus, iPEC implants are as robust as PEC implants. In addition, iPECs from E2380, which did not have the same shifts in endocrine and non-endocrine subpopulations, also showed superior function and appeared to affect some of the iPEC populations (eg E2314, E2347 and E2354). , The relative ratio of endocrine cells to non-endocrine cells did not appear to affect in vivo function (see Figures 7A-C).

グルコース刺激インスリン分泌を試験することに加えて、宿主動物のベータ細胞を破壊した場合に、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣによって維持される正常血糖と同様の正常血糖をそれらが単独で維持することができるかどうか判定するために、成熟したｉＰＥＣ移植片を試験した。これは、ヒトベータ細胞と比較してマウスベータ細胞に対してより強い細胞毒性を示すベータ細胞毒素、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用して、移植されたマウスのベータ細胞を破壊することを必要とした。ＳＴＺ処置の前後に各マウスについて、ランダムな非絶食血中グルコースを測定した。ＳＴＺ処置から１３日目のｉＰＥＣ移植片の外植の結果、高血糖が再開した（血中グルコースの急騰を記す）が、それは内因性マウス膵臓ではなくｉＰＥＣ移植片による血糖症の制御を実証する（図８Ａおよび図８Ｂを参照する）。 In addition to testing glucose-stimulated insulin secretion, they are capable of independently maintaining normoglycemia similar to that maintained by hESC-derived PEC when beta cells of host animals are destroyed. Mature iPEC implants were tested to determine if. This involved destroying the transplanted mouse beta cells with the beta cytotoxin, streptozotocin (STZ), which is more cytotoxic to mouse beta cells compared to human beta cells. Random, non-fasted blood glucose was measured for each mouse before and after STZ treatment. Explantation of iPEC grafts 13 days after STZ treatment resulted in resumption of hyperglycemia (noting a spike in blood glucose), demonstrating control of glycemia by the iPEC grafts but not the endogenous mouse pancreas. (See Figures 8A and 8B).

さらに、分化のステージ１〜４の間にヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤が与えられたときに、相乗効果があるようであった（表１０を参照する）。例えば、ｒｈｏキナーゼ阻害剤なしでステージ３および４でヘレグリンによって処置したｉＰＳＣは、目にみえて劣る細胞量をもたらし、移植を不可能にした。ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の相乗効果のさらなる傍証が、実験のいくつか、例えばＥ２３５６、Ｅ２３８０で明白であったが、そこではｒｈｏキナーゼ阻害剤単独によるベースライン条件は、ｒｈｏキナーゼ阻害剤とヘレグリンによる移植片と同じくらい安定的には機能しなかった（図７ＡおよびＢを参照）。ヘレグリン単独の添加が提供した細胞量は移植に不十分であり、ｒｈｏキナーゼ阻害剤単独の添加（ベースライン条件）は不良なｉｎｖｉｖｏ機能を有したので、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤による処置は相加的でなかったようである。このように、ヘレグリンだけまたはｒｈｏキナーゼ阻害剤だけの提供は、２つを組み合わせた合計の影響に実質的に同等でない。すなわち、単独ではいずれもｉｎｖｉｖｏで安定したグルコース応答性をもたらさないが、組み合わせるとそれらはｈＥＳ由来の細胞のそれと同等のグルコース応答性をもたらす。したがって、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の両方の提供は、それらの組み合わせた影響が各々別々の影響の合計より大きいので相乗的であるようであった。すなわち、ｒｈｏキナーゼ阻害剤およびヘレグリンで処置したｉＰＥＣはｉｎｖｉｖｏで成熟してグルコース刺激インスリン分泌を示し、糖尿病マウスモデルで正常血糖を維持することができた（図７Ａ〜Ｂおよび図８Ａ〜Ｂを参照されたい）。 Furthermore, there appeared to be a synergistic effect when given heregulin and rho kinase inhibitors during stages 1-4 of differentiation (see Table 10). For example, iPSCs treated with heregulin at stages 3 and 4 without rho-kinase inhibitor resulted in a visually inferior cell mass, rendering transplantation impossible. Further support for the synergistic effect of heregulin and rho kinase inhibitors was evident in some of the experiments, eg E2356, E2380, where the baseline condition with rho kinase inhibitor alone was due to rho kinase inhibitor and heregulin. It did not function as stably as the implant (see Figures 7A and B). Treatment with heregulin and rho kinase inhibitors was phased because addition of heregulin alone provided insufficient cell mass for transplantation and addition of rho kinase inhibitor alone (baseline conditions) had poor in vivo function. It didn't seem to be additive. Thus, the provision of heregulin alone or rho kinase inhibitor alone is not substantially equivalent to the combined effect of the two. That is, none alone yields stable glucose responsiveness in vivo, but when combined they yield glucose responsiveness comparable to that of hES-derived cells. Thus, the provision of both heregulin and rho kinase inhibitors appeared to be synergistic as their combined effects were each greater than the sum of their separate effects. That is, iPECs treated with rho kinase inhibitor and heregulin matured in vivo and showed glucose-stimulated insulin secretion and were able to maintain normoglycemia in a diabetic mouse model (Figs. 7A-B and 8A-B. See).

ＥＲＢＢ機能性は、リガンド結合、受容体二量体化および受容体輸送を必要とする。各過程での変動は、受容体およびそれらが制御する下流シグナルの差次的調節をもたらす場合がある。例えば、異なるＥＲＢＢリガンドはＥＲＢＢ受容体に異なる親和性で結合し、それによってＥＲＢＢ二量体構成体のパターンおよび動態力学を変化させる。表１２は、リガンドおよび受容体結合複合体の多くの可能な異なる組合せを示す。この系の複雑性に関するレビューは、Ｏｄａら（２００５）Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｐａｔｈｗａｙｍａｐｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、１（２００５）およびＬａｚｚａｒａら（２００９）ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｏｄｅｌｉｎｇｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅＥＲＢＢｓｙｓｔｅｍｏｆｃｅｌｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ３１５（４）：７１７〜７２５頁によって提供され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。

ERBB functionality requires ligand binding, receptor dimerization and receptor transport. Variations in each process may result in differential regulation of receptors and the downstream signals they control. For example, different ERBB ligands bind to the ERBB receptor with different affinities, thereby altering the pattern and kinetics of the ERBB dimer construct. Table 12 shows many possible different combinations of ligand and receptor binding complexes. A review of the complexity of this system can be found in Oda et al. Syst. Biol. 1 (2005) and Lazzara et al. (2009) Quantitative modeling perspec- tives on the ERBB system of cell regulatory processes; Incorporated.

Ｈｕｏｔａｒｉらは、ニューレグリン−４がグルカゴン（アルファ）細胞を代償にしてソマトスタチン（デルタ）細胞の数を増加させることによって内分泌細胞亜集団の相対レベルをモジュレートすることができること、およびニューレグリン−４は、内分泌（例えば、β−インスリン、α−グルカゴン、δ−ソマトスタチン、ＰＰ−膵臓ポリペプチド）細胞に対する外分泌（例えば、アミラーゼ）細胞の比に影響を及ぼさないことを示唆した。しかし、これらの研究は、Ｅ１２．５日目のマウスから得られたホールマウント器官組織培養の上でニューレグリン−４をインキュベートすることによって実施された。これらのマウス外植細胞集団は、本明細書に記載されるステージ３（例えばＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞集団よりさらに分化していた。ニューレグリン−４はＥＲＢＢ４ＲＴＫだけに結合するので、ホールマウントマウス培養物の内分泌亜集団だけをこの関係においてニューレグリン−４によってモジュレートすることができる。したがって、Ｈｒｇ１はＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２／３の二量体化を誘導することが既に示されているので、本明細書に記載されるように、異なるＥＲＢＢリガンド、例えばＨｒｇ１によるステージ３（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞の処置が、Ｈｕｏｔａｒｉにおけるように相対的な内分泌亜集団をモジュレートするとは予想され得ない。しかし、図６に示すようにＰＥＣでのＥＲＢＢ２および３の低レベルの発現のために、ステージ３および４型の細胞が低いレベルか高いレベルのＥＲＢＢ２および３を発現してＨｒｇ１に結合するかどうかは不明であった。 Huotari et al., Neuregulin-4 can modulate the relative levels of endocrine cell subpopulations by compensating for glucagon (alpha) cells and increasing the number of somatostatin (delta) cells, and neuregulin-4. Suggested that it had no effect on the ratio of exocrine (eg amylase) cells to endocrine (eg β-insulin, α-glucagon, δ-somatostatin, PP-pancreatic polypeptide) cells. However, these studies were performed by incubating neuregulin-4 on whole mount organ tissue culture obtained from E12.5 day mice. These mouse explant cell populations were more differentiated than the stage 3 (eg PDX1-negative foregut endoderm) and/or stage 4 (PDX1-positive foregut endoderm) cell populations described herein. Since neuregulin-4 binds only to the ERBB4 RTK, only the endocrine subpopulation of whole mount mouse cultures can be modulated by neuregulin-4 in this context. Therefore, Hrg1 has previously been shown to bind to ERBB3 and induce dimerization of ERBB2/3, and thus, as described herein, different ERBB ligands, such as Stage 3 (PDX1) by Hrg1. Treatment of (negative foregut endoderm) and/or stage 4 (PDX1-positive foregut endoderm) cells could not be expected to modulate relative endocrine subpopulations as in Huoutari. However, whether low expression of ERBB2 and 3 in PECs resulted in low or high levels of ERBB2 and 3 expression and binding to Hrg1 as shown in FIG. Was unknown.

さらに、異なる場面で、出願人はＨｒｇ１がＥＲＲＢ２／３に結合して、多能性幹細胞の自己複製を促進したことを記載していた（Ｗａｎｇら（２００７）を参照する）。Ｈｒｇ１がステージ３および４の場面で同じ能力で作用することができる可能性があるが、出願人はＰＥＣの生成のための大部分の細胞増大が多能性幹細胞ステージ（ステージ０）で起こることを以前に記載した。ステージ０の間、ｈＥＳＣは約二（２）週の間成長、継代および増殖させられる。したがって、細胞増殖または細胞増殖をもたらす自己複製のほとんどは、ステージ１〜４の間には起こらない。上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）を参照されたい。さらに、ＥＲＲＢ２／３がステージ３および４の間に存在すると仮定すると、誘導される分化に影響を与えるのと反対に多能性幹細胞と同様の効果（自己複製）をヘレグリンが有すると予想し得る。そうすると、機能の差は、場面に、すなわち多能性幹細胞か、内胚葉または膵臓系列の細胞型かに依存するようである。 Moreover, in different contexts, Applicants have described that Hrg1 bound to ERRB2/3 and promoted self-renewal of pluripotent stem cells (see Wang et al. (2007)). Although it is possible that Hrg1 could act at the same capacity in stages 3 and 4, Applicants have shown that most of the cell expansion for PEC production occurs at the pluripotent stem cell stage (stage 0). Were previously described. During stage 0, hESCs are grown, passaged and expanded for approximately two (2) weeks. Therefore, most of the cell proliferation or self-renewal leading to cell proliferation does not occur during stages 1-4. See Schulz et al. (2012) supra. Moreover, assuming that ERRB2/3 is present between stages 3 and 4, heregulin may be expected to have a similar effect (self-renewal) as pluripotent stem cells as opposed to affecting induced differentiation. .. The functional differences then appear to be context-dependent, ie pluripotent stem cells or endodermal or pancreatic lineage cell types.

要約すると、前腸内胚葉（ステージ３）およびＰＤＸ１発現膵臓内胚葉細胞（ステージ３の終わりおよびステージ４）へのヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏでの提供は、移植されたときにｉｎｖｉｖｏで成熟してグルコース応答性インスリン分泌細胞に発達するＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生成した（図７および８を参照する）。ヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のそのような使用は、ここで初めて報告された。そのような使用および影響は、特許または非特許文献で前に記載されたものからは認識できない。 In summary, in vitro donation of heregulin or heregulin and rho kinase inhibitors to foregut endoderm (stage 3) and PDX1-expressing pancreatic endoderm cells (end of stage 3 and stage 4) was demonstrated when transplanted. We generated PEC and iPEC populations that mature in vivo and develop into glucose-responsive insulin secreting cells (see Figures 7 and 8). Such use of heregulin or heregulin and rho kinase inhibitors was first reported here. Such uses and effects are invisible to those previously described in patent or non-patent literature.

本明細書に記載されるＱ−ＰＣＲ結果は免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってさらに確認することができ、当業者が容易に実施することができることが理解される。 It is understood that the Q-PCR results described herein can be further confirmed by immunocytochemistry (ICC) and can be easily performed by one of ordinary skill in the art.

本明細書に記載される方法、組成物およびデバイスは、現在好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者は、本発明の精神に包含され、開示の範囲によって規定される、それへの変更および他の使用を思いつくであろう。したがって、本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で、様々な置換および改変を本明細書に開示される本発明に加えることができることは、当業者には明らかであろう。 The methods, compositions and devices described herein are presently representative of preferred embodiments, are exemplary, and are not intended as limitations on the scope of the invention. A person of ordinary skill in the art will be aware of modifications and other uses therein that are within the spirit of the invention and are defined by the scope of the disclosure. It will therefore be apparent to those skilled in the art that various substitutions and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the invention.

下の請求項およびこの開示全体において、語句「から事実上なる」は、語句の後に掲載される任意の要素を含むことを意味し、掲載される要素について開示で特定される活性または作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句「から事実上なる」は、掲載される要素は必要とされるか必須であるが、他の要素は任意選択であり、掲載される要素の活性か作用にそれらが影響を及ぼすかどうかによって存在しても存在しなくてもよいことを示す。さらに、数値、例えば量、濃度、百分率、割合または範囲が列挙される実施形態では、言及される値は、「少なくとも約」その数値、「約」その数値、または「少なくとも」その数値であってもよいことが理解される。 In the claims below and throughout this disclosure, the phrase "consisting essentially of" is meant to include any element listed after the phrase and does not interfere with the activity or action specified in the disclosure for the listed element. Limited to other elements that do or do not contribute. Thus, the phrase "consisting essentially of" means that the listed elements are required or required, but other elements are optional, and whether they affect the activity or action of the listed elements. It indicates that it may or may not exist depending on the situation. Further, in embodiments in which a numerical value, such as an amount, concentration, percentage, ratio, or range is listed, the value referred to is "at least about" that number, "about" that number, or "at least" that number. It is understood that it is good.

実施形態
実施形態１．ｉｎｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物。
実施形態２．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１に記載の細胞培養物。
実施形態３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触している、実施形態１または２に記載の細胞培養物。
実施形態４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３に記載の細胞培養物。
実施形態５．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態６．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態５に記載の細胞培養物。
実施形態７．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態５に記載の細胞培養物。
実施形態８．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態９．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１０．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性細胞である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態３に記載の細胞培養物。
実施形態１２．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１３．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１２に記載の細胞培養物。
実施形態１４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１６．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１７．ｉｎｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉集団。
実施形態１８．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１７に記載の細胞集団。
実施形態１９．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態１８に記載の細胞集団。
実施形態２０．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触している、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２２．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態１７〜２１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２３．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態２２に記載の細胞集団。
実施形態２４．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態２２に記載の細胞集団。
実施形態２５．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態１７〜２４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２６．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態１７〜２５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２７．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１７〜２６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２９．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態１７〜２８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３０．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態２９に記載の細胞集団。
実施形態３１．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３２．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜２０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触しているヒト膵臓内胚葉細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞集団。
実施形態３５．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態３４に記載の細胞集団。
実施形態３６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態３５に記載の細胞集団。
実施形態３７．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３８．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態３４〜３７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３９．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態３８に記載の細胞集団。
実施形態４０．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態３８に記載の細胞集団。
実施形態４１．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態３４〜４０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４２．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態３４〜４１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４３．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態３４〜４２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４５．ヒト膵臓内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態３４〜４４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態４５に記載の細胞集団。
実施形態４７．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態３４〜４６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４８．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４９．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態５０．インスリンを生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の膵臓内胚葉をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５１．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質とｉｎｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌および非内分泌亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．膵臓内胚葉細胞をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップ
を含む方法。
実施形態５３．膵臓内胚葉細胞が前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させることによって作製される、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態５０〜５２および５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．前腸内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）とさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦとさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのドミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、実施形態５７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６およびＹ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジルおよびＨ−１１５２Ｐ、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．膵臓内胚葉が内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６３．内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．非内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６５．非内分泌細胞亜集団がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６６．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６７．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６８．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するステップと、
ｃ．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の細胞集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態６９．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態６８〜６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７２．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７３．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７４．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのドミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、実施形態７２〜７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．内分泌細胞と比較して膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増加させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増加させるステップを含む方法。
実施形態７７．前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７９．前腸内胚葉細胞をＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８０．移植された膵臓内胚葉のグルコース応答性を向上させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
膵臓内胚葉をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞が、前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させることなく作製した膵臓内胚葉から導出されたインスリン分泌細胞よりもよくインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態８１．膵臓内胚葉細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．インスリンを生成する方法であって、（ａ）生細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）ステップａの最後に細胞を移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態８３．生細胞が前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉である、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４．生細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される、実施形態８２〜８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団。
実施形態８６．内分泌および非内分泌細胞亜集団が多能性細胞から導出される、実施形態８５に記載の細胞集団。
実施形態８７．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態８６に記載の細胞集団。
実施形態８８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態８５〜８７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態８９．非内分泌細胞はＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態８５〜８８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９０．内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態８５〜８９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９１．細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態８５〜９０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９２．細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態８５〜９１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９３．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態８５〜９２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９４．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態８５〜９３のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９５．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態９４に記載の細胞集団。
実施形態９６．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態８５〜９５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９７．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９８．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９９．インスリンを生成する方法であって、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎｖｉｔｒｏで接触させるステップと、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の細胞集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態１００．インスリンを生成する方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陽性細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）の細胞集団をｉｎｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態１０１．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂまたはｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂおよびｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０３．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａおよびｂで加えられる、実施形態６８または９９〜１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａまたはｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａおよびｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０６．ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成する方法であって、少なくとも前腸内胚葉、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の集団、または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成するステップを含む方法。
実施形態１０７．膵臓内胚葉を生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップ
を含む方法。
実施形態１０８．前腸内胚葉細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることをさらに含む、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触させることをさらに含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１２．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態１０７〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１０７〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．前腸内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態５０、７６、１０７〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態５０、７６、１０７〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態１に記載の細胞培養物。
実施形態１１７．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１８．ＥＲＲＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質がＥＧＦ成長因子またはリガンドを含む、実施形態１１７に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１９．ＥＧＦ成長因子またはリガンドが、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２およびヘレグリン−３およびヘレグリン−４からなる群から選択されるヘレグリンアイソフォームを含む、実施形態１１８に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２０．ヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−１およびヘレグリン−４を含む、実施形態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２１．リガンドヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−４を含む、実施形態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップと
を含む方法。
実施形態１２３．前腸内胚葉細胞培養物をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２６．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態１２８．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１２９．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３０．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１をさらに発現する、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、実施形態１３１に記載の方法。 Embodiments Embodiment 1. In vitro human pancreatic endoderm cell culture.
Embodiment 2. The cell culture of embodiment 1, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 3. The cell culture of embodiment 1 or 2, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.
Embodiment 4. The ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), The cell culture of embodiment 3, which is Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 5. The cell culture of any one of embodiments 1-4, wherein the pancreatic endoderm cells comprise pancreatic progenitor cells and multi-hormonal endocrine cells.
Embodiment 6. The cell culture of embodiment 5, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 7. The cell culture of embodiment 5, wherein the multihormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 8. The cell culture of any one of embodiments 1-4, wherein the pancreatic endoderm cells comprise CHGA positive and CHGA negative cells.
Embodiment 9. The cell culture of any one of embodiments 1-8, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm cells are CHGA negative cells.
Embodiment 10. The cell culture of any one of embodiments 1-9, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm cells are PDX1-positive cells.
Embodiment 11. The cell culture of embodiment 3, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.
Embodiment 12. The cell culture of any one of embodiments 1-11, which is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 13. The cell culture of embodiment 12, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 14. The cell culture of any one of embodiments 1-13, which is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.
Embodiment 15. 16. The cell culture of any one of embodiments 1-15, which is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 16. The cell culture of any one of embodiments 1-16, which is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 17. In vitro human pancreatic endoderm population.
Embodiment 18. The cell population of embodiment 17, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 19. The cell population of embodiment 18, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 20. The cell population of any one of embodiments 17-19, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.
Embodiment 21. ERBB tyrosine kinase receptor activating agents include EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), The cell population of embodiment 20, which is Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 22. The cell population of any one of embodiments 17-21, wherein the pancreatic endoderm cells comprise pancreatic progenitor cells and multi-hormonal endocrine cells.
Embodiment 23. The cell population of embodiment 22, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 24. The cell population of embodiment 22, wherein the multi-hormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 25. The cell population of any one of embodiments 17-24, wherein the pancreatic endoderm cells comprise CHGA positive and CHGA negative cells.
Embodiment 26. The cell population of any one of embodiments 17-25, wherein at least 30% of pancreatic endoderm cells are CHGA negative cells.
Embodiment 27. The cell population of any one of embodiments 17-26, wherein at least 50% of pancreatic endoderm cells are PDX1-positive.
Embodiment 28. The cell population of embodiment 20, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.
Embodiment 29. The cell population of any one of embodiments 17-28, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 30. The cell population according to embodiment 29, wherein FGF is FGF-7.
Embodiment 31. The cell population of any one of embodiments 17-30, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.
Embodiment 32. The cell population of any one of embodiments 17-30, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 33. The cell population of any one of embodiments 17-20, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 34. An in vitro cell population comprising human pancreatic endoderm cells in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.
Embodiment 35. The cell population of embodiment 34, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 36. The cell population of embodiment 35, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 37. ERBB tyrosine kinase receptor activating agents include EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), 37. The cell population of any one of embodiments 34-36, which is Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 38. 38. The cell population of any one of embodiments 34-37, wherein the pancreatic endoderm cells comprise pancreatic progenitor cells and multi-hormonal endocrine cells.
Embodiment 39. The cell population of embodiment 38, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 40. The cell population of embodiment 38, wherein the multi-hormonal endocrine cells express CHGA.
Embodiment 41. The cell population of any one of embodiments 34-40, wherein the pancreatic endoderm cells comprise CHGA positive and CHGA negative cells.
Embodiment 42. The cell population of any one of embodiments 34-41, wherein at least 30% of pancreatic endoderm cells are CHGA negative cells.
Embodiment 43. The cell population of any one of embodiments 34-42, wherein at least 50% of pancreatic endoderm cells are PDX1-positive.
Embodiment 44. The cell population of any one of embodiments 34-36, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.
Embodiment 45. The cell population of any one of embodiments 34-44, wherein the human pancreatic endoderm cells are in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 46. The cell population of embodiment 45, wherein FGF is FGF-7.
Embodiment 47. The cell population of any one of embodiments 34-46, wherein human pancreatic endoderm cells are contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.
Embodiment 48. The cell population of any one of embodiments 34-47, wherein the human pancreatic endoderm cells are contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 49. 49. The cell population of any one of embodiments 34-48, wherein the human pancreatic endoderm cells are contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 50. A method of producing insulin, comprising:
a. Contacting the foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby producing a cell population comprising pancreatic endoderm,
b. Transplanting the pancreatic endoderm of step (a) in vivo and maturing to thereby obtain insulin secreting cells, the insulin secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 51. A method of producing insulin, comprising:
a. Foregut endoderm cells derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells are contacted in vitro with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby producing a cell population comprising endocrine and non-endocrine subpopulations. To generate
b. Transplanting the subpopulation of step (a) in vivo and maturing to thereby obtain insulin secreting cells, which secretes insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 52. A method of producing insulin, comprising:
a. A method of transplanting pancreatic endoderm cells in vivo to mature and thereby obtain insulin-secreting cells, the insulin-secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 53. 53. The method of embodiment 52, wherein the pancreatic endoderm cells are made by contacting the foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.
Embodiment 54. ERBB tyrosine kinase receptor activating agents include EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), The method according to any one of embodiments 50-52 and 53, which is Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 55. 55. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-54, wherein the foregut endoderm cells are further contacted with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 56. The method of embodiment 55, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 57. 57. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-56, wherein the foregut endoderm cells are further contacted with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 58. 58. The method of any one of embodiments 50-52 and 53-57, wherein the foregut endoderm cells are further contacted with a rho kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 59. The rho kinase inhibitor is Y-27632, fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment The method of any one of embodiments 57-58, which is selected from the group consisting of: dominant negative variants, derivatives, and expression vectors thereof.
Embodiment 60. 60. The method of any one of embodiments 57-59, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536 and Y-30141 and derivatives thereof.
Embodiment 61. The method of any one of embodiments 57-60, wherein the Rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil and H-1152P, and derivatives thereof.
Embodiment 62. The method of embodiment 50, wherein the pancreatic endoderm comprises endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
Embodiment 63. 63. The method of embodiment 62, wherein the endocrine cell subpopulation is CHGA positive (CHGA+) cells.
Embodiment 64. 63. The method of embodiment 62, wherein the non-endocrine cell subpopulation is CHGA negative (CHGA-).
Embodiment 65. 63. The method of embodiment 62, wherein the non-endocrine cell subpopulation expresses NKX6.1.
Embodiment 66. The method of embodiment 50, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm is CHGA negative.
Embodiment 67. The method of embodiment 50, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm is PDX1 positive.
Embodiment 68. A method of producing insulin, comprising:
a. Contacting the dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a TGFβ receptor family member,
b. Culturing the cells of step (a) in vitro in a second medium lacking an agent that activates a TGFβ receptor family member, thereby producing foregut endoderm cells,
c. Contacting the foregut endoderm cells of (b) with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby generating a cell population comprising endocrine and non-endocrine cell subpopulations,
d. Transplanting the cell population of (c) in vivo, allowing to mature, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 69. 69. The method of embodiment 68, wherein the non-endocrine cells are CHGA negative (CHGA-) cells.
Embodiment 70. 70. The method of any one of embodiments 68-69, wherein the endocrine cells are CHGA positive (CHGA+) cells.
Embodiment 71. The method of embodiment 69, wherein the CHGA negative (CHGA-) cells express NKX6.1.
Embodiment 72. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are contacted with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 73. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are contacted with FGF.
Embodiment 74. The method of embodiment 69, wherein the foregut endoderm cells of (b) are contacted with a rho kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 75. The rho kinase inhibitor is Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment The method of any one of embodiments 72-74, wherein the method is selected from the group consisting of: dominant negative variants, derivatives and expression vectors thereof.
Embodiment 76. A method of increasing the proportion of non-endocrine cells in a pancreatic endoderm cell population as compared to endocrine cells,
A method comprising contacting foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby increasing the proportion of non-endocrine cells in the pancreatic endoderm cell population.
Embodiment 77. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are contacted with FGF.
Embodiment 78. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are contacted with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 79. The method of embodiment 76, wherein the foregut endoderm cells are further contacted with FGF and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 80. A method for improving glucose responsiveness of transplanted pancreatic endoderm, comprising:
Contacting the foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby producing a cell population comprising pancreatic endoderm,
A step of transplanting pancreatic endoderm in vivo and maturing to thereby obtain insulin secreting cells, the insulin secreting cells without contacting the foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent. Secreting insulin better than the insulin-secreting cells derived from the produced pancreatic endoderm.
Embodiment 81. 81. The method of embodiment 80, wherein the pancreatic endoderm cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 82. A method of producing insulin, comprising: (a) contacting live cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, and (b) transplanting and maturing the cells at the end of step a, thereby producing insulin secretion. Obtaining cells, wherein the insulin secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 83. The method of embodiment 82, wherein the viable cells are foregut endoderm or PDX1-negative foregut endoderm.
Embodiment 84. The method of any one of embodiments 82-83, wherein the live cells are derived from dedifferentiated, genetically reprogrammed cells.
Embodiment 85. Cell populations, including endocrine and non-endocrine cell subpopulations.
Embodiment 86. The cell population of embodiment 85, wherein the endocrine and non-endocrine cell subpopulations are derived from pluripotent cells.
Embodiment 87. 89. The cell population of embodiment 86, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 88. The ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), The cell population of any one of embodiments 85-87, which is Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.
Embodiment 89. The cell population of any one of embodiments 85-88, wherein the non-endocrine cells express NKX6.1 but not CHGA.
Embodiment 90. The cell population of any one of embodiments 85-89, wherein the endocrine cells express CHGA.
Embodiment 91. The cell population of any one of embodiments 85-90, wherein at least 30% of the cells are CHGA negative cells.
Embodiment 92. The cell population of any one of embodiments 85-91, wherein at least 50% of the cells are PDX1-positive.
Embodiment 93. The cell population of any one of embodiments 85-92, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.
Embodiment 94. The cell population of any one of embodiments 85-93, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 95. The cell population of embodiment 94, wherein FGF is FGF-7.
Embodiment 96. The cell population of any one of embodiments 85-95, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.
Embodiment 97. The cell population of any one of embodiments 85-96, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 98. The cell population of any one of embodiments 85-97, wherein the cell culture is contacted with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF and a rho kinase inhibitor.
Embodiment 99. A method of producing insulin, comprising: (a) contacting a dedifferentiated genetically reprogrammed cell with a first medium containing an agent that activates a TGFβ receptor family member in vitro. , (B) culturing the cells of step (a) in vitro in a second medium lacking an agent that activates a TGFβ receptor family member, whereby at least the foregut endoderm or at least the PDX1-negative foregut Generating a germ layer cell, contacting the cell of (c)(b) with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby generating a cell population comprising endocrine and non-endocrine cell subpopulations; (D) transplanting the cell population of (c) in vivo and allowing it to mature, thereby obtaining insulin-secreting cells, the insulin-secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation. ..
Embodiment 100. A method of producing insulin, comprising: (a) contacting PDX1-positive cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, and (b) transplanting and maturing the cell population of (a) in vivo. Thereby obtaining insulin-secreting cells, the insulin-secreting cells secreting insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 101. The method according to embodiment 68 or 99, wherein the rho kinase inhibitor is added in step a, b or c.
Embodiment 102. The method according to embodiment 68 or 99, wherein a rho kinase inhibitor is added in steps a, b and c.
Embodiment 103. The method of any one of embodiments 68 or 99-100, wherein a rho kinase inhibitor is added in steps a and b.
Embodiment 104. The method of embodiment 68 or 99, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in step a or c.
Embodiment 105. The method of embodiment 68 or 99, wherein an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in steps a and c.
Embodiment 106. A method of producing a cell population capable of maturing into glucose responsive insulin secreting cells in vivo, comprising at least a foregut endoderm, at least a PDX1-negative foregut endoderm population, or at least a PDX1-positive pancreatic endoderm cell. Contacting an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent, thereby generating a cell population capable of maturing in vivo to glucose-responsive insulin secreting cells.
Embodiment 107. A method of producing pancreatic endoderm, comprising:
a. A method comprising contacting foregut endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby producing a cell population comprising pancreatic endoderm.
Embodiment 108. 108. The method of embodiment 107, further comprising contacting foregut endoderm cells with fibroblast growth factor (FGF).
Embodiment 109. The method of embodiment 108, wherein the FGF is FGF-7.
Embodiment 110. The method of any one of embodiments 107-109, further comprising contacting foregut endoderm cells with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 111. 110. The method of any one of embodiments 107-109, further comprising contacting foregut endoderm cells with a rho kinase inhibitor and FGF.
Embodiment 112. 112. The method of any one of embodiments 107-111, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm is CHGA negative.
Embodiment 113. 113. The method of any one of embodiments 107-112, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm is PDX1-positive.
Embodiment 114. The method of any one of embodiments 50, 76, 107-113, wherein the foregut endoderm cells are derived from pluripotent cells.
Embodiment 115. 115. The method of any one of embodiments 50, 76, 107-114, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 116. The cell culture of embodiment 1, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.
Embodiment 117. An in vitro human pancreatic endoderm cell population comprising differentiated cells derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells and an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent.
Embodiment 118. 118. The pancreatic endoderm cell population of embodiment 117, wherein the ERRB receptor tyrosine kinase activating agent comprises an EGF growth factor or ligand.
Embodiment 119. 118. The pancreatic endoderm cell population of embodiment 118, wherein the EGF growth factor or ligand comprises a heregulin isoform selected from the group consisting of heregulin-1, heregulin-2 and heregulin-3 and heregulin-4.
Embodiment 120. The pancreatic endoderm cell population of embodiment 119, wherein the heregulin isoforms include heregulin-1 and heregulin-4.
Embodiment 121. The pancreatic endoderm cell population of embodiment 119, wherein the ligand heregulin isoform comprises Heregulin-4.
Embodiment 122. A method of producing insulin, comprising:
a. Foregut endoderm cell cultures derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells are contacted in vitro with an ERBB receptor tyrosine kinase activator, thereby producing endocrine and non-endocrine cell subpopulations. Generating a cell population containing
b. Maturing the subpopulation of step (a) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 123. 123. The method of embodiment 122, further comprising contacting the foregut endoderm cell culture with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 124. The rho kinase inhibitor is Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment The method of embodiment 123, which is selected from the group consisting of:, dominant negative variants, their derivatives and their expression vectors.
Embodiment 125. 124. The method of embodiment 123, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141 and derivatives thereof.
Embodiment 126. The method of embodiment 125, wherein the Rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P and derivatives thereof.
Embodiment 127. A method of producing insulin, comprising:
a. Contacting the dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a TGFβ receptor family member,
b. Culturing the cells of step (a) in vitro in a second medium lacking an agent that activates a TGFβ receptor family member, thereby producing foregut endoderm cells,
c. Contacting the foregut endoderm cells of step (b) with an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent, thereby producing a cell population comprising endocrine cells and non-endocrine cell subpopulations.
d. Maturing the cell subpopulation of step (c) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.
Embodiment 128. The method of embodiment 127, wherein the non-endocrine cells are CHGA negative (CHGA-) cells.
Embodiment 129. The method of embodiment 127, wherein the endocrine cells are CHGA positive (CHGA+) cells.
Embodiment 130. The method of embodiment 127, wherein the CHGA negative (CHGA-) cells further express NKX6.1.
Embodiment 131. 128. The method of embodiment 127, further comprising contacting foregut endoderm cells with a rho kinase inhibitor.
Embodiment 132. The rho kinase inhibitor is Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, ROCK antisense nucleic acid, RNA interference inducing nucleic acid, competitive peptide, antagonist peptide, inhibitory antibody, antibody-ScFV fragment The method of embodiment 131, which is selected from the group consisting of:, dominant negative variants, their derivatives and their expression vectors.

Claims

クロモグラニンＡ（＋）内分泌細胞亜集団と、ＮＫＸ６．１（＋）であり且つクロモグラニンＡ（−）である非内分泌細胞亜集団とを含む膵臓前駆細胞集団を含む組成物であって、
前記組成物はさらにヘレグリン−１β、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２、ヘレグリン−３またはヘレグリン−４を含み、
前記細胞集団は、成長因子を含む培地中の脱分化したリプログラミング化ヒト多能性幹細胞に由来するものであり、
前記成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーリガンドまたは線維芽細胞成長因子であり、
前記細胞集団の少なくとも３０％が前記ＮＫＸ６．１（＋）であり且つクロモグラニンＡ（−）である非内分泌細胞亜集団である、
組成物。 A composition comprising pancreatic progenitor cell population comprising a non-endocrine cell subpopulation is, - and chromogranin A (+) endocrine cell subpopulations, NKX6.1 (+) and is and chromogranin A ()
The composition further comprises heregulin- 1β, heregulin-1, heregulin-2, heregulin-3 or heregulin-4 ,
The cell population is derived from dedifferentiated reprogrammed human pluripotent stem cells in a medium containing growth factors,
The growth factor is epidermal growth factor (EGF) family ligand or fibroblast growth factor,
Wherein at least 30% of the cell population wherein NKX6.1 (+) and chromogranin A (-) is a non-endocrine cell subpopulation is,
Composition.

前記ＥＧＦファミリーリガンドが、ヘレグリン−１βを含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the EGF family ligand comprises heregulin- 1β .

前記膵臓前駆細胞集団が、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む、請求項１または２に記載の組成物。 The composition according to claim 1 or 2 , wherein the pancreatic progenitor cell population comprises PDX1-positive pancreatic endoderm cells.

前記膵臓前駆細胞集団が封入されており、ｉｎｖｉｖｏで移植することができるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。 The pancreatic progenitor and cell populations is enclosed, are those that can be implanted in in vivo, a composition according to any one of claims 1-3.

移植された前記膵臓前駆細胞集団はｉｎｖｉｖｏでインスリン生成細胞に成熟する、請求項４に記載の組成物。 The composition of claim 4 , wherein the transplanted pancreatic progenitor cell population matures into insulin-producing cells in vivo.

前記膵臓前駆細胞集団は半透膜を含む半透過性デバイスに封入されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。 The pancreatic progenitor cell population is encapsulated in a semipermeable device comprising a semipermeable membrane, the composition according to any one of claims 1-5.

前記半透過性デバイスは少なくとも１つの細胞封入チャンバーを含む、請求項６に記載の組成物。 7. The composition of claim 6 , wherein the semipermeable device comprises at least one cell encapsulation chamber.

前記半透過性デバイスは穿孔性半透膜を含む、請求項６に記載の組成物。 7. The composition of claim 6 , wherein the semipermeable device comprises a perforated semipermeable membrane.

前記脱分化したリプログラミング化ヒト多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。 The reprogramming of human pluripotent stem cells dedifferentiated is an artificial pluripotent stem cell composition according to any one of claims 1-8.

前記線維芽細胞成長因子はＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２またはＦＧＦ２３を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
The fibroblast growth factor is FGF1, FGF2, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 or FGF23. containing composition according to any one of claims 1-9.