RU2754089C2

RU2754089C2 - Cell compositions obtained from dedifferentiated reprogrammed cells

Info

Publication number: RU2754089C2
Application number: RU2018144412A
Authority: RU
Inventors: Алан Д. Агулник; Оливия КЕЛЛИ; Юки ОХИ; Аллан РОБИНС; Томас ШУЛЬЦ
Original assignee: Виасайт, Инк.
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2021-08-26
Also published as: JP2016506736A; IL239953B; IL283088A; CA2898431A1; RU2015131279A; HK1218139A1; AU2022200075A1; JP6721752B2; JP7250731B2; JP2023017838A; AU2022200075C1; JP2020178694A; AU2019201314B2; JP2019146578A; CA3212301A1; WO2014124172A1; CA2898431C; RU2018144412A3; AU2014214879A1; IL239953A0

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: present invention relates to biotechnology, namely to isolation, maintenance and application of cell cultures. Particularly, it relates to cell compositions obtained from induced pluripotent stem cells. Disclosed are pancreatic cell culture compositions obtained from dedifferentiated reprogrammed pluripotent human stem cells, such as induced pluripotent stem (iPS) cells, for treatment of diabetes. The compositions comprise human pancreatic progenitor cells, including endocrine and non-endocrine subpopulations of cells contained in a nutrient medium containing an epidermal growth factor (EGF) family ligand or a fibroblast growth factor. No less than 30% of said cells are presented by cells of a non-endocrine cell subpopulation.

EFFECT: invention allows to determine and demonstrate detailed properties of differentiation and efficiency of directed differentiation of iPS cells.

22 cl, 8 dwg, 13 tbl, 7 ex

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross-references to related claims

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США №13/761,078, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 6 февраля 2013, которая является частичным продолжением заявки США №12/765,714, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 22 апреля 2010, которая является непредварительной заявкой, по которой испрашивается приоритет по 35 U.S.C. §119(e) для предварительной патентной заявки США №61/171,759, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 22 апреля 2009, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством.This application claims the priority of US Patent Application No. 13 / 761,078, entitled "Cell Compositions Derived from Dedifferentiated Reprogrammed Cells," filed February 6, 2013, which is a partial continuation of US Patent Application No. 12 / 765,714 entitled "Cell Compositions Derived from Dedifferentiated Reprogrammed Cells." cells ”filed on April 22, 2010, which is a non-provisional application claiming priority under 35 USC §119 (e) for US Provisional Patent Application No. 61 / 171,759, entitled "Cell Compositions Derived from Dedifferentiated Reprogrammed Cells," filed April 22, 2009, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Список последовательностейSequence list

Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла, озаглавленного CYTHERA068P1.TXT, созданного 28 января 2013, размером 8,92 кб. Информация в электронном формате Списка последовательностей полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.This application is filed with a sequence listing in electronic format. The sequence listing is in the form of a 8.92 kb file entitled CYTHERA068P1.TXT created on January 28, 2013. The information in the electronic format of the Sequence Listing is fully incorporated into this description by reference.

Области техники, к которой относится настоящее изобретениеThe technical field to which the present invention relates

Настоящее изобретение относится к выделению, поддержанию и применению культур клеток. В частности, оно относится к композициям клеток, полученным из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.The present invention relates to the isolation, maintenance and use of cell cultures. In particular, it relates to cell compositions obtained from induced pluripotent stem cells.

Предшествующий уровень техникиPrior art

Важным применением плюрипотентных клеток является их применение в клеточной терапии. Плюрипотентные стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона человек (hES), зародышевые клетки эмбриона человека (hEG), но не ограничиваются ими. Существуют другие типы плюрипотентных клеток, например, дедифференцированные стволовые клетки человека и мыши, т.е. дифференцированные соматические взрослые клетки, дедифференцированные для получения стволовых клеток, подобных плюрипотентным. Эти дедифференцированные клетки, индуцированные для получения клеток, обладающих плюрипотентностью и способностью к росту, подобной ES клеткам, также называют «индуцированными плюрипотентными стволовыми (iPS) клетками», «клетками, подобным эмбриональным стволовым клеткам», «ES-подобными клетками», или их эквивалентами. Такие клетки являются потенциально жизнеспособными альтернативными плюрипотентными клетками. Для терапевтического применения iPS клеток требуется доказательство того, что эти клетки стабильны и демонстрируют подходящий профиль безопасности в доклинических исследования при лечении диабета и других заболеваний. Перепрограммирование дифференцированных соматических клеток человека в плюрипотентное состояние обеспечивает получение стволовых клеток, специфичных для пациента и заболевания. См. Takahashi, К. et al. Cell, 1-12, 2007, и Ju, J. et al. Science 2007. Takahashi et al. и Ju et al. вводили четыре гена в фибробласты взрослого человека и плода/новорожденного для генерации iPS клеток: Oct4, Sox2, K1f4 и c-myc у Takahashi et al.; Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 у Ju et al. В каждом случае iPS клетки обладали некоторыми характеристиками hES клеток, включая морфологию, экспрессию маркеров, пролонгированную пролиферацию, нормальный кариотип и плюрипотентность hES клеток.An important application of pluripotent cells is their use in cell therapy. Pluripotent stem cells include, but are not limited to, human embryonic stem cells (hES), human embryonic germ cells (hEG). There are other types of pluripotent cells, for example, dedifferentiated human and mouse stem cells, i.e. differentiated somatic adult cells, dedifferentiated to produce stem cells similar to pluripotent ones. These dedifferentiated cells, induced to produce cells with pluripotency and growth ability similar to ES cells, are also called "induced pluripotent stem (iPS) cells", "embryonic stem cells like", "ES-like cells", or their equivalents. Such cells are potentially viable alternative pluripotent cells. The therapeutic use of iPS cells requires proof that these cells are stable and show a suitable safety profile in preclinical studies in the treatment of diabetes and other diseases. Reprogramming differentiated human somatic cells into a pluripotent state ensures the production of stem cells specific to the patient and the disease. See Takahashi, K. et al. Cell, 1-12, 2007, and Ju, J. et al. Science 2007. Takahashi et al. and Ju et al. introduced four genes into adult and fetal / neonatal fibroblasts to generate iPS cells: Oct4, Sox2, K1f4 and c-myc in Takahashi et al .; Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 by Ju et al. In each case, the iPS cells had some of the characteristics of hES cells, including morphology, marker expression, prolonged proliferation, normal karyotype, and pluripotency of hES cells.

Хотя iPS клетки могут обеспечивать регенеративное средство на клеточной основе без связанных этических проблем, свойства дифференцировки iPS клеток, например, потенциал дифференцировки и эффективность дифференцировки in vitro, остаются неясными, и способ направленной дифференцировки для iPS клеток не был продемонстрирован. Таким образом, имеется потребность в определении и демонстрации детальных свойств дифференцировки и эффективности направленной дифференцировки iPS клеток.Although iPS cells can provide a cell-based regenerative agent without associated ethical concerns, the differentiation properties of iPS cells, such as differentiation potential and in vitro differentiation efficiency, remain unclear, and a targeted differentiation route for iPS cells has not been demonstrated. Thus, there is a need to define and demonstrate the detailed differentiation properties and efficiency of directed differentiation of iPS cells.

Изложение сущности настоящего изобретенияSummary of the present invention

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, обеспечивают композиции клеток, полученные из плюрипотентных клеток, например, дедифференцированных перепрограммированных клеток, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки.The embodiments described herein provide cell compositions derived from pluripotent cells, eg, dedifferentiated reprogrammed cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells.

Один вариант осуществления обеспечивает композиции и способы изготовления культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, в которой по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются дефинитивными энтодермальными клетками, где дефинитивные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте дефинитивные энтодермальные клетки являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки кишечной трубки или органы, полученные из нее.One embodiment provides compositions and methods for making an in vitro cell culture comprising human cells, in which at least about 15% of the human cells are definitive endodermal cells, where definitive cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, definitive endodermal cells are multipotent cells that can differentiate into intestinal tube cells or organs derived therefrom.

Другие варианты осуществления обеспечивают композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются энтодермальными клетками передней части пищеварительного тракта, позитивными в отношении панкреато-дуоденального гомеобоксного фактора-1 (PDX1), где PDX1-позитивные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта являются полученными из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте PDX1-позитивные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта являются PDX1, SOX9, PROX1 и HNF6 позитивными одновременно.Other embodiments provide compositions and methods for producing an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are anterior gastrointestinal tract endodermal cells, pancreato-duodenal homeobox factor-1 (PDX1) positive, wherein PDX1 -positive endodermal cells of the anterior part of the digestive tract are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX1-positive endodermal cells of the anterior digestive tract are PDX1, SOX9, PROX1, and HNF6 positive at the same time.

Другой вариант осуществления обеспечивает композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются панкреатическими прогениторными клетками, позитивными в отношении панкреато-дуоденального гомеобоксного фактора-1 (PDX1), где PDX1 -позитивные панкреатические прогениторные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте PDX1-позитивные панкреатические прогениторные клетки являются PDX1 и NKX6.1 позитивными одновременно.Another embodiment provides compositions and methods for producing an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are pancreatic progenitor cells positive for pancreato-duodenal homeobox factor-1 (PDX1), wherein PDX1 is pancreatic positive progenitor cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells. In one aspect, PDX1-positive pancreatic progenitor cells are PDX1 and NKX6.1 positive at the same time.

Еще один вариант осуществления обеспечивает композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются эндокринными клетками-предшественниками, позитивными в отношении нейрогенина-3 (NGN3), где NGN3-позитивные эндокринные клетки-предшественники получены из дедифференцированныхAnother embodiment provides compositions and methods for producing an in vitro cell culture comprising human cells, wherein at least about 15% of the human cells are neurogenin-3 (NGN3) positive endocrine progenitor cells, wherein NGN3-positive endocrine cells are predecessors obtained from dedifferentiated

перепрограммированных клеток. В одном аспекте NGN3-позитивные эндокринные клетки-предшественники являются NGN3, РАХ4 и NKX2.2 позитивными одновременно.reprogrammed cells. In one aspect, NGN3-positive endocrine progenitor cells are NGN3, PAX4 and NKX2.2 positive at the same time.

Другие варианты осуществления композиций культур клеток, описанных в настоящей заявке, включают in vitro культуры панкреатических энтодермальных клеток человека, содержащие дифференцированные клетки, полученные из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток, и агент, активирующий тирозинкиназу ERBB рецептора.Other embodiments of the cell culture compositions described herein include in vitro cultures of human pancreatic endodermal cells containing differentiated cells derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells and an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent.

Дополнительные варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способу получения инсулина. В некоторых таких вариантах осуществления способ включает этапы (а) обеспечения контакта по меньшей мере культуры энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и/или по меньшей мере культуры PDX1-негативных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, таким образом, продуцируя популяцию панкреатических энтодермальных клеток, включающую субпопуляции эндокринных клеток и неэндокринных клеток; и (b) трансплантации и созревания популяции панкреатических энтодермальных клеток, полученных на этапе (а), или субпопуляции клеток, полученной на этапе (a), in vivo, получая таким образом инсулин-секретирующие клетки, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.Additional embodiments described in this application relate to a method for producing insulin. In some such embodiments, the method comprises the steps of (a) contacting at least a culture of anterior gastrointestinal tract endodermal cells and / or at least a culture of PDX1 negative anterior gastrointestinal tract endodermal cells obtained from dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro, with an agent that activates tyrosine kinase of the ERBB receptor, thereby producing a population of pancreatic endodermal cells, including subpopulations of endocrine cells and non-endocrine cells; and (b) transplanting and maturing the population of pancreatic endodermal cells obtained in step (a), or a subpopulation of cells obtained in step (a), in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin in response for glucose stimulation.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способу получения инсулина, включающему этапы: (а) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ; (b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ, с получением таким образом по меньшей мере энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и/или по меньшей мере PDX1-негативных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта; (с) обеспечения контакта клеток, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, с генерацией, таким образом, популяции клеток, включающей субпопуляции эндокринных клеток и не-эндокринных клеток; и (d) трансплантации и созревания популяции клеток, полученной на этапе (с), или субпопуляции клеток, полученной на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой. Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к обеспечению контакта популяции, содержащей по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, и/или по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, с получением таким образом популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.Other embodiments described herein relate to a method for producing insulin comprising the steps of: (a) contacting dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family; (b) in vitro culturing the cells obtained in step (a) in a second medium that does not contain an agent that activates a member of the TGFβ receptor family, thereby obtaining at least endodermal cells of the anterior digestive tract and / or at least PDX1- negative endodermal cells in the anterior part of the digestive tract; (c) contacting the cells obtained in step (b) with an agent that activates tyrosine kinase of the ERBB receptor, thereby generating a population of cells including subpopulations of endocrine cells and non-endocrine cells; and (d) transplanting and maturing the cell population obtained in step (c), or a subpopulation of cells obtained in step (c), in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin into response to glucose stimulation. Other embodiments described herein relate to contacting a population comprising at least anterior endodermal endodermal cells, at least PDX1 negative anterior gastrointestinal endodermal cells, and / or at least PDX1 positive pancreatic endodermal cells, with an agent that activates ERBB receptor tyrosine kinase, thereby obtaining a population of cells capable of maturation into glucose-sensitive insulin-secreting cells in vivo.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к обеспечению контакта популяции, включающей по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, и/или по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, и ингибитором rho-киназы, с получением таким образом популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.Other embodiments described herein relate to providing contact of a population including at least anterior endodermal endodermal cells, at least PDX1 negative anterior gastrointestinal endodermal cells, and / or at least PDX1 positive pancreatic endodermal cells, with an ERBB receptor tyrosine kinase activating agent and an rho kinase inhibitor, thereby obtaining a population of cells capable of maturation into glucose sensitive insulin-secreting cells in vivo.

Выражение «по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», «по меньшей мере PDX1 -негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», и «по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки», использующееся в настоящей заявке, означает, что некоторая часть клеток в популяции клеток дифференцирована из iPSC в энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта или дальше, из iPSC в PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта или дальше, и/или из iPSC в PDX1 -позитивные панкреатические энтодермальные клетки или дальше в их дифференцировке по направлению к клеткам панкреатических островков.The expression "at least endodermal cells of the anterior part of the digestive tract", "at least PDX1-negative endodermal cells of the anterior part of the digestive tract", and "at least PDX1-positive pancreatic endodermal cells" used in this application means that some part of the cells in the cell population differentiated from iPSC to endodermal cells in the anterior part of the digestive tract or further, from iPSC to PDX1-negative endodermal cells in the anterior part of the digestive tract or further, and / or from iPSC to PDX1-positive pancreatic endodermal cells or further in their differentiation towards the cells of the pancreatic islets.

Термины «некоторые из» и/или «часть из», использующееся в настоящей заявке по отношению к популяции клеток, означает, что популяция клеток содержит по меньшей мере 5%, меньшей мере 10%, меньшей мере 15%, меньшей мере 20%, меньшей мере 25%, меньшей мере 30%, меньшей мере 35%, меньшей мере 40%, меньшей мере 45%, меньшей мере 50%, меньшей мере 55%, меньшей мере 60%, меньшей мере 65%, меньшей мере 70%, меньшей мере 75%, меньшей мере 80%, меньшей мере 85%, меньшей мере 90%, меньшей мере 95% или меньшей мере больше 95% клеток специфического типа.The terms "some of" and / or "part of" as used herein in relation to a population of cells means that the population of cells contains at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least more than 95% of cells of a specific type.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Фигура 1 является фотографическим изображением агрегатной суспензионной культуры дедифференцированных перепрограммированных клеток, или также упомянутых как iPS клетки.Figure 1 is a photographic image of an aggregate suspension culture of dedifferentiated reprogrammed cells, or also referred to as iPS cells.

Фигуры 2A-L являются гистограммами, демонстрирующими относительные уровни экспрессии генов ОСТ4 (Фиг. 2А), BRACHYURY (Фиг. 2В), CER1 (Фиг. 2С), GSC (Фиг. 2D), FOXA2 (Фиг. 2Е), FOXA1 (Фиг. 2F), HNF6 (Фиг. 2G), PDX1 (Фиг. 2Н), PTF1A (Фиг. 2I), NKX6.1 (Фиг. 2J), NGN3 (Фиг. 2K) и INS (Фиг. 2L). Уровни экспрессии нормализованы до средних уровней экспрессии конститутивных генов, экспрессии циклофилина G и ТАТА-связывающего белка (ТВР). Графики изображают кратность положительной регуляции против наименьшей точки данных в наборе данных.Figures 2A-L are histograms showing the relative expression levels of the genes OCT4 (Fig.2A), BRACHYURY (Fig.2B), CER1 (Fig.2C), GSC (Fig.2D), FOXA2 (Fig.2E), FOXA1 (Fig. 2F), HNF6 (Fig. 2G), PDX1 (Fig. 2H), PTF1A (Fig. 2I), NKX6.1 (Fig. 2J), NGN3 (Fig. 2K), and INS (Fig. 2L). Expression levels are normalized to mean levels of constitutive gene expression, expression of cyclophilin G and TATA-binding protein (TBP). The graphs depict the fold upward versus the smallest data point in the dataset.

Фигуры 3A-3D являются микрофотографиями иммуноцитохимии (ИЦХ) культур iPS клеток человека с 4 стадии дифференцировки с применением антител, специфичных к (3А) PDX-1; (3В) NKX6.1; (3С) PTF1A; и (3D) Dapi.Figures 3A-3D are photomicrographs of immunocytochemistry (ICC) cultures of human iPS cells with differentiation stage 4 using antibodies specific for (3A) PDX-1; (3B) NKX6.1; (3C) PTF1A; and (3D) Dapi.

Фигуры 4A-4D являются изображениями иммуноцитохимии (ИЦХ) культур iPS клеток с 4 стадии дифференцировки с применением лигандов, специфичных к (4А) глюкагону; (4В) инсулину; (4С) соматостатину; и (4D) Dapi.Figures 4A-4D are immunocytochemistry (ICC) images of stage 4 iPS cell cultures using ligands specific for (4A) glucagon; (4B) insulin; (4C) somatostatin; and (4D) Dapi.

Фигуры 5А-В являются схемой расположения матрицы и ключа матрицы, обеспеченных в Proteome Profiler™ биочипах фосфо-RTK антител человека от R&D Systems. Схема расположения на Фигуре 5А показывает координаты или расположение RTK-антител. Идентичность или наименование RTK-семейства или антител описаны в ключе, Фигура 5В. Позитивные сигналы, наблюдаемые на проявленной пленке, таким образом, можно идентифицировать путем наложения слайда, как на Фигуре 5, и идентификации сигналов путем ссылки на координаты на накладке (Фигура 5А) с наименованием RTK на Фигуре 5В.Figures 5A-B are a layout diagram of the template and template key provided in Proteome Profiler ™ biochips of human phospho-RTK antibodies from R&D Systems. The layout diagram in Figure 5A shows the coordinates or location of the RTK antibodies. The identity or naming of the RTK family or antibodies is described in the key, Figure 5B. The positive signals observed on the developed film can thus be identified by overlaying a slide as in Figure 5 and identifying the signals by referring to the coordinates on the overlay (Figure 5A) named RTK in Figure 5B.

Фигура 6A-D являются анализом RTK матрицы полученных из iPS клеток панкреатических энтодермальных клеток (РЕС) в различных условиях (А, В, С и D, как описано в Примере 5). Фосфорилирование тирозина определенных RTK наблюдали путем идентификации сигналов от высокой к низкой интенсивности. Идентифицированы или заключены в рамку члены семейств IGF1R/IR и ERBB (EGFR).Figure 6A-D are an RTK matrix assay of iPS-derived pancreatic endodermal cell (PEC) cells under various conditions (A, B, C and D as described in Example 5). Tyrosine phosphorylation of certain RTKs was observed by identifying signals from high to low intensity. Members of the IGF1R / IR and ERBB (EGFR) families have been identified or framed.

Фигуры 7А-С являются графиками, демонстрирующими концентрации С-пептида и инсулина человека в сыворотке крови при имплантации мышам для экспериментов Е2314, Е2356 и Е2380 (Фиг. 7А), Е2347 (Фиг. 7В), и Е2354 (Фиг. 7С), как указано в Таблице 9. У мышей, которым имплантировали РЕС, анализировали в указанные моменты времени после трансплантации сывороточные уровни С-пептида человека натощак, и спустя 30 минут и 60 минут после интраперитонеального введения глюкозы. На Фиг. 7С РЕС инкапсулировали с устройством для инкапсулирования клеток (Encaptra® EN20, или EN20, ViaCyte, Сан-Диего, Калифорния), и в некоторых случаях устройства имели микроперфорации (pEN20, ViaCyte, Сан-Диего, Калифорния). Такие устройства описаны в патенте США №8,278,106, описание которого полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.Figures 7A-C are graphs showing human serum C-peptide and insulin concentrations when implanted in mice for experiments E2314, E2356 and E2380 (Fig.7A), E2347 (Fig.7B), and E2354 (Fig.7C) as shown in Table 9. In PEC-implanted mice, fasted serum human C-peptide levels were analyzed at the indicated time points after transplantation, and 30 minutes and 60 minutes after intraperitoneal glucose administration. FIG. The 7C PEC was encapsulated with a cell encapsulation device (Encaptra® EN20, or EN20, ViaCyte, San Diego, CA), and in some cases the devices were microperforated (pEN20, ViaCyte, San Diego, CA). Such devices are described in US Pat. No. 8,278,106, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Фигуры 8А и 8B являются графиками, демонстрирующими результаты анализа глюкозы крови мышей, леченных STZ, в Эксперименте №2347. На Фигуре 8А показана глюкоза крови для каждой из 13 мышей (базовая линия с херегулином и без него), а на Фигуре 8B показаны комбинированные средние значения для каждого лечения (базовая линия с херегулином и без него). Результаты анализа произвольных уровней глюкозы в крови не-натощак показаны для 13 мышей, которым имплантировали iPEC, до 14 суток перед лечением STZ (день 0), и для тех же самых мышей после лечения STZ и после удаления трансплантатов. Животные, леченные STZ, получали STZ примерно 26 недель после трансплантации (день 0). На 28 неделе после трансплантации, примерно 2 недели после начала лечения STZ, iPEC трансплантаты эксплантировали (удаляли). Образец для анализа глюкозы крови не натощак собирали на протяжении времени для каждого из животных.Figures 8A and 8B are graphs showing the blood glucose analysis results of STZ-treated mice in Experiment # 2347. Figure 8A shows the blood glucose for each of the 13 mice (baseline with and without heregulin) and Figure 8B shows the combined mean values for each treatment (baseline with and without heregulin). Non-fasting random blood glucose results are shown for 13 iPEC implanted mice up to 14 days before STZ treatment (day 0), and for the same mice after STZ treatment and after graft removal. STZ-treated animals received STZ approximately 26 weeks after transplantation (day 0). At 28 weeks post-transplant, approximately 2 weeks after starting STZ treatment, iPEC grafts were explanted (removed). A non-fasting blood glucose sample was collected over time for each of the animals.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Настоящее изобретение станет более понятным со ссылкой на следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения и примеров, включенных него. Однако перед раскрытием и описанием представленных соединений, композиций и способов, необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается специфическими типами клеток, специфическими слоями фидерных клеток, специфическими условиями, или специфическими способами, и т.д., и как таковое, может варьировать. Многочисленные модификации и варианты станут понятными для специалистов в данной области техники. Необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для описания специфических вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения.The present invention will be better understood with reference to the following detailed description of the preferred embodiments of the invention and the examples included therein. However, before disclosing and describing the present compounds, compositions and methods, it should be understood that the present invention is not limited to specific cell types, specific feeder cell layers, specific conditions, or specific methods, etc., and as such may vary. Numerous modifications and variations will become apparent to those skilled in the art. It should be understood that the terminology used in this application is only intended to describe specific embodiments, and is not intended to be limiting.

ОпределенияDefinitions

Необходимо понимать, что все численные диапазоны, выраженные в настоящей заявке, включают конечные точки, указанные далее, и описывают все числа между конечными точками в установленном численном диапазоне.It should be understood that all numerical ranges expressed in this application include the endpoints indicated below and describe all numbers between the endpoints in the specified numerical range.

Если не указано иное, термины, используемые в настоящей заявке, необходимо понимать в соответствии с их обычным применением рядовым специалистом в соответствующей области техники. Кроме того, для целей настоящего описания и формулы изобретения, если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, проценты или пропорции материалов, условия реакции, и другие численные величины, используемые в данном описании и формуле изобретения, необходимо понимать как модифицированные во всех случаях термином «примерно». Соответственно, если не указано противоположное, численные параметры, установленные в следующем описании и формуле изобретения, являются приблизительными, и могут варьировать в зависимости от необходимых свойств, ожидаемых при осуществлении настоящего изобретения. В крайнем случае, и не с целью ограничения заявки доктриной эквивалентов в объеме формулы изобретения, каждый численный параметр должен быть истолкован по меньшей мере в свете ряда указанных значимых чисел и путем применения обычных методик округления.Unless otherwise indicated, the terms used in this application should be understood in accordance with their usual use by one of ordinary skill in the relevant field of technology. In addition, for the purposes of the present description and the claims, unless otherwise indicated, all numbers expressing the amounts of ingredients, percentages or proportions of materials, reaction conditions, and other numerical values used in this description and the claims are to be understood as modified in all cases by the term "about". Accordingly, unless otherwise indicated, the numerical parameters set forth in the following description and claims are approximate and may vary depending on the desired properties expected in the practice of the present invention. As a last resort, and not to limit the application to the doctrine of equivalents within the scope of the claims, each numerical parameter should be construed at least in light of the range of significant numbers indicated and by applying conventional rounding techniques.

При осуществлении вариантов, описанных в настоящей заявке, если не указано иное, применяются обычные методики клеточной биологии, молекулярной биологии, генетики, химии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, и иммунологии.In the implementation of the options described in this application, unless otherwise indicated, apply conventional techniques of cell biology, molecular biology, genetics, chemistry, microbiology, recombinant DNA, and immunology.

Необходимо понимать, что при использовании в настоящей заявке и формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если в контексте явно не указано иное. Так, например, ссылка на «клетку» включает одну или несколько таких различных клеток, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные рядовому специалисту в данной области техники, которые могут быть модифицированы или заменены на способы, описанные в настоящей заявке.It should be understood that when used in this application and the claims, the singular includes the plural, unless the context clearly indicates otherwise. For example, a reference to a "cell" includes one or more of these different cells, and a reference to a "method" includes reference to equivalent steps and methods known to one of ordinary skill in the art, which may be modified or replaced by the methods described in this application.

Термин «клетка», использующийся в настоящей заявке, также относится к индивидуальным клеткам, линиям клеток, или культурам, полученным из таких клеток. «Культура» означает композицию, включающую изолированные клетки того же самого или отличающегося типа.The term "cell" as used in this application also refers to individual cells, cell lines, or cultures derived from such cells. "Culture" means a composition comprising isolated cells of the same or different type.

Термин «тотипотентные стволовые клетки», использующийся в настоящей заявке, относится к клеткам, обладающим способностью к дифференцировке во все клетки, составляющие организм, такие как клетки, полученные при слиянии яйцеклетки и сперматозоида. Клетки, полученные путем первых нескольких делений оплодотворенной яйцеклетки, также могут быть тотипотентными. Эти клетки могут дифференцироваться в эмбриональные и экстраэмбриональные типы клеток. Плюрипотентные стволовые клетки, например, такие как ES клетки, могут давать начало любому типу клеток плода или взрослого организма. Однако по отдельности они не могут развиться в плод или взрослое животное, поскольку не обладают потенциалом к развитию экстраэмбриональной ткани. Экстраэмбриональная ткань является, например, полученной из экстраэмбриональной энтодермы, и может дополнительно классифицироваться на париетальную энтодерму (мембрану Рейхерта) и висцеральную энтодерму (образует часть желточного мешка). Как париетальная, так и висцеральная энтодерма поддерживают развитие эмбриона, но сами не образую эмбриональных структур. Также существуют другие экстраэмбриональные ткани, включая экстраэмбриональную мезодерму и экстраэмбриональную эктодерму.The term "totipotent stem cells" as used in this application refers to cells that have the ability to differentiate into all the cells that make up an organism, such as cells obtained from the fusion of an egg and a sperm cell. Cells obtained by the first few divisions of a fertilized egg can also be totipotent. These cells can differentiate into embryonic and extraembryonic cell types. Pluripotent stem cells, such as ES cells, can give rise to any type of fetal or adult cell. However, individually, they cannot develop into a fetus or an adult animal, since they do not have the potential to develop extraembryonic tissue. Extraembryonic tissue is, for example, derived from extraembryonic endoderm, and can be further classified into parietal endoderm (Reichert membrane) and visceral endoderm (forms part of the yolk sac). Both the parietal and visceral endoderm support the development of the embryo, but do not themselves form embryonic structures. Other extraembryonic tissues also exist, including extraembryonic mesoderm and extraembryonic ectoderm.

В некоторых вариантах осуществления «плюрипотентную клетку» применяют в качестве исходного материала для дифференцировки в энтодермальную линию, или более конкретно, в типы клеток панкреатической энтодермы. Термин «плюрипотентность» или «плюрипотентные клетки», использующийся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают клетки, которые способны как к пролиферации в культуре клеток, так и к дифференцировке в множество линиеспецифических популяций клеток, которые проявляют мультипотентные свойства; например, и плюрипотентные ES клетки, и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки могут давать начало каждой из трех эмбриональных линий клеток. Однако плюрипотентные клетки не обладают способностью к образованию целого организма. То есть, плюрипотентные клетки не являются тотипотентными.In some embodiments, a "pluripotent cell" is used as a starting material for differentiation into an endodermal lineage, or more specifically, into pancreatic endoderm cell types. The term "pluripotency" or "pluripotent cells" as used in this application, or their equivalents, means cells that are capable of both proliferation in cell culture and differentiation into a variety of lineage-specific cell populations that exhibit multipotent properties; for example, both pluripotent ES cells and induced pluripotent stem (iPS) cells can give rise to each of three embryonic cell lines. However, pluripotent cells do not have the ability to form a whole organism. That is, pluripotent cells are not totipotent.

В некоторых вариантах осуществления плюрипотентные клетки, применяемые в качестве исходного материала, являются стволовыми клетками, включая hES клетки, hEG клетки, iPS клетки, даже партеногенные клетки и тому подобные. Термин «эмбриональные», использующийся в настоящей заявке, означает ряд стадий развития организма, начиная от единственной зиготы, и заканчивая многоклеточной структурой, которая больше не содержит плюрипотентных или тотипотентных клеток, отличных от развитых половых клеток. В дополнение к эмбриону, полученному при слиянии гамет, термин «эмбриональный» относится к эмбриону, полученному путем переноса ядра соматической клетки. В еще одном варианте осуществления плюрипотентные клетки не получены или не получены непосредственно из эмбриона, например, iPS клетки получены из не-плюрипотентной клетки, например, мультипотентной клетки или окончательно дифференцированной клетки.In some embodiments, the pluripotent cells used as starting material are stem cells, including hES cells, hEG cells, iPS cells, even parthenogenic cells, and the like. The term "embryonic" as used in this application means a series of developmental stages of an organism, ranging from a single zygote to a multicellular structure that no longer contains pluripotent or totipotent cells other than developed germ cells. In addition to a gamete fusion embryo, the term "embryonic" refers to an embryo obtained by transferring the nucleus of a somatic cell. In yet another embodiment, the pluripotent cells are not obtained or obtained directly from the embryo, for example, iPS cells are obtained from a non-pluripotent cell, for example, a multipotent cell or a definitively differentiated cell.

Плюрипотентные стволовые клетки человека также могут быть определены или охарактеризованы по наличию некоторых факторов транскрипции и белков поверхности клеток, включая факторы транскрипции Oct-4, Nanog и Sox-2, которые формируют коровый регуляторный комплекс, обеспечивающий супрессию генов, приводящих к дифференцировке и поддержанию плюрипотентности; и антигены поверхности клеток, такие как гликолипиды SSEA3, SSEA4 и кератансульфатные антигены, Tra-1 -60 and Tra-1-81.Human pluripotent stem cells can also be identified or characterized by the presence of several transcription factors and cell surface proteins, including the transcription factors Oct-4, Nanog and Sox-2, which form a core regulatory complex that suppresses genes leading to differentiation and maintenance of pluripotency; and cell surface antigens such as the glycolipids SSEA3, SSEA4 and keratan sulfate antigens, Tra-1-60 and Tra-1-81.

Термин «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» или «iPS клетки» или «iPSC», использующийся в настоящей заявке, означает тип плюрипотентных стволовых клеток, искусственно полученных из не-плюрипотентной клетки, как правило, взрослой соматической клетки, или окончательно дифференцированной клетки, такой как фибробласт, гемопоэтическая клетка, миоцит, нейрон, эпидермальная клетка, или тому подобной, путем вставки некоторых генов или продуктов генов, обозначаемых как факторы перепрограммирования. См. Takahashi et al., Cell 131:861-872 (2007); Wernig et al., Nature 448:318-324 (2007); Park et al., Nature 451:141-146 (2008), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки по существу подобны натуральным плюрипотентным стволовым клеткам человека, таким как hES клетки, во многих отношениях, включая экспрессию некоторых генов и белков стволовых клеток, характер метилирования хроматина, время удвоения, формирование эмбриоидных телец, формирование тератомы, формирование жизнеспособной химеры, и потенцию и способность к дифференцировке. iPS клетки человека обеспечивают источник плюрипотентных стволовых клеток без сопутствующего применения эмбрионов.The term "induced pluripotent stem cells" or "iPS cells" or "iPSC" as used herein means a type of pluripotent stem cells artificially derived from a non-pluripotent cell, typically an adult somatic cell, or a terminally differentiated cell such as fibroblast, hematopoietic cell, myocyte, neuron, epidermal cell, or the like, by inserting certain genes or gene products designated as reprogramming factors. See Takahashi et al., Cell 131: 861-872 (2007); Wernig et al. Nature 448: 318-324 (2007); Park et al., Nature 451: 141-146 (2008), which are fully incorporated herein by reference. Induced pluripotent stem cells are essentially similar to natural human pluripotent stem cells such as hES cells in many ways, including the expression of certain stem cell genes and proteins, chromatin methylation patterns, doubling times, embryoid body formation, teratoma formation, viable chimera formation, and potency and ability to differentiate. Human iPS cells provide a source of pluripotent stem cells without the concomitant use of embryos.

Могут применяться различные способы получения iPS клеток, которые более подробно описаны ниже. Однако все методологии используют определенные перепрограммирующие факторы, включающие кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, Nanog и факультативно Lin-28, или кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, K1f4 и факультативно c-myc, или кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, и факультативно Esrrb. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти перепрограммирующие факторы, могут быть в одной и той же кассете экспрессии, различных кассетах экспрессии, одном и том же перепрограммирующем векторе, или различных перепрограммирующих векторах. Oct-3/4 и некоторые члены семейства генов Sox (Sox-1, Sox-2, Sox-3 и Sox-15) являются ключевыми регуляторами транскрипции, вовлеченными в индукцию процесса, чье отсутствие делает индукцию невозможной. Oct-3/4 (Pou5fl) является одним из семейства октамерных («Oct») факторов транскрипции, и играет важную роль в поддержании плюрипотентности. Например, отсутствие Oct-3/4 в нормально Oct-3/4+ клетках, таких как бластомеры и эмбриональные стволовые клетки, приводит к спонтанной дифференцировке трофобласта; в то время как присутствие Oct-3/4 дает начало плюрипотентности и потенциалу дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Кроме того, другие гены в семействе «Oct», например, Oct1 и Oct6, не индуцируют плюрипотентность; таким образом, этот процесс индукции плюрипотентности может быть связан с Oct-3/4. Другим семейством генов, связанных с поддержанием плюрипотентности, подобно Oct-3/4, является семейство Sox. Однако семейство Sox не является исключительным для плюрипотентных типов клеток, но также связано с мультипотентными и унипотентными стволовыми клетками. Было установлено, что семейство Sox работает также в процессе индукции. Исходные исследования Takahashi et al., 2006 ранее использовали Sox2. С того времени гены Sox1, Sox3, Sox15 и Sox18 также генерировали iPS клетки. K1f4 из семейства генов K1f (K1f-1, K1f2, K1f4 и K1f5) был исходно идентифицирован Yamanaka et al. 2006 ранее, в качестве фактора генерации iPS клеток мыши. iPS клетки человека из S. Yamanaka были использованы в настоящей заявке для осуществления клеточных терапевтических приложений hIPS клеток. Однако, Yu et al. 2007 ранее сообщали, что K1f4 не требовался, и фактически был неспособен к получения iPS клеток человека. Другие члены семейства K1f способны к генерации iPS клеток, включая K1f1, K1f2 и K1f5. Наконец, прото-онкогены семейства Мус (C-myc, L-myc и N-myc) вовлечены в патогенез рака; с-myc является фактором, вовлеченным в получение iPS клеток мыши и человека, но Yu et al. (2007) ранее сообщал, что с-myc не требовался для генерации iPS клеток человека.Various methods of producing iPS cells can be used and are described in more detail below. However, all methodologies use certain reprogramming factors, including expression cassettes encoding Sox-2, Oct-4, Nanog and optionally Lin-28, or expression cassettes encoding Sox-2, Oct-4, K1f4 and optionally c-myc, or cassettes expressions encoding Sox-2, Oct-4, and optionally Esrrb. The nucleic acids encoding these reprogramming factors can be in the same expression cassette, different expression cassettes, the same reprogramming vector, or different reprogramming vectors. Oct-3/4 and some members of the Sox gene family (Sox-1, Sox-2, Sox-3, and Sox-15) are key transcriptional regulators involved in the induction process, whose absence makes induction impossible. Oct-3/4 (Pou5fl) is one of the family of octameric ("Oct") transcription factors, and plays an important role in maintaining pluripotency. For example, the absence of Oct-3/4 in normally Oct-3/4 + cells such as blastomeres and embryonic stem cells leads to spontaneous trophoblast differentiation; while the presence of Oct-3/4 gives rise to pluripotency and differentiation potential of embryonic stem cells. In addition, other genes in the "Oct" family, such as Oct1 and Oct6, do not induce pluripotency; thus, this pluripotency induction process may be related to Oct-3/4. Another family of genes associated with the maintenance of pluripotency, like Oct-3/4, is the Sox family. However, the Sox family is not exclusive to pluripotent cell types, but is also associated with multipotent and unipotent stem cells. The Sox family has been found to work in the induction process as well. The original studies by Takahashi et al., 2006 previously used Sox2. Since then, the genes Sox1, Sox3, Sox15 and Sox18 have also generated iPS cells. K1f4 from the K1f gene family (K1f-1, K1f2, K1f4 and K1f5) was originally identified by Yamanaka et al. 2006 earlier, as a factor in the generation of mouse iPS cells. Human iPS cells from S. Yamanaka have been used herein to carry out cellular therapeutic applications of hIPS cells. However, Yu et al. 2007 previously reported that K1f4 was not required and was actually incapable of producing iPS human cells. Other members of the K1f family are capable of generating iPS cells, including K1f1, K1f2, and K1f5. Finally, proto-oncogenes of the Myc family (C-myc, L-myc and N-myc) are involved in the pathogenesis of cancer; c-myc is a factor involved in the production of mouse and human iPS cells, but Yu et al. (2007) previously reported that c-myc was not required for the generation of human iPS cells.

Термины «мультипотентность» или «мультипотентная клетка», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают тип клеток, который может давать начало ограниченному количеству других конкретных типов клеток. То есть, мультипотентные клетки являются коммитированными для одного или нескольких эмбриональных клеточных зачатков, и таким образом, в отличие от плюрипотентных клеток, не могут давать начало каждой из трех эмбриональных линий клеток, а также экстраэмбриональных клеток. Мультипотентные соматические клетки являются более дифференцированными, по сравнению с плюрипотентными клетками, но не являются окончательно дифференцированными. Плюрипотентные клетки, таким образом, обладают более высокой потенцией, чем мультипотентные клетки. Факторы, определяющие потенцию, которые могут перепрограммировать соматические клетки или использоваться для генерации iPS клеток, включают такие факторы, как Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 или их комбинации, но не ограничиваются ими.The terms "multipotency" or "multipotent cell" as used herein, or their equivalents, mean a cell type that can give rise to a limited number of other specific cell types. That is, multipotent cells are committed to one or more embryonic cell rudiments, and thus, unlike pluripotent cells, cannot give rise to each of the three embryonic cell lines, as well as extraembryonic cells. Multipotent somatic cells are more differentiated than pluripotent cells, but they are not completely differentiated. Pluripotent cells thus have a higher potency than multipotent cells. Potency determinants that can reprogram somatic cells or be used to generate iPS cells include factors such as Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 or combinations thereof, but not limited to them.

Термин «агент, активирующий тирозинкиназу ERBB рецептора», использующийся в настоящей заявке, включает по меньшей мере 16 различных лигандов семейства EGF, связывающихся с ERBB рецепторами: EGF (эпидермальный фактор роста), AG или AREG (амфирегулин), и TGF-α (трансформирующий фактор роста-альфа), Btc (бетацеллюлин), HBEGF (гепарин-связывающий EGF), и Ereg (эпирегулин), нейрегулины (или херегулины), такие как нейрегулин-1, -2, -3 и -4 (или херегулин-1, -2, -3 and -4), но не ограничивается ими. Однако настоящее изобретение подразумевает любой лиганд, способный к связыванию с любым одним из четырех ERBB рецепторов или их комбинацией для индукции образования гомо- и гетеродимерных рецепторных комплексов, приводя к активации мембранного киназного домена и последующему фосфорилированию. См. также Таблицу 11.The term “ERBB receptor tyrosine kinase activating agent” as used herein includes at least 16 different ligands of the EGF family that bind to ERBB receptors: EGF (epidermal growth factor), AG or AREG (amphiregulin), and TGF-α (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), and Ereg (epiregulin), neuregulins (or heregulins) such as neuregulin-1, -2, -3 and -4 (or heregulin-1 , -2, -3 and -4), but is not limited to them. However, the present invention contemplates any ligand capable of binding to any one of the four ERBB receptors or a combination thereof to induce the formation of homo- and heterodimeric receptor complexes, leading to activation of the membrane kinase domain and subsequent phosphorylation. See also Table 11.

Некоторые варианты осуществления способов получения инсулина, описанные в настоящей заявке, могут включать лечение животных, страдающих диабетом, или контроль концентрации глюкозы в крови животного, путем обеспечения животного панкреатическими энтодермальными клетками, которые могут созревать in vivo в инсулин-продуцирующие клетки, которые секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.Some embodiments of the methods for producing insulin described herein may include treating diabetic animals or controlling the blood glucose concentration of the animal by providing the animal with pancreatic endodermal cells that can mature in vivo into insulin-producing cells that secrete insulin into the animal. response to glucose stimulation.

Один аспект, описанный в настоящей заявке, включает популяции плюрипотентных клеток или клеток-предшественников, которые способны к избирательному, и в некоторых аспектах к избирательно обратимому развитию в различные линии клеток при культивировании в подходящих условиях. Термин «популяция», использующийся в настоящей заявке, относится к культуре клеток более чем из одной клетки, обладающей одними и теми же идентификационным характеристиками. Термин «клеточная линия» означает все стадии развития типа клетки, от самой ранней клетки-предшественника до полностью созревшей клетки (т.е. специализированной клетки). «Клетка-предшественник» или «прогениторная клетка» может быть любой клеткой на пути дифференцировки клеток, способной к дифференцировке в более зрелую клетку. Как таковая, клетка-предшественник может быть плюрипотентной клеткой, или она может быть частично дифференцированной мультипотентной клеткой, или обратимо дифференцированной клеткой. Термин «популяция клеток-предшественников» означает группу клеток, способных к развитию в более зрелый или дифференцированный тип клетки. Популяция клеток-предшественников может содержать клетки, являющиеся плюрипотентными, клетки, которые являются линиеспецифическими стволовым клетками (т.е. клетками, способными развиваться в клетки не всех эктодермальных линий, или например, клетками только нейрональной линии), и клетки, которые являются обратимо линиеспецифическими стволовыми клетками. Таким образом, термин «прогениторная клетка» или «клетка-предшественник» может означать «плюрипотентную клетку» или «мультипотентную клетку».One aspect described in this application includes populations of pluripotent or progenitor cells that are capable of selectively, and in some aspects selectively reversible, development into different cell lines when cultured under suitable conditions. The term "population" as used in this application refers to a cell culture from more than one cell having the same identification characteristics. The term "cell line" refers to all stages of development of a cell type, from the earliest progenitor cell to a fully matured cell (ie, specialized cell). A "progenitor cell" or "progenitor cell" can be any cell in the cell differentiation pathway capable of differentiating into a more mature cell. As such, the progenitor cell can be a pluripotent cell, or it can be a partially differentiated multipotent cell, or a reversibly differentiated cell. The term "progenitor cell population" means a group of cells capable of developing into a more mature or differentiated cell type. The progenitor cell population may contain cells that are pluripotent, cells that are lineage-specific stem cells (i.e., cells that are capable of developing into cells of not all ectodermal lines, or for example, cells of only a neuronal lineage), and cells that are reversibly line-specific. stem cells. Thus, the term "progenitor cell" or "progenitor cell" can mean "pluripotent cell" or "multipotent cell".

Термин «перепрограммирование», «перепрограммированная», использующийся в настоящей заявке, или их эквиваленты относятся к процессу, который обеспечивает для клетки измеримо повышенную способность к образованию потомства по меньшей мере одного нового типа клеток, в культуре или in vivo, по сравнению с теми же самыми условиями без перепрограммирования. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, соматические клетки «перепрограммированы» в плюрипотентные клетки. В некоторых аспектах соматические клетки перепрограммированы так, чтобы после достаточной пролиферации измеряемая часть клеток in vivo или в культуре клеток in vitro проявляла фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток. Без перепрограммирования такие соматические клетки не дают начало потомству, проявляющему фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток. Если даже без перепрограммирования соматические клетки могут давать начало потомству, проявляющему фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток, доля потомства этих соматических клеток, проявляющего фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток, измеримо увеличивается по сравнению с тем, что было до перепрограммирования.The term "reprogramming", "reprogramming" as used in this application, or their equivalents, refers to a process that provides a cell with a measurably increased ability to produce offspring of at least one new cell type, in culture or in vivo, compared to the same the very conditions without reprogramming. In some embodiments, the implementation described in this application, the somatic cells are "reprogrammed" into pluripotent cells. In some aspects, somatic cells are reprogrammed so that, after sufficient proliferation, a measurable proportion of cells in vivo or in in vitro cell culture exhibit the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type. Without reprogramming, such somatic cells do not give rise to offspring exhibiting the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type. Even if, even without reprogramming, somatic cells can give rise to offspring exhibiting the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type, the proportion of the offspring of these somatic cells exhibiting the phenotypic characteristics of the new pluripotent cell type is measurably increased compared to what it was before the reprogramming.

Выражение «перепрограммирование дифференцировки», использующееся в настоящей заявке, относится к процессу, изменяющему клетку до образования потомства по меньшей мере одного нового типа клеток с новым статусом дифференцировки, либо в культуре, либо in vivo, по сравнению с теми же самыми условиями без перепрограммирования дифференцировки. Этот процесс включает дифференцировку, дедифференцировку и трансдифференцировку. Следовательно, выражение «дифференцировка», использующееся в настоящей заявке, означает процесс, при котором менее специализированные клетки становятся более специализированным типом клеток. Напротив, выражение «дедифференцировка» означает клеточный процесс, при котором частично или окончательно дифференцированные клетки обращаются на раннюю стадию развития, такую как клетки, обладающие плюрипотентностью или мультипотентностью. Далее, выражение «трансдифференцировка» означает процесс трансформации одного дифференцированного типа клеток в другой дифференцированный тип клеток.The expression "reprogramming of differentiation" as used herein refers to a process that alters a cell prior to the formation of progeny of at least one new cell type with a new differentiation status, either in culture or in vivo, compared to the same conditions without reprogramming differentiation ... This process includes differentiation, dedifferentiation, and transdifferentiation. Therefore, the expression "differentiation" as used in this application means a process by which less specialized cells become a more specialized type of cells. In contrast, the expression "dedifferentiation" means a cellular process in which partially or finally differentiated cells return to an early stage of development, such as cells with pluripotency or multipotency. Further, the expression "transdifferentiation" means the process of transformation of one differentiated cell type into another differentiated cell type.

Термины «развиваться из плюрипотентных клеток», «дифференцироваться из плюрипотентных клеток», «созревать из плюрипотентных клеток», или «продуцированный из плюрипотентных клеток», «полученный из плюрипотентных клеток», «дифференцированный из плюрипотентных клеток», использующееся в настоящей заявке, и эквивалентные выражения относятся к получения дифференцированного типа клеток из плюрипотентных клеток in vitro или in vivo, например, в случае эндокринных клеток, созревающих из трансплантированных PDX1 панкреатических энтодермальных клеток in vivo, как описано в Международной патентной заявке №PCT/US2007/015536, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Все такие термины относятся к развитию клетки от стадии с потенциалом дифференцировки по меньшей мере в две различных линии клеток до специализированной и окончательно дифференцированной клетки. Такие термины могут применяться взаимозаменяемо для целей настоящей заявки. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, подразумевают условия культивирования, позволяющие такой дифференцировке быть обратимой, так чтобы плюрипотентность или по меньшей мере способность к дифференцировке в более чем одну линию клеток могла быть избирательно восстановлена.The terms "develop from pluripotent cells", "differentiate from pluripotent cells", "mature from pluripotent cells", or "produced from pluripotent cells", "obtained from pluripotent cells", "differentiated from pluripotent cells" are used in this application, and equivalent expressions refer to the production of a differentiated cell type from pluripotent cells in vitro or in vivo, for example, in the case of endocrine cells maturing from PDX1 transplanted pancreatic endodermal cells in vivo, as described in International Patent Application No. PCT / US2007 / 015536, entitled "Methods obtaining pancreatic hormones ", the description of which is fully incorporated into the present description by reference. All such terms refer to the development of a cell from a stage with differentiation potential into at least two different cell lines to a specialized and definitively differentiated cell. Such terms can be used interchangeably for the purposes of this application. The embodiments described in this application imply culture conditions that allow such differentiation to be reversible, so that pluripotency, or at least the ability to differentiate into more than one cell line, can be selectively restored.

Термин «фидерная клетка» означает культуру клеток, выращенную in vitro и секретирующую по меньшей мере один фактор в культуральную среду, и которую можно применять для поддержания роста другой необходимой клетки в культуре. Термин «слой фидерных клеток», использующийся в настоящей заявке, может применяться взаимозаменяемо с термином «фидерная клетка». Фидерная клетка может включать монослой, где фидерные клетки покрывают поверхность культуральной чашки полным слоем перед ростом сверху других клеток, или может включать кластеры клеток. В предпочтительном варианте осуществления фидерная клетка включает адгезивный монослой.The term "feeder cell" means a cell culture grown in vitro and secreting at least one factor into the culture medium and which can be used to support the growth of another desired cell in culture. The term "feeder cell layer" as used herein may be used interchangeably with the term "feeder cell". The feeder cell may include a monolayer, where the feeder cells cover the surface of the culture dish with a full layer before growing on top of other cells, or may include clusters of cells. In a preferred embodiment, the feeder cell comprises an adhesive monolayer.

Термины «кластер» и «скопление» или «агрегат», использующиеся в настоящей заявке, могут применяться взаимозаменяемо, и обычно означают группу клеток, которая не диссоциирована на отдельные клетки. Кластеры могут диссоциироваться на более мелкие кластеры. Эта диссоциация обычно по природе осуществляется вручную (например, с применением пастеровской пипетки), но подразумеваются и другие средства диссоциации. Суспензия агрегатов плюрипотентных или мультипотентных культур клеток является по существу такой, как описано в Международных публикациях PCT/US2007/062755, озаглавленной «Композиции и способы культивирования дифференцированных клеток» и PCT/US2008/082356, озаглавленной «Суспензионные композиции агрегатов стволовых клеток и способы их дифференцировки», полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.The terms "cluster" and "clump" or "aggregate", as used in this application, can be used interchangeably, and usually means a group of cells that are not dissociated into individual cells. Clusters can dissociate into smaller clusters. This dissociation is usually done manually by nature (for example, using a Pasteur pipette), but other means of dissociation are contemplated. A suspension of pluripotent or multipotent cell culture aggregates is essentially as described in International Publications PCT / US2007 / 062755 entitled Compositions and Methods for Culturing Differentiated Cells and PCT / US2008 / 082356 entitled Suspension Compositions of Stem Cell Aggregates and Methods for Their Differentiation ", Fully incorporated into this description by reference.

Подобным образом, варианты осуществления, в которых плюрипотентные культуры клеток или агрегатные плюрипотентные суспензионные культуры растут в определенных условиях без применения фидерных клеток, являются «бесфидерными». Бесфидерные способы культивирования повышают масштабируемость и воспроизводимость плюрипотентной культуры клеток и снижают риск контаминации, например, инфекционными агентами из фидерных клеток или других компонентов культур животного происхождения. Бесфидерные способы также описаны в патенте США №6,800,480, Bodnar et al. (принадлежит Geron Corporation, Менло-Парк, Калифорния). Однако, и в отличие от патента США №6,800,480, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, являющиеся плюрипотентными, мультипотентными или дифференцированными культурами клеток, являются бесфидерными и не содержат дополнительно эндогенного или экзогенного экстрацеллюлярного матрикса, т.е. культуры, описанные в настоящей заявке, свободны от экстрацеллюлярного матрикса, а также являются бесфидерными. Например, в патенте США №6,800,480 экстрацеллюлярный матрикс готовят путем культивирования фибробластов, лизиса фибробластов in situ, с последующим отмыванием того, что осталось после лизиса. Альтернативно, в патенте США №6,800,480 экстрацеллюлярный матрикс может также быть приготовлен из изолированного компонента матрикса или комбинации компонентов, выбранных из коллагена, плацентарного матрикса, фибронектина, ламинина, мерозина, тенасцина, гепаринсульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, агтрекана, бигликана, тромбоспондина, витронектина и декорина. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, не продуцируют экстрацеллюлярный матрикс путем роста фидерного или фибробластного слоя и лизиса клеток для получения экстрацеллюлярного матрикса; и не требуют первоначального покрывания сосуда для культивирования ткани компонентом экстрацеллюлярного матрикса или комбинацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса, выбранных из коллагена, плацентарного матрикса, фибронектина, ламинина, мерозина, тенасцина, гепаринсульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, аггрекана, бигликана, тромбоспондина, витронектина и декорина. Следовательно, агрегатные суспензионные культуры, описанные в настоящей заявке для плюрипотентных, мультипотентных и дифференцированных клеток, не требуют фидерного слоя, лизированных фидерных или фибробластных клеток для получения покрытия из экстрацеллюлярного матрикса, экзогенно добавленного экстрацеллюлярного матрикса или компонента матрикса; скорее применение растворимого компонента сыворотки человека, как описано в Международной заявке PCT/US2008/080516, озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерной среды для плюрипотентных стволовых клеток, содержащей сыворотку человека», полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки, преодолевает потребность в фидерных клетках или фидерном монослое, а также преодолевает потребность в эндогенном экстрацеллюлярном матриксе из фидерной или фибробластной клетки или из экзогенно добавленных компонентов экстрацеллюлярного матрикса.Likewise, embodiments in which pluripotent cell cultures or aggregate pluripotent suspension cultures are grown under specified conditions without using feeder cells are “feederless”. Feederless culture methods increase the scalability and reproducibility of pluripotent cell culture and reduce the risk of contamination, for example, by infectious agents from feeder cells or other components of animal cultures. Feederless methods are also described in US Pat. No. 6,800,480 to Bodnar et al. (owned by Geron Corporation, Menlo Park, California). However, and unlike US Pat. No. 6,800,480, the embodiments described herein, which are pluripotent, multipotent, or differentiated cell cultures, are feederless and do not additionally contain endogenous or exogenous extracellular matrix, i. E. the cultures described in this application are free of extracellular matrix and are also feederless. For example, in US Pat. No. 6,800,480, an extracellular matrix is prepared by culturing fibroblasts, lysis of the fibroblasts in situ, followed by washing what remains after lysis. Alternatively, in US Pat. No. 6,800,480, the extracellular matrix can also be prepared from an isolated matrix component or a combination of components selected from collagen, placental matrix, fibronectin, laminin, merosine, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, iiginalikanospin, vitronospherecan decor. The embodiments described herein do not produce extracellular matrix by growth of a feeder or fibroblast layer and lysis of cells to produce extracellular matrix; and does not require the initial coating of the tissue culture vessel with an extracellular matrix component or a combination of extracellular matrix components selected from collagen, placental matrix, fibronectin, laminin, merosine, tenascin, heparin sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, iiginaginagoronecantine, decanaginagoronecans Therefore, the aggregate suspension cultures described herein for pluripotent, multipotent and differentiated cells do not require a feeder layer, lysed feeder or fibroblast cells to obtain a coating of extracellular matrix, exogenously added extracellular matrix or matrix component; rather, the use of a soluble component of human serum, as described in International Application PCT / US2008 / 080516, entitled "Methods and Compositions for Feeder-Free Pluripotent Stem Cell Medium Containing Human Serum", which is hereby incorporated by reference in its entirety, overcomes the need for feeder cells or feeder monolayer, and also overcomes the need for an endogenous extracellular matrix from a feeder or fibroblast cell or from exogenously added extracellular matrix components.

В предпочтительных вариантах осуществления способы культивирования не включают продуктов животного происхождения. В другом предпочтительном варианте осуществления способы культивирования не содержат ксеногенных продуктов. В еще более предпочтительных вариантах осуществления одно или несколько условий или требований для коммерческого производства лечебных средств на основе клеток человека удовлетворяются или соответствуют лучшим показателям с помощью способов культивирования, описанных в настоящей заявке.In preferred embodiments, the cultivation methods do not include animal products. In another preferred embodiment, the culture methods do not contain xenogenic products. In even more preferred embodiments, one or more of the conditions or requirements for the commercial production of human cell therapies are met or better matched by the culture methods described herein.

Популяция плюрипотентных клеток может быть далее культивирована в присутствии некоторых дополнительных факторов роста для получения популяции клеток, которые являются или будут развиваться в различные линии клеток, или могут быть избирательно обратимыми, чтобы быть способными к развитию в различные линии клеток. Термин «дополнительный фактор роста» используется в самом широком контексте, и означает вещество, эффективное для активации роста плюрипотентной клетки, поддержания выживания клетки, стимуляции дифференцировки клетки и/или стимуляции обращения дифференцировки клетки. Далее, дополнительный фактор роста может быть веществом, секретируемым фидерной клеткой в среду. Такие вещества включают цитокины, хемокины, малые молекулы, нейтрализующие антитела, и белки, но не ограничиваются ими. Факторы роста могут также включать межклеточные сигнальные полипептиды, которые контролируют развитие и поддержание клетки, а также форму и функции тканей. В предпочтительных вариантах осуществления дополнительный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF), онкостатина М (OSM), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), интерлейкина-6 (IL-6) в комбинации с растворимым рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), фактора роста фибробластов (FGF), костного морфогенетического белка (BMP), фактора некроза опухоли (TNF), и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).The population of pluripotent cells can be further cultured in the presence of certain additional growth factors to obtain a population of cells that are or will develop into different cell lines, or can be selectively reversible to be able to develop into different cell lines. The term "additional growth factor" is used in its broadest context, and means a substance effective to activate the growth of a pluripotent cell, maintain cell survival, stimulate cell differentiation and / or stimulate the reversal of cell differentiation. Further, the additional growth factor can be a substance secreted by the feeder cell into the environment. Such substances include, but are not limited to, cytokines, chemokines, small molecules that neutralize antibodies, and proteins. Growth factors can also include intercellular signaling polypeptides that control cell development and maintenance, and tissue shape and function. In preferred embodiments, the additional growth factor is selected from the group consisting of stem cell factor (SCF), oncostatin M (OSM), ciliary neurotrophic factor (CNTF), interleukin-6 (IL-6) in combination with a soluble interleukin-6 receptor ( IL-6R), fibroblast growth factor (FGF), bone morphogenetic protein (BMP), tumor necrosis factor (TNF), and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).

В некоторых способах получения клеток, как описано в настоящей заявке, факторы роста удаляют из культуры клеток или популяции клеток после их добавления. Например, фактор роста, такой как активин А, активны В, GDF-8 или GDF-11, можно добавить и удалить в пределах примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно четырех дней, примерно пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления. В некоторых вариантах осуществления факторы дифференцировки не удаляют из культуры клеток.In some methods of obtaining cells, as described in this application, growth factors are removed from the cell culture or cell population after adding them. For example, a growth factor such as activin A, active B, GDF-8 or GDF-11, can be added and removed within about one day, about two days, about three days, about four days, about five days, about six days , about seven days, about eight days, about nine days, or about ten days after adding them. In some embodiments, the differentiation factors are not removed from the cell culture.

Поскольку эффективность процесса дифференцировки можно регулировать путем модификации определенных параметров, которые включают условия роста клеток, концентрации факторов роста и продолжительность этапов культивирования, но не ограничиваются ими, процедуры дифференцировки, описанные в настоящей заявке, могут приводить примерно к 5%, примерно к 10%, примерно к 15%, примерно к 20%, примерно к 25%, примерно к 30%, примерно к 35%, примерно к 40%, примерно к 45%, примерно к 50%, примерно к 55%, примерно к 60%, примерно к 65%, примерно к 70%, примерно к 75%, примерно к 80%, примерно к 85%, примерно к 90%, примерно к 95%, или к более чем примерно 95% превращению плюрипотентных клеток, которые включают индуцированные плюрипотентные клетки, к мультипотентным или дифференцированным клеткам, например, окончательной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1 со-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2 со-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующим эндокринным клеткам или INS, GCG, GHRL, SST, РР единично-позитивным эндокринным клеткам. В способах, в которых применяют выделение клеток препервичной полоски или мезоэнтодермальных клеток, можно выделить по существу чистую популяцию клеток препервичной полоски или мезоэнтодермы.Since the efficiency of the differentiation process can be controlled by modifying certain parameters, which include, but are not limited to, the conditions for cell growth, the concentration of growth factors and the duration of the culture steps, the differentiation procedures described in this application can lead to about 5%, about 10%. about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, or more than about 95% conversion of pluripotent cells that include induced pluripotent cells, to multipotent or differentiated cells, for example, terminal endoderm, anterior endoderm, PDX1-positive endoderm of the anterior digestive tract, PDX1-positive pancreatic endoderm, or PDX1 / NKX6. 1 co-positive pancreatic endocrine endocrine precursor or NGN3 / NKX2.2 co-positive endocrine precursor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP single-positive endocrine cells. In methods that use the isolation of preprimary streak cells or mesoentoderm cells, a substantially pure population of preprimary streak or mesoentoderm cells can be isolated.

Различные композиции клеток, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, описаны в настоящей заявке. Один вариант осуществления включает iPS клетки и клетки, полученные из них. Другие способы и композиции, родственные, но отличающиеся от вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, можно найти в предварительной заявке на патент США №60/532,004, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2003; предварительной заявке на патент США №60/566,293, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 27 апреля 2004; предварительной заявке на патент США №60/586,566, озаглавленной «Хемокиновый рецептор поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы», поданной 9 июля 2004; предварительной заявке на патент США №60/587,942, озаглавленной «Хемокиновый рецептор поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы», поданной 14 июля 2004; патентной заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004; и патентной заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005; патентной заявке США №11/165,305, озаглавленной «Способы идентификации факторов для дифференцировки дефинитивной энтодермы», поданной 23 июня, 2005; предварительной патентной заявке США №60/730,917, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2005; предварительной патентной заявке США №60/736,598, озаглавленной «Маркеры дефинитивной энтодермы», поданной 14 ноября 2005; предварительной патентной заявке США №60/778,649, озаглавленной «Инсулин-продуцирующие клетки и способ их получения», поданной 2 марта 2006; предварительной патентной заявке США №60/833,633, озаглавленной «Инсулин-продуцирующие клетки и способ их получения», поданной 26 июля 2006; предварительной патентной заявке США №60/852,878, озаглавленной «Обогащение эндокринных клеток-предшественников, незрелых клеток панкреатических островков и зрелых клеток панкреатических островков с применением NCAM», поданной 18 октября 2006; патентной заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006; патентной заявке США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марат 2007; патентной заявке США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля, 2007; патентной заявке США №60/972,174, озаглавленной «Способы лечения диабета», поданной 13 сентября 2007; патентной заявке США №11/860,494, озаглавленной «Способы увеличения получения дефинитивной энтодермы», поданной 24 сентября 2007; патентной заявке США №60/977,349, озаглавленной «Маркеры поверхности клеток эмбриональных стволовых клеток человека и раковых стволовых клеток», поданной 3 октября 2007; и патентной заявке США №12/099,759, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 8 апреля 2008; и патентной заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермальных и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека», поданной 21 апреля 2008, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Various cell compositions derived from pluripotent stem cells are described herein. One embodiment includes iPS cells and cells derived therefrom. Other methods and compositions related to, but different from, the embodiments described herein can be found in US Provisional Patent Application No. 60 / 532,004, entitled “Definitive Endoderm,” filed December 23, 2003; US Provisional Patent Application No. 60 / 566,293, entitled "PDX1 Expressing Endoderm," filed April 27, 2004; US Provisional Application Serial No. 60 / 586,566, entitled "Cell Surface Chemokine Receptor for Secretion of Definitive Endoderm," filed July 9, 2004; US Provisional Patent Application No. 60 / 587,942, entitled "Cell Surface Chemokine Receptor for Secretion of Definitive Endoderm," filed July 14, 2004; US Patent Application No. 11/021,618, entitled “Definitive Endoderm,” filed December 23, 2004; and US Patent Application No. 11 / 115,868 entitled "PDX1 Expressing Endoderm" filed April 26, 2005; US Patent Application No. 11/165,305, entitled “Methods for Identifying Factors for Differentiating a Definitive Endoderm,” filed June 23, 2005; US Provisional Patent Application No. 60/730,917, entitled “PDX1-Expressing Dorsal and Ventral Endoderm of the Anterior Gastrointestinal Tract,” filed October 27, 2005; US Provisional Patent Application No. 60/736,598, entitled “Markers of Definitive Endoderm,” filed November 14, 2005; US Provisional Patent Application No. 60/778,649, entitled "Insulin-Producing Cells and a Method for Their Production," filed March 2, 2006; US Provisional Patent Application No. 60 / 833,633, entitled "Insulin-Producing Cells and a Method for Their Production," filed July 26, 2006; US Provisional Patent Application No. 60/852,878, entitled "Enrichment of Endocrine Progenitor Cells, Immature Pancreatic Islet Cells and Mature Pancreatic Islet Cells Using NCAM," filed October 18, 2006; US Patent Application No. 11 / 588,693, entitled "PDX1-Expressing Dorsal and Ventral Endoderm of the Anterior Gastrointestinal Tract," filed October 27, 2006; US Patent Application No. 11 / 681,687, entitled "Endocrine Progenitor Cells, Pancreatic Hormone Expressing Cells and Methods for Making Them", filed March 2, 2007; US Patent Application No. 11 / 773,944, entitled "Methods for Making Pancreatic Hormones," filed July 5, 2007; US Patent Application No. 60/972,174, entitled "Methods for Treating Diabetes," filed September 13, 2007; US Patent Application No. 11 / 860,494, entitled "Methods for Enhancing Production of Definitive Endoderm," filed September 24, 2007; US Patent Application No. 60 / 977,349, entitled "Cell Surface Markers of Human Embryonic Stem Cells and Cancer Stem Cells," filed October 3, 2007; and US Patent Application No. 12 / 099,759, entitled "Methods for Making Pancreatic Hormones," filed April 8, 2008; and US Patent Application No. 12 / 107,020, entitled "Methods for Purifying Endodermal and Pancreatic Endodermal Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells," filed April 21, 2008, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Общие способы получения клеток энтодермальных линий, полученных из hES клеток, описаны в родственных заявках США, как указано выше, и в D'Amour et al. 2005 Nat Biotechnol. 23:1534-41 и D'Amour et al. 2006 Nat Biotechnol. 24(11):1392-401, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. D'Amour et al. описывают 5-этапный протокол дифференцировки: этап 1 (приводит в основном к получения дефинитивной энтодермы); этап 2 (приводит в основном к получения PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта); этап 3 (приводит в основном к получения PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта); этап 4 (приводит в основном к получения панкреатической энтодермы или панкреатического эндокринного предшественника) и этап 5 (приводит в основном к получения гормон-экспрессирующих эндокринных клеток).General methods of obtaining endodermal cell lineages derived from hES cells are described in related US applications, as noted above, and in D'Amour et al. 2005 Nat Biotechnol. 23: 1534-41 and D'Amour et al. 2006 Nat Biotechnol. 24 (11): 1392-401, the descriptions of which are fully incorporated into the present description by reference. D'Amour et al. describe a 5-stage differentiation protocol: stage 1 (leads mainly to obtaining a definitive endoderm); stage 2 (leads mainly to the production of PDX1-negative endoderm of the anterior part of the digestive tract); stage 3 (leads mainly to obtaining PDX1-positive endoderm of the anterior part of the digestive tract); stage 4 (leads mainly to the production of pancreatic endoderm or pancreatic endocrine precursor) and stage 5 (leads mainly to the production of hormone-expressing endocrine cells).

Термин «трофоэктодерма» относится к мультипотентным клеткам с относительно высокой экспрессией маркеров, выбранных из группы, состоящей из HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, и ERRB генов, по сравнению с уровнями экспрессии HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, и ERRB в не-трофоэктодермальных клетках или популяциях клеток.The term "trophoectoderm" refers to multipotent cells with relatively high expression of markers selected from the group consisting of HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERRB genes, compared to levels expressing HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERRB in non-trophoectodermal cells or cell populations.

«Экстраэмбриональная энтодерма» означает мультипотентную клетку с относительно высокими уровнями экспрессии маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP генов, по сравнению с уровнями экспрессии SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP в не-экстраэмбриональных энтодермальных клетках или популяциях клеток."Extraembryonic endoderm" means a multipotent cell with relatively high levels of expression of markers selected from the group consisting of SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 or AFP genes, compared to the expression levels of SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 or AFP in non-extraembryonic endodermal cells or cell populations.

Термин «клетки препервичной полоски» относится к мультипотентным клеткам с относительно высокими уровнями экспрессии генов маркеров FGF8 и/или NODAL, по сравнению с клетками с низкой экспрессией BRACHURY, FGF4, SNAI1, SOX17, FOXA2, SOX7 и SOX1.The term “preprimary streak cells” refers to multipotent cells with relatively high levels of expression of FGF8 and / or NODAL marker genes, compared to cells with low expression of BRACHURY, FGF4, SNAI1, SOX17, FOXA2, SOX7, and SOX1.

Термин «мезоэнтодермальная клетка» относится к мультипотентной клетке с относительно высокими уровнями экспрессии генов маркеров BRACHURY, FGF4, SNAI1 MDCL1 и/или WNT3, по сравнению с клетками с низкой экспрессией SOX17, CXCR4, FOXA2, SOX7 и SOX1.The term "mesoendodermal cell" refers to a multipotent cell with relatively high levels of expression of the BRACHURY, FGF4, SNAI1 MDCL1 and / or WNT3 marker genes, compared to cells with low expression of SOX17, CXCR4, FOXA2, SOX7, and SOX1.

Термин «дефинитивная энтодерма (DE)» означает мультипотентную энтодермальную линию клеток, которая может дифференцироваться в клетки кишечной трубки или органы, полученные из кишечной трубки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клетки дефинитивной энтодермы являются клетками млекопитающих, а в предпочтительном варианте осуществления клетки дефинитивной энтодермы являются клетками человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют или незначительно экспрессируют некоторые маркеры. В некоторых вариантах осуществления один или несколько маркеров, выбранных из SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 и CRIP1, экспрессируются в клетках дефинитивной энтодермы. В других вариантах осуществления один или несколько маркеров, выбранных из ОСТ4, альфа-фетопротеина (AFP), тромбомодулина (ТМ), SPARC, SOX7 и HNF4-альфа, не экспрессируются или незначительно экспрессируются клетками дефинитивной энтодермы. Популяции клеток дефинитивной энтодермы и способы их получения также описаны в заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004, которая полностью включена в настоящее описание.The term "definitive endoderm (DE)" means a multipotent endoderm cell line that can differentiate into intestinal tube cells or intestinal tube-derived organs. In some embodiments, the cells of the definitive endoderm are mammalian cells, and in a preferred embodiment, the cells of the definitive endoderm are human cells. In some embodiments, implementation of the present invention cells of the definitive endoderm express or slightly express some markers. In some embodiments, one or more markers selected from SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, and CRIP1 are expressed in cells of the definitive endoderm. In other embodiments, one or more markers selected from OCT4, alpha-fetoprotein (AFP), thrombomodulin (TM), SPARC, SOX7, and HNF4-alpha are not expressed or are only slightly expressed by cells of the definitive endoderm. Populations of definitive endoderm cells and methods for their preparation are also described in US Application No. 11/021,618, entitled "Definitive endoderm," filed December 23, 2004, which is incorporated herein in its entirety.

Другие варианты осуществления относятся к культурам клеток, обозначенным как «PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта» или «энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», или их эквивалентами. В некоторых вариантах осуществления энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта экспрессируют SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4-альфа (HNF4A) и FOXA1 маркеры, но по существу не экспрессируют PDX1, AFP, SOX7, или SOX1. PDX1 -негативные популяции энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и способы их получения также описаны в заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.Other embodiments relate to cell cultures designated "PDX1 negative anterior endodermal cells" or "anterior endodermal endodermal cells", or their equivalents. In some embodiments, the anterior gut endodermal cells express SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4 alpha (HNF4A), and FOXA1 markers, but do not substantially express PDX1, AFP, SOX7, or SOX1. PDX1 negative populations of anterior gastrointestinal tract endodermal cells and methods for their preparation are also described in US Application No. 11 / 588,693 entitled "PDX1 Expressing Dorsal and Ventral Endoderm of the Anterior Gastrointestinal Tract," filed October 27, 2006, incorporated in its entirety by links.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся ккультурам клеток «PDX1-позитивных дорсальных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта» (дорсальных PDX1-позитивных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта» или просто «PDX1-позитивной энтодермы». В некоторых вариантах осуществления PDX1-позитивные энтодермальные клетки экспрессируют один или несколько маркеров, выбранных из Таблицы 1 и/или один или несколько маркеров, выбранных из таблицы 2, также описанных в родственной заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006, а также заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDXl-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.Other embodiments described herein relate to cell cultures of "PDX1-positive dorsal endodermal cells of the anterior gut" (dorsal PDX1-positive endoderm cells of the anterior gut "or simply" PDX1-positive endoderm ". In some embodiments, PDX1 -positive endodermal cells express one or more markers selected from Table 1 and / or one or more markers selected from Table 2, also described in related US application No. 11 / 588,693 entitled "PDX1-expressing dorsal and ventral endoderm of the anterior digestive path ", filed October 27, 2006, as well as US application No. 11 / 115,868, entitled" PDXl-expressing endoderm ", filed April 26, 2005, fully incorporated into the present description by reference.

PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, такие как те, что получены в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, являются предшественниками, которые могут использоваться для получения полностью дифференцированных панкреатических гормон-секретирующих или эндокринных клеток, например, инсулин-продуцирующих β-клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения PDXl-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта получают путем дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, которые по существу не экспрессируют PDX1 (PDX1 -негативные клетки дефинитивной энтодермы; также обозначаемые как дефинитивная энтодерма), до формирования PDX1-позитивных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта.PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, such as those prepared according to the methods described herein, are precursors that can be used to produce fully differentiated pancreatic hormone-secreting or endocrine cells, e.g., insulin-producing β -cells. In some embodiments, PDXl-positive endoderm cells of the anterior digestive tract are obtained by differentiation of definitive endoderm cells that do not substantially express PDX1 (PDX1-negative definitive endoderm cells; also referred to as definitive endoderm), prior to the formation of PDX1-positive endoderm cells. the front of the digestive tract.

Термины «панкреатическая энтодерма», «панкреатический эпителиальный», «панкреатический эпителий» (сокращенно «РЕ»), «панкреатический прогенитор», «PDX-1 позитивная панкреатическая энтодерма», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты, такие как панкреатические энтодермальные клетки («РЕС»), все являются предшественниками или прогениторными панкреатическими клетками. РЕС, как описано в настоящей заявке, является популяцией прогениторных клеток после 4 стадии дифференцировки (примерно 12-14 день) и включает по меньшей мере две основных различных популяции: (i) панкреатические прогениторные клетки, которые экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA (или CHGA-негативные, CHGA-); и (ii) полигормональные эндокринные клетки, которые экспрессируют CHGA (CHGA-позитивные, CHGA+). Не углубляясь в теорию, полагают, чтопопуляция клеток, которая экспрессирует NKX6.1, но не CHGA, является более активным или терапевтическим компонентом РЕС, в то время как популяция CHGA-позитивных полигормональных эндокринных клеток далее дифференцирует и созревает in vivo в глюкагон-экспрессирующие островковые клетки. См. Kelly et al. (2011) «Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells», Nat Biotechnol. 29(8):750-756 («Маркеры поверхности клеток для выделения типов панкреатических клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека»), опубликовано он-лайн 31 июля 2011, и Schulz et al. (2012), «А Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells», PLosOne 7(5): 1-17, e37004 («Масштабируемые системы для получения функциональных панкреатических прогениторов из эмбриональных стволовых клеток человека»), описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The terms "pancreatic endoderm", "pancreatic epithelial", "pancreatic epithelium" (abbreviated as "PE"), "pancreatic progenitor", "PDX-1 positive pancreatic endoderm" as used herein, or their equivalents such as pancreatic cells ("PEC") are all precursors or progenitor pancreatic cells. PEC, as described herein, is a progenitor cell population after stage 4 of differentiation (about 12-14 days) and includes at least two major distinct populations: (i) pancreatic progenitor cells that express NKX6.1 but do not express CHGA (or CHGA-negative, CHGA-); and (ii) polyhormonal endocrine cells that express CHGA (CHGA-positive, CHGA +). Without going into theory, it is believed that a population of cells that expresses NKX6.1 but not CHGA is the more active or therapeutic component of PEC, while the population of CHGA-positive polyhormonal endocrine cells further differentiates and matures in vivo into glucagon-expressing islets. cells. See Kelly et al. (2011) "Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells", Nat Biotechnol. 29 (8): 750-756 (“Cell surface markers for the identification of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells”), published online July 31, 2011, and Schulz et al. (2012), "A Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells", PLosOne 7 (5): 1-17, e37004 ("Scalable systems for the production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells"), descriptions which are fully incorporated into this description by reference.

До сих пор, иногда панкреатические энтодермальные клетки применяют без ссылки на РЕС, как описано выше, но обозначают в целом как типы клеток по меньшей мере на 3 и 4 стадии дифференцировки. Применение и значение станет ясным из контекста. Панкреатическая энтодерма, полученная из плюрипотентных стволовых клеток, и по меньшей мере hES и hIPS клеток, таким образом, отличается от других типов энтодермальных линий клеток, на основе отличающихся или высоких уровней экспрессии маркеров, выбранных из PDX1, NKX6.1, PTF1A, СРА1, cMYC, NGN3, РАХ4, ARX и NKX2.2 маркеров, но по существу не экспрессирующих гены, являющиеся признаком панкреатических эндокринных клеток, например, CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAFA, PCSK1 и GLUT1. Кроме того, некоторые «эндокринные прогениторные клетки», экспрессирующие NGN3, могут дифференцироваться в другие не-панкреатические структуры (например, двенадцатиперстную кишку). В одном варианте осуществления NGN3-экспрессирующий эндокринный прогенитор, описанный в настоящей заявке, дифференцируется в зрелую панкреатическую линию клеток, например, панкреатические эндокринные клетки. Популяции панкреатических энтодермальных или эндокринных прогениторных клеток и способы для них также описаны, например, а патентной заявке США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля 2007, и патентной заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермы и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека», поданной 21 апреля 2008, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Until now, sometimes pancreatic endodermal cells have been used without reference to PEC, as described above, but are generally referred to as cell types at at least 3 and 4 stages of differentiation. The application and meaning will become clear from the context. Pancreatic endoderm derived from pluripotent stem cells and at least hES and hIPS cells are thus distinguished from other types of endodermal cell lines based on differing or high expression levels of markers selected from PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA1, cMYC, NGN3, PAX4, ARX and NKX2.2 markers, but essentially not expressing genes that are characteristic of pancreatic endocrine cells, for example, CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAFA, PCSK1 and GLUT1. In addition, some "endocrine progenitor cells" expressing NGN3 can differentiate into other non-pancreatic structures (eg, the duodenum). In one embodiment, the NGN3-expressing endocrine progenitor described herein differentiates into a mature pancreatic cell line, eg, pancreatic endocrine cells. Populations of pancreatic endodermal or endocrine progenitor cells and methods for them are also described, for example, in US patent application No. 11 / 773,944, entitled "Methods for producing pancreatic hormones," filed July 5, 2007, and US patent application No. 12 / 107,020, entitled "Methods Purification of Endoderm and Pancreatic Endodermal Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells, filed April 21, 2008, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Термин «эндокринная клетка-предшественник», использующийся в настоящей заявке, означает мультипотентную клетку дефинитивной энтодермальной линии, экспрессирующую нейрогенин-3 (NEUROG3), которая может далее дифференцироваться в клетки эндокринной системы, включая гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, но не ограничиваясь ими. Эндокринные клетки-предшественники не могут дифференцироваться во многие различные клетки, ткани/или типы органов, по сравнению с менее специфически дифференцированнымилиниями клеток дефинитивной энтодермы, такими как PDX1-позитивная панкреатическая энтодермальная клетка.The term "endocrine progenitor cell" as used in this application means a multipotent cell of the definitive endodermal line expressing neurogenin-3 (NEUROG3), which can further differentiate into cells of the endocrine system, including, but not limited to, hormone-expressing pancreatic islet cells. Endocrine progenitor cells cannot differentiate into many different cells, tissues / or organ types, compared to less specifically differentiated definitive endoderm cell lines such as PDX1-positive pancreatic endodermal cell.

Термины «гормон-экспрессирующая клетка панкреатических островков», «панкреатическая эндокринная клетка», использующиеся в настоящей заявке, или ее эквиваленты означают клетку, которая получена из плюрипотентной клетки in vitro, которая может быть полигормональной или моногормональной. Таким образом, эндокринные клетки могут экспрессировать один или несколько панкреатических гормонов, которые выполняют по меньшей мере некоторые из функций клеток человека панкреатических островков. Клетки, экспрессирующие гормоны панкреатических островков, могут быть зрелыми или незрелыми. Незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков могут отличаться от зрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков на основе дифференциальной экспрессии некоторых маркеров, или на основе функциональных способностей, например, чувствительности к глюкозе.The terms "hormone-expressing pancreatic islet cell", "pancreatic endocrine cell" as used herein, or their equivalents, mean a cell that is derived from a pluripotent cell in vitro, which can be polyhormonal or monohormonal. Thus, endocrine cells can express one or more pancreatic hormones that perform at least some of the functions of human pancreatic islet cells. Cells expressing pancreatic islet hormones can be mature or immature. Immature hormone-expressing pancreatic islet cells may differ from mature hormone-expressing pancreatic islet cells based on differential expression of certain markers, or based on functional abilities such as glucose sensitivity.

Условия среды для культивирования или роста многих стволовых клеток указаны в вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, включая среды с определенным составом, кондиционированные среды, бесфидерные среды, бессывороточные среды и тому подобное. Термин «среда для выращивания» или «коктейль», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означают среду, в которой недифференцированные или дифференцированные стволовые клетки (например, эмбриональные стволовые клетки приматов) пролиферируют in vitro. Характеристики среды включают среду, в которой культивируют клетки, и поддерживающую структуру (такую, как субстрат на твердой поверхности), если она присутствует. Способы культивирования или поддержания плюрипотентных клеток и/или дифференцировки плюрипотентных клеток также описаны в PCT/US2007/062755, озаглавленной «Композиции и способы, пригодные для культивирования дифференцируемых клеток», поданной 23 февраля 2007; заявке США №11/993,399, озаглавленной «Композиции для культивирования эмбриональных стволовых клеток и способы их применения», поданной 20 декабря 2007; и заявке США №11/875,057, озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», поданной 19 октября 2007, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.Medium conditions for culturing or growing many stem cells are specified in the embodiments described herein, including formulated media, conditioned media, feeder-free media, serum-free media, and the like. The term "growth medium" or "cocktail" as used in this application, or its equivalents, means an environment in which undifferentiated or differentiated stem cells (eg, primate embryonic stem cells) proliferate in vitro. The characteristics of the environment include the environment in which the cells are cultured and the supporting structure (such as a substrate on a solid surface), if present. Methods for culturing or maintaining pluripotent cells and / or differentiating pluripotent cells are also described in PCT / US2007 / 062755, entitled "Compositions and Methods Suitable for Culturing Differentiable Cells," filed February 23, 2007; US Application No. 11 / 993,399, entitled Compositions for Culturing Embryonic Stem Cells and Methods for Their Use, filed December 20, 2007; and US Application No. 11 / 875,057, entitled "Methods and Compositions for Feederless Pluripotent Stem Cell Media Containing Human Serum," filed October 19, 2007, which are hereby incorporated by reference in their entirety.

Термин «по существу» или «в основном» означает минимальное или сниженное количество компонента или клетки, присутствующих в любомагрегате клеток суспензионного типа, например, агрегаты клеток в суспензии, описанные в настоящей заявке, являются «по существу или в основном однородными», «по существу или в основном гомо-целлюлярными», или состоят «по существу из hES клеток», «по существу или в основном из дефинитивных энтодермальных клеток», «по существу или в основном из клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта», «по существу или в основном из PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта», «по существу или в основном из PDX1-позитивных препанкреатических энтодермальных клеток», «по существу или в основном из PDX1-позитивных панкреатических энтодермальных или прогениторных клеток», «по существу или в основном из PDX1-позитивных панкреатических энтодермальных концевых клеток», «по существу или в основном из панкреатических эндокринных клеток-предшественников», «по существу или в основном из панкреатических эндокринных клеток», и тому подобное.The term "substantially" or "substantially" means the minimum or reduced amount of a component or cell present in any suspension-type cell aggregate, for example, the cell aggregates in suspension described herein are "substantially or substantially homogeneous", " essentially or mainly homocellular ", or consist of" essentially hES cells "," essentially or mainly of definitive endodermal cells "," essentially or mainly of endoderm cells of the anterior part of the digestive tract "," essentially or mainly from PDX1-negative endoderm cells of the anterior gastrointestinal tract "," essentially or mainly from PDX1-positive prepancreatic endodermal cells "," essentially or mainly from PDX1-positive pancreatic endodermal or progenitor cells "," essentially or mainly from PDX1-positive pancreatic endocrine end cells "," essentially or mainly from pancreatic endocrine precursor cells "people", "essentially or mainly from pancreatic endocrine cells", and the like.

Что касается клеток в культурах клеток или популяциях клеток, термин «по существу не содержит» означает, что указанный тип клеток, который не содержит культура клеток или популяция клеток, присутствует в количестве менее примерно 10%, менее примерно 9%, менее примерно 8%, менее примерно 7%, менее примерно 6%, менее примерно 5%, менее примерно 4%, менее примерно 3%, менее примерно 2% или менее примерно 1% от общего числа клеток, присутствующих в культуре клеток клеток или популяции клеток.With regard to cells in cell cultures or cell populations, the term “substantially free” means that the specified cell type, which does not contain the cell culture or cell population, is present in an amount of less than about 10%, less than about 9%, less than about 8% less than about 7%, less than about 6%, less than about 5%, less than about 4%, less than about 3%, less than about 2%, or less than about 1% of the total number of cells present in a cell culture or cell population.

Культуры клеток Культуры клеток могут быть выращены в среде, содержащей сниженное количество сыворотки или по существу свободной от сыворотки, или без сыворотки. В определенных условиях культивирования концентрации сыворотки могут находиться в диапазоне примерно от 0 об. % до 10 об. %. Например, в некоторых способах дифференцировки концентрация сыворотки в среде может составлять меньше примерно 0,05% (об./об.), меньше примерно 0,1% (об./об.), меньше примерно 0,2% (об./об.), меньше примерно 0,3% (об./об.), меньше примерно 0,4% (об./об.), меньше примерно 0,5% (об./об.), меньше примерно 0,6% (об./об.), меньше примерно 0,7% (об./об.), меньше примерно 0,8% (об./об.), меньше примерно 0,9% (об./об.), меньше примерно 1% (об./об.), меньше примерно 2% (об./об.), меньше примерно 3% (об./об.), меньше примерно 4% (об./об.), меньше примерно 5% (об./об.), меньше примерно 6% (об./об.), меньше примерно 7% (об./об.), меньше примерно 8% (об./об.), меньше примерно 9% (об./об.) или меньше примерно 10% (об./об.). В некоторых способах клетки препервичной полоски выращивают без сыворотки или без замены сыворотки. В таких способах концентрация В27 добавки может быть в диапазоне примерно от 0,1% (об./об.) до 20% (об./об.).Cell Cultures Cell cultures can be grown in a medium containing a reduced amount of serum, or substantially free of serum, or without serum. Under certain culture conditions, serum concentrations can range from about 0 vol. % up to 10 vol. %. For example, in some differentiation methods, the serum concentration in the medium may be less than about 0.05% (v / v), less than about 0.1% (v / v), less than about 0.2% (v / vol.), less than about 0.3% (v / v), less than about 0.4% (v / v), less than about 0.5% (v / v), less than about 0, 6% (v / v), less than about 0.7% (v / v), less than about 0.8% (v / v), less than about 0.9% (v / v) ), less than about 1% (v / v), less than about 2% (v / v), less than about 3% (v / v), less than about 4% (v / v), less than about 5% (v / v), less than about 6% (v / v), less than about 7% (v / v), less than about 8% (v / v), less than about 9% (v / v) or less than about 10% (v / v). In some methods, the cells of the preprimary streak are grown without serum or without serum replacement. In such methods, the concentration of B27 additive can range from about 0.1% (v / v) to 20% (v / v).

В других способах незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков выращивают в присутствии В27. В таких способах концентрация добавки В27 может быть в диапазоне примерно от 0,1% (об./об.) до 20% (об./об.), или в концентрациях выше примерно 20% (об./об.). В некоторых способах концентрация В27 в среде составляет примерно 0,1% (об./об.), примерно 0,2% (об./об.), примерно 0,3% (об./об.), примерно 0,4% (об./об.), примерно 0,5% (об./об.), примерно 0,6% (об./об.), примерно 0,7% (об./об.), примерно 0,8% (об./об.), примерно 0,9% (об./об.), примерно 1% (об./об.), примерно 2% (об./об.), примерно 3% (об./об.), примерно 4% (об./об.), примерно 5% (об./об.), примерно 6% (об./об.), примерно 7% (об./об.), примерно 8% (об./об.), примерно 9% (об./об.), примерно 10% (об./об.), примерно 15% (об./об.) или примерно 20% (об./об.). Альтернативно, концентрация внесенной добавки В27 может быть измерена в виде кратности крепости коммерческого маточного раствора В27. Например, В27 поставляется Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) в виде 50Х маточного раствора. Добавление достаточного количества такого маточного раствора к достаточному объему среды для выращивания обеспечивает среду с добавлением необходимого количества В27. Например, добавление 10 мл 50Х маточного раствора В27 к 90 мл среды для выращивания обеспечивает среду для выращивания с 5Х В27. Концентрация добавки В27 может составлять примерно 0,1Х, примерно 0,2Х, примерно 0,3Х, примерно 0,4Х, примерно 0,5Х, примерно 0,6Х, примерно 0,7Х, примерно 0,8Х, примерно 0,9Х, примерно 1X, примерно 1,1Х, примерно 1,2Х, примерно 1,3Х, примерно 1,4Х, примерно 1,5Х, примерно 1,6Х, примерно 1,7Х, примерно 1,8Х, примерно 1,9Х, примерно 2Х, примерно 2,5Х, примерно 3Х, примерно 3,5Х, примерно 4Х, примерно 4,5Х, примерно 5Х, примерно 6Х, примерно 7Х, примерно 8Х, примерно 9Х, примерно 10Х, примерно 11Х, примерно 12Х, примерно 13Х, примерно 14Х, примерно 15Х, примерно 16Х, примерно 17Х, примерно 18Х, примерно 19Х, примерно 20Х и более чем примерно 20Х.In other methods, immature hormone-expressing cells of the pancreatic islets are grown in the presence of B27. In such methods, the concentration of B27 additive can range from about 0.1% (v / v) to 20% (v / v), or at concentrations greater than about 20% (v / v). In some methods, the concentration of B27 in the medium is about 0.1% (v / v), about 0.2% (v / v), about 0.3% (v / v), about 0, 4% (v / v), about 0.5% (v / v), about 0.6% (v / v), about 0.7% (v / v), about 0.8% (v / v), about 0.9% (v / v), about 1% (v / v), about 2% (v / v), about 3% (v / v), about 4% (v / v), about 5% (v / v), about 6% (v / v), about 7% (v / v) ), about 8% (v / v), about 9% (v / v), about 10% (v / v), about 15% (v / v), or about 20% ( about. / about.). Alternatively, the concentration of B27 additive added can be measured as a multiple of the strength of a commercial B27 stock solution. For example, B27 is available from Invitrogen (Carlsbad, Calif.) As a 50X stock solution. Adding a sufficient amount of such stock solution to a sufficient volume of growth medium provides the medium with the required amount of B27 added. For example, adding 10 ml of 50X B27 stock solution to 90 ml of growth medium provides 5X B27 growth medium. The concentration of B27 additive can be about 0.1X, about 0.2X, about 0.3X, about 0.4X, about 0.5X, about 0.6X, about 0.7X, about 0.8X, about 0.9X, about 1X, about 1.1X, about 1.2X, about 1.3X, about 1.4X, about 1.5X, about 1.6X, about 1.7X, about 1.8X, about 1.9X, about 2X , about 2.5X, about 3X, about 3.5X, about 4X, about 4.5X, about 5X, about 6X, about 7X, about 8X, about 9X, about 10X, about 11X, about 12X, about 13X, about 14X, about 15X, about 16X, about 17X, about 18X, about 19X, about 20X, and more than about 20X.

Термин «экзогенно добавленные» соединения, использующийся в настоящей заявке, такие как факторы роста, факторы дифференцировки, и тому подобные, в контексте культур или кондиционированных сред, означают факторы роста, которые добавляют в культуры или среды для дополнения любыми соединениями или факторами роста, которые уже могут присутствовать в культуре или среде. Например, в некоторых вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток и/или популяции клеток не включают экзогенно добавленного ретиноида.The term "exogenously added" compounds as used herein, such as growth factors, differentiation factors, and the like, in the context of cultures or conditioned media, means growth factors that are added to cultures or media to supplement with any compounds or growth factors that may already be present in a culture or environment. For example, in some cell cultures, cell cultures and / or cell populations do not include exogenously added retinoid.

Термин «ретиноид», использующийся в настоящей заявке, означает ретинол, ретиналь или ретиноевую кислоту, а также производные любого из этих соединений. В предпочтительном варианте осуществления ретиноид является ретиноевой кислотой.The term "retinoid" as used in this application means retinol, retinal or retinoic acid, as well as derivatives of any of these compounds. In a preferred embodiment, the retinoid is retinoic acid.

«Фактор роста семейства FGF», «фактор роста фибробластов» или «член семейства фактора роста фибробластов» означает FGF, выбранный из группы, состоящей из FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 и FGF23. В некоторых вариантах осуществления «фактор роста семейства FGF», «фактор роста фибробластов» или «член семейства фактора роста фибробластов» означает любой фактор роста, обладающий гомологией и/или функцией, подобной известному члену семейства фактора роста фибробластов."FGF family growth factor", "fibroblast growth factor" or "fibroblast growth factor family member" means an FGF selected from the group consisting of FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF , FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 and FGF23. In some embodiments, "FGF family growth factor", "fibroblast growth factor" or "fibroblast growth factor family member" means any growth factor having similar homology and / or function to a known member of the fibroblast growth factor family.

Термин «экспрессия», использующийся в настоящей заявке, означает получение материала или вещества, а также уровень или количество получения материала или вещества. Таким образом, определение экспрессии специфического маркера означает детекцию относительного или абсолютного количества экспрессируемого маркера, или просто детекцию присутствия или отсутствия маркера.The term "expression", as used in this application, means the receipt of a material or substance, as well as the level or amount of receipt of the material or substance. Thus, determining the expression of a specific marker means detecting the relative or absolute amount of the expressed marker, or simply detecting the presence or absence of the marker.

Термин «маркер», использующийся в настоящей заявке, означает любую молекулу, которую можно наблюдать или выявлять. Например, маркер может включать нуклеиновую кислоту, такую как транскрипт специфического гена, полипептидный продукт гена, полипептид - не-генный продукт, гликопротеин, углевод, гликолипид, липид, липопротеин, или малую молекулу (например, молекулы с молекулярной массой меньшей 10,000 а.е.м.), но не ограничивается ими.The term "marker" as used in this application means any molecule that can be observed or detected. For example, a marker can include a nucleic acid, such as a specific gene transcript, a polypeptide gene product, a non-gene product polypeptide, a glycoprotein, a carbohydrate, a glycolipid, a lipid, a lipoprotein, or a small molecule (for example, molecules with a molecular weight of less than 10,000 amu). .m.), but is not limited to them.

Для большинства маркеров, описанных в настоящей заявке, обеспечивается официальный символ гена Международной организации по изучению генома человека (HUGO). Такие символы, которые разработаны Комитетом по номенклатуре генов HUGO, обеспечивают уникальные аббревиатуры для каждого из названных генов человека и продуктов генов. Эти символы генов легко распознаются и могут легко быть ассоциированы с соответствующим уникальным геном человека и/или белковой последовательностью рядовым специалистом в данной области техники.For most of the markers described in this application, an official gene symbol of the International Organization for the Study of the Human Genome (HUGO) is provided. Such symbols, which are developed by the HUGO Gene Nomenclature Committee, provide unique abbreviations for each of the named human genes and gene products. These gene symbols are easily recognized and can be easily associated with the corresponding unique human genome and / or protein sequence by one of ordinary skill in the art.

В соответствии с обозначениями HUGO, определены следующие символы генов: GHRL - грелин; IAPP - островковый амилоидный полипептид; INS - инсулин; GCG - глюкагон; ISL1 - фактор транскрипции ISL1; РАХ6 - ген спаренных боксов 6; РАХ4 ген спаренных боксов 4; NEUROG3 - нейрогенин 3 (NGN3); NKX2-2 - NKX2-фактор-транскрипции-зависимый, локус 2 (NKX2.2); NKX6-1 - NKX6-фактор транскрипции-зависимый, локус 1 (NKX6.1); IPF1 - промоторный инсулиновый фактор 1 (PDX1); ONECUT1 - one cut домен, член семейства 1 (HNF6); HLXB9 - гомеобокс В9 (НВ9); TCF2 - фактор транскрипции 2, печеночный (HNF1b); FOXA1- forkhead box A1; HGF -фактор роста гепатоцитов; IGF1 - инсулиноподобный фактор роста 1; POU5F1 - POU домен, класс 5, фактор транскрипции 1 (ОСТ4); NANOG - Nanog гомеобокс; SOX2 -SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 2; CDH1 - кадгерин 1, тип 1, Е-кадгерин (ECAD); Т - brachyury гомолог (BRACH); FGF4 - фактор роста фибробластов 4; WNT3 - бескрылого типа MMTV семейства сайта интеграции, член 3; SOX17 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 17; GSC - гусекоид; CER1 - (cerberus 1, cysteine-knot суперсемейства, гомолог (CER); CXCR4 - хемокина (С-Х-С мотив) рецептор 4; FGF17 - фактор роста фибробластов 17; FOXA2 - forkhead бокс А2; SOX7 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 7; SOX1 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 1; AFP - альфа-фетопротеин; SPARC - секретируемый белок, кислый, богатый цистеином (остеонектин); и THBD - тромбомодулин (ТМ), NCAM - молекула адгезии нервных клеток; SYP - синаптопсин; ZIC1 - Zic семейства член 1; NEF3 - нейрофиламент 3 (NFM); SST - соматостатин; MAFA - v-maf мышечно-апоневротической фибросаркомы онкогена гомолог A; MAFB - v-maf мышечно-апоневротической фибросаркомы онкогена гомолог В; SYP - синаптопсин; CHGA -хромогранин А (паратиреоидный секреторный белок 1).In accordance with the HUGO notation, the following gene symbols are defined: GHRL - ghrelin; IAPP, islet amyloid polypeptide; INS, insulin; GCG, glucagon; ISL1 - ISL1 transcription factor; PAX6 - paired box 6 gene; PAX4 gene of paired boxes 4; NEUROG3 - neurogenin 3 (NGN3); NKX2-2 - NKX2-transcription factor-dependent, locus 2 (NKX2.2); NKX6-1 - NKX6 transcription factor-dependent, locus 1 (NKX6.1); IPF1 - promoter insulin factor 1 (PDX1); ONECUT1 - one cut domain, family member 1 (HNF6); HLXB9 - homeobox B9 (HB9); TCF2 - transcription factor 2, hepatic (HNF1b); FOXA1 - forkhead box A1; HGF - hepatocyte growth factor; IGF1 - insulin-like growth factor 1; POU5F1 - POU domain, class 5, transcription factor 1 (OCT4); NANOG - Nanog homeobox; SOX2 -SRY (sex-defining site Y) -box 2; CDH1 - cadherin 1, type 1, E-cadherin (ECAD); T, brachyury homologue (BRACH); FGF4 - fibroblast growth factor 4; WNT3 — Wingless type MMTV of the integration site family, member 3; SOX17 - SRY (sex-determining region Y) -box 17; GSC, goosecoid; CER1 - (cerberus 1, cysteine-knot superfamily, homologue (CER); CXCR4 - chemokine (C-X-C motif) receptor 4; FGF17 - fibroblast growth factor 17; FOXA2 - forkhead box A2; SOX7 - SRY (sex-determining region Y ) -box 7; SOX1 - SRY (sex-determining region Y) -box 1; AFP - alpha-fetoprotein; SPARC - secreted protein, acidic, rich in cysteine (osteonectin); and THBD - thrombomodulin (TM), NCAM - nerve cell adhesion molecule ; SYP - synaptopsin; ZIC1 - Zic family member 1; NEF3 - neurofilament 3 (NFM); SST - somatostatin; MAFA - v-maf of muscular aponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A; MAFB - v-maf of muscular aponeurotic fibrosarcoma B homologous SYP - synaptopsin; CHGA - chromogranin A (parathyroid secretory protein 1).

Далее приведены полные наименования генов, соответствующих не-HUGO символам генов, а также другие аббревиатуры, которые могут применяться в настоящей заявке: SS - соматостатин (SOM); РР - панкреатический полипептид; С-пептид - соединительный пептид; Ех4 - эксендин 4; NIC - никотинамид и DAPT - N-[N-(3,5-дифторфенацетил)-L-аланил]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир; RA - ретиноевая кислота; RPMI - среда Мемориального института Розуэлла Парка; CMRL - среда Лаборатории медицинских исследований Коннаута; FBS - эмбриональная телячья сыворотка; NBP10 - NCAM связывающий белок 10; PTF1a - панкерато-специфический фактор транскрипции 1а.The following are the full names of genes corresponding to non-HUGO gene symbols, as well as other abbreviations that may be used in this application: SS - somatostatin (SOM); PP, pancreatic polypeptide; C-peptide - connecting peptide; Ex4 - exendin 4; NIC - nicotinamide and DAPT - N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester; RA, retinoic acid; RPMI - Roswell Park Memorial Institute Wednesday; CMRL - Connaught Medical Research Laboratory environment; FBS - fetal bovine serum; NBP10 - NCAM binding protein 10; PTF1a is a pankerato-specific transcription factor 1a.

Развитие плюрипотентных клеток в различные мультипотентные и/или дифференцированные клетки можно контролировать путем определения относительной экспрессии генов, или маркеров генов, характерных для специфических клеток, по сравнению с экспрессией второго или контрольного гена, например, конститутивных генов. В некоторых способах экспрессию определенных маркеров оценивают путем детекции присутствия или отсутствия маркера. Альтернативно, экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, на котором маркер присутствует в клетке из культуры клеток или популяции клеток. В таких способах измерение экспрессии маркеров может быть качественным или количественным. Одним способом количественного определения экспрессии маркеров, продуцируемых генами маркеров, является применение количественной ПЦР (Q-PCR). Способы выполнения Q-PCR хорошо известны в данной области техники. Другие способы, известные в данной области техники, также можно применять для количественного определения экспрессии гена маркера. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно определить с применением антител, специфичных для интересующего продукта гена маркера.The development of pluripotent cells into various multipotent and / or differentiated cells can be controlled by determining the relative expression of genes, or gene markers characteristic of specific cells, compared to the expression of a second or control gene, for example, constitutive genes. In some methods, the expression of certain markers is assessed by detecting the presence or absence of a marker. Alternatively, the expression of some markers can be determined by measuring the level at which the marker is present in a cell from a cell culture or cell population. In such methods, the measurement of the expression of markers can be qualitative or quantitative. One way to quantify the expression of markers produced by marker genes is by using quantitative PCR (Q-PCR). Methods for performing Q-PCR are well known in the art. Other methods known in the art can also be used to quantify the expression of a marker gene. For example, expression of a marker gene product can be determined using antibodies specific for the marker gene product of interest.

В некоторых способах наивысшая экспрессия следующих генов является показателем для некоторых популяций клеток, например, SOX17, SOX7, AFP или THBD являются показателями экстраэмбриональной энтодермы; NODAL и/или FGF8 являются показателями препервичной полоски; brachyury, FGF4, SNAI1 и/или WNT3 являются показателями мезоэнтодермы; CER, GSC, CXCR4, SOX17 и FOXA2 являются показателями дефинитивных энтодермальных клеток; SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B и HNF4A являются показателями энтодермы передней части пищеварительного тракта (или PDXl-негативной энтодермы); PDX1, HNF6, SOX9 и PROX1 являются показателями PDX1-позитивной энтодермы; PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA и cMYC являются показателями панкреатического эпителия (РЕ или панкреатического прогенитора); NGN3, РАХ4, ARX и NKX2.2 являются показателями эндокринных клеток-предшественников; a INS, GCG, GHRL, SST и РР являются показателями различных эндокринных клеток; относительно высокая экспрессия генов MAFA - MAFB является показателем инсулин-секретирующих эндокринных клеток; а относительно высокая экспрессия генов MAFB - MAFA является показателем глюкагон-секретирующих эндокринных клеток.In some methods, the highest expression of the following genes is indicative for some cell populations, for example SOX17, SOX7, AFP or THBD are indicative of extraembryonic endoderm; NODAL and / or FGF8 are indications of a primary streak; brachyury, FGF4, SNAI1 and / or WNT3 are indicators of mesoentoderm; CER, GSC, CXCR4, SOX17 and FOXA2 are indicators of definitive endodermal cells; SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B and HNF4A are indicators of the anterior gastrointestinal tract endoderm (or PDXl-negative endoderm); PDX1, HNF6, SOX9 and PROX1 are indicators of PDX1-positive endoderm; PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA and cMYC are indicators of pancreatic epithelium (PE or pancreatic progenitor); NGN3, PAX4, ARX and NKX2.2 are indicators of endocrine progenitor cells; a INS, GCG, GHRL, SST and PP are indicators of various endocrine cells; relatively high expression of genes MAFA - MAFB is an indicator of insulin-secreting endocrine cells; and the relatively high expression of the MAFB-MAFA genes is indicative of glucagon-secreting endocrine cells.

Термины «фактор роста фибробластов 7 (FGF7)» и фактор роста кератиноцитов (KGF) являются синонимами.The terms "fibroblast growth factor 7 (FGF7)" and keratinocyte growth factor (KGF) are synonymous.

Способы получения индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клетокMethods for producing induced pluripotent stem (iPS) cells

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, не ограничиваются каким-либо одним типом iPS клеток или каким-либо одним способом получения iPS клеток. Варианты осуществления не ограничиваются и не зависят от уровней эффективности получения iPS клеток, поскольку существуют различные способы. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, применяются к дифференцировке iPS клеток в энтодермальные линии клеток, и к их применению.The embodiments described herein are not limited to any one type of iPS cells or any one method for producing iPS cells. The options for implementation are not limited to and do not depend on the levels of efficiency of obtaining iPS cells, as there are various ways. The embodiments described herein apply to the differentiation of iPS cells into endodermal cell lines, and to their use.

Описаны вирусные, невирусные и неинтегрирующие вирусные способы генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) с применением аденовирусов, плазмид или вырезания перепрограммирующих факторов с применением Cre-loxP3, или piggyback транскрипции. См. Stadtfeld, М., et al., Science 322, 945-949 (2008); Okita, K. et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K. et al. Nature 458, 771-775 (2009); Soldner, F. et al. Cell 136, 964-977 (2009); и Woltjen, K. et al. Nature 458, 766-770 (2009), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. См. также патентную заявку США №20100003757 от Mack, A. et al. (опубликовано 7 января 2010) и №PCT/US2009/037429 от Shi et al, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти способы, однако, обладают низкой перепрограммирующей эффективностью (<0,003%), и могут оставлять остаточные векторные последовательности, несмотря на вырезание, что ограничивает терапевтическое применение. Например, вирусная интеграция в геном хозяина и гиперэкспрессия вышеуказанных факторов транскрипции является потенциально характеристикой, которая отличает ES клетки и iPS клетки. См. Solder, F. et al., Cell 136:964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24:1491-1500 (2005); и Hochedlinger, K. et al., Cell 121:465-477 (2005), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Described are viral, non-viral and non-integrating viral methods for generating induced pluripotent stem cells (iPSC) using adenoviruses, plasmids or excision of reprogramming factors using Cre-loxP3, or piggyback transcription. See Stadtfeld, M., et al., Science 322, 945-949 (2008); Okita, K. et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K. et al. Nature 458,771-775 (2009); Soldner, F. et al. Cell 136,964-977 (2009); and Woltjen, K. et al. Nature 458, 766-770 (2009), which are fully incorporated into this description by reference. See also US patent application No. 20100003757 from Mack, A. et al. (published January 7, 2010) and No. PCT / US2009 / 037429 from Shi et al, which are fully incorporated into this description by reference. These methods, however, have low reprogramming efficiencies (<0.003%), and may leave residual vector sequences despite excision, limiting therapeutic use. For example, viral integration into the host genome and overexpression of the above transcription factors is a potential characteristic that distinguishes ES cells and iPS cells. See Solder, F. et al., Cell 136: 964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24: 1491-1500 (2005); and Hochedlinger, K. et al., Cell 121: 465-477 (2005), which are fully incorporated herein by reference.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы генерации iPSC включают эписомальные векторы, полученные из вируса Эпштейн-Барра. См. Yu, J. et al. Science 324, 797-801 (2009) и заявку США №20100003757 от Mack, A. et al. опубликованную 7 января 2010, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти способы требуют трех отдельных плазмид, несущих комбинацию семи факторов, включая онкоген SV40.In other embodiments, implementation of the present invention, the methods for generating iPSC include episomal vectors derived from the Epstein-Barr virus. See Yu, J. et al. Science 324, 797-801 (2009) and US Application No. 20100003757 from Mack, A. et al. published January 7, 2010, which are fully incorporated into this description by reference. These methods require three separate plasmids carrying a combination of seven factors, including the SV40 oncogene.

В другом варианте осуществления изобретения способы генерации iPSC включают iPSC на белковой основе от фетальных и неонатальных клеток мыши и человека. См. Zhou, Н. et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); и Kim, D. et al. Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти методологии осуществляют с применением химической обработки (например, вальпроевой кислотой в случае Zhou et al. 2009, выше) или многих циклов обработки (Kim et al. 2009, выше).In another embodiment, the methods for generating iPSCs include protein-based iPSCs from fetal and neonatal mouse and human cells. See Zhou, H. et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); and Kim, D. et al. Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009), which are fully incorporated into this description by reference. These methodologies are carried out using chemical treatments (eg valproic acid in the case of Zhou et al. 2009, above) or multiple treatment cycles (Kim et al. 2009, above).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения можно применять миникольцевые векторы или плазмиды, которые являются молекулами сверспиральной ДНК, утратившей бактериальное происхождение репликации и генов устойчивости к антибиотикам. См. See Chen, Z.-Y. et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003); Chen, Z.-Y. et al., Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005); и Jia, F. et al., Nature Methods Advance Publication Online, 7 февраля 2010, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти методологии генерируют iPSC с более высокой эффективностью трансфекции и более длительной эктопической экспрессией, поскольку они имеют меньшую активацию экзогенных механизмов сайленсинга.In another embodiment of the present invention, minicircular vectors or plasmids can be used that are coiled DNA molecules that have lost their bacterial origin of replication and antibiotic resistance genes. See See Chen, Z.-Y. et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003); Chen, Z.-Y. et al., Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005); and Jia, F. et al., Nature Methods Advance Publication Online, February 7, 2010, which are fully incorporated herein by reference. These methodologies generate iPSCs with higher transfection efficiency and longer ectopic expression because they have less activation of exogenous silencing mechanisms.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения iPS могут быть генерированы от людей - пациентов, включая больных диабетом, боковым амиотрофическим склерозом, спинальной мышечной дистрофией и болезнью Паркинсона. См. Maehr et al. PNAS USA 106(37):15768-73 (2009); Dimos et al., Science, 321:1218-21 (2008); Ebert et al. Nature 457:277-80 (2009); Park et al. Cell 134:877-886 (2008); и Soldner et al., Cell 136:964-977, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. По меньшей мере одним преимуществом получения hIPS клеток от пациентов со специфическими заболеваниями является то, что полученные клетки могут содержать генотип и иметь клеточный ответ для заболевания человека. Также, см. Таблицу 3, перечисляющую по меньшей мере некоторые существующие iPS линии клеток человека. Эта информация была получена из литературы и доступна в базах данных, включая например, Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NIH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток, расположенный в Медицинской школе Массачусетского университета, Ворчестер, Массачусетс, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда становятся доступными линии клеток и получена регистрация.In another embodiment of the present invention, iPS can be generated from human patients, including patients with diabetes, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular dystrophy, and Parkinson's disease. See Maehr et al. PNAS USA 106 (37): 15768-73 (2009); Dimos et al. Science 321: 1218-21 (2008); Ebert et al. Nature 457: 277-80 (2009); Park et al. Cell 134: 877-886 (2008); and Soldner et al., Cell 136: 964-977, which are fully incorporated herein by reference. At least one advantage of obtaining hIPS cells from patients with specific diseases is that the resulting cells can contain the genotype and have a cellular response for human disease. Also, see Table 3 listing at least some existing iPS human cell lines. This information has been obtained from the literature and is available in databases including, for example, the National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry, the Human Embryonic Stem Cell Registry, and the International Stem Cell Registry located at the University of Massachusetts School of Medicine, Worcester, MA, USA. These databases are periodically updated when cell lines become available and registrations are received.

Варианты осуществления композиций и способов, описанных в настоящей заявке, подразумевают применение различных дифференцируемых плюрипотентных стволовых клеток приматов, включая плюрипотентные стволовые клетки человека, такие как hESC, включая CyT49, CyT212, CyT203, CyT25, (коммерчески доступные по меньшей мере ко времени подачи настоящей заявки от ViaCyte Inc., расположенном в 3550 General Atpmics Court, Сан-Диего, Калифорния, 92121) BGOl, BG02 и MEL1, и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, такие как iPSC-482c7 и iPSC-603 (Cellular Dynamics International, Inc., Мэдисон, Висконсин) и iPSC-G4 (далее «G4») и iPSC-B7 (далее «В7») (Shinya Yamanaka, Центр исследования iPS клеток, Университет Киото), но не ограничиваясь ими; исследования с применением G4 и В7 подробно описаны ниже. Некоторые из этих плюрипотентных стволовых клеток человека зарегистрированы в национальных реестрах, таких как Реестр Национального института здравоохранения (NIH), и перечислены в Реестре стволовых клеток человека NIH (например, CyT49, регистрационный номер 0041). Информацию по CyT49, другим доступным линиям клеток также можно найти в Интернете на stemcells.nih.gov/research/registry. Другие линии клеток, например, BG01 и BG01v, поставляются и распространяются третьими лицами от WiCell®, филиалом Висконсинского международного банка стволовых клеток (WISC) (номер по каталогу BG01) и АТСС (номер по каталогу SCRC-2002), соответственно. В то время как другие линии клеток, описанные в настоящей заявке, могут быть не зарегистрированы и не распределяться биологическим репозиторием, таким как WiCell® или АТСС, такие линии клеток доступны напрямую или опосредованно от основных исследователей, лабораторий и/или институтов. Публичный запрос на линии клеток и реагенты, например, является обычным для рядовых специалистов в данной области техники. Как правило, передача этих клеток или материалов осуществляется путем стандартного соглашения по передаче материалов между собственникомлинии клеток или материала, и потребителем. Передача этих типов материалов осуществляется частным образом в исследовательской среде, в частности, в области науки о жизни. Фактически, автор заявки рутинно передавал клетки со времени их получения и характеристики, включая CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt212 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) и BG0lv (2004), посредством таких соглашений с коммерческими и некоммерческими промышленными партнерами и соавторами. Год в скобках после каждойлинии клеток в предыдущем списке указывает год, когда линии клеток или материалы становятся публично доступными и бессмертными (например, из банков клеток, где они изготовлены), и таким образом, разрушение другого эмбриона не проводится и не требуется, благодаря получению этих линий клеток для создания композиций и осуществления способов, описанных в настоящей заявке.Embodiments of the compositions and methods described herein involve the use of a variety of differentiable primate pluripotent stem cells, including human pluripotent stem cells such as hESCs, including CyT49, CyT212, CyT203, CyT25, (commercially available at least at the time of filing of this application from ViaCyte Inc., located at 3550 General Atpmics Court, San Diego, CA 92121) BGOl, BG02 and MEL1, and induced pluripotent stem (iPS) cells such as iPSC-482c7 and iPSC-603 (Cellular Dynamics International, Inc ., Madison, WI) and iPSC-G4 (hereinafter “G4”) and iPSC-B7 (hereinafter “B7”) (Shinya Yamanaka, iPS Cell Research Center, Kyoto University); studies using G4 and B7 are detailed below. Some of these human pluripotent stem cells are registered in national registries such as the National Institutes of Health (NIH) Registry and are listed on the NIH Human Stem Cell Registry (e.g. CyT49, accession number 0041). Information on CyT49, other available cell lines, can also be found online at stemcells.nih.gov/research/registry. Other cell lines, such as BG01 and BG01v, are supplied and distributed by third parties from WiCell®, the Wisconsin International Stem Cell Bank (WISC) affiliate (cat # BG01) and ATCC (cat # SCRC-2002), respectively. While other cell lines described in this application may not be registered and distributed by a biological repository such as WiCell® or ATCC, such cell lines are available directly or indirectly from main researchers, laboratories and / or institutes. Public inquiry for cell lines and reagents, for example, is common to those of ordinary skill in the art. Typically, the transfer of these cells or materials is done through a standard material transfer agreement between the owner of the cell or material line and the consumer. The transfer of these types of materials is carried out privately in a research environment, in particular in the field of life sciences. In fact, the applicant has routinely transferred cells since their receipt and characterization, including CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt212 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) and BG0lv (2004), through such agreements with commercial and non-commercial industry partners and co-authors. The year in brackets after each cell line in the previous listing indicates the year that the cell lines or materials become publicly available and immortal (for example, from the cell banks where they are made), and thus the destruction of another embryo is not carried out or required, due to the receipt of these cell lines to create compositions and implement the methods described in this application.

В августе 2006 Klimanskaya et al. показали, что hESC можно получить из единичных бластомеров, таким образом, сохраняя эмбрион интактным и не вызывая его разрушения. Были проведены биопсии из каждого эмбриона с применением методики микроинкапсулирования, и было получено девятнадцать (19) продуктов, подобных ES-клеткам, и две (2) стабильных hESC линии. Эти hESC линии были способны к сохранению в недифференцированном состоянии в течение более чем шести (6) месяцев, и демонстрировали нормальный кариотип и экспрессию маркеров плюрипотентности, включая Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog и щелочную фосфатазу. Эти hESC могут дифференцировать и формировать производные всех трех (3) эмбриональных зародышевых слоев in vitro и формировать тератомы in vivo. Эти способы создания новых линий стволовых клеток без разрушения эмбриона направлены на этические проблемы применения эмбрионов человека. См. Klimanskaya et al. (2006) Nature 444:481-5, опубликовано 23 августа 2006, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Однако Klimanskaya et al. совместно культивировали полученную линию hESC с другими hESC. Позднее, в 2008, Chung Y. et al., смогли получить линии hES клеток, вновь из единственного бластомера, но без совместного культивирования с hESC. См. Chung Y. et al., Cell Stem Cell 2008, 2(2), 113-117, который полностью включен в настояще описание посредством ссылки. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, и в частности, такие композиции и способы, которые относятся к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам или генетически дедифференцированным плюрипотентным стволовым клеткам, не требуют разрушения эмбриона человека.In August 2006, Klimanskaya et al. showed that hESC can be obtained from single blastomeres, thus keeping the embryo intact and not causing destruction. Biopsies were performed from each embryo using microencapsulation techniques and nineteen (19) ES cell-like products and two (2) stable hESC lines were obtained. These hESC lines were able to persist in an undifferentiated state for more than six (6) months, and showed normal karyotype and expression of pluripotency markers, including Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA- 1-81, Nanog and alkaline phosphatase. These hESCs can differentiate and form derivatives of all three (3) embryonic germ layers in vitro and form teratomas in vivo. These methods of creating new stem cell lines without destroying the embryo address the ethical problems of using human embryos. See Klimanskaya et al. (2006) Nature 444: 481-5, published August 23, 2006, the descriptions of which are fully incorporated into this description by reference. However, Klimanskaya et al. co-cultured the resulting hESC line with other hESCs. Later, in 2008, Chung Y. et al. Were able to obtain hES cell lines, again from a single blastomere, but without co-culture with hESC. See Chung Y. et al., Cell Stem Cell 2008, 2 (2), 113-117, which is fully incorporated into this description by reference. Thus, the compositions and methods described in this application, and in particular, such compositions and methods that relate to induced pluripotent stem cells or genetically dedifferentiated pluripotent stem cells do not require destruction of the human embryo.

Таблицы 3 и 4 являются не ограничивающими перечнями некоторых iPSC и hESC. соответственно, которые доступны во всем мире для исследовательских и/или коммерческих целей, и пригодны для применения в способах и композициях из настоящего изобретения. Информация из Таблиц 3 и 4 получена из литературы и публичных баз, включая, например Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NIH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток медицинской школы Массачусетского университета, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда линии клеток становятся доступными и зарегистрированными.Tables 3 and 4 are non-limiting listings of some of the iPSCs and hESCs. accordingly, which are available worldwide for research and / or commercial purposes, and are suitable for use in the methods and compositions of the present invention. The information in Tables 3 and 4 is obtained from the literature and public databases, including, for example, the National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry, the Human Embryonic Stem Cell Registry, and the University of Massachusetts Medical School International Stem Cell Registry, USA. These databases are periodically updated when cell lines become available and registered.

iPSC человека, описанные в настоящей заявке (по меньшей мере iPSC-603 и iPSC-482-с7), получали от Cellular Dynamics International, Inc. (Мэдисон, Висконсин, США).The human iPSCs described herein (at least iPSC-603 and iPSC-482-c7) were obtained from Cellular Dynamics International, Inc. (Madison, Wisconsin, USA).

Другим преимуществом является то, что hIPS клетки будут соответствовать иммунологически аутологичной популяции клеток; и пациент-специфические клетки можно получать для изучения происхождения и прогрессирования заболевания. Таким образом, можно понять первопричины заболевания, что позволит создать представление, ведущее к разработке профилактического и терапевтического лечения заболевания.Another advantage is that the hIPS cells will correspond to an immunologically autologous cell population; and patient-specific cells can be obtained to study the origin and progression of the disease. Thus, it is possible to understand the root causes of the disease, which will provide insight leading to the development of preventive and therapeutic treatments for the disease.

Плюрипотентные эмбриональные стволовые (hES) клетки человекаHuman pluripotent embryonic stem (hES) cells

Некоторые варианты осуществления направлены на способы получения дефинитивных энтодермальных клеток и наконец, любого типа клеток, полученных из энтодермальной линии, включая энтодерму передней части пищеварительного тракта, панкреатическую энтодерму, эндокринные клетки-предшественники и/или гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, но не ограничиваясь ими, с применением эмбриональных стволовых (hES) клеток человека в качестве исходного материала. Эти hES клетки могут быть клетками, происходящими из морулы, внутренней клеточной массы эмбриона или клетками, полученными из эмбриональных половых гребней. Эмбриональные стволовые клетки человека могут поддерживаться в культуре в плюрипотентном состоянии без существенной дифференцировки с применением способов, известных в данной области техники. Такие способы описаны, например, в патентах США №№5,453,357, 5,670,372, 5,690,926 5,843,780, 6,200,806 и 6,251,671, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Some embodiments are directed to methods of producing definitive endodermal cells, and finally, any type of cell derived from an endodermal lineage, including, but not limited to, endoderm of the anterior digestive tract, pancreatic endoderm, endocrine progenitor cells, and / or hormone-expressing pancreatic islet cells , using human embryonic stem (hES) cells as starting material. These hES cells can be cells derived from morula, the inner cell mass of the embryo, or cells derived from the embryonic reproductive ridges. Human embryonic stem cells can be maintained in a pluripotent state in culture without significant differentiation using methods known in the art. Such methods are described, for example, in US Pat. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926 5,843,780, 6,200,806 and 6,251,671, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

В некоторых способах плюрипотентные стволовые клетки, например, hES клетки, поддерживаются на фидерном слое. В таких способах может применяться любой фидерный слой, позволяющий плюрипотентной клетке сохраняться в плюрипотентном состоянии. Одним обычно используемым фидерным слоем для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека является слой фибробластов мыши. Недавно были разработаны фидерные слои фибробластов человека для применения при культивировании плюрипотентных клеток (см. патентную заявку США №2002/0072117, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Альтернативные способы позволяют поддерживать плюрипотентные клетки без применения фидерного слоя. Способы поддержания плюрипотентных клеток в бесфидерных условиях описаны в патентной публикации США №2003/0175956, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.In some methods, pluripotent stem cells, such as hES cells, are supported on the feeder layer. Such methods can use any feeder layer that allows the pluripotent cell to remain in the pluripotent state. One commonly used feeder layer for culturing human embryonic stem cells is the mouse fibroblast layer. Recently, feeder layers of human fibroblasts have been developed for use in culturing pluripotent cells (see US patent application No. 2002/0072117, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety). Alternative methods allow the maintenance of pluripotent cells without the use of a feeder layer. Methods for maintaining pluripotent cells in a feederless environment are described in US Patent Publication No. 2003/0175956, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Плюрипотентные клетки, раскрытые в настоящей заявке, можно поддерживать в культуре с сывороткой или без сыворотки, с экстрацеллюлярным матриксом или без него, с FGF или без него. В некоторых процедурах поддержания плюрипотентных клеток применяют замену сыворотки. Эти и другие способы культивирования и дифференцировки плюрипотентных или мультипотентных клеток, соответственно, описаны в PCT/US2007/062755, поданной 23 февраля 2007, и озаглавленной «Композиции и способы культивирования дифференциальный клеток», и PCT/US2008/080516, поданной 20 октября 2008, и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The pluripotent cells disclosed herein can be maintained in culture with or without serum, with or without extracellular matrix, with or without FGF. Some procedures for maintaining pluripotent cells use serum replacement. These and other methods for culturing and differentiating pluripotent or multipotent cells, respectively, are described in PCT / US2007 / 062755, filed Feb. 23, 2007, and entitled Differential Cell Culturing Compositions and Methods, and PCT / US2008 / 080516, filed Oct. 20, 2008. and entitled "Methods and Compositions for Feederless Pluripotent Stem Cell Media Containing Human Serum", which are hereby incorporated by reference in their entirety.

Изобретение, раскрытое в настоящей заявке, пригодно для всех hES линий клеток, и по меньшей мере тех, которые перечислены в Таблице 4. Эта информация получена из литературы и публичных баз данных, включая, например, Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NTH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток, расположенный в Медицинской школе Массачусетского университета, Ворчестер, Массачусетс, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда становятся доступными линии клеток и получена регистрация. На дату подачи настоящей заявки имеется 254 линии iPSC, перечисленных в Международной реестре стволовых клеток, и 1211 линий hESC. В Таблице 4 внизу не включены все перечисленные hESC и iPSC, но скорее приведены примеры потенциально доступных плюрипотентных стволовых клеток.The invention disclosed in this application is applicable to all hES cell lines, and at least those listed in Table 4. This information is obtained from the literature and public databases, including, for example, the National Institutes of Health (NTH) Stem Cell Registry, Human Embryonic Stem Cell Registry and International Stem Cell Registry located at the University of Massachusetts School of Medicine, Worcester, MA, USA. These databases are periodically updated when cell lines become available and registrations are received. As of the filing date of this application, there are 254 iPSC lines listed in the International Stem Cell Registry and 1211 hESC lines. Table 4 below does not include all of the listed hESCs and iPSCs, but rather provides examples of potentially available pluripotent stem cells.

Плюрипотентные дедифференцированные соматические клеткиPluripotent dedifferentiated somatic cells

Недавние исследования с применением определенных нуклеарных перепрограммирующих факторов обеспечили получение плюрипотентных стволовых клеток или плюрипотентно-подобных стволовых клеток из собственных соматических клеток пациента. Эти клетки также называются индуцированными плюрипотентными стволовыми (iPS) клетками. Настоящее изобретение описывает различные линии iPS клеток, предоставленные Shinya Yamanaka, Университет Киото. Однако, другие линии iPS клеток, например, описанные James Thomson et al., включены в настоящее изобретение. См. публикацию США 20090047263, Международную публикацию WO 2005/80598, публикацию США 20080233610 и Международную публикацию WO 2008/11882, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, термин «индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки», использующийся в настоящей заявке, означает клетки, обладающие свойствами, подобными свойствам других плюрипотентных стволовых клеток, например, hES клетки, hEG клетки, pPS клетки (плюрипотентные стволовые клетки приматов), патогенные клетки, и тому подобное.Recent studies using certain nuclear reprogramming factors have provided pluripotent stem cells or pluripotent-like stem cells from the patient's own somatic cells. These cells are also called induced pluripotent stem cells (iPS) cells. The present invention describes various iPS cell lines provided by Shinya Yamanaka, Kyoto University. However, other iPS cell lines, such as those described by James Thomson et al., Are included in the present invention. See US Publication 20090047263, International Publication WO 2005/80598, US Publication 20080233610 and International Publication WO 2008/11882, which are hereby incorporated by reference in their entirety. Thus, the term "induced pluripotent stem (iPS) cells", as used in this application, means cells with properties similar to those of other pluripotent stem cells, for example, hES cells, hEG cells, pPS cells (primate pluripotent stem cells), pathogenic cells, and the like.

Ядерные программирующие факторы описаны в публикации США 20090047263, Международной публикации WO 2005/80598, публикации США 20080233610 и Международной публикации WO 2008/11882, и применяются для индукции перепрограммировании дифференцированных клеток без применения яйцеклеток, эмбрионов или ES клеток. Способы приготовления индуцированных iPS клеток из соматических клеток путем применения ядерных перепрограммирующих факторов подобны тем, которые описаны в настоящем изобретении, и не ограничиваются конкретно. В предпочтительных вариантах осуществления ядерные перепрограммирующие факторы контактируют с соматическими клетками в среде, в которой соматические клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут пролиферировать. Преимуществом некоторых вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, является то, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки можно приготовить путем контакта ядерного перепрограммирующего фактора с соматическими клетками при отсутствии яйцеклеток, эмбрионов или эмбриональных стволовых (ES) клеток. С применением ядерного перепрограммирующего фактора ядро соматической клетки можно перепрограммировать для получения iPS клетки или «ES-подобной клетки».Nuclear programming factors are described in US Publication 20090047263, International Publication WO 2005/80598, US Publication 20080233610 and International Publication WO 2008/11882, and are used to induce the reprogramming of differentiated cells without the use of eggs, embryos or ES cells. Methods for preparing iPS-induced cells from somatic cells by using nuclear reprogramming factors are similar to those described in the present invention and are not particularly limited. In preferred embodiments, nuclear reprogramming factors are contacted with somatic cells in an environment in which somatic cells and induced pluripotent stem cells can proliferate. An advantage of some of the embodiments described herein is that induced pluripotent stem cells can be prepared by contacting nuclear reprogramming factor with somatic cells in the absence of eggs, embryos, or embryonic stem (ES) cells. Using a nuclear reprogramming factor, the nucleus of a somatic cell can be reprogrammed to produce an iPS cell or "ES-like cell".

Плюрипотентные стволовые клетки, описанные в настоящей заявке, являющиеся hES клетками или iPS клетками, могут экспрессировать любое количество маркеров плюрипотентных клеток, включая щелочную фосфатазу (АР); ABCG2; стадиеспецифический эмбриональный антиген-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, Е-кадгерин; βIII-тубулин; альфа-гладкомышечный актин (альфа-SMA); фактор роста фибробластов 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; белок «цинковые пальцы» 296 (Zfp296); N-ацетилтрансферазу-1 (Nat1); ассоциированный с ES клетками транскрипт 1 (ЕСАТ1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ЕСАТ3; ЕСАТ6; ЕСАТ7; ЕСАТ8; ЕСАТ9; ЕСАТ10; ЕСАТ15-1; ЕСАТ15-2; Fthl17; Sal14; фактор транскрипции недифференцированных эмбриональных клеток (Utf1); Rex1; р53; G3PDH; теломеразу, включая TERT; молчащие гены X хромосомы; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-бокс содержащий белок 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c- Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; дифференцировочный ассоциированный с плюрипотентностью 2 (DPPA2); Т-клеточной лимфомы точка разрыва 1 (Tcl1); DPPA3/Stella; DPPA4 и тому подобные, но не ограничиваясь ими. Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается маркерами, перечисленными в настоящей заявке, и охватывает такие маркеры, как маркеры поверхности клеток, антигены, и другие продукты генов, включая EST, РНК (включая микроРНК и антисмысловые РНК), ДНК (включая гены и кДНК), и их части.The pluripotent stem cells described herein, which are hES cells or iPS cells, can express any number of pluripotent cell markers, including alkaline phosphatase (AP); ABCG2; stage specific embryonic antigen-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49 / 6E; ERas / ECAT5, E-cadherin; βIII-tubulin; alpha smooth muscle actin (alpha SMA); fibroblast growth factor 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; zinc finger protein 296 (Zfp296); N-acetyltransferase-1 (Nat1); ES cell associated transcript 1 (ECAT1); ESG1 / DPPA5 / ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; an undifferentiated embryonic cell transcription factor (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerase, including TERT; silent genes of the X chromosome; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box containing protein 15 (Fbx15); Nanog / ECAT4; Oct 3/4; Sox2; Klf4; c - Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; differentiation associated with pluripotency 2 (DPPA2); T-cell lymphoma break point 1 (Tcl1); DPPA3 / Stella; DPPA4 and the like, but not limited to. It should be understood that the present invention is not limited to the markers listed in this application, and covers markers such as cell surface markers, antigens, and other gene products, including EST, RNA (including microRNA and antisense RNA), DNA (including genes and cDNA ), and their parts.

В одном варианте осуществления линии iPS клеток, применяемые в настоящей заявке, содержат следующие гены ядерных перепрограммирующих факторов: семейство генов Oct, семейство генов Klf, и семейство генов Sox. В одной линии iPS клеток обеспечен каждый из трех видов генов: Oct3/4, Klf4, и Sox2. Применялись другие продукты генов линии iPS из каждого из следующих трех видов: ген семейства Oct, ген семейства Klf, и ген семейства Myc, например, Oct3/4, Klf4 и c-Myc. Соответственно, необходимо понимать, что ядерный перепрограммирующий фактор может быть с геном семейства Myc или без него.In one embodiment, the iPS cell lines used herein comprise the following nuclear reprogramming factor genes: the Oct gene family, the Klf gene family, and the Sox gene family. In one iPS cell line, each of three kinds of genes is provided: Oct3 / 4, Klf4, and Sox2. Other iPS gene products from each of the following three species were used: the Oct family gene, the Klf family gene, and the Myc family gene, for example Oct3 / 4, Klf4 and c-Myc. Accordingly, it should be understood that the nuclear reprogramming factor can be with or without the gene of the Myc family.

Ядерные перепрограммирующие факторы, описанные в настоящей заявке и также известные в данной области техники, можно применять для генерации iPS клеток из дифференцированных взрослых соматических клеток, и они не ограничиваются типом перепрограммируемых соматических клеток, т.е. любой вид соматических клеток можно перепрограммировать или дедифференцировать. Поскольку перепрограммирование соматических клеток не требует яйцеклетки и/или эмбриона, iPS клетка может быть клеткой млекопитающего, таким образом, обеспечивая возможность генерации пациент- или болезнь-специфических плюрипотентных стволовых клеток.The nuclear reprogramming factors described herein and also known in the art can be used to generate iPS cells from differentiated adult somatic cells, and are not limited to the type of reprogrammed somatic cells, i.e. any kind of somatic cells can be reprogrammed or dedifferentiated. Since reprogramming of somatic cells does not require an egg and / or an embryo, the iPS cell can be a mammalian cell, thus allowing the generation of patient- or disease-specific pluripotent stem cells.

Суспензия агрегатов плюрипотентных стволовых клетокSuspension of pluripotent stem cell aggregates

В отличие от ранее известных способов тканевой инженерии, которые основаны на высеве индивидуальных клеток на полимерные каркасы, матрицы и/или гели, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут применять суспензии агрегатов клеток, полученные из плюрипотентной стволовой клетки, суспензий отдельных клеток или суспензий дифференцированных отдельных клеток, полученных из них. Способы обработки и/или производства суспензий агрегатов стволовых клеток и дифференцировки клеток из них описаны в Международных заявках PCT/US2007/062755 и PCT/US2008/082356, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Unlike previously known tissue engineering methods, which are based on seeding individual cells on polymer scaffolds, matrices and / or gels, the embodiments described in this application can use suspensions of cell aggregates obtained from a pluripotent stem cell, single cell suspensions or suspensions. differentiated individual cells derived from them. Methods for processing and / or producing suspensions of stem cell aggregates and differentiating cells therefrom are described in WOs PCT / US2007 / 062755 and PCT / US2008 / 082356, which are hereby incorporated by reference in their entirety.

В одном варианте осуществления обеспечиваются способы получения суспензий агрегатов плюрипотентных столовых клеток из суспензии отдельных клеток культур плюрипотентных стволовых клеток, например, культур hES или iPS. Плюрипотентные стволовые клетки можно исходно культивировать на фибробластных фидерах или без фидеров. Способы выделения hES клеток и их культивирования на фидерных клетках человека описаны в патенте США №7,432,104, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.In one embodiment, methods are provided for preparing suspensions of pluripotent stem cell aggregates from a single cell suspension of pluripotent stem cell cultures, eg, hES or iPS cultures. Pluripotent stem cells can be cultured initially on fibroblast feeders or without feeders. Methods for isolating hES cells and culturing them on human feeder cells are described in US Pat. No. 7,432,104, which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Термин «суспензия из отдельных клеток», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означает суспензию плюрипотентных, мультипотентных или окончательно дифференцированных отдельных клеток, или суспензию отдельных клеток, полученных их плюрипотентной или мультипотентных клеток, любыми механическими или химическими средствами. Существует несколько способов диссоциации кластеров клеток до получения суспензий отдельных клеток из первичных тканей, прикрепленных клеток в культуре, и агрегатов, например, физические усилия (механическая диссоциация, такая как с помощью скребка для клеток, измельчение с помощью пипетки с узким поперечным сечением, тонкоигольная аспирация, дизагрегация с помощью вортекса и принудительная фильтрация через мелкую сетку из нейлона или нержавеющей стали), ферменты (ферментативная диссоциация таким ферментами, как трипсин, коллагеназа, Accutase™ и тому подобное), или комбинация того и другого. Далее, способы и условия культуральных сред, пригодных для поддержания диссоциации на отдельные клетки плюрипотентных, мультипотентных или дифференцированных клеток, применяются для экспансии, сортировки клеток, и установленного высева для анализа на многолуночных планшетах и обеспечения автоматизации процедур культивирования и клональной экспансии.The term "suspension of single cells" as used in this application, or its equivalents, means a suspension of pluripotent, multipotent or definitively differentiated single cells, or a suspension of single cells obtained from pluripotent or multipotent cells, by any mechanical or chemical means. There are several ways to dissociate cell clusters to obtain single cell suspensions from primary tissues, attached cells in culture, and aggregates, for example, physical exertion (mechanical dissociation such as with a cell scraper, comminution with a narrow cross-section pipette, fine needle aspiration , vortex disaggregation and forced filtration through fine nylon or stainless steel mesh), enzymes (enzymatic dissociation by enzymes such as trypsin, collagenase, Accutase ™, etc.), or a combination of both. Further, methods and conditions of culture media suitable for maintaining dissociation into single cells of pluripotent, multipotent, or differentiated cells are used for expansion, sorting of cells, and set seeding for assay on multi-well plates and to provide automation of culture and clonal expansion procedures.

Другие варианты осуществления обеспечивают способы получения суспензий агрегатов плюрипотентных стволовых клеток непосредственно в средах для дифференцировки, например, средах для дифференцировки, содержащих агент, предпочтительно, член семейства TGFβ, способный активировать рецептор семейства TGFβ, например, активин А, активин В, GDF-8, GDF-11, и Nodal. Факторы роста для получения энтодермы описаны в Международной заявке № PCT/US2008/065686, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Способы получения суспензии агрегатов клеток в средах для дифференцировки могут отличаться от других способов, также описанных в настоящей заявке, которые обеспечивают получение агрегатных суспензионных культур клеток в средах для плюрипотентных стволовых клеток, например, StemPro® hES SFM (Invitrogen) на основе херегулин-основанных DC-HAIF сред, описанных в PCT/US2007/062755.Other embodiments provide methods for preparing suspensions of pluripotent stem cell aggregates directly in differentiation media, for example, differentiation media containing an agent, preferably a member of the TGFβ family, capable of activating a receptor of the TGFβ family, for example, Activin A, Activin B, GDF-8, GDF-11, and Nodal. Growth factors for the production of endoderm are described in International Application No. PCT / US2008 / 065686, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Methods for preparing a suspension of cell aggregates in differentiation media may differ from other methods also described in this application, which provide for the preparation of aggregate suspension cultures of cells in media for pluripotent stem cells, for example, StemPro® hES SFM (Invitrogen) based on heregulin-based DC -HAIF media described in PCT / US2007 / 062755.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам генерации агрегата плюрипотентных клеток в суспензии из плюрипотентной адгезивной культуры, путем культивирования плюрипотентной клетки в условиях адгезивной ростовой культуры, обеспечивающих экспансию в недифференцированном состоянии; диссоциации адгезивной культуры плюрипотентных клеток в суспензионную культуру отдельных клеток; контактирования суспензионной культуры отдельных клеток при первых дифференцирующих условиях культивирования, обеспечивающих образование агрегатов клеток из hES в суспензии путем перемешивания суспензионной культуры из отдельных клеток в течение такого периода времени, когда суспензионная культура из отдельных клеток образует в суспензии агрегаты клеток, полученные из плюрипотентных; и таким образом, генерации агрегатов клеток в суспензии, полученных из плюрипотентных клеток. В предпочтительных вариантах осуществления перемешивание суспензионной культуры отдельных клеток выполняют путем вращения со скоростью 80-160 об./мин. В некоторых других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, ингибитор rho-киназы применяют для облегчения агрегации, роста, пролиферации, экспансии и/или клеточной массы плюрипотентных стволовых клеток.The embodiments described herein relate to methods for generating an aggregate of pluripotent cells in suspension from a pluripotent adhesive culture by culturing the pluripotent cell under adhesive growth culture conditions allowing expansion in an undifferentiated state; dissociation of an adhesive culture of pluripotent cells into a suspension culture of single cells; contacting the suspension culture of individual cells under the first differentiating culture conditions, ensuring the formation of cell aggregates from hES in suspension by stirring the suspension culture from individual cells for a period of time when the suspension culture from individual cells forms cell aggregates obtained from pluripotent cells in suspension; and thus the generation of cell aggregates in suspension derived from pluripotent cells. In preferred embodiments, stirring of the single cell suspension culture is performed by rotating at 80-160 rpm. In some other embodiments, implementation described in this application, the rho kinase inhibitor is used to facilitate the aggregation, growth, proliferation, expansion and / or cell mass of pluripotent stem cells.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, также относятся к способам генерации агрегатов, полученных из плюрипотентных клеток, в суспензии из отдельных плюрипотентных клеток, путем культивирования hES клеток в условиях адгезивной ростовой культуры, обеспечивающих экспансию в недифференцированном состоянии; контактирования недифференцированных hES клеток с первыми дифференцирующими культуральными условиями, пригодными для дифференцировки hES клеток с получением адгезивных клеток, полученных из плюрипотентных; диссоциации адгезивных клеток, полученных из hES, в суспензионную культуру из отдельных клеток; контактирования суспензионной культуры из отдельных клеток со вторыми дифференцирующими культуральными условиями, обеспечивающими образование агрегатов, полученных из hES клеток, в суспензии, путем перемешивания суспензионной культуры отдельных клеток в течение такого периода времени, чтобы суспензионная культура из отдельных клеток формировала агрегаты, полученные из плюрипотентных клеток, в суспензии, и таким образом, получая агрегаты, образованные из плюрипотентных клеток, в суспензии. В предпочтительных вариантах осуществления перемешивание суспензионной культуры из отдельных клеток выполняют путем вращения со скоростью примерно от 80 об./мин до 160 об./мин.The embodiments described herein also relate to methods for generating aggregates derived from pluripotent cells in suspension from single pluripotent cells by culturing hES cells under adhesive growth culture conditions allowing expansion in an undifferentiated state; contacting undifferentiated hES cells with first differentiating culture conditions suitable for differentiating hES cells to obtain adherent cells derived from pluripotent; dissociation of adherent cells derived from hES into suspension culture from single cells; contacting the suspension culture from single cells with a second differentiating culture conditions allowing the formation of aggregates derived from hES cells in suspension by stirring the suspension culture of single cells for such a period of time that the suspension culture from single cells forms aggregates derived from pluripotent cells, in suspension, and thus obtaining aggregates formed from pluripotent cells in suspension. In preferred embodiments, agitation of the single cell suspension culture is performed by rotating at about 80 rpm to 160 rpm.

В предпочтительных вариантах осуществления суспензионные культуры промышленного масштаба применяют непрерывную перфузию сред в качестве способа поддержания жизнеспособности клеток при максимизации плотности клеток. В этом контексте замен среды вносит сдвиг жидкости в культуру, влияя на адгезивные клетки и суспендированные агрегаты по-разному. Иммобилизованные адгезивные клетки подвергаются стрессу сдвига жидкости, когда среда течет, касаясь поверхности клеток. Напротив, суспендированные агрегаты подвергаются значительно меньшему влиянию сдвигового стресса вдоль поверхности агрегатов, поскольку агрегаты свободно переворачиваются в ответ на прилагаемое сдвиговое усилие. Ожидается, что длительный сдвиговый стресс является вредным для адгезивных плюрипотентных клеток, и что формат суспендированных агрегатов предпочтителен для оптимального выживания и функции. Таким образом, на основе потребности в эффективном производственном процессе для получения плюрипотентных стволовых клеток и/или мультипотентных прогениторных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток и вышеуказанных механических факторов, связанных со сдвиговым усилием и сдвиговым стрессом, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, обеспечивают в первую очередь способы производства для получения плюрипотентных стволовых клеток и/или мультипотентных прогениторных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток в формате суспензии, в частности, формате суспензии агрегатов клеток.In preferred embodiments, commercial scale suspension cultures employ continuous perfusion of media as a method of maintaining cell viability while maximizing cell density. In this context, medium substitution introduces fluid shear into the culture, affecting adherent cells and suspended aggregates in different ways. Immobilized adherent cells are subjected to fluid shear stress as the medium flows into contact with the cell surface. In contrast, suspended aggregates are significantly less affected by shear stress along the surface of the aggregates, since the aggregates freely turn over in response to the applied shear force. Long-term shear stress is expected to be detrimental to adherent pluripotent cells and that the suspended aggregate format is preferred for optimal survival and function. Thus, based on the need for an efficient manufacturing process for obtaining pluripotent stem cells and / or multipotent progenitor cells derived from pluripotent stem cells and the above mechanical factors associated with shear force and shear stress, the embodiments described herein are provided in primarily manufacturing methods for producing pluripotent stem cells and / or multipotent progenitor cells derived from pluripotent stem cells in a suspension format, in particular a cell aggregate suspension format.

В еще одном варианте осуществления суспензии агрегатов hES клеток культивировали в среде, по существу свободной от сыворотки, и кроме того, не содержащей экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF). Это отличается от патента США №7,005,252 от Thomson, J., в котором было необходимо культивирование hES клеток в среде без сыворотки, но содержащей экзогенно добавленные ростовые факторы, включая FGF. В некоторых вариантах осуществления суспензии агрегатов iPS клеток культивировали в среде, по существу свободной от сыворотки и/или дополнительно при отсутствии экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF).In yet another embodiment, suspensions of hES cell aggregates are cultured in substantially serum-free media and further free of exogenously added fibroblast growth factor (FGF). This is in contrast to US Pat. No. 7,005,252 from Thomson, J., which required culturing hES cells in serum-free medium but containing exogenously added growth factors, including FGF. In some embodiments, the iPS cell aggregate suspensions are cultured in substantially serum-free media and / or additionally in the absence of exogenously added fibroblast growth factor (FGF).

В отличие от агрегатов клеток, полученных ранее известными способами, которые могут варьировать по размеру и форме, агрегаты клеток и способы, описанные в настоящей заявке, имеют более узкий диапазон распределения по размеру и форме, т.е. агрегаты клеток являются по существу однородными по размеру и/или форме. Однородность размера агрегатов клеток является критической для эффективности дифференцировки и однородности культуры. При использовании основного анализа массового переноса агрегатов ожидается, что диффузия кислорода и нутриентов к центру больших агрегатов будет низкой по сравнению с диффузией в меньшие агрегаты, с учетом равной проницаемости. Поскольку дифференцировка агрегированных ES клеток, или iPS клеток, в линию панкреатических клеток зависит от временного применения специфических факторов роста, культура со смесью агрегатов различного диаметра, вероятно, будет десинхронизованной, по сравнению с однородной (по размеру и форме) культурой агрегатов клеток. Смесь агрегатов клеток дает начало гетерогенности, и может привести к плохой эффективности дифференцировки, и в итоге не будет пригодной для производства, масштабирования и выработки. Таким образом, выражение «по существу однородный» или «по существу однородный по размеру и форме», использующееся в настоящей заявке, или его эквиваленты, относится к разбросу по однородности агрегатов, и составляет не более примерно 20%. В другом варианте осуществления разброс по однородности агрегатов составляет не более примерно 15%, 10% или 5%.Unlike the cell aggregates obtained by prior art methods, which can vary in size and shape, the cell aggregates and methods described herein have a narrower range of size and shape distribution, i. E. the cell aggregates are substantially uniform in size and / or shape. The uniformity of the size of the cell aggregates is critical for the efficiency of differentiation and the uniformity of the culture. Using basic aggregate mass transfer analysis, diffusion of oxygen and nutrients towards the center of large aggregates is expected to be low compared to diffusion into smaller aggregates, given equal permeability. Since the differentiation of aggregated ES cells, or iPS cells, into a pancreatic cell line depends on the temporary application of specific growth factors, a culture with a mixture of aggregates of different diameters is likely to be desynchronized compared to a homogeneous (in size and shape) culture of cell aggregates. A mixture of cell aggregates gives rise to heterogeneity, and can lead to poor differentiation efficiency, and ultimately will not be suitable for production, scaling and development. Thus, the expression "substantially uniform" or "substantially uniform in size and shape" as used in this application, or its equivalents, refers to the spread in uniformity of the aggregates, and is no more than about 20%. In another embodiment, the spread in the uniformity of the aggregates is no more than about 15%, 10%, or 5%.

Хотя точное число клеток на агрегат не является критическим, специалистам в данной области техники понятно, что размер каждого агрегата (и таким образом, число клеток на агрегат) ограничивается способностью кислорода и нутриентов к диффузии в центральные клетки, и что это число может также варьировать в зависимости от типа клеток и питательных потребностей этого типа клеток. Агрегаты клеток могут содержать минимальное число клеток (например, две или три клетки) на агрегат, или могут содержать многие сотни или тысячи клеток на агрегат. Как правило, агрегаты клеток содержать сотни или тысячи клеток на агрегат. Для целей настоящего изобретения агрегаты клеток, как правило, имеют размер примерно от 50 микрон до 600 микрон, хотя, в зависимости от типа клеток, размер может быть меньше или больше этого диапазона. В одном варианте осуществления агрегаты клеток имеют размер примерно от 50 микрон до 250 микрон, или примерно от 75 до 200 микрон, и предпочтительно, примерно от 100 до 150 микрон.While the exact number of cells per aggregate is not critical, those skilled in the art will appreciate that the size of each aggregate (and thus the number of cells per aggregate) is limited by the ability of oxygen and nutrients to diffuse into central cells, and that this number can also vary in depending on the cell type and the nutritional requirements of that cell type. Cell aggregates may contain a minimum number of cells (eg, two or three cells) per aggregate, or may contain many hundreds or thousands of cells per aggregate. Typically, cell aggregates contain hundreds or thousands of cells per aggregate. For purposes of the present invention, cell aggregates typically range in size from about 50 microns to about 600 microns, although depending on the type of cells, the size may be less or greater than this range. In one embodiment, the cell aggregates are from about 50 microns to about 250 microns, or from about 75 to 200 microns, and preferably from about 100 to 150 microns.

Другие способы описывают получение эмбриоидных телец (ЕВ). Термины «эмбриоидные тельца», «агрегатные тельца», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают агрегаты из дифференцированных или недифференцированных клеток, которые появляются, когда ES клетки перерастают в однослойных культурах, или поддерживаются в суспензионных культурах в не-дифференцирующей среде, или дифференцируются с помощью ненаправленных протоколов в ткани из множества зародышевых листков. То есть, ЕВ не образуются из суспензии из отдельных клеток или плюрипотентных стволовых клеток, как описано в настоящей заявке, и не образуются из адгезивных культур или мультипотентных клеток, полученных из плюрипотентных. Эти характеристики по отдельности явно отличают настоящее изобретение от эмбриоидных телец.Other methods describe the production of embryoid bodies (EB). The terms "embryoid bodies", "aggregate bodies" as used herein, or their equivalents, mean aggregates of differentiated or undifferentiated cells that appear when ES cells are outgrown in monolayer cultures, or are maintained in suspension cultures in a non-differentiating medium, or differentiate by non-directional protocols into tissues from multiple germ layers. That is, EBs are not formed from a suspension of single cells or pluripotent stem cells, as described in this application, and are not formed from adherent cultures or multipotent cells derived from pluripotent. These characteristics alone clearly distinguish the present invention from embryoid bodies.

В отличие от эмбриоидных телец, которые являются смесью дифференцированных и недифференцированных клеток, и, как правило, состоят из клеток из нескольких зародышевых листков и проходят через произвольную дифференцировку, агрегаты клеток, описанные в настоящей заявке, по существу или в основном являются гомо-клеточными, существуя в виде агрегатов из плюрипотентных, мультипотентных, бипотентных или унипотентных типов клеток, например, эмбриональных клеток, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1 позитивной панкреатической энтодермы, панкреатических эндокринных клеток и тому подобного.Unlike embryoid bodies, which are a mixture of differentiated and undifferentiated cells, and usually consist of cells from several germ layers and undergo arbitrary differentiation, the cell aggregates described in this application are essentially or mainly homocellular. existing as aggregates of pluripotent, multipotent, bipotent or unipotent cell types, for example, embryonic cells, definitive endoderm, anterior gastrointestinal tract endoderm, PDX1 positive pancreatic endoderm, pancreatic endocrine cells, and the like.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, решают вышеуказанные проблемы путем обеспечения экономичных производственных процессов или способов, обеспечивающих воспроизводимое получение агрегатов клеток, по существу однородных по размеру и форме, с применением способа, который легко применить в производственном масштабе. В одном частном варианте осуществления дифференцируемые клетки увеличиваются в суспензионной культуре, с применением клеточных сред из настоящего изобретения. В другом частном варианте осуществления дифференцируемые клетки могут поддерживаться и увеличиваться в суспензии, т.е. они остаются недифференцированными, или предотвращается их дальнейшая дифференцировка. Термин «увеличиваться» в контексте культуры клеток применяется так, как в данной области техники, и относится к пролиферации клеток и повышению количества клеток, предпочтительно, к повышению числа жизнеспособных клеток. В специфическом варианте осуществления клетки увеличиваются в суспензии культуры более чем примерно за одни сутки, т.е. примерно за 24 часа. В более специфическом варианте осуществления клетки увеличиваются в суспензионной культуре путем культивирования в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 суток, или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 недель.The embodiments described herein address the above problems by providing cost-effective manufacturing processes or methods that reproducibly produce cell aggregates that are substantially uniform in size and shape using a method that is easy to apply on a production scale. In one particular embodiment, differentiable cells are increased in suspension culture using the cell media of the present invention. In another particular embodiment, the differentiated cells can be maintained and enlarged in suspension, i. E. they remain undifferentiated, or their further differentiation is prevented. The term "increase" in the context of cell culture is used as in the art and refers to cell proliferation and an increase in the number of cells, preferably to an increase in the number of viable cells. In a specific embodiment, cells increase in culture suspension in more than about one day, i. E. in about 24 hours. In a more specific embodiment, the cells are grown in suspension culture by culture for at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 weeks ...

Другие варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы получения суспензий агрегатов клеток, образованных из культур дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, например, клеток, полученных из плюрипотентных клеток, описанных в настоящей заявке, и включая клетки от этапов 1, 2, 3, 4 и 5, как описано в

2005 and 2006, выше. Таким образом, способы получения агрегатов клеток, описанных в настоящей заявке, не ограничиваются какой-либо одной плюрипотентной или мультипотентной клеткой или стадией клетки, но скорее способом применения и потребностью в оптимизации типа клеток, которые диктуют, какие способы являются предпочтительными.Other embodiments of the present invention provide methods for preparing suspensions of cell aggregates formed from cultures of differentiated pluripotent stem cells, for example, cells derived from pluripotent cells described herein, and including cells from

steps

1, 2, 3, 4 and 5, as described in

2005 and 2006, above. Thus, the methods for producing cell aggregates described herein are not limited to any single pluripotent or multipotent cell or cell stage, but rather the mode of use and the need for cell type optimization that dictate which methods are preferred.

Способы, описанные в настоящей заявке для получения агрегатных суспензионных культур плюрипотентных клеток, например, hES или iPS клеток, и клеток, полученных из других источников плюрипотентных клеток, например, эмбриональных зародышевых клеток или пратенотов, подробно описаны в PCT/US2007/062755, поданной 23 февраля 2007, и озаглавленной «Compositions and methods for culturing differential cells» («Композиции и способы культивирования различных клеток») и PCT/US2008/080516, поданной 20 октября, 2008, и озаглавленной «Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum» («Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека»), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The methods described in this application for the preparation of aggregate suspension cultures of pluripotent cells, for example, hES or iPS cells, and cells obtained from other sources of pluripotent cells, for example, embryonic germ cells or pratenots, are detailed in PCT / US2007 / 062755, filed 23 February 2007, and entitled “Compositions and methods for culturing differential cells” and PCT / US2008 / 080516, filed October 20, 2008, and entitled “Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum "(" Methods and compositions for feederless media for pluripotent stem cells containing human serum "), which are fully incorporated into this description by reference.

Способы, описанные в настоящей заявке, никоим образом не требуют предварительного покрытия сосудов для культивирования экстрацеллюлярным матриксом, например, как описано в патенте США №6,800,480, Bodnar et al., принадлежащем Geron Corporation. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, iPS клетки можно культивировать таким же способом, как и другие плюрипотентные стволовые клетки, например, hES и iPS клетки, которые культивируют с применением растворенной сыворотки человека, как подробно описано в патентной заявке США PCT/US2008/080516, поданной 20 октября 2008, и озаглавленной «Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum» («Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека»), полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.The methods described in this application in no way require pre-coating of culture vessels with an extracellular matrix, for example, as described in US patent No. 6,800,480, Bodnar et al., Owned by Geron Corporation. In some embodiments, the implementation described in this application, iPS cells can be cultured in the same manner as other pluripotent stem cells, for example, hES and iPS cells, which are cultured using dissolved human serum, as detailed in US patent application PCT / US2008 / 080516, filed October 20, 2008, and entitled "Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum" via link.

Способы, описанные в настоящей заявке, никоим образом не требуют экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF) из иного источника, чем просто слой фидерных фибробластов, как описано в патенте США №7,005,252, Thomson, J., принадлежащем Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF), полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.The methods described herein do not in any way require exogenously added fibroblast growth factor (FGF) from a source other than just the feeder fibroblast layer as described in US Pat. No. 7,005,252, Thomson, J., to the Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) , fully incorporated into the present description by reference.

Композиции мультипотентных и дифференцированных клетокCompositions of multipotent and differentiated cells

Композиции клеток, полученные посредством способов из настоящей заявки, включают культуры клеток, содержащие плюрипотентные стволовые клетки, клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-со-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующие эндокринные клетки или INS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивные эндокринные клетки, где по меньшей мере примерно 5-90% клеток в культуре являются полученными клетками препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-co-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующими эндокринными клетками или INS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивными эндокринными клетками.Cell compositions obtained by the methods of this application include cell cultures containing pluripotent stem cells, cells of the preprimary streak, mesoentoderm, definitive endoderm, anterior endoderm, PDX1-positive endoderm of the anterior alimentary tract, PDX1-positive PDX1 pancreatic pancreatic /NKX6.1- co-positive pancreatic endocrine endocrine precursor, or NGN3 / NKX2.2-co-positive endocrine precursor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP single-positive endocrine cells, where at least about 5-90% of the cells in culture are derived from preprimary streak, mesoentoderm, definitive endoderm, anterior endoderm, PDX1-positive anterior endoderm, PDX1-positive pancreatic endodermX6.1 / N-co positive pancreatic endoderm, endocrine pre precursor or NGN3 / NKX2.2-co-positive endocrine precursor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP single-positive endocrine cells.

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к композициям, таким как популяции клеток и культуры клеток клеток, содержащие как плюрипотентные клетки, так и стволовые клетки, такие как стволовые клетки и iPS клетки, и мультипотентные клетки, такие как клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы или дефинитивной энтодермы, а также более дифференцированные, но все еще потенциально мультипотентные клетки, такие как клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-co-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующие эндокринные клетки или INS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивные эндокринные клетки. Например, с применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие смеси плюрипотентных стволовых клеток и других мультипотентных или дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления получают композиции, содержащие по меньшей мере примерно 5 мультипотентных или дифференцированных клеток на каждые 95 плюрипотентных клеток. В других вариантах осуществления получают композиции, содержащие по меньшей мере примерно 95 мультипотентных или дифференцированных клеток на каждые 5 плюрипотентных клеток. Дополнительно подразумеваются композиции, содержащие другие отношения мультипотентных или дифференцированных клеток к плюрипотентным клеткам. Например, подразумеваются композиции, содержащие по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 1,000,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 100,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 10,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 1000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 500 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 100 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 10 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 5 плюрипотентных клеток, и примерно на каждую 1 плюрипотентную клетку, и по меньшей мере примерно 1,000,000 мультипотентных или дифференцированных клеток примерно на каждую 1 плюрипотентную клетку.Some embodiments described herein relate to compositions such as cell populations and cell cultures containing both pluripotent cells and stem cells such as stem cells and iPS cells and multipotent cells such as preprimary streak cells. mesoendoderm or definitive endoderm, as well as more differentiated but still potentially multipotent cells such as PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, PDX1-positive pancreatic endoderm, or PDX1 / NKX6.1-co-positive pancreatic or endocrine pancreatic cells NGN3 / NKX2.2-co-positive endocrine progenitor, and hormone-secreting endocrine cells or INS, GCG, GHRL, SST, PP single-positive endocrine cells. For example, using the methods described herein, compositions containing mixtures of pluripotent stem cells and other multipotent or differentiated cells can be prepared. In some embodiments, compositions are prepared comprising at least about 5 multipotent or differentiated cells for every 95 pluripotent cells. In other embodiments, compositions are prepared comprising at least about 95 multipotent or differentiated cells for every 5 pluripotent cells. Additionally, compositions are contemplated containing other ratios of multipotent or differentiated cells to pluripotent cells. For example, compositions are contemplated containing at least 1 multipotent or differentiated cell for every 1,000,000 pluripotent cells, at least 1 multipotent or differentiated cell for every 100,000 pluripotent cells, at least 1 multipotent or differentiated cell for every 10,000 pluripotent cells at least 1 multipotent or differentiated cell for every 1000 pluripotent cells, at least 1 multipotent or differentiated cell for every 500 pluripotent cells, at least 1 multipotent or differentiated cell for every 100 pluripotent cells, at least 1 a multipotent or differentiated cell for about every 10 pluripotent cells, at least 1 multipotent or differentiated cell for about every 5 pluripotent cells, and for about every 1 pluripotent cell, and at least 1 There are approximately 1,000,000 multipotent or differentiated cells for approximately every 1 pluripotent cell.

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся ккультурам клеток или популяциям клеток, содержащим по меньшей мере примерно от 5% мультипотентных или дифференцированных клеток до 99% мультипотентных или дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат клетки млекопитающих. В предпочтительных вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат клетки человека. Например, некоторые специфические варианты осуществления относятся ккультурам клеток, содержащим клетки человека, где по меньшей мере примерно от 5% до 99% от клеток человека являются мультипотентными или дифференцированными клетками. Другие варианты осуществления относятся ккультурам клеток, содержащим клетки человека, где по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99%, или больше 99% клеток человека являются мультипотентными или дифференцированными клетками. В вариантах осуществления, где культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат фидерные клетки человека, вышеуказанные проценты рассчитывают по отношению к фидерным клеткам человека в культурах клеток.Some embodiments described in this application relate to cell cultures or cell populations containing at least about 5% multipotent or differentiated cells to 99% multipotent or differentiated cells. In some embodiments, cell cultures, cell cultures or cell populations comprise mammalian cells. In preferred embodiments, cell cultures, cell cultures or cell populations comprise human cells. For example, some specific embodiments relate to cell cultures containing human cells, where at least about 5% to 99% of the human cells are multipotent or differentiated cells. Other embodiments relate to cell cultures containing human cells, wherein at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 55%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 98 %, at least about 99%, or more than 99% of human cells are multipotent or differentiated cells. In embodiments where cell cultures, cell cultures or cell populations comprise human feeder cells, the above percentages are calculated relative to human feeder cells in cell cultures.

Плюрипотентные, мультипотентные или дифференцированные клетки способны к дифференцировке, или дополнительной дифференцировке в клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, а также клетки, ткани и органы, происходящие из них. Клетки мезоэнтодермы способны к дифференцировке в клетки мезодермы и/или клетки дефинитивной энтодермы, а также клетки, ткани и/или органы, полученные из каждой из этих линий. В некоторых вариантах осуществления клетки препервичной полоски превращаются, через промежуточную мезоэнтодерму, в окончательно дифференцированные клетки линий мезодермы или дефинитивной энтодермы. Например, такие процессы могут обеспечить основу для эффективной получения тканей человека, полученных из энтодермы, таких как поджелудочная железа, печень, легкие, желудок, тонкая кишка, щитовидная железа, паращитовидная железа, тимус, глотка, желчный пузырь и мочевой пузырь. Важно, что получение клеток препервичной полоски и/или клеток мезоэнтодермы является ранним этапом дифференцировки плюрипотентной стволовой клетки в функциональную инсулин-продуцирующую β-клетку. В качестве другого примера, дифференцировка клеток препервичной полоски и/или клеток мезоэнтодермы может обеспечить основу для эффективной получения тканей человека, полученных из мезоэнтодермы, таких как клетки крови, сердечнососудистые ткани, скелетные ткани, а также другие структурные и соединительные ткани.Pluripotent, multipotent or differentiated cells are capable of differentiation, or additional differentiation into cells of the preprimary stria, mesoentoderm, definitive endoderm, as well as cells, tissues and organs derived from them. The cells of the mesoderm are capable of differentiation into cells of the mesoderm and / or cells of the definitive endoderm, as well as cells, tissues and / or organs derived from each of these lines. In some embodiments, the cells of the preprimary streak are transformed, through the intermediate mesoendoderm, into definitively differentiated cells of the mesoderm or definitive endoderm lines. For example, such processes can provide the basis for efficient production of endoderm-derived human tissue such as pancreas, liver, lungs, stomach, small intestine, thyroid, parathyroid, thymus, pharynx, gallbladder, and bladder. It is important that the production of preprimary streak cells and / or mesoentoderm cells is an early stage in the differentiation of a pluripotent stem cell into a functional insulin-producing β-cell. As another example, differentiation of preprimary streak cells and / or mesoentoderm cells can provide the basis for efficient production of human tissues derived from mesoentoderm, such as blood cells, cardiovascular tissues, skeletal tissues, and other structural and connective tissues.

Композиции и способы, описанные в настоящей заявке, имеют некоторые полезные характеристики. Например, культуры клетоккультуры клеток и популяции клеток, включающие мультипотентные клетки, например, клетки препервичной полоски и/или клетки мезоэнтодермы, а также способы получения культур клеток и популяций клеток клеток, пригодны для моделирования ранних этапов развития человека. Далее, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, можно также использовать для терапевтического вмешательства в патологические состояния, такие как сахарный диабет. Например, поскольку клетки препервичной полоски и/или мезоэнтодермальные клетки служат в качестве источника только ограниченного числа тканей, они могут служить для получения чистых тканей или типов клеток. В некоторых способов получения клеток препервичной полоски плюрипотентные клетки, используемые в качестве исходного материала, являются плюрипотентными стволовыми клетками, например, hES, hEG или iPS клетками.The compositions and methods described in this application have some useful characteristics. For example, cell cultures, cell cultures and cell populations including multipotent cells, eg, preprimary streak cells and / or mesoentoderm cells, as well as methods for producing cell cultures and cell populations, are useful for simulating early stages of human development. Further, the compositions and methods described herein can also be used for therapeutic intervention in pathological conditions such as diabetes mellitus. For example, since preprimary streak cells and / or mesoentodermal cells serve as a source of only a limited number of tissues, they can serve to obtain pure tissues or cell types. In some methods of obtaining preprimary streak cells, the pluripotent cells used as starting material are pluripotent stem cells, for example, hES, hEG, or iPS cells.

Трофоэктодермальные клеткиTrophoectodermal cells

С помощью способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие трофоэктодермальные клетки, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, трофоэктодермальные популяции клеток или культуры клеток, полученные способами, описанными в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 и ERRB генов, по сравнению с уровнями экспрессии HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 и ERRB в не-трофоэктодермальных клетках или популяциях клеток.Using the methods described in this application, you can obtain compositions containing trophoectodermal cells, essentially free of other types of cells. In some embodiments, the implementation described in this application, trophoectodermal cell populations or cell cultures obtained by the methods described in this application, essentially have high expression of markers selected from the group consisting of HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 and ERRB genes, compared to expression levels of HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, and ERRB in non-trophoectodermal cell populations.

Клетки препервичной полоскиPrimary streak cells

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие клетки препервичной полоски, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры клеток препервичной полоски, полученные способами, описанным в настоящей заявке, по существу экспрессируют FGF8 и/или NODAL маркерные гены, по сравнению с BRACHURYlow, FGF4 low, SNAI1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low и SOX1 low.Using the methods described in this application, you can obtain compositions containing cells of the preprimary streak, essentially free of other types of cells. In some embodiments, implementation described in this application, populations or cultures of cells of the preprimary streak obtained by the methods described in this application, essentially express FGF8 and / or NODAL marker genes, compared to BRACHURYlow, FGF4 low, SNAI1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

Экстраэмбриональные клеткиExtraembryonic cells

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие экстраэмбриональные клетки, по существу свободные от других типов клеток. Клетки примитивной, висцеральной и париетальной энтодермы являются экстраэмбриональными клетками. Клетки примитивной энтодермы дают начало клеткам висцеральной и париетальной энтодермы. Клетки висцеральной энтодермы являются энтодермальными клетками, которые образуют часть желточного мешка. Функцией клеток висцеральной энтодермы является захват и транспорт нутриентов. Клетки париетальной энтодермы соприкасаются с экстраэмбриональной тканью, известной как мембрана Рейхерта. Одной из ролей клеток париетальной энтодермы является продукция компонентов базальной мембраны. Вместе клетки висцеральной энтодермы и клетки париетальной энтодермы образуют то, что часто обозначают как экстраэмбриональная энтодерма. Как предполагает наименование, клетки экстраэмбриональной энтодермы не дают начало эмбриональным структурами, образуемым при развитии. Напротив, клетки дефинитивной энтодермы и другие клетки энтодермальных линий или панкреатических линий, описанные в настоящей заявке, являются эмбриональными или полученными из эмбриональных клеток, и дают начало тканям, которые получены из кишечной трубки, образуемой при развитии эмбриона. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры экстраэмбриональных клеток, полученных способами, описанными в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из генов SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, HNF4alpha или AFP, по сравнению с уровнями экспрессии по меньшей мере SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP, которые на экспрессируются в других типах клеток или популяций клеток, например, дефинитивной энтодерме.Using the methods described in this application, you can obtain compositions containing extraembryonic cells, essentially free of other types of cells. The cells of the primitive, visceral and parietal endoderm are extraembryonic cells. The cells of the primitive endoderm give rise to the cells of the visceral and parietal endoderm. Visceral endoderm cells are endodermal cells that form part of the yolk sac. The function of the cells of the visceral endoderm is the capture and transport of nutrients. The cells of the parietal endoderm come in contact with extraembryonic tissue known as Reichert's membrane. One of the roles of parietal endoderm cells is the production of basement membrane components. Together, the cells of the visceral endoderm and the cells of the parietal endoderm form what is often referred to as the extraembryonic endoderm. As the name suggests, extraembryonic endoderm cells do not give rise to the embryonic structures that develop during development. In contrast, the cells of the definitive endoderm and other cells of the endodermal lines or pancreatic lines described in this application are embryonic or derived from embryonic cells, and give rise to tissues that are derived from the intestinal tube formed during the development of the embryo. In some embodiments, implementation described in this application, populations or cultures of extraembryonic cells obtained by methods described in this application, essentially have high expression of markers selected from the group consisting of genes SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, HNF4alpha or AFP, compared to expression levels of at least SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, or AFP that are not expressed in other cell types or cell populations, for example, definitive endoderm.

Мезоэнтодермальные клеткиMesoentodermal cells

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие мезоэнтодермальные клетки, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры мезоэнтодермальных клеток, полученные способами, описанным в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из FGF4, SNAI1 MIXL1 и/или WNT3 маркерных генов, по сравнению с SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low и SOX1 low.Using the methods described in this application, you can obtain compositions containing mesoentodermal cells, essentially free of other types of cells. In some embodiments, the implementation described in this application, the populations or cultures of mesoentodermal cells obtained by the methods described in this application, essentially have high expression of markers selected from the group consisting of FGF4, SNAI1 MIXL1 and / or WNT3 marker genes, compared with SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low and SOX1 low.

Способы скринингаScreening methods

В некоторых вариантах осуществления применяются способы скрининга для получения определенных популяций клеток, включающих плюрипотентные, мультипотентные и/или дифференцированные клетки, такие как плюрипотентные стволовые клетки человека, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки препервичной полоски, мезоэнтодермальные клетки, клетки дефинитивной энтодермы, клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки или панкреатические прогениторные клетки, эндокринные клетки-предшественники, и/или эндокринные клетки. Популяция клеток затем обеспечивается потенциальным фактором дифференцировки. В первый момент времени, который отмечается до или примерно в то же время, что и обеспечение потенциального фактора дифференцировки, определяют экспрессию маркера. Альтернативно, экспрессию маркера можно определить после обеспечения потенциального фактора дифференцировки. Во второй момент времени, который отмечается после первого момента времени и после этапа обеспечения потенциального фактора дифференцировки популяции клеток, вновь определяют экспрессию того же самого маркера. Определяют, способен ли потенциальный фактор дифференцировки к стимуляции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, путем сравнения экспрессии маркера в первый момент времени с экспрессией маркера во второй момент времени. Если экспрессия маркера во второй момент времени повышается или снижается, по сравнению с экспрессией маркера в первый момент времени, то потенциальный фактор дифференцировки способен к стимуляции дифференцировки панкреатических прогениторных клеток.In some embodiments, screening methods are used to obtain specific cell populations, including pluripotent, multipotent and / or differentiated cells, such as human pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells, preprimary streak cells, mesoentodermal cells, definitive endoderm cells, portions of the anterior endoderm digestive tract or PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract, PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, or PDX1-positive pancreatic endodermal cells or pancreatic progenitor cells, endocrine progenitor cells, and / or endocrine cells. The cell population is then provided with a potential differentiation factor. At the first time point, which is observed before or at about the same time as the provision of the potential differentiation factor, the expression of the marker is determined. Alternatively, the expression of the marker can be determined after the provision of the potential differentiation factor. At the second time point, which is noted after the first time point and after the stage of providing a potential differentiation factor of the cell population, the expression of the same marker is again determined. It is determined whether the potential differentiation factor is capable of stimulating the differentiation of pancreatic progenitor cells by comparing the expression of the marker at the first time point with the expression of the marker at the second time point. If the expression of the marker at the second time point increases or decreases, compared to the expression of the marker at the first time point, then the potential differentiation factor is capable of stimulating the differentiation of pancreatic progenitor cells.

Некоторые варианты осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, используют популяции или культуры клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы человека, PDX-1 негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX-1 позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX-1 позитивные панкреатические энтодермальные клетки, или панкреатические прогениторные клетки или эндокринные клетки-предшественники. Например, популяция клеток может быть по существу очищенной популяцией PDX-1 позитивных панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических прогениторных клеток. Например, популяция клеток может быть обогащенной популяцией панкреатических прогениторных клеток человека, где по меньшей мере 50%-97% клеток человека в популяции клеток являются панкреатическими клетками-предшественниками человека, остаток включает эндокринные предшественники или эндокринные клетки и другие типы клеток.Some embodiments of the screening methods described herein use cell populations or cultures containing human definitive endoderm cells, PDX-1 negative anterior endoderm cells, PDX-1 positive anterior endoderm cells, PDX-1 positive pancreatic endodermal cells, or pancreatic progenitor cells or endocrine progenitor cells. For example, the cell population can be a substantially purified population of PDX-1 positive pancreatic endodermal cells or pancreatic progenitor cells. For example, the cell population can be an enriched population of human pancreatic progenitor cells, where at least 50% to 97% of the human cells in the cell population are human pancreatic progenitor cells, the remainder includes endocrine progenitors or endocrine cells and other cell types.

В вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, популяция клеток контактирует или иным образом обеспечена потенциальным (тестируемым) фактором дифференцировки. Потенциальный фактор дифференцировки может содержать любую молекулу, которая может обладать потенциалом стимуляции дифференцировки любой из вышеупомянутых клеток, например, панкреатических клеток-предшественников человека. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая известна как фактор дифференцировки для одного или нескольких типов клеток. В альтернативных вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая неизвестна как стимулятор дифференцировки клеток. В предпочтительных вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая неизвестна как стимулятор дифференцировки панкреатических клеток-предшаственников человека.In embodiments of the screening methods described herein, the cell population is contacted or otherwise provided with a potential (testable) differentiation factor. The potential differentiation factor can contain any molecule that can have the potential to stimulate the differentiation of any of the aforementioned cells, for example, human pancreatic progenitor cells. In some embodiments, the implementation described in this application, the potential differentiation factor includes a molecule that is known as a differentiation factor for one or more cell types. In alternative embodiments, the potential differentiation factor comprises a molecule that is not known to stimulate cell differentiation. In preferred embodiments, the potential differentiation factor comprises a molecule that is not known to stimulate the differentiation of human pancreatic progenitor cells.

В некоторый вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки включает малую молекулу. В предпочтительных вариантах осуществления малая молекула является молекулой, имеющей молекулярную массу примерно 10,000 а.е.м. или меньше.In some embodiments of the screening methods described herein, the potential differentiation factor comprises a small molecule. In preferred embodiments, the small molecule is a molecule having a molecular weight of about 10,000 amu. or less.

В других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки содержит большую молекулу, например, полипептид. Полипептид может быть любым полипептидом, включая гликопротеин, липопротеин, белок экстрацеллюлярного матрикса, цитокин, хемокин, пептидный гормон, интерлейкин или фактор роста, но не ограничиваясь ими. Предпочтительные полипептиды включают факторы роста.In other embodiments, the implementation described in this application, the potential differentiation factor contains a large molecule, for example, a polypeptide. The polypeptide can be any polypeptide, including, but not limited to, a glycoprotein, lipoprotein, extracellular matrix protein, cytokine, chemokine, peptide hormone, interleukin, or growth factor. Preferred polypeptides include growth factors.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальные факторы дифференцировки включают один или несколько факторов роста, выбранных из группы, состоящей из амфирегулина, стимулятора В-лимфоцитов, ИЛ-16, тимопоэтина, TRAIL/Apo-2, пре-В-клеточного колониестимулирующего фактора, фактора, связанного с дифференцировкой эндотелия 1 (EDF1), эндотелиального моноцит-активирующего полипептида II; фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF); фактора, усиливающего естественные киллерные клетки (NKEFA); костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 8 (остеогенного белка 2), костного морфогенетического белка 6, костного морфогенетического белка 7, фактора роста соединительной ткани (CTGF), CGI-149 белка (нейроэндокринного фактора дифференцировки), цитокина A3 (макрофагального воспалительного белка 1-альфа); белка, связанного с дифференцировкой клеток глиобластомы (GBDR1), фактора роста из гепатомы, предшественника нейромедина U-25, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста эндотелия сосудов В (VEGF-B), Т-клеточно-специфического предшественника RANTES; фактора, полученного из дендритных клеток тимуса-1; трансферрина, интерлейкина-1 (IL 1), интерлейкина-2 (IL 2), интерлейкина-3 (IL 3), интерлейкина-4 (IL 4), интерлейкина-5 (IL 5), интерлейкина-6 (IL 6), интерлейкина-7 (IL 7), интерлейкина-8 (IL 8), интерлейкина-9 (IL 9), интерлейкина-10 (IL 10), интерлейкина-11 (IL 11), интерлейкина-12 (EL 12), интерлейкина-13 (EL 13), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), эритропоэтина, тромбопоэтина, витамина D3, эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора головного мозга; фактора, ингибирующего лейкемию; тиреоидного гормона, основного фактора роста фибробластов (bFGF), aFGF, FGF-4, FGF-6, FGF-7/фактора роста кератиноцитов (KGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), тромбоцитарного фактора роста-ВВ, β-фактора роста нервов, активина А, трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1), интерферона-α, интерферона-β, интерферона-γ, фактора некроза опухоли-α, фактора некроза опухоли-β, бурст-промоторной активности (BPA), эритроидной промоторной активности (ЕРА), PGE2, инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), IGF-II, фактора роста нервов (NGF), нейтрофина-3, нейтрофина 4/5, цилиарного нейротрофического фактора, глиального нексина, дексаметазона, β-меркаптоэтанола, ретиноевой кислоты, бутилированного гидроксианизола, 5-азацитидина, амфотерицина В, аскорбиновой кислоты, аскорбата, изобутилксантина, индометацина, β-глицерофосфата, никотинамида, ДМСО, тиазолидиндионов, TWS119, окситоцина, вазопрессина, меланоцитостимулирующего гормона, кортикотропина, липотропина, тиротропина, гормона роста, пролактина, лютеинизирующего гормона, хорионического гонадотропина человека, фолликулостимулирующего гормона, кортиколиберина, гонадолиберина, пролактолиберина, пролактин-ингибирующего фактора, соматолиберина, соматостатина, тиреолиберина; пептида, кодируемого геном кальцитонина; паратиреоидного гормона, глюкагоноподобного пептида-1, глюкозозависимого инсулинстропного пептида, гастрина, секретина, холецистокинина, мотилина, вазоактивного интестинального пептида, субстанции Р, панкреатического полипептида, пептида тирозин-тирозин, нейропептида тирозина, инсулина, глюкагона. плацентарного лактогена, релаксина, ангиотензина II, кальцитриола, предсердного натрийуретического пептида, и мелатонина, тироксина, трийодтиронина, кальцитонина, эстрадиола, эстрона, прогестерона, тестостерона, кортизола, кортикостерона, альдостерона, эпинефрина, норэпинефрина, андростена, кальцитриола, коллагена, дексаметазона, β-меркаптоэтанола, ретиноевой кислоты, бутилированного гидроксианизола, 5-азацитидина, амфотерицина В, аскорбиновой кислоты, аскорбата, изобутилксантина, индометацина, β-глицерофосфата, никотинамида, ДМСО, тиазолидиндионов, и TWS119.In some embodiments of the screening methods described herein, the potential differentiation factors include one or more growth factors selected from the group consisting of amphiregulin, a B-lymphocyte stimulant, IL-16, thymopoietin, TRAIL / Apo-2, pre-B -cellular colony-stimulating factor, endothelial differentiation factor 1 (EDF1), endothelial monocyte-activating polypeptide II; a factor that inhibits the migration of macrophages (MIF); natural killer cell enhancing factor (NKEFA); bone morphogenetic protein 2, bone morphogenetic protein 8 (osteogenic protein 2), bone morphogenetic protein 6, bone morphogenetic protein 7, connective tissue growth factor (CTGF), CGI-149 protein (neuroendocrine differentiation factor), cytokine A3 (macrophage inflammatory protein 1 -alpha); protein associated with differentiation of glioblastoma cells (GBDR1), growth factor from hepatoma, neuromedin U-25 precursor, vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor B (VEGF-B), T-cell-specific precursor RANTES; factor derived from thymus dendritic cells-1; transferrin, interleukin-1 (IL 1), interleukin-2 (IL 2), interleukin-3 (IL 3), interleukin-4 (IL 4), interleukin-5 (IL 5), interleukin-6 (IL 6), interleukin-7 (IL 7), interleukin-8 (IL 8), interleukin-9 (IL 9), interleukin-10 (IL 10), interleukin-11 (IL 11), interleukin-12 (EL 12), interleukin- 13 (EL 13), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, thrombopoietin, vitamin D3, epidermal growth factor (EGF), head neurotic brain; a factor that inhibits leukemia; thyroid hormone, basic fibroblast growth factor (bFGF), aFGF, FGF-4, FGF-6, FGF-7 / keratinocyte growth factor (KGF), platelet-derived growth factor (PDGF), platelet-derived growth factor-BB, β-nerve growth factor , activin A, transforming growth factor β1 (TGFβ1), interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tumor necrosis factor-α, tumor necrosis factor-β, burst promoter activity (BPA), erythroid promoter activity (EPA) , PGE2, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), IGF-II, nerve growth factor (NGF), neutrophin-3, neutrophin 4/5, ciliary neurotrophic factor, glial nexin, dexamethasone, β-mercaptoethanol, retinoic acid, butylated hydroxyanisole, 5-azacytidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, isobutylxanthine, indomethacin, β-glycerophosphate, nicotinamide, DMSO, thiazolidinediones, TWS119, oxytocin, vasopressin, prolactin-tropin, corticosteroid ina, luteinizing hormone, human chorionic gonadotropin, follicle-stimulating hormone, corticoliberin, gonadoliberin, prolactoliberin, prolactin-inhibiting factor, somatoliberin, somatostatin, thyreoliberin; a peptide encoded by the calcitonin gene; parathyroid hormone, glucagon-like peptide-1, glucose-dependent insulinstropic peptide, gastrin, secretin, cholecystokinin, motilin, vasoactive intestinal peptide, substance P, pancreatic polypeptide, tyrosine-tyrosine peptide, insulinuculin placental lactogen, relaxin, angiotensin II, calcitriol, atrial natriuretic peptide, and melatonin, thyroxine, triiodothyronine, calcitonin, estradiol, estrone, progesterone, testosterone, cortisol, corticosterone, aldrinosterone, norepinephrine, colicosterone, β-aldrinosterone, epinephinephacyne -mercaptoethanol, retinoic acid, butylated hydroxyanisole, 5-azacytidine, amphotericin B, ascorbic acid, ascorbate, isobutylxanthine, indomethacin, β-glycerophosphate, nicotinamide, DMSO, thiazolidinediones, and TWS119.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки обеспечивается для популяции клеток в одной или нескольких концентрациях. В некоторых вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки обеспечивается для популяции клеток так, чтобы концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, была в диапазоне примерно от 0,1 нг/мл до 10 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 1 нг/мл до 1 мг/мл. В других вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 10 нг/мл до 100 мкг/мл. В других вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 100 нг/мл до 10 мкг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 5 нг/мл до 1000 мкг/мл.In some embodiments of the screening methods described herein, a potential differentiation factor is provided to a population of cells at one or more concentrations. In some embodiments, the implementation of the potential differentiation factor is provided to the population of cells such that the concentration of the potential differentiation factor in the environment of the cells is in the range from about 0.1 ng / ml to 10 mg / ml. In some embodiments, the concentration of the potential differentiation factor in the environment surrounding the cells ranges from about 1 ng / ml to 1 mg / ml. In other embodiments, the concentration of the potential differentiation factor in the environment surrounding the cells ranges from about 10 ng / ml to 100 μg / ml. In other embodiments, the concentration of the potential differentiation factor in the environment surrounding the cells ranges from about 100 ng / ml to 10 μg / ml. In preferred embodiments, the concentration of the potential differentiation factor in the environment surrounding the cells ranges from about 5 ng / ml to 1000 μg / ml.

В некоторых вариантах осуществления этапы способов скрининга, описанных в настоящей заявке, включают определение экспрессии по меньшей мере одного маркера в первый момент времени и второй момент времени. В некоторых из этих вариантов осуществления первый момент времени может быть до или примерно в то же самое время, что и обеспечение популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления первый момент времени отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления экспрессию множества маркеров определяют в первый момент времени.In some embodiments, the steps of the screening methods described herein include determining the expression of at least one marker at a first time point and a second time point. In some of these embodiments, the first point in time may be before or about the same time as the provision of the cell population with a potential differentiation factor. Alternatively, in some embodiments, the first point in time is observed after the potential differentiation factor has been provided to the cell population. In some embodiments, the expression of multiple markers is determined at a first point in time.

В дополнение к определению экспрессии по меньшей мере одного маркера в первый момент времени, некоторые варианты осуществления способов скрининга, обеспеченные в настоящей заявке, подразумевают определение экспрессии по меньшей мере одного маркера во второй момент времени, после второго момента времени, и который отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В таких вариантах осуществления экспрессию того же самого маркера определяют и в первый, и во второй момент времени. В некоторых вариантах осуществления экспрессию множества маркеров определяют и в первый, и во второй момент времени. В таких вариантах осуществления экспрессию одного и того же множества маркеров и в первый, и во второй момент времени. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют во множестве моментов времени, каждый из которых отмечается после первого момента времени, и каждый из которых отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют путем Q-PCR. В других вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют с помощью иммунохимии.In addition to determining the expression of at least one marker at a first time point, some embodiments of the screening methods provided herein involve determining the expression of at least one marker at a second time point, after a second time point, and which is noted after providing a population cells as a potential differentiation factor. In such embodiments, the expression of the same marker is determined at both the first and second time points. In some embodiments, the expression of multiple markers is determined at both the first and second time points. In such embodiments, the expression of the same plurality of markers at both the first and second time points. In some embodiments, the expression of markers is determined at a plurality of points in time, each of which is marked after the first point in time, and each of which is marked after providing the population of cells with a potential differentiation factor. In some embodiments, the expression of markers is determined by Q-PCR. In other embodiments, the expression of markers is determined using immunochemistry.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, маркер, чью экспрессию определяют в первый и второй моменты времени, является маркером, связанным с дифференцировкой панкреатических прогениторных клеток в клетки, являющиеся предшественниками окончательно дифференцированных клеток, которые образуют ткани панкреатических островков. Такие клетки могут включать незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков.In some embodiments of the screening methods described herein, the marker whose expression is determined at the first and second time points is a marker associated with the differentiation of pancreatic progenitor cells into cells that are precursors of definitively differentiated cells that form pancreatic islet tissues. Such cells can include immature hormone-expressing cells of the pancreatic islets.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, обеспеченных в настоящей заявке, обеспечивается достаточное время между обеспечением популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки и определением экспрессии маркера во второй момент времени. Достаточное время между обеспечением популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки и определением экспрессии маркера во второй момент времени может составлять от всего лишь примерно 1 час вплоть до примерно 10 дней. В некоторых вариантах осуществления экспрессию по меньшей мере одного маркера определяют много раз после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления достаточное время составляет по меньшей мере примерно 1 час, по меньшей мере примерно 6 часов, по меньшей мере примерно 12 часов, по меньшей мере примерно 16 часов, по меньшей мере примерно 1 сутки, по меньшей мере примерно 2 суток, по меньшей мере примерно 3 суток, по меньшей мере примерно 4 суток, по меньшей мере примерно 5 суток, по меньшей мере примерно 6 суток, по меньшей мере примерно 7 суток, по меньшей мере примерно 8 суток, по меньшей мере примерно 9 суток, по меньшей мере примерно 10 суток, по меньшей мере примерно 11 суток, по меньшей мере примерно 12 суток, по меньшей мере примерно 13 суток, по меньшей мере примерно 14 суток, по меньшей мере примерно 1 неделю, по меньшей мере примерно 2 недели, по меньшей мере примерно 3 недели, по меньшей мере примерно 4 недели, по меньшей мере примерно 5 недель, по меньшей мере примерно 6 недель, по меньшей мере примерно 7 недель, или по меньшей мере примерно 8 недель.In some embodiments of the screening methods provided herein, sufficient time is provided between providing the cell population with a potential differentiation factor and determining the expression of the marker at a second time point. The sufficient time between providing the cell population with a potential differentiation factor and determining the expression of the marker at the second time point can range from as little as about 1 hour up to about 10 days. In some embodiments, the expression of at least one marker is determined multiple times after providing the cell population with a potential differentiation factor. In some embodiments, a sufficient time is at least about 1 hour, at least about 6 hours, at least about 12 hours, at least about 16 hours, at least about 1 day, at least about 2 days, at least about 3 days, at least about 4 days, at least about 5 days, at least about 6 days, at least about 7 days, at least about 8 days, at least about 9 days, at least at least about 10 days, at least about 11 days, at least about 12 days, at least about 13 days, at least about 14 days, at least about 1 week, at least about 2 weeks, at least about 3 weeks, at least about 4 weeks, at least about 5 weeks, at least about 6 weeks, at least about 7 weeks, or at least about 8 weeks.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящей заявке, дополнительно определяют, повышается или снижается ли экспрессия маркера во второй момент времени по сравнению с экспрессией этого маркера в первый момент времени. Повышение или снижение экспрессии по меньшей мере одного маркера указывает, что потенциальный фактор дифференцировки способен к стимуляции дифференцировки эндокринных клеток-предшественников. Подобным образом, если определяют экспрессию множества маркеров, дополнительно определяют, повышается или снижается ли экспрессия множества маркеров во второй момент времени по сравнению с экспрессией этого множества маркеров в первый момент времени. Повышение или снижение множества маркеров можно определить путем измерения или иной оценки количества, уровня или активности маркера в популяции клеток в первый и второй моменты времени. Такое определение может быть относительным по другим маркерам, например, экспрессии конститутивных генов, или абсолютным. В некоторых вариантах осуществления, где экспрессия маркера повышается во второй момент времени, по сравнению с первым моментом времени, повышение является по меньшей мере примерно 2-кратным, по меньшей мере примерно 5-кратным, по меньшей мере примерно 10-кратным, по меньшей мере примерно 20-кратным, по меньшей мере примерно 30-кратным, по меньшей мере примерно 40-кратным, по меньшей мере примерно 50-кратным, по меньшей мере примерно 60-кратным, по меньшей мере примерно 70-кратным, по меньшей мере примерно 80-кратным, по меньшей мере примерно 90-кратным, по меньшей мере примерно 100-кратным, или более чем по меньшей мере примерно 100-кратным. В некоторых вариантах осуществления повышение является менее чем 2-кратным. В вариантах осуществления, где экспрессия маркеров снижается во второй момент времени, по сравнению с первым моментом времени, снижение является по меньшей мере примерно 2-кратным, по меньшей мере примерно 5-кратным, по меньшей мере примерно 10-кратным, по меньшей мере примерно 20-кратным, по меньшей мере примерно 30-кратным, по меньшей мере примерно 40-кратным, по меньшей мере примерно 50-кратным, по меньшей мере примерно 60-кратным, по меньшей мере примерно 70-кратным, по меньшей мере примерно 80-кратным, по меньшей мере примерно 90-кратным, по меньшей мере примерно 100-кратным, или более чем по меньшей мере примерно 100-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение является менее чем 2-кратным.In some embodiments of the methods described herein, it is further determined whether the expression of the marker at the second time point is increased or decreased compared to the expression of the marker at the first time point. An increase or decrease in the expression of at least one marker indicates that the potential differentiation factor is capable of stimulating the differentiation of endocrine progenitor cells. Likewise, if the expression of a plurality of markers is determined, it is further determined whether the expression of the plurality of markers is increased or decreased at the second time point compared to the expression of the plurality of markers at the first time point. An increase or decrease in a plurality of markers can be determined by measuring or otherwise assessing the amount, level, or activity of the marker in the cell population at the first and second time points. Such a definition can be relative for other markers, for example, expression of constitutive genes, or absolute. In some embodiments, implementation, where the expression of the marker is increased at the second time point, compared with the first time point, the increase is at least about 2-fold, at least about 5-fold, at least about 10-fold, at least about 20-fold, at least about 30-fold, at least about 40-fold, at least about 50-fold, at least about 60-fold, at least about 70-fold, at least about 80 -fold, at least about 90-fold, at least about 100-fold, or more than at least about 100-fold. In some embodiments, the increase is less than 2-fold. In embodiments where the expression of markers is reduced at the second time point, compared to the first time point, the decrease is at least about 2-fold, at least about 5-fold, at least about 10-fold, at least about 20-fold, at least about 30-fold, at least about 40-fold, at least about 50-fold, at least about 60-fold, at least about 70-fold, at least about 80-fold multiple, at least about 90-fold, at least about 100-fold, or more than at least about 100-fold. In some embodiments, the reduction is less than 2-fold.

Мониторинг получения мультипотентных или дифференцированных клетокMonitoring the production of multipotent or differentiated cells

Развитие плюрипотентных клеток в мультипотентные клетки, другие мультипотентные клетки или дифференцированные клетки, такие как панкреатические прогениторы или эндокринные гормон-секретирующие клетки, можно контролировать путем определения экспрессии маркеров, характерных для специфических клеток, включая генетические маркеры и фенотипические маркеры, такой как экспрессия островковых гормонов и процессинг проинсулина в инсулин и С-пептид в эндокринных клетках. В некоторых способах экспрессию некоторых маркеров определяют путем детекции присутствия и отсутствия маркера. Альтернативно, экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, в котором маркер присутствует в клетках или культуре клеток или популяции клеток. Например, в некоторых способах определяют экспрессию маркеров, характерных для незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, а также отсутствие существенной экспрессии маркеров, характерных для плюрипотентных клеток, клеток дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, эндокринных предшественников, клеток экстраэмбриональной энтодермы, мезодермы, эктодермы, зрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков и/или других типов клеток.The development of pluripotent cells into multipotent cells, other multipotent cells, or differentiated cells such as pancreatic progenitors or endocrine hormone-secreting cells can be monitored by determining the expression of markers characteristic of specific cells, including genetic markers and phenotypic markers such as islet hormone expression and processing of proinsulin into insulin and C-peptide in endocrine cells. In some methods, the expression of some markers is determined by detecting the presence and absence of the marker. Alternatively, the expression of some markers can be determined by measuring the level at which the marker is present in cells or cell culture or cell population. For example, some methods determine the expression of markers characteristic of immature hormone-expressing cells of pancreatic islets, as well as the absence of significant expression of markers characteristic of pluripotent cells, cells of definitive endoderm, endoderm of the anterior part of the digestive tract, PDX1-positive endoderm of the anterior part of the digestive tract, endocrine progenitors, cells of extraembryonic endoderm, mesoderm, ectoderm, mature hormone-expressing cells of pancreatic islets and / or other cell types.

Как описано в связи с мониторингом получения других менее дифференцированных типов клеток линии дефинитивной энтодермы, можно применять качественные или полуколичественные методики, такие как способы блоттинга и иммунохимии, для измерения экспрессии маркера. Альтернативно, можно провести точное количественное определение экспрессии маркера с помощью такой методики, как Q-PCR. Кроме того, необходимо понимать, что на полипептидном уровне многие из маркеров гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков секретируют белки. Таким образом, можно применять методики для измерения содержания экстрацеллюлярного маркера, такие как ИФА.As described in connection with monitoring the production of other less differentiated cell types of the definitive endoderm lineage, qualitative or semi-quantitative techniques, such as blotting and immunochemistry techniques, can be used to measure marker expression. Alternatively, you can accurately quantify the expression of the marker using techniques such as Q-PCR. In addition, it should be understood that at the polypeptide level, many of the hormone-expressing pancreatic islet cell markers secrete proteins. Thus, it is possible to apply techniques for measuring the content of an extracellular marker, such as ELISA.

Например, в одном варианте осуществления PDX1 является маркерным геном, ассоциированным с PDX1-позитивной энтодермой передней части пищеварительного тракта. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определяют экспрессию PDX1. В других вариантах осуществления также определяют экспрессию других маркеров, которые экспрессируются в PDX1-позитивной энтодерме передней части пищеварительного тракта, включая SOX17, HNF6, SOX9 и PROX1, но не ограничиваясь ими. Поскольку PDX1 может также экспрессироваться некоторыми другими типами клеток (т.е. висцеральной энтодермой и определенной нейральной эктодермой), некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к демонстрации отсутствия или по существу отсутствия экспрессии маркерного гена, связанного с висцеральной энтодермой и/или нейральной эктодермой. Например, в некоторых вариантах осуществления определяют экспрессию маркеров, которые экспрессируются клетками висцеральной энтодермы и/или нервными клетками, включая SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 и/или NFM, но не ограничиваясь ими.For example, in one embodiment, PDX1 is a marker gene associated with a PDX1-positive endoderm of the anterior gastrointestinal tract. Thus, in some embodiments, PDX1 expression is determined. In other embodiments, the implementation also determines the expression of other markers that are expressed in the PDX1-positive endoderm of the anterior digestive tract, including, but not limited to SOX17, HNF6, SOX9 and PROX1. Since PDX1 can also be expressed by certain other cell types (i.e., visceral endoderm and certain neural ectoderm), some embodiments of the present invention relate to demonstrating the absence or substantial absence of expression of a marker gene associated with visceral endoderm and / or neural ectoderm. For example, in some embodiments, the expression of markers that are expressed by visceral endoderm cells and / or neural cells, including but not limited to SOX7, AFP, SOX1, ZIC1, and / or NFM, is determined.

В некоторых вариантах осуществления культуры PDX1-позитивных клеток передней части пищеварительного тракта, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, экспрессирующих SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 или NFM маркерные гены. В некоторых вариантах осуществления культуры PDX1-позитивных клеток передней части пищеварительного тракта, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток висцеральной энтодермы, париетальной энтодермы и/или нервных клеток.In some embodiments, PDX1-positive cell cultures of the anterior digestive tract obtained by the methods described herein are substantially free of cells expressing SOX7, AFP, SOX1, ZIC1, or NFM marker genes. In some embodiments, the anterior GI tract PDX1-positive cell cultures obtained by the methods described herein are substantially free of visceral endoderm, parietal endoderm, and / or nerve cells.

Прогрессирование развития плюрипотентных клеток, описанных в настоящей заявке (например, клеток, полученных в результате стадий или этапов 1-5, как описано в

et al. 2006, выше), можно контролировать путем определения экспрессии маркеров, характерных для каждого из типов клеток, полученных из hES или iPS клеток по отдельности на пути развития. В некоторых способах идентификацию и характеристику типа клеток, полученных из hES или iPS клеток, осуществляют по экспрессии определенного маркера или различных уровней и характеров экспрессии более чем одного маркера. Таким образом, наличие или отсутствие, высокая или низкая экспрессия одного или нескольких маркеров определяет и идентифицирует тип клеток. Также некоторые маркеры могут иметь временную экспрессию, где маркер высоко экспрессируется на одной стадии развития, и плохо экспрессируется на другой стадии развития. Экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, на котором маркер присутствует в клетках из культуры клеток или популяции клеток, по сравнению со стандартизованным или нормализованным контрольным маркером. В таких способах измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Один способ количественного определения экспрессии маркеров, продуцируемых маркерными генами, осуществляют путем применения количественной ПЦР (Q-PCR). Способы осуществления Q-PCR хорошо известны в данной области техники.The progression of development of pluripotent cells described in this application (e.g., cells obtained from stages or steps 1-5, as described in

et al. 2006, supra), can be monitored by determining the expression of markers characteristic of each of the cell types derived from hES or iPS cells separately along the developmental pathway. In some methods, identification and characterization of the type of cells derived from hES or iPS cells is performed by the expression of a specific marker or different levels and patterns of expression of more than one marker. Thus, the presence or absence, high or low expression of one or more markers determines and identifies the cell type. Also, some markers may have transient expression, where the marker is highly expressed at one developmental stage, and poorly expressed at another stage of development. The expression of certain markers can be determined by measuring the level at which the marker is present in cells from a cell culture or cell population, compared to a standardized or normalized control marker. In such methods, the measurement of the expression of the marker can be qualitative or quantitative. One method for quantifying the expression of markers produced by marker genes is by using quantitative PCR (Q-PCR). Methods for performing Q-PCR are well known in the art.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наличие, отсутствие и/или уровень экспрессии маркера определяют путем количественной ПЦР (Q-PCR). Например, количество транскрипта, продуцируемого некоторыми генетическими маркерами, такими как SOX17, CXCR4, ОСТ4, AFP, ТМ, SPARC, SOX7, CDX2, MIXL1, GATA4, HNF3β, HNF4alpha, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1 и другими маркерами, описанными в настоящей заявке, определяют путем количественной Q-PCR.In some embodiments, implementation of the present invention, the presence, absence and / or level of expression of the marker is determined by quantitative PCR (Q-PCR). For example, the amount of transcript produced by some genetic markers such as SOX17, CXCR4, OCT4, AFP, TM, SPARC, SOX7, CDX2, MIXL1, GATA4, HNF3β, HNF4alpha, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMIP1, and other markers described in this application are determined by quantitative Q-PCR.

В других вариантах осуществления иммунохимию применяют для детекции белков, экспрессируемых вышеупомянутыми генами. В других вариантах осуществления Q-PCR может применяться в сочетании с иммуногистохимическими методиками или методиками проточной цитометрии для эффективной и точной характеристики и идентификации количества и относительных пропорций таких маркеров в исследуемого типа клеток. В одном варианте осуществления Q-PCR позволяет количественно определить уровень экспрессии РНК в культуре клеток, содержащей смешанную популяцию клеток. Однако Q-PCR не позволяет предположить или оценить, имеется ли совместная экспрессия маркеров или белков в одной и той же клетке. В другом варианте осуществления Q-PCR применяют в сочетании со способами проточной цитометрии для характеристики и идентификации типов клеток. Таким образом, с применением комбинации способов, описанных в настоящей заявке, и таких как те, которые описаны выше, можно осуществить и продемонстрировать полную характеристику и идентификацию различных типов клеток, включая типы клеток энтодермальной линии.In other embodiments, immunochemistry is used to detect proteins expressed by the aforementioned genes. In other embodiments, Q-PCR can be used in conjunction with immunohistochemical or flow cytometric techniques to efficiently and accurately characterize and identify the amount and relative proportions of such markers in a cell type of interest. In one embodiment, Q-PCR can quantify the level of RNA expression in a cell culture containing a mixed population of cells. However, Q-PCR does not suggest or assess whether there is co-expression of markers or proteins in the same cell. In another embodiment, Q-PCR is used in combination with flow cytometry techniques to characterize and identify cell types. Thus, using a combination of the methods described herein and such as those described above, complete characterization and identification of various cell types, including endodermal lineage cell types, can be accomplished and demonstrated.

Например, в одном предпочтительном варианте осуществления панкреатические прогениторы или клетки панкреатической энтодермы или PDX-1-позитивные клетки панкреатической энтодермы, экспрессирующие по меньшей мере PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA и/или cMYC, как показано Q-PCR и/или ICC, по меньшей мере совместно экспрессирующие PDX1 и Nkx6.1 как показано ICC, и не экспрессирующие другие маркеры, включая SOX17, CXCR4 или CER, идентифицируются как PDX1-позитивные экспрессирующие клетки. Подобным образом, для надлежащей идентификации зрелых гормон-секретирующих панкреатических клеток, in vitro или in vivo, например, показано, что С-пептид (продукт надлежащего процессинга проинсулина в зрелой и функционирующей р" клетке) и инсулин совместно экспрессируются, посредством ICC, в инсулин-секретирующей клетке.For example, in one preferred embodiment, pancreatic progenitors or pancreatic endoderm cells or PDX-1-positive pancreatic endoderm cells expressing at least PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA and / or cMYC as shown by Q-PCR and / or ICC at least co-expressing PDX1 and Nkx6.1 as shown by ICC, and not expressing other markers, including SOX17, CXCR4, or CER, are identified as PDX1 positive expressing cells. Likewise, for the proper identification of mature hormone-secreting pancreatic cells, in vitro or in vivo, for example, it has been shown that C-peptide (a product of the proper processing of proinsulin in a mature and functioning p "cell) and insulin are co-expressed, by ICC, into insulin -secretory cell.

Другие способы, известные в данной области техники, можно также применять для количественного определения экспрессии маркерного гена. Например, можно выявить экспрессию продукта маркерного гена с применением антител, специфичных для интересующего продукта маркерного гена (например, посредством вестерн-блоттинга, проточной цитометрии, и тому подобного). В некоторых способах определяют экспрессию маркерных генов, характерных для клеток, полученных из hES, а также отсутствие существенной экспрессии маркерных генов, характерных для клеток, полученных из hES. Другие способы характеристики и идентификации типов клеток, полученных из hES, описаны в родственных заявках, как указано выше, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Other methods known in the art can also be used to quantify the expression of a marker gene. For example, expression of a marker gene product can be detected using antibodies specific for the marker gene product of interest (eg, by Western blotting, flow cytometry, and the like). Some methods determine the expression of marker genes characteristic of cells derived from hES, as well as the absence of significant expression of marker genes characteristic of cells derived from hES. Other methods for characterizing and identifying cell types derived from hES are described in related applications as set forth above, which are fully incorporated herein by reference.

Комбинации зонда/праймера для амплификации, пригодные для применения в амплификационных тестах, включают следующее: инсулин (INS) (GenBank NM_000207): праймеры

(SEQ ID №: 1);

(SEQ ID NO: 2); Nkx6.1 (NM_006168): праймеры

(SEQ ID №: 3);

(SEQ ID №: 4); Pdx1 (NM_000209): праймеры

(SEQ ID NO: 5);

(SEQ ID №: 6); Ngn3 (NM_020999): праймеры

(SEQ ID №: 7);

(SEQ ID №: 8); FOXA2 (HNF3B) (NM_021784): праймеры

(SEQ ID №: 9);

(SEQ ID №: 10); глюкагон (GCG) (NM_002054): праймеры

(SEQ ID №: 11);

(SEQ ID №: 12); HNF6 (NM_030712): праймеры

(SEQ ID №: 13);

(SEQ ID №: 14); HNF4Alpha (NM_000457): праймеры

(SEQ ID №: 15);

(SEQ ID №: 16); Sox17 (NM_022454): праймеры

(SEQ ID №: 17);

(SEQ ID №: 18); HLxB9 (NM_005515): праймеры

(SEQ ID №: 19);

(SEQ ID №: 20); Nkx2.2 (NM_002509): праймеры

(SEQ ID №: 21);

(SEQ ID №; 22); PTF1a (NM_178161): праймеры

(SEQ ID №: 23)

(SEQ ID №: 24); SST (NM_001048): праймеры

(SEQ ID №: 25);

(SEQ ID №: 26); PAX6 (NM_000280): праймеры

(SEQ ID №: 27);

(SEQ ID №: 28); Oct4 праймеры:

(SEQ ID №: 29)

(SEQ ID №: 30); MIXL1 праймеры

(SEQ ID №: 31)

(SEQ ID №: 32); GATA4 праймеры

(SEQ ID №: 33)

(SEQ ID №: 34); GSC праймеры

(SEQ ID №: 35)

(SEQ ID №: 36); CER праймеры

(SEQ ID №: 37)

(SEQ ID №: 38); AFP праймеры

(SEQ ID №: 39)

(SEQ ID №: 40); SOX1 праймеры

(SEQ ID №: 41)

(SEQ ID №: 42); ZIC1 праймеры

(SEQ ID №: 43)

(SEQ ID №: 44); NFM праймеры

(SEQ ID №: 45)

(SEQ ID №: 46). Другие праймеры доступны через ABI Taqman, включая FGF17 (Hs00182599_ml), VWF (Hs00169795_m1), CMKOR1 (Hs00604567_m1), CRIP1 (Hs00832816_g1), FOXQ1 (Hs00536425_s1), CALCR (Hs00156229_m1) и CHGA (Hs00154441_m1).Amplification probe / primer combinations suitable for use in amplification tests include the following: insulin (INS) (GenBank NM_000207): primers

(SEQ ID no: 1);

(SEQ ID NO: 2); Nkx6.1 (NM_006168): primers

(SEQ ID no: 3);

(SEQ ID no: 4); Pdx1 (NM_000209): primers

(SEQ ID NO: 5);

(SEQ ID no: 6); Ngn3 (NM_020999): primers

(SEQ ID no: 7);

(SEQ ID no: 8); FOXA2 (HNF3B) (NM_021784): primers

(SEQ ID no: 9);

(SEQ ID no: 10); glucagon (GCG) (NM_002054): primers

(SEQ ID no: 11);

(SEQ ID no: 12); HNF6 (NM_030712): primers

(SEQ ID no: 13);

(SEQ ID no: 14); HNF4Alpha (NM_000457): primers

(SEQ ID no: 15);

(SEQ ID no: 16); Sox17 (NM_022454): primers

(SEQ ID no: 17);

(SEQ ID no: 18); HLxB9 (NM_005515): primers

(SEQ ID no: 19);

(SEQ ID no: 20); Nkx2.2 (NM_002509): primers

(SEQ ID no: 21);

(SEQ ID NO; 22); PTF1a (NM_178161): primers

(SEQ ID no: 23)

(SEQ ID no: 24); SST (NM_001048): primers

(SEQ ID no: 25);

(SEQ ID no: 26); PAX6 (NM_000280): primers

(SEQ ID no: 27);

(SEQ ID no: 28); Oct4 primers:

(SEQ ID no: 29)

(SEQ ID no: 30); MIXL1 primers

(SEQ ID no: 31)

(SEQ ID no: 32); GATA4 primers

(SEQ ID no: 33)

(SEQ ID no: 34); GSC primers

(SEQ ID no: 35)

(SEQ ID no: 36); CER primers

(SEQ ID no: 37)

(SEQ ID no: 38); AFP primers

(SEQ ID no: 39)

(SEQ ID no: 40); SOX1 primers

(SEQ ID no: 41)

(SEQ ID no: 42); ZIC1 primers

(SEQ ID no: 43)

(SEQ ID no: 44); NFM primers

(SEQ ID no: 45)

(SEQ ID no: 46). Other primers are available through ABI Taqman, including FGF17 (Hs00182599_ml), VWF (Hs00169795_m1), CMKOR1 (Hs00604567_m1), CRIP1 (Hs00832816_g1), FOXQ1 (Hs00536425_s1), CAL156CR9

Обобщение получения PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (Стадии 1-4) и получения инсулина in vivoGeneralization of PDX1-positive pancreatic endoderm production (Stages 1-4) and in vivo insulin production

Способы получения определенных клеток энтодермальной линии и панкреатической энтодермальной линии обеспечены в настоящей заявке, и обсуждаются далее в других родственных заявках, таких как заявка США №11/773,944, озаглавленная «Способы получения панкреатических гормонов», поданная 5 июля 2007, которая является частичным продолжением патентной заявки США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марта 2007; которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.Methods for producing certain cells of the endodermal lineage and pancreatic endodermal lineage are provided herein and are discussed further in other related applications such as US Application No. 11 / 773,944, entitled "Methods for Preparing Pancreatic Hormones," filed July 5, 2007, which is a partial continuation of the patent US Application No. 11 / 681,687, entitled "Endocrine Progenitor Cells, Pancreatic Hormone Expressing Cells and Methods for Making Them", filed March 2, 2007; which are fully incorporated into the present description by reference.

Вкратце, способы направленной дифференцировки для плюрипотентных стволовых клеток, например, hES и iPS, могут быть описаны по меньшей мере четырьмя или пятью стадиями. Стадия 1 является стадией получения дефинитивной энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, и занимает от 2 до 5 суток, предпочтительно от 2 до 3 суток. Плюрипотентные стволовые клетки суспендируют в средах, содержащих RPMI, фактор роста, являющийся членом суперсемейства TGFβ, такой как активин А, активин В, GDF-8 или GDF-11 (100 нг/мл), член семейства Wnt или активатор Wnt пути, такой Wnt3a (25 нг/мл), и альтернативно, ингибитор rho-киназы или ROCK, такой как Y-27632 (10 мкМ) для усиления роста, выживания и пролиферации, а также индукции адгезии клеток. Спустя примерно 24 часа среды заменяют на среды, содержащие RPMI с сывороткой, такой как 0,2% FBS, и фактор роста, являющийся членом суперсемейства TGFβ, такой как активин А, активин В, GDF-8 или GDF-11 (100 нг/мл), и альтернативно, ингибитор rho-киназы или ROCK еще на 24 (день 1) или 48 часов (день 2). Альтернативно, спустя примерно 24 часа в среде, содержащей активин/Wnt3a, клетки культивируют еще 24 часа в среде, содержащей один активин (т.е. в среде, не содержащей Wnt3a). Важно, что получение дефинитивной энтодермы требует условий культивирования клеток с низким содержанием сыворотки, и таким образом, с низким содержанием инсулина или инсулиноподобного фактора роста. См. McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38, полностью включенную в настоящее описание посредством ссылки. McLean et al. также показали, что обеспечение контакта hES клеток с инсулином в концентрациях всего 0,2 мкг/мл на Стадии 1 может быть вредным для получения дефинитивной энтодермы. Другие специалисты в данной области техники модифицировали Стадию 1 дифференцировки плюрипотентных клеток в дефинитивную энтодерму по существу так, как описано в настоящей заявке и в

et al. (2005), например, по меньшей мере, в Agarwal et al., «Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells», Stem Cells (2008) 26:1117-1127 («Эффективная дифференцировка функциональных гепатоцитов из эмбриональных стволовых клеток человека»); Borowiak et al., «Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells», (2009) Cell Stem Cell 4:348-358 («Малые молекулы эффективно направляют энтодермальную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши и человека»); и Brunner et al., «Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver», (2009) Genome Res. 19:1044-1056 («Отличающийся характер метилирования ДНК характеризует дифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека и развивающуюся фетальную печень человека»). Надлежащая дифференцировка, спецификация, характеристика и идентификация определителя необходимы для получения других клеток энтодермальной линии. Клетки дефинитивной энтодермы на этой стадии совместно экспрессируют SOX17 и HNF3β (FOXA2), и не экспрессируют ощутимо по меньшей мере HNF4alpha, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, РАХ3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST или PP.Briefly, methods of directed differentiation for pluripotent stem cells, for example, hES and iPS, can be described in at least four or five stages. Stage 1 is the stage of obtaining a definitive endoderm from pluripotent stem cells and takes 2 to 5 days, preferably 2 to 3 days. Pluripotent stem cells are suspended in media containing RPMI, a growth factor that is a member of the TGFβ superfamily such as Activin A, Activin B, GDF-8 or GDF-11 (100 ng / ml), a member of the Wnt family, or a Wnt pathway activator such as Wnt3a (25 ng / ml), and alternatively, an rho kinase or ROCK inhibitor such as Y-27632 (10 μM) to enhance growth, survival and proliferation, and induce cell adhesion. After about 24 hours, the media are replaced with media containing RPMI with serum such as 0.2% FBS and a growth factor that is a member of the TGFβ superfamily such as Activin A, Activin B, GDF-8 or GDF-11 (100 ng / ml), and alternatively, an rho kinase or ROCK inhibitor for an additional 24 (day 1) or 48 hours (day 2). Alternatively, after about 24 hours in activin / Wnt3a containing medium, cells are cultured for an additional 24 hours in activin containing medium (ie, Wnt3a free medium). Importantly, obtaining a definitive endoderm requires cell culture conditions with a low serum content, and thus a low content of insulin or insulin-like growth factor. See McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38, incorporated by reference in its entirety. McLean et al. also showed that contacting hES cells with insulin at concentrations as low as 0.2 μg / ml in Stage 1 can be detrimental to the production of definitive endoderm. Others skilled in the art have modified the Stage 1 differentiation of pluripotent cells into a definitive endoderm essentially as described herein and in

et al. (2005), for example, at least in Agarwal et al., “Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells”, Stem Cells (2008) 26: 1117-1127 (“Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells "); Borowiak et al., “Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells”, (2009) Cell Stem Cell 4: 348-358 (“Small molecules effectively direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells”); and Brunner et al., “Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver,” (2009) Genome Res. 19: 1044-1056 ("Differing patterns of DNA methylation characterize differentiated human embryonic stem cells and the developing human fetal liver"). Proper differentiation, specification, characterization and identification of the guide are essential to obtain other endodermal lineage cells. The cells of the definitive endoderm at this stage co-express SOX17 and HNF3β (FOXA2), and do not appreciably express at least HNF4alpha, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, NAKX3, ARX. 2, INS, GSC, GHRL, SST, or PP.

Стадия 2 принимает культуру клеток дефинитивной энтодермы со стадии 1 и продуцирует энтодерму передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта путем инкубации суспензионных культур с RPMI с низкими уровнями сыворотки, такими как 0,2% FBS, в разведении ITS 1:1000, 25 нг KGF (или FGF7), и альтернативно ROCK ингибитором в течение 24 часов (день 2 - день 3) для усиления роста, выживания, пролиферации и стимуляции адгезии клеток. Спустя 24 часа (день 3 - день 4), среду заменяют на ту же самую среду минус ингибитор TGFβ, но альтернативно с ROCKингибитором для усиления роста, выживания и пролиферации клеток, еще на 24 часа (день 4 - день 5) или 48 часов (день 6). Критическим этапом для надлежащей спецификации энтодермы передней части пищеварительного тракта является удаление факторов роста семейства TGFβ. Таким образом, ингибитор TGFβ можно добавить на Стадии 2 культур клеток, такой как 2,5 мкМ ингибитор TGFβ №4, или 5 мкМ SB431542, специфический ингибитор киназы, подобной рецептору активина (ALK), который является рецептором TGFβ I типа. Клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные со Стадии 2, совместно экспрессируют SOX17, HNF1β и HNF4alpha и не проявляют выраженной совместной экспрессии по меньшей мере ни SOX17 и HNF3β (FOXA2), ни HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, РАХ3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, или PP, которые являются отличительной чертой дефинитивной энтодермы, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатических прстениторных клеток или эндокринных предшественников, а также клеток одно- или полигормонального типа.Stage 2 accepts the definitive endoderm cell culture from stage 1 and produces an anterior endoderm endoderm or PDX1 negative anterior endoderm endoderm by incubating suspension cultures with RPMI with low serum levels such as 0.2% FBS at a dilution of ITS 1: 1000, 25 ng KGF (or FGF7), and alternatively a ROCK inhibitor for 24 hours (day 2 - day 3) to enhance growth, survival, proliferation and stimulate cell adhesion. After 24 hours (day 3 - day 4), the medium is replaced with the same medium minus the TGFβ inhibitor, but alternatively with the ROCK inhibitor to enhance cell growth, survival and proliferation, for an additional 24 hours (day 4 - day 5) or 48 hours ( day 6). Removal of the growth factors of the TGFβ family is a critical step for proper specification of the anterior endoderm of the digestive tract. Thus, a TGFβ inhibitor can be added in Stage 2 cell cultures, such as 2.5 μM TGFβ inhibitor # 4, or 5 μM SB431542, a specific inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK), which is a type I TGFβ receptor. Endoderm cells of the anterior digestive tract or PDX1-negative endoderm of the anterior digestive tract obtained from Stage 2 co-express SOX17, HNF1β and HNF4alpha and show no significant co-expression of at least SOX17 and HNF3β (FOXA2, PDX1, HNF6) SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, or PP, which are the hallmarks of definitive endoderm, PDX1-positive pancreatic prostate or pancreatic endoderm cells or endocrine progenitors, as well as cells of the mono- or polyhormonal type.

Стадия 3 (дни 5-8) принимает культуру клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 2 и продуцирует клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта с помощью DMEM или RPMI в 1% В27, 0,25 мкМ KAAD циклопамина, ретиноида, такого как 0.2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) или аналога ретиноевой кислоты, такого как 3 нМ TTNPB, и 50 нг/мл Noggin в течение примерно 24 (день 7) - 48 часов (день 8). В частности, авторы заявки применяли DMEM с высоким содержанием глюкозы примерно с 2003, и все патентные и не-патентные источники, раскрытые к настоящему времени, применяли DMEM с высоким содержанием глюкозы, даже если не упоминалось «DMEM с высоким содержанием глюкозы» и тому подобное. Это отчасти обусловлено тем, что производители, такие как Gibco, не называют их среду DMEM как таковую, например DMEM (Кат. №11960) и Knockout DMEM (Кат. №10829). Это заслуживает внимания, поскольку на момент подачи настоящей заявки Gibco поставляет большую часть DMEM продуктов, но еще не указывает «высокое содержание глюкозы» в некоторых из своих DMEM продуктов, содержащих высокое количество глюкозы, например, Knockout DMEM (Кат. №10829-018). Таким образом, можно предположить, что в каждом случае, когда описывается DMEM, это означает DMEM с высоким содержанием глюкозы, и это понятно другим специалистам, проводящим исследования и разработки в данной области техники. Вновь, ROCK ингибитор или ингибитор rho-киназы, такой как Y-27632, можно применять для усиления роста, выживания, пролиферации и стимуляции адгезии клеток. PDX1-позитивные клетки передней части пищеварительного тракта, полученные со Стадии 3, совместно экспрессируют PDX1 и HNF6, а также SOX9 и PROX, и не проявляют заметной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) или PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, как описано на Стадиях 1 и 2.Stage 3 (days 5-8) takes an anterior GI tract endoderm cell culture from Stage 2 and produces PDX1-positive anterior GI endoderm cells using DMEM or RPMI in 1% B27, 0.25 μM KAAD cyclopamine, a retinoid, such as 0.2 μM retinoic acid (RA) or a retinoic acid analog such as 3 nM TTNPB, and 50 ng / ml Noggin for about 24 (day 7) - 48 hours (day 8). Specifically, the applicants have been using high glucose DMEM since about 2003, and all patent and non-patent sources disclosed to date have used high glucose DMEM even though "high glucose DMEM" and the like are not mentioned. ... This is in part due to the fact that manufacturers such as Gibco do not refer to their medium as DMEM per se, such as DMEM (Cat. # 11960) and Knockout DMEM (Cat. # 10829). This is noteworthy as Gibco supplies most of the DMEM products at the time of filing but does not yet indicate "high glucose" in some of its high glucose DMEM products, such as Knockout DMEM (Cat. # 10829-018) ... Thus, it can be assumed that in each case where DMEM is described it means high glucose DMEM, and this will be understood by those of ordinary skill in the research and development in the art. Again, a ROCK inhibitor or rho kinase inhibitor such as Y-27632 can be used to enhance growth, survival, proliferation, and stimulation of cell adhesion. PDX1-positive anterior GI cells obtained from Stage 3 co-express PDX1 and HNF6, as well as SOX9 and PROX, and do not show appreciable expression of markers characteristic of cells of the definitive endoderm or endoderm of the anterior GI tract (PDX1-negative anterior endoderm part of the digestive tract) or PDX1-positive endoderm of the anterior digestive tract, as described in Stages 1 and 2.

Стадия 4 (дни 8-14) принимает среды от Стадии 3 и заменяет их на среды, содержащие DMEM с 1% о/о В27 добавки, плюс 50 нг/мл KGF и 50 нг/мл EGF и иногда также 50 нг/мл ноггина. Вновь, ROCK ингибитор, такой как Y-27632, можно применять для усиления роста, выживания, пролиферации и индукции адгезии клеток. PDX1-позитивные клетки панкреатической энтодермы, полученные со Стадии 4, совместно экспрессируют по меньшей мере PDX1 и Nkx6.1, а также PTF1A, и не проявляют существенной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта), как описано выше для Стадий 1,2 и 3.Stage 4 (days 8-14) takes media from Stage 3 and replaces them with media containing DMEM with 1% v / v B27 supplementation, plus 50 ng / ml KGF and 50 ng / ml EGF and sometimes also 50 ng / ml noggin ... Again, a ROCK inhibitor such as Y-27632 can be used to enhance growth, survival, proliferation, and induction of cell adhesion. PDX1-positive pancreatic endoderm cells obtained from Stage 4 co-express at least PDX1 and Nkx6.1, as well as PTF1A, and do not show significant expression of markers characteristic of cells of the definitive endoderm or endoderm of the anterior part of the digestive tract (PDX1-negative endoderm front of the digestive tract) as described above for Stages 1, 2 and 3.

Альтернативно, клетки со Стадии 4 можно дополнительно дифференцировать на Стадии 5 для получения эндокринных предшественников или прогениторных типов клеток и/или одно- или полигормональных панкреатических эндокринных типов клеток со Стадии 4 в среде, содержащей DMEM в 1% о/о В27 в течение примерно 1-6 суток (дни 15-20). Эндокринные предшественники, полученные со Стадии 5, совместно экспрессируют по меньшей мере NGN3 и РАХ4, а также Nkx2.2, но не проявляют заметной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) или PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта или прогениторных клеток, как описано выше на Стадиях 1, 2, 3 и 4.Alternatively, Stage 4 cells can be further differentiated in Stage 5 to generate endocrine progenitor or progenitor cell types and / or single or polyhormonal pancreatic endocrine cell types from Stage 4 in medium containing DMEM at 1% v / v B27 for about 1 -6 days (days 15-20). Endocrine progenitors from Stage 5 co-express at least NGN3 and PAX4 as well as Nkx2.2, but do not show appreciable expression of markers characteristic of cells of the definitive endoderm or endoderm of the anterior digestive tract (PDX1-negative endoderm of the anterior digestive tract ) or PDX1-positive anterior endoderm or progenitor cells as described in Stages 1, 2, 3 and 4 above.

PDX1-позитивную панкреатическую энтодерму, полученную со Стадии 4, загружают и полностью содержат в устройстве для макро-инкапсулирования и трансплантируют пациенту, и клетки PDX1-позитивной панкреатической энтодермы созревают в панкреатические гормон-секретирующие клетки, например, инсулин-секретирующие клетки, in vivo. Инкапсулирование клеток PDX1-позитивной панкреатической энтодермы и получение инсулина in vivo подробно описаны в заявке США №12/618,659 («заявке '659»), озаглавленной «Инкапсулирование панкреатическойлинии клеток, полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009. Заявка '659 испрашивает приоритет предварительной патентной заявки 61/114,857, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических прогениторов, полученных из HES клеток», поданной 14 ноября 2008; и предварительной патентной заявки США №61/121,084, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических энтодермальных клеток», поданной 9 декабря 2008. Описания каждой из этих заявок полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The PDX1-positive pancreatic endoderm obtained from Step 4 is loaded and completely contained in a macro-encapsulation device and transplanted into a patient, and the PDX1-positive pancreatic endoderm cells mature into pancreatic hormone-secreting cells, eg, insulin-secreting cells, in vivo. The encapsulation of PDX1-positive pancreatic endoderm cells and the production of insulin in vivo are described in detail in US Application No. 12 / 618,659 ('' 659 application ”), entitled“ Encapsulation of Pancreatic Cell Line Derived from Human Pluripotent Stem Cells, ”filed Nov. 13, 2009. 'Application' 659 claims priority of Provisional Patent Application 61 / 114,857, entitled “Encapsulation of Pancreatic Progenitors Derived from HES Cells,” filed Nov. 14, 2008; and US Provisional Patent Application No. 61 / 121,084, entitled "Encapsulation of Pancreatic Endodermal Cells," filed December 9, 2008. The descriptions of each of these applications are incorporated herein by reference in their entirety.

Способы, композиции и устройства, раскрытые в настоящей заявке, представляют предпочтительные варианты осуществления, и являются примерными, и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения и другие виды применения очевидны для специалистов в данной области техники и охватываются сущностью изобретения и определены объемом описания. Соответственно, для специалиста в данной области техники понятно, что различные замены и модификации могут быть выполнены в изобретении, раскрытом в настоящей заявке, без отделения от объема и сущности настоящего изобретения.The methods, compositions and devices disclosed in this application represent preferred embodiments, and are exemplary, and are not intended to limit the scope of the invention. Variations and other uses will be obvious to those skilled in the art and are encompassed by the spirit of the invention and defined by the scope of the description. Accordingly, one skilled in the art will understand that various substitutions and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the present invention.

Например, активин А, член суперсемейства факторов роста TGFβ или сигнальных белков, используют для получения дефинитивной энтодермы из плюрипотентных клеток, например, hES клеток и iPS клеток, однако, можно применять другие члены суперсемейства TGFβ, например, GDF-8 и GDF-11, для получения дефинитивной энтодермы, такие как те, которые описаны в международной заявке PCT/US 2008/065686, озаглавленной «Факторы роста для получения дефинитивной энтодермы», поданной 3 июня 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.For example, activin A, a member of the superfamily of TGFβ growth factors or signaling proteins, is used to generate definitive endoderm from pluripotent cells, for example, hES cells and iPS cells, however, other members of the TGFβ superfamily, for example, GDF-8 and GDF-11, can be used. to obtain a definitive endoderm, such as those described in international application PCT / US 2008/065686, entitled "Growth factors for obtaining a definitive endoderm", filed June 3, 2008, fully incorporated herein by reference.

Ретиноевую кислоту (RA) применяют для дифференцировки PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта на Стадии 2 в PDX1-позитивне клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта на Стадии 3. Однако, можно применять другие ретиноиды или аналоги ретиноевой кислоты, такие как 4-[(Е)-2-(5,6,7,8-тетрагадро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]-бензойная кислота (или TTNPB) и подобные аналоги (например, 4-HBTTNPB).Retinoic acid (RA) is used to differentiate PDX1-negative endoderm cells in the anterior digestive tract in Stage 2 to PDX1-positive endoderm cells in the anterior digestive tract in Stage 3. However, other retinoids or retinoic acid analogs such as 4- [ (E) -2- (5,6,7,8-tetragadro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] benzoic acid (or TTNPB) and similar analogs (e.g. 4 -HBTTNPB).

Noggin является белком, например, который инактивирует сигнальные белки - члены суперсемейства TGFβ, такие как костный морфогенетический белок-4 (ВМР4). Однако другие BMP; ингибиторы, такие как хордин и белок гаструляции в скрученной форме (Tsg) или анти-ВМР нейтрализующие антитела могут предотвратить связывание BMP с рецепторами поверхности клеток, таким образом, эффективно ингибируя передачу сигнала BMP. Альтернативно, ген ноггина человека был клонирован и секвенирован. См. патент США №6,075,007, который включен посредством ссылки. Анализ последовательности ноггина показал карбоксиконцевой участок, имеющий гомологию с ингибитором протеаз типа Куница, что указывает на возможность наличия у ингибиторов протеаз типа Куница схожего эффекта в ингибировании BMP.Noggin is a protein, for example, that inactivates signaling proteins that are members of the TGFβ superfamily, such as bone morphogenetic protein-4 (BMP4). However, other BMPs; inhibitors such as chordin and coiled gastrulation protein (Tsg) or anti-BMP neutralizing antibodies can prevent BMP from binding to cell surface receptors, thus effectively inhibiting BMP signaling. Alternatively, the human noggin gene has been cloned and sequenced. See US patent No. 6,075,007, which is incorporated by reference. Sequence analysis of noggin showed a carboxy-terminal region that has homology with the Kunits-type protease inhibitor, which indicates the possibility of a similar effect in BMP inhibition in the Kunits-type protease inhibitors.

Наконец, устройства для макро-инкасулирования, описанные в настоящей заявке и в заявке США №12/618,659, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки, являются лишь примерными, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В частности, изменения конструкции устройства, такие как изменения размера устройства, множества камер или субкомпартментов в устройстве, или множестве портов, или механизмах загрузки и извлечения устройства, охвачены сущностью настоящего изобретения. Таким образом, для специалиста в данной области техники очевидно, что различные замены и модификации не только описанных способов дифференцировки, но и инкапсулирующего устройства, также могут быть выполнены в раскрытом изобретении без отделения от объема и сущности изобретения.Finally, the macro-encapsulation devices described in this application and in US Patent Application No. 12 / 618,659, which is hereby incorporated by reference in its entirety, are exemplary only and are not intended to limit the scope of the present invention. In particular, changes in device design, such as changes in device size, multiple cameras or sub-compartments in a device, or multiple ports, or device loading and ejecting mechanisms are encompassed within the spirit of the present invention. Thus, for a person skilled in the art it is obvious that various replacements and modifications not only to the described differentiation methods, but also to the encapsulating device, can also be performed in the disclosed invention without separating from the scope and spirit of the invention.

Получение и композиции дефинитивной энтодермы (Стадия 1)Obtaining and composition of definitive endoderm (Stage 1)

В некоторых способах дифференцировка дефинитивной энтодермы достигается путем обеспечения культуры плюрипотентных клеток с фактором роста из суперсемейства TGFβ в количестве, достаточном для индукции дифференцировки в дефинитивную энтодерму. Факторы роста из суперсемейства TGFβ, пригодные для получения дефинитивной энтодермы, выбраны из Nodal/активина, GDF-8, -9, -10, -11 и тому подобных, или подгрупп BMP. В некоторых предпочтительных способах дифференцировки фактор роста выбран из группы, состоящей из Nodal, активина А, активина В, GDF-8, GDF-11 и ВМР4. Кроме того, фактор роста Wnt3a, другие члены семейства Wnt, и активаторы пути Wnt пригодны для получения клеток дефинитивной энтодермы. В некоторых способах дифференцировки можно применять комбинации любых из вышеупомянутых факторов роста. Эти и другие способы описаны подробно в патенте США №7,510,876, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.In some methods, differentiation of the definitive endoderm is achieved by providing a culture of pluripotent cells with a growth factor from the TGFβ superfamily in an amount sufficient to induce differentiation into the definitive endoderm. Growth factors from the TGFβ superfamily suitable for the production of definitive endoderm are selected from Nodal / activin, GDF-8, -9, -10, -11 and the like, or BMP subgroups. In some preferred methods of differentiation, the growth factor is selected from the group consisting of Nodal, activin A, activin B, GDF-8, GDF-11, and BMP4. In addition, the growth factor Wnt3a, other members of the Wnt family, and activators of the Wnt pathway are useful in the production of definitive endoderm cells. In some methods of differentiation, combinations of any of the above growth factors can be used. These and other methods are described in detail in US patent No. 7,510,876, which is fully incorporated into this description by reference.

Что касается некоторых способов дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы, вышеупомянутые факторы роста обеспечивают для клеток так, чтобы факторы роста присутствовали в культурах в концентрациях, достаточных для индукции дифференцировки по меньшей мере части плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы. В некоторых способах вышеупомянутые факторы роста присутствуют в культуре клеток в концентрации по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, по меньшей мере примерно 1000 нг/мл, по меньшей мере примерно 2000 нг/мл, по меньшей мере примерно 3000 нг/мл по меньшей мере примерно 4000 нг/мл, по меньшей мере примерно 5000 нг/мл или больше примерно 5000 нг/мл.Regarding some methods of differentiating pluripotent cells into definitive endoderm cells, the aforementioned growth factors are provided to the cells so that growth factors are present in cultures at concentrations sufficient to induce differentiation of at least a portion of the pluripotent cells into definitive endoderm cells. In some methods, the above growth factors are present in cell culture at a concentration of at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, at least about 1000 ng / ml, at least about 2000 ng / ml, at least about 3000 ng / ml at least about 4000 ng / ml, at least about 5000 ng / ml, or more about 5000 ng / ml.

В некоторых способах дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы вышеупомянутые факторы роста удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, факторы роста можно удалить в течение примерно одних суток, примерно двух суток, примерно трех суток, примерно четырех суток, примерно пяти суток, примерно шести суток, примерно семи суток, примерно восьми суток, примерно девяти суток или примерно десяти суток после их добавления. В предпочтительных способах факторы роста удаляют спустя примерно 4 суток после их добавления.In some methods of differentiating pluripotent cells into definitive endoderm cells, the above growth factors are removed from the cell culture after they are added. For example, growth factors can be removed within about one day, about two days, about three days, about four days, about five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, or about ten days after adding them. ... In preferred methods, the growth factors are removed about 4 days after they are added.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящей заявке, клетки дефинитивной энтодермы обогащают, изолируют и/или очищают перед дальнейшей дифференцировкой. В таких вариантах осуществления клетки дефинитивной энтодермы могут быть обогащены, изолированы и/или очищены с применением любого известного способа. В предпочтительных вариантах осуществления клетки дефинитивной энтодермы обогащают, изолируют и/или очищают с применением одного или нескольких способов, описанных в патентной заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004, и предварительной заявке на патент США №60/736,598, озаглавленной «Маркеры дефинитивной энтодермы», поданной 14 ноября 2005, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством.In some embodiments of the methods described herein, the definitive endoderm cells are enriched, isolated and / or purified prior to further differentiation. In such embodiments, the cells of the definitive endoderm can be enriched, isolated and / or purified using any known method. In preferred embodiments, the definitive endoderm cells are enriched, isolated, and / or purified using one or more of the methods described in US Patent Application Serial No. 11/021,618, entitled “Definitive Endoderm,” filed December 23, 2004, and US Provisional Patent Application No. 60 / 736,598, entitled "Markers of the Definitive Endoderm," filed November 14, 2005, the disclosures of which are incorporated herein in their entirety by.

В предпочтительном варианте осуществления клетки дефинитивной энтодермы, полученные и описанные в настоящей заявке, могут иметь высокие уровни экспрессии генов CER, GSC, CXCR4, SOX17 и FOXA2 при нормализации и по сравнению с уровнями контрольных генов, таких как конститутивные гены.In a preferred embodiment, the definitive endoderm cells obtained and described herein can have high levels of expression of the CER, GSC, CXCR4, SOX17, and FOXA2 genes when normalized and compared to levels of control genes such as constitutive genes.

Получение PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта и композиции (Стадия 2)Obtaining PDX1-negative anterior endoderm and composition (Stage 2)

Клети дефинитивной энтодермы могут быть специализированы по направлению к панкреатической дифференцировке путем дальнейшей дифференцировки этих клеток до получения PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта. В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, культуры клеток, а также обогащенные или очищенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы, можно применять для дальнейшей дифференцировки до культур клеток и/или обогащенных популяций клеток, содержащих PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта.Cells of the definitive endoderm can be specialized towards pancreatic differentiation by further differentiating these cells to produce PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract. In some of the differentiation methods described in this application, cell cultures, as well as enriched or purified cell populations containing cells of the definitive endoderm, can be used for further differentiation to cell cultures and / or enriched cell populations containing PDX1-negative cells of the anterior digestive endoderm. path.

Как правило, клетки дефинитивной энтодермы дифференцируют в PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта путем снижения или элиминации или удаления сигнальной системы суперсемейства факторов роста TGFβ в культуре клеток или популяции клеток SOX17-позитивных клеток дефинитивной энтодермы. В некоторых вариантах осуществления снижение или элиминация сигнальной системы суперсемейства факторов роста TGFβ опосредуется путем разбавления или удаления экзогенно добавленного фактора роста семейства TGFβ, такого как активин А, из культуры клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы. В других вариантах осуществления сигнальная система суперсемейства факторов роста TGFβ снижается или устраняется путем обеспечения клеток дефинитивной энтодермы соединением, блокирующим сигнальную систему суперсемейства факторов роста TGFβ, таким как фолллистатин и/или ноггин. В некоторых вариантах осуществления сигнальную систему суперсемейства факторов роста TGFβ можно уменьшить или устранить примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней или больше чем примерно на десять дней после дифференцировки плюрипотентных клеток человека в клетки дефинитивной энтодермы.Typically, cells of the definitive endoderm differentiate into PDX1-negative endoderm cells of the anterior part of the digestive tract by reducing or eliminating or removing the signaling system of the superfamily of growth factors TGFβ in cell culture or in the cell population of SOX17-positive cells of the definitive endoderm. In some embodiments, the reduction or elimination of the TGFβ growth factor superfamily signaling system is mediated by dilution or removal of an exogenously added TGFβ family growth factor, such as activin A, from a cell culture or population of definitive endoderm cells. In other embodiments, the signaling system of the TGFβ growth factor superfamily is reduced or abolished by providing the cells of the definitive endoderm with a compound that blocks the signaling system of the TGFβ growth factor superfamily, such as folllistatin and / or noggin. In some embodiments, the signaling system of the TGFβ growth factor superfamily can be reduced or eliminated by about one day, about two days, about three days, about four days, about five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, about ten days or more than about ten days after differentiation of human pluripotent cells into definitive endoderm cells.

В некоторых вариантах осуществления дифференцировку клеток дефинитивной энтодермы в клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта усиливают путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы фактором роста семейства FGF и/или ингибитором пути хэджхог. В таких вариантах осуществления фактор роста семейства FGF и/или ингибитор пути хэджхог обеспечивают примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или более чем примерно на десять дней после уменьшения или устранения сигнализации фактора роста суперсемейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы. В предпочтительном варианте осуществления фактор роста семейства FGF и/или ингибитор пути хэджхог обеспечивают примерно в то же самое время, что и снижение или устранение сигнализации фактора роста суперсемейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы.In some embodiments, differentiation of definitive endoderm cells into anterior endoderm endoderm cells is enhanced by providing a cell culture or population of definitive endoderm cells with an FGF family growth factor and / or a hedgehog pathway inhibitor. In such embodiments, the FGF family growth factor and / or hedgehog pathway inhibitor is provided for about one day, about two days, about three days, about four days, about five days, about six days, about seven days. about eight days, about nine days, about ten days, or more than about ten days after the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in definitive endoderm cell culture. In a preferred embodiment, a growth factor of the FGF family and / or an inhibitor of the hedgehog pathway is provided at about the same time as the reduction or elimination of TGFβ superfamily growth factor signaling in definitive endoderm cell culture.

В предпочтительном варианте осуществления фактор роста семейства FGF, обеспечиваемый в культуре клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы, является FGF10 и/или FGF7. Однако необходимо понимать, что иные факторы роста семейства FGF, или аналоги фактора роста семейства FGF, или миметики могут быть предоставлены вместо или в дополнение к FGF10 и/или FGF7. Например, может быть обеспечен фактор роста семейства FGF, выбранный из группы, состоящей из FGF1, FGF2, FGF3, и тому подобного, включая FGF23. В таких вариантах осуществления фактор роста семейства FGF и/или аналог фактора роста семейства FGF, или миметик обеспечивается для клетки или культуры клеток так, чтобы присутствовать в концентрации по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, или по меньшей мере примерно 1000 нг/мл.In a preferred embodiment, the growth factor of the FGF family provided in the cell culture or cell population of the definitive endoderm is FGF10 and / or FGF7. However, it should be understood that other growth factors of the FGF family, or analogs of the growth factor of the FGF family, or mimetics may be provided in place of or in addition to FGF10 and / or FGF7. For example, a FGF family growth factor selected from the group consisting of FGF1, FGF2, FGF3, and the like, including FGF23, can be provided. In such embodiments, the FGF family growth factor and / or the FGF family growth factor analog or mimetic is provided to the cell or cell culture so as to be present at a concentration of at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, by at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, or at least about 1000 ng / ml.

В других предпочтительных вариантах осуществления ингибитором хеджхог является KAAD-циклопамин. Однако необходимо понимать, что можно использовать другие ингибиторы хэджхог. Такие ингибиторы включают аналоги KAAD-циклопамина, иервин, аналоги иервина; антитела, блокирующие путь хэджхог; и любые другие ингибиторы функции пути хэджхог, известные для рядового специалиста в данной области техники, но не ограничиваются ими. При использовании по отдельности или в сочетании с фактором роста семейства FGF, ингибитор хэджхог может быть обеспечен в концентрации по меньшей мере примерно от 0,01 мкМ до 50 мкМ.In other preferred embodiments, the hedgehog inhibitor is KAAD-cyclopamine. However, it should be understood that other hedgehog inhibitors can be used. Such inhibitors include analogs of KAAD-cyclopamine, Hiervine, Hiervine analogs; antibodies that block the hedgehog pathway; and any other inhibitors of hedgehog pathway function known but not limited to those of ordinary skill in the art. When used alone or in combination with a growth factor of the FGF family, the hedgehog inhibitor can be provided at a concentration of at least about 0.01 μM to 50 μM.

В предпочтительном способе получения популяции PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта из клеток дефинитивной энтодермы, передачу сигналов фактора роста суперсемейства TGFβ снижают или устраняют примерно на два дня после дифференцировки существенной части плюрипотентных клеток человека в дефинитивную энтодерму (например, после трех дней, четырех дней или пяти дней протокола дифференцировки, как описано в примерах ниже). Примерно в то же самое время культуру клеток или популяцию клеток дефинитивной энтодермы обеспечивают ноггином и KAAD-циклопамином, например, 50 нг/мл ноггина и 0,25 мкМ KAAD-циклопамина в среде DMEM в присутствии 2 мМ RA или 3 нМ TTNPB.In a preferred method of obtaining a population of PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract from definitive endoderm cells, TGFβ superfamily growth factor signaling is reduced or eliminated for about two days after a substantial proportion of human pluripotent cells have differentiated into the definitive endoderm (e.g., after three days, four days or five days of the differentiation protocol, as described in the examples below). At about the same time, a cell culture or population of definitive endoderm cells is provided with noggin and KAAD-cyclopamine, for example, 50 ng / ml noggin and 0.25 μM KAAD-cyclopamine in DMEM medium in the presence of 2 mM RA or 3 nM TTNPB.

В некоторых вариантах осуществления PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта могут быть дополнительно дифференцированы в PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта путем обеспечения контакта клеток или иного обеспечения клеток средой, содержащей ретиноид, такой как ретиноевая кислота (RA). В некоторых вариантах осуществления ретиноид обеспечивается для клеток в культуре клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 1 нМ до 50 мкМ. В таких вариантах осуществления ретиноид обеспечивается для клеток примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или больше чем примерно на десять дней после снижения или удаления переноса сигнала фактора роста семейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы. В предпочтительном варианте осуществления примерно от 0,05 мкМ RA до 2 мкМ RA обеспечивается для культуры клеток PDX-1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на 2-3 дня после снижения или устранения переноса сигнала фактора роста семейства TGFβ.In some embodiments, PDX1 negative anterior endoderm cells can be further differentiated into anterior PDX1 positive endoderm cells by providing cell contact or otherwise providing cells with a retinoid-containing medium such as retinoic acid (RA). In some embodiments, the retinoid is provided to cells in cell culture at a concentration of at least about 1 nM to 50 μM. In such embodiments, the retinoid is provided to the cells for about one day, about two days, about three days, about four days, about five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, by about ten days, or more than about ten days after the decrease or removal of signal transfer of the growth factor of the TGFβ family in definitive endoderm cell culture. In a preferred embodiment, from about 0.05 µM RA to 2 µM RA is provided for cultured PDX-1 negative endoderm cells of the anterior digestive tract for about 2-3 days after decreasing or eliminating TGFβ family growth factor signaling.

В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, вышеупомянутые факторы дифференцировки удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, вышеупомянутые факторы дифференцировки можно удалить в течение примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления.In some of the methods of differentiation described in this application, the aforementioned differentiation factors are removed from the cell culture after they are added. For example, the aforementioned differentiation factors can be removed within about one day, about two days, about three days, about five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, or about ten days after adding them.

В предпочтительном варианте осуществления PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные и описанные в настоящей заявке, имеют относительно высокие уровни экспрессии генов SOX17, FOXA1, HNF1B и HNF4A при нормализации до уровней контрольных генов, таких как конститутивные гены. В частности, уровни экспрессии гена HNF4A по существу не повышаются до удаления системы передачи сигнала фактора роста суперсемейства TGFβ (например, активина), например, из культуры дефинитивной энтодермы.In a preferred embodiment, PDX1 negative anterior endoderm cells obtained and described herein have relatively high levels of SOX17, FOXA1, HNF1B, and HNF4A gene expression when normalized to control genes such as constitutive genes. In particular, HNF4A gene expression levels are not substantially increased until the TGFβ superfamily growth factor signaling system (eg, activin) is removed from, for example, a definitive endoderm culture.

Получение и композиции PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта (Стадия 3)Preparation and composition of PDX1-positive endoderm of the anterior digestive tract (Stage 3)

Клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта можно дополнительно специализировать по направлению к панкреатической дифференцировке путем дополнительной дифференцировки эти клеток до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или ее эквивалентов. В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, культуры клеток, а также обогащенные или очищенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы, можно применять для дополнительной дифференцировки в культуры клетоккультуры клеток и/или обогащенные популяции клеток, содержащие клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.PDX1-negative anterior endoderm cells can be further specialized towards pancreatic differentiation by further differentiating these cells to produce PDX1-positive anterior endoderm cells or PDX1-positive pancreatic endoderm or their equivalents. In some of the differentiation methods described in this application, cell cultures, as well as enriched or purified cell populations containing cells of the definitive endoderm, can be used for additional differentiation in cell cultures, cell cultures and / or enriched cell populations containing PDX1-positive endoderm cells of the anterior part digestive tract.

Как правило, клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта дифференцируют в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта путем обеспечения культуры клеток, содержащей клетки SOX17-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, ретиноидом, таким как ретиноевая кислота (RA). В некоторых способах дифференцировки клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта также обеспечивают членом семейства факторов роста фибробластов до или примерно в то же самое время, что и добавление RA. Предпочтительным фактором роста фибробластов является FGF-7. В другом предпочтительном способе фактор роста фибробластов включает любой фактор роста фибробластов или лиганд, стимулирующий или иным образом взаимодействующий с рецептором IIIb фактора роста фибробластов 2 (FGFR2(IIIb)). В еще более предпочтительных способах фактор роста семейства FGF используют в сочетании с ингибитором пути хэджхог. Предпочтительным ингибитором пути хэджхог является KAAD-циклопамин. В особо предпочтительных способах дифференцировки FGF-10 и/или KAAD-циклопамин обеспечивают для культуры клеток, содержащей клетки PDX1-негативной дефинитивной энтодермы, в присутствии RA. В некоторых способах ВМР4 может быть включен с FGF 10 и/или KAAD-циклопамином в присутствии RA. В некоторых способах ретиноид применяют в сочетании с членом TGFβ суперсемейства факторов роста и/или средой Connaught Medical Research Labs (CRML средой) (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).Typically, PDX1-negative anterior endoderm cells differentiate into anterior PDX1-positive endoderm cells by providing a cell culture containing SOX17-positive anterior endoderm cells with a retinoid such as retinoic acid (RA). In some differentiation methods, PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract are also provided with a member of the fibroblast growth factor family before or about the same time as RA supplementation. The preferred fibroblast growth factor is FGF-7. In another preferred method, the fibroblast growth factor comprises any fibroblast growth factor or ligand that stimulates or otherwise interacts with the fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2 (IIIb)). In even more preferred methods, a growth factor of the FGF family is used in combination with a hedgehog pathway inhibitor. The preferred inhibitor of the hedgehog pathway is KAAD-cyclopamine. In particularly preferred differentiation methods, FGF-10 and / or KAAD-cyclopamine is provided for a cell culture containing PDX1 negative definitive endoderm cells in the presence of RA. In some methods, BMP4 can be included with FGF 10 and / or KAAD-cyclopamine in the presence of RA. In some methods, the retinoid is used in combination with a member of the TGFβ superfamily of growth factors and / or Connaught Medical Research Labs medium (CRML medium) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

Что касается некоторых вариантов осуществления способов дифференцировки, описанных в настоящей заявке, ретиноид и/или комбинацию вышеупомянутых факторов дифференцировки обеспечивают для клеток так, чтобы эти факторы присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части культуры клеток или популяции клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.For some embodiments of the differentiation methods described herein, a retinoid and / or a combination of the aforementioned differentiation factors is provided to cells such that these factors are present in the cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate differentiation of at least a portion of the cell culture, or the population of cells of PDX1-negative endoderm of the anterior part of the digestive tract into cells of PDX1-positive endoderm of the anterior part of the digestive tract.

В других способах FGF-10 обеспечивают для клеток в культуре клеток так, чтобы он присутствовал в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 2 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл и до 50 мкМ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фактор роста фибробластов или лиганд, стимулирующий или иным образом взаимодействующий с рецептором IIIb фактора роста фибробластов 2 (FGFR2(IIIb)), обеспечивается по отдельности или в комбинации с ингибитором пути хэджхог.In other methods, FGF-10 is provided to cells in cell culture so that it is present at a concentration of at least about 1 ng / ml, at least about 2 ng / ml, at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml and up to 50 μM. In some embodiments, a fibroblast growth factor or ligand that stimulates or otherwise interacts with fibroblast growth factor 2 receptor IIIb (FGFR2 (IIIb)) is provided alone or in combination with a hedgehog pathway inhibitor.

В предпочтительном способе для получения популяции клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта из клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительной тракта культуру клеток или обогащенную популяцию клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают FGF-7, KAAD-циклопамином и ретиноевой кислотой (RA), например, 25 нг/мл FGF-7 и 0,2 мкМ KAAD-циклопамина в среде CMRL в присутствии 2 мкМ RA.In a preferred method for obtaining a population of PDX1-positive endoderm of the anterior digestive tract from PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract, a cell culture or enriched population of PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract is provided with FGF-7, KAAD-cyclopamine and retinoic acid (RA), for example, 25 ng / ml FGF-7 and 0.2 μM KAAD-cyclopamine in CMRL medium in the presence of 2 μM RA.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, фактор передачи сигнала TGFβ, например, активин А и/или активин В, GDF-8, GDF-11 и тому подобное обеспечивается в культуре клеток вместе с ретиноидом и/или фактором роста фибробластов и ингибитором хэджхог. Например, в таких способах активин А и/или активин В и/или GDF-8 и/или GDF-11 обеспечивают для культуры клеток в концентрации по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, или по меньшей мере примерно 1000 нг/мл.In some of the methods described in this application, a signaling factor TGFβ, for example, activin A and / or activin B, GDF-8, GDF-11, and the like is provided in cell culture together with retinoid and / or fibroblast growth factor and a hedgehog inhibitor ... For example, in such methods, activin A and / or activin B and / or GDF-8 and / or GDF-11 are provided for cell culture at a concentration of at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, or at least about 1000 ng / ml.

В некоторых способах факторы дифференцировки и/или среду CRML обеспечивают для клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на один день, два дня, три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или более чем примерно на десять дней после начала дифференцировки из плюрипотентных клеток. В предпочтительных способах факторы дифференцировки и/или среду CRML обеспечивают для клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на три, или четыре, или пять дней после начала дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток.In some methods, differentiation factors and / or CRML media are provided to PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract for about one day, two days, three days, about four days, about five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, about ten days, or more than about ten days after the onset of differentiation from pluripotent cells. In preferred methods, differentiation factors and / or CRML medium are provided to PDX1-negative endoderm cells of the anterior digestive tract for about three, or four, or five days after the onset of differentiation from pluripotent stem cells.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, вышеупомянутые факторы дифференцировки удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, вышеупомянутые факторы дифференцировки можно удалить в пределах примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно четырех дней, пример пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления.In some of the methods described in this application, the aforementioned differentiation factors are removed from the cell culture after they are added. For example, the aforementioned differentiation factors can be removed within about one day, about two days, about three days, about four days, example five days, about six days, about seven days, about eight days, about nine days, or about ten days after them. additions.

Эти и другие способы подробно описаны в предварительной патентной заявке США №60/730,917, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2005, а клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта описаны в патентной заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.These and other methods are described in detail in US Provisional Patent Application No. 60/730,917, entitled "PDX1-Expressing Dorsal and Ventral Endoderm of the Anterior Gastrointestinal Tract," filed Oct. 27, 2005, and PDX1-positive endoderm cells of the anterior GI tract are described in Patent Application US No. 11 / 115,868, entitled "PDX1-Expressing Endoderm", filed April 26, 2005, the descriptions of which are fully incorporated into this description by reference.

В предпочтительном варианте осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные и описанные в настоящей заявке, имеют относительно высокие уровни экспрессии генов PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA и cMYC при нормализации, по сравнению с уровнями контрольных генов, таких как конститутивные гены.In a preferred embodiment, the PDX1-positive anterior endoderm cells obtained and described herein have relatively high levels of expression of PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA and cMYC genes when normalized, compared to levels of control genes such as constitutive genes.

Получение и композиции PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (Стадия 4)Preparation and composition of PDX1-positive pancreatic endoderm (Stage 4)

Получение и композиции PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или «панкреатического эпителия» или вообще панкреатических прогениторов подробно описаны в заявке США №12/167,227, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 2 июля 2008, изданной 19 мая 2009 как патент США №7,534,608. Заявка 12/167,227 является продолжением заявки США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля 2007, которая является частичным продолжением патентной заявки США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марта 2007. Описания каждой из этих заявок полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The preparation and composition of PDX1-positive pancreatic endoderm or "pancreatic epithelium" or pancreatic progenitors in general are described in detail in US Application No. 12/167,227, entitled “Methods for Preparing Pancreatic Hormones," filed July 2, 2008, issued May 19, 2009 as US Patent No. 7,534,608. Application 12 / 167,227 is a continuation of US Application No. 11 / 773,944, entitled "Methods for Making Pancreatic Hormones," filed July 5, 2007, which is a continuation of US Patent Application No. 11 / 681,687, entitled "Endocrine Progenitor Cells, Pancreatic Hormone Expressing Cells and Methods for Their Preparation, ”filed March 2, 2007. The descriptions of each of these applications are fully incorporated herein by reference.

Пример 22 из заявки 12/167,227 подробно описывает различные модификации условий культуры клеток, описанные в настоящей заявке на Стадиях 1-4. В целом, на Стадии 3 типы клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культивируют в средах, содержащих DMEM в 1% о/о В27 добавке плюс ноггин, или другой ВМР4 специфический ингибитор в течение примерно 1-3 дней, или примерно 1-4 дней, или 1-5 дней, или примерно 1-6 дней. В конце Стадии 4, получают PDX1-позитивную панкреатическую энтодерму, клетки которой по меньшей мере совместно экспрессируют PDX1 и Nkx6.1, а также PTF1A. Культура клеток не проявляет существенной экспрессии клеток, характерных для одно- или полигормональных эндокринных клеток со Стадии 5, или клеток дефинитивной энтодермы со Стадии 1, или клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 2, или клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 3.Example 22 of application 12 / 167,227 details the various modifications of the cell culture conditions described herein in Steps 1-4. In general, in Stage 3, PDX1-positive endoderm cell types of the anterior digestive tract are cultured in media containing DMEM in 1% v / v B27 supplement plus noggin or another BMP4 specific inhibitor for about 1-3 days, or about 1- 4 days, or 1-5 days, or approximately 1-6 days. At the end of Step 4, a PDX1-positive pancreatic endoderm is obtained, the cells of which at least co-express PDX1 and Nkx6.1 as well as PTF1A. The cell culture does not show significant expression of cells characteristic of mono- or polyhormonal endocrine cells from Stage 5, or definitive endoderm cells from Stage 1, or PDX1-negative endoderm cells from the anterior part of the digestive tract from Stage 2, or PDX1-positive endoderm cells from the anterior part digestive tract from Stage 3.

Получение и композиции эндокринных клеток-предшественников (Стадия 5)Obtaining and Composing Endocrine Progenitor Cells (Step 5)

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам получения эндокринных клеток-предшественников, начиная от плюрипотентных клеток. Как описано выше, эндокринные клетки-предшественники можно получить вначале путем дифференцировки плюрипотентных клеток до получения клеток дефинитивной энтодермы, с последующей дифференцировкой клеток дефинитивной энтодермы до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта. В таких вариантах осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта далее дифференцируют до мультипотентных эндокринных клеток-предшественников, способных к дифференцировке в гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков человека.Some of the options for implementation described in this application relate to methods of obtaining endocrine progenitor cells, ranging from pluripotent cells. As described above, endocrine progenitor cells can be obtained first by differentiating pluripotent cells to obtain definitive endoderm cells, followed by differentiation of definitive endoderm cells to obtain PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract. In such embodiments, the PDX1-positive endoderm cells of the anterior gastrointestinal tract are further differentiated to multipotent endocrine progenitor cells capable of differentiating into hormone-expressing human pancreatic islet cells.

В одном варианте осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта дифференцируют в эндокринные клетки-предшественники путем продолжения инкубации клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в присутствии ретиноида, такого как ретиноевая кислота, в течение времени, достаточного для получения эндокринных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления время, достаточное для получения эндокринных клеток-предшественников, находится в диапазоне примерно от 1 часа до 10 суток после экспрессии PDX1 маркера в части клеток в культуре клеток. В некоторых вариантах осуществления ретиноид сохраняют в культуре клеток в течение примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 4 часов, примерно 6 часов, примерно 8 часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов, примерно 16 часов, примерно 1 дня, примерно 2 дней, примерно 3 дней, примерно 4 дней, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 7 дней, примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней, или более чем примерно 10 дней после экспрессии PDX1 маркера в части клеток из культуры клеток.In one embodiment, PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract differentiate into endocrine progenitor cells by continuing to incubate PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract in the presence of a retinoid such as retinoic acid for a time sufficient to obtain endocrine cells - predecessors. In some embodiments, the time sufficient to obtain endocrine progenitor cells ranges from about 1 hour to 10 days after expression of the PDX1 marker in a portion of the cells in cell culture. In some embodiments, the retinoid is retained in cell culture for about 1 hour, about 2 hours, about 4 hours, about 6 hours, about 8 hours, about 10 hours, about 12 hours, about 16 hours, about 1 day, about 2 days , about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days, or more than about 10 days after expression of the PDX1 marker in a portion of cells from cell culture.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, концентрация ретиноида, используемого для дифференцировки клеток PDX1 -позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в культуре клеток или популяции клеток в эндокринные клетки-предшественники, находится в диапазоне примерно от 1 нМ до 100 мкМ.In some of the methods described herein, the concentration of retinoid used to differentiate PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract in a cell culture or cell population into endocrine progenitor cells ranges from about 1 nM to 100 μM.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления дифференцировка из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в панкреатические клетки-предшественники опосредована путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток, содержащих клетки человека PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, ингибитором гамма-секретазы. В предпочтительном варианте осуществления ингибитором гамма-секретазы является N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир (DAPT).In some preferred embodiments, differentiation from PDX1 positive anterior endoderm cells to pancreatic progenitor cells is mediated by providing a cell culture or cell population containing human PDX1 positive anterior endoderm cells with a gamma secretase inhibitor. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)] - S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают в начале способа дифференцировки, например, плюрипотентной стадии, и оставляют в культуре клеток на протяжении дифференцировки гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков. В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы добавляют после начала дифференцировки, но перед дифференцировкой до стадии PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта. В предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают в культуре клеток или популяции клеток примерно в то же самое время, что и обеспечение факторов дифференцировки, индуцирующих превращение дефинитивной энтодермы в PDX1-позитивную энтодерму. В других предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для культуры клеток или популяции клеток после дифференцировки существенной части клеток в культуре клеток или популяции клеток в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.In other embodiments, a gamma-secretase inhibitor is provided at the beginning of a differentiation process, eg, a pluripotent stage, and is left in cell culture throughout differentiation of hormone-expressing pancreatic islet cells. In other embodiments, the gamma-secretase inhibitor is added after the onset of differentiation, but before differentiation to the PDX1-positive endoderm stage of the anterior gastrointestinal tract. In preferred embodiments, the gamma-secretase inhibitor is provided in a cell culture or cell population at about the same time as providing differentiation factors that induce the conversion of definitive endoderm to PDX1-positive endoderm. In other preferred embodiments, the gamma-secretase inhibitor is provided to a cell culture or cell population after a substantial portion of the cells in the cell culture or cell population have differentiated into PDX1-positive endoderm cells of the anterior gut.

Что касается некоторых вариантов осуществления, касающихся дифференцировки клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в эндокринные клетки-предшественники, ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части PDX1-позитивных клеток в эндокринные клетки-предшественники. В некоторых вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации в диапазоне примерно от 0,01 мкМ до 1000 мкМ. В предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации в диапазоне примерно от 0,1 мкМ до 100 мкМ.With regard to some embodiments concerning the differentiation of PDX1-positive endoderm cells of the anterior gastrointestinal tract into endocrine progenitor cells, the gamma-secretase inhibitor is provided to the cells to be present in the cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate differentiation at least part of PDX1-positive cells into endocrine progenitor cells. In some embodiments, the gamma secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration in the range of about 0.01 μM to 1000 μM. In preferred embodiments, the gamma-secretase inhibitor is present in the cell culture or cell population at a concentration ranging from about 0.1 μM to 100 μM.

В некоторых вариантах осуществления способов получения эндокринных клеток-предшественников, как описано в настоящей заявке, ингибитор гамма-секретазы обеспечивают после удаления одного или нескольких ранее обеспеченных факторов дифференцировки из культур клеток. Например, один или несколько ранее обеспеченных факторов дифференцировки могут быть удалены примерно за 1-10 дней или более чем примерно за 10 дней до добавления ингибитора гамма-секретазы. В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для культур клеток или популяций клеток, содержащих один или несколько факторов дифференцировки, обеспеченных раньше или примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы. В предпочтительных вариантах осуществления факторы дифференцировки, которые обеспечены раньше или примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы, включают FGF-10, KAAD-циклопамин, активин А, активин В, GDF-8, GDF-11, ВМР4 и/или RA, но не ограничиваются ими.In some embodiments of the methods for producing endocrine progenitor cells as described herein, a gamma secretase inhibitor is provided after one or more previously provided differentiation factors are removed from cell cultures. For example, one or more of the previously provided differentiation factors can be removed about 1-10 days, or more than about 10 days before the addition of the gamma-secretase inhibitor. In other embodiments, the gamma-secretase inhibitor is provided to cell cultures or cell populations containing one or more differentiation factors provided earlier or at about the same time as the gamma-secretase inhibitor. In preferred embodiments, differentiation factors that are provided earlier or at about the same time as the gamma secretase inhibitor include FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A, activin B, GDF-8, GDF-11, BMP4, and / or RA, but not limited to them.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке, эксендин 4 обеспечивают для дифференцировки культуры клеток или популяции клеток примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы. В некоторых вариантах осуществления эксендин 4 обеспечивают так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 0,1 нг/мл до 1000 нг/мл.In some embodiments of the invention described herein, Exendin 4 is provided to differentiate a cell culture or cell population at about the same time as a gamma secretase inhibitor. In some embodiments, Exendin 4 is provided to be present in a cell culture or cell population at a concentration of at least about 0.1 ng / ml to 1000 ng / ml.

В предпочтительном способе получения эндокринных клеток-предшественников из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культуру клеток или популяцию клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают 3 мкМ DAPT и 40 нг/мл эксендина 4. В особо предпочтительных вариантах осуществления клетки дифференцируют в CMRL. В другом особо предпочтительном способе для получения эндокринных клеток-предшественников из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культуру клеток или популяцию клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают 3 мкМ DAPT и 40 нг/мл эксендина 4 в присутствии 2 мкМ RA.In a preferred method of obtaining endocrine progenitor cells from PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, a cell culture or population of PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract is provided with 3 μM DAPT and 40 ng / ml exendin 4. In particularly preferred embodiments, the cells are differentiated at CMRL. In another particularly preferred method for obtaining endocrine progenitor cells from PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, a cell culture or population of PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract is provided with 3 μM DAPT and 40 ng / ml Exendin 4 in the presence of 2 μM RA ...

Необходимо понимать, что экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 индуцируется в диапазоне различных уровней в эндокринных клетках-предшественниках, в зависимости от условий дифференцировки. Как таковая, в некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток превышает по меньшей мере в 2 раза - 10000 раз экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы. В других вариантах осуществления экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток превышает по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере в 6 раз - в 10000 раз экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы. В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток неограниченно превышает экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, таких как iPS клетки и hES клетки, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы.It should be understood that the expression of markers NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 is induced at a range of different levels in endocrine progenitor cells, depending on the conditions of differentiation. As such, in some embodiments described herein, the expression of markers NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 in endocrine progenitor cells or cell populations is at least 2 times to 10,000 times the expression of markers NGN3, NKX2.2, and / or PAX4 in non-endocrine progenitor cells or cell populations, e.g., pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, immature hormone-expressing pancreatic islet cells, mature pancreatic islet expressing cells extraembryonic endoderm cells, mesoderm cells and / or ectoderm cells. In other embodiments, the expression of markers NGN3, NKX2.2, and / or PAX4 in endocrine progenitor cells or cell populations is at least about 4 times, at least 6 times to 10,000 times the expression of markers NGN3, NKX2.2, and / or PAX4 in non-endocrine progenitor cells or cell populations, e.g., pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, immature hormone-expressing pancreatic islet cells, mature pancreatic islet expressing cells extraembryonic endoderm cells, mesoderm cells and / or ectoderm cells. In some embodiments, the expression of markers NGN3, NKX2.2, and / or PAX4 in endocrine progenitor cells or cell populations unrestrictedly exceeds the expression of markers NGN3, NKX2.2, and / or PAX4 in non-endocrine progenitor cells or cell populations, for example, pluripotent stem cells, such as iPS cells and hES cells, definitive endoderm cells, PDX1-positive endoderm cells of the anterior digestive tract, immature hormone-expressing pancreatic islet cells, mature hormone-expressing pancreatic islet cells, extraembryonic / endoderm cells, or modermata ectoderm cells.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки человека, включая эндокринные клетки-предшественники человека, где экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или РАХ6 по меньшей мере примерно на 2% от клеток человека. В других вариантах осуществления экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 5%-98% от клеток человека. В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культур клетоках или популяциях, где экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6, рассчитывают независимо от фидерных клеток.Other embodiments of the present invention relate to compositions such as cell cultures or cell populations containing human cells, including human endocrine progenitor cells, where the expression of the NGN3 marker exceeds the expression of the AFP marker, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA , INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 at least about 2% of human cells. In other embodiments, the expression of the NGN3 marker exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 by at least about 5% -98% of human cells ... In some embodiments, the percentage of human cells in cell cultures or populations where the expression of the NGN3 marker exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 is calculated independently from feeder cells.

Необходимо понимать, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим эндокринные клетки-предшественники человека, где экспрессия маркера NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере от примерно 2% до более чем примерно 98% клеток человека. В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркера NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере от 5% до 98% клеток человека. В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культурах клеток или популяциях, где экспрессия маркера NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6, рассчитывают независимо от фидерных клеток.It should be understood that some embodiments of the present invention relate to compositions such as cell cultures or cell populations containing human endocrine progenitor cells, where the expression of the marker NKX2.2 and / or PAX4 exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM , MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 from at least about 2% to more than about 98% of human cells. In some embodiments, the expression of the marker NKX2.2 and / or PAX4 exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 by at least 5% to 98% of human cells. In some embodiments, the percentage of human cells in cell cultures or populations where the expression of the NKX2.2 and / or PAX4 marker exceeds the expression of the AFP marker, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, and / or PAX6, calculated independently of the feeder cells.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки млекопитающих, дифференцированные из дефинитивной энтодермы in vitro, такие как клетки человека, дифференцированные из дефинитивной энтодермы in vitro, где экспрессия маркера NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 2% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro. В других вариантах осуществления экспрессия маркера NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 5% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro, до по меньшей мере примерно на 98% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro.Additional embodiments of the present invention relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising mammalian cells differentiated from a definitive endoderm in vitro, such as human cells differentiated from a definitive endoderm in vitro, wherein the expression of the marker NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 by at least about 2% of cells differentiated from the definitive endoderm in vitro. In other embodiments, the expression of the marker NGN3, NKX2.2 and / or PAX4 exceeds the expression of the marker AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6 by at least about 5% of cells differentiated from definitive endoderm in vitro to at least about 98% of cells differentiated from definitive endoderm in vitro.

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие эндокринные клетки-предшественники, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения популяции клеток или культуры клеток эндокринных клеток-предшественников, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, проявляющих значительную экспрессию маркеров AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM. В некоторых вариантах осуществления популяции или культуры эндокринных клеток-предшественников, полученные способами, описанными в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, проявляющих значительную экспрессию маркеров AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6.Using the methods described in this application, you can get compositions containing endocrine progenitor cells, essentially free of other types of cells. In some embodiments, implementation of the present invention, cell populations or cell cultures of endocrine progenitor cells obtained by the methods described in this application are substantially free of cells exhibiting significant expression of markers AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM. In some embodiments, endocrine progenitor cell populations or cultures obtained by the methods described herein are substantially free of cells exhibiting significant expression of markers AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL and / or PAX6.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения описание эндокринной клетки-предшественника на основании экспрессии маркеров является следующим: NGN3 high, NKX2.2 high, PAX4 high, AFP low, SOX7 low, SOX1 low, ZIC1 low NFM low, MAFA low; SYP low; CHGA low; INS low, GCG low, SST low, GHRL low и/или PAX6 low.In one embodiment of the present invention, the description of an endocrine progenitor cell based on the expression of markers is as follows: NGN3 high, NKX2.2 high, PAX4 high, AFP low, SOX7 low, SOX1 low, ZIC1 low NFM low, MAFA low; SYP low; CHGA low; INS low, GCG low, SST low, GHRL low and / or PAX6 low.

Получение незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островковProduction of immature hormone-expressing cells of pancreatic islets

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков из плюрипотентных клеток. Как описано выше, незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков можно получить сначала путем дифференцировки плюрипотентных клеток до получения клеток дефинитивной энтодермы, дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы до получения клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, дифференцировки энтодермы передней части пищеварительного тракта до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, а затем дополнительной дифференцировки клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта до получения эндокринных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления способ продолжают путем обеспечения дальнейшей дифференцировки эндокринных клеток-предшественников до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков.The embodiments described herein relate to methods for producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells from pluripotent cells. As described above, immature hormone-expressing cells of pancreatic islets can be obtained first by differentiating pluripotent cells to obtain definitive endoderm cells, differentiating definitive endoderm cells to obtain endoderm cells of the anterior part of the digestive tract, differentiating endoderm of the anterior digestive tract-positive endoderm cells. the anterior part of the digestive tract, and then additional differentiation of PDX1-positive endoderm cells of the anterior part of the digestive tract to obtain endocrine progenitor cells. In some embodiments, the method continues by allowing further differentiation of endocrine progenitor cells to immature hormone-expressing pancreatic islet cells.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дифференцировку из эндокринных клеток-предшественников до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков осуществляют путем продолжения инкубации культуры эндокринных клеток-предшественников с ингибитором гамма-секретазы в течение времени, достаточного, чтобы клетки по существу прекратили экспрессию NGN3, и начали экспрессию РАХ6, и чтобы клетки стали способными к экспрессии по меньшей мере одного гормона клеток панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы удаляют спустя примерно 1 день, примерно 2 дня, примерно 3 дня, примерно 4 дня, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 7 дней, примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней, или больше чем примерно 10 дней после индукции эндокринных клеток-предшественников. В предпочтительном варианте осуществления ингибитором гамма-секретазы является N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир (DAPT).In some embodiments, differentiation from endocrine progenitor cells to immature hormone-expressing pancreatic islet cells is accomplished by continuing to incubate the endocrine progenitor cell culture with a gamma secretase inhibitor for a time sufficient for the cells to substantially stop expressing NGN3 and begin expression of PAX6, and that the cells become capable of expressing at least one hormone from pancreatic islet cells. In some embodiments, the gamma-secretase inhibitor is removed after about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days, or more than about 10 days after induction of endocrine progenitor cells. In a preferred embodiment, the gamma secretase inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)] - S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).

Некоторые способы получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, раскрытые в настоящей заявке, опосредованы путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток, содержащей эндокринные клетки-предшественники человека, с одним или несколькими факторами, выбранными из группы, состоящей из никотинамида, эксендина 4, фактора роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF1). В некоторых вариантах осуществления все четыре вышеуказанных фактора обеспечиваются вместе. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вышеуказанных факторов обеспечивают для культуры клеток перед дифференцировкой эндокринных клеток-предшественников, и оставляют в культуре клеток во время дифференцировки по меньшей мере части клеток в культуре клеток до эндокринных клеток-предшественников. В других вариантах осуществления один или несколько вышеуказанных факторов обеспечивают в культуре клеток во время или близко к времени дифференцировки существенной части клеток в эндокринные клетки-предшественники, и оставляют в культуре клеток, пока по меньшей мере существенная часть клеток не дифференцируется в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько вышеописанных факторов обеспечивают в начале процесса дифференцировки, на стадии плюрипотентных стволовых клеток, и оставляют в культуре клеток на протяжении дифференцировки до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков.Certain methods for producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells disclosed herein are mediated by providing a cell culture or cell population containing human endocrine progenitor cells with one or more factors selected from the group consisting of nicotinamide, exendin 4, factor hepatocyte growth (HGF), insulin-like growth factor-1 (IGF1). In some embodiments, all four of the above factors are provided together. In some embodiments, one or more of the above factors are provided for cell culture prior to differentiation of endocrine progenitor cells, and are left in cell culture during differentiation of at least a portion of cells in cell culture to endocrine progenitor cells. In other embodiments, one or more of the above factors are provided in cell culture at or near the time of differentiation of a substantial portion of the cells into endocrine progenitor cells, and are left in cell culture until at least a substantial portion of the cells differentiate into immature hormone-expressing cells pancreatic islets. In some embodiments, implementation of the present invention, one or more of the above-described factors are provided at the beginning of the differentiation process, at the stage of pluripotent stem cells, and left in cell culture during differentiation to immature hormone-expressing cells of the pancreatic islets.

В некоторых способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, никотинамид, никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD) или никотиновую кислоту обеспечивают для клеток так, чтобы они присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления никотинамид присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 0,1 мМ, по меньшей мере примерно 0,5 мМ, до 1000 мМ.In some methods for producing immature pancreatic islet hormone expressing cells described herein, nicotinamide, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), or nicotinic acid is provided to cells to be present in a cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate differentiation of at least a portion of the endocrine progenitor cells into immature hormone-expressing cells of the pancreatic islets. In some embodiments, nicotinamide is present in a cell culture or cell population at a concentration of at least about 0.1 mM, at least about 0.5 mM, up to 1000 mM.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, эксендин 4 обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления эксендин 4 присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл до 1000 нг/мл.In other methods of producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells described herein, Exendin 4 is provided to cells to be present in a cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate the differentiation of at least a portion of endocrine progenitor cells into immature hormone-expressing cells of pancreatic islets. In some embodiments, Exendin 4 is present in a cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng / ml, at least about 5 ng / ml to 1000 ng / ml.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, HGF обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления HGF присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл до 1000 нг/мл.In other methods for producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells described herein, HGF is provided to cells to be present in a cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate the differentiation of at least a portion of the endocrine progenitor cells into immature hormone -expressing cells of the pancreatic islets. In some embodiments, HGF is present in a cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng / ml, at least about 5 ng / ml to 1000 ng / ml.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, IGF1 обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления IGF1 присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.In other methods for producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells described herein, IGF1 is provided to cells to be present in a cell culture or cell population at concentrations sufficient to stimulate the differentiation of at least a portion of endocrine progenitor cells into immature hormone -expressing cells of the pancreatic islets. In some embodiments, IGF1 is present in a cell culture or cell population at a concentration of at least about 1 ng / ml to 1000 ng / ml.

В некоторых вариантах осуществления способов получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, как описано в настоящей заявке, один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1 обеспечивают после удаления из культур клеток одного или нескольких ранее обеспеченных факторов дифференцировки. В других вариантах осуществления один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1 обеспечивают для культуры клеток или популяции клеток, содержащей один или несколько факторов дифференцировки, которые обеспечены раньше, или обеспечены примерно в то же самое время, как один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1. В предпочтительных вариантах осуществления факторы дифференцировки, которые обеспечены раньше, или обеспечены примерно в то же самое время, как один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1, включают DAPT, FGF-10, KAAD-циклопамин, активин А, активин В, ВМР4 и/или RA, но не ограничиваются ими.In some embodiments of the methods for producing immature hormone-expressing pancreatic islet cells as described herein, one or more of nicotinamide, Exendin 4, HGF, and IGF1 is provided after one or more previously provided differentiation factors are removed from cell cultures. In other embodiments, one or more of nicotinamide, exendin 4, HGF, and IGF1 is provided for a cell culture or cell population containing one or more differentiation factors that are provided earlier or provided at about the same time as one or more of nicotinamide , exendin 4, HGF and IGF1. In preferred embodiments, differentiation factors that are provided earlier or provided at about the same time as one or more of nicotinamide, Exendin 4, HGF and IGF1 include DAPT, FGF-10, KAAD-cyclopamine, activin A, activin B , BMP4 and / or RA, but are not limited to them.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащие клетки человека, включая незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков человека, где экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, РАХ6, NEUROD, PDX1, НВ9, GHRL, LAPP, INS GCG, SST, PP и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM по меньшей мере в 2% клеток человека. В других вариантах осуществления экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, РАХ6, NEUROD, PDX1, НВ9, GHRL, IAPP INS GCG, SST, РР и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM по меньшей мере в 5% клеток человека, по меньшей мере примерно от 10% клеток человека до 95% клеток человека, или по меньшей мере примерно в 98% клеток человека.Other embodiments of the present invention relate to compositions such as cell cultures or cell populations containing human cells, including immature hormone-expressing cells of human pancreatic islets, where the expression of the marker MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, LAPP, INS GCG, SST, PP and / or C-peptide exceeds the expression of the marker NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM by at least 2% human cells. In other embodiments, the expression of the MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP INS GCG, SST, PP and / or C-peptide marker exceeds the expression of the NGN3, MAFA, MOX1 marker, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM in at least 5% of human cells, at least about 10% of human cells to 95% of human cells, or at least about 98% of human cells.

В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культур клетоках или популяциях, где экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, РАХ6, NEUROD, PDX1, НВ9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, РР и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM, рассчитывают независимо от фидерных клеток.In some embodiments, the percentage of human cells in cell cultures or populations where the expression of the marker MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, PP and / or C β-peptide exceeds the expression of the marker NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 and / or NFM, calculated independently of the feeder cells.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, также включают среду, содержащую один или несколько секретируемых гормонов, выбранных из грелина, инсулина, соматостатина и/или глюкагона. В других вариантах осуществления среда содержит С-пептид. В предпочтительном варианте осуществления концентрация одного или нескольких секретируемых гормонов или С-пептида в среде находится в диапазоне от по меньшей мере примерно 1 пмоль грелина, инсулина, соматостатина, глюкагона или С-пептида на мкг клеточной ДНК до по меньшей мере примерно 1000 пикомоль (пмоль) грелина, инсулина, соматостатина, глюкагона или С-пептида на мкг клеточной ДНК.In some embodiments, implementation of the present invention, cell cultures and / or cell populations containing immature hormone-expressing cells of pancreatic islets also include a medium containing one or more secreted hormones selected from ghrelin, insulin, somatostatin and / or glucagon. In other embodiments, the medium comprises a C-peptide. In a preferred embodiment, the concentration of one or more secreted hormones or C-peptide in the medium ranges from at least about 1 pmol of ghrelin, insulin, somatostatin, glucagon, or C-peptide per μg of cellular DNA to at least about 1000 pmol (pmol ) ghrelin, insulin, somatostatin, glucagon, or C-peptide per μg of cellular DNA.

Способ получения инсулина in vivoMethod for producing insulin in vivo

В некоторых вариантах осуществления полученные in vitro панкреатические клетки-предшественники или типы клеток PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы, или их эквиваленты, описанные выше, трансплантируют млекопитающему субъекту. Эти способы подробно описаны в Международной заявке PCT/US 2007/015536, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим субъектом является субъект-человек. Особо предпочтительными субъектами являются те, кто признан имеющим состояние, ограничивающее способность субъекта к получения достаточных уровней инсулина в ответ на физиологически высокие концентрации глюкозы в крови. Диапазон уровней глюкозы в крови, представляющий физиологически высокий уровень глюкозы крови для какого-либо конкретного вида млекопитающий может легко определить рядовой специалист в данной области техники. Любой стойкий уровень глюкозы в крови, приводящий к выраженному заболеванию или состоянию, считается физиологически высоким уровнем глюкозы в крови.In some embodiments, the in vitro derived pancreatic progenitor cells or PDX-1 positive pancreatic endoderm cell types, or their equivalents, as described above, are transplanted into a mammalian subject. These methods are described in detail in International Application PCT / US 2007/015536 entitled "Methods for producing pancreatic hormones", which is fully incorporated herein by reference. In a preferred embodiment, the mammalian subject is a human subject. Particularly preferred subjects are those who are determined to have a condition that limits the subject's ability to obtain sufficient insulin levels in response to physiologically high blood glucose concentrations. The range of blood glucose levels representing the physiologically high blood glucose level for any particular mammalian species can be readily determined by one of ordinary skill in the art. Any persistent blood glucose level resulting in significant disease or condition is considered physiologically high blood glucose levels.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к клетке, секретирующей инсулин in vivo, полученной из in vitro плюрипотентной стволовой клетки или ее потомства, например, мультипотентным клеткам, таким как клетка PDX-1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, клетка PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатическая прогениторная клетка, эндокринный предшественник, такой как NGN3-позитивный эндокринный предшественник, или функциональная дифференцированная гормон-секретирующая клетка, такая как инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, грелин- или панкреатический полипептид-секретирующая клетка. Любые из вышеописанных окончательно дифференцированных или мультипотентных клеток могут быть трансплантированы хозяину, или млекопитающему, и созревать в физиологически функциональные гормон-секретирующие клетки, такие как инсулин-секретирующие клетки, в ответ на высокие уровни глюкозы в крови хозяина. В предпочтительных вариантах осуществления клетки не образуют тератомы in vivo, и если она формируется, остаются локализованными в области трансплантата и могут легко быть отделены или удалены. В особо предпочтительных вариантах осуществления клетки не содержат какой-либо кариотипической аномалии во время процесса дифференцировки in vitro, или при трансплантации млекопитающему in vivo, или при созревании и развитии в функциональные островки in vivo.Additional embodiments of the present invention relate to an in vivo insulin secreting cell derived from an in vitro pluripotent stem cell or its progeny, for example, multipotent cells such as PDX-1 positive endoderm cell of the anterior digestive tract, PDX-1 positive pancreatic cell an endoderm or pancreatic progenitor cell, an endocrine precursor such as an NGN3-positive endocrine precursor, or a functionally differentiated hormone-secreting cell such as an insulin-, glucagon-, somatostatin-, ghrelin-, or pancreatic polypeptide-secreting cell. Any of the above definitively differentiated or multipotent cells can be transplanted into a host, or mammal, and mature into physiologically functional hormone-secreting cells, such as insulin-secreting cells, in response to the host's high blood glucose levels. In preferred embodiments, the cells do not form teratomas in vivo, and if they do, remain localized to the graft site and can be easily detached or removed. In particularly preferred embodiments, the cells do not contain any karyotypic abnormality during the in vitro differentiation process, or when transplanted into a mammal in vivo, or during maturation and development into functional islets in vivo.

Далее, хотя варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к сконструированной или генетически рекомбинантной плюрипотентной клетке, мультипотентной или дифференцированной клетке, полученной из плюрипотентной клетки, такой как iPS клетка человека, на основе описания, обеспеченного в настоящей заявке, предполагается, что поскольку iPS клетки демонстрируют схожую физиологию и профили экспрессии маркерных генов с hES клетками и полученными из hES клетками, то они должны иметь схожие физиологические характеристики in vivo.Further, although the embodiments described in this application relate to an engineered or genetically recombinant pluripotent cell, a multipotent or differentiated cell derived from a pluripotent cell such as a human iPS cell, based on the description provided herein, it is assumed that since the iPS Since cells show similar physiology and expression profiles of marker genes to hES cells and hES-derived cells, they should have similar physiological characteristics in vivo.

Способ инкапсулирования панкреатических прогениторовMethod for encapsulating pancreatic progenitors

В некоторых вариантах осуществления композиция плюрипотентных, мультипотентных и дифференцированных клеток, описанная в настоящей заявке, может быть инкапсулирована в биологическом и/или не-биологическом механическом устройстве, где инкапсулирующее устройство отделяет и/или изолирует композиции клеток от хозяина.In some embodiments, the pluripotent, multipotent and differentiated cell composition described herein can be encapsulated in a biological and / or non-biological mechanical device, where the encapsulating device separates and / or isolates the cell composition from the host.

Способы инкапсулирования подробно описаны в заявке США №61/114,857, поданной 14 ноября 2008, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических прогениторов, полученных из HES клеток», и заявке США №61/121,086, поданной 12 декабря 2008, озаглавленной «Инкапсулирование клеток панкреатической энтодермы», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, и которые описывают инкапсулирование клеток панкреатической энтодермы с применением полупроницаемой мембраны, например, устройства Theracyte™ или Gore.Encapsulation methods are described in detail in US Application No. 61 / 114,857, filed November 14, 2008, entitled "Encapsulation of Pancreatic Progenitors Derived from HES Cells," and US Application No. 61 / 121,086, filed December 12, 2008, entitled "Encapsulation of Pancreatic Endoderm Cells" which are fully incorporated into this description by reference, and which describe the encapsulation of cells of the pancreatic endoderm using a semipermeable membrane, for example, a Theracyte ™ or Gore device.

В одном варианте осуществления клетки, полученные из hES, инкапсулируют с применением биосовместимого полиэтиленгликоля (PEG). Инкапсулирование на основе PEG описано более подробно в патенте США №7,427,415, озаглавленной «Имплантация инкапсулированных биологических материалов для лечения заболеваний»; патенте США №6,911,227, озаглавленном «Гели для инкапсулирования биологических материалов»; и патентах США №№6,911,227, 5,529,914, 5,801,033, 6,258,870, озаглавленных «Гели для инкапсулирования биологических материалов», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, и которые описывают конформное покрытие агрегатов клеток с применением полиэтиленгликоля.In one embodiment, cells derived from hES are encapsulated using biocompatible polyethylene glycol (PEG). PEG-based encapsulation is described in more detail in US Pat. No. 7,427,415, entitled "Implantation of Encapsulated Biological Materials for the Treatment of Diseases"; US Pat. No. 6,911,227 entitled "Gels for Encapsulating Biological Materials"; and US Patent Nos. 6,911,227, 5,529,914, 5,801,033, 6,258,870, entitled "Gels for Encapsulating Biological Materials," which are hereby incorporated by reference in their entirety, and which describe the conformal coating of cell aggregates using polyethylene glycol.

В одном варианте осуществления устройство для инкапсулирования содержит клетки, полученные из плюрипотентных, например, клетки PDX-1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, клетки PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы или прогениторные клетки, эндокринный предшественник, такой как NGN3-позитивный эндокринный предшественник, или функционально дифференцированные гормон-секретирующие клетки, такие как инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, грелин-, или панкреатический полипептид-секретирующие клетки, в полупроницаемой мембране, предотвращающей проникновение трансплантированной популяции клеток, хранящейся в устройстве, и в то же самое время обеспечивающий проход некоторых секретируемых полипептидов, например, инсулина, глюкагона, соматостатина, грелина, панкреатического полипептида и тому подобного. Альтернативно, устройство имеет множество мембран, включая васкуляризованную мембрану.In one embodiment, the encapsulating device comprises pluripotent-derived cells, e.g., PDX-1 positive endoderm cells of the anterior digestive tract, PDX-1 positive pancreatic endoderm cells, or progenitor cells, an endocrine progenitor such as NGN3-positive endocrine precursor , or functionally differentiated hormone-secreting cells, such as insulin-, glucagon-, somatostatin-, ghrelin-, or pancreatic polypeptide-secreting cells, in a semipermeable membrane preventing the penetration of the transplanted cell population stored in the device, and at the same time allowing passage of certain secreted polypeptides, for example, insulin, glucagon, somatostatin, ghrelin, pancreatic polypeptide, and the like. Alternatively, the device has multiple membranes, including a vascularized membrane.

Применение агентов для усиления и индукции роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток плюрипотентных стволовых клеток человека, например, hES клеток и iPS клетокUse of agents to enhance and induce growth, survival, proliferation and adhesion of human pluripotent stem cells, e.g. hES cells and iPS cells

На клеточную регуляцию можно влиять путем трансдукции экстрацеллюлярного сигнала через мембрану, что в свою очередь модулирует биохимические пути в клетке. Фосфорилирование белков представляет один вариант, при котором внутриклеточные сигналы передаются от молекулы к молекуле, в итоге приводя к клеточному ответу. Эти каскады трансдукции сигнала являются высоко регулируемыми, и часто перекрываются, о чем свидетельствует существование многих киназ, а также фосфатаз. Отмечалось, что у человека белковые тирозинкиназы, как известно, играют существенную роль в развитии многих патологических состояний, включая диабет, рак, а также связаны с широким рядом врожденных синдромов. Серин-треонин-киназы, например, Rho киназы, являются классом ферментов, ингибирование которых может быть пригодным для лечения заболеваний человека, включая диабет, рак и множество сердечнососудистых заболеваний и СПИД. Большинство ингибиторов, идентифицированных на сегодняшний день, действуют на участок связывания АТФ. Такие конкурирующие с АТФ ингибиторы продемонстрировали селективность благодаря своей способности к нацеливанию на менее консервативные области участка связывания АТФ.Cell regulation can be influenced by transduction of an extracellular signal across the membrane, which in turn modulates biochemical pathways in the cell. Phosphorylation of proteins is one variation in which intracellular signals are transmitted from molecule to molecule, eventually leading to a cellular response. These signal transduction cascades are highly regulated and often overlap, as evidenced by the existence of many kinases as well as phosphatases. It was noted that in humans, protein tyrosine kinases are known to play an essential role in the development of many pathological conditions, including diabetes, cancer, and are also associated with a wide range of congenital syndromes. Serine threonine kinases, for example Rho kinases, are a class of enzymes whose inhibition may be useful in the treatment of human diseases, including diabetes, cancer, and a variety of cardiovascular diseases and AIDS. Most of the inhibitors identified to date act on the ATP binding site. Such ATP-competing inhibitors have shown selectivity due to their ability to target less conserved regions of the ATP binding site.

Семейство Rho киназы малых ГТФ-связывающих белков содержит по меньшей мере 10 членов, включая Rho А-Е и G, Rac 1 и 2, Cdc42, и ТС10. Ингибиторы часто обозначаются как ROK или ROCK ингибиторы, или ингибиторы Rho-киназы, и термины применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке. Эффекторные домены RhoA, RhoB, и RhoC имеют одну и ту же аминокислотную последовательность, и по-видимому, имеют схожие внутриклеточные мишени. Rho киназа действует в качестве первичного медиатора, регулирующего последующие звенья каскада Rho, и существует в двух изоформах: α (ROCK2) и β (ROCK1). Белки семейства Rho киназы имеют каталитический (киназный) домен в их N-концевом домене, суперспиральный домен в средней части, и гипотетический плекстрин-гомологичный (РН) домен в С-концевом участке. Rho-связывающий домен ROCK локализован в С-концевой части суперспирального домена, и связывание ГТФ-связанной формы Rho приводит к повышению киназной активности. Rho/Rho-киназа-опосредованный путь играет важную роль в передаче сигнала, инициированной многими агонистами, включая ангиотензин II, серотонин, тромбин, эндотелии-1, норадреналин, тромбоцитарный фактор роста, АТФ/АДФ и экстрацеллюлярные нуклеотиды, и уротензин II. Через модуляцию своих целевых эффекторов/субстратов Rho киназа играет важную роль в различных функциях клетки, включая сокращение гладких мышц, организацию актинового цитоскелета, адгезию клеток и подвижность, и экспрессию генов. Благодаря роли, которую Rho киназные белки играют в опосредовании ряда функций клеток, считающихся связанными с патогенезом атеросклероза, ингибиторы этих киназ могут также быть пригодными для лечения или профилактики различных атеросклеротических сердечнососудистых заболеваний, и вовлечены в сокращение эндотелия.The Rho kinase family of small GTP binding proteins contains at least 10 members, including Rho AE and G, Rac 1 and 2, Cdc42, and TC10. Inhibitors are often referred to as ROK or ROCK inhibitors, or Rho kinase inhibitors, and the terms are used interchangeably in this application. The effector domains RhoA, RhoB, and RhoC share the same amino acid sequence and appear to have similar intracellular targets. Rho kinase acts as a primary mediator regulating downstream Rho cascade and exists in two isoforms: α (ROCK2) and β (ROCK1). Proteins of the Rho kinase family have a catalytic (kinase) domain in their N-terminal domain, a supercoiled domain in the middle, and a hypothetical plextrin-homologous (PH) domain in the C-terminal region. The Rho-binding domain of ROCK is located in the C-terminal part of the supercoiled domain, and the binding of the GTP-bound form of Rho leads to an increase in kinase activity. The Rho / Rho kinase-mediated pathway plays an important role in signal transduction initiated by many agonists, including angiotensin II, serotonin, thrombin, endothelium-1, norepinephrine, platelet-derived growth factor, ATP / ADP and extracellular nucleotides, and urotensin II. Through modulation of its target effectors / substrates, Rho kinase plays an important role in various cell functions, including smooth muscle contraction, actin cytoskeleton organization, cell adhesion and motility, and gene expression. Due to the role that Rho kinase proteins play in mediating a number of cell functions believed to be associated with the pathogenesis of atherosclerosis, inhibitors of these kinases may also be useful in the treatment or prevention of various atherosclerotic cardiovascular diseases and are involved in endothelial contraction.

В некоторых вариантах осуществления агенты, которые стимулируют и/или поддерживают рост клеток, выживание, пролиферацию и адгезию клеток, добавляют в различные среды для культивирования клеток, включая ингибиторы Rho-киназы Y-27632, Fasudil (также обозначаемый как НА1077), Н-1152Р и ITS (инсулин/трансферрин/селен; Gibco), Wf-536, Y-30141 (описан в патенте США №5,478,838, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки) и их производные, и антисмысловую нуклеиновую кислоту для ROCK; нуклеиновую кислоту, индуцирующую интерференцию РНК (например, миРНК), конкурирующие пептиды, пептиды-антагонисты, ингибирующие антитела, ScFV-фрагменты антител, доминантно-негативные варианты, и их векторы экспрессии, но не ограничиваясь ими. Далее, поскольку другие низкомолекулярные соединения известны как ингибиторы ROCK, такие соединения или их производные также можно применять в настоящем изобретении (например, см. патентные заявки США №№20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 и 20030087919, и Международные патентные публикации №№2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 и 2004/039796, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки).In some embodiments, agents that stimulate and / or support cell growth, survival, proliferation, and cell adhesion are added to a variety of cell culture media, including Rho kinase inhibitors Y-27632, Fasudil (also referred to as HA1077), H-1152P and ITS (insulin / transferrin / selenium; Gibco), Wf-536, Y-30141 (described in US patent No. 5,478,838, fully incorporated herein by reference) and derivatives thereof, and antisense nucleic acid for ROCK; nucleic acid that induces RNA interference (eg, siRNA), competing peptides, antagonist peptides, inhibitory antibodies, ScFV antibody fragments, dominant negative variants, and their expression vectors, but not limited to them. Further, since other low molecular weight compounds are known as ROCK inhibitors, such compounds or derivatives thereof can also be used in the present invention (for example, see U.S. Patent Application Nos. 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 and 20030087919, and International Patent Publications Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 and 2004/039796, which are fully incorporated into this description by reference).

В настоящем изобретении можно также применять комбинацию одного или двух или более ингибиторов ROCK. Эти агенты функционируют, в свою очередь, путем стимуляции ре-ассоциации диссоциированных hES клеток, iPS или дифференцированных культур клеток, например, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, панкреатической энтодермы, панкреатического эпителия, популяций панкреатических прогениторов, эндокринных прогениторов и популяций, и тому подобного. Подобным образом, агенты могут функционировать, когда диссоциация клеток не происходит. Увеличение роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток плюрипотентных стволовых клеток человека достигалось независимо от того, были ли клетки получены из агрегатов клеток в суспензии или из адгезионных культур (с компонентами экстрацеллюлярного матрикса или без низ, с сывороткой или без нее, с фидерными фибробластами или без них, с FGF или без него, с активином или без него). Повышение выживания этих популяций клеток облегчает и улучшает системы очистки с применением сортера клеток, таким образом, повышает выход клеток. Применение ингибиторов Rho киназы, таких как Y27632, может обеспечивать экспансию дифференцированных типов клеток, а также стимуляцию их выживания во время пассажей диссоциированных единичных клеток или криоконсервирования. Хотя ингибиторы Rho киназы, такие как Y27632, тестировали на плюрипотентных стволовых клетках человека (например, hES и iPS клетках), и клетках, дифференцированных из них, ингибиторы Rho киназы можно применять для других типов клеток, например, в целом, эпителиальных клеток, включая клетки тонкой кишки, легких, тимуса, почки, но не ограничиваясь ими, а также нервных типов клеток, таких как пигментный эпителий сетчатки.A combination of one or two or more ROCK inhibitors can also be used in the present invention. These agents function, in turn, by stimulating the re-association of dissociated hES cells, iPS, or differentiated cell cultures, for example, definitive endoderm, anterior endoderm, pancreatic endoderm, pancreatic epithelium, pancreatic progenitor populations, endocrine progenitors, and population progenitors. the like. Likewise, agents can function when cell dissociation does not occur. An increase in the growth, survival, proliferation and adhesion of human pluripotent stem cells was achieved regardless of whether the cells were obtained from cell aggregates in suspension or from adherent cultures (with or without extracellular matrix components, with or without serum, with feeder fibroblasts or without them, with or without FGF, with or without activin). Enhancing the survival of these cell populations facilitates and improves cell sorter purification systems, thus increasing cell yield. The use of Rho kinase inhibitors, such as Y27632, can promote the expansion of differentiated cell types, as well as stimulate their survival during the passage of dissociated single cells or cryopreservation. Although Rho kinase inhibitors such as Y27632 have been tested on human pluripotent stem cells (e.g. hES and iPS cells) and cells differentiated therefrom, Rho kinase inhibitors can be applied to other cell types, e.g., epithelial cells in general, including cells of the small intestine, lungs, thymus, kidney, but not limited to them, as well as nerve cell types such as the retinal pigment epithelium.

Концентрация ингибитора ROCK в среде для культивирования клеток не ограничивается той, что описана в примерах ниже, с условием, что концентрация позволяет достичь необходимых эффектов, таких как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток. Специалисту в данной области техники понятно, что может быть необходима оптимизация различных ингибиторов ROCK в различных условиях. Например, при использовании Y-27632 предпочтительная концентрация может быть в диапазоне примерно от 0,01 до 1000 мкМ, более предпочтительно примерно от 0,1 до 100 мкм, и еще более предпочтительно примерно от 1,0 до 50 мкМ, и наиболее предпочтительно примерно от 5 до 20 мкМ. Когда применяют Fasudil/HA1077, его можно использовать в концентрации, превышающей примерно в два или три раза концентрацию вышеупомянутого Y-27632. Когда применяют Н-1152, его можно применять в концентрации, составляющей, например, около 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 или 1/60 от концентрации вышеупомянутого Y-27632. Концентрация используемого ингибитора ROCK зависит отчасти от биологической активности и мощности ингибитора, и условий, в которых его применяют.The concentration of the ROCK inhibitor in the cell culture medium is not limited to that described in the examples below, provided that the concentration achieves the desired effects such as enhancing, enhancing and / or stimulating cell growth, survival, proliferation and adhesion. One skilled in the art will understand that it may be necessary to optimize different ROCK inhibitors under different conditions. For example, when using Y-27632, the preferred concentration may be in the range of about 0.01 to 1000 μM, more preferably from about 0.1 to 100 μM, and even more preferably from about 1.0 to 50 μM, and most preferably about from 5 to 20 μM. When Fasudil / HA1077 is used, it can be used at a concentration of about two or three times that of the aforementioned Y-27632. When H-1152 is used, it can be used at a concentration of, for example, about 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, or 1/60 of the concentration of the aforementioned Y-27632. The concentration of ROCK inhibitor used depends in part on the biological activity and potency of the inhibitor and the conditions under which it is used.

Время и период лечения ингибитором ROCK может быть ограниченным или не ограниченным, в зависимости от необходимых эффектов, таких как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации (клеточной массы) и адгезии клеток. Однако добавление ингибитора ROCK может также влиять на дифференцировку необычным образом, как лучше описано в Примере 7. Примеры внизу описывают культуры плюрипотентных стволовых клеток человека и/или культуры дифференцированных клеток, обработанных в течение примерно 12 часов, 24 часов, 48 часов или больше.The time and period of treatment with the ROCK inhibitor may or may not be limited, depending on the desired effects, such as enhancement, enhancement and / or stimulation of growth, survival, proliferation (cell mass) and cell adhesion. However, the addition of a ROCK inhibitor can also affect differentiation in an unusual way, as best described in Example 7. The examples below describe human pluripotent stem cell cultures and / or differentiated cell cultures treated for about 12 hours, 24 hours, 48 hours or more.

Плотность культур плюрипотентных стволовых клеток человека, обработанных ингибитором ROCK, также не ограничена, если при этой плотности достигаются необходимые эффекты, такие как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток. Плотность засеянных клеток можно регулировать в зависимости от множества факторов, включая применение адгезионных или суспензионных культур, специфическую рецептуру используемой среды для культивирования, условия роста и предполагаемое применение культивируемых клеток, но не ограничиваясь ими. Примеры плотности культур клеток включают 0,01×10⁵ клеток/мл, 0,05×10⁵ клеток/мл, 0,1×10⁵ клеток/мл, 0,5×10⁵ клеток/мл, 1,0×10⁵ клеток/мл, 1,2×10⁵ клеток/мл, 1,4×10⁵ клеток/мл, 1,6×10⁵ клеток/мл, 1,8×10⁵ клеток/мл, 2,0×10⁵ клеток/мл, 3,0×10⁵ клеток/мл, 4,0×10⁵ клеток/мл, 5,0×10⁵ клеток/мл, 6,0×10⁵ клеток/мл, 7,0×10⁵ клеток/мл, 8,0×10⁵ клеток/мл, 9,0×10⁵ клеток/мл, или 10,0×10⁵ клеток/мл, или больше, например, до 5×10⁷ клеток/мл, или любое значение между ними, но не ограничиваясь ими, при культивировании с хорошим ростом клеток, выживанием, пролиферацией и адгезией.The density of human pluripotent stem cell cultures treated with a ROCK inhibitor is also not limited as long as the desired effects such as enhancement, enhancement and / or stimulation of growth, survival, proliferation and cell adhesion are achieved at this density. The density of the seeded cells can be controlled depending on many factors, including, but not limited to, the use of adherent or suspension cultures, the specific formulation of the culture medium used, the growth conditions, and the intended use of the cultured cells. Examples of cell culture density include 0.01 × 10 ⁵ cells / ml, 0.05 × 10 ⁵ cells / ml, 0.1 × 10 ⁵ cells / ml, 0.5 × 10 ⁵ cells / ml, 1.0 × 10 ⁵ cells / ml, 1.2 × 10 ⁵ cells / ml, 1.4 × 10 ⁵ cells / ml, 1.6 × 10 ⁵ cells / ml, 1.8 × 10 ⁵ cells / ml, 2.0 × 10 ⁵ cells / ml, 3.0 × 10 ⁵ cells / ml, 4.0 × 10 ⁵ cells / ml, 5.0 × 10 ⁵ cells / ml, 6.0 × 10 ⁵ cells / ml, 7.0 × 10 ⁵ cells / ml, 8.0 × 10 ⁵ cells / ml, 9.0 × 10 ⁵ cells / ml, or 10.0 × 10 ⁵ cells / ml, or more, for example, up to 5 × 10 ⁷ cells / ml, or any value between, but not limited to, when cultured with good cell growth, survival, proliferation, and adhesion.

Применение агентов, активирующих члены семейства рецептора TGFβUses of Agents Activating Members of the TGFβ Receptor Family

В другом варианте осуществления агенты, активирующие член семейства рецептора TGFβ, включают члены TGFβ суперсемейства факторов роста, как описано в настоящей заявке. Термин «член суперсемейства TGFβ», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означают более 30 структурно связанных белков, включая субсемейства, включающие TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, ВМР-15, ВМР-16, ВМР-3, GDF-10, ВМР-9, ВМР-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8, ВМР-2, ВМР-4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, активины βС, βЕ, βА и βВ, ВМР-14, GDF-14, MIS, ингибин-альфа, Lefty1, Lefty2, GDNF, нейротурин, персефин и артемин. См. Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6):787-823.In another embodiment, agents that activate a member of the TGFβ receptor family include members of the TGFβ superfamily of growth factors, as described herein. The term "TGFβ superfamily member" as used herein, or its equivalents, means more than 30 structurally related proteins, including subfamilies including TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP- 4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, activins βC, βE, βA and βB, BMP-14, GDF-14, MIS, inhibin-alpha, Lefty1, Lefty2, GDNF, neuroturin, persephin and artemin. See Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23 (6): 787-823.

Член семейства TGFβ может быть замещен, или использован в сочетании с активатором пути передачи сигналов TGFβ, который является соединением, стимулирующим один или несколько полипептидов или взаимодействий, участвующих в трансдукции или ином осуществлении изменений свойств клетки в ответ на член семейства TGFβ. Путь передачи сигнала TGFβ включает сами члены семейства TGFβ. Члены суперсемейства TGFβ передают сигналы к ядру путем передачи сигнала через рецепторы серин-треонин-киназы II и I типа и внутриклеточные эффекторы, известные как Smad. Эти рецепторы относятся к двум субсемействам, известным как рецепторы I и II типа, которые совместно действуют для связывания лиганда и передачи сигнала (Attisano et al., Mol Cell Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). Лиганды связывают рецепторы I и II типа на поверхности клеток, стимулируя активацию рецептора I типа через фосфорилирование. Этот активированный комплекс, в свою очередь, активирует внутриклеточные Smad, которые собирают мульти-субъединичные комплексы, регулирующие транскрипцию. Члены суперсемейства TGFβ разделяются на две подгруппы передачи сигнала: те, чья функция связана с TGFβ/активином, и те, чья функция связана с субсемейством BMP/GDF. Считают, что большинство лигандов TGFβ связываются вначале с рецептором II типа, и этот комплекс лиганд/рецептор II типа затем рекрутирует или фосфорилирует рецептор I типа (Mathews, L S, Endocr Rev 15:310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). Киназа рецептора II типа фософрилирует и активирует киназу рецептора I типа, которая затем фосфорилирует и активирует белки Smad. Лиганды TGFβ/активин связываются с рецепторами II типа TGFβ и активина, и могут активировать Smad-2 и -3, Nodal и Lefty сигнал посредством этого пути активинового типа. BMP/GDF лиганды связываются рецепторами BMP II типа, и могут активировать Smad 1, 5, и 8. См. Derynck, R et al. Cell 95, 737-740 (1998)). При стимуляции лигандом Smad перемещаются к ядру и функционируют в качестве компонентов комплексов транскрипции.A member of the TGFβ family can be substituted, or used in combination with an activator of the TGFβ signaling pathway, which is a compound that stimulates one or more polypeptides or interactions involved in transducting or otherwise effecting changes in cell properties in response to a member of the TGFβ family. The TGFβ signaling pathway includes members of the TGFβ family themselves. Members of the TGFβ superfamily transmit signals to the nucleus by signaling through type II and I serine-threonine kinase receptors and intracellular effectors known as Smad. These receptors belong to two subfamilies known as type I and type II receptors, which work together to bind ligand and transmit signal (Attisano et al., Mol Cell Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). The ligands bind type I and type II receptors on the cell surface, stimulating type I receptor activation through phosphorylation. This activated complex, in turn, activates intracellular Smads, which assemble multi-subunit complexes that regulate transcription. Members of the TGFβ superfamily are divided into two signal transduction subgroups: those whose function is associated with TGFβ / activin, and those whose function is associated with the BMP / GDF subfamily. It is believed that most TGFβ ligands first bind to a type II receptor and this type II ligand / receptor complex then recruits or phosphorylates a type I receptor (Mathews, LS, Endocr Rev 15: 310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1,169-178 (2000)). Type II receptor kinase phosphorylates and activates type I receptor kinase, which then phosphorylates and activates Smad proteins. TGFβ / activin ligands bind to type II TGFβ and activin receptors, and can activate the Smad-2 and -3, Nodal and Lefty signal through this activin-type pathway. BMP / GDF ligands bind to BMP type II receptors and can activate Smad 1, 5, and 8. See Derynck, R et al. Cell 95,737-740 (1998)). When stimulated with a ligand, Smads are transferred to the nucleus and function as components of transcription complexes.

Передача сигнала TGFβ регулируется позитивно и негативно через различные механизмы. Позитивная регуляция усиливает сигнал до уровня, достаточного для биологической активности. Лиганды суперсемейства TGFβ связываются с рецептором II типа, который привлекает и фосфорилирует рецептор I типа. Рецептор I типа затем фосфорилирует SMAD, регулируемые рецептором (R-SMAD, например, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, и SMAD8) которые связывают общий медиатор Smad или coSMAD. Комплексы R-SMAD/coSMAD аккумулируются в ядре, где они действуют, как факторы транскрипции, и участвуют в регуляции экспрессии целевого гена. Например, факторы роста и дифференцировки включают 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 15. В одном предпочтительном варианте осуществления GDF8 и GDF11 являются членами семейства TGFβ, которые также являются активаторами пути передачи сигнала TGFβ (позитивной регуляции), и действуют путем связывания с экстрацеллюлярной частью лиганд-связывающего домена ActRII рецептора, а затем образуют комплекс с ActRI, приводя к ингибированию Smad7 негативного регулятора и фосфорилированию комплекса Smad2/Smad3. Комплекс Smad2/Smad3 ассоциируется с Smad4 для регуляции экспрессии некоторых генов.TGFβ signaling is upregulated and downregulated through various mechanisms. Positive regulation amplifies the signal to a level sufficient for biological activity. Ligands of the TGFβ superfamily bind to the type II receptor, which attracts and phosphorylates the type I receptor. The type I receptor then phosphorylates SMADs regulated by the receptor (R-SMAD, eg, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, and SMAD8) that bind the common mediator Smad or coSMAD. R-SMAD / coSMAD complexes accumulate in the nucleus, where they act as transcription factors and are involved in the regulation of target gene expression. For example, growth and differentiation factors include 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 15. In one preferred embodiment, GDF8 and GDF11 are members of the TGFβ family that are also activators of the TGFβ signaling pathway. (upregulation), and act by binding to the extracellular portion of the ligand-binding domain of the ActRII receptor, and then complexing with ActRI, resulting in inhibition of the Smad7 negative regulator and phosphorylation of the Smad2 / Smad3 complex. The Smad2 / Smad3 complex associates with Smad4 to regulate the expression of several genes.

Негативная регуляция передачи сигнала TGFβ осуществляется на экстрацеллюлярном, мембранном, цитоплазматическом и ядерном уровне. Передача сигнала может быть прервана для подавления передачи сигналов, инициированных TGFβ. Это может осуществляться любыми средствами, известными в данной области техники, при которых взаимодействие между рецептором(ами) TGFβ и белком SMAD антагонизируется или предотвращается, включая белки, которые блокируют или конкурируют за взаимодействие с рецептором TGFβ и белком SMAD. Альтернативно, транскрипция или трансляция TGIβ рецептора или SMAD белка может быть изменена любыми средствами, известными в данной области техники, для предотвращения передачи сигнала по пути передачи сигнала. Дополнительные примеры позитивной и негативной регуляции различных белков членов семейства TGFβ приведены в более подробном описании некоторых факторов ниже.Negative regulation of TGFβ signaling is carried out at the extracellular, membrane, cytoplasmic and nuclear levels. Signaling can be interrupted to suppress TGFβ-initiated signaling. This can be done by any means known in the art in which the interaction between the TGFβ receptor (s) and the SMAD protein is antagonized or prevented, including proteins that block or compete for interaction with the TGFβ receptor and SMAD protein. Alternatively, the transcription or translation of the TGIβ receptor or SMAD protein can be altered by any means known in the art to prevent signal transduction along the signal pathway. Additional examples of up-regulation and down-regulation of various proteins of members of the TGFβ family are provided in the more detailed description of some of the factors below.

Как с применением любого агента, концентрация любого члена суперсемейства TGFP в среде для культивирования клеток не ограничивается описанной в примерах ниже, если концентрация позволяет достичь необходимых эффектов, например, чтобы активировать член семейства рецептора TGFβ. Например, при использовании активинов, например, активина А и/или В, или GDF8 and GDF-11, предпочтительная концентрация может быть в диапазоне примерно от 10 до 300 нМ, более предпочтительно, примерно от 50 до 200 нМ, и еще более предпочтительно примерно от 75 до 150 нМ, и наиболее предпочтительно примерно от 100 до 125 нМ. Рядовой специалист в данной области техники сможет легко протестировать любую концентрацию, и с применением стандартных методик в данной области техники определить эффективность такой концентрации, например, оценить дифференцировку путем определения экспрессии и отсутствии экспрессии панели генетических маркеров для любого типа клеток.As with any agent, the concentration of any member of the TGFP superfamily in the cell culture medium is not limited to that described in the examples below, as long as the concentration achieves the desired effects, for example, to activate a member of the TGFβ receptor family. For example, when using activins, for example, activin A and / or B, or GDF8 and GDF-11, the preferred concentration may be in the range of from about 10 to 300 nM, more preferably from about 50 to 200 nM, and even more preferably about 75 to 150 nM, and most preferably about 100 to 125 nM. One of ordinary skill in the art will be able to easily test any concentration and, using standard techniques in the art, determine the effectiveness of that concentration, for example, assess differentiation by determining the expression and non-expression of a panel of genetic markers for any cell type.

Эти и другие факторы роста, используемые для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека, описаны более подробно в заявке США №12/132,437, озаглавленной «Факторы роста для получения дефинитивной энтодермы», поданной 3 июня 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.These and other growth factors used to differentiate human pluripotent stem cells are described in more detail in US Application No. 12 / 132,437, entitled "Growth Factors for the Production of a Definitive Endoderm," filed June 3, 2008, which is hereby incorporated by reference in its entirety.

После общего описания настоящего изобретения можно получить дополнительные разъяснения со ссылкой на определенные конкретные примеры, которые приведены в настоящей заявке в целях иллюстрации, и не предназначены для ограничения.After a general description of the present invention, further explanation can be obtained with reference to certain specific examples, which are given in this application for purposes of illustration and are not intended to be limiting.

ПримерыExamples of

Необходимо также понимать, что вышеизложенное относится к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, и многочисленные изменения могут быть выполнены без выхода за рамки, определяющие объем настоящего изобретения. Изобретение далее иллюстрировано следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Напротив, необходимо ясно понимать, что изобретение может выполняться в различных других вариантах осуществления, модификациях и эквивалентах, которые после прочтения описания могут быть предложены специалистом в данной области техники без выхода за рамки, определяющие сущность настоящего изобретения и/или объем формулы изобретения.It should also be understood that the foregoing refers to preferred embodiments of the present invention, and numerous changes may be made without departing from the scope of the present invention. The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the invention. On the contrary, it should be clearly understood that the invention may be carried out in various other embodiments, modifications and equivalents that, upon reading the description, may be suggested by a person skilled in the art without departing from the scope defining the spirit of the present invention and / or the scope of the claims.

Пример 1Example 1

Дифференцировка iPS клеток человека в панкреатические прогениторные и эндокринные клетки через дефинитивную энтодерму и энтодермальные промежуточные формыDifferentiation of human iPS cells into pancreatic progenitor and endocrine cells through definitive endoderm and endodermal intermediate forms

Индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки человека дифференцировали в суспензионных агрегатах с применением четырех (4) этапной процедуры в течение примерно 2 недель (или 14 дней) для генерации популяции панкреатических типов клеток, включая панкреатические прогениторы, эндокринные прогениторы и гормон-экспрессирующие эндокринные клетки. Линии iPS клеток человека, применяемые в настоящей заявке, были предоставлены S. Yamanaka, Университет Киото, Япония, и Cellular Dynamics International, Inc. (CDI).Human induced pluripotent stem (iPS) cells were differentiated in suspension aggregates using a four (4) step procedure over approximately 2 weeks (or 14 days) to generate a population of pancreatic cell types, including pancreatic progenitors, endocrine progenitors, and hormone-expressing endocrine cells. The human iPS cell lines used herein were provided by S. Yamanaka, Kyoto University, Japan, and Cellular Dynamics International, Inc. (CDI).

Эти iPS клетки, описанные в настоящей заявке, вначале получали от Shinja Yamanaka, а позднее от CDI. Недифференцированные iPS клетки выращивали на митотически инактивированных эмбриональных фибробластах мыши, или предпочтительно без фидеров (без фидерного слоя фибробластов) в DMEM/F12, содержащей 20% замены нокаутной сыворотки. Дифференцировку инициировали путем диссоциации недифференцированных iPS клеток на отдельные клетки с применением аккутазы, образцы клеток отбирали на выделение и анализ РНК. Клетки ресуспендировали по 1-2 миллиона клеток на миллилитр в RPMI + 0,2% о/о FBS, содержащей 1:5000 разведение инсулина-трансферрина-селена (ITS), активны А (100 нг/мл), wnt3a (50 нг/мл), и ингибитор rho-киназы или ROCK ингибитор, Y-27632 в 10 мкМ, помещая в 6-луночный планшет с ультранизким прикреплением, помещая на ротационную платформу и вращая примерно при 100 об./мин. Культуры вращали при 100 об./мин в оставшейся части процесса дифференцировки с ежедневной заменой среды. Рост, пассирование и пролиферация iPSC были по существу такими, как описано в патентах США №№7,961,402 и 8,211,699, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.These iPS cells described in this application were originally obtained from Shinja Yamanaka and later from CDI. Undifferentiated iPS cells were grown on mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts, or preferably without feeders (no fibroblast feeder layer) in DMEM / F12 containing 20% knockout serum replacement. Differentiation was initiated by dissociation of undifferentiated iPS cells into separate cells using accutase; cell samples were taken for RNA isolation and analysis. Cells were resuspended at 1-2 million cells per milliliter in RPMI + 0.2% v / v FBS containing 1: 5000 dilution of insulin-transferrin-selenium (ITS), active A (100 ng / ml), wnt3a (50 ng / ml), and the rho kinase inhibitor or ROCK inhibitor, Y-27632 at 10 μM, placed in an ultra-low attachment 6-well plate, placed on a rotating platform and rotated at about 100 rpm. The cultures were spun at 100 rpm for the remainder of the differentiation process with daily media changes. The growth, passage and proliferation of iPSCs were essentially as described in US Pat. Nos. 7,961,402 and 8,211,699, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Способы, описанные в настоящей заявке для получения агрегатных суспензионных культур плюрипотентных клеток, например, hES или iPS клеток, и клеток, полученных из плюрипотентных клеток, являются по существу такими, как описано в PCT/US2007/062755, поданной 23 февраля 2007 и озаглавленной «Композиции и способы для культивирования различных клеток» и PCT/US2008/080516, поданной 20 октября 2008 и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The methods described in this application for the preparation of aggregate suspension cultures of pluripotent cells, for example, hES or iPS cells, and cells derived from pluripotent cells, are essentially the same as described in PCT / US2007 / 062755, filed February 23, 2007 and entitled " Compositions and Methods for Culturing Various Cells "and PCT / US2008 / 080516, filed Oct. 20, 2008 and entitled" Methods and Compositions for Feederless Pluripotent Stem Cell Media Containing Human Serum, "which are hereby incorporated by reference in their entirety.

Способы, описанные в настоящей заявке, можно упростить, прежде всего, покрытием сосуды для культивирования экстрацеллюлярным матриксом, например, как описано в патенте США 6,800,480 от Bodnar et al., принадлежащем Geron Corporation. Эти способы, а также другие способы культивирования других плюрипотентных стволовых клеток, например, hES и iPS клеток, можно осуществить с применением растворимой сыворотки человека, по существу, как описано в заявке США PCT/US2008/080516, поданной 20 октября 2008 и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The methods described in this application can be simplified, first of all, by coating the culture vessels with an extracellular matrix, for example, as described in US Pat. No. 6,800,480 from Bodnar et al. To Geron Corporation. These methods, as well as other methods for culturing other pluripotent stem cells, for example, hES and iPS cells, can be performed using soluble human serum, essentially as described in US Application PCT / US2008 / 080516, filed October 20, 2008 and entitled "Methods and compositions for feederless pluripotent stem cell media containing human serum, "which are hereby incorporated by reference in their entirety.

Способы, описанные в настоящей заявке, можно упростить с помощью экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF), полученного из иного источника, чем просто фидерный слой фибробластов, как описано в патенте США №7,005,252, Thomson, J., принадлежащем Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF), который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.The methods described in this application can be simplified using exogenously added fibroblast growth factor (FGF) obtained from a source other than just the feeder layer of fibroblasts, as described in US patent No. 7,005,252, Thomson, J., owned by the Wisconsin Alumni Research Foundation ( WARF), which is incorporated herein by reference in its entirety.

В течение примерно первых 24 часов вращения, отдельные клетки, прилипающие друг к другу, образуют агрегаты клеток, и достаточные образцы клеток были взяты для изоляции и анализа РНК. Агрегаты клеток находились в диапазоне примерно от 60 микрон до 120 микрон в диаметре. Спустя примерно 1 день (24 часа) после помещения образцов iPS клеток на ротационную платформу, в культуры подавали RPMI + 0,2% о/о FBS, содержащей 1:5000 разведение ITS, активин А (100-200 нг/мл), и Wnt3a (50-100 нг/мл), или примерно на один день (время 0 до 1 дня) и дополнительный день, или в ту же самую среду, но без Wnt3a (день 1 - день 2). Ежедневно образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК. После двух дней дифференцировки в культуры вносили RPMI + 0,2% о/о FBS, содержащую 1:1000 разведение ITS, KGF (или FGF7,25 нг/мл), и ингибитор TGFP №4 (2,5 мкМ) на один день (или 24 часа, день 2 - день 3). На следующие два дня (день 3 - день 5) в агрегатные суспензии iPS клеток вносили те же самые коктейли из среды и факторов роста, за тем исключением, что ингибитор TGFP удаляли из среды для культивирования. Вновь, образцы клеток отбирали для выделения РНК в конце этой стадии (стадия 2, или день 5). Для стадии 3 (день 5 - день 8) среду для культивирования клеток заменяли на DMEM + 1% о/о В27 добавки, содержащей TTNPB [4-[Е-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил] бензойную кислоту] (3 нМ), KAAD-циклопамин (0,25 мкМ) и ноггин (50 нг/мл). Вновь, образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК в конце этой стадии (стадия 3, день 8). Для стадии 4 (день 8 - день 14) среды меняли на DMEM + 1% о/о В27 добавку, содержащую ноггин (50 нг/мл), KGF (50 нг/мл) и EGF (50 нг/мл). Вновь, образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК в конце стадии 4 (или дня 14).During approximately the first 24 hours of rotation, individual cells adhering to each other form cell aggregates, and sufficient cell samples were taken for RNA isolation and analysis. Cell aggregates ranged from about 60 microns to 120 microns in diameter. Approximately 1 day (24 hours) after placing the iPS cell samples on a rotating platform, the cultures were fed with RPMI + 0.2% v / v FBS containing 1: 5000 dilution of ITS, activin A (100-200 ng / ml), and Wnt3a (50-100 ng / ml), or for about one day (time 0 to day 1) and an additional day, or on the same Wednesday, but without Wnt3a (day 1 - day 2). Cell samples were taken daily for RNA isolation and analysis. After two days of differentiation, the cultures were supplemented with RPMI + 0.2% v / v FBS containing 1: 1000 dilution of ITS, KGF (or FGF 7.25 ng / ml), and TGFP inhibitor # 4 (2.5 μM) for one day (or 24 hours, day 2 - day 3). On the next two days (day 3 - day 5), the same cocktails from the medium and growth factors were added to the aggregate suspensions of iPS cells, except that the TGFP inhibitor was removed from the culture medium. Again, cell samples were taken for RNA isolation at the end of this step (step 2, or day 5). For stage 3 (day 5 - day 8), the cell culture medium was replaced with DMEM + 1% v / v B27 supplement containing TTNPB [4- [E-2- (5,6,7,8-tetrahydro-5.5 , 8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] benzoic acid] (3 nM), KAAD-cyclopamine (0.25 μM) and noggin (50 ng / ml). Again, cell samples were taken for RNA isolation and analysis at the end of this step (step 3, day 8). For stage 4 (day 8 - day 14), the media were changed to DMEM + 1% v / v B27 supplement containing noggin (50 ng / ml), KGF (50 ng / ml) and EGF (50 ng / ml). Again, cell samples were taken for RNA isolation and analysis at the end of step 4 (or day 14).

ПЦР в режиме реального времени проводили для определения экспрессии гена для различных маркерных генов в течение курса дифференцировки. Экспрессия генов специфических маркеров вначале нормализовалась до среднего уровня экспрессии конститутивных генов, экспрессии циклофилина G и ТАТА-связывающего белка (ТВР). Нормализованную относительную экспрессию генов затем отображали на диаграммах относительно уровня экспрессии в недифференцированных iPS клетках, и показывали кратность возрастания различных маркеров дифференцировки. Для ОСТ4 экспрессия генов была нормализована для установки самого низкого образца в наборе данных (день 14), и таким образом, представляющего кратность снижения в ходе дифференцировки.Real-time PCR was performed to determine gene expression for various marker genes during the course of differentiation. The expression of genes for specific markers was initially normalized to the average level of expression of constitutive genes, expression of cyclophilin G and TATA-binding protein (TBP). The normalized relative gene expression was then plotted against the level of expression in undifferentiated iPS cells, and the fold increased for the various differentiation markers. For OCT4, gene expression was normalized to set the lowest pattern in the dataset (day 14), and thus represent the fold reduction during differentiation.

Фигуры 2A-L являются диаграммами, демонстрирующими относительную экспрессию идентифицированного гена (например, Oct4, Brachyury, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 и INS) относительно уровня экспрессии того же самого гена в недифференцированных iPS клетках. Уровень экспрессии генов был нормализован для установки конститутивных генов (контроль), а сравнение уровня экспрессии генов в два различных момента времени показало, имеется ли повышающая или понижающая регуляция гена или маркера экспрессии. Для ОСТ4 (Фиг. 2А) экспрессия гена была нормализована, и образец с самым низким уровнем экспрессии был установлен на 1 (день 14). Таким образом, как показано на Фиг. 2, относительные уровни экспрессии ОСТ4 представляют кратность понижающей регуляции (ось Y) в течение курса дифференцировки (ось X, стадия 0-4, или день 0 - день 14).Figures 2A-L are diagrams showing the relative expression of the identified gene (e.g. Oct4, Brachyury, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 and INS) versus the level of expression of the same gene in undifferentiated iPS cells. The level of gene expression was normalized to set constitutive genes (control), and comparison of the level of gene expression at two different time points showed whether there is an up or down regulation of the gene or expression marker. For OCT4 (Fig. 2A), gene expression was normalized and the sample with the lowest expression level was set to 1 (day 14). Thus, as shown in FIG. 2, the relative expression levels of OCT4 represent the fold down regulation (Y-axis) over the course of differentiation (X-axis, stage 0-4, or day 0 - day 14).

Как показано на Фигуре 2А, ОСТ4 (POU5F1) экспрессируется на высоких уровнях в недифференцированных iPS клетках, и проявляет последующую понижающую регуляцию в ходе дифференцировки (день 0 - день 14). В день 14 уровни экспрессии ОСТ4 более чем в 3000 раз снижаются по сравнению с уровнями экспрессии, наблюдавшимися в недифференцированных клетках. Напротив, имеется временная повышающая регуляция экспрессии гена brachyury (BRACHYURY, Фиг. 2В) в течение первых 2 дней (день 1 и день 2). Временная повышающая регуляция гена brachyury была результатом направленной дифференцировки плюрипотентных / iPS клеток в мезоэнтодермы путем применения активина А и wnt3a. Мезоэнтодерма была дополнительно дифференцирована в дефинитивную энтодерму во время дней 2-3 путем длительного воздействия активина А, на что указывала повышающая регуляция CER1, GSC и FOXA2 в конце стадии 1 в день 3 (Фиг. 2С-Е). Во время стадии 2 дефинитивную энтодерму дальше подвергали направленной дифференцировке в энтодерму кишечной трубки, как показано повышающей регуляцией FOXA1, сохранением экспрессии FOXA2 и понижающей регуляцией CER1 и GSC на день 6 дифференцировки (Фиг. 2С-F). Во время стадии 3, при воздействии ретиноида, циклопамина и ноггина, энтодерму кишечной трубки далее подвергали направленной дифференцировке в заднюю часть передней кишки / PDX1-экспрессирующую энтодерму, на что указывала повышающая регуляция HNF6 и PDX1 в день 8 (Фиг. 2G-H). Во время стадии 4, при воздействии KGF и EGF, задняя часть передней кишки / PDX1-экспрессирующая энтодерма дополнительно направлялась к дифференцировке в панкреатические прогениторы, эндокринные прогениторы, и гормон-экспрессирующие эндокринные клетки, на что указывала повышающая регуляция PTF1A, NKX6-1, NGN3 и INS в день 14 (Фигура 21-L).As shown in Figure 2A, OCT4 (POU5F1) is expressed at high levels in undifferentiated iPS cells, and exhibits subsequent downregulation during differentiation (day 0 to day 14). On day 14, OCT4 expression levels are reduced by more than 3000-fold compared to the expression levels observed in undifferentiated cells. In contrast, there is a transient up-regulation of brachyury gene expression (BRACHYURY, Fig. 2B) during the first 2 days (day 1 and day 2). The transient upregulation of the brachyury gene was the result of directed differentiation of pluripotent / iPS cells into the mesoendoderm by the use of activin A and wnt3a. The mesoentoderm was further differentiated into definitive endoderm during days 2-3 by prolonged exposure to activin A, as indicated by upregulation of CER1, GSC and FOXA2 at the end of stage 1 on day 3 (Fig. 2C-E). During stage 2, the definitive endoderm was further subjected to directed differentiation into the endoderm of the intestinal tube, as indicated by upregulation of FOXA1, retention of FOXA2 expression, and downregulation of CER1 and GSC on day 6 of differentiation (Fig. 2C-F). During stage 3, upon exposure to retinoid, cyclopamine and noggin, the endoderm of the intestinal tube was further directed to the posterior foregut / PDX1-expressing endoderm, as indicated by upregulation of HNF6 and PDX1 at day 8 (Fig. 2G-H). During stage 4, when exposed to KGF and EGF, the posterior foregut / PDX1-expressing endoderm was further directed to differentiate into pancreatic progenitors, endocrine progenitors, and hormone-expressing endocrine cells, as indicated by upregulation of PTF1A, NKX6-1, NGN3 and INS on day 14 (Figure 21-L).

Пример 2Example 2

Ингибиторы Rho-киназы стимулируют рост, выживание, пролиферацию и адгезию iPS клетокRho kinase inhibitors stimulate iPS cell growth, survival, proliferation and adhesion

Способы дифференцировки различных hES и iPS линий клеток были по существу такими же, как описано в настоящей заявке и в Примере 1. В дополнение к условиям культивирования, как описано для стадий 1, 2, 3, 4 и 5, ингибитор апоптоза и/или ингибитор Rho-киназы или ROCK добавляли в среды для культивирования для повышения и активизации роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток во время дифференцировки. Как правило, примерно 10 мкМ ингибитора Rho-киназы, например, Y-27632, добавляли в культуры клеток на каждой из стадий. Альтернативно, ингибитор Rho-киназы добавляли по меньшей мере на стадиях 1 и 2 и стадиях 4 и 5, или любой их комбинации. Морфология и профили экспрессии генетических маркеров суспензионных (агрегатных) культур дифференцированных iPS клеток были по существу схожими с суспензионными культурами клеток, полученными из hES клеток.The methods of differentiation of various hES and iPS cell lines were essentially the same as described in this application and in Example 1. In addition to the culture conditions as described for stages 1, 2, 3, 4 and 5, an apoptosis inhibitor and / or an inhibitor Rho kinases or ROCKs were added to culture media to enhance and enhance growth, survival, proliferation, and cell adhesion during differentiation. Typically, about 10 μM Rho kinase inhibitor, eg Y-27632, is added to cell cultures at each step. Alternatively, the Rho kinase inhibitor was added in at least steps 1 and 2 and steps 4 and 5, or any combination thereof. The morphology and expression profiles of genetic markers of suspension (aggregate) cultures of differentiated iPS cells were essentially similar to suspension cell cultures obtained from hES cells.

На Фигурах 3 и 4 показаны результаты иммуноцитохимии (ICC) iPS культур клеток со стадий 4 и 5, соответственно. На Фигуре 3 показаны агрегаты клеток со Стадии 4, экспрессирующие типичные генетические маркера, характерные для PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (также обозначаемой как панкреатический эпителий или панкреатические прогениторы), включая PDX1/ NKX6.1 со-позитивные клетки. Хотя это не показано на Фиг. 3, на Стадии 4 клетки не экспрессируют гормон-секретирующих белковых или генетических маркеров, более типичных для клеток Стадии 5, таких как инсулин (INS), глюкагон (GCG), соматостатин (SST) и панкреатический полипептид (РР). На Фигуре 4 показаны агрегаты клеток гормон-экспрессирующих клеток со Стадии 5. Результаты ICC были дополнительно подтверждены с применением QPCR. Однако поскольку QPCR является общим популяционным исследованием общего уровня РНК, экспрессируемой в образце или культуре клеток, нельзя определенно показать, что любая клетка экспрессирует множество маркеров.Figures 3 and 4 show the results of immunocytochemistry (ICC) of iPS cell cultures from stages 4 and 5, respectively. Figure 3 shows cell aggregates from Stage 4 expressing typical genetic markers characteristic of PDX1-positive pancreatic endoderm (also referred to as pancreatic epithelium or pancreatic progenitors), including PDX1 / NKX6.1 co-positive cells. Although not shown in FIG. 3, in Stage 4, the cells do not express the hormone-secreting protein or genetic markers more typical of Stage 5 cells, such as insulin (INS), glucagon (GCG), somatostatin (SST), and pancreatic polypeptide (PP). Figure 4 shows the cell aggregates of hormone expressing cells from Stage 5. The ICC results were further confirmed using QPCR. However, since QPCR is a general population study of the total level of RNA expressed in a sample or cell culture, it cannot be definitely shown that any cell expresses multiple markers.

Пример 3Example 3

Инкапсулирование панкреатических предшественников, полученных из IPSEncapsulation of pancreatic progenitors derived from IPS

На сегодняшний день описаны способы получения IPS клеток и источники для получения IPS клеток. Однако нет достаточного описания дифференцировки каких-либо EPS клеток в какие-либо дифференцированные клетки для потенциального применения в клеточной терапии для лечения конкретного заболевания, например, диабета.To date, methods for obtaining IPS cells and sources for obtaining IPS cells have been described. However, there is insufficient description of the differentiation of any EPS cells into any differentiated cells for potential use in cell therapy for the treatment of a specific disease, for example, diabetes.

Чтобы определить, действительно ли культуры PDX1-позитвной панкреатической энтодермы или культуры панкреатических клеток-предшественников со Стадии 4, полученные из iPS клеток человека, полностью способны к развитию и созреванию in vivo в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки, популяции панкреатических предшественников, по существу, как описано в Примерах 1 и 2, загружали в макро-инкапсулирующие устройства, по существу подобные тем, которые описаны в заявке США №12/618,659, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических линий клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009; и патентах США №№7,534,608 и 7,695,965, озаглавленных «Способы получения панкреатических гормонов», полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, примерно 5-10-20 мкл осажденных под действием гравитации агрегатов суспензий клеток загружали в каждое устройство, содержащее по существу примерно 3×10⁶ клеток.To determine whether PDX1-positive pancreatic endoderm cultures or Stage 4 pancreatic progenitor cell cultures derived from human iPS cells are fully capable of in vivo development and maturation into glucose-sensitive insulin-secreting cells, pancreatic progenitor populations are essentially as described in Examples 1 and 2, loaded into macro-encapsulating devices substantially similar to those described in US Application No. 12 / 618,659, entitled "Encapsulation of Pancreatic Cell Lines Derived from Human Pluripotent Stem Cells," filed November 13, 2009 ; and US Patent Nos. 7,534,608 and 7,695,965 entitled "Methods for producing pancreatic hormones", which are hereby incorporated by reference in their entirety. Briefly, about 5-10-20 μl of gravity-precipitated cell suspension aggregates was loaded into each device containing substantially about 3 x 10 ⁶ cells.

Инкапсулированные клетки в устройстве затем готовили к имплантации млекопитающему, например, мыши с иммунной недостаточностью SCID/Bg, но могли имплантировать более крупным животным, включая крыс, свиней, обезьян или людей. Способы имплантации инкапсулированных клеток и устройства являются по существу такими, как описано в патентной заявке США №12/618,659, патентах США №№7,534,608 и 7,695,965, включая панкреатические клетки-предшественники, имплантированные на GELFQAM матрикс и введенные под эпидидимальную жировую ткань (EFP).The encapsulated cells in the device were then prepared for implantation into a mammal, eg, SCID / Bg immune deficient mice, but could be implanted in larger animals, including rats, pigs, monkeys, or humans. Encapsulated cell implantation methods and devices are essentially as described in US Patent Application No. 12 / 618,659, US Pat. Nos. 7,534,608 and 7,695,965, including pancreatic progenitor cells implanted on a GELFQAM matrix and injected under epididymal adipose tissue (EFP).

Для данных исследований не была нужна иммуносупрессия, однако иммуносупрессия может требоваться для некоторых млекопитающих в начальный переходный период, пока предшественники внутри устройства не созреют полностью и не станут отвечать на глюкозу. У некоторых млекопитающих режим иммуносупрессии может занимать примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше недель, и будет зависеть от млекопитающего.These studies did not require immunosuppression, but immunosuppression may be required in some mammals during the initial transition period until the progenitors within the device are fully matured and respond to glucose. In some mammals, the immunosuppression regimen may take about 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more weeks, and will depend on the mammal.

Трансплантированным клеткам позволяли дифференцироваться и дополнительно созревать in vivo. Чтобы определить, действительно ли трансплантированные клетки обладают нормальной физиологической функцией, например, как натуральные бета-клетки, нужно определить уровни инсулина человека путем тестирования уровней С-пептида человека. С-пептид человека отщепляется или процессируется из проинсулина человека, таким образом, специфическое определение С-пептида человека, а не эндогенного С-пептида указывает на секрецию инсулина из пересаженных (экзогенных) клеток. У животных с имплантатами определяли уровни С-пептида человека примерно каждые две, три или четыре недели путем инъекции болюса аргинина или глюкозы, предпочтительно глюкозы. Созревшие бета-клетки (полученные из дифференцированных плюрипотентных iPS клеток) должны быть физиологически функциональными и чувствительными к глюкозе, подобно натуральным или эндогенным бета-клеткам. Как правило, количества С-пептида человека выше 50 пМ или среднего базового (порогового) уровня, являются индикатором функции бета-клеток из трансплантированных предшественников.The transplanted cells were allowed to differentiate and further mature in vivo. To determine whether the transplanted cells actually have normal physiological function, such as natural beta cells, it is necessary to determine human insulin levels by testing human C-peptide levels. Human C-peptide is cleaved or processed from human proinsulin, thus specific detection of human C-peptide rather than endogenous C-peptide indicates insulin secretion from transplanted (exogenous) cells. In implanted animals, human C-peptide levels were determined approximately every two, three or four weeks by injection of a bolus of arginine or glucose, preferably glucose. Matured beta cells (derived from differentiated pluripotent iPS cells) must be physiologically functional and sensitive to glucose, similar to natural or endogenous beta cells. Typically, amounts of human C-peptide above 50 pM or the average baseline (cut-off) level are indicative of beta cell function from the transplanted progenitors.

Подобно описанным в Kroon et al. (2008) выше, заявке США №12/618,659, патентах США №№7,534,608; 7,695,965 и 7,993,920, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки, инкапсулированные панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток, как ожидается, созревают в функционирующие кластеры панкреатических островков, содержащие эндокринные, ацинарные и дуктальные клетки, подобно натуральным островкам. Также предполагается, что очищенные или обогащенные панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток перед трансплантацией, также созревают и развиваются в функциональные панкреатические островки и продуцируют инсулин in vivo. Некоторые варианты осуществления для очистки и обогащения различных дифференцированных популяций клеток описаны более подробно в заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермальных и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из hES клеток», поданной 8 апреля 2008, теперь патенте США 8,338,170, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки. Также предполагается, что панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток, которые были подвергнуты криоконсервации, могут оттаивать и адаптировать в культуре перед трансплантацией, и созревать и продуцировать инсулин in vivo, соответственно. Гипогликемия может быть облегчена у животных с индуцированным диабетом, которым трансплантировали панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток.Similar to those described in Kroon et al. (2008) supra, US Application No. 12 / 618,659, US Patent Nos. 7,534,608; 7,695,965 and 7,993,920, fully incorporated herein by reference, encapsulated pancreatic progenitors derived from hIPS cells are expected to mature into functioning pancreatic islet clusters containing endocrine, acinar and ductal cells, like natural islets. It is also suggested that purified or enriched pancreatic progenitors derived from hIPS cells prior to transplantation also mature and develop into functional pancreatic islets and produce insulin in vivo. Some embodiments for purifying and enriching various differentiated cell populations are described in more detail in US Application No. 12 / 107,020, entitled "Methods for Purification of Endodermal and Pancreatic Endodermal Cells Derived from hES Cells," filed Apr. 8, 2008, now US Pat. No. 8,338,170, incorporated in its entirety. into the present description by reference. It is also suggested that pancreatic progenitors derived from hIPS cells that have been cryopreserved can thaw and adapt in culture prior to transplantation, and mature and produce insulin in vivo, respectively. Hypoglycemia can be alleviated in animals with induced diabetes transplanted with pancreatic progenitors derived from hIPS cells.

В итоге, полностью инкапсулированные панкреатические прогениторные клетки, полученные из hIPS клеток в макро-инк апеллирующем устройстве, созревают в физиологически функциональные панкреатические островки, и как ожидается, продуцируют инсулин в ответ на глюкозу in vivo.Eventually, fully encapsulated pancreatic progenitor cells, derived from hIPS cells in a macro-insertion device, mature into physiologically functional pancreatic islets and are expected to produce insulin in response to glucose in vivo.

Пример 4Example 4

Композиции панкреатических клеток-предшественников и гормон-секретирующих клетокPancreatic Progenitor and Hormone Secreting Cell Compositions

Популяции дифференцированных hIPS клеток анализировали с применением проточной цитометрии для определения содержания клеток PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатических клеток-предшественников (на стадии 4); и эндокринных клеток или эндокринных клеток-предшественников (на стадии 5), как показано в Таблицах 5а, 5b и 6, соответственно. В таблице 5b представлены те же данные, что и в Таблице 5а, но представлены подобно данным из Таблицы 9 для сравнения. Популяции из таблицы 5а перекрываются, например, общее число клеток превышает 100%, поскольку общее число PDX1+ и NKX6.1+ перекрывается с NKX6.1+/PDX1+/CHGA- популяциями клеток (5-я колонка из Таблицы 5а). Таблица 5b включает только данные PDX1+ и тройные негативные, что не показано в Таблице 5а. Некоторые из этих iPEC трансплантатов, а также другие, с применением по существу схожих рецептур, имплантировали животным для определения функции in vivo, однако, уровни сывороточного С-пептида человека были недостаточно стойкими для какой-либо потенциальной терапевтической цели (данные не показаны). Показанные значения являются процентами от общих клеток, принадлежащих к данной популяции. Ряд панкреатических прогениторов (NKX6.1(+) /PDX1(+) /Хромогранин А(-)) и очень маленькая популяция NKX6.1+/PDX1-/CHGA- находятся в агрегатах суспензий клеток, что согласуется с тем, что наблюдалось в агрегатах суспензий панкреатических прогениторных клеток, полученных из hES клеток и агрегировавших на стадии ESC, как описано в заявке США №12/264,760, озаглавленной «Композиции агрегатных суспензий стволовых клеток, и способы их дифференцировки», поданной 4 ноября 2008 и полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Уровни эндокринных клеток и/или эндокринных клеток-предшественников также по существу согласовались с полученными в культур клетоках, полученных из hES клеток из заявки США 12/107,020, озаглавленной «Способы очистки клеток энтодермы и клеток панкреатической энтодермы, полученных из hES клеток», поданной 8 апреля 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Подобно агрегатам суспензий, полученных из hES клеток, изменение концентраций различных факторов роста в среде для культивирования на определенных стадиях дифференцировки (например, стадии 4), должно повышать и/или снижать определенные популяции клеток панкреатической энтодермы, эндокринных клеток, клеток PDX1-позитивной энтодермы или не-панкреатических типов клеток.Populations of differentiated hIPS cells were analyzed using flow cytometry to determine the content of PDX1-positive pancreatic endoderm cells or pancreatic progenitor cells (in step 4); and endocrine or endocrine progenitor cells (in step 5), as shown in Tables 5a, 5b and 6, respectively. Table 5b presents the same data as Table 5a, but presents similar data from Table 9 for comparison. The populations from Table 5a overlap, for example, the total number of cells exceeds 100% because the total number of PDX1 + and NKX6.1 + overlaps with the NKX6.1 + / PDX1 + / CHGA- cell populations (5th column from Table 5a). Table 5b includes only PDX1 + data and triple negative data, which is not shown in Table 5a. Some of these iPEC grafts, as well as others using substantially similar formulations, were implanted in animals for in vivo function testing, however, human serum C-peptide levels were not persistent enough for any potential therapeutic target (data not shown). The values shown are percentages of the total cells belonging to a given population. A number of pancreatic progenitors (NKX6.1 (+) / PDX1 (+) / Chromogranin A (-)) and a very small population of NKX6.1 + / PDX1- / CHGA- are located in aggregates of cell suspensions, which is consistent with what was observed in aggregates of pancreatic progenitor cell suspensions obtained from hES cells and aggregated in the ESC step as described in US Application No. 12 / 264,760, entitled "Compositions of Aggregate Stem Cell Suspensions, and Methods for Their Differentiation," filed November 4, 2008 and incorporated herein in its entirety via link. Endocrine and / or endocrine progenitor cell levels were also substantially consistent with those obtained in cell cultures derived from hES cells from US Application 12 / 107,020, entitled "Methods for Purification of Endoderm Cells and Pancreatic Endoderm Cells Derived from hES Cells," filed 8 April 2008, fully incorporated into the present description by reference. Like aggregates of suspensions obtained from hES cells, changing the concentrations of various growth factors in the culture medium at certain stages of differentiation (for example, stage 4) should increase and / or decrease certain populations of pancreatic endoderm cells, endocrine cells, PDX1-positive endoderm cells, or non-pancreatic cell types.

Пример 5Example 5

Тирозинкиназы PEC рецептораPEC receptor tyrosine kinase

Вышеописанные примеры по существу подобны тем, что описаны в Таблице 7 ниже, адаптированным из Schulz et al., (2012), выше. Эти и другие способы, описанные в настоящей заявке, можно найти во многих патентных и не-патентных публикациях заявителя, включая патенты США №№7,964,402; 8,211,699; 8,334,138; 8,008,07; и 8,153,429, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.The above examples are substantially similar to those described in Table 7 below, adapted from Schulz et al., (2012), above. These and other methods described in this application can be found in many of the applicant's patent and non-patent publications, including US Patent Nos. 7,964,402; 8,211,699; 8,334,138; 8,008.07; and 8,153,429, the descriptions of which are fully incorporated into this description by reference.

hESC Agg.: агрегаты hESC; XF HA: DMEM/F12, содержащая GlutaMAX, с добавлением 10% о/о Xeno-free KnockOut заменителя сыворотки, 1% о/о ненезаменимых аминокислот, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 1% о/о пенициллина/стрептомицина (все от Life Technologies), 10 нг/мл херегулина-1β (Peprotech) и 10 нг/мл активина A (R&D Systems); SP: StemPro® hESC SFM (Life Technologies); r0,2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); 0,2% FBS (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), 1% о/о пенициллина/стрептомицина; ITS: Инсулин-трансферрин-селен (Life Technologies), разбавленный 1:5000 или 1:1000; A100: 100 нг/мл рекомбинантного активина А человека (R&D Systems); W50: 50 нг/мл рекомбинантного Wnt3A мыши (R&D Systems); K25: 25 нг/мл рекомбинантного KGF человека (R&D Systems); TV: 2,5 мкМ TGF-β RI киназы ингибитора IV (EMD Bioscience); db: DMEM HI глюкоза (HyClone) с добавлением 0,5х В-27 добавки (Life Technologies), 1x GlutaMAX, и 1% о/о пенициллина/стрептомицина; СТТ3: 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (Toronto Research Chemicals) и 3 нМ TTNPB (Sigma-Aldrich); N50: 50 нг/мл рекомбинантного ноггина человека (R&D Systems); K50: 50 нг/мл рекомбинантного KGF человека (R&D Systems); Е50: 50 нг/мл рекомбинантного EGF человека (R&D Systems); без подачи: указано, что в клетки не вносили повторно среду в указанный день; db, DMEM (с высоким содержанием глюкозы).hESC Agg .: hESC aggregates; XF HA: DMEM / F12 containing GlutaMAX, added 10% v / v Xeno-free KnockOut whey replacer, 1% v / v non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1% v / v penicillin / streptomycin (all from Life Technologies), 10 ng / ml Heregulin-1β (Peprotech) and 10 ng / ml Activin A (R&D Systems); SP: StemPro® hESC SFM (Life Technologies); r0.2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); 0.2% FBS (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), 1% v / v penicillin / streptomycin; ITS: Insulin Transferrin Selenium (Life Technologies) diluted 1: 5000 or 1: 1000; A100: 100 ng / ml recombinant human activin A (R&D Systems); W50: 50 ng / ml recombinant mouse Wnt3A (R&D Systems); K25: 25 ng / ml recombinant human KGF (R&D Systems); TV: 2.5 μM TGF-β RI inhibitor IV kinase (EMD Bioscience); db: DMEM HI glucose (HyClone) supplemented with 0.5x B-27 additive (Life Technologies), 1x GlutaMAX, and 1% v / v penicillin / streptomycin; CTT3: 0.25 μM KAAD-cyclopamine (Toronto Research Chemicals) and 3 nM TTNPB (Sigma-Aldrich); N50: 50 ng / ml recombinant human noggin (R&D Systems); K50: 50 ng / ml recombinant human KGF (R&D Systems); E50: 50 ng / ml recombinant human EGF (R&D Systems); without filing: it is indicated that the cells were not reintroduced with the medium on the specified day; db, DMEM (high glucose).

Когда вышеуказанные способы применяли к iPS клеткам и панкреатическим

предшественникам, трансплантированным животным, автор заявки не смог впоследствии получить ту же самую устойчивую функцию in vivo, по сравнению с тем, когда те же самые способы применяли к hESC и панкреатическим - предшественникам, полученным из hES. Это было удивительно, поскольку iPS клетки являются плюрипотентными стволовыми клетками человека, которые имеют морфологию и характеристики экспрессии генов hESC, и могут формировать как эмбриоидные тельца in vitro, так и тератомы in vivo, что указывает, что они могут формировать клетки из всех трех зародышевых слоев. См., по меньшей мере, например, Yu et al. (2007); патентную публикацию США №2009/0047263, Международную патентную публикацию № WO 2005/80598; патентную публикацию США №2008/0233610; и Международную патентную публикацию № WO2008/11882, выше. Эти ссылки описывают, что iPS клетки удовлетворяют критериям определения для ESC. Таким образом, ожидается, что iPS клетки могут заменять ESC в протоколе дифференцировки in vitro для получения панкреатических прогениторных клеток, полученных из hES, которые дальше созревают и развиваются в полностью функциональные чувствительные к глюкозе клетки in vivo. Однако, с учетом не согласующихся данных по функциональности in vivo с применением вышеуказанных способов, автор заявки предложил использовать рецептуру сред для дифференцировки, уникальную для панкреатических предшественников и/или панкреатических энтодермальных клеток (РЕС), т.е. клеток, полученных на стадии 4 из hiPSC (или «iPEC»), которые способны к обеспечению по существу схожих устойчивых уровней функции in vivo, которая впоследствии наблюдалась для РЕС, полученных из hESC.When the above methods were applied to iPS cells and pancreatic

transplanted animal progenitors, the Applicant was unable to subsequently obtain the same robust function in vivo compared to when the same methods were applied to hESC and hES derived pancreatic progenitors. This was surprising since iPS cells are human pluripotent stem cells that have the morphology and expression characteristics of hESC genes, and can form both embryoid bodies in vitro and teratomas in vivo, indicating that they can form cells from all three germ layers. ... See, at least, for example, Yu et al. (2007); US Patent Publication No. 2009/0047263; International Patent Publication No. WO 2005/80598; U.S. Patent Publication No. 2008/0233610; and International Patent Publication No. WO2008 / 11882 above. These references describe that iPS cells meet the definition criteria for ESC. Thus, it is expected that iPS cells can replace ESCs in an in vitro differentiation protocol to generate pancreatic progenitor cells derived from hES, which further mature and develop into fully functional glucose sensitive cells in vivo. However, in view of the inconsistent data on in vivo functionality using the above methods, the applicant proposed to use a differentiation media formulation unique to pancreatic progenitors and / or pancreatic endodermal cells (PECs), i.e. cells derived in step 4 from hiPSC (or “iPEC”) that are capable of providing substantially similar sustained levels of in vivo function that was subsequently observed for hESC derived PECs.

Авторы настоящей заявки ранее сообщали, что эндокринные (CHGA+) клетки, присутствующие в РЕС, являются полигормональными эндокринными клетками, и не являются субпопуляцией клеток РЕС, которые дают начало островкам, содержащим чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo. См. Kelly et. al. (2011) выше. Скорее, они являются популяцией не-эндокринных клеток (CHGA-клеток), особенно тех, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и PDX-1, которые считаются РЕС, которые действительно дают начало функциональным островкам in vivo. Таким образом, авторы заявки исследовали, действительно ли модуляция, изменение или сдвиг взаимных соотношений эндокринных и не-эндокринных субпопуляций может влиять впоследствии на функцию in vivo.We have previously reported that the endocrine (CHGA +) cells present in PEC are polyhormonal endocrine cells, and are not a subset of PEC cells that give rise to islets containing glucose-sensitive insulin-secreting cells in vivo. See Kelly et. al. (2011) above. Rather, they are a population of non-endocrine cells (CHGA cells), especially those that co-express NKX6.1 and PDX-1, which are believed to be PECs that actually give rise to functional islets in vivo. Thus, the applicants investigated whether modulation, alteration or shift in the mutual ratios of endocrine and non-endocrine subpopulations could subsequently influence in vivo function.

Предыдущие попытки расшифровки передачи сигналов рецептор-лиганд в hESC привели к успешной идентификации факторов роста, стимулирующих самообновление и обеспечивающих разработку определенных условий среды для культивирования. См. Wang et al (2007) выше. Wang et al. идентифицировали херегулин-1β в качестве лиганда, связывающегося с ERBB3 и индуцирующего димеризацию с ERBB2 для влияния на самообновление hESC в этом контексте. ERBB является рецепторной тирозинкиназой (RTK), a RTK является широко экспрессируемыми мембранными белками, которые действуют в качестве рецепторов для факторов роста и других экстраклеточных сигнальных молекул. При связывании лиганда они подвергаются фосфорилированию тирозина в специфических участках в цитоплазматическом хвосте и выделяют сигнальный каскад для связывания других белковых субстратов, вовлеченных в RTK-опосредованную трансдукцию сигнала. Функция RTK в некоторых процессах развития, включая регуляцию выживания клеток, пролиферацию и подвижность, и ее роль в образовании рака хорошо документирована. Также известно, что рецепторы ERBB тирозинкиназы экспрессируются на протяжении развития фетальной поджелудочной железы человека, хотя специфическая роль некоторых ERBB рецепторов и их лигандов неизвестна. См. Mari-Anne Huotari et al. (2002) «ERRB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture», Endocrinology 143(11): 4437-4446 («Передача сигналов с помощью ERRB регулирует дифференцировку линий при развитии клеток панкреатических островков в эмбриональной органной культуре»).Previous attempts to decipher receptor-ligand signaling in hESC have led to the successful identification of growth factors that stimulate self-renewal and provide for the development of specific conditions of the culture environment. See Wang et al (2007) above. Wang et al. identified Heregulin-1β as a ligand that binds to ERBB3 and induces dimerization with ERBB2 to influence self-renewal of hESC in this context. ERBB is a receptor tyrosine kinase (RTK), and RTKs are widely expressed membrane proteins that act as receptors for growth factors and other extracellular signaling molecules. Upon ligand binding, they undergo tyrosine phosphorylation at specific sites in the cytoplasmic tail and release a signaling cascade for binding other protein substrates involved in RTK-mediated signal transduction. The function of RTK in several developmental processes, including regulation of cell survival, proliferation and motility, and its role in cancer formation is well documented. It is also known that ERBB tyrosine kinase receptors are expressed throughout the development of the human fetal pancreas, although the specific role of some ERBB receptors and their ligands is unknown. See Mari-Anne Huotari et al. (2002) "ERRB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture", Endocrinology 143 (11): 4437-4446 ("ERRB Signaling Regulates Lineage Differentiation in the Development of Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture") ...

Благодаря роли передачи сигналов с помощью ERBB RTK в самообновлении плюрипотентных стволовых клеток и их экспрессии в фетальной поджелудочной железе человека, как показано Wang et al. (2007) выше, и ERBB RTK экспрессии в фетальной поджелудочной железе человека, авторы настоящей заявки стали исследовать потенциальную активацию RTK in vitro в клетках панкреатической энтодермы (РЕС), полученных из hES, в попытке идентифицировать рецепторы и лиганды, которые могут улучшать специализацию РЕС во время дифференцировки, или экспансию путем стимуляции самообновления, или каких-либо других неизвестных механизмов, которые стимулируют созревание до физиологически функциональных островковых гормон-секретирующих клеток in vivo. РЕС генерировали в суспензии в дифференцированных агрегатах, по существу как описано в Таблице 7, за исключением следующих модификаций.Due to the role of ERBB RTK signaling in the self-renewal of pluripotent stem cells and their expression in the human fetal pancreas, as shown by Wang et al. (2007) above, and ERBB RTK expression in the human fetal pancreas, the authors of the present application began to investigate the potential activation of RTK in vitro in pancreatic endoderm (PEC) cells derived from hES, in an attempt to identify receptors and ligands that can improve PEC specialization in the time of differentiation, or expansion by stimulating self-renewal, or some other unknown mechanism that stimulates the maturation of physiologically functional islet hormone-secreting cells in vivo. PECs were generated in suspension in differentiated aggregates essentially as described in Table 7, with the following modifications.

Четыре образца РЕС генерировали для RTK блоттинг-анализа. «Равновесный» образец РЕС агрегатов в db-N50 K50 Е50 собирали в конце стадии 4 (или d13). «Обедненный» образец представляли d12 РЕС агрегаты с добавлением db (DMEM с высоким содержанием глюкозы или DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 0,5х В-27 добавки (Life Technologies)) среды по отдельности (без факторов роста), и собирали в d13. Два «активированных» образца питали и культивировали в средах db на d12, затем на d13 питали либо db-K50 Е50 средами, либо db средами, содержащими 2% FBS, в течение 15 минут до сбора. Такие условия были предназначены для выявления RTK, которые были активными в условиях стадии 4, и чей ответ мог быть выявлен с импульсом KGF, EGF и инсулина (присутствовавшего в добавке В27), или сыворотке. Активация сывороткой предназначалась в качестве стимула факторов роста широкого спектра действия, потенциально идентифицирующего RTK, которые присутствовали на РЕС и могли быть активированы, но не стимулированы представленными условиями стадии 4.Four PEC samples were generated for RTK blotting analysis. An "equilibrium" sample of PEC aggregates in db-N50 K50 E50 was collected at the end of step 4 (or d13). The "lean" sample represented d12 PEC aggregates supplemented with db (high glucose DMEM or high glucose DMEM supplemented with 0.5x B-27 additive (Life Technologies)) media separately (no growth factors), and collected in d13 ... Two "activated" samples were fed and cultured in db media on d12, then on d13 were fed with either db-K50 E50 media or db media containing 2% FBS for 15 minutes before harvesting. These conditions were designed to detect RTKs that were active under stage 4 conditions, and whose response could be detected with a pulse of KGF, EGF and insulin (present in the B27 supplement), or serum. Serum activation was intended to stimulate broad spectrum growth factors potentially identifying RTKs that were present on the PEC and could be activated but not stimulated by the present stage 4 conditions.

Анализ RTK проводили по существу так, как описано ранее в Wang et al, (2007) выше. Вкратце, Proteome Profiler™ фосфо-RTK матрицы антител человека (R&D Systems) применяли в соответствии с инструкциями производителя. Белковые лизаты готовили в 1% NP-40, 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерине, 2,0 мМ ЭДТА, 1,0 мМ натрия ортованадата, 10 мкг/мл апротинина, и 10 мкг/мл лейпептина. 50 мкг свежих белковых лизатов инкубировали в течение ночи с нитроцеллюлозными мембранами, на которые наносили двойные пятна с 42 анти-RTK антителами и 5 негативными контрольными антителами, а также 8 анти-фосфотирозин-позитивных контрольных пятен (Фигура 5А). Матричные антитела улавливали экстрацеллюлярные домены фосфорилированных и нефосфорилированных RTK, а связанные фосфо-RTK выявляли с универсальным анти-фосфо-тирозиновым антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) с применением хемилюминесценции. См. фигуру 5 для размещения RTK матрицы, а также Таблицу 8 внизу для перечисления RTK в матрице.RTK analysis was performed essentially as described previously in Wang et al, (2007) above. Briefly, Proteome Profiler ™ phospho-RTK human antibody matrices (R&D Systems) were used according to the manufacturer's instructions. Protein lysates were prepared in 1% NP-40, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% glycerol, 2.0 mM EDTA, 1.0 mM sodium orthovanadate, 10 μg / ml aprotinin, and 10 μg / ml leupeptin. 50 μg of fresh protein lysates were incubated overnight with nitrocellulose membranes double-stained with 42 anti-RTK antibodies and 5 negative control antibodies, as well as 8 anti-phosphotyrosine-positive control spots (Figure 5A). Matrix antibodies captured the extracellular domains of phosphorylated and non-phosphorylated RTKs, and bound phospho-RTKs were detected with a universal anti-phosphotyrosine antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) using chemiluminescence. See Figure 5 for RTK matrix placement and Table 8 below for a listing of RTK in the matrix.

Анализ пятен RTK (Фигура 6А) показал, что инсулин- и IGF1-рецепторы (IR, IGF1R, соответственно) были фосфорилированы и активированы во всех условиях, подобно тому, что наблюдалось раньше с hESC. См. Wang et al (2007) выше. EGF рецептор (EGFR, также известный как ERBB1) был фосфорилирован в равновесных состояниях, которые ожидались с учетом присутствия EGF в среде на стадии 4. Действительно, низкоуровневое фосфорилирование ERBB2 наблюдалось как в равновесном состоянии, так и в обедненных условиях. Фосфорилирование и EGFR, и ERBB2 было повышено в каждом из активированных условий, что подтверждало способность анализа к выявлению активации в ответ на импульс лиганда. Фосфорилированный VEGFR3 был также выявлен во всех условиях, и был повышен в активированных образцах. Это позволило предположить, что РЕС продуцируют эндогенный VEGFR3 лиганд, возможными кандидатами являются VEGF-C и D. Сывороточный стимул, как оказалось, активировал дополнительные рецепторы, включая низкие уровни ERBB3 фосфорилирования. Обнаружение фосфорилированного ERBB2/3 показывает, что херегулин-подобный член семейства EGF может активировать передачу сигналов в PEC. ТТЕ-2 является одним из двух рецепторов ангиопоэтина, и как кажется, фосфорилируется в низких уровнях в ответ на сыворотку. Ангиопоэтин 1 и ангиопоэтин 4, как известно, являются активирующими лигандами ТГЕ-2, в то время как ангиопоэтин 2 и ангиопоэтин 3 функционируют как контекстно-зависимые конкурентные антагонисты. HGF-рецептор (HGFR) также фосфорилировался в ответ на сывороточный стимул, что позволило предположить, что фактор роста гепатоцитов может также вызывать передачу сигналов в РЕС. Наконец, в то время как был выявлен низкий уровень фосфорилирования эфрин В 2 RTK (ЕРНВ2), передача сигналов с помощью эфрин/Eph является мембрано-связанной системой передачи сигналов между клетками, и вряд ли легко используется в дифференцировке РЕС. Интересно, что ERBB4 не был фосфорилирован. Таким образом, анализ RTK выделил некоторые рецепторы, которые фосфорилировались в РЕС, или могли быть фосфорилированы в ответ на различные условия, например, сыворотку. Эти результаты позволили предположить, что некоторые растворимые лиганды могут вызывать передачу сигналов с помощью RTK в РЕС и возможно, воздействовать на пролиферацию клеток, дифференцировку и/или специализацию, и таким образом, возможно, влиять на последующее созревание в функционирующие панкреатические островки in vivo.Analysis of RTK spots (Figure 6A) showed that insulin and IGF1 receptors (IR, IGF1R, respectively) were phosphorylated and activated under all conditions, similar to that previously observed with hESC. See Wang et al (2007) above. The EGF receptor (EGFR, also known as ERBB1) was phosphorylated at equilibrium states that would be expected given the presence of EGF in the medium at stage 4. Indeed, low-level phosphorylation of ERBB2 was observed both at steady state and under impoverished conditions. Phosphorylation of both EGFR and ERBB2 was increased under each of the activated conditions, confirming the ability of the assay to detect activation in response to a ligand impulse. Phosphorylated VEGFR3 was also detected under all conditions, and was elevated in activated samples. This suggested that PECs produce an endogenous VEGFR3 ligand, possible candidates are VEGF-C and D. Serum stimulus appeared to activate additional receptors, including low levels of ERBB3 phosphorylation. The detection of phosphorylated ERBB2 / 3 indicates that a heregulin-like member of the EGF family can activate signaling in PECs. TTE-2 is one of two angiopoietin receptors and appears to be phosphorylated at low levels in response to serum. Angiopoietin 1 and angiopoietin 4 are known to be activating ligands of TGE-2, while angiopoietin 2 and angiopoietin 3 function as context-dependent competitive antagonists. The HGF receptor (HGFR) was also phosphorylated in response to serum stimulus, suggesting that hepatocyte growth factor may also induce PEC signaling. Finally, while low phosphorylation of ephrin B 2 RTK (EPHB2) has been identified, ephrin / Eph signaling is a membrane-bound signaling system between cells and is unlikely to be readily used in PEC differentiation. Interestingly, ERBB4 was not phosphorylated. Thus, RTK assay isolated some receptors that were phosphorylated in the PEC, or could be phosphorylated in response to various conditions, such as serum. These results suggested that some soluble ligands could induce RTK signaling in PEC and possibly affect cell proliferation, differentiation and / or specialization, and thus, possibly influence subsequent maturation into functioning pancreatic islets in vivo.

Пример 6.Example 6.

Херегулин и FGF2 факторы роста влияют на РЕС, полученные из композиций hESCHeregulin and FGF2 Growth Factors Affect PEC Derived from hESC Compositions

С учетом анализов RTK, которые показали, что некоторые RTK были активированы (или фосфорилированы) в определенных условиях, как описано выше в Примере 5, и поскольку было выявлено, что по меньшей мере ERBB2 и ERBB3 были активированы в РЕС (спустя 13 дней дифференцировки из стадий 1-4), автор настоящей заявки решил определить эффект херегулина при применении для клеток на стадии 3 и 4.Taking into account the RTK analyzes, which showed that some RTKs were activated (or phosphorylated) under certain conditions, as described above in Example 5, and since it was found that at least ERBB2 and ERBB3 were activated in PEC (after 13 days of differentiation from stages 1-4), the author of the present application decided to determine the effect of heregulin when applied to cells in stages 3 and 4.

Предварительные исследования проводили с применением херегулина и FGF. В некоторых из этих исследований включали ингибитор Rho-киназы, Y-27632. Эти предварительные исследования показали, что обработка плюрипотентных стволовых клеток в течение одного дня на стадии 1 с 10 нг/мл херегулина-1β (той же самой концентрацией и изомером херегулина, как описано в Wang et al. (2007)) повышала размер агрегатов клеток, полученных их hES клеток в суспензионной культуре, по сравнению с размером агрегатов, полученных их hES клеток в суспензионной культуре без херегулина-1β (Hrg1β). Повышение размера агрегатов клеток является предпочтительным в том, что приводит к более высокой массе клеток для последующей имплантации и анализа функций у животных. Кроме того, размер диска агрегатов повышался при увеличении Hrg1β от 10 нг/мл до 50 нг/мл на стадии 3. Этот результат также наблюдался, когда 50 нг/мл другого фактора роста, FGF2, использовали на стадии 3, по сравнению с культурами при отсутствии FGF2. Повышение размера агрегатов клеток также наблюдалось, когда культуры на стадии 3 подвергали дополнительным дням воздействия FGF2, например, 3 дня с 50 нг/мл FGF2, по сравнению с двумя днями.Preliminary studies were carried out using heregulin and FGF. Some of these studies included the Rho kinase inhibitor, Y-27632. These preliminary studies showed that treatment of pluripotent stem cells for one day in stage 1 with 10 ng / ml of Heregulin-1β (the same concentration and isomer of Heregulin as described in Wang et al. (2007)) increased the size of the cell aggregates. obtained from their hES cells in suspension culture, compared to the size of the aggregates obtained from their hES cells in suspension culture without heregulin-1β (Hrg1β). Increasing the size of cell aggregates is preferred in that it results in a higher cell mass for subsequent implantation and function analysis in animals. In addition, the disk size of the aggregates increased with increasing Hrg1β from 10 ng / ml to 50 ng / ml in stage 3. This result was also observed when 50 ng / ml of another growth factor, FGF2, was used in stage 3, compared to cultures at lack of FGF2. An increase in the size of cell aggregates was also observed when the stage 3 cultures were exposed to additional days of exposure to FGF2, for example 3 days with 50 ng / ml FGF2, compared to two days.

В Таблице 9 приведено краткое изложение анализа проточной цитометрией РЕС клеток, обработанных Hrg1β и FGF2 на стадии 3 и/или 4. Эндокринные клетки обозначались как CHGA позитивные (или CHGA+) клетки, а не-эндокринные клетки обозначались как CHGA негативные (или CHGA-) клетки. Эндокринные (CHGA+) и не-эндокринные клетки (CHGA-) могли позитивно окрашиваться на другие маркеры, например, позитивные на PDX1 и/или NKX6.1. Клетки, которые не окрашивались на какие-либо из тестируемых маркеров, обозначались как тройные негативные клетки или остальные клетки (CHGA-/NKX6.1-/PDX1).Table 9 summarizes the flow cytometric analysis of PEC cells treated with Hrg1β and FGF2 in stages 3 and / or 4. Endocrine cells were designated as CHGA positive (or CHGA +) cells, and non-endocrine cells were designated as CHGA negative (or CHGA-) cells. Endocrine (CHGA +) and non-endocrine cells (CHGA-) could stain positively for other markers, eg PDX1 and / or NKX6.1 positive. Cells that did not stain for any of the test markers were designated as triple negative cells or remaining cells (CHGA- / NKX6.1- / PDX1).

Hg, Херегулин-β; FGF2, Фактор роста фибробластов 2; Hrg10, 10 нг/мл херегулина-β; Hrg50, 50 нг/мл херегулина-1β; 2d FGF-50, 50 нг/мл FGF2 в течение 2 дней на стадии 3; 3d FGF2-50, 50 нг/мл FGF2 в течение 3 дней на стадии 3.Hg, Heregulin-β; FGF2, Fibroblast Growth Factor 2; Hrg10, 10 ng / ml Heregulin-β; Hrg50, 50 ng / ml Heregulin-1β; 2d FGF-50, 50 ng / ml FGF2 for 2 days in stage 3; 3d FGF2-50, 50 ng / ml FGF2 for 3 days in stage 3.

Чтобы определить, действительно ли повышение размера агрегатов клеток влияет на субпопуляции РЕС, композиции из РЕС популяций анализировали проточной цитометрией. По равнению с контрольными культурами, где не применяли ни Hrg1β, ни FGF2 для дифференцировки клеток, не-эндокринная субпопуляция PEC (CHGA-) повышалась от 54,01% до 61,2% при добавлении 10 нг/мл Hrg1β на стадии 3, и повышалась от 54,01% до 64,2% при добавлении 50 нг/мл Hrg1β на стадии 3. На эндокринную субпопуляцию (CHGA+) не оказывала существенного влияния обработка 10 нг/мл Hrg1β, тем более с 50 нг/мл. При этом относительные уровни остальных клеток снижались, и тем более с 50 нг/мл Hrg1β. Таким образом, повышение размера агрегатов клеток при обработке Hrg1β связано главным образом с повышением неэндокринных субпопуляций, относительно эндокринных и остальных субпопуляций.To determine whether an increase in the size of cell aggregates actually affects the PEC subpopulations, compositions from the PEC populations were analyzed by flow cytometry. Compared to control cultures that did not use either Hrg1β or FGF2 for cell differentiation, the non-endocrine PEC subpopulation (CHGA-) increased from 54.01% to 61.2% with the addition of 10 ng / ml Hrg1β in stage 3, and increased from 54.01% to 64.2% with the addition of 50 ng / ml Hrg1β at stage 3. The endocrine subpopulation (CHGA +) was not significantly affected by treatment with 10 ng / ml Hrg1β, especially with 50 ng / ml. At the same time, the relative levels of the remaining cells decreased, and even more so from 50 ng / ml Hrg1β. Thus, an increase in the size of cell aggregates upon treatment with Hrg1β is mainly associated with an increase in non-endocrine subpopulations relative to endocrine and other subpopulations.

Влияние FGF2 на культуры стадии 3 было схожим, но более выраженным, чем для Hrg1β. Например, не-эндокринная субпопуляция PEC (CHGA-) повышалась, как с Hrg1β. Основным эффектом FGF2 в этих культурах было существенное снижение эндокринной субпопуляции. В некоторых случаях эти клетки почти не выявлялись за 3 дня обработки (от 32,9% до 0,33%). Таким образом, повышение размера агрегатов клеток для культур, обработанных FGF2, было главным образом связано с повышением не-эндокринных, а в некоторых случаях остальных субпопуляций (от 13,1% до 22,7% в течение 3 дней на стадии 3).The effect of FGF2 on stage 3 cultures was similar, but more pronounced than for Hrg1β. For example, the non-endocrine PEC subpopulation (CHGA-) increased as with Hrg1β. The main effect of FGF2 in these cultures was a significant reduction in the endocrine subpopulation. In some cases, these cells were almost not detected after 3 days of treatment (from 32.9% to 0.33%). Thus, the increase in the size of cell aggregates for the cultures treated with FGF2 was mainly associated with an increase in non-endocrine and, in some cases, the rest of the subpopulations (from 13.1% to 22.7% within 3 days at stage 3).

Таким образом, херегулин и/или FGF2, как кажется, играют роль в специализации клеток в популяциях РЕС.Это было неожиданным с учетом того, что Wang et al (2007) выше сообщали, что херегулин по отдельности играет роль в обновлении клеток при использовании в среде с плюрипотентными стволовыми клетками.Thus, heregulin and / or FGF2 appear to play a role in cell specialization in PEC populations, which was unexpected given that Wang et al (2007) reported above that heregulin alone plays a role in cell renewal when used in environment with pluripotent stem cells.

Пример 7Example 7

Способы улучшения функции трансплантата из PEC in vivo путем обработки культур клеток, полученных из iPSC, херегулиномMethods for Improving PEC Graft Function in Vivo by Treating iPSC Derived Cell Cultures with Heregulin

Поскольку способы в соответствии с Таблицей 7 при применении к iPSC для получения iPEC не обеспечивали устойчивой функции in vivo у животных, авторы настоящей заявки разработали другие способы для получения iPEC. Изменения стандартного способа, указанного в Таблице 7, включают: оптимизацию числа пассажей iPSC; модуляцию уровней BMP сигналинга; модуляцию параметров агрегации суспензии iPSC во время экспансии и дифференцировки (например, скорости сдвига, скорости вращения, и тому подобное); оптимизацию концентраций, времени применения и продолжительности применения факторов роста, таких как Wnt, активин и ингибиторы rho-киназы; и обработку другими факторами роста на различных стадиях 1-4 протокола дифференцировки в качестве кандидатов для улучшения массы клеток, пролиферации, дифференцировки, выживания и тому подобного (например, ERBB лиганды), но не ограничиваются ими. Многие повторные эксперименты были проведены по отдельности, или в комбинации, для определения того, какие способы дифференцировки для iPSC на стадиях 1-4 могут быть оптимизированы. Такие оптимизированные способы дифференцировки, продуцирующие iPEC популяции, которые затем трансплантировали, привели к устойчивым чувствительным к глюкозе инсулин-секретирующим клеткам in vivo, подобным тем, что наблюдалось и сообщалось для hESC. В Таблице 10 ниже описаны базовые условия, с херегулином и без него, которые, как было показано, дифференцируют iPSC в iPEC, которые позднее созревают в чувствительные к глюкозе островковые клетки in vivo. Базовые условия были подобны тем, которые описаны в Примерах 1, 2 и 5, а также в Таблице 7, за тем исключением, что херегулин добавляли на стадиях 3 и 4. Хотя использовали 30 нг/мл Hrg1β, пригодны концентрации в диапазоне от 10 нг/мл до 50 нг/мл, или даже больше 50 нг/мл. Кроме того, добавление ингибитора rho-киназы, Y-27632, поддерживали в дифференцирующих культурах, как описано в Примере 2.Since the methods according to Table 7 when applied to the iPSC to obtain iPEC did not provide robust in vivo function in animals, the authors of the present application have developed other methods for obtaining iPEC. Changes to the standard method shown in Table 7 include: optimizing the iPSC passages; modulation of BMP signaling levels; modulating the aggregation parameters of the iPSC suspension during expansion and differentiation (eg, shear rate, rotation rate, and the like); optimization of concentrations, timing of application and duration of application of growth factors such as Wnt, activin and rho kinase inhibitors; and treatment with, but not limited to, other growth factors at various stages 1-4 of the differentiation protocol as candidates for improving cell mass, proliferation, differentiation, survival, and the like (eg, ERBB ligands). Many repeated experiments were performed, singly or in combination, to determine which differentiation methods for iPSC stages 1-4 could be optimized. Such optimized differentiation methods, iPEC-producing populations that were then transplanted, resulted in glucose-resistant insulin-secreting cells in vivo, similar to those observed and reported for hESC. Table 10 below describes the baseline conditions, with and without heregulin, that have been shown to differentiate iPSCs into iPECs, which later mature into glucose sensitive islet cells in vivo. The baseline conditions were similar to those described in Examples 1, 2 and 5, and also in Table 7, except that heregulin was added in steps 3 and 4. Although 30 ng / ml Hrg1β was used, concentrations ranging from 10 ng / ml up to 50 ng / ml, or even more than 50 ng / ml. In addition, the addition of the rho kinase inhibitor, Y-27632, was maintained in differentiation cultures as described in Example 2.

iPSC Aggs: агрегаты iPSC; KSR: нокаутная сыворотка (Life Technologies); F10: 10 нг/мл bFGF (R&D Systems); A10: 10 нг/мл активина A (R&D Systems); A100: 100 нг/мл активина A; r0.2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); 0,2% FBS (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), 1% о/о пенициллина/стрептомицина; ITS: Инсулин-трансферрин-селен (Life Technologies), разбавленный 1:5000 или 1:1000; A100: 100 нг/мл рекомбинантного активина А человека (R&D Systems); K25: 25 нг/мл рекомбинантного KGF человека (R&D Systems); СТТ3: 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (Toronto Research Chemicals) и 3 нМ TTNPB (Sigma-Aldrich); N50: 50 нг/мл рекомбинантного ноггина человека (R&D Systems); K50: 50 нг/мл рекомбинантного KGF человека (R&D Systems); Е50: 50 нг/мл рекомбинантного EGF человека (R&D Systems); Y10: 10 мкМ Y-27632 (маточный раствор 20 мМ, 2000Х; Н30: 30 нг/мл херегулина (маточный раствор 100 мкг/мл); db, DMEM (с высоким содержанием глюкозы)iPSC Aggs: iPSC aggregates; KSR: knockout serum (Life Technologies); F10: 10 ng / ml bFGF (R&D Systems); A10: 10 ng / ml Activin A (R&D Systems); A100: 100 ng / ml activin A; r0.2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); 0.2% FBS (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), 1% v / v penicillin / streptomycin; ITS: Insulin Transferrin Selenium (Life Technologies) diluted 1: 5000 or 1: 1000; A100: 100 ng / ml recombinant human activin A (R&D Systems); K25: 25 ng / ml recombinant human KGF (R&D Systems); CTT3: 0.25 μM KAAD-cyclopamine (Toronto Research Chemicals) and 3 nM TTNPB (Sigma-Aldrich); N50: 50 ng / ml recombinant human noggin (R&D Systems); K50: 50 ng / ml recombinant human KGF (R&D Systems); E50: 50 ng / ml recombinant human EGF (R&D Systems); Y10: 10 μM Y-27632 (20 mM stock, 2000X; H30: 30 ng / ml heregulin (100 μg / ml stock); db, DMEM (high glucose)

Для определения эффекта добавления херегулина, или херегулина и ингибитора rho-киназы в субпопуляции клеток на стадии 3 и 4, iPEC популяции анализировали проточной цитометрией. В Таблице 11 приведено краткое изложение анализа посредством проточной цитометрии различных популяций iPEC с применением набора рецептур, приведенных в Таблице 10, а также таких рецептур, модифицированных путем повышения концентрации активина до 200 нг/мл. Кроме того, в Таблице 11 показаны общие условия, установленные для каждого набора экспериментов (базовые условия с херегулином или без него), и относительные проценты типов клеток в популяции iPEC (эндокринных, не-эндокринных, только PDX1 и тройных негативных или остальных субпопуляций клеток). В Таблице 11 также описаны данные, касающиеся функции in vivo клеток, полученных в каждом эксперименте.To determine the effect of adding heregulin, or heregulin and an rho kinase inhibitor to the cell subpopulation in steps 3 and 4, the iPEC population was analyzed by flow cytometry. Table 11 summarizes the flow cytometric analysis of various iPEC populations using the set of formulations shown in Table 10, as well as those formulations modified by increasing the concentration of activin to 200 ng / ml. In addition, Table 11 shows the general conditions established for each set of experiments (baseline conditions with or without heregulin) and the relative percentages of cell types in the iPEC population (endocrine, non-endocrine, PDX1 only and triple negative or remaining cell subpopulations) ... Table 11 also describes the in vivo cell function data obtained in each experiment.

BL, базовые условия; hIPSC, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека; Hg30, 30 нг/мл херегулина-11 St 3+4, Стадии 3 и 4; hESC, эмбриональные стволовые клетки человека; CHGA, хромогранин А.BL, basic conditions; hIPSC-induced human pluripotent stem cells; Hg30, 30 ng / ml Heregulin-11 St 3 + 4, Stages 3 and 4; hESC, human embryonic stem cells; CHGA, chromogranin A.

При определенных условиях отношение субпопуляций клеток в PEC (hESC, Е2354) и iPEC (Е2314, Е2344, Е2347) популяциях изменялось. Например, иногда процент эндокринных (CHGA+) клеток снижался, а процент не-эндокринных клеток (CHGA-/NKX6.1+/PDX1+) повышался, по сравнению с базовыми условиями (без херегулина). Хотя кажется, что херегулин был ответственным за изменение пропорций эндокринных клеток относительно не-эндокринных клеток в этих РЕС и iPEC популяциях, в эксперименте #2380 (Е2380), уровень эндокринных (CHGA+) скорее повышался, чем снижался с добавлением херегулина.Under certain conditions, the ratio of cell subpopulations in PEC (hESC, E2354) and iPEC (E2314, E2344, E2347) populations changed. For example, sometimes the percentage of endocrine (CHGA +) cells decreased and the percentage of non-endocrine cells (CHGA- / NKX6.1 + / PDX1 +) increased compared to baseline conditions (without heregulin). Although heregulin appears to be responsible for changing the proportions of endocrine cells relative to non-endocrine cells in these PEC and iPEC populations, in experiment # 2380 (E2380), endocrine (CHGA +) levels increased rather than decreased with the addition of heregulin.

Чтобы определить, действительно ли изменение в составе РЕС и iPEC популяций влияет на функцию in vivo, РЕС и iPEC трансплантаты из большинства экспериментов, описанных в Таблице 11, трансплантировали мышам подкожно, как описано ранее в другом патенте автора настоящей заявки и не-патентных публикациях, включая Schulz et al. (2012) и Kroon et al (2008), выше, и патенты США №№7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 и 8,278,106, выше. Вкратце, РЕС и iPEC полностью инкапсулировали биодеградируемым полупроницаемым устройством для инкапсулирования клеток, некоторая часть которого включала микроперфорации. Устройства были произведены автором настоящей заявки и описаны подробно в патенте США №8,278,106, озаглавленном «Инкапсулирование панкреатических клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Анализы стимулированной глюкозой секреции инсулина (GSIS) проводили, начиная примерно 56 дней после имплантации. Кровь собирали до (натощак) и спустя 30 и/или 60 минут после применения глюкозы. Функцию трансплантата оценивали путем измерения концентраций С-пептида в сыворотке в ответ на применение глюкозы.To determine whether a change in the composition of PEC and iPEC populations actually affects in vivo function, PEC and iPEC grafts from most of the experiments described in Table 11 were transplanted subcutaneously into mice, as previously described in another patent of the present application and non-patent publications. including Schulz et al. (2012) and Kroon et al (2008), supra, and US Pat. Nos. 7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 and 8,278,106 above. Briefly, PEC and iPEC were completely encapsulated with a biodegradable semi-permeable cell encapsulation device, some of which involved microperforations. The devices were manufactured by the present applicant and are described in detail in US Pat. No. 8,278,106 entitled “Encapsulation of Pancreatic Cells from Human Pluripotent Stem Cells,” filed Nov. 13, 2009, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assays were performed starting approximately 56 days after implantation. Blood was collected before (on an empty stomach) and 30 and / or 60 minutes after glucose application. Graft function was assessed by measuring serum C-peptide concentrations in response to glucose application.

Количество С-пептида человека, высвобождаемого в сыворотку, является показателем количества высвобождаемого инсулина. С-пептид является коротким пептидом из 31 аминокислоты, соединяющим или связывающим А и В-цепи проинсулина и препроинсулина, который секретируется функциональными бета- или инсулин-секретирующими клетками. Как обсуждалось раньше Kroon et al. (2008) выше и другими, анализ С-пептида человека пригоден для оценки высвобождения инсулина, генерируемого de novo имплантированными клетками. Таким образом, уровни С-пептида человека в сыворотке этих животных являются мерой функции in vivo зрелых РЕС и iPEC трансплантатов. С-пептид человека определялся в сыворотке по меньшей мере спустя 8 недель после имплантации. С дополнительными неделями после имплантации и натощак, уровни стимулированного глюкозой С-пептида повышались со сдвигом пиковых уровней С-пептида от 60 минут до 30 минут после применения глюкозы, что является показателем более быстрого ответа на глюкозную нагрузку, когда инсулиновые клетки созревают. У некоторых мышей не проявлялась функция, или их умерщвляли из-за плохого состояния здоровья; однако, эти мыши относились к группам, которые в остальном были животными с высоким проявлением функции, что, таким образом, скорее указывает на недостаточность приживления, чем на неспособность имплантированных клеток к дифференцировке и функционированию.The amount of human C-peptide released into serum is an indication of the amount of insulin released. C-peptide is a short 31 amino acid peptide connecting or linking the A and B chains of proinsulin and preproinsulin, which is secreted by functional beta or insulin secreting cells. As discussed earlier, Kroon et al. (2008) supra and others, a human C-peptide assay is useful for assessing insulin release generated de novo by implanted cells. Thus, the serum levels of human C-peptide from these animals are a measure of the in vivo function of mature PEC and iPEC grafts. Human C-peptide was detectable in serum at least 8 weeks after implantation. With additional weeks post-implantation and fasting, glucose-stimulated C-peptide levels increased with peak C-peptide levels shifted from 60 minutes to 30 minutes after glucose application, indicative of a faster response to glucose load as insulin cells mature. Some mice failed to show function or were sacrificed due to poor health; however, these mice belonged to groups that were otherwise highly functional animals, thus indicating a failure of engraftment rather than an inability of the implanted cells to differentiate and function.

Фигуры 7А-С демонстрируют уровни С-пептида человека в сыворотке после применения глюкозы для всех экспериментов, указанных в таблице 11, за исключением Е2344. Фигуры 7А-С показывают, что по сравнению с контролями базового уровня, эти трансплантаты, полученные при обработке херегулином, в целом обеспечивали более высокие уровни сывороточного С-пептида человека. Например, на Фигуре 7А в эксперименте 2380 отмечалось примерно 5-кратное повышение (933 пМ : 200 пМ спустя 60 минут после применения глюкозы) для трансплантатов, полученных при обработке херегулином, по сравнению с трансплантатами, полученными без херегулина (базовый уровень). Херегулин, как кажется, оказывает меньшее влияние на РЕС, полученные из hESC, поскольку эксперимент 2354 (Фиг. 7С) не показал более высоких уровней сывороточного С-пептида в трансплантатах, полученных при обработке херегулином, по сравнению с контролями базового уровня. Далее, при сравнении РЕС, полученных из iPSC, iPEC трансплантаты имели сопоставимую функцию in vivo с РЕС трансплантатами (например, сравните Фиг. 7А и Фиг. 7В (iPSC трансплантаты) с Фиг. 7С (СуТ203 hESC). По существу, iPEC трансплантаты являются такими же устойчивыми, как РЕС трансплантаты. Кроме того, взаимные отношения эндокринных и не-эндокринных клеток, которые, как кажется, влияют на некоторые популяции iPEC (например, Е2314, Е2347 и Е2354), не влияют на функцию in vivo, поскольку iPEC из Е2380, которые не имеют того же самого сдвига в эндокринной и неэндокринной субпопуляции, также показали хорошую функцию (см. Фиг. 7А-С).Figures 7A-C show serum levels of human C-peptide after glucose application for all experiments shown in Table 11 except for E2344. Figures 7A-C show that compared to baseline controls, these grafts obtained from heregulin treatment generally provided higher levels of human serum C-peptide. For example, in Figure 7A, experiment 2380 showed an approximately 5-fold increase (933 pM: 200 pM 60 minutes after glucose application) for grafts obtained with heregulin compared to grafts obtained without heregulin (baseline). Heregulin appears to have less effect on hESC-derived PECs, as experiment 2354 (Fig. 7C) did not show higher levels of serum C-peptide in grafts obtained from heregulin compared to baseline controls. Further, when comparing PEC derived from iPSCs, iPEC grafts had comparable in vivo function to PEC grafts (e.g. compare Fig. 7A and Fig. 7B (iPSC grafts) with Fig. 7C (CyT203 hESC). Essentially, iPEC grafts are as resistant as PEC grafts.In addition, the mutual relationship of endocrine and non-endocrine cells, which appears to affect some iPEC populations (eg E2314, E2347 and E2354), do not affect in vivo function, since iPEC from E2380, which do not have the same shift in the endocrine and non-endocrine subpopulations, also showed good function (see Fig. 7A-C).

В дополнение к анализу стимулированной глюкозой секреции инсулина, трансплантаты зрелых iPEC тестировали, чтобы определить, действительно ли они по отдельности способны поддержать эугликемию, подобно эугликемии, поддерживаемой РЕС, полученными из hESC, если бета-клетки животного-хозяина разрушены. Это включало разрушение бета-клеток мыши, которой проводили имплантацию, с применением бета-клеточного токсина, стрептозотоцина (STZ), который проявляет большую цитотоксичность против бета-клеток мыши, по сравнению с бета-клетками человека. Произвольные измерения глюкозы крови не-натощак проводили для каждой мыши до и после обработки STZ. При удалении iPEC трансплантата на 13 день после обработки STZ гипергликемия восстанавливалась (отмечался подъем уровня глюкозы), что демонстрировало контроль гликемии iPEC трансплантатом, а не собственной поджелудочной железой мыши (см. Фиг. 8А и Фиг. 8В).In addition to assaying glucose-stimulated insulin secretion, mature iPEC grafts were tested to determine if they were individually capable of supporting euglycemia, similar to euglycemia supported by hESC-derived PECs, if the beta cells of the host animal are disrupted. This involved disrupting the beta cells of the implanted mouse using a beta cell toxin, streptozotocin (STZ), which is more cytotoxic against mouse beta cells than human beta cells. Non-fasting random blood glucose measurements were performed for each mouse before and after STZ treatment. With the removal of the iPEC graft on day 13 after STZ treatment, hyperglycemia was restored (there was a rise in glucose levels), demonstrating control of iPEC graft glycemia rather than the mouse's own pancreas (see Fig. 8A and Fig. 8B).

Кроме того, выражен синергетический эффект, когда херегулин и ингибитор rho-киназы были обеспечены во время 1-4 стадий дифференцировки (см. Таблицу 10). Например, iPSC, обработанные херегулином на стадиях 3 и 4 без ингибитора rho-киназы, приводили к ощутимо меньшей массе клеток, что делало имплантацию невозможной. Дополнительное доказательство синергизма херегулина и ингибитора rho-киназы было приведено в некоторых экспериментах, например, Е2356, Е2380, в то время как базовые условия с ингибитором rho-киназы по отдельности не обеспечивали устойчивой функции, как у трансплантата с ингибитором rho-киназы и херегулином (см. Фигуры 7А и В). Как кажется, обработка херегулином и ингибитором rho-киназы не была дополнительной, поскольку добавление херегулина по отдельности обеспечивало недостаточную массу клеток для трансплантации, а добавление ингибитора rho-киназы по отдельности (базовые условия) вызывало плохую функцию in vivo. Таким образом, обеспечение херегулина по отдельности или ингибитора rho-киназы по отдельности по существу не является схожим с суммой эффектов двух комбинированных веществ. Таким образом, по отдельности ни один из них не обеспечивает устойчивого ответа на глюкозу in vivo, но при объединении они обеспечивают ответ на глюкозу, схожий с ответом клеток, полученных из hES клеток. Соответственно, представляется, что обеспечение и херегулина, и ингибитора rho-киназы является синергетическим, поскольку их комбинированный эффект превышает сумму этих эффектов каждого из них по отдельности. Таким образом, iPEC, обработанные ингибитором rho-киназы и херегулином, созревают in vivo, проявляя стимулированную глюкозой секрецию инсулина, и являясь способными к сохранению эугликемии на модели диабета мыши (см. Фиг. 7А-В и Фиг. 8А-В).In addition, a synergistic effect was expressed when heregulin and the rho kinase inhibitor were provided during stages 1-4 of differentiation (see Table 10). For example, iPSCs treated with heregulin in stages 3 and 4 without the rho kinase inhibitor resulted in a significantly lower cell mass, which made implantation impossible. Additional evidence for the synergism of heregulin and rho kinase inhibitor was provided in some experiments, for example, E2356, E2380, while the base conditions with the rho kinase inhibitor alone did not provide stable function, as in the graft with the rho kinase inhibitor and heregulin ( see Figures 7A and B). The treatment with heregulin and the rho kinase inhibitor did not appear to be additional, since the addition of heregulin alone provided insufficient cell mass for transplantation, and the addition of the rho kinase inhibitor alone (baseline conditions) caused poor in vivo function. Thus, providing heregulin alone or a rho kinase inhibitor alone is not substantially similar to the sum of the effects of the two combined substances. Thus, alone, none of them provide a sustained glucose response in vivo, but when combined, they provide a glucose response similar to that of cells derived from hES cells. Accordingly, it appears that the provision of both heregulin and the rho kinase inhibitor is synergistic, since their combined effect exceeds the sum of these effects of each of them separately. Thus, iPEC treated with the rho kinase inhibitor and heregulin matured in vivo, exhibiting glucose-stimulated insulin secretion, and being capable of maintaining euglycemia in a mouse diabetes model (see Figs. 7A-B and Fig. 8A-B).

Функция ERBB требует связывания лиганда, димеризации рецепторов, и миграции рецептора. Вариабельность каждого процесса может привести к дифференциальной регуляции рецепторов и нисходящих сигналов, которые они контролируют. Например, различные ERBB лиганды связываются с ERBB рецепторами с различной аффинностью, таким образом, изменяя характеристики и динамику образования ERBB димеров. В Таблице 12 показано множество различных комбинаций лигандов и комплексов, связывающих рецепторы. Обзоры, касающиеся сложности этой системы, обеспечены Oda, et al. (2005) «А comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling)), Mol. Syst. Biol., 1 (2005) («Исчерпывающая карта пути сигналинга рецептора эпидермального фактора роста») и Lazzara et al. (2009) «Quantitative modeling perspectives on the ERBB system of cell regulatory processes)), Experimental Cell Research 315(4):717-725 («Перспективы количественного модулирования на системе ERBB регуляторных клеточных процессов»), описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.ERBB function requires ligand binding, receptor dimerization, and receptor migration. The variability of each process can lead to differential regulation of the receptors and the downstream signals that they control. For example, different ERBB ligands bind to ERBB receptors with different affinities, thus altering the characteristics and dynamics of ERBB dimer formation. Table 12 shows many different combinations of ligands and receptor binding complexes. Reviews regarding the complexity of this system are provided by Oda, et al. (2005) “A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling)), Mol. Syst. Biol., 1 (2005) (“A Comprehensive Map of the Epidermal Growth Factor Receptor Signaling Pathway”) and Lazzara et al. (2009) “Quantitative modeling perspectives on the ERBB system of cell regulatory processes)), Experimental Cell Research 315 (4): 717-725 (“ Prospects for the quantitative modulation of regulatory cellular processes on the ERBB system ”), the descriptions of which are fully included in this description. via link.

ERRB рецепторные тирозинкиназы: ErbB1 (также обозначаемый как Her1, или рецептор эпидермального фактора роста, EGFR); ErbB2 (также обозначаемый как рецептор эпидермального фактора роста человека, или Her2; или Neu); ErbB3 (также обозначаемый как Her3), ErbB4 (также обозначаемый как Her4), ERBB лиганды: EGF, эпидермальный фактор роста; TGFα, трансформирующий фактор роста α; HB-EGF, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста; EPR, эпирегулин; EPG, эпиген; AR, амфирегулин, Hrg1, херегулин-1 или нейрегулин-1; Hrg2, херегулин-2 или нейрегулин-2; Hrg3, херегулин-3 или нейрегулин-3; Hrg4, херегулин-4 или нейрегулин-4; херегулин применяется взаимозаменяемо с нейрегулином.ERRB receptor tyrosine kinases: ErbB1 (also referred to as Her1, or epidermal growth factor receptor, EGFR); ErbB2 (also referred to as human epidermal growth factor receptor, or Her2; or Neu); ErbB3 (also referred to as Her3), ErbB4 (also referred to as Her4), ERBB ligands: EGF, epidermal growth factor; TGFα, transforming growth factor α; HB-EGF, heparin-binding EGF-like growth factor; EPR, epiregulin; EPG, epigen; AR, amphiregulin, Hrg1, heregulin-1 or neuregulin-1; Hrg2, Heregulin-2 or Neuregulin-2; Hrg3, Heregulin-3, or Neuregulin-3; Hrg4, Heregulin-4 or Neuregulin-4; Heregulin is used interchangeably with neuregulin.

Huotari et al. предположил, что нейрегулин-4 может модулировать относительные уровни субпопулций эндокринных клеток путем повышения числа соматостатиновых (дельта) клеток при расходе глюкагоновых (альфа) клеток, и что нейрегулин-4 не влияет на отношение экзокринных (например, секретирующих амилазу) и эндокринных (например, секретирующих β-инсулин, α-глюкагон, δ-соматостатин, РР-панкреатический полипептид) клеток. Однако эти исследования выполняли путем инкубации нейрегулина 4 на тотальных органных культурах тканей, полученных от мышей в день Е12.5. Эти популяции клеток после эксплантации у мышей были дифференцированы дальше популяций клеток со стадии 3 (например, PDX1 негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) и/или стадии 4 (PDX1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, описанных в настоящей заявке. Нейрегулин-4 связывает только ERBB4 RTK, так что только эндокринная субпопуляция тотальной органной культуры мыши может быть модулирована нейрегулином-4 в этом контексте. Таким образом, не ожидается, что обработка на стадии 3 (PDX1 негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) и/или стадии 4 (PDX1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта) клеток, как описано в настоящей заявке с лигандом, иным чем ERBB, например, Hrg1, будет модулировать относительные эндокринные субпопуляции как в Huotari, поскольку уже было показано, что Hrg1 связывается с ERBB3 и индуцирует димеризацию ERBB2/3. Однако, из-за низкоуровневого экспрессии ERBB2 и 3 в РЕС, как показано на Фиг. 6, неясно, будут ли типы клеток на стадии 3 и 4 экспрессировать низкие или высокие уровни ERBB2 и 3 для связывания с Hrg1.Huotari et al. suggested that neuregulin-4 can modulate the relative levels of subpopulations of endocrine cells by increasing the number of somatostatin (delta) cells at the expense of glucagon (alpha) cells, and that neuregulin-4 does not affect the ratio of exocrine (for example, secreting amylase) and endocrine (for example, secreting β-insulin, α-glucagon, δ-somatostatin, PP-pancreatic polypeptide) cells. However, these studies were performed by incubating neuregulin 4 on total organ tissue cultures obtained from mice on day E12.5. These cell populations, after explantation in mice, were differentiated beyond the cell populations from stage 3 (eg, PDX1 negative endoderm of the anterior gastrointestinal tract) and / or stage 4 (PDX1 positive endoderm of the anterior gastrointestinal tract, described herein. Neuregulin-4 only binds ERBB4 RTK, so that only the endocrine subpopulation of mouse total organ culture can be modulated by neuregulin-4 in this context.Thus, treatment in stage 3 (PDX1 negative anterior endoderm) and / or stage 4 (PDX1 positive endoderm of the anterior GI tract) cells as described herein with a ligand other than ERBB, for example Hrg1, will modulate relative endocrine subpopulations as in Huotari, since Hrg1 has already been shown to bind to ERBB3 and induce ERBB2 / 3 dimerization. However, due to the low level expression of ERBB2 and 3 in PEC, as shown in Fig. 6, n it is unclear whether the cell types in stages 3 and 4 will express low or high levels of ERBB2 and 3 for Hrg1 binding.

Далее, в другом контексте, автор настоящей заявки описали, что Hrg1 связывается ERRB 2/3 и стимулирует самообновление плюрипотентных стволовых клеток (см. Wang et al (2007)). Хотя возможно, что Hrg1 может действовать с той же самой емкостью в контексте стадии 3 и 4, автор настоящей заявки ранее описывал, что большая часть экспансии клеток для получения РЕС осуществляется на стадии плюрипотентных стволовых клеток (стадия 0). Во время стадии 0 hESC выращивали, пассировали и подвергали экспансии в течение примерно двух (2) недель. Таким образом, большая часть экспансии клеток или самообновления для обеспечения экспансии клеток не происходит во время стадий 1-4. См. Schulz et al. (2012) выше. Также, если предположить, что ERRB2/3 присутствует во время стадий 3 и 4, можно ожидать, что херегулин будет проявлять тот же самый эффект, как с плюрипотентными стволовыми клетками (самообновление), в отличие от влияния на направленную дифференцировку. Различие в функции, как кажется, зависит от контекста, т.е. плюрипотентные стволовые клетки против типа клеток энтодермы или панкреатической линии.Further, in a different context, the present applicant described that Hrg1 binds to ERRB 2/3 and stimulates self-renewal of pluripotent stem cells (see Wang et al (2007)). While it is possible that Hrg1 can act with the same capacity in the context of steps 3 and 4, the present applicant has previously described that most of the cell expansion to produce PEC occurs at the pluripotent stem cell step (step 0). During stage 0, hESCs were grown, passaged and expanded for about two (2) weeks. Thus, most of the cell expansion or self-renewal to support cell expansion does not occur during stages 1-4. See Schulz et al. (2012) above. Also, assuming that ERRB2 / 3 is present during stages 3 and 4, heregulin can be expected to exhibit the same effect as with pluripotent stem cells (self-renewal), in contrast to the effect on directed differentiation. The difference in function seems to depend on the context, i.e. pluripotent stem cells against endoderm cell type or pancreatic lineage.

В целом, обеспечивая херегулин, или херегулин и ингибитор rho-киназы in vitro для клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта (стадия 3) и PDX1 экспрессирующих клеток панкреатической энтодермы (конец стадии 3 и стадия 4), получают популяции РЕС и iPEC, которые после трансплантации созревают и развиваются в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo (см. Фигуры 7 и 8). Такое применение херегулина, или херегулина и ингибитора rho-киназы указано нами в первый раз. Такое применение и эффект не отличаются от ранее описанных в патентной или не-патентной литературе.In general, by providing heregulin, or heregulin and an in vitro rho kinase inhibitor for anterior gastrointestinal tract endoderm cells (stage 3) and PDX1 expressing pancreatic endoderm cells (end of stage 3 and stage 4), PEC and iPEC populations are obtained, which after transplantation mature and develop into glucose-sensitive insulin-secreting cells in vivo (see Figures 7 and 8). This is the first time we have indicated such use of heregulin, or heregulin and an inhibitor of rho kinase. This application and effect does not differ from those previously described in the patent or non-patent literature.

Необходимо понимать, что результаты Q-PCR, описанные в настоящей заявке, могут быть дополнительно подтверждены с помощью иммуноцитохимии (ICC), и могут быть легко получены рядовым специалистом в данной области техники.It should be understood that the Q-PCR results described herein can be further confirmed by immunocytochemistry (ICC) and can be readily obtained by one of ordinary skill in the art.

Способы, композиции и устройства, описанные в настоящей заявке, представляют предпочтительные варианты осуществления, и являются примерными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения и другие виды применения очевидны для специалистов в данной области техники и охватываются сущностью настоящего изобретения и определяются объемом описания. Соответственно, для специалиста в данной области техники очевидно что различные замены и модификации могут быть выполнены в раскрытом изобретении без отделения от объема и сущности изобретения.The methods, compositions, and devices described herein represent preferred embodiments, and are exemplary and not intended to limit the scope of the invention. Variations and other uses are obvious to those skilled in the art and are encompassed by the spirit of the present invention and are determined by the scope of the description. Accordingly, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions and modifications can be made in the disclosed invention without departing from the scope and spirit of the invention.

Выражение «по существу состоящий из», использующееся в формуле изобретения и в описании, означает включение любых элементов, перечисленных после выражения, и ограничено другими элементами, которые не мешают или способствуют активности или действию, указанному в описании для перечисленных элементов. Таким образом, выражение «по существу состоящий из» указывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать, в зависимости от того, влияют или не влияют они на активность или действие перечисленных элементов. Далее, подразумевается, что в вариантах осуществления, где приведены численные величины, такие как количества, концентрации, проценты, пропорции или диапазоны, обозначенная величина может быть «по меньшей мере примерно» численным значением, «примерно» численным значением или «по меньшей мере» численным значением.The expression "essentially consisting of", as used in the claims and in the specification, means to include any of the elements listed after the expression and is limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in the description for the listed elements. Thus, the expression "consisting essentially of" indicates that the listed elements are necessary or required, but that other elements are optional and may or may not be present, depending on whether or not they affect the activity or action of the listed elements. Further, it is understood that in embodiments where numerical values are given, such as amounts, concentrations, percentages, proportions or ranges, the indicated value may be "at least about" a numerical value, "about" a numerical value, or "at least" numerical value.

Варианты осуществленияEmbodiments

Вариант осуществления 1. Культура панкреатических энтодермальных клеток человека in vitro.Embodiment 1. Culture of human pancreatic endodermal cells in vitro.

Вариант осуществления 2. Культура клеток из варианта 1, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.Embodiment 2. The cell culture of Embodiment 1, wherein the pancreatic endodermal cells are derived from pluripotent cells.

Вариант осуществления 3. Культура клеток из варианта 1 или 2, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.Embodiment 3. The cell culture of option 1 or 2, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.

Вариант осуществления 4. Культура клеток из варианта 3, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.Embodiment 4. Cell culture of option 3, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin- binding EGF), Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.

Вариант осуществления 5. Культура клеток по любому из вариантов 1-4, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.Embodiment 5. A cell culture according to any one of Embodiments 1-4, wherein the pancreatic endodermal cells comprise pancreatic progenitor cells and polyhormonal endocrine cells.

Вариант осуществления 6. Культура клеток из варианта 5, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.Embodiment 6 The cell culture of Embodiment 5, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but do not express CHGA.

Вариант осуществления 7. Культура клеток из варианта 5, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.Embodiment 7 The cell culture of Embodiment 5, wherein the polyhormonal endocrine cells express CHGA.

Вариант осуществления 8. Культура клеток из любого из вариантов 1-4, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.Embodiment 8 A cell culture of any one of Embodiments 1-4, wherein the pancreatic endodermal cells comprise CHGA-positive and CHGA-negative cells.

Вариант осуществления 9. Культура клеток по любому из вариантов 1-8, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.Embodiment 9. A cell culture according to any one of Embodiments 1-8, wherein at least 30% of the pancreatic endodermal cells are CHGA negative cells.

Вариант осуществления 10. Культура клеток по любому из вариантов 1-9, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными клетками.Embodiment 10. A cell culture according to any one of Embodiments 1-9, wherein at least 50% of the pancreatic endodermal cells are PDX1 positive cells.

Вариант осуществления 11. Культура клеток из варианта 3, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.Embodiment 11. Cell culture of Embodiment 3, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.

Вариант осуществления 12. Культура клеток по любому из вариантов 1-11, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 12. A cell culture according to any one of embodiments 1-11, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 13. Культура клеток из варианта 12, где FGF является FGF-7.Embodiment 13. Culture of the cells of Embodiment 12, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 14. Культура клеток по любому из вариантов 1-13, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.Embodiment 14. A cell culture according to any one of embodiments 1-13, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.

Вариант осуществления 15. Культура клеток по любому из вариантов 1-15, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.Embodiment 15. A cell culture according to any one of embodiments 1-15, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 16. Культура клеток по любому из вариантов 1-16, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.Embodiment 16. A cell culture according to any one of embodiments 1-16, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF, and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 17. Популяция панкреатической энтодермы человека in vitro.Embodiment 17. Population of human pancreatic endoderm in vitro.

Вариант осуществления 18. Популяция клеток из варианта 17, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.Embodiment 18 The cell population of Embodiment 17, wherein the pancreatic endodermal cells are derived from pluripotent cells.

Вариант осуществления 19. Популяция клеток из варианта 18, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.An implementation option 19. The population of cells of option 18, where the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 20. Популяция клеток по любому из вариантов 17-19, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.Embodiment 20. A population of cells according to any one of embodiments 17-19, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.

Вариант осуществления 21. Популяция клеток из варианта 20, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.Embodiment 21. The cell population of Embodiment 20, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin- binding EGF), Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.

Вариант осуществления 22. Популяция клеток по любому из вариантов 17-21, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.Embodiment 22. The cell population of any one of embodiments 17-21, wherein the pancreatic endodermal cells comprise pancreatic progenitor cells and polyhormonal endocrine cells.

Вариант осуществления 23. Популяция клеток из варианта 22, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.Embodiment 23. The cell population of Embodiment 22, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but do not express CHGA.

Вариант осуществления 24. Популяция клеток из варианта 22, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.Embodiment 24. The cell population of Embodiment 22, wherein the polyhormonal endocrine cells express CHGA.

Вариант осуществления 25. Популяция клеток по любому из вариантов 17-24, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.Embodiment 25. The cell population of any one of embodiments 17-24, wherein the pancreatic endodermal cells include CHGA positive and CHGA negative cells.

Вариант осуществления 26. Популяция клеток по любому из вариантов 17-25, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.Embodiment 26. The cell population of any one of embodiments 17-25, wherein at least 30% of the pancreatic endodermal cells are CHGA negative cells.

Вариант осуществления 27. Популяция клеток по любому из вариантов 17-26, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными.Embodiment 27. A population of cells according to any one of embodiments 17-26, wherein at least 50% of the pancreatic endodermal cells are PDX1 positive.

Вариант осуществления 28. Популяция клеток из варианта 20, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.Embodiment 28. The cell population of Embodiment 20, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.

Вариант осуществления 29. Популяция клеток по любому из вариантов 17-28, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 29. The cell population of any one of embodiments 17-28, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 30. Популяция клеток из варианта 29, где FGF является FGF-7.Embodiment 30. The cell population of option 29, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 31. Популяция клеток по любому из вариантов 17-30, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.Embodiment 31. A population of cells according to any one of embodiments 17-30, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.

Вариант осуществления 32. Популяция клеток по любому из вариантов 17-30, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.Embodiment 32. A cell population according to any one of embodiments 17-30, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 33. Популяция клеток по любому из вариантов 17-20, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.Embodiment 33. A population of cells according to any one of embodiments 17-20, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF, and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 34. Популяция клеток in vitro, включающая панкреатические энтодермальные клетки человека в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы.Embodiment 34. An in vitro cell population comprising human pancreatic endodermal cells in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.

Вариант осуществления 35. Популяция клеток из варианта 34, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.Embodiment 35. The cell population of Embodiment 34, wherein the pancreatic endodermal cells are derived from pluripotent cells.

Вариант осуществления 36. Популяция клеток из варианта 35, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетическим перепрограммированными клетками.An embodiment 36. The cell population of embodiment 35, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 37. Популяция клеток по любому из вариантов 34-36, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.Embodiment 37. A cell population according to any one of embodiments 34-36, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor alpha), Btc (betacellulin), HBEGF (heparin-binding EGF), Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.

Вариант осуществления 38. Популяция клеток по любому из вариантов 34-37, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.Embodiment 38. The cell population of any one of embodiments 34-37, wherein the pancreatic endodermal cells comprise pancreatic progenitor cells and polyhormonal endocrine cells.

Вариант осуществления 39. Популяция клеток из варианта 38, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.Embodiment 39. The cell population of option 38, wherein the pancreatic progenitor cells express NKX6.1 but do not express CHGA.

Вариант осуществления 40. Популяция клеток из варианта 38, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.Embodiment 40. The cell population of Embodiment 38, wherein the polyhormonal endocrine cells express CHGA.

Вариант осуществления 41. Популяция клеток по любому из вариантов 34-40, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.Embodiment 41. The cell population of any one of embodiments 34-40, wherein the pancreatic endodermal cells include CHGA-positive and CHGA-negative cells.

Вариант осуществления 42. Популяция клеток по любому из вариантов 34-41, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.Embodiment 42. The cell population of any one of embodiments 34-41, wherein at least 30% of the pancreatic endodermal cells are CHGA negative cells.

Вариант осуществления 43. Популяция клеток по любому из вариантов 34-42, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными.Embodiment 43. The cell population of any one of embodiments 34-42, wherein at least 50% of the pancreatic endodermal cells are PDX1 positive.

Вариант осуществления 44. Популяция клеток по любому из вариантов 34-36, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является херегулином-4.Embodiment 44. The cell population of any one of embodiments 34-36, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.

Вариант осуществления 45. Популяция клеток по любому из вариантов 34-44, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 45. The cell population of any one of embodiments 34-44, wherein the human pancreatic endodermal cells are in contact with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 46. Популяция клеток из варианта 45, где FGF является FGF-7.Embodiment 46. A population of cells from option 45, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 47. Популяция клеток по любому из вариантов 34-46, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.Embodiment 47. A cell population according to any one of embodiments 34-46, wherein the human pancreatic endodermal cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.

Вариант осуществления 48. Популяция клеток по любому из вариантов 34-47, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.Embodiment 48. The cell population of any one of embodiments 34-47, wherein the human pancreatic endodermal cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 49. Популяция клеток по любому из вариантов 34-48, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.Embodiment 49. A population of cells according to any one of embodiments 34-48, wherein the human pancreatic endodermal cells are in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF, and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 50. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 50. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(a) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму; и(a) contacting the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent to obtain a cell population including pancreatic endoderm; and

(b) трансплантации и созревания панкреатической энтодермы, полученных на этапе (a), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(b) transplanting and maturing the pancreatic endoderm obtained in step (a) in vivo to obtain insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 51. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 51. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(a) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением популяции клеток, включающей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции; и(a) providing contact of endoderm cells of the anterior part of the digestive tract, obtained from dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with an agent that activates the tyrosine kinase receptor ERBB, to obtain a population of cells, including the endocrine and non-endocrine subpopulations; and

(b) трансплантации и созревания субпопуляций, полученных на этапе (a), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(b) transplanting and maturing the subpopulations obtained in step (a) in vivo to produce insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 52. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 52. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(а) трансплантации и созревания панкреатических энтодермальных клеток in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(a) transplanting and maturing pancreatic endodermal cells in vivo to produce insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 53. Способ из варианта 52, где панкреатические энтодермальные клетки получены путем обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.Embodiment 53. The method of embodiment 52, wherein the pancreatic endodermal cells are obtained by contacting the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.

Вариант осуществления 54. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.Embodiment 54. The method of any one of embodiments 50-52 and 53, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor alpha), Btc (betacellulin) , HBEGF (heparin-binding EGF), Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.

Вариант осуществления 55. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-54, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 55. The method of any one of Embodiments 50-52 and 53-54, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are further in contact with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 56. Способ из варианта 55, где FGF является FGF-7.Embodiment 56. The method of embodiment 55, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 57. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-56, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с ингибитором rho-киназы.Embodiment 57. The method of any one of Embodiments 50-52 and 53-56, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are further contacted with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 58. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-57, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с ингибитором rho-киназы и FGF.Embodiment 58. The method of any one of Embodiments 50-52 and 53-57, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are further contacted with an rho kinase inhibitor and FGF.

Вариант осуществления 59. Способ по любому из вариантов 57-58, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.Embodiment 59. The method of any one of embodiments 57-58, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, antisense nucleic acids for ROCK; a nucleic acid that induces RNA interference; competing peptides, peptides-antagonists, inhibitory antibodies, ScFV-fragments of antibodies, dominant-negative variants, and their derivatives and expression vectors.

Вариант осуществления 60. Способ по любому из вариантов 57-59, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536 и Y-30141, и их производных.Embodiment 60. The method of any one of embodiments 57-59, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, and Y-30141, and derivatives thereof.

Вариант осуществления 61. Способ по любому из вариантов 57-60, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil и Н-1152Р, и их производных.Embodiment 61. The method of any one of Embodiments 57-60, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, and H-1152P, and derivatives thereof.

Вариант осуществления 62. Способ из варианта 50, где панкреатическая энтодерма содержит эндокринную и не-эндокринную субпопуляции.Embodiment 62. The method of embodiment 50, wherein the pancreatic endoderm comprises an endocrine and non-endocrine subpopulation.

Вариант осуществления 63. Способ из варианта 62, где эндокринная субпопуляция клеток является CHGA-позитивными (CHGA+) клетками.Embodiment 63. The method of embodiment 62, wherein the endocrine subset of cells is CHGA-positive (CHGA +) cells.

Вариант осуществления 64. Способ из варианта 62, где не-эндокринная субпопуляция клеток является CHGA-негативной (CHGA-).Embodiment 64. The method of embodiment 62, wherein the non-endocrine subset of cells is CHGA negative (CHGA-).

Вариант осуществления 65. Способ из варианта 62, где не-эндокринная субпопуляция клеток экспрессирует NKX6.1.Embodiment 65. The method of embodiment 62, wherein the non-endocrine subset of cells expresses NKX6.1.

Вариант осуществления 66. Способ из варианта 50, где по меньшей мере 30% панкреатической энтодермы является CHGA-негативной.Embodiment 66. The method of embodiment 50, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm is CHGA negative.

Вариант осуществления 67. Способ из варианта 50, где по меньшей мере 50% панкреатической энтодермы является PDX1-позитивной.Embodiment 67. The method of embodiment 50, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm is PDX1 positive.

Вариант осуществления 68. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 68. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(a) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ;(a) contacting the dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family;

(b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ, с получением клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта;(b) in vitro culturing the cells obtained in step (a) in a second medium not containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family to obtain endoderm cells of the anterior digestive tract;

(c) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с образованием популяции клеток, включающей эндокринную и неэндокринную популяции клеток; и(c) contacting the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract obtained in step (b) with an agent that activates the ERBB tyrosine kinase receptor to form a cell population including endocrine and non-endocrine cell populations; and

(d) трансплантации и созревания панкреатической энтодермы, полученных на этапе (с), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(d) transplanting and maturing the pancreatic endoderm obtained in step (c) in vivo to obtain insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 69. Способ из варианта 68, где не-эндокринная клетка является CHGA-негативной (CHGA-) клеткой.Embodiment 69. The method of embodiment 68, wherein the non-endocrine cell is a CHGA negative (CHGA-) cell.

Вариант осуществления 70. Способ по любому из вариантов 68-69, где эндокринная клетка является CHGA-позитивной (CHGA+) клеткой.Embodiment 70. The method of any one of embodiments 68-69, wherein the endocrine cell is a CHGA positive (CHGA +) cell.

Вариант осуществления 71. Способ из варианта 69, где CHGA-негативная (CHGA-) клетка экспрессирует NKX6.1.Embodiment 71. The method of embodiment 69, wherein a CHGA negative (CHGA-) cell expresses NKX6.1.

Вариант осуществления 72. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с ингибитором rho-киназы.Embodiment 72. The method of embodiment 69, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract obtained in step (b) are contacted with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 73. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с FGF.Embodiment 73. The method of embodiment 69, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract obtained in step (b) are contacted with FGF.

Вариант осуществления 74. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с ингибитором rho-киназы и FGF.Embodiment 74. The method of embodiment 69, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract obtained in step (b) are contacted with an rho kinase inhibitor and FGF.

Вариант осуществления 75. Способ по любому из вариантов 72-74, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.Embodiment 75. The method of any one of embodiments 72-74, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, antisense nucleic acids for ROCK; a nucleic acid that induces RNA interference; competing peptides, peptides-antagonists, inhibitory antibodies, ScFV-fragments of antibodies, dominant-negative variants, and their derivatives and expression vectors.

Вариант осуществления 76. Способ повышения процентного содержания неэндокринных клеток в популяции клеток панкреатической энтодермы, по сравнению с эндокринными клетками, включающий:Embodiment 76. A method of increasing the percentage of non-endocrine cells in a population of pancreatic endoderm cells as compared to endocrine cells, comprising:

- обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с повышением процента не-эндокринных клеток в популяции клеток панкреатической энтодермы.- ensuring the contact of the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract with an agent that activates the tyrosine kinase receptor ERBB, with an increase in the percentage of non-endocrine cells in the pancreatic endoderm cell population.

Вариант осуществления 77. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с FGF.Embodiment 77. The method of embodiment 76, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are contacted with FGF.

Вариант осуществления 78. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с ингибитором rho-киназы.Embodiment 78. The method of embodiment 76, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are contacted with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 79. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с FGF и ингибитором rho-киназы.Embodiment 79. The method of embodiment 76, wherein the endoderm cells of the anterior digestive tract are contacted with FGF and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 80. Способ повышения чувствительности к глюкозе имплантированной панкреатической энтодермы, включающий:Embodiment 80. A method for increasing glucose sensitivity of an implanted pancreatic endoderm, comprising:

- обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с генерацией популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму; и- ensuring the contact of the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract with an agent that activates the tyrosine kinase receptor ERBB, with the generation of a cell population, including the pancreatic endoderm; and

- трансплантацию и созревание панкреатической энтодермы in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин лучше, чем инсулин-секретирующие клетки, полученные из панкреатической энтодермы, полученной без контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.- transplantation and maturation of pancreatic endoderm in vivo, with obtaining insulin-secreting cells, where insulin-secreting cells secrete insulin better than insulin-secreting cells obtained from pancreatic endoderm, obtained without contact of the endoderm cells of the anterior part of the digestive tract with an agent that activates tympanic ERBB receptor.

Вариант осуществления 81. Способ из варианта 80, где панкреатические энтодермальные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток.Embodiment 81. The method of embodiment 80, wherein the pancreatic endodermal cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 82. Способ получения инсулина, включающий (а) обеспечение контакта живых клеток с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и (b) трансплантацию и созревание клеток в конце этапа (а), с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.Embodiment 82. A method of producing insulin, comprising (a) contacting living cells with an agent that activates the tyrosine kinase ERBB receptor, and (b) transplanting and maturing cells at the end of step (a), to obtain insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 83. Способ из варианта 82, где живые клетки являются энтодермой передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермой передней части пищеварительного тракта.Embodiment 83. The method of embodiment 82, wherein the living cells are an anterior endoderm or a PDX1 negative anterior endoderm.

Вариант осуществления 84. Способ по любому из вариантов 82-83, где живые клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток.Embodiment 84. The method of any one of embodiments 82-83, wherein the living cells are derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 85.популяция клеток, включающая эндокринную и неэндокринную субпопуляции клеток.Embodiment 85. A population of cells including an endocrine and non-endocrine subpopulation of cells.

Вариант осуществления 86. Популяция клеток из варианта 85, где эндокринная и не-эндокринная субпопуляции клеток получены из плюрипотентных клеток.Embodiment 86. The cell population of embodiment 85, wherein the endocrine and non-endocrine cell subpopulations are derived from pluripotent cells.

Вариант осуществления 87. Популяция клеток из варианта 86, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.An embodiment 87. The cell population of embodiment 86, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 88. Популяция клеток по любому из вариантов 85-87, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста-альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.Embodiment 88. A cell population according to any one of embodiments 85-87, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is EGF (epidermal growth factor), AREG (amphiregulin), TGF-alpha (transforming growth factor-alpha), Btc (betacellulin) , HBEGF (heparin-binding EGF), Ereg (epiregulin), neuregulin or heregulin.

Вариант осуществления 89. Популяция клеток по любому из вариантов 85-88, где не-эндокринные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.Embodiment 89. The cell population of any one of embodiments 85-88, wherein the non-endocrine cells express NKX6.1 but do not express CHGA.

Вариант осуществления 90. Популяция клеток по любому из вариантов 85-89, где эндокринные клетки экспрессируют CHGA.Embodiment 90. The cell population of any one of embodiments 85-89, wherein the endocrine cells express CHGA.

Вариант осуществления 91. Популяция клеток по любому из вариантов 85-90, где по меньшей мере 30% клеток являются CHGA-негативными клетками.Embodiment 91. A population of cells as in any one of embodiments 85-90, wherein at least 30% of the cells are CHGA negative cells.

Вариант осуществления 92. Популяция клеток по любому из вариантов 85-91, где по меньшей мере 50% клеток являются PDX1-позитивными.Embodiment 92. The cell population of any one of embodiments 85-91, wherein at least 50% of the cells are PDX1 positive.

Вариант осуществления 93. Популяция клеток по любому из вариантов 85-92, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.Embodiment 93. The cell population of any one of embodiments 85-92, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is heregulin-4.

Вариант осуществления 94. Популяция клеток по любому из вариантов 85-93, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 94. The cell population of any one of embodiments 85-93, wherein the cell culture is in contact with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 95. Популяция клеток из варианта 94, где FGF является FGF-7.Embodiment 95. The cell population from option 94, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 96. Популяция клеток по любому из вариантов 85-95, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.Embodiment 96. The cell population of any one of embodiments 85-95, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and FGF.

Вариант осуществления 97. Популяция клеток по любому из вариантов 85-96, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.Embodiment 97. A cell population according to any one of embodiments 85-96, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 98. Популяция клеток по любому из вариантов 85-97, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.Embodiment 98. The cell population of any one of embodiments 85-97, wherein the cell culture is in contact with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, FGF, and an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 99. Способ получения инсулина, включающий этапы: (а) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ; (b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, по меньшей мере энтодермы передней части пищеварительного тракта или по меньшей мере PDX1 -негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта; (с) обеспечения контакта клеток, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, содержащей эндокринную и не эндокринную субпопуляции клеток; и (d) трансплантации и созревания популяции клеток, полученных на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.Embodiment 99. A method for producing insulin, comprising the steps of: (a) contacting dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family; (b) in vitro culturing the cells obtained in step (a) in a second medium that does not contain an agent that activates a member of the TGFβ receptor family, thereby obtaining at least an anterior endoderm of the digestive tract or at least PDX1-negative endoderm cells of the anterior part of the digestive tract; (c) contacting the cells obtained in step (b) with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby obtaining a population of cells containing an endocrine and non-endocrine subpopulation of cells; and (d) transplanting and maturing the population of cells obtained in step (c) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 100. Способ получения инсулина, включающий этапы: (а) обеспечения контакта PDX1-позитивных клеток с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB; и (b) трансплантации и созревания популяции клеток in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.Embodiment 100. A method for producing insulin, comprising the steps of: (a) contacting PDX1-positive cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent; and (b) transplanting and maturing the cell population in vivo, thereby producing insulin-secreting cells, wherein the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 101. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а), (b) или (с).Embodiment 101. The method of Embodiments 68 or 99, wherein the rho kinase inhibitor is added in step (a), (b) or (c).

Вариант осуществления 102. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а), (b) и (с).Embodiment 102. The method of Embodiments 68 or 99, wherein the rho kinase inhibitor is added in step (a), (b) and (c).

Вариант осуществления 103. Способ из вариантов осуществления 68 или 99-100, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а) и (b).Embodiment 103. The method of Embodiments 68 or 99-100, wherein the rho kinase inhibitor is added in step (a) and (b).

Вариант осуществления 104. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, добавляют на этапе (а) или (с).Embodiment 104. The method of Embodiments 68 or 99, wherein an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in step (a) or (c).

Вариант осуществления 105. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, добавляют на этапе (а) и (с).Embodiment 105. The method of Embodiments 68 or 99, wherein an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent is added in step (a) and (c).

Вариант осуществления 106. Способ генерации популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo, включающий: обеспечение контакта популяции по меньшей мере энтодермы передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта, или по меньшей мере популяции PDX1-позитивных клеток панкреатической энтодермы с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с генерацией, таким образом, популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.Embodiment 106. A method of generating a population of cells capable of maturation into glucose sensitive insulin secreting cells in vivo, comprising: contacting a population of at least an anterior endoderm of the digestive tract, at least PDX1 negative endoderm of an anterior digestive tract, or at least a population of PDX1-positive pancreatic endoderm cells with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby generating a population of cells capable of maturation into glucose-sensitive insulin-secreting cells in vivo.

Вариант осуществления 107. Способ получения панкреатической энтодермы, включающий этапы:Embodiment 107. A method for producing pancreatic endoderm, comprising the steps of:

(а) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму.(a) allowing endoderm cells of the anterior digestive tract to contact an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby obtaining a cell population including pancreatic endoderm.

Вариант осуществления 108. Способ из варианта 107, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с фактором роста фибробластов (FGF).Embodiment 108. The method of embodiment 107, further comprising contacting endoderm cells of the anterior digestive tract with fibroblast growth factor (FGF).

Вариант осуществления 109. Способ из варианта 108, где FGF является FGF-7.Embodiment 109. The method of embodiment 108, wherein the FGF is FGF-7.

Вариант осуществления 110. Способ по любому из вариантов 107-109, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.Embodiment 110. The method of any one of Embodiments 107-109, further comprising contacting endoderm cells of the anterior digestive tract with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 111. Способ по любому из вариантов 107-109, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы и FGF.Embodiment 111. The method of any one of Embodiments 107-109, further comprising contacting the anterior gastrointestinal tract endoderm cells with an rho kinase inhibitor and FGF.

Вариант осуществления 112. Способ по любому из вариантов 107-111, где по меньшей мере 30% панкреатической энтодермы является CHGA-негативной.Embodiment 112. The method of any one of embodiments 107-111, wherein at least 30% of the pancreatic endoderm is CHGA negative.

Вариант осуществления 113. Способ по любому из вариантов 107-111, где по меньшей мере 50% панкреатической энтодермы является PDX1-позитивной.Embodiment 113. The method of any one of embodiments 107-111, wherein at least 50% of the pancreatic endoderm is PDX1 positive.

Вариант осуществления 114. Способ по любому из вариантов 50, 76, 107-113, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта получены из плюрипотентных клеток.Embodiment 114. The method of any one of Embodiments 50, 76, 107-113, wherein the anterior gastrointestinal tract endoderm cells are derived from pluripotent cells.

Вариант осуществления 115. Способ по любому из вариантов 50, 76, 107-114, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.Embryo 115. The method of any one of embodiments 50, 76, 107-114, wherein the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 116. Культура клеток из варианта 1, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.An implementation option 116. The cell culture of option 1, where the pluripotent cells are human embryonic stem cells or dedifferentiated genetically reprogrammed cells.

Вариант осуществления 117. Популяция панкреатических энтодермальных клеток человека in vitro, включающая дифференцированные клетки, полученные из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток, и агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB.Embodiment 117. An in vitro human pancreatic endodermal cell population comprising differentiated cells derived from dedifferentiated genetically reprogrammed cells and an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent.

Вариант осуществления 118. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 117, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, включает фактор роста или лиганд EGF.Embodiment 118. The pancreatic endodermal cell population of embodiment 117, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent comprises a growth factor or an EGF ligand.

Вариант осуществления 119. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 118, где фактор роста или лиганд EGF включает изоформу херегулина, выбранного из группы, состоящей из херегулина-1, херегулина-2, херегулина 3 и херегулина-4.Embodiment 119. The pancreatic endodermal cell population of embodiment 118, wherein the growth factor or EGF ligand comprises an isoform of heregulin selected from the group consisting of heregulin-1, heregulin-2, heregulin 3, and heregulin-4.

Вариант осуществления 120. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 119, где изоформа херегулина включает херегулин-1 и херегулин-4.Embodiment 120. The pancreatic endodermal cell population of embodiment 119, wherein the Heregulin isoform comprises Heregulin-1 and Heregulin-4.

Вариант осуществления 121. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 119, где изоформа херегулина включает херегулин-4.Embodiment 121. The pancreatic endodermal cell population of embodiment 119, wherein the Heregulin isoform comprises Heregulin-4.

Вариант осуществления 122. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 122. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(a) обеспечения контакта культуры клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, включающей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции клеток; и(a) contacting the culture of endoderm cells of the anterior part of the digestive tract, obtained from dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with an agent that activates the tyrosine kinase receptor ERBB, thereby obtaining a population of cells, including endocrine and non-endocrine subpopulations of cells; and

(b) созревания субпопуляций, полученных на этапе (a), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(b) maturation of the subpopulations obtained in step (a) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 123. Способ из варианта 122, дополнительно включающий обеспечение контакта культуры клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.Embodiment 123. The method of embodiment 122, further comprising contacting the anterior gastrointestinal tract endoderm cell culture with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 124. Способ из варианта 123, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.Embodiment 124. The method of embodiment 123, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, antisense nucleic acids for ROCK; a nucleic acid that induces RNA interference; competing peptides, peptides-antagonists, inhibitory antibodies, ScFV-fragments of antibodies, dominant-negative variants, and their derivatives and expression vectors.

Вариант осуществления 125, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, и их производных.Embodiment 125, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, and derivatives thereof.

Вариант осуществления 126, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, и их производных.Embodiment 126, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, and derivatives thereof.

Вариант осуществления 127. Способ получения инсулина, включающий этапы:Embodiment 127. A method for producing insulin, comprising the steps of:

(a) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ;(a) contacting the dedifferentiated genetically reprogrammed cells in vitro with a first medium containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family;

(b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта;(b) in vitro culturing the cells obtained in step (a) in a second medium not containing an agent that activates a member of the TGFβ receptor family, thereby obtaining endoderm cells of the anterior digestive tract;

(c) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, содержащей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции клеток; и(c) contacting the endoderm cells of the anterior digestive tract obtained in step (b) with an ERBB tyrosine kinase receptor activating agent, thereby obtaining a cell population containing an endocrine and non-endocrine subpopulation of cells; and

(d) созревания субпопуляций клеток, полученных на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.(d) maturation of the cell subpopulations obtained in step (c) in vivo, thereby obtaining insulin-secreting cells, where the insulin-secreting cells secrete insulin in response to glucose stimulation.

Вариант осуществления 128. Способ из варианта 127, где не-эндокринные клетки являются CHGA-негативными (CHGA-) клетками.Embodiment 128. The method of embodiment 127, wherein the non-endocrine cells are CHGA negative (CHGA-) cells.

Вариант осуществления 129. Способ из варианта 127, где эндокринные клетки являются CHGA-позитивными (CHGA+) клетками.Embodiment 129. The method of embodiment 127, wherein the endocrine cells are CHGA-positive (CHGA +) cells.

Вариант осуществления 130. Способ из варианта 127, где CHGA-негативные (CHGA-) клетки дополнительно экспрессируют NKX6.1.Embodiment 130. The method of embodiment 127, wherein CHGA negative (CHGA-) cells further express NKX6.1.

Вариант осуществления 131. Способ из варианта 127, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.Embodiment 131. The method of embodiment 127, further comprising contacting endoderm cells of the anterior digestive tract with an rho kinase inhibitor.

Вариант осуществления 132. Способ из варианта 131, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.Embodiment 132. The method of embodiment 131, wherein the rho kinase inhibitor is selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, H-1152P, Wf-536, Y-30141, antisense nucleic acids for ROCK; a nucleic acid that induces RNA interference; competing peptides, peptides-antagonists, inhibitory antibodies, ScFV-fragments of antibodies, dominant-negative variants, and their derivatives and expression vectors.

Claims

1. Композиция клеток для лечения диабета, содержащая панкреатические эндодермальные клетки человека in vitro и агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB,1. Composition of cells for the treatment of diabetes, containing human pancreatic endodermal cells in vitro and an agent that activates the tyrosine kinase receptor ERBB,

отличающаяся тем, что из указанной популяции клеток человека исключены клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных исключительно способом, требующим разрушения эмбриона.characterized in that the specified population of human cells excludes cells that are obtained from human embryonic stem cells, obtained exclusively by a method requiring the destruction of the embryo.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, включает лиганд семейства эпидермального фактора роста (EGF).2. The composition of claim 1, wherein the ERBB tyrosine kinase receptor activating agent comprises an epidermal growth factor (EGF) family ligand.

3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанный лиганд семейства EGF выбран из группы, состоящей из херегулина-1 (нейрегулина-1), херегулина-2 (нейрегулина-2), херегулина-3 (нейрегулина-3) и херегулина-4 (нейрегулина-4).3. A composition according to claim 2, wherein said EGF family ligand is selected from the group consisting of heregulin-1 (neuregulin-1), heregulin-2 (neuregulin-2), heregulin-3 (neuregulin-3) and heregulin -4 (neuregulin-4).

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанный лиганд семейства EGF включает херегулин-1 ихерегулин-4.4. The composition of claim 3, wherein said EGF family ligand comprises heregulin-1 and iheregulin-4.

5. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанным лигандом семейства EGF является херегулин-4 (нейрегулин-4).5. A composition according to claim 3, wherein said ligand of the EGF family is heregulin-4 (neuregulin-4).

6. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанным лигандом семейства EGF является херегулин-1 (нейрегулин-1).6. A composition according to claim 3, wherein said EGF family ligand is heregulin-1 (neuregulin-1).

7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанным херегулином-1 (нейрегулином-1) является херегулин-1β.7. A composition according to claim 6, characterized in that said heregulin-1 (neuregulin-1) is heregulin-1β.

8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанным херегулином-1β является фрагмент природного белка.8. A composition according to claim 7, characterized in that said heregulin-1β is a fragment of a natural protein.

9. Композиция клеток для лечения диабета, содержащая панкреатические прогениторные клетки, включающие эндокринную и не-эндокринную субпопуляции клеток, отличающаяся тем, что указанные клетки получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, содержащихся в питательной среде, содержащей лиганд семейства эпидермального фактора роста (EGF) или фактор роста фибробластов, где по меньшей мере 30% указанных клеток представлены клетками неэндокринной субпопуляции клеток,9. Composition of cells for the treatment of diabetes, containing pancreatic progenitor cells, including endocrine and non-endocrine subpopulations of cells, characterized in that these cells are obtained from induced pluripotent stem cells contained in a nutrient medium containing a ligand of the epidermal growth factor (EGF) family, or fibroblast growth factor, where at least 30% of said cells are cells of a non-endocrine subpopulation of cells,

при этом из указанных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток исключены клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных исключительно способом, требующим разрушения эмбриона.at the same time, from these induced pluripotent stem cells, cells that are obtained from human embryonic stem cells obtained exclusively by a method requiring the destruction of the embryo are excluded.

10. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что клетки указанной не-эндокринной субпопуляции клеток экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют хромогранин А, а клетки указанной эндокринной субпопуляции клеток экспрессируют хромогранин А.10. The composition of claim 9, wherein the cells of said non-endocrine subpopulation of cells express NKX6.1 but do not express chromogranin A, and the cells of said endocrine subpopulation of cells express chromogranin A.

11. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанный лиганд семейства эпидермального фактора роста (EGF) включает изоформу херегулина.11. The composition of claim 9, wherein said epidermal growth factor (EGF) family ligand comprises a heregulin isoform.

12. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что указанная изоформа херегулина включает херегулин-1β, херегулин-1, херегулин-2, херегулин-3 или херегулин-4.12. A composition according to claim 11, wherein said isoform of heregulin comprises heregulin-1β, heregulin-1, heregulin-2, heregulin-3 or heregulin-4.

13. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанные панкреатические прогениторные клетки человека включают PDX1-позитивные панкреатические эндодермальные клетки.13. The composition of claim 9, wherein said human pancreatic progenitor cells comprise PDX1-positive pancreatic endodermal cells.

14. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанные панкреатические прогениторные клетки являются инкапсулированными и могут быть трансплантированы in vivo.14. The composition of claim 9, wherein said pancreatic progenitor cells are encapsulated and can be transplanted in vivo.

15. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что указанные трансплантированные панкреатические прогениторные клетки созревают in vivo клетки, продуцирующие инсулин.15. The composition of claim 14, wherein said transplanted pancreatic progenitor cells mature in vivo insulin-producing cells.

16. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанные панкреатические прогениторные клетки инкапсулированы в полупроницаемом устройстве, содержащем полупроницаемую мембрану.16. The composition of claim 9, wherein said pancreatic progenitor cells are encapsulated in a semipermeable device containing a semipermeable membrane.

17. Композиция по п. 16, отличающаяся тем, что указанное полупроницаемое устройство содержит по меньшей мере одну камеру для инкапсулирования клеток.17. The composition of claim 16, wherein said semipermeable device comprises at least one cell for encapsulating cells.

18. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанная по меньшей мере одна камера содержит по меньшей мере один уплотнитель.18. The composition of claim 17, wherein said at least one chamber comprises at least one seal.

19. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанные трансплантированные панкреатические прогениторные клетки инкапсулированы в устройстве, содержащем уплотняющую кромку, камеру для инкапсулирования клеток, часть уплотнителя внутри камеры для инкапсулирования клеток, при этом указанная часть уплотнителя внутри камеры для инкапсулирования клеток не увеличивает площадь поверхности указанной камеры.19. The composition of claim 9, wherein said transplanted pancreatic progenitor cells are encapsulated in a device comprising a sealing lip, a cell encapsulation chamber, a portion of the seal inside the cell encapsulation chamber, while said portion of the seal inside the cell encapsulation chamber does not increase the surface area of the specified chamber.

20. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанный фактор роста фибробластов включает FGF1, FGF2, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 или FGF23.20. The composition of claim 9, wherein said fibroblast growth factor comprises FGF1, FGF2, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF16, , FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, or FGF23.

21. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанные трансплантированные панкреатические прогениторные клетки инкапсулированы в устройстве, содержащем полупроницаемую мембрану, при этом указанная полупроницаемая мембрана содержит синтетический материал, где указанным синтетическим материалом является полисульфон (PSF), нановолокнистые маты, полиимид, тетрафторэтилен/политетрафторэтилен (PTFE), вспененный политетрафторэтилен (ePTFE), полиакрилонитрил, полиэфирсульфон, акриловая смола, ацетат целлюлозы, нитрат целлюлозы, полиамид или гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС).21. A composition according to claim 9, characterized in that said transplanted pancreatic progenitor cells are encapsulated in a device containing a semipermeable membrane, wherein said semipermeable membrane contains a synthetic material, wherein said synthetic material is polysulfone (PSF), nanofiber mats, polyimide, tetrafluoroethylene / polytetrafluoroethylene (PTFE), expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE), polyacrylonitrile, polyethersulfone, acrylic resin, cellulose acetate, cellulose nitrate, polyamide or hydroxypropyl methylcellulose (HPMC).

22. Композиция по п. 16, отличающаяся тем, что указанное полупроницаемое устройство содержит перфорированную полупроницаемую мембрану.22. The composition of claim 16, wherein said semipermeable device comprises a perforated semipermeable membrane.