JP2020169217A - 骨髄異形成症候群および鉄芽球性貧血を処置するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】骨髄異形成症候群および鉄芽球性貧血を処置するための方法の提供。【解決手段】ある特定の態様では、本開示は、げっ歯類および霊長類を含む脊椎動物、特にヒトにおいて、赤血球および/またはヘモグロビンのレベルを増加させるための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本開示の組成物は、鉄芽球性貧血および骨髄異形成症候群、または鉄芽球性貧血および骨髄異形成症候群関連の1つまたは複数の合併症を処置または予防するために使用することができる。本開示の目的は、MDSおよび鉄芽球性貧血を有する患者を本明細書に開示されるActRIIアンタゴニストで処置する方法を提供すること、特に、処置の結果として赤血球、好中球および他の血液細胞の治療的に有益な増加を示す可能性が最も高いMDS患者の選択を導くことである。【選択図】なし
Description
本出願は、2014年12月3日に提出された米国仮特許出願第62/086,977号;2014年12月5日に提出された米国仮特許出願第62/088,087号;2015年4月30日に提出された米国仮特許出願第62/155,395号に対する優先権の利益を主張する。前記出願の各々の開示は、本明細書にそれらの全体が参照によって援用される。
本開示は、赤血球、好中球および血小板を含む血液細胞成分生成の調節不全の処置に関する。造血は、出産後の生活の間の、骨髄、脾臓またはリンパ節に主に位置する自己複製造血幹細胞からの血液の細胞成分の形成である。血液細胞は、リンパ球系統、骨髄球系統または赤血球系統に属するものに分類することができる。リンパ球新生として公知である過程によって、一般的なリンパ系前駆体細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する。骨髄造血と呼ばれる過程によって、一般的な骨髄性前駆体細胞は、マクロファージ、顆粒球(好塩基球、好中球、好酸球および肥満細胞)および栓球(血小板)を生成する。最後に、赤血球生成として公知である過程によって、赤血球前駆細胞は、赤血球(RBC、エリスロサイト)を生成する。
出生後の赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激(酸素圧の増減または組織の要求を含む)に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、分化系列が決定した(lineage committed)前駆体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上昇、または、網状赤血球:赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。成熟した赤血球(RBC)は、脊椎動物の循環系での酸素輸送の役割を担う。赤血球は、酸素の分圧(pO2)が比較的高い肺の中の酸素に結合し、比較的低いpO2の体の領域に酸素を送達するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で含有する。
エリスロポイエチン(EPO)は、脊椎動物における出産後の赤血球生成の有意な正の調節因子として広く認識されている。EPOは、低減された組織酸素圧(低酸素)および低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対する代償的赤血球生成応答を調節する。ヒトでは、上昇したEPOレベルは、骨髄および脾臓で赤血球前駆体の発生を刺激することによって、赤血球形成を促進する。マウスでは、EPOは主に脾臓で赤血球生成を増強する。
EPOの影響は、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する細胞表面受容体によって媒介される。ヒトEPO受容体遺伝子は、483アミノ酸膜貫通タンパク質をコードする。しかし、活性EPO受容体は、リガンドの非存在下においても多量体複合体として存在すると考えられている(例えば、米国特許第6,319,499号を参照)。哺乳動物細胞で発現されるクローン化完全長EPO受容体は、赤血球前駆細胞の上の天然受容体のそれと類似した親和性でEPOに結合する。その受容体へのEPOの結合は、受容体活性化、ならびに未熟赤芽球の増殖の増加、未熟赤芽球の分化の増加および赤血球前駆細胞のアポトーシスの減少を含む生物学的作用をもたらす、立体配置変化を引き起こす[例えば、Liboiら(1993年)Proc Natl Acad Sci USA 90巻:11351〜11355頁;Kouryら(1990年)Science 248巻:378〜381頁を参照]。
様々な臨床場面で、特に貧血の処置で赤血球レベルを増加させるために、組換えEPOの様々な形態が医師によって使用される。貧血は、血液中の正常より低いレベルのヘモグロビンまたは赤血球によって特徴付けられる、広く規定された状態である。一部の場合には、貧血は赤血球の生成または生存における原発性障害によって引き起こされる(例えば、骨髄異形成症候群)。より一般的には、貧血は他の系の疾患に起因する[例えば、WeatherallおよびProvan(2000年)Lancet 355巻、1169〜1175頁を参照]。貧血は、赤血球の低減された生成速度もしくは増加した破壊速度または出血による赤血球の減少から生じることがある。貧血は、例えば、急性もしくは慢性の腎性不全または末期の腎疾患、化学療法処置、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチおよび骨髄移植を含む様々な障害から生じることがある。
EPOによる処置は、健康なヒトにおいて数週間にわたって約1〜3g/dLのヘモグロビンの上昇を典型的には引き起こす。貧血の個体に投与されるとき、この処置レジメンはヘモグロビンおよび赤血球レベルの実質的な増加をしばしば提供し、生活の質の向上および長期生存につながる。しかし、EPOは均一に有効ではなく、多くの個体は高い用量にさえ不応性である[例えば、Horlら(2000年)Nephrol Dial Transplant 15
巻、43〜50頁を参照]。例えば、がんを有する患者の50%超はEPOに対する不十分な応答を有し、末期腎疾患を有する概ね10%はEPOに低応答性である[例えば、Glaspyら(1997年)J Clin Oncol 15巻、1218〜1234頁;Demetriら(1
998年)J Clin Oncol 16巻、3412〜3425頁を参照]。EPOへの抵抗性の分子機構はまだ不明であるが、炎症、鉄およびビタミン欠乏、不十分な透析、アルミニウム毒性ならびに副甲状腺機能亢進症を含むいくつかの因子が不良な処置応答を予測することができる。さらに、近年の証拠は、一部の患者集団においてEPOのより高い用量が心血管罹患率、腫瘍増殖および死亡率のリスクの増加と関連する可能性を示唆する[例えば、Krapfら(2009年)Clin J Am Soc Nephrol 4巻:470〜480頁;Glaspy(2009年)Annu Rev Med 60巻:181〜192頁を参照]。したがって、EPOをベースとした治療化合物(例えば、エリスロポイエチン刺激性の作用因子、ESA)は、患者が赤血球輸血を回避することを可能にする最も低い用量で投与することが推奨されている[例えば、Jelkmannら(2008年)Crit Rev Oncol. Hematol 67巻:39〜61頁を参照]。
遺伝性および後天性の形態の両方で起こる鉄芽球性貧血は、骨髄での「環状鉄芽球」の存在によって特徴付けられる。これらの特徴のある赤血球前駆体(赤芽球)は核周囲の鉄沈着顆粒の存在によって識別することができ、それらはペルシャンブルーによる組織学的染色によって明らかにされ、ミトコンドリアでの病理学的鉄沈着を示している[例えば、Muftiら(2008年)Haematologica 93巻:1712〜1717頁;Bottomleyら(
2014年)Hematol Oncol Clin N Am 28巻:653〜670頁を参照]。後天
性鉄芽球性貧血は、米国で1年に30,000人から40,000人の患者を冒すと推定される造血幹細胞障害の不均一な群である骨髄異形成症候群(MDS)を背景として最も頻繁に起こる[Bejarら(2014年)Blood1 24巻:2793〜2803頁]。これらの障害は、無効な造血、異常な「異形成」細胞形態および急性骨髄性白血病へのクローン進展の可能性によって特徴付けられる。下で議論されるように、MDSの遺伝的基礎における近年の進歩は、その診断および処置を大きく改善する可能性を有する。
MDS、鉄芽球性貧血およびそれらの障害の合併症のための有効な療法に対する高い満たされていない必要性がある。内因性EPOレベルはMDSを有する患者のサブセットで一般的に上昇し、したがって、これらの患者ではEPOの有効性が低いことが示唆される。MDSを有する患者の10%未満がEPOに好都合に応答すると推定されているが[Estey(2003年)Curr Opin Hematol 10巻、60〜67頁]、より近年のメタアナリシスは、EPO奏効率が研究によって30%〜60%の範囲であることを見出した[Moyoら(2008年)Ann Hematol 87巻:527〜536頁]。他のMDS患者と比較して、環状鉄芽球を有する患者は、急性骨髄性白血病を発症するリスクが実質的により低い傾向があり、したがって、全身鉄負荷に寄与せず、そのような患者に頻繁に存在する鉄過負荷を低減するのを代わりに助ける抗貧血治療剤からの恩恵を長期間受け続けるだろう[例えば、Temrazら、2014年、Crit Rev Oncol Hematol 91巻:64〜73頁
を参照]。
巻、43〜50頁を参照]。例えば、がんを有する患者の50%超はEPOに対する不十分な応答を有し、末期腎疾患を有する概ね10%はEPOに低応答性である[例えば、Glaspyら(1997年)J Clin Oncol 15巻、1218〜1234頁;Demetriら(1
998年)J Clin Oncol 16巻、3412〜3425頁を参照]。EPOへの抵抗性の分子機構はまだ不明であるが、炎症、鉄およびビタミン欠乏、不十分な透析、アルミニウム毒性ならびに副甲状腺機能亢進症を含むいくつかの因子が不良な処置応答を予測することができる。さらに、近年の証拠は、一部の患者集団においてEPOのより高い用量が心血管罹患率、腫瘍増殖および死亡率のリスクの増加と関連する可能性を示唆する[例えば、Krapfら(2009年)Clin J Am Soc Nephrol 4巻:470〜480頁;Glaspy(2009年)Annu Rev Med 60巻:181〜192頁を参照]。したがって、EPOをベースとした治療化合物(例えば、エリスロポイエチン刺激性の作用因子、ESA)は、患者が赤血球輸血を回避することを可能にする最も低い用量で投与することが推奨されている[例えば、Jelkmannら(2008年)Crit Rev Oncol. Hematol 67巻:39〜61頁を参照]。
遺伝性および後天性の形態の両方で起こる鉄芽球性貧血は、骨髄での「環状鉄芽球」の存在によって特徴付けられる。これらの特徴のある赤血球前駆体(赤芽球)は核周囲の鉄沈着顆粒の存在によって識別することができ、それらはペルシャンブルーによる組織学的染色によって明らかにされ、ミトコンドリアでの病理学的鉄沈着を示している[例えば、Muftiら(2008年)Haematologica 93巻:1712〜1717頁;Bottomleyら(
2014年)Hematol Oncol Clin N Am 28巻:653〜670頁を参照]。後天
性鉄芽球性貧血は、米国で1年に30,000人から40,000人の患者を冒すと推定される造血幹細胞障害の不均一な群である骨髄異形成症候群(MDS)を背景として最も頻繁に起こる[Bejarら(2014年)Blood1 24巻:2793〜2803頁]。これらの障害は、無効な造血、異常な「異形成」細胞形態および急性骨髄性白血病へのクローン進展の可能性によって特徴付けられる。下で議論されるように、MDSの遺伝的基礎における近年の進歩は、その診断および処置を大きく改善する可能性を有する。
MDS、鉄芽球性貧血およびそれらの障害の合併症のための有効な療法に対する高い満たされていない必要性がある。内因性EPOレベルはMDSを有する患者のサブセットで一般的に上昇し、したがって、これらの患者ではEPOの有効性が低いことが示唆される。MDSを有する患者の10%未満がEPOに好都合に応答すると推定されているが[Estey(2003年)Curr Opin Hematol 10巻、60〜67頁]、より近年のメタアナリシスは、EPO奏効率が研究によって30%〜60%の範囲であることを見出した[Moyoら(2008年)Ann Hematol 87巻:527〜536頁]。他のMDS患者と比較して、環状鉄芽球を有する患者は、急性骨髄性白血病を発症するリスクが実質的により低い傾向があり、したがって、全身鉄負荷に寄与せず、そのような患者に頻繁に存在する鉄過負荷を低減するのを代わりに助ける抗貧血治療剤からの恩恵を長期間受け続けるだろう[例えば、Temrazら、2014年、Crit Rev Oncol Hematol 91巻:64〜73頁
を参照]。
Liboiら(1993年)Proc Natl Acad Sci USA 90巻:11351〜11355頁
Kouryら(1990年)Science 248巻:378〜381頁
WeatherallおよびProvan(2000年)Lancet 355巻、1169〜1175頁
Horlら(2000年)Nephrol Dial Transplant 15巻、43〜50頁
Glaspyら(1997年)J Clin Oncol 15巻、1218〜1234頁
Demetriら(1998年)J Clin Oncol 16巻、3412〜3425頁
Krapfら(2009年)Clin J Am Soc Nephrol 4巻:470〜480頁
Glaspy(2009年)Annu Rev Med 60巻:181〜192頁
Jelkmannら(2008年)Crit Rev Oncol. Hematol 67巻:39〜61頁
Muftiら(2008年)Haematologica 93巻:1712〜1717頁
Bottomleyら(2014年)Hematol Oncol Clin N Am 28巻:653〜670頁
Bejarら(2014年)Blood1 24巻:2793〜2803頁
Estey(2003年)Curr Opin Hematol 10巻、60〜67頁
Moyoら(2008年)Ann Hematol 87巻:527〜536頁
Temrazら、2014年、Crit Rev Oncol Hematol 91巻:64〜73頁
したがって、本開示の目的は、MDSおよび鉄芽球性貧血を有する患者を本明細書に開示されるActRIIアンタゴニストで処置する方法を提供すること、特に、処置の結果として赤血球、好中球および他の血液細胞の治療的に有益な増加を示す可能性が最も高いMDS患者の選択を導くことである。
部分的に、本開示は、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストによってMDSおよび鉄芽球性貧血を処置する、特に、骨髄の鉄芽球の存在によって特徴付けられるMDS患者を含む、MDSの1つまたは複数の合併症またはサブタイプを処置または予防する方法を提供する。
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群(MDS)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)などのSF3B1での生殖細胞系列または体細胞変異と関連する、ならびに乳がん、膵がん、胃がん、前立腺がんおよびブドウ膜メラノーマにおける障害または障害の合併症を、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、SF3B1変異、特に骨髄異形成症候群、CLLおよびAMLについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、SF3B1遺伝子の変異は、エクソン、イントロンまたは5’および/もしくは3’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、SF3B1遺伝子の変異は、SF31Bのエクソン14、15および/または16にある。必要に応じて、SF3B1の変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、SF3B1遺伝子の変異は、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、E783KおよびV701Fの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。
ある特定の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号1のアミノ酸29〜109と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号1のアミノ酸25〜125と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。さらに他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号44のアミノ酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。ある特定の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号1のアミノ酸29〜109と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号1のアミノ酸25〜125と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。さらに他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号44のアミノ酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸[天然に存在するアミノ酸(例えば、DもしくはE)または人工アミノ酸]を含み、対象が、0.125〜1.75mg/kg(例えば、0.75〜1.75mg/kg)のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法により使用されるポリペプチドは、ダイマー(例えば、共有結合または非共有結合の相互作用によって会合した、配列番号44のアミノ酸配列に対応する2つのポリペプチドを含むホモダイマー)である。必要に応じて、ポリペプチドは、TGFβスーパーファミリーの1つまたは複数のリガンドに結合することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ActRIIAおよびActRIIBポリペプチドならびにその改変体、例えばGDFトラップ)は、GDF11に結合することができる。他の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ActRIIAおよびActRIIBポリペプチドならびにその改変体、例えばGDFトラップ)は、GDF8に結合することができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ActRIIAおよびActRIIBポリペプチドならびにその改変体、例えばGDFトラップ)は、GDF11およびGDF8に結合することができる。必要に応じて、ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される、1つまたは複数のアミノ酸改変を含むことができる。ある特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する。必要に応じて、ポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。必要に応じて、本方法は、対象へのポリペプチドの皮下投与を含む。必要に応じて、投薬スケジュールは、ポリペプチドを毎週2回、毎週1回、3週おきに1回、4週おきに1回、5週おきに1回、6週おきに1回、7週おきに1回、8週おきに1回、9週おきに1回、10週おきに1回、12週おきに1回、14週おきに1回、16週おきに1回、18週おきに1回、20週おきに1回、24週おきに1回、26週おきに1回、28週おきに1回、30週おきに1回、32週おきに1回、34週おきに1回または36週おきに1回、患者に投与することをさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、投薬スケジュールは、ポリペプチドを3週おきに1回、患者に投与することをさらに含む。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する。必要に応じて、対象は、1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、EPO受容体アゴニストは、EPOである。必要に応じて、処置は赤血球レベルを増加させる。必要に応じて、処置は、ヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、その場合、処置は、2週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす。必要に応じて、処置は、8週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす。必要に応じて、対象は、処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、その場合、対象は低輸血負荷対象である。必要に応じて、対象は高輸血負荷対象である。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも4週間、血液細胞輸血を50%以上減少させる。必要に応じて、処置は、処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも8週間、血液細胞輸血を50%以上減少させる。必要に応じて、患者は骨髄異形成症候群を有する。必要に応じて、患者は、低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する。必要に応じて、鉄芽球性貧血対象は、骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として、少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する。必要に応じて、処置は好中球レベルを増加させる。必要に応じて、対象は、SF3B1の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、対象は、DNMT3Aの1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、対象は、TET2の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。一部の実施形態では、処置は組織鉄過負荷(例えば、腎臓、肝臓および/または脾臓での鉄過負荷)を減少させる。一部の実施形態では、処置は血清鉄過負荷を減少させる。
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群(MDS)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)などの、DNMT3Aでの生殖細胞系列または体細胞変異と関連する障害または障害の合併症を、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、DNMT3A変異、特に骨髄異形成症候群、CLLおよびAMLについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、DNMT3A遺伝子の変異は、エクソン、イントロンおよび/または5’もしくは3’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、DNMT3A遺伝子の変異は、DNMT3Aのエクソン10、18および/または22にある。必要に応じて、DNMT3Aの変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、DNMT3A遺伝子の変異は、R882C、R882H、P904LおよびP905Pの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。必要に応じて、DNMT3A遺伝子の変異は、中途の終止コドンを導入する。例えば、一部の実施形態では、中途の終止コドンを導入するDNMT3A遺伝子の変異は、以下の位置:Y436XおよびW893Xから選択される。
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群(MDS)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)などの、TET2での生殖細胞系列または体細胞変異と関連する障害または障害の合併症を、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、TET2変異、特に骨髄異形成症候群、CLLおよびAMLについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、TET2遺伝子の変異は、エクソン、イントロンおよび/または5’もしくは3’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、TET2遺伝子の変異は、TET2のエクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8および/またはエクソン9にある。必要に応じて、TET2の変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、TET2遺伝子の変異は、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、N1387SおよびY1724Hの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。必要に応じて、TET2遺伝子の変異は、中途の終止コドンを導入する。例えば、一部の実施形態では、中途の終止コドンを導入するTET2遺伝子の変異は、以下の位置:R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xから選択される。
ある特定の態様では、本開示は、対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与することを含み、対象は、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、SF3B1エクソンにある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、SF3B1イントロンにある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、SF3B1の5’および/または3’領域にある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のSF3B1変異は、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のSF3B1変異は、エクソン14、エクソン15およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aエクソンにある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aイントロンにある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aの5’および/または3’領域にある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2エクソンにある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2イントロンにある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2の5’および/または3’領域にある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される。必要に応じて、対象は貧血を有する。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する。必要に応じて、対象は、1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、EPO受容体アゴニストはEPOである。必要に応じて、処置は白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は急性骨髄性白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、対象は前白血病患者である。必要に応じて、処置は、対象の赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、対象は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週の間、約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%血液細胞輸血を減少させる。必要に応じて、処置は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%を超えて減少させる。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、肝臓および/または脾臓の鉄含有量を減少させる。
ある特定の態様では、本開示は、骨髄異形成症候群(MDS)および/またはMDSの1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与することを含み、対象が、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す。必要に応じて、変異の1つまたは複数は、SF3B1エクソンにある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、SF3B1イントロンにある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、SF3B1の5’および/または3’領域にある。必要に応じて、SF3B1変異の1つまたは複数は、変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のSF3B1変異は、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のSF3B1変異は、エクソン14、エクソン14およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aエクソンにある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aイントロンにある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、DNMT3Aの5’および/または3’領域にある。必要に応じて、DNMT3A変異の1つまたは複数は、変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、1つまたは複数のDNMT3A変異は、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2エクソンにある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2イントロンにある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、TET2の5’および/または3’領域にある。必要に応じて、TET2変異の1つまたは複数は、変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、1つまたは複数のTET2変異は、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される。必要に応じて、対象は貧血を有する。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する。必要に応じて、対象は、1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、EPO受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、EPO受容体アゴニストはEPOである。必要に応じて、処置は白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は急性骨髄性白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は、対象の赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、対象は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週の間、約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%血液細胞輸血を減少させる。必要に応じて、処置は、ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%超減少させる。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、肝臓および/または脾臓の鉄含有量を減少させる。必要に応じて、対象は、環状鉄芽球を有する不応性貧血を伴うMDS(RARS);環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を伴うMDS(RARS−T);単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2の1つまたは複数の体細胞性変異を伴うMDS;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS;鉄過負荷を伴うMDS;ならびに好中球減少症を伴うMDSから選択されるMDSのサブタイプを有する。必要に応じて、対象は、低、中間1または中間2から選択される国際予後スコアリングシステム(IPSS)スコアを有する。必要に応じて、対象は鉄芽球を有する。必要に応じて、対象は、その骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として、少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の鉄芽球を有する。
本開示のActRIIアンタゴニストは、例えば、ActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体)に媒介されるシグナル伝達経路の活性化(例えば、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、および/またはSMAD8などの細胞内メディエーターを介するシグナル伝達の活性化)を阻害し得る作用因子;1つまたは複数のActRIIリガンド(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodalなど)が、例えば、ActRII受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害し得る作用因子;ActRIIリガンドおよび/またはActRII受容体の発現(例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組み合わせ)を阻害する作用因子;ならびにActRIIシグナル伝達経路の1つまたは複数の細胞内メディエーター(例えば、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、および/またはSMAD8)を阻害し得る作用因子を含む。
特に、本開示は、例えば、貧血、好中球減少症、脾腫、血液輸血要求、急性骨髄性白血病の発症、鉄過負荷および鉄過負荷の合併症、中でも、うっ血心不全、心臓不整脈、心筋梗塞、心疾患の他の形態、真性糖尿病、呼吸困難、肝臓疾患、および鉄キレート療法の有害作用を含む、MDSおよび鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防するために、ならびに他の例として、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
特に、本開示は、骨髄の赤芽球の上昇した数(過形成)を有するMDS患者を含むMDSのサブタイプ;骨髄において赤血球前駆体の百分率として、1%を超える、2%を超える、3%を超える、4%を超える、5%を超える、6%を超える、7%を超える、8%を超える、9%を超える、10%を超える、11%を超える、12%を超える、13%を超える、14%を超える、15%を超える、16%を超える、17%を超える、18%を超える、19%を超える、20%を超える、25%を超える、30%を超える、35%を超える、40%を超える、45%を超える、50%を超える、55%を超える、60%を超える、65%を超える、70%を超える、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超えるまたは95%を超える鉄芽球を有するMDS患者;環状鉄芽球を有する不応性貧血を有するMDS患者(RARS);環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を有するMDS患者(RARS−T);単一系統異形成を有する不応性血球減少症を有するMDS患者(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を有するMDS患者(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3A、TET2またはSETBP1の体細胞性変異を有するMDS患者;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS患者;鉄過負荷を有するMDS患者;ならびに好中球減少症を有するMDS患者において合併症を処置または予防するために、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
さらに特に、本開示は、環状鉄芽球を有する不応性貧血(RARS);環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血(RARS−T);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症(RCMD−RS);アルコール依存症と関連した鉄芽球性貧血;薬物性鉄芽球性貧血;銅欠乏症(亜鉛毒性)から生じる鉄芽球性貧血;低体温から生じる鉄芽球性貧血;X連鎖鉄芽球性貧血(XLSA);SLC25A38欠損;グルタレドキシン5欠損;赤芽球増殖性プロトポルフィリン症;運動失調を有するX連鎖鉄芽球性貧血(XLSA/A);B細胞免疫欠損、発熱および発達遅延を有する鉄芽球性貧血(SIFD);ピアソン髄−膵臓症候群;ミオパシー、乳酸性アシドーシスおよび鉄芽球性貧血(MLASA);チアミン応答性巨赤芽球性貧血(TRMA);ならびに原因不明の症候性/無症候性鉄芽球性貧血を含む、鉄芽球性貧血の合併症を処置または予防するために、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって使用される好ましいActRIIアンタゴニストは、GDF11および/またはGDF8に結合するおよび/またはそれを阻害する作用因子である(例えば、SMAD2/3シグナル伝達などのActRIIAおよび/またはActRIIBシグナル伝達のGDF11および/またはGDF8媒介活性化を阻害する作用因子)。このような作用因子は、GDF−ActRIIアンタゴニストと総称される。必要に応じて、このようなGDF−ActRIIアンタゴニストは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数をさらに阻害し得る。したがって、一部の実施形態では、本開示は、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストであって、例えば、可溶性ActRIIAポリペプチド、可溶性ActRIIBポリペプチド、GDFトラップポリペプチド、抗ActRIIA抗体、抗ActRIIB抗体、抗ActRIIリガンド抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗アクチビンA抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンAB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、および抗Nodal抗体)、ActRIIAの低分子阻害剤、ActRIIBの低分子阻害剤、1つもしくは複数のActRIIリガンド(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodalなど)の低分子阻害剤、ActRIIAの阻害剤ヌクレオチド、ActRIIBの阻害剤ヌクレオチド、1つもしくは複数のActRIIリガンド(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodalなど)の阻害剤ヌクレオチド(ヌクレオチドベースの阻害剤)、またはこれらの組み合わせを含むActRIIアンタゴニストを使用して、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび/もしくはヘモグロビンレベルを高める、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血もしくはMDSを処置する、または、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血もしくはMDSの1つもしくは複数の合併症を処置する、ならびに他の例として、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防する、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるActRIIアンタゴニストは、アクチビンAに実質的に結合しない、かつ/またはこれ(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。
部分的に、本開示は、GDF11に結合し、かつその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、GDF11に媒介される、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達)を阻害する、改変体の細胞外(可溶性)ActRIIBドメインを含むActRIIアンタゴニストを使用して、インビボにおける赤血球レベルを高め、種々の状態/障害から生じる貧血を処置し、鉄芽球性貧血またはMDSを処置し得ることを実証する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高める、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防する、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法など)に従い使用する好ましいActRIIアンタゴニストは、GDF11(例えば、SMAD2/3シグナル伝達などのActRIIAおよび/またはActRIIBシグナル伝達のGDF11媒介活性化)に結合するおよび/またはそれを阻害する可溶性ActRIIポリペプチド(例えば、可溶性ActRIIAまたはActRIIBポリペプチド)である。ActRIIアンタゴニストである、可溶性ActRIIAポリペプチドおよび可溶性ActRIIBポリペプチドは、GDF11に対する拮抗以外の機構を介して、赤血球の形成および潰瘍に影響を及ぼし得るが、本開示は、これにもかかわらず、本明細書で開示される方法に照らして望ましい治療剤は、GDF11に対する拮抗もしくはActRIIに対する拮抗またはこれらの両方に基づき選択し得ることを実証する。必要に応じて、このような可溶性ActRIIポリペプチドアンタゴニストは、GDF8にさらに結合することが可能であり、かつ/またはこれをさらに阻害し(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化を阻害し)得る。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8に結合し、かつ/またはこれらを阻害する、本開示の可溶性ActRIIAポリペプチドおよび可溶性ActRIIBポリペプチドは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalから選択される、1つまたは複数の追加のActRIIリガンドにさらに結合することが可能であり、かつ/またはこれらをさらに阻害し得る。
ある特定の態様では、本開示は、改変体ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)であって、アミノ末端およびカルボキシ末端の切断ならびに/または他の配列変更(1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、またはこれらの組み合わせ)を有するActRIIポリペプチドを含む、改変体ActRIIポリペプチドであるGDFトラップを提供する。必要に応じて、本発明のGDFトラップは、GDF8(ミオスタチンともまた呼ばれる)、GDF11、Nodal、BMP6、およびBMP7(OP−1ともまた呼ばれる)など、ActRII受容体の1つまたは複数のリガンドに優先的に拮抗するようにデザインすることができる。本明細書で開示される通り、GDFトラップの例は、ActRIIBに由来する改変体であって、アクチビン、特に、アクチビンAに対するアフィニティーを大幅に減殺した改変体のセットを含む。これらの改変体は、他の組織に対する効果を低減しながら、赤血球に対する所望の効果を呈示する。このような改変体の例は、配列番号1の79位に対応する位置に酸性アミノ酸[例えば、アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)]を有する改変体を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防する、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法など)に従い使用される好ましいGDFトラップは、GDF11に結合するおよび/またはそれを阻害する。必要に応じて、そのようなGDFトラップは、GDF8にさらに結合することおよび/またはそれを阻害することができる。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8に結合し、かつ/またはこれらを阻害する、GDFトラップは、1つまたは複数の追加のActRIIリガンド(例えば、アクチビンB、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodal)にさらに結合することが可能であり、かつ/またはこれらをさらに阻害し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるGDFトラップは、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはこれ(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。ある特定の実施形態では、GDFトラップポリペプチドは、配列番号36、37、41、44、45、50、または51のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドを含む。他の実施形態では、GDFトラップポリペプチドは、配列番号2、3、4、5、6、10、11、22、26、28、29、31、または49のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドを含む。さらに他の実施形態では、GDFトラップポリペプチドは、配列番号2、3、4、5、6、29、31、または49のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドを含み、配列番号1、4、または50の79位に対応する位置は、酸性アミノ酸である。GDFトラップは、天然ActRIIポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号1、2、3、4、5、6、9、10、11、もしくは49から選択される配列、または配列番号2、5、10、11、もしくは49の配列であり、C末端の1、2、3、4、5のアミノ酸、もしくは10〜15アミノ酸を欠き、かつ、N末端における1、2、3、4、もしくは5のアミノ酸を欠く配列の少なくとも10、20、もしくは30アミノ酸を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、N末端に配列番号2または5と比べて2から5アミノ酸の切断およびC末端に3以下のアミノ酸を含む。そのような調製物で使用するための好ましいGDFトラップは、配列番号36のアミノ酸配列からなるか、または本質的になる。
必要に応じて、変更させたActRIIリガンド結合性ドメインを含むGDFトラップは、そのアクチビンAへの結合についてのKdの、GDF11および/またはGDF8への結合についてのKdに対する比が、野生型リガンド結合性ドメインの場合の比と比べて、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、なおまたは1000倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインを含むGDFトラップは、アクチビンAの阻害についてのIC50の、GDF11および/またはGDF8の阻害についてのIC50に対する比が、野生型ActRIIリガンド結合性ドメインの場合と比べて、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、なおまたは1000倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインを含むGDFトラップは、GDF11および/またはGDF8を、アクチビンAの阻害についてのIC50の、多くとも、2分の1、5分の1、10分の1、20分の1、50分の1、なおまたは100分の1であるIC50で阻害する。これらのGDFトラップは、免疫グロブリンFcドメイン(野生型または変異体)を含む融合タンパク質であり得る。ある特定の場合には、対象の可溶性GDFトラップは、GDF8および/またはGDF11のアンタゴニスト(阻害剤)である。
ある特定の態様では、本開示は、変更させたリガンド結合性(例えば、GDF11結合性)ドメインを含む可溶性ActRIIBポリペプチドであるGDFトラップを提供する。リガンド結合性ドメインを変更させたGDFトラップは、例えば、ヒトActRIIBのE37、E39、R40、K55、R56、Y60、A64、K74、W78、L79、D80、F82、およびF101(番号付けは、配列番号1に照らした番号付けである)などのアミノ酸残基において、1つまたは複数の変異を含み得る。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、GDF8/GDF11などのリガンドに対する選択性を、ActRIIB受容体の野生型リガンド結合性ドメインと比べて増大させている場合がある。例示すると、本明細書では、これらの変異:K74Y、K74F、K74I、L79D、L79E、およびD80Iが、変更させたリガンド結合性ドメインの、GDF11に対する選択性を、アクチビンに対する場合を上回って増大させる(したがって、おそらく、GDF8に対する選択性も増大させる)ことが実証される。以下の変異:D54A、K55A、L79A、およびF82Aは、逆の作用を及ぼし、アクチビンへの結合の、GDF11への結合に対する比を増大させる。全体的な(GDF11およびアクチビンへの)結合活性は、「テール」領域の組入れにより増大する場合もあり、おそらく、構造化されていないリンカー領域により増大する場合もあり、また、K74A変異の使用により増大する場合もある。リガンド結合アフィニティーの全体的な減少を引き起こした他の変異は、R40A、E37A、R56A、W78A、D80K、D80R、D80A、D80G、D80F、D80M、およびD80Nを含む。変異は、所望の効果を達成するように組み合わせることができる。例えば、GDF11への結合の、アクチビンへの結合に対する比に影響を及ぼす変異の多くは、リガンドへの結合に対して、全体的な負の作用を及ぼし、したがって、これらを、リガンドへの結合を一般に増大させる変異と組み合わせることができ、これにより、リガンドへの選択性を有する、改善された結合性タンパク質をもたらす。例示的な実施形態では、GDFトラップは、必要に応じて、追加のアミノ酸の置換、付加、または欠失と組み合わせた、L79D変異またはL79E変異を含むActRIIBポリペプチドである。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるActRIIアンタゴニストは、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドである。一般に、このようなActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号1、4、または49のActRIIB配列に由来する部分/ドメイン、特に、配列番号1、4、または49のActRIIB配列に由来する細胞外のリガンド結合性部分/ドメインを含む、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸21〜29(例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり[必要に応じて、配列番号1または4のアミノ酸22〜25(例えば、22、23、24、または25)で始まり]、配列番号1または4のアミノ酸109〜134(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜29(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり[必要に応じて、配列番号1または4のアミノ酸22〜25(例えば、22、23、24、または25)で始まり]、配列番号1または4のアミノ酸109〜133(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜24(例えば、20、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり[必要に応じて、配列番号1または4のアミノ酸22〜25(例えば、22、23、24、または25)で始まり]、配列番号1または4のアミノ酸109〜133(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸21〜24(例えば、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸109〜134(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜24(例えば、20、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸118〜133(例えば、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸21〜24(例えば、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸118〜134(例えば、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜24(例えば、20、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸128〜133(例えば、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または39のアミノ酸20〜24(例えば、20、21、22、23、または24)のいずれか1つで始まり、配列番号1または39のアミノ酸128〜133(例えば、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸21〜29(例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸118〜134(例えば、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜29(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸118〜133(例えば、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸21〜29(例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸128〜134(例えば、128、129、130、131、132、133、または134)のいずれか1つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ActRIIBに由来する部分は、配列番号1または4のアミノ酸20〜29(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)のいずれか1つで始まり、配列番号1または4のアミノ酸128〜133(例えば、128、129、130、131、132、または133)のいずれか1つで終わる配列に対応する。驚くべきことに、配列番号1または4のアミノ酸22〜25(例えば、22、23、24、または25)で始まる、ActRIIBおよびActRIIBベースのGDFトラップ構築物の活性レベルは、ヒトActRIIBの全長細胞外ドメインを有するタンパク質より高い。好ましい実施形態では、ActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号1または4のアミノ酸25位で始まり、配列番号1または4のアミノ酸131位で終わるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。前出のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、ホモ二量体として生成することができる。前出のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、Fcドメインなど、IgG重鎖に由来する定常領域を含む異種部分をさらに含み得る。上記のActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、必要に応じて、配列番号1と比べた、1つまたは複数の追加のアミノ酸の置換、欠失、または挿入と組み合わせて、配列番号1の79位に対応する位置に、酸性アミノ酸を含み得る。そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、またはアクチビンAB)に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、GDF11および/またはGDF8に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。必要に応じて、そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。
以下のポリペプチドなど、他のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドも想定される。配列番号1または4のアミノ酸29〜109の配列に、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)同一であるアミノ酸配列を含むActRIIBポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1の64に対応する位置が、RまたはKであり、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドが、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、GDF8、および/またはGDF11によるシグナル伝達を阻害する、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の配列に照らした少なくとも1つの変更が、リガンド結合性ポケットの外部に位置する、ポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の配列に照らした少なくとも1つの変更が、リガンド結合性ポケット内に位置する保存的変更である、ポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の配列に照らした少なくとも1つの変更が、K74、R40、Q53、K55、F82、およびL79からなる群より選択される1つまたは複数の位置における変更である、ポリペプチド。
以下のポリペプチドなど、他のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドも想定される。配列番号1または4のアミノ酸29〜109の配列に、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)同一であるアミノ酸配列を含むActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、タンパク質が、ActRIIBの内因性N−X−S/T配列以外の位置、およびリガンド結合性ポケットの外部の位置において、少なくとも1つのN−X−S/T配列を含む、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の24位に対応する位置におけるNおよび配列番号1または4の26位に対応する位置におけるSまたはTを含み、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、GDF8、および/またはGDF11によるシグナル伝達を阻害する、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の64位に対応する位置におけるRまたはKを含む、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の79位に対応する位置におけるDまたはEを含み、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、GDF8、および/またはGDF11によるシグナル伝達を阻害する、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の配列に照らした少なくとも1つの変更が、リガンド結合性ポケット内に位置する保存的変更である、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、配列番号1または4の配列に照らした少なくとも1つの変更が、K74、R40、Q53、K55、F82、およびL79からなる群より選択される1つまたは複数の位置における変更である、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドであって、1つまたは複数の異種部分をさらに含む融合タンパク質である、ActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチド。上記のActRIIBポリペプチドもしくはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれか、またはその融合タンパク質は、ホモ二量体として生成することができる。上記のActRIIB融合タンパク質またはActRIIBベースのGDFトラップ融合タンパク質のいずれかは、Fcドメインなど、IgG重鎖に由来する定常領域を含む異種部分を有し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従う使用のための好ましいActRIIBポリペプチドは、配列番号2、3、5、6、29、31、または49のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドを含む。ActRIIBポリペプチドは、天然ActRIIBポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号2、3、5、6、29、31、もしくは49から選択される配列の少なくとも10、20、もしくは30アミノ酸、または配列番号2もしくは5の配列であり、C末端の1、2、3、4、5のアミノ酸、もしくは10〜15アミノ酸を欠き、かつ、N末端における1、2、3、4、もしくは5のアミノ酸を欠く配列を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、配列番号2または5と比べて、N末端における2〜5アミノ酸、および、C末端における3アミノ酸を超えない切断を含むで。本明細書で記載される方法に従う使用のための好ましいGDFトラップは、配列番号29のアミノ酸配列からなるか、またはこれから本質的になる。
活性(例えば、リガンド結合性)ActRIIAポリペプチドの一般式は、配列番号9のアミノ酸30から開始しアミノ酸110で終了するポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のActRIIAポリペプチドおよびActRIIAベースのGDFトラップは、配列番号9のアミノ酸30〜110と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるポリペプチドを含み得るか、これからなり得るか、またはこれから本質的になり得る。必要に応じて、本開示のActRIIAポリペプチドおよびActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸12〜82に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるポリペプチドであって、必要に応じて、配列番号9の1〜5位(例えば、1、2、3、4、または5位)または3〜5位(例えば、3、4、または5位)の範囲の位置で始まり、それぞれ、110〜116位(例えば、110、111、112、113、114、115、または116位)または110〜115位(例えば、110、111、112、113、114、または115位)の範囲の位置で終わり、配列番号9に照らして、リガンド結合性ポケット内に、1つ、2つ、5つ、10、または15を超えない保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合性ポケット内の40、53、55、74、79、および/または82位に、0、1つ、または複数の非保存的変更を含むポリペプチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。前出のActRIIAポリペプチドまたはActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、ホモ二量体として生成することができる。前出のActRIIAポリペプチドまたはActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、Fcドメインなど、IgG重鎖に由来する定常領域を含む異種部分をさらに含み得る。そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIAポリペプチドまたはActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、またはアクチビンAB)に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIAポリペプチドまたはActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、GDF11および/またはGDF8に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。必要に応じて、そのホモ二量体および/または融合タンパク質を含む、上記のActRIIAポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、GDF7、およびNodalのうちの1つまたは複数に結合することが可能であり、かつ/またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従う使用のための好ましいActRIIAポリペプチドおよびActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号9、10、22、26、または28のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドを含む。ActRIIAポリペプチドまたはActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドは、天然ActRIIAポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号9、10、22、26、もしくは28から選択される配列の少なくとも10、20、もしくは30アミノ酸、または配列番号10の配列であり、C末端の1、2、3、4、5のアミノ酸、もしくは10〜15アミノ酸を欠き、かつ、N末端における1、2、3、4、もしくは5のアミノ酸を欠く配列を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、配列番号10と比べて、N末端における2〜5アミノ酸、および、C末端における3アミノ酸を超えない切断を含む。本明細書で記載される方法における使用のための好ましいActRIIAポリペプチドは、配列番号26または28のアミノ酸配列からなるか、またはこれらから本質的になる。
本開示のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチドは、ActRIIポリペプチドのアミノ酸配列内(例えば、リガンド結合性ドメイン内)の1つまたは複数の変更(例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換、またはこれらの組み合わせ)を、天然に存在するActRIIポリペプチドと比べて含み得る。アミノ酸配列内の変更は、例えば、哺乳動物細胞内、昆虫細胞内、または他の真核細胞内で生成されると、ポリペプチドのグリコシル化を変更させる場合もあり、あるいは天然に存在するActRIIポリペプチドと比べて、ポリペプチドのタンパク質分解性切断を変更させる場合もある。
必要に応じて、本開示のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)およびGDFトラップポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合体化されたアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合体化されたアミノ酸から選択される、1つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。
一部の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチドは、1つのドメインとしての、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチド(例えば、必要に応じて、1つまたは複数の配列差異を有する、ActRII受容体のリガンド結合性ドメイン)と、1つまたは複数の追加の異種ドメインであって、薬物動態の改善、精製の容易さ、特定の組織への標的化など、望ましい特性をもたらす異種ドメインとを有する、融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボにおける安定性、インビボ半減期、取込み/投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および/または精製の1つまたは複数を増強し得る。ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップ融合タンパク質は、免疫グロブリンFcドメイン(野生型もしくは変異体)または血清アルブミンを含むことができる。ある特定の実施形態では、ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップ融合タンパク質は、FcドメインとActRIIまたはGDFトラップドメインとの間に位置する比較的非構造化されたリンカーを含む。この構造化されていないリンカーは、ActRIIまたはGDFトラップの細胞外ドメインのC末端(「テール」)における、約15アミノ酸の構造化されていない領域に対応してもよく、3〜5、15、20、30、50、またはこれを超えるアミノ酸の間の人工配列であって、比較的二次構造を含まない人工配列でもよい。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基に富む場合があり、例えば、スレオニン/セリンおよびグリシンの反復配列[例えば、TG4(配列番号52)、TG3(配列番号53)またはSG4(配列番号54)のシングレットまたはリピート]または一続きの3つのグリシンを含有し得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、FLAGタグ、ポリヒスチジン配列、およびGST融合物などの精製部分配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合物は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然のActRIIリーダー配列(例えば、天然のActRIIAリーダー配列またはActRIIBリーダー配列)であってもよく、異種リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)リーダー配列である。一部の実施形態では、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質は、式A−B−Cに示されるアミノ酸配列を含む。B部分は、本明細書で記載される、NおよびC末端短縮型ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドである。A部分およびC部分は、独立に、0、1、または1を超えるアミノ酸であることが可能であり、A部分およびC部分のいずれも、Bに対して異種である。A部分および/またはC部分は、リンカー配列を介して、B部分に付加され得る。
必要に応じて、本明細書で開示される方法に従い使用される、それらの改変体および融合タンパク質を含む、ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチドは、1つまたは複数のActRIIBリガンド(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、および/またはNodal)に、10μM未満、1μM未満、100nM未満、10nM未満、または1nM未満のKdで結合する。必要に応じて、このようなActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、ActRIIリガンドにより誘発されるActRIIAおよび/またはActRIIB細胞内シグナル伝達イベント(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達)などのActRIIシグナル伝達を阻害する。
ある特定の態様では、本開示は、本開示のActRIIアンタゴニスト(例えば、ActRIIAポリペプチド、およびActRIIBポリペプチド、GDFトラップポリペプチド)と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬調製物または組成物を提供する。医薬調製物または組成物はまた、本明細書で記載される障害または状態を処置するのに使用される化合物など、1つまたは複数の追加の化合物(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高め、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防する、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1変異に関連した障害を処置もしくは予防する、追加の化合物)も含み得る。好ましくは、本開示の医薬調製物は、発熱物質を実質的に含まない。一般に、ActRIIAポリペプチド、およびActRIIBポリペプチド、またはGDFトラップポリペプチドは、患者における望ましくない免疫応答の可能性を低減するために、ポリペプチドの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株内で発現させることが好ましい。ヒト細胞株およびCHO細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想される。一部の実施形態では、好ましいActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、およびGDFトラップポリペプチドは、グリコシル化されており、哺乳動物細胞、好ましくはCHO細胞から得ることができるグリコシル化パターンを有する。ある特定の実施形態では、本開示は、パッケージングされた医薬であって、本明細書で記載される医薬調製物を含み、哺乳動物(好ましくはヒト)において赤血球レベルを高めることおよび/もしくはヘモグロビンを増加させること、哺乳動物(好ましくはヒト)において貧血を処置もしくは予防すること、哺乳動物(好ましくはヒト)において鉄芽球性貧血もしくはMDSを処置すること、ならびに/または哺乳動物(好ましくはヒト)において鉄芽球性貧血もしくはMDSの1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血管閉塞性クリーゼ、など)を処置もしくは予防することまたは、哺乳動物(好ましくは、ヒト)においてSF3B1変異に関連した障害を処置もしくは予防するのうちの1つまたは複数における使用についてのラベルが付けられた医薬を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチドをコードする核酸を提供する。単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるポリペプチドなどの可溶性ActRIIポリペプチドまたは可溶性GDFトラップポリペプチドをコードする配列を含み得る。例えば、単離核酸は、1つまたは複数の配列差異を有するActRIIポリペプチドの細胞外ドメイン(例えば、リガンド結合性ドメイン)を含む、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップをコードする配列と、ActRIIポリペプチドの膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメインの一部または全部であって、膜貫通ドメイン内もしくは細胞質ドメイン内に位置するか、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する、終止コドンを除く一部または全部をコードする配列とを含み得る。例えば、GDFトラップをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号1、4、もしくは9などの全長ActRIIポリヌクレオチド配列または1つもしくは複数の差異を有する全長ActRIIポリヌクレオチド配列を含んでもよく、部分的な切断形を含んでもよいが、ポリヌクレオチドの翻訳により、必要に応じて、全長ActRIIの切断部分に融合させた細胞外ドメインがもたらされるように、前記単離ポリヌクレオチドは、3’末端の少なくとも600ヌクレオチド前における転写終結コドンか、または他の形で位置する転写終結コドンをさらに含む。本明細書で開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結することができ、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。細胞は、CHO細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。
ある特定の態様では、本開示は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップを作製するための方法を提供する。このような方法は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞など、適切な細胞内で、本明細書で開示される核酸(例えば、配列番号8、13、27、32、39、42、46または48)のいずれかを発現させることを含み得る。このような方法は、a)GDFトラップポリペプチドの発現に適する条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、前記細胞は、GDFトラップの発現構築物で形質転換される工程と;b)このようにして発現させたGDFトラップポリペプチドを回収する工程とを含み得る。GDFトラップポリペプチドは、タンパク質を細胞培養物から得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収され得る。
ある特定の態様では、本開示は、ActRII活性(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の阻害)に拮抗する抗体または抗体の組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、ならびに/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、抗体ActRIIアンタゴニストまたは抗体ActRIIアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示の、好ましい抗体ActRIIアンタゴニストは、少なくともGDF11に結合し、かつ/またはその活性(例えばSMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化)を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、GDF11およびGDF8の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または1つもしくは複数の抗GDF11抗体と、1つもしくは複数の抗GDF8抗体との組み合わせの文脈において、GDF8にさらに結合し、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化)をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8に結合し、かつ/またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体(各々が、異なるActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する)の組み合わせの文脈において、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数にさらに結合し、かつ/またはこれらの活性(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の活性化)をさらに阻害する。
部分的に、本開示は、赤血球レベルを増加させるために(赤血球生成)、または、例として、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、ならびに/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するためにActRIIアンタゴニストをEPO受容体活性化因子と組み合わせて使用する(例えば、同時にまたは異なる時間であるが、一般的に重複する薬理効果を達成するような方法で投与する)ことができることを実証する。部分的に、本開示は、患者において、特に鉄芽球性貧血またはMDSの患者において赤血球の形成を相乗的に増加させるために、GDFトラップをEPO受容体活性化因子と組み合わせて投与することができることを実証する。したがって、この組み合わせ処置の効果は、それらのそれぞれの用量で個別に投与された場合の、ActRIIアンタゴニストの効果と、EPO受容体活性化因子の効果との合計を顕著に超える可能性がある。ある特定の実施形態では、この相乗作用は、赤血球の標的レベルがより低い用量のEPO受容体活性化因子で達成されること可能とし、これにより、より高いレベルのEPO受容体の活性化と関連する潜在的な有害作用または他の問題を回避するので、有利であり得る。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の方法(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置する、ならびに/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防する、ならびに/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法)は、それを必要とする患者に1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト(例えば、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチドおよび/もしくはGDFトラップポリペプチド)を1つまたは複数のEPO受容体活性化因子と組み合わせて投与することを含む。
EPO受容体活性化因子は、EPO受容体に直接接触し、これを活性化させることにより、赤血球生成を刺激し得る。ある特定の実施形態では、EPO受容体活性化因子は、天然EPOの165アミノ酸配列に基づき、赤血球生成刺激因子(ESA)として一般に公知の化合物のクラスの1つであり、その例が、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、およびエポエチンオメガである。他の実施形態では、ESAは、望ましい薬物動態特性(循環半減期の延長)を付与する非ペプチド修飾を伴う合成EPOタンパク質(SEP)およびEPO誘導体を含み、それらの例が、ダルベポエチンアルファおよびメトキシポリエチレングリコールエポエチンベータである。ある特定の実施形態では、EPO受容体活性化因子は、EPOポリペプチド骨格を組み込んでいないか、または一般にESAと分類されない、EPO受容体アゴニストであり得る。このようなEPO受容体アゴニストは、EPOのペプチド模倣物および非ペプチド模倣物、EPO受容体を標的化するアゴニスト性抗体、EPO模倣物ドメインを含む融合タンパク質、ならびに持続時間延長型エリスロポエチン受容体制限アゴニスト(erythropoietin receptor extended−duration limited agonist)(EREDLA)を含み得るがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、EPO受容体活性化因子は、EPO受容体自体に接触させずに、内因性EPOの生成を増強することにより、間接的に赤血球生成を刺激し得る。例えば、低酸素誘導転写因子(HIF)は、正常酸素状態下では、細胞の調節機構により抑制されている(不安定化している)、EPO遺伝子発現の内因性刺激因子である。本開示は部分的に、GDFトラップと、プロピルヒドロキシラーゼ阻害剤など、HIF安定化特性を有する間接的EPO受容体活性化因子との組み合わせ処置によって、患者における赤血球生成の増大をもたらす。
ある特定の場合には、これらの他の処置適応症のためにGDFトラップポリペプチドを投与するとき、ActRIIアンタゴニストの投与時における赤血球に対する効果をモニタリングするか、または赤血球に対する所望されない作用を低減するために、ActRIIアンタゴニストの投薬を決定もしくは調整することが望ましいと考えられる。例えば、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、またはヘマトクリットレベルの上昇は、血圧の上昇を引き起こし得る。
本特許または特許出願の提出書類は、有色で作成された少なくとも1つの図面を含有する。有色の図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、入手を要請し、必要な手数料を支払えば、米国特許庁により提供される。
(発明の詳細な説明)
(1.概要)
トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特異化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。TGF−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのPiedmonteseおよびBelgian Blue品種は、GDF8(ミオスタチンとも呼ばれる)遺伝子に機能喪失変異を有しており、筋肉量の顕著な増加を引き起こしている[例えば、Grobetら(1997年)、Nat Genet.、17巻(1号)
:71〜4頁を参照されたい]。さらに、ヒトでは、GDF8の不活性な対立遺伝子は、筋肉量の増加、および、報告によれば、例外的な強度と関連している[例えば、Schuelkeら(2004年)、N Engl J Med、350巻:2682〜8頁を参照されたい]。
(1.概要)
トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特異化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。TGF−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのPiedmonteseおよびBelgian Blue品種は、GDF8(ミオスタチンとも呼ばれる)遺伝子に機能喪失変異を有しており、筋肉量の顕著な増加を引き起こしている[例えば、Grobetら(1997年)、Nat Genet.、17巻(1号)
:71〜4頁を参照されたい]。さらに、ヒトでは、GDF8の不活性な対立遺伝子は、筋肉量の増加、および、報告によれば、例外的な強度と関連している[例えば、Schuelkeら(2004年)、N Engl J Med、350巻:2682〜8頁を参照されたい]。
TGF−βシグナルは、I型およびII型のセリン/スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体(heteromeric complex)によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のSMADタンパク質(例えば、SMADタンパク質1、2、3、5、および8)をリン酸化および活性化する[例えば、Massague、2000年、Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1巻:169〜178頁を参照のこと]。これらのI型およびII型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン/スレオニン特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。I型受容体は、シグナル伝達に必須である。II型受容体は、リガンド結合およびI型受容体の活性化に必要とされる。I型およびII型のアクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、II型受容体によるI型受容体のリン酸化をもたらす。
2つの関連するII型受容体(ActRII)である、ActRIIAおよびActRIIBがアクチビンについてのII型受容体として同定されている[例えば、MathewsおよびVale(1991年)、Cell、65巻:973〜982頁;ならびにAttisanoら(1992年)、Cell、68巻:97〜108頁を参照されたい]。ActRIIAおよびActRIIBは、アクチビンに加えて、例えば、BMP6、BMP7、Nodal、GDF8、およびGDF11を含む他のいくつかのTGF−βファミリータンパク質とも生化学的に相互作用し得る[例えば、Yamashitaら(1995年)、J. Cell Biol.、130巻:217〜226頁;LeeおよびMcPherron(2001年)、Proc. Natl. Acad. Sci.USA、98巻:9306〜9311頁;YeoおよびWhitman(2001年)、Mol. Cell、7巻:949〜957頁;ならびにOhら(2002年)、Genes
Dev.、16巻:2749〜54頁を参照されたい]。ALK4は、アクチビン、特に、アクチビンAに対する主たるI型受容体であり、ALK7は、同様に他のアクチビン、特に、アクチビンBに対する受容体として機能し得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される1つまたは複数の阻害剤作用因子、特に、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11および/またはGDF8のうちの1つまたは複数に拮抗し得る阻害剤作用因子で、ActRII受容体のリガンド(ActRIIリガンドとも呼ばれる)に拮抗することに関する。
Dev.、16巻:2749〜54頁を参照されたい]。ALK4は、アクチビン、特に、アクチビンAに対する主たるI型受容体であり、ALK7は、同様に他のアクチビン、特に、アクチビンBに対する受容体として機能し得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される1つまたは複数の阻害剤作用因子、特に、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11および/またはGDF8のうちの1つまたは複数に拮抗し得る阻害剤作用因子で、ActRII受容体のリガンド(ActRIIリガンドとも呼ばれる)に拮抗することに関する。
アクチビンとは、TGFベータスーパーファミリーに属する、二量体ポリペプチドの増殖因子である。2つの近縁のβサブユニットのホモ/ヘテロ二量体(それぞれ、βAβA、βBβB、およびβAβB)である、3つの主要なアクチビン形態(A、B、およびAB)が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンCおよびアクチビンEもコードし、βCまたはβEを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。
TGF−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である[DePaoloら(1991年)、Proc Soc Ep Biol Med.198巻:500〜512頁;Dysonら(1997年)、Curr Biol.7巻:81〜84頁;およびWoodruff(1998年)、Biochem Pharmacol.55巻:953〜963頁]。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化作用因子(EDF)は、アクチビンAと同一であることが分かった[Murataら(1988年)、PNAS、85巻:2434頁]。アクチビンAは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出の間に、アクチビンは、FSHの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、FSHの分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして/または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン(FS)、フォリスタチン関連タンパク質(FSRP、FLRGまたはFSTL3としても公知)およびα2−マクログロブリンが挙げられる。
本明細書で記載される通り、「アクチビンA」に結合する作用因子は、単離βAサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体(例えば、βAβAホモ二量体またはβAβBヘテロ二量体)としてであれ、βAサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体(例えば、βAβBヘテロ二量体)の場合、「アクチビンA」に結合する作用因子は、βAサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβA以外のサブユニット(例えば、複合体のβBサブユニット)内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンA」に拮抗する(これを阻害する)本明細書で開示される作用因子は、単離βAサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体(例えば、βAβAホモ二量体またはβAβBヘテロ二量体)としてあれ、βAサブユニットにより媒介される1つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βAβBヘテロ二量体の場合、「アクチビンA」を阻害する作用因子は、βAサブユニットの1つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβA以外のサブユニット(例えば、複合体のβBサブユニット)の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンB」、「アクチビンC」、および「アクチビンE」に結合し、かつ/またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンAB」に拮抗する本明細書で開示される作用因子は、βAサブユニットにより媒介される1つまたは複数の活性と、βBサブユニットにより媒介される1つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
Nodalタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成における機能のほか、初期胚発生における心臓および胃など、体軸構造(axial structure)の後続の組織化における機能も有する。発生しつつある脊椎動物の胚内の背側組織は主に、脊索および前索板の体軸構造に寄与する一方で、体軸構造以外の胚構造を形成するように、周囲の細胞を動員することが実証されている。Nodalは、I型受容体およびII型受容体の両方ならびにSMADタンパク質として公知の細胞内エフェクターを介して、シグナル伝達すると考えられている。研究は、ActRIIAおよびActRIIBは、NodalのII型受容体として機能するという考えを裏付ける[例えば、Sakumaら(2002年)、Genes Cells.、2002年、7巻:401〜12頁を参照されたい]。Nodalリガンドは、それらの補因子(例えば、Cripto)と相互作用して、アクチビンI型受容体およびアクチビンII型受容体を活性化させ、これにより、SMAD2をリン酸化することが示唆される。Nodalタンパク質は、初期脊椎動物胚に極めて重要な多くのイベントであって、中胚葉形成、前部パターン形成、および左右体軸の指定を含むイベントに関与している。実験的証拠により、Nodalシグナル伝達は、アクチビンおよびTGFベータに特異的に応答することが既に示されているルシフェラーゼレポーターである、pAR3−Luxを活性化させることが実証されている。しかし、Nodalは、骨形成性タンパク質に対して特異的に応答するレポーターである、pTlx2−Luxを誘導することは不可能である。近年の結果は、Nodalシグナル伝達は、アクチビン−TGFベータ経路のSMADである、SMAD2およびSMAD3の両方に媒介されるという直接的な生化学的証拠を提示する。さらなる証拠により、Nodalシグナル伝達には、細胞外Criptoタンパク質を要することが示されており、これにより、Nodalシグナル伝達は、アクチビンシグナル伝達またはTGFベータシグナル伝達と顕著に異なっている。
増殖および分化因子8(GDF8)は、ミオスタチンとしても公知である。GDF8は、骨格筋量の負の調節因子である。GDF8は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるGDF8欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする[McPherronら、Nature(1997年)、387巻:83〜90頁]。骨格筋量の同様の増加は、ウシ[例えば、Ashmoreら(1974年)、Growth、38巻:501〜507頁;SwatlandおよびKieffer(1994年)、J. Anim. Sci.、38巻:752〜757頁;McPherronおよびLee(1997年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94巻:12457〜12461頁;ならびにKambadurら(1997年)、Genome Res.、7巻:910〜915頁を参照されたい]および、驚くべきことに、ヒト[例えば、Schuelkeら(2004年)、N Engl J
Med、350巻:2682〜8頁を参照されたい]におけるGDF8の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるHIV感染に関連する筋肉消耗には、GDF8タンパク質の発現の増加が随伴することも示している[例えば、Gonzalez−Cadavidら(1998年)、PNAS、95巻:14938〜43頁を参照されたい]。加えて、GDF8は、筋肉特異的酵素(例えば、クレアチンキナーゼ)の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る[例えば、国際特許出願公開第WO00/43781号を参照されたい]。GDF8プロペプチドは、成熟GDF8ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる[例えば、Miyazonoら(1988年)、J. Biol. Chem.、263巻:6407〜6415頁;Wakefieldら(1988年)、J. Biol. Chem.、263巻:7646〜7654頁;およびBrownら(1990年)、Growth Factors、3巻:35〜43頁を参照されたい]。GDF8または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる[例えば、Gamerら(1999年)、Dev. Biol.、208巻:222〜232頁を参照されたい]。
Med、350巻:2682〜8頁を参照されたい]におけるGDF8の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるHIV感染に関連する筋肉消耗には、GDF8タンパク質の発現の増加が随伴することも示している[例えば、Gonzalez−Cadavidら(1998年)、PNAS、95巻:14938〜43頁を参照されたい]。加えて、GDF8は、筋肉特異的酵素(例えば、クレアチンキナーゼ)の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る[例えば、国際特許出願公開第WO00/43781号を参照されたい]。GDF8プロペプチドは、成熟GDF8ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる[例えば、Miyazonoら(1988年)、J. Biol. Chem.、263巻:6407〜6415頁;Wakefieldら(1988年)、J. Biol. Chem.、263巻:7646〜7654頁;およびBrownら(1990年)、Growth Factors、3巻:35〜43頁を参照されたい]。GDF8または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる[例えば、Gamerら(1999年)、Dev. Biol.、208巻:222〜232頁を参照されたい]。
BMP11としても公知の増殖および分化因子11(GDF11)は、分泌タンパク質である[McPherronら(1999年)、Nat. Genet.、22巻:260〜264頁]。GDF11は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する[例えば、Nakashimaら(1999年)、Mech. Dev.、80巻:185〜189頁を参照されたい]。GDF11は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす[例えば、Gamerら(1999年)、Dev Biol.、208巻:222〜32頁を参照されたい]。GDF11は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された。例えば、Gamerら(2001年)、Dev Biol.、229巻:407〜20頁を参照されたい。筋内のGDF11の発現はまた、GDF8と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のGDF11の発現は、GDF11はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、GDF11は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された[例えば、Wuら(2003年)、Neuron、37巻:197〜207頁を参照されたい]。
骨形成性タンパク質1(OP−1)とも呼ばれる骨形態発生タンパク質(BMP7)は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、BMP7は、広範にわたる生理プロセスも調節する。例えば、BMP7は、上皮骨形成現象の一因となる、骨誘導因子であり得る。また、BMP7がカルシウムの調節および骨のホメオスタシスにおいても役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様に、BMP7も、II型受容体であるActRIIAおよびActRIIBに結合する。しかし、BMP7とアクチビンとは、異なるI型受容体を動員して、ヘテロマーの受容体複合体となる。観察される、BMP7の主要なI型受容体が、ALK2であったのに対し、アクチビンはもっぱら、ALK4(ActRIIB)に結合した。BMP7とアクチビンとは、顕著に異なる生体応答を誘発し、異なるSMAD経路を活性化させた[例えば、Macias−Silvaら(1998年)、J Biol Chem.、273巻:25628〜36頁を参照されたい]。
本明細書で実証される通り、ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)を使用して、インビボにおける赤血球レベルを高めることができる。ある特定の例では、GDFトラップポリペプチド(具体的には、改変体ActRIIBポリペプチド)は、野生型(非改変)ActRIIポリペプチドの対応する試料と比較して、固有の生体特性を特徴とすることが示される。このGDFトラップは、部分的に、アクチビンAへの結合親和性の実質的な消失、したがってアクチビンA活性に拮抗する能力のかなりの低下によって特徴付けられるが、GDF11の野生型に近いレベルの結合および阻害を保持する。in vivoで、GDFトラップは野生型ActRIIBポリペプチドと比較して赤血球レベルを増加させることにおいてより有効であり、貧血の様々なモデルで有益な影響を有する。赤血球生成は、エリスロポエチン、G−CSFおよび鉄のホメオスタシスを含む種々の因子によって調節される複雑なプロセスであることに注意すべきである。用語「赤血球レベルを増加させる」および「赤血球の形成を促進する」とは、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値のような臨床的に観察可能な測定基準(metrics)を指し、そのような変化が生じる機構に関しては中立であることが意図される。
したがって、本開示のデータは、赤血球レベルに関して、ActRIIポリペプチドの観察された生物学的活性が、アクチビンA阻害に依存性でないことを示す。しかし、アクチビンA結合性を保持する未改変のActRIIBポリペプチドが、in vivoで赤血球を増加させる能力をなお実証する点に留意するべきである。さらに、一部の適用では、アクチビンAへの結合親和性が低下したGDFトラップと比較して、アクチビンA阻害を保持するActRIIBまたはActRIIAポリペプチドがより望ましいかもしれなく、その場合、赤血球レベルのより穏やかな増加が望ましく、および/または標的外活性の一部のレベルが許容される(または、望ましくさえある)。
したがって、本開示の方法は、必要に応じて、環状鉄芽球ならびに/または骨髄細胞のSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2遺伝子の1つもしくは複数の変異を有する患者のサブグループにおいて、それを必要とする対象において赤血球の形成を増加させるための、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するための、骨髄異形成症候群を処置するための、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血を処置するための、および鉄芽球性貧血または骨髄異形成症候群の1つまたは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、鉄過負荷、好中球減少症、脾腫、急性骨髄性白血病への進行)を処置または予防するための、必要に応じて1つまたは複数の支持療法と組み合わせた、本明細書に記載される1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子の使用を一般に対象とする。ActRIIアンタゴニストに応答する可能性が特にあると特定される患者の別のサブグループは、EPO療法または他のEPO受容体活性化因子療法による前の処置が失敗した患者である。
本明細書に明白に示されるように、記載されるActRIIアンタゴニスト作用因子は、EPO受容体活性化因子と組み合わせて、またはEPO受容体活性化因子による処置が失敗した患者において使用することができる。EPOとは、赤血球系前駆細胞のエリスロサイトへの増殖および成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。EPOは、胎児期には肝臓により生成され、成人期には腎臓により生成される。成人期において、腎不全の帰結として一般的に生じるEPOの生成の減少は、貧血をもたらす。EPOは、遺伝子操作法により、EPO遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞からの、タンパク質の発現および分泌に基づき生成されている。このような組換えEPOの投与は、貧血の処置において有効となっている。例えば、Eschbachら(1987年、N Engl J Med、316巻:73頁)は、慢性腎不全により引き起こされる貧血を是正するためのEPOの使用について記載している。
EPOの効果は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属し、EPO受容体と呼ばれる細胞表面受容体へのその結合、およびこの受容体の活性化により媒介される。ヒトEPO受容体およびマウスEPO受容体は、クローニングされ、発現がなされている[例えば、D’Andreaら(1989年)、Cell、57巻:277頁;Jonesら(1990年)、Blood、76巻:31頁;Winkelmanら(1990年)、Blood、76巻:24頁;および米国特許第5,278,065号を参照されたい]。ヒトEPO受容体遺伝子は、およそ224アミノ酸の細胞外ドメインを含む、483アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、マウスEPO受容体とおよそ82%のアミノ酸配列同一性を呈示する(例えば、米国特許第6,319,499号を参照されたい)。クローニングされて哺乳動物細胞内で発現がなされた全長EPO受容体(66〜72kDa)は、赤血球系前駆細胞上の天然の受容体のアフィニティーと同様のアフィニティー(KD=100〜300nM)でEPOに結合する。したがって、この形態は、主要なEPO結合決定基を含有すると考えられ、EPO受容体と呼ばれる。他の近縁のサイトカイン受容体との類比によれば、EPO受容体は、アゴニストに結合すると二量体化すると考えられる。しかしながら、多量体の複合体であり得るEPO受容体の詳細な構造、およびその活性化の具体的機構は、完全には理解されていない(例えば、米国特許第6,319,499号を参照されたい)。
EPO受容体の活性化は、いくつかの生物学的効果を結果としてもたらす。これらの効果は、未成熟赤芽球の増殖の増大、未成熟赤芽球の分化の増大、および赤血球系前駆細胞におけるアポトーシスの低減を含む[例えば、Liboiら(1993年)、Proc Natl Acad Sci USA、90巻:11351〜11355頁;Kouryら(1990年)、Science、248巻:378〜381頁を参照されたい]。増殖を媒介するEPO受容体のシグナル伝達経路と、分化を媒介するEPO受容体のシグナル伝達経路とは、異なると考えられる[例えば、Noguchiら(1988年)、Mol Cell Biol、8巻:2604頁;Patelら(1992年)、J Biol Chem、267巻:21300頁;およびLiboiら(1993年)、Proc
Natl Acad Sci USA、90巻:11351〜11355頁を参照されたい]。一部の結果は、付属タンパク質が、分化シグナルの媒介に必要とされ得ることを示唆する[例えば、Chibaら(1993年)、Nature、362巻:646頁;およびChibaら(1993年)、Proc Natl Acad Sci USA、90巻:11593頁を参照されたい]。しかし、恒常的な活性化形態の受容体は、増殖および分化のいずれも刺激し得るので、分化における付属タンパク質の役割については、議論が一致していない[例えば、Pharrら(1993年)、Proc Natl Acad Sci USA、90巻:938頁を参照されたい]。
Natl Acad Sci USA、90巻:11351〜11355頁を参照されたい]。一部の結果は、付属タンパク質が、分化シグナルの媒介に必要とされ得ることを示唆する[例えば、Chibaら(1993年)、Nature、362巻:646頁;およびChibaら(1993年)、Proc Natl Acad Sci USA、90巻:11593頁を参照されたい]。しかし、恒常的な活性化形態の受容体は、増殖および分化のいずれも刺激し得るので、分化における付属タンパク質の役割については、議論が一致していない[例えば、Pharrら(1993年)、Proc Natl Acad Sci USA、90巻:938頁を参照されたい]。
EPO受容体活性化因子として、低分子赤血球生成刺激作用因子(ESA)のほか、EPOベースの化合物が挙げられる。前者の例は、ポリエチレングリコールに共有結合的に連結された二量体のペプチドベースのアゴニスト(商標名:Hematide(商標)およびOmontys(登録商標))であり、これは、健康なボランティアならびに慢性腎疾患および内因性の抗EPO抗体の両方を有する患者において赤血球生成刺激特性を示している[例えば、Steadら(2006年)、Blood、108巻:1830〜1834頁;およびMacdougallら(2009年)、N Engl J Med、361巻:1848〜1855頁を参照されたい]。他の例として、非ペプチドベースのESAが挙げられる[例えば、Qureshiら(1999年)、Proc Natl Acad Sci USA、96巻:12156〜12161頁を参照されたい]。
EPO受容体活性化因子はまた、EPO受容体自体には接触せずに、内因性EPOの生成を増強することにより赤血球生成を間接的に刺激する化合物も含む。例えば、低酸素誘導転写因子(HIF)は、正常酸素状態下では、細胞の調節機構により抑制されている(不安定化させられている)、EPO遺伝子発現の内因性刺激因子である。したがって、HIFプロピルヒドロキシラーゼ酵素の阻害剤が、インビボにおけるEPO誘導活性について調査されている。EPO受容体の他の間接的な活性化因子として、EPO遺伝子の発現を局所的に阻害する、GATA−2転写因子の阻害剤[例えば、Nakanoら(2004年)、Blood、104巻:4300〜4307頁を参照されたい]、およびEPO受容体シグナル伝達の負の調節因子として機能する、造血細胞ホスファターゼ(HCPまたはSHP−1)の阻害剤[例えば、Klingmullerら(1995年)、Cell、80巻:729〜738頁を参照されたい]が挙げられる。
本明細書に記載されるように、環状鉄芽球を示す患者がActRIIアンタゴニストによる処置に特に適し得る。鉄芽球性貧血は、先天性(遺伝性)および後天性の形態に大まかに分類することができ、これらは表1に示すようにさらに細分化することができる。
MDSは、成人の後天性骨髄不全症候群の最も一般的なクラスを表す。MDSは生物学的見地からますますよく理解されているが、向上した病理学的識見はこれらの障害を患っているほとんどの患者のための高度に有効または治療的な療法にまだ転換されていない。MDSでの細胞分化不全の増加は、WHOによって血液または髄に少なくとも20%の骨髄芽球を有するか、または芽球の割合に関係なくいくつかのAMLを規定する核型異常の1つの存在によって現在規定されている、二次性の急性骨髄性白血病(AML)への進展と関連する[例えば、Vardimanら(2009年)Blood 114巻:937〜951頁を
参照]。AMLは、最終的にMDS患者の30%で診断される。MDSの根底にある生物学的不均一性は、臨床転帰の大きな変動を生ずるなるので、MDSの自然経過を予測し、患者に助言するために、予後分類スキームが開発された[Zeidanら(2013年)Curr Hematol Malig Rep 8巻:351〜360頁]。国際予後スコアリングシステム(I
PSS)は、低(5.7年の生存中央値)から中間1(3.5年の生存中央値)、中間2(1.2年の生存中央値)、高(0.4年の生存中央値)までのリスクプロファイルに従って患者を類別するそのような分類の例である。患者層化のために、IPSS−Rと呼ばれる代替システムを使用することもできる。患者の観点からは、予後診断は疾患の重症度を規定するのを助け、それがどのように彼らに影響を及ぼす可能性があるのかについての予想を設定する。医師の立場からは、予後診断は、療法を導くのを助けるために使用することができる方法で疾患を病期診断する手段を提供する。注目すべきことに、そのようなスキームは患者の共存症を一般的に考慮せず、特異的療法に関する臨床的恩恵を予測することを意図しない。
参照]。AMLは、最終的にMDS患者の30%で診断される。MDSの根底にある生物学的不均一性は、臨床転帰の大きな変動を生ずるなるので、MDSの自然経過を予測し、患者に助言するために、予後分類スキームが開発された[Zeidanら(2013年)Curr Hematol Malig Rep 8巻:351〜360頁]。国際予後スコアリングシステム(I
PSS)は、低(5.7年の生存中央値)から中間1(3.5年の生存中央値)、中間2(1.2年の生存中央値)、高(0.4年の生存中央値)までのリスクプロファイルに従って患者を類別するそのような分類の例である。患者層化のために、IPSS−Rと呼ばれる代替システムを使用することもできる。患者の観点からは、予後診断は疾患の重症度を規定するのを助け、それがどのように彼らに影響を及ぼす可能性があるのかについての予想を設定する。医師の立場からは、予後診断は、療法を導くのを助けるために使用することができる方法で疾患を病期診断する手段を提供する。注目すべきことに、そのようなスキームは患者の共存症を一般的に考慮せず、特異的療法に関する臨床的恩恵を予測することを意図しない。
MDSを有する患者の適当な処置および管理を促進するために、追加のMDS分類システムが提案された。これらの複雑な症候群の理解の進歩を組み込むために、数十年の間、分類が進化した。MDSのための仏−米−英(FAB)分類スキームが1982年に提案され[Bennettら(1982年)Br J Haematol 51巻:189〜199頁]、2001年にWHOによって確立された改変分類システムのための基礎の役目を果たした。下の表2に要約されるように、WHO分類(2008年に改訂)の現行版は、(1)骨髄および末梢血における骨髄芽球の百分率、(2)異形成のタイプおよび程度、(3)環状鉄芽球の存在、ならびに(4)細胞遺伝学的異常の存在に基づく。したがって、環状鉄芽球はRARSの特徴であるが、MDSの他のサブタイプに存在することもできる[例えば、Junejaら(1983年)J Clin Pathol 36巻:566〜569頁;Malcovatiら(2013年)Best Pract Res Clin Haematol 26巻:377〜385頁を参照]。MDSサブタイプによって、貧血は、例えば、環状鉄芽球の存在下または非存在下で、単独で、または好中球の異常に低い数(好中球減少症)、血小板の低い数(血小板減少症)または血小板の上昇したレベル(血小板増加症)と一緒に起こり得る。著しい血小板増加症に関連した環状鉄芽球による難治性貧血(RARS−T)は、分類不能MDS新生物(MDS−U)の群の中にWHO分類(表2)の暫定エントリーとして現在含まれている。RARS−Tは、形成異常無効赤血球生成および環状鉄芽球が赤血球前駆体の≧15%、末梢血に芽球なしおよび骨髄に<5%を有する貧血、ならびに血小板数≧450×109/Lを有する血小板増加症として規定される[Malcovatiら(2013年)Best Pract Res
Clin Haematol 26巻:377〜385頁]。損なわれた免疫系のために、好中球減少症を有する患者は、感染、さらに敗血症の重大なリスクにある可能性があり、したがって、この状態を処置することが重要である。血小板減少症を有する患者は内部出血が高リスクであり、重症度によっては、この状態を処置することも有益であり得る。
Clin Haematol 26巻:377〜385頁]。損なわれた免疫系のために、好中球減少症を有する患者は、感染、さらに敗血症の重大なリスクにある可能性があり、したがって、この状態を処置することが重要である。血小板減少症を有する患者は内部出血が高リスクであり、重症度によっては、この状態を処置することも有益であり得る。
本開示の一実施形態では、ActRIIアンタゴニストは、MDS患者または鉄芽球性貧血を有する患者を含む、例えば、環状鉄芽球を有する不応性貧血(RARS)、著しい血小板増加症に関連したRARS(RARS−T)、または多系統異形成を有する不応性血球減少症(RCMD、環状鉄芽球が顕著である患者においてRCMD−RSとしても公知である)において、赤血球前駆体の1%超、2%超、3%超、4%超、5%超、6%超、7%超、8%超、9%超、10%超、11%超、12%超、13%超、14%超、15%超、16%超、17%超、18%超、19%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、45%超、50%超、55%超、60%超、65%超、70%超、75%超、80%超、85%超、90%超または95%超が環状鉄芽球である患者において貧血を処置するのに有益である。
貧血は、MDSで頻繁に起こる。MDS患者の概ね80%は貧血を訴え、彼らのかなりの割合はその疾患の過程で血液輸血に依存するようになる[Steensmaら(2006年)Mayo Clin Proc 81巻:104〜130頁]。一部のMDSサブタイプは、組織低酸素に応答した初期赤血球前駆細胞のEPOによって刺激された過剰増殖にもかかわらず後期赤血球前駆体細胞の分化(成熟)の障害がある「無効赤血球生成」によって特徴付けられる。したがって、無効赤血球生成の鍵となる徴候は、内因性EPOの上昇レベルにもかかわらず持続的な貧血である。無効赤血球生成はMDSのRARSサブタイプで頻繁に起こるが、赤血球髄の相対的な増殖低下によって特徴付けられるRAEBサブタイプではそうでない[Cazzolaら(1982年)Br J Haematol 50巻:55〜62頁]。鉄ホメオスタシスの重大な調節因子ヘプシジンの循環レベルは、RAEBよりRARSで約1桁低い[Santiniら(2011年)PLoS One 6巻:e23109頁]。低いレベルのヘプシジンは鉄吸収を促進するので、RARSおよび地中海貧血症などの障害で測定される不適切に低いレベルのヘプシジンは、血液輸血の非存在下においてもこれらの障害で観察される鉄過負荷を説明すると考えられる。
長期赤血球輸血は貧血を緩和するが、感染性疾患、アレルギー性または溶血性反応および鉄過負荷の増悪を含む複数のリスクに患者を曝露させる[Rawn(2008年)Curr Opin Anaesthesiol 21巻:664〜668頁;Ozcanら(2013年)Expert Rev Hematol 6巻:165〜189頁]。全身鉄レベルが増加するに従って、鉄貯蔵のために
身体はフェリチン生成を増加させ、また、細胞への鉄侵入を低減するためにトランスフェリン受容体生成を低減する。循環するトランスフェリンの鉄結合性能力を超えると、鉄は非トランスフェリン結合鉄(NTBI)として血漿中に見出される。MDSでは、非トランスフェリン結合鉄のレベルは、高リスクサブタイプより低リスクサブタイプで高く、RARSで最も高い[Santiniら(2011年)PLoS One 6巻:e23109頁]。身体から鉄を能動的に分泌させることができないので、それは最初に細網内皮系マクロファージに蓄積し、その後、主に心臓、肝臓および内分泌腺の実質細胞に沈着する[Siahら(2006年)Clin Biochem Rev 27巻:5〜16頁]。鉄過負荷の条件下で、非トランスフェリン結合鉄は不安定血漿鉄として公知のその酸化還元活性型に変化し、それは細胞に輸送され、そこでそれは反応性酸素種の形成を促進する。これらの高毒性の分子は、造血に悪影響を与え、特に心臓、肝臓および内分泌組織に害を及ぼす。
身体はフェリチン生成を増加させ、また、細胞への鉄侵入を低減するためにトランスフェリン受容体生成を低減する。循環するトランスフェリンの鉄結合性能力を超えると、鉄は非トランスフェリン結合鉄(NTBI)として血漿中に見出される。MDSでは、非トランスフェリン結合鉄のレベルは、高リスクサブタイプより低リスクサブタイプで高く、RARSで最も高い[Santiniら(2011年)PLoS One 6巻:e23109頁]。身体から鉄を能動的に分泌させることができないので、それは最初に細網内皮系マクロファージに蓄積し、その後、主に心臓、肝臓および内分泌腺の実質細胞に沈着する[Siahら(2006年)Clin Biochem Rev 27巻:5〜16頁]。鉄過負荷の条件下で、非トランスフェリン結合鉄は不安定血漿鉄として公知のその酸化還元活性型に変化し、それは細胞に輸送され、そこでそれは反応性酸素種の形成を促進する。これらの高毒性の分子は、造血に悪影響を与え、特に心臓、肝臓および内分泌組織に害を及ぼす。
MDS患者集団は、心不全、感染症、出血および肝硬変への傾向を含む共存症を有する高齢者から主になり、鉄過負荷はそのような既存の状態を急速に悪化させることがある。AMLを発症する高リスクのMDS患者と比較して、低リスクまたは中間1リスクの患者は、彼らのより長い平均余命のために鉄過負荷をより起こしやすい可能性がある。これらの理由から、長い平均余命を有し、20回を超えるRBC輸血を受けると予想される低または中間1リスクのMDSサブタイプを有する患者においては、鉄負荷を低減する鉄キレート療法が望ましいと考えられる[Temrazら(2014年)Crit Rev Oncol Hematol
91巻:64〜73頁]。
91巻:64〜73頁]。
ここ数年で、新規配列決定技術は、MDSで繰り返し変異する数十の遺伝子の同定につながった。タイプによって分類されるそのような遺伝子の2013年のリストを、表3に示す。1つまたは複数のそのような変異は、MDSを有するほとんど全ての患者で見出すことができ、関与遺伝子の性質を知ることは、MDSがどのように発症し、進展するかということに関する理解を向上させたが、まだ処置に影響を及ぼしていない。MDS患者試料に適用された全ゲノム配列決定は、mRNAスプライシング(スプライセオソーム)因子をコードするがん関連遺伝子の全く新規のクラスを同定した。MDSで同定された第1のそのような遺伝子はSF3B1であり、これはRARSを有する患者で特に頻繁に変異している[Papaemmanuilら(2011年)N Engl J Med 365巻:1384〜13
95頁]。変異した遺伝子の他の主要なカテゴリーは、後成的(DNAメチル化)調節因子、転写因子およびシグナル伝達分子である[Cazzolaら(2013年)Blood 122巻:4021〜4034頁;Bejarら(2014年)Blood 124巻:2793〜2803頁]。これらの変異がMDS患者で同時に見られる程度は、遺伝子タイプによって異なるようである。例えば、MDS患者の概ね50%は、変異体スプライシング因子をコードする、今日までに同定された10遺伝子のうちの1つを所有するが、これらの変異体遺伝子は同じ患者に同時に見られることは稀である[Bejarら(2014年)Blood 124巻:2793〜2803頁]。したがって、これらの変異体遺伝子は、同じ個体について冗長となることが稀なマーカーである。変異体後成的調節因子をコードする遺伝子は、同じ患者で互いに、および変異体スプライシング因子遺伝子とより頻繁に同時に見られる。本明細書に開示されるように、表3に掲載されるものなどの変異体遺伝子の差別的出現は、MDSまたは鉄芽球性貧血を有するどの患者がActRIIアンタゴニストに対して治療的に応答性または非応答性である可能性があるかを予測することを助けることができる遺伝子シグネチャーを提供する。
95頁]。変異した遺伝子の他の主要なカテゴリーは、後成的(DNAメチル化)調節因子、転写因子およびシグナル伝達分子である[Cazzolaら(2013年)Blood 122巻:4021〜4034頁;Bejarら(2014年)Blood 124巻:2793〜2803頁]。これらの変異がMDS患者で同時に見られる程度は、遺伝子タイプによって異なるようである。例えば、MDS患者の概ね50%は、変異体スプライシング因子をコードする、今日までに同定された10遺伝子のうちの1つを所有するが、これらの変異体遺伝子は同じ患者に同時に見られることは稀である[Bejarら(2014年)Blood 124巻:2793〜2803頁]。したがって、これらの変異体遺伝子は、同じ個体について冗長となることが稀なマーカーである。変異体後成的調節因子をコードする遺伝子は、同じ患者で互いに、および変異体スプライシング因子遺伝子とより頻繁に同時に見られる。本明細書に開示されるように、表3に掲載されるものなどの変異体遺伝子の差別的出現は、MDSまたは鉄芽球性貧血を有するどの患者がActRIIアンタゴニストに対して治療的に応答性または非応答性である可能性があるかを予測することを助けることができる遺伝子シグネチャーを提供する。
表3に掲載される遺伝子の中で、MDS、特にRARS、RARS−TおよびRCMD−RSサブタイプでは、スプライシング因子3B1をコードする遺伝子(SF3B1)が決定的であると最近示唆された[Malcovatiら(2011年)Blood 118巻:6239〜6246頁;Dolatshadら(2014年)Leukemia doi: 10.1038/leu.2014.331印刷
前電子出版]。SF3B1での体細胞性変異は、例えば慢性的リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)を含む血液がん、ならびに乳がん、すい臓がん、胃がん、前立腺がんおよびブドウ膜メラノーマでも見られる[Malcovatiら(2011年)Blood 118巻:6239〜6246頁;Wangら(2011年)N Engl J Med 36
5巻:2497〜2506頁;The Cancer Genome Atlas Network(2012年)Nature 490巻:61〜70頁;Biankinら(2012年)Nature 491巻:399〜405頁;Chesnaisら(2012年)Oncotarget 3巻:1284〜1293頁;Furneyら(2013年)Cancer Discov 3巻:1122〜1129頁;Jeら(2013年)Int
J Cancer 133:260〜266頁]。多くはタンパク質の数箇所でクラスター化
した一連のSF3B1変異が、臨床試料または高濃度のプラジエノリドに曝露させた細胞株で同定された[Webbら(2013年)Drug Discov Today 18巻:43〜49頁]
。MDSで同定されたSF3B1変異には、例えば、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781GおよびA1188Vが含まれる。がんで同定されたSF3B1変異には、例えば、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041HおよびI1241Tが含まれる。最後に、MDSおよびがんの両方で見出されたSF3B1変異には、例えば、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700EおよびV701Fが含まれる。
前電子出版]。SF3B1での体細胞性変異は、例えば慢性的リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)を含む血液がん、ならびに乳がん、すい臓がん、胃がん、前立腺がんおよびブドウ膜メラノーマでも見られる[Malcovatiら(2011年)Blood 118巻:6239〜6246頁;Wangら(2011年)N Engl J Med 36
5巻:2497〜2506頁;The Cancer Genome Atlas Network(2012年)Nature 490巻:61〜70頁;Biankinら(2012年)Nature 491巻:399〜405頁;Chesnaisら(2012年)Oncotarget 3巻:1284〜1293頁;Furneyら(2013年)Cancer Discov 3巻:1122〜1129頁;Jeら(2013年)Int
J Cancer 133:260〜266頁]。多くはタンパク質の数箇所でクラスター化
した一連のSF3B1変異が、臨床試料または高濃度のプラジエノリドに曝露させた細胞株で同定された[Webbら(2013年)Drug Discov Today 18巻:43〜49頁]
。MDSで同定されたSF3B1変異には、例えば、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781GおよびA1188Vが含まれる。がんで同定されたSF3B1変異には、例えば、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041HおよびI1241Tが含まれる。最後に、MDSおよびがんの両方で見出されたSF3B1変異には、例えば、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700EおよびV701Fが含まれる。
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それらが使用される特定の文脈から明らかである。
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する2つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質(およびこれをコードする核酸)は、%同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
参照ポリペプチド(またはヌクレオチド)配列に照らした「配列同一性パーセント(%)」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基(または核酸)の百分率であって、参照ポリペプチド(ヌクレオチド)配列内のアミノ酸残基(または核酸)と同一であるアミノ酸残基(または核酸)の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、BLASTソフトウェア、BLAST−2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸(核酸)配列同一性%値は、配列比較コンピュータプログラムである、ALIGN−2を使用して生成する。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Washington D.C.、20559に提出され、ここで、米国著作権登録第TXU510087号として登録されている。ALIGN−2プログラムは、Genentech,Inc.、South San Francisco、Calif.から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX(登録商標) V4.0Dを含む、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムにより設定され、変化しない。
全てのその文法形で、「アゴナイズする」とは、タンパク質および/または遺伝子を(例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性のタンパク質を活性状態に入るように誘導することによって)活性化する過程、あるいはタンパク質および/または遺伝子の活性を増加させる過程を指す。
全てのその文法形で、「拮抗する」とは、タンパク質および/または遺伝子を(例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは低減することによって、または活性タンパク質を不活性状態に入るように誘導することによって)阻害する過程、あるいはタンパク質および/または遺伝子の活性を低減する過程を指す。
本明細書で使用される場合、特記しない限り、「実質的にXに結合しない」は、作用因子が「X」に対して約10−7を超える、約10−6を超える、約10−5を超える、約10−4を超えるもしくはこれを超えるKDを有する(例えば、KDを判定するために使用されるアッセイにより検出可能な結合がない)こと、または「X」に対して比較的軽度の結合性、例えば約1×10−8Mもしくは約1×10−9Mを有することを意味するものである。
本明細書および特許請求の範囲全体で数値に関して使用される用語「約」および「概ね」は、当業者にとってはなじみのものでかつ許容される、精度の区間を表す。一般に、精度のそのような区間は、±10%である。あるいは、特に生物系では、用語「約」および「概ね」は、所与の値の1桁の範囲内、好ましくは≦5倍、より好ましくは≦2倍の値を意味することができる。
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を規定する数を含む。
その用語が使用される文脈が明らかに別途指図しない限り、用語「a」および「an」は複数形を含む。用語「a」(または、「an」)、ならびに用語「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」は、本明細書で互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合「および/または」は、他と一緒のまたは一緒でない、2つまたはこれを超える特定された特徴または成分の各々の特異的開示ととるべきである。したがって、本明細書の「Aおよび/またはB」などのフレーズで使用される用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)および「B」(単独)を含むものである。同様に、「A、Bおよび/またはC」などのフレーズで使用される用語「および/または」は、以下の態様:A、BおよびC;A、BまたはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);ならびにC(単独)の各々を包含するものである。
本明細書全体で、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「
含んでいる(comprising)」などの変化形は、明示される整数または整数の群が含まれることを暗示するが、他のいかなる整数または整数の群も除外されることを暗示しないものと理解される。
2.ActRIIアンタゴニスト
含んでいる(comprising)」などの変化形は、明示される整数または整数の群が含まれることを暗示するが、他のいかなる整数または整数の群も除外されることを暗示しないものと理解される。
2.ActRIIアンタゴニスト
本明細書に提示されるデータは、in vivoで赤血球レベルを増加させ、患者に他の恩恵を提供するために、ActRIIのアンタゴニスト(阻害剤)(例えば、ActRIIAおよび/またはActRIIB SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達のアンタゴニスト)を使用することができることを実証する。特に、本明細書において、そのようなActRIIアンタゴニストは、様々な貧血ならびにMDSおよび鉄芽球性貧血の様々な合併症(例えば、障害/状態)の処置で有効であることが示される。したがって、本開示は、部分的に、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用することができる、様々なActRIIアンタゴニスト作用因子を提供する。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用する好ましいActRIIアンタゴニストは、GDF−ActRIIアンタゴニスト(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、GDFに媒介される、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達、特に、GDF11および/またはGDF8に媒介されるActRIIシグナル伝達のアンタゴニスト)である。一部の実施形態では、本開示の好ましいActRIIアンタゴニストは、ActRIIA−Fc融合タンパク質、ActRIIB−Fc融合タンパク質、およびGDFトラップ−Fc融合タンパク質など、可溶性ActRIIポリペプチド(例えば、可溶性ActRIIAポリペプチドおよび可溶性ActRIIBポリペプチド)およびGDFトラップポリペプチドである。
本開示の可溶性ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチドは、GDF(例えば、GDF11および/またはGDF8)の拮抗以外の機構を介して、赤血球レベルならびに/またはMDSおよび鉄芽球性貧血の種々の合併症に影響を及ぼし得る[例えば、GDF11および/またはGDF8の阻害は、ある作用因子が、あるスペクトルの追加の作用因子であって、おそらく、TGFベータスーパーファミリーの他のメンバー(例えば、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodal)を含む作用因子の活性を阻害する傾向の指標であることが可能であり、このような集合的阻害は、例えば、造血に対する所望の効果をもたらし得る]が、例えば、抗GDF11抗体;抗GDF8抗体;抗アクチビンA、B、Cおよび/またはE抗体;抗ActRIIA抗体;抗ActRIIB抗体;抗ActRIIA/RIIB抗体、GDF11、GDF8、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の生成を阻害する、アンチセンス、RNAi、またはリボザイム核酸;ならびにGDF11、GDF8、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の他の阻害剤(例えば、低分子阻害剤)、特に、GDF11−ActRIIA間の結合および/もしくはGDF8−ActRIIA間の結合、ならびに/またはGDF11−ActRIIB間の結合および/もしくはGDF8−ActRIIB間の結合を破壊する作用因子のほか、GDF11、GDF8、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の発現を阻害する作用因子を含む、他の種類のGDF−ActRIIアンタゴニストも有用であることが予測される。必要に応じて、本開示のGDF−ActRIIアンタゴニストは、例えば、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodalを含む、他のActRIIリガンドに結合することが可能であり、かつ/またはこれらの活性(または発現)を阻害し得る。必要に応じて、本開示のGDF−ActRIIアンタゴニストは、例えば、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodalを含む、1つまたは複数の追加のActRIIリガンドに結合し、かつ/またはこれらの活性(または発現)を阻害する、少なくとも1つの追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるActRIIアンタゴニストは、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはこれ(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。
A.ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップ
A.ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップ
ある特定の態様では、本開示は、ActRIIポリペプチドに関する。特に、本開示は、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、ならびに/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ActRIIポリペプチドを単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ActRII」は、II型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体IIA型およびアクチビン受容体IIB型の両方を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ActRIIB」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体IIB型(ActRIIB)タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなActRIIBタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるActRIIBに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の1つに対する言及であるものと理解される。ActRIIBファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン/スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
用語「ActRIIBポリペプチド」は、ActRIIBファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体(変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む)を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ActRIIAポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第WO2006/012627号においても提供されている。必要に応じて、本開示のActRIIBポリペプチドを使用して、対象において赤血球レベルを高めることができる。本明細書で記載される、全てのActRIIB関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトActRIIB前駆体のタンパク質配列(配列番号1)の番号付けに基づく。
ヒトActRIIB前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
ヒトActRIIB前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性N−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIBポリペプチド配列は、以下の通りである。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIBポリペプチド配列は、以下の通りである。
一部の実施形態では、このタンパク質はN末端の「SGR・・・」配列で生成することができる。細胞外ドメインのC末端の「テール」は、一重下線によって示される。「テール」欠失配列(Δ15配列)は、以下の通りである:
配列番号1の64位においてアラニン(A64)を有するActRIIBの形態についてはまた、文献においても報告されている。例えば、Hildenら(1994年)、Blood、83巻(8号):2163〜2170頁を参照されたい。本出願人らは、A64置換を有するActRIIBの細胞外ドメインを含むActRIIB−Fc融合タンパク質は、アクチビンおよびGDF11に対するアフィニティーが比較的低いことを確認した。これに対し、64位においてアルギニン(R64)を有する、同じActRIIB−Fc融合タンパク質は、アクチビンおよびGDF11に対するアフィニティーが、低nM〜高pMの範囲である。したがって、R64を有する配列を、本開示におけるヒトActRIIBのための「野生型」参照配列として使用する。
64位においてアラニンを有するActRIIBの形態は、以下の通りである。
64位においてアラニンを有するActRIIBの形態は、以下の通りである。
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替的なA64形態の、プロセシング後の可溶性(細胞外)ActRIIBポリペプチド配列は、以下の通りである。
代替的なA64形態の、プロセシング後の可溶性(細胞外)ActRIIBポリペプチド配列は、以下の通りである。
一部の実施形態では、このタンパク質はN末端の「SGR・・・」配列で生成することができる。細胞外ドメインのC末端の「テール」は、一重下線によって示される。「テール」欠失配列(Δ15配列)は、以下の通りである:
ヒトActRIIB前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ActRIIB前駆体のアミノ酸1〜513をコードする、Genbank参照配列NM_001106.3のヌクレオチド25〜1560からなる核酸配列を、下記(配列番号7)に示す。示される配列は、64位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIBポリペプチドをコードする核酸配列は、以下(配列番号8)の通りである。示される配列は、64位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ActRIIAポリペプチドに関する。本明細書で使用する場合、用語「ActRIIA」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体IIA型(ActRIIA)タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなActRIIAタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるActRIIAへの言及は、現在同定されている形態のいずれか1つに対する言及であると理解される。ActRIIAファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン/スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
用語「ActRIIAポリペプチド」は、ActRIIAファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体(変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む)を含むポリペプチドを含む。このような改変体ActRIIAポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第WO2006/012627号においても提供されている。必要に応じて、本開示のActRIIAポリペプチドを使用して、対象において赤血球レベルを高めることができる。本明細書で記載される、全てのActRIIA関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトActRIIA前駆体のタンパク質配列(配列番号9)の番号付けに基づく。
ヒトActRIIA前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
ヒトActRIIA前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性N−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIAポリペプチド配列は、以下の通りである。
細胞外ドメインのC末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列(Δ15配列)は、以下の通りである。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIAポリペプチド配列は、以下の通りである。
ヒトActRIIA前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、Genbank参照配列NM_001616.4のヌクレオチド159〜1700の核酸配列を、下記(配列番号12)に示す。シグナル配列に下線を付す。
プロセシング後のヒト可溶性(細胞外)ActRIIAポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。
ヒトActRIIB可溶性細胞外ドメインおよびヒトActRIIA可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図1に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ActRIIリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。図2は、種々の脊椎動物ActRIIBタンパク質およびヒトActRIIAの多重配列アラインメントを描示する。これらのアラインメントからは、リガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、通常のActRII−リガンドの結合活性に重要なアミノ酸位置を予測することが可能であるほか、通常のActRII−リガンドの結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。
他の態様では、本開示は、GDFトラップポリペプチド(「GDFトラップ」とも呼ばれる)に関し、これは、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはそれを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、例えば、単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用することができる。
一部の実施形態では、本開示のGDFトラップは、可溶性の改変体ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)であって、改変体ActRIIポリペプチドが、1つまたは複数のリガンド結合活性を、対応する野生型ActRIIポリペプチドに照らして変更させているように、ActRIIポリペプチド(例えば、「野生型」ActRIIポリペプチド)の細胞外ドメイン(リガンド結合性ドメインともまた呼ばれる)内に、1つまたは複数の変異(例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換、およびこれらの組み合わせ)を含む改変体ActRIIポリペプチドである。好ましい実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、少なくとも1つの、対応する野生型ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)と同様な活性を保持する。例えば、GDFトラップは、1つまたは複数のActRIIリガンドに結合することが可能であり、かつ/またはこれらの機能を阻害(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達経路など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、ActRIIリガンドに媒介される活性化を阻害)し得る(例えば、これらの機能に拮抗し得る)。一部の実施形態では、本開示のGDFトラップは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6および/またはBMP7の1つまたは複数に結合し、かつ/またはこれらを阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、1つまたは複数の特異的ActRIIリガンド(例えば、GDF8、GDF11、BMP6、Nodal、および/またはBMP7)に対する結合アフィニティーを増大させている。他の実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、1つまたは複数の特異的ActRIIリガンド(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、および/またはアクチビンE)に対する結合アフィニティーを減少させている。さらに他の実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、1つまたは複数の特異的ActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを増大させ、1つまたは複数の異なる/他のActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを減少させている。したがって、本開示は、1つまたは複数のActRIIリガンドに対する結合特異性を変更させたGDFトラップポリペプチドを提供する。
ある特定の好ましい実施形態では、本開示のGDFトラップは、GDF11および/またはGDF8(ミオスタチンとしてもまた公知である)に、例えば、野生型ActRIIポリペプチドと比較して、優先的に結合し、拮抗するようにデザインする。必要に応じて、このようなGDF11および/またはGDF8結合性トラップは、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6および/またはBMP7の1つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ/または拮抗し得る。必要に応じて、このようなGDF11および/またはGDF8結合性トラップは、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6および/またはBMP7の1つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ/または拮抗し得る。必要に応じて、このようなGDF11および/またはGDF8結合性トラップは、アクチビンA、アクチビンA/B、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6および/またはBMP7の1つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ/または拮抗し得る。ある特定の実施形態では、本開示のGDFトラップは、アクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンA/B、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE)に対する結合アフィニティーを、例えば、野生型ActRIIポリペプチドと比較して減殺している。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、アクチビンAに対する結合アフィニティーを減殺している。
例えば、本開示は、GDF8/GDF11に、アクチビンAと比べて優先的に結合し、かつ/または拮抗するGDFトラップポリペプチドを提供する。本開示の実施例で実証される通り、このようなGDFトラップポリペプチドは、アクチビンAに対する高い結合アフィニティーを保持するActRIIポリペプチドと比較して、インビボにおける赤血球生成の、より強力な活性化因子である。さらに、これらの非アクチビンA結合性GDFトラップポリペプチドは、他の組織に対する影響の減少を実証する。したがって、このようなGDFトラップは、アクチビンAへの結合/拮抗と関連する、潜在的なオフターゲット作用を低減しながら、対象において赤血球レベルを高めるために有用であり得る。しかし、治療効果のために、より適度の赤血球レベルの上昇が必要とされる可能性があり、ある程度のレベルのオフターゲット作用も許容可能である(またはさらに望ましい)、一部の適用では、このような選択性のGDFトラップポリペプチドは、それほど望ましくない可能性がある。
ActRIIBタンパク質のアミノ酸残基(例えば、E39、K55、Y60、K74、W78、L79、D80、およびF101)は、ActRIIBリガンド結合性ポケット内にあり、例えば、アクチビンA、GDF11、およびGDF8を含むそのリガンドへの結合を媒介する一助となる。したがって、本開示は、ActRIIB受容体の、変更させたリガンド結合性ドメイン(例えば、GDF8/GDF11結合性ドメイン)であって、これらのアミノ酸残基において、1つまたは複数の変異を含むリガンド結合性ドメインを含むGDFトラップポリペプチドを提供する。
必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、GDF11および/またはGDF8などのリガンドに対する選択性を、ActRIIB受容体の野生型リガンド結合性ドメインと比べて増大させている場合がある。例示すると、変更させたリガンド結合性ドメインの、GDF11および/またはGDF8に対する選択性を、1つまたは複数のアクチビン(アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、および/またはアクチビンA)、特に、アクチビンAに対するものを上回って増大させる、1つまたは複数の変異を選択することができる。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、アクチビンへの結合についてのKdの、GDF11および/またはGDF8への結合についてのKdに対する比が、野生型リガンド結合性ドメインについての比と比べて、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、なおまたは1000倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、アクチビンの阻害についてのIC50の、GDF11および/またはGDF8の阻害についてのIC50に対する比が、野生型リガンド結合性ドメインと比べて、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、なおまたは1000倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、GDF11および/またはGDF8を、アクチビンの阻害についてのIC50の、多くとも、2分の1、5分の1、10分の1、20分の1、50分の1、100分の1、なおまたは1000分の1であるIC50で阻害する。
具体例として、ActRIIBのリガンド結合性ドメインの、正に荷電したアミノ酸残基であるAsp(D80)を、異なるアミノ酸残基に変異させて、アクチビンではなく、GDF8に優先的に結合する、GDFトラップポリペプチドを生成することができる。好ましくは、D80残基を、配列番号1に照らして、非荷電アミノ酸残基、負荷電アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基に変化させる。さらなる具体例として、配列番号1の疎水性残基であるL79を変更させて、アクチビン−GDF11/GDF8結合特性の変更を付与することができる。例えば、L79P置換は、GDF11への結合を、アクチビンへの結合より大幅に低減する。これに対し、L79の、酸性アミノ酸による置きかえ[アスパラギン酸またはグルタミン酸;L79D置換またはL79E置換]は、GDF11への結合アフィニティーを保持しながら、アクチビンAへの結合アフィニティーを大幅に低減する。例示的な実施形態では、本明細書で記載される方法は、配列番号1の79位に対応する位置に酸性アミノ酸(例えば、DまたはE)を含む改変体ActRIIBポリペプチドであって、必要に応じて、1つまたは複数の追加のアミノ酸の置換、付加、または欠失と組み合わせた改変体ActRIIBポリペプチドである、GDFトラップポリペプチドを活用する。
当業者により認識される通り、本明細書で記載される変異、改変体、または改変の大半は、核酸レベルで作製することもでき、場合によって、翻訳後修飾または化学合成により作製することもできる。このような技法は、当該分野で周知であり、それらの一部については、本明細書で記載される。
ある特定の実施形態では、本開示は、可溶性ActRIIポリペプチドであるActRIIポリペプチド(ActRIIAおよびActRIIBポリペプチド)に関する。本明細書で記載する場合、用語「可溶性ActRIIポリペプチド」とは一般に、ActRIIタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「可溶性ActRIIポリペプチド」は、ActRIIタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体(変異体、フラグメント、およびペプチド模倣物形態を含む)(例えば、本明細書で記載される、GDFトラップポリペプチド)を含む。可溶性ActRIIポリペプチドの他の例は、ActRIIまたはGDFトラップタンパク質の細胞外ドメインに加えて、シグナル配列を含む。例えば、シグナル配列は、ActRIIAまたはActRIIBタンパク質の天然シグナル配列であってもよく、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)シグナル配列またはミツバチメリチン(HBM)シグナル配列を含む、別のタンパク質に由来するシグナル配列であってもよい。
部分的に、本開示は、本明細書で記載される方法の範囲内にあるActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、およびGDFトラップポリペプチドを生成し、使用するための案内として使用し得る、ActRIIポリペプチドの機能的な活性部分および改変体を同定する。
当該分野では、ActRIIタンパク質が、構造的特徴および機能的特徴に関して、特に、リガンド結合に関して、特徴付けられている[例えば、Attisanoら(1992年)、Cell、68巻(1号):97〜108頁;Greenwaldら(1999年)、Nature Structural Biology、6巻(1号):18〜22頁;Allendorphら(2006年)、PNAS、103巻(20号):7643〜7648頁;Thompsonら(2003年)、The EMBO Journal、22巻(7号):1555〜1566頁;ならびに米国特許第7,709,605号、同第7,612,041号、および同第7,842,663号を参照されたい]。
例えば、Attisanoらは、ActRIIBの細胞外ドメインのC末端におけるプロリンノットの欠失により、受容体のアクチビンに対するアフィニティーが低減されることを示した。本願配列番号1のアミノ酸20〜119を含有するActRIIB−Fc融合タンパク質、「ActRIIB(20〜119)−Fc」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むActRIIB(20〜134)−Fcと比較してGDF−11およびアクチビンへの結合が減少している(例えば、米国特許第7,842,663号を参照のこと)。しかし、ActRIIB(20〜129)−Fcタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して同様だがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸134、133、132、131、130および129(本願配列番号1に照らして)で終止するActRIIB細胞外ドメインは全て活性であると予想されるが、134または133で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基129〜134(配列番号1に照らして)のいずれかにおける変異によってリガンドの結合親和性が大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、P129およびP130(配列番号1に照らして)の変異によってリガンドの結合は実質的に低下しない。したがって、本開示のActRIIBポリペプチドまたはActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、早ければアミノ酸109(最後のシステイン)で終了し得るが、109〜119(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118または119)で終わる形態は、リガンドの結合が減少していると予想される。アミノ酸119(本願配列番号1に照らして)は、不完全に保存されているので、容易に変更または切断される。128以後(本願配列番号1に照らして)で終わるActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップはリガンドの結合活性を保持しているはずである。119〜127(例えば、119、120、121、122、123、124、125、126または127)(配列番号1に照らして)で終わるActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップは、中間の結合能を有する。これらの形態はいずれも、臨床的または実験的な設定に応じて使用することが望ましい場合がある。
ActRIIBのN末端では、アミノ酸29またはその手前(本願配列番号1に照らして)で始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸29は、開始システインを表す。24位(本願配列番号1に照らして)における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、N−連結グリコシル化配列を導入する(例えば、米国特許第7,842,663号を参照されたい)。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸20〜29に対応する領域内の変異は、十分に許容されることが確認される。特に、20、21、22、23、および24位(本願配列番号1に照らして)で始まるActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップは、一般的なリガンド結合活性を保持し、25、26、27、28、および29位(本願配列番号1に照らして)で始まるActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップもまた、リガンド結合活性を保持するはずである。例えば、本明細書ならびに米国特許第7,842,663号において示されているデータは、驚くべきことに、22、23、24、または25で始まるActRIIB構築物は、最大の活性を有することを実証する。
まとめると、ActRIIBの活性部分(例えば、リガンド結合活性)は、配列番号1のアミノ酸29〜109を含む。したがって、本開示のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップは、例えば、ActRIIBの一部であって、配列番号1のアミノ酸20〜29に対応する残基で始まり(例えば、アミノ酸20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29で始まり)、配列番号1のアミノ酸109〜134に対応する位置で終わる(例えば、アミノ酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134で終わる)一部に少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、本開示のActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸29〜109を含まないか、またはこれらからならない。他の例は、配列番号1の20〜29位(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29位)、または21〜29位(例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、または29位)で始まり、119〜134位(例えば、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134位)、119〜133位(例えば、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、または133位)、129〜134位(例えば、129、130、131、132、133、または134位)、または129〜133位(例えば、129、130、131、132、または133位)で終わる、ポリペプチドを含む。他の例は、配列番号1の20〜24位(例えば、20、21、22、23、または24位)、21〜24位(例えば、21、22、23、または24位)、または22〜25位(例えば、22、22、23、または25位)で始まり、109〜134位(例えば、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134位)、119〜134位(例えば、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、または134位)、または129〜134位(例えば、129、130、131、132、133、または134位)で終わる構築物を含む。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号1の対応する部分に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する改変体もまた、企図される。一部の実施形態では、ActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップは、配列番号1のアミノ酸残基25〜131に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸25〜131を含まないか、またはこれらからならない。
本開示は、図1に示されるように、合成ActRIIB構造の分析結果を含み、これは、一部において、リガンド結合ポケットが残基Y31、N33、N35、L38〜T41、E47、E50、Q53〜K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78〜N83、Y85、R87、A92、およびE94〜F101によって規定されることを実証している。これらの位置において、保存的変異は許容されると予想されるが、K74A変異は、R40A、K55A、F82A、およびL79位における変異と同様に良好に許容される。R40はツメガエルにおいてKであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Q53は、ウシのActRIIBではRであり、ツメガエルのActRIIBではKであり、したがって、R、K、Q、NおよびHを含めたアミノ酸がこの位置で許容される。したがって、本開示のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドについての一般式は、配列番号1のアミノ酸29〜109に、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、必要に応じて、20〜24位(例えば、20、21、22、23、または24位)または22〜25位(例えば、22、23、24、または25位)の範囲の位置で始まり、129〜134位(例えば、129、130、131、132、133、または134位)の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内に、1つ、2つ、5つ、10、または15以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の40、53、55、74、79、および/または82位に、0、1つ、または複数の非保存的変更を含むアミノ酸配列である。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端(上述のように)、および42〜46位および65〜73位(配列番号1に照らして)を含む。65位におけるアスパラギンからアラニンへの変更(N65A)は、A64バックグラウンドにおけるリガンドの結合を実際に改善し、したがって、R64バックグラウンドにおいてリガンドの結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される(例えば、米国特許第7,842,663号を参照のこと)。この変化により、A64バックグラウンドにおけるN65のグリコシル化が排除される可能性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実証されている。R64A変化は許容性が乏しいが、R64Kは良好に許容され、したがって、Hなどの別の塩基性残基が64位において許容され得る(例えば、米国特許第7,842,663号を参照のこと)。
ActRIIBは、完全に保存された細胞外ドメインの大きなストレッチ(stretch)を持ち、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良好に保存されている。ActRIIBに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物の生物体からのActRIIB配列を比較することにより、変更され得る残基への洞察がもたらされる。したがって、活性な、本開示の方法に従う有用なヒトActRIIB改変体ポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップは、別の脊椎動物のActRIIBの配列からの対応する位置の1つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基と同様の残基を含み得る。以下の例は、活性なActRIIB改変体を定義するためのこのアプローチを例示している。L46は、ツメガエルのActRIIBではバリンであるので、この位置は変更され得、必要に応じて、V、IまたはFなどの別の疎水性残基、またはAなどの非極性残基に変更され得る。E52は、ツメガエルではKであり、これは、この部位で、E、D、K、R、H、S、T、P、G、YおよびおそらくAなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示している。T93は、ツメガエルではKであり、これは、この位置において幅広い構造的差異が許容されることを示しており、S、K、R、E、D、H、G、P、GおよびYなどの極性残基が好ましい。F108は、ツメガエルではYであり、したがって、Yまたは他の疎水性群、例えばI、VまたはLが許容されるはずである。E111は、ツメガエルではKであり、これは、この位置において、D、R、KおよびH、ならびにQおよびNを含めた、荷電残基が許容されることを示している。R112は、ツメガエルではKであり、これは、この位置において、RおよびHを含めた塩基性残基が許容されることを示している。119位のAは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではPとして、ツメガエルではVとして現れ、したがって、この位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずである。
ActRIIB(R64)−Fc形態と比べて、さらなるN−連結グリコシル化部位(N−X−S/T)の付加は、十分に許容されることが既に実証されている(例えば、米国特許第7,842,663号を参照されたい)。したがって、N−X−S/T配列は、一般に、本開示のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップにおいて図1において定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内因性N−X−S/T配列の導入に特に適した部位としては、アミノ酸20〜29、20〜24、22〜25、109〜134、120〜134または129〜134(配列番号1に照らして)が挙げられる。N−X−S/T配列は、ActRIIB配列とFcドメインまたは他の融合成分との間のリンカーにも導入され得る。このような部位は、以前から存在しているSまたはTに対して正しい位置にNを導入することによって、または、以前から存在しているNに対応する位置にSまたはTを導入することによって、最小の労力で導入され得る。したがって、N−連結グリコシル化部位を生じる望ましい変更は、A24N、R64N、S67N(できるかぎりN65Aの変更と組み合わせる)、E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112SおよびR112T(配列番号1に照らして)である。グリコシル化されることが予測されるSはどれも、グリコシル化によってもたらされる保護のために、免疫原性部位を生じることなくTに変更され得る。同様に、グリコシル化されることが予測されるTはどれも、Sに変更され得る。したがって、S67TおよびS44T(配列番号1に照らして)の変更が企図される。同様に、A24N改変体では、S26Tの変更が使用され得る。したがって、本開示のActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップポリペプチドは、上記の、1つまたは複数の追加の非内因性N−連結グリコシル化コンセンサス配列を有する改変体であり得る。
本明細書に記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わせられ得る。さらに、本明細書中に記載される変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がActRIIBにあることを示す。配列番号1に照らして、これらとしては、64位(塩基性アミノ酸)、80位(酸性または疎水性アミノ酸)、78位(疎水性、そして特にトリプトファン)、37位(酸性、そして特にアスパラギン酸またはグルタミン酸)、56位(塩基性アミノ酸)、60位(疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン)が挙げられる。したがって、本明細書中に開示されるActRIIBポリペプチドおよびActRIIBベースのGDFトラップにおいて、本開示は保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである:52位(酸性アミノ酸)、55位(塩基性アミノ酸)、81位(酸性)、98位(極性または荷電、特にE、D、RまたはK)、全て配列番号1に照らして。
活性(例えば、リガンド結合性)ActRIIAポリペプチドの一般式は、配列番号9のアミノ酸30から開始しアミノ酸110で終了するポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のActRIIAポリペプチドおよびActRIIAベースのGDFトラップは、配列番号9のアミノ酸30〜110と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、本開示のActRIIAベースのGDFトラップは、配列番号9のアミノ酸30〜110を含まないか、またはこれからならない。必要に応じて、本開示のActRIIAポリペプチドおよびActRIIAベースのGDFトラップポリペプチドは、必要に応じて、それぞれ1〜5(例えば、1、2、3、4もしくは5)または3〜5(例えば、3、4もしくは5)の範囲内の位置で始まり、110〜116(例えば、110、111、112、113、114、115もしくは116)または110〜115(例えば、110、111、112、113、114もしくは115)の範囲内の位置で終わり、リガンド結合性ポケットに多くとも1、2、5、10または15個の保存的アミノ酸変化、ならびに配列番号9に関してリガンド結合性ポケットの40、53、55、74、79および/または82位にゼロ、1つまたは複数の非保存的改変を含む、配列番号9のアミノ酸12〜82と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)およびGDFトラップポリペプチドの機能的に活性なフラグメントは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチド(例えば、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、46および48)をコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより生成されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のメリフィールド固相f−Moc化学反応またはメリフィールド固相t−Boc化学反応など、当該分野で公知の技法を使用して、化学合成することができる。フラグメントを、生成(組換えにより、または化学合成により)および試験して、ActRII受容体および/または1つまたは複数のActRIIリガンド(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7および/またはNodal)のアンタゴニスト(阻害剤)として機能し得るペプチジルフラグメントを特定し得る。
一部の実施形態では、本開示のActRIIAポリペプチドは、配列番号9、10、11、22、26、および28から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ActRIIAポリペプチドは、配列番号9、10、11、22、26、および28から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ActRIIAポリペプチドは、配列番号9、10、11、22、26、および28から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、本開示のActRIIBポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、31、および49から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ActRIIBポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、31、および49から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ActRIIBポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、31、および49から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50、および51から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む改変体ActRIIBポリペプチドである。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50、および51から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50、および51から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み、この場合、配列番号1、4、または49のL79に対応する位置は、酸性アミノ酸(Dアミノ酸残基またはEアミノ酸残基)である。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号36、37、38、41、44、45、50、および51から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号1、2、3、4、5、6、29、および31から選択されるアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
一部の実施形態では、本開示のGDFトラップポリペプチドは、配列番号9、10、11、22、26、28、29および31から選択されるアミノ酸配列に少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む改変体ActRIIAポリペプチドである。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号9、10、11、22、26、28、29および31から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号9、10、11、22、26、28、29および31から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、GDFトラップは、配列番号9、10、11、22、26、28、29および31から選択されるアミノ酸配列を含まないか、またはこれからならない。
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性(例えば、貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性)を増強することなどの目的のために、ActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップの構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変体は、アミノ酸の置換、欠失、付加またはそれらの組み合わせによっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換(例えば、保存的変異)は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、非改変もしくは野生型ポリペプチドと比較した場合に、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、GDF11、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF8、BMP6およびBMP7など、1つまたは複数のリガンドに結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような、本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチドの特異的変異を企図する。このような変異は、1または複数のグリコシル化部位(例えば、O−連結もしくはN−連結のグリコシル化部位)を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン−X−スレオニンまたはアスパラギン−X−セリン(ここで、「X」は任意のアミノ酸である)を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、(O−連結グリコシル化部位については)ポリペプチドの配列への、1または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、1または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第1位もしくは第3位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失(および/または、第2位におけるアミノ酸の欠失)は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、(a)アルギニンおよびヒスチジン;(b)フリーなカルボキシル基;(c)フリーなスルフヒドリル基(例えば、システインのもの);(d)フリーなヒドロキシル基(例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの);(e)芳香族残基(例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの);または(f)グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する1または複数の糖質部分の除去は、化学的および/または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら[Meth. Enzymol.(1987年)、138巻:350頁]により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るからである。一般に、ヒトにおいて使用するための本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチドは、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株(例えば、HEK293細胞株またはCHO細胞株)において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
本開示はさらに、変異体、特に、本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法のほか、短縮型変異体も生成する方法も企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、ActRIIおよびGDFトラップ配列を同定するためにとりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変更またはリガンドへの結合の変更など、特性を変更させたポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチドは、ActRII受容体に結合する能力、ActRIIリガンド(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP7、BMP6および/またはNodal)のActRIIポリペプチドへの結合を妨害する能力、または、ActRIIリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの活性はまた、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイでも試験することができる。例えば、赤血球生成に関与する遺伝子の発現に対するActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの作用が評価され得る。これは、必要な場合、1または複数の組換えActRIIリガンドタンパク質(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP7、BMP6および/またはNodal)の存在下で行われ得、そして、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチド、そして必要に応じてActRIIリガンドを生成するように細胞がトランスフェクトされ得る。同様に、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、マウスもしくは他の動物に投与され得、そして、1または複数の血液測定値、例えば、RBC数、ヘモグロビン、または網状赤血球値が、当該分野で認識された方法を用いて評価され得る。
コンビナトリアル由来の改変体であって、参照ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドと比べて選択的な効力を有するか、または一般に効力を増大させたリガンドトラップを生成することができる。このような改変体は、組換えDNA構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変ポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのポリペプチドの半減期を調節することによってActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドレベルを変更するのに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。Fc融合タンパク質では、変異は、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー(存在する場合)および/またはFc部分において作製され得る。
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なActRIIまたはGDFトラップ配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なActRIIまたはGDFトラップポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット(例えば、ファージディスプレイのための)として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式DNA合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である。例えば、Narang, SA(1983年)、Tetrahedron、39巻:3頁;Itakuraら(1981年)、Recombinant DNA、Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules、AG Walton編、Amsterdam、Elsevier、273〜289頁;Itakuraら(1984年)、Annu. Rev. Biochem.、53巻:323頁;Itakuraら(1984年)、Science、198巻:1056頁;Ikeら(1983年)、Nucleic Acid Res.、11巻:477頁を参照されたい。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている。例えば、Scottら、(1990年)、Science、249巻:386〜390頁;Robertsら(1992年)、PNAS USA、89巻:2429〜2433頁;Devlinら(1990年)、Science、249巻:404〜406頁;Cwirlaら、(1990年)、PNAS USA、87巻:6378〜6382頁のほか、米国特許第5,223,409号、同第5,198,346号、および同第5,096,815号を参照されたい。
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、本開示のActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、例えば、アラニン走査変異誘発[例えば、Rufら(1994年)、Biochemistry、33巻:1565〜1572頁;Wangら(1994年)、J. Biol. Chem.、269巻:3095〜3099頁;Balintら(1993年)、Gene、137巻:109〜118頁;Grodbergら(1993年)、Eur. J. Biochem.、218巻:597〜601頁;Nagashimaら(1993年)、J. Biol. Chem.、268巻:2888〜2892頁;Lowmanら(1991年)、Biochemistry、30巻:10832〜10838頁;およびCunninghamら(1989年)、Science、244巻:1081〜1085頁を参照されたい]を使用して、リンカー走査変異誘発(例えば、Gustinら(1993年)、Virology、193巻:653〜660頁;およびBrownら(1992年)、Mol. Cell Biol.、12巻:2644〜2652頁;McKnightら(1982年)、Science、232巻:316頁を参照されたい)によって、飽和変異誘発[例えば、Meyersら、(1986年)、Science、232巻:613頁を参照されたい]によって、PCR変異誘発[例えば、Leungら(1989年)、Method Cell Mol Biol、1巻:11〜19頁を参照されたい]によって、または化学的変異誘発[例えば、Millerら(1992年)、A Short Course in Bacterial Genetics、CSHL Press、Cold Spring Harbor、NY;およびGreenerら(1994年)、Strategies in Mol Biol、7巻:32〜34頁を参照されたい]を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ActRIIポリペプチドの短縮型(生体活性)形態を同定するための魅力的な方法である。
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、本開示のActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ActRIIリガンド(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP7、BMP6および/またはNodal)についての結合アッセイならびに/またはActRIIリガンドに媒介される細胞シグナル伝達についてのアッセイを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドはさらに、ActRII(例えば、ActRIIAまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチド内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、リガンドトラップポリペプチドの機能に対する影響は、他のActRIIまたはGDFトラップ改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。本開示のポリペプチドの新生形態を切断することによってポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび/または機能にとって重要となり得る。様々な細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH−3T3またはHEK293)が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
ある特定の態様では、本開示のActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、少なくともActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAまたはActRIIBポリペプチド)またはGDFトラップポリペプチドの部分(ドメイン)と、1つまたは複数の異種部分(ドメイン)とを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Glu−Glu、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Pharmacia GST精製システムおよび(HIS6)融合パートナーと共に有用なQIAexpress(商標)システム(Qiagen)のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、リガンドトラップポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質(例えば、GFP)、ならびに、「エピトープタグ」(これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である)が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)およびc−mycタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Xa因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、インビボでポリペプチドを安定化させるドメイン(「安定化」ドメイン)と融合される。「安定化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加させる任意のものを意味する。免疫グロブリンのFc部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化(例えば、二量体化、四量体化)ドメインおよび機能的ドメイン(例えば、筋肉成長のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの)が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下のIgG1 Fcドメイン配列を含むActRIIまたはGDFトラップ融合タンパク質を提供する:
他の実施形態では、本開示は、以下のIgG1 Fcドメインの改変体を含む、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質を提供する:
さらに他の実施形態では、本開示は、以下のIgG1 Fcドメインの改変体を含むActRIIまたはGDFトラップ融合タンパク質を提供する:
必要に応じて、IgG1Fcドメインは、Asp−265、リジン322およびAsn−434のような残基における1または複数の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち1または複数(例えば、Asp−265変異)を持つ変異型IgG1Fcドメインは、野生型Fcドメインに対する、Fcγ受容体への結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異のうち1または複数(例えば、Asn−434変異)を持つ変異型Fcドメインは、野生型IgG1Fcドメインに比べて、MHCクラスI関連のFc受容体(FcRN)への結合能の増加を有する。
ある特定の他の実施形態では、本開示は、以下を含む、IgG2 Fcドメインの改変体を含むActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質を提供する:
ある特定の他の実施形態では、本開示は、以下を含む、IgG2 Fcドメインの改変体を含むActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質を提供する:
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と符合する任意の様式で配列し得ることが理解される。例えば、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFトラップポリペプチドドメインを、異種ドメインに対してC末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFトラップポリペプチドドメインに対してC末端に配置することもできる。ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFトラップポリペプチドドメインと、異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してC末端またはN末端に含めることもでき、ドメインの間に含めることもできる。
例えば、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質は、式A−B−Cに示されるアミノ酸配列を含み得る。B部分は、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFトラップポリペプチドドメインに対応する。A部分およびC部分は、独立に、0、1、または1を超えるアミノ酸であることが可能であり、A部分およびC部分のいずれも、存在する場合、Bに対して異種である。A部分および/またはC部分は、リンカー配列を介して、B部分に付加され得る。例示的なリンカーは、例えば、Gly−Gly−Glyリンカーなど、2つ〜10、2つ〜5つ、2つ〜4つ、2つ〜3つのグリシン残基などの短いポリペプチドリンカーを含む。他の適切なリンカーについては、本明細書の上記で記載している[例えば、TGGGリンカー(配列番号53)]。ある特定の実施形態では、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質は、式A−B−Cに示されるアミノ酸配列[式中、Aは、リーダー(シグナル)配列であり、Bは、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFポリペプチドドメインからなり、Cは、インビボにおける安定性、インビボ半減期、取込み/投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および/または精製の1つまたは複数を増強するポリペプチド部分である]を含む。ある特定の実施形態では、ActRII融合タンパク質またはGDFトラップ融合タンパク質は、式A−B−Cに示されるアミノ酸配列[式中、Aは、TPAリーダー配列であり、Bは、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFポリペプチドドメインからなり、Cは、免疫グロブリンFcドメインである]を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号22、26、29、31、36、38、41、44、および51のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させ得る1または複数の修飾を含む。例えば、このような修飾は、ポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ/または、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質(例えば、ActRIIポリペプチドドメインまたはGDFトラップポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる)、グリコシル化部位の修飾(例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる)、および糖質部分の修飾(例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる)が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン(例えば、免疫グロブリンFcドメイン)を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従い使用されるActRIIポリペプチドおよびGDFトラップは、単離ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、単離タンパク質または単離ポリペプチドとは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドを、例えば、電気泳動(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)、またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換HPLCまたは逆相HPLC)により決定した場合に、95%、96%、97%、98%、または99%より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である[例えば、Flatmanら、(2007年)、J. Chromatogr.、B848巻:79〜87頁を参照されたい]。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップは、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Bodansky, M.、Principles of Peptide Synthesis、Springer Verlag、Berlin(1993年);およびGrant G. A.(編)、Synthetic Peptides: A User’s Guide、W. H. Freeman and Company、New York(1992年)において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている(例えば、Advanced ChemTech 396型;Milligen/Biosearch9600を参照されたい)。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、本開示のポリペプチドは、当該分野で周知の種々の発現系[例えば、E.coli、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、バキュロウイルス]を使用して、組換えにより生成することもできる。さらなる実施形態では、本開示の改変ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはPACE(paired basic amino acid converting enzyme)の使用を介する、組換えにより生成された全長ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの消化により生成することができる。(市販のソフトウェア、例えば、MacVector、Omega、PCGene、Molecular Simulation,Inc.を使用する)コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。代替的に、このようなポリペプチドは、化学的切断(例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミンなど)を使用して、組換えにより生成された全長ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドから生成することができる。
本明細書に開示されるActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAまたはActRIIBポリペプチド)のいずれも、所望の効果を達成する(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、MDSまたは鉄芽球性貧血を処置する、MDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する)ために、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるActRIIポリペプチドは、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のActRIIポリペプチド、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗アクチビンA抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、および/または抗ActRIIB抗体);iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);v)本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストの1つもしくは複数(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド;ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
同様に、本明細書に開示されるGDFトラップのいずれも、所望の効果を達成する(例えば、それを必要とする患者において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、MDSまたは鉄芽球性貧血を処置する、MDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する)ために、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるGDFトラップは、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のGDFトラップ、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドまたはActRIIBポリペプチド);iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗アクチビンA抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、および/または抗ActRIIB抗体);iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);v)本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストの1つもしくは複数(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド;ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
B.ActRIIポリペプチドおよびGDFトラップをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチド(そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む)をコードする、単離核酸および/または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号12は、天然に存在するヒトActRIIA前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号13は、ActRIIAのプロセシング後の細胞外ドメインをコードする。さらに、配列番号7は、天然に存在するヒトActRIIB前駆体ポリペプチド(上記のR64改変体)をコードするが、配列番号8は、ActRIIBのプロセシング後の細胞外ドメイン(上記のR64改変体)をコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、DNA分子でもよく、RNA分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のActRIIベースのリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるActRIIポリペプチドおよびGDFトラップポリペプチド(そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む)をコードする、単離核酸および/または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号12は、天然に存在するヒトActRIIA前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号13は、ActRIIAのプロセシング後の細胞外ドメインをコードする。さらに、配列番号7は、天然に存在するヒトActRIIB前駆体ポリペプチド(上記のR64改変体)をコードするが、配列番号8は、ActRIIBのプロセシング後の細胞外ドメイン(上記のR64改変体)をコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、DNA分子でもよく、RNA分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のActRIIベースのリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色***置と異なる染色***置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップをコードする核酸は、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47、および48のいずれか1つの改変体である核酸を含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列は、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列であって、対立遺伝子改変体を含む配列を含み、したがって、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47、および48のいずれか1つに表示されるヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のActRIIポリペプチドおよびGDFトラップは、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47および48に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一である単離核酸配列または組換え核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本開示のGDFトラップは、配列番号7、8、12、13、27、および32のいずれか1つに対応するヌクレオチド配列のいずれか1つを含むかまたはこれらからなる核酸配列によりコードされない。当業者は、配列番号7、8、12、13、27、32、39、42、47および48、ならびにこれらの改変体に相補的な配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一である核酸配列もまた、本開示の範囲内にあることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離核酸配列であっても、組換え核酸配列であっても、かつ/または異種ヌクレオチド配列と融合させてもよく、DNAライブラリー内の核酸配列であってもよい。
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47および48に指定されるヌクレオチド配列、配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47および48の相補配列、またはこれらのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上述のように、当業者は、DNAのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。当業者は、DNAのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約45℃における6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でのハイブリダイゼーションの後に、50℃における2.0×SSCの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、50℃における約2.0×SSCの低ストリンジェンシーから、50℃における約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温(約22℃)の低ストリンジェンシー条件から、約65℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における6×SSCとその後の室温で2×SSCでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47および48に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が1より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語(例えば、CAUおよびCACはヒスチジンに対する同義語である)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすDNA配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の1または複数のヌクレオチド(約3〜5%までのヌクレオチド)におけるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において1または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記1または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、1つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップをコードし、そして、少なくとも1つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego、CA(1990年)に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにDNA配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドをコードするDNA配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、tetプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、RSVプロモーター、lacシステム、trpシステム、TACもしくはTRCシステム、T7 RNAポリメラーゼによってその発現が誘導されるT7プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター(例えば、Pho5)、酵母α−接合因子(mating factor)のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および/または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質(例えば、抗生物質マーカー)の発現もまた考慮されるべきである。
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞(酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物)のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる:原核生物細胞(例えば、E.coli)における発現のための、pBR322由来のプラスミド、pEMBL由来のプラスミド、pEX由来のプラスミド、pBTac由来のプラスミドおよびpUC由来のプラスミド。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される1または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2−dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko−neoおよびpHyg由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド(例えば、pBR322)からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス(BPV−1)またはエプスタイン−バーウイルス(pHEBo、pREP由来およびp205)のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス(レトロウイルスを含む)発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、3rd Ed.、Sambrook、FritschおよびManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001年)を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、pVL由来のベクター(例えば、pVL1392、pVL1393およびpVL941)、pAcUW由来のベクター(例えば、pAcUWl)およびpBlueBac由来のベクター(例えば、β−galを含むpBlueBac III)が挙げられる。
好ましい実施形態では、ベクターは、CHO細胞における本主題のActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの生成のために設計される(例えば、Pcmv−Scriptベクター(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pcDNA4ベクター(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)およびpCI−neoベクター(Promega,Madison,Wisc))。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質(融合タンパク質または改変体タンパク質を含む)を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のActRIIポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示はまた、1または複数の本主題のActRIIまたはGDFトラップポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のActRIIまたはGDFトラップポリペプチドは、E.coliのような細菌細胞、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を用いる)、酵母細胞または哺乳動物細胞[例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株]において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本開示はさらに、本主題のActRIIまたはGDFトラップポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製、およびActRIIまたはGDFトラップポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティー精製(例えば、プロテインAカラムを使用して、ActRII−FcまたはGDFトラップ−Fc融合タンパク質を精製することができる)を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下:プロテインAクロマトグラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの3つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ActRII−Fcタンパク質またはGDFトラップ−Fcタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、>90%、>95%、>96%、>98%、または>99%の純度まで精製することができ、SDS PAGEにより決定した場合に、>90%、>95%、>96%、>98%、または>99%の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物(マウス)、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
別の実施形態では、精製用リーダー配列(例えば、組換えActRIIまたはGDFトラップポリペプチドの所望の部分のN末端に位置するポリ−(His)/エンテロキナーゼ切断部位の配列)をコードする融合遺伝子は、Ni2+金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ActRIIまたはGDFトラップポリペプチドを提供し得る。例えば、Hochuliら、(1987年)J.Chromatography 411巻:177頁;およびJanknechtら、(1991年)PNAS USA 88巻:8972頁を参照のこと)。
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のDNAフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出(staggered)末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン(filling−in)、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのPCR増幅は、2つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング(overhang)を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons:1992年を参照のこと。
C.抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示は、ActRII活性に拮抗する(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の阻害)抗体または抗体の組み合わせに関する。そのような抗体は、1つもしくは複数のリガンド(例えば、GDF8、GDF11、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7もしくはNodal)または1つもしくは複数の受容体(例えば、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5)に結合し、それらを阻害することができる。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、抗体ActRIIアンタゴニストまたは抗体ActRIIアンタゴニストの組合せを単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用する方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、ActRII活性に拮抗する(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の阻害)抗体または抗体の組み合わせに関する。そのような抗体は、1つもしくは複数のリガンド(例えば、GDF8、GDF11、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7もしくはNodal)または1つもしくは複数の受容体(例えば、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5)に結合し、それらを阻害することができる。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、抗体ActRIIアンタゴニストまたは抗体ActRIIアンタゴニストの組合せを単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示の好ましい抗体ActRIIアンタゴニストは、少なくともGDF11に結合し、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化)を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、GDF11およびGDF8の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または1つもしくは複数の抗GDF11抗体と、1つもしくは複数の抗GDF8抗体との組み合わせの文脈において、GDF8にさらに結合し、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化)をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8に結合し、かつ/またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体(各々が、異なるActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する)の組み合わせの文脈において、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数にさらに結合し、かつ/またはこれらの活性(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の活性化)をさらに阻害する。
ある特定の態様では、本開示のActRIIアンタゴニストは、少なくともGDF8に結合し、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化)を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、GDF8およびGDF11の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または1つもしくは複数の抗GDF8抗体と、1つもしくは複数の抗GDF11抗体との組み合わせの文脈において、GDF11にさらに結合し、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化)をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはその活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF8および/またはGDF11に結合し、かつ/またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体(各々が、異なるActRIIリガンドに対する結合アフィニティーを有する)の組み合わせの文脈において、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数にさらに結合し、かつ/またはこれらの活性(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8のシグナル伝達など、ActRIIAまたはActRIIBのシグナル伝達の活性化)をさらに阻害する。
別の態様では、本開示のActRIIアンタゴニストは、ActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体またはActRIIB受容体)に結合し、かつ/またはその活性を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。好ましい実施形態では、本開示の抗ActRII受容体抗体(例えば、抗ActRIIA受容体抗体または抗ActRIIB受容体抗体)または抗体の組み合わせは、ActRII受容体に結合し、少なくともGDF11によるActRII受容体への結合および/またはその活性化(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化)を防止する。必要に応じて、本開示の抗ActRII受容体抗体または抗体の組み合わせは、GDF8によるActRII受容体への結合および/またはその活性化をさらに防止する。必要に応じて、本開示の抗ActRII受容体抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンAが、ActRII受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ActRII受容体に結合し、GDF11および/またはGDF8によるActRII受容体への結合および/またはその活性化を防止する、本開示の抗ActRII受容体抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数によるActRII受容体への結合および/またはその活性化をさらに防止する。
抗体という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、それらが、所望の抗原結合活性を呈示する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体)、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包摂する。抗体フラグメントとは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗体フラグメントの例は、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2;ダイアボディー(diabody);直鎖状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むがこれらに限定されない。例えば、Hudsonら(2003年)、Nat. Med.、9巻:129〜134頁;Plueckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、RosenburgおよびMoore編(Springer−Verlag、New York)、269〜315頁(1994年);WO93/16185;ならびに米国特許第5,571,894号;同第5,587,458号;および同第5,869,046号を参照されたい。本明細書で開示される抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付加させた、検出可能な標識を含む(例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る)。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
ダイアボディーは、二価または二特異性であり得る、2つの抗原結合性部位を有する抗体フラグメントである。例えば、EP404,097;WO1993/01161;Hudsonら(2003年)、Nat. Med.、9巻:129〜134頁;およびHollingerら(1993年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻:6444〜6448頁を参照されたい。トリアボディー(triabody)およびテトラボディー(tetrabody)もまた、Hudsonら(2003年)、Nat. Med.、9巻:129〜134頁において記載されている。
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許第6,248,516号を参照されたい。
抗体フラグメントは、本明細書で記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化のほか、組換え宿主細胞(例えば、E.coliまたはファージ)による生成を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
一般に、本明細書で開示される方法における使用のための抗体は、その標的抗原に、好ましくは、大きな結合アフィニティーで特異的に結合する。アフィニティーは、KD値として表すことができ、内因性結合アフィニティー(例えば、アビディティー効果を最小化して)を反映する。典型的に、結合アフィニティーは、無細胞状況の場合であれ、細胞会合状況の場合であれ、インビトロにおいて測定する。本明細書で開示されるアッセイを含む、当該分野で公知の多数のアッセイであって、例えば、表面プラズモン共鳴(Biacore(商標)アッセイ)、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)、およびELISAを含むアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティーの測定値を得ることができる。。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原(例えば、GDF11、GDF8、ActRIIA、ActRIIBなど)に、少なくとも1×10−7もしくはこれよりも強力に、1×10−8もしくはこれよりも強力に、1×10−9もしくはこれよりも強力に、1×10−10もしくはこれよりも強力に、1×10−11もしくはこれよりも強力に、1×10−12もしくはこれよりも強力に、1×10−13もしくはこれよりも強力に、または1×10−14もしくはこれよりも強力なKDで結合する。
ある特定の実施形態では、KDは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のFabバージョンおよびその標的抗原で実施されるRIAにより測定される。Fabの抗原に対する溶液結合アフィニティーは、Fabを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原(例えば、125Iで標識された)と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Fab抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する[例えば、Chenら(1999年)、J.Mol.Biol.、293巻:865〜881頁を参照されたい]。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート(例えば、Thermo Scientific製のMICROTITER(登録商標))を、捕捉用抗Fab抗体(例えば、Cappel Labs製)でコーティングし(例えば、一晩にわたり)、その後、好ましくは、室温(およそ23℃)において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるFabの系列希釈液と混合する[例えば、Prestaら、(1997年)、Cancer Res.、57巻:4593〜4599頁における抗VEGF抗体である、Fab−12の評価と符合する]。次いで、関心のあるFabを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間(例えば、約65時間)にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約1時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート20とPBSとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤(例えば、Packard製のMICROSCINT(登録商標))を添加し、ガンマカウンター(例えば、Packard製のTOPCOUNT(登録商標))上で、プレートをカウントする。
別の実施形態によれば、KDは、例えば、抗原CM5チップを約10応答単位(RU)で固定化させた、BIACORE(登録商標)2000またはBIACORE(登録商標)3000(Biacore,Inc.、Piscataway、N.J.)を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、Biacore,Inc.)を、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化させる。例えば、抗原は、10mMの酢酸ナトリウム、pH4.8で、5μg/ml(約0.2μM)まで希釈してから、5μl/分の流量で注入して、およそ10応答単位(RU)のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、1Mのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Fabの2倍系列希釈液(0.78nM〜500nM)を、0.05%のポリソルベート20(TWEEN−20(登録商標))界面活性剤を含むPBS(PBST)に、およそ25μl/分の流量で注入する。会合速度(kon)および解離速度(koff)は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2)を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数(KD)は、koff/kon比として計算する[例えば、Chenら、(1999年)、J. Mol. Biol.、293巻:865〜881頁を参照されたい]。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで106M−1s−1を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるPBS中、20nMの抗抗原抗体(Fab形態)の蛍光発光強度(例えば、励起=295nm;発光=340nm、16nmのバンドパス)であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計(Aviv Instruments)、または8000シリーズのSLM−AMINCO(登録商標)分光光度計(ThermoSpectronic)などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
本明細書で使用される抗GDF11抗体とは一般に、抗体が、GDF11を標的化するときの診断剤および/または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでGDF11に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗GDF11抗体の、GDF11以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)により測定される、抗体のGDF11への結合の約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満、または1%未満である。ある特定の実施形態では、抗GDF11抗体は、異なる種に由来するGDF11の間で保存的な、GDF11のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗GDF11抗体は、GDF11活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗GDF11抗体は、GDF11が、同族受容体(例えば、ActRIIA受容体またはActRIIB受容体)に結合することを阻害することが可能であり、かつ/またはActRIIA受容体および/もしくはActRIIB受容体によるSMAD2/3シグナル伝達など、GDF11に媒介される、同族受容体のシグナル伝達(活性化)を阻害し得る。一部の実施形態では、本開示の抗GDF11抗体は、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはその活性を実質的に阻害しない。GDF11は、GDF8との配列相同性が大きく、したがって、GDF11に結合し、かつ/またはこれを阻害する抗体はまた、場合によって、GDF8にも結合し、かつ/またはこれも阻害し得ることに注目されたい。
抗GDF8抗体とは、抗体が、GDF8を標的化するときの診断剤および/または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでGDF8に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗GDF8抗体の、GDF8以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)により測定される、抗体のGDF8への結合の約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満、または1%未満である。ある特定の実施形態では、抗GDF8抗体は、異なる種に由来するGDF8の間で保存的な、GDF8のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗GDF8抗体は、GDF8活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗GDF8抗体は、GDF8が、同族受容体(例えば、ActRIIA受容体またはActRIIB受容体)に結合することを阻害することが可能であり、かつ/またはActRIIA受容体および/もしくはActRIIB受容体によるSMAD2/3シグナル伝達など、GDF8に媒介される、同族受容体のシグナル伝達(活性化)を阻害し得る。一部の実施形態では、本開示の抗GDF8抗体は、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはその活性を実質的に阻害しない。GDF8は、GDF11との配列相同性が大きく、したがって、GDF8に結合し、かつ/またはこれを阻害する抗体はまた、多くの場合、GDF11にも結合し、かつ/またはこれも阻害し得ることに注目されたい。
抗ActRIIA抗体とは、抗体が、ActRIIAを標的化するときの診断剤および/または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでActRIIAに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ActRIIA抗体の、ActRIIA以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)により測定される、抗体のActRIIAへの結合の約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満、または1%未満である。ある特定の実施形態では、抗ActRIIA抗体は、異なる種に由来するActRIIAの間で保存的な、ActRIIAのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ActRIIA抗体は、ActRIIA活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ActRIIA抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、アクチビンA、BMP6、およびBMP7から選択される、1つもしくは複数のActRIIAリガンドが、ActRIIA受容体に結合することを阻害することが可能であり、かつ/またはこれらのリガンドの1つが、ActRIIAシグナル伝達(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8 ActRIIAシグナル伝達)を活性化させることを阻害し得る。好ましい実施形態では、本開示の抗ActRIIA抗体は、GDF11が、ActRIIA受容体に結合することを阻害し、かつ/またはGDF11が、ActRIIAシグナル伝達を活性化させることを阻害する。必要に応じて、本開示の抗ActRIIA抗体は、GDF8が、ActRIIA受容体に結合することをさらに阻害し、かつ/またはGDF8が、ActRIIAシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗ActRIIA抗体は、アクチビンAが、ActRIIA受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ/またはActRIIAシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の抗ActRIIA抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、アクチビンA、GDF8、BMP6、およびBMP7の1つまたは複数が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
抗ActRIIB抗体とは、抗体が、ActRIIBを標的化するときの診断剤および/または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでActRIIBに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ActRIIB抗体の、ActRIIB以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)により測定される、抗体のActRIIBへの結合の約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満、または1%未満である。ある特定の実施形態では、抗ActRIIB抗体は、異なる種に由来するActRIIBの間で保存的な、ActRIIBのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ActRIIB抗体は、ActRIIB活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ActRIIB抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF11、GDF8、アクチビンA、BMP6、およびBMP7から選択される、1つもしくは複数のActRIIBリガンドが、ActRIIB受容体に結合することを阻害することが可能であり、かつ/またはこれらのリガンドの1つが、ActRIIBシグナル伝達(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8 ActRIIBシグナル伝達)を活性化させることを阻害し得る。好ましい実施形態では、本開示の抗ActRIIB抗体は、GDF11が、ActRIIB受容体に結合することを阻害し、かつ/またはGDF11が、ActRIIBシグナル伝達を活性化させることを阻害する。必要に応じて、本開示の抗ActRIIB抗体は、GDF8が、ActRIIB受容体に結合することをさらに阻害し、かつ/またはGDF8が、ActRIIBシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗ActRIIB抗体は、アクチビンAが、ActRIIB受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ/またはActRIIBシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の抗ActRIIB抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、アクチビンA、GDF8、BMP6、およびBMP7の1つまたは複数が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
当該分野では、ヒトのGDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、GDF8、BMP6、BMP7、ActRIIB、およびActRIIAの核酸配列およびアミノ酸配列が周知であり、したがって、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が日常的に作製することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および/または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、(1984年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻:6851〜6855頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域)と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域(HVR)に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域(FR)に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも1つの可変ドメインであり、典型的には2つの可変ドメインであって、HVR(例えば、CDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のHVR(例えば、CDR)に対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のFRに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、AlmagroおよびFransson(2008年)、Front. Biosci.、13巻:1619〜1633頁において総説されており、例えば、Riechmannら、(1988年)、Nature、332巻:323〜329頁;Queenら(1989年)、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、86巻:10029〜10033頁;米国特許第5,821,337号;同第7,527,791号;同第6,982,321号;および同第7,087,409号;Kashmiriら、(2005年)、Methods、36巻:25〜34頁[SDR(a−CDR)グラフティングについて記載する];Padlan、Mol. Immunol.、(1991年)、28巻:489〜498頁(「リサーフェシング」について記載する);Dall’Acquaら(2005年)、Methods、36巻:43〜60頁(「FRシャフリング」について記載する);Osbournら(2005年)、Methods、36巻:61〜68頁;ならびにKlimkaら、Br. J. Cancer(2000年)、83巻:252〜260頁(FRシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載する)においてさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域[例えば、Simsら(1993年)、J. Immunol.、151巻:2296頁を参照されたい];軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の亜集団による、ヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域[例えば、Carterら(1992年)、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、89巻:4285頁;およびPrestaら(1993年)、J. Immunol.、151巻:2623頁を参照されたい];ヒト成熟(体細胞変異させた)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域[例えば、AlmagroおよびFransson(2008年)、Front. Biosci.、13巻:1619〜1633頁を参照されたい];およびFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域を含むがこれらに限定されない[例えば、Bacaら、(1997年)、J. Biol. Chem.、272巻:10678〜10684頁;およびRosokら、(1996年)、J. Biol. Chem.、271巻:22611〜22618頁を参照されたい]。
USA、89巻:4285頁;およびPrestaら(1993年)、J. Immunol.、151巻:2623頁を参照されたい];ヒト成熟(体細胞変異させた)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域[例えば、AlmagroおよびFransson(2008年)、Front. Biosci.、13巻:1619〜1633頁を参照されたい];およびFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域を含むがこれらに限定されない[例えば、Bacaら、(1997年)、J. Biol. Chem.、272巻:10678〜10684頁;およびRosokら、(1996年)、J. Biol. Chem.、271巻:22611〜22618頁を参照されたい]。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の技法を使用して生成することができる。ヒト抗体は一般に、van Dijkおよびvan de Winkel(2001年)、Curr. Opin. Pharmacol.、5巻:368〜74頁;ならびにLonberg(2008年)、Curr. Opin. Immunol.、20巻:450〜459頁において記載されている。
ヒト抗体は、免疫原(例えば、GDF11ポリペプチド、GDF8ポリペプチド、ActRIIAポリペプチド、またはActRIIBポリペプチド)を、抗原性攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することにより調製することができる。このような動物は典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置きかえるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、例えば、Lonberg(2005年)、Nat. Biotechnol.、23巻:1117〜1125頁;米国特許第6,075,181号および同第6,150,584号(XENOMOUSE(商標)技術について記載);米国特許第5,770,429号(HuMab(登録商標)技術について記載);米国特許第7,041,870号(K−M MOUSE(登録商標)技術について記載);ならびに米国特許出願公開第2007/0061900号(VelociMouse(登録商標)技術について記載)を参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変することができる。
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている[例えば、Kozbor、J. Immunol.、(1984年)、133巻:3001頁;Brodeurら(1987年)、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker, Inc.、New York;およびBoernerら(1991年)、J. Immunol.、147巻:86頁を参照されたい]。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Liら、(2006年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、103巻:3557〜3562頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルIgM抗体の生成について記載)およびNi、Xiandai Mianyixue(2006年)、26巻(4号):265〜268頁(2006年)(ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載)において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、VollmersおよびBrandlein(2005年)、Histol. Histopathol.、20巻(3号):927〜937頁;ならびにVollmersおよびBrandlein(2005年)、Methods Find Exp. Clin. Pharmacol.、27巻(3号):185〜91頁において記載されている。
本明細書で提供されるヒト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成することができる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーより選択するための技法については、本明細書で記載される。
例えば、本開示の抗体は、1つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboomら(2001年)、Methods in Molecular Biology、178巻:1〜37頁、O’Brienら編、Human Press、Totowa、N.J.において総説されており、例えば、McCaffertyら(1991年)、Nature、348巻:552〜554頁;Clacksonら、(1991年)、Nature、352巻:624〜628頁;Marksら(1992年)、J. Mol. Biol.、222巻:581〜597頁;MarksおよびBradbury(2003年)、Methods in Molecular Biology、248巻:161〜175頁、Lo編、Human Press、Totowa、N.J.;Sidhuら(2004年)、J. Mol. Biol.、338巻(2号):299〜310頁;Leeら(2004年)、J. Mol. Biol.、340巻(5号):1073〜1093頁;Fellouse(2004年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、101巻(34号):12467〜12472頁;ならびにLeeら(2004年)、J. Immunol. Methods、284巻(1〜2号):119〜132頁においてさらに記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、Winterら(1994年)、Ann. Rev. Immunol.、12巻:433〜455頁において記載されているように、VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、次いで、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、抗体フラグメントを、単鎖Fv(scFv)フラグメントまたはFabフラグメントとして呈示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原(例えば、GDF11、アクチビンB、ActRIIA、またはActRIIB)に対する高アフィニティー抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーは、Griffithsら(1993年)、EMBO J、12巻:725〜734頁により記載されているように、いかなる免疫化もなく、広範にわたる非自己抗原を指向する抗体の単一の供給源をもたらし、また、広範にわたる自己抗原を指向する抗体の単一の供給源ももたらすように、クローニングすることができる(例えば、ヒトから)。最後に、ナイーブライブラリーはまた、HoogenboomおよびWinter(1992年)、J. Mol. Biol.、227巻:381〜388頁により記載されているように、再配列されていないV遺伝子セグメントを、幹細胞からクローニングし、高度に可変的なCDR3領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成する、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用することを介して、合成により作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公開は、例えば、米国特許第5,750,373号;ならびに米国特許公開第2005/0079574号、同第2005/0119455号、同第2005/0266000号、同第2007/0117126号、同第2007/0160598号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号、および同第2009/0002360号を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体(典型的に、モノクローナル抗体)は、1つまたは複数の(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはこれを超える)抗原上の、少なくとも2つの(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはこれを超える)異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、2つまたはこれを超える結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも1つは、GDF11エピトープに対する結合特異性であり、必要に応じて、1つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるActRIIリガンド(例えば、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodal)上および/またはActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体)上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、GDF11の2つまたはこれを超える異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、GDF11エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、GDF11活性(例えば、ActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれらを活性化させる能力)を阻害することができ、必要に応じて、1つまたは複数の異なるActRIIリガンド(例えば、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodal)および/またはActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体またはActRIIB受容体)の活性を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、GDF11に結合し、かつ/またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、少なくともGDF8にさらに結合し、かつ/またはこれをさらに阻害する。必要に応じて、GDF11に結合し、かつ/またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11およびGDF8に結合し、かつ/またはこれらを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodalの1つまたは複数にさらに結合し、かつ/またはこれらをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、2つまたはこれを超える結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも1つは、GDF8エピトープに対する結合特異性であり、必要に応じて、1つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるActRIIリガンド(例えば、GDF11、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodal)上および/またはActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体)上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、GDF8の2つまたはこれを超える異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、GDF8エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、GDF8活性(例えば、ActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれらを活性化させる能力)を阻害することができ、必要に応じて、1つまたは複数の異なるActRIIリガンド(例えば、GDF11、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodal)および/またはActRII受容体(例えば、ActRIIA受容体またはActRIIB受容体)の活性を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、GDF8に結合し、かつ/またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、少なくともGDF11にさらに結合し、かつ/またはこれをさらに阻害する。必要に応じて、GDF8に結合し、かつ/またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンAに実質的に結合せず、かつ/またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF8およびGDF11に結合し、かつ/またはこれらを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、および/またはNodalの1つまたは複数にさらに結合し、かつ/またはこれらをさらに阻害する。
本明細書にはまた、3つまたはこれを超える、機能的な抗原結合性部位を有する操作抗体であって、「オクトパス抗体」を含む操作抗体も含まれる(例えば、US2006/0025576A1を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体(このような改変体は、一般に少量で存在する)を除き同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、任意の特定の方法により抗体の生成を必要とするとはみなさないものとする。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
例えば、標準的なプロトコルを介して、GDF11またはGDF8に由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清または抗タンパク質/抗ペプチドモノクローナル抗体を作製することができる[例えば、Antibodies: A Laboratory Manual(1988年)、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Pressを参照されたい]。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物は、GDF11ポリペプチドもしくはGDF8ポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能である抗原性フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法は、キャリアへの結合体化または当該分野で周知の他の技法を含む。GDF11ポリペプチドまたはGDF8ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。免疫原を抗原とする標準的なELISAまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体生成レベルおよび/または結合アフィニティーレベルを評価することができる。
GDF11またはGDF8の抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞(リンパ球)を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法[例えば、KohlerおよびMilstein(1975年)、Nature、256巻:495〜497頁を参照されたい]、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法[例えば、Kozbarら(1983年)、Immunology Today、4巻:72頁を参照されたい]、およびヒトモノクローナル抗体を生成するEBVハイブリドーマ技法[Coleら(1985年)、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁]が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、GDF11ポリペプチドまたはGDF8ポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)のFc領域に導入し、これにより、Fc領域改変体を生成することができる。Fc領域改変体は、1つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変(例えば、置換、欠失、および/または付加)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4のFc領域)を含み得る。
例えば、本開示は、一部のエフェクター機能を保有するが、全てのエフェクター機能は保有しない抗体の改変体であって、これにより、インビボにおける抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能[例えば、補体依存性細胞傷害作用(CDC)および抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)]は、不要または有害である適用に望ましい候補となる抗体の改変体を企図する。インビトロおよび/またはインビボにおける細胞傷害作用アッセイを実行して、CDC活性および/またはADCC活性の低減/枯渇を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを実行して、抗体が、FcγR結合を欠く(よって、ADCC活性を欠く可能性が高い)が、FcRnへの結合能は保持することを確保することができる。ADCCを媒介するための主要な細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcRの発現は、例えば、RavetchおよびKinet(1991年)、Annu. Rev. Immunol.、9巻:457〜492頁にまとめられている。関心のある分子のADCC活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号;Hellstrom,
I.ら(1986年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、83巻:7059〜7063頁;Hellstrom, Iら(1985年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、82巻:1499〜1502頁;米国特許第5,821,337号;およびBruggemann, M.ら(1987年)、J. Exp. Med.、166巻:1351〜1361頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる(例えば、フローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射性細胞傷害作用アッセイ;CellTechnology,Inc.、Mountain View、Calif.;およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害作用アッセイ、Promega、Madison、Wis.)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のADCC活性は、インビボにおいて、例えば、Clynesら(1998年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、95巻:652〜656頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、C1q結合アッセイを実行して、抗体がC1qに結合できず、よって、CDC活性を欠くことを確認することもできる[例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402における、C1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照されたい]。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを実施することができる[例えば、Gazzano−Santoroら(1996年)、J. Immunol. Methods、202巻:163頁;Cragg, M. S.ら(2003年)、Blood、101巻:1045〜1052頁;ならびにCragg, M. S.およびM. J. Glennie(2004年)、Blood、103巻:2738〜2743頁を参照されたい]。当該分野で公知の方法を使用して、FcRnへの結合およびインビボにおけるクリアランス/半減期の決定もまた、実施することができる[例えば、Petkova, S. B.ら(2006年)、Int’l. Immunol.、18巻(12号):1759〜1769頁を参照されたい]。
I.ら(1986年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、83巻:7059〜7063頁;Hellstrom, Iら(1985年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、82巻:1499〜1502頁;米国特許第5,821,337号;およびBruggemann, M.ら(1987年)、J. Exp. Med.、166巻:1351〜1361頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる(例えば、フローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射性細胞傷害作用アッセイ;CellTechnology,Inc.、Mountain View、Calif.;およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害作用アッセイ、Promega、Madison、Wis.)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のADCC活性は、インビボにおいて、例えば、Clynesら(1998年)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、95巻:652〜656頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、C1q結合アッセイを実行して、抗体がC1qに結合できず、よって、CDC活性を欠くことを確認することもできる[例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402における、C1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照されたい]。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを実施することができる[例えば、Gazzano−Santoroら(1996年)、J. Immunol. Methods、202巻:163頁;Cragg, M. S.ら(2003年)、Blood、101巻:1045〜1052頁;ならびにCragg, M. S.およびM. J. Glennie(2004年)、Blood、103巻:2738〜2743頁を参照されたい]。当該分野で公知の方法を使用して、FcRnへの結合およびインビボにおけるクリアランス/半減期の決定もまた、実施することができる[例えば、Petkova, S. B.ら(2006年)、Int’l. Immunol.、18巻(12号):1759〜1769頁を参照されたい]。
エフェクター機能を低減した本開示の抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329のうちの1つまたは複数を置換した抗体を含む(米国特許第6,737,056号)。このようなFc変異体は、アミノ酸265位、269位、270位、297位、および327位のうちの2つまたはこれより多くにおいて置換を有するFc変異体であって、残基265および297のアラニンへの置換を有する、いわゆる「DANA」Fc変異体を含むFc変異体を含む(米国特許第7,332,581号)。
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の1つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオMAb」を創出することが望ましいと考えられる。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分など、他の部分に結合体化させて、本明細書でさらに記載されるような、免疫結合体を創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基:軽鎖のV205(Kabat番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);および重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)のうちの任意の1つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号において記載されているように生成することができる。
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ELISA、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore結合アッセイ、Biacore AB、Uppsala、Sweden)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International,Inc.、Gaithersburg、Marylandの常磁性ビーズシステム)、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および/または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および/または結合ポリペプチドの結合アフィニティーおよび/または他の生体特性を改善することが望ましい場合がある。抗体および/または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および/または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような改変は、例えば、抗体および/または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはこれらへの挿入、および/またはこれらの置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、標的への結合(GDF11、GDF8、ActRIIA、および/またはActRIIBへの結合)を保有するという条件で、最終的な構築物に到達するように施すことができる。
変更(例えば、置換)をHVR内に施して、例えば、抗体のアフィニティーを改善することができる。このような変更は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基(例えば、Chowdhury(2008年)、Methods Mol. Biol.、207巻:179〜196頁(2008年)を参照されたい)、および/またはSDR(a−CDR)に施すことができ、結果として得られる改変体VHまたは改変体VLを結合アフィニティーについて調べる。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティー成熟が記載されている[例えば、Hoogenboomら、Methods in Molecular Biology、178巻:1〜37頁、O’Brienら編、Human Press、Totowa、N.J.(2001年)を参照されたい]。アフィニティー成熟の一部の実施形態では、様々な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発)のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基(例えば、一度に4〜6残基)をランダム化する、HVR指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するHVR残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にCDR−H3およびCDR−L3は、しばしば標的化される。
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、1つまたは複数のHVR内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変更(例えば、本明細書で提供される保存的置換)を、HVR内に施すことができる。このような変更は、HVR「ホットスポット」またはSDRの外部であり得る。上記で提供した改変体VH配列およびVL配列のある特定の実施形態では、各HVRは、不変であるか、または1つ、2つ、もしくは3つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異誘発のために標的化され得る抗体および/または結合性ポリペプチドの残基または領域の同定に有用な方法は、CunninghamおよびWells(1989年)、Science、244巻:1081〜1085頁により記載されているように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれている。この方法では、残基または標的残基の群(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基)を同定し、中性であるかまたは負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)で置きかえて、抗体または結合ポリペプチドと抗原との相互作用が影響を受けるのかどうかを決定する。初期の置換に対して機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することもできる。代替的に、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接点を同定することができる。このような接触残基および近傍の残基は、置換の標的化してもよく、置換の候補として消失させてもよい。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、1残基〜100またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合物および/またはカルボキシル末端融合物のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のN末端もしくはC末端の、酵素(例えば、ADEPTのための)、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合物が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および/または結合性ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および/または結合性ポリペプチドの誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、およびデキストラン、またはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、ポリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および/または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、1つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/または種類は、抗体の誘導体および/または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および/または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
本明細書で開示されるActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗アクチビンA抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、および/または抗ActRIIB抗体)のいずれかを、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、本明細書で開示されるActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体)は、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のActRIIアンタゴニスト抗体、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよび/またはActRIIBポリペプチド)、iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);v)本明細書で開示される、1つもしくは複数の、ポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド;ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
D.小分子アンタゴニスト
D.小分子アンタゴニスト
別の態様では、本開示は、ActRII活性に拮抗する(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達などのActRIIAおよび/またはActRIIBシグナル伝達の阻害)小分子または小分子の組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ActRIIの小分子アンタゴニストまたは抗体アンタゴニストの組合せを単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用する方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示の好ましいActRIIアンタゴニストは、少なくともGDF11活性を直接的または間接的に阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせである。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF8をさらに直接的または間接的に阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA活性を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11活性および/またはGDF8活性を直接的または間接的に阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数の活性をさらに直接的または間接的に阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数の間接的阻害剤である。例えば、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともGDF11の発現(例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組み合わせ)を阻害し得る。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF8の発現をさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAの発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8の発現を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数の発現をさらに阻害し得る。
他の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数の直接的阻害剤である。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、少なくともGDF11に直接結合し、かつ、その活性を直接阻害する(例えば、GDF11がActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力を阻害し;SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化を阻害する)。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、GDF8にさらに結合することが可能であり、かつ、その活性をさらに阻害し得る(例えば、GDF8がActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力を阻害し;SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化を阻害する)。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンAに実質的に結合しないか、またはその活性(例えば、アクチビンAがActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力;SMAD2/3のシグナル伝達経路など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8に結合し、かつ、これらの活性を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数にさらに結合し、かつ、これらの活性をさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともGDF8に直接結合し、かつ、その活性を直接阻害する(例えば、GDF8がActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力を阻害し;SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF8に媒介される活性化を阻害する)。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF11にさらに結合することが可能であり、かつ、その活性をさらに阻害し得る(例えば、GDF11がActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力を阻害し;SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、GDF11に媒介される活性化を阻害し得る)。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAに実質的に結合しないか、またはその活性(例えば、アクチビンAがActRIIA受容体および/またはActRIIB受容体に結合する能力;SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンAに媒介される活性化)を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF8および/またはGDF11に結合し、かつ、これらの活性を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、およびActRIIBの1つまたは複数にさらに結合し、かつ、これらの活性をさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともActRIIAに直接結合し、かつ、その活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAシグナル伝達の、ActRIIリガンドに媒介される活性化)を直接阻害する。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ActRIIA受容体に結合し、かつ、少なくともGDF11が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF8が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAが、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数が、ActRIIA受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともActRIIBに直接結合し、かつ、その活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIBシグナル伝達の、ActRIIリガンドに媒介される活性化)を直接阻害する。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ActRIIB受容体に結合し、かつ、少なくともGDF11が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、GDF8が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAが、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、およびNodalの1つまたは複数が、ActRIIB受容体に結合し、かつ/またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
本開示の結合有機低分子アンタゴニストは、公知の方法を使用して、同定し、化学合成することができる(例えば、PCT公開第WO00/00823号および同第WO00/39585号を参照されたい)。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常約2000ダルトン未満のサイズであり、代替的に、約1500、750、500、250、または200ダルトン未満のサイズであり、ここで、このような有機低分子は、本明細書で記載されるポリペプチド(例えば、GDF11、GDF8、ActRIIAおよびActRIIB)に、好ましくは、特異的に結合することが可能である。このような低分子アンタゴニストは、不要な実験を行わず、周知の技法を使用して同定することができる。これに関して、当該分野では、ポリペプチド標的に特異的に結合することが可能な分子について、有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることに留意されたい(例えば、国際特許公開第WO00/00823号および同第WO00/39585号を参照されたい)。
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、N置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
本明細書で開示される低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト)のいずれかを、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成する(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高め、かつ/またはヘモグロビンを増加させ、貧血を処置または予防し、MDSまたは鉄芽球性貧血を処置し、MDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する)ことができる。例えば、本明細書で開示される低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト)は、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加の低分子ActRIIアンタゴニスト、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよび/またはActRIIBポリペプチド)、iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体);v)本明細書で開示される、1つもしくは複数の、ポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド;ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
E.アンタゴニストポリヌクレオチド
E.アンタゴニストポリヌクレオチド
別の態様では、本開示は、ActRII活性に拮抗する(例えば、SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達などのActRIIAおよび/またはActRIIBシグナル伝達の阻害)ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ポリヌクレオチドActRIIアンタゴニストまたはポリヌクレオチドActRIIアンタゴニストの組合せを単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用する方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストまたはポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストの組み合わせを使用して、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の活性および/または発現を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストまたはポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニストの組み合わせは、GDF−ActRIIアンタゴニストである。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともGDF11の活性および/または発現(例えば、転写、翻訳、分泌、またはこれらの組み合わせ)を阻害する。必要に応じて、このようなポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、GDF8の活性および/または発現をさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAの活性および/または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF11および/またはGDF8の活性および/または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の活性および/または発現をさらに阻害し得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともGDF8の活性および/または発現(例えば、転写、翻訳、分泌またはその組合せ)を阻害する。必要に応じて、そのようなポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、GDF11の活性および/または発現をさらに阻害することができる。アクチビンAの活性および/または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、GDF8および/またはGDF11の活性および/または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の活性および/または発現をさらに阻害し得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともActRIIAの活性および/または発現(例えば、転写、翻訳、分泌、またはこれらの組み合わせ)を阻害する。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンAの活性および/または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ActRIIAの活性および/または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、および/またはActRIIBの1つまたは複数の活性および/または発現をさらに阻害し得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともActRIIBの活性および/または発現(例えば、転写、翻訳、分泌またはその組合せ)を阻害する。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンAの活性および/または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ActRIIBの活性および/または発現を阻害する本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodalおよび/またはActRIIAの1つまたは複数の活性および/または発現をさらに阻害することができる。
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、RNAi分子[例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)]、アプタマーおよび/またはリボザイムであり得る。当該分野では、ヒトGDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIBの核酸配列およびアミノ酸配列が公知であり、したがって、本開示の方法に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が慣習的に作製することができる。
例えば、アンチセンス技術は、アンチセンスDNAもしくはアンチセンスRNA、または三重螺旋形成を介して、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。アンチセンス法は、例えば、Okano(1991年)、J. Neurochem.、56巻:560頁;Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.(1988年)において論じられている。三重螺旋形成は、例えば、Cooneyら(1988年)、Science、241巻:456頁;およびDervanら、(1991年)、Science、251巻:1300頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの、相補性DNAまたはRNAへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示される遺伝子のRNA転写物(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIB)の少なくとも一部に相補的な一本鎖RNA配列または一本鎖DNA配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましくはあるが、必要ではない。
本明細書で言及される「RNAの少なくとも一部に相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIB)の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖DNAの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るRNAとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖(または、場合に応じて、三重鎖)を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
メッセージの5’末端、例えば、AUG開始コドンまでの5’側非翻訳配列であって、AUG開始コドンを含む5’側非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、mRNAの3’側非翻訳配列に対する配列相補性もまた、mRNAの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている[例えば、Wagner, R.、(1994年)、Nature、372巻:333〜335頁を参照されたい]。したがって、本開示の遺伝子(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIB)の非コード領域である、5’側または3’側の非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性mRNAの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用し得る。mRNAの5’側非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補体を含むべきである。mRNAコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のそれほど効率的な阻害剤ではないが、本開示の方法に従い使用し得る。本開示のmRNA(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIBのmRNA)の5’側非翻訳領域、3’側非翻訳領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするようにデザインされている場合でも、アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、6〜約50ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAまたはActRIIBのアンチセンス核酸)は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸(RNA)を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスRNAを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えDNA法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、SV40初期プロモーター領域[例えば、BenoistおよびChambon(1981年)、Nature、29巻:304〜310頁を参照されたい]、ラウス肉腫ウイルスの3’側長末端リピート内に含有されるプロモーター[例えば、Yamamotoら(1980年)、Cell、22巻:787〜797頁を参照されたい]、ヘルペスチミジンプロモーター[例えば、Wagnerら(1981年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、78巻:1441〜1445頁を参照されたい]、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列[例えば、Brinsterら(1982年)、Nature、296巻:39〜42頁を参照されたい]が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIBのうちの1つまたは複数の発現を標的化する干渉RNAまたはRNAi分子である。RNAiとは、標的化されるmRNAの発現に干渉するRNAの発現を指す。具体的には、RNAiは、siRNA(低分子干渉RNA)を介する特異的mRNAとの相互作用により、標的化される遺伝子をサイレンシングする。次いで、dsRNA複合体が、細胞による分解の標的化される。siRNA分子は、10〜50ヌクレオチドの長さの二本鎖RNA二重鎖であり、十分に相補的な標的遺伝子(例えば、遺伝子に少なくとも80%の同一性)の発現に干渉する。一部の実施形態では、siRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも85、90、95、96、97、98、99、または100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
追加のRNAi分子として、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)が挙げられ、また、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロRNA(miRNA)が挙げられる。shRNA分子は、ループにより接続された、標的遺伝子に由来するセンス配列とアンチセンス配列とを含有する。shRNAは、核から細胞質に輸送され、mRNAと共に分解される。Pol IIIプロモーターまたはU6プロモーターを使用して、RNAiのためのRNAを発現させることができる。Paddisonら[Genes & Dev.(2002年)、16巻:948〜958頁、2002年]は、RNAiを実行する手段としてヘアピンに折り畳まれた低分子RNA分子を使用している。したがって、このような短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子はまた、本明細書で記載される方法においても有利に使用される。機能的なshRNAのステムおよびループの長さは、サイレンシング活性に影響を及ぼさずに変化し、ステム長は、約25〜約30ntのいずれかの範囲であることが可能であり、ループサイズは、4〜約25ntの間の範囲であり得る。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、これらのshRNAは、DICER RNaseの二本鎖RNA(dsRNA)産物に相似し、いずれにせよ、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられる。shRNAは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。miRNAは、約10〜70ヌクレオチドの長さの一本鎖RNAであり、「ステムループ」構造を特徴とするpre−miRNAとして最初に転写され、その後、RISCを介するさらなるプロセシングの後で、成熟miRNAにプロセシングされる。
siRNAを含むがこれに限定せず、RNAiを媒介する分子は、インビトロで、化学合成(Hohjoh、FEBS Lett、521巻:195〜199頁、2002年)、dsRNAの加水分解(Yangら、Proc Natl Acad Sci USA、99巻:9942〜9947頁、2002年)、T7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写(Donzeetら、Nucleic Acids Res、30巻:e46頁、2002年;Yuら、Proc Natl Acad Sci USA、99巻:6047〜6052頁、2002年)、およびE.coli RNアーゼIIIなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖RNAの加水分解(Yangら、Proc Natl Acad Sci USA、99巻:9942〜9947頁、2002年)によって生成することができる。
別の態様に従うと、本開示は、デコイDNA、二本鎖DNA、一本鎖DNA、複合体化DNA、封入型DNA、ウイルスDNA、プラスミドDNA、ネイキッドRNA、封入型RNA、ウイルスRNA、二本鎖RNA、RNA干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、二本鎖DNA分子および一本鎖RNA分子を含む核酸分子であって、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよびActRIIBのポリペプチドなど、標的分子に特異的に結合する三次構造に結合し、これを形成する核酸分子である。当該分野では、アプタマーの生成および治療的使用が、十分に確立されている。例えば、米国特許第5,475,096号を参照されたい。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第20060148748号において見出すことができる。核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)プロセスを介して選択される。SELEXは、例えば、米国特許第5,475,096号、同第5,580,737号、同第5,567,588号、同第5,707,796号、同第5,763,177号、同第6,011,577号、および同第6,699,843号において記載されているように、標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化法である。アプタマーを同定する別のスクリーニング法は、米国特許第5,270,163号において記載されている。SELEXプロセスは、単量体であれ、多量体であれ、他の核酸分子およびポリペプチドを含め、事実上任意の化合物に対してリガンドとして作用する(特異的結合対を形成する)ヌクレオチド単量体内で利用可能な二次元構造および三次元構造ならびに化学的多様性を形成する核酸の能力に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。SELEX法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、区分、および増幅の段階的反復を伴い、同じ一般的な選択スキームを使用して、所望の結合アフィニティーおよび選択性を達成する。ランダム化された配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から始めて、SELEX法は、混合物を結合に好適な条件下で標的と接触させる工程と;非結合核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から区分する工程と;核酸−標的複合体を解離させる工程と;核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物をもたらす工程とを含む。結合させる工程と、区分する工程と、解離させる工程と、増幅する工程を、所望の回数のサイクルにわたり繰り返して、標的分子に対する高度に特異的な高アフィニティーの核酸リガンドをもたらす。
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される[例えば、O’Connor(1991年)、J. Neurochem.、56巻:560頁を参照されたい]が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる[例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.(1988年)を参照されたい]。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIAおよび/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト)のいずれも、所望の効果を達成する(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、MDSまたは鉄芽球性貧血を処置する、MDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する)ために、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト)は、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよび/またはActRIIBポリペプチド)、iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体);v)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド;ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
F.他のアンタゴニスト
F.他のアンタゴニスト
他の態様では、本明細書に開示される方法に従って使用するための作用因子は、フォリスタチンポリペプチドであり、これは、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために(例えば、輸血負荷の低減を含む)、それを必要とする対象においてMDSもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および/またはMDSもしくは鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症(例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行)を処置もしくは予防するために、および/または、それを必要とする対象においてSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、単独で、あるいは1つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子(例えば、EPO)または他の支持療法[例えば、造血成長因子(例えば、G−CSFもしくはGM−CSF)、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法]と組み合わせて使用することができる。用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体(変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む)も含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的な単量体または多量体もさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンAに結合し、かつ/またはこれらの活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンに媒介される活性化)を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持する、フォリスタチンポリペプチドの改変体は、フォリスタチンとアクチビンとの相互作用に関するかつての研究に基づき同定することができる。例えば、WO2008/030367は、アクチビンへの結合に重要であることが示されている、特異的なフォリスタチンドメイン(「FSD」)について開示している。下記の配列番号18〜20に示される通り、フォリスタチンのN末端ドメイン(「FSND」;配列番号18)、FSD2(配列番号20)は、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表し、程度は劣るが、FSD1(配列番号19)も、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表す。加えて、上記では、ActRIIポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、フォリスタチンの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。フォリスタチンポリペプチドは、任意の公知のフォリスタチン配列に由来するポリペプチドであって、フォリスタチンポリペプチドの配列に少なくとも約80%同一である配列を有し、必要に応じて、少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。フォリスタチンポリペプチドの例は、成熟フォリスタチンポリペプチド、または、例えば、WO2005/025601において記載されている、ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチド(配列番号16)の短いアイソフォームもしくは他の改変体を含む。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるFST344は、以下の通りである:
(配列番号16;NCBI参照番号NP_037541.1)
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるFST344は、以下の通りである:
シグナルペプチドに下線を付す;上記ではまた、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示される短いフォリスタチンアイソフォームであるFST317から弁別する、C末端伸長部分を表す最後の27残基にも下線を付している。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるFST317は、以下の通りである:
シグナルペプチドは下線付きである。
フォリスタチンのN末端ドメイン(FSND)配列は、以下の通りである:
FSD1配列およびFSD2配列は、以下の通りである。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるFST317は、以下の通りである:
フォリスタチンのN末端ドメイン(FSND)配列は、以下の通りである:
他の態様では、本明細書に開示される方法に従って使用するための作用因子は、フォリスタチン様関連遺伝子(FLRG)であり、フォリスタチン関連タンパク質3(FSTL3)としても公知である。用語「FLRGポリペプチド」は、FLRGの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体(変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む)も含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のFLRGポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンAに結合し、かつ/またはこれらの活性(例えば、SMAD2/3のシグナル伝達など、ActRIIAおよび/またはActRIIBのシグナル伝達の、アクチビンに媒介される活性化)を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持するFLRGポリペプチドの改変体は、FLRGとアクチビンとの相互作用についてアッセイする日常的方法を使用して同定することができる(例えば、US6,537,966を参照されたい}。加えて、上記では、ActRIIポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、FLRGの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。FLRGポリペプチドは、任意の公知のFLRG配列に由来するポリペプチドであって、FLRGポリペプチドの配列に少なくとも約80%同一である配列を有し、必要に応じて、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。
ヒトFLRG前駆体(フォリスタチン関連タンパク質3前駆体)ポリペプチドは、以下の通りである:
シグナルペプチドは下線付きである。
ヒトFLRG前駆体(フォリスタチン関連タンパク質3前駆体)ポリペプチドは、以下の通りである:
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびFLRGポリペプチドの機能的な改変体または改変形態は、フォリスタチンポリペプチドまたはFLRGポリペプチドの少なくとも一部を有する融合タンパク質と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易とするドメインなど、1つまたは複数の融合ドメインとを含む。適切な融合ドメインについては、ActRIIポリペプチドに関して、上記で詳細に論じられている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Fcドメインに融合させたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Fcドメインに融合させたFLRGポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。
本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれも、所望の効果を達成する(例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、MDSまたは鉄芽球性貧血を処置する、MDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する)ために、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるフォリスタチンポリペプチドは、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のフォリスタチンポリペプチド、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよび/またはActRIIBポリペプチド)、iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体);v)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のFLRGポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
同様に、本明細書で開示されるFLRGポリペプチドのいずれかを、本開示の1つまたは複数の追加のActRIIアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、本明細書で開示されるFLRGポリペプチドは、i)本明細書で開示される、1つもしくは複数の追加のFLRGポリペプチド、ii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよび/またはActRIIBポリペプチド)、iii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のGDFトラップ;iv)本明細書で開示される、1つもしくは複数のActRIIアンタゴニスト抗体(例えば、抗GDF11抗体、抗アクチビンB抗体、抗アクチビンC抗体、抗アクチビンE抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体、または抗ActRIIB抗体);v)本明細書で開示される、1つもしくは複数の低分子ActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数の低分子アンタゴニスト);vi)本明細書で開示される、1つもしくは複数のポリヌクレオチドのActRIIアンタゴニスト(例えば、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA、および/またはActRIIBの1つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト);ならびに/またはvii)本明細書で開示される、1つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
3.スクリーニングアッセイ
3.スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、対象のActRIIポリペプチド(例えば、ActRIIAポリペプチドおよびActRIIBポリペプチド)およびGDFトラップポリペプチドの使用であって、ActRIIBポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物(作用因子)を同定するための使用に関する。このスクリーニングを介して同定される化合物を試験して、インビボまたはインビトロにおける赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および/または網状赤血球レベルを調節するそれらの能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
ActRIIのシグナル伝達(例えば、ActRIIAおよび/またはActRIIB
SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達)を標的化することによって、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてActRII媒介性の作用を混乱させる作用因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばActRIIリガンドなど(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、Nodal、GDF8、GDF11またはBMP7)への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばActRIIリガンドなどへの結合を増強しない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドと相互作用するその能力によって同定され得る。
SMAD2/3および/またはSMAD1/5/8シグナル伝達)を標的化することによって、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてActRII媒介性の作用を混乱させる作用因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばActRIIリガンドなど(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB、アクチビンC、Nodal、GDF8、GDF11またはBMP7)への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばActRIIリガンドなどへの結合を増強しない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドと相互作用するその能力によって同定され得る。
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物(作用因子)は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物(作用因子)は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても(例えば、天然の生成物)、化学的に生成されても(例えば、ペプチド模倣物を含む低分子)、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約2000ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、必要に応じて他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製(semi−purified)されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとその結合パートナー(例えば、ActRIIリガンド)との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ActRIIBリガンドに結合し得る単離および精製されたActRIIBポリペプチドと接触させられる。その後、化合物とActRIIBポリペプチドとの混合物は、ActRIIBリガンド(例えば、GDF11)を含む組成物に加えられる。ActRIIB/ActRIIBリガンド複合体の検出および定量は、ActRIIBポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害(または助長)における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたActRIIBリガンドは、ActRIIBポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ActRIIB/ActRIIBリガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識(例えば、32P、35S、14Cまたは3H)、蛍光標識(例えば、FITC)、または、酵素標識されたActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドおよび/またはその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移(FRET)アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管(waveguide)(例えば、PCT公開WO96/26432および米国特許第5,677,196号を参照のこと)、表面プラズモン共鳴(SPR)、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
さらに、本開示は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する作用因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第5,283,317号;Zervosら(1993年)Cell 72巻:223〜232頁;Maduraら(1993年)J Biol Chem
268巻:12046〜12054頁;Bartelら(1993年)Biotechniques 14巻:920〜924頁;およびIwabuchiら(1993年)Oncogene 8巻:1693〜1696頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物(例えば、低分子またはペプチド)を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する[例えば、VidalおよびLegrain(1999年)Nucleic Acids Res 27巻:919〜29頁;VidalおよびLegrain(1999年)Trends Biotechnol 17巻:374〜81頁;ならびに米国特許第5,525,490号;同第5,955,280号;および同第5,965,368号を参照のこと]。
268巻:12046〜12054頁;Bartelら(1993年)Biotechniques 14巻:920〜924頁;およびIwabuchiら(1993年)Oncogene 8巻:1693〜1696頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物(例えば、低分子またはペプチド)を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する[例えば、VidalおよびLegrain(1999年)Nucleic Acids Res 27巻:919〜29頁;VidalおよびLegrain(1999年)Trends Biotechnol 17巻:374〜81頁;ならびに米国特許第5,525,490号;同第5,955,280号;および同第5,965,368号を参照のこと]。
特定の実施形態では、本主題の化合物は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る[例えば、Jakoby WBら(1974年)、Methods in Enzymology 46巻:1頁を参照のこと]。特定の場合には、化合物は、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ActRIIポリペプチドまたはGDFトラップポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーターシステム(例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質)と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ(例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ)が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色エンドポイントあるいは蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
4.例示的な治療的使用
4.例示的な治療的使用
ある特定の態様では本開示は、環状鉄芽球ならびに/またはSF3B1、DNMT3Aおよび/もしくはTET2遺伝子中の1つもしくは複数の変異の存在によって特徴付けられるMDSを有する患者の処置を含む、1つまたは複数のActRIIアンタゴニストで、MDSおよび鉄芽球性貧血を処置する、特にMDSの1つまたは複数のサブタイプまたは合併症を処置するまたは予防する方法を提供する。特に本開示は、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用して、例えば、貧血、好中球減少症、脾腫、輸血に対する必要、急性骨髄性白血病の進行、鉄過負荷ならびに、うっ血性心不全、心臓性不整脈、心筋梗塞、心疾患の他の形態、糖尿病、呼吸困難、肝臓疾患および鉄キレート療法の有害作用である鉄過負荷の合併症を含むMDSおよび鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置するまたは予防するための方法を提供する。
特に、本開示は、MDSのサブタイプで、例えば骨髄の赤芽球の上昇した数(過形成)を有するMDS患者;骨髄において、1%を超える、2%を超える、3%を超える、4%を超える、5%を超える、6%を超える、7%を超える、8%を超える、9%を超える、10%を超える、11%を超える、12%を超える、13%を超える、14%を超える、15%を超える、16%を超える、17%を超える、18%を超える、19%を超える、20%を超える、25%を超える、30%を超える、35%を超える、40%を超える、45%を超える、50%を超える、55%を超える、60%を超える、65%を超える、70%を超える、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超えるまたは95%を超えるの鉄芽球を有するMDS患者;環状鉄芽球を有する不応性貧血を有するMDS患者(RARS);環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を有するMDS患者(RARS−T);単一系統異形成を有する不応性血球減少症を有するMDS患者(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を有するMDS患者(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3A、またはTET2の体細胞性変異を有するMDS患者;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS患者;鉄過負荷を有するMDS患者;ならびに好中球減少を有するMDS患者で貧血または他の合併症を処置または予防するために、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
同様に特に本開示は、ActRIIアンタゴニストまたはActRIIアンタゴニストの組合せを使用して、環状鉄芽球を有する不応性貧血(RARS);環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血(RARS−T);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症(RCMD−RS);アルコール症と関連した鉄芽球性貧血;薬物性鉄芽球性貧血;銅欠乏症(亜鉛毒性)から生じる鉄芽球性貧血;低体温から生じる鉄芽球性貧血;X連鎖鉄芽球性貧血(XLSA);SLC25A38欠損;グルタレドキシン5欠損;赤芽球増殖性プロトポルフィリン症;運動失調を有するX連鎖鉄芽球性貧血(XLSA/A);B細胞免疫欠損、発熱および発達遅延を有する鉄芽球性貧血(SIFD);ピアソン髄−膵臓症候群;ミオパシー、乳酸性アシドーシスおよび鉄芽球性貧血(MLASA);チアミン応答性巨赤芽球性貧血(TRMA);ならびに原因不明の症候性/無症候性鉄芽球性貧血を含むがこれだけに限定されない、貧血または鉄芽球性貧血の他の合併症を処置または予防するための方法を提供する。
ある特定の態様では本開示は、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)などのSF3B1、DNMT3A、および/またはTET2での生殖細胞系列または体細胞変異に関連する、ならびに乳がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がんおよびぶどう膜メラノーマにおける障害または障害の合併症を処置するまたは予防する方法を提供する。ある特定の態様では障害は、SF3B1、DNMT3Aおよび/またはTET2変異について検査で陽性となった骨髄細胞、詳細には骨髄異形成症候群、CLLおよびAMLを有する対象にあってよい。必要に応じてSF3B1遺伝子中の変異は、エクソン、イントロンまたは5’もしくは3’非翻訳領域にある。必要に応じてSF3B1、DNMT3Aおよび/またはTET2中の変異は、アミノ酸配列における変化を生じるまたは遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じない。必要に応じてSF3B1遺伝子中の変異は、次の変化:K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700EおよびV701Fから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてDNMT3A遺伝子中の変異は、次の変化:R882C、R882H、P904LおよびP905Pから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてDNMT3A遺伝子中の変異は、中途終止コドンを導入する。例えば一部の実施形態では中途終止コドンを導入するDNMT3A遺伝子中の変異は、次の位置:Y436XおよびW893Xから選択される。必要に応じてTET2遺伝子中の変異は、次の変化:E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、N1387SおよびY1724Hから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてTET2遺伝子中の変異は、中途終止コドンを導入する。例えば一部の実施形態では、中途終止コドンを導入するTET2遺伝子中の変異は、次の位置:R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xから選択される。
用語「対象」、「個体」または「患者」は、明細書全体を通じて互換的に用いられ、一般に哺乳動物を指す。哺乳動物は、飼い慣らされた動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ)、霊長類(例えばヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギならびにげっ歯類(例えばマウスおよびラット)を含むがこれだけに限定されない。
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の1または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。
用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
一般に、本開示で記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト(例えば、ActRIIAおよび/またはActRIIBアンタゴニスト)を、「有効量」で投与することにより達成する。作用因子の有効量とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療結果または予防結果を達成するのに効果的な量を指す。本開示の作用因子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用因子の能力などの要因に従い変化し得る。「予防有効量」とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防結果を達成するのに効果的な量を指す。
骨髄異形成症候群(MDS)とは、骨髄性血球生成の無効および急性骨髄性白血病への転換の危険性を特徴とする血液学的障害の多様な集合である。MDS患者では、造血幹細胞が、健常な赤血球、白血球、または血小板に成熟しない。MDS障害として、例えば、不応性貧血、単一系統異形成を伴う不応性血球減少症(RCUD)、環状鉄芽球を有する不応性貧血(RARS)、顕著な血小板増加を伴い環状鉄芽球を有する不応性貧血(RARS−T)、過剰な芽球を有する不応性貧血(RAEB−1)、変形した過剰な芽球を有する不応性貧血(RAEB−2)、多系統異形成を有する不応性血球減少症(RCMD)、未分類MDS(MDS−U)、および孤発性5q染色体異常と関連する骨髄異形成症候群[del(5q)を伴うMDS]を含む。
同種幹細胞移植は、MDSのための可能性がある唯一の公知の根治療法である。しかし、高齢、医学的併存疾患および適切な幹細胞ドナーの限定的な利用可能性のために少数の患者だけがこの手順を受けている。同種幹細胞移植に進んだ患者についてでさえ、急性および慢性移植片対宿主疾患を含む重大な処置関連死亡率および罹患率ならびに高い再発率は長期間の無病生存に支障をきたす[Zeidanら、(2013年)Blood Rev 27巻:2
43〜259頁]。これらの理由のためにMDSを有する大部分の患者は、治癒目的でない治療パラダイムでまだ対処されている。処置は、生存または急性骨髄性白血病への進行を予測する予後予測因子に基づいている。低危険性MDS患者の生存率は、数ヶ月から十年を超える範囲にあり、これらの患者の大部分は、MDSの合併症に直接関連する原因で死亡する[Dayyaniら、(2010年) Cancer 116巻:2174〜2179頁]。
したがって低危険性患者のための治療戦略は、血球減少症の重症度および型ならびに予測される生存率を含む特定の患者の状況に適合される。低危険性患者は、増殖因子、del(5q)症候群の場合はレナリドミド、サリドマイド、ポマリドミド、アザシチジンまたはデシチビン(decitibine)などの低メチル化剤および潜在的治験薬での処置を含む複数の治療選択を有する。対照的に同種幹細胞移植の対象ではない高危険性MDS患者は、典型的には低メチル化剤、強化化学療法または治験薬で処置される[Garcia-Maneroら、(
2011年)29巻:516〜523頁]。
43〜259頁]。これらの理由のためにMDSを有する大部分の患者は、治癒目的でない治療パラダイムでまだ対処されている。処置は、生存または急性骨髄性白血病への進行を予測する予後予測因子に基づいている。低危険性MDS患者の生存率は、数ヶ月から十年を超える範囲にあり、これらの患者の大部分は、MDSの合併症に直接関連する原因で死亡する[Dayyaniら、(2010年) Cancer 116巻:2174〜2179頁]。
したがって低危険性患者のための治療戦略は、血球減少症の重症度および型ならびに予測される生存率を含む特定の患者の状況に適合される。低危険性患者は、増殖因子、del(5q)症候群の場合はレナリドミド、サリドマイド、ポマリドミド、アザシチジンまたはデシチビン(decitibine)などの低メチル化剤および潜在的治験薬での処置を含む複数の治療選択を有する。対照的に同種幹細胞移植の対象ではない高危険性MDS患者は、典型的には低メチル化剤、強化化学療法または治験薬で処置される[Garcia-Maneroら、(
2011年)29巻:516〜523頁]。
MDSは、造血細胞の量および質の両方における不可逆性の欠失として顕在化するので、MDS患者の大半は慢性貧血に罹患している。MDS患者のおよそ80%から90%は、彼らの疾患の経過の間に貧血を発症し、その少なくとも40%はRBC輸血依存になる[Santini(2011年)Oncologist 16巻:35〜42頁、Malcovatiら、(2005
年)J Clin Oncol 23巻:7594〜7603頁;Leitch(2011年)Blood Rev
25巻:17〜31頁]。高危険性MDS群中の患者(IPSS分類による)は、さら
に輸血依存になりやすい;例えばある研究では、高危険性範疇の患者の79%に対して低危険性患者の39%が重度の貧血を処置または予防するために慢性輸血を必要とする[Oscanら、(2013年)Expert Rev Hematol 6巻:165〜189頁]。低ヘモグロ
ビンレベルは、脳および末梢器官への酸素供給の不良を生じる;結果として、MDS患者は典型的には嗜眠、精神的敏捷性の減少、身体虚弱および集中力不足を患う。これらの症状は、健康に関する生活の質の低下に関連している。加えてヘモグロビン閾値は、MDSにおける重大な死亡率および罹患率に独立に関連している。それぞれ8g/dLおよび9g/dL未満のヘモグロビンレベルを有する女性および男性患者では、主に心臓性合併症の危険性が高まることにより死亡率および罹患率の危険性が高まる[Malcovatiら、(2
011年)Haematologica 96巻:1433〜1440頁]。低ヘモグロビンレベル、
および赤血球輸血への依存は、MDSを有する患者での低水準の心血管転帰および死亡率の増加に関連し、MDSにおける貧血の積極的管理に対する強い理論的根拠となっている[Goldbergら、(2010年)J Clin Oncol 28巻:2847〜2852頁;Leitch(2011年)Blood Rev 25巻:17〜31頁、Olivaら、(2011年)Am J Blood Res 1巻:160〜166頁、Ozcanら、(2013年)Expert Rev Hematol
6巻:165〜189頁]。
年)J Clin Oncol 23巻:7594〜7603頁;Leitch(2011年)Blood Rev
25巻:17〜31頁]。高危険性MDS群中の患者(IPSS分類による)は、さら
に輸血依存になりやすい;例えばある研究では、高危険性範疇の患者の79%に対して低危険性患者の39%が重度の貧血を処置または予防するために慢性輸血を必要とする[Oscanら、(2013年)Expert Rev Hematol 6巻:165〜189頁]。低ヘモグロ
ビンレベルは、脳および末梢器官への酸素供給の不良を生じる;結果として、MDS患者は典型的には嗜眠、精神的敏捷性の減少、身体虚弱および集中力不足を患う。これらの症状は、健康に関する生活の質の低下に関連している。加えてヘモグロビン閾値は、MDSにおける重大な死亡率および罹患率に独立に関連している。それぞれ8g/dLおよび9g/dL未満のヘモグロビンレベルを有する女性および男性患者では、主に心臓性合併症の危険性が高まることにより死亡率および罹患率の危険性が高まる[Malcovatiら、(2
011年)Haematologica 96巻:1433〜1440頁]。低ヘモグロビンレベル、
および赤血球輸血への依存は、MDSを有する患者での低水準の心血管転帰および死亡率の増加に関連し、MDSにおける貧血の積極的管理に対する強い理論的根拠となっている[Goldbergら、(2010年)J Clin Oncol 28巻:2847〜2852頁;Leitch(2011年)Blood Rev 25巻:17〜31頁、Olivaら、(2011年)Am J Blood Res 1巻:160〜166頁、Ozcanら、(2013年)Expert Rev Hematol
6巻:165〜189頁]。
MDS患者は、赤血球レベルを高めるための輸血、および/または赤血球生成増殖因子(例えばEPOなどのESA)単独またはコロニー刺激因子[例えば、フィルグラスチムなどの顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の類似体またはサルグラモスチムなどの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の類似体(GM−GSF)]と組み合わせた処置を最終的に必要とする。輸血の頻度は、疾患の程度および併存症の存在に依存する。慢性輸血はヘモグロビンレベルを高めることが公知であり、結果として脳および末梢組織の酸素供給を改善し、それにより身体的活性および精神的敏捷性を改善する。しかし多数のMDS患者は、このような療法の使用から副作用を発症する。例えば高頻度の赤血球輸血を受ける患者は、鉄蓄積および毒性反応性酸素種の生成に由来する組織および器官損傷を発症する場合がある。したがって本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者を処置できる。ある特定の実施形態ではMDSまたは鉄芽球性貧血を罹患している患者は、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して処置できる。他の実施形態ではMDSまたは鉄芽球性貧血を罹患している患者は、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)と、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ(例えばNeoRecormon)、エポエチンデルタ(例えばDynepo)、エポエチンオメガ、ダルベポエチンアルファ(例えばAranesp)、メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ(例えばMicera)および合成赤血球生成タンパク質(SEP)を含むESA;フィルグラスチムを含むG−CSF類似体;サルグラモスチムを含むGM−CSF類似体;レナリドミド;サリドマイド;ポマリドミド、アザシチジンおよびデシタビンを含む低メチル化剤;デフェロキサミン(別名デフェリオキサミンB、デフェロキサミンB、DFO−B、DFOA、DFBまたはデスフェラール)、デフェリプロン(別名Ferriprox)およびデフェラシロクス(別名ビス−ヒドロキシフェニルトリアゾール、ICL670またはExjade(商標))を含む鉄キレート化剤;ロミプロスチムおよびエルトロンボパグを含むトロンボポエチン模倣物;シタラビン(ara−C)を単独またはイダルビシン、トポテカンまたはフルダラビンと組み合わせて含む化学療法剤;抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブおよびシクロスポリンを含む免疫抑制剤;ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、MGCD0103および他のクラスI核HDAC阻害剤、クラスII非核HDAC阻害剤、pan HDAC阻害剤およびアイソフォーム特異的HDAC阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC阻害剤);ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)阻害剤;エザチオスタットを含むグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)P1−1の阻害剤;ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むCD33の阻害剤、を例えば含むMDSを処置するための1つまたは複数の追加の治療剤との組合せを使用して処置できる。
本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、貧血(MDSまたは鉄芽球性貧血)を有する患者において赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび/またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおいてヘモグロビンおよび/またはヘマトクリットレベルをモニタリングする場合、個体の変動は考慮されるが、適切な年齢および性別の範疇に応じた正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、10〜12.5g/dlであり、典型的に、約11.0g/dlのヘモグロビンレベルは、健常な成人において、正常な範囲内にあると考えられるが、治療の点では、標的レベルが低ければ、心血管副作用を引き起こす可能性は小さい。例えば、Jacobsら(2000年)、Nephrol Dial Transplant、15巻、15〜19頁を参照さ
れたい。代替的に、ヘマトクリットレベル(細胞により占有される血液試料の容量百分率)を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約41〜51%の範囲にあり、成人女性では、35〜45%の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および/もしくはヘマトクリットの標的レベルに戻す、または赤血球、ヘモグロビンおよび/またはヘマトクリットの許容可能なレベルを維持しながら赤血球輸血の低減もしくは中止を可能にすることが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび/または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
れたい。代替的に、ヘマトクリットレベル(細胞により占有される血液試料の容量百分率)を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約41〜51%の範囲にあり、成人女性では、35〜45%の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および/もしくはヘマトクリットの標的レベルに戻す、または赤血球、ヘモグロビンおよび/またはヘマトクリットの許容可能なレベルを維持しながら赤血球輸血の低減もしくは中止を可能にすることが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび/または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
好中球減少症は循環顆粒球の異常に低レベルの状態を意味し、MDS患者のおよそ40%において見出される[Steensmaら、(2006年)Mayo Clin Proc 81巻:104〜130頁]。好中球減少症を有する患者によく見られる訴えは、疲労および高頻度の細菌感染、特に皮膚を含む。しかし好中球減少症はMDSを有する患者にも深刻な合併症を生じる場合があり、感染はMDS関連死の最も一般的な原因である。顆粒球コロニー刺激因子(フィルグラスチム)での処置は、重度の好中球減少症患者について好中球数を1×109/Lより上に維持することに役立つが[Akhtari(2011年)Oncology(Williston Park)25巻:480〜486頁]、骨髄性増殖因子は病歴を明確に変更せず、殺菌能力を欠いている機能的に異常な好中球の生成を増加させるだけである場合がある[Dayyaniら、(2010年)Cancer 116巻:2174〜2179頁;Steensma(2011
年)Semin Oncol 38巻:635〜647頁]。予防的抗生物質は、MDSを有する患者において証明された役割を有さず、MDSに関連する好中球減少症を有する患者に対して推奨されない。しかしMDS患者での好中球減少性発熱は、経験的な広域スペクトルの抗生物質の即時投与およびしばしば入院加療を必要とする医学的緊急事態と見なされるべきである[Barziら、(2010年)Cleve Clin J Med 77巻:37〜44頁]。一部の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/またはG−CSFもしくはGM−CSF治療などの1つまたは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDS患者における好中球減少症を処置できる。本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDS患者での顆粒球輸血の頻度を低減できる。
年)Semin Oncol 38巻:635〜647頁]。予防的抗生物質は、MDSを有する患者において証明された役割を有さず、MDSに関連する好中球減少症を有する患者に対して推奨されない。しかしMDS患者での好中球減少性発熱は、経験的な広域スペクトルの抗生物質の即時投与およびしばしば入院加療を必要とする医学的緊急事態と見なされるべきである[Barziら、(2010年)Cleve Clin J Med 77巻:37〜44頁]。一部の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/またはG−CSFもしくはGM−CSF治療などの1つまたは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDS患者における好中球減少症を処置できる。本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDS患者での顆粒球輸血の頻度を低減できる。
赤血球または全血の高頻度の輸血を受けているMDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者は、輸血性鉄過負荷を発症する傾向があり、これは、MDSにおける輸血依存が生存可能性の低下になぜ関連するのかを一部説明できる。しかしながら、輸血依存MDS患者での鉄キレート療法の使用は、後ろ向きおよび登録データが、キレートを受けた患者がキレートを受けていない患者よりも長く生存できることを示唆しているが、キレートからの死亡率または罹患率利益を実証している前向き無作為化治験データがなく、現在認可されている作用因子が不都合である(デフェロキサミン)または多くの患者にとって高価であり、許容されにくい(デフェラシロクス)ことから議論のあるままである[Steensmaら、(2013年)Best Pract Res Clin Haematol 26巻:431〜444頁、Lyonsら、
(2014年)Leuk Res 38巻:149〜154頁]。
(2014年)Leuk Res 38巻:149〜154頁]。
一部の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者における鉄過負荷の合併症を予防または転導できる。ある特定の態様では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、例えば心拍出量の増大、心肥大、心筋症、左室肥大、急性心筋梗塞、不整脈、およびうっ血性心不全を含む鉄過負荷の心臓性合併症を予防または転導できる。ある特定の態様では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、肝臓鉄含有量を低減、ならびに/または、例えば、肝腫大(肝腫)、肝線維症(瘢痕組織の増加)および肝硬変(高度な瘢痕化)を含む鉄過負荷の肝臓合併症を予防もしくは転導できる。ある特定の態様では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、例えば糖尿病を含む鉄過負荷の内分泌合併症を予防または転導できる。
ある特定の態様では本開示のActRIIアンタゴニスト作用因子は、1つまたは複数の追加の作用因子[例えばESA;フィルグラスチムを含むG−CSF類似体;サルグラモスチムを含むGM−CSF類似体;レナリドミド;サリドマイド;ポマリドミド、アザシチジンおよびデシタビンを含む低メチル化剤;デフェロキサミンおよびデフェラシロクスを含む鉄キレート化剤;ロミプロスチムおよびエルトロンボパグを含むトロンボポエチン模倣物;シタラビン(ara−C)を単独またはイダルビシン、トポテカンまたはフルダラビンと組み合わせて含む化学療法薬;抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブおよびシクロスポリンを含む免疫抑制剤;ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、MGCD0103および他のクラスI核HDAC阻害剤、クラスII非核HDAC阻害剤、pan HDAC阻害剤およびアイソフォーム特異的HDAC阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC阻害剤);ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)阻害剤;エザチオスタットを含むグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)P1−1の阻害剤;ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むCD33の阻害剤]または支持療法[例えば、赤血球輸血、顆粒球輸血、トロンボサイト(血小板)輸血]と組み合わせて、MDSおよび鉄芽球性貧血またはMDSおよび鉄芽球性貧血の1つもしくは複数の合併症を処置するためにそれを必要とする対象に投与され得る。
本明細書で使用する場合、「〜と組み合わせて」または「併用投与」とは、追加療法(例えば第2の、第3の、第4の、など)が、体内でなおも効果的である(例えば、複数の化合物が、患者において同時に効果的であり、これはこれらの化合物の相乗効果を含み得る)ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合もある。。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤において投与することもでき、別個の製剤において、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組み合わせ効果から利益を得ることができる。本開示の1つまたは複数のGDF11および/またはアクチビンBアンタゴニスト作用因子(必要に応じて、GDF8、アクチビンA、アクチビンC、アクチビンEおよびBMP6のうちの1つまたは複数のさらなるアンタゴニスト)は、1つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および/または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて利用する特定の組み合わせは、本開示のアンタゴニストの、治療および/または達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。
ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップ、抗体など)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者における貧血を処置するために赤血球または全血のいずれかの輸血と組み合わされ得る。全血または赤血球の高頻度の輸血を受けている患者では、鉄ホメオスタシスの正常な機構が、圧伏される場合があり、心臓、肝臓、および内分泌腺などの死活的組織内の、毒性であり、潜在的に致死性である鉄の蓄積を最終的にもたらす。定期的な赤血球輸血は、種々のドナー単位の血液への曝露を要請し、よって、同種免疫の危険性が高い。血管アクセスの困難、鉄キレート化剤の入手可能性および服薬遵守、ならびに高額な費用は、赤血球の輸血回数を限定することが有益であり得るという理由の一部である。一部の実施形態では、本開示の方法は、本開示のActRIIアンタゴニストと、1つまたは複数の血液細胞による輸血との組合せを投与することにより、それを必要とする対象においてMDSまたは鉄芽球性貧血を処置することに関する。一部の実施形態では、本開示の方法は、本開示のActRIIアンタゴニストと、1つまたは複数の赤血球輸血との組合せを投与することにより、それを必要とする対象においてMDSまたは鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防することに関する。一部の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニストによる処置は、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者における輸血に対する必要を減殺するのに有効であり、例えば、MDSまたは鉄芽球性貧血またはそれらの1つもしくは複数の合併症を有効に処置するのに必要とされる輸血の頻度および/または量を低減する。
ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、尿および/または糞便中の鉄排出を促進し、これによりMDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者における組織鉄過負荷を予防するまたは転導するための1つまたは複数の鉄キレート分子と組み合わせることができる。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒生成を通じて大半の鉄毒性の主因となる可能性が高い、非トランスフェリン結合鉄の酸化形態である第二鉄に選択的に結合し、これを中和することが可能であるべきである[例えば、Espositoら、(2003年)Blood 102巻:2670〜2677頁を参照されたい]。これらの作用因子は構造的
に多様であるが、全てが、八面体の中和配位複合体を形成することが可能な酸素供与原子または窒素供与原子を保有し、個々の鉄原子は1:1(六座配位剤)、2:1(三座配位)または3:1(二座配位)の化学量論である[Kalinowskiら、(2005年)Pharmacol Rev 57巻:547〜583頁]。一般に、効果的な鉄キレート化剤は、比較的低分子量(例えば700ダルトン未満)であり、水中および脂質中のいずれにおいても罹患組織への接触を可能にする可溶性を有する。鉄キレート分子の具体例は、毎日の非経口投与を要する、細菌由来の六座配位剤である、デフェロキサミンならびに経***性合成作用因子であるデフェリプロン(二座配位)およびデフェラシロクス(三座配位)を含む。2つの鉄キレート化剤の同日投与からなる組合せ療法は、キレート化単剤療法に対して応答性でない患者において有望であり、またデフェロキサミン単剤対する患者の服薬遵守不良の課題の克服においても有望である[Caoら、(2011年)Pediatr Rep 3巻(2号)
:e17およびGalanelloら、(2010年)Ann NY Acad Sci 1202巻:79〜
86頁]。
に多様であるが、全てが、八面体の中和配位複合体を形成することが可能な酸素供与原子または窒素供与原子を保有し、個々の鉄原子は1:1(六座配位剤)、2:1(三座配位)または3:1(二座配位)の化学量論である[Kalinowskiら、(2005年)Pharmacol Rev 57巻:547〜583頁]。一般に、効果的な鉄キレート化剤は、比較的低分子量(例えば700ダルトン未満)であり、水中および脂質中のいずれにおいても罹患組織への接触を可能にする可溶性を有する。鉄キレート分子の具体例は、毎日の非経口投与を要する、細菌由来の六座配位剤である、デフェロキサミンならびに経***性合成作用因子であるデフェリプロン(二座配位)およびデフェラシロクス(三座配位)を含む。2つの鉄キレート化剤の同日投与からなる組合せ療法は、キレート化単剤療法に対して応答性でない患者において有望であり、またデフェロキサミン単剤対する患者の服薬遵守不良の課題の克服においても有望である[Caoら、(2011年)Pediatr Rep 3巻(2号)
:e17およびGalanelloら、(2010年)Ann NY Acad Sci 1202巻:79〜
86頁]。
本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じて、EPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者において赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および/またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおけるヘモグロビンレベルおよび/またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体の変動は考慮されるが、適切な年齢および性別の範疇に応じた正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、10〜12.5g/dlであり、典型的に、約11.0g/dlのヘモグロビンレベルは、健常な成人において、正常な範囲内にあると考えられるが、治療の点では、標的レベルが低ければ、心血管副作用を引き起こす可能性は小さい。例えば、Jacobsら(2000年)、Nephrol Dial Transplant、15巻、15〜19頁を参照された
い。代替的に、ヘマトクリットレベル(細胞により占有される血液試料の容量百分率)を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約41〜51%の範囲にあり、成人女性では、35〜45%の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットの標的レベルに戻すことが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび/または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
い。代替的に、ヘマトクリットレベル(細胞により占有される血液試料の容量百分率)を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約41〜51%の範囲にあり、成人女性では、35〜45%の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットの標的レベルに戻すことが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび/または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、EPO受容体活性化因子および/または貧血を処置するための1つまたは複数の追加の療法と組み合わせて使用され得る。MDSを有する一部の患者での最適以下のエリスロポエチン応答はESAでMDS関連貧血を処置することについての1つの生物学的根拠と考えられている[Greenbergら、(2011年)J Natl Compr Canc Netw 9巻:30〜56頁、Santini(2012年)Semin Hematol 49巻:295〜303頁]。MDS関連貧血における使用についてFDAによって認可されていないにも関わらず、ESAは臨床で広く使用され、MDSのために最も一般的に使用されている治療である[Casadevallら、(2004年)Blood 104巻:321〜327頁、Greenbergら、(2009年)Blood 114巻:2393〜2400頁]。2001年から
2005年の間の連結されたSEER−Medicareデータの分析は、MDSを有するメディケア受益者の62%がESAを受けたことを見出した[Davidoffら、(2013年)Leuk Res 37巻:675〜680頁]。Greenbergら、(2009年)Blood 1
14巻:2393〜2400頁]。一部の前臨床および臨床研究は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)がESAと相乗効果を有し、少ない用量のG−CSFが、一部の患者、特にRARSを有する者において、最初に、または応答を欠いている場合にはESA治療全体に対してのいずれかで赤血球応答を改善するために試みられ得ることを示唆した[Negrinら、(1996年)Blood 87巻:4076〜4081頁]。さらに低危険性M
DSおよび低レベルの血清EPO(<200〜500mU/mL)を有する患者ならびに低いRBC輸血に対する要求性を有する者(<2単位/月)は、ESAで赤血球応答を達成する高い蓋然性を有する[Hellstrom-Lindbergら、(2003年)Br J Haematol
120巻:1037〜1046頁、Parkら、(2008年)111巻:574〜582頁]。したがって、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、顆粒球コロニー刺激因子(例えば、フィルグラスチム)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(例えば、サルグラモスチム)と組み合わせて、貧血を処置するために使用され得る。
2005年の間の連結されたSEER−Medicareデータの分析は、MDSを有するメディケア受益者の62%がESAを受けたことを見出した[Davidoffら、(2013年)Leuk Res 37巻:675〜680頁]。Greenbergら、(2009年)Blood 1
14巻:2393〜2400頁]。一部の前臨床および臨床研究は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)がESAと相乗効果を有し、少ない用量のG−CSFが、一部の患者、特にRARSを有する者において、最初に、または応答を欠いている場合にはESA治療全体に対してのいずれかで赤血球応答を改善するために試みられ得ることを示唆した[Negrinら、(1996年)Blood 87巻:4076〜4081頁]。さらに低危険性M
DSおよび低レベルの血清EPO(<200〜500mU/mL)を有する患者ならびに低いRBC輸血に対する要求性を有する者(<2単位/月)は、ESAで赤血球応答を達成する高い蓋然性を有する[Hellstrom-Lindbergら、(2003年)Br J Haematol
120巻:1037〜1046頁、Parkら、(2008年)111巻:574〜582頁]。したがって、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、顆粒球コロニー刺激因子(例えば、フィルグラスチム)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(例えば、サルグラモスチム)と組み合わせて、貧血を処置するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする個体において、個体に、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)、ならびにEPO受容体活性化因子の治療有効量を投与することにより、貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を、EPO受容体活性化因子と組み合わせて使用して、ESAの有害作用に感受性である患者において、これらの活性化因子の必要とされる用量を低減することができる。これらの方法は、患者の治療処理および予防処置のために使用することができる。
本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、EPO受容体活性化因子と組み合わせて赤血球の増加を、特に低用量範囲で達成するように、使用できる。これは、高用量のEPO受容体活性化因子と関連する、公知のオフターゲット効果および危険性を低減するのに有益であり得る。ESAの主要な有害作用は、例えば、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および多血症を含む。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧症(より特定すれば、高血圧症の悪化)および血管内血栓症をもたらし得る。報告されている他のESAの有害作用であって、それらの一部が高血圧症と関連する有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、および血栓症に起因する脳痙攣、高血圧性脳症、および赤血球無形成である。例えば、Singibarti(1994年)、J. Clin Investig、72巻(補遺6号):S36〜S43頁;Horlら(2000年)、Nephrol Dial Transplant、15巻(補遺4号):51〜56頁;Delantyら(1997年)、Neurology、49巻、686〜689頁;およびBunn(2002年)、N Engl J Med、346巻(7号)、522〜523頁を参照されたい。
本開示のアンタゴニストが、ESAとは異なる機構で作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ESAまたは他のEPO受容体アクチベーターに十分に応答しない患者における赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、本開示のActRIIアンタゴニストは、通常用量〜増量用量(>300IU/kg/週)のESAの投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者に有益であり得る。不適切なESA応答を有する患者は、全てのタイプの貧血において見られるが、より多い数の不応者が、がんを有する患者および末期の腎疾患を有する患者において特に頻繁に観察されている。ESAに対する不適切な応答は、構成的(ESAでの最初の処置の際に観察される)、または後天的(ESAでの反復処置の際に観察される)のいずれかであり得る。
レナリドミドは、del5qを伴う低危険性MDSおよび輸血依存貧血を有する患者に対して認可されているサリドマイド誘導体である。ポマリドミドは別のサリドマイド誘導体である。米国でのレナリドミドの認可は、検査された患者の約3分の2で輸血非依存が達成され、輸血非依存の平均持続期間が2.2年間であった第2相試験の結果に基づいている[Listら、(2006年)N Engl J Med 355巻:1456〜1465頁]。
欧州でも続いて認可され[Giagounidisら、(2014年)Eur J Haematol 93巻:
429〜438頁]、レナリドミドはdel5qを伴う低危険性MDSおよび貧血を有する患者に対する第1選択治療と考えられている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSを有する患者を処置するためのレナリドミドと組み合わせることができる。
欧州でも続いて認可され[Giagounidisら、(2014年)Eur J Haematol 93巻:
429〜438頁]、レナリドミドはdel5qを伴う低危険性MDSおよび貧血を有する患者に対する第1選択治療と考えられている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSを有する患者を処置するためのレナリドミドと組み合わせることができる。
異常なDNAメチル化は、MDSにおける予後不良特性である[Shenら、(2010年)J Clin Oncol 28巻:605〜613頁]。アザシチジンおよびデシタビンは、主に高危険性MDSを有する患者を処置するために現在使用されているDNA低メチル化活性を有する2個の作用因子である[Kantarjianら、(2007年)Cancer 109巻:1133〜1137頁、Fenauxら、(2009年)Lancet Oncol 10巻:223〜23
2頁]。それらの治療効果の根底にある機構が不明確であることから、これらの作用因子はそれらの化学的構造(アザヌクレオシド)または公知のin vitro活性(DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤)によって場合によって分類される。低危険性MDSにおいてアザシチジンおよびデシタビン治療はあまり経験がないが、研究はアザシチジンおよびデシタビンが低危険性MDSを有するESA抵抗性患者の30%から40%において赤血球応答を生成できることを指し示す[Lyonsら、(2009年)J Clin Oncol 2
7巻:1850〜1856頁]。血小板応答も血小板減少性の患者において観察される。これらの結果に基づいてアザシチジンおよびデシタビンは、症候性血球減少症を有する低危険性MDSの処置について米国において認可されている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせてActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSを有する患者を処置するためにアザシチジン、デシタビンまたは別のDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤と組み合わせることができる。
2頁]。それらの治療効果の根底にある機構が不明確であることから、これらの作用因子はそれらの化学的構造(アザヌクレオシド)または公知のin vitro活性(DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤)によって場合によって分類される。低危険性MDSにおいてアザシチジンおよびデシタビン治療はあまり経験がないが、研究はアザシチジンおよびデシタビンが低危険性MDSを有するESA抵抗性患者の30%から40%において赤血球応答を生成できることを指し示す[Lyonsら、(2009年)J Clin Oncol 2
7巻:1850〜1856頁]。血小板応答も血小板減少性の患者において観察される。これらの結果に基づいてアザシチジンおよびデシタビンは、症候性血球減少症を有する低危険性MDSの処置について米国において認可されている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせてActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSを有する患者を処置するためにアザシチジン、デシタビンまたは別のDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤と組み合わせることができる。
血小板減少症は、MDS患者のおよそ35%から45%において生じ、皮下出血しやすさまたは高頻度の軽度の粘膜皮膚出血を訴える場合があり、紫斑または点状出血を示す場合がある[Steensmaら、(2006年)Mayo Clin Proc 81巻:104〜130頁]。さらに極端な場合では、消化管出血または頭蓋内出血の危険性の高まりが生じる場合がある。血小板減少性の患者のために血小板輸血は、典型的には血小板レベルが血小板10,000個/μL未満に降下した場合に指し示される[Slichter(2007年)Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007年:172〜178頁]。血小板輸血
の支持的使用は、一過的であり、慢性的な輸血依存MDS患者では感作頻度のために必ずしも有効ではない。MDSの治療において血小板生成活性を有する増殖因子を使用することに相当な関心がある。ロミプロスチムおよびエルトロンボパグは、特発性血小板減少性紫斑病を有する患者について米国において認可されたトロンボミメティック(thrombomimetic)作用因子であり、ロミプロスチムはMDSを有する患者において広範に研究されている[Kantarjianら、(2010年)J Clin Oncol 28巻:437〜444頁、Santini(2012年)Semin Hematol 49巻:295〜303頁]。単一
作用因子として使用される場合、ロミプロスチムは血小板減少症を伴う低危険性MDSを有する患者のおよそ50%において血小板数を顕著に改善できる。しかし、場合によって20%を超える骨髄芽球百分率における一過的増加が15%の患者において観察でき、MDSにおける芽球細胞でのトロンボポエチン受容体の存在と整合する。ロミプロスチムもアザシチジン、デシタビンまたはレナリドミド、サリドマイドまたはポマリドミドを受けているMDSを有する患者において血小板減少症および/または血小板輸血を顕著に低減でき、これらの処置への重要な補助剤になり得る[Kantarjianら、(2010年)Blood
116巻:3163〜3170頁]。エルトロンボパグもMDSにおいて開発されている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者を処置するためにロミプロスチムまたはエルトロンボパグなどのトロンボミメティック作用因子と組み合わせることができる。
の支持的使用は、一過的であり、慢性的な輸血依存MDS患者では感作頻度のために必ずしも有効ではない。MDSの治療において血小板生成活性を有する増殖因子を使用することに相当な関心がある。ロミプロスチムおよびエルトロンボパグは、特発性血小板減少性紫斑病を有する患者について米国において認可されたトロンボミメティック(thrombomimetic)作用因子であり、ロミプロスチムはMDSを有する患者において広範に研究されている[Kantarjianら、(2010年)J Clin Oncol 28巻:437〜444頁、Santini(2012年)Semin Hematol 49巻:295〜303頁]。単一
作用因子として使用される場合、ロミプロスチムは血小板減少症を伴う低危険性MDSを有する患者のおよそ50%において血小板数を顕著に改善できる。しかし、場合によって20%を超える骨髄芽球百分率における一過的増加が15%の患者において観察でき、MDSにおける芽球細胞でのトロンボポエチン受容体の存在と整合する。ロミプロスチムもアザシチジン、デシタビンまたはレナリドミド、サリドマイドまたはポマリドミドを受けているMDSを有する患者において血小板減少症および/または血小板輸血を顕著に低減でき、これらの処置への重要な補助剤になり得る[Kantarjianら、(2010年)Blood
116巻:3163〜3170頁]。エルトロンボパグもMDSにおいて開発されている。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血を有する患者を処置するためにロミプロスチムまたはエルトロンボパグなどのトロンボミメティック作用因子と組み合わせることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSまたは鉄芽球性貧血、特に鉄過負荷に関連する合併症を有する患者を処置するためのヘプシジン、ヘプシジン類似体またはヘプシジン受容体活性化因子と組み合わせることができる。主に肝臓で生成される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞、およびマクロファージに局在化する鉄排出タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導するその能力のために、鉄代謝の主要な調節因子であると考えられている。大まかに述べると、ヘプシジンは、細胞外における鉄の利用可能性を低減するので、ヘプシジン、ヘプシジン類似体またはヘプシジン受容体活性化因子は、MDSまたは鉄芽球性貧血、特に鉄過負荷に関連する合併症を有する患者の処置において有益であり得る。
MDSのための治験薬は開発中である。これらは免疫抑制性に基づく治療のための基準に合致する患者のためのヒストン脱アセチル化酵素の単一作用因子阻害剤、p38MAPK阻害剤、グルタチオンS−トランスフェラーゼπ阻害剤およびアレムツズマブを含む[Garcia-Maneroら、(2011年)J Clin Oncol 29巻:516〜523頁]。例え
ば高い応答率は、抗胸腺細胞グロブリンまたはアレムツズマブを組み込んでいる免疫抑制性治療で処置されたMDS患者において報告された[Sloandら、(2010年)J Clin
Oncol 28巻:5166〜5173頁]。しかしこのような患者は、一般に若く、全
体的にMDS患者よりも正常な核形を有する頻度が高く、これらの結果の一般化可能性を限定する。治験治療は、例えば、ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、MGCD0103および他のクラスI核HDAC阻害剤、クラスII非核HDAC阻害剤、pan HDAC阻害剤およびアイソフォーム特異的HDAC阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC阻害剤);ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)阻害剤;エザチオスタットを含むグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)P1−1の阻害剤;ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むCD33の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSのためのこれらの治験治療の1つまたは複数と組み合わせることができる。
ば高い応答率は、抗胸腺細胞グロブリンまたはアレムツズマブを組み込んでいる免疫抑制性治療で処置されたMDS患者において報告された[Sloandら、(2010年)J Clin
Oncol 28巻:5166〜5173頁]。しかしこのような患者は、一般に若く、全
体的にMDS患者よりも正常な核形を有する頻度が高く、これらの結果の一般化可能性を限定する。治験治療は、例えば、ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、MGCD0103および他のクラスI核HDAC阻害剤、クラスII非核HDAC阻害剤、pan HDAC阻害剤およびアイソフォーム特異的HDAC阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC阻害剤);ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)阻害剤;エザチオスタットを含むグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)P1−1の阻害剤;ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むCD33の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子および/または1つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、MDSのためのこれらの治験治療の1つまたは複数と組み合わせることができる。
証拠の増加は、異なる作用機構を有するMDS治療剤との組合せ使用が副作用の減少、全体的な生存率の改善および急性骨髄性白血病への進行の遅延の形態で実質的な利益を提供することを示唆する。複数の研究は、伝統的単剤療法と比較した場合、重複しない作用機構および毒性を有する種々の薬物療法と組み合わせることはMDS患者に顕著な利益を生じ得ることを指し示す。増殖因子、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および免疫抑制処置との種々の組合せ療法は、有望なデータを提供している[Ornsteinら、(2012年)Int J Hematol 95巻:26〜33頁]。
したがって、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、増殖因子、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤または免疫抑制剤処置を含むがこれだけに限定されない2つまたはそれ超の作用因子の組合せで加えて処置されたMDS患者において赤血球の数を高めることができる。
したがって、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えばGDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)であって、必要に応じてEPO受容体活性化因子と組み合わせたActRIIアンタゴニスト作用因子を使用して、増殖因子、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤または免疫抑制剤処置を含むがこれだけに限定されない2つまたはそれ超の作用因子の組合せで加えて処置されたMDS患者において赤血球の数を高めることができる。
特定の実施形態では、本開示は、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置されているか、または処置される候補の患者を、その患者における1つまたは複数の血液学的パラメータを測定することによって管理するための方法を提供する。血液学的パラメータは、本開示のアンタゴニストを用いた処置の候補である患者に対する適切な投薬を評価するため、処置中に血液学的パラメータをモニタリングするため、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中に投薬量を調節するかどうかを評価するため、および/または本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用され得る。1つまたは複数の血液学的パラメータが正常レベルの外側である場合、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いた投薬は減少、延期または終了され得る。
本明細書中で提供される方法に従って測定され得る血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、貯蔵鉄、および、当該分野で認識されている方法を使用する、赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。そのようなパラメータは、患者からの血液試料を使用して決定され得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および/またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の上昇が引き起こされ得る。
一実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置される候補である患者において、1つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入によってのいずれかで正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの投与の開始が延期され得る。例えば、候補の患者が高血圧または前高血圧である場合、そのときは、患者は、患者の血圧を低下させるために血圧降下剤を用いて処置され得る。個々の患者の状態に適した任意の血圧降下剤が使用され得、例えば、利尿薬、アドレナリンインヒビター(アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む)、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素(ACE)インヒビター、またはアンジオテンシンII受容体遮断薬が挙げられる。血圧は、食事および運動レジメンを使用して代替的に処置され得る。同様に、候補の患者が正常よりも低いか、または正常の低値側の貯蔵鉄を有する場合、そのときは、患者は、患者の貯蔵鉄が正常または許容されるレベルに戻るまで、適切な食事および/または鉄サプリメントのレジメンを用いて処置され得る。正常よりも高い赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを有する患者に対して、そのときは、そのレベルが正常または許容されるレベルに戻るまで本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの投与が延期され得る。
特定の実施形態では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置される候補である患者において、1つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、投与の開始が延期されないことがある。しかし、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの投薬量または投薬の頻度は、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストが投与されると上昇する血液学的パラメータの許容されない増加リスクを低下させる量に設定され得る。あるいは、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)と、望ましくないレベルの血液学的パラメータに対処する治療剤を組み合わせた治療レジメンが患者のために開発され得る。例えば、患者の血圧が上昇している場合、治療レジメンは、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)および血圧降下剤の投与を含めて設計され得る。所望より低い貯蔵鉄を有する患者について、治療レジメンは、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)および鉄の補給を含めて開発され得る。
一実施形態では、1つまたは複数の血液学的パラメータについてのベースラインパラメータは、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置される候補である患者に対して確立され得、適切な投薬レジメンが、ベースライン値に基づいて患者に対して確立される。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメータが、患者に対して適切なアンタゴニスト投薬レジメンを通知するために使用され得る。例えば、健康な患者が、規定の正常範囲を超える確立された血圧のベースライン数値を有する場合、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置の前に、その患者の血圧を一般集団について正常だとみなされる範囲に至らせる必要がないことがあり得る。患者の、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いた処置前の1つまたは複数の血液学的パラメータのベースライン値は、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中の、血液学的パラメータの任意の変化をモニタリングするための関連性のある比較値としても使用され得る。
特定の実施形態では、1つまたは複数の血液学的パラメータは、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置されている患者において測定される。血液学的パラメータは、処置中の患者をモニタリングし、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬または別の治療剤を用いた追加の投薬の調節または終了を可能にするために使用され得る。例えば、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)の投与によって血圧、赤血球レベル、またはヘモグロビンレベルが上昇したか、または貯蔵鉄が減少した場合、そのときは、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの用量は、1つまたは複数の血液学的パラメータに対する本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの作用を減少させるために、その量または頻度が減少され得る。本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)の投与によって、患者にとって不都合な1つまたは複数の血液学的パラメータの変化が生じた場合、そのときは、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの投薬は、一時的に、血液学的パラメータが許容されるレベルに戻るまでか、または永久に、のいずれかで終了され得る。同様に、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストの投与の用量または頻度を減らした後、1つまたは複数の血液学的パラメータが許容される範囲内に至らない場合、そのときは、投薬は終了され得る。本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を減らすかまたは終了する代わりに、またはそれに加えて、患者は、血液学的パラメータの望ましくないレベルに対処する追加の治療剤、例えば、血圧降下剤または鉄のサプリメントなどが投薬され得る。例えば、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)を用いて処置されている患者の血圧が上昇している場合、そのときは、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は同じレベルで継続され得、および処置レジメンに血圧降下剤が追加されるか、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は減らされ得(例えば、量および/または頻度について)、および処置レジメンに血液降下剤が追加されるか、または、本開示の1つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は終了され得、および患者は血圧降下剤を用いて処置され得る。
(6.薬学的組成物)
ある特定の態様では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、単独で投与することもでき、医薬製剤(治療用組成物または薬学的組成物とも称される)の成分として投与することもできる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分(例えば、本開示の作用因子)の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題のは、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の1つまたは複数の作用物質は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および/または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な作用因子であって、必要に応じて、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の作用物質と組み合わせて投与することができる。
ある特定の態様では、本開示の1つまたは複数のActRIIアンタゴニスト作用因子(例えば、GDF−ActRIIアンタゴニスト、ActRIIAポリペプチド、ActRIIBポリペプチド、GDFトラップなど)は、単独で投与することもでき、医薬製剤(治療用組成物または薬学的組成物とも称される)の成分として投与することもできる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分(例えば、本開示の作用因子)の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題のは、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の1つまたは複数の作用物質は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および/または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な作用因子であって、必要に応じて、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の作用物質と組み合わせて投与することができる。
典型的には、化合物は、非経口投与される[例えば、静脈内(I.V.)注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により]。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の1つまたは複数の作用物質を、1つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、植物油(例えば、オリーブ油)、注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料(例えば、レシチン)の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから薬学的組成物を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、薬学的組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位(例えば、骨髄または筋肉)へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位(例えば、骨髄または筋肉)に本開示の1つまたは複数の作用因子を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の1つまたは複数の作用因子の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの1つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの(例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる)である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの(例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる)である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ(例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム)から構成され得る。バイオセラミクスは、組成物(例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸)中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの1つまたは複数を変更するように加工され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、各々が、所定量の、本開示の化合物と、必要に応じて、1つまたは複数の他の有効成分とを含有する、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤(スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する)、散剤、顆粒剤、水性または非水性液体中の溶剤または懸濁剤、水中油または油中水の液体エマルジョン、エリキシル剤またはシロップ剤、または香錠(ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する)、かつ/またはマウスウォッシュの形態で経口投与することができる。本開示の化合物と、必要に応じて、1つまたは複数の他の有効成分とはまた、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤としても投与することができる。
経口投与のための固体投薬形態(例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤)において、本開示の1または複数の化合物は、1または複数の薬学的に受容可能なキャリア(例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤(例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸)、結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア)、湿潤剤(例えば、グリセロール)、崩壊剤(例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム)、溶液抑制因子(solution retarding agent)(例えば、パラフィン)、吸収加速剤(例えば、四級アンモニウム化合物)、加湿剤(例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール)、吸着剤(例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ)、潤滑剤(例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、着色剤およびこれらの混合物を含む)と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤(組成物)はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、1つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
薬学的組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤(例えば、水または他の溶媒が挙げられる)、可溶化剤および/または乳化剤[例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、油(例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物]を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、トラガント、およびこれらの組み合わせを含む懸濁剤を含有し得る。
微生物の作用および/または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
投薬レジメンは、本開示の1つまたは複数の作用因子の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられるがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの1つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の1つまたは複数の作用物質のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち1つまたは複数を有する細胞または組織中に作用因子配列を導入することによってその治療作用を達成する。作用因子配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の1つまたは複数の作用因子配列の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、RNAウイルス(例えば、レトロウイルス)が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベーマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺癌ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の1つまたは複数の作用因子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子(gag、polおよびenv)をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
本開示の1つまたは複数の作用因子のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系(水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む)が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。RNA、DNAおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る[例えば、Fraleyら(1981年)、Trends Biochem. Sci.、6巻:77頁を参照のこと]。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である[例えば、Manninoら(1988年)、Biotechniques、6巻:682頁、1988を参照のこと]。
リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせであり、ステロイド(例えば、コレステロール)を含み得る。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物(例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドまたはガングリオシド)、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
(実施例)
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
(実施例1)
ActRIIa−Fc融合タンパク質
本出願人らは、間に最小限のリンカーを有する、ヒトActRIIaの細胞外ドメインを、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた、可溶性ActRIIA融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ActRIIA−hFcおよびActRIIA−mFcと呼ぶ。
CHO細胞株から精製されたActRIIA−hFcを、下記(配列番号22)に示す。
ActRIIA−hFcタンパク質およびActRIIA−mFcタンパク質は、CHO細胞株内で発現させた。
3つの異なるリーダー配列:
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(配列番号25)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
ActRIIa−Fc融合タンパク質
本出願人らは、間に最小限のリンカーを有する、ヒトActRIIaの細胞外ドメインを、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた、可溶性ActRIIA融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ActRIIA−hFcおよびActRIIA−mFcと呼ぶ。
CHO細胞株から精製されたActRIIA−hFcを、下記(配列番号22)に示す。
3つの異なるリーダー配列:
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(配列番号25)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
ActRIIA−hFcおよびActRIIA−mFcはいずれも、組換え発現に目覚ましく適した。図3において示される通り、タンパク質は、タンパク質の、単一で十分に明確なピークとして精製した。N末端のシーケンシングにより、−ILGRSETQE(配列番号34)の単一の配列を明らかにした。精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下:プロテインAクロマトグラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの3つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。ActRIIA−hFcタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定されるように、>98%の純度まで精製し、SDS PAGEにより決定されるように、>95%の純度まで精製した。
ActRIIA−hFcおよびActRIIA−mFcは、リガンド、特に、アクチビンAに対する高アフィニティーを示した。GDF−11またはアクチビンAは、標準的なアミンカップリング手順を使用して、Biacore(商標)CM5チップ上に固定化した。ActRIIA−hFcタンパク質およびActRIIA−mFcタンパク質を、システム上にロードし、結合を測定した。ActRIIA−hFcは、アクチビンに、5×10−12の解離定数(KD)で結合し、GDF11に、9.96×10−9のKDで結合した。図4を参照されたい。ActRIIA−mFcも同様に挙動した。
ActRIIA−hFcは、薬物動態研究において極めて安定であった。ラットに、1mg/kg、3mg/kg、または10mg/kgのActRIIA−hFcタンパク質を投薬し、24、48、72、144、および168時間で、タンパク質の血漿レベルを測定した。別個の研究では、ラットに、1mg/kg、10mg/kg、または30mg/kgで投薬した。ラットでは、ActRIIA−hFcの血清半減期は、11〜14日間であり、薬物の循環レベルは、2週間後においても極めて高かった(1mg/kg、10mg/kg、または30mg/kgの初回投与について、それぞれ、11μg/ml、110μg/ml、または304μg/ml)。カニクイザルでは、血漿半減期は、実質的に14日間を超え、薬物の循環レベルは、1mg/kg、10mg/kg、または30mg/kgの初回投与について、それぞれ、25μg/ml、304μg/ml、または1440μg/mlであった。
(実施例2)
ActRIIA−hFcタンパク質の特徴付け
ActRIIA−hFc融合タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたCHO−DUKX B11細胞内で、pAID4ベクター(SV40 ori/エンハンサー、CMVプロモーター)から、配列番号9の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して発現させた。上記の実施例1で記載した通りに精製されたタンパク質は、配列番号22の配列を有した。Fc部分は、配列番号22において示される、ヒトIgG1のFc配列である。タンパク質解析は、ActRIIA−hFc融合タンパク質は、ジスルフィド結合によるホモ二量体として形成されることを明らかにする。
ActRIIA−hFcタンパク質の特徴付け
ActRIIA−hFc融合タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたCHO−DUKX B11細胞内で、pAID4ベクター(SV40 ori/エンハンサー、CMVプロモーター)から、配列番号9の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して発現させた。上記の実施例1で記載した通りに精製されたタンパク質は、配列番号22の配列を有した。Fc部分は、配列番号22において示される、ヒトIgG1のFc配列である。タンパク質解析は、ActRIIA−hFc融合タンパク質は、ジスルフィド結合によるホモ二量体として形成されることを明らかにする。
CHO細胞により発現された物質は、ヒト293細胞において発現されたActRIIa−hFc融合タンパク質について報告されたものよりもアクチビンBリガンドに対してより高い親和性を有する[del Reら、(2004年)J Biol Chem. 279巻(51
号):53126〜53135頁を参照されたい]。さらにTPAリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりもより大きな生成を提供し、天然リーダーで発現されたActRIIA−Fcと異なり高純度のN末端配列を提供した。天然リーダー配列の使用は、それぞれ異なるN末端配列を有するActRIIA−Fcの2つの主な分子種をもたらした。
号):53126〜53135頁を参照されたい]。さらにTPAリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりもより大きな生成を提供し、天然リーダーで発現されたActRIIA−Fcと異なり高純度のN末端配列を提供した。天然リーダー配列の使用は、それぞれ異なるN末端配列を有するActRIIA−Fcの2つの主な分子種をもたらした。
(実施例3)
ActRIIA−hFcは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
研究では、各々、雄カニクイザル5匹および雌カニクイザル5匹ずつによる4つの群を使用し、群当たり性別当たり3匹ずつを、29日目に終了するようにスケジュールにし、群当たり性別当たり2匹ずつを、57日目に終了するようにスケジュールにした。各動物に、1、8、15、および22日目において、静脈内(IV)注射を介して、ビヒクル(群1)または1、10、もしくは30mg/kg(それぞれ、群2、3、および4)の用量のActRIIA−Fcを投与した。投薬容量は、3mL/kgで維持した。赤血球レベルの種々の尺度は、初回投与の2日前、ならびに初回投与後15、29、および57日目(残りの2匹の動物について)に評価した。
ActRIIA−hFcは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
研究では、各々、雄カニクイザル5匹および雌カニクイザル5匹ずつによる4つの群を使用し、群当たり性別当たり3匹ずつを、29日目に終了するようにスケジュールにし、群当たり性別当たり2匹ずつを、57日目に終了するようにスケジュールにした。各動物に、1、8、15、および22日目において、静脈内(IV)注射を介して、ビヒクル(群1)または1、10、もしくは30mg/kg(それぞれ、群2、3、および4)の用量のActRIIA−Fcを投与した。投薬容量は、3mL/kgで維持した。赤血球レベルの種々の尺度は、初回投与の2日前、ならびに初回投与後15、29、および57日目(残りの2匹の動物について)に評価した。
ActRIIA−hFcは、雄および雌について、全ての用量レベルおよび研究を通した全ての時点において、平均赤血球パラメータ[赤血球数(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、およびヘマトクリット(HCT)]の統計学的に有意な増大を引き起こし、絶対網状赤血球数および相対網状赤血球数(ARTC;RTC)の上昇を伴った。図5〜8を参照されたい。
統計学的有意性は、各処置群について、ベースラインにおける処置群についての平均と比べて計算した。
とりわけ、赤血球数の増大およびヘモグロビンレベルの上昇は、大きさが、エリスロポエチンについて報告されている効果とほぼ同等である。これらの効果の発生は、ActRIIA−Fcの場合が、エリスロポエチンの場合より急速である。
ラットおよびマウスについて同様の結果が観察された。
(実施例4)
ActRIIA−hFcは、ヒト対象において赤血球レベルを高め、かつ骨形成のマーカーを増加させる
実施例1で記載したActRIIA−hFc融合タンパク質を、主に、健常な閉経後女性におけるタンパク質の安全性を評価するように実施された、無作為化、二重盲検、プラセボ対照研究において、ヒト患者に投与した。48例の対象を、6つのコホートに無作為化して、単一用量のActRIIA−hFcまたはプラセボを施した(5つが実薬(active):1つがプラセボ)。用量レベルは、静脈内(IV)で0.01〜3.0mg/kgの範囲とし、皮下(SC)で0.03〜0.1mg/kgの範囲とした。全ての対象は、120日間にわたり追跡した。薬物動態(PK)解析に加えて、ActRIIA−hFcの生体活性もまた、骨形成および骨吸収についての生化学的マーカーの測定ならびにFSHレベルの測定により評価した。
ActRIIA−hFcは、ヒト対象において赤血球レベルを高め、かつ骨形成のマーカーを増加させる
実施例1で記載したActRIIA−hFc融合タンパク質を、主に、健常な閉経後女性におけるタンパク質の安全性を評価するように実施された、無作為化、二重盲検、プラセボ対照研究において、ヒト患者に投与した。48例の対象を、6つのコホートに無作為化して、単一用量のActRIIA−hFcまたはプラセボを施した(5つが実薬(active):1つがプラセボ)。用量レベルは、静脈内(IV)で0.01〜3.0mg/kgの範囲とし、皮下(SC)で0.03〜0.1mg/kgの範囲とした。全ての対象は、120日間にわたり追跡した。薬物動態(PK)解析に加えて、ActRIIA−hFcの生体活性もまた、骨形成および骨吸収についての生化学的マーカーの測定ならびにFSHレベルの測定により評価した。
潜在的変化を見出すために、ヘモグロビン数およびRBC数を、全ての対象について、研究の経過にわたり詳細に調べ、ベースラインレベルと比較した。血小板数を、同じ時間にわたり、対照として比較した。血小板数については、時間をわたってベースライン値からの臨床的に有意な変化は見られなかった。
ActRIIA−hFcの薬物動態(PK)解析は、用量に対する直線的プロファイルと、およそ25〜32日間の平均半減期とを明らかにした。ActRIIA−hFcの曲線下面積(AUC)は、用量に直線的に関係し、SC投薬後における吸収は、本質的に完全であった。図9および10を参照されたい。これらのデータは、SCが、最初の数日間のIV投薬と関連する、薬物の血清濃度のスパイクを回避しながら、薬物について、同等のバイオアベイラビリティおよび血清半減期をもたらすため、投薬への望ましいアプローチであることを指し示す(図10を参照されたい)。ActRIIA−hFcは、同化による骨成長のマーカーである、骨特異的アルカリホスファターゼ(BAP)の血清レベルの、急速で持続的な用量依存性の上昇と、骨吸収のマーカーである、C末端1型コラーゲンテロペプチドレベルおよび酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ5bレベルの、用量依存性の減少とを引き起こした。P1NPなど、他のマーカーが示した結果は、決定的ではなかった。BAPレベルが、薬物の最高投与量において、準飽和効果を示したことから、この骨同化バイオマーカーに対する最大半量効果は、投与量を3mg/kgまでの範囲で増大させるとき、0.3mg/kgの投与量で達成され得ることが指し示される。薬物について、薬力学効果の、AUCに対する関係として計算されるEC50は、51,465(日×ng/ml)であった(図11を参照されたい)。これらの骨バイオマーカーの変化は、被験最高用量レベルにおいて、およそ120日間にわたり持続された。また、血清FSHレベルの用量依存性の低下も見られたことは、アクチビンの阻害と符合した。
総じて、研究の最初の1週間にわたり、薬物関連でないヘモグロビンの極めて小幅な低減であって、おそらく、IVで施される場合であれ、SCで施される場合であれ、0.01mg/kg群および0.03mg/kg群における研究のための瀉血に関連する低減が見られた。SCおよびIVによる0.1mg/kgにおけるヘモグロビンの結果は、8〜15日目までに、安定するか、または適度の上昇を示した。IVによる0.3mg/kgの用量レベルでは、早くも2日目にHGBレベルの明らかな増大が見られ、しばしば、15〜29日目にピークに達したが、これは、プラセボ処置対象では見られなかった。IVによる1.0mg/kgの用量およびIVによる3.0mg/kgの用量では、単回投薬に応答して、対応するRBC数およびヘマトクリットの増大と共に、1g/dlを超えるヘモグロビンの平均の増大が観察された。これらの血液学的パラメータは、投薬の約60日後においてピークに達し、120日目までに実質的な低下を示した。これは、赤血球レベルを高めることを目的とする投薬が、120日間未満の間隔で(すなわち、ベースラインに戻る前に)なされる場合により有効であり、90日間もしくはこれ未満、または60日間もしくはこれ未満の投薬間隔が望ましいと考えられることを指し示す。血液学的変化の概要については、図12〜15を参照されたい。
総じて、ActRIIA−hFcは、赤血球数および網状赤血球数に対する用量依存性効果を示した。
(実施例5)
貧血患者の、ActRIIA−hFcによる処置
0.1mg/kg、0.3mg/kg、および1.0mg/kgという3の用量レベルで、30日ごとに投薬を行う、複数回用量のActRIIA−hFcにより患者を処置するように、臨床研究をデザインした。試験において、正常な健常対象は、一部の場合に、ヘモグロビン(Hg)およびヘマトクリット(Hct)が、正常な範囲を超えて増大することを除き、実施例4で報告した、第I相臨床試験において見られる増大と符合するヘモグロビンおよびヘマトクリットの増大を呈示した。ヘモグロビンレベルがおよそ7.5g/dLである貧血性患者にもまた、1mg/kgのレベルで2用量を施したところ、2カ月後において、およそ10.5g/dLのヘモグロビンレベルが結果としてもたらされた。患者の貧血は、慢性鉄欠損により引き起こされると考えられる、小球性貧血であった。
貧血患者の、ActRIIA−hFcによる処置
0.1mg/kg、0.3mg/kg、および1.0mg/kgという3の用量レベルで、30日ごとに投薬を行う、複数回用量のActRIIA−hFcにより患者を処置するように、臨床研究をデザインした。試験において、正常な健常対象は、一部の場合に、ヘモグロビン(Hg)およびヘマトクリット(Hct)が、正常な範囲を超えて増大することを除き、実施例4で報告した、第I相臨床試験において見られる増大と符合するヘモグロビンおよびヘマトクリットの増大を呈示した。ヘモグロビンレベルがおよそ7.5g/dLである貧血性患者にもまた、1mg/kgのレベルで2用量を施したところ、2カ月後において、およそ10.5g/dLのヘモグロビンレベルが結果としてもたらされた。患者の貧血は、慢性鉄欠損により引き起こされると考えられる、小球性貧血であった。
ActRIIA−Fc融合タンパク質はさらに、例えば、化学療法誘導性貧血および慢性腎疾患と関連する貧血を含む、貧血の種々のモデルにおいて、赤血球レベルを高めるのに有効であることも実証されている(例えば、米国特許出願公開第2010/0028331号を参照されたい)。
(実施例6)
代替的なActRIIA−Fcタンパク質
本明細書で記載される方法に従い使用され得る、様々なActRIIA改変体は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、WO2006/012627として公開されている国際特許出願(例えば、55〜58頁を参照されたい)において記載されている。代替的な構築物は、C末端テール(ActRIIAの細胞外ドメインの最後の15アミノ酸)を欠失させている場合がある。このような構築物の配列を下記(Fc部分に下線を付す)(配列番号28)に提示する。
代替的なActRIIA−Fcタンパク質
本明細書で記載される方法に従い使用され得る、様々なActRIIA改変体は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、WO2006/012627として公開されている国際特許出願(例えば、55〜58頁を参照されたい)において記載されている。代替的な構築物は、C末端テール(ActRIIAの細胞外ドメインの最後の15アミノ酸)を欠失させている場合がある。このような構築物の配列を下記(Fc部分に下線を付す)(配列番号28)に提示する。
(実施例7)
ActRIIB−Fc融合タンパク質の生成
本出願人らは、間に最小限のリンカー(3つのグリシンアミノ酸)を有する、ヒトActRIIBの細胞外ドメインを、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた、可溶性ActRIIB融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ActRIIB−hFcおよびActRIIB−mFcと呼ぶ。
CHO細胞株から精製されたActRIIB−hFcを、下記(配列番号29)に示す。
ActRIIB−Fc融合タンパク質の生成
本出願人らは、間に最小限のリンカー(3つのグリシンアミノ酸)を有する、ヒトActRIIBの細胞外ドメインを、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた、可溶性ActRIIB融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ActRIIB−hFcおよびActRIIB−mFcと呼ぶ。
CHO細胞株から精製されたActRIIB−hFcを、下記(配列番号29)に示す。
ActRIIB−hFcタンパク質およびActRIIB−mFcタンパク質は、CHO細胞株内で発現させた。3つの異なるリーダー配列:
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(配列番号30)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列(配列番号31)を有する。
このポリペプチドは、以下の核酸配列(配列番号32)によりコードされる。
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(配列番号30)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列(配列番号31)を有する。
CHO細胞により生成された材料の、N末端のシーケンシングにより、−GRGEAE(配列番号33)の主要な配列を明らかにした。とりわけ、文献において報告されている他の構築物は、−SGR・・・配列で始まる。
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下:プロテインAクロマトグラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの3つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。
ActRIIB−Fc融合タンパク質はまた、HEK293細胞内およびCOS細胞内でも発現された。全ての細胞株および妥当な培養条件に由来する材料は、インビボにおいて筋構築活性を有するタンパク質をもたらしたが、おそらく細胞株の選択および/または培養条件に関連する、効力の変動性も観察された。
本出願人らは、ActRIIBの細胞外ドメイン内に一連の変異を生成し、これらの変異体タンパク質を、細胞外ActRIIBとFcドメインとの間の可溶性融合タンパク質として生成した。バックグラウンドのActRIIB−Fc融合物は、配列番号29の配列を有する。
N末端およびC末端の切断を含む種々の変異を、バックグラウンドのActRIIB−Fcタンパク質に導入した。実施例1に提示したデータに基づくと、これらの構築物は、TPAリーダーとともに発現させる場合、N末端のセリンを欠くことが予想される。変異は、PCR変異誘発により、ActRIIB細胞外ドメイン内に生成した。PCRの後、フラグメントを、Qiagenカラムを介して精製し、SfoIおよびAgeIで消化し、ゲル精製した。ライゲーションすると、ヒトIgG1との融合物キメラを創出するように、これらのフラグメントを、発現ベクターであるpAID4(WO2006/012627を参照されたい)にライゲーションした。E.coli DH5アルファへと形質転換させたら、コロニーを採取し、DNAを単離した。マウス構築物(mFc)のために、マウスIgG2aで、ヒトIgG1を置換した。全ての変異体の配列を検証した。
変異体の全ては、HEK293T細胞内で、一過性のトランスフェクションにより生成した。まとめると、500mlのスピナー内で、HEK293T細胞を、容量250mlのFreestyle(Invitrogen)培地中に1ml当たりの細胞6×105個で設定し、一晩にわたり増殖させた。翌日、これらの細胞を、最終DNA濃度を0.5ug/mlとするDNA:PEI(1:1)複合体で処理した。4時間後、250mlの培地を添加し、細胞を、7日間にわたり増殖させた。細胞をスピンダウンすることにより馴化培地を採取し、濃縮した。
変異体を、例えば、プロテインAカラムを含む、様々な技法を使用して精製し、低pH(3.0)のグリシン緩衝液で溶出させた。中和の後、これらを、PBSに対して透析した。
変異体はまた、同様な方法により、CHO細胞内でも生成した。
変異体を、参照により本明細書に組み込まれる、WO2008/097541およびWO2006/012627において記載されている、結合アッセイおよび/またはバイオアッセイにおいて調べた。一部の場合には、アッセイを、精製タンパク質ではなく、馴化培地について実施した。ActRIIBの追加のバリエーションについては、米国特許第7,842,663号において記載されている。
変異体を、参照により本明細書に組み込まれる、WO2008/097541およびWO2006/012627において記載されている、結合アッセイおよび/またはバイオアッセイにおいて調べた。一部の場合には、アッセイを、精製タンパク質ではなく、馴化培地について実施した。ActRIIBの追加のバリエーションについては、米国特許第7,842,663号において記載されている。
(実施例8)
ActRIIB−Fcは、非ヒト霊長動物における赤血球生成を刺激する
カニクイザルを、7つの群(群当たり性別当たり6匹ずつ)に割りつけ、ActRIIB(20〜134)−hFcを、投与量0.6、3、または15mg/kgで、2週間ごとまたは4週間ごとに、9カ月間にわたる皮下注射として投与した。対照群(群当たり性別当たり6匹ずつ)には、ActRIIB(20〜134)−hFc処置動物と同じ投薬容量(用量当たり0.5ml/kg)で、ビヒクルを施した。一般的な臨床病態パラメータ(例えば、血液学パラメータ、臨床化学パラメータ、凝固パラメータ、および尿検査パラメータ)の変化について、動物をモニタリングした。血液学パラメータ、凝固パラメータ、および臨床化学パラメータ(鉄パラメータ、リパーゼ、およびアミラーゼを含む)は、投薬を開始する前、ならびに59、143、199、227日目、および267日目(4週間ごとに投薬される群について)または281日目(2週間ごとに投薬される群について)において、2回評価した。267/281日目における評価は、最終用量を投与した2週間後に行った。
ActRIIB−Fcは、非ヒト霊長動物における赤血球生成を刺激する
カニクイザルを、7つの群(群当たり性別当たり6匹ずつ)に割りつけ、ActRIIB(20〜134)−hFcを、投与量0.6、3、または15mg/kgで、2週間ごとまたは4週間ごとに、9カ月間にわたる皮下注射として投与した。対照群(群当たり性別当たり6匹ずつ)には、ActRIIB(20〜134)−hFc処置動物と同じ投薬容量(用量当たり0.5ml/kg)で、ビヒクルを施した。一般的な臨床病態パラメータ(例えば、血液学パラメータ、臨床化学パラメータ、凝固パラメータ、および尿検査パラメータ)の変化について、動物をモニタリングした。血液学パラメータ、凝固パラメータ、および臨床化学パラメータ(鉄パラメータ、リパーゼ、およびアミラーゼを含む)は、投薬を開始する前、ならびに59、143、199、227日目、および267日目(4週間ごとに投薬される群について)または281日目(2週間ごとに投薬される群について)において、2回評価した。267/281日目における評価は、最終用量を投与した2週間後に行った。
ActRIIB(20〜134)−hFcの投与は、雄ザルおよび雌ザルにおいて、血液学パラメータに対する、有害でない、用量に関連する変化を結果としてもたらした。これらの変化は、赤血球数、網状赤血球数、および赤血球の分布幅の増大、ならびに平均赤血球容量、平均赤血球ヘモグロビン量、および血小板数の減少を含んだ。雄では、RBC数は、全ての用量レベルで増大し、増大の大きさは概して、ActRIIB(20〜134)−hFcを2週間ごとに投与するのであれ、4週間ごとに投与するのであれ、同等であった。平均RBC数は、59〜267/281日目の間の全ての時点において(群2の雄[2週間ごとに0.6mg/kg]で、281日目においてRBC数が増大しなかったことを除き)増大した。雌では、RBC数は、2週間ごとに≧3mg/kgで増大し、変化は、143〜281日目の間に生じ;4週間ごとに15mg/kgでは、平均RBC数は、59〜267日目の間に増大した。
これらの効果は、ActRIIB(20〜134)−hFcの、赤血球生成の刺激に対する正の効果と符合する。
(実施例9)
GDFトラップの生成
本出願人らは、以下の通りに、GDFトラップを構築した。アクチビンAへの結合を、GDF11および/またはミオスタチンと比べて大幅に低減した(配列番号1内の79位における、ロイシンからアスパラギン酸への置換の帰結として)、改変ActRIIBの細胞外ドメイン(L79D置換を有する配列番号1のアミノ酸20〜134)を有するポリペプチドを、間に最小限のリンカー(3つのグリシンアミノ酸)を有する、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた。構築物を、それぞれ、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcおよびActRIIB(L79D 20〜134)−mFcと呼ぶ。79位にアスパラギン酸ではなく、グルタミン酸を有する代替的形態についても、同様に実施した(L79E)。下記の配列番号36に照らした226位において、バリンではなく、アラニンを有する代替的形態もまた、生成し、調べる全ての点において、同等に実施した。79位におけるアスパラギン酸(配列番号1に照らした;または配列番号36に照らした60位)は、下記で二重下線により指し示す。配列番号36に照らした226位におけるバリンもまた、下記で二重下線により指し示す。
GDFトラップの生成
本出願人らは、以下の通りに、GDFトラップを構築した。アクチビンAへの結合を、GDF11および/またはミオスタチンと比べて大幅に低減した(配列番号1内の79位における、ロイシンからアスパラギン酸への置換の帰結として)、改変ActRIIBの細胞外ドメイン(L79D置換を有する配列番号1のアミノ酸20〜134)を有するポリペプチドを、間に最小限のリンカー(3つのグリシンアミノ酸)を有する、ヒトFcドメインまたはマウスFcドメインに融合させた。構築物を、それぞれ、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcおよびActRIIB(L79D 20〜134)−mFcと呼ぶ。79位にアスパラギン酸ではなく、グルタミン酸を有する代替的形態についても、同様に実施した(L79E)。下記の配列番号36に照らした226位において、バリンではなく、アラニンを有する代替的形態もまた、生成し、調べる全ての点において、同等に実施した。79位におけるアスパラギン酸(配列番号1に照らした;または配列番号36に照らした60位)は、下記で二重下線により指し示す。配列番号36に照らした226位におけるバリンもまた、下記で二重下線により指し示す。
CHO細胞株から精製されたGDFトラップであるActRIIB(L79D 20〜134)−hFcを、下記(配列番号36)に示す。
GDFトラップのActRIIBに由来する部分は、下記(配列番号37)に示されるアミノ酸配列を有し、この部分は、単量体として使用することもでき、単量体、二量体またはより高次の複合体としての非Fc融合タンパク質として使用することもできるであろう。
GDFトラップタンパク質は、CHO細胞株内で発現させた。3つの異なるリーダー配列:
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MTAPWVALALLWGSLCAGS(配列番号30)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号23)
(ii)組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号24)
(iii)天然:MTAPWVALALLWGSLCAGS(配列番号30)
について検討した。
選択された形態は、TPAリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
このポリペプチドは、以下の核酸配列(配列番号39)によりコードされる。
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下:プロテインAクロマトグラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの3つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。精製スキームの例では、細胞培養培地を、プロテインAカラムに通し、150mMのトリス/NaCl(pH8.0)中で洗浄し、次いで、50mMのトリス/NaCl(pH8.0)中で洗浄し、0.1Mのグリシン、pH3.0で溶出させる。低pHの溶出物は、ウイルス除去工程として、室温で30分間にわたり保持する。次いで、溶出物を中和させ、Qセファロースイオン交換カラムに通し、50mMのトリス、pH8.0、50mMのNaCl中で洗浄し、150mM〜300mMの間の濃度のNaClを伴う、50mMのトリス、pH8.0中で溶出させる。次いで、溶出物を、50mMのトリス、pH8.0、1.1Mの硫酸アンモニウムへと交換し、フェニルセファロースカラムに通し、洗浄し、150〜300mMの間で硫酸アンモニウムを伴う、50mMのトリス、pH8.0で溶出させる。使用のために、溶出物を透析し、濾過する。
追加のGDFトラップ(アクチビンAへの結合の、ミオスタチンまたはGDF11への結合と比べた比を低減するように改変されたActRIIB−Fc融合タンパク質)は、参照により本明細書に組み込まれる、WO2008/097541およびWO2006/012627において記載されている。
(実施例10)
GDF−11およびアクチビンに媒介されるシグナル伝達についてのバイオアッセイ
A−204レポーター遺伝子アッセイを使用して、ActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの、GDF−11およびアクチビンAによるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞株:ヒト横紋筋肉腫(筋肉に由来する)。レポーターベクター:pGL3(CAGA)12(Dennlerら、1998年、EMBO、17巻:3091〜3100頁において記載されている)。CAGA12モチーフは、TGFベータ応答性遺伝子(例えば、PAI−1遺伝子)内に存在するので、このベクターは、SMAD2およびSMAD3を介してシグナル伝達する因子のために一般的に使用される。
1日目:A−204細胞を、48ウェルプレートに分ける。
2日目:A−204細胞に、10ugのpGL3(CAGA)12またはpGL3(CAGA)12(10ug)+pRLCMV(1μg)およびFugeneをトランスフェクトする。
3日目:因子(培地+0.1%のBSA中に希釈された)を添加する。細胞に添加する前に、1時間にわたり、阻害剤を、因子と共に、あらかじめインキュベートする必要がある。6時間後、細胞を、PBSですすぎ、溶解させた。
GDF−11およびアクチビンに媒介されるシグナル伝達についてのバイオアッセイ
A−204レポーター遺伝子アッセイを使用して、ActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの、GDF−11およびアクチビンAによるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞株:ヒト横紋筋肉腫(筋肉に由来する)。レポーターベクター:pGL3(CAGA)12(Dennlerら、1998年、EMBO、17巻:3091〜3100頁において記載されている)。CAGA12モチーフは、TGFベータ応答性遺伝子(例えば、PAI−1遺伝子)内に存在するので、このベクターは、SMAD2およびSMAD3を介してシグナル伝達する因子のために一般的に使用される。
1日目:A−204細胞を、48ウェルプレートに分ける。
2日目:A−204細胞に、10ugのpGL3(CAGA)12またはpGL3(CAGA)12(10ug)+pRLCMV(1μg)およびFugeneをトランスフェクトする。
3日目:因子(培地+0.1%のBSA中に希釈された)を添加する。細胞に添加する前に、1時間にわたり、阻害剤を、因子と共に、あらかじめインキュベートする必要がある。6時間後、細胞を、PBSですすぎ、溶解させた。
これに続いて、ルシフェラーゼアッセイを行う。いかなる阻害剤も存在しない下で、アクチビンAは、レポーター遺伝子発現に対する10倍の刺激およびED50約2ng/mlを示した。GDF−11:16倍の刺激、ED50:約1.5ng/mlを示した。
このアッセイでは、ActRIIB(20〜134)は、アクチビンA、GDF−8、およびGDF−11の活性の強力な阻害剤である。下記で記載される、ActRIIB改変体もまた、このアッセイで調べた。
(実施例11)
ActRIIB−Fc改変体の細胞ベースの活性
ActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの活性を、上記で記載した細胞ベースのアッセイで調べた。結果を、下記の表にまとめる。一部の改変体を、異なるC末端切断構築物で調べた。上記で論じた通り、5または15アミノ酸の切断は、活性の低減を引き起こした。GDFトラップ(L79D改変体およびL79E改変体)は、GDF−11の野生型阻害をほとんど保持しながら、アクチビンA阻害の実質的な喪失を示した。
GDF11およびアクチビンAへの可溶性ActRIIB−Fcの結合:
ActRIIB−Fc改変体の細胞ベースの活性
ActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの活性を、上記で記載した細胞ベースのアッセイで調べた。結果を、下記の表にまとめる。一部の改変体を、異なるC末端切断構築物で調べた。上記で論じた通り、5または15アミノ酸の切断は、活性の低減を引き起こした。GDFトラップ(L79D改変体およびL79E改変体)は、GDF−11の野生型阻害をほとんど保持しながら、アクチビンA阻害の実質的な喪失を示した。
GDF11およびアクチビンAへの可溶性ActRIIB−Fcの結合:
いくつかの改変体は、ラットにおける血清半減期について評価されている。ActRIIB(20〜134)−Fcの血清半減期は、およそ70時間である。ActRIIB(A24N 20〜134)−Fcの血清半減期は、およそ100〜150時間である。A24N改変体の、細胞ベースのアッセイ(上記)およびインビボアッセイ(下記)における活性は、野生型分子と同等である。より長い半減期と併せて、これは、時間をわたって、A24N改変体は、タンパク質単位当たりで、野生型分子より大きな効果をもたらすことを意味する。A24N改変体、および上記で調べた他の改変体のいずれかは、L79D改変体またはL79E改変体など、GDFトラップ分子と組み合わせることができる。
(実施例12)
GDF−11およびアクチビンAへの結合
ある特定のActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの、リガンドへの結合について、Biacore(商標)アッセイで調べた。
GDF−11およびアクチビンAへの結合
ある特定のActRIIB−Fcタンパク質およびGDFトラップの、リガンドへの結合について、Biacore(商標)アッセイで調べた。
ActRIIB−Fc改変体または野生型タンパク質を、抗hFc抗体を使用するシステム上に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を、下記の表にまとめる。
IIB改変体のリガンド結合特異性
無細胞アッセイにおいて得られたこれらのデータにより、細胞ベースのアッセイによるデータが確認され、A24N改変体は、ActRIIB(20〜134)−hFc分子のリガンド結合活性と同様なリガンド結合活性を保持し、L79D分子またはL79E分子は、ミオスタチンおよびGDF11への結合を保持するが、アクチビンAへの結合の顕著な減殺(定量化不可能な結合)を示すことが実証される。
他の改変体も、WO2006/012627(参照によりその全体において本明細書に組み込まれる)で報告される通りに生成され、調べられている。例えば、デバイスにカップリングさせたリガンドを使用し、カップリングさせたリガンド上に受容体を流す、59〜60頁を参照されたい。とりわけ、K74Y、K74F、K74I(および、おそらく、K74Lなど、K74における他の疎水性置換)およびD80Iは、アクチビンA(ActA)への結合の、GDF11への結合に対する比の、野生型K74分子と比べた減少を引き起こす。これらの改変体に関するデータの表を、下記に再掲載する:
可溶性ActRIIB−Fc改変体のGDF11およびアクチビンAへの結合(Biacore(商標)アッセイ)
可溶性ActRIIB−Fc改変体のGDF11およびアクチビンAへの結合(Biacore(商標)アッセイ)
(実施例13)
GDFトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高める
12週齢の雄C57BL/6NTacマウスを、2つの処置群(N=10)の1つに割り当てた。マウスに、ビヒクルまたは改変体ActRIIBポリペプチド(「GDFトラップ」)[ActRIIB(L79D 20〜134)−hFc]を、皮下注射(SC)により、10mg/kgで、毎週2回ずつ、4週間にわたり投薬した。研究終了時において、全血液を、心臓穿刺により、EDTAを含有する管へと回収し、HM2血液解析器(Abaxis,Inc)を使用して、細胞分布について解析した。
GDFトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高める
12週齢の雄C57BL/6NTacマウスを、2つの処置群(N=10)の1つに割り当てた。マウスに、ビヒクルまたは改変体ActRIIBポリペプチド(「GDFトラップ」)[ActRIIB(L79D 20〜134)−hFc]を、皮下注射(SC)により、10mg/kgで、毎週2回ずつ、4週間にわたり投薬した。研究終了時において、全血液を、心臓穿刺により、EDTAを含有する管へと回収し、HM2血液解析器(Abaxis,Inc)を使用して、細胞分布について解析した。
GDFトラップによる処置は、白血球(WBC)数に対して、ビヒクル対照と比較して、統計学的に有意な効果を及ぼさなかった。赤血球(RBC)数は、処置群において、対照と比べて増大した(下記の表を参照されたい)。ヘモグロビン含量(HGB)およびヘマトクリット(HCT)の両方もまた、追加の赤血球に起因して増大した。平均赤血球分布幅(RDWc)が、処置動物において大きかったことから、未成熟赤血球プールの増大が指し示される。したがって、GDFトラップによる処置は、白血球集団に弁別可能な影響を及ぼさずに、赤血球の増大をもたらす。
(実施例14)
GDFトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高めるのに、ActRIIB−Fcより優れている
19週齢の雄C57BL/6NTacマウスを、3つの群の1つに無作為に割り当てた。マウスに、ビヒクル(10mMのトリス緩衝生理食塩液、TBS)、野生型ActRIIB(20〜134)−mFc、またはGDFトラップであるActRIIB(L79D
20〜134)−hFcを、皮下注射により、毎週2回ずつ、3週間にわたり投薬した。血液は、ベースラインおよび3週間の投薬後における回収頬部採血であり、、血液解析器(HM2、Abaxis,Inc.)を使用して、細胞分布について解析した。
GDFトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高めるのに、ActRIIB−Fcより優れている
19週齢の雄C57BL/6NTacマウスを、3つの群の1つに無作為に割り当てた。マウスに、ビヒクル(10mMのトリス緩衝生理食塩液、TBS)、野生型ActRIIB(20〜134)−mFc、またはGDFトラップであるActRIIB(L79D
20〜134)−hFcを、皮下注射により、毎週2回ずつ、3週間にわたり投薬した。血液は、ベースラインおよび3週間の投薬後における回収頬部採血であり、、血液解析器(HM2、Abaxis,Inc.)を使用して、細胞分布について解析した。
ActRIIB−FcまたはGDFトラップによる処置は、白血球(WBC)数に対して、ビヒクル対照と比較して、有意な効果を及ぼさなかった。赤血球(RBC)数、ヘマトクリット(HCT)レベル、およびヘモグロビンレベルは全て、GDFトラップで処置されたマウスにおいて、対照または野生型構築物と比較して上昇した(下記の表を参照されたい)。したがって、直接的な比較では、GDFトラップは、赤血球の増大を、野生型ActRIIB−Fcタンパク質より有意に大きな程度まで促進する。実際、この実験では、野生型ActRIIB−Fcタンパク質は、赤血球の統計学的に有意な増大を引き起こさなかったことから、この効果を顕示するには、より長期またはより高用量の投薬が必要とされることが示唆される
(実施例15)
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを含むGDFトラップの生成
実施例9で記載した通り、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcと呼ばれるGDFトラップを、N末端における、TPAリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換(配列番号1内の残基79における)を含有するActRIIB細胞外ドメイン(配列番号1内の残基20〜134)への融合と、C末端における、ヒトFcドメインの、最小限のリンカー(3つのグリシン残基)による融合とにより生成した(図16)。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を、図17Aおよび17Bに示す。
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを含むGDFトラップの生成
実施例9で記載した通り、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcと呼ばれるGDFトラップを、N末端における、TPAリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換(配列番号1内の残基79における)を含有するActRIIB細胞外ドメイン(配列番号1内の残基20〜134)への融合と、C末端における、ヒトFcドメインの、最小限のリンカー(3つのグリシン残基)による融合とにより生成した(図16)。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を、図17Aおよび17Bに示す。
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcと呼ばれる短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップを、N末端における、TPAリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換(配列番号1内の残基79における)を含有する短縮型細胞外ドメイン(配列番号1内の残基25〜131)への融合と、C末端における、ヒトFcドメインの、最小限のリンカー(3つのグリシン残基)による融合とにより生成した(図18)。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を、図19Aおよび19Bに示す。
(実施例16)
二重短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップによる選択的リガンド結合
GDFトラップおよび他のActRIIB−hFcタンパク質の、いくつかのリガンドに対するアフィニティーを、インビトロにおいて、Biacore(商標)装置により評価した。結果を、下記の表にまとめる。Kd値は、複合体の会合および解離が極めて急速であり、konおよびkoffの正確な決定が妨げられるために、定常状態アフィニティーの当てはめにより得た。
ActRIIB−hFc改変体のリガンド選択性
二重短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップによる選択的リガンド結合
GDFトラップおよび他のActRIIB−hFcタンパク質の、いくつかのリガンドに対するアフィニティーを、インビトロにおいて、Biacore(商標)装置により評価した。結果を、下記の表にまとめる。Kd値は、複合体の会合および解離が極めて急速であり、konおよびkoffの正確な決定が妨げられるために、定常状態アフィニティーの当てはめにより得た。
ActRIIB−hFc改変体のリガンド選択性
短縮型細胞外ドメインを有するGDFトラップである、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcは、より長い改変体である、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcにより示されるリガンドへの選択性に匹敵するかまたはこれを凌駕し、アクチビンAへの結合の顕著な喪失、アクチビンBへの結合の部分的喪失、およびL79D置換を欠くActRIIB−hFc対応物と比較してほぼ完全なGDF11への結合の保持を伴った。短縮単独(L79D置換を有さない)では、本実施例で示されるリガンド間の選択性を変更しなかった[ActRIIB(L79 25〜131)−hFcを、ActRIIB(L79 20〜134)−hFcと比較する]ことに注目されたい。
(実施例17)
代替的なヌクレオチド配列によるActRIIB(L79D 25〜131)−hFcの生成
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを生成するために、天然の79位(配列番号1)においてアスパラギン酸置換を有し、N末端およびC末端を短縮した(配列番号1内の残基25〜131)ヒトActRIIB細胞外ドメインを、N末端において、天然のActRIIBリーダーの代わりに、TPAリーダー配列と融合させ、C末端において、最小限のリンカー(3つのグリシン残基)を介して、ヒトFcドメインと融合させた(図18)。この融合タンパク質をコードする1つのヌクレオチド配列を、図19Aおよび19B(配列番号42)に示し、正確に同じ融合タンパク質をコードする代替的なヌクレオチド配列を、図22Aおよび22B(配列番号46)に示す。このタンパク質は、実施例9で記載した方法を使用して、発現させ、精製した。
代替的なヌクレオチド配列によるActRIIB(L79D 25〜131)−hFcの生成
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを生成するために、天然の79位(配列番号1)においてアスパラギン酸置換を有し、N末端およびC末端を短縮した(配列番号1内の残基25〜131)ヒトActRIIB細胞外ドメインを、N末端において、天然のActRIIBリーダーの代わりに、TPAリーダー配列と融合させ、C末端において、最小限のリンカー(3つのグリシン残基)を介して、ヒトFcドメインと融合させた(図18)。この融合タンパク質をコードする1つのヌクレオチド配列を、図19Aおよび19B(配列番号42)に示し、正確に同じ融合タンパク質をコードする代替的なヌクレオチド配列を、図22Aおよび22B(配列番号46)に示す。このタンパク質は、実施例9で記載した方法を使用して、発現させ、精製した。
(実施例18)
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップは、マウスにおける赤血球系前駆細胞の増殖を高める
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを、評価して、赤血球系前駆細胞の増殖に対するその効果を決定した。雄C57BL/6マウス(8週齢)を、1および4日目において、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFc(10mg/kg、s.c.;n=6)またはビヒクル(TBS;n=6)で処置し、次いで、8日目に、脾臓、脛骨、大腿骨、および血液を回収するために安楽死させた。脾臓および骨髄の細胞を単離し、5%のウシ胎仔血清を含有するIscoveによる改変ダルベッコ培地中で希釈し、特製のメチルセルロースベースの培地中に懸濁させ、2または12日間にわたり培養して、それぞれ、コロニー形成単位赤芽球(CFU−E)期およびバースト形成単位赤芽球(BFU−E)期にあるクローン生成性前駆細胞のレベルを評価した。BFU−Eを決定するためのメチルセルロースベースの培地(MethoCult M3434、Stem Cell Technologies)は、CFU−Eを決定するためのメチルセルロース培地(MethoCult M3334、Stem Cell Technologies)中には存在しない、組換えマウス幹細胞因子、インターロイキン3、およびインターロイキン6を含む一方、いずれの培地も、他の成分の中でもとりわけ、エリスロポエチンを含有した。BFU−EおよびCFU−Eのいずれについても、各組織試料に由来する、二連の培養プレート内でコロニー数を決定し、結果についての統計学的解析は、処置群当たりのマウスの数に基づいた。
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップは、マウスにおける赤血球系前駆細胞の増殖を高める
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを、評価して、赤血球系前駆細胞の増殖に対するその効果を決定した。雄C57BL/6マウス(8週齢)を、1および4日目において、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFc(10mg/kg、s.c.;n=6)またはビヒクル(TBS;n=6)で処置し、次いで、8日目に、脾臓、脛骨、大腿骨、および血液を回収するために安楽死させた。脾臓および骨髄の細胞を単離し、5%のウシ胎仔血清を含有するIscoveによる改変ダルベッコ培地中で希釈し、特製のメチルセルロースベースの培地中に懸濁させ、2または12日間にわたり培養して、それぞれ、コロニー形成単位赤芽球(CFU−E)期およびバースト形成単位赤芽球(BFU−E)期にあるクローン生成性前駆細胞のレベルを評価した。BFU−Eを決定するためのメチルセルロースベースの培地(MethoCult M3434、Stem Cell Technologies)は、CFU−Eを決定するためのメチルセルロース培地(MethoCult M3334、Stem Cell Technologies)中には存在しない、組換えマウス幹細胞因子、インターロイキン3、およびインターロイキン6を含む一方、いずれの培地も、他の成分の中でもとりわけ、エリスロポエチンを含有した。BFU−EおよびCFU−Eのいずれについても、各組織試料に由来する、二連の培養プレート内でコロニー数を決定し、結果についての統計学的解析は、処置群当たりのマウスの数に基づいた。
ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcで処置されたマウスからの脾臓由来の培養物のCFU−Eコロニー数は、対照マウスに由来する対応する培養物の2倍であった(P<0.05)が、BFU−Eコロニー数は、インビボにおける処置により有意には異ならなかった。骨髄培養物に由来するCFU−EコロニーまたはBFU−Eコロニーの数もまた、処置により有意には異ならなかった。予想される通り、脾臓由来の培養物中のCFU−Eコロニー数の増大は、安楽死時のActRIIB(L79D 25〜131)−hFcで処置されたマウスにおいて、対照と比較して、赤血球レベルの高度に有意な(P<0.001)変化(11.6%の増大)、ヘモグロビン濃度(12%の増大)、およびヘマトクリットレベル(11.6%の増大)をともなった。これらの結果は、短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップのインビボ投与は、赤血球レベルを高めるその全体的な効果の一部として、赤血球系前駆細胞の増殖を刺激し得ることを指し示す。
GDFトラップ融合タンパク質は、例えば、化学療法誘導性貧血、腎摘出術誘導性貧血、および失血性貧血を含む、種々の貧血モデルにおいて赤血球レベルを高めるのに有効であることもさらに実証されている(例えば、国際特許出願公開第WO2010/019261号を参照されたい)。
(実施例19)
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
2つのGDFトラップである、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを、カニクイザルにおける赤血球生成を刺激するそれらの能力について評価した。サルを、GDFトラップ(10mg/kg;n=4匹の雄/4匹の雌)、またはビヒクル(n=2匹の雄/2匹の雌)で、1および8日目に、皮下処置した。血液試料は、1(処置前のベースライン)、3、8、15、29、および44日目に回収し、赤血球レベル(図24)、ヘマトクリット(図25)、ヘモグロビンレベル(図26)、および網状赤血球レベル(図27)について解析した。ビヒクルで処置されたサルは、全ての処置後時点において、反復した血液サンプリングの予想される効果である、赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビンのレベルの低下を呈示した。これに対し、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcまたはActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる処置は、最初の処置後時点(3日目)までに、これらのパラメータを増大させ、それらを、実質的に上昇したレベルで、研究期間にわたり維持した(図24〜26)。ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcまたはActRIIB(L79D 25〜131)−hFcで処置されたサルにおける網状赤血球レベルが、8、15、および29日目において、ビヒクルと比較して実質的に上昇した(図27)ことは、重要である。この結果は、GDFトラップによる処置が、赤血球前駆体の生成を増大させ、赤血球レベルの上昇を結果としてもたらすことを実証する。
短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
2つのGDFトラップである、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcを、カニクイザルにおける赤血球生成を刺激するそれらの能力について評価した。サルを、GDFトラップ(10mg/kg;n=4匹の雄/4匹の雌)、またはビヒクル(n=2匹の雄/2匹の雌)で、1および8日目に、皮下処置した。血液試料は、1(処置前のベースライン)、3、8、15、29、および44日目に回収し、赤血球レベル(図24)、ヘマトクリット(図25)、ヘモグロビンレベル(図26)、および網状赤血球レベル(図27)について解析した。ビヒクルで処置されたサルは、全ての処置後時点において、反復した血液サンプリングの予想される効果である、赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビンのレベルの低下を呈示した。これに対し、ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcまたはActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる処置は、最初の処置後時点(3日目)までに、これらのパラメータを増大させ、それらを、実質的に上昇したレベルで、研究期間にわたり維持した(図24〜26)。ActRIIB(L79D 20〜134)−hFcまたはActRIIB(L79D 25〜131)−hFcで処置されたサルにおける網状赤血球レベルが、8、15、および29日目において、ビヒクルと比較して実質的に上昇した(図27)ことは、重要である。この結果は、GDFトラップによる処置が、赤血球前駆体の生成を増大させ、赤血球レベルの上昇を結果としてもたらすことを実証する。
まとめると、これらのデータは、短縮型GDFトラップのほか、全長改変体も、インビボにおける赤血球の形成を増大させるのに、GDF11および潜在的に関連するリガンドの選択的アンタゴニストとして使用し得ることを実証する。
(実施例20)
ActRIIB5に由来するGDFトラップ
他の研究者らも、ActRIIBの膜貫通ドメインを含むエクソン4が、異なるC末端配列により置きかえられた、ActRIIBの代替的な可溶性形態(ActRIIB5と表記される)について報告している(例えば、WO2007/053775を参照されたい)。
そのリーダーを有さない天然ヒトActRIIB5の配列は、以下の通りである。
ActRIIB5に由来するGDFトラップ
他の研究者らも、ActRIIBの膜貫通ドメインを含むエクソン4が、異なるC末端配列により置きかえられた、ActRIIBの代替的な可溶性形態(ActRIIB5と表記される)について報告している(例えば、WO2007/053775を参照されたい)。
そのリーダーを有さない天然ヒトActRIIB5の配列は、以下の通りである。
記載される通りに、ロイシンからアスパラギン酸への置換、または他の酸性置換を、天然の79位(下線を付す)に施して、以下の配列を有する、改変体ActRIIB5(L79D)を構築することができる。
この改変体を、TGGGリンカー(一重下線)により、ヒトFc(二重下線)に接続して、以下の配列を有するヒトActRIIB5(L79D)−hFc融合タンパク質を生成することができる。
この構築物は、CHO細胞内で発現させることができる。
(実施例21)
マウスにおける、EPOおよび短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップによる組み合わせ処置の効果
EPOが、赤血球系前駆体の増殖を増大させることにより、赤血球の形成を誘導するのに対し、GDFトラップは、EPOの効果を補完または増強する形で、赤血球の形成に潜在的に影響を及ぼし得る。したがって、本出願人らは、EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる組み合わせ処置の、赤血球生成パラメータに対する効果について探索した。雄C57BL/6マウス(9週齢)に、組換えヒトEPO単独(エポエチンアルファ、1800単位/kg)、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFc単独(10mg/kg)、EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcの両方、またはビヒクル(トリス緩衝生理食塩液)の単回i.p.注射を施した。血液、脾臓、および大腿骨を回収するために、マウスを、投薬の72時間後に安楽死させた。
マウスにおける、EPOおよび短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップによる組み合わせ処置の効果
EPOが、赤血球系前駆体の増殖を増大させることにより、赤血球の形成を誘導するのに対し、GDFトラップは、EPOの効果を補完または増強する形で、赤血球の形成に潜在的に影響を及ぼし得る。したがって、本出願人らは、EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる組み合わせ処置の、赤血球生成パラメータに対する効果について探索した。雄C57BL/6マウス(9週齢)に、組換えヒトEPO単独(エポエチンアルファ、1800単位/kg)、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFc単独(10mg/kg)、EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcの両方、またはビヒクル(トリス緩衝生理食塩液)の単回i.p.注射を施した。血液、脾臓、および大腿骨を回収するために、マウスを、投薬の72時間後に安楽死させた。
脾臓および大腿骨を加工して、フローサイトメトリー解析のための赤血球系前駆細胞を得た。摘出後、脾臓を、5%のウシ胎仔血清を含有するIscoveによる改変ダルベッコ培地中で細かく刻み、1mLの滅菌シリンジのプランジャーで、70μmの細胞ストレーナーを介して押し込むことにより、機械的に解離させた。大腿骨から、あらゆる残存する筋肉または結合組織を除去し、残る骨幹部を、3mLのシリンジに接続された21ゲージの注射針を介して、5%のウシ胎仔血清を含有するIscoveによる改変ダルベッコ培地フラッシングすることによる、骨髄の回収を許容するように、端部を切除した。細胞懸濁液を遠心分離し(2000rpmで10分間にわたる)、細胞ペレットを、5%のウシ胎仔血清を含有するPBS中に再懸濁させた。各組織に由来する細胞(106個)を、抗マウスIgGと共にインキュベートして、非特異的結合をブロッキングし、次いで、マウス細胞表面マーカーであるCD71(トランスフェリン受容体)およびTer119(細胞表面グリコフォリンAと関連する抗原)に対する蛍光標識抗体と共にインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。試料中の死細胞は、ヨウ化プロピジウムによる対比染色を介して、解析から除外した。脾臓内または骨髄内の赤血球系分化は、分化の経過にわたり低下する、CD71標識化の程度、および前赤芽球期により始まる終末赤血球系分化(terminal erythroid differentiation)の間に増大する、Ter119標識化により評価した(Socolovskyら、2001年、Blood、98巻:3261〜3273頁;Yingら、2006年、Blood、108巻:123〜133頁)。こうして、記載される通りに、フローサイトメトリーを使用して、前赤芽球(CD71highTer119low)、好塩基性赤芽球(CD71highTer119high)、多染性赤芽球+正染性赤芽球(CD71medTer119high)、および後期正染性赤芽球+網状赤血球(CD71lowTer119high)の数を決定した。
EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる組み合わせ処置は、驚くべき程度に活発な赤血球の増大をもたらした。この実験の72時間にわたる時間枠では、EPOも、ActRIIB(L79D 25〜131)−hFcも、単独では、ヘマトクリットを、ビヒクルと比較して有意には増大させなかったのに対し、2つの作用因子による組み合わせ処置は、ヘマトクリットのほぼ25%の増大をもたらし、これは、予想外に相乗作用的であり、すなわち、それらの別個の効果の合計を超えた(図28)。この種類の相乗作用は一般に、個別の作用因子が、異なる細胞機構を介して作用している証拠であると考えられる。同様の結果はまた、ヘモグロビン濃度(図29)および赤血球濃度(図30)についても観察され、これらの各々もまた、組み合わせ処置により相乗作用的に増大した。
赤血球系前駆体レベルの解析は、より複雑なパターンを明らかにした。マウスでは、脾臓は、誘導的(「ストレス」性)赤血球生成を担う主要な臓器であると考えられる。72時間での脾臓組織のフローサイトメトリー解析は、EPOにより、赤血球生成性前駆体プロファイルが、ビヒクルと比較して顕著に変更され、好塩基性赤芽球数を、170%を超えて増大させたが、後期前駆体(後期正染性赤芽球+網状赤血球)は増大させず、3分の1超減少させた(図31)ことを明らかにした。組み合わせ処置が、好塩基性赤芽球を、EPO単独より程度は劣るが、ビヒクルと比較して有意に増大させる一方で、後期前駆体の成熟を減殺せずに支援した(図31)ことは重要である。したがって、EPOおよびActRIIB(L79D 25〜131)−hFcによる組み合わせ処置は、前駆体の増殖と成熟との調和ある増強を介して、赤血球生成を増大させた。脾臓とは対照的に、組み合わせ処置後における骨髄内の前駆体細胞プロファイルは、EPO単独処置後におけるプロファイルと、認識可能には異ならなかった。本出願人らは、脾臓前駆体プロファイルから、実験を、72時間を超えて延長した場合、組み合わせ処置は、網状赤血球レベルの上昇をもたらし、成熟赤血球レベルの持続的な上昇を随伴することを予測する。
まとめると、これらの知見は、短縮型ActRIIB細胞外ドメインを有するGDFトラップを、EPOと組み合わせて投与して、インビボにおける赤血球の形成を相乗作用的に増大させ得ることを実証する。補完的であるが規定されていない機構を介して作用するGDFトラップは、EPO受容体活性化因子単独の強力な増殖性効果を緩和し、かつ、より低い用量のEPO受容体活性化因子で達成される赤血球の標的レベルをなおも可能とし、これにより、より高いレベルのEPO受容体の活性化と関連する、潜在的な有害作用または他の問題を回避することが可能である。
(実施例22)
MDSのマウスモデルにおける無効赤血球生成および貧血へのGDFトラップの効果
(実施例22)
MDSのマウスモデルにおける無効赤血球生成および貧血へのGDFトラップの効果
本出願人らは、不全型の前駆体成熟および無効造血によって特徴付けられるMDSのNUP98−HOXD13マウスモデルにおいてGDFトラップActRIIB(L79D
25−131)−mFc(RAP−536)の効果を探索した。このモデルでは疾患重症度は、年齢と共に高まり、最終的に大部分のマウスにおいて急性骨髄性白血病に進行し、それらの平均寿命はおよそ14カ月である。およそ4カ月齢から、これらのマウスは、貧血、白血球減少症、無効赤血球生成および正常細胞性から細胞過多である骨髄を呈する[Linら、(2005年)Blood 106巻:287〜295頁]。慢性投与の効果をモニターするために、MDSマウスをRAP−536(10mg/kg、s.c.)またはビヒクルで、4カ月齢において開始し毎週2回7カ月間にわたり継続して処置した、一方血液試料(50μL)は、ベースラインおよびその後毎月、全血球計算分析のために回収した。予想される通り、6カ月齢MDSマウスは野生型マウスと比較して重度の貧血を発症し(図32A)、骨髄分析は月齢合致FVB野生型マウスと比較してMDSマウスにおいて赤血球前駆体の数の増加(図32A)、低い骨髄球/赤血球(M/E)比を明らかにした[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。これは無効赤血球生成を示す。6カ月齢MDSマウスでは、RAP−536処置はRBC数(16.9%まで)およびヘモグロビン濃度(12.5%まで)を顕著に増加させ(図32A)、骨髄中の赤血球前駆体細胞数を低減し(図32A)、M/E比を野生型マウスでの比まで正常化した[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。
25−131)−mFc(RAP−536)の効果を探索した。このモデルでは疾患重症度は、年齢と共に高まり、最終的に大部分のマウスにおいて急性骨髄性白血病に進行し、それらの平均寿命はおよそ14カ月である。およそ4カ月齢から、これらのマウスは、貧血、白血球減少症、無効赤血球生成および正常細胞性から細胞過多である骨髄を呈する[Linら、(2005年)Blood 106巻:287〜295頁]。慢性投与の効果をモニターするために、MDSマウスをRAP−536(10mg/kg、s.c.)またはビヒクルで、4カ月齢において開始し毎週2回7カ月間にわたり継続して処置した、一方血液試料(50μL)は、ベースラインおよびその後毎月、全血球計算分析のために回収した。予想される通り、6カ月齢MDSマウスは野生型マウスと比較して重度の貧血を発症し(図32A)、骨髄分析は月齢合致FVB野生型マウスと比較してMDSマウスにおいて赤血球前駆体の数の増加(図32A)、低い骨髄球/赤血球(M/E)比を明らかにした[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。これは無効赤血球生成を示す。6カ月齢MDSマウスでは、RAP−536処置はRBC数(16.9%まで)およびヘモグロビン濃度(12.5%まで)を顕著に増加させ(図32A)、骨髄中の赤血球前駆体細胞数を低減し(図32A)、M/E比を野生型マウスでの比まで正常化した[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。
12カ月齢のMDSマウスでは、RAP−536処置は、ビヒクルと比較してRBC数(18.3%まで)およびヘモグロビンレベル(13.0%まで)を顕著に増加させ(図32B)、赤血球前駆体細胞数を低減し(図32B)、M:E比を改善した[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。RAP−536処置は、骨髄性前駆体の絶対数に影響を与えなかった。フローサイトメトリーは、RAP−536処置が両方の月齢のMDSマウスにおいて赤血球過形成を低減することを確認した。RAP−536で7カ月にわたり処置したMDSマウスでの経時分析は、研究期間にわたりRBC数における持続的な上昇を示した[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。併せてこれらの結果は、GDFトラップでの処置が疾患の重症度に関わらずMDSマウスにおいて貧血、赤血球過形成および無効赤血球生成を改善することを指し示す。
(実施例23)
GDFトラップに治療応答性のMDS患者における細胞学的および遺伝学的シグネチャー
(実施例23)
GDFトラップに治療応答性のMDS患者における細胞学的および遺伝学的シグネチャー
修飾アクチビン受容体IIB型およびIgG Fcを含有する組換え融合タンパク質[ActRIIB(L79D 25−131)−hFc、ラスパテルセプト(luspatercept)またはACE−536としても公知]は、骨髄異形成症候群(MDS)などの無効赤血球生成による貧血の処置のために開発されている。MDSを有する患者は、EPOのレベルがしばしば上昇しており、赤血球生成刺激剤(ESA)に非応答性または不応性である場合がある。MDS患者は、GDF11の血清レベルの増加[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]および骨髄におけるSmad 2/3シグナル伝達の増加[Zhouら、(2008年)Blood 112巻:3434〜3443頁]を有す
ることも示された。ActRIIB(L79D 25−131)−hFcは、GDF11を含むTGFβスーパーファミリー中のリガンドに結合し、Smad2/3シグナル伝達を阻害し、ESAとは異なる機構を介した後期赤血球分化を促進する。マウスバージョン、ActRIIB(L79D 25−131)−mFcは、MDSのマウスモデルにおいてSmad2シグナル伝達を低減し、ヘモグロビン(Hb)レベルを高め、骨髄赤血球過形成を減少させる[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。健康なボランティアでの研究では、ActRIIB(L79D 25−131)−hFcは、十分に許容され、Hbレベルを高めた[Attieら、(2014年)Am J Hematol
89巻:766〜770頁]。
ることも示された。ActRIIB(L79D 25−131)−hFcは、GDF11を含むTGFβスーパーファミリー中のリガンドに結合し、Smad2/3シグナル伝達を阻害し、ESAとは異なる機構を介した後期赤血球分化を促進する。マウスバージョン、ActRIIB(L79D 25−131)−mFcは、MDSのマウスモデルにおいてSmad2シグナル伝達を低減し、ヘモグロビン(Hb)レベルを高め、骨髄赤血球過形成を減少させる[Suraganiら、(2014年)Nat Med 20巻:408〜414頁]。健康なボランティアでの研究では、ActRIIB(L79D 25−131)−hFcは、十分に許容され、Hbレベルを高めた[Attieら、(2014年)Am J Hematol
89巻:766〜770頁]。
本出願人らは、高輸血負荷(HTB、ベースライン前の8週間あたり≧4単位RBCと規定される)または低輸血負荷(LTB、ベースライン前の8週間あたり<4単位RBCと規定される)のいずれかを有する、低いまたはInt−1危険性MDSを有する患者における貧血へのActRIIB(L79D 25−131)−hFcの効果を評価するために継続的、第2相、多施設、非盲検、用量設定試験を実施している。研究結果は、赤血球応答(LTB患者でのHb増加またはHTB患者での輸血負荷低減のいずれか)、安全性、認容性、薬物動態および薬力学的バイオマーカーを含む。組み入れ基準は:低いまたはInt−1危険性MDS、年齢≧18歳、貧血(HTB患者である、またはLTB患者においてベースラインHb<10.0g/dLを有すると規定される)、EPO>500U/LまたはESAに非応答性/不応性、アザシチジンまたはデシタビンが先行しない、およびESA、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)またはレナリドミド、サリドマイドもしくはポマリドミドで現在処置されていないことを含む。用量漸増相ではActRIIB(L79D 25−131)−hFcは、皮下注射によって3週間ごとに1回、7個の逐次コホート(n=3〜6)、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.33および1.75mg/kgの用量レベルで3カ月フォローアップを伴って5用量まで投与した。
データは、26名の患者(7名LTB/19名HTB)について利用可能であった。年齢中央値は71歳(範囲:27〜88歳)であり、50%は女性であり、54%は先行してEPO治療を受けており、15%は先行してレナリドミドを受けていた。WHOサブタイプによる患者分類は次の通り:15%RARS、46%RCMD−RS、15%RCMD、15%RAEB−1(≧15%の環状鉄芽球を有する患者2名を含む)および8%del(5q)。LTB患者(n=7)についての平均(SD)ベースラインHgbは、9.1(0.4)g/dLであった。処置前8週間に輸血された平均(SD)単位RBCは、LTB患者について0.9(1.1)単位およびHTB患者について6.3(2.4)単位であった。LTB患者7名の内2名は、8週間にわたりベースラインと比較して平均Hb≧1.5g/dL高まっていた。LTB患者における平均最大Hb増加は、0.125(n=1)、0.25(n=1)、0.75(n=3)および1.75(n=2)mg/kg用量群においてそれぞれ0.8、1.0、2.2および3.5g/dLであった。LTB患者7名の内6名はRBC輸血非依存(RBC−TI)を研究の間に≧8週間について達成した。0.75mg/kgから1.75mg/kgの範囲の用量レベルを活性用量と見なした。活性用量群の患者5名の内、4名(80%)は、≧2週間について≧1.5g/dlのHgb増加の予め規定したエンドポイントを達成した。患者2名(40%)は、LTB患者において≧1.5g/dlのHgb増加を≧8週間と規定されたHI−E応答を達成した[International Working Group; Chesonら、(2000年)Blood
96巻:3671〜3674頁、Chesonら、(2006年)Blood 108巻:419〜
425頁]。HTB患者ではHI−E応答は、研究開始前8週間と比較して、8週間の間に輸血された赤血球について少なくとも4単位の輸血負荷における低減と規定される。活性用量群では、12名の内5名(42%)のHTB患者が処置前8週間と比較して処置期間にわたり8週間間隔で輸血された≧4RBC単位の低減またはRBC単位での≧50%低減の予め規定したエンドポイントを達成し、同じ患者(12名のうち5名、42%)はHI−E応答を達成し;活性用量群のHTB患者12名の内3名(25%)は研究においてRBC−TI≧8週間を達成した。治験薬投与後の好中球数の増加が一部の患者において観察された。最終的にActRIIB(L79D 25−131)−hFcは一般に十分に許容された。関連する重篤な有害事象は今日までに報告されていない。原因に関わらず最も高頻度の有害事象は:下痢(n=4、グレード1/2)、骨痛、疲労、筋肉れん縮、筋肉痛および上咽頭炎(n=各3、グレード1/2)であった。
96巻:3671〜3674頁、Chesonら、(2006年)Blood 108巻:419〜
425頁]。HTB患者ではHI−E応答は、研究開始前8週間と比較して、8週間の間に輸血された赤血球について少なくとも4単位の輸血負荷における低減と規定される。活性用量群では、12名の内5名(42%)のHTB患者が処置前8週間と比較して処置期間にわたり8週間間隔で輸血された≧4RBC単位の低減またはRBC単位での≧50%低減の予め規定したエンドポイントを達成し、同じ患者(12名のうち5名、42%)はHI−E応答を達成し;活性用量群のHTB患者12名の内3名(25%)は研究においてRBC−TI≧8週間を達成した。治験薬投与後の好中球数の増加が一部の患者において観察された。最終的にActRIIB(L79D 25−131)−hFcは一般に十分に許容された。関連する重篤な有害事象は今日までに報告されていない。原因に関わらず最も高頻度の有害事象は:下痢(n=4、グレード1/2)、骨痛、疲労、筋肉れん縮、筋肉痛および上咽頭炎(n=各3、グレード1/2)であった。
骨髄吸引物の評価は、活性用量群(0.75〜1.75mg/kg)において環状鉄芽球の存在(赤血球前駆体の≧15%が環状鉄芽球形態を呈した場合に陽性と見なした)とActRIIB(L79D 25−131)−hFcへの応答性との間の関連を実証した。LTBおよびHTB患者の両方にわたる全体の応答率(上に記載のHI−E基準を使用)は、17名の内7名(41%)であった。ベースラインで環状鉄芽球について陽性の患者の内、患者13名の内7名(54%)がHI−E応答を達成し、とりわけベースラインで環状鉄芽球について陰性の患者4名でHI−E応答を達成した者はいなかった。
患者由来の骨髄吸引物もMDSに関連する変異(主に体細胞変異)を有することが公知である21個の異なる遺伝子中の変異の存在について評価した。ゲノムDNAを骨髄吸引物から単離し、遺伝子21個の選択したコード領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、これらの領域のDNA配列を次世代配列決定(骨髄性分子プロファイル21−遺伝子パネル、Genoptix,Inc.、Carlsbad、CA)を使用して決定した。この分析は、活性化シグナル伝達遺伝子(KIT、JAK2、NRAS、CBLおよびMPL)、転写因子(RUNX1、ETV6)、エピジェネティック遺伝子(IDH1、IDH2、TET2、DNMT3A、EZH2、ASXL1およびSETBP1)、RNAスプライシング遺伝子(SF3B1、U2AF1、ZRSR2およびSRSF2)ならびに腫瘍抑制因子/他(TP53、NPM1、PHF6)を調べた。SF3B1の分析はエクソン13〜16を特異的に標的化した。評価したこれら21個のMDS関連遺伝子について、SF3B1中の変異は、非応答性患者においてより応答性患者の骨髄細胞においてさらに高頻度で検出された。これらの患者において検出された個々のSF3B1変異を次の表に示す。場合によって同じ変異が複数の患者に生じていた。
活性用量群のSF3B1変異を有する患者では、8週間を超える輸血非依存を達成した全部で3名の患者を含んで9名の内6名(67%)がHI−E応答を達成した。SF3B1変異を有さない患者では、8名の内1名だけ(13%)がHI−E応答を達成した。SF3B1中の変異は、環状鉄芽球を有するMDS患者において高頻度で観察され、無効赤血球生成に関連する。
上に示す工程における臨床試験の初回分析は、データが利用可能であった44患者(15名LTB/29名HTB)について後期分析において確認した。年齢中央値は71歳(範囲:27〜88歳)であり、43%は女性であり、61%は先行してEPO治療を受けており、21%は先行してレナリドミドを受けていた。LTB患者(n=15)についての平均ベースラインHgbは9.0(範囲:6.8〜10.1)g/dLであった。処置前8週間において輸血された平均単位RBCは、輸血を受けていた6名のLTB患者について2(範囲2〜2)単位でありHTB患者について6(範囲:4〜14)単位であった。0.75mg/kgから1.75mg/kgの範囲の用量レベルを活性用量と見なした。活性用量群の35名のLTBおよびHTB患者の内、22名(63%)は、LTB患者について≧2週間の≧1.5g/dlのHgb増加、およびHTB患者について8週間にわたる輸血の≧4単位または50%低減の予め規定したエンドポイントを達成した。活性用量群の患者35名の内19名(54%)は、LTB患者について≧8週間の≧1.5g/dlのHgb増加、およびHTB患者について処置前8週間と比較して処置期間にわたり8週間間隔で輸血された≧4RBC単位の低減またはRBC単位での≧50%低減として規定されたHI−E応答を達成した[International Working Group; Chesonら、(2000年)Blood 96巻:3671〜3674頁、Chesonら、(2006年)Blood 108巻:419〜425頁]。ベースライン輸血を有する活性用量群の患者10名/28名(36%)は、少なくとも8週間にわたる輸血非依存を達成した。骨髄吸引物の評価は、活性用量群(0.75〜1.75mg/kg)において環状鉄芽球の存在(赤血球前駆体の≧15%が環状鉄芽球形態を呈した場合に陽性と見なした)またはSF3B1遺伝子中の変異とActRIIB(L79D 25−131)−hFcへの応答性との間の関連を実証した。LTBおよびHTB患者の両方にわたる全体の応答率(上に記載のHI−E基準を使用)は、19名/35名(54%)であった。ベースラインで環状鉄芽球について陽性の患者の内、19名/30名(63%)の患者がHI−E応答を達成し、とりわけベースラインで環状鉄芽球について陰性の患者4名でHI−E応答を達成した者はいなかった。ベースラインでSF3B1変異について陽性での患者の内、患者16名/22名(73%)がHI−E応答を達成し、とりわけベースラインでSF3B1変異について陰性の患者3名/13名(23%)だけがHI−E応答を達成した。最終的にActRIIB(L79D 25−131)−hFcは一般に十分に許容された。原因に関わらず最も高頻度の有害事象は:下痢、上咽頭炎、筋肉痛、骨痛、気管支炎、頭痛および筋肉れん縮であった。2種の関連する可能性がある重度の有害事象(SAE)が報告された:グレード3筋痛、グレード3全身状態の悪化。1種の関連する可能性がある重度でない芽球細胞数増加のグレード3有害事象が報告された。
後日実施されたさらなるデータ評価は、上の結果を拡張し一般に確認した。全体として活性用量群の患者49名の内24名(49%)は、低輸血負荷(LTB)を有する患者では≧8週間にわたる≧1.5g/dLのヘモグロビン濃度の増加として規定され、高輸血負荷(HTB)を有する患者では処置前8週間と比較して処置期間にわたり8週間間隔で輸血された≧4RBC単位の低減または≧50%RBC単位の低減として規定されたHI−E応答を達成した。ベースライン輸血を有する活性用量群の患者40名の内14名(35%)は、少なくとも8週間の輸血非依存を達成した。
ある種の体細胞遺伝子変異の存在下での応答率の評価を活性用量群の患者についても実施した。SF3B1中の変異は、非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。SF3B1変異を有する活性用量群における30名の患者の内18名(60%)がHI−E応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者19名の内6名(32%)だけがHI−E応答を達成した。これらの患者において検出された個々のSF3B1変異を次の表に示す。場合によって同じ変異が複数の患者において生じた。
同様にDNMT3A中の変異は、活性用量群において非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。DNMT3A変異を有する活性用量群における11名の患者の内7名(64%)がHI−E応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者38名の内17名(45%)はHI−E応答を達成した。これらの患者において検出された個々のDNMT3A変異を次の表に示す(IVSはイントロン性変異を指し、Xは中途終止コドンの形成を指し示す)。
同様にTET2中の変異は、活性用量群において非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。TET2変異を有する活性用量群における20名の患者の内11名(55%)がHI−E応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者29名の内13名(45%)はHI−E応答を達成した。これらの患者において検出された個々のTET2変異(公知の多型を除く)を次の表に示す。
他の遺伝子中の変異は、非応答性患者由来の細胞におけるものと類似する頻度で応答性患者由来の骨髄細胞において検出された。例えば、ASXL1変異を有する活性用量群の8名の患者のうち4名(50%)は、HI−E応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったそのような患者の類似の百分率(41名のうち20名、49%)がHI−E応答を達成した。
これらの結果は、≧15%の環状鉄芽球を呈し(および他の形態の鉄芽球性貧血を有する患者)および/またはSF3B1中に少なくとも1つの変異を有するMDSを有する患者は、<15%の環状鉄芽球でおよび/またはSF3B1中に変異を有さないMDS患者よりActRIIB(L79D 25−131)−hFcに治療応答する可能性が高いことを指し示す。同様に、≧15%の環状鉄芽球を呈し(および他の形態の鉄芽球性貧血を有する患者)および/またはDNMT3AもしくはTET2中に少なくとも1つの変異を呈する患者は、<15%の環状鉄芽球でおよび/またはDNMT3AもしくはTET2中に変異を有さないMDS患者よりActRIIB(L79D 25−131)−hFcに治療応答する可能性が高い。これらのデータに基づいて任意のこれらの患者サブグループの選択的処置は、ActRII阻害剤での処置の利益/危険比を大きく高めることが予測される。
(参考としての援用)
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒト患者において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を必要とする患者に配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与する工程を含み、前記患者が、0.75〜1.75mg/kgの前記ポリペプチドを前記患者に投与する工程を含む投薬スケジュール中である、方法。
(項目2)
前記ポリペプチドが配列番号44のアミノ酸配列からなる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ポリペプチドがダイマーである、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記ポリペプチドがGDF11に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。(項目5)
前記ポリペプチドがGDF8に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記ポリペプチドがGDF11およびGDF8に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ポリペプチドが、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記ポリペプチドが前記患者に皮下投与される、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記投薬スケジュールが前記ポリペプチドを前記患者に3週おきに1回投与する工程をさらに含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記患者が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記患者が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記患者が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記患者が前記EPO受容体アゴニストに対してもはや応答性でない、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目13〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記処置がヘモグロビンレベルを増加させる、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記処置が2週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記処置が8週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記患者が処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記患者が低輸血負荷患者である、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記患者が高輸血負荷患者である、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも4週間、50%以上血液細胞輸血を減少させる、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも8週間、50%以上血液細胞輸血を減少させる、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記患者が骨髄異形成症候群を有する、項目1〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記患者が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記鉄芽球性貧血患者が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目1〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記患者がSF3B1の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記患者がDNMT3Aの1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記患者がTET2の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目1〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
骨髄障害を処置または予防することを必要とする対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、前記対象にActRIIアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がSF3B1変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有し、必要に応じて、SF3B1遺伝子の変異がエクソン、イントロンまたは5’もしくは3’非翻訳領域にあり、必要に応じて、SF3B1の変異が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさず、必要に応じて、前記SF3B1遺伝子の変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700EおよびV701Fの変化から選択される、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす、方法。
(項目36)
前記対象が、鉄芽球性貧血、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)から選択される障害を有する、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記ActRIIアンタゴニストの投与が鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する、項目35または36に記載の方法。
(項目38)
前記対象がMDSを有する、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記対象が環状芽球を有する、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記対象がSF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数に体細胞性変異を有する、項目35〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目38〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目35〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目35〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目43〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
MDSを処置または予防することを必要とする対象においてMDSを処置または予防するための方法であって、前記対象にActRIIアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、方法。
(項目48)
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数の体細胞性変異を伴うMDS;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS;鉄過負荷を伴うMDS;ならびに好中球減少症を伴うMDSから選択されるMDSのサブタイプを有する、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目47または48に記載の方法。
(項目50)
前記対象が環状芽球を有する、項目47〜49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記対象が前記SF3B1遺伝子の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目47〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目47〜52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目53〜55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目47〜56のいずれか一項に記載の方法。(項目58)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目47〜57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目47〜58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を50%を超えて減少させる、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目47〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記処置が肝臓の鉄含有量を減少させる、項目47〜61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目47〜62のいずれか一項に記載の方法。(項目64)
前記処置が急性骨髄性白血病(AML)への変換を遅延させる、項目47〜63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、ActRIIアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
(項目66)
前記対象が1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1エクソンにある、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1イントロンにある、項目66または67に記載の方法。
(項目69)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1の5’および/または3’領域にある、項目66〜68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目66〜69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、エクソン14、エクソン15およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある、項目67に記載の方法。
(項目73)
前記対象が1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す、項目65〜72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aエクソンにある、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記DNMT3A変異の1つまたは複数がDNMT3Aイントロンにある、項目73または74に記載の方法。
(項目76)
前記DNMT3A変異の1つまたは複数がDNMT3Aの5’および/または3’領域にある、項目73〜75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目73〜76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある、項目74に記載の方法。(項目80)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が中途の終止コドンを導入する、項目73に記載の方法。
(項目81)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記対象が1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す、項目65〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2エクソンにある、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2イントロンにある、項目82または83に記載の方法。
(項目85)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2の5’および/または3’領域にある、項目82〜84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目82〜85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記1つまたは複数のTET2変異が、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記1つまたは複数のTET2変異が、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある、項目83に記載の方法。
(項目89)
前記1つまたは複数のTET2変異が中途の終止コドンを導入する、項目82に記載の方法。
(項目90)
前記1つまたは複数のTET2変異が、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記対象が貧血を有する、項目65〜90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目65〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目65〜92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目93のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目93〜95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
処置が白血病への変換を遅延させる、項目65〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目96に記載の方法。
(項目99)
前記対象が前白血病患者である、項目65〜98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目65〜99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目65〜100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目65〜101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記処置が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%減少させる、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%を超えて減少させる、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目65〜104のいずれか一項に記載の方法。
(項目106)
前記処置が肝臓および/または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目65〜105のいずれか一項に記載の方法。
(項目107)
骨髄異形成症候群(MDS)および/またはMDSの1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、ActRIIアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
(項目108)
前記対象が1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記変異のうちの1つまたは複数がSF3B1エクソンにある、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1イントロンにある、項目107または108に記載の方法。
(項目111)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1の5’および/または3’領域にある、項目107〜110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目107〜111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、エクソン14、エクソン14およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある、項目109に記載の方法。
(項目115)
前記対象が1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す、項目107〜114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aエクソンにある、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aイントロンにある、項目115または116に記載の方法。
(項目118)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aの5’および/または3’領域にある、項目115〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目115〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある、項目116に記載の方法。
(項目122)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が中途の終止コドンを導入する、項目115に記載の方法。
(項目123)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記対象が1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す、項目107〜123のいずれか一項に記載の方法。
(項目125)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2エクソンにある、項目124に記載の方法。
(項目126)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2イントロンにある、項目124または125に記載の方法。
(項目127)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2の5’および/または3’領域にある、項目124〜126のいずれか一項に記載の方法。
(項目128)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目124〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記1つまたは複数のTET2変異が、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目128に記載の方法。
(項目130)
前記1つまたは複数のTET2変異が、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある、項目125に記載の方法。
(項目131)
前記1つまたは複数のTET2変異が中途の終止コドンを導入する、項目124に記載の方法。
(項目132)
前記1つまたは複数のTET2変異が、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記対象が貧血を有する、項目107〜132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目107〜133のいずれか一項に記載の方法。
(項目135)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目107〜134のいずれか一項に記載の方法。
(項目136)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目136のいずれか一項に記載の方法。
(項目138)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目135〜137のいずれか一項に記載の方法。
(項目139)
処置が白血病への変換を遅延させる、項目107〜138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目139に記載の方法。
(項目141)
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目107〜140のいずれか一項に記載の方法。
(項目142)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目107〜141のいずれか一項に記載の方法。
(項目143)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目107〜142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
前記処置が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%減少させる、項目143に記載の方法。
(項目145)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%を超えて減少させる、項目143に記載の方法。
(項目146)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目107〜145のいずれか一項に記載の方法。(項目147)
前記処置が肝臓および/または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目107〜145のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数における体細胞性変異を伴うMDS;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS;鉄過負荷を伴うMDS;ならびに好中球減少症を伴うMDSから選択されるMDSのサブタイプを有する、項目107〜147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
前記対象が、低、中間1または中間2から選択される国際予後スコアリングシステム(IPSS)スコアを有する、項目107〜148のいずれか一項に記載の方法。
(項目150)
前記対象が環状芽球を有する、項目107〜149のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目150に記載の方法。
(項目152)
前記ActRIIアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目153)
前記ActRIIAポリペプチドが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を含むか、または配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号11のアミノ酸配列を含むか、または配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号22のアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号26のアミノ酸配列を含むか、または配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号28のアミノ酸配列を含むか、または配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
f)配列番号9のアミノ酸30〜110と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号9のアミノ酸30〜110の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目152に記載の方法。
(項目154)
前記ActRIIアンタゴニストがActRIIBポリペプチドである、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目155)
前記ActRIIBポリペプチドが、
a)配列番号1のアミノ酸29〜109と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸29〜109の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号1のアミノ酸25〜131と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸25〜131の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号2のアミノ酸配列を含むか、または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号3のアミノ酸配列を含むか、または配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号4のアミノ酸配列を含むか、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
f)配列番号5のアミノ酸配列を含むか、または配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
g)配列番号6のアミノ酸配列を含むか、または配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
h)配列番号36のアミノ酸配列を含むか、または配列番号36のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
i)配列番号37のアミノ酸配列を含むか、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
j)配列番号38のアミノ酸配列を含むか、または配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
k)配列番号49のアミノ酸配列を含むか、または配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
l)配列番号50のアミノ酸配列を含むか、または配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
m)配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
n)配列番号41のアミノ酸配列を含むか、または配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
o)配列番号44のアミノ酸配列を含むか、または配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
p)配列番号45のアミノ酸配列を含むか、または配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
q)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記ActRIIBポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸を含む、項目155に記載の方法。
(項目157)
前記ActRIIアンタゴニストがGDFトラップポリペプチドである、項目1〜156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
前記ポリペプチドが、ActRIIポリペプチドドメインに加えて、in vivo半減期、in vitro半減期、投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成および精製のうちの1つまたは複数を増強する1つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である、項目152〜157のいずれか一項に記載の方法。
(項目159)
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンFcドメインおよび血清アルブミンから選択される異種ポリペプチドドメインを含む、項目158に記載の方法。
(項目160)
前記免疫グロブリンFcドメインがIgG1 Fcドメインである、項目159に記載の方法。
(項目161)
前記免疫グロブリンFcドメインが配列番号15または16から選択されるアミノ酸配列を含む、項目159に記載の方法。
(項目162)
前記融合タンパク質が、前記ActRIIポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンFcドメインとの間に配置されるリンカードメインをさらに含む、項目158〜161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
前記リンカードメインがTGGGまたはGGGリンカーである、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記ポリペプチドが、
a)配列番号22のアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
b)配列番号28のアミノ酸配列を含むか、または配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むActRIIA−Fc融合タンパク質である、項目158に記載の方法。
(項目165)
前記ポリペプチドが、
a)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号36のアミノ酸配列を含むか、または配列番号36のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号38のアミノ酸配列を含むか、または配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号41のアミノ酸配列を含むか、または配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
f)配列番号44のアミノ酸配列を含むか、または配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
g)配列番号45のアミノ酸配列を含むか、または配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
h)配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むActRIIB−Fc融合タンパク質である、項目158に記載の方法。
(項目166)
前記ActRIIB−Fc融合タンパク質が配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸を含む、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸および有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目152〜166のいずれか一項に記載の方法。
(項目168)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目167に記載の方法。
(項目169)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記ポリペプチドがGDF11に結合する、項目152〜169のいずれか一項に記載の方法。
(項目171)
前記ポリペプチドがGDF8に結合する、項目152〜170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記ポリペプチドがアクチビンに結合する、項目152〜171のいずれか一項に記載の方法。
(項目173)
前記ポリペプチドがアクチビンAに結合する、項目172に記載の方法。
(項目174)
前記ポリペプチドがアクチビンBに結合する、項目172または173に記載の方法。(項目175)
前記ActRIIアンタゴニストが抗GDF11抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目176)
前記ActRIIアンタゴニストが抗GDF8抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目177)
前記ActRIIアンタゴニストが抗アクチビン抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目178)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンAに結合する、項目177に記載の方法。
(項目179)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンBに結合する、項目177に記載の方法。
(項目180)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンAおよびアクチビンBに結合する、項目177に記載の方法。
(項目181)
前記ActRIIアンタゴニストが、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP7、GDF3およびBMP6のうちの1つまたは複数にさらに結合する多特異性抗体である、項目175〜180のいずれか一項に記載の方法。
(項目182)
前記ActRIIアンタゴニストが抗ActRII抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目183)
前記抗ActRII抗体がActRIIAに結合する、項目182に記載の方法。
(項目184)
前記抗ActRII抗体がActRIIBに結合する、項目182に記載の方法。
(項目185)
前記抗ActRII抗体がActRIIAおよびActRIIBに結合する、項目182に記載の方法。
(項目186)
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、項目175〜185のいずれか一項に記載の方法。
(項目187)
前記抗体が単鎖抗体、F(ab’)2断片、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Fv断片、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディー、および免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質である、項目175〜186のいずれか一項に記載の方法。
(項目188)
鉄芽球性貧血のために1つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目1〜187のいずれか一項に記載の方法。
(項目189)
MDSのために1つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目1〜187のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
前記支持療法が赤血球、顆粒球および栓球のうちの1つまたは複数の輸血である、項目188または189に記載の方法。
(項目191)
前記支持療法が1つまたは複数の鉄キレート化剤の投与を含む、項目188〜190のいずれか一項に記載の方法。
(項目192)
前記1つまたは複数の鉄キレート化剤が、
a)デフェロキサミン;
b)デフェリプロン;および
c)デフェラシロクス
から選択される、項目191に記載の方法。
(項目193)
前記支持療法がEPO受容体活性化因子を投与する工程を含む、項目188〜192のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
前記EPO受容体活性化因子が、EPO、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、ダーベポエチンアルファ、メトキシ−ポリエチレン−グリコールエポエチンベータおよび合成赤血球生成タンパク質(SEP)から選択される、項目193に記載の方法。
(項目195)
前記支持療法が、G−CSF類似体、GM−CSF類似体、鉄キレート化剤、ヘプシジンまたはヘプシジン受容体活性化因子、レナリドマイド、サリドマイド、ポマリドマイド、アザシチジン、デシタビン、抗胸腺細胞グロブリンおよびトロンボ模倣剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、p38MAPK阻害剤、グルタチオンSトランスフェラーゼπ阻害剤、アレムツズマブ、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択される1つまたは複数の作用因子の投与を含む、項目188〜194のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒト患者において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を必要とする患者に配列番号44のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与する工程を含み、前記患者が、0.75〜1.75mg/kgの前記ポリペプチドを前記患者に投与する工程を含む投薬スケジュール中である、方法。
(項目2)
前記ポリペプチドが配列番号44のアミノ酸配列からなる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ポリペプチドがダイマーである、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記ポリペプチドがGDF11に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。(項目5)
前記ポリペプチドがGDF8に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記ポリペプチドがGDF11およびGDF8に結合する、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ポリペプチドが、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記ポリペプチドが前記患者に皮下投与される、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記投薬スケジュールが前記ポリペプチドを前記患者に3週おきに1回投与する工程をさらに含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記患者が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記患者が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記患者が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記患者が前記EPO受容体アゴニストに対してもはや応答性でない、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目13〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記処置がヘモグロビンレベルを増加させる、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記処置が2週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記処置が8週以上の間1.5g/dL以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記患者が処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記患者が低輸血負荷患者である、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記患者が高輸血負荷患者である、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも4週間、50%以上血液細胞輸血を減少させる、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも8週間、50%以上血液細胞輸血を減少させる、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記患者が骨髄異形成症候群を有する、項目1〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記患者が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記鉄芽球性貧血患者が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目1〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記患者がSF3B1の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記患者がDNMT3Aの1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記患者がTET2の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目1〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目1〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
骨髄障害を処置または予防することを必要とする対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、前記対象にActRIIアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がSF3B1変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有し、必要に応じて、SF3B1遺伝子の変異がエクソン、イントロンまたは5’もしくは3’非翻訳領域にあり、必要に応じて、SF3B1の変異が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさず、必要に応じて、前記SF3B1遺伝子の変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700EおよびV701Fの変化から選択される、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす、方法。
(項目36)
前記対象が、鉄芽球性貧血、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)から選択される障害を有する、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記ActRIIアンタゴニストの投与が鉄芽球性貧血の1つまたは複数の合併症を処置または予防する、項目35または36に記載の方法。
(項目38)
前記対象がMDSを有する、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記対象が環状芽球を有する、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記対象がSF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数に体細胞性変異を有する、項目35〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目38〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目35〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目35〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目43〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
MDSを処置または予防することを必要とする対象においてMDSを処置または予防するための方法であって、前記対象にActRIIアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、方法。
(項目48)
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数の体細胞性変異を伴うMDS;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS;鉄過負荷を伴うMDS;ならびに好中球減少症を伴うMDSから選択されるMDSのサブタイプを有する、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム(IPSS)またはIPSS−Rスコアを有する、項目47または48に記載の方法。
(項目50)
前記対象が環状芽球を有する、項目47〜49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記対象が前記SF3B1遺伝子の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目47〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目47〜52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目53〜55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目47〜56のいずれか一項に記載の方法。(項目58)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目47〜57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目47〜58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を50%を超えて減少させる、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目47〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記処置が肝臓の鉄含有量を減少させる、項目47〜61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目47〜62のいずれか一項に記載の方法。(項目64)
前記処置が急性骨髄性白血病(AML)への変換を遅延させる、項目47〜63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、ActRIIアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
(項目66)
前記対象が1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1エクソンにある、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1イントロンにある、項目66または67に記載の方法。
(項目69)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1の5’および/または3’領域にある、項目66〜68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目66〜69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、エクソン14、エクソン15およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある、項目67に記載の方法。
(項目73)
前記対象が1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す、項目65〜72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aエクソンにある、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記DNMT3A変異の1つまたは複数がDNMT3Aイントロンにある、項目73または74に記載の方法。
(項目76)
前記DNMT3A変異の1つまたは複数がDNMT3Aの5’および/または3’領域にある、項目73〜75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目73〜76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある、項目74に記載の方法。(項目80)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が中途の終止コドンを導入する、項目73に記載の方法。
(項目81)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記対象が1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す、項目65〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2エクソンにある、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2イントロンにある、項目82または83に記載の方法。
(項目85)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2の5’および/または3’領域にある、項目82〜84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目82〜85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記1つまたは複数のTET2変異が、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記1つまたは複数のTET2変異が、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある、項目83に記載の方法。
(項目89)
前記1つまたは複数のTET2変異が中途の終止コドンを導入する、項目82に記載の方法。
(項目90)
前記1つまたは複数のTET2変異が、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記対象が貧血を有する、項目65〜90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目65〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目65〜92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目93のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目93〜95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
処置が白血病への変換を遅延させる、項目65〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目96に記載の方法。
(項目99)
前記対象が前白血病患者である、項目65〜98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目65〜99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目65〜100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目65〜101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記処置が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%減少させる、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%を超えて減少させる、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目65〜104のいずれか一項に記載の方法。
(項目106)
前記処置が肝臓および/または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目65〜105のいずれか一項に記載の方法。
(項目107)
骨髄異形成症候群(MDS)および/またはMDSの1つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、ActRIIアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にActRIIアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、SF3B1、DNMT3AおよびTET2からなる群から選択される遺伝子の1つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
(項目108)
前記対象が1つまたは複数のSF3B1変異について陽性反応を示す、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記変異のうちの1つまたは複数がSF3B1エクソンにある、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1イントロンにある、項目107または108に記載の方法。
(項目111)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数がSF3B1の5’および/または3’領域にある、項目107〜110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記SF3B1変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したSF3B1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目107〜111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、K182E、E491G、R590K、E592K、R625C、R625G、N626D、N626S、H662Y、T663A、K666M、K666Q、K666R、Q670E、G676D、V701I、I704N、I704V、G740R、A744P、D781G、A1188V、N619K、N626H、N626Y、R630S、I704T、G740E、K741N、G742D、D894G、Q903R、R1041H、I1241T、G347V、E622D、Y623C、R625H、R625L、H662D、H662Q、T663I、K666E、K666N、K666T、K700E、V701FおよびE783Kからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記1つまたは複数のSF3B1変異が、エクソン14、エクソン14およびエクソン16からなる群から選択されるSF3B1エクソンにある、項目109に記載の方法。
(項目115)
前記対象が1つまたは複数のDNMT3A変異について陽性反応を示す、項目107〜114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aエクソンにある、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aイントロンにある、項目115または116に記載の方法。
(項目118)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数がDNMT3Aの5’および/または3’領域にある、項目115〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記DNMT3A変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したDNMT3A遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目115〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、R882C、R882H、P904LおよびP905Pからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、エクソン10、エクソン18およびエクソン22からなる群から選択されるDNMT3Aエクソンにある、項目116に記載の方法。
(項目122)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が中途の終止コドンを導入する、項目115に記載の方法。
(項目123)
前記1つまたは複数のDNMT3A変異が、Y436XおよびW893Xからなる群から選択される、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記対象が1つまたは複数のTET2変異について陽性反応を示す、項目107〜123のいずれか一項に記載の方法。
(項目125)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2エクソンにある、項目124に記載の方法。
(項目126)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2イントロンにある、項目124または125に記載の方法。
(項目127)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数がTET2の5’および/または3’領域にある、項目124〜126のいずれか一項に記載の方法。
(項目128)
前記TET2変異のうちの1つまたは複数が、前記変異したTET2遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および/または置換を引き起こす、項目124〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記1つまたは複数のTET2変異が、E47Q、Q1274R、W1291R、G1370R、G1370E、N1387SおよびY1724Hからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目128に記載の方法。
(項目130)
前記1つまたは複数のTET2変異が、エクソン1、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8およびエクソン9からなる群から選択されるTET2エクソンにある、項目125に記載の方法。
(項目131)
前記1つまたは複数のTET2変異が中途の終止コドンを導入する、項目124に記載の方法。
(項目132)
前記1つまたは複数のTET2変異が、R550X、Q1009X、Y1337X、R1404X、R1516XおよびQ1652Xからなる群から選択される、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記対象が貧血を有する、項目107〜132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性EPOを有する、項目107〜133のいずれか一項に記載の方法。
(項目135)
前記対象が1つまたは複数のEPO受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目107〜134のいずれか一項に記載の方法。
(項目136)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記対象が前記EPO受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目136のいずれか一項に記載の方法。
(項目138)
前記EPO受容体アゴニストがEPOである、項目135〜137のいずれか一項に記載の方法。
(項目139)
処置が白血病への変換を遅延させる、項目107〜138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目139に記載の方法。
(項目141)
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび/またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目107〜140のいずれか一項に記載の方法。
(項目142)
前記対象が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前に1回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目107〜141のいずれか一項に記載の方法。
(項目143)
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目107〜142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
前記処置が前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約30%を超えて、約40%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えてまたは100%減少させる、項目143に記載の方法。
(項目145)
前記処置が、前記ActRIIアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて4〜8週間、血液細胞輸血を約50%を超えて減少させる、項目143に記載の方法。
(項目146)
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目107〜145のいずれか一項に記載の方法。(項目147)
前記処置が肝臓および/または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目107〜145のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCUD);多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うMDS(RCMD−RS);SF3B1、SRSF2、DNMT3AおよびTET2のうちの1つまたは複数における体細胞性変異を伴うMDS;ASXL1またはZRSR2の体細胞性変異のないMDS;鉄過負荷を伴うMDS;ならびに好中球減少症を伴うMDSから選択されるMDSのサブタイプを有する、項目107〜147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
前記対象が、低、中間1または中間2から選択される国際予後スコアリングシステム(IPSS)スコアを有する、項目107〜148のいずれか一項に記載の方法。
(項目150)
前記対象が環状芽球を有する、項目107〜149のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の環状芽球を有する、項目150に記載の方法。
(項目152)
前記ActRIIアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目153)
前記ActRIIAポリペプチドが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を含むか、または配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号11のアミノ酸配列を含むか、または配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号22のアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号26のアミノ酸配列を含むか、または配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号28のアミノ酸配列を含むか、または配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
f)配列番号9のアミノ酸30〜110と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号9のアミノ酸30〜110の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目152に記載の方法。
(項目154)
前記ActRIIアンタゴニストがActRIIBポリペプチドである、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目155)
前記ActRIIBポリペプチドが、
a)配列番号1のアミノ酸29〜109と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸29〜109の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号1のアミノ酸25〜131と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸25〜131の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号2のアミノ酸配列を含むか、または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号3のアミノ酸配列を含むか、または配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号4のアミノ酸配列を含むか、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
f)配列番号5のアミノ酸配列を含むか、または配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
g)配列番号6のアミノ酸配列を含むか、または配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
h)配列番号36のアミノ酸配列を含むか、または配列番号36のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
i)配列番号37のアミノ酸配列を含むか、または配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
j)配列番号38のアミノ酸配列を含むか、または配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
k)配列番号49のアミノ酸配列を含むか、または配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
l)配列番号50のアミノ酸配列を含むか、または配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
m)配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
n)配列番号41のアミノ酸配列を含むか、または配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
o)配列番号44のアミノ酸配列を含むか、または配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
p)配列番号45のアミノ酸配列を含むか、または配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
q)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記ActRIIBポリペプチドが配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸を含む、項目155に記載の方法。
(項目157)
前記ActRIIアンタゴニストがGDFトラップポリペプチドである、項目1〜156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
前記ポリペプチドが、ActRIIポリペプチドドメインに加えて、in vivo半減期、in vitro半減期、投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成および精製のうちの1つまたは複数を増強する1つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である、項目152〜157のいずれか一項に記載の方法。
(項目159)
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンFcドメインおよび血清アルブミンから選択される異種ポリペプチドドメインを含む、項目158に記載の方法。
(項目160)
前記免疫グロブリンFcドメインがIgG1 Fcドメインである、項目159に記載の方法。
(項目161)
前記免疫グロブリンFcドメインが配列番号15または16から選択されるアミノ酸配列を含む、項目159に記載の方法。
(項目162)
前記融合タンパク質が、前記ActRIIポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンFcドメインとの間に配置されるリンカードメインをさらに含む、項目158〜161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
前記リンカードメインがTGGGまたはGGGリンカーである、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記ポリペプチドが、
a)配列番号22のアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
b)配列番号28のアミノ酸配列を含むか、または配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むActRIIA−Fc融合タンパク質である、項目158に記載の方法。
(項目165)
前記ポリペプチドが、
a)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号36のアミノ酸配列を含むか、または配列番号36のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号29のアミノ酸配列を含むか、または配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
d)配列番号38のアミノ酸配列を含むか、または配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
e)配列番号41のアミノ酸配列を含むか、または配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
f)配列番号44のアミノ酸配列を含むか、または配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
g)配列番号45のアミノ酸配列を含むか、または配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
h)配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むActRIIB−Fc融合タンパク質である、項目158に記載の方法。
(項目166)
前記ActRIIB−Fc融合タンパク質が配列番号1に関して79位に酸性アミノ酸を含む、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸および有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目152〜166のいずれか一項に記載の方法。
(項目168)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目167に記載の方法。
(項目169)
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記ポリペプチドがGDF11に結合する、項目152〜169のいずれか一項に記載の方法。
(項目171)
前記ポリペプチドがGDF8に結合する、項目152〜170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記ポリペプチドがアクチビンに結合する、項目152〜171のいずれか一項に記載の方法。
(項目173)
前記ポリペプチドがアクチビンAに結合する、項目172に記載の方法。
(項目174)
前記ポリペプチドがアクチビンBに結合する、項目172または173に記載の方法。(項目175)
前記ActRIIアンタゴニストが抗GDF11抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目176)
前記ActRIIアンタゴニストが抗GDF8抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目177)
前記ActRIIアンタゴニストが抗アクチビン抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目178)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンAに結合する、項目177に記載の方法。
(項目179)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンBに結合する、項目177に記載の方法。
(項目180)
前記ActRIIアンタゴニストがアクチビンAおよびアクチビンBに結合する、項目177に記載の方法。
(項目181)
前記ActRIIアンタゴニストが、GDF11、GDF8、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンC、アクチビンE、BMP7、GDF3およびBMP6のうちの1つまたは複数にさらに結合する多特異性抗体である、項目175〜180のいずれか一項に記載の方法。
(項目182)
前記ActRIIアンタゴニストが抗ActRII抗体である、項目1〜151のいずれか一項に記載の方法。
(項目183)
前記抗ActRII抗体がActRIIAに結合する、項目182に記載の方法。
(項目184)
前記抗ActRII抗体がActRIIBに結合する、項目182に記載の方法。
(項目185)
前記抗ActRII抗体がActRIIAおよびActRIIBに結合する、項目182に記載の方法。
(項目186)
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、項目175〜185のいずれか一項に記載の方法。
(項目187)
前記抗体が単鎖抗体、F(ab’)2断片、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Fv断片、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディー、および免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質である、項目175〜186のいずれか一項に記載の方法。
(項目188)
鉄芽球性貧血のために1つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目1〜187のいずれか一項に記載の方法。
(項目189)
MDSのために1つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目1〜187のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
前記支持療法が赤血球、顆粒球および栓球のうちの1つまたは複数の輸血である、項目188または189に記載の方法。
(項目191)
前記支持療法が1つまたは複数の鉄キレート化剤の投与を含む、項目188〜190のいずれか一項に記載の方法。
(項目192)
前記1つまたは複数の鉄キレート化剤が、
a)デフェロキサミン;
b)デフェリプロン;および
c)デフェラシロクス
から選択される、項目191に記載の方法。
(項目193)
前記支持療法がEPO受容体活性化因子を投与する工程を含む、項目188〜192のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
前記EPO受容体活性化因子が、EPO、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、ダーベポエチンアルファ、メトキシ−ポリエチレン−グリコールエポエチンベータおよび合成赤血球生成タンパク質(SEP)から選択される、項目193に記載の方法。
(項目195)
前記支持療法が、G−CSF類似体、GM−CSF類似体、鉄キレート化剤、ヘプシジンまたはヘプシジン受容体活性化因子、レナリドマイド、サリドマイド、ポマリドマイド、アザシチジン、デシタビン、抗胸腺細胞グロブリンおよびトロンボ模倣剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、p38MAPK阻害剤、グルタチオンSトランスフェラーゼπ阻害剤、アレムツズマブ、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択される1つまたは複数の作用因子の投与を含む、項目188〜194のいずれか一項に記載の方法。
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- 明細書に記載の発明。
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