JP7154250B2 - アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法 - Google Patents

アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7154250B2
JP7154250B2 JP2020077142A JP2020077142A JP7154250B2 JP 7154250 B2 JP7154250 B2 JP 7154250B2 JP 2020077142 A JP2020077142 A JP 2020077142A JP 2020077142 A JP2020077142 A JP 2020077142A JP 7154250 B2 JP7154250 B2 JP 7154250B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
activin
gdf11
antibody
trap
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020077142A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020111621A (ja
JP2020111621A5 (ja
Inventor
クマール ラビンドラ
ベンカタ サイ ラジャセクハル スラガニ ナガ
ノプフ ジョン
Original Assignee
アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド filed Critical アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド
Publication of JP2020111621A publication Critical patent/JP2020111621A/ja
Publication of JP2020111621A5 publication Critical patent/JP2020111621A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7154250B2 publication Critical patent/JP7154250B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１４年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／９６９，０７３号、および２０１４年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０２１，９２３号に対する利益を主張する。上記参照の出願の全ての教示は、参考として本明細書に援用される。
（発明の背景）
成熟した赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、すなわちエリスロサイト（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、脊椎動物の循環系において酸素の輸送を担っている。赤血球は、比較的高い酸素分圧（ｐＯ２）の肺において酸素に結合し、そして、比較的低いｐＯ２の身体の領域へと酸素を運搬するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で含む。
成熟赤血球は、赤血球生成と呼ばれるプロセスにおいて、多能性の造血幹細胞から生成される。出生後の赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激（酸素圧の増減または組織の要求を含む）に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、分化系列が決定した（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上昇、または、網状赤血球：赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、脊椎動物における出生後の赤血球生成の最も重要な正の調節因子として広く認識されている。ＥＰＯは、組織酸素圧の低下（低酸素）および低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対し、これを補う赤血球生成性の応答を調節する。ヒトでは、ＥＰＯレベルの上昇は、骨髄および脾臓における赤血球先駆細胞の生成を刺激することによって、赤血球の形成を促進する。マウスでは、ＥＰＯは、主として脾臓における赤血球生成を増強する。
ＥＰＯの効果は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属する細胞表面受容体によって媒介される。ヒトＥＰＯ受容体遺伝子は、４８３アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードするが、活性ＥＰＯ受容体は、リガンドの非存在下においても多量体の複合体として存在すると考えられる［例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい］。クローニングされて哺乳動物細胞内で発現がなされた全長ＥＰＯ受容体は、赤芽球系前駆細胞上の天然の受容体のアフィニティーと同様のアフィニティーでＥＰＯに結合する。ＥＰＯのその受容体への結合は、受容体の活性化、ならびに未成熟赤芽球の増殖の増大、未成熟赤芽球の分化の増大、および赤芽球系前駆細胞におけるアポトーシスの低減を含む生物学的効果を結果としてもたらす、コンフォメーション変化を引き起こす［例えば、Ｌｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：１１３５１～１１３５５頁；およびＫｏｕｒｙら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：３７８～３８１頁を参照されたい］。
種々の臨床的状況において赤血球レベルを増加させるため、特に、貧血の処置において、組換え型ＥＰＯの種々の形態が医師によって使用されている。貧血は、血中のヘモグロビンまたは赤血球が正常レベルよりも低いことによって特徴付けられる、広く定義される状態である。ある場合には、貧血は、赤血球の生成または生存における一次的な障害によって引き起こされる（例えば、サラセミア障害または鎌状赤血球貧血）。より一般的には、貧血は、他の系の疾患に対して続発的である［例えば、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ＆ Ｐｒｏｖａｎ （２０００） Ｌａｎｃｅｔ ３５５， １１６９－１１７５を参照されたい］。貧血は、赤血球の生成速度の低下もしくは破壊速度の増加から、または、出血に起因する赤血球の喪失によって生じ得る。貧血は、例えば、急性もしくは慢性腎不全または末期腎臓疾患、化学療法処置、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチおよび骨髄移植を含む種々の障害から生じ得る。
ＥＰＯを用いた処置は、代表的に、数週間の期間にわたり、健康なヒトにおいて約１～３ｇ／ｄＬのヘモグロビンの上昇をもたらす。貧血の個体に投与された場合、この処置レジメンは、しばしば、ヘモグロビンおよび赤血球のレベルのかなりの増加を提供し、そして、クオリティオブライフの改善と生存の延長につながる。しかし、ＥＰＯは、一様に有効ではなく、多くの個体は、高用量に対してさえも不応性である［例えば、Ｈｏｒｌ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５，
４３－５０を参照されたい］。例えば、５０％より多くのがんを有する患者がＥＰＯに対して不十分な応答を有し、末期の腎疾患を有する患者の約１０％がＥＰＯに対して低反応性であり［例えば、Ｇｌａｓｐｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５， １２１８－１２３４；およびＤｅｍｅｔｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６， ３４１２－３４２５を参照されたい］、そして、骨髄異形成症候群を有する患者の１０％未満しか有利に応答しない［Ｅｓｔｅｙ （２００３） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １０， ６０－６７０を参照されたい］。炎症、鉄およびビタミンの欠乏、不適切な透析、アルミニウムの毒性、および副甲状腺機能亢進を含むいくつかの要因は、治療応答が乏しいことを予測し得る。ＥＰＯに対する抵抗性の分子機構は、いまだにはっきりしていない。近年の証拠は、より高用量のＥＰＯが、一部の患者集団における心血管性の罹患率、腫瘍の増殖、および死亡率という危険性の増大と関連し得ることを示唆する［例えば、Ｋｒａｐｆら（２００９年）、Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、４巻：４７０～４８０頁；およびＧｌａｓｐｙ（２００９年）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、６０巻：１８１～１９２頁を参照されたい］。したがって、ＥＰＯベースの治療用化合物（例えば、エリスロポエチン刺激剤、ＥＳＡ）を、赤血球輸血を回避するのに必要な最低用量で投与することが推奨されている［例えば、Ｊｅｌｋｍａｎｎら（２００８年）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ、６７巻：３９～６１頁を参照されたい］。
無効赤血球生成とは、早期における赤芽球系細胞数の増加にもかかわらず、エリスロサイトの生成が低減される、赤芽球系障害群を記載するのに使用される用語である［例えば、Ｔａｎｎｏ（２０１０年）、Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：３５８２８３頁を参照されたい］。無効赤血球生成はしばしば、貧血、エリスロポエチンレベルの上昇、過剰数の赤血球前駆体の形成、および鉄過負荷を引き起こす。遷延すると、これらの状態は、脾腫、肝臓障害および心臓障害、ならびに骨損傷のほか、他の合併症ももたらし得る。無効赤血球生成を有する患者においては一般に、内因性エリスロポエチンレベルが極めて高いため、ＥＰＯベースの治療剤はしばしば、これらの患者における貧血を処置することがないか、または脾腫および鉄過負荷など、疾患の他の側面の悪化を引き起こし得る。
米国特許第６，３１９，４９９号明細書
Ｌｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：１１３５１～１１３５５頁 Ｋｏｕｒｙら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：３７８～３８１頁 Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ＆ Ｐｒｏｖａｎ （２０００） Ｌａｎｃｅｔ ３５５， １１６９－１１７５ Ｈｏｒｌ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５， ４３－５０ Ｇｌａｓｐｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５， １２１８－１２３４ Ｄｅｍｅｔｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６， ３４１２－３４２５ Ｅｓｔｅｙ （２００３） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １０， ６０－６７０ Ｋｒａｐｆら（２００９年）、Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、４巻：４７０～４８０頁頁 Ｇｌａｓｐｙ（２００９年）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、６０巻：１８１～１９２ Ｊｅｌｋｍａｎｎら（２００８年）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ、６７巻：３９～６１頁 Ｔａｎｎｏ（２０１０年）、Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：３５８２８３頁
したがって、赤血球レベルを高め、かつ／または無効赤血球生成の文脈における他の障害に取り組むための代替的な方法を提供することが本開示の目的である。
ある特定の態様では、本開示は、対象において、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防することを必要とする対象に、少なくともアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１に拮抗（を阻害）する作用因子または作用因子群の組合せの有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、アクチビンＢを阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＡｃｔＲＩＩＢに結合し、Ｓｍａｄ２／３を介してシグナル伝達する１つまたは複数の追加のリガンドをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＡｃｔＲＩＩＢに結合し、Ｓｍａｄ２／３を介してシグナル伝達する１つまたは複数の追加のリガンドをさらに阻害する。例えば、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８をさらに阻害し得る。任意選択で、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＡを阻害しない。ある特定の実施形態では、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＥ、アクチビンＣ、およびＢＭＰ６の１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の実施形態では、作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂの１つまたは複数をさらに阻害し得る。ある特定の実施形態では、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＢＭＰ９の、ＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用、および／またはＢＭＰ１０の、ＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用をさらに阻害する。好ましくは、本開示の方法に従い使用される作用因子または作用因子群の組合せは、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との相互作用および／またはＢＭＰ１０とＡＬＫ１との相互作用（例えば、結合、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化など）を阻害しないか、またはこれらを実質的に阻害しない。阻害は、当該分野で公知の様々な生化学的アッセイのほか、本明細書で提供される生化学的アッセイ（例えば、タンパク質ベースのアッセイ、細胞ベースのアッセイなど）によっても評価することができる。
一部の実施形態では、作用因子または作用因子群の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、少なくともアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達（Ｓｍａｄ２／３のシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、作用因子または作用因子群の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＡに実質的に結合しない。一部の実施形態では、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＡ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のシグナル伝達のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合する作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＡ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数にさらに結合する。
一部の実施形態では、作用因子は、少なくともＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合しかつ／またはこれらを阻害する多特異性抗体または多特異性抗体の組合せである。一部の実施形態では、多特異性抗体または多特異性抗体の組合せは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、多特異性抗体または多特異性抗体の組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合しかつ／またはこれらを阻害する多特異性抗体または多特異性抗体の組合せは、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。
一部の実施形態では、多特異性抗体は、二特異性抗体または二特異性抗体の組合せである。一部の実施形態では、二特異性抗体または二特異性抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらを阻害する。一部の実施形態では、二特異性抗体または二特異性抗体の組合せは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。
一部の実施形態では、二特異性抗体は、互いに会合した２つの異なる単一特異性抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。一部の実施形態では、抗体は、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Ｆｖフラグメント、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディーと免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部とを含む融合タンパク質である。
一部の実施形態では、抗体は、二重可変ドメイン免疫グロブリンである。
一部の実施形態では、抗体は、異種部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む。一部の実施形態では、異種部分は、糖、検出可能な標識、または安定化部分である。
一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップである。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＡトラップは、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、アクチビンＢに、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または１ｐＭ未満のＫＤで結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、アクチビンＢに、１ｎＭ～７５０ｐＭ、７５０ｐＭ～５００ｐＭ、５００ｐＭ～２５０ｐＭ、２５０ｐＭ～１００ｐＭ、１００ｐＭ～５０ｐＭ、５０～２５ｐＭ、２５～１０ｐＭ、または１０～１ｐＭのＫＤで結合する。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップの、アクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより、３倍低い、４倍高い、５倍高い、６倍高い、７倍高い、８倍高い、９倍高い、１０倍高い、１５倍高い、または２０倍高い。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号３または４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号５または６のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号４８のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号４９のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、作用因子は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップである。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１／アクチビントラップの、ＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップの、アクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、作用因子は、本明細書で開示されるＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、およびＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのいずれか１つ、またはこれらの組合せであり得る。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドドメインに加えて、インビボ半減期、インビトロ半減期、取込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうちの１つまたは複数を増強する、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンより選択される異種ポリペプチドドメインを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、配列番号１６または１７より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、トラップポリペプチドドメインと免疫グロブリンＦｃドメインとの間に配置されたリンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＴＧＧＧリンカー（配列番号４５）である。一部の実施形態では、リンカードメインは、本明細書で開示されるリンカードメインのいずれかであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合物などの精製部分配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ融合物は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然リーダー配列であってもよく、異種リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。一実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含む。Ｂ部分は、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップである。Ａ部分およびＣ部分は、独立に、０、１、または１より多くのアミノ酸であることが可能であり、Ａ部分およびＣ部分のいずれも、Ｂに対して異種である。Ａ部分および／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ融合タンパク質は、本明細書で開示される融合タンパク質のいずれかを含み得る。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸より選択される、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。一般に、ＧＤＦトラップは、患者における望ましくない免疫応答の可能性を低減するために、ＧＤＦトラップの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現されることが好ましい。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、本明細書に開示されるアミノ酸修飾のいずれかまたはその組み合わせを含み得る。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドをコードする核酸を提供する。単離ポリヌクレオチドは、上述のような可溶性のＧＤＦトラップポリペプチドのコード配列を含み得る。本明細書で開示される核酸は、発現のためにプロモーターに作動可能に連結することができ、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、このような目的のために本明細書で開示される細胞のいずれかより選択することができる。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドを作製するための方法を提供する。このような方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、適切な細胞内で、本明細書で開示される核酸のいずれかを発現させることを含み得る。このような方法は、ａ）ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドの発現に適する条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、前記細胞は、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップの発現構築物で形質転換されている工程と；ｂ）このようにして発現させたＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドを回収する工程とを含み得る。ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチドは、タンパク質を細胞培養物から得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収され得る。
ある特定の態様では、本開示は、対象において赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象に、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１のシグナル伝達を阻害する作用因子群の組合せの有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＡに実質的に結合しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢを阻害する作用因子群のうちの１つまたは複数は、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のシグナル伝達をさらに阻害する。
一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＢに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、本明細書で開示される、２つまたはこれより多くの標的（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０）を指向する、２つまたはこれより多くの抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せを含む。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体またはそのフラグメントである。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはそのフラグメントである。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体からなる群より選択される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、異種部分を含む。一部の実施形態では、異種部分は、糖、検出可能な標識、または安定化部分である。
一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１トラップである少なくとも１つの作用因子を含み、ＧＤＦ１１トラップは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＢトラップである少なくとも１つの作用因子を含み、アクチビンＢトラップは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップを含み、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１トラップであり、ＧＤＦ１１トラップは、アクチビンＢに、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または１ｐＭ未満のＫＤで結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップは、アクチビンＢに、１ｎＭ～７５０ｐＭ、７５０ｐＭ～５００ｐＭ、５００ｐＭ～２５０ｐＭ、２５０ｐＭ～１００ｐＭ、１００ｐＭ～５０ｐＭ、５０～２５ｐＭ、２５～１０ｐＭ、または１０～１ｐＭのＫＤで結合する。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１トラップであり、ＧＤＦ１１トラップの、ＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むアクチビンＢトラップであり、ＧＤＦ１１トラップの、アクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号３または４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号５または６のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１トラップである少なくとも１つの作用因子を含み、ＧＤＦ１１トラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、作用因子の組合せは、アクチビンＢトラップである少なくとも１つの作用因子を含み、アクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦトラップであり、ＧＤＦ１１トラップの、ＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、作用因子は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むアクチビンＢトラップであり、アクチビンＢトラップの、アクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーより、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍高い。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、ＧＤＦトラップまたはアクチビンＢトラップポリペプチドドメインに加えて、インビボ半減期、インビトロ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうちの１つまたは複数を増強する、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンより選択される異種ポリペプチドドメインを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、配列番号１６または１７より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、トラップポリペプチドドメインと免疫グロブリンＦｃドメインとの間に配置されたリンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＴＧＧＧリンカーである。一部の実施形態では、リンカードメインは、本明細書で開示されるリンカードメインのいずれかであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合物などの精製部分配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップ融合物は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然リーダー配列であってもよく、異種リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。一実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含む。Ｂ部分は、本開示のＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップである。Ａ部分およびＣ部分は、独立に、０、１、または１より多くのアミノ酸であることが可能であり、Ａ部分およびＣ部分のいずれも、Ｂに対して異種である。Ａ部分および／またはＣ部分は、リンカー配列を介して、Ｂ部分に付加され得る。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップ融合タンパク質は、本明細書で開示される融合タンパク質のいずれかを含み得る。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸より選択される、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。一般に、ＧＤＦ１１トラップは、患者における望ましくない免疫応答の可能性を低減するために、ＧＤＦ１１トラップの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株内で発現させることが好ましい。ヒトおよびＣＨＯ細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想される。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップは、本明細書で開示されるアミノ酸修飾のいずれか、またはこれらの組合せを含み得る。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１１トラップまたはアクチビンＢトラップポリペプチドをコードする核酸を提供する。単離ポリヌクレオチドは、上述のような可溶性のＧＤＦ１１トラップポリペプチドまたはアクチビンＢトラップポリペプチドのコード配列を含み得る。本明細書中に開示される核酸は、発現のためにプロモーターに作動可能に連結され得、そして、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、このような目的のために本明細書で開示される細胞のいずれかより選択することができる。
特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１１トラップもしくはアクチビンＢトラップポリペプチドを作製するための方法を提供する。このような方法は、適切な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において、本明細書中に開示される任意の核酸を発現させることを包含し得る。このような方法は、ａ）ＧＤＦ１１トラップもしくはアクチビンＢトラップポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、前記細胞は、ＧＤＦ１１トラップもしくはアクチビンＢトラップ発現構築物で形質転換されている、工程と；ｂ）このようにして発現されたＧＤＦ１１トラップ／アクチビンＢトラップポリペプチドを回収する工程とを包含し得る。ＧＤＦ１１トラップ／アクチビンＢトラップポリペプチドは、細胞培養物からタンパク質を得るための周知技術のいずれかを用いて、粗画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収することができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、およびＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのいずれかのうちの２つまたはこれより多くを組み合わせることができる。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢのアンタゴニストは、低分子アンタゴニスト、または低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＢの低分子アンタゴニストである少なくとも１つの作用因子を含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニストである少なくとも１つの作用因子を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢの低分子アンタゴニスト、または低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢの低分子アンタゴニスト、または低分子アンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢの低分子アンタゴニスト、または低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。
別の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストである。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニストポリヌクレオチドは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現（例えば、転写、翻訳、および／または細胞分泌）を阻害する。任意選択で、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡを阻害しない（例えば、アクチビンＡの発現および／または活性を阻害しない）。任意選択で、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８をさらに阻害する（例えば、ＧＤＦ８の発現および／または活性を阻害する）。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢ（例えば、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現および／または活性）を阻害する本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＥ、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂのうちの１つまたは複数をさらに阻害する（例えば、発現および／または活性を阻害する）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ３、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂより選択される遺伝子の転写物とハイブリダイズして、遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、アクチビンＢの転写物とハイブリダイズして、アクチビンＢの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１の転写物とハイブリダイズして、ＧＤＦ１１の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、本開示の、２つまたはこれより多くの標的（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂ）の発現を阻害する２つまたはこれより多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂより選択される遺伝子の転写物を標的とするＲＮＡｉ分子を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、ＧＤＦ１１の転写物を標的とするＲＮＡｉ分子を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、アクチビンＢの転写物を標的とするＲＮＡｉ分子を含む。一部の実施形態では、作用因子群の組合せは、本開示の、２つまたはこれ寄居多くの標的（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂ）の発現を阻害する、２つまたはこれより多くのＲＮＡｉ分子の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９～約４５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約２５～約３０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１０～約２０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｓｈＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、１９～２９ヌクレオチドのステム長を有する。一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、１９～２３ヌクレオチドのステム長を有する。一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡのループ領域は、５～９ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、低分子アンタゴニスト、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニスト）のいずれかを、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、低分子アンタゴニスト、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、赤血球を増加させることを必要とする対象において、赤血球を増加させるための方法である。一部の実施形態では、方法は、貧血を処置または予防することを必要とする対象において、貧血を処置または予防するための方法である。一部の実施形態では、貧血は、多発性骨髄腫、慢性腎疾患もしくは急性腎疾患または慢性腎不全もしくは急性腎不全、対象の化学療法処置、骨髄異形成症候群、およびサラセミアのうちの１つまたは複数と関連する。一部の実施形態では、サラセミアは、ベータサラセミアである。一部の実施形態では、腎不全は、末期腎不全である。一部の実施形態では、対象は、鎌状赤血球貧血を有する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象において赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象に、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１を阻害する作用因子の有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目２）
前記作用因子が、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１のシグナル伝達を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記作用因子が、アクチビンＡを実質的に阻害しない、項目１または２に記載の方法。（項目４）
前記作用因子が、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記作用因子が、アクチビンＡに実質的に結合しない、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記作用因子が、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記作用因子が、多特異性抗体である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記多特異性抗体が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの２つまたはこれより多くに結合する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記作用因子が、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１に結合する二特異性抗体である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記二特異性抗体が、互いに会合した２つの異なる単一特異性抗体を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体が、キメラ抗体である、項目７から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体が、ヒト化抗体である、項目７から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記抗体が、ヒト抗体である、項目７から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体が、単鎖抗体である、項目７から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、項目７から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記抗体が、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Ｆｖフラグメント、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディーと免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部とを含む融合タンパク質である、項目７から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体が、二重可変ドメイン免疫グロブリンである、項目７から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記抗体が、異種部分を含む、項目７から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記異種部分が、糖、検出可能な標識、または安定化部分である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記作用因子が、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号１の７９位に酸性アミノ酸を含まない、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記作用因子が、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、アクチビンＢに１００ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記作用因子が、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのＧＤＦ１１に対するＫＤが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインのＫＤの多くとも２分の１未満である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記作用因子が、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのアクチビンＢに対するＫＤが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインのＫＤの多くとも２分の１未満である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号１のアミノ酸２５～１３１に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号３または４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号５または６のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、ＧＤＦ／アクチビンＢトラップポリペプチドドメインに加えて、インビボ半減期、インビトロ半減期、投与、組織局在または分布、タンパク質複合体の形成、および精製のうちの１つまたは複数を増強する、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である、項目２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンより選択される、異種ポリペプチドドメインを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
融合タンパク質が、前記トラップポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインとの間に配置されたリンカードメインをさらに含む、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３３）
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧリンカーである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号４９のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記作用因子が、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップである、項目１から６に記載の方法。
（項目３６）
前記作用因子が、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビントラップのＧＤＦ１１に対するＫＤが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインのＫＤの多くとも２分の１未満である、項目１から６に記載の方法。
（項目３７）
前記作用因子が、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップであり、前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップのアクチビンＢに対するＫＤが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体の野生型リガンド結合ドメインの結合アフィニティーの多くとも２分の１未満である、項目１から６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。（項目４１）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、ＧＤＦ／アクチビンＢトラップポリペプチドドメインに加えて、インビボ半減期、インビトロ半減期、投与、組織局在または分布、タンパク質複合体の形成、および精製のうちの１つまたは複数を増強する、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である、項目３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンより選択される、異種ポリペプチドドメインを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、配列番号１６より選択されるアミノ酸配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
融合タンパク質が、前記トラップポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインとの間に配置されたリンカードメインをさらに含む、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧリンカーである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸より選択される、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目２０から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップが、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
赤血球を増加させることを必要とする対象において、赤血球を増加させるための、項目１から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
貧血を処置または予防することを必要とする対象において、貧血を処置または予防するための、項目１から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記貧血が、多発性骨髄腫、慢性腎疾患もしくは急性腎疾患または慢性腎不全もしくは急性腎不全、前記対象の化学療法処置、骨髄異形成症候群、およびサラセミアのうちの１つまたは複数と関連する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記サラセミアが、ベータサラセミアである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記腎不全が、末期腎不全である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記対象が、鎌状赤血球貧血を有する、項目１から５０のいずれか一項に記載の方法。（項目５７）
対象において赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象に、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１を阻害する作用因子群の組合せの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目５８）
作用因子群の前記組合せが、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１のシグナル伝達を阻害する、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＡを実質的に阻害しない、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
作用因子群の前記組合せが、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない、項目５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＡに実質的に結合しない、項目５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記作用因子群の１つまたは複数が、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０ののうちの１つまたは複数をさらに阻害する、項目５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体またはそのフラグメントである、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体またはそのフラグメントである、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、単鎖抗体である、項目６３から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｄ、およびＦｖからなる群より選択される、項目６３から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、異種部分を含む、項目６３から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記異種部分が、糖、検出可能な標識、または安定化部分である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１トラップである少なくとも１つの作用因子を含み、前記ＧＤＦ１１トラップが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目５７から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢトラップである少なくとも１つの作用因子を含み、前記アクチビンＢトラップが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目５７から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１トラップである少なくとも１つの作用因子を含み、前記ＧＤＦ１１トラップが、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目５７から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢトラップである少なくとも１つの作用因子を含み、前記アクチビンＢトラップが、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目５７から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８のうちの１つまたは複数の低分子アンタゴニストである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢの低分子アンタゴニストである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニストである少なくとも１つの作用因子を含む、項目５７から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数の発現を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、項目５７から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記ポリヌクレオチド配列が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される遺伝子の転写物とハイブリダイズして、前記遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
作用因子群の前記組合せが、アクチビンＢの転写物とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
作用因子群の前記組合せが、ＧＤＦ１１の転写物とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記ポリヌクレオチド配列が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される遺伝子の転写物を標的とするＲＮＡｉ配列を含む、項目８０に記載の方法。
（項目８５）
ポリヌクレオチド分子が、アクチビンＢの転写物を標的とするＲＮＡｉ配列を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ポリヌクレオチド配列が、ＧＤＦ１１の転写物を標的とするＲＮＡｉ配列を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
前記ＲＮＡｉ配列が、ｓｉＲＮＡである、項目８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記ｓｉＲＮＡが、約１９～約４５ヌクレオチドの長さである、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記ｓｉＲＮＡが、約２５～約３０ヌクレオチドの長さである、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
前記ｓｉＲＮＡが、約１０～約２０ヌクレオチドの長さである、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記ＲＮＡｉ配列が、ｓｈＲＮＡである、項目８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ｓｈＲＮＡが、１９～２９ヌクレオチドのステム長を有する、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記ｓｈＲＮＡが、１９～２３ヌクレオチドのステム長を有する、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記ｓｈＲＮＡのループ領域が、５～９ヌクレオチドの長さを有する、項目９１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記作用因子が、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のシグナル伝達のうちの１つまたは複数を阻害する、項目６に記載の方法。（項目９６）
作用因子群の前記組合せが、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のシグナル伝達の１つまたは複数を阻害する、項目５７に記載の方法。
（項目９７）
前記作用因子または作用因子群の組合せが、Ｓｍａｄ２／３のシグナル伝達を阻害する、項目１から９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
対象において赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象に、ＧＤＦ１１と、ＡｃｔＲＩＩＢに結合しＳｍａｄ２／３を介してシグナル伝達する１つまたは複数の追加のリガンドとを阻害する作用因子または作用因子群の組合せの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目９９）
前記１つまたは複数の追加のリガンドが、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
対象において赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防するための方法であって、赤血球レベルを高めるかまたは貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象に、アクチビンＢと、ＡｃｔＲＩＩＢに結合しＳｍａｄ２／３を介してシグナル伝達する１つまたは複数の追加のリガンドとを阻害する作用因子または作用因子の組合せの有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目１０１）
前記１つまたは複数の追加のリガンドが、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記作用因子または作用因子群の組合せが、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない、項目９８から１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記作用因子または作用因子群の組合せが、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない、項目９８から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記作用因子または作用因子群の組合せが、アクチビンＡに実質的に結合しない、項目９８から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである少なくとも１つの作用因子を含む、項目９８から１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目９８から１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、アクチビンＣ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびアクチビンＥのうちの１つまたは複数に結合する多特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目９８から１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体またはそのフラグメントである、項目１０５から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、項目１０５から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体またはそのフラグメントである、項目１０５から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、単鎖抗体である、項目１０５から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｄ、およびＦｖからなる群より選択される、項目１０５から１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、異種部分を含む、項目１０５から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記異種部分が、糖、検出可能な標識、または安定化部分である、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１トラップであり、前記ＧＤＦ１１トラップが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目９８から１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢトラップであり、前記アクチビンＢトラップが、配列番号１のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目９８から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１トラップであり、前記ＧＤＦ１１トラップが、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目９８から１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢトラップであり、前記アクチビンＢトラップが、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目９８から１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数の低分子アンタゴニストである、項目９８から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢの低分子アンタゴニストである、項目９８から１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニストである、項目９８から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記作用因子、または前記作用因子群のうちの少なくとも１つが、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数の発現を阻害するポリヌクレオチドを含む、項目９８から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記ポリヌクレオチド、または少なくとも１つのポリヌクレオチドが、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される遺伝子の転写物とハイブリダイズして、前記遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アクチビンＢの転写物とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１の転写物とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される遺伝子の転写物を標的とするＲＮＡｉ配列である、項目１２２に記載の方法。
（項目１２７）
前記ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アクチビンＢの前記転写物を標的とするＲＮＡｉ配列である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ＧＤＦ１１の転写物を標的とするＲＮＡｉ配列である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２９）
前記ＲＮＡｉ配列、または前記ＲＮＡｉ配列のうちの少なくとも１つが、ｓｉＲＮＡである、項目１２６から１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記ｓｉＲＮＡ配列、または前記ｓｉＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、約１９～約４５ヌクレオチドの長さである、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記ｓｉＲＮＡ配列、または前記ｓｉＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、約２５～約３０ヌクレオチドの長さである、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記ｓｉＲＮＡ配列、または前記ｓｉＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、約１０～約２０ヌクレオチドの長さである、項目１３０に記載の方法。
（項目１３３）
前記ＲＮＡｉ配列、または前記ＲＮＡｉ配列のうちの少なくとも１つが、ｓｈＲＮＡである、項目１２６から１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記ｓｈＲＮＡ配列、または前記ｓｈＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、１９～２９ヌクレオチドのステム長を有する、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記ｓｈＲＮＡ配列、または前記ｓｈＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、１９～２３ヌクレオチドのステム長を有する、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記ｓｈＲＮＡ配列、または前記ｓｈＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つのループ領域が、５～９ヌクレオチドの長さを有する、項目１３３から１３５のいずれか一項に記載の方法。
特許または出願の提出書類は、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色図面を有する本特許または本特許出願公開のコピーは、要請し、必要な手数料を支払えば、官庁により提供される。
図１は、本明細書中で推定される残基を持つヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号３６）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号４６）の細胞外ドメインのアラインメントを示し、これは、枠で示した、リガンドと直接接触するための複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造（リガンド結合ポケット）の合成分析に基づく。
図２は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号３７～４４）の複数の配列アラインメントを示す。
図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＧＤＦ１１ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５８１１．３）（配列番号２４）を描示する。 図３Ａおよび３Ｂは、ヒトＧＤＦ１１ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５８１１．３）（配列番号２４）を描示する。
図４は、ヒトＧＤＦ１１前駆体タンパク質配列のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５８０２．１）（配列番号２５）を描示する。
図５Ａおよび５Ｂは、ヒトアクチビンＢ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００２１９３．２）（配列番号２６）を描示する。 図５Ａおよび５Ｂは、ヒトアクチビンＢ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００２１９３．２）（配列番号２６）を描示する。
図６は、ヒトアクチビンＢ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２１８４．２）（配列番号２７）を描示する。
図７は、ヒトアクチビンＥ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１４７９．３）（配列番号２８）を描示する。
図８は、ヒトアクチビンＥ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１３６６７．１）（配列番号２９）を描示する。
図９Ａおよび９Ｂは、ヒトアクチビンＣ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５３８．３）（配列番号３０）を描示する。 図９Ａおよび９Ｂは、ヒトアクチビンＣ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５３８．３）（配列番号３０）を描示する。
図１０は、ヒトアクチビンＣ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５５２９．１）（配列番号３１）を描示する。
図１１は、ヒトＧＤＦ８ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５２５９．２）（配列番号３２）を描示する。
図１２は、ヒトＧＤＦ８前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００５２５０．１）（配列番号３３）を描示する。
図１３は、表面プラズモン共鳴により決定した場合の、種々のＡｃｔＲＩＩリガンド（ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９）に関して特徴付けられた、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ（例えば、米国特許第８，０５８，２２９号を参照されたい）についてのリガンド結合プロファイルを描示する。
図１４は、ヒトＢＭＰ６ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７１８．４）（配列番号３４）を描示する。
図１５は、ヒトＢＭＰ６前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７０９．１）（配列番号３５）を描示する。
図１６は、ヒトＧＤＦ１５前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００４８５５．２）（配列番号５０）を描示する。
図１７は、ヒトＧＤＦ１５ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００４８６４．２）（配列番号５１）を描示する。
図１８は、ヒトＮｏｄａｌ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６０５２５．３）（配列番号５２）を描示する。
図１９は、ヒトＮｏｄａｌ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１８０５５．４）（配列番号５３）を描示する。
図２０は、ヒトＧＤＦ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６５６８５．１）（配列番号５４）を描示する。
図２１は、ヒトＧＤＦ３ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０２０６３４．１）（配列番号５５）を描示する。
図２２は、ヒトＢＭＰ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１９２．２）（配列番号５６）を描示する。
図２３Ａおよび２３Ｂは、ヒトＢＭＰ３ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１２０１．２）（配列番号５７）を描示する。 図２３Ａおよび２３Ｂは、ヒトＢＭＰ３ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１２０１．２）（配列番号５７）を描示する。
図２４は、ヒトＢＭＰ３Ｂ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００４９５３．１）（配列番号５８）を描示する。
図２５は、ヒトＢＭＰ３Ｂ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００４９６２．３）（配列番号５９）を描示する。
図２６は、ヒトＢＭＰ９前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５７２８８．１）（配列番号６０）を描示する。
図２７は、ヒトＢＭＰ９ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１６２０４．２）（配列番号６１）を描示する。
図２８は、ヒトＢＭＰ１０前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５２９７．１）（配列番号６２）を描示する。
図２９は、ヒトＢＭＰ１０ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１４４８２．１）（配列番号６３）を描示する。
図３０は、抗アクチビンＢ抗体（Ａｂ）、抗ＧＤＦ８ Ａｂ、二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１ Ａｂ、または抗アクチビンＢ Ａｂと二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１ Ａｂとの組合せによる処置の、Ｃ５７ＢＬ６マウス（群当たりｎ＝５ずつのマウス）における赤血球レベルに対する効果を示す。データは、ビヒクル（ＰＢＳ）処置対象において観察される赤血球レベルを上回る、赤血球レベルの上昇パーセントとして示す。
（発明の詳細な説明）
（１．概要）
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特異化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。ＴＧＦ－βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子に機能喪失変異を有しており、筋肉量の顕著な増加を引き起こしている［例えば、Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（１号）：７１～４頁を参照されたい］。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、筋肉量の増加、および、報告によれば、例外的な強度と関連している［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁を参照されたい］。
ＴＧＦ－βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１巻：１６９～１７８頁を参照のこと］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニン特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須であり、そして、ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型受容体の発現に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
アクチビンは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する二量体ポリペプチド増殖因子である。３つの主なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在し、これらは、２つの密接に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢおよびβＡβＢ）である。ヒトゲノムはまた、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードしているが、これらは、主として肝臓で発現されており、そして、βＣもしくはβＥを含むヘテロ二量体形態もまた公知である。
アクチビンについての２つの関連するＩＩ型受容体である、ＡｃｔＲＩＩＡ（ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子によりコードされる）およびＡｃｔＲＩＩＢ（ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子によりコードされる）が同定されている［例えば、ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ（１９９１年）、Ｃｅｌｌ、６５巻：９７３～９８２頁；ならびにＡｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：９７～１０８頁を参照されたい］。ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンに加えて、例えば、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含む他のいくつかのＴＧＦ－βファミリータンパク質とも生化学的に相互作用し得る［例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（１９９５年）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３０巻：２１７～２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（２００１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９８巻：９３０６～９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ（２００１年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ、７巻：９４９～９５７頁；ならびにＯｈら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６巻：２７４９～５４頁を参照されたい］。アクチビン様キナーゼ４（ＡＬＫ４）は、アクチビン、特に、アクチビンＡに対する主たるＩ型受容体であり、ＡＬＫ７は、同様に他のアクチビン、特に、アクチビンＢに対する受容体として機能し得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される１つまたは複数の作用因子、特に、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに拮抗し得る作用因子で、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩＡリガンドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドとも呼ばれる）に拮抗することに関する。
本明細書で記載される場合、「アクチビンＢ」に結合する作用因子とは、単離βＢサブユニットの文脈であれ、二量体複合体（例えば、βＢβＢホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＢサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＢ」に結合する作用因子は、βＢサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＢ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＡサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、本明細書で開示される作用因子であって、「アクチビンＢ」に拮抗（を阻害）する作用因子は、単離βＢサブユニットの文脈であれ、二量体複合体（例えば、βＢβＢホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＢサブユニットにより媒介される、１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＢ」を阻害する作用因子は、βＢサブユニットの１つまたは複数の活性は特異的に阻害するが、複合体のβＢ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＡサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＡ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９８巻：５００～５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７巻：８１～８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３～９６３頁］。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化作用因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが分かった［Ｍｕｒａｔａら（１９８８年）、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁］。アクチビンＡは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビンは、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）およびα２－マクログロブリンが挙げられる。
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。マウスにおけるＧＤＦ８遺伝子の欠失は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３～９０頁］。骨格筋量の同様の増加は、ウシ［例えば、Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１～５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ（１９９４年）、Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ．、３８巻：７５２～７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ（１９９７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４巻：１２４５７～１２４６１頁；ならびにＫａｍｂａｄｕｒら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７巻：９１０～９１５頁を参照されたい］および、驚くべきことに、ヒト［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁を参照されたい］におけるＧＤＦ８の自然発生変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している［例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８年）、ＰＮＡＳ、９５巻：１４９３８～４３頁を参照されたい］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号を参照されたい］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる［例えば、Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７～６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６～７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５～４３頁を参照されたい］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～２３２頁を参照されたい］。
骨形態発生タンパク質１１（ＢＭＰ１１）としても公知の増殖および分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、脊椎動物発生の調節因子として最初に同定された分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０～２６４頁］。ＧＤＦ１１は、マウス胚発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する［例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ．
Ｄｅｖ．、８０巻：１８５～１８９頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たし［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～３２頁を参照されたい］、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された［例えば、Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７～２０頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１はまた、生後の組織ホメオスタシスの調節因子としても関与している。例えば、筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式で筋肉の増殖の調節における、このリガンドの役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能も調節し得ることを示唆し、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出されている［例えば、Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７～２０７頁を参照されたい］。
骨形成性タンパク質１（ＯＰ－１）とも呼ばれる骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ７）は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、ＢＭＰ７は、広範にわたる生理プロセスも調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成現象の一因となる、骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ７はまた、カルシウムの調節および骨のホメオスタシスにおいても役割を果たす。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７も、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７とアクチビンとは、異なるＩ型受容体を動員して、ヘテロマーの受容体複合体となる。ＢＭＰ７が、優先的にＡＬＫ２を介してシグナル伝達するのに対し、アクチビンは、ＡＬＫ４を介してシグナル伝達する。この差違は、ＢＭＰ７とアクチビンとが、異なるＳｍａｄ経路を活性化させ、異なる生物反応を誘発することを可能とする［例えば、Ｍａｃｉａｓ－Ｓｉｌｖａら（１９９８年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２５６２８～３６頁を参照されたい］。
改変体ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質であって、１つの改変体は、本明細書の配列番号１のアミノ酸２０～１３４を含み、配列番号１に照らして、７９位に酸性アミノ酸を有し［以下では、「ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃ」融合タンパク質と呼ばれる］、第２の短縮型改変体は、本明細書の配列番号１のアミノ酸２５～１３１を含み、これもまた、７９位に酸性アミノ酸を組み込んでいる［以下では、「ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ」と呼ばれる］、改変体により、インビトロおよびインビボにおいて特殊な生体特性が呈示されることが既に報告されている。例えば、米国特許第８，０５８，２２９号を参照されたい。非改変融合タンパク質である、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－Ｆｃと比較して、対応するＬ７９Ｄ改変体［それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ］は部分的に、アクチビンＡに対する結合アフィニティーの実質的な喪失を特徴とし、したがって、アクチビンＡ活性に拮抗する能力の著明な低減を特徴とするが、ＧＤＦ１１に対する結合および阻害の野生型に近いレベルを保持する。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃ改変体およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ改変体は、それぞれ、非改変ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃ融合タンパク質および非改変ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、インビボにおいて赤血球レベルを高める能力が著明により強力であることが見出された。したがって、これらのデータは、観察された生物活性が、アクチビンＡの阻害に依存しないことを指し示す。
本出願は部分的に、米国特許第８，０５８，２２９号において開示されているＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ改変体が、アクチビンＡに対する結合アフィニティーは著明に低減されているが、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１は阻害することが可能であるという洞察に方向付けられる。したがって、本出願者らは、本明細書において、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性に拮抗する作用因子または作用因子群の組合せにより、赤血球生成を増大させ得ることを結論付ける。アクチビンＡの阻害は、赤血球の形成を促進するのに必要ではないが、アクチビンＡを阻害するＡｃｔＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、赤血球の形成も促進することが公知である。したがって、アクチビンＡを阻害する作用因子は、本開示の範囲内に含まれる。
本明細書で実証されるように、より多くのそれらのリガンドが阻害されると、種々の血液パラメータのレベル（例えば、ヘマトクリットレベル、ヘモグロビンレベル、および赤血球レベル）が高まる傾向が見られるため、複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８）が、赤血球生成の調節因子であると考えられる。例えば、本明細書で提示されるデータは、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１の活性を阻害する作用因子の投与は、インビボにおける赤血球レベルの上昇に対して、ＧＤＦ８だけに拮抗する作用因子と比較して、より実質的な効果を及ぼすことを実証する。加えて、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を阻害する作用因子を使用する組合せ治療は、赤血球の増加に対して、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１アンタゴニストによる処置と比較して、さらに大きな効果を及ぼすことも示される。したがって、本明細書で提示されるデータは、対象において赤血球生成を促進するための効果的な戦略は、複数の（すなわち、２つまたはそれより多くの）ＡｃｔＲＩＩリガンドを標的とすることであることを指し示す。
したがって、本開示は部分的に、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防することを必要とする対象において、ＧＤＦ１１（例えば、ＧＤＦ１１に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）および／またはアクチビンＢ（例えば、アクチビンＢに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）に拮抗（を阻害）する作用因子または作用因子群の組合せにより、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防するための方法を提供する。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに拮抗する、本開示の作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＡ（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）に実質的に拮抗しない。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに拮抗する、本開示の作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８の活性をさらに阻害し得る。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに拮抗する、本開示の作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの活性を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに直接結合する作用因子であり、例えば、少なくともＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）（任意選択で、このような作用因子、または作用因子群の組合せは、アクチビンＡに実質的に結合しない）；抗ＧＤＦ１１抗体および抗アクチビンＢ抗体を含む、抗体の組合せ；ＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合する（任意選択で、アクチビンＡに結合しなくてもよい）、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）；改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの組合せ（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）であって、ＧＤＦ１１に結合する（が、アクチビンＢには実質的に結合しない）少なくとも１つの改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと、アクチビンＢに結合する（が、ＧＤＦ１１には実質的に結合しない）少なくとも１つの可溶性の改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとを含む組合せ（任意選択で、ＧＤＦ結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびアクチビンＢ結合ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの一方または両方が、アクチビンＡに実質的に結合しなくてもよい）；ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに直接結合する（任意選択で、アクチビンＡに実質的に結合しなくてもよい）低分子；ならびにＧＤＦ１１に結合する（が、アクチビンＢには実質的に結合しない）少なくとも１つの低分子と、アクチビンＢに結合する（が、ＧＤＦ１１には実質的に結合しない）１つの低分子とを含む、低分子の組合せ（ＧＤＦ結合低分子およびアクチビンＢ結合低分子の一方または両方が、アクチビンＡに実質的に結合しなくてもよい）が挙げられる。
代替的な実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの活性を阻害する作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに直接結合しない、間接的アンタゴニスト作用因子である。例えば、間接的アンタゴニスト作用因子は、天然のＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合する抗体であることが可能であり、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを防止する。任意選択で、このような作用因子、または作用因子群の組合せは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。本開示の、他の間接的アンタゴニスト作用因子として、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現（例えば、転写、翻訳、および／または細胞分泌）を阻害する作用因子または作用因子群の組合せが挙げられる。任意選択で、このような作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＡの発現に実質的に影響を及ぼさない。このような間接的作用因子として、例えば、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現の低分子阻害剤のほか、種々のポリヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、ＧＤＦ１１ ｍＲＮＡおよび／またはアクチビンＢ ｍＲＮＡを標的とする、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または化学的類似体、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む干渉ＲＮＡ分子］の使用であって、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現を阻害する使用が挙げられる。
一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの活性を阻害する、本開示の作用因子または作用因子群の組合せは任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する。
加えて、本開示の方法は、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、本明細書で記載される１つまたは複数のアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢを阻害する作用因子または作用因子群の組合せ）の使用であって、赤血球の形成を増大させるほか、種々の貧血および無効赤血球生成障害ならびに関連する状態を処置または予防する使用を対象とする。赤血球生成は、エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦおよび鉄のホメオスタシスを含む種々の因子によって調節される複雑なプロセスであることに注意すべきである。用語「赤血球レベルを増加させる」および「赤血球の形成を促進する」とは、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値のような臨床的に観察可能な測定基準（ｍｅｔｒｉｃｓ）を指し、そのような変化が生じる機構に関しては中立であることが意図される。
ＥＰＯとは、赤芽球系前駆細胞のエリスロサイトへの増殖および成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、胎児期には肝臓により生成され、成人期には腎臓により生成される。成人期において、腎不全の帰結として一般的に生じるＥＰＯの生成の減少は、貧血をもたらす。ＥＰＯは、遺伝子操作法により、ＥＰＯ遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞からの、タンパク質の発現および分泌に基づき生成されている。このような組換えＥＰＯの投与は、貧血の処置において有効となっている。例えば、Ｅｓｃｈｂａｃｈら（１９８７年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３１６巻：７３頁）は、慢性腎不全により引き起こされる貧血を是正するためのＥＰＯの使用について記載している。
ＥＰＯの効果は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属し、ＥＰＯ受容体と呼ばれる細胞表面受容体へのその結合、およびこの受容体の活性化により媒介される。ヒトＥＰＯ受容体およびマウスＥＰＯ受容体は、クローニングされ、発現がなされている［例えば、Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９８９年）、Ｃｅｌｌ、５７巻：２７７頁；Ｊｏｎｅｓら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：３１頁；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：２４頁；および米国特許第５，２７８，０６５号を参照されたい］。ヒトＥＰＯ受容体遺伝子は、およそ２２４アミノ酸の細胞外ドメインを含む、４８３アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、マウスＥＰＯ受容体とおよそ８２％のアミノ酸配列同一性を呈示する［例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい］。クローニングされて哺乳動物細胞内で発現がなされた全長ＥＰＯ受容体（６６～７２ｋＤａ）は、赤芽球系前駆細胞上の天然の受容体のアフィニティーと同様のアフィニティー（ＫＤ＝１００～３００ｎＭ）でＥＰＯに結合する。したがって、この形態は、主要なＥＰＯ結合決定基を含有すると考えられ、ＥＰＯ受容体と呼ばれる。他の近縁のサイトカイン受容体との類比によれば、ＥＰＯ受容体は、アゴニストに結合すると二量体化すると考えられる。しかしながら、多量体の複合体であり得るＥＰＯ受容体の詳細な構造、およびその活性化の具体的機構は、完全には理解されていない［例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい］。
ＥＰＯ受容体の活性化は、いくつかの生物学的効果を結果としてもたらす。これらの効果は、未成熟赤芽球の増殖の増大、未成熟赤芽球の分化の増大、および赤芽球系前駆細胞におけるアポトーシスの低減を含む［例えば、Ｌｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：１１３５１～１１３５５頁；Ｋｏｕｒｙら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：３７８～３８１頁を参照されたい］。増殖を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路と、分化を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路とは、異なると考えられる［例えば、Ｎｏｇｕｃｈｉら（１９８８年）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、８巻：２６０４頁；Ｐａｔｅｌら（１９９２年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６７巻：２１３００頁；およびＬｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：１１３５１～１１３５５頁を参照されたい］。一部の結果は、付属タンパク質が、分化シグナルの媒介に要請され得ることを示唆する［例えば、Ｃｈｉｂａら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：６４６頁；およびＣｈｉｂａら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：１１５９３頁を参照されたい］。しかし、恒常的な活性化形態の受容体は、増殖および分化のいずれも刺激し得るので、分化における付属タンパク質の役割については、議論が一致していない［例えば、Ｐｈａｒｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０巻：９３８頁を参照されたい］。
ＥＰＯ受容体活性化因子として、低分子赤血球生成刺激作用因子（ＥＳＡ）のほか、ＥＰＯベースの化合物が挙げられる。前者の例は、ポリエチレングリコールに共有結合的に連結された二量体のペプチドベースのアゴニスト（商標名：Ｈｅｍａｔｉｄｅ）であり、これは、健康なボランティアならびに慢性腎疾患および内因性の抗ＥＰＯ抗体の両方を有する患者において赤血球生成刺激特性を示している［例えば、Ｓｔｅａｄら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１８３０～１８３４頁；およびＭａｃｄｏｕｇａｌｌら（２００９年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６１巻：１８４８～１８５５頁を参照されたい］。他の例として、非ペプチドベースのＥＳＡが挙げられる［例えば、Ｑｕｒｅｓｈｉら（１９９９年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６巻：１２１５６～１２１６１頁を参照されたい］。
ＥＰＯ受容体活性化因子はまた、ＥＰＯ受容体自体には接触せずに、内因性ＥＰＯの生成を増強することにより赤血球生成を間接的に刺激する化合物も含む。例えば、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ）は、正常酸素状態下では、細胞内調節機構により抑制されている（不安定化させられている）、ＥＰＯ遺伝子発現の内因性刺激因子である。したがって、ＨＩＦプロピルヒドロキシラーゼ酵素の阻害剤が、インビボにおけるＥＰＯ誘導活性について調査されている。ＥＰＯ受容体の他の間接的な活性化因子として、ＥＰＯ遺伝子の発現を局所的に阻害する、ＧＡＴＡ－２転写因子の阻害剤［例えば、Ｎａｋａｎｏら（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０４巻：４３００～４３０７頁を参照されたい］、およびＥＰＯ受容体シグナル伝達の負の調節因子として機能する、造血細胞ホスファターゼ（ＨＣＰまたはＳＨＰ－１）の阻害剤［例えば、Ｋｌｉｎｇｍｕｌｌｅｒら（１９９５年）、Ｃｅｌｌ、８０巻：７２９～７３８頁を参照されたい］が挙げられる。
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、特定の文脈から明らかである。
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ－２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ－２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変化しない。
本明細書で使用される場合、「Ｘに実質的に結合しない」とは、「Ｘ」に対する作用因子のＫＤが、約１０－７より大きい、１０－６より大きい、１０－５より大きい、１０－４より大きい、またはそれより大きい（例えば、ＫＤを決定するのに使用されるアッセイにより検出可能でない結合）を意味することが意図される。
２．アンタゴニスト作用因子
Ａ．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡベースまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＳｍａｄ２／３のシグナル伝達の活性化）を阻害する抗体である。任意選択で、本開示の抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡベースまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＳｍａｄ２／３のシグナル伝達の活性化）を阻害しない。任意選択で、本開示の抗体または抗体の組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＧＤＦ８に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。一部の実施形態では、少なくともアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する本開示の抗体または抗体の組合せは、ＧＤＦ８、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡベースまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＳｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。
別の態様では、本開示の抗体または抗体の組合せは、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、少なくともアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１によるＡｃｔＲＩＩ受容体の結合および／または活性化を防止する抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体の抗体）である。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組合せは、ＧＤＦ８によるＡｃｔＲＩＩ受容体の結合および／または活性化をさらに防止する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１によるＡｃｔＲＩＩ受容体の結合および／または活性化を防止する本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数による、ＡｃｔＲＩＩ受容体の結合および／または活性化をさらに防止する。
抗体という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、それらが、所望の抗原結合活性を呈示する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包摂する。抗体フラグメントとは、完全抗体以外の分子であって、完全抗体が結合する抗原に結合する完全抗体の一部を含む分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むがこれらに限定されない［例えば、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６９～３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号；同第５，５８７，４５８号；および同第５，８６９，０４６号を参照されたい］。本明細書で開示される抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付加させた、検出可能な標識を含む（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
ダイアボディーは、二価または二特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである［例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい］。トリアボディーおよびテトラボディーはまた、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、９巻：１２９～１３４頁において記載されている。
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である［例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい］。
抗体フラグメントは、本明細書で記載されるように、完全抗体のタンパク質分解性消化のほか、組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生成を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
一般に、本明細書で開示される方法における使用のための抗体は、その標的抗原に、好ましくは、大きな結合アフィニティーで特異的に結合する。アフィニティーは、ＫＤ値として表すことができ、内因性結合アフィニティー（例えば、アビディティー効果を最小化して）を反映する。典型的に、結合アフィニティーは、無細胞状況の場合であれ、細胞会合状況の場合であれ、インビトロにおいて測定する。本明細書で開示されるアッセイを含む、当該分野で公知の多数のアッセイであって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含むアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティーの測定値を得ることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、アクチビンＥ、アクチビンＣ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０）に、少なくとも１×１０－７もしくはより強い、１×１０－８もしくはより強い、１×１０－９もしくはより強い、１×１０－１０もしくはより強い、１×１０－１１もしくはより強い、１×１０－１２もしくはより強い、１×１０－１３もしくはより強い、または１×１０－１４もしくはより強いＫＤで結合する。
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原で実施されるＲＩＡにより測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合アフィニティーは、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原（例えば、１２５Ｉで標識された）と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、一晩にわたり）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるＦａｂの系列希釈液と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３～４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ－１２の評価と符合する］。次いで、関心のあるＦａｂを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間（例えば、約６５時間）にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０とＰＢＳとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、ガンマカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））上で、プレートをカウントする。
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化した、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡単に述べると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。例えば、抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μｌ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるＰＢＳ中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または８０００シリーズのＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
一般に、抗ＧＤＦ１１抗体とは、抗体がＧＤＦ１１の標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ１１に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体の、ＧＤＦ１１以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＧＤＦ１１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するオーソログのＧＤＦ１１タンパク質の間で保存された、ＧＤＦ１１のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ１１に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ＧＤＦ１１は、アミノ酸レベルでＧＤＦ８との配列同一性が高く、したがって、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する抗体はまた、多くの場合、ＧＤＦ８にも結合し、かつ／またはこれも阻害し得ることに留意されたい。
一般に、抗アクチビンＢ抗体とは、抗体がアクチビンＢの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでアクチビンＢに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＢ抗体の、アクチビンＢ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のアクチビンＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＢ抗体は、異なる種に由来するオーソログのアクチビンＢタンパク質の間で保存された、アクチビンＢのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢがコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、アクチビンＢに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗アクチビンＢ抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗アクチビンＣ抗体とは、抗体がアクチビンＣの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでアクチビンＣに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＣ抗体の、アクチビンＣ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定場合の抗体のアクチビンＣへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＣ抗体は、異なる種に由来するオーソログのアクチビンＣタンパク質の間で保存された、アクチビンＣのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗アクチビンＣ抗体は、アクチビンＣ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗アクチビンＣ抗体は、アクチビンＣがコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、アクチビンＣに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗アクチビンＣ抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗アクチビンＡ抗体とは、抗体がアクチビンＡの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでアクチビンＡに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＡ抗体の、アクチビンＡ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のアクチビンＡへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＡ抗体は、異なる種に由来するオーソログのアクチビンＡタンパク質の間で保存された、アクチビンＡのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗アクチビンＡ抗体は、アクチビンＡ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗アクチビンＡ抗体は、アクチビンＡが、コグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、アクチビンＡに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。
一般に、抗アクチビンＥ抗体とは、抗体がアクチビンＥの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでアクチビンＥに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＥ抗体の、アクチビンＥ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のアクチビンＥへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビンＥ抗体は、異なる種に由来するオーソログのアクチビンＥタンパク質の間で保存された、アクチビンＥのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗アクチビンＥ抗体は、アクチビンＥ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗アクチビンＥ抗体は、アクチビンＥが、コグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、アクチビンＥに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗アクチビンＥ抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＧＤＦ８抗体とは、抗体がＧＤＦ８の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ８に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体の、ＧＤＦ８以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＧＤＦ８への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するオーソログのＧＤＦ８タンパク質の間で保存された、ＧＤＦ８のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が、コグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ８に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１との配列相同性が高く、したがって、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する抗体はまた、多くの場合、ＧＤＦ１１にも結合し、かつ／またはこれを阻害し得ることに留意されたい。
一般に、抗ＢＭＰ６抗体とは、抗体がＢＭＰ６の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ６に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体の、ＢＭＰ６以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＢＭＰ６への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、異なる種に由来するオーソログのＢＭＰ６タンパク質の間で保存された、ＢＭＰ６のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が、コグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＢＭＰ６に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ６抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＧＤＦ１５抗体とは、抗体がＧＤＦ１５の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ１５に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１５抗体の、ＧＤＦ１５以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＧＤＦ１５への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１５抗体は、異なる種に由来するオーソログのＧＤＦ１５タンパク質の間で保存された、ＧＤＦ１５のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１５抗体は、ＧＤＦ１５活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ１５抗体は、ＧＤＦ１５がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ１５に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１５抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗Ｎｏｄａｌ抗体とは、抗体がＮｏｄａｌの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＮｏｄａｌに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体の、Ｎｏｄａｌ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＮｏｄａｌへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体は、異なる種に由来するオーソログのＮｏｄａｌタンパク質の間で保存された、Ｎｏｄａｌのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗Ｎｏｄａｌ抗体は、Ｎｏｄａｌ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗Ｎｏｄａｌ抗体は、Ｎｏｄａｌがコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、Ｎｏｄａｌに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗Ｎｏｄａｌ抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＧＤＦ３抗体とは、抗体がＧＤＦ３の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ３に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体の、ＧＤＦ３以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＧＤＦ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、異なる種に由来するオーソログのＧＤＦ３タンパク質の間で保存された、ＧＤＦ３のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ３に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ３抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＢＭＰ３抗体とは、抗体がＢＭＰ３の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ３に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ３抗体の、ＢＭＰ３以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＢＭＰ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ３抗体は、異なる種に由来するオーソログのＢＭＰ３タンパク質の間で保存された、ＢＭＰ３のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ３抗体は、ＢＭＰ３活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＢＭＰ３抗体は、ＢＭＰ３がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＢＭＰ３に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ３抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体とは、抗体がＢＭＰ３Ｂの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ３Ｂに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体の、ＢＭＰ３Ｂ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＢＭＰ３Ｂへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体は、異なる種に由来するオーソログのＢＭＰ３Ｂタンパク質の間で保存された、ＢＭＰ３Ｂのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ３Ｂ抗体は、ＢＭＰ３Ｂ活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＢＭＰ３Ｂ抗体は、ＢＭＰ３Ｂがコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＢＭＰ３Ｂに媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ３Ｂ抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。
一般に、抗ＢＭＰ９抗体とは、抗体がＢＭＰ９の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ９に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体の、ＢＭＰ９以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＢＭＰ９への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、異なる種に由来するオーソログのＢＭＰ９タンパク質の間で保存された、ＢＭＰ９のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＢＭＰ９に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ９抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との相互作用を阻害しないか、またはこれを実質的に阻害しない。
一般に、抗ＢＭＰ１０抗体とは、抗体がＢＭＰ１０の標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ１０に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体の、ＢＭＰ１０以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＢＭＰ１０への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、異なる種に由来するオーソログのＢＭＰ１０タンパク質の間で保存された、ＢＭＰ１０のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０活性を実質的に阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０がコグネイト受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを実質的に阻害することができ、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳｍａｄ２／３シグナル伝達など、ＢＭＰ１０に媒介される、コグネイト受容体のシグナル伝達（活性化）を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＢＭＰ１０抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０とＡＬＫ１との相互作用を阻害しないか、またはこれを実質的に阻害しない。
抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体とは、抗体がＡｃｔＲＩＩＡの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＡに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の、ＡｃｔＲＩＩＡ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＡｃｔＲＩＩＡへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、異なる種に由来するオーソログのＡｃｔＲＩＩＡタンパク質の間で保存された、ＡｃｔＲＩＩＡのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、もしくはＢＭＰ１０より選択される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡリガンドが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを阻害することができ、かつ／またはこれらのリガンドのうちの１つが、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３経路および／またはＳｍａｄ１／５／８経路を介する）を活性化させることを阻害することができる。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを阻害し、かつ／またはＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を活性化させることを阻害する。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することをさらに阻害し、かつ／またはＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＡがＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ／または、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達の活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数がＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体とは、抗体がＡｃｔＲＩＩＢの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＢに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の、ＡｃｔＲＩＩＢ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合の抗体のＡｃｔＲＩＩＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、異なる種に由来するオーソログのＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の間で保存された、ＡｃｔＲＩＩＢのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０より選択される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドがＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを阻害することができ、かつ／またはこれらのリガンドのうちの１つがＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３経路および／またはＳｍａｄ１／５／８経路を介する）を活性化させることを阻害することができる。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを阻害し、かつ／またはＧＤＦ１１および／もしくはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を活性化させることを阻害する。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することをさらに阻害し、かつ／またはＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。任意選択で、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＡがＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ／または、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達の活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢがＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数がＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
ヒトＧＤＦ１１、ヒトアクチビンＡ、ヒトアクチビンＢ、ヒトアクチビンＣ、ヒトアクチビンＥ、ヒトＧＤＦ８、ヒトＢＭＰ６、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ、ヒトＧＤＦ１５、ヒトＮｏｄａｌ、ヒトＧＤＦ３、ヒトＢＭＰ３、ヒトＢＭＰ３Ｂ、ヒトＢＭＰ９、およびヒトＢＭＰ９の核酸配列およびアミノ酸配列が、当該分野では周知である。加えて、抗体を生成するための多数の方法も、当該分野で周知であり、これらの一部については、本明細書で記載される。したがって、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が慣習的に作製することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１～６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩｂ抗体）は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的には２つの可変ドメインであって、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９～１６３３頁において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３～３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻：１００２９～１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：２５～３４頁［ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングについて記載］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１年）、２８巻：４８９～４９８頁（「リサーフェシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３～６０頁（「ＦＲシャフリング」について記載）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：６１～６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２～２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載）においてさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域として、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁を参照されたい］；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の亜集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異させた）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９～１６３３頁を参照されたい］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａら、（１９９７年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１０６７８～１０６８４頁；およびＲｏｓｏｋら、（１９９６年）、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１～２２６１８頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の技法を使用して生成することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ（２００８年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５巻：３６８～７４頁（２００１年）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０～４５９頁において記載されている。
ヒト抗体は、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１ポリペプチド、アクチビンＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、抗原負荷に応答して、ヒト可変領域を有する完全ヒト抗体または完全抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することにより調製することができる。このような動物は典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置きかえるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７～１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について記載）を参照されたい。このような動物により生成される完全抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変飾することができる。
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）、１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻：３５５７～３５６２頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の生成について記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）、２６巻（４号）：２６５～２６８頁（２００６年）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７～９３７頁；ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｎｄ Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５～９１頁において記載されている。
本明細書で提供されるヒト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成することができる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーより選択するための技法については、本明細書で記載される。
例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２～５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻：１６１～１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９～３１０頁；Ｌｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３～１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７～１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１～２号）：１１９～１３２頁においてさらに記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３～４５５頁において記載されているように、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、次いで、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、抗体フラグメントを、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして呈示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、またはＡｃｔＲＩＩＢ）に対する高アフィニティー抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）、ＥＭＢＯ Ｊ、１２巻：７２５～７３４頁により記載されているように、免疫化なしに、広範にわたる非自己抗原、また広範にわたる自己抗原、に対する抗体の単一の供給源をもたらすように、クローニングすることができる（例えば、ヒトから）。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１～３８８頁により記載されているように、再配列されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成するランダム配列含有ＰＣＲプライマーを使用することによって、合成により作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公開として、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号；ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体（典型的に、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くの）抗原上の、少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ、またはこれより多く）に対する結合特異性を有する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＧＤＦ１１エピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＧＤＦ１１の２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＧＤＦ１１エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、ＧＤＦ１１活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。任意選択で、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、アクチビンＢエピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、アクチビンＢの２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、アクチビンＢエピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、アクチビンＢ活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、アクチビンＢに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。任意選択で、アクチビンＢに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＧＤＦ８エピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＧＤＦ８の２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＧＤＦ８エピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、ＧＤＦ８活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、アクチビンＣエピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、アクチビンＣの２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、アクチビンＣエピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、アクチビンＣ活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、アクチビンＣに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、アクチビンＣに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、アクチビンＣに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、アクチビンＥエピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＣ、アクチビンＢ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、アクチビンＥの２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、アクチビンＥエピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、アクチビンＥ活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、アクチビンＥに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、アクチビンＥに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、アクチビンＥに結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＢＭＰ６エピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＢＭＰ６の２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＢＭＰ６エピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、ＢＭＰ６活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、ＢＭＰ６に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、ＢＭＰ６に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、ＢＭＰ６に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＢＭＰ９エピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、およびＢＭＰ１０）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＢＭＰ９の２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＢＭＰ９エピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、ＢＭＰ９活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、およびＢＭＰ１０）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、ＢＭＰ９に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、ＢＭＰ９に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、ＢＭＰ９に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、ＢＭＰ９に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との相互作用を阻害しないか、またはこれを実質的に阻害しない。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＢＭＰ１０エピトープに対する結合特異性であり、任意選択で、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、およびＢＭＰ９）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＢＭＰ１０の２つまたはこれより多くの異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＢＭＰ１０エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、ＢＭＰ１０活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、任意選択で、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、およびＢＭＰ９）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。好ましい実施形態では、ＢＭＰ１０に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢにさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、ＢＭＰ１０に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、ＢＭＰ１０に結合し、かつ／またはこれを阻害する本開示の多特異性抗体は、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ１０とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、ＢＭＰ１０に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ１０とＡＬＫ１との相互作用を阻害しないか、またはこれを実質的に阻害しない。
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれより多くの結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＧＤＦ１１エピトープに対する結合特異性であり、他の１つの結合特異性は、アクチビンＢエピトープに対する結合特異性である。好ましくは、部分的に、ＧＤＦ１１エピトープおよびアクチビンＢエピトープに対する結合アフィニティーを有する本開示の多特異性抗体を使用して、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する多特異性抗体は、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらを阻害する多特異性抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。
多特異性抗体を作製するための技法は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の組換え共発現を含むがこれに限定されない［例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ（１９８３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７頁；国際特許公開第ＷＯ９３／０８８２９号；ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１年）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：３６５５頁、および米国特許第５，７３１，１６８号（「ノブインホール」操作）を参照されたい］。多特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１を参照されたい）；２つまたはこれより多くの抗体またはフラグメントを架橋すること［例えば、米国特許第４，６７６，９８０号；およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁を参照されたい］；ロイシンジッパーを使用して、二特異性抗体を生成すること［例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７～１５５３頁を参照されたい］；二特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディー」技術を使用すること［例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい］；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること［例えば、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁を参照されたい］；および三特異性抗体を調製すること［例えば、Ｔｕｔｔら（１９９１年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁を参照されたい］によって作製することもできる。多特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
本明細書にはまた、３つまたはこれより多くの機能的な抗原結合部位を有する操作抗体であって、「オクトパス抗体」を含む操作抗体も含まれる［例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい］。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、自然発生の変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体（このような改変体は、一般に少量で存在する）を除き同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、いずれかの特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されない。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
例えば、標準的なプロトコルによって、ＧＤＦ１１またはアクチビンＢに由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清または抗タンパク質／抗ペプチドモノクローナル抗体を作製することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年を参照されたい］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物を、ＧＤＦ１１ポリペプチドまたはアクチビンＢポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能である抗原性フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法は、キャリアへのコンジュゲート化または当該分野で周知の他の技法を含む。ＧＤＦ１１ポリペプチドまたはアクチビンＢポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。免疫原を抗原とする標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体生成レベルおよび／または結合アフィニティーレベルを評価することができる。
ＧＤＦ１１またはアクチビンＢの抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５～４９７頁を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７～９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＦ１１ポリペプチドまたはアクチビンＢポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
例えば、本開示は、一部のエフェクター機能を保有するが、全てのエフェクター機能は保有しない抗体の改変体を企図し、これは、インビボにおける抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）］は不要または有害である用途に望ましい候補となる。インビトロおよび／またはインビボにおける細胞傷害作用アッセイを実行して、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（よって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎへの結合能は保持することを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７～４９２頁にまとめられている。関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ．ら（１９８６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３巻：７０５９～７０６３頁；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：１４９９～１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６巻：１３５１～１３６１頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：６５２～６５６頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２における、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁；Ｃｒａｇｇ， Ｍ． Ｓ．ら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻：１０４５～１０５２頁；ならびにＣｒａｇｇ， Ｍ． Ｓ．およびＭ． Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：２７３８～２７４３頁を参照されたい］。当該分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎへの結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定もまた、実施することができる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ， Ｓ． Ｂ．ら（２００６年）、Ｉｎｔｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１２号）：１７５９～１７６９頁を参照されたい］。
エフェクター機能を低減した本開示の抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数を置換した抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つまたはこれより多くにおいて置換を有するＦｃ変異体であって、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含むＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオＭＡｂ」を創出することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー－薬物部分など、他の部分にコンジュゲートさせて、本明細書でさらに記載されるような、免疫結合体を創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成することができる。
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合アフィニティーおよび／または他の生体特性を改善することが望ましい場合がある。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような改変は、例えば、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはこれらへの挿入、および／またはこれらの置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを、最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、標的への結合（ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢへの結合）を保有するという条件で、最終的な構築物に到達するように施すことができる。
変更（例えば、置換）をＨＶＲ内に施して、例えば、抗体のアフィニティーを改善することができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基［例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２０７巻：１７９～１９６頁を参照されたい］、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）に施すことができ、結果として得られる改変体ＶＨまたは改変体ＶＬを結合アフィニティーについて試験する。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティー成熟が記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００１年）を参照されたい］。アフィニティー成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３は、しばしば標的とされる。
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、１つまたは複数のＨＶＲ内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内に施すことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であり得る。上記で提供した改変体ＶＨ配列およびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異誘発の標的とされ得る抗体および／または結合ポリペプチド残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁により記載されているように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれている。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの帯電残基）を同定し、中性であるかまたは負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置きかえて、抗体－抗原間相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。初期の置換に対して機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することもできる。代替的に、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を決定して、抗体と抗原との間の接点を同定する。このような接触残基および近傍の残基は、置換の標的としてもよく、置換の候補として消失させてもよい。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、１残基～１００またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合物および／またはカルボキシル末端融合物のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合物が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導体化に適する部分として、水溶性ポリマーが挙げられるがこれに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、１つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の誘導体および／または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
本明細書で開示される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗ＢＭＰ１０抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。本明細書で開示される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗ＢＭＰ１０抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）を、本明細書で開示される別の抗体、または本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド）、または本開示の標的のいずれかを指向する低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ低分子アンタゴニスト、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１低分子アンタゴニスト、アクチビンＣ低分子アンタゴニスト、アクチビンＥ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ８低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ６低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１５低分子アンタゴニスト、Ｎｏｄａｌ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３Ｂ低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３Ｂ低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ９低分子アンタゴニスト、またはＢＭＰ１０低分子アンタゴニスト）、または本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、またはＢＭＰ６のポリヌクレオチドアンタゴニスト）、または本明細書で開示される非抗体の結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＡ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、ＢＭＰ１０結合ポリペプチド、またはＢＭＰ６結合ポリペプチド）と組み合わせることができる。例えば、抗ＧＤＦ１１抗体を、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、アクチビンＢの低分子アンタゴニスト、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはアクチビンＢの非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。代替的な実施形態では、抗アクチビンＢ抗体を、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＧＤＦ１１の非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性を阻害することができる。
Ｂ．ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、およびＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド
一態様では、本開示のアンタゴニスト（阻害性）作用因子は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその改変体である。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」とは、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）の両方を含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂのうちの１つまたは複数に結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８のシグナル伝達の活性化）に拮抗（を阻害）する、１つまたは複数の改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。一部の実施形態では、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、リガンド「トラップ」ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド）である。一部の実施形態では、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、およびその融合構築物は、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に対する結合アフィニティーが低減されている。
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性細胞外ドメインおよび関連のＡｃｔＲＩＩＡ可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号を参照されたい］。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、配列番号１についての番号付けに基づく。
本出願者らは、Ｈｉｌｄｅｎら［Ｂｌｏｏｄ（１９９４年）、８３巻（８号）：２１６３～２１７０頁］により開示されている配列を有するＦｃ融合タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸６４に対応する位置においてアラニン（Ａ６５）を有するＦｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが比較的に低いことを確認した。これに対し、位置においてアルギニン（Ｒ６５）を有する同じＦｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが、低ナノモル～高ピコモルの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢについての「野生型」参照配列として使用する。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質の配列は以下の通りである。
Figure 0007154250000001
シグナルペプチドは、一重下線を付して指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、天然Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
６４位にアラニンを持つ形態も、以下の通り文献に報告されている。
Figure 0007154250000002
ヒトＡｃｔＲＩＩＢの可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は以下の通りである。
Figure 0007154250000003
Ａ６４を持つ代替の形態は以下の通りである。
Figure 0007154250000004
一部の実施形態では、タンパク質はＮ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を伴って生成され得る。細胞外ドメインのＣ末端「テール」を一重下線によって示す。「テール」が欠失された配列（△１５配列）は以下の通りである。
Figure 0007154250000005
Ａ６４を持つ代替の形態は以下の通りである。
Figure 0007154250000006
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下の通りである（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１１０６のヌクレオチド５～１５４３；示した配列は６４位にアラニンを提供し、代わりにアルギニンを提供するように改変され得る）。
Figure 0007154250000007
ヒトＡｃｔＲＩＩＢの可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである（示した配列は６４位にアラニンを提供し、代わりにアルギニンを提供するように改変され得る。
Figure 0007154250000008
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の自然発生のポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号を参照されたい）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、配列番号９についての番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである。
Figure 0007154250000009
シグナルペプチドは、一重下線を付して指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、天然Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ可溶性（細胞外）の、プロセシング後のポリペプチド配列は、以下の通りである。
Figure 0007154250000010
細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
Figure 0007154250000011
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下の通りである（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１６１６のヌクレオチド１６４～１７０５）。
Figure 0007154250000012
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。
Figure 0007154250000013
ある特定の実施形態では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドであるＡｃｔＲＩＩポリペプチド（ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。本明細書で記載する場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」とは一般に、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の任意の自然発生の細胞外ドメインのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、およびペプチド模倣物形態を含む）（例えば、本明細書で記載される、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、およびＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）を含む。可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインに加えて、シグナル配列を含む。例えば、シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の天然シグナル配列であってもよく、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列またはミツバチメリチン（ＨＢＭ）シグナル配列を含む、別のタンパク質に由来するシグナル配列であってもよい。
ＨＢＭシグナル配列の例は、以下の通りである。
ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１４）
ＴＰＡシグナル配列の例は、以下の通りである。
ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１５）
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合活性（例えば、結合特異性）を変更させるように、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも呼ばれる）内に変異を施すことを企図する。ある特定の態様では、このような「リガンドトラップ」ポリペプチドは、１つまたは複数の特異的ＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを変更させている（上昇または低減している）。他の態様では、リガンドトラップポリペプチドは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合特異性を変更させている。
例えば、本開示は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに優先的に結合するリガンドトラップポリペプチドを使用する方法、特に、赤血球レベルを高め、かつ／または貧血を処置することを必要とする対象において、赤血球レベルを高め、かつ／または貧血を処置するための方法を提供する。任意選択で、本開示のトラップポリペプチドは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはこれを阻害しない。任意選択で、本開示のトラップポリペプチドは、ＧＤＦ８にさらに結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらを阻害する本開示のトラップポリペプチドは、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、およびＧＤＦ８のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。任意選択で、本開示のトラップポリペプチドは、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に対する結合アフィニティーが低減されている～これらに対する結合アフィニティーを有しない。
本明細書で開示されるように、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢの両方に結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）に拮抗（を阻害）する改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ受容体のリガンド結合ドメインの変更［例えば、１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、付加、または欠失）を含む］を含み、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢに対する増大した選択性を部分的に特徴とする、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップを提供する。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）を実質的に阻害しない。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップの、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、同等であるかまたは増大している（例えば、２倍、３倍、１０倍、１００倍、１０００倍増大した結合アフィニティー）。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡへの結合についてのＫＤの、ＧＤＦ１１への結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡへの結合についてのＫＤの、アクチビンＢへの結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、ＧＤＦ１１の阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、アクチビンＢの阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、ＧＤＦ１１を、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、アクチビンＢを、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは任意選択で、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０、およびＧＤＦ８のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性をさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。他の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１または２に照らした７９位において、酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まない。
他の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０を含まないか、またはこれらからならない。他の実施形態では、ＧＤＦ１１／アクチビントラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
本明細書で開示されるように、ＧＤＦ１１トラップは、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＧＤＦ１１に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）に拮抗（を阻害）するが、アクチビンＢには実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＢに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）を実質的に阻害しない改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ受容体の変更させたリガンド結合ドメイン［例えば、１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、付加、または欠失）を含む］を含み、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、ＧＤＦ１１に対する増大した選択性を部分的に特徴とする、ＧＤＦ１１トラップを提供する。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）を阻害しない。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップの、ＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、同等であるかまたは増大している（例えば、２倍、３倍、１０倍、１００倍、１０００倍増大した結合アフィニティー）。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡへの結合についてのＫＤの、ＧＤＦ１１への結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＢへの結合についてのＫＤの、ＧＤＦ１１への結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、ＧＤＦ１１の阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＢの阻害についてのＩＣ５０の、ＧＤＦ１１の阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、ＧＤＦ１１を、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、ＧＤＦ１１トラップは、ＧＤＦ１１を、アクチビンＢの阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは任意選択で、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ８のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性をさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。他の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号１または２に照らした７９位において、酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まない。
他の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０を含まないか、またはこれらからならない。他の実施形態では、ＧＤＦ１１トラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
本明細書で開示されるように、アクチビンＢトラップは、アクチビンＢに結合し、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＢに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）に拮抗（を阻害）するが、ＧＤＦ１１には実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、ＧＤＦ１１に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）を実質的に阻害しない、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。したがって、本開示は、変更させたＡｃｔＲＩＩ受容体のリガンド結合ドメイン［例えば、１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、付加、または欠失）を含む］を含み、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、アクチビンＢに対する増大した選択性を部分的に特徴とする、アクチビンＢトラップを提供する。任意選択で、アクチビンＢトラップは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化）を実質的に阻害しない。
一部の実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップの、アクチビンＢに対する結合アフィニティーは、ＡｃｔＲＩＩ受容体の非改変（野生型）リガンド結合ドメインと比べて、同等であるかまたは増大している（例えば、２倍、３倍、１０倍、１００倍、１０００倍増大した結合アフィニティー）。任意選択で、アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡへの結合についてのＫＤの、アクチビンＢへの結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのＧＤＦ１１への結合についてのＫＤの、アクチビンＢへの結合についてのＫＤに対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのアクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、アクチビンＢの阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、アクチビンＢトラップは、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインであって、そのＧＤＦ１１の阻害についてのＩＣ５０の、アクチビンＢの阻害についてのＩＣ５０に対する比が、非改変（野生型）ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、アクチビンＢトラップは、アクチビンＢを、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。任意選択で、アクチビンＢトラップは、アクチビンＢを、ＧＤＦ１１の阻害についてのＩＣ５０より、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、またはさらに１００分の１小さいＩＣ５０で阻害する、変更させたリガンド結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは任意選択で、ＢＭＰ６、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ８のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性をさらに阻害する。
一部の実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。他の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦ１１トラップは、配列番号１または２に照らした７９位において、酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まない。
他の実施形態では、アクチビンＢトラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号３、４、５、６、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
一部の実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０を含まないか、またはこれらからならない。他の実施形態では、アクチビンＢトラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のアクチビンＢトラップは、配列番号１０、１１、１８、および２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
当業者により認識されるように、記載される変異、改変体、または修飾の大半は、核酸レベルで施すこともでき、場合によって、翻訳後修飾により施すこともでき、化学合成により施すこともできる。このような技法は、当該分野で周知であり、本明細書で記載される。
当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質が、構造的特徴および機能的特徴に関して、特に、リガンド結合に関して、十分に特徴付けられている［例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７～１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８～２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）、ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３～７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号；同第７，６１２，０４１号；および同第７，８４２，６６３号を参照されたい］。例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失により、受容体のアクチビンに対するアフィニティーが低減されることを示した。配列番号１のアミノ酸２０～１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質、「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１１９）－Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃと比較してＧＤＦ－１１およびアクチビンへの結合が減少している（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１２９）－Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して同様だがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１または２に照らして）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９～１３４（配列番号１または２に照らして）のいずれかにおける変異によってリガンドの結合親和性が大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１または２に照らして）の変異によってリガンドの結合は実質的に低下しない。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢトラップポリペプチドは、早ければアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終了し得るが、１０９～１１９で終わる形態は、リガンドの結合が減少していると予想される。アミノ酸１１９（配列番号１または２に照らして）は、不完全に保存されているので、容易に変更または切断される。１２８以後（配列番号１または２に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢに基づくリガンドトラップはリガンドの結合活性を保持している。１１９～１２７（配列番号１または２に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢに基づくリガンドトラップは、中間の結合能を有する。これらの形態はいずれも、臨床的または実験的な設定に応じて使用することが望ましい場合がある。
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはその手前（配列番号１または２に照らして）で始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、開始システインを表す。２４位（配列番号１または２に照らして）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ－連結グリコシル化配列を導入する（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０～２９に対応する領域内の変異は、十分に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号１または２に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップ構築物は、一般的なリガンド結合活性を保持し、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号１または２に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップ構築物もまた、リガンド結合活性を保持することが予想される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号において示されているデータは、驚くべきことに、２２、２３、２４、または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物は、最大の活性を有することを実証する。
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合活性）は、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含む。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップ構築物は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの一部であって、配列番号１または２のアミノ酸２０～２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９で始まり）、配列番号１または２のアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４で終わる）一部に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態では、本開示の、ＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号１または２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まない。他の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。他の例は、配列番号１または２の２０～２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）、または２１～２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）で始まり、１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９～１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）、１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９～１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）で終わる、ＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップ構築物を含む。他の例は、配列番号１または２の２０～２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）、２１～２４位（例えば、２１、２２、２３、または２４位）、または２２～２５位（例えば、２２、２２、２３、または２５位）で始まり、１０９～１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）で終わる構築物を含む。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号１または２の対応する部分に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する改変体もまた、企図され、任意選択で、このようなＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、ｉ）配列番号１または２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まず、ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸残基２５～１３１に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸２５～１３１を含まないか、またはこれらからならない。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢベースのトラップポリペプチドは、ｉ）ＡｃｔＲＩＩＢベースのトラップポリペプチドが、配列番号１または２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まず、ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＢベースのトラップポリペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならないという条件で、配列番号３、４、５、６、２１、および２３に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
本開示は、図１に示されるように、合成ＡｃｔＲＩＩＢ構造の分析結果を含み、これは、一部において、リガンド結合ポケットが残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３～Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４～Ｆ１０１によって規定されることを実証している。これらの位置において、保存的変異は許容されると予想されるが、Ｋ７４Ａ変異は、Ｒ４０Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｆ８２Ａ、およびＬ７９位における変異と同様に良好に許容される。Ｒ４０はツメガエルにおいてＫであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Ｑ５３は、ウシのＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではＫであり、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含めたアミノ酸がこの位置で許容される。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップタンパク質についての一般式は、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、任意選択で、２０～２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）または２２～２５位（例えば、２２、２３、２４、または２５位）の範囲の位置で始まり、１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内に、１つ、２つ、５つ、１０、または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、０、１つ、または複数の非保存的変更を含むアミノ酸配列である。好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのトラップポリペプチドは、配列番号１または２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン（Ｄ）酸またはグルタミン（Ｅ）酸］を含まない。他の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸２９～１０９を含まないか、またはこれらからならない。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上述のように）、および４２～４６位および６５～７３位（配列番号１に照らして）を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンドの結合を実際に改善し、したがって、Ｒ６４バックグラウンドにおいてリガンドの結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。この変化により、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化が排除される可能性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実証されている。Ｒ６４Ａ変化は許容性が乏しいが、Ｒ６４Ｋは良好に許容され、したがって、Ｈなどの別の塩基性残基が６４位において許容され得る（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。
ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きなストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を持ち、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良好に保存されている。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物の生物体からのＡｃｔＲＩＩＢ配列を比較することにより、変更され得る残基への洞察がもたらされる。したがって、活性な、本開示の方法に従う有用なヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置の１つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基と同様の残基を含み得る。以下の例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するためのこのアプローチを例示している。Ｌ４６は、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではバリンであるので、この位置は変更され得、任意選択で、Ｖ、ＩまたはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更され得る。Ｅ５２は、ツメガエルではＫであり、これは、この部位で、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示している。Ｔ９３は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において幅広い構造的差異が許容されることを示しており、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好ましい。Ｆ１０８は、ツメガエルではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性群、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。Ｅ１１１は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた、荷電残基が許容されることを示している。Ｒ１１２は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、ＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示している。１１９位のＡは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではＰとして、ツメガエルではＶとして現れ、したがって、この位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずである。
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）－Ｆｃ形態と比べて、さらなるＮ－連結グリコシル化部位（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）の付加は、十分に許容されることが既に実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。２４位にアスパラギンを導入することにより（Ａ２４Ｎ構築物；配列番号１に照らして））、より長い半減期を与え得るＮＸＴ配列が作製される。他のＮＸ（Ｔ／Ｓ）配列は、４２～４４（ＮＱＳ）および６５～６７（ＮＳＳ）において見出されるが、後者は６４位のＲで効率的にグリコシル化されないことがあり得る。Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、一般に、図１において定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内因性Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位としては、アミノ酸２０～２９、２０～２４、２２～２５、１０９～１３４、１２０～１３４または１２９～１３４（配列番号１に照らして）が挙げられる。Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合成分との間のリンカーにも導入され得る。このような部位は、以前から存在しているＳまたはＴに対して正しい位置にＮを導入することによって、または、以前から存在しているＮに対応する位置にＳまたはＴを導入することによって、最小の労力で導入され得る。したがって、Ｎ－連結グリコシル化部位を生じる望ましい変更は、Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（できるかぎりＮ６５Ａの変更と組み合わせる）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔ（配列番号１に照らして）である。グリコシル化されることが予測されるＳはどれも、グリコシル化によってもたらされる保護のために、免疫原性部位を生じることなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されることが予測されるＴはどれも、Ｓに変更され得る。したがって、Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１に照らして）の変更が企図される。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔの変更が使用され得る。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドは、上記の、１つまたは複数の追加の非内因性Ｎ－連結グリコシル化コンセンサス配列を有するＡｃｔＲＩＩＢ改変体であり得る。
記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わせられ得る。さらに、本明細書中に記載される変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がＡｃｔＲＩＩＢにあることを示す。配列番号１に照らして、これらとしては、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、そして特にトリプトファン）、３７位（酸性、そして特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本明細書中に開示されるトラップそれぞれにおいて、本開示は保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）、全て配列番号１に照らして。
活性なＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドについての一般式は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含むポリペプチドである。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０を含まないか、またはこれらからならない。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１２～８２に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドであって、任意選択で、１～５位（例えば、１、２、３、４、または５位）または３～５位（例えば、３、４、または５位）の範囲の位置で始まり、それぞれ、１１０～１１６位（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、または１１６位）または１１０～１１５位（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５位）の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内に、１つ、２つ、５つ、１０、または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、０、１つ、または複数の非保存的変更（配列番号９に照らして）を含むポリペプチドを含む。
本開示のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）の機能的に活性なフラグメントは、リガンドトラップポリペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより生成されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のメリフィールド固相ｆ－Ｍｏｃ化学反応またはメリフィールド固相ｔ－Ｂｏｃ化学反応など、当該分野で公知の技法を使用して、化学合成することができる。フラグメントを、生成することができ（組換えにより、または化学合成により）、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢのアンタゴニスト（阻害剤）として機能し得るが、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しないペプチジルフラグメントを同定するように試験することができる。
機能的改変体は、治療有効性または安定性（例えば、貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどの目的のために、本開示のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）の構造を改変することにより生成することができる。このような改変リガンドトラップポリペプチドは、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢへの結合を保持するように選択される場合、自然発生のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的同等物であると考えられる。改変リガンドトラップポリペプチドはまた、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。リガンドトラップポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、非改変ＡｃｔＲＩＩポリペプチドもしくは野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較した場合に、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、Ｎｏｄａｌ、およびＧＤＦ１５など、１つまたは複数のリガンドに結合する、改変体リガンドトラップポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような、本開示のリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）の特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ－連結もしくはＮ－連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－スレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ－連結グリコシル化部位については）リガンドトラップポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。リガンドトラップポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド上に存在する１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのリガンドトラップポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。リガンドトラップポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）、１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。リガンドトラップポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するためのリガンドトラップタンパク質は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
本開示はさらに、変異体、特に、リガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）のコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法のほか、短縮型変異体も生成する方法も企図するが、コンビナトリアル変異体のプールは、リガンドトラップ配列を同定するためにとりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１に結合し、任意選択で、他のリガンドにも結合するが、アクチビンＡには実質的に結合しないリガンドトラップポリペプチドを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、リガンドトラップは、ＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢ）に結合する能力、ＡｃｔＲＩＩリガンドのＡｃｔＲＩＩポリペプチドへの結合を妨害する能力、または、ＡｃｔＲＩＩリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
リガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）またはその改変体の活性はまた、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイでも試験することができる。例えば、赤血球生成に関与する遺伝子の発現に対するリガンドトラップの作用が評価され得る。これは、必要な場合、１または複数の組換えＡｃｔＲＩＩリガンドタンパク質（例えば、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢ）の存在下で行われ得、そして、リガンドトラップポリペプチドおよび／またはその改変体、そして任意選択でＡｃｔＲＩＩリガンドを生成するように細胞がトランスフェクトされ得る。同様に、リガンドトラップは、マウスもしくは他の動物に投与され得、そして、１または複数の血液測定値（例えば、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、または網状赤血球数）が、当該分野で認識された方法を用いて評価され得る。
コンビナトリアル由来のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）であって、参照リガンドトラップと比べて選択的な効力を有するか、または一般に効力を増大させたリガンドトラップを生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変リガンドトラップとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変リガンドトラップの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、リガンドトラップの半減期を調節することによってリガンドトラップポリペプチドレベルに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えリガンドトラップポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチド配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である［例えば、Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ． ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３～２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁を参照されたい］。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている［例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６～３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ、８９巻：２４２９～２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４～４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８７巻：６３７８～６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，１９８，３４６号；および同第５，０９６，８１５号を参照されたい］。
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、本開示のリガンドトラップは、例えば、アラニン走査変異誘発［例えば、Ｒｕｆら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１５６５～１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３０９５～３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ、１３７巻：１０９～１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８巻：５９７～６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８巻：２８８８～２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２～１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁を参照されたい］を使用して、リンカー走査変異誘発［例えば、Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻：６５３～６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２巻：２６４４～２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：３１６頁を参照されたい］によって、飽和変異誘発［例えば、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：６１３頁を参照されたい］によって、ＰＣＲ変異誘発［例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１巻：１１～１９頁を参照されたい］によって、または化学的変異誘発［例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、７巻：３２～３４頁を参照されたい］を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの短縮型（生体活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、本開示のリガンドトラップのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、および／またはアクチビンについての結合アッセイならびにＧＤＦ１１、アクチビンＢ、および／またはアクチビンに媒介される細胞シグナル伝達についてのアッセイを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）はさらに、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたリガンドトラップポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、リガンドトラップポリペプチドの機能に対する影響は、他のリガンドトラップポリペプチド改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。リガンドトラップポリペプチドの新生形態を切断することによってリガンドトラップポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、リガンドトラップポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
ある特定の態様では、本開示のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）は、少なくともＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の部分（ドメイン）と、１つまたは複数の異種部分（ドメイン）とを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン－、アミラーゼ－、およびニッケル－もしくはコバルト－結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、リガンドトラップポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、リガンドトラップは、インビボでリガンドトラップポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加させる任意のものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、筋肉成長のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下のＦｃドメインに融合させたＡｃｔＲＩＩタンパク質の改変体細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）を含むリガンドトラップ融合タンパク質を提供する。
Figure 0007154250000014
他の実施形態では、本開示は、Ｆｃドメインに融合させたＡｃｔＲＩＩＢの改変体細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）を含むリガンドトラップ融合タンパク質を提供する。
Figure 0007154250000015
Ａ６４置換を有する代替的な形態は、以下の通りである。
Figure 0007154250000016
任意選択で、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、リジン３２２およびＡｓｎ－４３４のような残基における１または複数の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｐ－２６５変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、Ｆｃγ受容体への結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｎ－４３４変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能の増加を有する。
融合タンパク質の様々な成分は、所望の機能と両立するあらゆる様式で配列され得ることが理解される。例えば、リガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）を、異種ドメインに対してＣ末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、リガンドトラップドメインに対してＣ末端に配置することもできる。リガンドトラップドメインと異種ドメインとは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、そして、さらなるドメインもしくはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端側に、または、これらのドメイン間に含められてもよい。
特定の実施形態では、本開示のリガンドトラップ（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）は、リガンドトラップポリペプチドを安定化させ得る１または複数の修飾を含む。例えば、このような修飾は、リガンドトラップポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、リガンドトラップポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ／または、リガンドトラップポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、リガンドトラップと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、リガンドトラップポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、リガンドトラップポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
ＴＰＡリンカーを含むＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ融合タンパク質の例を、下記に提供する。
Figure 0007154250000017
ＴＰＡリーダー配列は、一重下線で指し示し、ＴＧＧＧリンカードメインは、二重下線で指し示し、免疫グロブリンＦｃドメインは、太字フォントで指し示す。
このポリペプチドは、以下の核酸配列によりコードされる。
Figure 0007154250000018
ＣＨＯ細胞株から精製される、成熟ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ融合タンパク質の例を、下記に提供する。
Figure 0007154250000019
ＴＧＧＧリンカードメインは、二重下線で指し示し、免疫グロブリンＦｃドメインは、太字フォントで指し示す。
ＴＰＡリンカーを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質の例を、下記に提供する。
Figure 0007154250000020
ＴＰＡリーダー配列は、一重下線で指し示し、ＴＧＧＧリンカードメインは、二重下線で指し示し、免疫グロブリンＦｃドメインは、太字フォントで指し示す。
このポリペプチドは、以下の核酸配列によりコードされる。
Figure 0007154250000021
ＣＨＯ細胞株から精製される、成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質［本明細書では、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃと呼ばれる］の例を、下記に提供する。
Figure 0007154250000022
免疫グロブリンＦｃドメインは、一重下線で指し示す。
Ｌ７９Ｄ置換［本明細書では、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃと呼ばれる］を有する代替的な形態は、以下の通りである。
Figure 0007154250000023
免疫グロブリンＦｃドメインは、一重下線で指し示す。
二重短縮型ＡｃｔＲＩＩＢドメインおよびＬ７９Ｄ置換を含む代替的な形態［本明細書では、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃと呼ばれる］は、以下の通りである。
Figure 0007154250000024
免疫グロブリンＦｃドメインは、一重下線で指し示す。
ある特定の実施形態では、本開示のリガンドトラップ融合タンパク質（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）は、配列番号１８、２０、２１、２３、４８、および４９のいずれか１つのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本開示のリガンドトラップ融合タンパク質は、配列番号１８、２０、２１、２３、４８および４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。他の好ましい実施形態では、配列番号２１または２３のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップ融合タンパク質は、配列番号１または２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。
特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの単離および／または精製された形態（他のタンパク質から単離されたか、そうでなければ、他のタンパク質を実質的に含まないもの）を利用可能にする。
特定の実施形態では、本開示のリガンドトラップポリペプチドは、種々の当該分野で公知の技法によって生成され得る。例えば、リガンドトラップポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｍ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載されているものなどの、標準のタンパク質化学の技法を使用して合成され得る。さらに、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００を参照のこと）。あるいは、リガンドトラップポリペプチド、そのフラグメントまたは改変体は、当該分野で周知のように、種々の発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換えにより生成され得る。さらなる実施形態では、改変、または非改変リガンドトラップポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対の塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用して、組換えにより生成された完全長リガンドトラップポリペプチドを消化することによって生成され得る。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）は、タンパク質分解の切断部位を同定するために使用され得る。あるいは、このようなリガンドトラップポリペプチドは、化学的切断によって（例えば、臭化シアン、ヒドロキシアミン）などの当該分野で公知の標準技法などで組換えにより生成された完全長リガンドトラップポリペプチドから生成され得る。
好ましい実施形態では、本開示の全てのタンパク質およびポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ、ＧＤＦ１１トラップ、およびアクチビンＢトラップ）であって、本明細書で記載される方法に従い使用されるタンパク質およびポリペプチドは、単離タンパク質および単離ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、単離タンパク質または単離ポリペプチドとは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドを、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、（２００７年）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ８４８巻：７９～８７頁を参照されたい］。
本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップ、アクチビンＢトラップ、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップ）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド）を、本明細書で開示される別のリガンドトラップポリペプチド、または本開示の標的のいずれかを指向する抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、または抗ＢＭＰ１０抗体）、または本開示の標的のいずれかを指向する低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１低分子アンタゴニスト、アクチビンＣ低分子アンタゴニスト、アクチビンＥ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ８低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ６低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１５低分子アンタゴニスト、Ｎｏｄａｌ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３Ｂ低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ９低分子アンタゴニスト、またはＢＭＰ１０低分子アンタゴニスト）、または本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、またはＢＭＰ６のポリヌクレオチドアンタゴニスト）、または本明細書で開示される非抗体の結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＢＭＰ６結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂ結合ポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、またはＢＭＰ１０結合ポリペプチド）と組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチドを、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、アクチビンＢの低分子アンタゴニスト、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはアクチビンＢの非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。代替的な実施形態では、アクチビンＢトラップポリペプチドを、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＧＤＦ１１の非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性を阻害することができる。
Ｃ．トラップポリペプチドをコードする核酸および組換え法
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）をコードする、単離核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１２は、自然発生のヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号１３は、ＡｃｔＲＩＩＡのプロセシング後の細胞外ドメインをコードする。例えば、配列番号７は、自然発生のヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（上記のＡ６４改変体）をコードするが、配列番号８は、ＡｃｔＲＩＩＢのプロセシング後の細胞外ドメイン（上記のＡ６４改変体）をコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、ＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩベースのリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色***置と異なる染色***置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１２または１３の改変体である核酸を含むと理解される。ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７または８の改変体である核酸を含むと理解される。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体など、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失により異なる配列を含む。本開示の核酸は、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性に拮抗するＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドをコードする。任意選択で、本開示の核酸は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しないＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらを阻害するＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップポリペプチドをコードする本開示の核酸は、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップは、配列番号８、１３、１９、および２２に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離核酸配列または組換え核酸配列によりコードされる。好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのリガンドトラップおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのリガンドトラップは、配列番号８、１３、１９、および２２のいずれか１つを含むかまたはこれらからなる核酸配列によりコードされない。当業者は、配列番号８、１３、１９、および２２、ならびにこれらの改変体に相補的な配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列もまた、配列番号８、１３、１９、および２２に相補的な配列を含まないか、またはこれらからならないという条件で、本開示の範囲内にあることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離核酸配列であっても、組換え核酸配列であっても、かつ／または異種ヌクレオチド配列と融合させてもよく、ＤＮＡライブラリー内の核酸配列であってもよい。
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号８、１３、１９、および２２に指定されるヌクレオチド配列、配列番号８、１３、１９、および２２の相補配列、またはこれらのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も、それらが、配列番号８、１３、１９、および２２のヌクレオチドを含まないか、またはこれらからならないという条件で含む。上述のように、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号８、１３、１９および２２に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３～５％までのヌクレオチド）におけるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α－接合因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組合せが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン－バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順［例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年）を参照のこと］。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β－ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示はまた、１または複数の本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本開示はさらに、本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ融合物またはＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合物を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃタンパク質またはＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができ、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物（マウス）、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８巻：８９７２頁を参照のこと）。
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくはスタガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ－ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る［例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと］。
Ｄ．他の結合ポリペプチド
別の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）を阻害する、非抗体結合ポリペプチドである。任意選択で、本開示の非抗体結合ポリペプチドまたは非抗体結合ポリペプチドの組合せは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）を阻害しない。任意選択で、本開示の非抗体結合ポリペプチドまたは非抗体結合ポリペプチドの組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＧＤＦ８に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。一部の実施形態では、本開示の非抗体結合ポリペプチドまたは非抗体結合ポリペプチドの組合せであって、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害するポリペプチドまたは組合せは、アクチビンＥ、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に結合する非抗体結合ポリペプチドは、ＢＭＰ９とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用、および／またはＢＭＰ１０とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に結合する非抗体結合ポリペプチドは、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との相互作用、および／またはＢＭＰ１０とＡＬＫ１との相互作用を阻害しないか、またはこれらを実質的に阻害しない。
本開示の結合ポリペプチドは、公知のポリペプチド合成法を使用して化学合成することもでき、組換え技術を使用して調製および精製することもできる。結合ポリペプチドは、通常少なくとも約５アミノ酸の長さであり、代替的に、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００アミノ酸の長さまたはこれより長く、ここで、このような結合ポリペプチドは、好ましくは、本明細書で記載される標的（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＥ、アクチビンＣ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０）に特異的に結合することが可能である。結合ポリペプチドは、不要な実験を行わず、周知の技法を使用して同定することができる。これに関して、例えば、米国特許第５，５５６，７６２号；同第５，７５０，３７３号；同第４，７０８，８７１号；同第４，８３３，０９２号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６８９号；および同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号；および同第ＷＯ８４／０３５６４号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻：３９９８～４００２頁；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２巻：１７８～１８２頁；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６年）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０～１４９頁；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ、１０２巻：２５９～２７４頁；Ｓｃｈｏｏｆｓら（１９８８年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０巻：６１１～６１６頁、Ｃｗｉｒｌａ， Ｓ． Ｅ．ら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７巻：６３７８頁；Ｌｏｗｍａｎ， Ｈ． Ｂ．ら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．ら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４頁；Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．ら（１９９１年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁；Ｋａｎｇ， Ａ． Ｓ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：８３６３頁、ならびにＳｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．（１９９１年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２巻：６６８頁を含め、当該分野では、ポリペプチド標的に特異的に結合することが可能な結合ポリペプチドについて、ポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることに留意されたい。
これに関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大規模なポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、標的ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＥ、アクチビンＣ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０）に特異的に結合することが可能なライブラリーのメンバーを同定することを可能とする、１つの周知の技法である。ファージディスプレイとは、改変体ポリペプチドを、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示する技法である［例えば、Ｓｃｏｔｔ， Ｊ． Ｋ．およびＳｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６頁を参照されたい］。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質改変体（またはランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大規模なライブラリーは、標的分子に高アフィニティーで結合する配列について、迅速かつ効率的にソートし得るという事実にある。ファージ上のペプチドライブラリー［例えば、Ｃｗｉｒｌａ， Ｓ． Ｅ．ら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７巻：６３７８頁を参照されたい］またはタンパク質ライブラリー［Ｌｏｗｍａｎ， Ｈ． Ｂ．ら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．ら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４頁；Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．ら（１９９１年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁；Ｋａｎｇ， Ａ． Ｓ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：８３６３頁］の提示が、特異的結合特性を有するポリペプチドまたはオリゴペプチドについて、数百万に及ぶポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている［例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．（１９９１年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２巻：６６８頁を参照されたい］。ランダム変異体のファージライブラリーのソートは、多数の改変体を構築し、拡大させるための戦略、標的受容体を使用したアフィニティー精製のための手順、および結合濃縮結果を評価する手段を必要とする（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６８９号；および同第５，６６３，１４３号を参照されたい）。
大半のファージディスプレイ法では、フィラメント型ファージを使用しているが、ラムダ字形ファージディスプレイシステム（例えば、ＷＯ９５／３４６８３；および米国特許第５，６２７，０２４号を参照されたい）、Ｔ４ファージディスプレイシステム［例えば、Ｒｅｎら（１９９８年）、Ｇｅｎｅ、２１５巻：４３９頁；Ｚｈｕら（１９９８年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８巻（１５号）：３２０９～３２１４頁；Ｊｉａｎｇら（１９９７年）、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５巻（１１号）：４７７０～４７７７頁；Ｒｅｎら（１９９７年）、Ｇｅｎｅ、１９５巻（２号）：３０３～３１１頁；Ｒｅｎ（１９９６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、５巻：１８３３頁；Ｅｆｉｍｏｖら（１９９５年）、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、１０巻：１７３頁を参照されたい］、およびＴ７ファージディスプレイシステム［例えば、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（１９９３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７巻：２２８～２５７頁；および米国特許第５，７６６，９０５号を参照されたい］もまた公知である。
当該分野では、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、機能的タンパク質を提示し、これらのタンパク質を所望の特性についてスクリーニングする潜在的可能性を有するディスプレイシステムの能力を増強する追加の改善が公知である。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発されており（例えば、ＷＯ９８／１４２７７を参照されたい）、ファージディスプレイライブラリーを使用して、二分子間相互作用（例えば、ＷＯ９８／２０１６９；およびＷＯ９８／２０１５９を参照されたい）および拘束螺旋状ペプチドの特性（例えば、ＷＯ９８／２００３６を参照されたい）が解析および制御されている。国際特許公開第ＷＯ９７／３５１９６号は、アフィニティーリガンドを単離する方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、１つの溶液であって、その中でリガンドが標的分子に結合する溶液、および第２の溶液であって、その中でアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない溶液と接触させて、結合リガンドを選択的に単離する方法について記載している。国際特許公開第ＷＯ９７／４６２５１号は、ランダムファージディスプレイライブラリーを、アフィニティー精製された抗体でバイオパニングし、次いで、結合ファージを単離した後で、マイクロプレートウェルを使用して、高アフィニティーの結合ファージを単離する、マイクロパニングプロセスを施す方法について記載している。Ｓｔａｐｈｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓのプロテインＡの、アフィニティータグとしての使用についてもまた、報告されている［例えば、Ｌｉら（１９９８年）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９巻：１８７頁を参照されたい］。
ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーであり得るコンビナトリアルライブラリーを使用して、酵素特異性を識別する、基質サブトラクションライブラリーの使用について記載している。ファージディスプレイを使用する洗浄剤中の使用に適する酵素を選択するための方法については、国際特許公開第ＷＯ９７／０９４４６号において記載されている。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法については、例えば、米国特許第５，４９８，５３８号；同第５，４３２，０１８号；および国際特許公開第ＷＯ９８／１５８３３号において記載されている。
ペプチドライブラリーを生成し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法はまた、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号；同第５，４３２，０１８号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，４９８，５３０号；同第５，７７０，４３４号；同第５，７３４，０１８号；同第５，６９８，４２６号；同第５，７６３，１９２号；および同第５，７２３，３２３号においても開示されている。
本明細書で開示される非抗体結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＢＭＰ６結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂ結合ポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、またはＢＭＰ６結合ポリペプチド）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。本明細書で開示される非抗体結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＡ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＢＭＰ６結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂ結合ポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、またはＢＭＰ６結合ポリペプチド）を、本開示の、別の非抗体結合ポリペプチド、または本開示の標的のいずれかを指向する抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、または抗ＢＭＰ１０抗体）、または本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド）、または本開示の標的のいずれかを指向する低分子もしくは本開示の標的のいずれかを指向する低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１低分子アンタゴニスト、アクチビンＣ低分子アンタゴニスト、アクチビンＥ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ８低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ６低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１５低分子アンタゴニスト、Ｎｏｄａｌ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３Ｂ低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ９低分子アンタゴニスト、またはＢＭＰ１０低分子アンタゴニスト）、または本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、またはＢＭＰ６のポリヌクレオチドアンタゴニスト）と組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチドを、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、アクチビンＢの低分子アンタゴニスト、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはアクチビンＢの非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。代替的な実施形態では、アクチビンＢ結合ポリペプチドを、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＧＤＦ１１の非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性を阻害することができる。
Ｅ．低分子アンタゴニスト
別の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現（例えば、転写、翻訳、および／または細胞内分泌）を阻害する低分子アンタゴニストである。任意選択で、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡの発現を阻害しない。任意選択で、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８の発現をさらに阻害する。一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せであって、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現を阻害する低分子アンタゴニストまたは組合せは、アクチビンＥ、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＢＭＰ３Ｂの１つまたは複数の発現をさらに阻害する。
別の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつ、これらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）を阻害する低分子作用因子である。任意選択で、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡに結合せず、かつ／またはその活性（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）を阻害しない。任意選択で、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ、その活性（例えば、ＧＤＦ８に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せであって、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢに結合し、かつこれらの活性を阻害する低分子アンタゴニストまたは組合せは、ＧＤＦ８、アクチビンＥ、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数にさらに結合し、かつ、これらの活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に結合する低分子は、ＢＭＰ９とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用、および／またはＢＭＰ１０とＴＧＦβスーパーファミリーのＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する。好ましくは、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に結合する低分子は、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との相互作用、および／またはＢＭＰ１０とＡＬＫ１との相互作用 を阻害しないか、またはこれらを実質的に阻害しない。
さらなる態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの活性に間接的に拮抗する低分子作用因子である。一部の実施形態では、本開示の間接的な低分子アンタゴニストまたは間接的な低分子アンタゴニストの組合せは、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合する低分子であり、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させること（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３シグナル伝達の活性化）を阻害する。任意選択で、本開示の間接的な低分子アンタゴニストまたは間接的な低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させること（例えば、アクチビンＡに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３のシグナル伝達）を実質的に阻害しない。任意選択で、本開示の間接的な低分子アンタゴニストまたは間接的な低分子アンタゴニストの組合せは、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、ＧＤＦ８によるＡｃｔＲＩＩ受容体への結合および／またはこの活性化をさらに阻害する。一部の実施形態では、本開示の間接的な低分子アンタゴニストまたは間接的な低分子アンタゴニストの組合せであって、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する低分子アンタゴニストまたは組合せは、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＡ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させること（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢによるＳｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８のシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。
本開示の結合有機低分子アンタゴニストは、公知の方法を使用して、同定し、化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常約２０００ダルトン未満のサイズであり、代替的に、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ダルトン未満のサイズであり、ここで、このような有機低分子は、本明細書で記載されるポリペプチド（アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６）に、好ましくは、特異的に結合することが可能である。このような低分子アンタゴニストは、不要な実験を行わず、周知の技法を使用して同定することができる。これに関して、当該分野では、ポリペプチド標的に特異的に結合することが可能な分子について、有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることに留意されたい（例えば、国際特許公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
本明細書で開示される低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の低分子アンタゴニスト）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。本明細書で開示される低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の低分子アンタゴニスト）を、本開示の別の低分子アンタゴニスト、または本開示の標的のいずれかを指向する抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、または抗ＢＭＰ１０抗体）、または本明細書で開示される非抗体結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＢＭＰ６結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂ結合ポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、またはＢＭＰ１０結合ポリペプチド）、または本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、またはＧＤＦ／アクチビンＢトラップポリペプチド）、または本開示のポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＡのポリヌクレオチドアンタゴニスト、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、またはＢＭＰ３Ｂのポリヌクレオチドアンタゴニスト）と組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニストを、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、アクチビンＢの低分子アンタゴニスト、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはアクチビンＢの非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。代替的な実施形態では、アクチビンＢ抗体の低分子アンタゴニストを、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＧＤＦ１１の非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性を阻害することができる。
Ｆ．アンタゴニストポリヌクレオチド
別の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストである。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニストポリヌクレオチドは、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現（例えば、転写、翻訳、および／または細胞内分泌）を阻害する。任意選択で、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡを阻害しない（例えば、アクチビンＡの発現および／または活性を阻害しない）。任意選択で、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８をさらに阻害する（例えば、ＧＤＦ８の発現および／または活性を阻害する）。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢ（例えば、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢの発現および／または活性）を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＥ、アクチビンＣ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂのうちの１つまたは複数をさらに阻害する（例えば、発現および／または活性を阻害する）。
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。当該分野では、ヒトＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列が公知である。当該分野では加えて、ポリヌクレオチドアンタゴニストを生成する多くの異なる方法も周知である。したがって、本開示に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が慣習的に作製することができる。
アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ、または三重螺旋形成を介して、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。アンチセンス法は、例えば、Ｏｋａｎｏ（１９９１年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）において論じられている。三重螺旋形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁；およびＤｅｒｖａｎら、（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３００頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示される遺伝子のＲＮＡ転写物（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ）の少なくとも一部に相補的な一本鎖ＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ）の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るＲＮＡとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖（または、場合に応じて、三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’側非翻訳配列であって、ＡＵＧ開始コドンを含む５’側非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に対する配列相補性もまた、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ， Ｒ．、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：３３３～３３５頁を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ）の非コード領域である、５’側または３’側の非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡ（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ）の翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用し得る。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のそれほど効率的な阻害剤ではないが、本開示の方法に従い使用し得る。本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ）の５’側領域、３’側領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするようにデザインされている場合でも、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６～約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂ、ならびに／またはアンチセンス核酸）は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：３０４～３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端リピート内に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２２巻：７８７～７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：１４４１～１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻：３９～４２頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、およびＧＤＦ３Ｂのうちの１つまたは複数の発現を標的とする干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉとは、標的とされるｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を介する特異的ｍＲＮＡとの相互作用により、標的とされる遺伝子をサイレンシングする。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体が、細胞による分解の標的とされる。ｓｉＲＮＡ分子は、１０～５０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的な標的遺伝子（例えば、遺伝子に少なくとも８０％の同一性）の発現に干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
追加のＲＮＡｉ分子として、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、また、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループにより接続された、標的遺伝子に由来するセンス配列とアンチセンス配列とを含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎら［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．（２００２年）、１６巻：９４８～９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを実行する手段としてヘアピンに折り畳まれた低分子ＲＮＡ分子を使用している。したがって、このような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はまた、本明細書で記載される方法においても有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは、サイレンシング活性に影響を及ぼさずに変化し、ステム長は、約２５～約３０ｎｔのいずれかの範囲であることが可能であり、ループサイズは、４～約２５ｎｔの間の範囲であり得る。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物に相似し、いずれにせよ、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、約１０～７０ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡであり、「ステムループ」構造を特徴とするｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後、ＲＩＳＣを介するさらなるプロセシングの後で、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定せず、ＲＮＡｉを媒介する分子は、インビトロで、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５２１巻：１９５～１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：６０４７～６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）によって生成することができる。
別の態様に従うと、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入型ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入型ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子であって、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、またはＧＤＦ３Ｂのポリペプチドなど、標的分子に特異的に結合する三次構造に結合し、これを形成する核酸分子である。当該分野では、アプタマーの生成および治療的使用が、十分に確立されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい）。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号において見出すことができる。核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）プロセスを介して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，５８０，７３７号；同第５，５６７，５８８号；同第５，７０７，７９６号；同第５，７６３，１７７号；同第６，０１１，５７７号；および同第６，６９９，８４３号において記載されているように、標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化法である。アプタマーを同定する別のスクリーニング法は、米国特許第５，２７０，１６３号において記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、単量体であれ、多量体であれ、他の核酸分子およびポリペプチドを含め、事実上任意の化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な二次元構造および三次元構造ならびに化学的多様性を形成する核酸の能力に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、区分、および増幅の段階的反復を伴い、同じ一般的な選択スキームを使用して、所望の結合アフィニティーおよび選択性を達成する。ランダム化された配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から始めて、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を結合に好適な条件下で標的と接触させる工程と；非結合核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から区分する工程と；核酸－標的複合体を解離させる工程と；核酸－標的複合体から解離させた核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物をもたらす工程とを含む。結合させる工程と、区分する工程と、解離させる工程と、増幅する工程を、所望の回数のサイクルにわたり繰り返して、高アフィニティーおよび大きな特異性で標的分子に結合する核酸リガンドをもたらす。
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁を参照されたい］が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照されたい］。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、またはＧＤＦ３Ｂのポリヌクレオチドアンタゴニスト）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。本明細書で開示されるポリヌクレオチドアンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、またはＧＤＦ３Ｂのポリヌクレオチドアンタゴニスト）を、本開示の別のポリヌクレオチドアンタゴニスト、または本開示の標的のいずれかを指向する抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＧＤＦ１５抗体、抗Ｎｏｄａｌ抗体、抗ＧＤＦ３抗体、抗ＢＭＰ３抗体、抗ＢＭＰ３Ｂ抗体、抗ＢＭＰ９抗体、または抗ＢＭＰ１０抗体）、または本明細書で開示される非抗体結合ポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＢ結合ポリペプチド、アクチビンＥ結合ポリペプチド、アクチビンＣ結合ポリペプチド、ＧＤＦ８結合ポリペプチド、ＢＭＰ６結合ポリペプチド、ＧＤＦ１５結合ポリペプチド、Ｎｏｄａｌ結合ポリペプチド、ＧＤＦ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３結合ポリペプチド、ＢＭＰ３Ｂ結合ポリペプチド、ＢＭＰ９結合ポリペプチド、またはＢＭＰ１０結合ポリペプチド）、または本明細書で開示されるリガンドトラップポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１トラップポリペプチド、アクチビンＢトラップポリペプチド、またはＧＤＦ１１／アクチビンＢトラップポリペプチド）、または本開示の標的のいずれかを指向する低分子アンタゴニスト（例えば、アクチビンＡ低分子アンタゴニスト、アクチビンＢ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１低分子アンタゴニスト、アクチビンＣ低分子アンタゴニスト、アクチビンＥ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ８低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ６低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ６低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１５低分子アンタゴニスト、Ｎｏｄａｌ低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ３Ｂ低分子アンタゴニスト、ＢＭＰ９低分子アンタゴニスト、またはＢＭＰ１０低分子アンタゴニスト）と組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１のアンチセンスアンタゴニストを、本開示のアクチビンＢアンタゴニスト（例えば、アクチビンＢトラップポリペプチド、抗アクチビンＢ抗体、アクチビンＢの低分子アンタゴニスト、アクチビンＢのポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはアクチビンＢの非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができる。代替的な実施形態では、アクチビンＢのアンチセンスアンタゴニストを、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニスト（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＧＤＦ１１抗体、ＧＤＦ１１の低分子アンタゴニスト、ＧＤＦ１１のポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＧＤＦ１１の非抗体ポリペプチドアンタゴニスト）と組み合わせて、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢ両方の活性を阻害することができる。
３．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、開示されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその改変体）の使用であって、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト、特に、これらのリガンドの１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させること（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）を阻害するが、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることは阻害しないアンタゴニストを同定するための使用に関する。本明細書で開示されるスクリーニングアッセイを介して同定される化合物を試験して、インビボまたはインビトロにおける赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／または網状赤血球レベルを調節するそれらの能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
ＡｃｔＲＩＩのシグナル伝達を標的化することによって、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてＡｃｔＲＩＩ媒介性の作用を混乱させる因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、その結合パートナー、例えばＡｃｔＲＩＩリガンドなど（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、その結合パートナー、例えばＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＡ）などへの結合に実質的に影響を及ぼさない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと相互作用するその能力によって同定され得る。
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本開示の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本開示によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、試験因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合パートナー（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢなど）との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）に結合し得る単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させられる。その後、化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含む組成物に加えられる。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照のこと）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
さらに、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する［例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２巻：２２３～２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻：１２０４６～１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４巻：９２０～９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８巻：１６９３～１６９６頁を参照のこと］。特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する［例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７巻：９１９～２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７巻：３７４～８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと］。
特定の実施形態では、本主題の化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る［例えば、Ｊａｋｏｂｙ ＷＢら（１９７４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６巻：１頁を参照のこと］。特定の場合には、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
４．例示的な治療的使用
ある特定の態様では、少なくともＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢを阻害する本開示のアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せを使用して、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防することを必要とする対象において、赤血球レベルを高め、貧血を処置もしくは予防し、かつ／または無効赤血球生成を処置もしくは予防することができる。任意選択で、本明細書の方法に従い使用されるアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、アクチビンＡを阻害しない。任意選択で、本明細書の方法に従い使用されるアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ８をさらに阻害する。ある特定の態様では、本明細書の方法に従い使用されるアンタゴニスト作用因子または作用因子群の組合せは、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢを阻害することに加えて、ＧＤＦ８、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。
用語「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書を通して互換的であり、一般に、哺乳動物を指す。哺乳動物は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長動物（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長動物）、ウサギ、および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）を含むがこれらに限定されない。ある特定の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子を、赤血球レベルを高めるための従来の治療アプローチ、特に、多因子起源の貧血を処置するのに使用される治療アプローチと組み合わせて使用することができる。赤血球レベルを高めるための従来の治療アプローチは、例えば、赤血球輸血、１つまたは複数のＥＰＯ受容体活性化因子の投与、造血幹細胞移植、免疫抑制性生物学的製剤および免疫抑制性薬物（例えば、コルチコステロイド）を含む。ある特定の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子を使用して、貧血を処置もしくは予防することを必要とする対象において、貧血を処置もしくは予防することができる。ある特定の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子を使用して、無効赤血球生成および／または無効赤血球生成に関連する障害を処置または予防することを必要とする対象において、無効赤血球生成および／または無効赤血球生成に関連する障害を処置または予防することができる。ある特定の態様では、本開示のアンタゴニスト作用因子を、貧血または無効赤血球生成障害を処置または予防するための従来の治療アプローチ、特に、多因子起源の貧血を処置するのに使用される治療アプローチと組み合わせて使用することができる。
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。
用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。
いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
一般に、本開示で記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、「有効量」で投与することにより達成する。作用因子の有効量とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療結果または予防結果を達成するのに効果的な量を指す。本開示の作用因子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用因子の能力などの要因に従い変化し得る。「予防有効量」とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防結果を達成するのに効果的な量を指す。
特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト） を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、健康な個体において、そして、選択された患者集団において赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球のレベルを増加させるために使用することができる。適切な患者集団の例としては、貧血を有する患者のような望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する患者、および、大きな外科手術またはかなりの血液喪失を生じ得る他の処置を受ける予定の患者のような、望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを生じる危険性のある患者、が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを増加させるために１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）で処置され、その後、血液が採血され、そして、後に輸血に使用するために保存される。
本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、貧血を有する患者における、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおけるヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体間のばらつきを考慮に入れるが、適切な年齢および性別のカテゴリーについての正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０～１２．５ｇ／ｄｌ、典型的に、約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常成人では、正常な範囲内にあると考えられるが、治療に関して、標的レベルをより低くすることにより、心血管副作用の発生をより少なくすることができる［例えば、Ｊａｃｏｂｓら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻、１５～１９頁を参照されたい］。代替的に、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の容量百分率）を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約４１～５１％の範囲にあり、成人女性では、３５～４５％の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの標的レベルに戻すことが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび／または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
貧血は、組織傷害、感染、および／または慢性疾患、特に、がんを有する患者において高頻度で観察される。対象によっては、貧血は、低エリスロポエチンレベルおよび／または骨髄中のエリスロポエチンに対する不適切な応答により識別される［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６２８～６３４頁を参照されたい］。貧血の潜在的な原因としては、例えば、血液喪失、栄養不良（例えば、たんぱく質の食餌性摂取の低減）、薬物療法反応、骨髄に関連する種々の問題および多くの疾患が挙げられる。より具体的には、貧血は、例えば、骨髄移植、固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がんおよび結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群および多発性骨髄腫）；放射線治療；化学療法（例えば、白金を含むレジメン）；炎症および自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性もしくは慢性の皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）；急性もしくは慢性の腎疾患もしくは腎不全（特発性もしくは先天性の状態を含む）；急性もしくは慢性の肝臓病；急性もしくは慢性の出血；患者の同種もしくは自己抗体および／または宗教上の理由（例えば、いくつかのエホバの証人（Ｊｅｈｏｖａｈ’ｓ Ｗｉｔｎｅｓｓ））に起因する赤血球の輸血が可能ではない状況；感染（例えば、マラリアおよび骨髄炎）；異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病（貧血）、サラセミアを含む）；薬物の使用または乱用（例えば、アルコールの誤用）；輸血を回避するためのあらゆる要因から貧血を有する小児患者；ならびに、循環過負荷に関する問題に起因して輸血を受けることができない、老齢の患者または貧血と共に基礎心肺疾患を有する患者を含む種々の障害および状態に関連している［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６２８～６３４頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を使用して、本明細書で開示される障害または状態のうちの１つまたは複数に関連する貧血を処置もしくは予防することができる。
多くの因子が、がん関連の貧血に寄与し得る。いくつかは、疾患過程自体、および炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１、インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子の生成に関連する［Ｂｒｏｎら（２００１年）、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２８巻（補遺８号）：１～６頁］。その影響の中で、炎症は重要な鉄調節ペプチドヘプシジンを誘導し、それによってマクロファージからの鉄のエクスポートを阻害し、一般に赤血球生成のための鉄の利用可能性を制限する［例えば、Ｇａｎｚ（２００７年）、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １８巻：３９４～４００頁を参照のこと］。様々な経路を通しての血液喪失も、がん関連の貧血に寄与することができる。がん進行による貧血の有病率は、前立腺がんでの５％から多発性骨髄腫での９０％まで、がん型によって変動する。がん関連の貧血は、倦怠および生活の質の低下、処置効力の低下および死亡率の増加を含む、重大な結果を患者にもたらす。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用してがん関連の貧血を処置することができる。
低増殖性貧血は、原発性骨髄機能障害または原発性骨髄不全から生じ得る。低増殖性貧血として、慢性疾患による貧血、腎疾患による貧血、低代謝状態に関連する貧血、およびがんに関連する貧血が挙げられる。これらの種類の各々では、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して不適切に低い。他の低増殖性貧血として、初期鉄欠損性貧血、および骨髄への損傷により引き起こされる貧血が挙げられる。これらの種類では、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して適切に増加している。顕著な例は、がんおよび／もしくは化学療法薬またはがんの放射線療法により引き起こされる骨髄抑制である。広範にわたる臨床試験の再検討により、軽度の貧血が、化学療法後の患者の１００％で生じ得るのに対し、より重度の貧血は、このような患者の最大８０％で生じ得ることが見出された［例えば、Ｇｒｏｏｐｍａｎら（１９９９年）、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９１巻：１６１６～１６３４頁を参照されたい］。骨髄抑制薬には、例えば以下のものが含まれる：１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）などのアルキル化剤；２）葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート）、プリン類似体（例えば、チオグアニン）およびピリミジン類似体（例えば、ゲムシタビン）などの代謝拮抗物質；３）アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）などの細胞傷害抗生物質；４）キナーゼインヒビター（例えば、ゲフィチニブ）；５）タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）などの***抑制剤；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；ならびに７）トポイソメラーゼインヒビター（例えば、トポテカンおよびエトポシド）。さらに、低代謝速度をもたらす多くの状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血をもたらし得る。内分泌欠乏状態は、そのような状態の１つである。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢されたかもしくはエストロゲンで処置された男性で起こることがある。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して高増殖性貧血を処置することができる。
慢性腎疾患は、場合によって、低増殖性貧血と関連し、貧血の重症度は、腎機能障害のレベルに応じて変化する。そのような貧血は、主に、エリスロポイエチンの不十分な生成および赤血球の生存の低下による。慢性腎臓疾患は、透析または腎移植が患者生存のために必要とされる末期（５期）疾患まで、数年または数十年にわたって徐々に通常進行する。貧血はしばしばこの過程の初期に発生し、疾患の進行に伴い悪化する。腎臓疾患の貧血の臨床上の結果は十分に記載されており、その例には、左心室肥大の発達、認知機能障害、生活の質の低下、および免疫機能の変化が含まれる［例えば、Ｌｅｖｉｎら（１９９９年）、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ２７巻：３４７～３５４頁；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ（１９９２年）、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ２０巻（補遺１号）：２１～２４頁；Ｒｅｖｉｃｋｉら（１９９５年）、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ２５巻：５４８～５５４頁；Ｇａｆｔｅｒら（１９９４年）、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４５巻：２２４～２３１頁を参照のこと］。一部の実施形態において、１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して急性腎臓疾患もしくは慢性腎臓疾患または急性腎不全もしくは慢性腎不全に関連する貧血を処置することができる。
外傷または分娩後出血からなど、十分な量の急性失血によって生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。急性失血は、他の血液成分と共に比例的なＲＢＣ枯渇があるので、貧血を伴わない血液量減少を最初に引き起こす。しかし、血液量減少は、血管外から血管区画へ流体を移動させる生理学的機構を急速に引き起こし、血液希釈および貧血をもたらす。慢性であれば、失血により体内に貯蔵されている鉄が徐々に枯渇し、最終的に鉄欠乏症につながる。一部の実施形態において、１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して急性失血によって生じる貧血を処置することができる。
鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄均衡および鉄欠乏赤血球生成を含む、鉄欠乏増加の段階的進行の最終段階である。妊娠、不十分な食事、腸の吸収不良、急性または慢性の炎症および急性または慢性の血液喪失などの状態で例示されるように、鉄欠乏は、鉄要求の増加、鉄摂取の減少または鉄損失の増加から起こることがある。この型の軽度から中等度の貧血では、骨髄は低増殖性のままであり、ＲＢＣ形態はほとんど正常である。しかし、軽度の貧血でさえ、多少の小球性淡色性ＲＢＣを生じることがあり、重度の鉄欠乏貧血への移行には、骨髄の過剰増殖およびますます増加する小球性および淡色性のＲＢＣが付随する［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１７版；ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６２８～６３４頁を参照のこと］。鉄欠乏性貧血のための適当な療法は、その原因および重症度によって決まり、経口用鉄製剤、非経口鉄製剤およびＲＢＣ輸血が主要な従来の選択肢である。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト），を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して慢性鉄欠乏を処置することができる。
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）とは、骨髄性血球生成の無効および急性骨髄性白血病への転換の危険性を特徴とする血液学的状態の多様な集合である。ＭＤＳ患者では、血液幹細胞が、健常な赤血球、白血球、または血小板に成熟しない。ＭＤＳ障害として、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を有する不応性貧血、変形した過剰な芽球を有する不応性貧血、多系列異形成を有する不応性血球減少症、および孤発性５ｑ染色体異常と関連する骨髄異形成症候群を含む。これらの障害は、造血細胞の量および質の両方における不可逆性の欠失として顕在化するので、ＭＤＳ患者の大半は慢性貧血に罹患している。したがって、ＭＤＳ患者は、赤血球レベルを高めるための、輸血および／または増殖因子（例えば、エリスロポエチンまたはＧ－ＣＳＦ）による処置を最終的に必要とする。しかし、多くのＭＤＳ患者は、このような治療の頻度に起因する副作用を発症する。例えば、高頻度の赤血球輸血を施される患者は、余剰鉄の蓄積に由来する組織損傷および臓器損傷を呈示し得る。したがって、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、およびＢＭＰ６の１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を使用して、ＭＤＳを有する患者を処置することができる。ある特定の実施形態では、ＭＤＳを患う患者は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して処置することができる。他の実施形態では、ＭＤＳを患う患者は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）と、ＭＤＳを処置するための１つまたは複数の追加の治療剤であって、例えば、サリドマイド、レナリドミド、アザシチジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）、デシタビン、エリスロポエチン、デフェロキサミン、抗胸腺細胞グロブリン、およびフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｒｉｍ）（Ｇ－ＣＳＦ）を含む治療剤との組合せを使用して処置することができる。
鉄動態研究に基づき、再生不良性貧血、出血、または末梢溶血とは元来識別される［例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓら（１９７８年）、Ｃｌｉｎ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ、３巻：１５９～１６４頁を参照されたい］無効赤血球生成は、成熟ＲＢＣの生成が、骨髄中に存在する赤芽球系前駆体（赤芽球）の数が与えられたときに予測されるより少ない、多様な貧血群を説明している［Ｔａｎｎｏら（２０１０年）、Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：３５８２８３頁］。このような貧血では、エリスロポエチンレベルの上昇にもかかわらず、成熟ＲＢＣ生成の無効に起因して、組織低酸素症が遷延する。最終的には、エリスロポエチンレベルの上昇が赤芽球の大規模な増殖を駆動する悪循環が発生し、これは、髄外赤血球生成に起因する脾腫（脾臓の腫大）［例えば、Ａｉｚａｗａら（２００３年）、Ａｍ
Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ、７４巻：６８～７２頁を参照されたい］、赤芽球誘導性骨病態［例えば、Ｄｉ Ｍａｔｔｅｏら（２００８年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ、２２巻：２１１～２１６頁を参照されたい］を潜在的にもたらし、治療的ＲＢＣ輸血の非存在下においてもなお、組織鉄過負荷［例えば、Ｐｉｐｐａｒｄら（１９７９年）、Ｌａｎｃｅｔ、２巻：８１９～８２１頁を参照されたい］を潜在的にもたらす。したがって、赤血球生成の有効性を促進することにより、本開示のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢのアンタゴニストは、前述の悪循環を打破し、したがって、根底にある貧血だけでなく、エリスロポエチンレベルの上昇、脾腫、骨病態、および組織鉄過負荷といった関連する合併症も緩和することができる。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、および／またはＢＭＰ１０のアンタゴニスト）を使用して、貧血およびＥＰＯレベルの上昇のほか、脾腫、赤芽球誘導性骨病態、鉄過負荷、およびそれらの付随する病態などの合併症を含む、無効赤血球生成を処置または予防することができる。脾腫に関して、このような病態は、胸痛または腹痛および網内系過形成を含む。髄外造血は、脾臓内だけでなく、潜在的には他の組織内でも、髄外造血性偽腫瘍の形態で生じる場合がある［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ、２巻：ａ０１３４８２頁を参照されたい］。赤芽球誘導性骨病態に関して、付随する病態は、低骨塩密度、骨粗鬆症、および骨疼痛を含む［例えば、Ｈａｉｄａｒら（２０１１年）、Ｂｏｎｅ、４８巻：４２５～４３２頁を参照されたい］。鉄過負荷に関して、付随する病態は、ヘプシジン抑制および食餌中の鉄の過剰吸収［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ、２６巻（補遺１号）：Ｓ１６～Ｓ１９頁を参照されたい］、複数の内分泌障害および肝線維症／肝硬変［例えば、Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ、５巻：１１頁を参照されたい］、ならびに鉄過剰性心筋症［Ｌｅｋａｗａｎｖｉｊｉｔら、２００９年、Ｃａｎ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ、２５巻：２１３～２１８頁］を含む。
無効赤血球生成の最も一般的な原因は、完全アルファヘモグロビン鎖の生成と完全ベータヘモグロビン鎖の生成との不均衡が赤芽球の成熟時におけるアポトーシスの増大をもたらす遺伝性異常ヘモグロビン症である、サラセミア症候群である［例えば、Ｓｃｈｒｉｅｒ （２００２年）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ、９巻：１２３～１２６頁を参照されたい］。サラセミアは総体として、世界中で最も高頻度の遺伝子障害であり、疫学的パターンを変化させながら、米国および全世界のいずれにおいても増大しつつある公衆衛生問題に寄与することが予測されている［Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ（２００５年）、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１０５４巻：１８～２４頁］。サラセミア症候群は、それらの重症度に応じて命名される。したがって、αサラセミアは、軽症型αサラセミア（αサラセミア形質としてもまた公知であり、２つのα－グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＨ症（３つのα－グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型αサラセミア（胎児水腫としてもまた公知であり、４つのα－グロビン遺伝子が影響を受ける）を含む。βサラセミアは、軽症型βサラセミア（βサラセミア形質としてもまた公知であり、１つのβ－グロビン遺伝子が影響を受ける）、中間型βサラセミア（２つのβ－グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＥサラセミア（２つのβ－グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型βサラセミア（クーリー貧血としてもまた公知であり、２つのβ－グロビン遺伝子が影響を受ける結果として、β－グロビンタンパク質の完全な非存在がもたらされる）を含む。βサラセミアは、複数の機関に影響を及ぼし、無視できない罹患率および死亡率と関連し、現在のところ一生にわたるケアを必要とする。近年では、鉄のキレート化と組み合わせた定期的な輸血の使用に起因して、βサラセミアを有する患者の平均余命が延長されているが、輸血および消化管による鉄の吸収過剰の両方から生じる鉄過負荷は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗鬆症、および骨減少症など、重篤な合併症を引き起こし得る［例えば、Ｒｕｎｄら（２００５年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５３巻：１１３５～１１４６頁を参照されたい］。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、サラセミア症候群を処置または予防することができる。
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、サラセミア症候群に加えて、無効赤血球生成による障害を処置するために使用することができる。このような障害は、鉄芽球性貧血（ｓｉｄｅｒｂｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）（遺伝性または後天性）；赤血球生成異常性貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取の減少に起因する）、ある特定の薬物、または説明されていない原因（先天性赤血球生成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）などの状態により潜在的に引き起こされる巨赤芽球性貧血；例えば、骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄ろうを含む骨髄ろう性貧血；先天性赤芽球性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、無効赤血球生成のための支持療法と組み合わせて使用することができる。このような療法は、貧血を処置するための、赤血球または全血液による輸血を含む。慢性貧血または遺伝性貧血では、鉄ホメオスタシスのための正常な機構が輸血の反復で圧倒され、最終的には、心臓、肝臓、および内分泌腺などの主要組織において、毒性であり、潜在的に致死性である鉄の蓄積がもたらされる。したがって、無効赤血球生成に慢性的に罹患する患者のための支持療法はまた、尿および／または糞便への鉄の排出を促進し、これにより、組織鉄過負荷を予防するかまたは転導する、１つまたは複数の鉄キレート化分子による処置も含む［例えば、Ｈｅｒｓｈｋｏ（２００６年）、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９１巻：１３０７～１３１２頁；Ｃａｏら（２０１１年）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｐ、３巻（２号）：ｅ１７頁を参照されたい］。有効な鉄キレート化剤は、触媒による、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の生成を介して、大半の鉄毒性の主因となる可能性が高い、非トランスフェリン結合鉄の酸化形態である第二鉄に選択的に結合し、これを中和することが可能であるべきである［例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻：２６７０～２６７７頁を参照されたい］。これらの作用因子は構造的に多様であるが、全てが、八面体の中和配位錯体を形成することが可能な酸素供与体原子または窒素供与体原子を保有し、個々の鉄原子は１：１（六座キレート化剤）、２：１（三座）、または３：１（二座）の当量比である［Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉら（２００５年）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ、５７巻：５４７～５８３頁］。一般に、効果的な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量（例えば、７００ダルトン未満）であり、水中および脂質中のいずれにおいても、罹患組織への接触を可能とする可溶性を有する。鉄キレート化分子の具体例は、毎日の非経口投与を必要とする、細菌起源の六座キレート化剤であるデフェロキサミン、ならびに経***性合成剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）を含む。２つの鉄キレート化剤の同日投与からなる組合せ療法は、キレート化単剤療法に対して不応性の患者において有望であり、また、デフェロキサミン（ｄｅｒｅｒｏｘａｍｉｎｅ）単剤に対する患者の服薬遵守不良の問題の克服においても有望である［Ｃａｏら（２０１１年）、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｐ、３巻（２号）：ｅ１７頁；Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１２０２巻：７９～８６頁］。
本明細書で使用する場合、「～と組み合わせて」または「併用投与」とは、第２の治療が、体内でなおも効果的である（例えば、２つの化合物は、患者において同時に効果的であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合もある。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤において投与することもでき、別個の製剤において、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組合せ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）は、１つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて利用する特定の組合せは、本開示のアンタゴニストの、治療および／または達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、無効赤血球生成のために、ヘプシジンまたはヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用することができる。主に肝臓で生成される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞、およびマクロファージに局在化する鉄排出タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導するその能力のために、鉄代謝の主要な調節因子であると考えられている。大まかに述べると、ヘプシジンは、細胞外における鉄の利用可能性を低減するので、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置において有益であり得る［例えば、Ｎｅｍｅｔｈ（２０１０年）、Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：７５０６４３頁を参照されたい］。この視点は、βサラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現増大の有益な効果により裏付けられている［Ｇａｒｄｅｎｇｈｉら（２０１０年）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２０巻：４４６６～４４７７頁］。
本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）， はまた、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、小型（小球性）、特大（大赤血球性）、奇形または異常な色（淡色性）のＲＢＣを部分的に特徴とする、無秩序なＲＢＣ成熟の貧血の処置にも適当である。
ある特定の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする個体において、個体に、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）、ならびにＥＰＯ受容体活性化因子の治療有効量を投与することにより、貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、ＥＰＯの有害作用に感受性である患者において、これらの活性化因子の必要とされる用量を低減することができる。これらの方法は、患者の治療処理および予防処置のために使用することができる。
本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、特により低用量範囲のＥＰＯ受容体活性化因子で、赤血球の増加を達成することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化因子と関連する、公知のオフターゲット効果および危険性を低減するのに有益であり得る。ＥＰＯの主要な有害作用は、例えば、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および多血症を含む。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧症（より特定すれば、高血圧症の悪化）および血管内血栓症をもたらし得る。報告されている他のＥＰＯの有害作用であって、それらの一部が高血圧症と関連する有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、および血栓症に起因する脳痙攣、高血圧性脳症、および赤血球無形成である。例えば、Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ（１９９４年）、Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、７２巻（補遺６号）：Ｓ３６～Ｓ４３頁；Ｈｏｒｌら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻（補遺４号）：５１～５６頁；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７年）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４９巻、６８６～６８９頁；およびＢｕｎｎ（２００２年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４６巻（７号）、５２２～５２３頁を参照されたい。
本開示のアンタゴニストが、ＥＰＯとは異なる機構で作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに十分に応答しない患者における赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、本開示のアンタゴニストは、通常用量～増量用量のＥＰＯ（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）の投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者に有益であり得る。不適切なＥＰＯ応答を有する患者は、全てのタイプの貧血において見られるが、より多い数の不応者が、がんを有する患者および末期の腎疾患を有する患者において特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不適切な応答は、構成的（ＥＰＯでの最初の処置の際に観察される）、または後天的（ＥＰＯでの反復処置の際に観察される）のいずれかであり得る。
特定の実施形態では、本開示は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置されているか、または処置される候補の患者を、その患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを測定することによって管理するための方法を提供する。血液学的パラメータは、本開示のアンタゴニストを用いた処置の候補である患者に対する適切な投薬を評価するため、処置中に血液学的パラメータをモニタリングするため、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中に投薬量を調節するかどうかを評価するため、および／または本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用され得る。１つまたは複数の血液学的パラメータが正常レベルの外側である場合、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いた投薬は減少、延期または終了され得る。
本明細書中で提供される方法に従って測定され得る血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、貯蔵鉄、および、当該分野で認識されている方法を使用する、赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。そのようなパラメータは、患者からの血液試料を使用して決定され得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の上昇が引き起こされ得る。
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入によってのいずれかで正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の開始が延期され得る。例えば、候補の患者が高血圧または前高血圧である場合、そのときは、患者は、患者の血圧を低下させるために血圧降下剤を用いて処置され得る。個々の患者の状態に適した任意の血圧降下剤が使用され得、例えば、利尿薬、アドレナリンインヒビター（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬が挙げられる。血圧は、食事および運動レジメンを使用して代替的に処置され得る。同様に、候補の患者が正常よりも低いか、または正常の低値側の貯蔵鉄を有する場合、そのときは、患者は、患者の貯蔵鉄が正常または許容されるレベルに戻るまで、適切な食事および／または鉄サプリメントのレジメンを用いて処置され得る。正常よりも高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者に対して、そのときは、そのレベルが正常または許容されるレベルに戻るまで本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与が延期され得る。
特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、投与の開始が延期されないことがある。しかし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬量または投薬の頻度は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストが投与されると上昇する血液学的パラメータの許容されない増加リスクを低下させる量に設定され得る。あるいは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）と、望ましくないレベルの血液学的パラメータに対処する治療剤を組み合わせた治療レジメンが患者のために開発され得る。例えば、患者の血圧が上昇している場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）および血圧降下剤の投与を含む治療レジメンが設計され得る。所望より低い貯蔵鉄を有する患者に対して、１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）および鉄の補給の治療レジメンが開発され得る。
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータについてのベースラインパラメータは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置される候補である患者に対して確立され得、適切な投薬レジメンが、ベースライン値に基づいて患者に対して確立される。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメータが、患者に対して適切なアンタゴニスト投薬レジメンを通知するために使用され得る。例えば、健康な患者が、規定の正常範囲を超える確立された血圧のベースライン数値を有する場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置の前に、その患者の血圧を一般集団について正常だとみなされる範囲に至らせる必要がないことがあり得る。患者の、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いた処置前の１つまたは複数の血液学的パラメータのベースライン値は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中の、血液学的パラメータの任意の変化をモニタリングするための関連性のある比較値としても使用され得る。
特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置されている患者において測定される。血液学的パラメータは、処置中の患者をモニタリングし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬または別の治療剤を用いた追加の投薬の調節または終了を可能にするために使用され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）の投与によって血圧、赤血球レベル、またはヘモグロビンレベルが上昇したか、または貯蔵鉄が減少した場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの用量は、１つまたは複数の血液学的パラメータに対する本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの作用を減少させるために、その量または頻度が減少され得る。本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）の投与によって、患者にとって不都合な１つまたは複数の血液学的パラメータの変化が生じた場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬は、一時的に、血液学的パラメータが許容されるレベルに戻るまでか、または永久に、のいずれかで終了され得る。同様に、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の用量または頻度を減らした後、１つまたは複数の血液学的パラメータが許容される範囲内に至らない場合、そのときは、投薬は終了され得る。本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を減らすかまたは終了する代わりに、またはそれに加えて、患者は、血液学的パラメータの望ましくないレベルに対処する追加の治療剤、例えば、血圧降下剤または鉄のサプリメントなどが投薬され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を用いて処置されている患者の血圧が上昇している場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は同じレベルで継続され得、および処置レジメンに血圧降下剤が追加されるか、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は減らされ得（例えば、量および／または頻度について）、および処置レジメンに血液降下剤が追加されるか、または、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は終了され得、および患者は血圧降下剤を用いて処置され得る。
５．薬学的組成物
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）は、単独で投与することもでき、医薬製剤（治療用組成物または薬学的組成物）の成分として投与することもできる。医薬形成とは、その中に含有される活性成分の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題の化合物は、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本開示のアンタゴニスト以外の治療的に有用な作用因子であって、任意選択で、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の化合物と組み合わせて投与することができる。
典型的に、化合物は、非経口投与される［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、およびＢＭＰ６の１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから製剤を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの１つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組合せ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）を含み得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム－アルミン酸－リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの１つまたは複数を変更するように加工され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の製剤（組成物）は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する）、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水の液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）、かつ／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することもでき、各々が、所定量の、本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とを含有する。本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与することができる。
経口投与のための固体投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤）において、本開示の１または複数の化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー－アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびこれらの混合物を含む）と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
本製剤（組成物）の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒が挙げられる）、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー－アガー、トラガント、およびこれらの組合せを含む懸濁剤を含有し得る。
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
投薬レジメンは、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられるがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中にアンタゴニスト配列を導入することによってその治療作用を達成する。アンタゴニスト配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る［例えば、Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、６巻：７７頁を参照のこと］。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である［例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８を参照のこと］。
リポソームの組成は通常、リン脂質の組合せであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
（実施例）
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃのリガンド結合特異性の特徴付け
本明細書の配列番号１のアミノ酸２０～１３４を含む、改変体ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質であって、配列番号１に照らして、７９位に酸性アミノ酸を有する改変体［本明細書では、「ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃ」融合タンパク質、構築物、改変体などと呼ばれる；本開示の配列番号２３を参照されたい］は、インビトロおよびインビボにおける固有の生物学的特性を特徴とすることが既に報告されている（例えば、米国特許第８，０５８，２２９号を参照されたい）。対応する試料の非改変融合タンパク質（ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃ融合タンパク質）と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃ改変体は、一部において、アクチビンＡに対する結合アフィニティーの実質的な喪失を特徴とし、したがって、アクチビンＡ活性に拮抗する能力の著明な低減を特徴とするが、ＧＤＦ１１に対する結合および阻害の野生型に近いレベルを保持する。インビボにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃ改変体は、赤血球レベルを高める能力が、非改変ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、著明により強力であることが見出された。したがって、これらのデータは、観察された生物活性が、アクチビンＡの阻害に依存しないことを指し示す。
同様の結果は、既に、二重短縮型改変体ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃ（例えば、本開示の配列番号４９のほか、米国特許第８，０５８，２２９号も参照されたい）について報告されており、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－Ｆｃについてのリガンド結合プロファイルを、表面プラズモン共鳴により、種々のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９）に関して、さらに特徴付けた。結果を、図１３に描示する。
このデータおよび他のデータを検討して、本出願者らは、赤血球レベルの上昇を促進するように阻害されるＡｃｔＲＩＩリガンドは、ＧＤＦ１１およびアクチビンＢであることを決定した。このデータはさらに、対象において赤血球レベルを高めるための方法の文脈では、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ８に拮抗（を阻害）することも可能であることを示唆する。
（実施例２）
ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－８、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥに媒介されるシグナル伝達についてのバイオアッセイ
Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、抗ＧＤＦ１１／アクチビンＢ二特異性抗体の、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＡおよび／またはＧＤＦ８によるシグナル伝達に対する効果を評価する。当該分野では、このアッセイは既に記載されている（例えば、米国特許出願第２０１３／０２４３７４３号を参照されたい）。略述すると、Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイでは、Ｄｅｎｎｌｅｒら（１９９８年）、ＥＭＢＯ、１７巻：３０９１～３１００頁において記載されているように、筋肉に由来するヒト横紋筋肉腫細胞株と、レポーターベクターであるｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２とを使用する。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ－β応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ－１遺伝子）内に存在するため、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を介してシグナル伝達する因子（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＡ、およびＧＤＦ８）に一般に使用される。
１日目に、Ａ－２０４細胞を、１つまたは複数の４８ウェルプレートに移す。２日目に、Ａ－２０４細胞に、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。３日目に、培地＋０．１％のＢＳＡへと希釈されたリガンド因子（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、アクチビンＡ）を、抗ＧＤＦ１１／アクチビンＢ二特異性抗体と共に、細胞に添加する。典型的には、抗ＧＤＦ１１／アクチビンＢ二特異性抗体は、細胞に添加する前に、因子と共に１時間にわたりプレインキュベートすることを必要とする。およそ６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、溶解させる。
次いで、細胞溶解物を、ルシフェラーゼアッセイにかけて、Ｓｍａｄ２／３活性化の程度を決定する。抗ＧＤＦ１１／アクチビンＢ二特異性抗体の阻害の程度を、適切な対照と比べて決定する。
（実施例３）
抗ＧＤＦ１１／抗アクチビンＢ二特異性抗体による処置
１９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、２つの群のうちの１つにランダムに割り当てる。マウスに、ビヒクル（１０ｍＭのトリス緩衝生理食塩液；ＴＢＳ）または抗ＧＤＦ１１／抗アクチビンＢ二特異性抗体を、皮下注射により、毎週２回ずつ３週間にわたり投薬する。血液を、ベースラインおよび投薬の３週間後に回収する。血液解析器（例えば、ＨＭ２、Ａｂａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、血液試料を、細胞分布について解析する。特に、マウスは、例えば、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を含む、赤血球パラメータの変化についてモニタリングする。
（実施例４）
抗ＧＤＦ１１抗体と、抗アクチビンＢ抗体との併用投与
１９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、４つの群のうちの１つにランダムに割り当てる。マウスに、ビヒクル（１０ｍＭのＴＢＳ）、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、または抗ＧＤＦ１１および抗アクチビンＢ抗体の両方を投薬する。血液を、ベースラインおよび投薬の３週間後に回収する。血液解析器（例えば、ＨＭ２、Ａｂａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、血液試料を、細胞分布について解析する。特に、マウスは、例えば、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を含む、赤血球パラメータの変化についてモニタリングする。
（実施例５）
抗アクチビンＢ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、および抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体の、赤血球生成に対する効果
３つの抗体、抗アクチビンＢ、抗ＧＤＦ８抗体、および二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体を、マウスにおける赤血球生成を刺激する（例えば、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、およびヘマトクリットレベルを高める）それらの能力について評価した。Ｃ５７ＢＬ６マウス（８～１０週齢）を、５つの処置群：ｉ）ビヒクルによる処置（ＴＢＳ、毎週２回；皮下）、ｉｉ）抗アクチビンＢ抗体による処置（１０ｍｇ／ｋｇ；毎週２回；皮下）、ｉｉｉ）抗ＧＤＦ８抗体による処置（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回；皮下）、ｉｖ）二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体による処置（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回；皮下）、およびｖ）抗アクチビンＢ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回；皮下）と、二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回；皮下）との組合せによる処置のうちの１つに分けた。２週間の処置後に、マウスを安楽死させ、全血算パラメータを測定した。
ビヒクル処置（対照）対象と比較して、抗アクチビンＢ抗体単独および抗ＧＤＦ８抗体単独で処置されたマウスでは、赤血球レベルのわずかな増大が見られた。図１６を参照されたい。赤血球レベルに対するより実質的な効果は、二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体で処置したマウスにおいて観察された。図１６を参照されたい。しかし、赤血球生成に対する最大の効果は、抗アクチビンＢ抗体と、二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体との組合せで処置されたマウスにおいて観察され、例えば、この組合せ治療は、赤血球レベルを、対照の対象と比較して著明に高めた（８．８％）。図１６を参照されたい。加えて、抗アクチビンＢ抗体と、二特異性抗ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１抗体とによる組合せ処置は、対照の対象と比較してヘモグロビン（９．６％）およびヘマトクリット（９．１％）のレベルの上昇を結果としてもたらすことが観察された。
したがって、検討したリガンドには、追加のＡｃｔＲＩＩリガンドアンタゴニスト（阻害剤）を動物に投与するのに応じて、血球レベル、ヘマトクリットレベル、およびヘモグロビンレベルが上昇する、明確な傾向が見られる。興味深いことに、単一のＡｃｔＲＩＩリガンドの阻害は、赤血球レベルに対する著明な効果を及ぼさなかった。しかし、少なくとも２つのＡｃｔＲＩＩリガンドの阻害は、赤血球生成を刺激し得ると考えられ、３つのＡｃｔＲＩＩリガンドを阻害すると、赤血球レベルのほか、ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルに対しても、さらに大きな効果が観察される。まとめると、これらのデータは、複数のＡｃｔＲＩＩリガンドが、赤血球生成に寄与することを実証し、さらに、これらのリガンドのうちの１つだけを阻害しても、ヘマトクリットレベル、ヘモグロビンレベル、および／または赤血球レベルの著明な上昇を達成するのに十分ではない可能性があることを指し示す。したがって、これらの実験から、対象において赤血球生成を促進するための効果的な戦略は、複数の（すなわち、少なくとも２つの）ＡｃｔＲＩＩリガンドを標的とすることであると考えられる。
（参考としての援用）
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。

Claims (13)

  1. 対象において赤血球数を増大させる、ヘモグロビンレベルを増大させる、ヘマトクリットを増大させるまたは貧血を処置もしくは予防するための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子群を含み、前記作用因子群は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合する、１つの二特異性抗体またはその抗原結合フラグメントと、アクチビンＢに結合する、１つの抗体またはその抗原結合フラグメントとを含み、前記作用因子群の組み合わせ物はアクチビンＡに結合しない、組み合わせ物。
  2. 前記作用因子群の組み合わせ物が、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のシグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の組み合わせ物。
  3. 前記作用因子群の組み合わせ物が、アクチビンＡを実質的に阻害しない、請求項１または２に記載の組み合わせ物。
  4. 前記作用因子群の組み合わせ物が、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＡのシグナル伝達を実質的に阻害しない、請求項１から３のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  5. 前記作用因子群のうちの１つまたは複数が、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１５、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  6. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  7. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  8. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  9. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、単鎖抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  10. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、ＦｄおよびＦｖからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  11. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、異種部分を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  12. 対象において赤血球数を増大させる、ヘモグロビンレベルを増大させる、ヘマトクリットを増大させるまたは貧血を処置もしくは予防するための組成物であって、前記組成物は、アクチビンＢを阻害する作用因子を含み、前記組成物は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子と組み合わせて投与されることを特徴とし、ここで、前記アクチビンＢを阻害する作用因子は、アクチビンＢに結合する、１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合する、１つの二特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記アクチビンＢを阻害する作用因子および前記ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子はアクチビンＡに結合しない、組成物。
  13. 対象において赤血球数を増大させる、ヘモグロビンレベルを増大させる、ヘマトクリットを増大させるまたは貧血を処置もしくは予防するための組成物であって、前記組成物は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子を含み、アクチビンＢを阻害する作用因子と組み合わせて投与されることを特徴とし、ここで、前記アクチビンＢを阻害する作用因子は、アクチビンＢに結合する、１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合する、１つの二特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記アクチビンＢを阻害する作用因子および前記ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を阻害する作用因子はアクチビンＡに結合しない、組成物。
JP2020077142A 2014-03-21 2020-04-24 アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法 Active JP7154250B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461969073P 2014-03-21 2014-03-21
US61/969,073 2014-03-21
US201462021923P 2014-07-08 2014-07-08
US62/021,923 2014-07-08

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016557982A Division JP2017509647A (ja) 2014-03-21 2015-03-20 アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020111621A JP2020111621A (ja) 2020-07-27
JP2020111621A5 JP2020111621A5 (ja) 2021-04-08
JP7154250B2 true JP7154250B2 (ja) 2022-10-17

Family

ID=54145413

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016557982A Withdrawn JP2017509647A (ja) 2014-03-21 2015-03-20 アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法
JP2020077142A Active JP7154250B2 (ja) 2014-03-21 2020-04-24 アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016557982A Withdrawn JP2017509647A (ja) 2014-03-21 2015-03-20 アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20160046690A1 (ja)
EP (1) EP3119418B1 (ja)
JP (2) JP2017509647A (ja)
KR (2) KR102520970B1 (ja)
CN (1) CN106659769A (ja)
AU (3) AU2015231022B2 (ja)
CA (1) CA2942954A1 (ja)
MA (1) MA39722A (ja)
WO (1) WO2015143403A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
WO2016069925A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions using gdf15 polypeptides for increasing red blood cells
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
EP3227675B1 (en) 2014-12-03 2023-03-15 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating myelodysplastic syndrome
MX2017013520A (es) 2015-04-22 2018-05-22 Alivegen Usa Inc Nuevas proteinas hibridas de bloqueo del ligando actriib para tratar enfermedades de atrofia muscular.
AU2016359695A1 (en) 2015-11-23 2018-06-14 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
EA201990226A1 (ru) * 2016-07-27 2019-08-30 Акселерон Фарма Инк. Способы и композиции для лечения миелофиброза
EP3512887A4 (en) * 2016-09-15 2020-04-15 Acceleron Pharma Inc. TWISTED GASTRULATION POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
CA3039525A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Variant actriib proteins and uses thereof
JP7139326B2 (ja) 2016-11-10 2022-09-20 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンＩＩａ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
CN107828719B (zh) * 2017-09-14 2020-05-19 暨南大学 Gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用
EP3706777B1 (en) 2017-11-09 2024-05-22 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
US20210252106A1 (en) * 2018-04-30 2021-08-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods of improving anemias by combining agents
WO2023212296A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 University Of Massachusetts Selective rna-modulating agents

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059347A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
WO2013164444A1 (en) 2012-05-03 2013-11-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and pharmaceutical composition for use in the treatment and diagnotic of anemia of inflammation

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008539241A (ja) * 2005-04-25 2008-11-13 ファイザー インコーポレイティッド ミオスタチンに対する抗体
US8128933B2 (en) * 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
KR102223231B1 (ko) * 2006-12-18 2021-03-08 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉ 길항물질과 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이의 용도
DK3494986T3 (da) * 2008-08-14 2020-08-03 Acceleron Pharma Inc GDF fanger
US8216997B2 (en) * 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
EP3845239A1 (en) * 2009-06-08 2021-07-07 Acceleron Pharma Inc. Use of anti-actriib proteins for increasing thermogenic adipocytes
CN113171442A (zh) * 2009-08-13 2021-07-27 阿塞勒隆制药公司 Gdf捕获物和***受体激活剂联合应用以增加红细胞水平
WO2012027065A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
CN104981250A (zh) * 2012-10-24 2015-10-14 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059347A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
WO2013164444A1 (en) 2012-05-03 2013-11-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and pharmaceutical composition for use in the treatment and diagnotic of anemia of inflammation

Also Published As

Publication number Publication date
MA39722A (fr) 2021-06-02
EP3119418A1 (en) 2017-01-25
JP2017509647A (ja) 2017-04-06
KR20230004942A (ko) 2023-01-06
AU2023219885A1 (en) 2023-09-14
AU2021200301A1 (en) 2021-03-18
WO2015143403A1 (en) 2015-09-24
CA2942954A1 (en) 2015-09-24
EP3119418A4 (en) 2018-01-03
AU2015231022A1 (en) 2016-09-29
KR102520970B1 (ko) 2023-04-12
EP3119418B1 (en) 2022-02-23
JP2020111621A (ja) 2020-07-27
AU2015231022B2 (en) 2021-02-04
US20160046690A1 (en) 2016-02-18
KR20160127148A (ko) 2016-11-02
CN106659769A (zh) 2017-05-10
US20210155672A1 (en) 2021-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7154250B2 (ja) アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法
JP7315487B2 (ja) 赤血球レベルを増加させ、そして鎌状赤血球症を処置するための方法
JP7154243B2 (ja) 潰瘍を処置するための方法および組成物
JP7391139B2 (ja) 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
JP6737786B2 (ja) 骨髄異形成症候群および鉄芽球性貧血を処置するための方法
JP7264580B2 (ja) 骨髄線維症を処置するための方法および組成物
US11123430B2 (en) Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
JP2022116031A (ja) ツイスティッド・ガストルレーション・ポリペプチドおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200424

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210219

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210518

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210708

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211118

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220301

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220601

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220701

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220914

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221004

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7154250

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04