JP2019537427A

JP2019537427A - Ｘ染色体の再活性化のためのｈｄａｃ阻害剤組成物

Info

Publication number: JP2019537427A
Application number: JP2019514721A
Authority: JP
Inventors: ガットマンミッチェル; チェンチュン−カン
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-12-26
Also published as: US11197881B2; EP3532044A1; EP3532044A4; US20200179420A1; WO2018081661A1

Abstract

細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化または再活性化するための再活性化組成物は、無細胞毒性ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。再活性化組成物は、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤を含み、ＤＮＡメチル化阻害剤をさらに含み得る。細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化または再活性化する方法は、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤を含む再活性化組成物を投与することを含む。沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化または再活性化する方法は、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤およびＤＮＡメチル化の阻害剤を含む再活性化組成物を投与することをさらに含み得る。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願され、発明の名称が「HDAC INHIBITORS FOR REACTIVATION OF THE X CHROMOSOME」である、米国仮出願第６２／４１３，９２８号の優先権および利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に援用する。
参照による援用

本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体で参照により本明細書に援用する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年１０月２７日に作成され、144622WOSEQLISTING.txtという名称であり、サイズは２，３８１バイトである。

多くの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が、遺伝子発現に影響を与えるが、それらが作用するメカニズムは、まだほとんど分かっていない。研究されているｌｎｃＲＮＡの１つは、雌哺乳動物において発生中に１つのＸ染色体の転写型サイレンシングに必要とされるＸｉｓｔである。Ｘｉｓｔは、将来不活性となるＸ染色体に広がり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）を排除し、活性遺伝子を転写的にサイレンシングされる核の区画に再配置することにより、ＸＣＩを開始する。これらの役割の全て−局在化、ＲＮＡｐｏｌＩＩ排除、および再配置−が、ＸＣＩの開始中の転写の適切なサイレンシングに必要とされる。

Ｘｉｓｔ媒介転写型サイレンシングの機序を明らかにする大規模な試みにもかかわらず、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングに必要なタンパク質は同定されていない。主な課題は、細胞内でＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡと直接的に相互作用するタンパク質を網羅的に明らかにする方法が欠如していることである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化するための組成物は、細胞に対して細胞毒性ではないヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）メチル化の阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、少なくともＨＤＡＣ３活性を阻害する。本明細書で開示されているように、沈黙化Ｘ染色体遺伝子を再活性化するための再活性化組成物は、細胞に対して細胞毒性を示すことなく、ＨＤＡＣ３活性を阻害する濃度で、ＨＤＡＣ阻害剤を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞に対して細胞毒性を示すことなく、ＨＤＡＣ３活性を阻害するＨＤＡＣ阻害剤には、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（Abexinostate））、ＣＵＤＣ−１０１、レスミノスタット（Resminostat）、モセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、４ＳＣ−２０２、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、ロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、またはそれらの組み合わせが含まれる。

本発明のいくつかの実施形態において、再活性化組成物は、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（５−アザ−２’−ｄｃ）、ＲＧ１０８、ＳＧＩ−１０２７、またはそれらの組み合わせから選択されるＤＮＡメチル化の阻害剤を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子を活性化する方法は、沈黙化Ｘ染色体遺伝子を有する前記細胞に再活性化組成物を投与することを含み、前記再活性化組成物は、前記細胞に対して細胞毒性ではないヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（Abexinostate））、ＣＵＤＣ−１０１、レスミノスタット（Resminostat）、モセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、４ＳＣ−２０２、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、ロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、またはそれらの組み合わせから選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、沈黙化Ｘ染色体遺伝子を活性化する方法は、細胞に対して細胞毒性ではないＨＤＡＣ阻害剤、およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）メチル化の阻害剤を含む再活性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化の阻害剤は、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（５−アザ−２’−ｄｃ）、ＲＧ１０８、ＳＧＩ−１０２７、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロであるか、または対象内にある。いくつかの実施形態において、沈黙化Ｘ染色体遺伝子は、Ｘｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子である。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された１つ以上の図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願の広報のコピーは、請求および必要な料金の支払いをすると、官庁により提供される。

本発明の実施形態による、Ｘ媒介転写型サイレンシングおよびＸ染色体にわたるＰＲＣ２の動員のモデルを示す概略図である。本発明の実施形態による、核ラミナへのＸｉｓｔ媒介動員が、Ｘ染色体上での活性遺伝子への広がりと転写型サイレンシングとをどのようにして可能にするのかについてのモデルを示す概略図である。本発明の実施形態による、コントロール（上部）、非サイレンシングタンパク質（中央部）、またはサイレンシングタンパク質（下部）のノックダウンについてのＸｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングに関するスクリーニング方法を示す概略図である。図３Ａは、本発明の実施形態による、ＬＢＲ、ＳＨＡＲＰ、およびＰＴＢＰ１タンパク質についてＸｉｓｔＲＮＡにわたりプロットしたＣＬＩＰデータを示し、値は、本明細書に記載の方法に従い、サイズが一致した入力ＲＮＡコントロールに対して正規化したＸｉｓｔ上の各位置での濃縮倍率（fold-enrichment）を表し、入力はＬＢＲＣＬＩＰサンプルの総ＲＮＡコントロールを表し；下部：ＸｉｓｔＲＮＡ（ＷＴ）上の注釈付きリピート領域ならびにΔＡ（ヌクレオチド１〜９３７）およびΔＬＢＳ（ヌクレオチド８９８〜１６８２）ＸｉｓｔＲＮＡ中の欠失領域の位置の概略図である。図３Ｂは、本発明の実施形態による、野生型、ΔＡ、またはΔＬＢＳ細胞における内因性ＬＢＲまたはＳＨＡＲＰの免疫沈降後のＲＴ−ｑＰＣＲによって測定したＸｉｓｔＲＮＡ濃縮レベルをプロットするグラフであり、エラーバーは、４つの独立したＩＰ実験からのＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定によって野生型細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１。図３Ｃは、本発明の実施形態による、野生型、ΔＡ、またはΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ細胞における相対的ＡｔｒｘｍＲＮＡ発現をプロットするグラフであり、対応のない２標本ｔ検定によって野生型細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１。図３Ｄは、本発明の実施形態による、ＧＦＰ−λＮ（コントロール）、ＥＥＤ−λＮ、ＳＨＡＲＰ−λＮ、またはＬＢＲ−λＮの発現と共に３ｘ−ＢｏｘＢ融合体を有するΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ（ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ）の発現をプロットするグラフであり、追加のコントロールとして、ＬＢＲをバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質と融合させて発現させており（ＬＢＲ−ＭＣＰ）、対応のない２標本ｔ検定によって、ＧＦＰ−λＮ（ｄ）をトランスフェクトした細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、本明細書で開示されている方法に従って、ＷＴ：スクランブルｓｉＲＮＡコントロール、ｓｉＥＭＤ：エメリンノックダウン、ｓｉＬＭＮＢ１：ラミンＢ１ノックダウン、ｓｇＬＢＲ：ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９−ＫＲＡＢを用いるＬＢＲのノックダウンで種々の核ラミナタンパク質のノックダウンをしたときのＸｉｓｔ誘導前（−ｄｏｘ）のレベルに対するＸｉｓｔの誘導後（＋ｄｏｘ）のＡｔｒｘ（Ｘ染色体遺伝子）のｍＲＮＡ分子の数をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔの誘導前（−ｄｏｘ）のＧｐｃ４レベルに対して正規化したＸｉｓｔ誘導後（＋ｄｏｘ）のＧｐｃ４ｍＲＮＡレベルをプロットするグラフであり、エラーバー：１回の実験からの５０個の細胞間の平均の標準誤差、ｓｉＣｔｒｌ：スクランブルｓｉＲＮＡコントロール、および示されている各ｓｉＲＮＡ。本発明の実施形態による、様々なｓｉＲＮＡ（列）で処理した後の２つのＸ連鎖ｍＲＮＡ、Ｇｐｃ４（緑色）およびＡｔｒｘ（赤色）、ならびにＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の画像を示し、同定されたｍＲＮＡの数が示されており、スケールバーは５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ；左部）または１６時間のＸｉｓｔの誘導後（＋Ｄｏｘ；中央および右部）の雄性ＥＳ細胞における様々なｓｉＲＮＡノックダウンについてのＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色を示す代表画像を示す。本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ；左部）または１６時間のＸｉｓｔの誘導後（＋Ｄｏｘ；中央および右部）の雄性ＥＳ細胞における様々なｓｉＲＮＡノックダウンについてのＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色を示す代表画像を示す。本発明の実施形態による、様々なｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡでノックダウンした後の−Ｄｏｘおよび＋Ｄｏｘ細胞におけるＧｐｃ４のコピー数の定量を示し、エラーバーは、１回の実験からの５０個の個々の細胞間の平均の標準誤差を表し、ＮＳ：＋Ｄｏｘ細胞と−Ｄｏｘ細胞との間に有意差なし；^＊＊＊＊は、対応のない２標本ｔ検定に基づいて＋Ｄｏｘ細胞と−Ｄｏｘ細胞との間でｐ値＜０．００１を有する値を表し、画像上のスケールバーは５μｍを表す。本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ；左部）または１６時間のＸｉｓｔ誘導後（＋Ｄｏｘ；中央部および右部）に、独立した、重複していないｓｉＲＮＡプール、またはプールからデコンボリューションした個々のｓｉＲＮＡを用いてタンパク質のノックダウンをした後のＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色を示す代表画像を示し、ここでは、本明細書に記載の方法によって、細胞をDharmacon（ｓｉＲＮＡ−Ｄ）、Qiagen（ｓｉＲＮＡ−Ｑ）、もしくはAmbion / Life Technologies（ｓｉＲＮＡ−Ａ）からのｓｉＲＮＡプール、またはDharmacon（ｓｉＲＮＡ−Ｄ１、２、３、４）もしくはQiagen（ｓｉＲＮＡ−Ｑ１、２、３、４）からのプールからデコンボリューションした各個々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。様々なｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡでノックダウンした後の−Ｄｏｘおよび＋Ｄｏｘ細胞におけるＧｐｃ４のコピー数の定量のグラフであり、エラーバーは、１回の実験からの５０個の個々の細胞間の平均の標準誤差を表し、ＮＳ：対応のない２標本ｔ検定に基づいて＋Ｄｏｘ細胞と−Ｄｏｘ細胞との間に有意差なし。本発明の実施形態によれば、画像上のスケールバーは、５μｍを表す。本発明の実施形態による、ＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ３をノックダウンした、またはＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ３阻害剤で処理した細胞中のＧｐｃ４ｍＲＮＡ（緑）およびＤＡＰＩ（青）についての個々の細胞の画像を示す。本発明の実施形態による、様々な条件におけるＧｐｃ４ｍＲＮＡのコピー数の定量のグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間の標準誤差を表し、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、ＤＭＳＯ（ＷＴ）またはＤＭＮＴ１およびＨＤＡＣ３阻害剤で処理した細胞におけるＧｐｃ４、Ａｔｒｘ、Ｍｅｃｐ２、またはＳｈａｒｐｍＲＮＡ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の画像を示す。本発明の実施形態による、様々な条件におけるＧｐｃ４、Ａｔｒｘ、Ｍｅｃｐ２、またはＳｈａｒｐｍＲＮＡのコピー数の定量のグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間の標準誤差を表し、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、示された最終濃度で示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤で処理されたマウスリンパ線維芽（ＭＬＦ）細胞における細胞死または正常にサイレンシングされたＸ染色体遺伝子Ｇｐｃ４の再活性化の増加倍率を表す表である。本発明の実施形態による、（コントロールとしての）ＤＭＳＯ、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２−ｄｃ）、およびＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６で示されているように４８時間（ｈ）、７２時間、および７日間同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有する５０個のヒト線維芽細胞の集団についての活性ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子座の数として測定した再活性化細胞のパーセンテージのグラフであり、２を超える活性ＰＧＫ１遺伝子座の数は灰色で示されており、２に等しいＰＧＫ１遺伝子座の数はオレンジ色で示されており、１に等しいＰＧＫ１遺伝子座の数は青色で示されている。本発明の実施形態による、５０細胞の集団についてＤＭＳＯ（コントロール）、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２−ｄｃ）、およびＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６で７日間同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有する再活性化ヒト線維芽細胞の（コントロールと比較した）ＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの発現レベルを定量するグラフである。本発明の実施形態による、（コントロールとしての）ＤＭＳＯ、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２−ｄｃ）、およびＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６で示されているように４８時間（ｈ）、７２時間、および７日間同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有する５０個のマウス有糸***後神経細胞の集団についての活性ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子座の数として測定した再活性化細胞のパーセンテージのグラフであり、２を超える活性ＰＧＫ１遺伝子座の数は灰色で示されており、２に等しいＰＧＫ１遺伝子座の数はオレンジ色で示されており、１に等しいＰＧＫ１遺伝子座の数は青色で示されている。本発明の実施形態による、５０細胞の集団についてＤＭＳＯ（コントロール）、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２−ｄｃ）、およびＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６で７日間同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有するマウス有糸***後神経細胞におけるＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの発現レベルを定量するグラフであり、当該発現は、再活性化雌性有糸***後神経細胞を雄性有糸***後神経細胞に対して正規化することによって計算した相対的発現である。本発明の実施形態による、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２ｄｃ）およびＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡで示されているように処理したヒトｉＰＳＣ由来神経細胞におけるＭｅＣＰ２ｍＲＮＡ（黄色）、活性Ｘ染色体（赤色、活性ＰＧＫ１遺伝子座により示される）、およびＤＡＰＩ（青色）染色について染色された沈黙化Ｘ染色体を有する個々のヒトｉＰＳＣ由来神経細胞の画像を示し、画像の右にある数は、５０個の細胞間のＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの平均数を平均の標準誤差（ＳＥＭ）と共に示す。本発明の実施形態による、５０細胞の集団についてＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２−ｄｃ）およびＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡで７日間同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有するヒトｉＰＳＣ由来神経細胞におけるＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの発現レベルを定量するグラフであり、当該発現は、神経細胞（活性ＰＫＧ１遺伝子座の２つのスポット）を再活性化されていない（処理した）神経細胞（活性ＰＫＧ１遺伝子座の１つのスポット）に対して正規化することによって計算した相対的発現である。本発明の実施形態による、ＲＡＰ−ＭＳ法の概略図である。本発明の実施形態による、ＸｉｓｔのＲＡＰ−ＭＳ後に回復された総細胞内Ｘｉｓｔまたは１８Ｓのパーセンテージを測定するＲＴ−ｑＰＣＲの結果のグラフであり、ここで、値は、出発（「入力」）溶解物中のＲＮＡの量で割った溶出液中の各ＲＮＡの量として算出し、エラーバーは、５つの生物学的反復の平均の標準誤差を表す。本発明の実施形態による、ｑＰＣＲにより測定したｐＳＭ３３細胞からのＲＡＰ−ＭＳ捕捉後のＸｉｓｔの濃縮をプロットするグラフであり、棒は、入力サンプル中のＲＮＡに対して正規化した、Ｘｉｓｔの精製後のＸｉｓｔ、１８Ｓ、およびＯｃｔ４のＲＮＡレベルを示し、各棒は、３つの生物学的反復からの、入力サンプル中のＲＮＡに対して正規化した、Ｘｉｓｔの精製後のＸｉｓｔ、１８Ｓ、およびＯｃｔ４のＲＮＡレベルを表す。本発明の実施形態による、ＳＩＬＡＣ培地中で１０日間の増殖（３細胞継代）後のｐＳＭ３３マウスＥＳ細胞の代表的培養物のＳＩＬＡＣ標識効率をプロットするグラフであり、ここでは、ペプチドは質量分析法によって分析されており、値は、重い標識の組み込みを有する同定されたペプチドの割合を示し、ペプチド標識のレベルは様々である（ビンに示す）。本発明の実施形態による、ＲＡＰ−ＭＳＵ１ｓｎＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、および４５Ｓプレ−ｒＲＮＡ実験で濃縮されたトップタンパク質のＳＩＬＡＣ比をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、２つの生物学的に独立した標識交換実験のうちの１つからのＵ１ｓｎＲＮＡ対１８ＳｒＲＮＡの反復捕捉のＳＩＬＡＣ比プロットであり、ここで、Ｕ１に関連するタンパク質は、軽い標識および重い標識で標識された両方のＵ１サンプルに一貫して見られ（右上の四分円）、１８Ｓと特異的に会合するタンパク質は、軽い標識および重い標識で標識された両方の１８Ｓに一貫して同定され（左下の四分円）、バックグラウンド夾雑タンパク質は、濃縮が低いか（パネル中央）、または光チャンネル内で一貫して見られ、実験間で反復されない（すなわち、ケラチン、ストレプトアビジン）。本発明の実施形態による、１つの標識交換実験からのＵ１ｓｎＲＮＡ対４５Ｓプレ−ｒＲＮＡの反復捕捉のＳＩＬＡＣ比プロットであり、ここで、４５Ｓプレ−ｒＲＮＡと会合することが知られているタンパク質は、４５Ｓ捕捉において一貫して同定される。図１１Ａは、本発明の実施形態による、４つの生物学的反復のうちの１つの代表的なサンプルについて、ＲＡＰ−ＭＳによって同定された各Ｘｉｓｔ濃縮タンパク質についてのＳＩＬＡＣ比（Ｘｉｓｔ／Ｕ１）をプロットするグラフであり、ＳＨＡＲＰおよびＲＢＭ１５では、濃縮値は、それらの棒の上に示されている。図１１Ｂは、本発明の実施形態による、各Ｘｉｓｔ相互作用タンパク質の（タンパク質長に合わせて調整した）概略図が示されており、機能ドメインの位置が示されている。本発明の実施形態による、本明細書に記載されている方法に従ったドキシサイクリン付加によるＸｉｓｔ誘導の６時間後のＵＶ架橋細胞溶解物で、７つのＸｉｓｔ相互作用タンパク質（黒色の棒）、ＲＡＰ−ＭＳおよびＩｇＧで同定されなかった２つのコントロールＲＮＡ結合タンパク質(灰色の棒)について実施したＲＮＡ免疫沈降実験からの結果を示し、ここで、各タンパク質と会合するＲＮＡを測定し、全細胞入力量中のＲＮＡのレベルに対して濃縮レベルを算出し、各サンプル中の総捕捉効率に対して正規化して、全てのＩＰ実験間の直接的比較を可能にした。ｐＳＭ３３雄性細胞のサンプルからの免疫沈降後のＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡの濃縮をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、本明細書に記載されている方法に従ったドキシサイクリン付加によるＸｉｓｔ誘導の６時間後のＵＶ架橋細胞溶解物で、７つのＸｉｓｔ相互作用タンパク質（黒色の棒）、ＲＡＰ−ＭＳおよびＩｇＧで同定されなかった２つのコントロールＲＮＡ結合タンパク質(灰色の棒)について実施したＲＮＡ免疫沈降実験からの結果を示し、ここで、各タンパク質と会合するＲＮＡを測定し、全細胞入力量中のＲＮＡのレベルに対して濃縮レベルを算出し、各サンプル中の総捕捉効率に対して正規化して、全てのＩＰ実験間の直接的比較を可能にした。レチノイン酸で２４時間処理したＵＶ架橋雌性ＥＳ細胞のサンプルから実施したＳＨＡＲＰの免疫沈降からのＩｇＧに対する濃縮をプロットするグラフであり、回収したＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡ（黒色の棒）、Ｎｅａｔ１ｌｎｃＲＮＡ（白色の棒）、および４５Ｓプレ−リボソームＲＮＡ（灰色の棒）のレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定し、抗ＳＨＡＲＰ抗体で捕捉された後の各ＲＮＡの濃縮を、ＩｇＧコントロール抗体で捕捉されたＲＮＡのレベルと比較して算出した。本発明の実施形態による、本明細書に記載されている方法に従ったドキシサイクリン付加によるＸｉｓｔ誘導の６時間後のＵＶ架橋細胞溶解物で、７つのＸｉｓｔ相互作用タンパク質（黒色の棒）、ＲＡＰ−ＭＳおよびＩｇＧで同定されなかった２つのコントロールＲＮＡ結合タンパク質(灰色の棒)について実施したＲＮＡ免疫沈降実験からの結果を示し、ここで、各タンパク質と会合するＲＮＡを測定し、全細胞入力量中のＲＮＡのレベルに対して濃縮レベルを算出し、各サンプル中の総捕捉効率に対して正規化して、全てのＩＰ実験間の直接的比較を可能にした。ｐＳＭ３３雄性細胞における免疫沈降後の様々なｌｎｃＲＮＡの濃縮をプロットするグラフであり、Ｎｅａｔ１、Ｍａｌａｔ１、Ｆｉｒｒｅ、およびＴｕｇ１が示されている。本発明の実施形態による、本明細書に記載されている方法に従ったドキシサイクリン付加によるＸｉｓｔ誘導の６時間後のＵＶ架橋細胞溶解物で、７つのＸｉｓｔ相互作用タンパク質（黒色の棒）、ＲＡＰ−ＭＳおよびＩｇＧで同定されなかった２つのコントロールＲＮＡ結合タンパク質(灰色の棒)について実施したＲＮＡ免疫沈降実験からの結果を示し、ここで、各タンパク質と会合するＲＮＡを測定し、全細胞入力量中のＲＮＡのレベルに対して濃縮レベルを算出し、各サンプル中の総捕捉効率に対して正規化して、全てのＩＰ実験間の直接的比較を可能にした。ｐＳＭ３３雄性細胞における免疫沈降後の様々なｍＲＮＡコントロールの濃縮をプロットするグラフであり、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｔａｔ３、およびＳｕｚ１２が示されている。図１３Ａは、本発明の実施形態による、Ｘ染色体に沿ってＸｉｓｔ（赤色）、Ｘ連鎖沈黙化遺伝子（黒色）、およびＸ連鎖脱出（X-linked escaped）遺伝子（緑色）の位置を示す図である。図１３Ｂは、本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ）または１６時間のＸｉｓｔ誘導後（＋Ｄｏｘ）のＳＨＡＲＰのノックダウンまたはコントロール雄性ＥＳ細胞でのＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、Ｘ連鎖沈黙化遺伝子（緑色）、およびＸ連鎖脱出（X-linked escaped）遺伝子（黄色）の染色を示す代表画像を示し、ここで、ＳＨＡＲＰのノックは、Ｘｉｓｔが発現すると通常サイレンシングされるＡｔｒｘ、Ｇｐｃ４、Ｒｂｍｘ、Ｓｍｃ１ａ、およびＭｅｃｐ２のサイレンシングを止めるが、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングを通常免れるＭｉｄ１およびＰｉｒには影響を及ぼさない。棒グラフは、ＳＨＡＲＰｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたときの−Ｄｏｘおよび＋Ｄｏｘ細胞についての各遺伝子のｍＲＮＡのコピー数の定量を示し；エラーバーは、１回の実験からの５０個の個々の細胞間の平均の標準誤差を表し、対応のない２標本ｔ検定に基づいて＋Ｄｏｘ細胞と−Ｄｏｘ細胞との間に、ＮＳ：有意差なし、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１の値を表し、^＊＊はｐ値＜０．０１の値を表し、画像上のスケールバーは５μｍを表す。図１３Ｃは、本発明の実施形態による、転写型サイレンシングにおける役割について、Ｘｉｓｔと会合するが転写をサイレンシングしないことがこれまでに同定されているいくつかのタンパク質の機能を試験するために、各タンパク質−ＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）をノックダウンした後の、Ｘｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ；左部）または１６時間のＸｉｓｔ誘導後（＋Ｄｏｘ；中央部および右部）の誘導性雄性ＥＳ細胞における代表画像である。図１３Ｄは、本発明の実施形態による、様々なｓｉＲＮＡで処理したときのＸｉｓｔ誘導前後のＧｐｃ４のコピー数の定量をプロットするグラフであり；エラーバーは、１回の実験からの５０個の個々の細胞間の平均の標準誤差を表し、対応のない２標本ｔ検定に基づいて＋Ｄｏｘ細胞と−Ｄｏｘ細胞との間で、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１の値を表し、画像上のスケールバーは５μｍを表す。本発明の実施形態による、分化前（−ＲＡ；左部）または２４時間の分化後（＋ＲＡ；中央部および右部）の雌性ＥＳ細胞において様々なｓｉＲＮＡを用いて特定のタンパク質をノックダウンしたときのＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色を示す代表画像を示す。本発明の実施形態による、分化前（−ＲＡ；左部）または２４時間の分化後（＋ＲＡ；中央部および右部）の雌性ＥＳ細胞において様々なｓｉＲＮＡを用いて特定のタンパク質をノックダウンしたときのＤＡＰＩ（青色）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色を示す代表画像を示す。本発明の実施形態による、様々なｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたときの−ＲＡおよび＋ＲＡ細胞についてのＧｐｃ４のコピー数の定量を示し、エラーバーは、１回の実験からの５０個の個々の細胞間の標準誤差を表し、対応のない２標本ｔ検定に基づいて、ＮＳ：＋ＲＡ細胞と−ＲＡ細胞との間で有意差なし、＋ＲＡ細胞と−ＲＡ細胞との間で、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１の値を表し、^＊＊はｐ値＜０．０１の値を表し、^＊はｐ値＜０．０５の値を表し、画像上のスケールバーは５μｍを表す。図１５Ａは、本発明の実施形態による、様々なｓｉＲＮＡ条件（列）におけるＸｉｓｔ（赤色）、ＰｏｌＩＩ（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）の代表的な蛍光画像を示す。図１５Ｂは、本発明の実施形態による、１６時間のドキシサイクリン処理後の雄性ＥＳ細胞における、コントロールｓｉＲＮＡレベルに対して正規化した、図１５Ａに示されているＸｉｓｔの領域内のＰｏｌＩＩの蛍光強度の定量をプロットするグラフである。図１５Ｃは、本発明の実施形態による、１日のレチノイン酸（ＲＡ）誘導分化後の雌性ＥＳ細胞における、コントロールｓｉＲＮＡレベルに対して正規化した、図１５Ａに示されているＸｉｓｔの領域内のＰｏｌＩＩの蛍光強度の定量をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、２４時間のレチノイン酸処理後の雌性ＥＳ細胞における、様々なｓｉＲＮＡ条件（列）におけるＸｉｓｔ（赤色）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）で標識されている個々の細胞の代表画像を示し、破線の白い領域は、輪郭が表されたＸｉｓｔ被覆領域を表す。図１７Ａは、本発明の実施形態による、複数のｓｉＲＮＡ条件（列）におけるＸｉｓｔ（赤色）、Ｅｚｈ２（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）について標識されたＥＳ細胞の代表的な蛍光画像を示す。図１７Ｂは、本発明の実施形態による、１６時間のドキシサイクリン処理後の雄性ＥＳ細胞についての、コントロールｓｉＲＮＡレベルに対して正規化した、Ｘｉｓｔの領域内のＰｏｌＩＩの蛍光強度の定量のグラフである。図１７Ｃは、本発明の実施形態による、１日のレチノイン酸誘導分化後の雌性ＥＳ細胞についての、コントロールｓｉＲＮＡレベルに対して正規化した、Ｘｉｓｔの領域内のＰｏｌＩＩの蛍光強度の定量のグラフである。本発明の実施形態による、２４時間の分化後の雌性ＥＳ細胞における、様々なｓｉＲＮＡ条件（列）におけるＸｉｓｔ（赤色）、Ｅｚｈ２（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）で標識されている個々の細胞の代表画像を示し、破線の白い領域は、輪郭が表されたＸｉｓｔ被覆領域を表す。本発明の実施形態による、ドキシサイクリンによる１６時間のＸｉｓｔ誘導後のＥＳ細胞における、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−ＡをノックダウンしたときのＮａｎｏｇ（シアン）、Ｘｉｓｔ（赤色）、およびＧｐｃ４（緑色）の染色の代表画像を示し、画像上のスケールバーは５μｍを表す。本発明の実施形態による、様々なｓｉＲＮＡ（列）で処理した後に、２つのＸ連鎖ｍＲＮＡ、Ｇｐｃ４（緑色）およびＡｔｒｘ（赤色）をＸｉｓｔ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）と共に示す個々の細胞の代表画像を示し、同定されたｍＲＮＡの数が示されており、スケールバー：５マイクロメートルである。様々なｓｉＲＮＡで処理した後のＸｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ）およびＸｉｓｔ誘導後（＋Ｄｏｘ）のＧｐｃ４（図２０Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２０Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフである。本発明の実施形態により、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。様々なｓｉＲＮＡで処理した後のＸｉｓｔ誘導前（−Ｄｏｘ）およびＸｉｓｔ誘導後（＋Ｄｏｘ）のＧｐｃ４（図２０Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２０Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフである。本発明の実施形態により、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、ΔＲＳ−ＬＢＲ（アミノ酸７１〜９０）およびΔＴＭ−ＬＢＲ（アミノ酸２３７〜６１５）において欠失した領域を示すＬＢＲタンパク質のドメイン構造の概略図である。本発明の実施形態による、本明細書に記載の方法により、全長ＬＢＲ（ＷＴ）、ΔＲＳ−ＬＢＲ、またはΔＴＭ−ＬＢＲを発現する細胞における、入力ＲＮＡレベルに対して正規化した、３ｘ−ＦＬＡＧタグ付きＬＢＲの免疫沈降後のＸｉｓｔＲＮＡ濃縮レベルをプロットするグラフであり、エラーバーは、３つの独立したＩＰ実験からのＳＥＭを表す。本発明の実施形態による、内在性ＬＢＲをｓｉＲＮＡノックダウンしたときの相対的なＡｔｒｘｍＲＮＡ発現、および全長ＬＢＲ（ＷＴ）、ΔＴＭ−ＬＢＲ、またはΔＲＳ−ＬＢＲを発現するｃＤＮＡコンストラクトの発現をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、λＮ融合タンパク質と３ｘ−ＢｏｘＢを含むＸｉｓｔとの相互作用の概略図である。本発明の実施形態による、内在性ＬＢＲをｓｉＲＮＡノックダウンした後のＸｉｓｔ−ＢｏｘＢ細胞における相対的なＡｔｒｘｍＲＮＡ発現、およびＧＦＰ−λＮ（コントロール）、ＬＢＲ−λＮ、またはΔＲＳ−ＬＢＲ−λＮの発現をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、核ラミナ、およびＬＢＲとＸｉｓｔとの相互作用の概略図である。本発明の実施形態による、全長ＬＢＲ、ΔＲＳ−ＬＢＲ、またはΔＴＭ−ＬＢＲ（黄色）およびＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、ＬＢＲをノックダウンしたときのΔＲＳ−ＬＢＲまたはΔＴＭ−ＬＢＲを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＧｐｃ４（図２２Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２２Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、ＬＢＲをノックダウンしたときのΔＲＳ−ＬＢＲまたはΔＴＭ−ＬＢＲを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＧｐｃ４（図２２Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２２Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。図２３Ａは、本発明の実施形態による、３ｘ−ＢｏｘＢ細胞と融合されたＸｉｓｔを発現する細胞における、ＡｔｒｘｍＲＮＡ（黄色）ならびにＸｉｓｔ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、スケールバー：５マイクロメートルである。図２３Ｂは、本発明の実施形態による、Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＡｔｒｘｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。図２４Ａは、本発明の実施形態による、ＬＢＲ、ＳＨＡＲＰ、およびＰＴＢＰ１タンパク質についてＸｉｓｔＲＮＡにわたりプロットしたＣＬＩＰデータを示し、値は、本明細書に記載の方法に従い、サイズが一致した入力ＲＮＡコントロールに対して正規化したＸｉｓｔ上の各位置での濃縮倍率（fold-enrichment）を表し；入力はＬＢＲＣＬＩＰサンプルの総ＲＮＡコントロールを表し；下部：ＸｉｓｔＲＮＡ（ＷＴ）上の注釈付きリピート領域ならびにΔＡ（ヌクレオチド１〜９３７）およびΔＬＢＳ（ヌクレオチド８９８〜１６８２）ＸｉｓｔＲＮＡ中の欠失領域の位置の概略図である。図２４Ｂは、本発明の実施形態による、野生型、ΔＡ、またはΔＬＢＳ細胞における内因性ＬＢＲまたはＳＨＡＲＰの免疫沈降後のＲＴ−ｑＰＣＲによって測定したＸｉｓｔＲＮＡ濃縮レベルをプロットするグラフであり、エラーバーは、４つの独立したＩＰ実験からのＳＥＭを表し、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、野生型細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１である。図２４Ｃは、本発明の実施形態による、野生型、ΔＡ、またはΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ細胞における相対的ＡｔｒｘｍＲＮＡ発現をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、野生型細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１である。図２４Ｄは、本発明の実施形態による、ＧＦＰ−λＮ（コントロール）、ＥＥＤ−λＮ、ＳＨＡＲＰ−λＮ、またはＬＢＲ−λＮの発現と共に３ｘ−ＢｏｘＢ融合体を有するΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ（ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ）の発現をプロットするグラフであり、コントロールとして、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質と融合させたＬＢＲ（ＬＢＲ−ＭＣＰ）を用いており、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、ＧＦＰ−λＮをトランスフェクトした細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、野生型サンプル、ΔＬＢＳ、およびΔＡ細胞についてのＸｉｓｔＲＮＡにわたるＬＢＲのＣＬＩＰ結果を示し、値は、各サンプルからの入力ＲＮＡに対して正規化した、ＸｉｓｔＲＮＡ上の各位置での各サンプルの濃縮倍率を表す。図２６Ａは、本発明の実施形態による、ΔＬＢＳ細胞における２つのＸ連鎖ｍＲＮＡ、Ｇｐｃ４（緑色）およびＡｔｒｘ（赤色）ならびにＸｉｓｔ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、同定されたｍＲＮＡの数が示されており、スケールバー：５マイクロメートルである。図２６Ｂは、本発明の実施形態による、ΔＬＢＳＸｉｓｔを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＧｐｃ４（図２６Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。図２６Ｃは、本発明の実施形態による、ΔＬＢＳＸｉｓｔを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＧｐｃ４（図２６Ｂ）およびＡｔｒｘ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、様々な融合タンパク質でトランスフェクトした後のΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを発現する細胞におけるＡｔｒｘｍＲＮＡ（黄色）およびＸｉｓｔ（赤色）ならびにＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、同定されたｍＲＮＡの数が示されており、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、様々な融合タンパク質でトランスフェクトした後のΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＡｔｒｘｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊はｐ値＜０．００５である。本発明の実施形態による、様々な条件におけるＸｉｓｔ（赤色）、ラミンＢ１（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）で標識されている個々の細胞の代表画像を示し、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、ＸｉｓｔとラミンＢ１との間の正規化した距離算出を示す概略図である。本発明の実施形態による、様々な条件にわたる８０個の個々の細胞におけるＸｉｓｔとラミンＢ１との間の正規化した距離の累積度数分布をプロットするグラフである。本発明の実施形態による、ラミンＢ１−λＮ融合タンパク質を使用するΔＬＢＳ−ＢｏｘＢの核ラミナへの係留を示す概略図である。本発明の実施形態による、ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢの発現をＬＢＲ−ＭＣＰ（コントロール）、ＬＢＲ−λＮ、またはラミンＢ１−λＮの発現と共にプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、ＬＢＲ−ＭＣＰでトランスフェクトされた細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。本発明の実施形態による、ＬＭＮＢ１−λＮ融合タンパク質でトランスフェクトされたΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを発現する細胞における、ＡｔｒｘｍＲＮＡ（黄色）およびＸｉｓｔ（赤色）ならびにＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、同定されたｍＲＮＡの数が示されており、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、ＬＭＮＢ１−λＮ融合タンパク質でトランスフェクトされたΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＡｔｒｘｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊＊はｐ値＜０．００５である。本発明の実施形態による、活発に転写される遺伝子（赤色）および不活性遺伝子（青色）のクラスターを含むＸ染色体の代表的な領域における、野生型（上部）、ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ（中央部）、および変化倍率（下部）についての、ＲＡＰ−ＤＮＡにより測定したＸｉｓｔＲＮＡ局在をプロットするグラフであり、破線は、野生型細胞における当該領域での平均Ｘｉｓｔ濃縮を表す。本発明の実施形態による、野生型細胞と比較した、ΔＬＢＳ、ＳＨＡＲＰのノックダウン、およびΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ＋ＬＭＮＢ１−λＮ細胞についてのＸ染色体上の最も転写活性化が高い遺伝子（暗赤色、ＲＰＫＭ＞５）、全ての活発に転写される遺伝子（赤色、ＲＰＫＭ＞１）、および不活性遺伝子（青色）における平均Ｘｉｓｔ濃縮を示すグラフを示し、網掛け領域は９５％信頼区間を表し、ここで、濃縮レベルは、Ｘ染色体全体の平均濃縮レベルに対して正規化されている。本発明の実施形態による、様々な細胞株（列）におけるＸｉｓｔ（赤色）、Ｇｐｃ４遺伝子座（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）で標識されている個々の細胞の代表画像を示し、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、８０個の個々の細胞において、Ｇｐｃ４遺伝子座（Ｘ染色体）またはＮｏｔｃｈ２遺伝子座（常染色体）がＸｉｓｔのクラウドの内側または外側に見られた細胞のパーセンテージをプロットするグラフである。本発明の実施形態による、様々な細胞株についての、８０個の個々の細胞におけるＧｐｃ４遺伝子座またはＮｏｔｃｈ２遺伝子座からＸｉｓｔ被覆区画までの距離をプロットするグラフであり、対応のない２標本ｔ検定により、ｓｉＳＨＡＲＰと比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊はｐ値＜０．０１、^＊＊＊はｐ値＜０．００５である。本発明の実施形態による、野生型Ｘｉｓｔ細胞と比較した、ΔＬＢＳ、ＳＨＡＲＰのノックダウン、ΔＡ、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢでのＬＢＲのノックダウン、およびΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ＋ＬＭＮＢ１−λＮ細胞についてのＸ染色体上の最も転写活性化が高い遺伝子（暗赤色、ＲＰＫＭ発現＞５）、全ての活発に転写される遺伝子（赤色、ＲＰＫＭ＞１）、および不活性遺伝子（青色）における平均したＸｉｓｔ濃縮の変化倍率示すグラフを示し、網掛け領域は平均濃縮の９５％信頼区間を表し、ここで、濃縮レベルは、Ｘ染色体全体の濃縮レベルの平均に対して正規化されており、ｌｏｇスケールでプロットされている。本発明の実施形態による、代表的な領域のＸｉｓｔ濃縮の野生型とΔＬＢＳ細胞におけるＬＭＮＢ１−λＮとの比較を示すグラフを示し、灰色のボックスは、野生型細胞と比較してΔＬＢＳ細胞においてＸｉｓｔ会合が枯渇している領域を示し、破線は野生型細胞の領域平均Ｘｉｓｔ濃縮レベルを表す。本発明の実施形態による、様々な細胞株（列）におけるＧｐｃ４遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ２遺伝子座、またはＸｉｓｔ遺伝子座（緑色）、ならびにＸｉｓｔ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）で標識されている個々の細胞の代表画像を示す。本発明の実施形態による、８０個の細胞において、Ｇｐｃ４遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ２遺伝子座、またはＸｉｓｔ遺伝子座がＸｉｓｔのクラウドの内側または外側に見られた細胞のパーセンテージをプロットするグラフである。本発明の実施形態による、８０個の細胞における、様々な細胞株にわたる、Ｇｐｃ４遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ２遺伝子座、またはＸｉｓｔ遺伝子座からＸｉｓｔのクラウドまでの距離をプロットするグラフであり、エラーバーは、８０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、ｓｉＳＨＡＲＰと比較して、ＮＳ：有意ではない、^＊＊はｐ値＜０．０１、^＊＊＊はｐ値＜０．００５であり、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、開始時に（左パネル）、ＸｉｓｔがＸｉｓｔ転写遺伝子座に最も近い領域に広がる（赤矢印）ことを示す概略図である。これらの最初のＸｉｓｔ被覆ＤＮＡ領域（黒色領域）は、ＸｉｓｔとＬＢＲとの間の相互作用により核ラミナに動員される（中央パネル）。この動員は、Ｘ染色体の３次元構成を変化させ、活性遺伝子（緑色領域）をＸｉｓｔ転写遺伝子座により近く再配置し、Ｘｉｓｔ、およびそのＳＨＡＲＰ／ＳＭＲＴ／ＨＤＡＣ３サイレンシング複合体をこれらの新しい部位に３次元近接間転送により広げることを可能にする。次にこれらの部位を核ラミナに動員し、別の活性遺伝子の組（黄色の領域）を効果的にＸｉｓｔ転写遺伝子座とより緊密に接触させるようにする（右パネル）。この反復プロセスは、Ｘｉｓｔが、Ｘ染色体全体にわたる活発に転写される遺伝子に広がり、それらをサイレンシングすることを可能にするであろう。本発明の実施形態による、ＳＨＡＲＰまたはＬＢＲがノックダウンされたＳＨＡＲＰ−λＮ−３ｘＦＬＡＧまたはＬＢＲ−λＮ−３ｘＦＬＡＧを発現する細胞におけるＧｐｃ４ｍＲＮＡ（緑色）およびＸｉｓｔ（赤色）ならびにＤＡＰＩ（青色）についての個々の細胞の代表画像を示し、同定されたｍＲＮＡ数の数が示されており、スケールバー：５マイクロメートルである。本発明の実施形態による、ＳＨＡＲＰまたはＬＢＲのノックダウンをしたときのＳＨＡＲＰ−λＮ−３ｘＦＬＡＧまたはＬＢＲ−λＮ−３ｘＦＬＡＧを発現する−Ｄｏｘ細胞および＋Ｄｏｘ細胞についてのＧｐｃ４ｍＲＮＡのコピー数の定量をプロットするグラフであり、エラーバーは、５０個の個々の細胞間のＳＥＭを表し、対応のない２標本ｔ検定により、−Ｄｏｘ細胞と比較して、^＊＊＊＊はｐ値＜０．００１である。

詳細な説明
Ｘｉｓｔ長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、哺乳動物細胞中で、染色体全体のサイレンシングおよびＸ染色体の３次元構造のリモデリングを含むプロセスにおいて、Ｘ染色体不活性化（ＸＣＩ）を媒介する。本発明の実施形態によれば、ＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡと相互作用し、Ｘ染色体遺伝子のＸｉｓｔ依存性転写型サイレンシングに必要とされるタンパク質成分には、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−Ａ、およびＬＢＲタンパク質が含まれる。図１Ａに示されているように、ＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡはＳＨＡＲＰに直接結合し、ＳＨＡＲＰはＳＭＲＴに直接結合し、ＨＤＡＣ３はＳＭＲＴに直接結合する。同様に図１Ａに示されているように、Ｘｉｓｔのいくつかの他の領域は、ＳＡＦ−Ａタンパク質に結合し、ＳＡＦ−ＡはＸ染色体遺伝子のゲノムＤＮＡに直接結合する。図１Ｂに示されているように、ＬＢＲ膜貫通タンパク質は、Ｘｉｓｔに直接結合する。

Ｘｉｓｔのこれらの同定されたタンパク質相互作用およびＸ染色体遺伝子のＸｉｓｔ依存性サイレンシングに必要とされるこれらのタンパク質各々の条件を使用して、本発明の実施形態は、Ｘ染色体遺伝子のＸｉｓｔ依存性サイレンシングを阻害、妨害、または防止するためにこれらの同定されたＸｉｓｔ相互作用のいずれか一つを標的とすることを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、１以上のＸｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化する方法は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与を含む。後述するように、沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化または再活性化するための好適なＨＤＡＣ阻害剤は、細胞を死滅させることなく、または少なくとも大部分の細胞を死滅させることなく、細胞内でＨＤＡＣ３を阻害することができるＨＤＡＣ阻害剤である。例えば、細胞集団に投与された無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤は、大部分の細胞の生存をもたらし、生存する大部分はＨＤＡＣ３活性が阻害される。本明細書に開示されているように（例えば、図７Ｅ）、一部の阻害剤で見られる高レベルの細胞死によって示されるように、ＨＤＡＣ阻害が観察される前に細胞死を引き起こす、いくつかの用量のＨＤＡＣ阻害剤が観察された。本明細書中の他のデータは、細胞に対して細胞毒性ではないＨＤＡＣ３阻害剤による沈黙化Ｘ染色体遺伝子の成功裏の活性化（例えば、再活性化）を証明する。

いくつかの実施形態によれば、沈黙化Ｘ染色体を有する細胞におけるＨＤＡＣ３活性の阻害には、許容できない細胞毒性を誘発することなく、１以上のＸｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子または沈黙化Ｘｉｓｔ依存性常染色体遺伝子を効果的に再活性化することが示されている無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤が含まれる。

本明細書で使用される場合、ＳＨＡＲＰは、ＳＭＲＴおよびＨＤＡＣ関連リプレッサータンパク質（SMRT and HDAC associated repressor protein）を指す。ＳＨＡＲＰタンパク質は、ＳｐｅｎまたはＭＩＮＴとしても知られており、Ｓｐｅｎ（スプリットエンド）タンパク質である。

本明細書で使用される場合、ＳＭＲＴは、レチノイドおよび甲状腺受容体タンパク質のサイレンシングメディエーター（silencing mediator of retinoid and thyroid receptors protein）を指し、ＮＣｏｒ２としても知られている。

本明細書で使用される場合、ＨＤＡＣ３は、酵素的ヒストンデアセチラーゼ３タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、ＳＡＦ−Ａはスキャフォールド付着因子Ａタンパク質を指す。ＳＡＦ−Ａは、ＨＮＲＮＰＵ（不均一核リボ核タンパク質Ｕ）としても知られている。

本明細書で使用される場合、ＬＢＲは、核ラミナの不可欠な部分である膜貫通タンパク質である、ラミンＢ受容体タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「サイレンシング」、「沈黙化」、および同様の用語は、遺伝子の発現活性の抑制を指す。例えば、沈黙化遺伝子は、発現されず、転写を受けない。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、転写され得るＤＮＡヌクレオチドの配列を指す。このような遺伝子としては、タンパク質をコードするＤＮＡおよび転写を受ける非コードＤＮＡが挙げられる。遺伝子は、細胞のゲノム（染色体の一部）に存在し得るか、または遺伝子は細胞内でプラスミドベクター上で外因的に発現され得る。染色体遺伝子は、天然に存在する遺伝子または細胞のゲノムに組み込まれている遺伝子であり得る。

本明細書で使用される場合、「阻止する」、「阻止」、および同様の用語は、活性の阻害、妨害、または防止を指す。本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、沈黙化転写またはＸｉｓｔ依存性遺伝子の転写／発現の防止（妨害）の阻害、妨害、再活性化を含む。サイレンシングの防止が図２に示されており、図２では、Ｘｉｓｔ発現は、その内因性遺伝子座からテトラサイクリン誘導性プロモーターによって制御される。ドキシサイクリンの添加は、野生型条件（例えば、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体成分との相互作用）下でＸ染色体遺伝子または操作されたＸｉｓｔ依存性遺伝子をサイレンシングするＸｉｓｔの発現を誘導する。Ｘｉｓｔはドキシサイクリン（ｄｏｘ＋）の存在下で発現されるが、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体成分のうちの１つの阻害は転写をもたらすため、Ｘｉｓｔの発現を制御すると、Ｘｉｓｔ依存性サイレンシングは防止されることが示されている。サイレンシングのこの防止（すなわち、阻止または妨害）は、例えば、図３Ｃ、３Ｄ、４、５Ａ、６Ｂ、および６Ｄに示されており、阻害方法または分子が投与されていなかった場合、示されている遺伝子の発現はサイレンシングされていたであろう。

本明細書で使用される場合、「投与」および同様の用語は、提供する行為を指す。本発明のいくつかの実施形態において、阻害剤分子または候補分子を細胞に投与することには、分子を細胞に提供することが含まれる。提供または投与するこの行為には、細胞に、および細胞内に、分子を提供するために必要な方法およびインキュベーションが含まれる。

本明細書で使用される場合、「発現活性」および同様の用語は、遺伝子に関連するあらゆる全ての活性を指す。発現活性の例として、クロマチンの修飾、転写因子の動員、クロマチン調節因子、ＲＮＡＩＩポリメラーゼの存在、転写開始部位の上流または下流（例えば、エンハンサー、オペレーター、またはプロモーター領域）の相互作用を含む転写の活性化が挙げられる。発現活性の例として、遺伝子の転写に必要な因子、またはｍＲＮＡ転写産物の翻訳に必要な因子が含まれる。

本明細書で使用される場合、句「発現活性の測定」は、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子が発現を受けることができるかどうかを決定することができる方法を指す。発現活性の測定には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰｏｌＩＩ）の動員の測定が含まれ得る。発現活性の測定には、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子の転写（例えば、ｍＲＮＡのレベル）を測定すること、またはＸｉｓｔ依存性遺伝子の翻訳（例えば、タンパク質レベル）もしくはタンパク質産物を測定することが含まれ得る。

本明細書で使用される場合、句「Ｘｉｓｔ依存性Ｘ染色体遺伝子」は、Ｘ染色体不活性化を受けるＸ染色体遺伝子を指す。ほとんど全てのＸ染色体遺伝子がＸｉｓｔによってサイレンシングされるため、これらのＸ染色体遺伝子は、Ｘｉｓｔ依存性である−すなわち、Ｘ染色体遺伝子は、Ｘｉｓｔ媒介抑制によってサイレンシングされる。

本明細書で使用される場合、句「Ｘｉｓｔ依存性常染色体遺伝子」は、Ｘｉｓｔ依存性常染色体遺伝子の発現が、Ｘｉｓｔを阻害して常染色体遺伝子のＸｉｓｔ媒介サイレンシングを逆転または阻止することを必要とする、Ｘｉｓｔを組み込むように操作された遺伝子を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｘｉｓｔサイレンシング複合体」は、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−Ａ、ＬＢＲ、Ｘｉｓｔ上のＳＨＡＲＰの結合部位、Ｘｉｓｔ上のＬＢＲの結合部位、およびＸｉｓｔ上のＳＡＦ−Ａの結合部位を含むＸｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングに必要な成分の全てを指す。

本明細書で使用される場合、「再活性化」および同様の用語は、遺伝子サイレンシングの逆転を指す。例えば、沈黙化遺伝子の再活性化は、遺伝子を「サイレンシング解除」し、それによって遺伝子の発現を可能にすることを指す。例えば、再活性化された沈黙化遺伝子は、発現され、したがって、転写および翻訳を受ける。
Ｘｉｓｔサイレンシング複合体相互作用の標的化

本発明の実施形態によれば、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体における直接的相互作用のいずれか１つの阻止により、Ｘｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングが阻害または妨害される。例えば、ＳＨＡＲＰとＳＭＲＴ、ＳＭＲＴとＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−ＡとＸｉｓｔ、ＬＢＲとＸｉｓｔ、またはＳＨＡＲＰとＸｉｓｔから選択される直接的相互作用のいずれか１つを阻止することによって、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングが阻害または妨害される。本発明の実施形態によれば、Ｘｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングを阻止するための方法は、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体において必要とされる相互作用を阻止するための多くの可能な方法および／または分子のうちのいずれかを含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｘ染色体遺伝子のＸｉｓｔ依存性サイレンシングを阻止する分子を同定するための方法は、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体中の成分のＸｉｓｔ依存性活性を標的とするように選択された候補分子を投与することを含む。成分は、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−Ａ、ＬＢＲ、Ｘｉｓｔ上のＳＨＡＲＰの結合部位、Ｘｉｓｔ上のＬＢＲの結合部位、またはＸｉｓｔ上のＳＡＦ−Ａの結合部位から選択されるタンパク質または長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であり得る。１以上のＸｉｓｔ依存性Ｘ染色体遺伝子を有する細胞、またはＸｉｓｔ依存性常染色体遺伝子を有する細胞に分子を投与し得る。Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、候補分子を投与されていない細胞と比較して、候補分子を投与された細胞において観察される転写量として定義される。

本発明の実施形態によれば、必要とされるＸｉｓｔサイレンシング複合体相互作用のいずれかを標的とする分子は、Ｘ染色体遺伝子またはＸｉｓｔ媒介沈黙化遺伝子のサイレンシングを防止または逆転させることができるため、有用である。

本発明の実施形態は、必要とされるＸｉｓｔサイレンシング複合体相互作用を標的とすることができる分子を選択することによって、Ｘｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングを阻止する分子を同定するための方法を含む。

本発明の実施形態は、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体の成分をコードする遺伝子を破壊する分子を含む。例えば、分子には、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−Ａ、ＬＢＲ、Ｘｉｓｔ上のＳＨＡＲＰの結合部位、Ｘｉｓｔ上のＬＢＲの結合部位、またはＸｉｓｔ上のＳＡＦ−Ａの結合部位のうちのいずれかをコードする遺伝子または遺伝子の一部を破壊する分子が含まれ得る。遺伝子破壊の方法には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、ならびにその両方の内容全体が参照により本明細書に援用されるLienert et al., 2014, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 15:95-107、およびLee et al., 2016, Molec. Therapy, 24:475-487に記載されている遺伝子または遺伝子の一部を特異的に標的とするヌクレアーゼが含まれる。

例えば、図３Ａに示されているように、Ｘｉｓｔ上の１つのＬＢＲ結合部位（LBR binding site）（ＬＢＳ−１）をＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトを用いて欠失させて、ΔＬＢＳＸｉｓｔを得た。Ｘ染色体サイレンシングアッセイを用いて、野生型（ＷＴ）ＸｉｓｔおよびΔＬＢＳＸｉｓｔを用いて、Ａｔｒｘ遺伝子の細胞発現を測定した。図３Ｃに示されているように、ＷＴＸｉｓｔを有する細胞は、Ａｔｒｘを発現せず、ΔＬＢＳＸｉｓｔを有する細胞は、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングを阻害し、Ａｔｒｘを発現した。

本発明の実施形態は、タンパク質またはｌｎｃＲＮＡ成分をコードする遺伝子の転写を制御する分子を含む。非限定的な例として、クロマチン調節因子、転写因子、およびタンパク質またはｌｎｃＲＮＡ成分をコードする遺伝子の転写を調節する小分子が挙げられる。例えば、クルッペル関連ボックスリプレッサー（Kruppel-associated box repressor）（ＫＲＡＢ）は、クロマチン状態を媒介することによって遺伝子発現を調節するクロマチン調節因子である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９法を用いて、ＬＢＲの転写を標的とするようにＫＲＡＢを特異的に修飾した。したがって、ＬＢＲの転写開始部位の近くを標的とするｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよび単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する細胞は、ＬＢＲの発現をノックダウンし、Ｘｉｓｔの誘導（または存在）にもかかわらず、Ａｒｔｘ遺伝子の発現をもたらす。Ｘｉｓｔ発現が誘導され、ＬＢＲがｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ媒介のノックダウン（ｓｇＬＢＲ）をされた細胞におけるＡｒｔｘの発現が、図４に示されている。

本発明の実施形態は、タンパク質成分をコードするｍＲＮＡと直接接触し、阻害または分解する分子を含む。例えば、タンパク質成分のｍＲＮＡに直接接触し、阻害する分子、またはｌｎｃＲＮＡ上の結合部位に直接接触する分子は、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−ＡのｍＲＮＡを標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（ｓｇＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択され得る。

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｘｉｓｔサイレンス複合体成分の各々について、いずれかの調節部位に対応する特定のＤＮＡまたはＲＮＡ領域を標的とし、それによってその成分の発現を全体的または部分的に妨げるように設計され得る。ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−ＡのゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡは、それぞれ、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドで標的化され得る。ＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡでは、アンチセンスＤＮＡを用いる遺伝子の標的化に加えて、機能性ｌｎｃＲＮＡそれ自体を、ＬＢＲ結合部位（ＬＢＳ１、ＬＢＳ２、またはＬＢＳ３）、ＳＡＦ−Ａ、および／またはＳＨＡＲＰのうちの１つに対する結合部位に対応するＸｉｓｔのＲＮＡヌクレオチドを特異的に標的とし、結合するように設計されたアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて標的化し得る。ＬＢＳ１は、Ｘｉｓｔ上のヌクレオチド５３５〜１６０８を含み、ＬＢＳ２は、Ｘｉｓｔ上のヌクレオチド９５０６〜１０２４５を含み、ＬＢＳ３はＸｉｓｔ上のヌクレオチド１１７３２〜１１９５６を含む。Ｘｉｓｔ上のＳＨＡＲＰ結合部位は、Ｘｉｓｔ上のヌクレオチド３１７〜１０５６を含む。これらのＬＢＲ、ＳＡＦ−Ａ、またはＳＨＡＲＰ結合部位のいずれかを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対応するＸｉｓｔ複合体成分の結合を妨害するか、または止めるために、全結合領域に結合する必要はない。短いＡＳＯは特異性に問題があり、長いＡＳＯは安定性および適当な送達に問題がある。ＡＳＯは、高親和性ＲＮＡバインダー（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ））および化学的修飾を含むように修飾され得る。本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体成分のいずれかを標的とするＡＳＯは、長さが８〜８０サブユニット（またはヌクレオチド）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および修飾が、例えば、Subramanian et al., 2015, Nucleic Acids Res. 43:9123-9132；Staarup et al., 2010, Nucleic Acids Res., 38:7100-7111；Gupta et al., 2010, PLoS ONE, 5:e10682, 1-9；Prakash et al.,米国第２０１６／００１７３２３号；およびKrieg et al., 米国第２０１５／０２５２３５４号に記載されており、これらの全ての内容全体が参照により本明細書に援用される。ＳＭＲＴを標的とする具体的なＡＳＯは、Pandeyらの米国特許第８，５４１，３８７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−Ａのうちの１つのｍＲＮＡを標的とし、それによって標的タンパク質の翻訳を阻止した。例えば、細胞内のＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＬＢＲ、およびＳＡＦ−Ａの各々に対して別々に標的とするｓｉＲＮＡは、Ｘｉｓｔ依存性サイレンシングを妨げる。図５Ａ〜５Ｂに示されているように、ＬＢＲ、ＳＨＡＲＰ、ＳＡＦ−Ａ、ＳＭＲＴ、またはＨＤＡＣ３発現のうちの１つがｓｉＲＮＡによって阻害された場合、Ｘｉｓｔ誘導で、Ｇｐｃ４転写は進行した。比べて、他のＸｉｓｔサイレンシング成分−例えば、Ｘｉｓｔに直接結合する成分（例えば、ＰＴＢＰ１）はＸｉｓｔ依存性サイレンシングに必須ではないため、これらの成分を標的とするｓｉＲＮＡは、Ｘｉｓｔサイレンシングを阻害しなかった。別の実施例において、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡの量を、図６Ａ〜６Ｂに表されているように、示されているタンパク質がｓｉＲＮＡノックダウンされ、Ｘｉｓｔ誘導を受けている細胞（＋ｄｏｘ、オレンジ色の棒）で定量したところ、ＬＢＲ、ＳＨＡＲＰ、ＳＡＦ−Ａ、ＳＭＲＴ、またはＨＤＡＣ３のいずれかのｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｘｉｓｔの非存在下での転写（−ｄｏｘ、青色の棒）と同程度のレベルでの転写（Ｇｐｃ４ｍＲＮＡの量）をもたらした。ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、ＳＡＦ−Ａ、ＳＭＲＴ、およびＨＤＡＣ３の各々に対する様々なｓｉＲＮＡを、図６Ｃ〜６Ｄに示されているようにアッセイしたところ、同程度の有効性を示した。高い機能性および特異性を有するｓｉＲＮＡの設計は、例えば、Birmingham et al., 2007, Nature Protocols, 2:2068-2078に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

本発明の実施形態は、タンパク質成分と直接接触し、タンパク質成分とｌｎｃＲＮＡまたは他のタンパク質成分との結合を阻止または妨害する分子を含み、ここで、タンパク質成分と直接接触し、ｌｎｃＲＮＡまたは他のタンパク質成分との結合を阻止または妨害する分子は、抗体、ナノボディ、タンパク質結合核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）アプタマー、ペプチド、ならびに小分子阻害剤からなる群から選択される。

Ｘｉｓｔサイレンシング複合体タンパク質（ＳＨＡＲＰ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ３、ＳＡＦ−Ａ、およびＬＢＲ）の同定された結合相互作用を考慮すると、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングを阻止するための本発明の実施形態は、これらの特異的アミノ酸残基の標的化を含み、当該標的化は、抗体、ナノボディ、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、ペプチド、および小分子阻害剤を含むいくつかの利用可能な方法を用いて実施し得る。ナノボディの設計方法は、Steeland et al., 2016, Drug Discov. Today, doi:10.1016/j.drudis.2016.04.003およびOliveira et al., 2013, J. Control. Release, 172:607-617に記載されており、その両方の内容全体が参照により本明細書に援用される。核酸アプタマーの設計方法は、Hermann and Patel, 2000, Science, 287:820-825およびPatel and Suri, 2000, Rev. Molec. Biotechnol., 74:39-60に記載されており、その両方の内容全体が参照により本明細書に援用される。

本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、ＳＨＡＲＰ上のＸｉｓｔに対する結合部位またはＳＨＡＲＰ上のＳＭＲＴに対する結合部位を標的とする抗体、ナノボディ、アプタマー、ペプチド、または小分子阻害剤を用いるＳＨＡＲＰタンパク質の標的化を含む。ＳＨＡＲＰ上のＸｉｓｔ結合部位は、４つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）（ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ３、およびＲＲＭ４）を含み、ここでＲＲＭ１はアミノ酸（ａａ）残基６〜８１を含み、ＲＲＭ２はａａ残基３３７〜４１０を含み、ＲＲＭ３はａａ残基４４０〜５１５を含み、ＲＲＭ４はａａ残基５１９〜５９１を含む。ＳＨＡＲＰ上のＳＭＲＴ結合部位は、ＳＰＯＣ（ＳｐｅｎパラログおよびオルソログＣ末端）ドメインと呼ばれるａａ残基３４９６〜３６６４を含む。部位特異的突然変異誘発研究は、ＳＭＲＴへの結合および転写サイレンシング活性に関して、ＳＰＯＣ残基について報告されている。例えば、ＳＰＯＣドメイン残基Ｋ３５１６、Ｋ３６０６、Ｒ３５４８、およびＬ３５１５は、操作時にＳＭＲＴへの結合を減少させる脆弱な残基である。さらに、リン酸化も、ＳＭＲＴとＳＨＡＲＰのＳＰＯＣドメインとの結合に必要とされる。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Mikami et al., 2014, Structure, 22: 35-46を参照。）

本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、抗体、ナノボディ、アプタマー、ペプチド、またはＳＭＲＴとＳＨＡＲＰとの、もしくはＳＭＲＴとＨＤＡＣ３との相互作用を妨害する小分子阻害剤を用いて、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体中のＳＭＲＴタンパク質の活性を阻止することを含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＲＴタンパク質の標的化は、ＳＨＡＲＰに対する結合部位またはＨＤＡＣ３に対する結合部位を標的化することを含む。ＳＭＲＴ上のＳＨＡＲＰ結合部位は、アミノ酸２５１８〜２５２５を含む。ＳＭＡＲＴの残基２５１８〜２５２５とＳＨＡＲＰのＳＰＯＣドメインとの結合は、前出のMikami et al., 2014に記載されているようにリン酸化に依存する。ＳＭＲＴ上のＨＤＡＣ３結合部位は、ａａ残基３９５〜４８９にあり、デアクチラーゼ活性化ドメイン（ＤＡＤ）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＳＭＲＴタンパク質は、小分子阻害剤三酸化ヒ素により標的化される。

本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、抗体、ナノボディ、アプタマー、ペプチド、またはＨＤＡＣ３とＳＭＲＴとの結合を妨害もしくは阻止するか、もしくはＨＤＡＣ３の脱アセチル化活性を消失させる小分子阻害剤を用いて、ＨＤＡＣ３タンパク質を標的化し、それによりＨＤＡＣ３がクロマチンを脱アセチル化し、転写をサイレンシングするように作用することを防止することを含む。ＨＤＡＣ３中の４２８アミノ酸残基のうち、ＨＤＡＣ３の活性は、残基１〜３７９内に包含されていると報告されている。残基Ｈｉｓ１７、Ｌｙｓ２５、Ａｒｇ２６５、およびＡｒｇ３０１は、正電荷を帯びたポケットを作る。ＨＤＡＣ３の結合およびコンフォメーションの解析は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Abdelkarim et al., 2013, ACS Chem Biol., doi:10.1021/cb400601gに記載されている。ＨＤＡＣ３は、クラスＩおよびクラスＩＩの両方のＨＤＡＣタンパク質を標的とする汎ＨＤＡＣ阻害剤で阻害され得る。しかしながら、図６Ａ〜６Ｂに示されているように、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２の阻害は、Ｘｉｓｔ遺伝子サイレンシングを阻止しない。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性遺伝子サイレンシングの阻止は、クラスＩＨＤＡＣ阻害剤またはＨＤＡＣ３特異的阻害剤による阻害を含む。

ＨＤＡＣ３の小分子阻害剤の非限定的な例として、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、スクリプタイド（Scriptaid）、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、ＣＵＤＣ−９０７、キシノスタット（Quisinostat）、ＲＧ２８３３、ＰＣＩ−２４７８１、ＣＵＤＣ−１０１、プラシノスタット（Pracinostat）、レスミノスタット（Resminostat）、ロシリノスタット（Rocilinostat）、４ＳＣ−２０２、モセチノスタット（Mocetinostat）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、および酪酸が挙げられる。図７Ａ〜７Ｂに示されているように、沈黙化Ｘ遺伝子を有するマウスリンパ繊維芽（ＭＬＦ）細胞をＨＤＡＣ３阻害剤であるスクリプタイド（Scriptaid）と共にインキュベートした結果、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡのレベルによって測定して、Ｇｐｃ４の発現がもたらされた。
Ｘｉｓｔ媒介沈黙化遺伝子の再活性化

本発明のいくつかの実施形態において、１以上のＸｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子または沈黙化Ｘｉｓｔ依存性常染色体遺伝子の発現を再活性化する方法は、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体中の直接的な相互作用のいずれか一つを阻止し、それによりＸｉｓｔ媒介遺伝子サイレンシングを阻害することを含む。図７Ａ〜７Ｂに示されているように、沈黙化Ｘ遺伝子を有するマウスリンパ繊維芽（ＭＬＦ）細胞をＨＤＡＣ３阻害剤であるスクリプタイド（Scriptaid）（黒色の棒）と共にインキュベートした結果、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡのレベルによって測定して、Ｘｉｓｔ依存性沈黙Ｇｐｃ４遺伝子の再活性化がもたらされた。

本発明のいくつかの実施形態において、Ｘｉｓｔ依存性沈黙化遺伝子の再活性化は、ＤＮＡメチル化を阻害することと組み合わせて、Ｘｉｓｔサイレンシング複合体中の直接的な相互作用のいずれか一つを阻止することを含む。例えば、ＭＬＦ細胞に、ＨＤＡＣ３阻害剤であるスクリプタイド（Scriptaid）またはトリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）（ＴＳＡ）のいずれかを、ＤＮＡ（シトシン−５−）メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）阻害剤である５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−２’−ｄｃ）、ＲＧ１０８、またはＳＧＩ−１０２７のうちの１つと組み合わせて投与する。図７Ａ〜７Ｂにおいて示されているように、沈黙化Ｘ染色体遺伝子Ｇｐｃ４は、スクリプタイド（Scriptaid）単独よりも高いレベルの再活性化へと（すなわち、高レベルのＧｐｃ４ｍＲＮＡを有するように）再活性化された。図７Ｃ〜７Ｄに示されているように、Ｘ染色体遺伝子Ｇｐｃ４、Ａｔｒｘ、およびＭｅｃｐ２は、ＨＤＡＣ３阻害剤およびＤＮＭＴ１阻害剤を投与されたＭＬＦ細胞において再活性化されたが、ＳＨＡＲＰ常染色体遺伝子は影響を受けないままであった。

図７Ｅに関連して、沈黙化Ｘ染色体を有するＭＬＦ細胞を、２μＭのＳＡＨＡ、３μＭのＲＧＦＰ９６６、３００ｎＭのＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、３００ｎＭのＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（abexinostate））、４００ｎＭのＣＵＤＣ−１０１、１００ｎＭのレスミノスタット（Resminostat）、１０μＭのモセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、５μＭのＨＰＯＢ（４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル]−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−フェニル−ベンゼンアセトアミド）、２μｍのエンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、２μＭのドロキシノスタット（Droxinostat）、２μＭの４ＳＣ−２０２、５μＭのトリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、１００ｎＭのロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、１００ｎＭのキシノスタット（Quisinostat）（ＪＮＪ−２６４８１５８５）、または１μＭのプラシノスタット（Pracinostat）（ＳＢ９３９）と共にインキュベートした後のＧｐｃ４遺伝子の再活性化についてアッセイした。図７Ｅの表に示されているように、キシノスタット（Quisinostat）およびプラシノスタット（Pracinostat）は両方とも細胞毒性であり、細胞死を引き起こした。大部分の細胞において細胞死を誘導しなかった他の列挙されている無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤については、Ｘ連鎖Ｇｐｃ４遺伝子の発現によって測定したＸ再活性化の増加倍率は、表に示されている通りである。したがって、沈黙化Ｘ染色体遺伝子を活性化する方法は、沈黙化Ｘ染色体を有する（インビトロまたは対象内の）細胞に、本明細書に開示されている無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤を、ＤＮＡメチル化阻害剤（例えば、ＤＮＭＴ１の阻害剤）と同時に投与する。

いくつかの実施形態において、再活性化組成物には、沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化することができるＸｉｓｔ複合体の１以上の阻害剤を含む組成物が含まれる。例えば、再活性化組成物は、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態において、再活性化組成物は、無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、再活性化組成物は、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（abexinostate））、ＣＵＤＣ−１０１、レスミノスタット（Resminostat）、モセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、４ＳＣ−２０２、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、ロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、またはそれらの組み合わせから選択される無毒性ＨＤＡＣ阻害剤を含む。

本発明の実施形態によれば、沈黙化Ｘ染色体を含むヒト線維芽細胞を再活性化組成物（ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２’−ｄｃ）および無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６））で同時処理すると、ヒト線維芽細胞においてＸ染色体の活性化（または再活性化）がもたらされる。図７Ｆのグラフは、１つのＰＧＫ１遺伝子座（青色で表示）と比較した活性ＰＧＫ１遺伝子座（オレンジ色で表示）によって測定した再活性化ヒト線維芽細胞のパーセンテージを示す。示されているように、７日間にわたる処理の増加は、再活性化の増加をもたらした。図７Ｇのグラフは、ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２’−ｄｃ）および無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６）で同時処理した後の沈黙化Ｘ染色体を有するヒト線維芽細胞におけるＸ連鎖ＭｅＣＰ２の相対的発現を示す。

いくつかの実施形態において、沈黙化Ｘ染色体を有するマウス有糸***後神経細胞を再活性化組成物（ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２’−ｄｃ）および無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６））で同時処理すると、マウス有糸***後神経細胞においてＸ染色体の活性化がもたらされる。図７Ｈのグラフは、青色で表示されている１つのＰＧＫ１遺伝子座と比較した活性ＰＧＫ１遺伝子座（オレンジ色で表示）によって測定した再活性化マウス有糸***後神経細胞のパーセンテージを示す。図７Ｉのグラフは、再活性化組成物（ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２’−ｄｃ）および無細胞毒性ＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６））で同時処理した後の雄性神経細胞に対して正規化した雌性神経細胞におけるＸ連鎖ＭｅＣＰ２の相対的発現を示す。

いくつかの実施形態によれば、沈黙化Ｘ染色体を有するヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来神経細胞を再活性化組成物（ＤＮＭＴ１阻害剤（５−アザ−２’−ｄｃ）およびＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡまたはＲＧＦＰ９６６））で同時処理すると、ヒトｉＰＳ由来神経細胞においてＸ染色体の活性化がもたらされる。この活性化または再活性化は、ＰＧＫ１およびＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの染色により、図７Ｊに示されている。図７Ｋのグラフは、再活性化されていない神経細胞に対する、図７Ｊの再活性化された（活性ＰＧＫ１遺伝子座）ｉＰＳ神経細胞のＭｅＣＰ２ｍＲＮＡの比を定量する。

以下の実施例は、単に説明目的で提示されており、本願の範囲または内容を限定するものではない。

その内容全体が参照により本明細書に援用されるMcHugh et al., 2015, Nature, 521:232-236に引用されている参考文献を参照する。
実施例１．Ｘｉｓｔ複合体を精製するためのＲＮＡアンチセンス精製（ＲＡＰ）法

生体内で特定のｌｎｃＲＮＡと直接的に相互作用するタンパク質を同定するための方法を開発するために、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Engreitz et al., 2013, Science, doi:10.1126/science.1237973に記載されているＲＮＡアンチセンス精製（ＲＡＰ）法を修正して、ｌｎｃＲＮＡ複合体を精製し、定量的質量分析（ＲＡＰ−ＭＳ）により相互作用するタンパク質を同定した（図８）。簡潔には、ＲＡＰ−ＭＳは、ＵＶ架橋を用いて、直接的に相互作用するＲＮＡとタンパク質との間に共有結合を作り出し、変性条件下でｌｎｃＲＮＡを精製して、非共有相互作用を破壊する。ＣＬＩＰなどの方法によって利用されるこのＵＶ架橋および変性のアプローチは、直接的なＲＮＡ−タンパク質相互作用のみを同定すること、および細胞内で架橋される相互作用を溶液中で単に会合する相互作用から分離することが知られている。

このＵＶ架橋および変性のアプローチを特定のｌｎｃＲＮＡの精製を可能にするように適合させることは、以下のいくつかの理由から困難である。（ｉ）変性条件下でｌｎｃＲＮＡ複合体を精製するために、厳しい変性条件に耐えることができるＲＮＡ捕捉方法が必要とされた。（ｉｉ）核酸とは異なり、タンパク質を検出前に増幅することができないため、所与のｌｎｃＲＮＡに関連するタンパク質を検出するために、ｌｎｃＲＮＡ複合体の高い精製収率が必要とされた。（ｉｉｉ）個々のＲＮＡは全細胞ＲＮＡのうちの非常に低いパーセンテージで存在する可能性があるため、特定の相互作用タンパク質を同定するために、高レベルの濃縮が必要とされる。（ｉｖ）バックグラウンドタンパク質の数が多くなるため、濃縮後でさえも、特定のｌｎｃＲＮＡ相互作用タンパク質を検出するためのタンパク質定量化に、正確かつ高感度の方法が必要である。

ＲＡＰ−ＭＳ法は、以下の理由でこれらの課題に対処する。（ｉ）ＲＡＰは、非常に安定なＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する、長鎖ビオチン化アンチセンスプローブを使用し、そのため、変性および還元条件（すなわち、６７℃で４Ｍの尿素，Methods）でｌｎｃＲＮＡ複合体を精製するために使用することができる。（ｉｉ）ＲＡＰ法は、内因性ＲＮＡ複合体を高収率で得るために最適化された。前出のEngreitz et al., 2013は、内因性ＲＮＡ複合体の２％未満の収率を達成したが、ハイブリダイゼーション、洗浄、および溶出条件を最適化することによって、約７０％の収率が得られた（図９Ａ）。（ｉｉｉ）最適化した条件を用いて、以前に達成された我々のすでに高いレベルの濃縮（約１００倍）と比較して、標的ｌｎｃＲＮＡ複合体の濃縮レベルが増加した（約５，０００倍，図９Ｂ）。（ｉｖ）高感度の定量化の達成と、特定のタンパク質とバックグラウンドタンパク質との区別のために、培養物中のアミノ酸による安定同位体標識（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Culture）（ＳＩＬＡＣ）を使用してタンパク質を標識した（図９Ｃ）。これにより、質量分析による精製タンパク質の定量的比較が可能になる。

ＲＡＰ−ＭＳアプローチを、２つの充分に特徴付けられている非コードＲＮＡと相互作用するタンパク質：Ｕ１（スプライセオソームのコア成分）および１８Ｓ（リボソーム小サブユニットの成分）を明らかにすることによって検証した。Ｕ１精製において、９種の濃縮タンパク質を同定したが、それらは全てＵ１と相互作用することが知られている。１８Ｓ精製において、１０５種の濃縮タンパク質を同定したが、これらのうち９８種（９３％）が、以前に、リボソームタンパク質、リボソームプロセシングおよびアセンブリ因子、翻訳調節因子、または他の公知のリボソーム相互作用因子として特徴付けられていた（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ）。特に、３１種の公知のリボソーム小サブユニットタンパク質のうち２１種を同定した。数種の同定されていないタンパク質は、主に以下の２つのカテゴリーに分類されると考えられる。（ｉ）ＲＮＡと直接接触することがほとんどないタンパク質、および（ｉｉ）質量分析によって検出し得るペプチドをほとんど含まない小タンパク質。これらの結果は、ＲＡＰ−ＭＳ法が公知のＲＮＡ相互作用タンパク質の大部分を同定すること、およびＲＡＰ−ＭＳによって同定されたタンパク質が精製ｎｃＲＮＡ複合体に対する特異性が高いことを実証している。

ＸＣＩの開始中にＸｉｓｔと相互作用するタンパク質を明らかにするために、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、Ｘｉｓｔ誘導後にＵＶ架橋ＳＩＬＡＣ標識し、核抽出物中のＸｉｓｔを精製した。バックグラウンドタンパク質またはいずれの核ＲＮＡとも相互作用し得る非特異的タンパク質を制御するために、Ｘｉｓｔと同じタンパク質と相互作用するとは考えられない、充分な量のＵ１ｓｎＲＮＡを精製した。各サンプル中のタンパク質を液体クロマトグラフィー−質量分析法を使用して同定し、ＸｉｓｔまたはＵ１精製に由来する全ての重いペプチドまたは軽いペプチドの強度に基づいて各タンパク質についてのＳＩＬＡＣ比を計算した（図８）。

Ｕ１と比較してＸｉｓｔが濃縮された１０種のタンパク質が同定された（ＳＩＬＡＣ比＞３倍，図１１Ａ）。１０種のタンパク質の全てが、独立した生体サンプルからの複数のＸｉｓｔ精製物において再現性よく濃縮された。これらのタンパク質が直接的なＸｉｓｔ相互作用タンパク質であるという見解と一致して、９つのタンパク質は、充分に特徴付けられているＲＮＡ結合ドメインを含む（図１１Ｂ）。
実施例２．Ｘｉｓｔ相互作用タンパク質の同定

同定されたＸｉｓｔ相互作用タンパク質は、ＳＨＡＲＰ、Ｒｂｍ１５、Ｍｙｅｆ２、Ｃｅｌｆ１、ｈｎＲＮＰＣ、ＬＢＲ、ＳＡＦ−Ａ、Ｒａｌｙ、ｈｎＲＮＰＭ、およびＰｔｂｐ１である（図１１Ａ）。ＳＡＦ−Ａ（スキャフォールド付着因子−Ａ，ｈｎＲＮＰＵとも呼ばれる）は、Ｘｉｓｔと直接的に相互作用することが以前に示されており、分化細胞において不活性Ｘ染色体にＸｉｓｔを係留するために必要とされる。また、これらのタンパク質のうちの５つは、転写抑制、クロマチン調節、および核構成に関与するとこれまでされていた。これらには、クロマチン上のＨＤＡＣ３脱アセチル化活性と相互作用し活性化することが知られている、核コリプレッサー複合体のＳＭＲＴ成分（ＮＣｏＲ−２とも呼ばれる）と直接的に相互作用する、転写リプレッサーのＳＰＥＮファミリーのメンバーである、ＳＨＡＲＰ（ＳＭＲＴおよびＨＤＡＣ関連リプレッサータンパク質，ＳＰＥＮとも呼ばれる）が含まれる（図１１Ｂ）。興味深いことに、転写リプレッサーのＳＰＥＮファミリーの別のメンバーであるＲＢＭ１５も同定された。ＲＢＭ１５は、ＳＨＡＲＰと同じドメイン構造を共有するが、発生中に明確な機能的役割を有すると考えられる。Ｍｙｅｆ２は、その調節機構は依然として知られていないが、複数の細胞型において転写の負の調節因子として機能することが示されている。ｈｎＲＮＰＭはＭｙｅｆ２のパラログである。最後に、核内膜に係留され、抑制性クロマチン調節タンパク質およびラミンＢと相互作用するタンパク質であるＬＢＲ（ラミンＢ受容体）も同定された（図１１Ｂ）。

同定されたＸｉｓｔ相互作用タンパク質の特異性を以下のように確認した。（ｉ）Ｘｉｓｔ相互作用タンパク質が非特異的ＲＮＡまたはタンパク質捕捉によるものではないことを確かめるために、ＲＡＰを非誘導細胞（Ｘｉｓｔなし）で実施し、濃縮されないタンパク質を同定した。（ｉｉ）これらのタンパク質が細胞内でＸｉｓｔと架橋され、溶液中で単に会合はしないことを確かめるために、架橋されていない（ＵＶなし）細胞でＲＡＰを行い、濃縮されないタンパク質を同定した。（ｉｉｉ）これらのタンパク質が核で濃縮された長鎖ｎｃＲＮＡと単に相互作用するのではないことを確かめるために、Ｘｉｓｔ精製タンパク質を４５Ｓ（プレ−リボソームＲＮＡ）で精製されたタンパク質と比較し、１０種のＸｉｓｔ相互作用タンパク質全てがやはり濃縮されていたことが分かった。（ｉｖ）これらの相互作用を独立して検証するために、１０種のタンパク質のうちの８種（Ｐｔｂｐ１、ｈｎＲＮＰＣ、Ｃｅｌｆ１、Ｍｙｅｆ２、Ｒｂｍ１５、ＬＢＲ、Ｒａｌｙ、およびＳＨＡＲＰ）について高品質親和性試薬を得、ＵＶ架橋溶解物中の同定されたタンパク質を免疫沈降させた。全ての場合において、ＸｉｓｔＲＮＡでは強い濃縮（＞４倍）が観察されたが、コントロールｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡでは強い濃縮は観察されなかった（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、および表１）。

まとめると、これらの結果は、ＸＣＩの開始中にＸｉｓｔと直接的に相互作用する、特異性が高く、再現性のある一組のタンパク質を同定するものである。ＲＡＰ−ＭＳアプローチの汎用性を考慮すると、他のｌｎｃＲＮＡと直接的に相互作用するタンパク質を明らかにするために、ＲＡＰ−ＭＳアプローチは広く適用可能であると予想された。

実施例３．必要なＸｉｓｔサイレンシング複合体成分の同定
どのタンパク質がＸｉｓｔ媒介転写型サイレンシングに必要とされるかを決定するために、同定されたタンパク質の各々をノックダウンし、Ｘｉｓｔ発現を誘導したときに、Ｘ染色体上の遺伝子発現のサイレンシングが起こらないことについてアッセイした（図２）。

具体的には、Ｘｉｓｔ発現の非存在下でよく発現されるが、雄性細胞内の我々のドキシサイクリン誘導系で１６時間のＸｉｓｔ誘導によって通常サイレンシングされる、２つのＸ連鎖遺伝子、Ｇｐｃ４およびＡｔｒｘを選択した（図５Ｂ）。ｓｉＲＮＡを用いて、いくつかのネガティブコントロールと共に、ＲＡＰ−ＭＳによって同定された各タンパク質のｍＲＮＡレベルをノックダウンした（表２）。試験した各細胞がｓｉＲＮＡ標的化ｍＲＮＡの成功裏の減少（＞７０％の低減）とＸｉｓｔ発現の誘導との両方を示したことを確かめるために、一分子ＲＮＡＦＩＳＨ（Methods）を使用した。これらの各細胞内で、Ｘｉｓｔ誘導前（−ｄｏｘ）およびＸｉｓｔ誘導後（＋ｄｏｘ）の２つのＸ連鎖遺伝子の各々についてｍＲＮＡレベルを定量した。

コントロールとして、いくつかの非標的指向性ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。これらのネガティブコントロールにおいて、研究したＸ連鎖遺伝子の予想したサイレンシング（Ｇｐｃ４発現は細胞あたり平均２０コピー（−ｄｏｘ）から２コピー（＋ｄｏｘ）に減少し、Ａｔｒｘ発現は細胞あたり２２から３コピーに減少した；図５Ａ〜５Ｂ）が観察された。以前の観察と一致して、ＥＥＤ、ＰＲＣ２の必要な成分（図５Ａ）、または転写型サイレンシングに必要とされるとは考えられない、以前にＸｉｓｔと関連づけられている他のタンパク質をノックダウンしたときに、Ｘ染色体遺伝子サイレンシングに対する効果は見られなかった（図１３Ｃ〜図１３Ｄ）。同様に、Ｒｂｍ１５、Ｍｙｅｆ２、Ｐｔｂｐ１、Ｃｅｌｆ１、ｈｎＲＮＰＣ、Ｒａｌｙ、またはｈｎＲＮＰＭのノックダウンは、Ｘ染色体上の遺伝子サイレンシングを変化させなかった（図５Ａ，図６Ａ〜６Ｂ）。

対照的に、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−Ａのノックダウンは、Ｘｉｓｔ誘導後にＸ染色体遺伝子のサイレンシングをほとんど消失させた（図５Ａ〜５Ｂ、図６Ａ〜６Ｂ、図１３Ａ〜１３Ｂ）。実際、研究したＸ染色体遺伝子の発現レベルは、Ｘｉｓｔ発現後に有意に変化しなかった（図５Ｂ，図６Ａ〜６Ｂ）。これらの同じサイレンシング欠損が、いくつかの独立したｓｉＲＮＡで観察された（図６Ｃ〜６Ｄ）。注目すべきことに、分化している雌性ＥＳ細胞において、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−Ａをノックダウンしたときに、同じＸ染色体サイレンシング欠損が観察された（図１４Ａ〜１４Ｂ）。

これらの結果は、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、およびＳＡＦ−ＡがＸ染色体のＸｉｓｔ媒介転写型サイレンシングに必要とされることを実証している。残りの７種のＸｉｓｔ相互作用タンパク質は、Ｘ染色体遺伝子サイレンシングに対して効果を示さなかったが、それらは依然としてＸｉｓｔ機能にとって重要であり得る：（ｉ）いくつかは重複した機能を有し得る（例えば、パラログとして知られているＭｙｅｆ２およびｈｎＲＮＰＭ）、（ｉｉ）これらの場合の一部において、ノックダウン後に残っている少量のタンパク質は、依然としてＸｉｓｔ機能に充分であり得る、または（ｉｉｉ）これらのタンパク質のいくつかは、このサイレンシングアッセイによって捉えられないであろう、ＸＣＩの維持などの別のＸｉｓｔ媒介性の役割に重要であり得る。
実施例４．ＳＡＦ−Ａ局在化

ＳＡＦ−Ａが分化細胞におけるクロマチンへのＸｉｓｔ局在化に必要とされるという以前の観察と一致して、ＳＡＦ−Ａをノックダウンしたときに、散在性のＸｉｓｔ局在化パターンが核で観察された（図６Ａ）。このことは、ＳＡＦ−Ａが、ＸＣＩの開始中にＸｉｓｔおよびそのサイレンシングタンパク質をＸ染色体に局在化させることによる転写型サイレンシングに必要とされることを示唆する。
実施例５．ＸｉｓｔおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩの共局在化

Ｘ染色体上の最初にサイレンシングされる区画の確立に関与するタンパク質を決定するために、Ｘｉｓｔ被覆領域からＰｏｌＩＩを排除するためのＳＨＡＲＰまたはＬＢＲの要件を調べた。具体的には、ＸｉｓｔおよびＰｏｌＩＩの共局在化を単一細胞において測定した。１６時間のＸｉｓｔ誘導後の野生型細胞では、Ｘｉｓｔ被覆領域にわたってＰｏｌＩＩの欠乏が観察された（図１５Ａ）。ネガティブコントロールにおいて、およびＥＥＤまたはＬＢＲをノックダウンしたときに、Ｘｉｓｔ被覆領域からのＰｏｌＩＩの同様の排除があった（図１５Ａ〜１５Ｂ）。対照的に、ＳＨＡＲＰをノックダウンしたときには、Ｘｉｓｔ被覆領域にわたって、コントロールサンプルと比較して、より高いレベルのＰｏｌＩＩが観察された（図１５Ｂ）。ＬＢＲまたはＥＥＤではなく、ＳＨＡＲＰが、分化中の雌性ＥＳ細胞におけるＰｏｌＩＩ排除に同様に必要とされることが確認された（図１５Ｃ，図１６）。

これらの結果は、ＳＨＡＲＰが不活性Ｘ染色体上でＰｏｌＩＩを排除するために必要とされ、Ｘｉｓｔ局在化の際に最初にサイレンシングされる区画を生じさせるために必要とされ得ることを実証している。

Ｘ染色体上のＰｏｌＩＩを排除するために必要とされる直接的なＸｉｓｔ相互作用タンパク質としてＳＨＡＲＰを同定したため、次のステップは、ＳＨＡＲＰがこの役割をどのように果たし得るかを決定することであった。ＳＨＡＲＰは、ＨＤＡＣ３と相互作用することが知られており、生体内でＨＤＡＣ３の脱アセチル化および転写型サイレンシング活性を活性化するために必要とされる、ＳＭＲＴコリプレッサー複合体とのその相互作用に基づいて、哺乳動物において最初に同定された直接的なＲＮＡ結合タンパク質である。これらの以前の観察に基づいて、ＳＨＡＲＰによるＸｉｓｔ媒介転写型サイレンシングは、ＳＭＲＴおよびＨＤＡＣ３のサイレンシング機能を介して起こると仮定した。

この仮説を試験するために、ＳＭＲＴまたはＨＤＡＣ３のいずれかをノックダウンし、Ｘ染色体遺伝子の発現をＸｉｓｔを誘導して測定した。雄性および雌性ＥＳ細胞両方におけるＳＭＲＴまたはＨＤＡＣ３のノックダウンは、Ｘｉｓｔ発現を誘導したときに、Ｘ染色体遺伝子のサイレンシングを抑制した（図５Ａ，図６Ａ〜６Ｄ，図１４Ａ〜１４Ｂ）。観察されたサイレンシング欠損がＨＤＡＣ３に特異的であり、他のクラスＩＨＤＡＣタンパク質には特異的ではないことを確かめるために、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２をノックダウンしたが、遺伝子サイレンシングに対する効果（図６Ａ〜６Ｂ）は、観察されなかった。これらの結果の特異性をさらに確認するために、独立したｓｉＲＮＡを使用してＳＭＲＴまたはＨＤＡＣ３をノックダウンし、全ての場合において、同様のサイレンシング欠損を同定した（図６Ｃ〜６Ｄ）。

この効果がＳＨＡＲＰのノックダウンまたは転写型サイレンシングにおける明確な欠損によって生じる効果と同様であるのかどうかを決定するために、この複合体におけるサイレンシングタンパク質であるＨＤＡＣ３が、Ｘｉｓｔ被覆領域からのＲＮＡＰｏｌＩＩの排除に必要とされるかどうかを試験した。雄性および雌性ＥＳ細胞両方におけるＨＤＡＣ３のノックダウンは、Ｘｉｓｔ被覆区画からのＲＮＡＰｏｌＩＩの排除を、ＳＨＡＲＰのノックダウンについて見られた程度と同程度に解消することが分かった（図１５Ａ〜１５Ｃ，図１６）。

これらの結果は、ＳＨＡＲＰがＳＭＲＴおよびＨＤＡＣ３サイレンシングタンパク質を介して転写をサイレンシングすることを示唆する。Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングにおけるＨＤＡＣ３のこの役割は、ＸＣＩの開始時に起こるまさに最初の事象の１つとして、Ｘ染色体全体に対する全体的なハイポアセチル化が長期にわたり見られることを説明するであろう。
実施例６．ＳＨＡＲＰの追加のキャラクタリゼーション

ＰｏｌＩＩ排除におけるＳＨＡＲＰの重要な役割を同定したため、ＳＨＡＲＰの機能的重要性のさらなる確証を調べた。（ｉ）ＸＣＩの誘導中の異なる時点でサイレンシングされる３つのさらなる遺伝子（Ｒｂｍｘ、ＭｅＣＰ２、およびＳｍｃ１ａ）を選択することによって、ＳＨＡＲＰがさらなるＸ染色体遺伝子をサイレンシングするために必要とされることを確認した。ＳＨＡＲＰのノックダウンは、３つのさらなるＸ染色体遺伝子全てのサイレンシングを消失させた。対照的に、ＳＨＡＲＰのノックダウンは、ＸＣＩ１１を回避することが知られている２つのＸ染色体遺伝子（Ｍｉｄ１およびＰｉｒ）の発現に影響を及ぼさなかった（図１３Ａ〜３Ｂ）。（ｉｉ）ＳＨＡＲＰが、分化中の雌性ＥＳ細胞において、同様にＸｉｓｔと相互作用することを確認した。この確認を行うために、ＵＶ架橋レチノイン酸（ＲＡ）処理雌性ＥＳ細胞の溶解物からＳＨＡＲＰを精製し、ＩｇＧ中のレベルと比較して、強い濃縮（＞４５倍）がＸｉｓｔについては同定されたが、Ｎｅａｔ１または４５Ｓについては同定されなかった（＜１倍）（図１２Ｂ）。（ｉｉｉ）分化中の雌性ＥＳ細胞におけるＰｏｌＩＩ排除には、ＬＢＲではなく、ＳＨＡＲＰが同様に必要とされることを確認した。ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、およびいくつかのコントロールを雌性ＥＳ細胞でノックダウンし、ＲＡ処理によってＸｉｓｔ発現を誘導し、ＳＨＡＲＰをノックダウンしたところ、Ｘｉｓｔ被覆領域でより高いレベルのＰｏｌＩＩ局在化が同定されたが、他のタンパク質では同定されなかった（図１５Ｃ，図１６）。

ＳＨＡＲＰおよびＨＤＡＣ３がＰＲＣ２の動員に必要とされることは明らかであるが、これが直接的動員によるものか間接的動員によるものかは不明のままである。以前の研究は、いくつかの推定機序を示唆している：（ｉ）ＰｏｌＩＩ排除は、他の状況ではＰＲＣ２動員を誘発するのに充分であることが示されており、ＳＨＡＲＰはＸ染色体上のＰｏｌＩＩ排除に必要とされるため、ＳＨＡＲＰはＰＲＣ２動員を間接的にもたらし得る。（ｉｉ）以前の研究は、ＰＲＣ２複合体が様々なＨＤＡＣ複合体と相互作用することができ、そのため、ＰＲＣ２はＨＤＡＣ３複合体を介してＸｉｓｔによって直接動員され得ることを示している。（ｉｉｉ）ＨＤＡＣ３はクロマチン凝縮をもたらすことができ、ＨＤＡＣ３はＰＲＣ２動員を間接的に導き得るため、クロマチン凝縮は、ＰＲＣ２動員を媒介するのに充分であることが示されている。（ｉｖ）ＳＨＡＲＰは、ＰＲＣ２およびＨＤＡＣ３複合体を含むいくつかのクロマチン調節複合体の成分であるＲｂＡｐ４８１５とインビトロで相互作用することが示されており、したがって、Ｘｉｓｔは、ＳＨＡＲＰまたはＨＤＡＣ３とＲｂＡｐ４８およびＰＲＣ２複合体との間の相互作用を介して、ＰＲＣ２を直接的に動員し得る。
実施例７．ＰＲＣ２の動員

ＸＣＩの特徴の１つは、Ｘｉｓｔ依存的な様式でのＸ染色体にわたるＰＲＣ２動員、およびそれに関連するＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制性クロマチン修飾である。ＰＲＣ２はＸＣＩの開始には必要とされないが（図１５Ｂ）、ＰＲＣ２またはＰＲＣ２関連Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抑制性クロマチン修飾は、エピジェネティックにサイレンシングされた状態を確立することに関与している可能性がある。しかし、どのようにしてＸｉｓｔがＸ染色体にわたってＰＲＣ２複合体を動員するかは分かっていない。ＲＡＰ−ＭＳによってＰＲＣ２成分が全く同定されておらず、様々なＨＤＡＣ複合体がＰＲＣ２を動員することが知られているため、ＰＲＣ２動員はＳＨＡＲＰおよびＨＤＡＣ３により媒介されると仮定した。

この仮説を検証するために、Ｘｉｓｔ被覆領域へのＰＲＣ２の動員を調べた。野生型細胞では、１６時間の誘導後に、Ｘｉｓｔ被覆領域にわたって、ＥＺＨ２（ＰＲＣ２の成分）の強い濃縮が観察された（図１７Ａ）。クロマチンへのＰＲＣ２複合体の適切な局在化に必要とされるＰＲＣ２複合体の異なる成分であるＥＥＤをノックダウンすると、この同じ時点で、ＸｉｓｔクラウドにわたるＥＺＨ２の濃縮は観察されなかった（図１７Ａ）。同様に、ＳＨＡＲＰをノックダウンすると、ＥＥＤの非存在下で観察された程度と同程度のＥＺＨ２の喪失がＸｉｓｔ被覆領域にわたって同定された（図１７Ａ）。逆に、ＬＢＲをノックダウンすると、野生型条件下での動員のレベルと同程度のＥＺＨ２の強い濃縮が、Ｘｉｓｔ被覆領域にわたって観察された（図１７Ｂ）。ＨＤＡＣ３がＰＲＣ２動員に必要とされるかどうかを決定するために、ＨＤＡＣ３をノックダウンし、ＳＨＡＲＰの喪失時に観察された程度と同程度の（図１７Ｂ）ＰＲＣ２動員の喪失が観察された（図１７Ａ）。ＳＨＡＲＰまたはＨＤＡＣ３のノックダウンは、雌性ＥＳ細胞において同じＰＲＣ２動員欠損をもたらした（図１７Ｃ，図１８）。

これらの結果は、Ｘ染色体にわたるＰＲＣ２のＸｉｓｔ媒介動員がＳＨＡＲＰおよびＨＤＡＣ３に依存することを示す。これがＳＨＡＲＰまたはＨＤＡＣ３との相互作用（直接的動員）によって起こるのか、またはＨＤＡＣ３が誘導するサイレンシングされた転写状態、クロマチン修飾、もしくは凝縮クロマチン構造（間接的動員）に起因するのかは、不明なままである。さらに、結果は、ＥＺＨ２とＸｉｓｔのＡリピートとの間の直接的相互作用を介してＰＲＣ２が動員されるという以前のモデルとは対照的である。このＰＲＣ２−Ｘｉｓｔ相互作用の証拠は、非変性条件におけるインビトロでの結合および精製に基づいている。最近では、ＰＲＣ２がこれらの条件下では細菌ＲＮＡを含む多くのＲＮＡに無差別に結合すると考えられるため、この相互作用の特異性が疑問視されている。むしろ、ここでの結果は、Ａリピートの欠失は、ＳＨＡＲＰまたはＨＤＡＣ３のノックダウンとは異なり、Ｘｉｓｔ被覆領域へのＰＲＣ２動員に有意な影響を及ぼさないという報告と一致している（図１７Ｂ）。

まとめると、本明細書のデータは、どのようにＸｉｓｔがＸ染色体上の転写型サイレンシングを調整することができるかについてのモデルを示唆している（図１Ａ）。Ｘｉｓｔ発現が開始されると、Ｘｉｓｔは、クロマチンと直接相互作用することが知られている、ＳＡＦ−Ａタンパク質に結合することによって、Ｘ染色体上の部位に局在化することができる。Ｘｉｓｔは、ＳＨＡＲＰと直接的に相互作用して、不活性Ｘ染色体にわたって、これらのＤＮＡ部位にＳＭＲＴを動員する。このＸｉｓｔ−ＳＨＡＲＰ−ＳＭＲＴ複合体は、ＨＤＡＣ３をＸ染色体に直接的に動員するか、またはＸ染色体にわたる活性遺伝子にすでに存在し得るＨＤＡＣ３の酵素活性を誘導するように作用し得る。ＨＤＡＣ３を介して、Ｘｉｓｔは、クロマチン上の活性化ヒストンアセチル化マークの除去を指示し、それによってクロマチンを凝縮させ、転写をサイレンシングすることができる。サイレンシングされた状態を開始すると、Ｘｉｓｔは、ＰＲＣ２とＨＤＡＣ３との間の直接的相互作用を介して、またはＨＤＡＣ３誘導転写型サイレンシングもしくはクロマチン凝縮を介して間接的に、Ｘ染色体にわたってＰＲＣ２をＨＤＡＣ３依存的な様式で動員する。このように、同じＸｉｓｔ相互作用タンパク質は、ＸＣＩにおける２つの本質的な役割−転写サイレンサー（ＨＤＡＣ３）を動員することによって不活性状態を開始すること、および安定なエピジェネティックサイレンサー（ＰＲＣ２）を動員することによって不活性状態を維持することを達成し得る。ＲＡＰ−ＭＳは、Ｘｉｓｔを超えて、これまでつかみどころのないことが分かっていた新規なｌｎｃＲＮＡ機序の発見を加速するであろう、重要なツールを提供する。
実施例８．実施例１〜７の材料および方法

マウスＥＳ細胞培養．全てのマウスＥＳ細胞株を無血清２ｉ／ＬＩＦ培地中で培養した。以下の細胞株を用いた：（ｉ）野生型雄性ＥＳ細胞（Ｖ６．５株）；（ｉｉ）前出のEngreitz et al.に記載されている、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下の内因性遺伝子座からＸｉｓｔを発現する雄性ＥＳ細胞（ｐＳＭ３３ＥＳ細胞株）。（ｉｉｉ）ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下のＨｐｒｔ遺伝子座に組み込まれたＡリピートを含まないｃＤＮＡＸｉｓｔ導入遺伝子を有する雄性ＥＳ細胞（Ａリピート欠失：A. Wutzにより親切にも提供された）。（ｉｖ）雌性ＥＳ細胞（Ｆ１２−１株）。この野生型雌性マウスＥＳ細胞株は、前出のEngreitz et al.に以前に記載されている、１２９×クリイロ（castaneous）Ｆ１マウス交雑由来である。

Ｘｉｓｔ誘導．Ｄｏｘ誘導性細胞（ｐＳＭ３３およびＡリピート欠失）については、用途に基づいて６時間、１６時間、または２４時間、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma）で細胞を処理することによってＸｉｓｔ発現を誘導した。雌性ＥＳ細胞（Ｆ１２−１株）については、分化を誘導することによってＸｉｓｔ発現を誘導した；２ｉを２４時間ＭＥＦ培地（ＤＭＥＭ，１０％Gemini Benchmark ＦＢＳ，１×Ｌ−グルタミン，１×ＮＥＡＡ，１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；特記がないものはLife Technologies）と交換し、続いて１μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Sigma）でさらに２４時間処理した。

ＸｉｓｔＲＮＡの量を、ドキシサイクリン誘導細胞（６時間の誘導）および分化中の雌性ＥＳ細胞（２４時間の誘導）の両方において、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。このレベルを、両方の細胞集団において、様々なＲＮＡハウスキーピングコントロール、１８Ｓ、２８Ｓ、およびＵ６に対して正規化し、比較Ｃｔ法を用いて雄性細胞と雌性細胞との間の発現倍率の差を計算した。ある範囲の発現が観察され、雄性誘導系は雌性細胞よりも５〜２０倍（平均１２倍）多くのＸｉｓｔを発現した。ただし、雌性ＥＳ細胞系は、Ｘｉｓｔ誘導において不均一であることが知られており、２４時間のレチノイン酸処理後に全ての細胞がＸｉｓｔを同じレベルに誘導するわけではないため、この推定値は実際の差の上限を表す可能性が高い。したがって、雄性誘導系と分化中の雌性ＥＳ細胞との間に予想される実際の差は、実際には著しく低い。正確なレベルを一分子ＦＩＳＨにより比較するのは難しいが、各ＸｉｓｔＲＮＡクラウドのサイズおよび強度は、使用された時点では両方の系で類似している。

雄におけるＸｉｓｔ媒介サイレンシングは、１つの活性Ｘをなおも保持する雌の系におけるＸ染色体転写物のたった５０％の喪失ではなく、Ｘ染色体転写物の１００％の喪失をもたらすため、雄性誘導系は、雌性系と比較して、サイレンシングに影響を及ぼすタンパク質の同定について、より感度が高い。

ＵＶ架橋．細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでSpectrolinker UV Crosslinker中で、２５４ｎｍの０．８ジュール／ｃｍ２のＵＶ（ＵＶ８ｋ）を使用して氷上で架橋した。次いで、細胞を培養皿から掻き取り、ＰＢＳで１回洗浄し、１５００×ｇで４分間の遠心分離によりペレット化し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。

ＳＩＬＡＣＥＳ細胞培養．ＳＩＬＡＣ実験のために、ＥＳ細胞培養手順を、軽い、または重いリジンおよびアルギニンアミノ酸のいずれかを取り込むように適合させた。２ｉ／ＬＩＦＳＩＬＡＣ培地は以下のように構成した：リジンまたはアルギニンを含まないカスタムＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Dundee Cell Products）に、０．３９８ｍＭの重いＡｒｇ１０（Sigma）または非標識のアルギニン（Sigma）のいずれか、および０．７９８ｍＭの重いＬｙｓ８（Cambridge Isotope Labs）または非標識のリジン（Sigma）のいずれか、０．５×Ｂ−２７（Gibco）、２ｍｇ／ｍＬウシインスリン（Sigma）、１．３７μｇ／ｍＬプロゲステロン（Sigma）、５ｍｇ／ｍＬ BSA Fraction V（Gibco）、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール（Sigma）、５ｎｇ／ｍＬマウスＬＩＦ（GlobalStem）、０．１μＭＰＤ０３２５９０１（SelleckChem）、および０．３μＭＣＨＩＲ９９０２１（SelleckChem）を補充した。重い、および軽い両方の２ｉ／ＬＩＦＳＩＬＡＣ培地中の細胞に、標識アルギニンのプロリンへの変換を防ぐために、０．２ｍｇ／ｍＬの非標識プロリン（Sigma）も補充した。各培地を交換して新たに２ｉ阻害剤を添加した。

細胞をＳＩＬＡＣ条件に適応させる．質量分析の前に、ＥＳ細胞を３継代にわたってＳＩＬＡＣ条件に適応させた。重い、または軽い培養培地を細胞密度に応じて２４〜４８時間ごとに交換し、０．０２５％トリプシン（Gibco）を用いて７２時間ごとに細胞を継代し、０．０３８％BSA Fraction V（Gibco）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２でプレートから解離した細胞をすすいだ。細胞を２つの異なる種類の培地中で増殖させた：（ｉ）軽い（非標識）リジンおよびアルギニンを含む２ｉ／ＬＩＦＳＩＬＡＣ培地、または（ｉｉ）重い同位体標識リジンおよびアルギニンを含む２ｉ／ＬＩＦＳＩＬＡＣ培地。

ＳＩＬＡＣ取り込み測定．ｐＳＭ３３細胞におけるＳＩＬＡＣ標識の効率を調べるために、重い２ｉ／ＬＩＦＳＩＬＡＣ培地中での１０日間の増殖（３細胞継代）後に標識アミノ酸の取り込みを試験した。２００万個の細胞のペレットをLDS Sample Loading Buffer（Invitrogen）中で１０分間煮沸し、次いでタンパク質を４〜１２％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。総タンパク質を、Colloidal Coomassie（Invitrogen）で染色し、ゲル切片を清潔なメスで切り取り、ゲル内トリプシン消化のために微量遠心管に移した。タンパク質ジスルフィド結合をＤＴＴで還元し、次いでヨードアセトアミドでアルキル化した。タンパク質をトリプシンで一晩消化し、次いで、１％ギ酸／２％アセトニトリル、１：１アセトニトリル／水、およびアセトニトリル中１％ギ酸で連続的に洗浄することを用いて抽出した。ペプチドを収集し、凍結乾燥し、次いで質量分析（以下で質量スペクトル測定において記載）のために１％ギ酸中に再懸濁した。MaxQuant（以下でＭＳデータ分析において記載）を使用して、質量スペクトルからペプチドを同定した。標識されたアミノ酸の取り込み率は、同定された各ペプチドの重いバージョンと軽いバージョンの強度の比に基づいて計算した。その後のアッセイに使用される細胞では、細胞タンパク質由来のペプチドの９５％超が標識アミノ酸の＞９５％の取り込みを示したことが確認された（図９Ｂ）。
ＲＮＡアフィニティー精製−質量分析（ＲＡＰ−ＭＳ）

プローブ設計および生成．標的ＲＮＡを捕捉するために使用するプローブを作製するために、標的ＲＮＡの全長にわたる９０マーのＤＮＡオリゴヌクレオチド（Eurofins Operon）を設計および合成した。各ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの配列は、相補的標的ＲＮＡ配列に対してアンチセンスであった。また、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ上でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの捕捉を可能にするために、各ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを５’ビオチンで修飾した（後述）。１２０マーのプローブが以前に使用されていたが、９０マーのプローブが、使用した条件で同程度のストリンジェンシーおよび収率を与えることが分かった。Ｘｉｓｔについては、以前に記載されている他の転写産物またはゲノム領域と一致する領域を除いて、成熟ＲＮＡ配列全体を包含する１４２のプローブを使用した。

全細胞溶解物調製．１８ＳおよびＵ１実験のために、以下の方法で調製した全細胞溶解物を使用した。凍結細胞ペレットを氷冷界面活性剤ベース細胞溶解バッファー（１０ｍＭトリスｐＨ７．５，５００ｍＭＬｉＣｌ，０．５％ドデシルマルトシド（ＤＤＭ，Sigma）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，Ambion）、０．１％デオキシコール酸ナトリウム（Sigma））中に完全に再懸濁することによって、２０００万個の細胞のバッチを溶解した。次に、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Protease Inhibitor Cocktail）（Set III、ＥＤＴＡフリー、Calbiochem）および９２０ＵのマウスＲＮアーゼ阻害剤（Murine RNase Inhibitor）（New England Biolabs）を添加し、サンプルを氷上で１０分間インキュベートして溶解を進行させた。このインキュベーション期間中、ペレットを破砕しゲノムＤＮＡを剪断するために、細胞サンプルを１ｍＬシリンジに取り付けられた２６ゲージの針に３〜５回通した。次いで、各サンプルを、５ワットの電力に設定したマイクロチップを備えたBranson Digital Sonifierを用いて、断続的なパルス（０．７秒オン、１．３秒オフ）で合計３０秒間超音波処理した。超音波処理中に、溶解物の過熱を防ぐためにサンプルを冷却した。次に、サンプルを２．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＣａＣｌ２、および２０ＵのTURBO ＤＮアーゼ（Ambion）で３７℃で１０分間処理してＤＮＡを消化した。サンプルを氷に戻し、１０ｍＭＥＤＴＡおよび５ｍＭＥＧＴＡの添加により反応を直ちに停止させた。２．５ｍＭトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の添加によりジスルフィド結合を還元し、次いでサンプルを溶解物の体積の２倍の１．５×ＬｉＣｌ／尿素バッファー（最終１×バッファーは、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭＬｉＣｌ、０．５％ＤＤＭ、０．２％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸、４Ｍ尿素、２．５ｍＭＴＣＥＰを含む）と混合した。溶解物を氷上で１０分間インキュベートし、次いでEppendorf 5424R遠心機で１６，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化した。上清をプールし、液体窒素中で急速凍結して−８０℃で保存した。

核溶解物調製．Ｘｉｓｔ対Ｕ１の比較および４５Ｓ対Ｕ１の比較のために、以下の方法で調製した核溶解物を使用した。凍結ペレットを１ｍＬの溶解バッファー１（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２，２０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭＭｇＣｌ２，０．５ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ），０．５ｍＭＰＭＳＦ）に再懸濁することによって、５，０００万個の細胞のバッチを溶解した。次に、サンプルを３，３００×ｇで１０分間遠心分離して細胞をペレット化した。０．１％ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）を含む１ｍＬの溶解バッファー１中に細胞ペレットを再懸濁し、隙間の狭いペストル（Kontes）を備えたガラス製ダウンス型ホモジナイザーを使用して２０回加圧破砕（dounced）した。加圧破砕（douncing）後に細胞から放出された核を、３，３００×ｇでの遠心分離によりペレット化し、次いで５５０μｌの溶解バッファー２（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍＭＴＣＥＰ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、０．４％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＤＤＭ、および０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ））に再懸濁した。サンプルを氷上で１０分間インキュベートし、次いで、各サンプルを、５ワットの電力でBranson Sonifierを用いて、断続的なパルス（０．７秒オン、３．３秒オフ）で合計１分間超音波処理して、核を溶解し、クロマチンを可溶化した。超音波処理中に、核溶解物の過熱を防ぐためにサンプルを冷却した。次に、サンプルを２．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＣａＣｌ２、および３３０Ｕ TURBO DNase（Ambion）で３７℃で１２分間処理して、クロマチンをさらに可溶化した。ＤＮアーゼ処理後、溶解物を等しい体積の２×ハイブリダイゼーションバッファー（最終１×バッファーは、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭＬｉＣｌ、０．５％ＤＤＭ、０．２％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸、４Ｍ尿素、２．５ｍＭＴＣＥＰを含む）と混合した。最後に、溶解物をEppendorf 5424R遠心機で１６，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化し、得られた上清をプールし、液体窒素中で急速凍結して−８０℃で保存した。

架橋複合体のＲＮＡアフィニティー精製．各捕捉に２億個または８億個の細胞からの溶解物を使用した。２億個の細胞について、以下のプロトコルを使用し、より大きい細胞数に合わせて適切に調整した。各捕捉について、重いまたは軽いＳＩＬＡＣ標識凍結溶解物のサンプルを３７℃に温めた。各サンプルについて、１．２ｍＬのStreptavidin Dynabeads MyOne C1磁気ビーズ（Invitrogen）を等しい体積のハイブリダイゼーションバッファー（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭＬｉＣｌ、０．５％ＤＤＭ、０．２％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸、４Ｍ尿素、２．５ｍＭＴＣＥＰ）で６回洗浄した。溶解物サンプルを、洗浄したストレプトアビジンＣ１（Streptavidin C1）磁気ビーズと共に、３７℃で３０分間、Eppendorf Thermomixer Cで、１１００ｒｐｍで断続的に振盪しながら（３０秒混合、３０秒オフ）インキュベートすることによって、予備清澄化した。次いで、ストレプトアビジンビーズをDynamag磁石（Life Technologies）を用いて溶解物サンプルから磁気的に分離した。溶解物を予備清澄化するために使用したビーズを捨て、溶解物サンプルを新しいチューブに２回移して、微量の磁気ビーズを全て除去した。目的のＲＮＡ標的に特異的なビオチン化した９０マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（サンプルあたり２０μｇ，水中）を８５℃で３分間熱変性させ、次いで氷上で急冷した。プローブおよび予備清澄化した溶解物を混合し、Eppendorfサーモミキサーを使用して、断続的に振盪しながら（３０秒振盪、３０秒オフ）、６７℃で２時間インキュベートして、プローブを捕捉標的ＲＮＡにハイブリダイズさせた。次に、上記のように、Eppendorf Thermomixer Cで断続的に振盪しながら、１．２ｍＬの洗浄したストレプトアビジンがコートされた磁気ビーズと共に、３０分間６７℃で各サンプルをインキュベートすることによって、ビオチン化ＤＮＡプローブと標的ＲＮＡのハイブリッドをストレプトアビジンビーズに結合させた。捕捉されたハイブリッドを有するビーズを、ＬｉＣｌ／尿素ハイブリダイゼーションバッファーで、６７℃で５分間、６回洗浄して、非特異的に会合したタンパク質を除去した。全ビーズの０．５〜１％を取り出し、最後の洗浄後に新しいチューブに移して、ｑＰＣＲによりＲＮＡ捕捉を調べた（「ＲＮＡサンプルの溶出および分析」を参照）。タンパク質サンプルのその後の処理のために、残りのビーズをベンゾナーゼ溶出バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、２ｍＭＭｇＣｌ２、０．０５％ＮＬＳ、０．５ｍＭＴＣＥＰ）に再懸濁した。

タンパク質サンプルの溶出．ストレプトアビジンビーズからの捕捉されたタンパク質の溶出を、１２５Ｕのベンゾナーゼ非特異的ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレアーゼを用いて３７℃で２時間、全核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ、二本鎖および一本鎖の両方）を消化することによって達成した（Millipore，#71206-3）。次に、DynaMag磁石（Life Technologies）を用いてビーズをサンプルから磁気的に分離し、溶出したＸｉｓｔ特異的タンパク質を含む上清を、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて４℃で一晩沈殿させた。ＴＣＡ処理したタンパク質溶出サンプルを、＞２０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によりペレット化し、次いで１ｍＬの冷アセトンで洗浄し、再度遠心分離した。最終タンパク質溶出ペレットを風乾してアセトンを除去し、質量分析のために処理するまで−２０℃で保存した。

ＲＮＡサンプルの溶出および分析．ハイブリッドを有するビーズを９６ウェルDynaMag（Life Technologies）を使用して磁気的に分離し、上清を捨てた。次いで、ビーズを、２０μＬＮＬＳＲＮＡ溶出バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％ＮＬＳ、２．５ｍＭＴＣＥＰ）中にピペッティングすることによって再懸濁した。標的ＲＮＡを遊離させるために、ビーズをEppendorf Thermomixer Cで９５℃で２分間加熱した。次いで、ビーズを９６ウェルDynaMag（登録商標）（Life Technologies）を使用して磁気的に分離し、溶出した標的ＲＮＡを含有する上清を、５５℃で１時間、１ｍｇ／ｍＬのプロテインキナーゼＫを添加することによって消化して、全てのタンパク質を除去した。次に、前述13,32のように、残りの核酸をSILANEビーズ（Invitrogen）上へのエタノール沈殿によって精製した。TURBO（登録商標）ＤＮアーゼ（Ambion）を用いる消化によって、ＤＮＡプローブを除去した。ＲＮＡ収率および濃縮を定量するために、前出のEngreitz et al.に以前に記載されているようにｑＰＣＲを実施した。
質量分析

質量分析用タンパク質の調製．ＲＡＰ−ＭＳ捕捉からのタンパク質を、４０μＬの１００ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．５に溶解した新鮮な８Ｍ尿素に再懸濁した。ジスルフィド結合を、３ｍＭＴＣＥＰと共に室温で２０分間インキュベートすることにより還元し、続いて１１ｍＭヨードアセトアミドを用いて、暗所で室温で１５分間アルキル化した。次に、サンプルを０．１μｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで室温で４時間消化した。Ｌｙｓ−Ｃ消化の後、１００ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．５を添加することによってサンプルを２Ｍの最終濃度の尿素に希釈し、ＣａＣｌ２を添加して、１ｍＭの最終濃度にした。トリプシンペプチドは、室温で一晩、０．１〜０．５μｇのトリプシンで処理することによって得た。ＨｉＰＰＲ界面活性剤除去カラム（Thermo）を用いて夾雑界面活性剤をペプチドから除去し、ペプチドを５％ギ酸の添加によってプロトン化し、Microm Bioresources C8 peptide MicroTrapカラムで脱塩した。ペプチド画分を収集して凍結乾燥し、乾燥したペプチドを、５％アセトニトリルを含む０．２％ギ酸に再懸濁した。

質量分析測定．消化されたサンプルの液体クロマトグラフィー−質量分析およびデータ分析は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWutz et al., 2014, Nature Genet 30:167-174に以前に記載されているように、以下の修正をして行った。全ての実験は、ナノエレクトロスプレーイオン源（Thermo Fisher Scientific）を備えたハイブリッド線形イオントラップOrbitrap Elite質量分析計（ドイツのブレーメンのThermo Fisher Scientific）に連結されたナノフローＬＣシステム、EASY-nLC 1000で行った。EASY-nLC IIシステムでは、溶媒Ａは、９７．８％Ｈ２Ｏ、２％ＡＣＮ、および０．２％ギ酸からなり、溶媒Ｂは、１９．８％Ｈ２Ｏ、８０％ＡＣＮ、および０．２％ギ酸からなっていた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験では、２００ｎｇの消化ペプチドを、５００ｎＬ／分の流速で、ReproSil-Pur C18AQ ３μｍ樹脂（孔径１２０Å、ドイツのアンマーブーフのMaisch）が工場で充填された１６ｃｍ分析用ＨＰＬＣカラム（７５μｍＩＤ）に直接ロードした。カラムを３０℃で作動するカラムヒーターに入れた。３０分のロード時間の後、ペプチドを７５分間の勾配で３５０ｎＬ／分の流速で分離した。勾配は以下の通りであった：０〜２％溶媒Ｂ（５分）、２〜３０％Ｂ（６０分）、および１００％Ｂ（１０分）。Eliteをデータ依存型取得モードで運転して、Orbitrap内のフルスキャン（ｍ／ｚ＝４００〜１６００）と線形イオントラップ内のその後の高速２０ＣＩＤＭＳ／ＭＳスキャンとを自動的に交互に行った。ＣＩＤを、衝突ガスとしてヘリウムを用い、３５％の規格化された衝突エネルギーおよび１０ｍｓの活性化時間で実施した。

ＭＳデータ分析．Thermo RAWファイルは、MaxQuant (v 1.5.0.30)34,35で検索した。スペクトルは、全てのUniProtマウスエントリー（４３，５６５エントリー，０２年１０月１４日ダウンロード）およびMaxQuant夾雑物データベース（２４５エントリー）に対して検索した。偽発見率を推定するために、デコイ配列（逆のペプチド配列）をMaxQuantで生じさせた。検索パラメータは、重いペプチド修飾として重いＡｒｇ（＋１０．００８３）および重いＬｙｓ（＋８．０１４２）を有する２の多重度を含んでいた。様々な修飾は、Ｍｅｔの酸化（＋１５．９９４９）およびタンパク質のＮ末端アセチル化（＋４２．０１０６）を含んだ。Ｃｙｓのカルボキシアミドメチル化（＋５７．０２１５）を固定化修飾として指定した。タンパク質およびペプチドの偽発見率は、閾値を１％に設定した。前駆体質量許容差は、７ｐｐｍ（個々のペプチドについてはそれ以下）であった。断片質量許容差は０．５Ｄａであった。実行間の再定量およびマッチングを両方とも可能にした。トリプシンを切断ミス（missed cleavage）が最大２である消化酵素として指定した。

ＲＮＡ相互作用タンパク質の同定．ＲＡＰ−ＭＳ捕捉からの目的のタンパク質を、いくつかの基準に基づいて同定した。第１に、２以上の固有のペプチドが質量スペクトルにみられた場合にのみ、タンパク質が同定されたと見なした。次に、捕捉対コントロールサンプルのＳＩＬＡＣ比に基づいて、目的のタンパク質を選択した。各ペプチドについてのＳＩＬＡＣ比は、重いＳＩＬＡＣ対および軽いＳＩＬＡＣ対の強度比に基づいて計算した。タンパク質比は、全ての計算されたペプチド比の中央値であり、ＳＩＬＡＣ比が所与のタンパク質に割り当てられるためには最低２つのＳＩＬＡＣ対が必要とされる。さらなる分析のためのカットオフとして、≧３．０のＳＩＬＡＣ比カットオフ（コントロールサンプルに対する濃縮倍率）を使用した。ヒトケラチンならびにサンプルの精製および調製プロセス中に入ったタンパク質（ストレプトアビジン、ベンゾナーゼ、およびトリプシンなど）、ならびに調製物を汚染する天然のビオチン化タンパク質を含む既知の夾雑物を、ストレプトアビジンビーズに結合させることによって除いた。
ＲＡＰ−ＭＳ実験およびコントロール

ＲＡＰ−ＭＳアプローチを、以下の２つの充分に特徴付けられている非コードＲＮＡと相互作用するタンパク質を明らかにすることによって検証した：（ｉ）スプライセオソームのコア成分である、Ｕ１小核ＲＮＡ、および（ｉｉ）リボソーム小サブユニットの成分である、１８リボソームＲＮＡ。Ｕ１精製において、９種の濃縮タンパク質が同定され、それらは全てＵ１ｓｎＲＮＡと相互作用することが知られている。リストには、コアＵ１ｓｎＲＮＰ複合体を含んでなる１０種のタンパク質のうち７種（Ｕ１−Ａ、Ｕ１−Ｃ、Ｕ１−７０Ｋ、Ｓｍ−Ｂ、Ｓｍ−Ｄ２、Ｓｍ−Ｄ３、Ｓｍ−Ｅ３）、およびＵ１ｓｎＲＮＰの生合成４に関与するＧｅｍｉｎ５プロセシング因子が含まれる（図１０Ａ〜１０Ｃ）。第９の濃縮タンパク質であるＳＦ３ａ１は、以前はＵ１相互作用タンパク質として同定されていなかったが、生体内でＵ１ｓｎＲＮＡと直接相互作用することが最近示された。

１８ＳｒＲＮＡ対Ｕ１ｓｎＲＮＡ．ＲＡＰ−ＭＳ法を検証し、１８ＳリボソームＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡと特異的に相互作用するタンパク質を同定するために、野生型Ｖ６．５ＥＳ細胞からの軽い標識および重い標識で標識された溶解物からの平行サンプルで各標的ＲＮＡの捕捉を行った。各ＲＡＰ−ＭＳ捕捉からの溶出サンプル中の総タンパク質量は、各サンプルについて１回の定量ＭＳ分析の実行で同定したペプチドの強度中央値を比較することによって測定した。次に、重い標識および軽い標識で交換したサンプルを総タンパク質量に基づいて等しく混合し、質量分析によって分析して、１８ＳｒＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡ捕捉に由来するタンパク質のＳＩＬＡＣ濃縮比を同定した。実験は２回行い、各実験セットは１８Ｓ捕捉およびＵ１捕捉の２つの生物学的反復（重い標識状態および軽い標識状態）を含んだ。

ＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡ捕捉対Ｕ１ｓｎＲＮＡ捕捉．ＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡと特異的に相互作用するタンパク質を同定するために、ドキシサイクリンで６時間処理した２００Ｍの細胞または８００ＭのｐＳＭ３３細胞のいずれかを用いて、上記のように捕捉を行った。各ＲＡＰ−ＭＳ捕捉からの溶出サンプル中の総タンパク質量は、各サンプルについて１回の定量ＭＳの実行によって測定した。重い標識および軽い標識で交換したサンプルを総タンパク質量に基づいて等しく混合し、質量分析によって分析した。Ｘｉｓｔ濃縮タンパク質対Ｕ１濃縮タンパク質のＳＩＬＡＣ比を計算し、さらなる分析のためにＸｉｓｔ特異的相互作用タンパク質を同定するために使用した。実験は２回行い、各実験セットは、重い標識および軽い標識で標識されたサンプルから、Ｘｉｓｔ捕捉およびＵ１捕捉の２つの生物学的反復を含んだ。タンパク質は、一部の反復サンプルにおいてその濃縮レベル（２倍）が我々の濃縮カットオフ（３倍）を下回ったためだけに失敗した唯一の例外（ＬＢＲ）を除いて、サンプル間でよく再現した。

ＲＡＰ−ＭＳにより同定したＸｉｓｔ相互作用タンパク質の検証．同定したタンパク質がＸｉｓｔとの特異的相互作用を反映し、バックグラウンドタンパク質または他のＲＮＡの非特異的精製によるものではないことを確認するために、Ｘｉｓｔが発現されない非誘導細胞において同じＸｉｓｔプローブを用いてＲＡＰを行った。さらに、同定した相互作用が、溶液中で形成される相互作用よりもむしろ生体内でＸｉｓｔに架橋されるタンパク質を表すことを確認するために、架橋されなかった（ＵＶ光なし）細胞からＸｉｓｔを精製した。両方の場合において、これらの１０種のＸｉｓｔ相互作用タンパク質のいずれも同定されず、これらのコントロールサンプルのいずれにおいても、他に特異的に濃縮されたタンパク質はなかった。まとめると、これらの結果は、同定されたタンパク質が、細胞内でＸｉｓｔと共有結合的に架橋している直接的なＲＮＡ結合タンパク質であることを実証している。

これらのタンパク質が核長鎖ｎｃＲＮＡと単に非特異的に会合するだけではないことを確認するために、Ｘｉｓｔと同等の長さである４５Ｓプレ−リボソームＲＮＡとＸｉｓｔを比較した（それぞれ約１３，０００ヌクレオチド対約１７，０００ヌクレオチド）（図１０Ａ〜１０Ｃ）。注目すべきことに、ＸｉｓｔをＵ１と比較した場合に濃縮されていた１０種のタンパク質の各々は、Ｘｉｓｔを４５Ｓと比較した場合に、やはり濃縮されていた。３つの場合（ｈｎＲＮＰＣ、ＲＡＬＹ、およびＬＢＲ）では、これらのタンパク質は核小体に存在することが知られていることと一致して、これらのタンパク質は４５Ｓ精製においてより高いレベルを有するため、濃縮レベルはわずか約２倍であった。これらの結果は、これらの１０種のタンパク質がＸｉｓｔと特異的に会合し、核内のいずれの長鎖ＲＮＡとも単に会合するのではないことを実証している。

以前の研究により、分化中の特定の臨界期の後にはＸｉｓｔが転写型サイレンシングをもはや開始できないことが示されているため、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、およびＳＡＦ−ＡをノックダウンしたときのＸｉｓｔサイレンシングの喪失が、細胞分化に単に起因するのではないことを確認した。これに対処するために、分化の際に急速に失われる多能性状態のマーカーであるＮａｎｏｇについての免疫蛍光法と共に、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡについての一分子ＦＩＳＨを実施した。ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、またはＳＡＦ−Ａのノックダウンが、Ｎａｎｏｇ陽性細胞において、Ｘ染色体上の遺伝子サイレンシングを消失させることも確認した（図１９）。

最後に、同定されたタンパク質を免疫沈降したときに、ＸｉｓｔＲＮＡが濃縮され得るかどうかを試験することによって、これらの相互作用を独立に検証した。これを行うために、１０種のタンパク質のうち８種（Ｐｔｂｐ１、ｈｎＲＮＰＣ、ＣＥＬＦ１、Ｍｙｅｆ２、Ｒｂｍ１５、ＬＢＲ、ＲＡＬＹ、およびＳＨＡＲＰ）ならびにＵＶ架橋溶解物からの精製タンパク質−ＲＮＡ複合体について高品質のＩＰグレード抗体またはエピトープタグ付きタンパク質を得た（Methods）。全ての場合において、総入力ＲＮＡレベルと比較して、ＸｉｓｔＲＮＡについての強い濃縮（＞４倍、図１２Ａ〜１２Ｄ）が観察された。対照的に、ｍＲＮＡ（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、もしくはＳｔａｔ３）またはｌｎｃＲＮＡ（すなわち、Ｎｅａｔ１、Ｍａｌａｔ１、Ｔｕｇ１、もしくはＦｉｒｒｅ）を含む他のコントロールＲＮＡ（図１２Ａ〜１２Ｄ）について、同様の濃縮は観察されなかった。残りの２種のタンパク質について、それらの相互作用を独立に確認するために使用され得る抗体の同定、または親和性試薬の生成は不可能であった。ある場合（ＳＡＦ−Ａ）では、タンパク質は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、You et al., 2013, Nature Struct. Mol. Biol., 20:182-187に記載されているように、ヒト細胞においてＸｉｓｔと直接的に相互作用することが以前に示されており、独立に確認されている。

非架橋細胞からのＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡ捕捉．精製タンパク質が捕捉中に標的ＲＮＡとインビトロで非特異的に会合または結合しないことを確かめるためのコントロールとして、ＸｉｓｔのＲＡＰ−ＭＳ捕捉を、その他の点では同じ方法で処理した（すなわち、６時間のドキシサイクリン処理した）非架橋細胞から行った。

Ｘｉｓｔが発現されていない細胞からのＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡ捕捉．ｐＳＭ３３細胞において同定されたタンパク質が、バックグラウンドタンパク質または他のＲＮＡもしくはタンパク質とのプローブ会合から生じていないことを確認するために、ドキシサイクリンで処理しなかったが、その他の点では同一に処理したｐＳＭ３３細胞から、ＸｉｓｔのＲＡＰ捕捉を行った。

４５Ｓプレ−ｒＲＮＡ捕捉対Ｕ１捕捉．ＲＡＰ−ＭＳを用いるＸｉｓｔ捕捉で濃縮されたタンパク質が、単に、長鎖標的ＲＮＡ転写物の結果としてのタンパク質捕捉の増加によるものではないことを確かめるために、コントロールとしての１３，０００ヌクレオチド長４５Ｓプレ−リボソームＲＮＡのさらなる捕捉を行った。成熟１８Ｓおよび２８Ｓではなく４５Ｓのみの特異的捕捉を確実にするために、４５Ｓプレ−リボソームＲＮＡにのみ存在する内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）を特異的に標的とするプローブを設計した。実験は、上記のＸｉｓｔｌｎｃＲＮＡ捕捉と同じ方法で同じ条件で行った。Ｘｉｓｔタンパク質濃縮を４５Ｓタンパク質濃縮と比較するために、（スパイクインＳＩＬＡＣと呼ばれる）共通の分母を共有する２つのサンプルの直接比較に基づいてＳＩＬＡＣアプローチを使用した。具体的には、同定された各タンパク質について、全体のＸｉｓｔ／４５ＳＳＩＬＡＣ比は、Ｘｉｓｔ／Ｕ１比にＵ１／４５Ｓ比を掛けることによって計算される。

タンパク質ドメイン分類．タンパク質の保存ドメイン構造は、タンパク質ファミリー（Protein Families）データベース（Pfam38）を用いて明らかにした。

ＵＶ架橋細胞におけるＲＮＡ免疫沈降．ｐＳＭ３３細胞を、６時間のドキシサイクリン処理後に、０．４ジュール／ｃｍ２のＵＶ２５４で架橋した。細胞を溶解し、ＲＮＡをＲＮアーゼＩで消化して、長さ１００〜５００ヌクレオチドのサイズ範囲を達成した。溶解調製物を、４℃で１時間プロテインＧビーズと混合することによって、予備清澄化した。各サンプルについて、１０μｇの抗体（表１）および６０μｌのプロテインＧ磁気ビーズ（Invitrogen）を用いて２，０００万個の細胞から標的タンパク質を免疫沈降させた。抗体を室温で１時間混合しながらビーズに予備結合させた後、予備清澄化した溶解物を抗体−ビーズ複合体と４℃で２時間インキュベートした。免疫沈降後、界面活性剤を含む１×ＰＢＳの洗浄バッファーでビーズを洗浄した。脱リン酸化処理後、各サンプル中のＲＮＡを、各アダプターが固有のバーコード識別子を有するバーコード化アダプターの混合物に連結した。連結後、ビーズを１×ＰＢＳおよび界面活性剤、次いで５×ＰＢＳ（７５０ｍＭＮａＣｌ）および界面活性剤で洗浄してから３〜４種の抗体を新しいチューブにプールした。次いで、タンパク質およびＲＮＡを、６０℃で６Ｍの尿素および４０ｍＭのＤＴＴを用いてプロテインＧビーズから溶出した。タンパク質をＮＨＳ−磁気ビーズ（Pierce）に共有結合させ、６ＭのＧｕＳＣＮ（Qiagen RLTバッファー）中で３回洗浄し、９８℃で１０分間、１％ＮＬＳ中で加熱することによって、タンパク質−ＲＮＡ複合体を遊離ＲＮＡから分離した。次いで、タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、その後の分析のためにＲＮＡを精製した。各プールのバーコード化ＲＮＡから、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Kuo et al., 1998, Bioessays, 20:615-626に以前に記載されているように、イルミナシークエンシングライブラリーを調製した。免疫沈降の前に出発材料をわずかなパーセンテージ（約１％）節約し、このサンプルを並行して処理およびシークエンシングした。

架橋ＲＮＡ免疫沈降データの分析．特異的タンパク質で免疫沈降をしたときのＲＮＡについて、細胞内のＲＮＡの総レベルと比較して、濃縮を計算した。これを行うために、ＲＮＡとオーバーラップするリードの総数を、免疫沈降サンプルまたは入力コントロールでカウントした。サンプル間のリードカバレッジの差異を説明するために、これらの数値の各々を同じ実験内のリードの総数に対して正規化した。これにより、各サンプル内で、ＲＮＡごとに正規化されたスコアが得られる。次いで、これらの正規化された値の比（ＩＰ／入力）をとることによって、濃縮メトリックを計算した。次いで、これらの濃縮レベルを、様々なタンパク質およびコントロール（すなわちＩｇＧ）間で比較した。所与の遺伝子についてタンパク質間の直接比較を可能にするために、各抗体のＩＰ効率または非特異的結合の差異を生じ得る、タンパク質特異的バックグラウンドレベルの差異を説明する必要があった。これを行うために、所与のタンパク質について、各遺伝子についての比を全遺伝子にわたる平均比で割ることによって正規化された濃縮比を計算した。

全てのＲＮＡへの無差別な結合の可能性を排除するために、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｔａｔ３、およびＳｕｚ１２を含む、これらのタンパク質に結合することが予想されない様々なｍＲＮＡコントロールを考慮した。これらのｍＲＮＡは、ＥＳ細胞において発現されるため例として選択したが、多くのｍＲＮＡが同様の結果を示す。ＸｉｓｔＲＮＡがＲＢＰに非特異的に結合する可能性を説明するために、ＲＡＰ−ＭＳによりＸｉｓｔと相互作用すると同定されなかった他のＲＢＰ（Ｐｕｍ１およびｈｎＲＮＰ−Ｈ）と共にＸｉｓｔを評価した。陰性の結果（すなわち、Ｘｉｓｔの濃縮がない）が有意であり、失敗した免疫沈降実験を反映しないことを確かめるために、ｈｎＲＮＰＨ１と免疫沈降することが以前に分かっているＮｅａｔ１−１を評価した。他のｌｎｃＲＮＡに対する濃縮のレベルをさらに評価するために、Ｍａｌａｔ１、Ｆｉｒｒｅ、およびＴｕｇ１を含むいくつかのｌｎｃＲＮＡを評価した。これらのｌｎｃＲＮＡは、周知であり、ＥＳ細胞で発現されるため、例として選択したが、多くのＥＳｌｎｃＲＮＡは同様の結果を示す。

免疫沈降およびＲＴ−ｑＰＣＲ．雌性ＥＳ細胞を分化させ、次いで上記のようにＵＶ４ｋで架橋した。２０Ｍ細胞のペレットを溶解し、TURBO（登録商標）ＤＮアーゼ（Ambion）で処理して、Eppendorf Thermomixer Cで３７℃で１０分間インキュベートすることによってＤＮＡを破壊した。溶解物を１８０μＬのDynabeadsプロテインＧ磁気ビーズ（Life Technologies）と共にインキュベートすることによって予備清澄化した。一方、１０μｇの免疫沈降用の抗体（ＳＨＡＲＰ抗体、Novus NBP1-82952またはＩｇＧ抗体、Cell Signaling 2729S）を６０μｌのプロテインＧ磁気ビーズに結合させた。予備洗浄が完了した後、次いで、タンパク質捕捉のために、溶解物を適当な抗体結合プロテインＧ磁気ビーズと混合し、Hulamixerサンプルミキサー（Life Technologies）で４℃で２時間インキュベートした。免疫沈降後、ビーズを界面活性剤を含む１×ＰＢＳの洗浄バッファーで洗浄し、次いで５．６ＵプロテイナーゼＫ（New England Biolabs）で全タンパク質を消化することによって捕捉した核酸を溶出した。溶出したＲＮＡをRNA Clean and Concentrator-5 Kit（Zima Research）を用いて精製し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行ってＲＮＡ濃縮を評価した。

Ｖ５−エピトープタグ付きタンパク質発現．Ｖ５−タグ付きタンパク質発現および免疫沈降のために、Neonトランスフェクションシステム（Invitrogen）を用いて、ＣＡＧプロモーターによって駆動される、Ｃ末端Ｖ５タグ付きＯＲＦの発現をコードする、エピソーム複製ベクター（ｐＣＡＧ−ＧＷ−Ｖ５−Ｈｙｇｒｏ）でマウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションした。GatewayエントリークローンとしてDNASUプラスミドレポジトリからＯＲＦを得、LR組み換え反応（Invitrogen）を用いてｐＣＡＧ−ＧＷ−Ｖ５−Ｈｙｇｒｏに挿入した。トランスフェクトした細胞を１２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Invitrogen）上で選択して安定に発現する株を得た。

ｓｉＲＮＡトランスフェクション．ｓｉＲＮＡノックダウン実験のために、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを、Neon（登録商標）トランスフェクションシステム（設定：１２００Ｖ，４０ｍｓ幅，１パルス）を用いてトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、同じｓｉＲＮＡを用いた２回の１０μＬのトランスフェクションを、それぞれ１００，０００細胞を用いて連続して行い、混合し、２ｉ培地を含有する２４ウェルプレートのウェルに入れたポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン（Sigma）および０．２％ゼラチン（Sigma）がコートされた２つの＃１．５カバーガラスに均等に蒔いた。４８時間後、２ｉ培地を交換し、各対の一方のカバーガラス上の細胞を２μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Sigma）で１６時間処理してＸｉｓｔ発現を誘導した。次に、カバーガラスをHistochoice（Sigma）中で５分間固定し、ＰＢＳ中で充分に洗浄し、エタノール中で脱水し、ＦＩＳＨ染色まで保存した。

全てのタンパク質について、DharmaconからのｓｉＲＮＡプール（ON-TARGETplus SMARTpool siRNA）を使用した。これらの各々について、ｓｉＲＮＡが標的化ｍＲＮＡ発現を＞７０％成功裏に減少させるかどうかを試験した。ＳＡＦ−ＡおよびＳＭＲＴでは、ｓｉＲＮＡはこのレベルのｍＲＮＡ減少を達成することができなかったため、ＳＡＦ−ＡおよびＳＭＲＴ用の追加のｓｉＲＮＡ（およびそれらに関連するコントロール）をそれぞれQiagenおよびAmbionから購入し、目的のｍＲＮＡレベルを成功裏に減少させたｓｉＲＮＡを選択した。ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡはQiagenから購入した。追加の独立したｓｉＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡは、表２に示されているように、プールとしてDharmacon、Qiagen、およびAmbionから、またはプールからデコンボリューションした各個々のｓｉＲＮＡとしてDharmaconおよびQiagenから購入した。

ＲＡＰ−ＭＳによって同定されたタンパク質に加えて、ＥＥＤ（ＰＲＣ２の成分）、ＹＹ１３９、Ｓａｔｂ１４０、ＳＲＳＦ１４１、ｈｎＲＮＰＣ４２、およびＡｔｒｘ４３を含む、Ｘｉｓｔと関連があるいくつかのタンパク質をノックダウンした。

雌性ＥＳ細胞におけるｓｉＲＮＡ実験．雌性ＥＳＦ１２−１細胞を同様にトランスフェクトした。これらの細胞について分化およびＸｉｓｔ発現を開始させるために、トランスフェクションの１２時間後に、２ｉをＭＥＦ培地（ＤＭＥＭ，１０％Gemini Benchmark ＦＢＳ、１×Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；特記がないものはLife Technologies）と交換した。トランスフェクションの４８時間後に、１μＭのレチノイン酸（Sigma）を２４時間投与し、細胞を上記のように固定した。分化を受けていない細胞については、トランスフェクションの１２時間後および４８時間後に２ｉを交換した。

一分子ＲＮＡＦＩＳＨ．製造者のプロトコルに従って、QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay （Affymetrix）およびQuantiGene ViewRNA ISH Cell 740 Module （Affymetrix）を用いて、一分子ＲＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験を行った。カバーガラス上に固定された細胞を、最初に、室温で５分間、Detergent Solution QCで透過処理し、次いでProbe Set Diluent QF中のプローブセット（Affymetrix）の所望の混合物と共に４０℃で３時間インキュベートし、続いて、PreAmplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Amplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Label Probe Mixと共に４０℃で３０分間、順次インキュベートした。ＤＡＰＩ染色では、ＰＢＳ中３０ｎＭのＤＡＰＩ中で、室温で１５〜２０分間、カバーガラスをインキュベートした。ＦＩＳＨ用のプローブセットおよび結合されるフルオロフォアは、ＴＹＰＥ１−ＸＩＳＴ（５５０ｎｍ）、ＴＹＰＥ４−ＧＰＣ４、ＲＢＭＸ、ＳＭＣ１Ａ、ＭＥＣＰ２（４８８ｎｍ）、ＴＹＰＥ１０−ＡＴＲＸ（７４０ｎｍ）、およびＴＹＰＥ６−ＥＥＤ１、ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、ＳＡＦＡ、ＲＢＭ１５、ＭＹＥＦ２、ＰＴＢＰ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＭ、ＣＥＬＦ１、ＲＡＬＹ、ＨＤＡＣ３、ＮＣＯＲ２、ＭＩＤ１、ＰＩＲ（６５０ｎｍ）であった。

免疫蛍光法およびＲＮＡＦＩＳＨ．免疫蛍光法（ＩＦ）では、細胞をカバーガラス上に固定し、室温で１０分間ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理し、室温で１０分間ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清でブロッキングした。次いで、細胞を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、続いて二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、上記のように、サンプルをＲＮＡＦＩＳＨプロトコルを用いて処理した。ＩＦに使用した一次抗体および希釈物は、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤリピートＹＳＰＴＳＰＳ（ｐｈｏｓｐｈｏＳ２）（Abcam; ab5095）（１：１００）、抗Ｎａｎｏｇ（Abcam; ab80892）（１：１００）、および抗ＥＺＨ２(Active Motif; 39933)（１：１００）であった。ＩＦに使用した二次抗体および希釈物は、Alexa Fluor（登録商標） 405ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Life Technology; 1575534）（１：１００）およびAlexa Fluor（登録商標）488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦ（ａｂ’）２断片（Life Technology; 1618692）（１：１００）であった。

顕微鏡イメージング．ＦＩＳＨおよびＩＦ／ＦＩＳＨサンプルを、Leica HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2対物レンズを備えたLeica DMI 6000 Deconvolution Microscopeを使用してイメージングした。TYPE 10-ATRX（７４０ｎｍ）で染色したサンプルを、Nikon CFI Plan Apochromat λ DM 60x/1.40油浸対物レンズを備えたNikon Ti Eclipseを使用してイメージングした。画像を最大投影（３μｍ；ステップサイズ，０．５μｍ）で投影した。

Ｘ染色体サイレンシングアッセイ．細胞を、ＦＩＳＨによってＸｉｓｔＲＮＡ、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡ、ＡｔｒｘｍＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ標的化ｍＲＮＡについて染色し、イメージングした。さらに、いくつかのｓｉスクランブルおよびｓｉＳＨＡＲＰサンプルでは、Ｒｂｍ１５、Ｍｅｃｐ２、Ｓｍｃ１ａ、Ｍｉｄ１、またはＰｉｒｍＲＮＡに対するプローブを使用した。次に、画像をMatlab R2013b（後述）を使用して分析した。標的化ｍＲＮＡのコピー数がｓｉＲＮＡで処理されていない細胞のレベルの３０％未満である場合、および細胞がＸｉｓｔ発現を誘導する場合、細胞を選択した。これらの細胞内で、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡおよびＡｔｒｘｍＲＮＡのコピー数をピーク検出法（後述）を用いて定量し、条件間で比較した。ｍＲＮＡレベルを５０個の個々の細胞について定量した。Ｘｉｓｔ発現も、ｓｉＲＮＡ処理細胞において評価し、未処理細胞と比較して、いずれのｓｉＲＮＡ条件においても、Ｘｉｓｔ発現を誘導した細胞のパーセンテージに差は観察されなかった。

一分子ＦＩＳＨによるｍＲＮＡの定量．全ての画像分析を、Image Processing toolboxからの組み込み機能を利用するMatlab（バージョンR2013b）を使用して実施した。バックグラウンドを除去するために、画像を最初に２次元メディアンフィルターを用いてフィルター処理した。細胞境界をＤＡＰＩ染色を頼りに手動で縁取り、バイナリマスクを作成し、同じ視野から様々なチャンネルに適用した。その内容全体が参照により本明細書に援用される、Theodosiou et al., 2007, Cytometry, 71:439-450に記載されているように、個々の焦点を強調するバックグラウンド除去法であるＴｏｐ−ｈａｔ形態学的フィルタリングを画像に適用した。次いで、細胞内の局所的最大シグナルを同定する２Ｄピーク検出アルゴリズムを用いてスポットを同定した。局所的最大値が同定されたら、各細胞についてスポットの数を数えた。

Ｅｚｈ２動員およびＰｏｌＩＩ排除．細胞を、ＸｉｓｔＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ標的化ｍＲＮＡ（ＦＩＳＨ）、ならびにＥｚｈ２またはＰｏｌＩＩ（ＩＦ）について、上記のように染色した。画像取得では、各個々のチャンネルの露光時間を全てのサンプルにわたって同一に保った。次いで、上記のように、画像を分析し、ＸＩＳＴ誘導細胞および標的ｍＲＮＡのノックダウンを示す細胞を選択した。具体的には、個々の細胞の核をＤＡＰＩ染色を用いて手動で同定した。強度による閾値を使用して、核内の画像を区切り、高強度の連続した２次元領域を見つけることによって、Ｘｉｓｔクラウドを同定した。画像を２つのビン−高および低−に分割し、区画内の分散を最小にする閾値を特定する大津法に基づいて、閾値を決定した。これにより、画像上にバイナリマスクが作成される。このバイナリマスクがＸｉｓｔクラウドを正確に反映していることを視覚的に確認した。次いで、このバイナリマスクを、全ての画像について、その視野内（ＰｏｌＩＩまたはＥｚｈ２）の全ての他の画像について適用した。次いで、領域内（すなわち、それぞれＰｏｌＩＩまたはＥｚｈ２）の全ピクセルの平均強度を取ることによって、蛍光シグナルの強度を定量した。この平均強度（細胞あたり１個の数値）を全条件にわたって計算し、５０個の単一細胞にわたるスクランブルサンプルと比較して、対応のない２標本ｔ検定（2-same unpaired t-test）を用いて全条件を比較した。
実施例９．Ｘｉｓｔ−ＬＢＲ相互作用

Ｘｉｓｔサイレンシング複合体において同定されたタンパク質の１つは、核内膜に係留され、ラミンＢと相互作用し、核ラミナ−ＤＮＡの３次元構造を形作るのを助け、サイレンシングタンパク質に富む核の区画にクロマチンを係留するのに必要とされる、膜貫通タンパク質である、ラミンＢ受容体（ＬＢＲ）である。ＸＣＩの誘導が核ラミナへの不活性Ｘ染色体の動員をもたらすという観察とともに、これらの観察に基づいて、Ｘｉｓｔ−ＬＢＲ相互作用が、ＸＣＩ中の核組織の形成および遺伝子発現の調節の両方にとって重要であり得るという仮説を立てた。

このことを試験するために、ＬＢＲ発現をノックダウンし、一分子ＲＮＡＦＩＳＨを用いてＸｉｓｔ誘導の前後に２つのＸ染色体遺伝子、ＡｔｒｘおよびＧｐｃ４の発現を測定した。ＬＢＲのノックダウンは、これらのＸ染色体遺伝子のＸｉｓｔ媒介サイレンシングの欠損をもたらし（図４）、細胞はＸｉｓｔ誘導の前後で同程度の発現を示した（図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ）。観察されたサイレンシング欠損が、単に核ラミナの破壊によって引き起こされるのではないことを確かめるために、核ラミナの２つの他の成分である、ラミンＢ１またはエマリンをノックダウンしたところ、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングの欠損は観察されなかった（図４、図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ）。
実施例１０．ＬＢＲ媒介サイレンシングの役割

ＬＢＲ媒介サイレンシングがＸｉｓｔとのその相互作用によるものであるかどうかを決定するために、そのＲＮＡ結合領域を破壊することを考えた。しかしながら、ＲＡＰ−ＭＳによって同定されたＸｉｓｔ相互作用タンパク質の中で、ＬＢＲは、標準的なＲＮＡ結合ドメインを含まない唯一のタンパク質である。ＬＢＲのアルギニン−セリン（ＲＳ）モチーフは、ＲＮＡ結合に関与することが知られているため、このモチーフがＸｉｓｔとの相互作用に必要であり得ると仮定した（図２１）。このことを試験するために、ＲＳモチーフの欠失を含むトランケート型ＬＢＲタンパク質を作製した（ΔＲＳ−ＬＢＲ，図２１Ａ）。コントロールとして、ＬＢＲ中の８つの膜貫通ドメインのうち７つ（ΔＴＭ−ＬＢＲ，図２１Ａ）を欠失させた。以前の観察と一致して、ΔＲＳ−ＬＢＲおよびΔＴＭ−ＬＢＲの両方が核膜に適切に局在することが分かった（図２２Ａ）。注目すべきことに、ΔＲＳ−ＬＢＲは、Ｘｉｓｔと相互作用せず（約９７％の結合の減少，図２１Ｂ）、ＬＢＲをノックダウンしたときのサイレンシング欠損を復帰させることができなかった（図２１Ｃ、図２２Ｂ〜２２Ｃ）。対照的に、ΔＴＭ−ＬＢＲは、Ｘｉｓｔ結合に影響を与えず（図２１Ｂ）、ＬＢＲをノックダウンしたときのサイレンシング欠損を復帰させることができた（図２１Ｃ、図２２Ｂ〜２２Ｃ）。

ΔＲＳ−ＬＢＲがそのＲＮＡ結合能力および特にＸｉｓｔとのその相互作用のためにＸ染色体遺伝子をサイレンシングさせることができないことを確かめるために、ΔＲＳ−ＬＢＲをＸｉｓｔＲＮＡに人工的に係留することによりＸｉｓｔ媒介サイレンシングの再確立が可能かどうかを試験した。これを行うために、ウイルスλＮコートタンパク質に強く結合するウイルスＢｏｘＢＲＮＡアプタマーの３コピーを内因性ＸｉｓｔＲＮＡの３’末端に融合させ（Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢ，図２１Ｄ）、Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢがなおもＸ染色体遺伝子をサイレンシングすることを確かめた（図２３Ａ〜２３Ｂ）。Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢ細胞におけるΔＲＳ−ＬＢＲ−λＮの発現は、ＬＢＲをノックダウンしたときに観察されたサイレンシング欠損を復帰させた（図２１Ｅ）。まとめると、これらの結果は、Ｘｉｓｔ−ＬＢＲ相互作用がＸｉｓｔ媒介転写型サイレンシングに必要とされることを実証している（図２１Ｆ）。

ＲＳモチーフは、スプライシングに関与するｍＲＮＡ結合タンパク質（ＳＲタンパク質）のクラス内に存在し、標準的なＲＮＡ結合ドメインを欠くＲＮＡ結合タンパク質で大きな比率を占め、ＬＢＲのＲＳモチーフは、インビトロでＲＮＡと相互作用することが以前に示されていたため、ＬＢＲのＲＳモチーフがＸｉｓｔとの相互作用に必要とされ得ると仮定した。
実施例１１．ＬＢＲの架橋および免疫沈降（ＣＬＩＰ）

ＬＢＲがＸｉｓｔに結合する場所を決定するために、ＲＮＡ−タンパク質複合体を細胞内でＵＶ架橋し、ＲＮＡを短い断片に消化し、ＬＢＲを免疫沈降させ、架橋ＲＮＡ−タンパク質複合体をゲル抽出し、ＸｉｓｔＲＮＡをシークエンシングした。ＸｉｓｔＲＮＡの＞１０，０００ヌクレオチドにわたって広がる３つの別々のＬＢＲ結合部位（ＬＢＳ）を同定した（図２４Ａ）。これらのＬＢＲ結合部位は、ＳＨＡＲＰおよびＰＴＢＰ１を含む他のＸｉｓｔ相互作用タンパク質の結合部位とは異なる（図２４Ａ）。興味深いことに、これらのＬＢＲ結合部位の１つ（ＬＢＳ−１）は、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングに必要とされることが以前に示されていたＸｉｓｔの約９００ヌクレオチド領域（ΔＡリピート領域）（２０）と重なる（図２４Ａ）。
実施例１２．ＬＢＲの結合ドメイン

ＬＢＲ結合を以前に作製されたΔＡリピート細胞株（２０）内で試験し、ΔＡリピート領域と重ならないＬＢＲ結合部位（補足図４）を含むＸｉｓｔＲＮＡ全体にわたってＬＢＲ結合が妨害されることが分かった（図２４Ｂ）。ＳＨＡＲＰもまたΔＡリピート領域内に結合し（図２４Ａ）、その結合もΔＡ−Ｘｉｓｔで妨害されるため（図２４Ｂ）、ＳＨＡＲＰ結合部位内ではないＬＢＲ結合部位内にある領域をちょうど欠失する突然変異体Ｘｉｓｔを作製した（ΔＬＢＳ，図２４Ａ）。ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔにおいて、ＬＢＲ結合は、ＳＨＡＲＰ結合に影響を与えることなく、ＸｉｓｔＲＮＡ全体にわたって失われた（図２４Ｂ，図２５）。注目すべきことに、ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔは、ΔＡ−Ｘｉｓｔで観察されたレベルと同様のレベルにＸ染色体転写をサイレンシングすることはできなかった（図２４Ｃ，図２６Ａ，２６Ｂ，２６Ｃ）。ただ１つのＬＢＲ結合部位の欠失がＸｉｓｔにわたるＬＢＲ結合の喪失をもたらすという観察結果（図２５）は、これらの部位がＬＢＲ結合に必要とされる長距離の構造的相互作用に関与している可能性があることを示唆する。

ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ細胞において観察されたサイレンシング欠損が、ＬＢＲ結合のみに起因し、別の未知のタンパク質相互作用の妨害によるものではないことを確かめるために、観察されたサイレンシング欠損がΔＬＢＳ−ＬＢＲ相互作用を再確立することによって復帰され得るかどうかを試験した。これを行うために、内因性ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔＲＮＡを作製し、異なるＲＮＡ結合ドメイン（ＭＳ２−コートタンパク質）に融合されたＬＢＲではなく、ＬＢＲ−λＮ融合タンパク質の発現が、ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ細胞において観察されたサイレンシング欠損を復帰させることができることが確認された（図２４Ｄ，図２７Ａ〜２７Ｂ）。対照的に、λＮに融合された他のサイレンシングタンパク質、例えばＳＨＡＲＰおよびＥＥＤの発現は、観察されたサイレンシング欠損を復帰させなかった（図２４Ｄ，図２７Ａ〜２７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＸｉｓｔのΔＡリピート領域と重なるＬＢＲ結合部位がサイレンシングに必要とされることを実証している。
実施例１３．ＬＢＲを介した不活性Ｘ染色体の動員

ＸＣＩの誘導が核ラミナへの不活性Ｘ染色体の動員をもたらすことが知られているため、Ｘｉｓｔ−ＬＢＲ相互作用がこれらの構造変化を媒介するために必要とされ得ると仮定した。これを試験するために、核内のＸｉｓｔ被覆核区画とラミンＢ１との間の距離を、ＲＮＡＦＩＳＨおよび免疫蛍光法を用いて測定した（図２８Ａ〜２８Ｂ）。野生型細胞においてＸｉｓｔを誘導すると、Ｘｉｓｔ区画は大多数の野生型細胞において（約９０％，図２８Ｃ）ラミンＢ１シグナルと重なることが分かった。対照的に、ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ細胞およびΔＡ−Ｘｉｓｔ細胞において、大多数の細胞が、Ｘｉｓｔ被覆区画とラミンＢ１との間に明確な分離を示し（それぞれ、約９１％および約８５％，図２８Ｃ）、これは、野生型Ｘｉｓｔと比較して＞２０倍の距離の増加を示している（図２８Ｃ）。これらの結果は、核ラミナへの不活性Ｘ染色体の動員を、ＸｉｓｔＲＮＡがＬＢＲとのその相互作用を介して直接媒介することを実証する。

Ｇｐｃ４遺伝子座はＸｉｓｔ転写遺伝子座から＞５０メガベースペア（Ｍｂｓ）離れて位置するため、ＲＮＡＦＩＳＨによってＸｉｓｔ区画と活発に転写される遺伝子との間の距離を測定するためにＧｐｃ４遺伝子座を選択した。Ｘｉｓｔ遺伝子座に近い（５Ｍｂｓ以内の）領域は、単にその直線距離が近いために、より高いレベルのＸｉｓｔ局在化を示すことが以前に分かっている。ＡｔｒｘもまたＲＡＰ−ＤＮＡによりＸｉｓｔＲＮＡ局在化が強く欠損しているが、ＡｒｔｘはＸｉｓｔとの直線距離が近い（２．５Ｍｂｓ以内）ため、イメージング分析から除外され、したがって、Ａｒｔｘは、これらのイメージング実験の解像度がより限られているというだけの理由から、より高いレベルのシグナルオーバーラップを示し得る。

ＬＢＲは、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングに必要とされ、Ｘｉｓｔ被覆ＤＮＡの核ラミナへの動員ももたらすため、ＬＢＲの機能はＸ染色体の核ラミナへの動員を媒介することであり、これにより、Ｘｉｓｔ媒介転写型サイレンシングをもたらすと仮定した。これを試験するために、Ｘｉｓｔ−ＬＢＲ相互作用を、核ラミナと相互作用することが同様に知られている別のタンパク質で置換した。具体的には、ＬＢＲと相互作用することができない内因性ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを使用して、ＸｉｓｔとラミンＢ１−Ｘ染色体サイレンシングに通常必要とはされない異なる核ラミナタンパク質（図４）との間に相互作用を生じさせた（図２８Ｄ）。ラミンＢ１−λＮ融合タンパク質を発現させ、ΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを発現する細胞において、Ｘｉｓｔ区画が野生型条件で観察される程度と同程度に核ラミナに動員されることが確認された（図２８Ａ、２８Ｃ）。

人工的にＸｉｓｔを核ラミナに動員したため、ＸｉｓｔがＸ染色体上の転写をサイレンシングすることができるかどうかを試験した。実際、核ラミナへのＸｉｓｔの係留は、ＬＢＲ−λＮで直接復帰させた後に観察された程度と同程度に、ΔＬＢＳ細胞において観察されたＸｉｓｔサイレンシング欠損を復帰させる（図２８Ｅ、図２９Ａ〜２９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｘ染色体の核ラミナへのＸｉｓｔ媒介動員が、Ｘｉｓｔ媒介転写型サイレンシングに必要とされることを実証している。さらに、これらの結果は、Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングにおけるＬＢＲの機能が、Ｘ染色体を核ラミナに動員するＬＢＲの能力に起因することを実証している。

核ラミナへのＸｉｓｔ媒介動員が転写型サイレンシングになぜ必要であるかを調べるために、核ラミナ、沈黙化ＤＮＡおよび抑制性クロマチン調節因子が豊富な核の領域への動員が、Ｘ染色体上の転写を直接サイレンシングするように作用する可能性を検討した。この考えと一致して、活発に転写される遺伝子の核ラミナへの動員は、転写をサイレンシングするのに充分であることが、いくつかの場合において示されている。この仮説を検証するために、同様にＸ染色体上の転写をサイレンシングすることができない、ＳＨＡＲＰをノックダウンしたときのＸｉｓｔ被覆領域の核ラミナ会合を調べた。ＳＨＡＲＰの非存在下では、Ｘｉｓｔ被覆区画はなおも核ラミナに局在化しており、ＸｉｓｔとラミンＢ１との間の距離分布が野生型Ｘｉｓｔについて観察された距離分布と同等であることを示している（図２８Ａ、２８Ｃ）。これらの結果は、Ｘ染色体の核ラミナへのＸｉｓｔ媒介動員が、転写型サイレンシングを直接もたらすのではないことを実証している。
実施例１４．ＬＢＲが媒介するＸｉｓｔの局在化

別の仮説は、Ｘ染色体の核ラミナへのＬＢＲ媒介動員が、活性遺伝子をＸｉｓｔ被覆核区画に再配置し、それによってＸｉｓｔがＸ染色体中に広がることを可能にするというものである。この考えと一致して、Ａリピートの欠失は、ＸＣＩの開始前に活発に転写される遺伝子へのＸｉｓｔの広がりにおける欠陥をもたらすことが以前に示されていた。この仮説を検証するために、ＸｉｓｔをゲノムＤＮＡに包括的にマッピングすることを可能にする方法であるＲＡＰ−ＤＮＡを使用して、Ｘ染色体におけるＸｉｓｔの局在化を調べた（１７）。ΔＬＢＳ−Ｘｉｓｔ細胞において、またはＬＢＲをノックダウンしたときに、ΔＡ−Ｘｉｓｔ細胞において観察される欠陥と比較して、活発に転写される遺伝子の領域にわたってＸｉｓｔＲＮＡ局在化の強い欠損が観察された（野生型と比較して約３倍，図３０Ａ〜３０Ｂ，図３１）。注目すべきことに、ＸｉｓｔＲＮＡ局在化は、転写活性が高い遺伝子でさらにより強く欠損していることが分かった（図３０Ｂ）。この局在化欠陥がＸｉｓｔ媒介サイレンシングの喪失に単に起因するのではないことを確かめるために、ＳＨＡＲＰをノックダウンしたところ、Ｘｉｓｔ局在化欠陥は観察されなかった（図３０Ｂ、図３１）。注目すべきことに、ラミンＢ１−λＮ融合体を使用してΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔを核ラミナに人工的に係留することは、野生型条件で観察されるレベルと同様のレベルまでＸｉｓｔが活性遺伝子に広がることを可能にすることが分かった（図３０Ｂ，図３２）。
実施例１５．活性遺伝子へのＸｉｓｔの局在化およびＲＮＡＰｏｌＩＩの排除

この広がりの欠陥が、活発に転写される遺伝子をＸｉｓｔ被覆区画に再配置することができないことに起因するかどうかを決定するために、活発に転写される遺伝子のＸｉｓｔ被覆区画に対するゲノム遺伝子座の位置をＲＮＡＦＩＳＨを用いて測定した（図３０Ｃ）。ΔＬＢＳ細胞において、またはＬＢＲをノックダウンしたときに、Ｘｉｓｔ区画と活発に転写されるＸ染色体遺伝子の遺伝子座（Ｇｐｃ４遺伝子座）との間の距離は、Ｘｉｓｔと常染色体遺伝子（Ｎｏｔｃｈ２遺伝子座）との間の距離と同等であった（Methods、図３０Ｄ、３０Ｅ参照）。対照的に、ＳＨＡＲＰをノックダウンしたときに、大多数の細胞においてＧｐｃ４遺伝子座がＸｉｓｔ区画とオーバーラップし（約８０％，図３０Ｄ）、Ｘｉｓｔゲノム遺伝子座自体について観察された程度と同程度のオーバーラップの頻度を示すことが分かった（約９０％，図３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）。ＲＮＡＰｏｌＩＩの排除に必要であることが知られているＳＨＡＲＰをノックダウンしたときに、Ｘｉｓｔはなおも活性遺伝子に広がることができるため（図１５Ａ〜１５Ｃ）、ここでの結果は、活性遺伝子への広がり、およびＲＮＡＰｏｌＩＩの排除が、染色体全体の転写型サイレンシングに両方とも必要とされる、独立した機能であることを実証している。
実施例１６．Ｘｉｓｔのモデル

まとめると、ここでの結果は、どのようにしてＸｉｓｔが不活性Ｘ染色体の３次元核構造を形成して、活性遺伝子に広がり、染色体全体の転写をサイレンシングするかについて、モデルで示されている（図３４）。Ｘｉｓｔは、最初に、前出のEngreitz et al., 2013、およびその内容全体が参照により本明細書に援用されるSimon et al., 2013, Nature, 504:465-469に記載されているように、その転写遺伝子座に３次元的に近接しているＤＮＡ部位に局在化することによってＸ染色体領域のコアに局在化する。これらの初期Ｘｉｓｔ局在化部位は、通常、Ｘｉｓｔ誘導前は不活性である。Ｘｉｓｔ被覆ＤＮＡは、他の染色体ＤＮＡ領域と同様に、様々な核位置を動的に試し、ＸｉｓｔがＬＢＲに結合するため、核ラミナが空間的に近接するようになると核ラミナで係留されるようになる。このラミナ会合は、染色体の移動性を制限することが知られており、そうすることによって、Ｘｉｓｔ被覆ＤＮＡを活発に転写されるＸｉｓｔ転写遺伝子座から離して配置し、これらの係留領域に物理的に連結しているＸ染色体上の他のＤＮＡ領域が、Ｘｉｓｔ転写遺伝子座の空間的により近い場所に持って来られることを可能にする。このようにして、Ｘｉｓｔおよびそのサイレンシング因子は、Ｘ染色体上のこれらの新たに接近可能なＤＮＡ領域に広がることができる。
実施例１７．実施例９〜１６の材料および方法

マウスＥＳ細胞培養およびＸｉｓｔ誘導．本明細書および前出のEngreitz et al., 2013に記載されているように、全てのマウスＥＳ細胞株を無血清２ｉ／ＬＩＦ培地中で培養した。以下の細胞株を用いた：（ｉ）前出のEngreitz et al., 2013に記載されている、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下で内因性遺伝子座からＸｉｓｔを発現する雄性ＥＳ細胞（ｐＳＭ３３ＥＳ細胞株）。（ｉｉ）前出のWutz et al., 2002に記載されている、Ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下のＨｐｒｔ遺伝子座に組み込まれたＡリピートを含まないｃＤＮＡＸｉｓｔ導入遺伝子を有する雄性ＥＳ細胞（ΔＡ−Ｘｉｓｔ：細胞はA. Wutzにより親切にも提供された）。実施するアッセイに応じて、６時間または１６時間、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma）で細胞（ｐＳＭ３３およびΔＡリピート欠失）を処理することによって、Ｘｉｓｔ発現を誘導した。

Ｘｉｓｔ媒介サイレンシングを測定するために、その内因性位置から発現されたドキシサイクリン誘導Ｘｉｓｔを含む、以前に開発された雄性マウス胚性幹（ＥＳ）細胞株を使用した。重要なことには、この誘導系は、ＸＣＩの開始を正確に反映する、よく同期したモデルを表すことが示されている。さらに、雄におけるＸｉｓｔ媒介サイレンシングは、１つの活性Ｘをなおも保持する雌の系におけるＸ染色体転写物のたった５０％の喪失ではなく、Ｘ染色体転写物の１００％の喪失をもたらすため、この雄性誘導系は、雌性系と比較して、サイレンシングに影響を及ぼすタンパク質の同定について、より感度が高い。さらに、この系は、分化誘導活性化と比較してよく同期しているため、所与の時点でのより信頼性の高いサイレンシング測定を提供する。

Ｇｐｃ４およびＡｔｒｘはＸｉｓｔ誘導前によく発現されるが、ドキシサイクリン誘導系で１６時間のＸｉｓｔ誘導によって通常サイレンシングされるＸ染色体遺伝子であるため、Ｇｐｃ４およびＡｔｒｘを選択した（図２）。さらに、Ｘ染色体中でＸｉｓｔ転写遺伝子座から様々な距離に位置するこれらの２つの遺伝子は、不活性Ｘ染色体中の多くの遺伝子の転写状態を正確に反映することが示された。

一分子ＦＩＳＨを用いてＸｉｓｔ誘導の前後にＸ染色体発現を測定した。このアプローチは、我々がＸｉｓｔ発現を誘導する細胞のみ（本明細書で使用する系では約５０％）を分析することを可能にするため、凝集をベースとする方法と比較してより高感度の測定値を提供する。さらに、このアプローチは、目的の標的ｍＲＮＡを成功裏に枯渇させる（ｓｉＲＮＡ実験）、または我々の実験においてトランスフェクトされた融合タンパク質を含む、個々の細胞の分析を可能にする。

ｓｉＲＮＡトランスフェクション．ｓｉＲＮＡノックダウン実験では、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを、Neonトランスフェクションシステム（設定：１２００Ｖ，４０ｍｓ幅，１パルス）を用いてトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、同じｓｉＲＮＡを用いた２回の１０μＬのトランスフェクションを、それぞれ１００，０００細胞を用いて連続して行い、混合し、２ｉ培地を含有する２４ウェルプレートのウェルに入れたポリ−Ｌ−リジン（Sigma）および０．２％ゼラチン（Sigma）がコートされた２つの＃１．５カバーガラスに均等に蒔いた。４８時間後、２ｉ培地を交換し、各対の一方のカバーガラス上の細胞を２μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Sigma）で１６時間処理してＸｉｓｔ発現を誘導した。次に、カバーガラスをHistochoice（Sigma）中で１０分間固定し、ＰＢＳ中で充分に洗浄し、エタノール中で脱水し、ＦＩＳＨ染色まで保存した。

全てのタンパク質および非標的指向性コントロールプールについて、DharmaconからのｓｉＲＮＡプール（ON-TARGETplus SMARTpool siRNA）を使用した。分析した各細胞について、ｓｉＲＮＡが標的化ｍＲＮＡ発現を＞７０％成功裏に減少させることが確認された。

ＢｏｘＢ配列のＸｉｓｔ遺伝子座への組み込み．その内容全体が参照により本明細書に援用されるCong et al., 2013, Science, 339:819-813に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲ媒介相同組み換えを用いて、ｐＳＭ３３ＥＳ細胞株中の内因性ＸｉｓｔＲＮＡのヌクレオチド１６，５２３へ３コピーのＢｏｘＢヘアピン配列（３８）を入れた。具体的には、ｐＣＡＧプロモーターから駆動されるＣａｓ９、Ｘｉｓｔ遺伝子座の３’領域を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ配列：ＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣ）（配列番号８）、ならびに挿入部位の７０ヌクレオチドの上流および下流の相同配列に隣接する３ｘ−ＢｏｘＢ配列を含む一本鎖ＤＮＡウルトラマー（ultramer）（IDT）を発現するコンストラクトをコトランスフェクトした。単一のコロニーをトランスフェクトした細胞から選び出し、ＰＣＲを用いてＢｏｘＢの組み込みを確認し、組み込み部位に隣接するプライマーを用いて成功した組み込み株をサンガーシークエンシングし、正しい挿入を確認した。Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢがなおもＸ染色体をサイレンシングすることができることを確かめるために、Ｘｉｓｔ−ＢｏｘＢを発現させ、Ａｔｒｘの転写型サイレンシングを測定した（図２３Ａ〜２３Ｂ）。

ＵＶ架橋．細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでSpectrolinker UV Crosslinker中で、２５４ｎｍの０．４ジュール／ｃｍ２のＵＶ（ＵＶ４ｋ）を使用して氷上で架橋した。次いで、細胞を培養皿から掻き取り、ＰＢＳで１回洗浄し、１５００×ｇで４分間の遠心分離によりペレット化し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。

免疫沈降およびＲＴ−ｑＰＣＲ．マウスＥＳ細胞を誘導し、次いで上記のようにＵＶ４ｋで架橋した。２０Ｍ細胞のペレットを溶解し、TURBO ＤＮアーゼ（Ambion）で処理し、Eppendorf Thermomixer Cで３７℃で１０分間インキュベートしてゲノムＤＮＡを消化した。溶解物を、１８０μＬのDynabeadsプロテインＧ磁気ビーズ（Life Technologies）と共にインキュベートすることによって予備清澄化した。一方、１０μｇの免疫沈降用の抗体を７５μｌのプロテインＧ磁気ビーズに結合させた。予備洗浄が完了した後、次いで、タンパク質捕捉のために、溶解物を適当な抗体結合プロテインＧ磁気ビーズと混合し、Hulamixerサンプルミキサー（Life Technologies）で４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降後、ビーズを界面活性剤を含む１×ＰＢＳの洗浄バッファーで洗浄し、次いで５．６ＵプロテイナーゼＫ（New England Biolabs）で全タンパク質を消化することによって捕捉した核酸を溶出した。溶出したＲＮＡをRNA Clean and Concentrator-5 Kit（Zima Research）を用いて精製し、ＲＴ−ｑＰＣＲを上記のように行って（１７）ＲＮＡ濃縮を評価した。免疫沈降に使用した抗体は、抗FLAG（登録商標）M2（Sigma-Aldrich; F1804）（ΔＴＭ−およびΔＲＳ−ＬＢＲトランスフェクト細胞用）、抗ＳＨＡＲＰ（Bethyl; A301-119A）、およびGenScriptからのカスタマイズＬＢＲ抗体（LBR #4; 540774‐1）であった。

架橋および免疫沈降（ＣＬＩＰ）分析．ドキシサイクリン誘導ｐＳＭ３３マウス雄性ＥＳ細胞を０．４ＪのＵＶ２５４で６時間架橋した。細胞を溶解し、ＲＮＡをＲＮアーゼＩで消化して、長さ１００〜５００ヌクレオチドのサイズ範囲を達成した。溶解調製物を、４℃で１時間プロテインＧビーズと混合することによって、予備清澄化した。各ＣＬＩＰサンプルについて、１０μｇの抗体および７５μｌのプロテインＧビーズを用いて２，０００万個の細胞から標的タンパク質を免疫沈降させた。抗体を室温で１時間混合しながらビーズに予備結合させた後、予備清澄化した溶解物をビーズ−抗体に４Ｃで一晩インキュベートした。免疫沈降後、ビーズを高塩濃度洗浄バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４，１ＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４０，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコール酸ナトリウム）で４回洗浄し、洗浄バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４，１０ｍＭＭｇＣｌ２，０．２％Tween-20）で４回洗浄した。次いで、１００ｍＭＤＴＴを含むＮＬＳ溶出バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５，１０ｍＭＥＤＴＡ，２％Ｎ−ラウロイルサクロシン，２．５ｍＭＴＣＥＰ）でＲＮＡを溶出した。次いで、サンプルを標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、ニトロセルロース膜に移し、目的のタンパク質の分子サイズより７５ｋＤａ上の領域を単離し、プロテイナーゼＫ（NEB）で処理し、続いてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐＨ６．５）抽出して、ＲＮＡを単離した。次いで、抽出したＲＮＡをRNA Clean & Concentrator^TM-5（Zymo）で精製した。脱リン酸化処理後、その内容全体が参照により本明細書に援用されるShishkin et al., 2015, Nat. Methods, 12:323-325に記載のMassively Multiplexed RNA Sequencing methodに従って、各サンプル中のＲＮＡを、各アダプターが固有のバーコード識別子を有するバーコード化アダプターの混合物に連結した。連結後、ビーズを１×ＰＢＳおよび界面活性剤、次いで５×ＰＢＳおよび界面活性剤で洗浄してから新しいチューブあたり３〜４種のＩＰをプールした。次いで、タンパク質およびＲＮＡを、６０℃で６Ｍの尿素および４０ｍＭのＤＴＴを用いてプロテインＧビーズから溶出した。タンパク質−ＲＮＡ複合体を遊離ＲＮＡから分離し、次いでタンパク質をプロテイナーゼＫで消化した。各プールのバーコード化ＲＮＡから、前出のEngreitz et al., 2014に以前に記載されているようにイルミナシークエンシングライブラリーを作製した。

入力サンプル：コントロールとして、「入力」ＲＮＡコントロールを各免疫沈降タンパク質についてシークエンシングした。これを行うために、免疫沈降工程の前に、全細胞溶解物の１０％をとっておいた。次に、これらのサンプルを免疫沈降サンプルと一緒にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、分析したタンパク質と同一の領域からゲル抽出した。シークエンシングライブラリーは、上記のようにこれらのサンプルから作製した。

ＣＬＩＰデータの分析．特定のタンパク質で免疫沈降をしたときのリードの数を、そのサイズが一致した入力コントロール（入力サンプル）中のリードの数と比較して正規化することにより、ＲＮＡ領域についての濃縮を計算し、視覚化した。具体的には、ＲＮＡ領域とオーバーラップするリードの総数を、免疫沈降サンプルまたは入力コントロールでカウントした。サンプル間のリードカバレッジの差異を説明するために、これらの数値の各々を同じ実験内のリードの総数に対して正規化した。これにより、各サンプル内で、領域ごとに正規化されたスコアが得られる。これらの正規化された値の比（ＩＰ／入力）をとることによって、濃縮メトリックを測定した。

入力コントロール中の同じ領域と比較して濃縮されている領域（「差次的濃縮」）および残りのＸｉｓｔＲＮＡ上の全ての他の領域と比較して濃縮されている領域（「局所的濃縮」）を同定することによって、ＸｉｓｔＲＮＡ上のタンパク質結合部位を同定した。差次的濃縮は、ＲＮＡの特定の領域におけるリードの積み重ねをもたらすが、真のタンパク質結合部位を反映しないサイズ選択された入力サンプル中のバイアスを説明する。対照的に、局所的濃縮は、所与のＲＮＡが、入力と比較して、タンパク質結合の全体的レベルがより高い可能性がある場合を説明する。有意な濃縮を計算するために、上記で定義されている差次的濃縮（ＩＰ／入力）を各ウィンドウ（ウィンドウサイズ＝１００ヌクレオチド）について計算した。各領域についての正規化されたリードの数（ＩＰ）を取り、それをＸｉｓｔＲＮＡ全体における正規化されたリードの数で割ることによって、各領域について局所的濃縮を計算した。これらの率を比較可能にするために、比をとる前に各数をそれらのそれぞれの領域の長さで割った。次いで、ＩＰサンプルにおけるリードの１，０００のランダム置換を生じさせ、ＸｉｓｔＲＮＡにわたって入力サンプルを対にした。各置換について、差次的濃縮および局所的濃縮を計算し、各置換について観察された最大値の経験分布を得た。観察された差次的濃縮値および局所的濃縮値をこれらの置換分布と比較することによって、多重検定補正ｐ値を各領域に割り当てた。差次的ｐ値＜０．０１および局所的ｐ値＜０．０１を有する有意なウィンドウを同定した。

５３５〜１６０８ヌクレオチド（ＬＢＳ−１）、９５０６〜１０２４５ヌクレオチド（ＬＢＳ−２）、および１１７３２〜１１９５６ヌクレオチド（ＬＢＳ−３）からの３つのＬＢＲ結合部位を同定した。Ｘｉｓｔ上の３１７〜１０５６ヌクレオチドからのＳＨＡＲＰ結合部位および１０８５９〜１１３４４ヌクレオチドからのＰＴＢＰ１結合部位も同定した。

ΔＬＢＳおよびΔＬＢＳ−ＢｏｘＢＸｉｓｔの作製．ΔＬＢＳおよびΔＬＢＳ−ＢｏｘＢをＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトを使用して作製した。ΔＬＢＳおよびΔＬＢＳ−ＢｏｘＢ細胞を作製するために、マウスｐＳＭ３３ＥＳ細胞およびＸｉｓｔ−ＢｏｘＢ細胞を、ＸｉｓｔのＬＢＳ−１領域に隣接する２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ配列：ＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣ（配列番号９）およびＴＡＡＧＧＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＣＧＣＴＴ）（配列番号１０）でトランスフェクトし、上記のＣａｓ９コンストラクトと共にコトランスフェクトして、非相同末端結合によるＬＢＳ−１の欠失を作り出した。単一コロニーを両方の細胞株についてトランスフェクト細胞から単離し、ＸｉｓｔのＡリピート領域に隣接するプライマーを使用するＰＣＲおよびサンガーシークエンシングを用いて、ＬＢＳ−１領域がゲノムから欠失されたことを確認した。ＸｉｓｔＲＮＡ全体にわたって、ＩＰ−ｑＰＣＲおよびＣＬＩＰシークエンシングを用いて、ΔＬＢＳがＬＢＲタンパク質の結合に影響を与えることを確認した。ＩＰ−ｑＰＣＲを用いて、ＳＨＡＲＰ結合に影響がないことも確認した。

ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢサイレンシング．安定なＬＢＲおよびＳＨＡＲＰノックダウン細胞を作製するために、Ｅｆ１ａプロモーターによって駆動されるｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびＬＢＲ（ｓｇＲＮＡ配列：ＣＧＧＧＡＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧ）（配列番号１１）またはＳＨＡＲＰ（ｓｇＲＮＡ配列：ＣＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧ）（配列番号１２）の転写開始部位付近の領域を標的とするスキャフォールド構造を有するガイドＲＮＡを発現するピューロマイシン耐性コンストラクトをコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Sigma-Aldrich）で４日間選択して、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢを含む細胞を濃縮した。ＦＩＳＨを使用して、ピューロマイシン選択の４日後に、これらのピューロ耐性細胞の＞９０％が検出可能な量のｍＲＮＡを有しなかったことを確認した。

ＬＢＲタンパク質突然変異誘発．ＬＢＲの全長ＯＲＦを含むヒトｃＤＮＡをGatewayエントリークローンとしてDNASUプラスミドレポジトリから得、LR組み換え反応（Invitrogen）を用いてｐＣＡＧ−ＧＷ−λＮ−３ｘＦＬＡＧ−ＢＳＤベクターに挿入した。ΔＲＳ−ＬＢＲおよびΔＴＭ−ＬＢＲを作製するために、λＮ−３ｘＦＬＡＧタグ付き全長ＬＢＲコンストラクトを、欠失領域に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ媒介欠失を使用してトランケートした。

ｃＤＮＡレスキューコンストラクトの発現．マウスＥＳ細胞を、上記からのヒトΔＲＳ−ＬＢＲ、ΔＴＭ−ＬＢＲ、または全長ＬＢＲコンストラクトを発現する哺乳動物発現ベクター（ｐＣＡＧ−ＧＷ−λＮ−３ｘＦＬＡＧ−ＢＳＤベクター）と共にNeon（登録商標）トランスフェクションシステム（Invitrogen）を用いてエレクトロポレーションした。内因性ＬＢＲを、マウスＬＢＲのみを標的とし、ヒトＬＢＲを標的としないDharmacon製のｓｉＲＮＡプール（ON-TARGETplus SMARTpool siRNA）で細胞を処理することによってノックダウンした。ヒト全長ＬＢＲコンストラクトが内因性ＬＢＲがノックダウンされた細胞をレスキューできることを確かめることによって、ｓｉＲＮＡがマウスＬＢＲを特異的に標的とすることを確認した。

λＮ−３ｘＦＬＡＧエピトープタグ付きタンパク質の作製．λＮ−３ｘＦＬＡＧ−タグ付きタンパク質発現および免疫沈降のために、Neon（登録商標）トランスフェクションシステム（Invitrogen）を用いて、ＣＡＧによって駆動される、Ｃ末端λＮ−３ｘＦＬＡＧタグ付きＯＲＦの発現をコードする、哺乳類発現ベクター（ｐＣＡＧ−ＧＷ−λＮ−３ｘＦＬＡＧ−ＢＳＤ）でマウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションした。GatewayエントリークローンとしてDNASUプラスミドレポジトリからＧＦＰ、ＬＢＲ、ＳＨＡＲＰ、ＥＥＤ１、およびＬＭＮＢ１のヒトＯＲＦを得、LR組み換え反応（Invitrogen）を用いてｐＣＡＧ−ＧＷ−λＮ−３ｘＦＬＡＧ−ＢＳＤに挿入した。トランスフェクトした細胞を４μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Blasticidin）（InvivoGen）で選択して、タグ付きタンパク質ＦｏｒＬＢＲ−ＭＣＰを発現する細胞を濃縮し、LR組み換え反応（Invitrogen）を用いてＬＢＲのＯＲＦをＥｆ１ａ−ＧＷ−ＭＣＰ−Ｖ５−Ｎｅｏベクターに挿入し、２００μｇ／ｍＬのGeneticin／Ｇ４１８（Invitrogen）で選択した。分析のために、免疫蛍光染色を３ｘＦＬＡＧまたはＶ５エピトープに対する抗体（後述）と共に使用して、タグ付きタンパク質を発現している細胞を選択した。λＮ−３ｘＦＬＡＧタグ付きタンパク質が内因性タンパク質の欠失を復帰することができることを確認することによって、λＮ−３ｘＦＬＡＧタグ付きタンパク質をやはり機能性であると確認した（図３５Ａ〜３５Ｂ）。

一分子ＲＮＡＦＩＳＨ．製造者のプロトコルに従って、QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay（Affymetrix）およびQuantiGene ViewRNA ISH Cell 740 Module（Affymetrix）を用いて、一分子ＲＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験を行った。カバーガラス上に固定された細胞を、最初に、室温で５分間、Detergent Solution QCで透過処理し、次いでProbe Set Diluent QF中のプローブセット（Affymetrix）の所望の混合物と共に４０℃で３時間インキュベートし、続いて、PreAmplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Amplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Label Probe Mixと共に４０℃で３０分間、順次インキュベートした。ＤＡＰＩ染色では、ＰＢＳ中３０ｎＭのＤＡＰＩ中で、室温で１５〜２０分間、カバーガラスをインキュベートした。ＦＩＳＨ用のプローブセットおよび結合されるフルオロフォアは、ＴＹＰＥ１−ＸＩＳＴ（５５０ｎｍ）、ＴＹＰＥ４−ＧＰＣ４（４８８ｎｍ）、ＴＹＰＥ１０−ＡＴＲＸ（７４０ｎｍ）、およびＴＹＰＥ６−ＳＨＡＲＰ、ＬＢＲ、ＬＭＮＢ１、ＥＭＤ（６５０ｎｍ）であった。

免疫蛍光法およびＲＮＡＦＩＳＨ．免疫蛍光法（ＩＦ）では、細胞をカバーガラス上に固定し、室温で１０分間ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理し、室温で１０分間ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清でブロッキングした。次いで、細胞を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、続いて二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、上記のように、サンプルをＲＮＡＦＩＳＨプロトコルを用いて処理した。ＩＦに使用した一次抗体および希釈物は、抗ラミンＢ１（Abcam; ab16048）（１：１００）、および抗FLAG（登録商標）M2（Sigma-Aldrich; F1804）（１：１００）であった。ＩＦに使用した二次抗体および希釈物は、Alexa Fluor（登録商標）488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦ（ａｂ’）２断片（Life Technology; 1618692）（１：１００）および高ｘ−ａｄｓ（highly x-ads） DyLight（登録商標）650ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Bethyl; A120-201D5）であった。

顕微鏡イメージング．ＦＩＳＨおよびＩＦ／ＦＩＳＨサンプルを、Leica HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2対物レンズを備えたLeica DMI 6000 Deconvolution Microscopeを使用してイメージングした。TYPE 10-ATRX（７４０ｎｍ）で染色したサンプルを、Nikon CFI Plan Apochromat λ DM 60x/1.40油浸対物レンズを備えたNikon Ti Eclipseを用いてイメージングした。画像を最大投影（３μｍ；ステップサイズ，０．２μｍ）で投影した。

Ｘ染色体サイレンシングアッセイ．細胞を、ＦＩＳＨによってＸｉｓｔＲＮＡ、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡ、ＡｔｒｘｍＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ標的化ｍＲＮＡについて染色し、イメージングした。次に、画像をMatlab R2013bを使用して分析した（後述）。標的化ｍＲＮＡのコピー数がｓｉＲＮＡで処理されていない細胞のレベルの３０％未満である場合、および細胞がＸｉｓｔ発現を誘導する場合、細胞を選択した。これらの細胞内で、Ｇｐｃ４ｍＲＮＡおよびＡｔｒｘｍＲＮＡのコピー数をピーク検出法（後述）を用いて定量し、条件間で比較した。ｍＲＮＡレベルを５０個の個々の細胞について定量した。Ｘｉｓｔ発現も、ｓｉＲＮＡ処理細胞において評価し、未処理細胞と比較して、いずれのｓｉＲＮＡ条件においても、Ｘｉｓｔ発現を誘導した細胞のパーセンテージに差は観察されなかった。

一分子ＦＩＳＨによるｍＲＮＡの定量．全ての画像分析を、Image Processing toolboxからの組み込み機能を利用するMatlab（バージョンR2013b）を使用して実施した。バックグラウンドを除去するために、画像を最初に２次元メディアンフィルターを用いてフィルター処理した。細胞境界をＤＡＰＩ染色を頼りに手動で縁取り、バイナリマスクを作成し、同じ視野から様々なチャンネルに適用した。個々の焦点を強調するバックグラウンド除去法であるＴｏｐ−ｈａｔ形態学的フィルタリングを画像に適用した、前出のTheodosiou et al., 2007。次いで、細胞内の局所的最大シグナルを同定する２Ｄピーク検出アルゴリズムを用いてスポットを同定した。局所的最大値が同定されたら、各細胞についてスポットの数を数えた。

ＸｉｓｔクラウドとＬａｍｉｎＢ１との間の距離の計算．個々の細胞の核をＤＡＰＩ染色を用いて手動で同定した。強度による閾値を使用して、核内の画像を分割し、高強度の連続した２次元領域を見つけることによって、Ｘｉｓｔクラウド、ラミンＢ１領域、および核領域を同定した。その内容全体が参照により本明細書に援用される、Fumagalli et al., 2012, Nat. Cell. Biol. 14:355-365に以前に記載されている大津法に基づいて、閾値を決定した。大津法は、画像を２つのビン−高および低−に分割し、区画内の分散を最小にする閾値を特定する。これにより、画像上にバイナリマスクが作成される。このバイナリマスクがＸｉｓｔクラウドおよびラミンＢ１領域を正確に反映していることが視覚的に確認された。ＸｉｓｔクラウドとラミンＢ１との間の各ピクセルの距離を計算し、カスタマイズされたFijiマクロスクリプトを用いて最小値を見つけることによって、ＸｉｓｔクラウドとラミンＢ１との間の距離を求めた。核の面積（Ａｒｅａ）をFijiを使用して測定し、核の半径（ｒ）をｒ＝√（Ａｒｅａ／π）を使用して計算した。ラミンＢ１蛍光シグナルがＸｉｓｔ区画について検出される蛍光シグナルとオーバーラップする場合、距離をゼロに設定した。

Ｘｉｓｔクラウドとゲノム遺伝子座との間の距離の計算．核面積およびＸｉｓｔクラウドを上記の方法を用いて同定した。ゲノム遺伝子座は、上記のようにｓｍＦＩＳＨを用いて遺伝子のイントロン領域に対するプローブを用いてＲＮＡＦＩＳＨにより決定した（ＴＹＰＥ４−ＧＰＣ４（イントロン１）、ＮＯＴＣＨ２（イントロン１）、およびＸＩＳＴ（イントロン１）（４８８ｎｍ））。スポットをFijiでAnalyze Particle機能を用いて同定し、核内で最高の蛍光強度を有するスポットを選択した。（ＸＩＳＴおよびＧＰＣ４については）２つ以上のスポットまたは（ＮＯＴＣＨ２については）２つのスポットを含む少数の画像を捨てた。ＸＩＳＴおよびＧＰＣ４遺伝子座については、Ｘｉｓｔクラウドと遺伝子座との間の距離を、上記のカスタマイズされたFijiマクロスクリプトを用いてＸｉｓｔクラウドと遺伝子座との間の最小距離を見つけることによって求めた。ＮＯＴＣＨ２遺伝子座については、Ｘｉｓｔクラウドと遺伝子座との間の距離を、Ｘｉｓｔクラウドと２つの遺伝子座との間の最小距離を平均することによって求めた。

（ＸＩＳＴおよびＧＰＣ４については）Ｘｉｓｔに関するこれらの蛍光シグナルと、または（ＮＯＴＣＨ２については）Ｘｉｓｔ区画からの蛍光シグナルとオーバーラップする２つの遺伝子座のうちのいずれか１つの蛍光シグナルと遺伝子座の蛍光シグナルがオーバーラップする場合、遺伝子座をＸｉｓｔクラウドの内側にあると同定した。

ＲＮＡアンチセンス精製（ＲＡＰ）．６時間ドキシサイクリン誘導した１，０００万個のマウスＥＳ細胞を作製し、ＸｉｓｔＲＮＡを前出のEngreitz et al., 2013に記載のように捕捉し精製した。ＸｉｓｔＲＮＡ捕捉では、ＸｉｓｔＲＮＡの全長にわたるアンチセンス５’ビオチン化９０マーＤＮＡオリゴヌクレオチド（Eurofins Operon）を、前述のように使用した（２３）。捕捉されたＤＮＡを溶出するために、ビーズを２０μＬのＲＮアーゼＨバッファー（NEB Biolabs）中１５ＵＲＮアーゼＨと共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＲＮアーゼＨで消化したサンプルを新しいチューブに移した。架橋を元に戻すために、２５μＬのハイブリダイゼーションバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭＥＤＴＡ，３ｍＭＥＧＴＡ，１５０ｍＭＬｉＣｌ，１％ＮＰ−４０，０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシン，０．１２５％Ｎａ−デオキシコール酸，３Ｍチオシアン酸グアニジニウム，２．５ｍＭＴＣＥＰ）、１２５μＬＮＬＳ溶出バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＥＤＴＡ，２％Ｎ−ラウロイルサルコシン，２．５ｍＭＴＣＥＰ）、５００ｍＭＮａＣｌ、および４ＵプロテアーゼＫ（NEB Biolabs，Molecular Biology Grade）を添加し、６０℃で一晩インキュベートした。前出のEngreitz et al., 2013、およびその内容全体が参照により本明細書に援用されるEngreitz et al., 2014, Cell, 159:188-189に記載されているように、溶出したＤＮＡをシークエンシングし、アラインメントし、分析した。

総合遺伝子分析．Ｘｉｓｔ濃縮は、遺伝子の上流および下流の１００Ｋｂ、遺伝子の始まりおよび終わりで始まる１０Ｋｂ、および遺伝子の中央を中心とする２０Ｋｂについて５００ｂｐウィンドウで平均した。Ｘｉｓｔ転写遺伝子座の５Ｍｂ以内の遺伝子は、平均Ｘｉｓｔ濃縮に関して異常値を表すため、分析から除外した。DeepToolsおよびGvizを使用してプロットを作成および視覚化した。「活性」および「不活性」遺伝子を、前出のEngreitz et al., 2013に記載されているように定義した。前出のEngreitz et al., 2014に記載のように、クロマチンＲＮＡ−Ｓｅｑレベルから計算したＲＰＫＭレベルに基づいて発現レベルを分割した。１より大きいＲＰＫＭ発現を有する遺伝子のみを考慮した。５を超えるＲＰＫＭ発現を有する遺伝子は、非常に活発に転写される遺伝子として分類される。
実施例１８．ＭＬＦ細胞における再活性化のための材料および方法図７Ａ〜７Ｉ

マウスＭＬＦ細胞培養および阻害剤処理．５，０００個のマウスＭＬＦ細胞を、ＨＥＫ培地（ＤＭＥＭ，１０％Gemini Benchmark ＦＢＳ，１×Ｌ−グルタミン，１×ピルビン酸ナトリウム，１×ＮＥＡＡ，１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；特記がないものはLife Technologies）を含有する２４ウェルプレートのウェルに配置されたポリ−Ｄ−リジン（Sigma）および０．２％ゼラチン（Sigma）がコートされた＃１．５カバーガラス上に播種した。１６時間後、阻害剤を培地に添加し、細胞を４８時間インキュベートした。別段の定めがない限り、使用した阻害剤および濃度は以下である：５−アザシチジン（６μＭ；Sigma, A2385）、５−アザ−２'−デオキシシチジン（０．３μＭ；Sigma, A3656）、ＲＧ１０８（２００μＭ；Abcam, ab141013）、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（５μＭ；Sigma, T8552）、およびスクリプタイド（Scriptaid）（１００ｎＭ；Sigma, S7817）。

ｓｉＲＮＡトランスフェクション．ｓｉＲＮＡノックダウン実験では、２０ｎＭＤＮＭＴ１およびＨＤＡＣ３ｓｉＲＮＡ（Dharmacon，ON-TARGETplus SMARTpool siRNAs；ＨＤＡＣｓｉＲＮＡ：カタログ番号：L-043553-02-0005；ＤＮＭＴ１ｓｉＲＮＡカタログ番号L-044147-01-0005）を混合し、Neon（登録商標）トランスフェクションシステム（設定：１２００Ｖ，４０ｍｓ幅，１パルス）を用いてトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、ｓｉＲＮＡを用いる１０μＬのトランスフェクションを１００，０００細胞を用いて連続して行い、４８時間、ＨＥＫ培地を含有する２４ウェルプレートのウェルに入れたポリ−Ｄ−リジン（Sigma）および０．２％ゼラチン（Sigma）がコートされた＃１．５カバーガラス上に蒔いた。分析した各細胞について、ｓｉＲＮＡが標的化ｍＲＮＡ発現を＞７０％成功裏に減少させることが確認された。

一分子ＲＮＡＦＩＳＨ．ｓｉＲＮＡトランスフェクションまたは阻害剤処理からのカバーガラスをHistochoice（登録商標）（Sigma）中で１０分間固定し、ＰＢＳ中で充分に洗浄し、エタノール中で脱水し、ＦＩＳＨ染色まで保存した。製造者のプロトコルに従って、QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay（Affymetrix）およびQuantiGene ViewRNA ISH Cell 740 Module（Affymetrix）を用いて、一分子ＲＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験を行った。具体的には、カバーガラス上に固定された細胞を、最初に、室温で５分間、Detergent Solution QCで透過処理し、次いでProbe Set Diluent QF中のプローブセット（Affymetrix）の所望の混合物と共に４０℃で３時間インキュベートし、続いて、PreAmplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Amplifier Mixと共に４０℃で３０分間、Label Probe Mixと共に４０℃で３０分間、順次インキュベートした。ＤＡＰＩ染色では、ＰＢＳ中３０ｎＭのＤＡＰＩ中で、室温で１５〜２０分間、カバーガラスをインキュベートした。ＦＩＳＨ用のプローブセットおよび結合されるフルオロフォア（励起波長）は、ＴＹＰＥ４−ＧＰＣ４、ＭＥＣＰ２、ＳＭＣ１Ａ（４８８ｎｍ）、ＴＹＰＥ１０−ＡＴＲＸ（７４０ｎｍ）、およびＴＹＰＥ６−ＥＭＤ（６５０ｎｍ）であった。

顕微鏡イメージング．ＦＩＳＨサンプルを、Leica HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2対物レンズを備えたLeica DMI 6000 Deconvolution Microscopeを使用してイメージングした。TYPE 10-ATRX（７４０ｎｍ）で染色したサンプルを、Nikon CFI Plan Apochromat λ DM 60x/1.40油浸対物レンズを備えたNikon Ti Eclipseを用いてイメージングした。画像を最大投影（３μｍ；ステップサイズ，０．２μｍ）で投影した。３Ｄデコンボリューション用サンプルを、Leica HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2対物レンズを備えたLeica DMI 6000 Deconvolution Microscopeを使用してイメージングした（１５μｍ；ステップサイズ，０．０２μｍ）。

Ｘ染色体再活性化アッセイ．標的ｍＲＮＡ（例えば、Ｘ連鎖Ｇｐｃ４ｍＲＮＡ、Ｘ連鎖ＭｅＣＰ２ｍＲＮＡ、または示されているもの)およびｓｉＲＮＡ標的化ｍＲＮＡについてＦＩＳＨにより細胞を染色し、イメージングした。次に、画像をMatlab R2013bを使用して分析した（後述）。ｓｉＲＮＡ標的化の場合、標的化ｍＲＮＡのコピー数がｓｉＲＮＡで処理されていない細胞のレベルの３０％未満である場合、および細胞がＸｉｓｔ発現を誘導する場合、細胞を選択した。これらの細胞内で、標的ｍＲＮＡのコピー数をピーク検出法（後述）を用いて定量し、条件間で比較した。ｍＲＮＡレベルを５０個の個々の細胞について定量した。

一分子ＦＩＳＨによるｍＲＮＡの定量．全ての画像分析を、Image Processing toolboxからの組み込み機能を利用するMatlab（バージョンR2013b）を使用して実施した。バックグラウンドを除去するために、画像を最初に２次元メディアンフィルターを用いてフィルター処理した。細胞境界をＤＡＰＩ染色を頼りに手動で縁取り、バイナリマスクを作成し、同じ視野から様々なチャンネルに適用した。個々の焦点を強調するバックグラウンド除去法であるＴｏｐ−ｈａｔ形態学的フィルタリングを画像に適用した。次いで、細胞内の局所的最大シグナルを同定する２Ｄピーク検出アルゴリズムを用いてスポットを同定した。局所的最大値が同定されたら、各細胞についてスポットの数を数えた。Ｘ再活性化のパーセンテージは、各条件の平均スポット数を未処理細胞中の平均スポット数に対して正規化し、その値から１を引くことによって計算される。

活性Ｘ染色体数の定量．ｓｍＦＩＳＨを用いてＰｇｋ１／ＰＧＫ１ＲＮＡのイントロン領域に対するプローブを使用して、ＲＮＡＦＩＳＨにより、活性Ｘ染色体の数を求めた。次いで、細胞内の局所的最大シグナルを同定する２Ｄピーク検出アルゴリズムを用いてスポットを同定した。局所的最大値が同定されたら、各細胞についてスポットの数を数えた。細胞をＣｙｃｌｉｎＥ抗体（Abcam；マウス細胞についてはab33911；ヒト細胞についてはab32103）で免疫共染色し、ＣｙｃｌｉｎＥ陽性細胞を選択することにより、細胞周期のＧ１期にある細胞を選択した。

本発明を特定の例示的な実施形態を参照して例示し説明してきたが、当業者であれば、以下の特許請求の範囲に規定されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、説明した実施形態に対して様々な修正および変更をなし得ることを理解するであろう。

Claims

細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子の発現を活性化するための組成物であって、
前記細胞に対して細胞毒性ではないヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）メチル化の阻害剤と、
を含んでなる前記組成物。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が少なくともＨＤＡＣ３タンパク質を阻害する、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、前記細胞に対して細胞毒性を示すことなく、ＨＤＡＣ３活性を阻害する濃度である、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（abexinostate））、ＣＵＤＣ−１０１、レスミノスタット（Resminostat）、モセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、４ＳＣ−２０２、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、ロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記ＤＮＡメチル化の阻害剤が、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（５−アザ−２’−ｄｃ）、ＲＧ１０８、ＳＧＩ−１０２７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子を活性化する方法であって、
請求項１に記載の組成物を前記細胞に投与すること
を含んでなる前記方法。
前記細胞が対象内にある、請求項７に記載の方法。
前記細胞が有糸***後細胞である、請求項７に記載の方法。
前記沈黙化Ｘ染色体遺伝子がＸｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子である、請求項７に記載の方法。
細胞内で沈黙化Ｘ染色体遺伝子を活性化する方法であって、
沈黙化Ｘ染色体遺伝子を有する前記細胞に再活性化組成物を投与することを含んでなり、前記再活性化組成物が、
前記細胞に対して細胞毒性ではないヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含んでなる、
前記方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、前記細胞に対して細胞毒性を示すことなく、ＨＤＡＣ３活性を阻害する濃度である、請求項１１に記載の方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、ＲＧ２８３３（ＲＧＦＰ１０９）、ＰＣＩ−２４７８１（アベキシノスタット（abexinostate））、ＣＵＤＣ−１０１、レスミノスタット（Resminostat）、モセチノスタット（Mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、ＨＰＯＢ、エンチノスタット（Entinostat）（ＭＳ０２７５）、ドロキシノスタット（Droxinostat）、４ＳＣ−２０２、トリコスタチン（Trichostatin）Ａ（ＴＳＡ）、ロシリノスタット（Rocilinostat）（ＡＣＹ−１２１５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＳＡＨＡ、ＲＧＦＰ９６６、スクリプタイド（Scriptaid）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記再活性化組成物が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）メチル化の阻害剤をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
前記ＤＮＡメチル化の阻害剤が、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（５−アザ−２’−ｄｃ）、ＲＧ１０８、ＳＧＩ−１０２７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
前記細胞が対象内にある、請求項１１に記載の方法。
前記細胞が有糸***後細胞である、請求項１１に記載の方法。
前記沈黙化Ｘ染色体遺伝子がＸｉｓｔ依存性沈黙化Ｘ染色体遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が少なくともＨＤＡＣ３タンパク質を阻害する、請求項１１に記載の方法。