JP2019528726A - マルチプレックスリアルタイムｐｃｒを実施する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、タグ付き加水分解プローブを用いて標的核酸を検出及び定量するためのより高度に多重化されたリアルタイムＰＣＲを実施する方法を記載する。【選択図】図１

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための方法、具体的にはマルチプレックスリアルタイムＰＣＲを実施するための方法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物医学研究、疾患モニタリング、及び診断の普遍的なツールとなっています。ＰＣＲによる核酸配列の増幅は、米国特許第４６８３１９５号明細書、同第４６８３２０２号明細書、及び同第４９６５１８８号明細書に記載されている。今日、ＰＣＲは当該技術分野において周知であり、科学文献に広く記載されている。ＰＣＲの応用（PCR Applications）（(1999) Innis et al., eds., Academic Press、サンディエゴ）、ＰＣＲの戦略（PCR Strategies）（(1995) Innis et al., eds., Academic Press、サンディエゴ）ＰＣＲのプロトコール（PCR Protocols）（(1990) Innis et al., eds., Academic Press、サンディエゴ）、及びＰＣＲの技術（PCR Technology）（(1989) Erlich, ed., Stockton Press、ニューヨーク）を参照。「リアルタイム」ＰＣＲアッセイは、標的配列の開始量を同時に増幅、検出、及び定量することができる。ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性を用いる基本的なＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイは、Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280及び米国特許第５２１００１５号明細書に記載されている。ヌクレアーゼ活性なしでのリアルタイムＰＣＲ（ヌクレアーゼフリーアッセイ）は、２００８年１２月９日に出願された米国特許出願第１２／３３０６９４号明細書に記載されている。リアルタイムＰＣＲにおける蛍光プローブの使用は、米国特許第５５３８８４８号明細書に記載されている。
蛍光プローブを使用した典型的なリアルタイムＰＣＲプロトコールでは、各標的配列に特異的な標識プローブを使用する。プローブは、特定の波長の光を吸収及び放出する１つ以上の蛍光部分で標識されていることが好ましい。標的配列又はそのアンプリコンにハイブリダイズすると、プローブのハイブリダイゼーション又は加水分解の結果として、プローブは蛍光発光の検出可能な変化を示す。
しかし、リアルタイムアッセイの大きな課題は、依然として、１本のチューブで多数の標的を分析する能力にある。医学及び診断学の事実上あらゆる分野において、関心対象の遺伝子座の数は急速に増加している。例えば、いくつか例を挙げると、法医学的ＤＮＡプロファイリング、病原性微生物の検出、多遺伝子座遺伝性疾患スクリーニング、及び多遺伝子発現研究において複数の遺伝子座を分析しなければならない。
現在の方法の大部分では、アッセイを多重化する能力は検出機器によって制限されている。具体的には、同一反応で複数のプローブを使用するには、異なる蛍光標識を使用する必要がある。複数のプローブを同時に検出するためには、機器は各プローブによって放出された光シグナルを識別できなければならない。市場に出ている現在の技術の大部分は、同じ反応容器中でせいぜい４〜７つの別個の波長しか検出できない。したがって、標的ごとに１つの独自に標識されたプローブを使用して、同じ容器内で４〜７つの別個の標的しか検出することができない。実際には、少なくとも１つの標的は通常対照核酸である。したがって、実際には、３〜６つの実験標的しか同じチューブ内で検出することができない。また、顕著な重なり干渉なしに可視スペクトル内に約６又は７個の色素しか適合できないスペクトル幅に起因して、蛍光色素の使用にも制限がある。したがって、増幅及び検出戦略において根本的な変更がなされない限り、アッセイを多重化する能力は臨床的ニーズに追いつかないことになる。
リアルタイム増幅反応を多重化する追加の能力は、ＰＣＲ後の融解アッセイによってもたらされる。２００６年６月２３日に出願された米国特許出願第１１／４７４０７１号明細書を参照。融解アッセイにおいて、増幅された核酸はその独自の融解プロファイルにより同定される。融解アッセイは、二本鎖標的、又は標識プローブと標的の二本鎖の融解温度（融点）を決定することを含む。米国特許第５８７１９０８号明細書に記載されているように、蛍光標識プローブを使用して融解温度を決定するために、標的核酸とプローブの二本鎖は制御温度プログラムで徐々に加熱（又は冷却）される。二本鎖の解離は、相互作用する蛍光色素分子間又は蛍光色素分子とクエンチャーの間の距離を変える。相互作用する蛍光色素分子は、米国特許第６１７４６７０号明細書に記載されているように、別個のプローブ分子に結合させることができる。代替的に、米国特許第５８７１９０８号明細書に記載されているように、一方の蛍光色素分子をプローブに結合させ、もう一方の蛍光色素分子を核酸二本鎖に挿入してもよい。さらに別の方法として、蛍光色素分子を単一のプローブオリゴヌクレオチドに結合させてもよい。二本鎖が融解すると、クエンチャーに対する蛍光色素分子が一本鎖プローブ中で一緒になるので蛍光はクエンチされる。
核酸二本鎖の融解は、関連する蛍光の変化を測定することによってモニターされる。蛍光の変化は、「融解プロファイル」と呼ばれるグラフ上に表すことができる。異なるプローブ−標的二本鎖が異なる温度で融解（又は再アニール）しうるように設計できるので、各プローブは独自の融解プロファイルを生成することになる。適切に設計されたプローブは、同じアッセイにおいて他のプローブの融解温度と明確に区別できる融解温度を有することになる。多くの既存のソフトウェアツールは、これらの目的を念頭に置いて、同一チューブマルチプレックスアッセイ用のプローブを設計することを可能にする。例えば、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（商標）ソフトウェア（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．、アナーバー、ミシガン州）は、さまざまな反応条件下で核酸二本鎖の融解温度を決定することを可能にする。
色検出及びそれに続く増幅後融解アッセイを用いるマルチプレックスＰＣＲの方法は、米国特許第６４７２１５６号明細書に記載されている。そのような方法によって検出可能な標的の数は、検出可能な波長の数と識別可能な融解プロファイルの数との積である。したがって、色検出に融解アッセイを追加することは、複数の標的を検出する能力において一歩前進した。
増幅後融解アッセイは最も一般的には定性的な目的、すなわち標的核酸を同定するために使用される。米国特許第６１７４６７０号明細書、同第６４２７１５６号明細書、及び同第５８７１９０８号明細書を参照。融解曲線関数を微分することによって融解ピークが得られることが知られている。Ririe et al. ("Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction," (1997) Anal. Biochem. 245:154-160)には、生成物の混合物によって作成された融解曲線を分析するのに微分は有用であることが述べられている。微分した後、混合物の各構成成分によって生じる融解ピークは容易に区別可能になる。また、増幅後融解シグナル、すなわち融解ピークが、試料中の核酸の量に比例して高いことも以前にから知られている。例えば、米国特許第６２４５５１４号明細書は、二本鎖挿入色素を使用して微分融解ピークを作成し、次いで専有ソフトウェアを使用してそのピークを積分する増幅後融解アッセイを教示している。積分は、増幅の効率及び増幅された核酸の相対量についての情報をもたらす。
実際には、定性的アッセイのほかに、同一サンプル中の複数の標的を定量できることが望ましいであろう。例えば、Sparano et al. "Development of the 21-gene assay and its application in clinical practice and clinical trials," J. Clin. Oncol. (2008) 26(5):721-728を参照。標的の量を定量できることは、患者の血清中のウイルス量の決定、薬物療法に応答した遺伝子の発現レベルの測定、又はその療法に対する応答を予測するための腫瘍の分子署名（molecular signature）の決定などの臨床用途において有用である。
リアルタイムＰＣＲアッセイでは、標識プローブによって生成されたシグナルを使用して、投入標的核酸の量を推定することができる。投入量が大きいほど、蛍光シグナルは所定の閾値（Ｃｔ）を早く越える。したがって、試料を互いに、又は既知量の核酸を有する対照試料と比較することによって、標的核酸の相対量又は絶対量を決定することができる。しかし、既存の方法には、複数の標的を同時に定量する能力に限りがある。複数の標的の定性的検出と同様に、制限要因はスペクトル的に分解可能な蛍光色素分子の利用可能性である。上記で説明したように、最先端の蛍光標識技術は、同一チューブ内の６又は７つより多い別個の蛍光標識プローブから異なるシグナルを得ることができない。したがって、リアルタイムＰＣＲの間に多数の核酸標的の増幅及び検出を可能にするためには、根本的に異なる実験的アプローチが必要とされる。
標的核酸を検出するための方法は数多く知られている。現在利用可能な核酸検出のためのホモジニアスアッセイとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒ（登録商標）、色素結合、対立遺伝子選択的キネティックＰＣＲ、及びＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーアッセイが含まれる。これらのアッセイ手順は、検出されるべき各標的核酸に対して異なる色素を必要とするために容易には多重化されず、したがってその改良の可能性が制限される。そのような制限を克服するために、いくつかの最近の研究は、容易に分離及び検出できる切断可能な「タグ」部分を含むオリゴヌクレオチドプローブの使用を開示している（例えば、Chenna et al、米国特許出願公開第２００５／００５３９３９号明細書、Van Den Boom、米国特許第８１３３７０１号明細書を参照）。より最近では、構造に基づいたオリゴヌクレオチドプローブの切断を用いることによってマルチプレックス核酸標的同定を行うための改良された方法が、米国特許出願公開第２０１４／０２７２９５５号明細書、同第２０１５／０１７６０７５号明細書、同第２０１５／０３７６６８１号明細書に記載されている。「プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Probing and Tagging Oligonucleotide）」（ＰＴＯ）及び「キャプチャリングアンドテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Capturing and Templating Oligonucleotide）」（ＣＴＯ）の組み合わせを用いることによって、いわゆるＰＴＯ切断及び伸長アッセイでＤＮＡ又は核酸の混合物から標的核酸配列を検出するさらなる方法が、Chun et al.米国特許第８８０９２３９号明細書に記載されている。しかし、標的核酸のハイスループットのマルチプレックス検出を実行するための正確な方法に対する必要性が依然として存在する。
本発明は核酸配列検出、具体的にはリアルタイムＰＣＲアッセイを用いた複数の標的核酸の検出のための新規の方法を提供する。この方法は、２つの独自の特徴、非相補的タグ部分とクエンチング分子を有する新規のオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行われる。
したがって、１つの態様では、本発明は、（ａ）単一の反応容器内で標的核酸配列を含む試料を、（ｉ）各オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸の部分配列の逆鎖にハイブリダイズできる１つのオリゴヌクレオチドプライマー対、（ｉｉ）アニーリング部分及びタグ部分を含み、タグ部分が、標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列又は非ヌクレオチド分子を含み、アニーリング部分が、標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された標的核酸の部分配列の領域にハイブリダイズし、タグ部分又はアニーリング部分に位置するレポーター部分及びアニーリング部分に位置する第１のクエンチャー部分を含む相互作用標識をさらに含み、レポーター部分がヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチャー部分から分離され、レポーター部分をクエンチできる１つ以上のクエンチャー部分を含む又はそれと結合しているクエンチング分子がタグ部分に結合しているとき、タグ部分が、クエンチング分子に温度依存的に可逆的結合しているオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップ、（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が、プローブのアニーリング部分の第１のクエンチング部分からのレポーター部分の切断及び分離を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いるＰＣＲで標的核酸を増幅するステップ、（ｃ）クエンチング分子がタグ部分に結合している第１の温度でレポーター部分からの抑制シグナルを測定するステップ、（ｄ）クエンチング分子がタグ部分に結合していない第２の温度に温度を上昇させるステップ、（ｅ）第２の温度でレポーター部分からの温度補正シグナルを測定するステップ、（ｆ）第２の温度で検出された温度補正シグナルから第１の温度で検出された抑制シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、（ｇ）複数のＰＣＲサイクルを通してステップ（ｂ）から（ｆ）を繰り返すステップ、（ｈ）複数のＰＣＲサイクルからの算出シグナル値を測定して、標的核酸の存在を検出するステップを含む、試料中の標的核酸を増幅及び検出する方法を提供する。
１つの実施形態では、タグ部分は、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む。１つの実施形態では、レポーター部分はオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分である。別の実施形態では、レポーター部分はオリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分に位置し、温度依存的に第２のクエンチャー部分を含むクエンチング分子に相互作用することができる。１つの実施形態では、タグ部分は、標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、クエンチング分子は、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ハイブリダイゼーションによってタグ部分に結合する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分又はクエンチング分子又はタグ部分とクエンチング分子の両方は、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチド修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。１つの実施形態では、レポーター部分は蛍光色素であり、クエンチャー部分は蛍光色素からの検出可能なシグナルをクエンチする。
別の態様では、本発明は、（ａ）単一の反応容器内で２つ以上の標的核酸配列を含むことが疑われる試料を、（ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、（ｉｉ）第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された第１の標的核酸配列内にアニールし、検出可能なシグナルを生成できる蛍光部分及び蛍光部分によって生成される検出可能なシグナルをクエンチできる第１のクエンチャー部分を含み、蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチャー部分と分離されている第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｉｉｉ）２つの異なる部分、第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された第２の標的核酸配列内にアニールし、第２のクエンチャー部分を含むアニーリング部分と、アニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合された又はアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合された、２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むタグ部分を含み、タグ部分が、第１のオリゴヌクレオチドプローブの蛍光部分と同一であり、その検出可能なシグナルがアニーリング部分の第２のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第２のクエンチング部分から分離されている第２のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、タグ部分にハイブリダイズしたときにタグ部分の蛍光部分によって生成される検出可能なシグナルをクエンチする第３のクエンチャー部分を含むクエンチングオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、核酸ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のクエンチング部分からの蛍光部分の切断及び分離並びに第２のオリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分の第２のクエンチング部分からのタグ部分の蛍光部分の切断及び分離を可能にするように、第１及び第２の標的核酸配列を、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、伸長ステップの間に、クエンチングオリゴヌクレオチドがタグ部分にハイブリダイズしたままであるステップ、（ｃ）クエンチングオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分にハイブリダイズされている第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、（ｄ）クエンチングオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分にハイブリダイズされない、第１の温度より高い第２の温度に温度を上昇させるステップ、（ｅ）第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、（ｆ）第２の温度で検出された蛍光シグナルから第１の温度で検出された蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、（ｇ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、（ｈ）複数のＰＣＲサイクルからの第１の温度で検出された蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、複数のＰＣＲサイクルからの算出シグナル値から第２の標的核酸配列の存在を決定するステップを含む、試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法を提供する。
１つの実施形態では、タグ部分は、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む。別の実施形態では、タグ部分は前記アニーリング部分の５’末端に結合されている。さらに別の実施形態では、タグ部分は前記アニーリング部分の３’末端に結合されている。さらに別の実施形態では、タグ部分は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されている。別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又はクエンチングオリゴヌクレオチド又は前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方は、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチド修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）単一の反応容器内で２つ以上の標的核酸配列を含むことが疑われる試料を、（ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、（ｉｉ）２つの異なる部分、第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された第１の標的核酸配列内にアニールし、第１のクエンチャー部分を含む第１のアニーリング部分と、第１のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合されるか又は第１のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む第１のタグ部分を含み、第１のタグ部分が、検出可能なシグナルが第１のアニーリング部分の第１のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチング部分から分離されている第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｉｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のタグ部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第１のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、第１のタグ部分にハイブリダイズされたときに第１のタグ部分の蛍光部分によって生成される検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチング部分を含む第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、（ｉｖ）２つの異なる部分、第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された第２の標的核酸配列内にアニールし、第３のクエンチャー部分を含む第２のアニーリング部分と、第２のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合されるか又は第２のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のタグ部分のヌクレオチド配列と比較して異なる核酸配列若しくは異なるヌクレオチド修飾を有する第２のタグ部分を含み、第２のタグ部分が、第１のオリゴヌクレオチドプローブの蛍光部分と同一であり、検出可能なシグナルが、第２のアニーリング部分の第３のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第３のクエンチング部分から分離されている第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ｖ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のタグ部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第２のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、第２のタグ部分にハイブリダイズされたときに第２のタグ部分の蛍光部分によって生成される検出可能なシグナルをクエンチする第４のクエンチング部分を含む第２のクエンチングオリゴヌクレオチドと接触させ、第２のクエンチングオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のタグ部分の間の二本鎖が、第１のクエンチングオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のタグ部分の間の二本鎖より高い融解温度（Ｔｍ）値を有するステップ、（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、核酸ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、（ｉ）伸長ステップにおいて、第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが第１のタグ部分にハイブリダイズしたままである、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のアニーリング部分の第１のクエンチング部分からの第１のタグ部分の蛍光部分の切断及び分離、及び（ｉｉ）伸長ステップにおいて、第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のアニーリング部分の第３のクエンチング部分からの第２のタグ部分の蛍光部分の切断及び分離を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって第１及び第２の標的核酸配列を増幅するステップ、（ｃ）第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドプローブからの第１のタグ部分にハイブリダイズされず、第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドプローブからの第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである第１の温度に温度を上昇させるステップ、（ｄ）第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、（ｅ）第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のタグ部分にハイブリダイズされない第２の温度に温度を上昇させるステップ、（ｆ）第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、（ｇ）第２の温度で検出された蛍光シグナルから第１の温度で検出された蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、（ｈ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、（Ｉ）複数のＰＣＲサイクルからの第１の温度で検出された蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、複数のＰＣＲサイクルからの算出シグナル値から第２の標的核酸配列の存在を決定するステップを含む、試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法を提供する。
１つの実施形態では、前記第１のタグ部分と前記第２のタグ部分はともに、両方のタグ部分が核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む。
１つの実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の３’末端に結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の３’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の３’末端に結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の５’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の３’末端に結合され、第２のタグ部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されている。
１つの実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の５’末端に結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の５’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の５’末端に結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の３’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の５’末端に結合され、第２のタグ部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されている。
１つの実施形態では、第１のタグ部分は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の５’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、第２のタグ部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の３’末端に結合されている。別の実施形態では、第１のタグ部分は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、第２のタグ部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２のアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されている。
１つの実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分、若しくは前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、若しくは前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分、若しくは前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドのいずれか又はそれらのいずれかの組み合わせは、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。１つの実施形態では、１つ以上のヌクレオチド修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらに別の態様では、本発明は、（ａ）２つ以上の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、（ｂ）２つの異なる部分、２つ以上の標的核酸配列の１つに少なくとも部分的に相補的な配列を含み、２つ以上の標的核酸配列の１つにアニールし、第１のクエンチャー部分を含むアニーリング部分と、第１のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合された、又はアニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されたタグ部分を含み、２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、タグ部分が、検出可能なシグナルがアニーリング部分の第１のクエンチャー部分でクエンチできる蛍光部分を含み、蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチング部分から分離されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ、（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、クエンチングオリゴヌクレオチドがタグ部分にハイブリダイズしたとき、タグ部分の蛍光部分によって生成された検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチャー部分を含む少なくとも１つのクエンチングオリゴヌクレオチドを備える、試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出するためのキットを提供する。１つの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分、又はクエンチングオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方は、もう１つの（one more）ヌクレオチド修飾を含み、１つ以上のヌクレオチド修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
図１は、本発明の方法を実施するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブの１つの実施形態の図による説明である。 図２は、タグ部分の分離及びそれに続くクエンチングオリゴヌクレオチドの解離を示す本発明の方法を図で表したものである。 図３は、本発明の方法の１つの実施形態の説明である。 図４は、本発明の方法の別の実施形態を用いるシグナル検出温度を示す。 図５は、本発明の方法を実施するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブのさまざまな実施形態を示す。 図６は、実施例１に記載の、クエンチングオリゴヌクレオチドと蛍光標識相補的オリゴヌクレオチドの間の２つの温度でのハイブリダイゼーション及び解離の結果を示す。 図７は、ＨＩＶ−１グループＭ鋳型（ＨＩＭ）の非存在下（図７Ａ）、又は１０ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｂ）、１００ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｃ）、及び１，０００ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｄ）のＨＩＭの存在下で、標準ＴａｑＭａｎプローブＧ０、及び５８℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値を用いて、０、１００、１０００、又は１０，０００ｃｐ／ｒｘｎの内部標準（internal control）テンプレート（ＧＩＣ）から作成されたＰＣＲ増幅曲線を示す。 図８は、ＧＩＣの非存在下（図８Ａ）、又は１００ｃｐ／ｒｘｎ（図８Ｂ）、１０００ｃｐ／ｒｘｎ（図８Ｃ）、及び１０，０００ｃｐ／ｒｘｎ（図８Ｄ）のＧＩＣの存在下で、相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９）をもつタグ付きプローブ（Ｌ２４）、及び８０℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値を用いて、０、１０、１００、又は１，０００ｃｐ／ｒｘｎのＨＩＭから作成されたＰＣＲ増幅曲線を示す。 図９は、ＧＩＣの非存在下（図９Ａ）、又は１００ｃｐ／ｒｘｎ（図９Ｂ）、１，０００ｃｐ／ｒｘｎ（図９Ｃ）、及び１０，０００ｃｐ／ｒｘｎ（図９Ｄ）のＧＩＣの存在下における８０℃での蛍光シグナルから８４％の５８℃での蛍光シグナルを引くことによって作成された０、１０、１００、又は１，０００ｃｐ／ｒｘｎのＨＩＭから得られた増幅曲線を示す。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＩＣプローブ（Ｇ０）と相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９）をもつタグ付きＨＩＶプローブ（Ｌ２４）を用いて、内部標準テンプレート（ＧＩＣ）、ＨＩＶテンプレート（ＨＩＶ）、又はＧＩＣとＨＩＶテンプレートの両方（Ｇ＋Ｈ）から作成されたＰＣＲ増幅曲線を示し、両プローブは、ＦＡＭ（図１０Ａ、上段）、ＨＥＸ（図１０Ａ、下段）、ＪＡ２７０色素（図１０Ｂ、上段）、又はＣｙ５．５（図１０Ｂ、下段）で標識されている。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＩＣプローブ（Ｇ０）と相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９）をもつタグ付きＨＩＶプローブ（Ｌ２４）を用いて、内部標準テンプレート（ＧＩＣ）、ＨＩＶテンプレート（ＨＩＶ）、又はＧＩＣとＨＩＶテンプレートの両方（Ｇ＋Ｈ）から作成されたＰＣＲ増幅曲線を示し、両プローブは、ＦＡＭ（図１０Ａ、上段）、ＨＥＸ（図１０Ａ、下段）、ＪＡ２７０色素（図１０Ｂ、上段）、又はＣｙ５．５（図１０Ｂ、下段）で標識されている。 図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃは、Ｌ２４タグ付きプローブがＤ−ＤＮＡの代わりにＬ−ＤＮＡを含む、実施例４に記載の実験のＰＣＲ増幅曲線を示し、５８℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ａ）、８０℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ｂ）、及び８０℃の蛍光シグナルから減算された５８℃での蛍光シグナルの８４％（図１１Ｃ）である。 図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃは、Ｌ２４タグ付きプローブがＤ−ＤＮＡの代わりにＬ−ＤＮＡを含む、実施例４に記載の実験のＰＣＲ増幅曲線を示し、５８℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ａ）、８０℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ｂ）、及び８０℃の蛍光シグナルから減算された５８℃での蛍光シグナルの８４％（図１１Ｃ）である。 図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃは、Ｌ２４タグ付きプローブがＤ−ＤＮＡの代わりにＬ−ＤＮＡを含む、実施例４に記載の実験のＰＣＲ増幅曲線を示し、５８℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ａ）、８０℃でのＦＡＭ蛍光読み取り値（図１１Ｂ）、及び８０℃の蛍光シグナルから減算された５８℃での蛍光シグナルの８４％（図１１Ｃ）である。 図１２は、蛍光シグナル検出が、標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＩＣプローブ（ＩＣ−ＱＦ）、Ａ及びＧヌクレオチドが２’−ＯＭｅ置換で修飾されたクエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９−ＯＭｅ Ａ／Ｇ）をもつタグ付きＨＩＶプローブ（Ｌ２４）、クエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９−ＯＭｅ Ａ／Ｇ）をもつすべてのヌクレオチドが２’−ＯＭｅ置換で修飾されたタグ付きＨＩＶプローブ（Ｌ２４−ＯＭｅ）、及びすべてのヌクレオチドが２’−ＯＭｅ置換で修飾されたクエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９−ＯＭｅ）をもつタグ付きＨＩＶプローブ（Ｌ２４−ＯＭｅ）の存在下において、５８℃、７５℃、８８℃、又は９７℃で測定された、実施例５に記載の実験のＰＣＲ増幅曲線を示す。
定義
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、核酸を含む標本又は培養物（例えば、微生物学的培養物）を含む。「試料」という用語はまた、生体試料及び環境試料の両方を含むことを意味する。試料は合成に由来する標本を含みうる。生体試料としては、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、乳管、耳、関節鏡検査）、生検試料、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、***、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、***液、胚細胞、及び胎児細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、生体試料は血液であり、より好ましくは血漿である。本明細書で使用される場合、「血液」という用語は、全血、又は従来定義されているような血清及び血漿などの血液のいずれの画分も包含する。血漿は、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離から生じる全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残っている水分の多い（watery）部分を指す。環境試料としては、表面物質、土壌、水、及び工業用試料などの環境材料、並びに食品及び乳製品加工器具、装置、機器、用具、使い捨て品、及び非使い捨て品から得られる試料が挙げられる。これらの実施例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「標的」又は「標的核酸」という用語は、その存在が検出又は測定されるべきであるか、又はその機能、相互作用、若しくは特性が研究されるべきである任意の分子を意味することを意図する。標的は、それに対する検出可能なプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）又はアッセイが既存又は当業者によって作製できる本質的にいずれの分子も含む。例えば、標的は、検出可能なプローブ（例えば、抗体）と結合できるか、そうでなければ接触することができる、核酸分子、ポリペプチド、脂質、又は炭水化物などの生体分子でありうる。ここで検出可能プローブは本発明の方法によって検出できる核酸も含む。本明細書で使用される場合、「検出可能プローブ」とは、対象の標的生体分子にハイブリダイズ又はアニールでき、本明細書に記載の標的生体分子の特異的検出を可能にする任意の分子又は薬剤をいう。本発明の１つの態様では、標的は核酸であり、検出可能なプローブはオリゴヌクレオチドである。「核酸」及び「核酸分子」という用語は、本開示全体を通して互換的に使用されうる。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＲＮＡ、メッセージＲＮＡ（message RNA）（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、クローン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、増幅核酸、アンプリコン、ＰＣＲ産物、他のタイプの増幅核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）を指し、これらはすべて一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態でありえ、別段の限定がない限り、天然ヌクレオチド並びにそれらの組み合わせ及び／又は混合物として同じように機能できる天然ヌクレオチドの既知のアナログを包含することになる。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドトリ、ジ、及びモノホスフェート、並びにポリ核酸又はオリゴヌクレオチド内に存在するモノホスフェートモノマーを含む、天然と修飾／非天然ヌクレオチドの両方を指す。ヌクレオチドはまた、リボ、２’−デオキシ、２’，３’−デオキシ、並びに当該技術分野で周知の他の膨大な数のヌクレオチド模倣物であってもよい。模倣物としては、３’−Ｏ−メチル、ハロゲン化塩基、又は糖置換などの鎖末端ヌクレオチド、非糖質、アルキル環構造を含む代替糖構造、イノシンを含む代替塩基、デアザ修飾、カイ、及びプサイ、リンカー修飾、マス標識（mass label）修飾、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテルを含むホスホジエステル修飾又は置換、光開裂可能なニトロフェニル部分などの切断連結（cleavage linkages）を含む塩基又は完全（basic or complete）ヌクレオチド間置換が挙げられる。
ターゲットの有無は、定量的又は定性的に測定することができる。標的は、例えば単純若しくは複雑な混合物、又は実質的に精製された形態を含むさまざまな異なる形態でありうる。例えば、標的は、他の構成成分を含有する試料の一部である場合もあり、試料の唯一の構成成分又は主要な構成成分である場合もある。したがって、標的は、全細胞若しくは組織、細胞若しくは組織抽出物、それらの分画された溶解物、又は実質的に精製された分子の構成成分でありうる。また標的は、既知又は未知の配列又は構造を有することができる。
「増幅反応」という用語は、核酸の標的配列のコピーを増やすためのいずれかのインビトロ手段を指す。
「増幅すること（Amplifying）」とは、増幅を可能にするのに充分な条件に溶液を供するステップを指す。増幅反応の構成要素としては、例えば、プライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどが挙げられうるが、これらに限定されない。「増幅すること（amplifying）」という用語は、典型的には標的核酸の「指数関数的」増加を指す。しかし、本明細書で使用される場合、「増幅すること」はまた、核酸の選択された標的配列の数の直線的増加を指すことができるが、一回の単一プライマー伸長ステップ（a one-time, single primer extension step）とは異なる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、それによって標的二本鎖ＤＮＡの特定のセグメント又は部分配列が幾何学的な進行（geometric progression）で増幅される方法を指す。ＰＣＲは当業者に周知である。例えば、米国特許第４６８３１９５号明細書及び同第４６８３２０２号明細書並びにＰＣＲプロトコール、A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990を参照。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって連結された天然若しくは修飾ヌクレオシドモノマーの直鎖オリゴマー又はその類似体を指す。オリゴヌクレオチドとしては、標的核酸に特異的に結合できるデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。通常、モノマーはホスホジエステル結合又はその類似体によって連結されて、数モノマー単位、例えば３〜４から数十モノマー単位、例えば４０〜６０の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のなどの一連の文字で表されるときはいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’−３’の順序であり、別段の注記のない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表し、「Ｕ」はリボヌクレオシド、ウリジンを表すことを理解されたい。通常、オリゴヌクレオチドは４つの天然デオキシヌクレオチドを含む。しかし、それらはリボヌクレオシド又は非天然ヌクレオチドアナログも含みうる。酵素が、活性のための、特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質の必要条件を有する、例えば一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質のための適切な組成物の選択は充分に当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチドプライマー」又は単に「プライマー」とは、標的核酸テンプレートの配列にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブの検出を容易にするポリヌクレオチド配列を指す。本発明の増幅実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは核酸合成の開始点として機能する。非増幅実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、切断剤によって切断できる構造を作り出すことができる。プライマーはさまざまな長さでありうる。多くの場合、５０ヌクレオチド長未満、例えば１２〜２５ヌクレオチド長である。ＰＣＲに使用するためのプライマーの長さ及び配列は、当業者に公知の原則に基づいて設計することができる。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、対象の標的核酸にハイブリダイズ又はアニールでき、標的核酸の特異的検出を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。
「レポーター部分」又は「レポーター分子」は、検出可能なシグナルを付与する分子である。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光、又は発光性でありうる。「クエンチャー部分」又は「クエンチャー分子」は、レポーター部分からの検出可能なシグナルをクエンチできる分子である。
「ミスマッチヌクレオチド」又は「ミスマッチ」は、その位置又は複数の位置で標的配列に相補的ではないヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのミスマッチを有することがある。２、３、４、５、６、７つ又はそれより多いミスマッチヌクレオチドを有する可能性もある。
本明細書で使用される場合、「多型」という用語は、対立遺伝子バリアントを指す。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）及び単純配列長多型を含みうる。多型は、１つの対立遺伝子における別の対立遺伝子に比べて１つ以上のヌクレオチド置換によるものでありうるか、又は挿入若しくは欠失、重複、逆位、及び当技術分野で公知の他の改変によるものでありうる。
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、分子レベル（例えば、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格）でのオリゴヌクレオチドプローブの改変を指す。ヌクレオシド修飾としては、切断ブロッカー又は切断誘発剤の導入、マイナーグルーブバインダーの導入、同位体濃縮、同位体ディプリーション（isotopic depletion）、重水素の導入、及びハロゲン修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオシド修飾はまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高める部分又はオリゴヌクレオチドプローブの融解温度を上げる部分を含みうる。例えば、ヌクレオチド分子は、（Imanishi et al.、米国特許第６２６８４９０号明細書及びWengel et al.、米国特許第６７９４４９９号明細書に記載のように）２’及び４’炭素を連結する追加の架橋で修飾されて、ヌクレアーゼによる切断に対して抵抗性であるロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドをもたらしうる。オリゴヌクレオチドプローブ及びクエンチングオリゴヌクレオチド分子のタグ部分の組成は、安定な二本鎖を形成するそれらの能力によってのみ制限される。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｌ−ＲＮＡ、ＬＮＡ、Ｌ−ＬＮＡ、ＰＮＡ（Nielsen et al.、米国特許第５５３９０８２号明細書に記載のペプチド核酸）、ＢＮＡ（架橋核酸、例えば、Rahman et al., J. Am. Chem. Soc. 2008;130(14):4886-96に記載の２’，４’−ＢＮＡ（ＮＣ）［２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノメチレン架橋核酸］）、Ｌ−ＢＮＡなど（ここで、「Ｌ−ＸＸＸ」は、核酸の糖単位のＬ−エナンチオマーを指す）、又はヌクレオチド塩基、糖、若しくはホスホジエステル骨格上のその他の既知の変形形態及び修飾形態から構成されうる。
ヌクレオシド修飾の他の例としては、オリゴヌクレオチドの糖部分に導入されるハロ、アルコキシ、及びアリルオキシ基などのさまざまな２’置換が挙げられる。２’−置換−２’−デオキシアデノシンポリヌクレオチドはＤＮＡよりも二本鎖ＲＮＡに似ているという証拠が提示されている。Ikehara et al., (Nucleic Acids Res., 1978, 5, 3315)は、標準的な融解アッセイで測定して、その相補体に二本鎖形成したポリＡ、ポリＩ、又はポリＣ中の２’−フルオロ置換基が、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドポリ二本鎖よりも著しく安定であることを示した。Inoue et al., (Nucleic Acids Res., 1987, 15, 6131)は、すべての核酸ヌクレオチドに２’−ＯＭｅ（Ｏ−メチル）置換基を含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成を記載している。混合２’−ＯＭｅ−置換オリゴヌクレオチドはそのＲＮＡ相補体に、同じ配列のＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖よりも著しく強いＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖と同じくらい強くハイブリダイズした。したがって、糖の２’位における置換の例には、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＭｅ、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＭｅ、ＳＯ2Ｍｅ、ＯＮＯ2、ＮＯ2、ＮＨ3、ＮＨ2、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ3＝ＣＨ2、及びＯＣＣＨが挙げられる。
標的ポリヌクレオチドに対するプローブなどの、ある分子の別の分子への結合に関する「特異的な」又は「特異性」という用語は、２つの分子間の認識、接触、及び安定した複合体の形成を指し、その分子と他の分子との認識、接触、又は複合体形成が非常に少ない。本明細書で使用される場合、「アニールする」という用語は、２つの分子間の安定した複合体の形成を指す。
プローブの少なくとも１つの領域が核酸配列の相補体の少なくとも１つの領域と実質的な配列同一性を共有する場合、プローブは核酸配列に「アニールすることができる」。「実質的な配列同一性」は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、又は９９％、及び最も好ましくは１００％の配列同一性である。ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列の配列同一性を決定する目的では、Ｕ及びＴはしばしば同じヌクレオチドと見なされる。例えば、配列ＡＴＣＡＧＣを含むプローブは、配列ＧＣＵＧＡＵを含む標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。
本明細書で使用される「切断剤」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブを切断して断片を生じさせることができる任意の手段を意味し、これには酵素が含まれるがそれに限定されない。増幅が起こらない方法では、切断剤は単独でオリゴヌクレオチドプローブの第２の部分又はその断片を切断、分解、そうでなければ分離する役目を果たしうる。切断剤は酵素でありうる。切断剤は、天然、合成、無修飾、又は修飾のいずれでもよい。
増幅が起こる方法では、切断剤は合成（又は重合）活性及びヌクレアーゼ活性を有する酵素であることが好ましい。そのような酵素はしばしば核酸増幅酵素である。核酸増幅酵素の例は、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））やイー・コライ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩなどの核酸ポリメラーゼ酵素である。酵素は、天然、無修飾、又は修飾のいずれでもよい。
「核酸ポリメラーゼ」とは、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素を指す。例示的な核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼなどが挙げられる。
「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、選択された期間にわたって高温に供されたときに安定であり（すなわち分解又は変性に抵抗し）、充分な触媒活性を保持するＤＮＡポリメラーゼを指す。例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間高温に供された場合に、その後のプライマー伸長反応を起こすのに充分な活性を保持する。核酸変性に必要な加熱条件は当該技術分野において周知であり、米国特許第４６８３２０２号明細書及び同第４６８３１９５号明細書に例示されている。本明細書で使用される場合、耐熱性ポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクル反応での使用に適している。耐熱性核酸ポリメラーゼの例としては、テルムス・アクウァーティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス種Ｚ０５ポリメラーゼ、テルムス・フラバスポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５やＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどのテルモトガ・マリティマポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
「修飾」ポリメラーゼとは、天然若しくは野生型のポリメラーゼ又は別の修飾された形態のポリメラーゼなど、少なくとも１つのモノマーが基準配列と異なるポリメラーゼを指す。例示的な修飾としては、モノマーの挿入、欠失、及び置換が挙げられる。修飾ポリメラーゼにはまた、２つ以上の親に由来する同定可能な構成要素配列（例えば、構造ドメイン又は機能ドメインなど）を有するキメラポリメラーゼも含まれる。修飾ポリメラーゼの定義内にはまた、基準配列の化学修飾を含むものも含まれる。修飾ポリメラーゼの例としては、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ ポリメラーゼ、ΔＺ０５−ゴールドポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒ ポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどが挙げられる。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」又は「５’−３’ヌクレアーゼ活性」という用語は、核酸鎖合成に典型的に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。例えば、イー・コライＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するのに対し、クレノウ断片は有しない。５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するいくつかの酵素は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼである。そのような５’から３’へのエキソヌクレアーゼの例としては、バチルス．サブティリス由来のエキソヌクレアーゼ、脾臓由来のホスホジエステラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、酵母由来のエキソヌクレアーゼＩＩ、酵母由来のエキソヌクレアーゼＶ、及びニューロスポラ・クラッサ由来のエキソヌクレアーゼが挙げられる。
「プロパンジオール」又は「プロパンジオールスペーサー」という用語は、１，３−プロパンジオールを指し、プロパン−１，３−ジオール、１，３−ジヒドロキシプロパン、及びトリメチレングリコールと同義である。「ＨＥＧ」又は「ＨＥＧスペーサー」という用語は、３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン−１，１７−ジオールと同義であるヘキサエチレングリコールを指す。
本発明のさまざまな態様は、核酸ポリメラーゼの特別な性質に基づいている。核酸ポリメラーゼは、いくつかの活性、とりわけ５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有することができ、それによって核酸ポリメラーゼは、より大きい相補的ポリヌクレオチドにアニールしたオリゴヌクレオチドからモノヌクレオチド又は小さいオリゴヌクレオチドを切断することができる。切断が効率的に起こるためには、上流オリゴヌクレオチドも、同じ大きいポリヌクレオチドにアニールされなければならない。
米国特許第５２１００１５号明細書、同第５４８７９７２号明細書、及び同第５８０４３７５号明細書、並びにHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載のように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を利用した標的核酸の検出は、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」又は「５′−ヌクレアーゼアッセイ」によって行うことができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、増幅反応中に増幅領域内でハイブリダイズする標識検出プローブが存在する。プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのを防ぐようにプローブは修飾される。増幅は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。増幅の各合成ステップの間に、伸長されているプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズするプローブはいずれも、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって分解される。したがって、新しい標的鎖の合成もまたプローブの分解をもたらし、分解産物の蓄積は標的配列の合成の尺度を提供する。
分解産物の検出に適した方法はいずれも、５’ヌクレアーゼアッセイに使用することができる。多くの場合、検出プローブは２つの蛍光色素で標識されており、そのうちの一方は、もう一方の色素の蛍光をクエンチすることができる。プローブがハイブリダイズしていない状態にあるときにクエンチングが起こり、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの色素の間で起こるように、色素は、５’末端に結合されているレポーター色素又はデテクター色素及び内部部位に結合されているクエンチング色素を典型的にもつプローブに結合されている。増幅は、色素間のプローブの切断をもたらし、附随してクエンチングが解消され、当初クエンチされた色素からの観察可能な蛍光が増加する。分解産物の蓄積は反応蛍光の増加を測定することによってモニターされる。米国特許第５４９１０６３号明細書及び同第５５７１６７３号明細書は、増幅と同時に起こるプローブの分解を検出するための代替的な方法を記載している。
標的核酸の検出のための５’ヌクレアーゼアッセイは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するいずれかのポリメラーゼを用いることができる。したがって、いくつかの実施形態では、５’−ヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼは耐熱性及び熱活性核酸ポリメラーゼである。そのような耐熱性ポリメラーゼとしては、限定されないが、真正細菌テルムス属、テルモトガ属、及びテルモシフォ属のさまざまな種に由来する天然及び組換え型のポリメラーゼ、並びにそれらのキメラ型が挙げられる。例えば、本発明の方法に使用できるテルムス種ポリメラーゼとしては、テルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス種Ｚ０５（Ｚ０５）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス種ｓｐｓ１７（ｓｐｓ１７）、及びテルムス種Ｚ０５が挙げられる（例えば、米国特許第５４０５７７４号明細書、同第５３５２６００号明細書、同第５０７９３５２号明細書、同第４８８９８１８号明細書、同第５４６６５９１号明細書、同第５６１８７１１号明細書、同第５６７４７３８号明細書、及び同第５７９５７６２号明細書に記載されている）。本発明の方法に使用できるテルモトガポリメラーゼとしては、例えば、テルモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ及びテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、一方で使用できるテルモシフォポリメラーゼの例はテルモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼである。テルモトガ・マリティマ及びテルモシフォ・アフリカヌスのＤＮＡポリメラーゼの配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７０３５号明細書と国際公開第９２／０６２００号パンフレットに公開されている。テルモトガ・ネアポリタナの配列は、国際特許公開第９７／０９４５１号パンフレットに見出すことができる。
５′ヌクレアーゼアッセイでは、増幅検出は典型的には増幅と同時並行して（すなわち「リアルタイム」）に行われる。いくつかの実施形態では、増幅検出は定量的であり、増幅検出はリアルタイムである。いくつかの実施形態では、増幅検出は定性的である（例えば、標的核酸の存在又は非存在の終点検出）。いくつかの実施形態では、増幅検出は増幅に続く。いくつかの実施形態では、増幅検出は定性的であり、増幅検出は増幅に続く。
本発明では、単一の反応容器（例えば、チューブ、ウェル）中の２つ以上の標的核酸のリアルタイムＰＣＲ増幅及び検出は、第１の標的の存在を検出するための標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブ及び第２、第３、又はより多くの標的の存在を検出するための１つ以上の新規のＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを用いて行うことができる。プローブはすべて同じ蛍光標識を含んでいる。代替的に、新規のＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを使用して、すべての標的核酸の存在を検出することができる。新規のプローブは２つの顕著な特徴を有する。
新規プローブの第１の特徴は、それが２つの異なる部分を含むことである。第１の部分はアニーリング部分と呼ばれ、標的配列とハイブリダイズできるように標的核酸配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む。アニーリング部分はまた、クエンチャー部分も含む。１つの実施形態では、アニーリング部分は、クエンチャー部分をクエンチでき、ヌクレアーゼ感受性切断部位によってクエンチャー部分から分離されている蛍光色素などのレポーター部分を含む。オリゴヌクレオチドプローブの第２の部分はタグ部分と呼ばれる。１つの実施形態では、タグ部分はアニーリング部分の５’末端に結合されている。別の実施形態では、タグ部分はアニーリング部分の３’末端に結合されている。別の実施形態では、タグ部分は、リンカーを介してアニーリング部分の５’末端と３’末端の間のどこかに結合されている。タグ部分は、標的核酸配列に相補的ではなく、標的核酸に結合できない「フラップ」領域を形成するヌクレオチド配列を含んでもよい（５’フラッププローブを図で表したものについては図１を参照）。タグ部分はまた、それがアニーリング部分に結合でき、（次のセクションに記載のように）クエンチング分子と相互作用できる限り、任意の有機部分などの非ヌクレオチド又は繰り返し単位（例えば（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）nなど）から構成されてもよい。１つの実施形態では、タグ部分は、アニーリング部分のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光色素などのレポーター部分を含む。オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分及びタグ部分は、任意選択で非ヌクレオチド「リンカー」によって分離されていてもよい。このリンカーは、炭素、炭素と酸素、炭素と窒素、又はこれらの任意の組み合わせから構成でき、任意の長さのものとすることができる。さらに、リンカーは直鎖状部分から構成することもでき、環状部分から構成することもできる。リンカーは、単一の単位に由来するものでもよく、又はリン酸結合で分離された複数の同一若しくは異なる単位に由来するものでもよい。リンカーの目的は、オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分とタグ部分の連結部（junction）に領域を作り出すことである。タグ部分がアニーリング部分から分離されている場合、リンカーはタグ部分が核酸ポリメラーゼによって伸長されるのを防ぐこともできる。代替的に、分離されたタグ部分に対する別の修飾は、そのタグ部分を核酸ポリメラーゼによって伸長できなくする。
新規のプローブの第２の特徴は、タグ部分がクエンチング分子に結合することである。タグ部分がヌクレオチド配列である場合、クエンチング分子は、タグ部分のヌクレオチド配列に対して完全又は部分的に相補的であり、タグ部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドでありうる。クエンチング分子はまた、クエンチャー部分、すなわちタグ部分のレポーター部分（例えば蛍光色素）からのシグナルもクエンチできる第２のクエンチャー部分を含むか又はそれと結合している。クエンチング分子上の又はそれと結合しているクエンチャー部分（第２のクエンチャー部分）は、アニーリング部分のクエンチャー部分（第１のクエンチャー部分）と同じであることもでき、異なっていることもできる。したがって、ＰＣＲ増幅を実施する前に、タグ部分のレポーター部分は、プローブのアニーリング部分のクエンチャー部分と、クエンチング分子上の又はそれと結合しているクエンチャー部分の両方によって（例えば、図１に示されるようなクエンチングオリゴヌクレオチドによって）クエンチされる。
５’ヌクレアーゼアッセイにおいて標的核酸のリアルタイムＰＣＲ増幅及び検出を行うために新規プローブを使用する一般的な原理を以下に記載する。最初に、標的核酸を含むことが疑われる試料が用意される。次いで試料を単一反応容器（例えば、単一試験管又はマルチウェルマイクロプレートの単一ウェル）内で標的核酸のアンプリコンを生成できるオリゴヌクレオチドプライマーと新規オリゴヌクレオチドプローブの両方を含有するＰＣＲ試薬と接触させる。ＰＣＲ増幅は、各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性がプローブのアニーリング部分のクエンチング部分からタグ部分の切断及び分離を可能にするように５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用することによって始まる。分離されたタグ部分は、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾（非ヌクレオチドリンカーなど）を任意選択で含みうる。
次に、分離されたタグ部分のレポーター部分からのシグナルは、クエンチング分子が依然としてタグ部分に結合している第１の温度、通常はアニーリング及び／又は伸長温度で測定される。クエンチング分子上の又はそれと結合しているクエンチャー部分の存在により、タグ部分のレポーター部分（例えば蛍光色素）からのシグナルはクエンチされたままである。次いで、ＰＣＲサイクルにおける通常のステップとして、温度を徐々に変性温度に上げる。温度が伸長温度から変性温度に上昇するにつれて、クエンチング分子がもはやタグ部分に結合していない温度点に達する。クエンチング分子がタグ部分のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである場合、この解離はクエンチングオリゴヌクレオチド分子とタグ部分の間の二本鎖形成の融解温度（Ｔｍ）で起こる。クエンチングオリゴヌクレオチド上の又はそれと結合しているクエンチャー部分によってもはやクエンチされていないレポーター部分からのシグナルは、次いで、二本鎖のＴｍ温度であるかそれを超える第２の温度で測定される。実際は、タグ部分のほぼ１００％が一本鎖形態であることを確実にするためには、第２の温度はＴｍ温度を超えるほうがよい。しかし、Ｔｍ温度未満の温度でシグナルを測定することも可能である。次いで、クエンチング分子がタグ部分に結合していないときに第２の温度で検出されたシグナルから、クエンチング分子がまだタグ部分に結合しているときに第１の温度で検出されたシグナルを差し引くことによって算出シグナル値を決定する（図２と図３を参照）。算出シグナル値は、温度によって影響を受ける可能性があるシグナルの補正のために任意選択で正規化することができる。例えば、蛍光シグナルは高い温度で減少することが知られており、したがって、異なる温度で得られたシグナル値を正規化するために標準品を使用することができる。
これらのシグナルの測定と計算は複数のＰＣＲサイクルで行われ、決定された累積シグナル値は標的核酸の有無だけでなく、ＰＣＲサイクル数に対してプロットされた算出シグナル値から作成されるＰＣＲ増幅曲線から閾値（Ｃｔ値）を決定することによって標的核酸の量を決めるのにも使用することができる。１つの実施形態では、シグナル測定及び計算は各ＰＣＲサイクルで行われる。
１つのレポーター部分（例えば１つの蛍光色素）のみを使用するマルチプレックスＰＣＲアッセイは、さまざまなＴｍ温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズされるタグ部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを設計することによって可能である。例えば、１つの反応における３つの標的核酸の増幅及び検出は、すべて同じ蛍光色素分子で標識された３つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって達成することができる。標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを使用して、第１の温度（通常はＰＣＲサイクルのアニーリング温度）で蛍光シグナルを測定することによって第１の標的を検出することができる。低Ｔｍタグ−クエンチングオリゴヌクレオチド二本鎖をもつ第１の「タグ付き」プローブを使用して、そのＴｍ温度であるか又はそれを超える、第１の温度より高い第２の温度での算出蛍光値を測定することによって第２の標的を検出することができる。高Ｔｍタグ−クエンチングオリゴヌクレオチド二本鎖をもつ第２の「タグ付き」プローブを使用して、そのＴｍ温度であるか又はそれを超える、第２の温度より高い第３の温度で算出蛍光値を測定することによって第３の標的を検出することができる（図４を参照）。理論的には、１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ及び４〜７つの異なるレポーター部分（例えば蛍光色素）をもつ２つの異なるタグ付きプローブを使用して、１つの反応で１２〜２１個の異なる標的核酸を検出することが可能であることになり、又は１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと３種類のタグ付きプローブを使用して、１つの反応で１６〜２８個の異なる標的核酸を検出することが可能であることになる。
くわえて、本発明の新規プローブは、タグ部分がヌクレオチド配列であり、クエンチングオリゴヌクレオチドに連結されてヘアピン（すなわちステムループ構造）を形成するように設計することができる。この構造では、「ステム」部分はタグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドの間の相補的領域から構成されることになり、一方で「ループ」部分は非相補的ヌクレオチド又は前述のようなリンカーなどの非ヌクレオチドから構成されうる。
本発明の新規プローブは、プローブのタグ部分に位置するレポーター部分を有するように記載されているが、レポーター部分がクエンチング分子の第２のクエンチャー部分と可逆的に相互作用できる限り、アニーリング部分にレポーター部分を配置し、タグ部分に第１のクエンチャー部分を置くことも可能である。一般的な意味では、レポーター部分は、５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））アッセイ中にアニーリング部分の第１のクエンチング部分から分離されるようにプローブオリゴヌクレオチドに設計及び配置され、さらにクエンチング分子の第２のクエンチング部分と可逆的に相互作用するように設計される。新規プローブのこれらのさまざまな代替実施形態のいくつかは図５に見ることができる。
本発明の方法を実施するためには、プローブオリゴヌクレオチドのタグ部分及びクエンチング分子の設計においてある特定の特徴が必要である。１つの実施形態では、タグ部分とクエンチング分子はともにヌクレオチド配列からなる。この状況では、タグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドはともに、標的核酸配列に特異的にハイブリダイズすべきではないが、それらは所望の温度でのハイブリダイゼーションを可能にするために互いに完全又は部分的に相補的であるべきである。両方とも、ＰＣＲ増幅の間に核酸ポリメラーゼによって伸長されないために、それらの３’末端に修飾を含みうる。タグ部分のレポーター部分（例えば蛍光色素）とクエンチングオリゴヌクレオチドのクエンチャー部分はともに、５’末端、３’末端、又は５’と３’末端の間の任意の位置に位置できるが、タグ部分がクエンチングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするときにそれらは互いに近接して位置し、クエンチング部分がレポーター部分からの検出可能なシグナルをクエンチできなければならない。
さまざまなＴｍ温度でそれらのそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズされる異なるタグ部分に関して、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さを短くすることができるように、タグ部分、クエンチングオリゴヌクレオチド、又はタグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドの両方の全部又は一部の位置に導入することができる。融解温度を上昇させる役割を果たすヌクレオチド修飾の例としては、ＬＮＡ、ＰＮＡ、Ｇ−クランプ（９−（アミノエトキシ）−フェノキサジン−２’−デオキシシチジン）、プロピニルデオキシウリジン（ｐｄＵ）、プロピニルデオキシシチジン（ｐｄＣ）、及び２’−Ｏ−メチル修飾などの糖基でのさまざまな２’修飾が挙げられる。タグ部分又はクエンチングオリゴヌクレオチドへの核酸ポリメラーゼの望ましくない結合を防止する役割を果たしうる別の種類の修飾としては、Ｌ−ＤＮＡや、Ｌ−ＲＮＡ、Ｌ−ＬＮＡなどのエナンチオマーＬ型のヌクレオチドの使用が挙げられることになる。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分及びクエンチング分子は、温度依存的に互いに可逆的に相互作用する非ヌクレオチド分子からなる。そのような非ヌクレオチド相互作用の例としては、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ペプチド相互作用（例えばペプチドアプタマー）、タンパク質−低分子相互作用、ペプチド−低分子相互作用、低分子−低分子相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。一例を挙げれば、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）の間のよく知られた相互作用が、相互作用を可逆的且つ温度依存的にするために、ビオチン部分（例えばデスチオビオチン）若しくはアビジン部分のいずれか（Nordlund et al., J. Biol. Chem., 2003, 278 (4) 2479-2483を参照）又はその両方を修飾することによって利用することができる。
さらに別の実施形態では、タグ部分とクエンチング分子の間の相互作用は、配列特異的にヌクレオチド配列（又は複数のヌクレオチド配列）と非ヌクレオチド分子の間の相互作用を含みうる。これらの種類の相互作用の例としては、核酸アプタマー、ＤＮＡ結合タンパク質又はペプチド、及びＤＮＡマイナーグルーブバインダーが挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的ＤＮＡ結合分子の設計及び合成はいくつかの論文に記載されている（例えば、Dervan, Science, 1986, 232, 464-471; White et al., Nature, 1998, 391, 468-471を参照）。これらの方法は、温度に依存するタグ部分とクエンチング分子の間の相互作用を生じさせるのに使用することができる。同様に、二本鎖ヌクレオチドと可溶性クエンチャーの間の相互作用もまた、クエンチング部分はクエンチング分子自体の中に含まれる必要はないが、タグ部分がクエンチング分子に結合している場合にのみレポーター部分と相互作用してクエンチすることになる可溶性の形態でありうるように検討されうる。本発明の実施形態は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
実施例１ クエンチングオリゴヌクレオチドによるクエンチングの確認
クエンチャー部分を含有するクエンチングオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光標識タグ部分とハイブリダイズでき、二本鎖の融解温度より低い温度では蛍光シグナルをクエンチできるが、二本鎖が解離している融解温度より高い温度ではクエンチできないことを検証するために実験を行った。表１は、タグ部分及びクエンチングオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。クエンチングオリゴヌクレオチドＱ０はクエンチャーを含まず、一方でクエンチングオリゴヌクレオチドＱ１はその５’末端にＢＨＱ−２クエンチャーを含む。
９ＦＡＭ９ ＴＡＧオリゴヌクレオチドを、クエンチングオリゴヌクレオチド（ＱＸ）なし、又はＱ０若しくはＱ１クエンチングオリゴヌクレオチドと１：５のモル比でインキュベーションした。次いで、混合物を、６０ｍＭトリシン、１２０ｍＭ酢酸カリウム、５．４％ＤＭＳＯ、０．０２７％アジ化ナトリウム、３％グリセロール、０．０２％ツイーン２０、４３．９μＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｕ／μＬ ＵＮＧ、０．１μＭ １９ＴＡＧＣ９ＦＡＭＣ９、０．５μＭ Ｑ０又はＱ１、４００μＭ ｄＡＴＰ、４００μＭ ４ＣＴＰ、４００μＭ ｄＧＴＰ、８００μＭ ｄＵＴＰ、及び３．３μＭ 酢酸マンガンからなる５０μＬ反応液中でＰＣＲサイクルに供した（cycled)。典型的なＰＣＲ増幅反応を模したサイクル条件を表２に示す。
実験の結果を図６に示す。ＦＡＭ色素からのシグナルを５８℃で測定したところ、クエンチングオリゴヌクレオチド（ＱＸ）なし又はクエンチング部分を含まないクエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ０）において蛍光は検出されたが、Ｑ１クエンチングオリゴヌクレオチドの存在下ではいずれのサイクルでもシグナルは検出されなかった。対照的に、蛍光を８０℃で測定した場合、Ｑ１クエンチングオリゴヌクレオチドの存在下でも全てのサイクルでシグナルを検出することができ、より高い温度ではＱ１クエンチングオリゴヌクレオチドがもはやＴＡＧとハイブリダイズせず、クエンチングが観察されなかったことを示す。
実施例２ タグ付きプローブ及びクエンチングオリゴヌクレオチドを用いたリアルタイムＰＣＲ
さまざまな濃度のＨＩＶ−１グループＭ（ＨＩＭ）のテンプレート配列と混合したさまざまな濃度の内部標準テンプレート（ＧＩＣ）を含んだ試料を用いてリアルタイムＰＣＲの検討を行った。ＧＩＣ配列にハイブリダイズする標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブ（Ｇ０）及び相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Ｑ９）とＨＩＭ配列にハイブリダイズするアニーリング部分をもつタグ付きプローブ（Ｌ２４）を使用して、これら２つのテンプレートから生成された増幅産物を検出した。両プローブをＦＡＭで標識した。表３はそれらの配列及びクエンチングオリゴヌクレオチドの配列を示す。
４つの濃度、０コピー／反応（ｃｐ／ｒｘｎ）、１００ｃｐ／ｒｘｎ、１，０００ｃｐ／ｒｘｎ、及び１０，０００ｃｐ／ｒｘｎのＧＩＣを、４つの濃度、０ｃｐ／ｒｘｎ、１０ｃｐ／ｒｘｎ、１００ｃｐ／ｒｘｎ、及び１，０００ｃｐ／ｒｘｎのＨＩＭと混合して１６の異なる濃度の組み合わせを作った。ＰＣＲ試薬及びサイクル条件は、１００ｎＭのＧ０及びＬ２４プローブ並びに２００ｎＭのＱ９クエンチングオリゴヌクレオチドを反応に使用したことを除いて、実施例１及び表２に記載したとおりであった。ＦＡＭ標識からの蛍光の読み取りは、サイクル＃６から始めて各サイクルについて５８℃及び８０℃で行った（表２を参照）。
これらの実験の結果を図７〜９に示す。５８℃での蛍光の読み取り値を図７に増幅曲線として示す。図７Ａは、ＨＩＭが存在せず、０、１００、１，０００、又は１０，０００ｃｐ／ｒｘｎのＧＩＣで作成された増幅曲線を示す。興味深いことに、１０ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｂ）、１００ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｃ）、及び１，０００ｃｐ／ｒｘｎ（図７Ｄ）のＨＩＭの存在下における５８℃での増幅曲線の読み取り値には、蛍光強度及びサイクル閾値（Ｃｔ）の値に本質的な違いがなく、この温度では標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇ０プローブからのＦＡＭシグナルのみが検出されることを示している。これは、Ｌ２４タグ付きプローブのＦＡＭ標識が、Ｑ９クエンチングオリゴヌクレオチドのクエンチャーによって非常に効率的にクエンチされ、ＧＩＣ標的の検出を妨害しないからである。
８０℃での蛍光の読み取り値を図８に増幅曲線として示す。図８Ａは、ＧＩＣなしに０、１０、１００、又は１，０００ｃｐ／ｒ×ｎのＨＩＭで作成された増幅曲線を示す。蛍光は、プローブの「アニーリング部分」のクエンチャー（ヌクレアーゼによる加水分解による）によっても、この高温での鎖解離によるクエンチングオリゴヌクレオチドのクエンチャー（Ｑ９）によっても、もはやクエンチされないので、ここでＬ２４プローブのＦＡＭラベルから検出することができる。Ｌ２４プローブからの蛍光強度はＧ０プローブの蛍光強度よりかなり低いが、それでもＨＩＭの出発濃度に対応するＣｔ値を計算するのに充分である。しかし、ＨＩＭとＧＩＣの両方が存在する場合、８０℃での蛍光読み取り値は、Ｇ０プローブから検出されるより強い蛍光に起因して複雑な曲線を生じる（図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄを参照）。したがって、Ｌ２４タグ付きプローブからの蛍光シグナルを「明らかにする（uncover）」ためには、Ｇ０プローブから蛍光シグナルを減算する必要があることになり、８０℃での蛍光読み取り値からの（Ｇ０プローブのみによってもたらされる）５８℃での蛍光読み取り値の減算を伴って、図８Ａで観察されたものに類似することになる増幅曲線が導き出されることになる。
５８℃での蛍光読み取り値の１００％を８０℃の蛍光読み取り値からを減算すると、得られた増幅曲線は負の値を示し、減算の過剰補正があることが示唆された。この観察結果の理由は、５８℃での蛍光強度と比較した、８０℃でのＦＡＭ標識の強度の減少によるものであった。したがって、「正規化」係数が必要であると考えられ、８０℃のシグナルから減算された５８℃でのシグナルの８４％が最良の結果を生むことが実験的に決定された。得られた増幅曲線は、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｄに示され、すべてが図８Ａの０ＧＩＣ増幅曲線と実質的に同一である。これら結果は、ＧＩＣの存在を示す蛍光シグナルは、ＨＩＭの存在を示す蛍光シグナルと切り離しできることを示し、本発明の多重化の有用性を実証している。
実施例３ 異なる蛍光色素を有するプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ
Ｇ０及びＬ２４プローブを、第１のセットではＦＡＭ色素で、第２のセットではＨＥＸ色素で、第３のセットではＪＡ２７０色素で、第４のセットではＣｙ５．５色素で標識したことを除いて、実施例２に記載したように一連の実験を行った。各実験セットにおいて、ＰＣＲ増幅を、ＧＩＣテンプレートのみが１００ｃｐ／ｒｘｎで存在する状態、ＨＩＶテンプレートのみが１０００ｃｐ／ｒｘｎで存在する状態、又は存在するＧＩＣ（１００ｃｐ／ｒｘｎ）及びＨＩＶ（１０００ｃｐ／ｒｘｎ）テンプレートの両方が存在する状態で実施した。実験の結果を図１０に示す。５８℃での蛍光読み取り値（図１０、第１列）では、Ｌ２４プローブは依然としてＱ９クエンチングオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたので、ＧＩＣテンプレートに対するＧ０プローブによって生成されたシグナルのみが観察された。８０℃での蛍光読み取り値（図１０、第２列）では、Ｇ０プローブ（ＧＩＣ用）及び「非クエンチ」Ｌ２４プローブ（ＨＩＶ用）の両方によって生成されたシグナルが観察された。各蛍光色素について正規化係数を使用した後、８０℃のシグナルから５８℃のシグナルを減算すると、ＨＩＶテンプレートのみに由来する増幅曲線が得られた（図１０、第３列）。ＨＥＸ及びＪＡ２７０から生成されたシグナルはＦＡＭからのシグナルと同等又はそれより高かった一方で、Ｃｙ５．５からのシグナルはＦＡＭシグナルよりもかなり低かったが検出可能であった。
実施例４：Ｌ−ＤＮＡタグ付きプローブ及びクエンチングオリゴヌクレオチドを用いたリアルタイムＰＣＲ ＨＩＶ−１グループＭ（ＨＩＭ）テンプレートを検出するためのＬ２４タグ付きプローブを、「天然の」Ｄ−デオキシリボースヌクレオチドの代わりにすべてＬ−デオキシリボースヌクレオチドで構成したことを除いて、実施例２に記載の実験と同一の実験を行った。実験の結果を図１１に示す。ここで、Ｌ−エナンチオマー型のＬ２４タグ付きプローブを用いて生じた蛍光シグナルは、Ｄ−エナンチオマー型のＬ２４タグ付きプローブを用いて生じたシグナルよりも４〜５倍高いことが観察された。
実施例５：２’−Ｏメチル修飾を有するタグ付きプローブ及びクエンチングオリゴヌクレオチドを用いたリアルタイムＰＣＲ
ヌクレオチド修飾を有するタグ付きプローブ及びクエンチングオリゴヌクレオチドを使用したことを除いて、実施例２に記載のものと同様の実験を行った。ＨＩＭテンプレートの存在を検出するために使用した「標準」Ｌ２４プローブにくわえて、プローブのタグ部分のすべてのヌクレオチド（Ｌ２４の下線部分として表３に示される）がリボース部分の２’位にＯ−メチル置換基（２’−ＯＭｅ）を有することによって修飾されたタグ付きプローブＬ２４−ＯＭＥを生成した。Ｌ２４のタグ部分にハイブリダイズするための２つの修飾Ｑ９クエンチングオリゴヌクレオチドも生成した。Ｑ９−ＯＭＥはすべてのヌクレオチドが２’−ＯＭｅ置換基で修飾され、Ｑ９−ＯＭＥ（Ａ／Ｇ）はＡ及びＧヌクレオチドのみが２’−ＯＭｅ置換基で修飾された。タグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドの次の３つの異なる組み合わせを用いて、ＨＩＭテンプレートの検出を行った。Ｑ９−ＯＭＥをもつＬ２４（Ａ／Ｇ）、Ｑ９−ＯＭＥをもつＬ２４−ＯＭＥ（Ａ／Ｇ）、及びＱ９−ＯＭＥをもつＬ２４−ＯＭＥ。この実験の結果を図１２に示す。
予想通り、５８℃では、Ｇ０ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからの蛍光シグナルしか検出できなかった。７５℃では、蛍光シグナルはＧ０及びＬ２４／Ｑ９−ＯＭＥ（Ａ／Ｇ）から検出されたが、他の２つのタグ−クエンチングオリゴヌクレオチドの組み合わせからは検出されなかった。８８℃では、蛍光シグナルはＬ２４−ＯＭＥ／Ｑ９−ＯＭＥ（Ａ／Ｇ）からも検出でき、９７℃では、シグナルはＬ２４−ＯＭＥ／Ｑ９−ＯＭＥの組み合わせを含むすべてのプローブから検出された。これら結果は、タグ付きプローブ及びクエンチング分子を用いて３つの別個の温度からの蛍光読み取りが達成できるだけでなく、２’−ＯＭｅなどのヌクレオチド修飾が、タグ部分のヌクレオチド配列又はクエンチングオリゴヌクレオチドに又は両方に、その配列又はその長さのいずれかを変える必要なしにタグ−クエンチングオリゴヌクレオチド二本鎖の融解温度を変えるために選択的に導入できることを示す。
明瞭さや理解のために、上記の発明をある程度詳細に記載してきたが、本開示を読むことから、本発明の真の範囲（the true scope of the invention）から逸脱することなく、形態及び詳細においてさまざまな変更がなされうることは当業者なら明らかであろう。例えば、上記の方法はさまざまな組み合わせで使用することができる。
非公式の（INFORMAL）配列リスト
配列番号１：９ＦＡＭ９ＴＡＧオリゴヌクレオチド配列
ＣＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴ
配列番号２：Ｑ０クエンチングオリゴヌクレオチド配列（クエンチャーなし）
ＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧ
配列番号３：Ｑ１クエンチングオリゴヌクレオチド配列（５’末端にＢＨＱ−１クエンチャー）
ＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧ
配列番号４：Ｇ０ ＴａｑＭａｎプローブオリゴヌクレオチド配列（ＦＡＭ／ＢＨＱ／リン酸塩）
ＴＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＴＴＣＧＴＡＡＣＧＧＴＧＣ
配列番号５：Ｌ２４タグ付きプローブオリゴヌクレオチド配列（ＢＨＱ／ＦＡＭ／リン酸塩）
ＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴ
配列番号６：Ｑ９クエンチングオリゴヌクレオチド配列（３’末端にクエンチャー）
ＡＧＡＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧ

Claims (23)

  1. 試料中の標的核酸を増幅及び検出する方法であって、
    （ａ）単一の反応容器内で前記標的核酸配列を含む前記試料を、
    （ｉ）各オリゴヌクレオチドプライマーが前記標的核酸の部分配列の逆鎖にハイブリダイズできる１つのオリゴヌクレオチドプライマー対、
    （ｉｉ）アニーリング部分及びタグ部分を含み、前記タグ部分が、前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列又は非ヌクレオチド分子を含み、前記アニーリング部分が、前記標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された前記標的核酸の前記部分配列の領域にハイブリダイズし、前記タグ部分又は前記アニーリング部分に位置するレポーター部分及び前記アニーリング部分に位置する第１のクエンチャー部分を含む相互作用標識をさらに含み、前記レポーター部分がヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチャー部分から分離され、前記レポーター部分をクエンチできる１つ以上のクエンチャー部分を含む又はそれと結合するクエンチング分子が前記タグ部分に結合しているとき、前記タグ部分が、前記クエンチング分子に温度依存的に可逆的結合しているオリゴヌクレオチドプローブ
    と接触させるステップ、
    （ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、前記ポリメラーゼの前記ヌクレアーゼ活性が、前記プローブの前記アニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分からの前記タグ部分の切断及び分離を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いるＰＣＲで前記標的核酸を増幅するステップ、
    （ｃ）前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合している第１の温度で前記レポーター部分からの抑制シグナルを測定するステップ、
    （ｄ）前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合していない第２の温度に温度を上昇させるステップ、
    （ｅ）前記第２の温度で前記レポーター部分からの温度補正シグナルを測定するステップ、
    （ｆ）前記第２の温度で検出された温度補正シグナルから前記前記第１の温度で検出された前記抑制シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
    （ｇ）複数のＰＣＲサイクルを通してステップ（ｂ）から（ｆ）を繰り返すステップ、
    （ｈ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値を測定して、前記標的核酸の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  2. 前記レポーター部分が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又は前記オリゴヌクレオチドプローブの前記アニーリング部分にある請求項１に記載の方法。
  3. 前記タグ部分が、前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、前記クエンチング分子が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ハイブリダイゼーションによって前記タグ部分に結合する請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  5. 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又は前記クエンチング分子又は前記タグ部分と前記クエンチング分子の両方が、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
  6. 前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記レポーター部分が蛍光色素であり、前記クエンチャー部分が、前記蛍光色素からの検出可能なシグナルをクエンチする請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
  8. 試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）単一の反応容器内で前記２つ以上の標的核酸配列を含むことが疑われる前記試料を、
    （ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、
    （ｉｉ）前記第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された前記第１の標的核酸配列内にアニールし、検出可能なシグナルを生成できる蛍光部分及び前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチできる第１のクエンチャー部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチャー部分と分離されている第１のオリゴヌクレオチドプローブ、
    （ｉｉｉ）２つの異なる部分、前記第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された前記第２の標的核酸配列内にアニールし、第２のクエンチャー部分を含むアニーリング部分と、前記アニーリング部分の前記５’末端若しくは３’末端に結合された又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合された、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むタグ部分を含み、前記タグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記蛍光部分と同一であり、その検出可能なシグナルが前記アニーリング部分の前記第２のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第２のクエンチング部分から分離されている第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
    （ｉｖ）前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記タグ部分にハイブリダイズしたときに前記タグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第３のクエンチャー部分を含むクエンチングオリゴヌクレオチド、
    と接触させるステップ、
    （ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、前記核酸ポリメラーゼの前記５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のクエンチング部分からの前記蛍光部分の切断及び分離並びに前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記アニーリング部分の前記第２のクエンチング部分からの前記タグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離を可能にするように、前記第１及び第２の標的核酸配列を、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、前記伸長ステップの間に、前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記タグ部分にハイブリダイズしたままであるステップ、
    （ｃ）前記クエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分にハイブリダイズされている第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
    （ｄ）前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分にハイブリダイズされない、前記第１の温度より高い第２の温度に温度を上昇させるステップ、
    （ｅ）前記第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
    （ｆ）前記第２の温度で検出された前記蛍光シグナルから前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
    （ｇ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、
    （ｈ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値から前記第２の標的核酸配列の存在を決定するステップ
    を含む方法。
  9. 前記タグ部分が、前記アニーリング部分の５’末端又は前記アニーリング部分の３’末端に結合されている請求項８に記載の方法。
  10. 前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記クエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に連結されている請求項８〜１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又は前記クエンチングオリゴヌクレオチド又は前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方が、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法。
  13. 前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項８〜１２の何れか一項に記載の方法。
  14. 試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）単一の反応容器内で前記２つ以上の標的核酸配列を含むことが疑われる前記試料を、
    （ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、
    （ｉｉ）２つの異なる部分、前記第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された前記第１の標的核酸配列内にアニールし、第１のクエンチャー部分を含み、３’末端でブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長を妨げる第１のアニーリング部分と、前記第１のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合され、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む第１のタグ部分を含み、前記第１のタグ部分が、検出可能なシグナルが前記第１のアニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチング部分から分離されている第１のオリゴヌクレオチドプローブ、
    （ｉｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、前記第１のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記第１のタグ部分にハイブリダイズされたときに前記第１のタグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチング部分を含む第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、
    （ｉｖ）２つの異なる部分、前記第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって境界を画された前記第２の標的核酸配列内にアニールし、第３のクエンチャー部分を含み、３’末端でブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長を妨げる第２のアニーリング部分と、前記第２のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合され、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分の前記ヌクレオチド配列と比較して異なる核酸配列若しくは異なるヌクレオチド修飾を有する第２のタグ部分を含み、前記第２のタグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記蛍光部分と同一であり、検出可能なシグナルが、前記第２のアニーリング部分の前記第３のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第３のクエンチング部分から分離されている第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
    （ｖ）前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、前記第２のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記第２のタグ部分にハイブリダイズされたときに前記第２のタグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第４のクエンチング部分を含む第２のクエンチングオリゴヌクレオチドと接触させ、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分の間の前記二本鎖が、前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドと前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分の間の前記二本鎖より高い融解温度（Ｔｍ）値を有するステップ、
    （ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、前記核酸ポリメラーゼの前記５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、
    （ｉ）前記伸長ステップにおいて、前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが前記第１のタグ部分にハイブリダイズしたままである、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の前記第１のクエンチング部分からの前記第１のタグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離、及び
    （ｉｉ）前記伸長ステップにおいて、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが前記第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の前記第３のクエンチング部分からの前記第２のタグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離
    を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記第１及び第２の標的核酸配列を増幅するステップ、
    （ｃ）前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブからの前記第１のタグ部分にハイブリダイズされず、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブからの前記第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである第１の温度に温度を上昇させるステップ、
    （ｄ）前記第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
    （ｅ）前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分にハイブリダイズされない、前記第１の温度より高い第２の温度に温度を上昇させるステップ、
    （ｆ）前記第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
    （ｇ）前記第２の温度で検出された前記蛍光シグナルから前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
    （ｈ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、
    （ｉ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値から前記第２の標的核酸配列の存在を決定するステップ
    を含む方法。
  15. 前記第１のタグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の３’末端に結合され、前記第２のタグ部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の３’末端に結合されている請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１のタグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の５’末端に結合され、前記第２のタグ部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の５’末端に結合されている請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分に連結されている請求項１４〜１６の何れか一項に記載の方法。
  18. 前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分に連結されている請求項１４〜１７の何れか一項に記載の方法。
  19. 前記第１のタグ部分と前記第２のタグ部分がともに、両方のタグ部分が核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項１４〜１８の何れか一項に記載の方法。
  20. 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分、若しくは前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、若しくは前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分、若しくは前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドのいずれか又はそれらのいずれかの組み合わせが、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む請求項１４〜１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１４〜２０の何れか一項に記載の方法。
  22. 試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出するためのキットであって、
    （ａ）前記２つ以上の標的核酸配列の各鎖に相補的な配列をもつ２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、
    （ｂ）２つの異なる部分、前記２つ以上の標的核酸配列の１つに少なくとも部分的に相補的な配列を含み、前記２つ以上の標的核酸配列の前記の１つにアニールし、第１のクエンチャー部分を含むアニーリング部分と、前記第１のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合された、又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合されたタグ部分を含み、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、前記タグ部分が、検出可能なシグナルが前記アニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分でクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチング部分から分離されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ、
    （ｃ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記タグ部分にハイブリダイズしたときに前記タグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチャー部分を含む少なくとも１つのクエンチングオリゴヌクレオチド
    を備えるキット。
  23. 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分、又は前記クエンチングオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方が、もう１つの（one more）ヌクレオチド修飾を含み、前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項２２に記載のキット。
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