JP2024522640A - 高感度で温度多重化ｐｃｒを行うための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、高感度で標的核酸を検出および定量するための温度多重化ＰＣＲのための方法を記載する。方法は、試料を温度多重化ＰＣＲ用に設計されたプローブと接触させ、複数の温度で蛍光を測定し、シグナルを減算して、目的の各標的の計算されたシグナルを取得することによって実施される。さらに、方法は、第１の蛍光シグナルのベースラインを取得すること、および取得された第１の蛍光シグナルのベースラインを用いて計算されたシグナルを調整して、ベースラインシフトした計算されたシグナルを取得することを含む。
【選択図】図７

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための方法、特に、高感度で温度多重化ＰＣＲを行うための方法に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物医学研究、疾患のモニタリングおよび診断の普遍的なツールとなっている。ＰＣＲによる核酸配列の増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，１８８号に記載されている。ＰＣＲは現在、当技術分野で周知であり、科学文献に広く記載されている。ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（（１９９９）Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、（（１９９５）Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（（１９９０）Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、およびＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（（１９８９）Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。「リアルタイム」ＰＣＲアッセイは、標的配列の増幅および検出および開始量の定量を同時に行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性を用いる基本的なＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイは、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７２７６－７２８０および米国特許第５，２１０，０１５号に記載されている。ヌクレアーゼ活性なしのリアルタイムＰＣＲ（ヌクレアーゼ－フリーアッセイ）は、２００８年１２月９日に出願された米国出願シリアル番号第１２／３３０，６９４号に記載されている。リアルタイムＰＣＲにおける蛍光プローブの使用は、米国特許第５，５３８，８４８号に記載されている。

蛍光プローブを用いた典型的なリアルタイムＰＣＲのプロトコルは、各標的配列に特異的な標識されたプローブの使用を含む。プローブは、好ましくは、特定の波長で光を吸収および放出する１つまたは複数の蛍光部分で標識される。標的配列またはそのアンプリコンにハイブリダイズすると、プローブは、プローブハイブリダイゼーションまたは加水分解の結果として蛍光発光の検出可能な変化を呈する。

しかしながら、リアルタイムアッセイの主な課題は、単一のチューブ内の多数の標的を分析する能力を維持することである。医学および診断の事実上あらゆる分野において、目的の遺伝子座の数は急速に増加している。例えば、いくつか例を挙げると、法医学のＤＮＡプロファイリング、病原性微生物の検出、多遺伝子座遺伝子疾患のスクリーニングおよび多遺伝子の発現研究では、複数の遺伝子座を分析しなければならない。

現在の方法の大半は、アッセイを多重化する能力は、検出機器によって制限されている。具体的には、同じ反応における複数のプローブの使用は、別個の蛍光標識の使用を必要とする。複数のプローブを同時に検出するために、機器は各プローブによって放出される光シグナルを識別できなくてはならない。市場に流通している現在の技術の大半は、同じ反応容器内で４～７を超える別個の波長を検出することができない。したがって、標的ごとに１つの一意的に標識されたプローブを使用すると、同じ容器内で４～７以下の別個の標的を検出できるにすぎない。実際には、少なくとも１つの標的は、通常、対照核酸である。したがって、実際には、同じチューブ内で３～６以下の実験標的が検出できるにすぎない。蛍光色素の使用はまた、約６つまたは７つの色素のみが顕著な重複干渉なしに可視スペクトル内に適合され得るという、スペクトル幅が原因で制限される。したがって、増幅および検出戦略に根本的な変化が生じない限り、アッセイを多重化する能力は、臨床面のニーズに追いつかないであろう。

上記のニーズに対処するために、温度多重化ＰＣＲ技法を用いて複数の標的核酸を検出するための方法が、米国特許出願シリアル番号第１５／７０５，８２１号（ＵＳ２０１８－０７３０６４Ａ１として公開）に開示されており、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法は、多重化の範囲を大幅に改善するが、臨床的に有益であるためには、このような方法の感度を改善するニーズが依然として存在する。

本発明は、高感度で核酸配列検出、特に温度多重化ＰＣＲ技法を用いた複数の標的核酸の検出のための新規方法を提供する。方法は、試料を温度多重化ＰＣＲ用に設計されたプローブと接触させ、複数の温度で蛍光を測定し、シグナルを減算して目的の各標的の計算されたシグナルを取得し、計算されたシグナルのベースラインを調整し、結果として得られたシグナルを評価して、標的を同定および定量することによって行われる。

一態様では、試料中の２以上の標的核酸配列を検出するための方法が提供される。方法は、単一の反応容器内において、前記２以上の標的核酸配列を含むと疑われる試料を、それぞれが共通の蛍光色素を含むプローブペアと接触させることであって、プローブペアのうちの第１のプローブは第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、プローブペアのうちの第２のプローブは第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む、プローブペアと接触させることを含む。第１のプローブおよび第２のプローブは、温度多重化ＰＣＲ用に設計され得る。

方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって第１の標的核酸配列および第２の標的核酸配列を増幅すること、第１の温度で共通の蛍光色素の第１の蛍光シグナルを測定すること、第１の温度よりも高い第２の温度まで温度を上昇させること、および第２の温度で共通の蛍光色素の第２の蛍光シグナルを測定することをさらに含む。方法は、第１の蛍光シグナルを第２の蛍光シグナルから減算して、計算されたシグナルを取得すること、第１の蛍光シグナルのベースラインを取得すること、および第１の蛍光シグナルの取得されたベースラインを用いて計算されたシグナルを調整してベースラインシフトした計算されたシグナルを取得することをさらに含む。

方法は、上記のステップを複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１の標的核酸配列および第２の標的核酸配列から所望量の増幅産物を生成させること、ならびに複数のＰＣＲサイクル由来の第１の蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を判定すること、および複数のＰＣＲサイクル由来のベースラインシフトした計算されたシグナルから第２の標的核酸配列の存在を判定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、第１の蛍光シグナルのベースラインを取得することは、第１の温度で第１の蛍光シグナルの非線形回帰分析を実行して近似シグナル曲線を同定し、近似シグナル曲線からベースラインを取得することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の蛍光シグナルのベースラインを取得することは、近似シグナル曲線のｙ切片を求めることを含み得、計算されたシグナルを調整することは、計算されたシグナルのｙ切片を近似シグナル曲線のｙ切片にマッチングさせることを含み得る。他の実施態様では、第１の蛍光シグナルのベースラインを取得することは、近似シグナル曲線のｙ切片およびベースラインスロープを求めることを含み得、計算されたシグナルを調整することは、計算されたシグナルのｙ切片を近似シグナル曲線のｙ切片にマッチングさせること、および計算されたシグナルのベースラインスロープを近似シグナル曲線のベースラインスロープにマッチングさせることを含み得る。

いくつかの実施形態では、第１の標的核酸および第２の標的核酸の存在を判定することは、第１の蛍光シグナルの一連の相対蛍光強度値およびベースラインシフトした計算されたシグナルの一連の相対蛍光強度値を求めることを含み得る。例えば、第１の標的核酸配列の存在を判定することは、第１の蛍光シグナルの一連の相対蛍光強度値を閾値と比較すること、および第２の標的核酸配列の存在を判定することは、ベースラインシフトした計算されたシグナルの一連の相対蛍光強度値を第２の閾値と比較することを含み得る。例えば、第１の標的核酸および第２の標的核酸の存在を判定することは、以下の式に基づいて計算される相対蛍光強度エンドポイント（ＲＦＩｅ）を求めることを含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、試料中の少なくとも３つの標的核酸配列を検出する。例えば、試料を、共通の蛍光色素と、第３の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列とを含む第３のプローブとも接触させ得、第３の核酸もポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。そのような方法は、第２の温度よりも高い第３の温度まで温度を上昇させること、第３の温度で共通の蛍光色素の第３の蛍光シグナルを測定すること、第２の蛍光シグナルを第３の蛍光シグナルから減算して、第２の計算されたシグナルを取得すること、および第１の蛍光シグナルの取得されたベースラインを用いて第２の計算されたシグナルを調整して第２のベースラインシフトした計算されたシグナルを取得することをさらに含み得る。方法は、複数のＰＣＲサイクルで上記ステップを繰り返して、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列から所望量の増幅産物を生成させること、ならびに複数のＰＣＲサイクル由来の第２のベースラインシフトした計算されたシグナルから第３の標的核酸配列の存在を判定することをさらに含み得る。

本発明の方法の一実施形態による、２つの温度での蛍光プローブを用いた温度多重化の図示である。 本発明の方法の一実施形態による、３つの温度での温度多重化の図示である。 ２つの温度での蛍光シグナルおよびベースラインマッチングなしの減算されたシグナルを示す。 本開示の方法の一実施形態による、図３に示す２つの温度での蛍光シグナルおよびベースラインマッチングした減算シグナルを示す。 ベースラインマッチングなしで結果として得られたＲＦＩｅ値のプロットを示す。 本開示の方法の一実施形態による、ベースラインマッチしたシグナルを用いて結果として得られたＲＦＩｅ値のプロットを示す。 本開示の方法の一実施形態による、ベースラインマッチングを用いた高感度で温度多重化ＰＣＲを行うための方法を示す。

定義
本明細書で使用される「試料」という用語は、核酸を含む標本または培養物（例えば微生物培養物）を含む。「試料」という用語はまた、生体試料および環境試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の標本を含み得る。生体試料としては、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞上皮、胃、腹膜、管、耳、関節鏡視下の）、生検試料、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、***、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、母体液（ｂｒｅａｓｔ ｆｌｕｉｄ）、胚細胞、および胎児細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、生体試料は血液であり、より好ましくは血漿である。本明細書で使用される場合、「血液」という用語は、一般的な定義のとおり、全血または血液の任意の画分（例えば、血清および血漿）を包含する。血漿とは、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離から生じる全血の画分を指す。血清とは、血液試料が凝固した後に残った体液の水様性部分を指す。環境試料としては、表面物質、土壌、水および工業試料などの環境物質、ならびに食品および乳製品の加工機器、装置、器具、設備、用具、使い捨ておよび非使い捨てアイテムから得られた試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「標的」または「標的核酸」という用語は、その存在が検出もしくは測定されるか、またはその機能、相互作用もしくは特性が研究される任意の分子を意味することが意図されている。したがって、標的は、検出可能なプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）もしくはアッセイが存在するか、または当業者によって生成され得る本質的にいかなる分子も含む。例えば、標的は、検出可能なプローブ（例えば、抗体）と結合するか、そうでなければ接触することができる生体分子、例えば核酸分子、ポリペプチド、脂質、または炭水化物であり得、検出可能なプローブはまた、本発明の方法によって検出され得る核酸を含む。本明細書で使用される場合、「検出可能なプローブ」とは、目的の標的生体分子にハイブリダイズまたはアニーリングすることができ、本明細書に記載の標的生体分子の特異的検出を可能にする任意の分子または作用物質を指す。本発明の一態様では、標的は核酸であり、検出可能なプローブはオリゴヌクレオチドである。「核酸」および「核酸分子」という用語は、本開示を通して互換的に使用され得る。用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＲＮＡ、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、クローン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、増幅された核酸、アンプリコン、ＰＣＲ産物および他の種類の増幅された核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ならびにポリアミド核酸（ＰＮＡ）を指し、これらはすべて、一本鎖か二本鎖形態のいずれかであり得、特に限定しない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の機能を果たすことができる天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびにそれらの組み合わせおよび／または混合物を包含し得る。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのトリ、ジ、およびモノホスフェート、ならびにポリ核酸またはオリゴヌクレオチド内に存在するモノホスフェートモノマーを含む、天然に存在するヌクレオチドおよび改変された／天然に存在しないヌクレオチドの両方を指す。ヌクレオチドはまた、リボ；２’－デオキシ；２’，３’－デオキシ、ならびに当技術分野において周知な多数の他のヌクレオチド模倣物であり得る。模倣物としては、鎖終結ヌクレオチド、例えば３’－Ｏ－メチル、ハロゲン化塩基または糖置換；非糖、アルキル環構造を含む代替糖構造；イノシンを含む代替塩基；デアザ改変；カイ（ｃｈｉ）、およびプシー（ｐｓｉ）、リンカー改変；質量標識改変；ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテルを含むホスホジエステル改変または置換；および光開裂性二トロフェニル部分などの開裂連結を含む、塩基性または完全なインターヌクレオチド置換が挙げられる。

標的の有無は、定量的または定性的に測定され得る。標的は、例えば単純もしくは複雑な混合物、または実質的に精製された形態を含む、様々な異なる形態があり得る。例えば、標的は、他の成分を含む試料の一部であり得るか、または試料の唯一のもしくは主要な成分であり得る。したがって、標的は、細胞または組織全体の成分、細胞もしくは組織抽出物、その分画されたライセート、または実質的に精製された分子であり得る。また、標的は、既知または未知の配列または構造のいずれかを有し得る。

「増幅反応」という用語は、核酸の標的配列のコピーを増やすための任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ手段を指す。

「増幅すること」とは、増幅を可能にするのに十分な条件に溶液を供するステップを指す。増幅反応の成分としては、例えば、プライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。「増幅すること」という用語は、典型的には、標的核酸の「指数関数的」増加を指す。しかしながら、本明細書で使用される「増幅すること」とは、核酸の選択された標的配列の数の直線的増加を指し得るが、１回限りの単一プライマー伸長ステップとは異なる。

「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、標的の二本鎖ＤＮＡの特定のセグメントまたはサブ配列が等比数列的に増幅される方法を指す。ＰＣＲは当業者に周知であり；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ、１９９０を参照されたい。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結された天然または改変ヌクレオシドモノマーの線状オリゴマーを指す。オリゴヌクレオチドとしては、標的核酸に特異的に結合することができる、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結され、数個のモノマー単位（例えば３～４個）から数十個のモノマー単位（例えば４０～６０個）までのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合、特に断りのない限り、ヌクレオチドは、左から右へ５’－３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示し、「Ｕ」はリボヌクレオシドであるウリジンを示すことが理解されるであろう。通常、オリゴヌクレオチドは、４つの天然デオキシヌクレオチドを含むが、それらは、リボヌクレオシドまたは非天然ヌクレオチドアナログも含み得る。酵素が活性のために特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件（例えば一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスなど）を有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質の適切な組成の選択は、十分に当業者の知識の範囲内である。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチドプライマー」または単に「プライマー」とは、標的核酸テンプレート上の配列にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブの検出を容易にするポリヌクレオチド配列を指す。本発明の増幅実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸合成の開始点として働く。非増幅の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、切断剤によって切断され得る構造を作成することができる。プライマーは、様々な長さであり得、多くの場合、５０ヌクレオチド長未満、例えば１２～２５ヌクレオチド長である。ＰＣＲで使用するためのプライマーの長さおよび配列は、当業者に既知の原理に基づいて設計され得る。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、目的の標的核酸にハイブリダイズまたはアニーリングすることができ、かつ標的核酸の特異的検出を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。

「レポーター部分」または「レポーター分子」は、検出可能なシグナルを与える分子である。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光または発光であり得る。「クエンチャー部分」または「クエンチャー分子」は、レポーター部分からの検出可能なシグナルをクエンチすることができる分子である。

「ミスマッチヌクレオチド」または「ミスマッチ」とは、その位置（複数可）で標的配列に相補的でないヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つのミスマッチを有し得、２、３、４、５、６もしくは７またはそれ以上のミスマッチヌクレオチドも有し得る。

本明細書で使用される「多型」という用語は、対立遺伝子バリアントを指す。多型としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、ならびに単純配列長多型が挙げられ得る。多型は、別の対立遺伝子と比較して、ある対立遺伝子での１つまたは複数のヌクレオチド置換に起因し得るか、または挿入もしくは欠失、重複、逆位、および当技術分野で公知な他の改変に起因し得る。

標的ポリヌクレオチドに対するプローブなど、１つの分子の別の分子への結合に関する「特異的」または「特異性」という用語は、２つの分子間の認識、接触、および安定な複合体の形成とともに、その分子と他の分子との大幅に弱い認識、接触、または複合体形成も指す。本明細書で使用される場合、「アニール」という用語は、２つの分子間の安定な複合体の形成を指す。

プローブの少なくとも１つの領域が核酸配列の相補体の少なくとも１つの領域と実質的な配列同一性を共有する場合、プローブは、核酸配列に「アニーリングすることができる」。「実質的な配列同一性」は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性である。ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の配列同一性を求める目的では、ＵおよびＴは、しばしば同じヌクレオチドと見なされる。例えば、配列ＡＴＣＡＧＣを含むプローブは、配列ＧＣＵＧＡＵを含む標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。

本明細書で使用される「切断剤」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブを切断して断片を得ることができる任意の手段を指し、酵素を含むがこれに限定されない。増幅が起こらない方法の場合、切断剤は、オリゴヌクレオチドプローブの第２の部分またはその断片を切断、分解するか、そうでなければ分離するためにのみ役立ち得る。切断剤は、酵素であってもよい。切断剤は、天然でも合成でも、修飾されていてもいなくてもよい。

増幅が起こる方法の場合、切断剤は、好ましくは、合成（または重合）活性およびヌクレアーゼ活性を有する酵素である。このような酵素は、しばしば核酸増幅酵素である。核酸増幅酵素の一例は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩなどの核酸ポリメラーゼ酵素である。酵素は、天然に存在するもの、非改変または改変されたものであり得る。

「核酸ポリメラーゼ」とは、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素を指す。例示的な核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、末端転移酵素、逆転写酵素、テロメラーゼなどが挙げられる。

「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、選択された期間高温にさらされた場合に、安定であり（すなわち、分解または変性に耐え）、かつ十分な触媒活性を保持するＤＮＡポリメラーゼを指す。例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間高温にさらされた場合に、後続のプライマー伸長反応を引き起こすのに十分な活性を保持する。核酸の変性に必要な加熱条件は当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号に例示されている。本明細書で使用される場合、耐熱性ポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクル反応における使用に適している。耐熱性核酸ポリメラーゼの例としては、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマポリメラーゼ、例えばＴＭＡ－２５およびＴＭＡ－３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

前述の米国特許出願第１５／７０５，８２１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、温度多重化ＰＣＲ技法は、各別個の蛍光プローブを使用して、別個の温度で蛍光をモニターすることによって複数の標的を同定することを可能にする。より低い温度でモニターされたシグナルは、後続の（より高い）温度シグナルから減算されて、目的のシグナル値を取得することができる。（図１を参照されたい。）より具体的には、前述の出願に記載されているように、温度多重化は、様々なＴｍ温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするタグ部分を有するようにプローブを設計し、Ｔｍ温度またはそれを超える複数の温度で蛍光を測定し、結果として得られたシグナルを処理して標的を同定および定量することによって行われ得る。

例えば、１つの反応における３つの標的核酸の増幅および検出は、すべて同じフルオロフォアで標識された３つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって達成され得る。標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを使用して、第１の温度（通常、ＰＣＲサイクルのアニーリング温度）で蛍光シグナルを測定することによって第１の標的を検出することができる。低いＴｍのタグ－クエンチングオリゴヌクレオチドデュプレックスを有する第１の「タグ付き」プローブを使用して、そのＴｍ温度またはそれを超える、第１の温度よりも高い第２の温度で、計算された蛍光値を測定することによって、第２の標的を検出することができる。高いＴｍのタグ－クエンチングオリゴヌクレオチドデュプレックスを有する第２の「タグ付き」プローブを使用して、そのＴｍ温度またはそれを超える、第２の温度よりも高い第３の温度で、計算された蛍光値を測定することによって、第３の標的を検出することができる。（図２を参照されたい）この方法論は、理論的には、１つの反応で１２から２１の間の異なる標的核酸を検出するために１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび４～７個の異なるレポーター部分（例えば蛍光色素）を有する２つの異なるタグ化プローブの使用、または１つの反応で１６から２８の間の異なる標的核酸を検出するために１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび３つの異なるタグ化プローブの使用を可能にするが、本開示による実施形態に従って実証されるように、改善された感度が望まれる。

３つの温度Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３（この例の目的については昇順）で読み取られる単一の蛍光チャネルの典型的な場合では、Ｔ１は標的「Ａ」に関連付けられ、Ｔ２は標的「Ｂ」に関連付けられ、Ｔ３は標的「Ｃ」に関連付けられ、標的「Ａ」の目的のシグナルは単にＴ１で生成されるシグナルであり、標的「Ｂ」の目的のシグナルはシグナル（Ｔ２）－シグナル（Ｔ１）であり、標的「Ｃ」のシグナルはシグナル（Ｔ３）－シグナル（Ｔ２）である。このシグナルの減算は、標的「Ｂ」および「Ｃ」の目的のシグナルが標的「Ａ」のそれとは異なるベースラインの切片を有するようにし得ることが理解されよう。実際には、シグナルをさらに処理することなく、このようにしてこれらのシグナルを用いる標的の感度は、関連する標的の存在を確実かつ正確に同定すること、および／または関連する標的を定量することを可能にするためには望ましくないことがわかっている。

本発明は、他のシグナルの減算によって計算された目的のシグナルを補正することによって、改善された感度を提供する。３つの異なる標的が、３つの温度（Ｔ１＜Ｔ２＜Ｔ３）で蛍光シグナルをモニターすることによって評価され得るように、異なる温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするように設計されたプローブを有する単一の蛍光色素、例えばＦＡＭを使用する場合、これらの３つの温度のシグナルは以下のように計算され得る（ここで、ＦＡＭ（Ｔ）は、所与の温度Ｔで測定されるＦＡＭの相対蛍光である）：
式１：シグナル（Ｔ１）＝ＦＡＭ（Ｔ１）
式２：シグナル（Ｔ２）＝ＦＡＭ（Ｔ２）－（ＦＡＭ＿ｍ１）ｘＦＡＭ（Ｔ１）
式３：シグナル（Ｔ３）＝ＦＡＭ（Ｔ３）－（ＦＡＭ＿ｍ２）ｘＦＡＭ（Ｔ２）

この場合、ＦＡＭ＿ｍ１およびＦＡＭ＿ｍ２は、シグナルの温度間のゲインを等しくするために求められる色素固有のマルチプライヤーであり得る。例えば、マルチプライヤーは、式４を各温度のシグナルについて評価し、次いで、式５および６を用いて変数を解くことによって計算され得る。
式４：ｍＴ＝中央値［最後の５つの蛍光値］－中央値［最初の５つの蛍光値］。
式５ ｘＦＡＭ（Ｔ１）＝ｍＴ２／ｍＴ１
式６ ｘＦＡＭ（Ｔ２）＝ｍＴ３／ｍＴ１

３つの標的の同定および／または定量に使用される３つの関連シグナルを取得するために、式２および３に記載されているようなシグナル値の単純な減算を含む上記の計算を実行すると、これらのシグナルの各々は、必然的に異なるベースラインの切片を有することが理解されよう。多くの場合、このようなベースラインの切片の処理は、シグナルを適切に評価するために必要なスケールの不変性を維持しない可能性があるため、適切ではない。しかしながら、単一ウェル内の所与の蛍光色素に対して、光路はすべての温度で同一である。したがって、ベースラインの切片のマッチングは、所与のシグナルを異なる温度で同じフルオロフォアのそれに単純にマッチングさせるので、スケールの不変性を実際には維持する。したがって、本発明によれば、Ｔ２およびＴ３でのシグナルのベースラインをＴ１でのシグナルのベースラインとマッチングさせることによって、後続のより高い温度での蛍光シグナルのより正確な表現が取得され得る。本発明のいくつかの実施形態では、このベースラインアライメントまたはマッチングは、シグナルＴ２およびＴ３のｙ切片をシグナルＴ１のそれとマッチングさせることによって達成され得る。他の実施形態では、ベースラインアライメントまたはマッチングは、シグナルＴ２およびＴ３のｙ切片およびベースラインスロープの両方をシグナルＴ１のそれらとマッチングさせることによって達成され得る。シグナルのｙ切片およびベースラインスロープの両方をシグナルＴ１のそれらとマッチングさせることが望ましくかつ最も正確であり得るが、それはまた、より計算集約的であり得ることが理解されよう。したがって、後続の計算の感度を十分に改善することができるので、ｙ切片を単純にマッチングさせることが適切であり得る。

本発明によれば、これは、初期温度でのシグナルのＰＣＲデータセットに適合する曲線への近似を特定し、次いでその近似の関連するベースラインパラメータを後続のより高い温度のシグナルに置換することによって行うことができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、所有者が共通の米国特許第７，６８０，８６８号に記載されているように、多くの場合、ＰＣＲデータセットは、式７、またはベースライン切片＋スロープを含む同様の関数を用いた近似に適合され、ｘはサイクル数を指し、ｚ_１～ｚ_７は調整可能なパラメータである。

この例では、ｙ切片はｚ_１として与えられ、ベースラインスロープはｚ_２として与えられる。したがって、シグナル（Ｔ２）およびシグナル（Ｔ３）とシグナル（Ｔ１）のそれとのベースラインマッチングは、シグナル（Ｔ２）およびシグナル（Ｔ３）のｚ_１またはｚ_１＋ｚ_２ｘをシグナル（Ｔ１）の近似から求められたもので置換することによって行われ得る。以下でさらに詳細に説明するように、そのようなベースラインマッチングは、標的の感度を大幅に改善し、本発明の方法を使用して行われる判定および定量の信頼性および精度を改善する。

図７は、本開示の方法の一実施形態による、ベースラインマッチングを用いた高感度で温度多重化ＰＣＲを行うための方法を示す。最初のステップ７０２では、標的核酸を含むことが疑われる試料を、単一の反応容器（例えば、単一の試験管またはマルチウェルマイクロプレートの単一のウェル）内で、温度多重化ＰＣＲ用に設計されたプローブと接触させる。例えば、試料は、少なくとも２つの別個の標的核酸を含むと疑われ得る。プローブは、複数の温度でモニターされる単一の蛍光色素を使用することによって、温度多重化ＰＣＲ用に設計され得る。例えば、プローブは、様々なＴｍ温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするタグ部分を有することによって、温度多重化用に設計され得る。プローブと接触させた後、ステップ７０４において、標的核酸をＰＣＲによって増幅する。

次に、ステップ７０６において、蛍光シグナルを第１の温度で測定する。例えば、第１の温度は、ＰＣＲサイクルのアニーリングおよび／または伸長温度であり得る。第１の温度で測定されたシグナルは、第１の標的核酸の存在を示し得る。

次に、ステップ７０８において、温度を第２の温度まで徐々に上昇させる。第２の温度は、第２のプローブのタグ－クエンチングオリゴヌクレオチドデュプレックスに関連する融解温度またはそれ以上であり得る。ステップ７１０において、蛍光シグナルを第２の温度で測定する。次いで、第２の標的核酸の存在を示すシグナルを取得するために、ステップ７１２において、第１の温度で検出されたシグナルを第２の温度で検出されたシグナルから減算することによって、計算されたシグナル値を求める。計算されたシグナル値は、任意に、温度の影響を受け得るシグナルの補正のために正規化され得る。例えば、蛍光シグナルは、より高い温度で減少することが公知であり、したがって、標準を使用して、異なる温度で取得されたシグナル値を正規化することができる。

任意に、３つ以上の標的が評価されている場合、温度を、第３のプローブのタグ－クエンチングオリゴヌクレオチドデュプレックスに関連する融解温度またはそれを超える第３の温度まで上昇させ得るさらなるステップ（図７には示されていない）が設けられ得る。蛍光シグナルは、第３の温度で測定され得、第２の計算されたシグナルは、第２の温度での蛍光シグナルを第３の温度での蛍光シグナルから減算することによって取得され得る。

ステップ７１４において、第１の温度での蛍光シグナルのベースラインが取得される。ベースラインは、第１の温度での蛍光シグナルのｙ切片および／またはベースラインスロープを含み得る。ベースラインは、評価されるシグナルのそのようなパラメータを取得するのに適した任意の方法によって取得され得る。いくつかの実施形態では、ベースラインは、測定されたシグナルの非線形回帰分析を実行することによって取得され得る。例えば、測定されたシグナルは、式７を用いて近似され得、ベースラインは、測定されたシグナルから求められる近似シグナルのｙ切片および／またはベースラインスロープ値を求めることによって取得され得る。

ステップ７１６において、ステップ７１２で計算されたシグナルのベースラインは、ステップ７１４で取得されたベースラインをマッチングさせるように調整される。いくつかの実施形態では、ベースラインをマッチングさせるために、ｙ切片のみが使用される。いくつかの実施形態では、ｙ切片およびベースラインスロープの両方がベースラインをマッチングさせるために使用される。第２の計算されたシグナルが取得される場合（例えば、３つの標的が評価されている場合）、第２の計算されたシグナルのベースラインはまた、ステップ７１４で取得されたベースラインをマッチングさせるように調整され得る。

矢印７１８によって示されるように、これらのシグナル測定および計算は、複数のＰＣＲサイクルで、反復され、行われ得る。次いで、ステップ７２０において、所望のサイクル数が繰り返されると、求められた累積シグナル値を使用して、標的核酸の有無だけでなく量も求めることができる。これは、ＰＣＲサイクル数に対してプロットした計算されたシグナル値から生成されるＰＣＲ増幅曲線から閾値（Ｃｔ値）を求めることによって行われ得る。例えば、ＲＦＩｅは、以下に記載の式８を用いて求められ得、閾値は、ＲＦＩｅ値に基づいて設定され得る。

本発明の実施形態を、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない、以下の実施例でさらに説明する。

実施例１
リアルタイムＰＣＲ研究を実施して、本発明の実施形態によるベースラインマッチングの効果を評価した。研究は、様々な濃度のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を含有する試料を用いて実施した。使用した蛍光プローブには、クマリン、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、およびＤＫＲが含まれた。蛍光を、５８℃（Ｔ１）、８０℃（Ｔ２）、および９６℃（Ｔ３）の３つの温度で評価した。本発明の実施形態によるベースラインマッチングの効果を理解するために、ＦＡＭに関連するシグナルを評価し、ベースラインマッチングありおよびなしで計算を行った。具体的には、ＲＦＩｅ値は、以下の式８によって求められ得る、ＰＣＲ曲線のスケール不変増幅の尺度であり、ベースラインマッチングありおよびなしで求めた。

図３は、Ｔ１およびＴ３での蛍光シグナル、および式３を用いて計算されたシグナル（ＣＴ３）を示し、ここで、ＦＡＭ＿ｍ２＝０．９１であり、いかなるベースラインマッチングも行っていない。図３では、ＣＴ３のベースラインがＴ１のそれとアライメントされていないことが分かり得る。図３に示された曲線のＲＦＩｅ値を以下の表に提供する。

図４は、Ｔ１およびＴ３での蛍光シグナル、ならびにベースラインシフトした計算されたシグナル（ＢＣＴ３）を示す。この場合、ＣＴ３のｙ切片をＴ１のそれに置換することによって、ベースラインをシフトさせた。図４では、ＢＣＴ３のベースラインがＴ１のそれとアライメントしていることが分かり得る。図４に示された曲線のＲＦＩｅ値を以下の表に提供する。

Ｔ３に関連する曲線のＲＦＩｅ値が、ベースラインマッチングが採用される場合に有意に増加することが分かり得る。したがって、ベースラインマッチングが標的の同定および定量に重要な影響を及ぼし得ることは明らかである。

実施例２
実施例１と同様であるが、より大きなデータセットを用いたリアルタイムＰＣＲ研究を実施して、ベースラインマッチングの感度改善を評価した。

図５は、ベースラインマッチングなしのデータセットの結果として得られたＲＦＩｅ値のプロットを示し、図６は、ベースラインマッチングしたシグナルを用いて結果として得られたＲＦＩｅ値のプロットを示す。各場合において、水平な線は、正対負の曲線コールの分離、すなわち標的の存在の判定を示す。しかしながら、本発明の実施形態によるベースラインマッチングを用いた後に計算された値を有する図６では、正および負の曲線コールの間にはるかに明確な分離があることが分かり得る。対照的に、ベースラインマッチングを使用しなかった図５では、正および負の曲線コールの間に明確な境界が単純には存在しないことが分かり得る。これらの結果は、本発明の実施形態によるベースラインマッチングを用いて得ることができる改善された感度を実証している。

前述の発明を明確化および理解する目的のために、ある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更が行われ得ることが当業者には明らかであろう。例えば、上述の方法は、様々な組み合わせで用いられ得る。

Claims (16)

1. 試料中の２以上の標的核酸配列を検出するための方法であって、
   （ａ）単一の反応容器内において、前記２以上の標的核酸配列を含むことが疑われる前記試料を、それぞれが共通の蛍光色素を含むプローブペアと接触させるステップであって、前記プローブペアのうちの第１のプローブは第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記プローブペアのうちの第２のプローブは第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブは温度多重化ＰＣＲ用に設計されている、前記ステップ；
   （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記第１の標的核酸配列および前記第２の標的核酸配列を増幅するステップ；
   （ｃ）第１の温度で前記共通の蛍光色素の第１の蛍光シグナルを測定するステップ；
   （ｄ）前記第１の温度よりも高い第２の温度まで温度を上昇させるステップ；
   （ｅ）前記第２の温度で前記共通の蛍光色素の第２の蛍光シグナルを測定するステップ；
   （ｆ）前記第１の蛍光シグナルを前記第２の蛍光シグナルから減算して、計算されたシグナルを取得するステップ；
   （ｇ）前記第１の蛍光シグナルのベースラインを取得するステップ；
   （ｈ）前記第１の蛍光シグナルの前記取得されたベースラインを用いて前記計算されたシグナルを調整して、ベースラインシフトした計算されたシグナルを取得するステップ；
   （ｉ）ステップ（ｂ）からステップ（ｈ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、前記第１の標的核酸配列および前記第２の標的核酸配列から所望量の増幅産物を生成させるステップ；
   （ｊ）前記複数のＰＣＲサイクル由来の前記第１の蛍光シグナルから前記第１の標的核酸配列の存在を判定し、かつ前記複数のＰＣＲサイクル由来の前記ベースラインシフトした計算されたシグナルから前記第２の標的核酸配列の存在を判定するステップ
   を含む、前記方法。
2. 前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインを取得することが、前記第１の温度で前記第１の蛍光シグナルの非線形回帰分析を実行して近似シグナル曲線を同定し、前記近似シグナル曲線から前記ベースラインを取得することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインを取得することが、前記近似シグナル曲線のｙ切片を求めることを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記計算されたシグナルを調整することが、前記計算されたシグナルのｙ切片を前記近似シグナル曲線の前記ｙ切片にマッチングさせることを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインを取得することが、前記近似シグナル曲線のｙ切片およびベースラインスロープを求めることを含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記計算されたシグナルを調整することが、前記計算されたシグナルのｙ切片を前記近似シグナル曲線の前記ｙ切片にマッチングさせること、および前記計算されたシグナルのベースラインスロープを前記近似シグナル曲線の前記ベースラインスロープにマッチングさせることを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１の標的核酸および前記第２の標的核酸の存在を判定することが、前記第１の蛍光シグナルの一連の相対蛍光強度値および前記ベースラインシフトした計算されたシグナルの一連の相対蛍光強度値を求めることを含む、請求項１に記載の方法。
8. （ｉ）前記第１の標的核酸配列の存在を判定することが、前記第１の蛍光シグナルの前記一連の相対蛍光強度値を閾値と比較することを含み；
   （ｉｉ）前記第２の標的核酸配列の存在を判定することが、前記ベースラインシフトした計算されたシグナルの前記一連の相対蛍光強度値を第２の閾値と比較することを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１の標的核酸および前記第２の標的核酸の存在を判定することが、式：
   に基づいて計算される相対蛍光強度エンドポイント（ＲＦＩｅ）を求めることを含む、請求項７に記載の方法。
10. 少なくとも３つの標的核酸配列が前記試料中で検出され、ステップ（ａ）において、前記試料を、前記共通の蛍光色素と、第３の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列とを含む第３のプローブとも接触させ、ステップ（ｂ）において、前記第３の核酸もポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、前記方法が、
    （ｅ１）ステップ（ｅ）の後に、前記第２の温度よりも高い第３の温度まで温度を上昇させるステップ；
    （ｆ１）前記第３の温度で前記共通の蛍光色素の第３の蛍光シグナルを測定するステップ；
    （ｇ１）前記第２の蛍光シグナルを前記第３の蛍光シグナルから減算して、第２の計算されたシグナルを取得するステップ；
    （ｈ１）前記第１の蛍光シグナルの前記取得されたベースラインを用いて前記第２の計算されたシグナルを調整して、第２のベースラインシフトした計算されたシグナルを取得するステップ；
    （ｉ１）ステップ（ｂ）から（ｈ）および（ｅ１）から（ｈ１）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、前記第１の標的核酸配列、前記第２の標的核酸配列、および前記第３の標的核酸配列から所望量の増幅産物を生成させるステップ；ならびに
    （ｊ１）前記複数のＰＣＲサイクル由来の前記第２のベースラインシフトした計算されたシグナルから前記第３の標的核酸配列の存在を判定するステップ
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインを取得することが、前記第１の蛍光シグナルのｙ切片を求めることを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記計算されたシグナルを調整することが、それぞれ、前記計算されたシグナルのｙ切片を前記第１の蛍光シグナルの前記ｙ切片にマッチングさせることを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインを取得することが、前記第１の蛍光シグナルのｙ切片およびベースラインスロープを求めることを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記計算されたシグナルを調整することが、それぞれ、前記計算されたシグナルの各ｙ切片を前記第１の蛍光シグナルの前記ｙ切片にマッチングさせること、および前記計算されたシグナルの各ベースラインスロープを前記第１の蛍光シグナルの前記ベースラインスロープにマッチングさせることを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記プローブの各々が、様々な融解温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズしたタグ部分を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記プローブの各々が、様々な融解温度でそれぞれのクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズしたタグ部分を含む、請求項１０に記載の方法。