KR20200115552A - 별개의 용융 분석을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

샘플 속에서 표적 핵산 서열의 존재를 측정하고/하거나 이의 양을 정량화하기 위한 방법 및 시약이 제공된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 프로브의 Tm에서 신호를 검출하지 않고, 프로브의 Tm보다 더 낮은 온도에서 프로브로부터의 신호 및 프로브의 Tm보다 더 높은 온도에서의 신호를 검출함으로써 용융 분석을 수행하는 단계를 포함한다.

Description

별개의 용융 분석을 위한 방법 및 조성물
본 출원은 2018년 1월 22일자로 출원된, 미국 가특허원 제62/620,298호의 이익을 청구하며, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 생물학적 샘플에서 핵산 표적(nucleic acid target)을 확인하고 정량화하는 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
듀플렉스(duplex) 핵산의 용융 분석은 용융 또는 어닐 피크(anneal peak)를 이용하여 앰플리콘 실체(amplicon identity) 실체를 구별하지만, 용융 피크는 앰플리콘 또는 핵산이 명백하게 표지되어 있지 않는 경우 동일한 온도 근처에서 용융하는 앰플리콘 또는 핵산 듀플렉스를 용이하게 구별할 수 없다. 더욱이, 용융 분석은 일반적으로 표적 증폭 후 수행되며 샘플의 온도를 서서히 증가시키거나 감소시키는데 요구되는 시간으로 인하여 검정의 소요 시간(turnaround time)을 증가시키고 다수의 온도에서 영상을 획득한다.
디지탈 폴리머라제 쇄 반응(Digital polymerase chain reaction: dPCR)은 통상의 PCR을 개량한 것이며 핵산, 예컨대, DNA, cDNA 또는 RNA를 적접 정량화하고 클론적으로 증폭시키는데 사용될 수 있다. 통상의 PCR은 일반적으로 핵산 양을 측정하기 위해 사용되며 샘플당 단일 반응으로 수행된다. dPCR 방법론을 활용하여, 단일 반응을 샘플에서 또한 수행하지만, 샘플은 다수의 구획으로 분리되며 반응은 각각의 구획에서 개별적으로 수행된다. 이러한 분리는 핵산 양의 보다 신뢰가능한 수집 및 민감한 측정을 허용한다.
dPCR을 위한 현재의 방법은 종점(end point) PCR에 의존하여 표적 핵산의 존재를 정량화하는 것이다. 이러한 종점 PCR 분석은 다수의 방식으로 제한된다. 첫째로, DNA 삽입 염료(intercalating dye) 및 TaqMan 프로브(probe)의 사용은 비-특이적인 증폭에 대한 가능성을 야기하여 구획 내에서 거짓 양성 신호를 생산한다. 또한, 기존의 시판 시스템은 다수의 표적을 검출하는 능력을 제한하는 이용가능한 형광성 채널의 수에 있어서의 제한을 갖는다. 마지막으로, 양성 또는 음성으로서 구획의 분류는 구획의 종점 형광성 강도에만 의존한다.
잘-설계된 검정에서, 양호한 분리는 양성 및 음성 구획의 평균 강도 값에서 바람직하다. 그러나, 디지탈 PCR에서보다 흔히, "레인(rain)"으로 알려진 현상은 구획의 이러한 2개 범주로의 분류를 혼란스럽게 한다. 레인은 증폭 후 중간 강도의 구획으로 기술될 수 있다. 양성 구획은 불완전한 증폭으로 인하여 예측된 강도보다 더 낮을 수 있고 음성 구획은 비-특이적인 증폭으로 인하여 예측된 강도보다 더 높을 수 있다. 이는 형광성 강도 변화 외에도 기구 광학 및 열 시스템 변동성에 기인한다.
유사한 방식으로 용융 분석을 dPCR 반응에 적용시키는 노력은 정량적인, 실시간 PCR(qPCR)에 적용되어 왔으며, 잠재적인 결점이 확인되었다. 결점들 중 하나는 dPCR 적용시 용융 프로파일을 획득하는데 요구되는 시간이다. 영상은 많은 상이한 온도, 예를 들면, 35 내지 70개의 독특한 온도에서 다수(예컨대, 30,000개 이하)의 구획에 걸쳐 획득되어야 하며, 이는 매우 시간 소모적일 수 있다. 대표적인 노출 시간은 1초 정도이며, 이는 영상화 전에 LED를 켜는 시간을 고려하지 않은 것이다. 30,000 1nL의 구획에 대한 풋프린트(footprint)는 대략 12.5mm x 12.5mm일 수 있다. 1 nL 구획에서 적절한 해상도를 달성하기 위한 대표적인 시야 치수(field of view dimension)는 대략 6mm x 6mm이다. 따라서, 0.5℃의 해상도에서 용융 프로파일을 생성하기 위해서는, 단일 샘플에 대해 630개의 영상이 요구될 수 있으며 영상 획득만 10분 이상 소요될 수 있으며, 이는 추가 채널에서 용융 획득을 고려하지 않은 것이다. 이러한 방법은 또한 구획을 연장된 기간 동안 성공적으로 보다 높은 온도에서 유지시키는 것을 필요로하며 광퇴색(photobleaching)을 통해 형광성 신호를 퇴색시킬 수 있는 광에 대한 샘플의 노출을 연장시켰다.
데이타 수집 및 분석에 필요한 시간을 감소시키고, 반응의 특이성을 개선시켜 정밀한 결과를 보증하는, dPCR 응용에서 용융 분석을 수행하기 위한 개선된 방법을 발견하는 것이 바람직할 수 있다.
발명의 요약
일부 구현예에서, 본 개시내용은 반응 혼합물 속에서 표지된 듀플렉스 핵산에서 용융 분석을 수행하는 방법을 제공하며, 표지된 듀플렉스 핵산은 예정된 Tm을 갖고 이러한 방법은: (a) 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제1의 신호를 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm 보다 낮은 제1의 온도에서 측정하는 단계; (b) 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제2의 신호를 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 더 높은 제2의 온도에서 측정하는 단계; 및 (c) 제1의 신호와 제2의 신호를 비교함으로써 표지된 듀플렉스 핵산이 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 표지된 듀플렉스 핵산이 반응 혼합물 속에서 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 나타내며 여기서 신호는 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm에서 측정되지 않는다. 일부 양태에서, 반응 혼합물 속의 표지된 듀플렉스 핵산 위에서 용융 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 표지된 듀플렉스 핵산은 예정된 Tm을 갖고 이러한 방법은 (a) 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제1의 신호를 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 더 낮은 제1의 온도에서 측정하는 단계; (b) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제2의 신호를 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 더 높은 제2의 온도에서 측정하는 단계; 및 (c) 제1의 신호 및 제2의 신호를 비교하여 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 변화가 있는 경우 표지된 듀플렉스 핵산이 반응 혼합물 속의 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 표적-특이적인 프로브는 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화 시 절단되는 절단가능한 프로브이다. 일부 양태에서, 표적-특이적인 프로브는 제1의 온도-의존성 구조 또는 제2의 온도-의존성 구조를 채택할 수 있다. 일부 양태에서, 신호는 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm의 섭씨 2도 내에서 측정되지 않는다. 일부 양태에서, 신호는 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm의 섭씨 5도 이내에서 측정되지 않는다. 일부 양태에서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 크다. 일부 양태에서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이는 섭씨 5도 보다 더 크다. 일부 양태에서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이는 섭씨 8도보다 더 크다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 반응 혼합물 속의 모든 표지된 듀플렉스 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 반응 혼합물은 적어도 2개의 상이한 듀플렉스 핵산을 함유하며, 각각은 독특하고, 예정된 Tm을 갖고, 각각의 상이한 듀플렉스 핵산은 동일한 신호-생성 표지를 가지며, 추가로: e) 독특한, 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 낮은 온도 및 독특한, 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 더 높은 온도에서 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산의 경우, 독특한, 예정된 Tm보다 낮은 온도에서 측정된 신호 및 독특한, 예정된 Tm보다 더 높은 온도에서 측정된 신호에 있어서의 변화는 표지된 듀플렉스 핵산이 이의 표적에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 나타낸다. 일부 양태에서, 신호는 n + 1개 이하의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 혼합물 속의 독특한 표적-특이적인 프로브의 수이다. 일부 양태에서, 단계는 dPCR 반응에서 다수의 구획에서 수행된다. 일부 양태에서, 제1 및 제2의 신호는 제1 및 제2의 신호로부터 제3의 신호를 감함으로써 제3의 신호에 대해 표준화된다. 추가의 양태에서, 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 예정된 역치(threshold)를 초과한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 하이브리드화 조건 하에서, 샘플을, 반응 혼합물에 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한, 표적-특이적인 프로브와 접촉시키는 단계; b) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하여 트렁케이트된(truncated) 프로브를 형성하는 프로브를 절단시키는 단계; c) 트렁케이트된 프로브가 포획 서열(capture sequence)에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계; d) 트렁케이트된 프로브을 연장하여 예정된 Tm 및 신호-생성 표지를 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계; e) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm 이하의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계(이에 의해 용융 분석을 수행함); 및 f) 제1의 신호 및 제2의 신호에 있어서의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 샘플은 적어도 2개의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되며, 각각의 상이한 절단가능한 프로브는 상이한 표적 핵산 서열에 대해 특이적이고, 여기서 이의 특이적인 표적 핵산 서열의 존재하에서, 각각의 상이한 절단가능한 프로브는 독특한, 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성하며, 여기서 독특한, 예정된 Tm 모두를 갖는 듀플렉스 핵산은 동일한 신호-생성 표지를 가지며, 추가로 독특한, 예정된 Tm을 갖는 각각의 듀플렉스 핵산의 경우, 예정된 Tm 이하의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계 및 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 신호는 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 혼합물 속의 상이한 절단가능한 프로브의 수이다. 일부 양태에서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산이 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 2도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 5도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 10도 상이하다. 일부 양태에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 단일분자이다. 다른 국면에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 이분자(bimolecular)이다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 비가 예정된 역치(threshold)를 초과하는 경우 존재하는 것으로 측정된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 예정된 Tm의 섭씨 2도 내의 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 예정된 Tm의 섭씨 5도 내의 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 절단가능한 프로브는 리포터-퀀처(reporter-quencher) 쌍의 제1의 구성원으로 표지되며 적어도 하나의 절단가능한 프로브는 이의 표적 핵산 서열에 하이브리드화되는 경우 제1의 구조를 채택한다.
일부 양태에서, 이의 표적 서열에 대한 적어도 하나의 절단가능한 프로브의 특이적인 하이브리드화는 절단 부위에서 프로브의 절단, 제2의 구조를 채택하기 위한 표적 핵산 서열로부터의 트렁케이트된 프로브의 방출, 및 절단 부위로부터의 가닥(strand) 연장을 야기한다. 일부 양태에서, 가닥 연장은 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 혼입시킴(신호의 변화를 야기함)을 포함한다. 일부 양태에서, 제1의 구조는 선형 구조이고 제2의 구조는 헤어핀(hairpin) 구조이다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 제3의 신호를 반응 혼합물 속의 모든 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단계들은 dPCR 반응내 다수 구획에서 수행된다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획에 거쳐 수행되며, 추가로 절단 전에, 다수의 구획내 절단가능한 프로브의 표지로부터 신호를 측정하는 단계 및 절단 전에 측정된 신호를 사용하여 역치를 설정함으로써 표적 핵산을 함유하지 않는 구획으로부터 표적 핵산을 함유하는 구획을 구별하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획에 거쳐 수행되며, 연장 후 및 용융 분석 전에, 일정한 온도 범위에서 다수의 신호를 측정하고 측정된 신호를 사용하여 용융 분석 동안 측정된 신호에서 광 및 온도-의존성 변화를 교정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 반응 혼합물 속의 표지된 듀플렉스 핵산의 용융 분석을 수행하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제1의 구조로 있는 제1의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제1의 신호를 측정하는 단계; (b) 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제2의 구조로 있는 제2의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제2의 신호를 측정하는 단계로서, 여기서 신호는 제1 및 제2의 온도 중간의 온도에서 측정되지 않고 여기서 듀플렉스 핵산의 약 1/2이 제1의 구조로 있고 듀플렉스 핵산의 1/2은 제2의 구조로 있는 단계; 및 (c) 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 신호 및 제2의 신호를 비교함으로써 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 측정하는 단계로서, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화가 표지된 듀플렉스 핵산이 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 나타내는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 방법은 반응 혼합물 속에서 표지된 듀플렉스 핵산의 용융 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 이러한 방법은 (a) 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 구조로 있는 제1의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제1의 신호를 측정하는 단계; (b) 표지된 듀플렉스 핵산이 제2의 구조로 있는 제2의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제2의 신호를 측정하는 단계로서, 여기서 신호는 제1 및 제2의 온도 중간의 온도에서 측정되지 않는 단계; 및 (c) 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 신호 및 제2의 신호를 비교함으로써 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 측정하는 단계로서, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 표지된 듀플렉스 핵산이 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 나타낸다. 일부 양태에서, 반응 혼합물은 적어도 2개의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산을 포함하고, 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산은 독특한 온도에서 제2의 구조를 채택할 수 있으며, 각각의 상이한 표지된 핵산은 동일한 신호-생성 표지를 갖고, 추가로 각각의 표지된 듀플렉스 핵산의 경우, 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제1의 구조로 있는 온도에서 제1의 신호를 측정하는 단계 및 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제2의 구조로 있는 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계 및 제1의 신호와 제2의 신호를 비교하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 신호는 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 혼합물 속의 상이한 듀플렉스 핵산의 수이다. 일부 양태에서, 제1의 구조는 헤어핀 구조이고 제2의 구조는 선형 구조이다. 일부 양태에서, 표적-특이적인 프로브는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 절단가능한 프로브이다. 일부 양태에서, 이의 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화는 트렁케이트된 프로브를 형성하기 위한 절단가능한 부위에서 프로브의 절단, 헤어핀 프로브를 형성시키기 위한, 표적 핵산 서열로부터의 트렁케이트된 프로브의 방출, 및 절단 부위로부터의 가닥 연장을 포함한다. 일부 양태에서, 가닥 연장은 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 혼입시켜, 신호의 변화를 야기하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 반응 혼합물 속의 모든 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단계는 dPCR 반응내 다수의 구획에서 수행된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 샘플 속에서 적어도 하나의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 샘플을 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 절단가능한 프로브는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 단계; b) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된 프로브를 형성시키는 단계; c) 트렁케이트된 프로브가 헤어핀 프로브를 형성하도록 하는 조건을 제공하는 단계; d) 헤어핀 프로브를 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원으로 표지된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장시키는 단계로서, 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 제1의 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화하여 예정된 Tm을 갖는 헤어핀 프로브를 형성할 수 있는 단계; e) 리포터-퀀처 쌍으로부터 제1의 신호를 예정된 Tm 이하의 온도에서 및 제2의 신호를 예정된 Tm 이상의 온도에서 예정된 Tm에서의 신호를 측정하지 않고 측정하는 단계(이에 의해 용융 분석을 수행하는 단계); 및 f) 제1 및 제2의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 샘플은 각각 상이한 핵산에 대해 특이적이고 이의 각각의 표적 핵산의 존재하에서 독특한 예정된 Tm을 갖는 헤어핀 프로브를 형성할 수 있는 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되며, 여기서 각각의 상이한 헤어핀 프로브는 동일한 리포터-퀀처 쌍을 포함하고, 또한 각각의 상이한 헤어핀 프로브의 경우, 헤어핀 프로브의 예정된 Tm 이하의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계, 및 각각의 상이한 헤어핀 프로브에 대해 제1 및 제2의 신호를 비교하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 샘플은 단일 반응 구획 내에서 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉된다. 일부 양태에서, 신호는 n + 1개 이하의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 구획내 상이한 절단가능한 프로브의 수이다. 일부 양태에서, 상기 상이한 헤어핀 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 2도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 헤어핀 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 5도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 헤어핀 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 10도 상이하다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 비가 예정된 역치를 초과하는 경우 존재하는 것으로 측정된다. 일부 양태에서, 용융 분석은 예정된 Tm의 섭씨 2도 내의 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 일부 양태에서, 용융 분석은 예정된 Tm의 섭씨 5도 내 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 반응 혼합물 속의 모든 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단계는 dPCR 반응내 다수의 구획에서 수행된다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획을 가로질러 수행되며, 절단 전에, 다수의 구획내 절단가능한 프로브의 표지로부터 신호를 측정하는 단계 및 절단 전에 측정된 신호를 사용하여 역치를 설정함으로써 표적 핵산을 함유하지 않는 구획으로부터 표적 핵산을 함유하는 구획을 구별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획을 가로질로 수행되며, 연장 후 및 용융 분석 전에, 일전한 범위의 온도 범위에서 다수의 신호를 측정하는 단계 및 측정된 신호를 사용하여 용융 분석 동안 측정된 신호에서 광 및 온도-의존적 변화에 대해 교정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 샘플 속의 적어도 하나의 표적 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: a) 샘플을 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 절단가능한 프로브가 신호-생성 표지를 포함하는 단계; b) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된 프로브를 형성시키는 단계; c) 트렁케이트된 프로브가 트렁케이트된 프로브에 대해 상보성인 서열을 포함하는 포획 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계; d) 주형으로서 포획 서열을 사용하여 트렁케이트된 프로브를 연장시켜, 예정된 Tm을 갖는 이중 가닥 프로브를 형성시키는 단계; 및 e) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고, 예정된 Tm 이하의 제1의 온도에서 신호-생성 표지로부터 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 제2의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계(이에 의해 용융 분석을 수행함); 및 f) 제1의 온도 및 제2의 온도에서 측정된 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 샘플은 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되며, 각각은 상이한 표적 핵산에 대해 특이적이고 각각은 이의 각각의 표적 핵산의 존재하에서, 독특한 예정된 Tm을 갖는 이중 가닥 프로브를 형성시킬 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 이중 가닥 프로브는 동일한 리포터-퀀처 쌍을 포함하며, 또한, 각각의 상이한 이중 가닥 프로브의 경우, 예정된 Tm 이하의 제1의 온도로부터 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 제2의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계, 및 각각의 상이한 이중 가닥 프로브에 대해 측정된 제1 및 제2의 신호를 비교하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 단일분자이다. 다른 양태에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 이분자이다. 일부 양태에서, 샘플은 단일 반응 구획 내에서 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉된다. 일부 양태에서, 신호는 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 구획내 상이한 절단가능한 프로브의 수이다. 일부 양태에서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 2도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 5도 상이하다. 일부 양태에서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm은 적어도 섭씨 8도 상이하다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 비가 예정된 역치를 초과하는 경우 존재하는 것으로 측정된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 예정된 Tm의 섭씨 2도 내의 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 예정된 Tm의 섭씨 5도 내의 온도에서 신호를 측정하지 않고 수행된다. 추가의 양태에서, 신호-생성 표지는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이고 이중 가닥 프로브는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 포함한다. 절단가능한 프로브가 신호 생성 표지가 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 일부 양태에서, 듀플렉스 핵산은 제1의 비-천연 뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원은 제2의 비-천연 뉴클레오타이드에 부착된다. 특정의 양태에서, 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원은 형광성 실체이고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원은 형광성 실체의 형광성을 퀀칭하는 퀀처이다. 여전히 추가의 양태에서, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 이소-C 및 이소-G 중 하나이다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 반응 혼합물 속의 모든 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단계는 dPCR 반응내 다수의 구획에서 수행된다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획을 가로질러 수행되며, 절단 전에, 다수의 구획내 절단가능한 프로브의 표지로부터 신호를 측정하는 단계 및 절단 전에 측정된 신호를 사용하여 역치를 설정함으로써 표적 핵산을 함유하지 않는 구획으로부터 표적 핵산을 함유하는 구획을 구별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 용융 분석은 dPCR 반응내 다수의 구획을 가로질러 수행되며, 연장 후 및 용융 분석 전에, 일정한 범위의 온도에서 다수의 신호를 측정하는 단계 및 측정된 신호를 사용하여 용융 분석 동안 측정된 신호내 광 및 온도-의존성 변화를 교정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 다수의 표지된 핵산 듀플렉스에서 용융 분석을 수행하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은: (a) 적어도 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산을 제공하는 단계로서, 여기서 각각의 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산은 독특한 예정된 Tm을 가지고, 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한 예정된 Tm은 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 높고, 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm은 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 높고, 여기서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산은 동일한 표지로 표지되는 단계; (b) 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 낮은 제1의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제1의 신호를 검출하는 단계; (c) 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm과 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 사이인 제2의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제2의 신호를 검출하는 단계; (d) 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm과 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 사이인 제3의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제3의 신호를 검출하는 단계; (e) 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 이상인 제4의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제4의 신호를 검출하는 단계; 및 (f) 제1의, 제2의, 제3의, 및 제4의 신호를 비교함으로써, 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산 중 하나 이상이 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과인지를 측정하는 단계로서, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 제1의 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내고, 제2의 신호와 제3의 신호 사이의 변화가, 제2의 표지된 듀플렉스 핵산이 제2의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내며, 제3의 신호와 제4의 신호 사이의 변화가, 제3의 표지된 듀플렉스 핵산이 제3의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 신호는 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm에서 검출되지 않는다. 일부 양태에서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 높고 제2의 온도와 제3의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 높고, 제3의 온도와 제4의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 높다. 일부 양태에서, 이러한 단계는 dPCR 반응내 다수의 구획에서 수행된다. 일부 양태에서, 제1 및 제2의 신호는 제1 및 제2의 신호로부터 제3의 신호를 감함으로써 제3의 신호에 대해 표준화된다. 추가의 양태에서, 방법은 반응 혼합물 속의 모든 듀플렉스 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 포함한다.
여전히 추가의 구현예에서 샘플 속의 표적 핵산의 존재를 측정하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 샘플 및 신호 생성 표적-특이적인 프로브를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 표적-특이적인 프로브가 제1의, 단일 가닥 구조인 경우 제1의 신호를 생성하는 단계; (b) 반응 혼합물 속의 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계; (c) 표적-특이적인 프로브가 존재하는 경우 표적 핵산에 하이브리드화하여 제2의 구조를 채택하는 조건을 제공하는 단계로서, 제2의 구조는 예정된 Tm을 가진 듀플렉스 핵산이고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 생성할 수 있는 단계; (d) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 듀플렉스 핵산으로부터 제2의 신호를 측정하는 단계; 및 (e) 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 특정의 양태에서, 표적 특이적인 프로브는 표적 핵산에 하이브리드화시 절단되어 트렁케이트된 프로브를 형성하는 절단가능한 프로브이고/이거나 트렁케이트된 프로브는 포획 서열에 결합하고 연장되어 듀플렉스 핵산을 형성한다. 일부 양태에서, 제1 및 제2의 신호는 형광성 신호이다. 특정의 양태에서, 제1의 신호는 표적 핵산에 대한 표적-특이적인 프로브의 하이브리드화 전에 검출된다. 일부 양태에서, 제1의 신호는 표적-특이적인 프로브가 제1의 구조로 있는 조건 하에서 절단 및 연장 후 검출된다. 추가의 양태에서, 절단가능한 프로브는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 듀플렉스 핵산은 제1의 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화할 수 있고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원으로 표지된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들면, 일부 경우에, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 이소-C 및 이소-G 중 하나이다. 일부 경우에, 표적-특이적인 프로브는 포획 서열에 대한 결합 전에 형광단으로 표지되고, 여기서 퀀처는 형광단의 퀀칭을 생성하는 위치에서 듀플렉스 핵산 내로 혼입된다. 일부 경우에, 반응 혼합물은 단계 (b) 후에 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용시킨다. 특정의 양태에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 단일분자이며 하이브리드화되어 헤어핀 프로브를 형성한다. 일부 경우에, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 이-분자이다.
여전히 추가의 구현예에서, 샘플 속에서 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 샘플, 반응 혼합물 속의 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 표지된, 절단가능한 표적-특이적인 프로브, 및 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원인 표지를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; (b) 반응 혼합물 속의 표지된 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계; (c) 표지된 절단가능한 표적-특이적인 프로브가 반응 혼합물 속에 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계; (d) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된 프로브를 형성시키는 단계; (e) 트렁케이트된 프로브가 포획 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계; (f) 트렁케이트된 프로브를 연장시켜 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원 및 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계; (g) 예정된 Tm 이하의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및 (h) 예정된 역치를 초과하는 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 단일분자이고 하이브리드화하여 헤어핀 프로브를 형성한다. 특정 경우에, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브는 이-분자이다. 특정의 양태에서, 표적 특이적인 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고 듀플렉스 핵산이 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 서로 염기-쌍화할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 이소C 및 이소G 중 하나 또는 다른 것이다. 특정의 양태에서, 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원은 형광단이고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원은 퀀처이다.
여전히 추가의 구현예에서, 샘플 속의 표적 핵산을 측정하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 샘플 및 신호 생성 표적-특이적인 프로브를 포함하는 반응혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 표적-특이적인 프로브는 제1의, 단일-가닥 구조인 경우 제1의 신호를 생성하는 단계; (b) 반응 혼합물 속의 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계; (c) 반응 혼합물을 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용시키는 단계로서, 여기서 증폭 동안, 표적-특이적인 프로브는 변형되어 예정된 Tm을 갖고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 생성할 수 있는 듀플렉스 핵산을 포함하는 변형된 표적-특이적인 프로브를 형성하는 단계; (d) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및 (e) 예정된 역치를 초과하는 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 표적 특이적인 프로브는 표적 핵산에 대한 하이브리드화 시 절단시킴으로써 변형시켜 포획 서열에 결합하는 트렁케이트된 프로브를 형성하고 연장되어 듀플렉스 핵산을 형성한다. 특정의 양태에서, 제1 및 제2의 신호는 형광성 신호이다. 일부 경우에, 제1의 신호는 표적 핵산에 대한 표적-특이적인 프로브의 하이브리드화 전에 검출된다. 특정의 양태에서, 제1의 신호는 변형된 표적-특이적인 프로브가 단일 가닥의 구조인 조건 하에서 절단 및 연장 후 검출된다. 특정의 양태에서, 표적-특이적인 프로브는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 변형된 표적-특이적인 프로브는 제1의 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화할 수 있고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원으로 표지된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들면, 일부 경우에, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 이소-C 및 이소-G 중 하나이다. 특정의 양태에서, 표적-특이적인 프로브는 포획 서열에 대한 결합 전에 형광단으로 표지되고, 여기서 퀀처는 형광단의 퀀칭을 생성하는 위치에서 연장 동안 듀플렉스 핵산내로 혼입된다.
추가의 구현예에서, 샘플 속의 제1 및 제2의 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브 및 제1 및 제2의 표적 핵산을 잠재적으로 함유하는 샘플을 포함하는 증폭 반응 혼합물을 형성시키는 단계; (b) 반응 혼합물을 구획화하여 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 제1의 및/또는 제2의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계; (c) 미리선택된 온도 T1, T2 및 T3의 구획의 적어도 서브세트(subset)의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제1의, 제2 및 제3의 세트를 획득하고 구획의 서브세트 내 각각의 구획의 경우, 미리선택된 온도 T1에서 제1의 형광성 강도 값, 및 미리선택된 온도 T2에서 제2의 형광성 강도 값 및 미리선택된 온도 T3에서 제3의 형광성 강도 값을 측정하는 단계; (d) 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 제1 및 제2의 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용시키고 이의 표적 핵산의 존재하에서 제1의 신호 생성 프로브의 변형으로 제1의 예정된 Tm을 갖는 제1의 듀플렉스 핵산을 형성시키고, 이의 표적 핵산의 존재하에서 제2의 신호 생성 프로브의 변형으로 제2의 예정된 Tm을 갖는 제2의 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계; (e) 제1의 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T1에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제4의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대한 제4의 강도 값을 계산하는 단계; (f) 제1의 예정된 Tm보다 더 높지만 제2의 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T2에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제5의 세트를 획득하고, 각각의 구획에 대한 제5의 강도 값을 계산하는 단계; (g) 제2의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T3에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제6의 세트를 획득하고, 각각의 구획에 대한 제6의 강도 값을 계산하는 단계; (h) 각각의 구획에 대해, 제4의 강도 값을 제1의 강도 값으로 나누어 T1과 관련된 제7의 강도 값을 수득하는 단계; (i) 각각의 구획에 대해, 제5의 강도 값을 제2의 강도 값으로 나누어 T2와 관련된 제8의 강도 값을 수득하는 단계; (j) 각각의 구획에 대해, 제6의 강도 값을 제3의 강도 값으로 나누어 T3와 관련된 제9의 강도 값을 수득하는 단계; (k) 각각의 구획에 대해, 제8의 강도 값과 제7의 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제1의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계; 및 (l) 각각의 구획에 대해, 제9의 평균 강도 값과 제8의 평균 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제2의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 프로브는 동일한 신호-생성 표지를 갖는다. 특정의 양태에서, 신호 생성 표지는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산은 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 포함한다. 특정의 양태에서, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브는 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산은 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 서로 염기-쌍화될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 비-천연 뉴클레오타이드는 이소-C 또는 이소-G 중 하나이다. 특정의 경우에, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브는 증폭 동안 절단되는 절단가능한 프로브이다. 추가의 양태에서, 제8의 강도 값과 제7의 강도 값 사이의 변화는 예정된 역치를 초과하며, 여기서 제9의 강도 값과 제8의 강도 값 사이의 변화는 예정된 역치를 초과한다.
여전히 추가의 구현예에서, 샘플 속에서 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은: (a) 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브 및 표적 핵산을 함유하는 샘플을 포함하는 증폭 반응 혼합물을 형성시키는 단계; (b) 반응 혼합물을 구획화하여 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계; (c) 미리선택된 온도 T1 및 T2에서 구획의 적어도 하나의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제1 및 제2의 세트를 획득하는 단계, 및 구획의 서브세트내 각각의 구획에 대해, 미리선택된 온도 T1에서 제1의 형광성 강도 값 및 미리선택된 온도 T2에서 제2의 형광성 강도 값을 측정하는 단계; (d) 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 표적 핵산의 증폭 및 이의 표적 핵산의 존재하에서 신호 생성 프로브의 증폭을 위한 조건에 적용시켜 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계; (e) 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T1에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제3의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제3의 강도 값을 계산하는 단계; (f) 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T2에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제4의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제4의 강도 값을 계산하는 단계; (g) 각각의 구획에 대해, 제3의 강도 값을 제1의 강도 값으로 나누어 T1과 관련된 제5의 강도 값을 수득하는 단계; (h) 각각의 구획에 대해, 제4의 강도 값을 제2의 강도 값으로 나누어 T2와 관련된 제6의 강도 값을 수득하는 단계; (i) 각각의 구획에 대해, 제6의 강도 값과 제5의 강도 값 사이의 변화를 검출함으로써 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 표적 핵산은 제1의 표적 핵산이고, 신호 생성 표적-특이적인 프로브는 제1의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브이며 예정된 Tm은 제1의 예정된 Tm이고, 제2의 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법을 추가로 포함하며, 여기서 반응 혼합물은 제2의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브를 추가로 포함하고, 이러한 방법은: (j) 단계 (b)에서, 반응 혼합물을 구획화함으로써 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 제1의 및/또는 제2의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계; (k) 단계 (c)에서, 미리선택된 온도 T3에서 구획의 적어도 하나의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제5의 세트를 획득하는 단계, 및 구획의 서브세트내 각각의 구획에 대해, 미리선택된 온도 T3에서 제7의 형광성 강도 값을 측정하는 단계; (l) 단계 (d)에서 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 표적 핵산의 증폭 및 이의 표적 핵산의 존재하에서 제2의 신호 생성 프로브의 변형을 위한 조건에 적용시켜 제2의 예정된 Tm을 갖는 제2의 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계; (m) 제2의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T3에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제6의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제8의 강도 값을 계산하는 단계; (n) 각각의 구획에 대해, 제8의 강도 값을 제7의 강도 값으로 나누어 T3와 관련된 제9의 강도 값을 수득하는 단계; (o) 각각의 구획에 대해, 제9의 강도 값과 제6의 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제2의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 제6 및 제5의 강도 값 사이의 변화 및 제9의 강도 값과 제6의 강도 값 사이의 변화는 예정된 역치를 초과한다. 특정의 경우에, 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 프로브는 동일한 신호-생성 표지를 갖는다. 추가의 양태에서, 신호 생성 표지는 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이고 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산은 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브는 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산은 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 서로 염기-쌍화할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 비-천연 뉴클레오타이드는 이소-C 또는 이소-G 중 하나이다. 일부 양태에서, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브는 증폭 동안 절단되는 절단가능한 프로브이다.
일부 추가의 양태에서, 선행 방법 중 어느 것도 수행될 수 있으며 여기서 단계는 dPCR 반응에서 다수의 구획을 가로질러 수행되고, 표적 핵산의 존재를 측정하기 전에, 표적-음성 구획으로서 제1 신호화 제2의 신호 사이에 변화가 없는 구획을 확인하고, 표적-음성 구획으로부터 측정된 신호를 사용하여 각각의 구획에서 측정된 제1 및 제2의 신호에 있어서 광 및 온도-의존성 변화에 대해 표준화하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 명시된 구성성분의 측면에서 "필수적으로 유리된"은 규정된 구성성분 중 어느 것도 조성물로 목적을 갖고 제형화되고/되거나 오염물로서 또는 미량으로서만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 조성물의 임의의 의도되지 않은 오염을 생성하는 명시된 구성성분의 총 량은 바람직하게는 0.01% 미만이다. 명시된 구성성분의 양이 표준 분석 방법으로 측정될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은, 하나("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 단어 하나("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 명세서 및 청구범위에서, 본원에 사용된 바와 같은, "다른" 또는 "추가로"는 적어도 2개 이상을 의미할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 고유의 오차 변화를 포함함을 나타내기 위해 사용되며, 이러한 방법은 연구 대상 중에 존재하는 값, 또는 변화를 측정하기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 ?? 영역내에 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당해 분야의 기술자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 나타내면서, 설명 방식으로만 제공됨을 이해하여야 한다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 구체적인 구현예의 상세한 설명과 함께 이러한 도면들 중 하나 이상을 참고로 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: 상대 형광성 단위(RFU) 대 온도(A)를 나타내는 연속 용융 분석 및 용융 온도가 각각 65, 75, 및 85℃인 3개의 표적-특이적인 프로브에 대한 표적을 함유하는 샘플에 대한 온도 (B)와 관련하여 RFU의 음성 유도체의 예시적인 플롯, 연속 용융 분석의 경우, RFU 측정은 0.5 내지 1.0 온도 변화마다 취한다.
도 2: 단일의 표적-특이적인 프로브(A, C)에 대한 표적을 함유하는 샘플 및 본 발명의 방법을 사용하여 도 1(B, D)에 나타낸 3개의 표적-특이적인 프로브에 대한 표적을 함유하는 샘플에 대해 RFU 대 온도(A, B) 및 온도(C,D)와 관련하여 RFU의 음성 유도체를 나타내는 용융 분석 플롯의 예. 형광성 영상은 X로 나타낸 온도에서만 획득하였다.
도 3: dPCR 응용을 위해 36개 구획에서 도 1에 나타낸 3개의 표적-특이적인 프로브에 대한 표적의 무작위 분포의 예. 각각의 구획은 0, 1, 2 또는 3개의 표적을 함유한다.
도 4: 구획내 절단되지 않은, 연장되지 않은 및 독특한 프로브의 수를 나타내는, 상대 밝기와 관련하여, T1(당해 실시예에서 60℃)에서 취한 도 3에 나타낸 시스템의 형광성 영상. 절단가능한 프로브를 사용하는 본 실시예에서, 모든 표적-음성 구획은 절단되지 않고, 연장되지 않은 프로브의 형광성으로 인하여 밝고, 모든 표적-함유 구획은 각각의 구획내 표적의 수에 따라 비교적 더 어둡다.
도 5: 표적 A를 함유하는 구획이 플루오르 및 퀀처의 분리를 야기하는, 표적-A 프로브가 변성된 결과로서 증가된 형광성을 나타내는, T2(70℃)에서 취한 도 3에 나타낸 시스템의 형광성 영상.
도 6: 도 3에 나타낸 시스템에 대한 영상 비교의 예. T2에서 각각의 구획에 대해 게산된 평균 형광성 강도를 T1에서 각각의 구획에 대해 계산된 평균 형광 강도로 나누어 어느 구획이 형광 강도(A)의 변화를 나타내는지를 측정한다. 도 6b는 표적에 대해 음성(1)인 것으로 측정된 구획 및 표적에 대해 양성(>1)으로 측정된 구획에 상응하는 구획의 2개 집단(>1 및 1)을 나타내는 1D 진폭 플롯을 나타낸다.
도 7: 각각의 구획내 표적의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 도 3에 나타낸 시스템에 대해 T1, T2, T3 및 T4에서 취한 영상의 영상 비교의 예(A). 동반하는 1D 진폭 플롯을 생성하기 위한 T2 대 T1, T3 대 T2, 및 T4 대 T3에서 각각의 구획에 대해 계산된 형광성 강도의 비교는 온도의 각각의 세트에 대해 표적에 대해 음성(1)으로 측정된 구획의 집단 및 표적에 대해 양성(>1)인 것으로 측정된 구획의 집단을 생성한다(B).
도 8: 구획-특이적인, 시스템-유도된 변화를 고려하기 위한 영상 표준화의 사용 예. 도 8a 및 8b는 미가공 데이타(raw data) 및 표준화된(95℃에서 취한 영상과 관련하여) 형광성 영상 각각을 나타낸다; 도 8c 및 8d는 상응하는 강도 막대그래프를 나타낸다; 도 8e 및 8f는 상응하는 1D 진폭 플롯을 나타낸다.
도 9: 예비 역치를 확립하기 위한 예비-증폭 영상의 사용 예. 구획된 샘플의 예비-증폭 영상(도 9a); 구획된 샘플의 증폭 후 영상(도 9b); 증폭 전(암 회색 바아) 및 증폭 후(백색 바아) 영상으로부터 평균 소적 강도 막대그래프(도 9c); 평균 소적 강도를 나타내는 증폭 전 및 후 영상(각각 흑색 및 백색)으로부터의 1D 증폭 플롯(도 9d). C 및 D 둘 다에서, 회색 선은 증폭 전 평균 강도의 평균으로부터의 3σ를 나타낸다.
도 10: 프로브의 형광성 강도에 있어서 온도- 및 빛 용량-의존된 변화의 교정 예. 명백한 Tm을 갖는 3개의 표적 및 3개의 프로브를 갖는 구획(상부, 실선 추적) 및 0개의 표적 및 3개의 프로브를 갖는 구획(하부, 사선 추적)으로부터 미가공의, 교정되지 않은 데이타를 사용한 형광성 대 온도의 플롯; 동일한 샘플로부터의 교정된 형광성 대 온도 데이타의 플롯은 도의 하부 1/2에 나타나 있다. 교정은 형광성 광표백 및 형광성에 있어서 온도-의존적 변화를 야기하는 음성 구획에 대해 관찰된 선형 감소(linear decay)로부터 측정된다.
도 11: 싱글플렉스 연속 용융 분석(Singleplex Continuous Melt Analysis). 용융 분석. 좌측: 단일-표적 샘플을 함유하는 dPCR 반응의 구획으로부터 1℃ 간격에서 취한 영상으로부터 취하고 절단가능한 프로브를 사용하여 검출된 형광성 대 온도 플롯; A: 미가공의, 교정되지 않은 데이타; B: 60℃에서 구획당 신호 강도를 나타내는 A에 상응하는 1D 증폭 플롯; C: 시스템-유도된 구획 변동성에 대해 교정하기 위해 95℃에서의 형광성에 대해 표준화된 A에 나타낸 데이타; D: 60℃에서 구획당 신호 강도를 나타내는 C에 상응하는 1D 진폭 플롯; E: 프로브의 광 및 온도-의존적인 형광성 변화에 대해 교정하기 위해 표준화된 C에 나타낸 데이타; F: 60℃에서 구획 당 신호 강도를 나타내는 E에 상응하는 1D 진폭 플롯; G: 각각의 구획에서 표적-특이적인 프로브에 대한 Tm을 나타내는 E에서 나타낸 데이타의 역 유도; H: 표적-특이적인 용융 윈도우(window)를 가로질러 통합된 신호 강도를 나타내는 G에 상응하는 1D 진폭 플롯. 구획당 카피의 예측된 수는 푸아송 통계학(Poisson statistics)을 사용하여 계산하고 μL당 표적의 카피의 수에 대해 외삽법으로 추정한다.
도 12: 싱글플렉스 별개의 용융 분석. A: 온도 T1 및 T2에서 측정된 도 11에 나타낸 샘플의 구획에 대한 형광성 대 온도 플롯; B: T2/T1에서 구획당 형광성 강도의 1D 진폭 플롯; C: 시스템 변동성에 대해 교정하기 위한 표준화 후 C로부터의 데이타의 형광성 대 온도 플롯. 표적 농도는 구획당 평균 카피의 수를 계산함으로써 측정한다.
도 13: 멀티플렉스 연속 용융 분석(Multiplex Continuous Melt Analysis). 좌측 패널: 구별가능한 Tm을 지닌 3개의 표적 및 3개의 프로브를 함유하는 샘플에 대해 1℃ 온도 간격에서 취한 35개 영상으로부터의 형광성 대 온도 플롯. 상부로부터 하부까지: A: 구획당 평균 형광성 대 용융 분석 동안의 온도; C: 시스템-유도된 구획 변동성에 대해 교정하기 위해 표준화된 구획당 평균 형광성; E: 광- 및 온도-의존적인 형광성 감소에 대해 추가로 교정된 C로부터의 구획당 평균 형광성; G: 3개의 구별가능한 프로브 Tm을 나타내는 E의 역 유도 플롯; 우측 패널: B: 95℃ 영상에 대해 표준화시킨 57℃에서 구획당 평균 강도의 1D 진폭 플롯; D, E & F: 각각의 표적-특이적인 용융 윈도우에 대한 유도 간격의 플롯.
도 14: 멀티플렉스 별개의 용융 분석. A: 온도 T1, T2, T3 및 T4에서 측정된 도 13에 나타낸 샘플의 구획에 대한 형광성 대 온도 플롯; B: 95℃에서 구획당 평균 형광성 강도에 대해 표준화된 57℃에서 구획당 평균 형광성 강도; C: 시스템-유도된 구획 변동성에 대해 교정하기 위한 표준화 후 A로부터의 데이타의 형광성 대 온도 플롯; D: 제1의 온도 간격(T2/T1)에 대해 계산된 구획당 형광성 강도의 비; E: 광- 및 온도-의존적인 형광성 감쇄에 대해 교정하기 위한 표준화 후 C로부터의 데이타의 형광성 대 온도 플롯; F: 제2의 온도 간격(T3/T2)에 대해 계산된 구획당 형광성 강도의 비; G: 제3의 온도 간격(T4/T3)에 대해 계산된 구획당 형광성 강도의 비. 다시 구획당 계산된 평균 카피수를 사용하여 특이적인 표적 농도를 측정한다.
도 15: 별개의 용융 분석에 대한 dPCR 작업 흐름도: 각각의 구획에서 다수의 표적-특이적인 프로브를 사용한 dPCR 용융 분석에 대한 작업흐름도의 예.
예시적인 구현예의 설명
I. 본 구현예
본 개시내용은 심지어 증폭된 표적이 유사한 용융 피크를 갖는 경우에도, 신속한 용융 분석을 수행함으로써 샘플 내 표적의 존재 또는 부재를 측정하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 용융 분석은 표적-특이적인 프로브의 Tm 이하 및 표적-특이적인 프로브의 Tm 이상, 그러나, 표적-특이적인 프로브의 Tm이 아닌 별개의 용융 온도에서 수행된다.
II. 정의
본원에 사용된 바와 같은 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA, 및 이의 임의의 화학적 변형을 의미한다. 변형은 추가의 전하, 분극률(polarizability), 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 핵산 리간드 염기 또는 전체로서 핵산 리간드에 대한 굴곡성(fluxionality)을 포함하는 다른 화학 그룹을 제공하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 변형은 2'-위치 당(sugar) 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 푸린 변형, 엑소사이클릭 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환, 골격 변형, 메틸화, 및 비정상적인 염기 쌍 조합, 예를 들면, 이소염기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 핵산은 표준 염기 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U) 뿐만 아니라 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 수소-결합 염기 쌍을 형성하는, 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드는 예를 들면, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호, 제6,037,120호, 및 제6,140,496호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. "비-표준 뉴클레오타이드" 또는 "비-천연 뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드내로 혼입되기 쉽고 수소 결합, 또는 소수성, 엔트로피, 또는 반 데르 바알스 상호작용(van der Waals interaction)에 의해 상보성의 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화하여 염기 쌍을 형성할 수 있는 A, G, C, T, 또는 U 이외의 염기를 의미한다. 이러한 예는 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,037,120호에 기술된 바와 같은 이소-C/이소-G, K/X, K/P, H/J, 및 M/N의 염기 쌍 조합을 포함한다.
이러한 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드 쌍의 수소 결합은 천연 염기의 것과 유사하며 여기서 2 또는 3개의 수소 결합은 쌍을 이룬 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드의 수소 결합 수용체와 수소 결합 공여체 사이에서 형성된다. 천연 염기와 이러한 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드 사이의 차이 중 하나는 수소 결합 수용체와 수소 결합 공여체의 수 및 위치이다. 예를 들면, 사이토신은 상보성 수용체/공여체/공여체 염기인 구아닌과 공여체/수용체/수용체 염기인 것으로 고려될 수 있다. 이소-C는 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,037,120호에 나타낸 바와 같이, 수용체/수용체/공여체 염기이며 이소-G는 상보성 공여체/공여체/수용체 염기이다.
올리고뉴클레오타이드에서 사용하기 위한 다른 비-천연 뉴클레오타이드는, 둘 다 본원에 참고로 포함된, 예를 들면, Ren, et al., 1996 및 McMinn et al., 1999에 논의된 바와 같은, 예를 들면, 나프탈렌, 페난트렌, 및 피렌 유도체를 포함한다. 이러한 염기는 안정화를 위해 수소 결합을 이용하지 않지만, 대신에 소수성 또는 반 데르 바알스 상호작용에 의존하여 염기 쌍을 형성한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플"은 이의 최광의의 의미로 사용된다. 샘플은 체조직 또는 혈액(또는 혈액의 분획, 예를 들면, 혈장 또는 혈청), 림프액, 점액, 눈물, 뇨, 및 타액을 포함하나 이에 한정되지 않는 체액을 포함할 수 있다. 샘플은 세포, 염색체, 세포기관, 또는 바이러스로부터의 추출물을 포함할 수 있다. 샘플은 DNA(예컨대, 게놈성 DNA), RNA(예컨대, mRNA), 및/또는 cDNA를 포함할 수 있으며, 이중 어느 것도 증폭되어 증폭된 핵산을 제공할 수 있다. 샘플은 용액 속의 또는 기질에 결합된(예컨대, 미세배열의 부분으로서) 핵산을 포함할 수 있다. 샘플은 환경적 위치(예컨대, 물줄기, 토양 등) 또는 비생체 접촉 매개물(fomite)(즉, 하나의 숙주로부터 다른 숙주로 병원체를 전달하는 작용을 하는 무생물 대상체)로부터 수득된 물질을 포함할 수 있다.
용어 "핵산의 공급원"은 핵산(RNA 또는 DNA)을 함유하는 임의의 샘플을 지칭한다. 표적 핵산의 특히 바람직한 공급원은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇌척수액, 흉수액, 젖(milk), 림프액, 가래, 및 정액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "검출 한계(limit of detection)"는 검출되고 정량화될 수 있는, 핵산과 같은, 분석물의 최저 수준 또는 양을 지칭한다. 검출 한계는 몰 값(예컨대, 2.0 nM의 검출 한계)로서, 그램 측정된 값(예를 들면, 규정된 반응 조건 하에서, 예컨대, 2.0 마이크로그램의 검출 한계), 카피 수(예컨대, 1 × 105개 카피 수의 검출 한계), 또는 당해 분야에 공지된 다른 표시로 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 핵산 분자와 관련하여 용어 "단리된"은 핵산 분자의 천연 공급원 속에 존재하는 유기체 및 생물학적 물질(예컨대, 혈액, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 대변, 가래, 비인두 흡입물 등)으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산 분자, 예를 들어, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않을 수 있거나, 화학적으로 합성된 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 핵산 분자를 또한 단리하거나 정제할 수 있다. 핵산 단리의 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 전체적인 핵산 단리/정제 방법, RNA-특이적인 단리/정제 방법, 또는 DNA-특이적인 단리/정제 방법을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "미세배열"은 다수의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 다른 화학적 화합물을 기판 상에 정렬시키는 것을 지칭한다. 용어 "성분(element)" 및 "배열 성분"은 미세배열에서 독특하고 정의된 위치를 갖는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 다른 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 올리고뉴클레오타이드는 정의된 간격에서 동일한 단량체로 주로 구성된 골격 상에 염기의 서열을 갖는 분자인 것으로 이해된다. 염기는 골격 위에 이들이 올리고뉴클레오타이드의 서열에 대해 상보성인 염기의 서열을 갖는 핵산과의 결합으로 도입될 수 있는 방식으로 정렬된다. 가장 일반적인 올리고뉴클레오타이드는 당 포스페이트 단위의 골격을 갖는다. 구별은 2' 위치에서 하이드록실 그룹을 갖지 않는 "dNTP"로 이루어지진 올리고데옥시리보뉴클레오타이드와 2' 위치에서 하이드록실 그룹을 갖는 "NTP"로 이루어진 올리고리보뉴클레오타이드 사이에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 유도체를 포함할 수 있으며, 여기서 하이드록실 그룹의 수소는 유기 그룹, 예컨대, 알릴 그룹으로 대체된다.
올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산이다. 본원에 개시된 방법에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 적어도 약 열개(10)의 뉴클레오타이드 및 보다 전형적으로 적어도 약 열다섯(15)개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 개시된 방법을 위한 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 "프라이머(primer)"로서 작용하도록 설계될 수 있다. "프라이머"는 짧은 핵산, 일반적으로 ssDNA 올리고뉴클레오타이드이며, 이는 상보성 염기-쌍화에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드에 어닐링(annealing)된다. 프라이머는 이후에 폴리머라제 효소, 예를 들면, DNA 폴리머라제 효소에 의해 표적 DNA 또는 RNA 주형 가닥을 따라 연장될 수 있다. 프라이머 쌍은 핵산 서열의 증폭(및 확인)(예컨대, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해)에 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 "프로브"로서 작용하도록 설계될 수 있다. "프로브"는 올리고뉴클레오타이드, 이의 상보체, 또는 이의 단편을 지칭하며, 이는 동일하거나, 대립형질이거나 또는 관련된 핵산 서열을 검출하는데 사용된다. 프로브는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대표적인 표지는 형광성 염료, 퀀처(quencher), 방사활성 동위원소, 리간드, 신틸레이션 제제, 화학발광성 제제, 및 효소를 포함한다. 프로브는 또한 주형으로서 표적 핵산 또는 자가-상보성 영역을 사용하여, 폴리머라제에 의해 연장될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 샘플 속에서 표적 핵산 서열에 대해 특이적이 되도록 설계할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산의 "안티센스(antisense)" 핵산 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "안티센스"는 핵산 서열의 "센스"(암호화) 가닥과 염기-쌍화할 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. "안티센스"는 핵산 서열의 "센스"(암호화) 가닥과 염기-쌍화할 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 안티센스 핵산 서열은 표적 핵산 서열에 대하여 "상보성"일 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은, "상보성"은 염기 쌍화에 의해 어닐링하는 2개의 단일 가닥의 핵산 서열 사이의 관계를 기술하고 있다. 예를 들면, 5'-AGT-3' 쌍과 이의 상보체, 3'-TCA-5'. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 다양한 위치에서 미스매치를 포함하도록 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "미스매치"는 표준 왓슨-크릭 염기 쌍(Watson-Crick base pair)을 포함하지 않는 뉴클레오타이드 쌍, 또는 우선적으로 수소 결합을 형성하지 않는 뉴클레오타이드 쌍을 포함하도록 설계될 수 있다. 미스매치는 표적 내에 특수한 염기 또는 염기들에 걸쳐 치환된 천연 뉴클레오타이드 또는 비-천연 또는 비-표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 프로브 또는 프라이머 서열 5'-AGT-3'는 표적 서열 3'-ACA-5'와 단일의 미스매치를 갖는다. 프로브 또는 프라이머의 5' "A"는 표적의 3' "A"와 미스매치된다. 유사하게, 표적 서열 5'-AGA-3'는 프로브 또는 프라이머 서열 3'-(iC)CT-5'와의 단일 미스매치를 갖는다. 여기서 이소-C는 천연의 "T" 대신에 치환된다. 그러나, 서열 3'-(iC)CT-5'는 서열 5'-(iG)GA-3'와 미스매치되지 않는다.
올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드를 변성시키도록 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "변성 올리고뉴클레오타이드"는 상이한 서열의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 집단, 혼주물(pool), 또는 다수를 포함하는 것을 의미하며 여기서 서열 차이는 집단의 각각의 올리고뉴클레오타이드내 규정된 위치에서 발생한다. 다양한 치환은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 임의의 주어진 위치에서 상이한 가능한 뉴클레오타이드의 임의의 수를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 변성 올리고뉴클레오타이드는 대신에 R = iC 또는 iG, 또는 R =A 또는 G 또는 T 또는 C 또는 iC 또는 iG를 포함할 수 이다.
본원에 기술된 바와 같은, 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 상보성 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 이러한 염기는 천연 염기, 예를 들면, A, G, C, T, 및 U 뿐만 아니라, 인공의 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오타이드, 예를 들면, 이소-사이토신 및 이소-구아닌을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은, 올리고뉴클레오타이드의 제1의 서열은 제1의 서열의 연속된 염기(5'-내지-3'로 판독)가 제2의 서열의 연속된 염기(3'-내지-5'로 판독)과 비교하여 염기 쌍화의 왓슨-크릭 규칙을 따르는 경우 올리고뉴클레오타이드의 제2의 서열과 100% 상보성인 것으로 기술된다. 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 인공 염기를 천연 염기 대신에 사용하여 인공 염기가 천연 염기와 유사한 특이적인 상호작용을 나타내도록 할 수 있다.
표적 핵산에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 또한 표적 핵산 서열에 대해 "상동성"인 핵산 서열에 대해 특이적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "상동성"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 사이에 서열 유사성 또는, 상호교환가능한, 서열 동일성을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 서열에 적용된, 용어 "동일성 퍼센트(percent identity)" 및 "동일성 %"는 표준화된 일고리즘(예컨대, BLAST)을 사용하여 정렬된 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 잔기 매치의 퍼센트를 지칭한다.
표적 핵산에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 적합한 조건 하에서 표적 핵산에 "하이브리드화"할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, "하이브리드화" 또는 "하이브리드하는"은 이에 의해 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥이 규정된 하이브리드화 조건 하에서 염기 쌍화를 통해 상보성 가닥과 어닐링하는 공정을 지칭한다. "특이적인 하이브리드화"는 2개의 핵산 서열이 고도의 상보성을 공유한다는 표시이다. 특이적인 하이브리드화 복합체는 허용되는 어닐링 조건 하에서 형성되며 임의의 후속적인 세척 단계 후 하이브리드화되어 남는다. 핵산 서열의 어닐링을 위해 허용되는 조건은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일정하게 측정가능하며 예를 들면, 약 6×SSC의 존재하에서 65℃에서 발생할 수 있다. 하이브리드화의 스트링전시(stringency)는 부분적으로는 세척 단계가 수행되는 온도를 참고로 하여 발현될 수 있다. 이러한 온도는 전형적으로 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적인 서열에 대해 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 내지 20℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전하게 매치하는 프로브에 하이브리드화하는 온도(규정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. Tm을 계산하는 방정식, 예를 들면, 최단 이웃(nearest-neighbor) 매개변수 및 핵산 하이브리드화 조건은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "표적" 또는 "표적 핵산"은 올리고뉴클레오타이드와 적어도 부분적인 상보성을 갖는 서열을 함유하는 핵산 분자, 예를 들면, 프로브 또는 프라이머를 지칭한다. "표적" 서열은 유전자 또는 게놈의 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 임의의 단편 및 천연적으로 발생하거나 합성인 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 또한 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭하며, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 나타낼 수 있다. DNA 서열과 관련하여 "RNA 등가물"은 질소성 염기 티민의 모든 발생이 우라실로 대체되는 것을 제외하고는, 참고 DNA 서열로서 뉴클레오타이드의 동일한 선형 서열로 구성되며, 당 골격은 데옥시리보스 대신에 리보스로 구성된다. RNA는 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있고/있거나 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 역 전사에 의해 cDNA로 전환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "증폭" 또는 "증폭하는"은 핵산 서열의 추가의 카피의 생산을 지칭한다. 증폭은 당해 분야에 공지된 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 다른 증폭 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 용어 "증폭 반응 시스템"은 핵산의 표적 서열의 적어도 제1의 상보성 카피를 생산하는 임의의 시험관내(in vitro) 수단을 지칭한다. 일부 양태에서, 증폭은 핵산의 표적 서열의 다수의 카피를 생산한다. 용어 "증폭 반응 혼합물"은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용된 다양한 시약을 포함하는 수용액을 지칭한다. 이들은 효소(예컨대, 열안전성 폴리머라제), 수성 완충액, 염, 증폭 프라이머, 표적 핵산, 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 및 임의로, 적어도 하나의 표지된 프로브 및/또는 임의로 증폭된 표적 핵산의 용융 온도를 측정하기 위한 적어도 하나의 제제(예컨대, 이중-가닥 핵산의 존재하에서 형광성의 변화를 나타내는 형광성 인터컬레이팅 제제(intercalating agent))를 포함할 수 있다.
핵산의 증폭은 핵산 또는 이러한 핵산의 소영역의 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들면, 증폭은 적절한 프라이머 서열을 선택하고 PCR을 사용함으로써 30 내지 50, 50 내지 100, 또는 100 내지 300개 염기의 핵산의 부위를 증폭시킴을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 증폭은 등온 증폭 기술(즉, 열 순환의 필요없이)을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 등온 핵산 증폭, 예를 들면, 루프 매개된 등온 증폭(LAMP)을 위한 방법이 미국 특허 제6,410,278호, 및 미국 특허 공보 제20080182312호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 본원에서 이의 전문이 참고로 포함된다.
증폭 혼합물은 천연 뉴클레오타이드(A, C, G, T, 및 U 포함) 및 비-천연 또는 비-표준 뉴클레오타이드(예컨대, iC 및 iG 포함)를 포함할 수 있다. DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합에 의해 커플링된, 데옥시리보스 또는 리보스를 각각 포함한다. 각각의 데옥시리보스 또는 리보스는 당에 커플링된 염기를 포함한다. 천연적으로 발생하는 DNA 및 RNA 속에 혼입된 염기는 아데노신(A), 구아노신(G), 티미딘(T), 사이토신(C), 및 우리딘(U)이다. 이러한 5개의 염기는 "천연 염기"이다. 왓슨 및 크릭에 의해 상술된 염기 쌍화의 규칙에 따라서, 천연 염기는 하이브리드화되어 푸린-피리미딘 염기 쌍을 형성하며, 여기서 G는 C와 쌍을 이루고 A는 T 또는 U와 쌍을 이룬다. 이러한 쌍화 규칙은 상보성 올리고뉴클레오타이드를 지닌 올리고뉴클레오타이드의 특이적인 하이브리드화를 촉진한다.
천연 염기에 의한 염기 쌍의 형성은 각각의 염기 쌍의 2개의 염기 사이의 2 또는 3개의 수소 결합의 생성으로 촉진된다. 각각의 염기는 2 또는 3개의 수소 결합 공여체(들) 및 수소 결합 수용체(들)를 포함한다. 염기 쌍의 수소 결합은 하나의 염기 상의 적어도 하나의 수소 결합 공여체와 다른 염기 상의 수소 결합 수용체의 상호작용에 의해 각각 형성된다. 수소 결합 공여체는, 예를 들면, 적어도 하나의 부착된 수소를 갖는 전자의 헤테로원자(예컨대, 산소 또는 질소)를 포함한다. 수소 결합 수용체는, 예를 들면, 단일 쌍의 전자를 갖는 헤테로원자(예컨대, 산소 또는 질소)를 포함한다.
본원에 사용된 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드는 비-수소 결합 부위에서의 치환에 의해 유도체화되어 변형된 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 예를 들면, 천연 뉴클레오타이드는 반응성 작용 그룹(예를 들면, 티올, 하이드라진, 알코올, 아민 등)을 뉴클레오타이드의 비-수소 결합 원자에 커플링시킴에 의해 지지체에 대한 부착용으로 유도체화시킬 수 있다. 다른 가능한 치환체는 예를 들면, 바이오틴, 디곡시게닌, 형광성 그룹, 알킬 그룹(예컨대, 메틸 또는 에틸) 등을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 따른 비-천연 뉴클레오타이드의 용도는 샘플 속에 존재하는 핵산 서열의 검출 및 정량화를 능가하여 확장될 수 있다. 예를 들면, 비-천연 뉴클레오타이드는 핵산과 관련된 반응을 촉매하는 많은 효소에 의해 인식될 수 있다. 폴리머라제는 올리고뉴클레오타이드 쇄를 지속적으로 중합시키고 연장시키기 위한 상보성 뉴클레오타이드를 필요로 하지만, 다른 효소는 상보성 뉴클레오타이드를 필요로 하지 않는다. 비-천연 뉴클레오타이드가 주형 속에 존재하고 이의 상보성 비-천연 뉴클레오타이드가 반응 혼합물 속에 존재하지 않는 경우, 연장 프라이머를 비-천연 뉴클레오타이드를 지나 연장시키려고 시도할 때 폴리머라제는 전형적으로 지연될 것이다(또는, 일부 경우에, 충분한 시간이 주어진 경우 염기를 잘못 혼입할 것이다). 그러나, 핵산과 관련된 반응을 촉매하는 다른 효소, 예를 들면, 리가제, 키나제, 뉴클레아제, 폴리머라제, 토포이소머라제, 헬리카제 등은 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 반응을 촉매할 수 있다. 비-천연 뉴클레오타이드의 이러한 특성은 현재 개시된 방법 및 키트의 장점을 취할 수 있으며, 이의 영역 내에 있다.
비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 본원에 개시된 뉴클레오타이드는 표지(예컨대, 퀀처 또는 형광단)에 커플링될 수 있다. 커플링은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 방법의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표지된다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 검출가능한 신호(예컨대, 형광단)을 방출하는 리포터로 표지될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 A, C, G, T, 또는 U가 아닌 염기(예컨대, iC 또는 iG)를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드가 PCR용 프라이머로서 사용되는 경우, 증폭 혼합물은 퀀처(예컨대, Dabcyl)로 표지된 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 비-천연 또는 비-표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표지된 뉴클레오타이드는 A, C, G, T, 또는 U가 아닌 염기(예컨대, iC 또는 iG)를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀과 같은 분자내 구조를 형성하지 않도록 설계될 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀과 같은 분자내 구조를 형성하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 하이브리드화한 후 및 임의로, 표적 핵산이 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭되는 경우 변경된 헤어핀 구조를 형성하도록 설계될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열에 대한 하이브리드화 시 절단되고 절단 후 분자내 구조를 채택하도록 설계될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 프라이머로서 증폭된 생성물 내에 혼입되는 경우 퀀칭을 나타내는 형광단으로 표지될 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 프라이머로서(예컨대, 고유하게, 또는 형광성 유도 또는 형광성 탈퀀칭에 의해) 증폭된 생성물내에 혼입된 후 검출가능한 신호를 방출할 수 있다. 이러한 프라이머는 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, LightCycler 프라이머, AmplifluorTM 프라이머, ScorpionTM 프라이머, 및 LuxTM 프라이머). 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 형광단은 이중-가닥 핵산내에서 삽입되는 경우 신호를 방출할 수 있다. 따라서, 형광단은 올리고뉴클레오타이드가 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용된 후 신호를 방출할 수 있다.
개시된 방법에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 샘플 내에서 적어도 하나의 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머로서 및 샘플 속에서 적어도 하나의 핵산을 검출하기 위한 프로브로서 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는적어도 하나의 형광성 염료로 표지되며, 이는 검출가능한 신호를 생산할 수 있다. 형광성 염료는 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 위한 형광성 공여체로서 작용할 수 있다. 검출가능한 신호는 올리고뉴클레오타이드가 사용되어 표적 핵산을 증폭시키는 경우 퀀칭될 수 있다. 예를 들면, 증폭 혼합물은 형광단에 의해 방출된 검출가능한 신호를 위해 퀀처로 표지된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 임의로, 올리고뉴클레오타이드는 제2의 형광성 염료 또는 형광성 수용체(예컨대, FRET의 경우)로서 작용할 수 있는 퀀처 염료로 표지될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드가 제1의 형광성 염료 및 제2의 형광성 염료로 표지되는 경우, 신호는 제1의 형광성 염료, 제2의 형광성 염료, 또는 둘 다로부터 검출될 수 있다. 신호는 온도의 구배에서 검출될 수 있다(예컨대, 듀플렉스 핵산, 예를 들면, 앰플리콘에 대한 용융 프로파일을 검출하기 위하여, 프로브를 포함하는 복합체는 표적 핵산, 헤어핀 프로브, 또는 T 프로브 복합체에 하이브리화한다). 대안적으로, 신호를 선택된 온도에서 검출하여 듀플렉스 핵산에 대한 용융 프로파일을 측정할 수 있다.
개시된 방법은 임의의 적합한 수의 올리고뉴클레오타이드로 수행할 수 있다. 다수의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우(예컨대, 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드), 상이한 올리고뉴클레오타이드는 규별가능하고 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 상이한 형광성 염료로 표지될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 2개의 상이한 형광성 염료 중 적어도 하나로 표지된다. 추가의 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 3개의 상이한 형광성 염료 중 적어도 하나로 표지된다.
일부 구현예에서, 각각의 상이한 형광성 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 상이한 형광성 염료 중 임의의 다른 것에 의해 방출된 신호로부터 구별될 수 있는 신호를 방출한다. 예를 들면, 상이한 형광성 염료는 이들 모두 서로로부터 적어도 약 5 nm(바람직하게는 적어도 약 10 nm)까지 상이한 최대 파장 방출을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 형광성 염료는 상이한 파장 에너지로 여기된다. 예를 들면, 상이한 형광성 염료는 이들 모두 서로 적어도 약 5 nm(바람직하게는 적어도 약 10 nm)까지 상이한 최대 파장 흡수를 가질 수 있다.
형광성 염료를 사용하여 방법에서 핵산의 용융 프로파일을 측정하는 경우, 형광성 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 상이한 형광성 염료 중의 임의의 다른 것에 의해 방출된 신호와는 구별될 수 있는 신호를 방출할 수 있다. 예를 들면, 핵산의 용융 프로파일을 측정하기 위한 형광성 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 임의의 다른 형광성 염료의 최대 파장 방출과는 적어도 약 5 nm(바람직하게는 적어또 약 10 nm)까지 상이한 최대 파장 방출을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산의 용융 프로파일을 측정하기 위한 형광성 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 상이한 형광성 염료 중 임의의 다른 것보다 상이판 파장 에너지에 의해 여기될 수 있다. 예를 들면, 핵산의 용융 프로파일을 측정하기 위한 형광성 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용된 임의의 형광성 염료의 최대 파장 흡수와는 적어도 약 5 nm(바람직하게는 적어도 약 10 nm)까지 상이한 최대 파장 흡수를 가질 수 있다.
이러한 방법은 샘플(예컨대, 표적 핵산에 하이브리드화된 프로브 또는 자가-상보성 영역에 하이브리드화된 프로브 또는 상보성 포획 서열에 하이브리드화된 프로브를 포함하는 앰플리콘 또는 듀플렉스 핵산) 내에 적어도 하나의 핵산의 용융 프로파일을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 핵산을 확인하는데 사용될 수 있다. 용융 프로파일을 측정하는 단계는 앰플리콘 또는 듀플렉스 핵산을 온도 구배에 노출시키는 단계 및 온도 구배 전체에서 형광단으로부터의 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 용융 프로파일을 측정하는 단계는 앰플리콘 또는 듀플렉스 핵산을 선택된 별개의 온도에 노출시키는 단계 및 선택된 별개의 온도에서만 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 이러한 방법의 올리고뉴클레오타이드는 제1의 형광성 염료로 표지되며, 검출된 핵산의 용융 프로파일을 측정하는 단계는 제1의 형광성 염료와는 상이한 제2의 형광성 염료로부터의 신호를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출된 핵산의 용융 프로파일을 측정하기 위한 제2의 형광성 염료는 인터컬레이팅 제제이다. 적합한 인터컬레이팅 제제는 SYBRTM Green 1 염료, SYBR 염료, Pico Green, SYTO 염료, SYTOX 염료, 에티디움 브로마이드, 에티디움 단독이량체-1, 에티디움 단독이량체-2, 에티디움 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티디움-아크리딘 이종이량체, 에티디움 모노아지드, 프로피디움 요오다이드, 시아닌 단량체, 7-아미노악티노마이신 D, YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3, TOTO-3, POPO-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, JOJO-1, 시아닌 이량체, YO-PRO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, PO-PRO-1, BO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-3, LO-PRO-1, JO-PRO-1, 및 이의 혼합물을 포함한다. 적합한 구현예에서, 선택된 인터컬레이팅 제제는 SYBRTM Green 1 염료이다.
개시된 방법에서, 각각의 증폭된 표적 핵산, 리포터 프로브-주형 쌍 또는 하이브리드화된 프로브는 상이한 용융 온도 또는 상이한 용융 프로파일을 가질 수 있다. 예를 들면, 각각의 증폭된 표적 핵산, 리포터 프로브-주형 쌍 또는 하이브리드화된 프로브는 임의의 다른 증폭된 표적 핵산, 리포터 프로브-주형 쌍 또는 하이브리드화된 프로브 중 어느 하나의 용융 온도로부터 1 내지 10℃, 예를 들면, 적어도 약 1℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 2℃ 또는 4℃, 또는 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 5℃ 까지 상이한 용융 온도를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "표지" 또는 "리포터 분자"는 핵산을 표지하는데 ;유용한 화학적 또는 생화학적 모이어티이다. "표지" 및 "리포터 분자"는 형광성 제제, 화학발광성 제제, 색원체성 제제, 퀀칭 제제, 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 신틸레이션 제제, 억제제, 자기 입자, 및 당해 분야에 공지된 다른 모이어티를 포함한다. "표지" 또는 "리포터 분자"는 측정가능한 신호를 생성할 수 있고 올리고뉴클레오타이드에 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 결합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "형광성 염료" 또는 "형광단"은 광에 의해 여기되어 형광을 방출할 수 있는 화학 그룹이다. 일부 적합한 형광단은 광에 의해 여기되어 인광을 방출할 수 있다. 염료은 형광성 공여체 염료로부터 형광성 신호를 퀀칭할 수 있는 수용체 염료를 포함할 수 있다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 염료는 형광단, 예를 들면, 적색 형광성 스쿠아린 염료, 예를 들면, 2,4-비스[1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴메틸]사이클로부텐디일리움-1,3-디옥살레이트, 적외선 염료, 예를 들면, 2,4 비스[3,3-디메틸-2-(1H-벤즈[e]인돌리닐리덴메틸)]사이클로부텐디일리늄-1, -3-디옥살레이트, 또는 오렌지 형광성 스쿠아린 염료, 예를 들면, 2,4-비스[3,5-디메틸-2-피롤릴]사이클로부텐디일리움-1,3-디옥솔레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 형광단의 추가의 비-제한적 예는 양자점, Alexa FluorTM 염료, AMCA, BODIPYTM 630/650, BODIPYTM 650/665, BODIPYTM-FL, BODIPYTM-R6G, BODIPYTM-TMR, BODIPYTM-TRX, Cascade BlueTM, CyDyeTM, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 Cy2TM, Cy3TM, 및 Cy5TM, DNA 인터컬레이팅 염료, 6-FAMTM, 플루오레세인, HEXTM, 6-JOE, Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500, Oregon GreenTM 514, Pacific BlueTM, REG, 피코빌리단백질, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 피코에리트린 및 알로피코시아닌, Rhodamine GreenTM, Rhodamine RedTM, ROXTM, TAMRATM, TETTM, 테트라메틸로다민, 또는 Texas RedTM을 포함한다.
형광성 염료 또는 형광단은 변형되어 다른 반응성 분자에 대한 접합을 촉진시키는 유도체를 포함할 수 있다. 따라서, 형광성 염료 또는 형광단은 아민-반응성 유도체, 예를 들면, 형광단의 이소티오시아네이트 유도체 및/또는 석신이미딜 에스테르 유도체를 포함할 수 있다.
개시된 방법의 올리고뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드는 퀀처로 표지될 수 있다. 퀀칭은 다이나믹 퀀칭(dynamic quenching)(예컨대, FRET에 의한), 정적 퀀칭(static quenching), 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 적합한 퀀처는 Dabcyl을 포함할 수 있다. 적합한 퀀처는 또한 다크 퀀처(Dark quencher)를 포함할 수 있으며, 이는 상표명 "BHQ" 하에 시판되는 블랙 홀 퀀처(예컨대, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, 및 BHQ-3, Biosearch Technologies, 캘리포니아주 노바토(Novato) 소재)를 포함할 수 있다. 다크 퀀처는 또한 상표명 "QXLTM"(Anaspec, 캘리포니아주 산 호세(San Jose) 소재) 하에 시판되는 퀀처를 포함할 수 있다. 다크 퀀처는 또한 2,4-디니트로페닐 그룹을 포함하는 DNP-형 비-형광단을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 구획화된 반응에서 사용될 수 있다. 반응을 구획화하는 한가지 접근법은 소적(droplet)을 사용하는 것이며, 이는 제2의 유액 또는 제2의 유액과 하나 이상의 표면에 의해 완전히 둘러싸인 제1의 유액의 단리된 용적이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2의 유액은 2개의 비혼화성 액체이다. 본원에 개시된 다양한 구현예는 비-수성의 연속 상으로 다수의 수성 소적을 포함하는 유중수 유액을 사용한다. 수성 소적 모두 또는 서브세트는 목적한 분석물을 함유할 수 있다. 유액은 흔히 하나 이상의 계면활성제의 존재하에서, 2개의 비혼화성 상(예컨대, 물 및 오일)을 조합합으로써 형성된다. 유액의 기본 유형은 수중유(oil-in-water)(o/w), 유중수(water-in-oil)(w/o), 및 이중-연속성(bi-continuous)이다. 소적-기반 생물학적 검정에서, 유액은 전형적으로 수성 상으로 함유된 검정 시약(예컨대, PCR 프라이머, 염, 효소 등)과의 유중수 유액일 것이다. "오일" 상은 단일 오일 또는 상이한 오일의 혼합물일 수 있다. 임의의 적합한 비-수성 유액은 본원에 기시된 유액의 비-수성의 연속 상을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-수성 연속 상은 광 오일, 실리콘 오일, 또는 불소화된 오일(예컨대, Fluorinert® FC-40 [Sigma-Aldrich])을 포함한다.
소적은 다양한 기술을 사용하여 영상화할 수 있다. 영상화를 촉진하기 위해, 소적을 함유하는 조성물을 표면 위에 분산시켜 소적이 실질적으로 표면 상에 단층으로 배치되도록 할 수 있다. 영상화 표면은, 예를 들면, 슬라이드 위 또는 챔버, 예를 들면, 유리 또는 석영 챔버 속에 존재할 수 있다. 소적 뿐만 아니라 소적 내 표지된 분석물 또는 반응 생성물(예컨대, 헤어핀 프로브)을 영상화 시스템을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 검출은 영상화 형광성 파장 및/또는 표지된 헤어핀 프로브로부터 방출된 형광성 강도를 포함할 수 있다. 소적이 또한 암호화된 입자, 예를 들면, 암호화된 미세구를 함유하는 구현예에서, 영상화는 암호화된 입자의 제1의 해독 영상(decoding image)을 취하는 단계 및 제2의 검정 영상을 취하여 소적 내 프로브를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 해독 영상 및 검정 영상의 비교는 형광단의 조합을 사용함으로써 보다 큰 멀티플렉스 능력(multiplex capability)을 허용한다. 본 발명의 방법은 또한 직접 또는 간접적으로 표지된 증폭 생성물로부터의 신호를 샘플 속의 DNA 또는 RNA의 농도로 상관시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용하도록 채택될 수 있는 영상 시스템의 예는 미국 특허 제8,296,088호 및 미국 특허 공보 제2012/0288897호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 또한, 암호화된 미세구의 사용은 소적 트래킹을 보조할 수 있다. 무작위적으로 분포되고, 충분한 농도로 포함된 독특하게 암호화된 미세구는 인접한 소적과 관련하여 명백한 특징을 각각의 소적에게 제공한다. 소적을 트래킹하는데 유용할 수 있는 이러한 특징은 임의의 이동이 PCR 증폭 또는 후-증폭 용융 분석 동안 발생하도록 할 수 있다. 당해 검정에서 독특한 미세구 코드의 수 및 미세구의 총 수를 최적화하여 구획 특징의 최소의 반복을 보증할 수 있다.
대안적으로, 소적 대신에, 칸막이(compartment) 또는 구획이 예를 들면, 규소, 금속 또는 유리의 조절된 에칭(etching)을 통해서 또는 통상의 또는 미세 사출 성형 기술을 통해 평편한 표면 위에 정적 배열로 형성될 수 있다. 정적 배열 또는 반응 챔버를 형성시키는 수개의 상이한 방식은 예를 들면, 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제9,039,993호, 제PCT/US2003/041356호, 제US6391559호, 제EP2906348호, 제US9643178호 및 Du. Et al. 2009 "SlipChip". Lab on a Chip 9 (16):2286에 기술되어 있다. 임의로, 구획은 매우 근접하게 패킹되어 전체 표면적을 감소시키거나 미세유동성 채널에 의해 연결되어 구획 충전을 개선시킬 수 있다. 후자의 구현예에서, 미국 특허 제9,163,277호에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 충전 후 구획의 완전한 분리를 보증할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)은 구획 내에서 수행될 수 있는 반응의 예이다. 특히, 구획은 디지탈 PCR(dPCR) 기술에 유용하다. dPCR은 샘플을 구획화함으로써 샘플 속에 함유된 개개의 핵산 분자가 많은 별도의 영역, 예를 들면 미세웰 플레이트 속의 개개 웰 또는 미세구획으로, 유액의 분산된 상으로, 또는 핵산 결합 표면의 배열로 국재화된다. 이상적으로, 각각의 구획은 표적 핵산의 0 또는 1개의 카피를 함유하여, 음성 또는 양성 반응 각각을 제공할 것이다. 통상의 PCR과는 달리, dPCR은 샘플 속의 표적 핵산의 초기 양을 측정하기 위한 증폭 주기의 수에 의존적이 아니다. 따라서, dPCR은 표적 핵산을 정량화하기 위한 지수 데이타의 신뢰성을 제거하며 절대적인 정량화를 제공한다. 유액 속의 비드 상에서 핵산을 클론적으로 증폭시키는, 비드 유액 PCR은 dPCR 기술의 하나의 예이며, 여기서 반응물은 소적으로 분배된다. 예컨대, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,048,627호 및 제7,842,457호를 참고한다. dPCR을 유액 속에서 수행하는 경우, 유액은 열 안정성이어서 열 사이클링 조건을 견디도록 하여야 한다.
유액 속에서 또는 정적 배열 위에서 dPCR을 수행하는 다양한 방식이 존재한다. 하나의 경우에, DNA 샘플은 적절한 농도로 희석되어, PCR 시약(프라이머, dNTP 등)과 혼합되고 다수의 별개의 반응 샘플내로 상응하게 구획화된다. 구획은 PCR 열 사이클링 및 상기 기술된 바와 같이 형광(또는 다른 적합한 리포터) 영상화에 의해 검출된 앰플리콘에 적용된다. 본 절단가능한 프로브 구현예의 맥락에서, 앰플리콘은 프로브의 형광성(또는 다른 적합한 리포터)의 변화에 의해 검출된다.
구획의 열 사이클링은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 기술로 수행될 수 있다. 예를 들면, 구획은 가열 및 냉각될 수 있는 튜브 또는 챔버 속에서 열 사이클링될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 연속-유동 증폭을 사용하여 핵산 주형을 증폭시킨다. 연속 유동 증폭의 다양한 방법은 보고되어 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제7,927,797호는 연속 유동 PCR과 함께 사용된 유중수 유액을 기술하고 있다. 대안적으로, 소적은 2D 배열로 정렬되고 정적 배열 기반 디지탈 PCR에서 열 순환에 사용된 방법에서와 같이 평평한 블랙 열 사이클러(flat block thermal cycler)를 사용하여 열 사이클링될 수 있다. 등온 반응(예컨대, 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification), 전체 게놈 증폭, NASBA, 또는 가닥 대체 증폭(strand displacement amplification))을 또한 소적 또는 정적 배열 구획에서 수행할 수 있다. 시스템을 또한 사용하여 소적 또는 정적 배열 구획으로 수행할 수 있다. 시스템을 또한 사용하여 온도를 증가시키거나 감소시켜 구획내에 프로브의 용융 프로파일을 수득하면서 소적 또는 구획을 모니터링할 수 있으며, 이는 멀티플렉스된 검출 및 정량화를 허용한다. 프로브 자체를 소적 또는 구획 내에서 사용하여 신호를 등온적으로 증폭시킴으로써 다른 형태의 증폭, 예를 들면, PCR 또는 다른 등온 증폭 반응이 소적 또는 정적 배열 구획 내에서 표적의 낮은 카피 수를 검출할 필요가 없도록 한다.
III 정량화를 위한 별개의 용융 방법
용융 곡선(해리 곡선)은 반응물의 온도가 상승하면서 이중 가닥 DNA가 해리되거나 단일-가닥 DNA로 "용융"되는 경우, 형광성의 변화를 기록한다. 예를 들면, 이중-가닥 DNA는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 서서히 가열시키는 경우, 형광성의 급작스러운 감소는 융점(Tm)이 도달하고 염료가 듀플렉스로부터 해리되면서 검출된다. 핵산의 Tm은 다른 인자들 중에서, 길이, GC 함량, 및 염기 미스매치의 존재에 의해 영향받으므로, 상이한 듀플렉스 핵산은 이들의 상이한 용융 특성에 의해 구별될 수 있다. 후-증폭 용융 곡선 분석을 또한 사용하여 표적-유래된 앰플리콘으로부터 프라이머-이량체 인공물 및 비-표적 핵산을 구별함으로써 반응 특이성을 보증할 수 있다. 더욱이, 반응 생성물의 특성화, 예컨대, 용융 곡선 분석을 통한 프라이머-이량체 대 앰플리콘은 시간-소모성 겔 전기영동을 위한 필요성을 감소시킨다. 실시간 PCR 검정의 특이성은 사용된 프라이머 및 반응 조건에 의해 측정된다. 그러나, 심지어 잘 설계된 프라이머가 프라이머-이량체를 형성시키거나 비특이적인 생성물을 증폭시킬 수 있는 가능성이 항상 존재한다. RNA 샘플이 게놈성 DNA를 함유하는 qRT-PCR을 수행하는 경우의 가능성이 또한 존재하며, 이는 또한 증폭될 수 있다. qPCR 또는 qRT-PCR 반응 생성물의 특이성은 용융 곡선 분석을 사용하여 수행할 수 있다.
고-해상도 용융 곡선(HRM) 분석은 단일 뉴클레오타이드 차이, 예컨대, SNP, 신규 돌연변이, 및 메틸화 패턴을 확인하기 위한 균질한, 후-증폭 방법이다. HRM 분석은 전통적인 용융 곡선 프로파일링에 비해 보다 민감한 접근법이며, 여기서 이중 가닥 DNA는 이것이 단일-가닥 DNA로 해리되는 온도(Tm)에 대해 모니터링된다. HRM에서, 증폭 반응은 작은, 증분 온도 증가(전형적으로 분당 0.1 내지 0.5℃)에 적용되지만 형광성은 연속적으로 모니터링된다. 이중-가닥 핵산에 결합하는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서, 형광성은 온도가 듀플렉스 Tm에 도달할 때까지 서서히 감소하며, Tm에서, 형광성의 급격한 감소가 이중 가닥 DNA로부터 단일 가닥 DNA로의 샘플 전이로서 관찰된다. Tm은 다른 것들 중에서도 뉴클레오타이드 서열 및 듀플렉스내 미스매치된 뉴클레오타이드에 의존적이므로, 돌연변이는 HRM 분석에서 Tm에서의 이동으로서 또는 용융 곡선의 유형의 변화로서 검출될 수 있다. 전통적인 용융 곡선 분석과는 대조적으로, HRM은 앰플리콘 사이에 단일-뉴클레오타이드 구별을 제공할 수 있다.
많은 온도 간격 - 2℃ 간격 이하, 예를 들면, 1℃, 0.5℃, 0.3℃, 0.2℃, 또는 심지어 0.1℃ 간격에서 형광성을 측정함으로써, 형광성 강도의 변화율(즉, 온도와 관련하여 형광성 강도의 유도체)를 트래킹(tracking)하고 유의적인 용융 활성이 일어나는 온도 또는 온도들(Tm)을 측정할 수 있다. 온도와 관련하여 상대 형광성 단위(RFU)의 유도체의 플롯에 있어서의 피크는 표적 듀플렉스의 용융 온도(Tm)에 상응한다. 예를 들면, 도 1a 및 1b는 각각 65℃, 75℃ 및 85℃의 용융 온도를 지닌 3개의 표적 프로브를 함유하는 샘플 속에서 온도가 증가하면서 형광성의 연속적인 모니터링으로부터 온도와 관련하여 RFU 대 온도 및 음성 유도체의 플롯을 나타낸다. 특수한 프로브 또는 듀플렉스 핵산에 대한 측정된 Tm과 예측된 Tm의 비교를 사용하여 표적 핵산이 증폭되었는지를 측정한다.
전통적으로, dPCR 응용에서, 개개의 구획내 형광성의 후-증폭 종점 측정을 사용하여 샘플 속의 표적 핵산의 존재 또는 부재를 측정하였다. 보다 최근에, 인터컬레이팅 염료를 사용한 용융 분석을 사용하여 dPCR 속의 표적 핵산을 특이적으로 확인할 수 있다. 단순한 노이즈(noise)와 용융 현상의 실제 존재 사이를 구별하기 위하여, 역치를 RFU 플롯 및 음성-유도체 플롯 중 어느 하나 또는 둘 다에 대해 설정할 수 있다. RFU 플롯의 경우, 신호 역치는 기울기-교정된 대조군 곡선의 표준 편차의 퍼센트, 예컨대, 표준 편차의 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 또는 2000%를 사용하여 선택할 수 있다. 형광성 강도가 주어진 용융 온도 윈도우(예컨대, 이의 용융 온도가 65℃인 것으로 예측된 표적 프로브의 경우 60 내지 70℃)에 걸쳐 역치 양을 능가하여 변화한 것으로 측정되는 경우, 표적이 존재하는 것으로 고려할 수 있다. 음성-유도체 플롯의 경우, 신호 역치는 대조군 샘플에 대한 기울기-교정된 RFU 곡선의 음성 유도체의 표준 편차의 퍼센트, 예컨대, 표준 편차의 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 또는 2000%를 사용하여 선택할 수 있다. 이후에, 임의의 음성-유도체 낮은 피크가 0 미만의 역치 크기 이상인 것으로 측정되는 경우, 양성 용융 현상이 관련 표적 프로브에 대해 발생된 것으로 고려하며, 상응하는 표적은 이러한 구획 속에 존재하는 것으로 측정된다. 역치 값은 상응하는 기왕 자료(historical data)를 고려하고 음성-유도체 용융 피크의 대표적인 크기의 분율을 사용함으로써 대안적으로 설정할 수 있다. 예를 들면, 역치는 특이적인 표적 프로브에 대해 평균 음성-유도체 용융 피크의 10% 내지 50%의 어디에서든 설정될 수 있다.
제US2016/0310949호는 디지탈 미세유동 시스템에서 전통적인 또는 고 해상도 용융 분석(HRM)으로부터 생성된 독특한 용융 특징을 사용하여 기술함으로써 dPCR에서 정량적 멀티플렉싱을 달성할 수 있다. 제WO2015023616호는 디지탈 시스템을 기술하며 여기서 표적 핵산은 공통의 프라이머를 사용하여 비-특이적으로 증폭되며 HRM 분석을 사용하여 개개 세균 종을 확인한다. 표적 핵산을 함유하는 개개 웰 속의 용융 특징을 표준 용융 곡선과 비교함으로써 존재하는 표적 서열을 확인한다. 개개의 세균 종의 정밀한 확인은 독특한 표준 중에서 용융 프로파일의 조심스러운 비교를 필요로 하므로, 고 해상도 용융 데이타, 전형적으로 ΔT < 1℃에 의존한다.
별개의 용융 분석(DMA)은 형광성 대 온도의 보다 적은 측정을 필요로 함으로써 보다 신속한 데이타 수집 및 분석을 야기하는 용융 분석을 수행하는 개선된 방법을 제공하며, 결과적으로 검정에 대해 보다 적은 턴어라운드 시간을 제공한다. 개념으로서, DMA는 연속 용융 또는 HRM 분석의 언더-샘플링(under-sampling)을 나타낸다. 후자의 2개 방법과는 대조적으로, DMA는 표적당 단지 2개의 온도에서 형광성의 측정을 필요로 하며 표적 핵산을 확인하기 위한 Tm의 계산을 필요로 하지 않는다. 특수한 표적 핵산에 대한 형광성 영상은 (1) 표적을 나타내는 모든 프로브 또는 듀플렉스 핵산이 하이브리드화된, 듀플렉스 상태인 온도 및 (2) 표적을 나타내는 모든 프로브 또는 듀플렉스 핵산이 단일 가닥 구조로 있거나, 완전히 변형된 온도에서 획득된다. 이러한 2개의 구조를 구별하는 적절한 표지화 계획(scheme)의 사용은 표적의 존재하에서 2개의 측정 온도에서 구조의 변화를 검출하도록 한다. 이러한 개념은 단일 표적-특이적인 프로브를 갖는 샘플(좌측) 및 독특한 Tm을 가짐으로써 구별가능한 3개의 표적-특이적인 프로브를 갖는 샘플(우측)에 대해 도 2에 나타낸다.
DMA는 본원에 참고로 포함된 미국 특허원 제14/82,288호에 기술된 것과 같은 프로브를 사용하여 수행된 용융 분석에 특히 매우 적합하며, 디지탈 증폭 시스템에서 멀티플렉싱의 효율적이고 비용-효과적인 수단을 제공한다.
본 방법은 예정된, 독특한 용융 특징을 가짐으로써 디지탈 PCR에서 개개 구획내 특이적인, 표적 핵산의 존재를 확인하는 절단가능한 프로브를 사용할 수 있다. 특수한 양태에서, 본 방법은 표적 핵산의 존재를 확인하기 위한 다수의 온도에서 획득된 다수의 영상보다는, 2개의 온도에서만 획득된 형광성 영상으로부터 유래된 별개의 용융 특징의 사용에 관한 것이다. DMA의 사용은 검출되는 듀플렉스 핵산 또는 프로브의 Tm에서 형광성 영상의 획득을 특히 필요로 하지 않는다.
표적-특이적인 프로브는 검출하는 비-특이적인 증폭 생성물의 발생을 감소시킬 수 있지만 이러한 프로브에 의해 가능하게 된 별개의 용융 분석은 검출된 표적의 존재 및 실체를 확인하는 효율적인 수단을 제공하므로, 특이성을 개선시키는 2개의 메카니즘을 제공한다. 또한, 본 방법은 표적-특이적인 절단가능한 프로브를 사용하여 dPCR 응용에서 멀티플렉싱 능력을 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 방법은 반응 혼합물 속의 하나 이상의 표적을 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 qPCR 및 dPCR 반응 둘 다에 적용될 수 있다. dPCR 반응의 경우, 3개 이상의 독특한 용융 특징은 단일 형광성 채널을 사용하여 단일 구획 속에서 검출할 수 있으며, 이는 최소, 4개의 상이한 형광성 채널을 사용하여, 12개의 독특한 표적을 단일 구획 내에서 검출할 수 있음을 의미한다.
중요하게는, 본원에 기술된 방법은 온도에 있어서 증분적 변화가 이루어지면서 획득될 다수의 영상을 필요로 하는 시간-소모적인 용융 분석에 대한 해결책을 제공한다. 이러한 방법은 dPCR 응용에 특히 유용한 것으로 고려되며 여기서 전통적인 및 HRM 용융 곡선 분석으로부터의 영상 획득 및 데이타 가공은 시간 소모적이고 계산 집약적이다. DMA는 표적 설명을 위한 최소 n+1개 영상을 획득하는데 필요하며 여기서 n은 동일한 파장에서 형광성을 방출하는 상이한 표적-특이적인 프로브의 수이다. 이는 표적을 정밀하게 확인하고 정량화하는 능력을 희생시키지 않으면서 표적 존재를 측정하는데 필요한 영상의 수를 유의적으로 감소시킬 수 있다. 전통적인 용융 분석 및 HRM과는 대조적으로, 본 방볍은 예정된 프로브 Tm 이상 및 이하의 온도에서 취한 별개의 형광성 측정을 대안적으로 사용하며 강도에 있어서의 단계 변화를 이용하여 특이적인 표적의 존재를 나타낸다.
구현예에서, 미국 특허원 일련번호 제14/823,288호에 기술된 것과 같은 절단가능한 프로브를 설계하여 표적 하이브리드화-매개된 절단에 이어, 절단된 프로브의 연장을 뒷받침하는 헤어핀 형성 후, 제1 표적에 대해 특이적인 프로브가 반응 혼합물 속의 임의의 다른 표적 핵산에 대해 특이적인 프로브보다 적어도 5℃ 상이한 Tm을 나타내도록 한다. 이러한 조건 하에서, 멀티플렉스 검출 계획에서 프로브의 각각의 세트에 대한 용융 프로파일의 유도체의 플롯은 각각 서로 구별가능한 고도로 차별화된 용융 피크를 수득한다. 바람직한 구현예에서, 상이한 프로브 Tm을 약 10℃까지 분리함으로써 보다 높은 Tm에서 용융하도록 설계된 프로브가 변성을 시작하기 전에 동일한 Tm에서 용융하는 모든 프로브가 완전히 변성/단일 가닥화되도록 한다. 전형적으로, 프로브는 증폭 반응 혼합물에 포함되며 증폭 후, 반응 혼합물 속의 변형된 프로브에 대한 용융 프로파일을 측정하기 위해 사용된다. 절단가능한 프로브는 이들이 이들의 유사한(cognate) 표적 핵산과 접했는지의 여부 및 절단되었는지의 여부 및 연장되었는지의 여부에 따라 상이한 형광성 강도를 나타낸다. 도 2 내지 7에 나타낸 구현예에서, 프로브는 프로브의 5' 말단에 커플링된 형광성 리포터를 가지는 결과로서 표적의 부재하에 형광성을 나타내며 형광성은 연장 동안 퀀처의 혼입을 통해 퀀칭된다.
영상 획득(Image Acquisition)
DMA에서 예정된 Tm을 갖는 프로브의 사용은 증폭 후 표적 존재를 설명하기 위한 예정된 용융 피크보다 더 낮거나 높은 온도 간격에서 형광성을 측정하도록 한다. 도 2의 좌측 패널은 예정된 Tm을 갖는 단일 프로브의 용융 분석 동안 단지 2개의 형광성 영상(X로 나타낸 온도에서 취함)의 획득을 나타낸다. 영상 획득은 프로브의 예측된 Tm에서 일어나지 않음에 주목한다. 도 2의 우측 패널은 각각 독특한 용융 피크(Tm1= 65℃, Tm2= 75℃ 및 Tm3= 85℃)를 지닌 3개의 프로브 각각을 함유하고 동일한 형광성 채널에서 검출가능한 3개의 프로브를 함유하는 반응 혼합물의 경우, 4개의 영상 만이 용융 프로파일을 생성하는데 요구됨을 나타낸다. 제1의 영상은 PCR 증폭에 사용된 프라이머에 대한 어닐링 온도에서 또는 약간 더 낮은 온도에서 획득되며 여기서 이들의 상응하는 표적에 접한 모든 프로브는 증폭 후 하이브리드화된, 듀플렉스 상태로 존재한다. 제2의 영상은 온도 T2에서 획득되며, 여기서 Tm1 프로브는 변성될 것이지만, Tm > Tm1을 갖는 프로브는 하이브리드화된 상태로 남는다. 제3의 영상은 T3, 중간 온도 Tm2 및 Tm3에서 획득된다. 제4 영상은 변성 온도 T4에서 획득되며, 이는 Tm3보다 더 높으며 여기서 모든 프로브가 변성될 것이다. dPCR 응용에서, 개개 구획내 평균 형광성 강도를 모든 4개의 획득된 영상에 대해 측정한다.
대안적인 방법에서, 미국 특허원 일련번호 제14/823,288호(본원에 참고로 포함됨)에 기술된 것과 같은 절단가능한 프로브를 사용하는 경우, 초기 영상 및 관련된 형광성을 증폭 전에 획득할 수 있으며, 반응물 속의 모든 프로브의 최대 형광성을 나타낸다. 이러한 형광성 측정은 온도 T4에서 획득된 영상과 이론적으로 동일하며, 여기서 반응물 속의 모든 프로브는 완전히 변성되고 이들이 이들의 유사한 표적과 접하는지의 여부와 상관없이 최대 형광성을 나타낸다. 증폭 후, 후속적인 영상은 증폭 전에 취한 영상과 비교하기 위해 온도 T1, T2 및 T3에서 획득하여 온도가 증가하면서 듀플렉스 구조로부터 단일 가닥 구조까지 프로브 이전으로서 형광성의 변화를 측정할 수 있다. 모든 프로브가 예비-증폭 영상에 의해 완전히 변성되는 고온(T4) 영상의 이러한 치환은 임의의 검정 양식으로 적용될 수 있으며 여기서 변형되지 않은(예비-증폭) 프로브는 최대로 형광성이며 이러한 동일한 프로브는, 일단 변성되면 이들이 표적과 접하는지의 여부를 기반으로 신호의 변화를 나타낸다.
측정 온도의 선택은 RFU-대-온도 플롯의 가장 평평한 영역이 각각의 프로브에 대한 용융 피크(즉, 최저 용융 온도보다 더 낮고, 최고 용융 온도보다 더 높은 온도)의 한 면에서 발생하는 경우를 나타내는 사전 임상 또는 실험실 데이타를 기반으로 할 수 있다. 대안적으로, 측정 온도는 또한 음성 유도체 곡선(Tm)의 피크를 플랭킹하는 최대 점(최소 음성 값)을 기반으로 선택할 수 있다. 전체 관련 온도 영역에 걸쳐 사전 고-해상도 RFU 및/또는 유도 데이타의 부재하에서도, 측정 온도는 반응 혼합물 속의 각각의 프로브에 대해 예정된 용융 온도보다 더 낮은 온도, 및 더 높은 온도를 선택함으로써 여전히 간단하게 선택할 수 있다. 이러한 공정은 인 실리코(in silico) 모델링 데이타로 추가로 뒷받침될 수 있다. 도 2는 균등하게 떨어져 있는 온도 간격에서 획득될 형광성 영상을 나타내지만, 이는 요건이 아니다.
도 2에 나타낸 형광성 강도 플롯이 이상적이었으며, 여기서 표적 용융 온도보다 더 낮은 온도 및 더 높은 온도에서 형광성은 변화를 거의 나타내지 않아 비교적 ?耽?, 거의 평평한 기울기(0에 이르는 기울기)를 생성한다. 그러나, 실제로, 형광성 리포터 염료의 광표백 및/또는 온도 의존성은 관련된 온도 범위에 걸쳐 형광성의 기울기를 변경시킬 수 있다. 기울기 교정 및/또는 표준화는 용융 특징의 보다 명확한 확인을 위해 용융 분석 전에 형광성 강도 대 온도에 대한 미가공 데이타에 적용할 수 있다.
도 3 내지 7은 dPCR 응용에서 DMA를 사용하는 투입 표적 카피의 수를 측정하는데 사용된 영상-분석 공정을 나타낸다. 도 3은 표적을 가지지 않는(빈 구획) 4 구획을 포함하는, 36개 구획 중에서 다양한 조합으로 분포된 도 2에 대해 기술된 동일한 3개의 표적 A, B, 및 C를 나타낸다. 본 실시예에서, 일부 구획은 표적 A, 표적 B, 또는 표적 C 만을 함유하며, 일부는 2개의 표적(AB, BC, 또는 AC)를 함유하고, 일부는 3개의 표적(ABC)을 함유하며, 일부는 증폭 후 표적을 함유하지 않는다. 표적은 도 2에 대해 기술된 동일한 프로브를 사용하여 검출할 수 있으며, 이는 독특한 용융 온도 Tm1, Tm2 및 Tm3를 가지도록 설계되고 여기서 Tm1<Tm2<Tm3이다.
본 구현예에서, 영상 분석 공정은 일반적으로 표적 증폭 후에 주어진 표적 프로브 또는 듀플렉스에 대해 예측된 용융 온도보다 더 높은 온도 및 더 낮은 온도에서 획득된 2개의 형광성 영상을 비교하는 단계를 포함한다. 초기에, 출발하는 형광성 강도 영상은 Tm1보다 더 낮은 온도 T1(본 실시예에서 60℃)에서 획득된다. 도 4는 증폭이 완료된 후 도 3에 나타낸 시스템의 개개 구획내 T1에서의 형광성 강도를 나타낸다. 도 4에 나타낸 영상은 모든 프로브가 듀플렉스(헤어핀) 구조로 존재하고, 절단되지 않고, 연장되지 않은 프로브(즉, 이에 대해 표적이 나타나지 않은 프로브) 만이 형광성을 방출하는 조건을 나타낸다. 당해 조건에서, 이들의 상응하는 표적 핵산의 존재하에서 절단되고 연장된 모든 3개의 표적에 대한 프로브로부터의 형광성은 퀀칭되어, 표적이 존재하지 않는 조건, 또는 절단되고 연장된 프로브가 변성되는 조건과 관련하여 감소된 형광성 강도를 생성한다. 다음에, 온도는 Tm1보다 더 높지만 Tm2보다 더 낮은 온도 T2(본 실시예에서, 70℃)까지 증가한다(도 5). 당해 온도에서 및 표적 A의 존재하에서, 표적 A-특이적인 프로브는 변성될 것이고 퀀칭 손실의 결과로서 형광성에 있어서 상대적인 증가를 나타낼 것이다.
표적 A에 대해 양성을 시험하는 구획의 수를 측정하기 위하여, 다음의 영상 가공 단계를 수행한다: i) 구획 영상내 픽셀(pixel)의 수로 나눈 개개 구획내 통합된 픽셀 강도 값으로 정의된, 개개 구획내 평균 픽셀 강도를 계산한다; ii) T2 대 T1에서의 평균 형광성 강도의 비(FT2/T1)를 측정한다; iii) 영상 비교의 결과를 플롯팅함으로써 온도 측정 윈도우에 걸쳐 형광성 강도에 있어서의 변화를 나타내는 구획을 확인한다. 대안적으로, 비를 사용하기 보다는 T2에서 획득한 것으로부터 T1에서 취한 형광성을 감할 수 있다(FT2-T1)(평균 강도 값을 사용함). 평균 강도 값은 또한 픽셀의 서브세트 또는 구획내 목적한 영역(ROI)을 문의(interrogating)할 수 있다. 대안적으로, 통합된 강도는 본원에 기술된 모든 분서에서 평균 강도에 대해 치환할 수 있다. 최종적으로, 비율 또는 감법을 픽셀 단위(pixel-by-pixel) 기준으로 영상 사이에서 직접 수행할 수 있으며 구획 강도(평균 또는 통합된)를 수득되는 영상으로부터 측정할 수 있다.
도 3 내지 7에서 형광성에 있어서의 변화는 각각의 말단 변성에서 형광단 및 퀀처를 함유함으로써, 형광단 및 퀀처 분자를 분리하는 헤어핀 프로브로서 형광성에 있어서의 증가를 나타낸다. 물론 용융 분석 동안 듀플렉스가 변성하면서 형광성 강도에 있어서의 감소를 야기하는 대안적인 검출 화학 및 표지화 계획을 또한 사용할 수 있다.
T2에서 획득한 영상은 또한 이의 용융 온도가 Tm2인 표적 B의 예정된 Tm보다 낮은 온도에서 취한 영상을 나타낸다. 동일한 일반적인 가정을 각각의 프로브의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 및 더 낮은 온도에서 각각의 표적에 대해 수행할 수 있다. DMA의 특징은 지정된 프로브에 대해 예정된 Tm보다 더 높은 온도 Tx에서 취한 측정이 Tx보다 더 높은 Tm을 갖는 프로브의 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 취한 측정으로서 제공될 수 있으므로, 각각의 프로브에 대해 적어도 2회 측정을 취할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 반응 혼합물이 상이한 Tm을 갖는 n개의 표적-특이적인 프로브를 함유하는 경우, 필요한 형광성 영상은 n+1개의 상이한 온도에서만 획득될 필요가 있다. 도 6은 도 3에 나타낸 시스템에 대한 영상 비교의 예이며, 여기서 T2(70℃)에서 계산된 평균 형광성 강도를 T1(60℃)에서 계산된 강도로 나누어 강도의 변화를 나타내는 구획을 측정한다. 수득되는 1D 진폭 플롯(도 6, 하부)은 표적에 대해 음성인(1에 근접한 비에서 성공적인 영상 결과 사이의 형광성 강도에 있어서 구별가능한 변화가 없음) 또는 표적에 대해 양성인(>1의 비에서 성공적인 영상 결과 사이의 형광성 강도에 있어서의 변화)인 구획에 상응하는, 2개의 강도에서 구획의 집단을 함유한다. 구획을 2개이 그룹으로 분류하는 것은 수동적 역치를 설정하거나 k-수단 군집화(k-means clustering)와 같은 알고리즘-기반 접근법을 사용함으로써 수행할 수 있다. 일단 영상이 모든 표적 프로브에 대해 각각의 Tm보다 더 낮은 온도 및 더 높은 온도에서 획득되면, 영상 분석을 수행하여 영상의 각각의 세트를 비교하고 각각의 측정 세트에 대해 형광성 강도 비를 계산한다(도 7). 영상의 세트 사이의 구획 강도의 비를 플롯팅하는 것은 양성 및 음석 구획의 상응하는 수의 계산을 허용한다. 일단 각각의 표적에 대해 양성을 시험하는 구획의 수를 알게되면, 구획당 표적 투입 카피의 평균 수, λ를 푸이송 통계학을 사용하여 추정할 수 있다. 수학식 1은 각각의 표적에 개별적으로 적용할 수 있다. 구획에 걸쳐 표적 A, B 및 C의 분포가 독립적인 것으로 추정되며, 따라서 수학식 1의 계산에서 표적 A에 대해 음성일 수 있는 구획이 표적 B 또는 C 또는 둘 다에 대해 양성일 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 이는 개개 표적의 획득에 영향을 미치지 않는다.
[수학식 1]
Figure pct00001
평균 로딩(λ)으로부터 +/- Z 표준 편차내 신뢰 구간은 수학식 2로 표현하여 제공하며 여기서 λCIL은 신뢰 구간의 하한치이고 λCIU는 신뢰 구간의 상한치이다. 95% 신뢰 구간의 경우, Z는 1.96이다. 대안적인 신뢰 구간은 Z에 대한 적절한 치환으로 수득할 수 있다. 신뢰 구간은 구획의 용적이 일정하게 유지되는 경우 구획의 수가 증가함에 따라 협소해진다. 따라서, 구획의 수가 증가하는 것은 구획 당 평균 투입 표적 카피를 추정하는 것의 정밀성을 증가시키는 한가지 방식일 수 있다.
[수학식 2]
Figure pct00002
정밀하게 정량화하기 위하여, 수학식 3에서의 표시를 구획당 표적 카피의 평균 수에 대한 신뢰 구간의 크기를 비교한다. 보다 작은 값은 보다 큰 정밀도를 나타낸다. 상대적인 표준 편차 및 상대적인 신뢰 구간은 정량화가능한 검출 한계(즉, 매우 적은 표적-양성 또는 매우 적은 표적-음성 구획)에서 현저하게 증가할 수 있지만, 이러한 경우에 오차의 크기는 여전히 허용될 수 있다. 예를 들어, 극도로 드믄 표적을 검출하려고 하는 경우, 표적의 단순한 존재 자체는 오차 정도와 상관없이 이미 극도의 유효한 정보일 수 있다.
[수학식 3]
Figure pct00003
데이타 분석
dPCR 증폭 전 및 후 둘다에서 획득한 영상을 사용하여 데이타 분석을 최적화하기 위한 전략이 또한 제공된다. 이러한 전략은 증폭 전 또는 후에 획득된 영상을 사용하여 용융 분석 동안 측정된 형광성 강도를 표준화하고(참고: 실시예 2) 배경(음성 구획) 역치를 확립하여 전- 및 후-증폭 영상을 사용하여 배경으로부터 양성 및 음성 신호를 구별하는 것(참고: 실시예 3)을 포함한다. 추가의 구현예(참고: 실시예 4)는 용융 분석 동안 획득된 영상을 교정하여 열 프로파일에 걸쳐 형광성 강도의 온도- 및 광-용량 의존적 변화를 밝히는 방법을 제공한다. 예를 들면, FAM은 매우 광 민감성인 것으로 알려져 있으며, 증가된 광 노출로 감소된 형광성 강도를 나타내며, 많은 염료, 예를 들어, FAM 및 HEX는 보다 높은 온도에서 감소된 형광성을 나타낸다.
실시예 5는 0 또는 3개의 표적을 함유하는 구획의 예비 확인을 위한 전- 및 후-증폭 영상을 비교하는 방법을 제공한다. 추가의 분석으로부터 이러한 구획을 제거하여 데이타 분석에 필요한 시간을 단순화하고 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 구획에 요구되는 영상은 필요하지 않으므로, 데이타 분석에 포함되지 않을 구획의 예비 확인은 용융 단계 동안 획득된 영상의 수를 제한하는데 또한 유용하다. 따라서, 이러한 방법은 유용한 데이타를 획득하는데 적합한 것으로 고려되는 결과로서 관심 구획으로부터 영상 획득 만을 허용한다. 특정의 실험 조건에서, 이는 용융 획득 시간 및 후속적인 데이타 분석을 크게 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 개선된 정량화를 초래하는 하나 이상의 표적에 대해 양성 또는 음성으로서 구획의 개선된 분류를 제공한다. 용융 분석을 위한 DNA 인터컬레이팅 염료에 의존하는 방법과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 검정 설계(예컨대, 프라이머 영역, 앰플리콘 길이 등)에서 유연성을 유지하면서 표적-특이적인 프로브의 용융 분석을 사용하여 특이성을 향상시킨다. 또한, 기술된 방법은 저 해상도 디지탈 용융 프로파일을 사용하여 표적 핵산을 검출하고 확인하는 것에 의존하며, 이는 용융 데이타 획득 및 분석을 단순화하고 궁극적으로 보다 신속한 데이타 획들 및 데이타의 분석을 야기한다.
DMA는 전통적인 연속 용융 분석보다 더 적은 데이타 점을 필요로 하며, 이는 데이타 획득에 필요한 시간을 감소시키고, 가공할 더 적은 영상 및 광민감성 리포터 프로브의 더 적은 광표백을 야기한다. 이는 영상화-기반 디지탈 PCR 시나리오에 특히 유리하며, 여기서 구획의 많은 영상(즉, 소적 또는 정적 배열 구획)은 각각의 용융 온도에서 가공된다. dPCR 반응의 용융 분석은 전형적으로 용융 프로파일의 각각의 온도에서 구획의 배열에 걸쳐 획득될 영상을 필요로 한다. 구획의 수에 따라서, 영상이 획득되는 영역은 매우 클 수 있다. 또한, 영상은 충분한 구획 확인 및 표적에 대해 양성 또는 음성으로서의 지정을 보증하기에 충분히 높은 해상도이어야 한다. 이는 흔히 구획의 배열 당 다수의 영상을 획득하는 것이 요구된다. 또한, 디지탈 뿐만 아니라 거대 용적 검정에서 멀티플렉싱화를 달성하기 위하여, 영상을 다수의 형광성 채널에서 획득한다. 용융 분석에 필요한 영상 획득 상황의 수를 감소시킴으로써, DMA는 용융 데이타를 획득하고 획득된 영상을 가공하는데 필요한 시간을 감소시키므로 디지탈 응용시 특히 가치를 갖는다.
DMA의 사용은 또한 샘플이 거의 잠재적으로 유해하지 않은 광 및 고온에 노출되는 장점을 제공한다. 일부 일반적으로 사용된 형광단(예컨대 FAM)은 광민감성이다. 이러한 광민감성은 전체 샘플이 거대 용적 PCR과 대조적으로 각각의 형광성 측정에 대해 문의되므로 디지탈 PCR에서 유의적이며 여기서 총 용적보다 더 작은 중심 용적이 전형적으로 문의된다. 초점 용적의 내부 및 외부에서 자유로이 확산되고 평균 미만의 여기 노출에서 수용되므로 광표백을 겪는 경향이 거의 없기 때문에 이러한 차이는 후자의 경우에 형광단으로서 중요하다. 디지탈 PCR 반응에서 형광단은, 특히 용융 분석이 수행되는 경우, 입사 여기의 증가된 양에 노출되므로, 더욱 광표백을 겪을 가능성이 더 크다. DMA는 노출 현상의 수 및 따라서 형광단에 의해 겪는 광표잭의 정도를 감소시킨다. 일부 예에서, 고온에 대한 형광성 프로브의 반복되고 연속된 노출은 또한 부작용을 가지며, 이는 DMA에 의해 완화될 수 있다.
절단가능한 프로브를 지닌 DMA를 사용하는 것에 대한 다른 장점은 이것이 향상된 특이성을 제공한다는 것이다. 미국 특허원 제14/82,228호에 기술된 절단가능한 프로브는 표적 DNA의 존재하에서만 절단되어 연장되지만, 연장을 위한 주형으로서 표적 DNA를 사용하지 않는다. 따라서, 이러한 프로브는 심지어 표적 핵산 서열 변화의 존재하에서 변하지 않은 매우 예측가능한 Tm을 갖는다. 대조적으로, 표적 핵산 또는 이의 증폭 생성물의 조성물에 의해 적어도 부분적으로 측정된 Tm을 갖는 핵산 듀플렉스 및 프로브/표적 듀플렉스는 작은 표적 서열 변화의 결과로서 샘플 대 샘플의 Tm에서의 변화를 나타낼 수 있다. 이는 전형적으로 HRM이 샘플 속에서 알려지지 않은 표적 서열의 실체를 확인하기 위하여 용융 피크를 측정하는 것을 필요로 한다. 대조적으로, 절단가능한 프로브와 조합된 DMA의 사용은 표적 핵산의 실체를 측정하기 위해 용융 피크 Tm의 측정을 필요로 하지 않는다. DMA는 음성 샘플로부터 양성을 구별하기 위하여 2개의 값들 사이의 비 또는 차이를 측정하기 위해 프로브의 예측된 Tm보다 더 낮은 온도 및 더 높은 온도에서만 획득된 형광성 강도 값을 필요로 한다. DMA는 또한 추가의 미리선택된 온도에서 형광성 강도 값을 획득하는 것을 포함할 수 있지만, 표적을 확인하기 위한 용융 온도의 측정을 필요로 하지 않는다. 또한, 일부 구현예에서, 형광성 강도 값은 증폭 전에 반응물 속의 모든 프로브가 변성되는 온도 대신 획득될 수 있다.
그러나, DMA는 dPCR 구현예로 제한되지 않는다. 이는 또한 용융 프로파일에 대한 데이타를 획득하는데 필요한 시간을 감소시키기 위해 실시간 PCR 및 qPCR 용융 분석 응용에 용이하게 응용가능하다. 이러한 방법은 또한 다른 프로브-기반 검출 방법, 예를 들면, 분자 비콘(Molecular Beacons)(MB), TaqMan, TOCE 기술 및 DNA 인터컬레이팅 염료, 예를 들면, SYBR 또는 EvaGreen의 특수한 사용에 응용가능하다.
분자 비콘 프로브를 설계하여 독특한, 예정된 용융 온도를 가지도록 할 수 있다. 그러나, MB 프로브를 사용하는 용융 분석은 이를 사용하여 이것이 하이브리드화되는 표적 서열로부터 프로브의 해리를 반영하며, 용융 온도는 표적 서열에 의해 측정되므로 설계의 측면에서 구속된다. 온도는 MB 프로브 용융 분석 동안 증가되므로, 형광성은 MB 프로브가 표적으로부터 해리되어 무작위 코일 구조를 채택함에 따라 감소한다. 유사하게, TaqMan 프로브를 사용하는 용융 분석의 경우, 용융 프로파일은 검출하려는 표적 서열에 의해 측정되므로 프로브 설계가 제한된다. Molecular Beacon 및 TaqMan 프로브를 사용한 용융 분석은 본원에 참고로 포함된, Huang et al., PLoS One, 6(4) 2011에 기술되어 있다. DMA는 특이적인 듀플렉스 Tm의 측정을 필요로하지 않으므로 예정된 용융 프로파일을 갖는 것으로 설계된 MB 및 Taqman 프로브를 DMA에서 또한 사용할 수 있으며, 따라서, 표적 서열의 작은 변화는 유의적인 유해 효과를 가지지 않을 수 있다.
DMA는 또한 본원에 참고로 포함된 제WO2012096523호에 기술된, TOCE 프로브와 함께 사용될 수 있다. 이의 표적 핵산의 존재하에서 상부 프라이머(upstream primer)의 하이브리드화 및 연장은 상부 하이브리드화된 피쳐(Ppitcher) 올리고뉴클레오타이드를 절단하여 태깅(tagging) 올리고뉴클레오타이드를 방출한다. 이후에, 태깅 올리고뉴클레오타이드는 태깅 영역의 연장을 위한 주형으로서 제공하여 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 생성하는 표지된 프로브 또는 캐쳐 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화된다. 다양한 표지화 계획을 사용하여 듀플렉스 핵산의 용융 분석을 뒷받침할 수 있다. 예를 들면, 태깅 영역의 연장은 랜덤 코일 표지된 프로브의 퀀처 및 형광단의 분리를 유발하여 형광성을 생성할 수 있다. 따라서, 증폭은 듀플렉스 형태로서 형광성의 증가를 검출함으로써 실시간으로 검출될 수 있으며, 용융 분석은 램덤 코일 프로브가 랜덤 코일 구조를 다시 취하므로 형광성에 있어서의 감소로 검출될 수 있다. 캐쳐 올리고뉴클레오타이드는 표적-독립적이며 예정된 Tm을 갖도록 설계될 수 있으므로, 이러한 검출 방법은 DMA에서 사용하기에 매우 적합하다.
DMA는 또한 인터컬레이팅 염료, 예를 들면, SYBR 또는 EvaGreen과 함께 사용될 수 있다. 표적의 확인은 상이한 길이 또는 서열 조성, 및 따라서 상이한 Tm 값을 갖는 표적 영역의 증폭을 통해 달성할 수 있다. 증폭 후, 반응 혼합물을 별개의 용융 분석에서 증가하는 온도에 적용시켜 이중-가닥 앰플리콘 또는 듀플렉스 해리에 상응하는 형광성 강도에서의 변화를 측정한다. DMA는 신호가 관심이 있는 듀플렉스의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 및 더 낮은 온도의 별개의 온도에서 검출될 수 있으므로 인터컬레이팅 염료 및 프로브-기반 검출 방법에 유용하며, 이는 비-표적 증폭 생성물, 예를 들면, 프라이머 이량체(이는 전형적으로 진정한 표적 듀플렉스보다 Tm에 있어서 더 낮다)를 포함하는 Tm 범위의 외부에 있도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 용융 분석에서 비-표적의 거짓된 듀플렉스는 60 내지 75℃의 온도 범위에서 Tm을 가질 수 있다. 목적한 표적 앰플리콘 또는 듀플렉스는 83℃의 Tm을 갖도록 설계할 수 있다. 이러한 시나리오에서 DMA는 대량 반응 또는 dPCR 양식으로 78℃ 및 88℃에서 수행할 수 있다. 이러한 분석 방법은 단일 온도 측정과 비교하여 특이성에서 우수할 수 있고, 고-해상도 용융 분석에 대해 속도 및 가공에 있어서 우수한 신속하고 효율적인 방식으로 비-표적 증폭 현상과 관련된 신호를 획득하는 것을 피할 수 있다.
DMA는 비-디지탈 또는 균질한 검정 화학 방법, 예를 들면, 밀폐된 튜브 또는 실시간 대량의 PCR 방법에 적용할 수 있지만, 이는 반응물 속의 표적의 출발 농도를 정량화하기 위해 양성 구획의 정밀한 계수에 특수한 장점을 제공하므로, 디지탈 증폭 응용에서 특히 유용하다.
또한, 다양한 분석 기술을 사용하여 dPCR에서 표적 핵산의 정량을 정량화하고 개선시키는 다양한 방법이 본원에 기술되어 있다.
A. dPCR에서 대조군을 사용하는 방법
dPCR에서 대조군을 사용하기 위한 전략은 단일 장치 및 작업흐름도(샘플-대-답)내로 샘플 가공 및 dPCR을 혼입시키는 dPCR 시스템 및 샘플 가공과 dPCR 작업흐름도 사이의 분리를 유지시키는 시스템에 대해 기술되어 있다. 기술된 모든 방법은 dPCR, 특히 용융 분석을 사용하여 단일 반응 칸막이 또는 구획내에서 다수의 표적을 확인하는 dPCR 시스템을 사용하여 표적 정량화 시 정밀도를 최적화시키는 것을 목적으로 한다. 본원에 기술된 방법은 이에 의해 장치 성능을 측정할 수 있는 참고 데이타 세트 및 표준을 생성하기 위한 보정(교정) 염료, 프로브 및 대조군 표적에 의존한다. 이러한 염료, 프로브 및 표적을 사용한 시험은 샘플 반응으로부터 별도로 또는 동시에 샘플 반응과 함께 수행하여 샘플 가공, 광학 및 열 대조군을 포함하는 시스템 성능을 입증할 수 있다. 바람직한 구현예는 샘플 시험 반응과 동시에 작동하며 대조군 반응은 샘플 시험 반응으로부터 별도로 작동한다.
현재의 dPCR 시스템은 멀티플렉싱 능력에서 제한되므로 본원에서 고려된 바와 같은 단일 반응에서 다수의 대조군을 포함하는 장점을 가지지 않는다. 따라서, 기존의 dPCR 방법은 이러한 대조군이 샘플과 대조군 성능 사이의 변동성을 도입할 수 있는 샘플 반응물 내에서 보다는 별도의 웰 또는 칩 내에 포함되는 것을 필요로 한다. 유사하게 qPCR 반응은 거대 용적의 PCR 반응내에 함유된 대조군에 의존하므로, 다수의 대조군을 포함시키는 능력은 또한 이용가능한 멀티플렉싱의 정도에 의해 제한된다.
교정 염료 및 프로브의 세트를 이용하여 참고 데이타의 세트를 생성시킬 수 있으며 이에 의해 장치 성능을 적합한 빈도로 모니터링할 수 있다. 염료 및 프로브의 이러한 세트는 이들이 물 속에서 가용성이 되도록 하는 짧은 올리고 서열로 표지된 시스템-특이적인 염료 뿐만 아니라 적절한 교정을 수행하기 위한 용융 프로파일(용융-교정 대조군)의 범위를 나타내도록 설계된 다양한 헤어핀 프로브를 포함할 수 있다.
교정 염료의 세트를 사용하여 장치가 모든 채널에 걸쳐 예측된 형광성 강도를 검출하여 보고하도록 보증할 수 있다. 각각의 채널에 대한 상이한 교정 염료는 대조군 샘플에 포함될 수 있으며, 측정된 강도는 바람직한 온도 범위(예를 들면, 55 내지 95℃)의 하부 및 상부 말단에서 이미 측정된 강도와 비교할 수 있다. 임의의 측정이 예측된 값으로부터 예정된 허용가능한 범위를 초과하는 경우, 이는 장치, 시약 혼합물, 또는 작동 조건을 사용하는 문제를 나타낼 수 있다. 또한, 교정 염료를 사용하여 미가공 측정 값을 표준화하고/하거나 조정함으로써 측정이 참고 데이타의 전체 세트(예컨대, 표적 또는 프로브의 예측된 용융 진폭 및 온도)에 대해 적절하게 평가될 수 있다.
다른 구현예에서, 공지된 용융 프로파일 및 용융 온도를 갖는 하나 이상의 용융-교정 대조군은 반응 혼합물 또는 별도의 구획 내에 포함된다. dPCR 응용에서 용융-교정 대조군을 평가하는 한가지 방법은 연속 용융 분석을 수행하여 형광성 대 온도의 미분계수의 플롯에 있어서 용융 피크를 확인한다. 일단 정밀하게 관찰된 용융 온도가 확인되면, 이를 예측된 값과 비교하고, 관측된 값과 예측된 값 사이의 임의의 차이를 사용하여 모든 측정에 대해 온도 교정을 적용한다. 요구될 경우, 1개 이상의 용융-교정 대조군을 포함시켜 전체 용융 분석 온도 윈도우에 걸쳐 정밀한 온도 교정을 보증할 수 있다. 그러나, 용융 대조군을 사용하여 DMA를 수행하는 경우, 용융 피크를 측정하는 표준 방법을 사용한 임의의 필수적인 온도 교정의 범위를 정확하게 측정하는 것은 어려울 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위하여, DMA에서 사용하기 위한 용융-교정 대조군을 설계하여 DMA 분석에 사용된 측정 온도를 괄호안에 제시하는(5℃내에서 >90% 용융됨) 협소한 온도 범위에 걸쳐 용융시킬 수 있다. DMA는 표적-특이적인 프로브에 대해 Tm에서 형광성을 측정하지 않으므로, DMA 측정 온도(T1, T2, T3 및 T4)의 협소한 범위내 용융 교정기의 Tm을 갖는 것은 시스템 열(system thermal)에서 변동성에 대해 최대로 민감할 것이다. 용융 교정기에 대해 유래된 참고 값과 비교한 형광성 강도 값에 있어서의 변동성은 열 변동성의 정도를 측정할 것이다. 열 변동성이 예정된 내성 사양내에 있는 경우, 용융 분석은 완전한 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 용융 교정기 값이 열 성능에서 변동성을 시사하는 경우, 용융 분석은 적절히 조절된 온도에서 반복될 수 있거나 적절한 교정 인자가 적용될 수 있다. 온도 변동성을 가장 정밀하게 정량화하기 위하여, 특수한 채널에 대해 측정된 최소 및 최대 형광성 강도가 이러한 채널에 대해 예측된 강도(참고 경우)와 매치하도록 하는 것이 중요하다. 이러한 용융-교정 대조군은 시스템 유지 및 교정의 일부로서 독립적으로 평가될 수 있거나, 이들은 온-보드(on board) 대조군으로서 포함될 수 있으며 채널내 또는 채널에 걸쳐 용융물의 목적한 수가 보존되는 경우 모든 샘플과 함께 가공될 수 있다.
개개의 실험 조건은 결과가 예측으로부터 벗어나도록 할 수 있으므로 샘플 측정과 함께 동시에 용융-교정 대조군을 측정하는 것이 최적이다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 및 염의 농도는 극도의 경우에 용융 온도는 10 내지 20℃와 같이 많이 변경시킬 수 있다. 하나의 방법에서, 이의 예측된 Tm이 공지된 용융-교정 대조군이 포함된다. 시험하는 표적과의 혼란을 피하기 위하여, 용융-교정 대조군을 선택함으로써 조명 채널 및 방출 파장 영역은 표적의 방출 파장과 일치하지 않을 것이다. 예로서, 84.1℃의 예측된 용융 온도를 지닌 FAM-표지된 대조군은 시험되는 분석물과 함께 포함될 수 있거나, 이는 별도로 측정될 수 있다. 허용가능한 범위, 예를 들면, +/- 2.5℃, 또는 81.6 내지 86.6℃가 확인될 수 있다. 이후에, 미가공 용융 데이타(예컨대, 0.5℃ 증분으로 55 내지 95℃에서의 측정을 취함으로써 수득됨)는 형광성 대 온도의 음성 미분계수의 플롯에서 83.1℃의 설정-점 온도에서 용융 피크를 나타내는 경우, 필요한 설정-점 온도를 이동시키는데 요구되는, 온도 교정, ΔTcorr를 계산할 수 있다. 예에서, 설정-점 온도로부터 예측된 온도를 감하는 것은 ΔTcorr = 83.1-84.1℃ = -1.0℃의 온도 교정을 수득한다. -1.0℃의 온도 교정에 의한 미래의 설정-점 온도를 조절함으로써, 예측된 용융은 예측된 온도에서 발생하여야 한다. 대조군이 반복되었지만 84.1℃에서의 본 발명자의 데이타 점의 경우, 온도 교정에 대해 이러한 시간을 계산하는 경우, 본 발명의 계산된 온도 교정은 본 발명자의 설정된 점의 경우, 본 발명자가 84.1℃ + ΔTcorr = 84.1-1.0 = 83.1℃를 사용하여야 함을 나타내며, 이는 이후 본 발명자의 목적한 84.1℃ 데이타 점에서 용융 피크를 수득하여야 한다.
필요한 경우, 하나 이상의 용융-교정 대조군을 포함시켜 적절한 온도 교정 뿐만 아니라 예측된 용융 피크 사이에서 적절한 온도 차이를 보증할 수 있다. 예를 들면, 제1의 용융-교정 대조군은 예측된 용융 온도가 84.1℃인 FAM-표지된 대조군 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 제2의 용융-교정 대조군은 예측된 용융 온도가 71.0℃인 AP-593-표지된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명자는 13.1 C의 온도 차이를 예측하므로, 관찰된 용융 피크 사이의 값으로부터 임의의 실질적인 편차는 시스템내 문제점, 예를 들면, 온도의 결함이 있거나 부적절한 경사도를 나타낼 수 있는데, 예를 들면, 느슨한 전선은 열-전기 가열/냉각 단위에 필수적인 것보다 더 적은 전류를 전달할 수 있으므로, 열을 거의 전달하지 않고 주어진 설정 점으로부터 예측된 것보다 더 낮은 온도를 전달할 수 있다.
열 교정을 위한 대안적인 방법은 잘-특성화된, 온도 민감성 형광성 염료의 사용에 의존한다. 이러한 용도를 위한 예시적인 염료는 로다민 및 AP662이다. 이러한 염료는 용융 분석 범위에 걸쳐 풍부한, 재생가능한 온도-의존성 형광성을 나타낸다. 예측된 염료 성능으로부터의 편차를 사용하여 시스템 열을 상응하게 조절한다.
동일한 투입 표적 농도의 경우에도, 실제 농도 측정은 다양한 이유, 예를 들면: 추출 및 정제 공정에서의 변동성; 작동 조건에서의 변동성; 올리고뉴클레오타이드의 농도 및/또는 염 농도에 있어서의 관찰된 용융 온도의 의존성; 장치 효율에서의 변동성으로 변할 수 있다. 이러한 이유로, 본 개시내용의 추가의 구현예는 최적의 비교 및 결과의 해석을 위해 측정된 투입 표적 값을 상쇄하거나 교정시키는 방법을 측정하기 위해 대조군을 포함시키고 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법은 샘플 처리의 다양한 전략에 포함된 핵산 대조군의 사용을 포함한다.
하나의 방법은 반응 혼합물 속에 재생가능한, 공지된 농도를 갖는 샘플 가공 대조군을 포함시킴으로써 샘플 제조 효율을 측정하는 단계를 포함한다. 대조군의 측정된 최종 농도를 공지된 투입물과 비교함으로써, 적절한 교정을 샘플에 대해 계산된 공지되지 않은 분석물의 농도에 적용할 수 있다. 이러한 교정은 대조군의 예측된 투입 값을 검정에서 수득된 측정된 값으로 나누어 승수 값을 수득함으로써 수득할 수 있다. 승수 값은 푸아송 교정후 각각의 분석물에 대해 수득된 초기 값에 적용하여, 환자 샘플 속의 각각의 분석물의 실제 농도물 보다 정밀하게 반영할 샘플 제조 효율 교정된 값을 수득할 수 있다. 샘플 가공 대조군은 샘플이 전형적으로 첨가되면서 동일한 단계에서 첨가될 수 있다. 이는 수동으로 첨가될 수 있거나 예를 들면, 카트릿지 내의 지정된 웰로부터 자동화 공정에 의해 기계적으로 첨가될 수 있다. 이는 액체 형태 또는 건조된 형태 또는 동결건조된 상태일 수 있다. 대안적으로, 목적한 샘플 유형에 대해 상대적으로 안정한 농도에 있는 것으로 예측된 내인성 핵산 대조군을 사용할 수 있다.
또한, 이러한 방법은 PCR 마스터 혼합물(샘플 가공 후) 속에 올리고뉴클레오타이드 표적 서열 및 상응하는 표적-특이적인 프로브를 포함하는 증폭 대조군을 첨가하여 공지된 농도의 대조군 표적에 대해 양성 및 음성 구획의 분포를 특성화하는 단계를 포함할 수 있다. 공지된 농도에서 대조군 표적을 첨가함으로써, 양성 및 음성 구획의 예측된 형광성 강도를 측정할 수 있고, 공지되지 않은 표적을 분류하기 위한 예비 역치를 설정하는데 사용할 수 있다. 또한, 예비 역치는 수동 역치화(threshokding) 또는 알고리즘-기반 방법을 사용하여 후속적으로 조절된 초기 분류 역치로서 사용될 수 있다. 임의의 경우에, 샘플 가공 대조군 또는 증폭 대조군을 설정하는 예시적으로 이상적인 농도는 1.59의 람다 값(구획당 예측된 카피)를 갖는 것일 수 있다. 이러한 값에서, 디지탈 PCR은 푸아송 분포의 고유한 변동성으로부터 최대로 단리될 수 있는 샘플 공정으로 인한 변동성을 의미하는 정량화에 있어서 최대의 정밀도를 달성한다(Majumdar et al., digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range 2 and Measurement Precision, PLOS One, 2015). 이러한 대조군은 단일의 형광성 채널내에서 또는 모든 형광성 채널에 걸쳐 단일 Tm에서 포함될 수 있다. 전자의 경우에, 교정 염료를 사용하는 데이타의 앞서 기술된 입증된 데이타 세트는 사용자가 단일의 형광성 채널 데이타를 다른 형광성 채널에 대해 외삽하여 추론하도록 할 것이다.
대안적으로, 공지되지 않은 표적에 대한 측정 온도 극단치에서 양성 및 음성 소적의 분포 및 이들의 강도는 결과의 최적의 해석을 위한 가치있는 정보를 생성할 수 있다. 예를 들면, 적어도 하나의 구획을 추정하는 것은 모든 표적에 대해 음성을 시험할 것이므로, 표적-음성 구획(들)의 형광성 강도를 내부 대조군으로서 사용할 수 있다. 표적-음성 구획(들)에 대한 평균 강도를 측정하여 참고 또는 과거 경우와 비교할 수 있다. 측정된 값과 과거의 값 사이의 차이는 작동 조건, 샘플 조성, 또는 장치 쟁점에서의 변화의 지표일 수 있다. 표적-양성 구획의 형광성 강도를 참고 또는 과거의 경우와 유사하게 비교하여 시스템 성능을 평가할 수 있다.
영상은 구획의 2차원 배열에 걸쳐 조명 또는 형광성 측정에 있어서 비-균일성으로 인하여 일부 정도의 변동성을 나타낼 수 있다. 이러한 변동성은 다수의 영상이 함께 스티칭(stitching)되어 단일 샘플에 대해 모든 구획의 전체 영상을 생성하는 경우 보다 큰 충격을 가질 것이다. 이러한 변동성을 교정하기 위한 하나의 방법에서, 구획화 후 그러나 핵산 증폭 전에 획득한 영상을 사용하여 증폭 후 획득된 영상을 표준화할 수 있다. 예비-증폭 영상에서 모든 구획에 걸쳐 평균 구획 강도를 계산하고 개개 구획에서 평균 강도로 나눈다. 수득되는 구획-특이적인 비를 사용하여 후속적으로 획득된 영상에 걸쳐 강도를 표준화함으로써 임의의 조명 또는 측정-유도된 비-균일성을 고려할 수 있다. 동일한 전략을 최종 기기장치 구현예에서 각각의 채널에 대해 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 포함된 프로브 예비-증폭의 고유한 형광성 신호에 의존하기 보다는, 수동적 참고 염료를 사용하여 형광성의 불-균일성에 대해 교정한다. 내부 참고 염료는 수동적 참고 염료가 기존의 실시간 또는 정량적 PCR 장치에서 사용되는 한 모든 형광성 측정을 위한 채널-애그노스틱(channel-agnostic) 강도 표준화 인자로서 사용할 수 있다. 또한, 소적 구현예에서, 프로브-기반 형광성 측정이 프로브 Tm에 의존하는 증폭 상태 및 온도와 관련하여 가변성일 것이므로 수동적 참고 염료를 사용하여 소적 확인을 보조할 수 있다.
다수의 샘플을 병렬로 가공하는 특정의 dPCR 시스템에서, 단일 샘플 웰을 보존하여 본원에 기술된 대조군의 유형을 포함시키는 것이 가능할 수 있다. 하나의 방법에서, 제US9039993호에 기술된 바와 같은 미세유동성 장치내 웰/구획을 형광성 표준화 및 열 교정을 위해 보존시킬 수 있다. 샘플 웰에 포함된 내부 대조군이 많을 수록, 이러한 웰은 모든 형광성 측정을 위한 채널-애고노스틱 강도 표준화 인자로서 사용될 수 있는 수동적 참고 염료를 함유할 수 있다. 하나 이상의 용융 교정기를 포함시켜 임의의 열 변동성을 계산할 수 있다. 이러한 또는 이들 용융 교정기의 측정된 피크는 교정기(들)의 공지된 용융 피크와 교정기(들)의 측정된 용융 피크 사이의 차이의 측정을 통한 열 교정에 사용될 수 있다. 온도 축에 따른 단순한 해독은 작은 일자별 변동성(day-to-day variability)을 계산할 수 있다.
IV. 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에 잘 작용하도록 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내므로, 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음이 당해 분야의 기술자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 기술자는 본 개시내용의 측면에서, 많은 변화가 본 발명의 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 개시되고 동일하거나 유사한 결과를 여전히 수득하는 구체적인 구현예에서 이루어질 수 있음을 인식하여야 한다.
실시예 1 - 핵산 증폭 전 또는 후에 획득된 영상을 사용하여 구획 분류를 개선시키기 위해 영상을 표준화하는 방법
실시간 PCR에서, ROX와 같은 수동적 참고 염료를 사용한 웰-대-웰 표준화는 광학(Optics) 및 반응 용적에 있어서의 변동성으로 인하여 발생하는 변동성을 최소화시킨다. 유사한 표준화 계획은 배열-기반 디지탈 PCR에 유리할 수 있지만, 단일의 수동적 참고 염료에 부여된 채널의 혼입은 궁극적으로 시스템의 멀티플렉스 능력을 제한할 수 있다. 기술된 구현예에서, 선택된 형광성 채널에서 완전히 변성된 프로브는 각각의 구획에서 내부 수동적 참고 염료로서 제공할 수 있다. 하나의 예에서, 영상은 모든 프로브가 변성되는 온도(예컨대 95℃)에서 획득되므로 최대의 형광성을 나타낸다. 이러한 95℃ 영상은 구획화 후 그러나 핵산 증폭 전 또는 핵산 증폭 수 용융 분석의 과정 동안 획득될 수 있다. 구획은 영상내에서 확인되며, 구획당 평균 픽셀 강도가 측정된다. 다양한 온도에서 용융 시리즈에서 획득된 모든 구획 평균 강도를 상응하는 95℃ 구획 평균 강도로 표준화하여 용융 분석 동안 측정된 강도로부터 95℃ 평균 강도를 감하여 구획-특이적인 변동을 계산할 수 있다.
도 8은 단일 프로브를 함유하는 구획으로부터 생성된 별개의 용융 데이타에 대한 이러한 표준화의 효과를 나타낸다. 도 8a는 T1에서 취한 미가공 데이타 영상을 나타내며 도 8b는 95℃ 영상을 사용하는 표준화된 동일한 데이타를 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, 대비(contrast)는 표준화된 영상에서 양성 소적과 음성 소적 사이에서 향상된다. 도 8c 및 도 8d에 나타낸 상응하는 강도 막대그래프는 표준화가 2개의 예측된 집단(어두운 소적과 관련된 픽셀 및 밝은 소적과 관련된 픽셀)으로의 군집화를 야기한다. 표준화 전에, 3개의 명백한 픽셀이 관찰된다(도 8c). 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 하나의 집단이 어두운 소적과 관련되며 2개의 집단이 조명의 비-균일성 및 형광성 수집으로 인하여 밝이에 있어서 변하는 밝은 소적과 관련되는 것으로 가정한다. 표준화의 양성 효과는 또한 도 8e 및 8f에 나타낸 1D 진폭 플롯에서 추가로 입증된다. 패널 E에서, 소적의 유의적인 수가 2개의 식별가능한 집단 사이에 놓이므로, 소적을 양성 또는 음성으로서의 분류하기에 적합한 역치를 측정하는 것이 어려울 수 있다. 그러나 표준화 후(도 8f), 많은 보다 적은 소적은 2개의 식별가능한 집단 사이에 속한다.
실시예 2 - 구획화 후 그러나 핵산 증폭 전에 획득된 영상을 사용하는 음성 및 양성 구획에 대한 예비 컷오프를 확립하는 방법
음성 및 양성 구획의 정확한 분류는 디지탈 PCR을 사용하는 정밀한 정량화에 필요하다. 기존의 dPCR 방법은 표적 핵산(들)에 대해 양성 또는 음성으로서 구획을 분류하기 위해 종점 영상화 단독에 의존한다. 본 방법에서, 구획 배열의 영상은 구획화 후 그러나 핵산 증폭 전에 획득된다(도 9a). 이러한 단계에서, 각각의 구획은 표적 특이적인 프로브(들)로부터 기원하는 동일한 균일한 형광성 강도를 가져야 한다. 그러나, 실제로, 상이한 구획의 평균 강도 값은 일부 변화 또는 표준 편차를 를 지닌 평균 또는 예측된 값에 대한 분포를 따를 것이다. 구획을 위한 평균 강도 값은 앞서 기술된 바와 같이 계산된다.
구획의 전체 집단에 걸친 이러한 평균 강도 값을 함께 그룹화하고 평균(예측된 값) 및 표준 편차(변화의 제곱근)을 계산한다(도 9c; 회색 바아). 이러한 분포의 현재 정의된 표준 편차를 사용하여, 양성 또는 음성으로서 구획을 분류하기 위한 역치는 증폭전 구획 집단의 평균 강도 값의 3개 미만(도 9c 및 9d에서 회색선)의 표준 편차를 모든 증폭전 구획에 걸쳐 평균 강도 값에서 설정한다. 이러한 초기 역치 설정은 증폭 후 반복적인 역치 개선을 위한 기준을 형성할 수 있다. 도 9b는 증폭 후 소적의 영상을 나타낸다. 밝은 소적은 표적에 대해 음성이며 흐릿한 소적은 표적에 대해 양성이다. 강도 분포(도 9c) 및 강도 현상 플롯(도 9d)의 오버레이(overlay)에서, 음성 집단내 고도의 오버랩은 이러한 방식의 초기 역치의 실행가능성을 입증한다. 추가로, 분류 알고리즘, 예를 들면, k-수단 군집화를 사용하여 양성 및 음성 구획을 확인하는 구현예에서, 이러한 영상을 통해 획득한 데이타는 분류 알고리즘을 위한 연습 세트로서 사용될 수 있다. 이러한 예비-분류 작업을 위한 순서에서, 증폭 전 및 증폭 후 영상은 동일한 온도에서 획득되어야 한다. 프로브 신호가 표적 증폭이 진행되면서 감소하는 검출 계획에서, 증폭 후 역치를 초과하는 강도 값을 지닌 구획은 음성 소적으로 분류됨에 주목한다. 증폭 후 역치 이하인 강도 값을 지닌 구획은 양성 구획으로서 분류된다. 표적의 존재하에서 퀀칭되지 않은 DNA-인터컬레이팅 염료 또는 프로브를 사용하는 신호화 계획에서, 형광성 강도는 표적의 증폭이 진행됨에 따라 증가하므로, 역치 이하의 구획은 음성으로 분류되는 반면 역치 이상의 구획은 양성으로 분류된다.
실시예 3 - 프로브의 형광성 강도에 있어서 온도-의존성 및 광 용량-의존성 변화에 대해 증폭 후 영상을 교정하는 방법
핵산 증폭 후, 특이적인 표적을 확인하기 위한 용융 분석을 55℃ 내지 95℃의 온도 범위에 걸쳐 수행한다. 일부 형광성 염료의 형광성 강도는 이러한 온도 범위내에서 가변적일 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 일부 염료, 예를 들어, FAM(플루오르세인의 유도체)은 반복된 광 노출, 예를 들면, 다수 영상 획득 동안 지속된 것의 결과로서 광표백을 나타내는 것으로 알려져 있다(Song et al., Photobleaching Kinetics of Fluorescein in Quantitative Fluorescence Microscopy, Biophysical Journal, 68, 2588-2600 (1995)).
이러한 변동성을 교정하기 위하여, 영상 시리즈를 55℃ 내지 95℃ 사이의 범위의 온도에서 구획화 후 그러나 핵산 증폭 전에 획득할 수 있다. 바람직하게는, 최소 3개의 영상을 용융 분석에 사용된 각각의 파장에 대한 전체 용융 프로파일 온도 범위에 걸쳐 동등하게 이격된 온도 간격에서 획득한다. 개개 구획내 평균 강도는 앞서 기술된 방법들 중 하나(전체 구획 대 ROI) 및 영상이 획득된 온도에 대해 그래프의 y-축에서의 플롯을 사용하여 측정한다. 데이타 점의 이러한 수집은 최소 제곱 회귀 분석을 사용하여 온도 및 광 둘 다에 대한 프로브의 민감성에 대한 선행 지식을 기반으로 하는 적절한 모델(선형 또는 지수)과 맞춘다. 광 민감성이 우세하고 광표백이 강도 손실의 유의적인 공급원인 프로브의 경우에, 지수 모델 또는 선형 및 대수의 혼합 모델은 데이타에 가장 잘 맞을 수 있다. 온도-의존성이 우세하고 광표백이 최소인 프로브의 경우에, 선형 모델은 데이타에 가장 잘 맞을 수 있다. 이러한 맞춤의 장점은 측정의 회귀의 표준 오차 또는 측정 계수, R2에 의해 측정된다. 이러한 맞춤으로부터 수득된 중요한 매트릭스는 기울기, 시간 상수 및/또는 y-절편을 포함할 수 있다. 매트릭스의 독특한 세트는 존재하는 각각의 형광성 채널에 대해 측정된다.
핵산 증폭에 이어서, 일련의 용융 영상을 획득한다. 용융 분석(즉, 프로브-특이적인 표적의 존재를 측정하기 위한 용융 프로파일의 평가) 전에, 전체 용융 프로파일 온도 범위에 걸쳐 각각의 개개 구획에 대해 측정된 평균 강도를 각각의 형광성 채널에 대해 특이적인 임의의 온도- 및 광 용량-의존성 손실에 대해 교정한다. 구체적으로, 형광성 신호의 선형 또는 지수 감소는 증폭 전 데이타로부터 수득된 맞춤에서 증폭 후 용융 프로파일로부터의 맞춤을 감하여 일련의 증폭 후 용융 영상에 대해 교정함으로써 교정된 용융 프로파일을 생성한다. 프로브-특이적인 표적의 존재를 확인하고 정량화하기 위한 추가의 분석을 이제 교정된 용융 프로파일을 사용하여 수행한다. 대안적으로, 온도- 및 광 용량-의존성 형광성 손실에 대한 교정을 개개 칸막이 또는 소적에서 평균 강도의 계산 전 전체 영상에 대해 픽셀별로 적용한다.
다른 대안적 방법에서, 기존의 데이타세트를 사용하여 온도- 및 광-용량 의존성 형광성 손실에 대해 교정한다. 앞서 언급한 바와 같이, 프로브 강도는 선형 또는 비-선형 양식으로, 또는 심지어 선형 및 비선형 관계의 조합을 통해, 용융 측정의 과정에서 걸쳐 변할 수 있다. 예를 들면, Song et al. (Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy, 1995. Biophysical Journal, 68(6), 2588-2600. doi:10.1016/s0006-3495(95)80442-x)에서, 플루오레세인 강도는 산소가 불량한 조건에서 이중-지수 광표백 거동을 갖는 것으로 밝혀졌지만, 단일-지수 거동은 산소가 풍부한 환경에서 관찰되었다. 임의의 온도 의존성 및/또는 광표백에 대한 강도 기울기를 교정하기 위해, 대조군 샘플로부터의 데이타를 사용하며, 여기서 가장 적절한 곡선을 대조군 데이타(예를 들면, 이중-지수 곡선 맞춤)에 맞추고, 실험 데이타로부터 맞춰진 곡선을 감하거나 대조군 값에 대해 표준화한다. 대안적으로, 충분한 음성-결과 구획이 증폭 후 존재하는 경우, 이들은 대조군으로서 작용할 수 있으며 곡선-맞춘 목적을 위해 온도- 및 광-의존성 형광성 변화에 기인한 기울기 변화에 대해 조절할 수 있다.
도 10은 음성(표적-유리된) 대조군 구획으로부터 측정된 형광성 강도를 사용하여 시험 샘플에서 온도-의존성 및/또는 광-용량-의존성 형광성 변화에 대해 보정/교정할 수 있는 방법을 나타낸다. 도 10은 3개의 표적-특이적인 프로브를 지닌 샘플에 대해 수집된 미가공 데이타로부터 생성된 용융 곡선을 나타내며, 상기 프로브 각각은 명백한 용융 온도(표적) 및 음성 구획(대조군), 및 샘플(교정된 표적) 및 음성 대조군(교정된 대조군)에 대해 교정된 용융 곡선을 갖는다. 대조군으로부터의 교정되지 않은(미가공) 데이타로부터 형광성 강도에 있어서 선형 감소는 음성 대조군에서 온도가 증가하면서 발생함이 명확하다. 예측된 형광성 강도보다 더 낮은 것은 또한 양성 샘플 용융 프로파일의 마지막 10°에 걸쳐 인식가능하며, 여기서 RFU에 있어서 예측된 증가는 검출되지 않는다. 교정되지 않은 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 교정되지 않은 별개의 샘플링은 제3 데이타 점과 제4 데이타 점 사이에 측정가능한 형광성 강도가 존재하지 않으므로 표적 3에 대해 음성 콜(negative call)을 야기할 수 있다(그래프 상에 큰 점으로 강조함). 각각의 용융 현상에 대한 강도의 예측된 단계식 증가는 형광성 표백의 결과로서 강도에 있어서 온도-의존성 감소에 의해 마스킹(masking)된다. 그러나, 선형 감소 교정(및 본원에서 비교시 검토의 목적을 위해 Y-축에 따른 해석)의 적용 후, 모든 3개의 프로브에 대한 별개의 용융 현상은 용이하게 검출가능하다.
실시예 4 - 초기 구획 분류를 위한 총 형광성 변화에 대한 값의 전체 범위를 측정하는 방법.
증폭 후, 영상을 용융 분석 온도 프로파일에서 최저 온도 (T1)에서 우선 획득한다. 형광성에 있어서 온도- 및 광-용량 의존성 감소에 대한 교정은 실시예 3에 기술된 방법 중 하나를 사용하여 모든 영상에 대해 적용시켜야 한다. 이후에, T1 영상에서 평균 또는 통합된 구획 강도는 열 순환 전 또는 후에 수득된 T4에서의 영상 또는 실시예 1에 기술된 바와 같이 열 순환 전에 T1에서 수득된 영상에 의해 표준화한다. 정적 배열 dPCR의 경우에, 교정 및 표준화를 전체 영상에 걸쳐 픽셀별 기준으로 또는 개개 구획내 평균 또는 통합된 강도에 적용할 수 있다. 소적 dPCR의 경우에, 소적이 영상 획득 동안 이동하는 경우, 소적별 기준으로 구획 형광성의 비를 측정하기 전에 2개의 영상으로부터 소적을 먼저 확인하고 교정하는 것이 필수적일 수 있다. 다음의 분석은 T1 영상의 교정 및 표준화를 통해 측정된 평균 강도를 사용하거나 수학식 5에 입증된 바와 같이 교정되고 표준화된 T1 영상과 T4 영상 사이의 차이를 사용함으로써 수행할 수 있다.
[수학식 5]
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교정되고 표준화된 T1 영상 또는 계산된 ΔF 값의 구획 특이적인, 평균 강도의 막대그래프 또는 1D 진폭 플롯은 구획의 초기 분류를 0, 1, 2 또는 3개의 독특한 표적을 함유하는 것으로서 알려준다. 표적 분자를 함유하지 않는 음성 구획은 형광성 강도에 있어서의 변화를 거의 나타내지 않을 것이다(즉, IAVG=1 또는 ΔF=0). 모든 3개의 표적을 함유하는 구획은 형광성 강도에 있어서 최대 변화를 나타낼 것이다. 1 또는 2개의 표적을 함유하는 구획은 형광성 강도에 있어서 중간 변화를 나타낼 것이고 2개의 표적 구획은 단일 표적을 함유하는 구획보다 형광성 강도에 있어서 보다 큰 변화를 나타낼 것이다. 단일 채널에서 3-플렉스 검정(3-plex assay)에 있어 초기 소적 분류를 입증하는 1D 진폭 플롯의 예는 도 13b에 나타낸다.
모든 프로브가 3-플렉스 반응(three-plex reaction)에 동일한 농도로 포함된다고 가정할 때, 해리 영상으로부터 구획 강도의 분포는 0 또는 1의 강도 주변에 집중된다, ΔRFU최대, (1/3)*ΔRFU최대, (2/3)*ΔRFU최대, 여기서 ΔRFU는 구체적으로 ΔRFU95-56을 지칭한다. 잘 특성화된 검정에서 주어진 프로브의 경우, ΔRFU최대는 고정 값이여야 하고, 초기 역치는 참고 데이타 세트를 기반으로 구획을 분류하기 위해 설정될 수 있다. 이러한 역치는 이후 수동으로 또는 알고리즘-기반 수단, 예를 들면, k-수단 군집화를 사용하여 추가로 개선시킬 수 있다. 예를 들면, k-수단 군집화를 사용하는 definetherain으로서 지칭된 방법이 Bio-Rad systems를 사용하여 수득된 디지탈 소적 데이타에 적용하기 위한 웹 인터페이스(definetherain.org.uk)를 통해 제3자에 의해 이용가능하게 되었다. 구획 분류에 적용될 수 있는 다양한 추가의 분류 또는 클러스터 분석 알고리즘이 존재한다.
표적을 함유하지 않거나 모두 3개의 표적을 함유하는 구획을 앞서 기술된 공정을 사용하여 분류할 수 있다. 이후에, 이러한 구획을 단순화를 위해 추가의 분석(용융 획득 또는 데이타 분석)으로부터 배제시킬 수 있다. 추가의 분석으로부터 이러한 구획을 제거하는 것은 영상 획득 및 데이타 분석을 위해 요구되는 시간을 추가로 감소시키기 위해 획득될 필요가 있는 남성 분석 영상의 수를 감소시킨다. 그러나, 3개의 표적-특이적인 프로브가 단일 채널에서 검출가능하고, 구획이 단지 하나의 표적을 함유하는 경우, 용융 분석을 사용하여 구획내 특수 표적의 존재를 구별할 수 있다.
초기 구획 분류를 수행하기 위해 기술된 방법을 또한 표준화를 위한 수동적 참고 염료의 사용에 적용할 수 있다. 수학식 1에서 계산된 ΔF 값은 Rn 및 ΔRn을 실시간 또는 정량적 실시간 PCR에 대해 계산하는 방식으로 많은 수동적 참고 염료 신호로 표준화한다. Rn은 측정된 형광성 및 수동적 참고 염료 형광성의 비인 반면 △Rn은 기준선 교정 후 Rn이다. 수동적 참고 염료 만이 단일 채널에서 이러한 손실을 계산하며 채널에 걸친 손실은 균일한 것으로 예측되지 않으므로 수동적 참고 염료의 사용은 용융 프로파일 생성의 과정에 걸쳐 온도- 및 광 용량-의존적 형광성 강도 손실에 대해 계산할 필요성을 제거하지 않는다. 유사하게, 상이한 형광단의 온도- 및 광 용량-의존성에 있어서 변동성이 있을 수 있다.
실시예 5 - 단일 플렉스 연속 용융 분석 대 별개의 용융 분석
싱글플렉스 연속 분석
싱글플렉스 PCR을 본원에서 표적 B로서 지칭된 표적에서 수행하고 74℃의 예측된 Tm을 갖는 미국 특허원 제14/822,288호에 기술된 바와 같은 절단가능한 프로브를 사용하여 검출하였다. PCR 샘플을 다음을 함유하는 완충액 속에서 제조하였다: 10mM 비스-트리스 프로판(pH 9.1), 0.3mg/mL BSA, 100μM dNTPs, 90μM DTT, 1μM Dabcyl-diGTP, 10mM 트리스 염기, 2.5mM MgCl2, 및 50mM KCl. 반응물에 포함된 효소는 4X에서의 TiTaq(Clontech) 및 16 mU/uL에서의 Hot Start RNase H2(Takara). 전방 프라이머(forward primer) B(표적 B에 대해) (5' GCAAGATACCATTTATCAATGAAG 3'; 서열 번호: 1)는 480nM의 농도에서 포함시켰고, 역방 프라이머(reverse primer) B(5' GGTGTCAATTTTCTTATATCATAAT 3'; 서열 번호: 2)는 120nM의 농도에서 포함되었으며 프로브 B(5' /56-HEX//iMe-isodC/TTCTCTTCTCTTTCATTCACATAACGCCAAA/iSpC3/AAACCCGTTATGTrCCTCCAGTTCCCATATTTG/3SpC3/3'; 서열 번호: 3)는 300nM의 농도에서 포함시켰다. 울트라머(Ultramer) B(5' ATGACTAAGCAAGATACCATTTATCAATGAAGAAGAGTTTATTGTAGAGAAAATAAGAGTAATGTTTGTCCAACATTAACTGCAAATATGGGAACTGGAGGACATAACGTTCCATTAATAAAGGATAATTATGATATAAGAAAATTGACACCAGAAGAATGTGTGGCATTTCAAGGTTTTCCTTCAGAATTTCAATTC 3'; 서열 번호: 4)는 907개 카피/uL의 예측된 농도에서 포함시켰다. 주형-유리된 대조군 반응을 포함시켜 검정이 예측된 바와 같이 수행되도록 보증하였지만, 데이타는 여기서 포함시키지 않는다. 샘플을 QuantStudio 3D(QS3D) 로더(loader) 및 v2 디지탈 PCR 칩(chip)(칩당 14.5μL)을 사용하여 다수의 구획으로 구획화하고 연속 용융 분석을 위하여 제조업자의 설명서에 따라 밀봉하였다.
구획화된 반응물을 ProFlex 열 순환기 상에서 11°경사(QS3D 매뉴얼에 따라)로 종점까지 다음의 열 순환 프로토콜을 사용하여 열 순환시켰다: 96℃에서 10분 동안, 57℃에서 2분 동안 45 주기 및 98℃에서 30초 동안, 및 최종적으로 57℃에서 5분 유지. 열 순환에 이어서, 용융 분석을 열전기 냉각기(TEC) 및 영상 장치로 이루어진 LabView 조절된 통상의 용융 판독기(LabView controlled custom melt reader)를 사용하여 수행하였다. 연속 용융 분석을 위해, 칩을 60℃로부터 90℃까지 1℃의 증분으로 가열하고 영상을 각각의 온도에서 HEX용으로 적절한 여기(511/55nM) 및 방출 필터링(549/15)을 사용하여 획득하였다. 영상을 Matlab에서 통상의 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 호프 변환(Hough transform)을 기반으로 한 빌트인 서클 파인딩 알고리즘(built-in circle finding algorithm)을 사용하여 개개 구획을 확인하고 평균 강도 값을 용융 프로파일(퍼(per) 영상 기준 상)에 걸쳐 측정하였다. 싱글플렉스 검정에서, 프로브의 자가-어닐링 온도에서 취한 종점 영상은 구획을 표적에 대해 양성 또는 음성으로 분류하기에 충분하다. 도 11은 프로브 어닐링 온도(B)에서 구획당 평균 강도의 플롯을 따라 용융 분석(A)로부터의 미가공 형광성 데이타를 나타낸다. 구획을 주형에 대해 양성 또는 음성으로의 분류 및 후속적인 계산을 하기 수학식 1에 적용하여 주형 카피/구획의 평균 수를 측정하고, 따라서 반응물에 존재하는 주형의 농도를 측정하였다. 이러한 분류는 수동으로 또는 분류 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. k-수단 분류는 예측된 907개 카피/μL와 비교하여 1,100개 카피/μL의 측정을 생성한다. 수동 분류는 고려할만한 "레인(rain)"의 존재로 인하여 사용자에 따라 가변적인 결과를 수득하는 것으로 예측된다. 개개 구획 응용 프로파일을 95℃에서 측정된 평균 구획 강도로 표준화하는 것은 레인을 감소시키며 양성 및 음성 소적의 수동 분류를 단순화시킨다(도 11의 C 및 D). 하기한 추가의 교정의 영향은 실험에 사용된 형광성 염료가 이러한 감소를 나타내는지의 여부에 의존할 것이나, 추가의 교정을 적용하여 용융 프로파일에 걸쳐 온도- 또는 광 용량-의존성 형광성 감소를 계산할 수 있다(도 11 E 및 F). 용융 프로파일의 미분계수를 또한 사용하여 주형 존재를 정량화할 수 있다. 표준화된 용융 곡선의 역 미분계수를 계산하고 강도를 용융 피크에 걸쳐 통합시킨다. 구획당 통합된 구획 강도는 도 11 G 및 H에 나타낸다. 앞서와 같이, 수동 또는 알고리즘-기반한 분류를 적용하여 반응물 속에 존재하는 주형의 수를 측정할 수 있다. 싱글플렉스 경우에, k-수단 분류를 사용하는 주형의 정량화는 용융 대 종점 분석에 대해 동일하며 상기 논의된 교정 인자의 적용은 907개 카피/μL의 예측된 값에 보다 근접한 값(1,038개 카피/μL)을 수득하는 것으로 여겨진다. 멀티플렉스 검정에서, 종점 영상은 주어진 구획(0, 1, 2, 또는 3) 속에 존재하는 독특한 표적의 수를 측정하기에 단지 충분할 것이지만, 용융 분석은 어떠한 특이적인 표적이 존재하는지를 확인하기에 필수적일 것이다.
싱글플렉스 별개의 용융 분석
샘플 반응물을 제조하고, 디지탈화하고 연속 용융 싱글플렉스 PCR에 대해 앞서 기술한 바와 같이 열 순환시켰다. 용융 영상을 프로브에 대해 예측된 Tm보다 낮은 온도(T1 = 67℃) 및 프로브에 대해 예측된 Tm보다 더 높은 온도(T2 = 78℃)에서 획득하고, 각각의 구획의 평균 강도를 각각의 온도에서 측정하였다(도 12a). 영상을 95℃에서 획득한 영상에 대해 표준화하고(도 12c) 및 T2/T1의 비를 측정하였다(도 b). 구획을 k-수단으로 분류하였으며, 표적 농도는 1,050개 카피/μL로 측정되었다.
이들 결과의 비교로부터 별개의 용융 분석이 연속 용융 분석을 충분히 대체함이 명백하다. 전자의 경우에, 1,050개의 카피/μL의 투입 카피 농도가 1,038개의 카피/μL와 비교하여 계산되었으며, 별개의 용융 분석의 경우, 차이는 단지 1.2%이었다.
실시예 6 - 멀티플렉스 연속 대 별개의 용융 분석
멀티플렉스 연속 용융 분석
연속 용융 분석을 사용하여 샘플 속의 다수의 표적의 존재를 측정하였다. 각각 63, 74 및 85℃의 Tm을 갖는 상응하는 프로브를 지닌, 3개의 표적(A, B 및 C)을 각각의 반응물에 포함시켰다. 샘플 및 증폭 완충액을 상술한 바와 같이 제조하였다. 표적 A 및 C에 대해 전방 프라이머 AF 및 CF(5' GTGGAGGATGACACTTTTCG 3'; 서열 번호: 5, 5' ATTGAATTGAGAGAACTGTTAGATA 3'; 서열 번호: 6), 역방 프라이머 AR 및 CR(5' ATTCCTTAGGTACCGTCAGA 3'; 서열 번호: 7, 5' CAACAAAGTTAAAGCTAGTGTTTAG 3'; 서열 번호: 8) 및 프로브 AP 및 CP(5' /56-HEX//iMe-isodC/ATATATATATATATAAGAATTCTGCCAAAA/iSpC3/AAAACCCAGAATTCTTrCCCTAAGAAAAGGAGTTTACG/3SpC3/ 3'; 서열 번호: 9, 5' /56-HEX//iMe-isodC/CCTCCCCTCCCCTCCCCTTCACCATCCAAA/iSpC3/AAACCATGGTGArUCAATCCTTAACACTGCTTT/3SpC3/ 3'; 서열 번호: 10) 각각을 전술된 프라이머와 함께 표적 B에 대해 및 표적 B용 프로브에 대해 기술된 동일한 농도에서 포함시켰다. 유사하게, 2개의 추가의 주형(A 및 C)을 포함시켰다(5' CCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACACTTTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTCTTAGGGAAGAATTCTGACGGTACCTAAGGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGC 3'; 서열 번호: 11, 5' ATGCTAATTACAAAAACAGGATTGAATTGAGAGAACTGTTAGATAAAAACCTGTTTAAAGCAGTGTTAAGGATTGATCACCATCCCAATGAAGATGATCTAAACACTAGCTTTAACTTTGTTGAAGAAAGCTATGTAGCTTGT 3'; 서열 번호: 12). 표적 A는 770 개의 카피/μL, 표적 B는 453 개의 카피/μL에서 및 표적 C는 775 개의 카피/μL에서 포함시켰다. 샘플을 전술한 바와 같이 구획화하고 열 순환시키고 용융시켰다. 영상을 동일한 통상의 소프트웨어를 사용하여 분석함으로써 용융 온도의 전체 범위에 걸쳐 구획내 평균 신호 강도를 측정하였다. 도 13의 A,C,E 및 G는 미가공 데이타(A), 95℃ 표준화된 데이타, (C) 온도 및 형광성 감소-교정된 데이타(E) 및 용융 유도체(G)에 대한 용융 곡선을 나타낸다.
프로브 어닐링 온도에서 획득한 용융 데이타를 기반으로 한 구획의 분류는 0개의 표적, 1개의-표적 점유된, 2개의 표적-점유된 및 3개의 표적-점유된 구획에 상응하는 4개의 병백한 군집을 확인시켰다(도 13b). 그러나, 용융 분석은 1- 및 2개-표적 점유된 구획의 특이적인 표적 점유를 측정하는데 요구된다. 샘플 속에 존재하는 표적 A의 양을 측정하기 위하여, 제1의 용융 프로파일의 적분을 계산하고 분류를 각각의 구획에 대해 수행하였다(도 13d). 동일한 공정을 2개의 나머지 주형에서 수행하였다(도 13f 및 13h). 이러한 분석을 기반으로 하여, 표적 A의 측정된 농도는 692 개의 카피/μL이었고, 표적 B는 537 개의 카피/μL이었으며 표적 C는 392 개의 카피/μL이었다.
멀티플렉스 별개의 용융 분석
샘플 반응물을 전술한 바와 같이 제조하고, 디지탈화하며 열 순환시켰다. 용융 영상은 4개의 온도, T1 = 57℃, T2 = 69℃, T3 = 81℃, T4 = 93℃에서 획득하였고, 각각의 분획의 평균 강도를 4개의 영상에 대해 측정하고(도 14a), 95℃로 표준화하고(도 14c), 온도- 및 광-용량 의존성에 대해 교정하였다(도 14e). 또한 구획을 0, 1, 2 또는 모든 3개의 표적을 함유하는 것으로 분류하는데 사용될 수 있는 57℃ 영상에서 모든 구획에 대한 1D 진폭 플롯을 나타낸다(도 14b). 주형 A의 농도를 측정하기 위하여, T2/T1의 비를 측정하였다(도 14d). 구획을 k-수단을 사용하여 분류하고, 표적 농도를 수학식 1을 사용하여 측정하였다. 주형 B의 경우, T3/T2의 비를 측정하였으며, 구획은 k-수단을 사용하여 분류하고 수학식 1을 사용하였다(도 14f). 최종적으로, 주형 C의 경우, T4/T3의 비를 측정하였고, 구획은 k-수단을 사용하여 분류하고 주형 농도는 수학식 1을 사용하여 측정하였다(도 14g). 싱글플렉스 경우에 입증된 바와 같이, 멀티플렉스 반응에서 별개의 용융 분석은 연속 용융 분석에서 측정된 것과 실제로 동일한 추정된 농도를 생성하였다. 싱글플렉스 및 멀티플렉스 연속 대 별개의 용융 분석 둘 다의 계산된 표적 농도는 표 1에 나타낸다.
Figure pct00005
실시예 7- 절단가능한 프로브를 사용한 dPCR 작업흐름
본 실시예는 미국 특허원 일련번호 제14/823,288호에 기술된 바와 같은 예정된 용융 프로파일을 갖는 표적-특이적인 프로브를 사용하는 dPCR 분석을 위한 예시적인 작업흐름을 제공한다. 이러한 프로브는 프로브가 접하는 표적 핵산의 결과로서 듀플렉스 구조 내에 있는지의 여부, 또는 이들이 단일 가닥 구조인지의 여부를 기반으로 하는 구별가능한 신호를 나타낸다. 이러한 프로브의 경우, 프로브 내로 혼입된 퀀처가 분자내 듀플렉스가 이러한 온도에서 해리됨에 따라 형광단으로부터 분리되는 경우, 최대 형광성이 프로브에 커플링된 형광단의 결과로서 표적 핵산에 접하기 전, 또는 듀플렉스의 예정된 Tm 이상의 온도에서 표적 핵산에 접한 후 임의의 온도에서 측정할 수 있음에 주목한다. 이러한 작업흐름은 이러한 프로브에 필수적으로 제한되지 않으며, 유사한 표지화 계획을 갖는 다른 유형의 프로브에 적용될 수 있다.
dPCR 반응에 대한 별개의 용융 영상 분석은 용융 데이타의 정밀한 해석 및 음성 또는 양성 구획으로 구획의 최적의 분류를 보증하는 3개의 주요 단계를 필요로 한다: 1) 형광성의 온도 의존성의 결과로서 형광성 강도에 있어서의 변화에 대해 측정된 형광성 값을 교정하는 단계; 2) 시스템-의존성 형광 변동성(예컨대, 광학 비-균일성 또는 구획 용적 변화)에 대해 측정된 형광성 값을 표준화시키는 단계; 및 3) 프로브의 미리선택된 Tm보다 더 높은 및 더 낮은 미리 선택된 온도에서 형광성 강도 변화를 측정함으로써 표적의 존재를 측정하는 단계. 도 15는 이러한 단계를 수행하기 위한 예시적인 작업흐름을 제공한다.
구획화 후 제1의 단계에서, 영상을 열 순환 전 온도의 범위에서 획득하여 온도로 인한 형광성 강도에 있어서의 변화를 측정한다. 온도는 열 순환 후 DMA에 사용될 것에 상응하도록 선택할 수 있거나, 보다 큰 범위의 온도(예컨대, DMA에 사용된 최저 온도와 최고 온도 사이의 모든 도)를 선택하거나, 각각의 형광성 염료에 대해 미리 획득한 영상의 세트를 사용할 수 있다.
형광성의 온도 의존성에 대한 교정은 다음과 같은 다수의 방식으로 열 순환 후 획득한 영상에 대해 적용할 수 있다: i) 증폭 전 다양한 온도에서 구획에 대해 계산된 평균 강도 값에 대해 곡선을 맞추고 이러한 표현을 사용하여 관련된 온도에서 증폭 후 영상을 교정한다; ii) 증폭 전 DMA를 위해 사용한 온도에서 구획에 대해 영상을 획득하고 각각의 증폭 후 영상을 상응하는 증폭 전 영상을 사용하여 표준화한다; iii) 예시적인 데이타 세트로부터 선택된 온도에서 적절한 교정 표현을 유도시키고 이를 선택된 온도에서 증폭 후 취한 영상에 적용시킨다; 및 iv) 증폭 후 음성 구획과 관련된 강도 값을 사용하여 양성 구획에서 통합된 강도 값을 교정한다. 이러한 마지막 실시예에서, 단일 온도에서 획득된 영상에서 음성 구획 강도를 동일한 온도에서 획득한 증폭 전 영상으로부터 측정된 구획 강도로 대체한다. 바람직한 구현예에서, 당해 방법은 시스템-의존성 형광 변동성에 대한 영상을 동시에 표준화시키는 장점을 제공하므로 (ii)에 기술된 방법을 사용한다. 다른 구현예에서, 형광성의 온도 의존성에 대한 교정을 수행한 후, 증폭 전에 취한 임의의 영상을 사용하여 표준화한다. 유사하게, 증폭 후 95℃에서 획득하고 온도-의존성 형광성 변화에 대해 교정한 영상을 표준화에 사용할 수 있다. 또한 표준화를 위해 ROX와 같은 수동적 참고 염료에 대해 획득한 영상을 대체하는 것이 가능하다.
영상을 상술한 바와 같이 교정하고 표준화한 후, 각각의 프로브에 대해 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 및 더 높은 온도에서 획득한 영상으로부터의 형광 강도를 비교하여 표적이 존재하는지를 측정할 수 있다. 기술자는 강도의 비교가 상이한 온도에서 획득한 강도 측정시 비 또는 차이를 계산하는 단계를 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 기술자는 계산이 목적한 각각의 영역에 대해 검출된 강도 값, 또는 통합되거나 평균화된 강도를 사용하여 수행할 수 있음을 인지할 것이다. 그럼에도 불구하고, 시험한 각각의 표적에 대해, 결과는 각각의 구획에 대해, 2개 그룹, 즉, 양성 구획 또는 음성 구획 중 하나로 군집화된다. 멀티플렉스화된 시나리오에서, 일부 구획은 다수의 표적을 함유할 것이므로, 양성 구획의 멀티플렉스 범주가 예측될 수 있다. 이러한 군집화는 양성 및 음성 구획을 구별하기 위한 역치가 수동으로 또는 분류 알고리즘을 사용하여 측정되도록 하여야 한다. 특히, 다양한 온도에서 획득된 증폭 전 영상은 음성 구획의 예측된 강도(평균 및 표준 편차 포함) 주변의 통계학을 확립하는데 있어서 도움을 주어야 한다.
본원에 개시되고 청구된 방법 모두는 본 개시내용의 관점에서 과도한 실험없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 측면에서 기술되었지만, 변화가 본 발명의 개념, 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 본원에 기술된 방법에서 및 단계에서 또는 단계의 서열에서 변형이 적용될 수 있음이 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘 다 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있으면서 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당해 분야의 기술자에게 익숙한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 고려된다.
참고문헌
다음의 참고 문헌은, 이들이 예시적인 과정 또는 본원에 나타낸 것을 보충하는 다른 세부사항을 제공하는 정도로, 본원에 참고에 의해 구체적으로 포함된다.
Published application, WO 2015023616 (Yang et al.)
Velez, et al., Scientific Reports, 7 (2017): 42326,
SEQUENCE LISTING <110> LUMINEX CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DISCRETE MELT ANALYSIS <130> IP20203854US <140> Unknown <141> 2019-01-22 <150> US 62/620,298 <151> 2018-01-22 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 gcaagatacc atttatcaat gaag 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 ggtgtcaatt ttcttatatc ataat 25 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetice probe <400> 3 ttctcttctc tttcattcac ataacgccaa aaaacccgtt atgtcctcca gttcccatat 60 ttg 63 <210> 4 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ultramer <400> 4 atgactaagc aagataccat ttatcaatga agaagagttt attgtagaga aaataagagt 60 aatgtttgtc caacattaac tgcaaatatg ggaactggag gacataacgt tccattaata 120 aaggataatt atgatataag aaaattgaca ccagaagaat gtgtggcatt tcaaggtttt 180 ccttcagaat ttcaattc 198 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 gtggaggatg acacttttcg 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 attgaattga gagaactgtt agata 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 attccttagg taccgtcaga 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 caacaaagtt aaagctagtg tttag 25 <210> 9 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetice probe <400> 9 atatatatat atataagaat tctgccaaaa aaaacccaga attcttccct aagaaaagga 60 gtttacg 67 <210> 10 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetice probe <400> 10 cctcccctcc cctccccttc accatccaaa aaaccatggt gaucaatcct taacactgct 60 tt 62 <210> 11 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 ccctgacgca gcaacgccgc gtggaggatg acacttttcg gagcgtaaac tccttttctt 60 agggaagaat tctgacggta cctaaggaat aagcaccggc taactccgtg c 111 <210> 12 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 atgctaatta caaaaacagg attgaattga gagaactgtt agataaaaac ctgtttaaag 60 cagtgttaag gattgatcac catcccaatg aagatgatct aaacactagc tttaactttg 120 ttgaagaaag ctatgtagct tgt 143

Claims (100)

  1. 반응 혼합물 속의 표지된 듀플렉스 핵산(labeled duplex nucleic acid)에서 용융 분석을 수행하는 방법으로서, 표지된 듀플렉스 핵산은 예정된 Tm을 가지고, 이러한 방법은:
    (a) 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제1의 신호를 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm 보다 낮은 제1의 온도에서 측정하는 단계;
    (b) 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제2의 신호를 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm보다 더 높은 제2의 온도에서 측정하는 단계; 및
    (c) 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 변화가 존재하는 경우 제1의 신호와 제2의 신호를 비교함으로써 표지된 듀플렉스 핵산이 반응 혼합물 속의 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적-특이적인 프로브가 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화 시 절단되는 절단가능한 프로브인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호가 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm의 섭씨 2도 내에서 측정되지 않는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호가 표지된 듀플렉스 핵산의 예정된 Tm의 섭씨 5도 이내에서 측정되지 않는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이가 섭씨 2도보다 더 큰 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이가 섭씨 5도 보다 더 큰 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이가 섭씨 8도보다 더 큰 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 혼합물 속의 모든 표지된 듀플렉스 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 반응 혼합물이 적어도 2개의 상이한 듀플렉스 핵산을 함유하며, 각각이 독특하고, 예정된 Tm을 갖고, 각각의 상이한 듀플렉스 핵산이 동일한 신호-생성 표지를 가지며,
    d) 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 및 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 높은 온도에서 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산의 경우, 독특한, 예정된 Tm보다 낮은 온도에서 측정된 신호 및 독특한, 예정된 Tm보다 더 높은 온도에서 측정된 신호에 있어서의 변화가 표지된 듀플렉스 핵산이 이의 표적에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 나타내는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 신호가 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n이 반응 혼합물 속의 상이한 표적-특이적인 프로브의 수인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 예정된 역치(threshold)를 초과하는 방법.
  12. 샘플 속에서 적어도 하나이 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 방법으로서,
    상기 방법이:
    a) 하이브리드화 조건 하에서, 샘플을, 반응 혼합물에 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한, 표적-특이적인 프로브와 접촉시키는 단계;
    b) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된(truncated) 프로브를 형성시키는 단계;
    c) 트렁케이트된 프로브가 포획 서열(capture sequence)에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계;
    d) 트렁케이트된 프로브을 연장하여 예정된 Tm 및 신호-생성 표지를 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계;
    e) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm 이하의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및
    f) 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 샘플이 적어도 2개의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되며, 각각의 상이한 절단가능한 프로브가 상이한 표적 핵산 서열에 대해 특이적이며, 여기서 각각의 상이한 절단가능한 프로브가, 이의 특이적인 표적 핵산 서열의 존재하에서, 독특한, 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성하며, 여기서 독특한, 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산 모두는 동일한 신호-생성 표지를 가지며, 독특한, 예정된 Tm을 갖는 각각의 듀플렉스 핵산에 대하여, 예정된 Tm 이하의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계 및 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 신호가 단지 n + 1의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n이 반응 혼합물 속의 상이한 절단가능한 프로브의 수인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 2도 상이한 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 5도 상이한 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 상이한 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 10도 상이한 방법.
  18. 제12항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 단일분자(unimolecular)인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 이분자(bimolecular)인 방법.
  20. 제12항에 있어서, 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 비가 예정된 역치(threshold)를 초과하는 경우, 표적 핵산이 존재하는 것으로 측정되는 방법.
  21. 제12항에 있어서, 신호가 예정된 Tm의 섭씨 2도 내의 온도에서 측정되지 않는 방법.
  22. 제12항에 있어서, 신호가 예정된 Tm의 섭씨 5도 내의 온도에서 측정되지 않는 방법.
  23. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 절단가능한 프로브가 리포터-퀀처(reporter-quencher) 쌍의 제1의 구성원으로 표지되며 적어도 하나의 절단가능한 프로브가 이의 표적 핵산 서열에 하이브리드화되는 경우 제1의 구조를 채택하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 이의 표적 서열에 대한 적어도 하나의 절단가능한 프로브의 특이적인 하이브리드화가 절단 부위에서 프로브의 절단, 제2의 구조를 채택하기 위한 표적 핵산 서열로부터 트렁케이트된 프로브의 방출, 및 절단가능한 부위로부터 가닥(strand) 연장을 생성하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 가닥 연장이 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 혼입시키는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 제1의 구조가 선형 구조이고 제2의 구조가 헤어핀(hairpin) 구조인 방법.
  27. 반응 혼합물 속의 표지된 듀플렉스 핵산의 융용 분석을 수행하는 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 구조로 있는 제1의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제1의 신호를 측정하는 단계;
    (b) 표지된 듀플렉스 핵산이 제2의 구조로 있는 제2의 온도에서 표지된 듀플렉스 핵산으로부터의 제2의 신호를 측정하는 단계로서, 신호가 제1 및 제2 온도 중간의 온도에서 측정되지 않는 단계; 및
    (c) 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 신호 및 제2의 신호를 비교함으로써 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과인지를 측정하는 단계로서, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화가 표지된 듀플렉스 핵산이 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화의 결과임을 나타내는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 반응 혼합물이 적어도 2개의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산을 함유하고, 각각의 상이한 표지된 듀플렉스 핵산이 독특한 온도에서 제2 구조를 채택할 수 있으며, 각각의 상이한 표지된 핵산이 동일한 신호-생성 표지를 가지고, 각각의 표지된 듀플렉스 핵산에 대해, 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제1 구조로 있는 온도에서 제1의 신호를 측정하는 단계 및 표지된 듀플렉스 핵산이 주로 제2 구조로 있는 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계 및 제1의 신호 및 제2의 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 신호가 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n이 반응 혼합물 속의 상이한 듀플렉스 핵산의 수인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 제1 구조가 헤어핀 구조이고 제2 구조가 선형 구조인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 표적-특이적인 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1 구성원으로 표지된 절단가능한 프로브인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 이의 표적 서열에 대한 표적-특이적인 프로브의 특이적인 하이브리드화가 트렁케이트된 프로브를 형성하기 위한 절단가능한 부위에서 프로브의 절단, 헤어핀 프로브를 형성시키기 위한, 표적 핵산 서열로부터 트렁케이트된 프로브의 방출, 및 절단 부위로부터 가닥 연장을 야기하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 가닥 연장이 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 혼입시켜, 신호에서의 변화를 야기하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 샘플 속에서 적어도 하나의 표적 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 샘플을, 존재하는 경우, 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한 프로브와 접촉시키는 단계로서, 절단가능한 프로브가 신호-생성 표지를 포함하는 단계;
    b) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된 프로브를 형성시키는 단계;
    c) 트렁케이트된 프로브가 트렁케이트된 프로브에 대해 상보성인 서열을 포함하는 포획 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계;
    d) 트렁케이트된 프로브를 주형으로서 포획 서열을 사용하여 연장시킴으로써 예정된 Tm을 갖는 이중 가닥 프로브를 형성시키는 단계;
    e) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고, 예정된 Tm 이하의 제1의 온도에서 신호-생성 표지로부터의 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 제2의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및
    f) 제1의 온도 및 제2의 온도에서 측정된 신호에서의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 서열의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 샘플이 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되고, 상기 절단가능한 프로브 각각은 상이한 표적 핵산에 대해 특이적이고 각각은 이의 각각의 표적 핵산의 존재하에서, 독특한 예정된 Tm을 갖는 이중 가닥 프로브를 형성할 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 이중 가닥 프로브는 동일한 리포터-퀀처 쌍을 포함하며, 또한, 각각의 상이한 이중 가닥 프로브에 대하여, 예정된 Tm 이하의 제1의 온도에서 제1의 신호 및 예정된 Tm 이상의 제2의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계, 및 각각의 상이한 이중 가닥 프로브에 대해 측정된 제1 및 제2의 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 단일분자인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 이분자인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 샘플이 단일 반응 칸막이(compartment) 내에서 2개 이상의 상이한 절단가능한 프로브와 접촉되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 신호가 단지 n + 1개의 상이한 온도에서 측정되며, 여기서 n은 반응 구획내 상이한 절단가능한 프로브의 수인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 2도 상이한 방법.
  41. 제35항에 있어서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 5도 상이한 방법.
  42. 제35항에 있어서, 상기 상이한 이중 가닥 프로브의 독특한, 예정된 Tm이 적어도 섭씨 8도 상이한 방법.
  43. 제34항에 있어서, 표적 핵산이 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 비가 예정된 역치를 초과하는 경우 존재하는 것으로 측정되는 방법.
  44. 제34항에 있어서, 신호가 예정된 Tm의 섭씨 2도 내의 온도에서 측정되지 않는 방법.
  45. 제34항에 있어서, 신호가 예정된 Tm의 섭씨 5도 내의 온도에서 측정되지 않는 방법.
  46. 제34항에 있어서, 신호 생성 표지가 리포터-퀀처 쌍의 제1 구성원이고 이중 가닥 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1 구성원과 상호작용하는 리포터-퀀처 쌍의 제2 구성원을 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 절단가능한 프로브가 신호 생성 표지가 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 듀플렉스 핵산이 제1의 비-천연 뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 제2의 비-천연 뉴클레오타이드에 부착되는 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 형광성 실체이고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 형광성 실체의 형광성을 퀀칭하는 퀀처인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드가 이소-C 및 이소-G 중 하나인 방법.
  50. 다수의 표지된 핵산 듀플렉스에서 용융 분석을 수행하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    (a) 적어도 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산을 제공하는 단계로서,
    여기서 각각의 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산은 독특한 예정된 Tm을 가지고,
    제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한 예정된 Tm은 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 높고,
    제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm은 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 높고,
    여기서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산은 동일한 표지로 표지되는 단계;
    (b) 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm보다 더 낮은 제1의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제1의 신호를 검출하는 단계;
    (c) 제1의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm과 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 사이인 제2의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제2의 신호를 검출하는 단계;
    (d) 제2의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm과 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 사이의 제3의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제3의 신호를 검출하는 단계;
    (e) 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm 이상인 제4의 온도에서 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산으로부터 제4의 신호를 검출하는 단계; 및
    (f) 제1의, 제2의, 제3의, 및 제4의 신호를 비교함으로써 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산 중 하나 이상이 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과인지를 측정하는 단계로서, 여기서 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 변화는 제1의 표지된 듀플렉스 핵산이 제1의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내고, 제2의 신호와 제3의 신호 사이의 변화가 제2의 표지된 듀플렉스 핵산이 제2의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내며, 제3의 신호와 제4의 신호 사이의 변화가 제3의 표지된 듀플렉스 핵산이 제3의 표적-특이적인 프로브의 절단의 결과임을 나타내는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 신호가 제1의, 제2의, 및 제3의 표지된 듀플렉스 핵산의 독특한, 예정된 Tm에서 검출되지 않는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 제1의 온도와 제2의 온도 사이의 차이가 섭씨 2도보다 더 크고 제2의 온도와 제3의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 크고, 제3의 온도와 제4의 온도 사이의 차이는 섭씨 2도보다 더 큰 방법.
  53. 제12항, 제27항 또는 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물 속의 모든 듀플렉스 핵산이 변성되는 제3의 온도에서 제3의 신호를 측정하는 단계, 및 제3의 신호에 대해 제1 및 제2의 신호를 표준화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  54. 제1항, 제12항, 제27항, 제34항 또는 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 단계가 dPCR 반응에서 다수 구획에서 수행되는 방법.
  55. 제8항 또는 제53항에 있어서, 제1 및 제2의 신호가 제3의 신호를 제1 및 제2의 신호로부터 감함으로써 제3의 신호에 대해 표준화되는 방법.
  56. 제8항 또는 제53항에 있어서, 제1 및 제2의 신호가 제1 및 제2의 신호를 제3의 신호로 나눔으로써 제3의 신호에 대해 표준화되는 방법.
  57. 제12항 또는 제34항에 있어서, 단계가 dPCR 반응내 다수의 구획에 걸쳐 수행되며, 절단 전에, 다수의 구획 내 절단가능한 프로브의 표지로부터의 신호를 측정하는 단계 및 절단하기 전에 측정된 신호를 사용하여 역치를 설정함으로써 표적 핵산을 함유하지 않는 구획으로부터 표적 핵산을 함유하는 구획을 구별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제12항 또는 제34항에 있어서, 단계가 dPCR 반응에서 다수의 구획에 걸쳐 수행되고, 절단 전에, 다수의 신호를 일정한 범위의 온도에서 측정하는 단계 및 측정된 신호를 사용하여 용융 분석 동안 측정된 신호에 있어서의 광 및 온도-의존성 변화에 대해 교정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제1항, 제12항, 제27항 또는 제34에 있어서, 단계가 dPCR 반응내 다수의 구획에 걸쳐 수행되며, 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계, 표적-음성 구획으로서 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 변화가 없는 구획을 확인하는 단계, 및 표적-음성 구획으로부터 측정된 신호를 사용하여 각각의 구획 내에서 제1 및 제2의 신호에 있어서 광 및 온도-의존성 변화에 대해 표준화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 샘플 속의 표적 핵산의 존재를 측정하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    (a) 샘플 및 신호 생성 표적-특이적인 프로브를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 표적-특이적인 프로브가 제1의, 단일 가닥 구조인 경우 제1의 신호를 생성하는 단계;
    (b) 반응 혼합물 속의 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계;
    (c) 표적-특이적인 프로브가 존재하는 경우 표적 핵산에 하이브리드화하여 제2의 구조를 채택하는 조건을 제공하는 단계로서, 제2의 구조는 예정된 Tm을 가진 듀플렉스 핵산이고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 생성할 수 있는 단계;
    (d) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 듀플렉스 핵산으로부터 제2의 신호를 측정하는 단계; 및
    (e) 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 표적 특이적인 프로브가 표적 핵산에 하이브리드화 시 절단되어 트렁케이트된 프로브를 형성하는 절단가능한 프로브인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 트렁케이트된 프로브가 포획 서열에 결합하고 연장되어 듀플렉스 핵산을 형성하는 방법.
  63. 제60항에 있어서, 제1 및 제2의 신호가 형광성 신호인 방법.
  64. 제60항에 있어서, 제1의 신호가 표적 핵산에 대한 표적-특이적인 프로브의 하이브리드화 전에 검출되는 방법.
  65. 제62항에 있어서, 제1의 신호가 표적-특이적인 프로브가 제1의 구조로 있는 조건 하에서 절단 및 연장 후 검출되는 방법.
  66. 제61항에 있어서, 절단가능한 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 듀플렉스 핵산이 제1의 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화할 수 있고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원으로 표지된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드가 이소-C 및 이소-G 중 하나인 방법.
  68. 제62항에 있어서, 표적-특이적인 프로브가 포획 서열에 대한 결합 전에 형광단으로 표지되고, 여기서 퀀처는 형광단의 퀀칭을 생성하는 위치에서 듀플렉스 핵산 내로 혼입되는 방법.
  69. 제60항에 있어서, 반응 혼합물이 단계 (b) 후에 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용되는 방법.
  70. 제62항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 단일분자이며 하이브리드화되어 헤어핀 프로브를 형성하는 방법.
  71. 제62항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 이-분자인 방법.
  72. 샘플 속에서 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 샘플, 반응 혼합물 속의 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 표지된, 절단가능한 표적-특이적인 프로브, 및 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원인 표지를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 반응 혼합물 속의 표지된 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계;
    c) 표지된 절단가능한 표적-특이적인 프로브가 반응 혼합물 속에 존재하는 경우 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계;
    d) 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 절단하여 트렁케이트된 프로브를 형성시키는 단계;
    e) 트렁케이트된 프로브가 포획 서열에 하이브리드화하도록 하는 조건을 제공하는 단계;
    f) 트렁케이트된 프로브를 연잔시켜 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원 및 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계;
    g) 예정된 Tm 이하의 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및
    h) 예정된 역치를 초과하는 제1의 신호와 제2의 신호 사이에 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 단일분자이고 하이브리드화하여 헤어핀 프로브를 형성하는 방법.
  74. 제72항에 있어서, 포획 서열 및 트렁케이트된 프로브가 이-분자인 방법.
  75. 제72항에 있어서, 표적 특이적인 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고 듀플렉스 핵산이 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하며, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 서로 염기-쌍화할 수 있는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드가 이소C 및 이소G 중 하나 또는 다른 것인 방법.
  77. 제72항에 있어서, 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 형광단이고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 퀀처인 방법.
  78. 샘플 속의 표적 핵산의 존재를 측정하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 샘플 및 신호 생성 표적-특이적인 프로브를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 표적-특이적인 프로브는 제1의, 단일-가닥 구조인 경우 제1의 신호를 생성하는 단계;
    b) 반응 혼합물 속의 표적-특이적인 프로브로부터 제1의 신호를 측정하는 단계;
    c) 반응 혼합물을 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용시키는 단계로서, 여기서 증폭 동안, 표적-특이적인 프로브는 변형되어 예정된 Tm을 갖고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 생성할 수 있는 듀플렉스 핵산을 포함하는 변형된 표적-특이적인 프로브를 형성하는 단계;
    d) 예정된 Tm에서 신호를 측정하지 않고 예정된 Tm보다 더 낮은 온도에서 제2의 신호를 측정하는 단계; 및
    e) 예정된 역치를 초과하는 제1의 신호와 제2의 신호 사이의 차이가 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 표적 특이적인 프로브가 표적 핵산에 대한 하이브리드화 시 절단시킴에 의해 변형되어 포획 서열에 결합하는 트렁케이트된 프로브를 형성하고 연장되어 듀플렉스 핵산을 형성하는 방법.
  80. 제78항에 있어서, 제1 및 제2의 신호가 형광성 신호인 방법.
  81. 제79항에 있어서, 제1의 신호가 표적 핵산에 대한 표적-특이적인 프로브의 하이브리드화 전에 검출되는 방법.
  82. 제79항에 있어서, 제1의 신호가 변형된 표적-특이적인 프로브가 단일 가닥의 구조인 조건 하에서 절단 및 연장 후 검출되는 방법.
  83. 제78항에 있어서, 표적-특이적인 프로브가 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원으로 표지된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 변형된 표적-특이적인 프로브가 제1의 비-천연 뉴클레오타이드와 염기-쌍화할 수 있고 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원으로 표지된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드가 이소-C 및 이소-G 중 하나인 방법.
  85. 제79항에 있어서, 표적-특이적인 프로브가 포획 서열에 대한 결합 전에 형광단으로 표지되고, 여기서 퀀처는 형광단의 퀀칭을 생성하는 위치에서 연장 동안 듀플렉스 핵산내로 혼입되는 방법.
  86. 샘플 속의 제1 및 제2의 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브 및 제1 및 제2의 표적 핵산을 잠재적으로 함유하는 샘플을 포함하는 증폭 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
    b) 반응 혼합물을 구획화하여 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 제1의 및/또는 제2의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계;
    c) 미리선택된 온도 T1, T2 및 T3의 구획의 적어도 하나의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제1의, 제2 및 제3의 세트를 획득하고 구획의 서브세트내 각각의 구획의 경우, 미리선택된 온도 T1에서 제1의 형광성 강도 값, 미리선택된 온도 T2에서 제2의 형광성 강도 값 및 미리선택된 온도 T3에서 제3의 형광성 강도 값을 측정하는 단계;
    d) 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 제1 및 제2의 표적 핵산의 증폭을 위한 조건에 적용시키고 이의 표적 핵산의 존재하에서 제1의 신호 생성 프로브의 변형으로 제1의 예정된 Tm을 갖는 제1의 듀플렉스 핵산을 형성시키고, 이의 표적 핵산의 존재하에서 제2의 신호 생성 프로브의 변형으로 제2의 예정된 Tm을 갖는 제2의 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계;
    e) 제1의 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T1에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제4의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대한 제4의 강도 값을 계산하는 단계;
    f) 제1의 예정된 Tm보다 더 높지만 제2의 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T2에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제5의 세트를 획득하고, 각각의 구획에 대한 제5의 강도 값을 계산하는 단계;
    g) 제2의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T3에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제6의 세트를 획득하고, 각각의 구획에 대한 제6의 강도 값을 계산하는 단계;
    h) 각각의 구획에 대해, 제4의 강도 값을 제1의 강도 값으로 나누어 T1과 관련된 제7의 강도 값을 수득하는 단계;
    i) 각각의 구획에 대해, 제5의 강도 값을 제2의 강도 값으로 나누어 T2와 관련된 제8의 강도 값을 수득하는 단계;
    j) 각각의 구획에 대해, 제6의 강도 값을 제3의 강도 값으로 나누어 T3와 관련된 제9의 강도 값을 수득하는 단계;
    k) 각각의 구획에 대해, 제8의 강도 값과 제7의 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제1의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계; 및
    l) 각각의 구획에 대해, 제9의 평균 강도 값과 제8의 평균 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제2의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 프로브가 동일한 신호-생성 표지를 갖는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 신호 생성 표지가 리포터-퀀처 쌍의 제1 구성원이고 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산이 리포터-퀀처 쌍의 제2 구성원을 포함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 제1 및 제2의 신호 생성 프로브가 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제1 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산이 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제2 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하며, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드는 서로 염기-쌍화할 수 있는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 비-천연 뉴클레오타이드가 이소-C 또는 이소-G 중 하나인 방법.
  91. 제86항에 있어서, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브가 증폭 동안 절단된 절단가능한 프로브인 방법.
  92. 제86항에 있어서, 제8의 강도 값과 제7의 강도 값 사이의 변화가 예정된 역치를 초과하며, 여기서 제9의 강도 값과 제8의 강도 값 사이의 변화는 예정된 역치를 초과하는 방법.
  93. 샘플 속에서 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    a) 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브 및, 표적 핵산을 함유하는 샘플을 포함하는 증폭 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
    b) 반응 혼합물을 구획화하여 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계;
    c) 미리선택된 온도 T1 및 T2에서 구획의 적어도 하나의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제1 및 제2의 세트를 획득하는 단계, 및 구획의 서브세트내 각각의 구획에 대해, 미리선택된 온도 T1에서 제1의 형광성 강도 값 및 미리선택된 온도 T2에서 제2의 형광성 강도 값을 측정하는 단계;
    d) 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 표적 핵산의 증폭 및 이의 표적 핵산의 존재하에서 신호 생성 프로브의 변형을 위한 조건에 적용시켜 예정된 Tm을 갖는 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계;
    e) 예정된 Tm보다 더 낮은 온도 T1에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제3의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제3의 강도 값을 계산하는 단계;
    f) 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T2에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제4의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제4의 강도 값을 계산하는 단계;
    g) 각각의 구획에 대해, 제3의 강도 값을 제1의 강도 값으로 나누어 T1과 관련된 제5의 강도 값을 수득하는 단계;
    h) 각각의 구획에 대해, 제4의 강도 값을 제2의 강도 값으로 나누어 T2와 관련된 제6의 강도 값을 수득하는 단계;
    i) 각각의 구획에 대해, 제6의 강도 값과 제5의 강도 값 사이의 변화를 검출함으로써 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 표적 핵산이 제1의 표적 핵산이고, 신호 생성 표적-특이적인 프로브가 제1의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브이며 예정된 Tm이 제1의 예정된 Tm이고, 제2의 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 반응 혼합물이 제2의 형광성 신호-생성 표적-특이적인 프로브를 추가로 포함하고, 이러한 방법은:
    j) 단계 (b)에서, 반응 혼합물을 구획화함으로써 각각의 구획이 평균 0 또는 1개의 제1의 및/또는 제2의 표적 핵산을 함유하도록 하는 단계;
    k) 단계 (c)에서, 미리선택된 온도 T3에서 구획의 적어도 하나의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제5의 세트를 획득하는 단계, 및 구획의 서브세트내 각각의 구획에 대해, 미리선택된 온도 T3에서 제7의 형광성 강도 값을 측정하는 단계;
    l) 단계 (d)에서 증폭 반응 혼합물을 함유하는 구획을 표적 핵산의 증폭 및 이의 표적 핵산의 존재하에서 제2의 신호 생성 프로브의 변형을 위한 조건에 적용시켜 제2의 예정된 Tm을 갖는 제2의 듀플렉스 핵산을 형성시키는 단계;
    m) 제2의 예정된 Tm보다 더 높은 온도 T3에서 구획의 서브세트의 영상으로부터 형광성 강도 값의 제6의 세트를 획득하고 각각의 구획에 대해 제8의 강도 값을 계산하는 단계;
    n) 각각의 구획에 대해, 제8의 강도 값을 제7의 강도 값으로 나누어 T3와 관련된 제9의 강도 값을 수득하는 단계;
    o) 각각의 구획에 대해, 제9의 강도 값과 제6의 강도 값 사이의 변화를 검출하여 제2의 표적 핵산의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 제6의 강도 값과 제5의 강도 값 사이의 변화 및 제9의 강도 값과 제6의 강도 값 사이의 변화가 예정된 역치를 초과하는 방법.
  96. 제94항에 있어서, 제1 및 제2의 형광성 신호-생성 프로브가 동일한 신호-생성 표지를 갖는 방법.
  97. 제94항에 있어서, 신호 생성 표지가 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이고 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산이 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원을 포함하는 방법.
  98. 제94항에 있어서, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브가 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제1의 구성원이 부착된 제1의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 듀플렉스 핵산이 이에 대해 리포터-퀀처 쌍의 제2의 구성원이 부착된 제2의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 및 제2의 비-천연 뉴클레오타이드가 서로 염기-쌍화할 수 있는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 비-천연 뉴클레오타이드가 이소-C 또는 이소-G 중 하나인 방법.
  100. 제94항에 있어서, 제1 및 제2의 신호-생성 프로브가 증폭 동안 절단되는 절단가능한 프로브인 방법.
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