JP2019522466A - 変異pd−l1ポリペプチド、t細胞調節多量体ポリペプチド、及びそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書で互換的に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであり、長さが任意の重合形態のヌクレオチドを指す。したがって、この用語は、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または多鎖のDNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNAとRNAとのハイブリッド、あるいはプリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
本開示は、変異免疫調節ポリペプチド、及び変異免疫調節ペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。本開示は、T細胞調節多量体ポリペプチド、及びT細胞調節多量体ポリペプチドを含む組成物を提供し、T細胞調節多量体ポリペプチドは、本開示の変異免疫調節ポリペプチドを含む。本開示は、T細胞調節多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、T細胞の活性の調節方法を提供し、方法は、T細胞と、本開示のT細胞調節多量体ポリペプチドとの接触を含む。
本開示は、変異PD−L1調節ポリペプチドを提供する。ヒトPD−L1の野生型アミノ酸配列は、図2Aに示される。
FT ITAPKDLYVV EYGSNVTMEC RFPVERELDL LALVVYWEKE DEQVIQFVAG EEDLKPQHSN FRGRASLPKD QLLKGNAALQ ITDVKLQDAG VYCCIISYGG ADYKRITLKV NAPYRKINQR ISVDPATSEH ELICQAEGYP EAEVIWTNSD HQPVSGKRSV TTSRTEGMLL NVTSSLRVNA TANDVFYCTF WRSQPGQNHT AELIIPELPA THPPQNR(配列番号1)。
FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI(配列番号2)。
場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、またはGluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ala、Gly、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、またはArgである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Alaである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Glyである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Valである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Leuである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ileである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Argである。場合によっては、変異PD−L1ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対する図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドの結合親和性と比較して、PD−1ポリペプチドに対する結合親和性の約40%〜約60%の低下を示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図2Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)の結合親和性の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%を保持する。
場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Argである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Lysである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Hisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Glyである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Alaである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Valである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Leuである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Ileである。場合によっては、変異PD−L1ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の約15%〜約35%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)の結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約70%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、イソロイシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸54は、Gly、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸54は、Gly、Ala、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Ala、Gly、Leu、Glu、またはAspである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、GluまたはAspである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Alaである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Glyである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Leuである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Aspである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Gluである。場合によっては、変異PD−L1ポリペプチドは、PD−1(例えば、図2Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の約70%〜約100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)の結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、グルタミン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸66は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、GluまたはAspである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、Gluである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、Aspである。場合によっては、変異PD−L1ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の約80%〜約100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)の結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、グルタミン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸72は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、またはAspである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Asp、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Argである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Lysである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Hisである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Aspである。場合によっては、変異PD−L1ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の約30%〜約60%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)の結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
本開示は、PD−L1融合ポリペプチドを提供する。本開示の融合ポリペプチドは、a)本開示の変異PD−L1ポリペプチド、及びb)異種融合パートナーを含む。場合によっては、異種融合パートナーは、変異PD−L1ポリペプチドのN末端に融合している。場合によっては、異種融合パートナーは、変異PD−L1ポリペプチドのC末端に融合している。場合によっては、本開示のPD−L1融合ポリペプチドは、変異PD−L1ポリペプチドのN末端に融合している第1の異種融合パートナー及び変異PD−L1ポリペプチドのC末端に融合している第2の異種融合パートナーを含む。
本開示は、多量体(例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体)ポリペプチドを提供する。多量体ポリペプチドはT細胞調節ポリペプチドであり、本明細書では、「T細胞調節多量体ポリペプチド」または「synTac」(「T細胞活性化のための免疫学的シナプス」)とも称される。図1A〜1Dは、本開示のさまざまなT細胞調節多量体ポリペプチドの概略図を示す。本開示のT細胞調節多量体ポリペプチドは、「synTacポリペプチド」または「多量体ポリペプチド」とも称される。本開示のT細胞調節多量体ポリペプチドがPD−L1免疫調節ポリペプチド(例えば、本開示の変異PD−L1免疫調節ポリペプチド)を含む場合、そのようなT細胞調節多量体ポリペプチドは、本明細書で「PD−L1/synTac」とも称される。
本開示の多量体ポリペプチドは、例えば、エピトープとMHCポリペプチドとの間、MHCポリペプチドと免疫調節ポリペプチドとの間、MHCポリペプチドとIg Fcポリペプチドとの間、第1の変異PD−L1ポリペプチドと第2の変異PD−L1ポリペプチドとの間、または第2の変異PD−L1ポリペプチドと第3の変異PD−L1ポリペプチドとの間に挿入されたリンカーペプチドを含むことができる。
本開示の多量体ポリペプチド中に存在するエピトープは、約4アミノ酸〜約25アミノ酸の長さを有することができ、例えば、エピトープは、4アミノ酸(aa)〜10aa、10aa〜15aa、15aa〜20aa、または20aa〜25aaの長さを有することができる。例えば、本開示の多量体ポリペプチド中に存在するエピトープは、4アミノ酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa、または25aaの長さを有することができる。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチド中に存在するエピトープは、5アミノ酸〜10アミノ酸、例えば、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、または10aaの長さを有する。
上記のように、本開示の多量体ポリペプチドはMHCポリペプチドを含む。本開示において、用語「主要組織適合抗原複合体(MHC)ポリペプチド」は、ヒトMHC(ヒト白血球抗原(HLA)とも称される)ポリペプチド、げっ歯類(例えば、マウス、ラットなど)のMHCポリペプチド及び他の哺乳類種(例えば、ウサギ類(例えば、ウサギ)、非ヒト霊長類、イヌ(例えば、イヌ)、ネコ(例えば、ネコ)、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなど)のMHCポリペプチドなどを含めた、様々な種のMHCポリペプチドを含むことを意図する。用語「MHCポリペプチド」は、クラスI MHCポリペプチド(例えば、β−2ミクログロブリン及びMHCクラスI重鎖)ならびにMHCクラスIIポリペプチド(例えば、MHCクラスIIαポリペプチド及びMHCクラスIIβポリペプチド)を含むことを意図する。
本開示の多量体ポリペプチドは、上記のように、変異PD−L1ポリペプチドを含む。したがって、本開示の多量体ポリペプチドは、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドを含む。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ala、Gly、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、またはArgである。場合によっては、本開示の変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Glyである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Valである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Leuである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Ileである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸26は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対する図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、PD−1ポリペプチドに対する結合親和性の約40%〜約60%の低下を示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図2Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%を保持する。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Gly、Ala、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Lysである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Hisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Glyである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Valである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Leuである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸37は、Ileである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約15%〜約35%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約70%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、イソロイシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸54は、Gly、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸54は、Gly、Ala、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Ala、Gly、Leu、Glu、Arg、またはAspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、GluまたはAspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Glyである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Leuである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Gluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸54は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図2Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約70%〜約100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、グルタミン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸66は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、GluまたはAspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、Gluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸66は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約80%〜約100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、グルタミン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸72は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、またはAspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Asp、Arg、Lys、またはHisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Lysである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Hisである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸72は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約30%〜約60%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約40%〜約90%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Ala、Gly、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、AspまたはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Arg、His、またはLysである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Ala、Asp、またはArgである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸56は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約50%〜約100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約60%〜約95%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、Ala、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、AspまたはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、Arg、His、またはLysである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸119は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約20%〜約50%または約50%〜100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示し(例えば、B7−1に対する結合親和性の約60%〜約95%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸120は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、Ala、Val、Leu、またはIleである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、AspまたはGluである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、Arg、His、またはLysである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、Aspである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、Argである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドに存在する変異PD−L1ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸120は、Alaである。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、PD−1(例えば、図3Bに示されるアミノ酸配列を含むPD−1ポリペプチド)に対して図2B(または配列番号2)に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドを含む対照多量体ポリペプチドが示す結合親和性の約20%〜約50%または約50%〜100%の結合親和性をPD−1ポリペプチドに対して示し、野生型B7−1ポリペプチド(例えば、図3Dに示されるアミノ酸配列を含むB7−1ポリペプチド)に対する野生型PD−L1ポリペプチド(例えば、図3Bまたは配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチド)を含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、B7−1に対する結合親和性の低下を示す(例えば、B7−1に対する結合親和性の約60%〜約95%の低下を示す)。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、単一の変異PD−L1免疫調節ポリペプチドを含む。
本開示のT細胞調節多量体ポリペプチドは、Fcポリペプチドまたは別の適切な骨格ポリペプチドを含む。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの第1及び/または第2のポリペプチド鎖は、Fcポリペプチドを含む。本開示の多量体ポリペプチドのFcポリペプチドは、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgG2 Fc、ヒトIgG3 Fc、ヒトIgG4 Fcなどでもよい。場合によっては、Fcポリペプチドは、図4A〜4Cに示されるFc領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Fc領域は、図4Aに示されるヒトIgG1 Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Fc領域は、図4Aに示されるヒトIgG1 Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つN77の置換を含み、例えば、Fcポリペプチドは、N77A置換を含む。場合によっては、Fcポリペプチドは、図4Aに示されるヒトIgG2 Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Fcポリペプチドは、図4Aに示されるヒトIgG2 Fcポリペプチドのアミノ酸99〜325に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Fcポリペプチドは、図4Aに示されるヒトIgG3 Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Fcポリペプチドは、図4Aに示されるヒトIgG3 Fcポリペプチドのアミノ酸19〜246に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Fcポリペプチドは、図4Bに示されるヒトIgM Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Fcポリペプチドは、図4Bに示されるヒトIgM Fcポリペプチドに対するアミノ酸1〜276に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Fcポリペプチドは、図4Cに示されるヒトIgA Fcポリペプチドに対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Fcポリペプチドは、図4Cに示されるヒトIgA Fcポリペプチドに対するアミノ酸1〜234に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖は、上記のものに加えて、1つまたは複数のポリペプチドを含むことができる。適切なさらなるポリペプチドとしては、エピトープタグ及び親和性ドメインが挙げられる。1つまたは複数のさらなるポリペプチドは、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のN末端、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のC末端または本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖の内部に含まれ得る。
適切なエピトープタグとしては、限定されないが、ヘマグルチニン(HA:例えば、YPYDVPDYA(配列番号22))、FLAG(例えば、DYKDDDDK(配列番号23))、c−myc(例えば、EQKLISEEDL(配列番号24))などが挙げられる。
親和性ドメインは、特定または精製に有用な結合パートナー、例えば固体支持体に固定化されたものなどと相互作用することができるペプチド配列を含む。複数の連続した単一アミノ酸、例えばヒスチジンをコードするDNA配列は、発現タンパク質に融合している場合に、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの高親和性結合による組換えタンパク質のワンステップ精製に使用することができる。例示的親和性ドメインとしては、His5(HHHHH)(配列番号25)、HisX6(HHHHHH)(配列番号26)、C−myc(EQKLISEEDL)(配列番号27)、Flag(DYKDDDDK)(配列番号28)、StrepTag(WSHPQFEK)(配列番号29)、ヘマグルチニン、例えば、HAタグ(YPYDVPDYA)(配列番号30)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、RYIRS(配列番号31)、Phe−His−His−Thr(配列番号32)、キチン結合ドメイン、S−ペプチド、T7ペプチド、SH2ドメイン、C末端RNAタグ、WEAAAREACCRECCARA(配列番号33)、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合ドメイン、例えば、カルシウム結合タンパク質、例えば、カルモジュリン、トロポニンC、カルシニューリンB、ミオシン軽鎖、リカバリン、S−モジュリン、ビジニン、VILIP、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、S100タンパク質、パルブアルブミン、カルビンディンD9K、カルビンディンD28K及びカルレチニン由来のもの、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、MyoD、Id、ロイシンジッパー配列ならびにマルトース結合タンパク質が挙げられる。
本開示の例示的多量体ポリペプチドを以下に記載する。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、及びiii)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸26が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸26が、AlaもしくはArgである変異PD−L1ポリペプチド、または配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸8が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸8が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸8が、AlaもしくはArgである変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸26が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸26が、AlaもしくはArgである変異PD−L1ポリペプチド、または配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸8が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸8が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸8が、AlaもしくはArgである変異PD−L1ポリペプチド、及びiii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、iii)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、iv)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、及びv)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸26が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸26が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸8が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸8が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸8が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iii)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、iv)クラスI MHC重鎖、及びv)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸26が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸26が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸8が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸8が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸8が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)リンカー、iii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iv)リンカー、v)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、vi)クラスI MHC重鎖、及びvii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸26が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸26が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸26が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸8が、アスパラギン酸以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸8が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸8が、AlaもしくはArgであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、リンカーは、(GSSSS)nという配列(nは、1、2、3、4、または5である)を含む。場合によっては、nは、4である。場合によっては、nは、5である。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、及びiii)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸37が、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisである変異PD−L1ポリペプチド、または配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸19が、スレオニン以外の任意のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり得、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisである変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸37が、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisである変異PD−L1ポリペプチド、または配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸19が、スレオニン以外の任意のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり得、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisである変異PD−L1ポリペプチド、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、iii)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、iv)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、及びv)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸37が、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸19が、スレオニン以外の任意のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり得、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iii)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、iv)クラスI MHC重鎖、及びv)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸37が、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸19が、スレオニン以外の任意のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり得、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)リンカー、iii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iv)リンカー、v)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、vi)クラスI MHC重鎖、及びvii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸37が、スレオニン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり、例えば、アミノ酸37が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含むか、またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸19が、スレオニン以外の任意のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであり得、例えば、アミノ酸19が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Arg、Lys、もしくはHisであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、リンカーは、(GSSSS)n という配列(nは、1、2、3、4、または5である)を含む。場合によっては、nは、4である。場合によっては、nは、5である。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、及びiii)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸56が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸56が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸56が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸56が、Arg、His、もしくはLysである変異PD−L1ポリペプチド、あるいは配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸38が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸38が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸38が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸38がArg、His、もしくはLysである変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸56が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸56が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸56が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸56が、Arg、His、もしくはLysである変異PD−L1ポリペプチド、あるいは配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸38が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸38が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸38が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸38が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸38が、Arg、His、もしくはLysである変異PD−L1ポリペプチド、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、iii)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、iv)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、及びv)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸56が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸56が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸56が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸56が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸38が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸38が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸38が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸38が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸38が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iii)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、iv)クラスI MHC重鎖、及びv)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸56が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸56が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸56が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸56が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸38が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸38が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸38が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸38が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸38が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)リンカー、iii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iv)リンカー、v)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、vi)クラスI MHC重鎖、及びvii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸56が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸56が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸56が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸56が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸56が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸38が、チロシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸38が、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸38が、Ala、Gly、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸38が、AspもしくはGluであるか、またはアミノ酸38が、Arg、His、もしくはLysであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、リンカーは、(GSSSS)n という配列(nは、1、2、3、4、または5である)を含む。場合によっては、nは、4である。場合によっては、nは、5である。
場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、及びiii)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸119が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸119が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸119が、GluもしくはAspである変異PD−L1ポリペプチド、あるいは配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸101が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸101が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸101が、GluもしくはAspである変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドど、b)i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸119が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸119が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸119が、GluもしくはAspである変異PD−L1ポリペプチド、あるいは配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1ポリペプチドであって、アミノ酸101が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸101が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸101が、GluもしくはAspである変異PD−L1ポリペプチド、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、ii)β2Mポリペプチド、iii)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、iv)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、及びv)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)クラスI MHC重鎖、及びii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸119が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸119が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸119が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸101が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸101が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸101が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iii)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、iv)クラスI MHC重鎖、及びv)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸119が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸119が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸119が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸101が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸101が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸101が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドは、a)i)エピトープ、及びii)β2MポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、b)i)本開示の第1の変異PD−L1ポリペプチド、ii)リンカー、iii)本開示の第2の変異PD−L1ポリペプチド、iv)リンカー、v)本開示の第3の変異PD−L1ポリペプチド、vi)クラスI MHC重鎖、及びvii)FcポリペプチドをN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、を含む。場合によっては、第1の変異PD−L1ポリペプチド、第2の変異PD−L1ポリペプチド、及び第3の変異PD−L1ポリペプチドはそれぞれ、i)図2Bに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸119が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸119が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸119が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸119が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含むか、あるいはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸101が、グリシン以外のアミノ酸であり、例えば、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、もしくはGluであるか、アミノ酸101が、Ala、Val、Leu、もしくはIleであるか、アミノ酸101が、Arg、His、もしくはLysであるか、またはアミノ酸101が、GluもしくはAspであるアミノ酸配列を含む。場合によっては、リンカーは、(GSSSS)n という配列(nは、1、2、3、4、または5である)を含む。場合によっては、nは、4である。場合によっては、nは、5である。
本開示は、本開示の変異PD−L1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示のPD−L1融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
本開示は、本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。上記のように、場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの個々のポリペプチド鎖は、別々の核酸にコードされる。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの別々のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えば、真核細胞で機能的なプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され、ここでは、プロモーターは構成的プロモーターでもよいし、誘導性プロモーターでもよい。したがって、本開示は、第1の核酸及び第2の核酸を含む組成物を提供し、第1の核酸は、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、第2の核酸は、本開示の多量体ポリペプチドの第2のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
本開示は、少なくとも本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドが、第1、第2及び第3のポリペプチドを含む場合は、核酸は、第1、第2及び第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に挿入された、タンパク分解により切断可能なリンカーを含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に挿入された配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に挿入されたリボソームスキッピングシグナル(またはシス作用性ヒドロラーゼ要素、CHYSEL)を含む。核酸の例は以下に記載され、ここでは、タンパク分解により切断可能なリンカーは、本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列の間に提供され、これらの実施形態のうちのいずれかでは、タンパク分解により切断可能なリンカーをコードするヌクレオチド配列の代わりに、IRESまたはリボソームスキッピングシグナルを使用することができる。
本開示は、本開示の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。場合によっては、組換え発現ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターはウイルスコンストラクト、例えば、組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクト(例えば、米国特許第7,078,387号を参照されたい)、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクト、組換えレトロウイルスコンストラクト、非組込みウイルスベクターなどである。
本開示は、宿主細胞が本開示の核酸で遺伝子改変されている、遺伝子改変宿主細胞を提供する。
本開示は、本開示の多量体ポリペプチドの生成方法を提供する。この方法は、一般に、多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子改変されている宿主細胞を培養培地で培養すること、ならびに遺伝子改変宿主細胞及び/または培養培地から多量体ポリペプチドを単離することを含む。多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子改変されている宿主細胞は、「発現宿主」とも称される。上記のように、場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドの個々のポリペプチド鎖は、別々の組換え発現ベクターにコードされる。場合によっては、本開示の多量体ポリペプチドのすべてのポリペプチド鎖は、単一の組換え発現ベクターにコードされる。
本開示は、医薬組成物を含めて、本開示の変異PD−L1ポリペプチドを含む組成物を提供する。本開示は、医薬組成物を含めて、本開示の多量体ポリペプチドを含む組成物を提供する。本開示は、医薬組成物を含めて、本開示の核酸または組換え発現ベクターを含む組成物を提供する。
本開示の組成物は、本開示の多量体ポリペプチドに加えて、以下の1つまたは複数を含むことができる:塩、例えば、NaCl、MgCl2 、KCl、MgSO4 など、緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N−トリス[ヒドロキシメチル]メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など、可溶化剤、デタージェント、例えば、非イオン性デタージェント、例えばTween−20など、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなど。
本開示は、本開示の核酸または組換え発現ベクターを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。多種多様の医薬的に許容可能な賦形剤が当技術分野で既知であり、本明細書で詳細に論じる必要はない。医薬的に許容可能な賦形剤は、例えば、A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,20th edition,Lippincott,Williams,& Wilkins、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.,eds 7th ed.,Lippincott,Williams,& Wilkins、及びHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assocを含めた、様々な刊行物に十分に記載されている。
本発明は、個体においてエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法を提供し、この方法は、個体においてエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するために有効な量の本開示の多量体ポリペプチドまたは多量体ポリペプチドをコードする1種または複数の核酸を個体に投与することを含む。場合によっては、本開示の治療方法は、本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1種または複数の組換え発現ベクターをそれらを必要とする個体に投与することを含む。場合によっては、本開示の治療方法は、本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1種または複数のmRNA分子をそれらを必要とする個体に投与することを含む。場合によっては、本開示の治療方法は、本開示の多量体ポリペプチドをそれらを必要とする個体に投与することを含む。
適切な製剤は既に記載されており、適切な製剤は医薬的に許容可能な賦形剤を含む。場合によっては、適切な製剤は、a)本開示の多量体ポリペプチド、及びb)医薬的に許容可能な賦形剤を含む。場合によっては、適切な製剤は、a)本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びb)医薬的に許容可能な賦形剤を含み、ある場合には、核酸はmRNAである。場合によっては、適切な製剤は、a)本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸、b)本開示の多量体ポリペプチドの第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸、及びc)医薬的に許容可能な賦形剤を含む。場合によっては、適切な製剤は、a)本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、及びb)医薬的に許容可能な賦形剤を含む。場合によっては、適切な製剤は、a)本開示の多量体ポリペプチドの第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の組換え発現ベクター、b)本開示の多量体ポリペプチドの第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の組換え発現ベクター、及びc)医薬的に許容可能な賦形剤を含む。
適切な投薬量は、様々な臨床因子に基づいて、主治医または資格を有する他の医療関係者が決定することができる。医学分野で周知であるように、任意のある患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定のポリペプチドまたは核酸、患者の性別、投与の時間及び経路、全体的な健康状態ならびに同時に投与される他の薬物を含めた、多くの因子に依存する。本開示の多量体ポリペプチドは、投与あたり1ng/kg体重〜20mg/kg体重、例えば、0.1mg/kg体重〜10mg/kg体重、例えば、0.5mg/kg体重〜5mg/kg体重の間の量で投与することができるが、特に前述した因子を考慮すれば、この例示的範囲より低いまたは高い用量が想定される。レジメンが持続注入である場合は、これはまた、1μg〜10mg/キログラム体重/分の範囲でもよい。
活性薬剤(本開示の多量体ポリペプチド、本開示の核酸または本開示の組換え発現ベクター)は、インビボ及びエキソビボの方法を含めた、薬物送達に適した任意の利用可能な方法及び経路、ならびに全身的及び局部的投与経路を使用して、個体に投与される。
本開示の方法による治療に適する対象としては、がんを有すると診断された個体、がんを治療したが、治療に応答することができなかった個体、及びがんを治療し、初期に応答したが、その後に治療に対して抵抗性になった個体を含めた、がんを有する個体が挙げられる。本開示の方法による治療に適する対象としては、感染を有すると診断された個体、及び感染を治療したが、治療に応答することができなかった個体を含めた、感染(例えば、病原体、例えば、細菌、ウイルス、原生動物などによる感染)を有する個体が挙げられる。本開示の方法による治療に適する対象としては、細菌感染を有すると診断された個体、及び細菌感染を治療したが、治療に応答することができなかった個体を含めた、細菌感染を有する個体が挙げられる。本開示の方法による治療に適する対象としては、ウイルス感染を有すると診断された個体、及びウイルス感染を治療したが、治療に応答することができなかった個体を含めた、ウイルス感染を有する個体が挙げられる。本開示の方法による治療に適する対象としては、自己免疫疾患を有すると診断された個体、及び自己免疫疾患を治療したが、治療に応答することができなかった個体を含めた、自己免疫疾患を有する個体が挙げられる。
材料及び方法
PD−L1への変異導入
Clontech N1 mCherry ベクターのSacI及びBamHIによる制限酵素部位にマウスの全長PD−L1をクローニングした。局在性及び発現レベルを改善するために、天然のリーダーペプチド配列をEPOリーダーペプチド配列によって置き換えた。部位特異的変異導入は、フィデリティが高いKODポリメラーゼ、2mMのdNTP、及び4mMのMgCl2 を使用して実施した。変異導入位置は、ヒトのPD−L1とPD−1とによって形成された複合体の結晶構造(PDB:3BIK)に基づいて選択した。マウスPD−L1における、対応する表面接触可能位置は、ヒトPD−L1に対して配列アライメントをとることによって同定した(合計で36位置)。変異導入は、それぞれの選択位置がAla残基、Glu残基、またはArg残基に変異するように試みた。全体の変異導入成功率は約70%であり、位置によっては、すべての置換(A、E、及びR)は得られなかった。HEK293細胞の浮遊液1mLを使用した一過性の遺伝子導入によって、配列検証済変異体の発現を試験した。その後、発現が野生型PD−L1と同等であり、膜局在化が正しく生じる変異体のみをマイクロアレイ及びFACSによる結合試験において利用し、その結果、アッセイに供するための60のPD−L1変異体を含む最終セットを得た。
PD−L1 mCherry変異コンストラクトをHEK293S細胞に一過性に遺伝子導入した後、プロテインAマイクロビーズ(Milltenyi)を負荷した。このプロテインAマイクロビーズは、PD−1 Fc融合体とFITC−Fcタンパク質とを4:1で含む混合物で事前に飽和させたものを使用した。Genentechによる以前の報告(16)に基づき、ビーズに対する総Fcタンパク質の比率は、マイクロビーズ10uL当たり5ugとした。FITC−Fcは、通常であれば非蛍光のマイクロビーズに緑色蛍光を与えるために使用した。各滴定実験について、10μgのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)−Fcと、40μgのPD−1−Fcタンパク質またはB7−1−Fcタンパク質のいずれかと、を総体積5mLの1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に含めた混合物を500μLのプロテインAマイクロビーズに負荷した。このビーズを4℃で一晩(約16時間)インキュベートした。負荷型ビーズを使用するまでの保管期間は、最大で2週間とした。最初の実験では、野生型PD−L1を遺伝子導入(遺伝子校導入効率は、一貫して60〜70%であった)した150,000個の細胞を飽和させるために十分な負荷型ビーズの量は75μLであることを決定した。滴定実験については、HEK−293細胞の浮遊液1mLを含む24ウェル組織培養プレートにおいて野生型及び変異したPD−L1コンストラクトのセットの遺伝子導入を行った。遺伝子導入から3日後に細胞の数を数え、2%のBSAを含む1×PBSで細胞を希釈して1×106 個細胞/mLとした。150K個の細胞(150μL)をエッペンドルフチューブに移し、2%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む追加の1×PBS(100μL)と共に、負荷型マイクロビーズを75μL添加した。反応液を回転させて4℃で1時間混合した後、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)を添加し、BD Aria IIIサイトメーターでフローサイトメトリーを行うことによって試料を直ちに分析した。データ解析は、生細胞(DAPI陰性)を最初にゲートした後、mCherry陽性細胞(PD−L1発現)のゲートを行うことによって実施した。FITC陽性(マイクロビーズの結合)のmCherry陽性細胞の割合を「結合パーセント」として使用した。各実験について、結合パーセントは、野生型の結合に基準化した。
mPD−L1 Fc融合タンパク質のクローニングを行うために、全長の野生型または変異したPD−L1の外部ドメイン(残基F19〜R237)を、C末端にhisタグを有するFcドメイン(mIgG2a−10×His)を含むLICベクターにサブクローニングした。こうしたコンストラクト及びアイソトープ(isotope)のみの対照をHEK293細胞の浮遊液1L中で一過性に発現させた。遺伝子導入から4日後、培地を収集し、50mMのMESを添加してpHを調整し、100mMのArg−Cl(pH7.6)を添加することで溶解性を改善した。その後、Fc融合体をNi2+−NTA樹脂(GE)で精製した。この精製は、バッチでの結合方法を使用した後、総体積10mLの樹脂を詰めたガラスカラム(容積600mL)で重量流を用いることによって行った。このNi2+−ニトロロ酢酸(nitroloacetic acid)(NTA)樹脂を100カラム体積の洗浄緩衝液(50mMのMES(pH6.5)、100mMのArg−Cl、5mMのイミダゾール、150mMのNaCl、10%のグリセロール)で洗浄し、500mMのイミジゾール(immidizole)を含む同一の緩衝液で結合タンパク質を溶出させた。ニッケル樹脂からの溶出液を濃縮し、50mMのMES(pH6.5)、100mMのArg−Cl、150mMのNaCl、10%のグリセロールにおいてS200sephadexカラム(GE)でゲル濾過を行うことによってさらに精製した。野生型のmPD−1 Fc(残基L25〜Q167)コンストラクト及びmB7−1 Fc(残基D37〜K245)コンストラクトは、レンチウイルス発現用のLICベクターにクローニングした。このベクターもまた、mIgG2a−10×Hisタグを含むものである。これらのコンストラクトをレンチウイルスパッケージングプラスミドと同時に遺伝子導入し、2日後にウイルス上清を収集した。大スケールの形質導入は、20×106 個の細胞及び5〜10mLのウイルス上清を用いて125mLのバッフル付きフラスコにおいて開始した。形質導入から3日目に完全培地の交換を実施し、5日目に培養のスケールアップを開始し、最終体積が1.5Lとなるまで行って終了した。12日目に、精製に向けて上清を収集した。得られたレンチウイルス上清を精製することでPD−1及びB7−1を得た。この精製は、mPD−L1を対象に記載したように行った。
上記のように社内で精製したPD−1 Fc融合タンパク質及びB7−1 Fc融合タンパク質を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)滴定アッセイを実施した。野生型または変異したPD−L1コンストラクトでHEK293浮遊細胞の遺伝子導入を行った。遺伝子導入から3日後に細胞の数を数え、1×PBSで細胞を希釈して1×106 個細胞/mLとした。最終濃度1μMのFc融合タンパク質及び1.5μMのAlexa488ヤギ抗マウス二次抗体を含む事前混合反応液を氷上で30分間インキュベートした。その後、この事前混合反応液を96ウェルプレートのウェルに対して量を増やしながら添加し、体積を50μLに調整した。その後、150μLの希釈細胞(総細胞数150,000個)をウェルに添加した。結合は、4℃で1時間実施し、遠心分離によってPBSで細胞を3回洗浄した後、FACSによって分析した。ゲートした生細胞をmCherryで部分ゲートし、mCherry陽性細胞をAlexa−488で部分ゲートした。結合パーセントは、Alexa−488が陽性であるmCherry細胞の割合を示す。結合部位が単一の場合の方程式であるY=B最大*X/(EC50+X)に対して3つの独立した実験を当てはめたものの平均値がデータとして示される。
C57BL/6マウスから脾臓を収集し、マウス抗CD4マイクロビーズ(Milltenyi)を使用してCD4+ T細胞を単離した。10%のウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、2mMのL−グルタミン、及び0.1%のBMEが添加されたRPMI完全培地にCD4+ T細胞を収集した。細胞の数を数え、製造者のプロトコールを使用してカルボキシフルオレセインN−スクシンイミジルエステル(CFSE)(Invitrogen)で細胞を染色した後、細胞の数を再度数えた。同日に、96ウェルTCプレートにウェル当たり75,000個の細胞を播種してRPMI完全培地に含め、そのままにして非活性化状態とするか、33.3nM(約5ug/mL)の抗CD3で活性化するか、または約5倍モル過剰(174.3nM)の対照Fcタンパク質、野生型PD−L1−Fcタンパク質、もしくは変異PD−L1 Fcタンパク質のいずれかの存在下で33.3nMの抗CD3で活性化した。活性化から4日後、非活性化T細胞に対してゲートを実施し、それによってCSFEの希釈を解析することで、FACSによって増殖を決定した。各実験から得られたデータは、対照のFc集団に基準化し、合計3つの独立した実験を平均化した。
mB7−1 hIgG1Fc融合コンストラクトのクローニングを行った。このコンストラクトでは、元の上記mIgG2aコンストラクトと同一のエリスロポエチン(EPO)リーダー、mB7−1外部ドメイン境界、及びリンカー配列を使用した。このコンストラクトは、HEK293細胞において一過性に発現させ、使用した他のFc融合タンパク質を対象に上に記載したように精製した。競合実験に向けて、野生型mPD−L1 mCherryを用いてHEK293浮遊細胞に一過性の遺伝子導入を行った。遺伝子導入から3日後、遺伝子導入細胞の数を数え、細胞を希釈して1×106 個細胞/mLとした。B7−1 hIgG1融合タンパク質を最終二量体濃度5nMで100,000個の遺伝子導入細胞に添加し、その際、PD−1 mIgG2aタンパク質の非存在下とするか、またはPD−1 mIgG2aタンパク質を濃度上昇系列(二量体濃度0.01〜250nM)として存在させた。並行実験として、精製したmIgG2aアイソタイプ対照の滴定を同等モル濃度で実施した。タンパク質の結合は、96ウェルプレートの振とう機上で、900rpm、22℃で1時間振とうして実施した。結合の後、0.2%のBSAを含む1×PBSでプレートを2回洗浄し、抗ヒト(H+L)Alexa488標識二次抗体(Invitrogen)を0.01μg/μL(合計1μg)で添加し、30分間インキュベートした。その後、0.2%のBSAを含む1×PBSでさらに2回、細胞を洗浄した。試料を直ちにFACSによって分析し、mCherryが陽性(FL4− PD−L1発現)であり、Alexa488もまた陽性(FL1− B7−1結合)である細胞のパーセントについてデータのゲートを行った。競合データは、mPD−1非存在下での5nMのB7−1の結合に基準化し、log[mPD−1]の関数としてプロットした。競合部位が1つの競合モデル方程式であるY=最小値+(最大値−最小値)/(1+10x-logEC50 )を使用し、3つの独立した実験に由来する平均データを当てはめた。
マイクロアレイ分析による機構的解析
選択的なPD−L1試薬を生成するために、PD−1とPD−L1との複合体のX線構造をフレームワークとして使用することで、変異導入のための残基を同定し、その結果、PD−L1のIg可変ドメインに含まれる36の溶媒露出残基を同定した(24)。それぞれの残基をアラニン、アルギニン、及びグルタミン酸に変更することで、側鎖の一連の特徴的な物理化学的特性のサンプリングを行った。一連の野生型及び変異したPD−L1コンストラクトに対してPD−1またはB7−1のFc融合タンパク質を負荷するために、細胞マイクロアレイプラットフォームを最初に使用した。こうした実験によって、PD−1結合のみに影響した変異体(D122A、Y123A、Y123R、K124A、K124D、R125A、R125D)、B7−1結合のみに影響した変異体(Y56A、Y56D、E72R、G119D、G120D)、または両方に影響した変異体(L53R、G119R、A121R)を同定した(図10に示される表1)。しかしながら、下記の理由から、細胞マイクロアレイを使用し、PD−1/B7−1結合を一貫して定量化することは困難であることが判明した。(1)PD−L1に対するB7−1の親和性が低いことから、PD−1を負荷したものと比較して、こうしたアレイではシグナル対ノイズ比が低下したこと、(2)結合の完全消失の同定は容易であったが、結合の中程度の減少は、より可変性であることが多かったこと、(3)スライドが独立してプリント、遺伝子導入、及び処理されることと関連して生じるスライドごとの固有の可変性がシグナル対ノイズ比の可変性に加わり、直接的な比較をより困難なものにしたこと。
PD−L1変異体の結合特性を検証し、より定量的に評価するために、我々は、ハイスループットな蛍光活性化細胞選別(FACS)アッセイを実施した。このアッセイでは、約15分ごとに96の試料を調べることが可能である。このFACsプラットフォームでは、細胞マイクロアレイと比較してダイナミックレンジの向上がもたらされる。検索タンパク質の提示様式が修正されることは、注目すべきことである。マイクロアレイプラットフォームにおいて使用した二価のIg融合体は、中程度の親和性を有する相互作用の同定には有効であるが、より弱い相互作用は見逃される可能性がある。PD−L1変異体のライブラリーの分析において予測される広範囲の見かけの親和性の検出を支援するために、磁性マイクロビーズによる捕捉及び提示によって高まった結合価を利用した(図7A)。例えば、PD−L1を提示するマイクロアレイの探索では、PD−1 Fcと比較してB7−1 Fcの濃度を高めることが必要であり、このことによってバックグラウンドシグナルが強くなるという結果を招いた。FACSマイクロビーズアッセイを使用することで観測されるダイナミックレンジの向上は、非特異的な結合によるバックグラウンドが減少することに少なくとも部分的には起因するものである。このことの理由は、以下の2つである可能性がある。(1)マイクロビーズアッセイでは二次抗体を使用しないこと、(2)親和性の向上が、細胞の負荷に使用し得るタンパク質の量の減少を意味すること。マイクロビーズアッセイは、洗浄段階を全く必要としないという利点を追加で有しており、このことによって結合試料の消失が最小化し、アッセイにおけるタンパク質結合の測定が、よりいっそう直接的なものとなる。さらに、B7−1とPD−L1との間の相互作用などの、いくつかのより低い親和性相互作用については、FACSアッセイにおいて可溶性のB7−1 Fcで飽和を達成することは困難であるが、B7−1 Fc結合型のマイクロビーズでは顕著な改善がもたらされた。
24ウェル浮遊組織培養プレートにおけるHEK293細胞のハイスループットな一過性の遺伝子導入では、スクリーニングに見合う量で組換えの分泌型Fc融合タンパク質が産生するように最適化を行った。この方法を利用し、結合特性が改変されたPD−L1変異体のサブセットについてFc融合タンパク質の精製を行った。PD−L1タンパク質を小スケールでニッケル精製した後、分析ゲル濾過によって、選択変異体の挙動が野生型タンパク質と同様であることが示された。T細胞増殖試験において活性を試験する前に、表面固定型のPD−1またはB7−1(GFP融合体)を発現するHEK細胞に対する結合について、それぞれの変異タンパク質の品質をFACS分析によって評価し、その結果、可溶性試薬の挙動が予測どおりであることが確認された(すなわち、PD−L1_Y56A_Fcは、PD−1を発現する細胞には結合するが、B7−1を発現する細胞には結合しない)。
変異導入データによって、PD−1及びB7−1に結合するPD−L1の結合表面が、重複しているが、明確に異なることが示され、このことは、PD−1とB7−1とが、PD−L1に対する結合について競合するであろうことを示唆している。この仮説は、2つの異なるFc融合アイソタイプを使用して我々が精製したB7−1及びPD−1のFc融合タンパク質を利用する細胞ベースのFACS競合アッセイを使用して試験した。こうした試薬を用いて、PD−1(mIgG2a)の濃度上昇系列で滴定し、それと同時に、野生型PD−L1を発現するHEK細胞に結合しているB7−1(hIgG1)の消失を、抗ヒトAlexa488二次抗体を使用して選択的に監視した(図9A)。PD−1結合が、PD−L1を発現する細胞からB7−1を効率的に置き換えることが結果によって示され、このことは、結合部位が重複しているという、PD−L1変異導入に基づく知見を支持するものである。
A)FACSによるマイクロビーズ結合アッセイの模式図を示す。B)代表的な対照マイクロビーズ実験を示す。対照Fc、PD−1 Fc融合タンパク質、またはB7−1 Fc融合タンパク質が結合したマイクロビーズを、mCherry単独(−対照)またはPD−L1 mCherryのいずれかを発現する細胞に負荷した。FACSデータは、すべての生細胞に対してゲートを行ったものであり、野生型PD−L1を発現する細胞に対して、PD−1がコートされたマイクロビーズと、B7−1がコートされたマイクロビーズとの両方が結合することを示している(右上の四分区画)。C)54個PD−L1変異体の一団に対するFACSによるマイクロビーズ結合のデータを示す。データは、PD−1(青色)またはB7−1(赤色)のいずれかでコートされたマイクロビーズに結合したmCherry陽性細胞(PD−L1発現)のフラクションを示しており、結合は、野生型に基準化されている。PD−1結合及びB7−1結合は、3連の実験において並行して実施したものであり、エラーバーは、標準偏差を示す。
A)PD−1とPD−L1との複合体の結晶構造(PDB:3SBW)であり、PD−L1のIgCドメイン及びIgVドメインのみが示される。IgVドメインが拡大されており、変異すると結合が変化した残基は下記に従って標識及び色付けされている。緑色=PD−1結合が影響を受ける、赤色=B7−1結合が影響を受ける、灰色=PD−1結合とB7−1結合との両方が影響を受ける。B)野生型PD−L1または変異体のいずれかを発現する細胞を組換えのPD−1 Fc融合タンパク質またはB7−1 Fc融合タンパク質の濃度上昇系列で滴定したFACS滴定実験から得られたデータを示す。結合は、抗マウスAlexa488二次抗体を使用して検出した。データ点は、3つの独立した実験の平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。曲線は、結合部位が単一の場合の結合モデルにデータを当てはめたものを示す。C)BにおけるFACS滴定実験から得られたEC50値及びB最大値の表を示す。星印は、滴定するには非常に結合が弱く(ベースライン)、データを当てはめることが不可能であったものを示す。D)データは、C57BL/6マウスから単離してCSFEで標識し、アイソタイプ対照、野生型、または変異したPD−L1 Fc融合タンパク質の存在下で、抗CD3で4日間刺激した後に活性化したCD4+ T細胞のフラクションを示す。活性化は、アイソタイプ対照に基準化したものであり、3つの独立した実験を示す。
A)競合アッセイの模式図を示す。簡潔に記載すると、PD−L1 mCherryを一過性に遺伝子導入したHEK293細胞を、mPD−1 mIgG2aの濃度上昇系列の非存在下または存在下でmB7−1 hIgG1タンパク質と共にインキュベートした。その後、細胞に結合したmB7−1 hIgG1の量を、抗ヒトAlexa488抗体を使用し、FACS分析によって監視した。B)1つの代表的な実験に由来する結果を示すヒートマップを示す。対照mIgG2aの存在下では、mB7−1 hIgG1の結合の消失は観測されなかった。グラフは、3つの独立した実験から得られたデータに対する平均値及び標準偏差を示す。このデータは、Prismソフトウェアにおいて競合部位が1つの場合のモデル方程式を使用して当てはめたものであり、EC50は、8.3±1.5nMと計算された。
1型糖尿病のNY8.3 TCR遺伝子導入NODモデル(NOD8.3)では、MHCクラスI対立遺伝子であるH−2Kd と関連して膵ベータ細胞抗原であるIgrp206−214を標的とする侵襲性のT細胞自己免疫が生じる。NOD8.3マウスは、循環性の遺伝子導入(Igrp特異的)T細胞を高頻度で有する。脾臓における病原性の遺伝子導入T細胞の頻度に対する作用を決定するために、Igrp206-214 /H−2Kd 及びPD−L1(G119R変異体)を有するPD−L1/synTacをNOD8.3マウスに投与した。図12に示されるように、PD−L1(G119R)/synTacは、Igrp206-214 /H−2Kd に特異的なT細胞の用量依存的な枯渇を引き起こすが、非特異的なT細胞にはこの作用を及ぼさない。
本出願は、2016年5月18日出願の米国仮特許出願第62/338,128号の利益を主張し、当該出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
Claims (87)
- 図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異PD−L1免疫調節ポリペプチドであって、
前記変異PD−L1免疫調節ポリペプチドは、図2Aに示されるPD−L1アミノ酸配列、または配列番号1に示されるPD−L1アミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換を有し、
a)図3Aまたは図3Bに示されるアミノ酸配列を有するPD1ポリペプチドに対する、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性と比較して、前記PD1ポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し、及び/または
b)図3Cまたは図3Dに示されるアミノ酸配列を有するB7−1ポリペプチドに対する、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性と比較して、前記B7−1ポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、変異PD−L1免疫調節ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、図2Aに示されるアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸D26、アミノ酸T37、アミノ酸V54、アミノ酸Q66、もしくはアミノ酸E72の置換を含むか、または前記ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸D26、アミノ酸T37、アミノ酸I54、アミノ酸Q66、もしくはアミノ酸E72の置換を含む、請求項1に記載の変異免疫調節ポリペプチド。
- 前記変異免疫調節ポリペプチドは前記PD1ポリペプチドに対して示す結合親和性が、図2Aもしくは図2Bまたは配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の10%未満〜75%未満である、請求項1または請求項2に記載の変異免疫調節ポリペプチド。
- 前記変異免疫調節ポリペプチドは前記B7−1ポリペプチドに対して示す結合親和性が、図2Aもしくは図2Bまたは配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の10%未満〜75%未満である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチド。
- 前記変異免疫調節ポリペプチドは前記PD1ポリペプチドに対して示す結合親和性が、図2Aもしくは図2Bまたは配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の75%〜95%超である、請求項1、請求項2、または請求項4のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチド。
- 前記変異免疫調節ポリペプチドは前記B7−1ポリペプチドに対して示す結合親和性が、図2Aもしくは図2Bまたは配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列を含むPD−L1ポリペプチドが示す結合親和性の75%〜95%超である、請求項1〜3または請求項5のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチド。
- a)
i)エピトープ、
ii)第1の主要組織適合抗原複合体(MHC)ポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)第2のMHCポリペプチド、及び
ii)任意選択の免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドまたは非Ig骨格
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む多量体ポリペプチドであって、
前記多量体ポリペプチドは、1つまたは複数の免疫調節ドメインを含み、前記1つまたは複数の免疫調節ドメインの少なくとも1つが、
A)前記第1のポリペプチドのC末端、
B)前記第2のポリペプチドのN末端、
C)前記第2のポリペプチドのC末端、または
D)前記第1のポリペプチドのC末端及び前記第2のポリペプチドのN末端
に位置し、
前記免疫調節ドメインは、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記変異PD−L1免疫調節ポリペプチドは、図2Aに示されるPD−L1アミノ酸配列、または配列番号1に示されるPD−L1アミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を有し、
前記変異PD−L1免疫調節ポリペプチドは、
a)図3Aまたは図3Bに示されるアミノ酸配列を有するPD1ポリペプチドに対する、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性と比較して、前記PD1ポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し、及び/または
b)図3Cまたは図3Dに示されるアミノ酸配列を有するB7−1ポリペプチドに対する、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列の結合親和性と比較して、前記B7−1ポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、図3Aまたは図3Bに示されるアミノ酸配列を有するPD1ポリペプチドに対する、図2Aもしくは図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列を含む免疫調節ドメインを含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性、または配列番号1もしくは配列番号2に示されるPD−L1アミノ酸配列を含む免疫調節ドメインを含む対照多量体ポリペプチドの結合親和性と比較して、前記PD1ポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、
ii)前記第1のMHCポリペプチド、及び
iii)前記免疫調節ドメイン
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記第2のMHCポリペプチド、及び
ii)前記IgFcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、及び
ii)前記第1のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記免疫調節ドメイン、
iii)前記第2のMHCポリペプチド、及び
ii)前記IgFcポリペプチド、
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、及び
ii)前記第1のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記第2のMHCポリペプチド、
ii)前記IgFcポリペプチド、及び
iii)前記免疫調節ドメイン
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、及び
ii)前記第1のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記第2のMHCポリペプチド、及び
ii)前記免疫調節ドメイン
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、及び
ii)前記第1のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記免疫調節ドメイン、及び
ii)前記第2のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記多量体ポリペプチドは、
a)
i)前記エピトープ、
ii)前記第1のMHCポリペプチド、及び
iii)前記免疫調節ドメイン
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドと、
b)
i)前記第2のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドと、
を含む、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。 - 前記非Ig骨格は、XTENポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド、シルク様ポリペプチド、またはシルク−エラスチン様ポリペプチドである、請求項7に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第1のMHCポリペプチドは、β2−ミクログロブリンポリペプチドであり、前記第2のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖ポリペプチドである、請求項7〜15のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記β2−ミクログロブリンポリペプチドは、図6に示されるアミノ酸配列のうちの1つに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、請求項16に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、図5A〜5Cのうちの1つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第1のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIアルファ鎖ポリペプチドであり、前記第2のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIベータ鎖ポリペプチドである、請求項7〜16のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記エピトープは、T細胞エピトープである、請求項7〜20のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- Fcポリペプチドを含み、前記IgFcポリペプチドは、IgG1Fcポリペプチド、IgG2Fcポリペプチド、IgG3Fcポリペプチド、IgG4Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである、請求項7〜11及び請求項15〜18のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記IgFcポリペプチドは、図4A〜4Cに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとが、非共有結合で結合される、請求項7〜22のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとが、共有結合で連結される、請求項7〜22のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記共有結合は、ジスルフィド結合を介するものである、請求項24に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第1のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第1のMHCポリペプチドとの間のリンカーは、アミノ酸置換を含むことで第1のCys残基を与え、前記第2のMHCポリペプチドは、アミノ酸置換を含むことで第2のCys残基を与え、前記ジスルフィド結合が、前記第1のCys残基と前記第2のCys残基との間に形成される、請求項25に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記エピトープと、前記第1のMHCポリペプチドとの間に挿入された第1のリンカーを含む、請求項7〜14のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記変異PD−L1免疫調節ポリペプチドは、図2Bに示されるPD−L1アミノ酸配列のアミノ酸の番号付けに基づくD26、T37、I54、Y56、Q66、E72、I115、G119、またはG120から選択されるアミノ酸の置換を含む、請求項7〜14のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 2つ以上の変異PD−L1免疫調節ポリペプチドを含む、請求項7〜28のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記2つ以上の免疫調節ポリペプチドは、直列に存在する、請求項29に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記免疫調節ポリペプチドは、請求項1〜6のいずれか1項に記載の免疫調節ポリペプチドである、請求項7〜28のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記多量体ポリペプチドは、第3のポリペプチドを含み、前記第3のポリペプチドは、前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドの前記免疫調節ポリペプチドに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫調節ポリペプチドを含む、請求項29〜31のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第3のポリペプチドが、前記第1のポリペプチドに共有結合で連結される、請求項32に記載の多量体ポリペプチド。
- 前記第2のポリペプチドは、
i)前記第2のMHCポリペプチド、
ii)前記IgFcポリペプチド、及び
iii)親和性タグ
をN末端からC末端の順序で含む、請求項7〜13及び請求項15〜33のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド。 - 組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、
i)前記組換えポリペプチドは、
a)エピトープ、
b)第1の主要組織適合抗原複合体(MHC)ポリペプチド、
c)請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチドである免疫調節ポリペプチド、
d)タンパク分解により切断可能なリンカーもしくはリボソームスキッピングシグナル、
e)第2のMHCポリペプチド、及び
f)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含むか、または
ii)前記組換えポリペプチドは、
a)エピトープ、
b)第1のMHCポリペプチド、
c)タンパク分解により切断可能なリンカーもしくはリボソームスキッピングシグナル、
d)請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチドである免疫調節ポリペプチド、
e)第2のMHCポリペプチド、及び
f)IgFcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む、核酸。 - 前記第1のMHCポリペプチドは、β2−ミクログロブリンポリペプチドであり、前記第2のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖ポリペプチドである、請求項35に記載の核酸。
- 前記β2−ミクログロブリンポリペプチドは、図6に示されるアミノ酸配列のうちの1つに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の核酸。
- 前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、請求項36に記載の核酸。
- 前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、図5A〜5Cのいずれか1つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の核酸。
- 前記第1のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIアルファ鎖ポリペプチドであり、前記第2のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIベータ鎖ポリペプチドである、請求項35に記載の核酸。
- 前記エピトープは、T細胞エピトープである、請求項35に記載の核酸。
- 前記IgFcポリペプチドは、IgG1Fcポリペプチド、IgG2Fcポリペプチド、IgG3Fcポリペプチド、IgG4Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである、請求項35に記載の核酸。
- 前記IgFcポリペプチドは、図4A〜4Cに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の核酸。
- 前記変異PD−L1ポリペプチドは、図2Aに示されるアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸D26、アミノ酸T37、アミノ酸V54、アミノ酸Q66、もしくはアミノ酸E72の置換を含むか、または前記ポリペプチドは、図2Bに示されるアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸D26、アミノ酸T37、アミノ酸I54、アミノ酸Q66、もしくはアミノ酸E72の置換を含む、請求項35に記載の核酸。
- 多量体ポリペプチドは、2つ以上の変異PD−L1免疫調節ポリペプチドを含む、請求項35に記載の核酸。
- 前記タンパク分解により切断可能なリンカーまたはリボソームスキッピングシグナルは、
a)LEVLFQGP(配列番号34)、
b)ENLYTQS(配列番号35)、
c)フューリン切断部位、
d)LVPR(配列番号37)、
e)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号38)、
f)GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(配列番号39)、
g)GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(配列番号40)、及び
h)GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(配列番号41)
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の核酸。 - 前記組換えポリペプチドは、
a)第1のリーダーペプチド、
b)前記エピトープ、
c)前記第1のMHCポリペプチド、
d)前記免疫調節ポリペプチド、
e)前記タンパク分解により切断可能なリンカーまたはリボソームスキッピングシグナル、
f)第2のリーダーペプチド、
g)前記第2のMHCポリペプチド、及び
h)前記免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む、請求項35に記載の核酸。 - 前記第1のリーダーペプチド及び前記第2のリーダーペプチドは、β2−Mリーダーペプチドである、請求項47に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド配列が、転写制御要素に機能可能なように連結される、請求項35に記載の核酸。
- 前記転写制御要素は、真核細胞において機能するプロモーターである、請求項49に記載の核酸。
- 前記第1のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第1のMHCポリペプチドとの間のリンカーは、アミノ酸置換を含むことで第1のCys残基を与え、前記第2のMHCポリペプチドは、アミノ酸置換を含むことで第2のCys残基を与え、前記第1のCys残基及び前記第2のCys残基は、前記第1のMHCポリペプチドと前記第2のMHCポリペプチドとの間にジスルフィド結合を生成する、請求項35に記載の核酸。
- 請求項35〜51のいずれか1項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
- 前記ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項52に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項52に記載の組換え発現ベクターで遺伝子改変された、宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、インビトロのものである、請求項54に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、前記細胞が内在性のMHCβ2−ミクログロブリンポリペプチドを産生しないように遺伝子改変される、請求項54に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Tリンパ球である、請求項54に記載の宿主細胞。
- a)
i)エピトープ、
ii)第1のMHCポリペプチド、及び
iii)請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチドである免疫調節ドメイン
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸と、
b)
i)第2のMHCポリペプチド、及び
ii)IgFcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸と、
を含む、組成物。 - a)
i)エピトープ、及び
ii)第1のMHCポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸と、
b)
i)請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異免疫調節ポリペプチドである免疫調節ドメイン
ii)第2のMHCポリペプチド、及び
iii)IgFcポリペプチド
をN末端からC末端の順序で含む第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸と、
を含む、組成物。 - 前記第1の核酸及び/または前記第2の核酸は、組換え発現ベクターに存在する、請求項58または請求項59に記載の組成物。
- 請求項58〜60のいずれか1項に記載の組成物で遺伝子改変された、宿主細胞。
- 請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチドの産生方法であって、
a)請求項54〜57及び請求項61のいずれか1項に記載の宿主細胞が前記多量体ポリペプチドを合成する条件下での培地における前記宿主細胞のインビトロの培養と、
b)前記宿主細胞及び/または前記培地からの前記多量体ポリペプチドの単離と、
を含む、方法。 - 前記第2のポリペプチドは、親和性タグを含み、前記単離は、前記細胞によって産生される前記多量体ポリペプチドと、前記親和性タグに対する結合パートナーと、の接触を含み、前記結合パートナーが固定化されていることによって前記多量体ポリペプチドが固定化される、請求項62に記載の方法。
- 前記固定化された多量体ポリペプチドの溶出を含む、請求項62に記載の方法。
- エピトープ特異的T細胞の活性の選択的調節方法であって、
前記エピトープ特異的T細胞と、請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチドと、の接触を含み、
前記接触は、前記エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する、方法。 - 前記免疫調節ポリペプチドは、抑制ポリペプチドであり、前記多量体ポリペプチドは、前記エピトープ特異的T細胞を抑制する、請求項65に記載の方法。
- 前記接触は、インビトロのものである、請求項65に記載の方法。
- 前記接触は、インビボのものである、請求項65に記載の方法。
- 前記接触は、エキソビボのものである、請求項65に記載の方法。
- 個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性の選択的調節方法であって、
個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性の選択的調節に有効な請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチドの、有効量での前記個体への投与を含む、方法。 - 前記免疫調節ポリペプチドは、抑制ポリペプチドであり、前記多量体ポリペプチドは、前記エピトープ特異的T細胞の活性を抑制する、請求項70に記載の方法。
- 前記エピトープは、自己エピトープであり、前記投与によって、前記自己エピトープに特異的なT細胞の活性が選択的に抑制される、請求項71に記載の方法。
- 前記エピトープは、同種移植片に存在するエピトープであり、前記投与によって、前記同種移植片に特異的なT細胞の活性が選択的に抑制される、請求項71に記載の方法。
- 個体における自己免疫障害の治療方法であって、
前記個体における自己エピトープに特異的なT細胞の活性の選択的抑制に有効な請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチドの、有効量での前記個体への投与を含み、それによって前記自己免疫障害が治療される、方法。 - 前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、または自己免疫性関節炎である、請求項74に記載の方法。
- 個体における同種移植片拒絶の抑制方法であって、
前記個体に存在する同種移植片に存在するエピトープに特異的なT細胞の活性の選択的抑制に有効な請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチドの、有効量での前記個体への投与を含み、それによって同種移植片拒絶が抑制される、方法。 - 前記同種移植片は、腎臓、肺、皮膚、肝臓、骨、軟骨、または心臓である、請求項76に記載の方法。
- 前記投与は、皮下投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、静脈内投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、筋肉内投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、全身投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、治療部位から遠い位置への投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、局所投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記投与は、治療部位または治療部位付近への投与である、請求項70〜77のいずれか1項に記載の方法。
- a)請求項7〜34のいずれか1項に記載の多量体ポリペプチド、及び
b)医薬的に許容可能な賦形剤
を含む、組成物。 - a)請求項35〜51のいずれか1項に記載の核酸、または請求項52もしくは請求項53に記載の組換え発現ベクター、及び
b)医薬的に許容可能な賦形剤
を含む、組成物。
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