JP2019515695A - 未熟膵臓からのイヌ科動物β細胞株の生産 - Google Patents
未熟膵臓からのイヌ科動物β細胞株の生産 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019515695A JP2019515695A JP2019511806A JP2019511806A JP2019515695A JP 2019515695 A JP2019515695 A JP 2019515695A JP 2019511806 A JP2019511806 A JP 2019511806A JP 2019511806 A JP2019511806 A JP 2019511806A JP 2019515695 A JP2019515695 A JP 2019515695A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- canine
- cells
- pancreatic
- cell
- insulin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
Abstract
Description
イヌ科動物の糖尿病、および一般的にはペット動物の糖尿病の有病率は、近年、特に疫学的レベルで初めて研究された。やはり動物の糖尿病の有病率もヒトと同様に増えている。獣医は、イヌ科動物の糖尿病の頻度は欧州およびUSAでは30年で3倍になったと見積もっている。しかしながら、イヌの糖尿病の原因は、詳細な特徴付けがなされて来なかった。結果として、イヌ科動物の糖尿病は、疾病経過において診断が遅れることが多い。
細胞療法による飼育動物の慢性疾患または損傷の治療は、獣医学分野ですでに実施されている。
哺乳動物成熟膵臓は、膵管を介して腸へ分泌される酵素(例えば、カルボキシペプチダーゼ−A)を産生する腺房細胞から構成される外分泌組織と、インスリン(β細胞)、グルカゴン(α細胞)、ソマトスタチン(δ細胞)および膵ポリペプチド(PP細胞)などのホルモンを産生する細胞から構成されるランゲルハンス島を含む、内分泌島としても知られる内分泌組織の2種類の組織を含む。
本明細書でそうではないことが定義されない限り、本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に共通に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈がそうではないことを必要としない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞・組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質・核酸化学ならびにハイブリダイゼーション、またそれらの技術に関して使用される名称は、当技術分野で周知かつ慣用されるものである。本発明の実施は、特に断りのない限り、分子生物学(組換え技術を含む)微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用し、それらは当業者の範囲内にある。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et ah, eds., 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)などの文献で十分に説明されている。酵素反応および精製技術は、製造者の明細書に従って、当技術分野で一般に達成されているように、または本明細書に記載されているように実施される。
a)イヌ科動物未熟膵細胞に、i)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスベクター、またはii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスベクターおよびインスリンプロモーターの制御下でhTertを発現するレンチウイルスベクター、またはiii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原とhTertの両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入および同時形質導入する工程;
b)a)で得られた形質導入未熟膵細胞を第1の重症複合免疫不全症(scid)非ヒト動物の腎被膜に導入する工程;
c)形質導入未熟膵細胞にインスリノーマ様構造を発達させる工程、ここで、インスリノーマ様構造のイヌ科動物未熟膵細胞はインスリン産生膵β細胞に分化している;
d)工程c)で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させる工程;
e)工程d)で得られた細胞を第2のscid非ヒト動物の腎被膜にサブ移植する工程;
f)工程e)のサブ移植細胞に新たに発達したインスリノーマ様構造を発達および再生させる工程、ここで、当該新たに発達したインスリノーマ様構造はインスリン産生膵β細胞内で富化される;
g)工程f)で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させ、回収する工程;
h)場合により、工程g)で得られた細胞を第3の非ヒトscid動物の腎被膜にサブ移植し、インスリン産生膵β細胞のさらなる富化および増幅を可能とする工程;および
i)場合により、適当な量のインスリン産生膵β細胞が得られるまで工程e)、f)およびg)を繰り返す工程
を含んでなる方法を対象とする。
イヌ科動物特異的インスリンの発現、および
転写因子Pdx陽性
のうち少なくとも1つを示す。
カルボキシペプチダーゼ−A陰性
転写因子Pdx1陽性
転写因子MafA陽性
プロコンベルターゼPcsk1陽性
グルコース輸送体Glut2の発現
カリウムチャネルのサブユニットをコードするKcnj11およびAbcc8の発現
亜鉛輸送体Znt8(Slc30a8)の発現
イヌ科動物特異的インスリンの発現
のうち少なくとも1つをさらに示す。
A.1.イヌ科動物膵組織の供給源および回収手順
表1に示されるように、イヌ胎仔膵臓の受胎後(pc)30、33、36、40、45および55日という6つの発達段階を選択した。本研究は、pc55日に調べた胎仔膵臓を除き、単一系統のビーグル犬、すなわちMaison−Alfort Veterinary Schoolの飼育施設で養育した系統に絞った。この55pcに得られた胎仔の母親は、Veterinary schoolで養育したものではなく、55pcに得られたその胎仔の種類は不明であった。その母親の体長はビーグル犬に相当するものであった。
手術後すぐに、総ての膵臓を摘出し、3.7%ホルムアルデヒド中で固定した後、パラフィンに包理した。pc30日および33日の膵臓では、膵臓および胃を含む全中腸管を摘出したが、それ以降の段階では、膵臓のみを摘出した。新生仔(1日)および幼犬(8週間)の膵組織は、犬の死亡の1時間後に摘出し、PBS−10%ホルモール溶液で固定した後にパラフィン包理した。同じ手順を成犬から得られた膵断端にも適用した。この場合、膵断端は右葉から採取した。
パラフィン包埋切片は、初期段階に対しては4μm、出生後および成犬段階には5μmの厚さで切断した。切片をモルモット抗インスリン抗体(1/500;A0564、Dako−Cytomation)およびウサギ抗グルカゴン(1/1000;20076−Immuno、Euromedex)で染色した。二次抗体はフルオレセインテキサスレッド抗モルモット抗体(1/2000;706−076−148、Jacksonおよび抗ウサギ抗体(1/200;711−096−152、Jackson Immunoresearch Laboratories、Beckman Coulter)であった。Axio Scan Z1(Zeiss)を用いてデジタル画像をキャプチャーした。
レンチウイルスベクターpTRIP ΔU3.RIP405−SV40LT loxPおよびpTRIP ΔU3.RIP405−hTERT loxPは、従前に記載された(Ravassard et al, 2009)pTrip ΔU3.RIP405−SV40LT/hTERTの3’LTR領域にloxP部位を付加することによって構築した。両pTRIP ΔU3ベクターをKpnIおよびPacIで消化して3’LTR領域を除去した。SIN−RP−LTcDNA−WHV−U3loxP(Bernard Thorensにより提供)の3’LTRloxP領域をPCRにより増幅し、次にKpnIおよびPacIで消化し、その後、2つの線状化したpTripベクターに連結した。レンチウイルスベクター原株は、従前に記載されているように(Zufferey et al., 1997)、p8.9プラスミド(ΔVprΔVifΔVpuΔNef)、VSV糖タンパク質GをコードしたpHCMV−GおよびpTRIP ΔU3組換えベクターのキャプシド形成による293T細胞の一時的トランスフェクションによって生産した。上清をDNアーゼI(Roche Diagnostic)で処理した後、超遠心分離を行い、得られたペレットをPBSに再懸濁させ、アリコートに分け、その後、使用まで−80℃で冷凍した。p24キャプシドタンパク質の量は、HIV−1 p24抗原ELISA(Beckman Coulter)によって定量した。総ての形質導入は、p24キャプシドタンパク質定量に対して正規化した。
膵組織をウシ胎仔血清痛で1mm角の切片とし37℃で30分間、コラゲナーゼXI(1mg/ml RPMI)(Sigma−Aldrich)で処理し、次に、20%ウシ胎仔血清を含有するPBS中で3回すすいだ。新生膵臓に、従前に記載されているように(Castaing et al., 2005; Scharfmann 2008)、pTRIP ΔU3.RIP405−SV40LT loxPを形質導入した。簡単に述べれば、組織に、5.6mMグルコース、2%ウシ血清アルブミン画分V(BSA、Roche diagnostics)、50μM 2−メルカプトエタノール、10mMニコチンアミド(Calbiochem)、5.5μg/mlトランスフェリン(Sigma−Aldrich)、6.7ng/mlセレナイト(Sigma−Aldrich)、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンおよび10μg/ml DEAE−デキストランを含んだ200μlのDMEM中、37℃で2時間、2μgのp24キャプシドタンパク質に相当する合計量のレンチウイルスベクターを形質導入した。次に、組織を培養培地で2回洗浄し、scidマウスに移植まで、一晩培養で維持した。
雄scidマウス(Harlan)をアイソレーター内で管理した。解剖顕微鏡を用い、従前に記載されているように(Ravassard et al., 2011)、膵臓または膵島を腎被膜下に移植した。移植後の種々の時点で、マウスを犠牲にし、腎臓を摘出し、移植片を切開した。総ての動物試験およびプロトコールは、契約番号B75−13−03の下、フランス立法に従ってVeterinary Inspection Officeにより承認されたものである。
MERCODIAにより市販されているELISAキットを製造者の説明書に従って用い、イヌ特異的インスリンのレベルをアッセイした。
1−緒論
本発明の方法は、in vitroで維持および拡大培養可能なイヌ科動物β細胞株の取得を可能とする。これはイヌ科動物の糖尿病の細胞療法の開発に向けた第一段階である。
受胎後30日(pc;E−30)からpc45日(E−45)までのイヌ胎仔膵臓の発達を図1に示す。左のレーンの上から下へ、胃の近くに局在した30日および33日目高密度の上皮芽から、36日から45日までの明瞭に分岐した上皮へと、膵上皮が顕著な拡大プロセスおよび分岐を受ける(図1、E−30〜E−45)。分岐した上皮では、幹部と頂部の両方が見て取れる(図1、E−36およびE−45、矢印)。
哺乳動物膵臓において、内分泌細胞は、外分泌組織に埋め込まれたランゲルハンス島に分類され、インスリン、グルカゴンおよびその他のポリペプチドホルモンを血流中へ分泌する。この構造は、成体哺乳動物でかなり集中に研究されており、種で保存されている(Steiner et al., 2010; Kim A. et al., 2010)。これに対して、胎仔および出生後の内分泌膵臓の発達は齧歯類(Pictet et al., 1972)およびヒト(Hawkins et al., 1987; Justice et al., 1997)で深く調べられているが、他の哺乳動物では、それは大方無視されている。本研究の目的は、初期胎仔から出生後までのイヌ科動物α細胞およびβ細胞の分化および成長を記述することであった。
受胎後42日のイヌ胎仔から得られた膵臓を、scidマウスの腎被膜下に移植した。腫瘍が2か月後に発達した(図4A)。免疫組織化学的分析は、多量のインスリン分泌細胞およびグルカゴン分泌細胞の存在を明らかにする(図4B)。成体β細胞に通常見られるPDX転写因子の存在は、膵細胞が正常な発達をしていることを示す(図4C)。これらの結果は、scidマウスに移植した場合、イヌ科動物胎仔膵臓は正常に成長および成熟し、インスリンとPDXの両方を発現するβ細胞を有することを示す。
インスリノーマ様構造は、上記実施例C)に記載のとおりにscidマウスの腎被膜下にSV40LT形質導入イヌ胎仔膵細胞を移植した後に得られた。インスリノーマ様構造を顕微解剖し、細胞を解離させた。解離した細胞を新たなscidマウスの腎被膜にサブ移植し、新たに発達したインスリノーマ様構造を得た。マウスを犠牲にし、インスリノーマ様構造を顕微解剖した。インスリノーマ様構造の細胞を解離させ、膵β細胞を回収して均質な細胞集団を形成した。これらの均質な細胞集団をin vitroで、マトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングプレート上、5.5mMグルコース、BSA、ニコチンアミド、2−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリンおよびナトリウムセレンを含有する無血清培地中で培養し、イヌβ細胞株を樹立した。イヌβ細胞株は、マトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングウェル上、無血清培地中での培養で維持および成長させた。
Ahlgren KM, Fall T, Landegren N, Grimelius L, von Euler H, Sundberg K, Lack of evidence for a role of islet autoimmunity in the aetiology of canine diabetes mellitus PLoS One. (2014);9(8):e105473.;
Barbas et al., 2001, Phage Display: A Laboratory Manual
Beta-cell development: the role of intercellular signals.Diabetes Obes Metab. 2008 Nov;10 Suppl 4:195-200.
Bonnet BN. & Egenvall A. “Age patterns of disease and death in insured Swedish dogs, cats and horses”, Department of Population Medicine, University of Guelph, Ontario, Canada nal of comparative pathology." J Comp Pathol. 2010 Jan;142 Suppl 1:S33-8.
Bricout-Neveu E, Pechberty S, Reynaud K, Maenhoudt C, Lecomte MJ, Ravassard P, and Czernichow P - Development of the Endocrine Pancreas in the Beagle Dog: From Fetal to Adult Life Anat Rec 2017 Mar 14. doi: 10.1002/ar.23595.
Castaing, M., Duvillie, B., Quemeneur, E., Basmaciogullari, A., and Scharfmann, R. (2005). Ex vivo analysis of acinar and endocrine cell development in the human embryonic pancreas. Dev Dyn 234, 339-345.
Catchpole B., Ristic JM., Fleeman LM. & Davison LJ. “Canine diabetes mellitus: can old dogs teach us new tricks?” in Diabetologia, 2005; 48:1948-56;
Davison LJ, Weenink SM, Christie MR, Herrtage ME, Catchpole B. Autoantibodies to GAD65 and IA-2 in canine diabetes mellitus. Veterinary immunology and immunopathology. (2008);126:83-90
Davison LJ., Herrtage ME. & Catchpole B. “Study of 253 dogs in the United Kingdom with diabetes mellitus” inVet Rec. 2005; 156(15):467-71.
F. M. Ausubel et ah, eds., 1987 Current Protocols in Molecular Biology
Gale E. A. M. Do dogs develop autoimmune diabetes? Diabetologia (2005) 48: 1945-1947
Hawkins, K.L ., Summers, A. , P. Kuhajda, P., Smith, C. A. Immunocytochemistry of Normal Pancreatic Islets and Spontaneous Islet Cell Tumors in Dogs Vet. Pathol. 2170-179 (1987)
Justice, D., Cruccioli, N., Roque, C., Galls, J,F., Remaudet, B., Cahard, D. Etude morphometrique des ilots de Langerhans du pancreas du chien Beagle Rev Fr Histotechnology 1997, 10 :45-49
Kennedy LJ, Davison LJ, Barnes A, Short AD, Fretwell N, Jones CA, et al. Tissue Antigens. Identification of susceptibility and protective major histocompatibility complex haplotypes in canine diabetes mellitus. (2006); 68(6):467-76.
Khalfallah, O., Ravassard, P., Serguera-Lagache C., Fligny, C., Serre, A., Bayard, E., Faucon-Biguet, N., Mallet, J., Meloni, R., and Nardelli, J. (2009). Zinc finger protein 191 (ZNF191/Zfp191) is necessary to maintain neural cells as cycling progenitors. Stem Cells 27:1643-1653
Kim A, Miller K, Jo J, Kilimnik G, Wojcik P, and Hara M Islet architecture: A comparative study Islets. 2009; 1(2): 129-136.
Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.
Mullis et al, ed., 1994 PCR: The Polymerase Chain Reaction
Nelson RW and Reusch CE, (2014), Animal models of disease: classification and etiology of diabetes in dogs and cats. J Endocrinol. Sep;222(3):T1-9. doi: 10.1530/JOE-14-0202.
Niessen SJ., Powney S. Guitian J., Niessen AP., Pion PD., Shaw JA. & Church DB. “Evaluation of a quality-of-life tool for dogs with diabetes mellitus” in J Vet Med. 2012; 26(4):953-61.
Perbal Bernard V., 1988, A Practical Guide to Molecular Cloning
Pictet, R.L., Clark, W.R., Williams, R.H., and Rutter, W.J. An ultrastructural analysis of the developing embryonic pancreas. Dev. Biol. 1972, 29, 436-67.
R. I. Freshney, ed., 1987 Animal Cell Culture
Rand JS, Fleeman LM, Farrow HA, Appleton DJ, Lederer R. (2004) Canine and feline diabetes mellitus: nature or nurture? J Nutr. 2004 Aug;134(8 Suppl):2072S-2080S.
Ravassard P, Emilie Bricout-Neveu, Hazhouz Y, Pechberty S, Mallet J, Czernichow P, Scharfmann R. (2009) A new strategy to generate functional insulin-producing cell lines by somatic gene transfer into pancreatic progenitors. PLoS One.4(3): e4731
Ravassard P, Hazhouz Y, Pechberty S, Bricout-Neveu E, Armanet M, Czernichow P, Scharfmann R.; (2011) A genetically engineered human pancreatic β cell line exhibiting glucose-inducible insulin secretion.J Clin Invest. 2011 Sep;121(9):3589-97.
Remington’s Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)
Russ, H.A., Bar, Y., Ravassard, P., and Efrat, S. (2008). In vitro proliferation of cells derived from adult human beta-cells revealed by cell-lineage tracing. Diabetes 57:1575-1583.
Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition; M. J. Gait, ed., 1984, Oligonucleotide Synthesis
Scharfmann R, Duvillie B, Stetsyuk V, Attali M, Filhoulaud G, Guillemain G. (2008)
Shield EJ et al, Extreme Beta-cell deficiency in Pancreata of Dogs with canine Diabetes, PloS one (2015);10, 1719
Steiner DJ, Kim A, Miller K, Hara M Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2010 ;2(3):135-45
Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., and Trono, D. (1997). Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol 15, 871-875.
Claims (40)
- イヌ科動物膵β細胞またはイヌ科動物β細胞腫瘍を調製する方法であって、
a)イヌ科動物未熟膵細胞に、i)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスベクター、またはii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原を発現するレンチウイルスベクターおよびインスリンプロモーターの制御下でhTertを発現するレンチウイルスベクター、またはiii)インスリンプロモーターの制御下でSV40ラージT抗原とhTertの両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入および同時形質導入する工程;
b)a)で得られた形質導入未熟膵細胞を第1の重症複合免疫不全症(scid)非ヒト動物の腎被膜に導入する工程;
c)形質導入未熟膵細胞にインスリノーマ様構造を発達させる工程、ここで、インスリノーマ様構造のイヌ科動物未熟膵細胞はインスリン産生膵β細胞に分化している;
d)工程c)で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させる工程;
e)工程d)で得られた細胞を第2のscid非ヒト動物の腎被膜にサブ移植する工程;
f)工程e)のサブ移植細胞に新たに発達したインスリノーマ様構造を発達および再生させる工程、ここで、当該新たに発達したインスリノーマ様構造はインスリン産生膵β細胞内で富化される;
g)工程f)で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させ、回収する工程;
h)場合により、工程g)で得られた細胞を第3の非ヒトscid動物の腎被膜にサブ移植し、インスリン産生膵β細胞のさらなる富化および増幅を可能とする工程;および
i)場合により、適当な量のインスリン産生膵β細胞が得られるまで工程e)、f)およびg)を繰り返す工程
を含んでなる、方法。 - 前記イヌ科動物未熟膵細胞が、イヌ未熟膵細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記イヌ科動物未熟膵細胞が、膵臓の右葉(または頭部)の一部または膵臓の全右葉(または頭部)から得られる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記イヌ科動物未熟膵細胞が、最終の妊娠第三期、好ましくは受胎後40〜60日、さらに好ましくは受胎後40〜55日、さらに好ましくは受胎後40〜46日、特に受胎後45日のイヌ科動物胎仔膵臓から得られる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターの構築物が、可逆的または条件付き不死化を可能とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つのLoxP部位およびSV40ラージTを含んでなり、かつ/または、hTERT遺伝子が、Creリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つのFRT部位を含んでなり、かつ、SV40ラージTおよび/またはhTERT遺伝子が、FLPリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- SV40ラージTを発現する前記レンチウイルスベクターおよびhTERTを発現する前記レンチウイルスベクターが、LoxP部位またはFLP部位をさらに含んでなる(ただし、部位特異的組換え部位は前記ベクター間で異なる)、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 不死化遺伝子SV40ラージTおよび/またはhTERTが除去された細胞のみを選択するために、CreまたはFLPリコンビナーゼの作用後に負の選択工程が行われる、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つの負の選択マーカー遺伝子を含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記負のマーカー遺伝子が、HSV−TK遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Gpt)遺伝子、およびシトシンデアミナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記scid非ヒト動物が、scidマウスである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)の細胞に、インスリンプロモーターの制御下で抗生物質耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入することをさらに含んでなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子である、請求項13に記載の方法。
- 工程i)で得られたイヌ科動物膵β細胞を回収して均質な細胞集団を形成し、場合により、前記集団をin vitroで培養してイヌ科動物機能的β細胞株を樹立することをさらに含んでなる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- SV40ラージT、hTERTおよび/または抗生物質耐性導入遺伝子を除去することを含む1以上の脱不死化工程をさらに含んでなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞。
- 前記腫瘍または細胞が、以下の特徴:
カルボキシペプチダーゼ−A陰性
転写因子Pdx1陽性
転写因子MafA陽性
プロコンベルターゼPcsk1陽性
グルコース輸送体Glut2の発現
カリウムチャネルのサブユニットをコードするKcnj11およびAbcc8の発現
亜鉛輸送体Znt8(Slc30a8)の発現
イヌ科動物特異的インスリンの発現
のうち少なくとも1つを有する、請求項17に記載のイヌβ細胞腫瘍またはイヌ膵β細胞。 - 前記腫瘍または細胞が、抗インスリン抗体、抗GAD抗体および/または抗IA2抗体との反応に陽性である、請求項17または18のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞。
- 前記細胞が、無血清培地およびマトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングウェルでの培養で維持および増殖される、請求項17〜19のいずれか一項に記載のイヌ膵β細胞。
- マトリゲルまたはフィブロネクチンを含んでなる無血清培地中に請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵β細胞を含んでなる細胞培養物。
- イヌ科動物の糖尿病を治療するための候補医薬を試験およびスクリーニングするための方法であって、候補医薬を請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵細胞が移植されたscid非ヒト動物に投与する工程を含んでなる、方法。
- 請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物膵β細胞、または前記細胞からのタンパク質抽出物を、固相支持体に結合または吸着させること、および、動物の血漿血清と反応させること、1型または他の型の糖尿病に特異的な異なる表面抗原、例えば、インスリン自己抗体(IAA)およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体(GADA)から選択される膵島細胞抗体(ICA)、に対する自己抗体の有無を検出することを含んでなる、イヌ科動物の糖尿病のin vitro診断方法。
- 罹患動物および対照からの血清を請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞の組織切片に加えること、および、前記イヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞の組織切片を、標識された抗イヌ科動物IgG、例えば、蛍光標識コンジュゲート抗イヌ科動物IgGとともにインキュベートして前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無を明らかにすることを含んでなり、自己抗体の存在が糖尿病の指標となる、請求項23に記載のイヌ科動物の糖尿病のin vitro診断方法。
- 罹患動物の血清とともにインキュベートされた請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物のウエスタンブロットを含んでなり、前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無が標識された抗イヌ科動物IgG、例えば、HRPコンジュゲート抗イヌ科動物IgGを用いて明らかにされ、自己抗体の存在下が糖尿病の指標となる、請求項23に記載のイヌ科動物の糖尿病のin vitro診断方法。
- ウェルプレートが請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物でコーティングされ、罹患動物血清および対照血清とインキュベートされるELISA試験を含んでなり、前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無が、標識された抗イヌ科動物IgG、例えば、HRPコンジュゲート抗イヌ科動物IgGを用いて明らかにされ、自己抗体の存在がイヌ科動物の糖尿病の指標となる、請求項23に記載のイヌ科動物の糖尿病のin vitro診断方法。
- 請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物を罹患動物の血漿血清と反応させること、異なる糖尿病関連表面抗原、すなわち、例えば、インスリン自己抗体(IAA)およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体(GADA)などの膵島細胞抗体(ICA)、または他の特異的な糖尿病関連抗原を、前記抗原に対するイムノブロットまたはドットブロット自己抗体により検出することを含んでなる、イヌ科動物糖尿病関連自己抗体を同定する方法。
- 場合により固相支持体に結合または吸着された、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物機能的膵β細胞、またはそれらからのタンパク質抽出物を含んでなる、イヌ科動物の糖尿病の診断キット。
- 請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法を実施するための試薬をさらに含んでなる、請求項28に記載の診断キット。
- イヌ科動物インスリン分泌を調節し得る化合物をスクリーニングするための方法であって、a)請求項17〜20のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵β細胞を試験化合物と接触させること、ならびにb)インスリン分泌を検出することおよびインスリン分泌のレベルを測定することを含んでなる、方法。
- 糖尿病の細胞療法のためのマスター細胞バンクの樹立方法であって、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によってイヌ科動物膵β細胞株を得る工程を含んでなり、細胞を脱不死化することをさらに含む、方法。
- 前記レンチウイルスベクターの構築物が、可逆的または条件付き不死化を可能とする、請求項31に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つのLoxP部位およびSV40ラージTを含んでなり、かつ/または、hTERT遺伝子が、Creリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項32に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つのFRT部位およびSV40ラージTを含んでなり、かつ/または、hTERT遺伝子が、FLPリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項33に記載の方法。
- SV40ラージTを発現する前記レンチウイルスベクターおよびhTERTを発現する前記レンチウイルスベクターが、LoxP部位またはFLP部位をさらに含んでなる(ただし、部位特異的組換え部位は前記ベクター間で異なる)、請求項34に記載の方法。
- 不死化遺伝子SV40ラージTおよび/またはhTERTが除去された細胞のみを選択するために、CreまたはFLPリコンビナーゼの作用後に負の選択工程が行われる、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが、少なくとも1つの負の選択マーカー遺伝子を含む、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が最初のβ細胞表現型に復帰する、請求項1〜16または29〜35のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物機能的膵β細胞。
- 薬学上許容可能な担体と、有効量の請求項38に記載のイヌ科動物機能的膵β細胞とを含んでなり、前記細胞が場合によりカプセル封入される、獣医学用組成物。
- イヌ科動物膵障害の治療において使用するための請求項39に記載のイヌ科動物機能的膵β細胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662334738P | 2016-05-11 | 2016-05-11 | |
US62/334,738 | 2016-05-11 | ||
PCT/EP2017/061401 WO2017194711A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-05-11 | Production of a canine beta cell line from an immature pancreas |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019515695A true JP2019515695A (ja) | 2019-06-13 |
JP2019515695A5 JP2019515695A5 (ja) | 2020-06-25 |
JP7224646B2 JP7224646B2 (ja) | 2023-02-20 |
Family
ID=59091465
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019511806A Active JP7224646B2 (ja) | 2016-05-11 | 2017-05-11 | 未熟膵臓からのイヌ科動物β細胞株の生産 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11629337B2 (ja) |
EP (1) | EP3455345B1 (ja) |
JP (1) | JP7224646B2 (ja) |
CA (1) | CA3024296A1 (ja) |
IL (1) | IL262917B (ja) |
WO (1) | WO2017194711A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019092135A1 (en) * | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Animal Cell Therapy - Act | Production of canine pancreatic islets from an immature pancreas |
CN115772543A (zh) * | 2022-11-09 | 2023-03-10 | 百欧派(天津)生物技术有限公司 | 用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合和表达载体及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003533540A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | ミルカウス ラボラトリー,インコーポレイテッド | 同種移植片拒絶を予防するための方法 |
WO2009132173A2 (en) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Encapsulife, Inc. | Immunoisolation patch system for cellular transplantation |
JP2010518840A (ja) * | 2007-02-21 | 2010-06-03 | エス・ア・エール・エル アンドセル | 糖尿病の診断のためのヒト膵臓β細胞株 |
WO2013057164A1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Sarl Endocells | Production of a human beta cell line from an early post natal pancreas |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6777231B1 (en) | 1999-03-10 | 2004-08-17 | The Regents Of The University Of California | Adipose-derived stem cells and lattices |
US6429013B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-08-06 | Artecel Science, Inc. | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair |
EP1103615A1 (en) | 1999-11-25 | 2001-05-30 | Universite De Geneve | Vectors capable of immortalizing non-dividing cells and cells immortalized with said vectors |
CA2447015A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-21 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells |
US8735154B2 (en) | 2006-10-30 | 2014-05-27 | The University Of Kansas | Templated islet cells and small islet cell clusters for diabetes treatment |
EP1947193A1 (en) * | 2007-01-17 | 2008-07-23 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Screening method for anti-diabetic compounds |
-
2017
- 2017-05-11 JP JP2019511806A patent/JP7224646B2/ja active Active
- 2017-05-11 WO PCT/EP2017/061401 patent/WO2017194711A1/en unknown
- 2017-05-11 US US16/300,310 patent/US11629337B2/en active Active
- 2017-05-11 EP EP17731469.7A patent/EP3455345B1/en active Active
- 2017-05-11 CA CA3024296A patent/CA3024296A1/en active Pending
-
2018
- 2018-11-11 IL IL262917A patent/IL262917B/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003533540A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | ミルカウス ラボラトリー,インコーポレイテッド | 同種移植片拒絶を予防するための方法 |
JP2010518840A (ja) * | 2007-02-21 | 2010-06-03 | エス・ア・エール・エル アンドセル | 糖尿病の診断のためのヒト膵臓β細胞株 |
WO2009132173A2 (en) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Encapsulife, Inc. | Immunoisolation patch system for cellular transplantation |
WO2013057164A1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Sarl Endocells | Production of a human beta cell line from an early post natal pancreas |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190367881A1 (en) | 2019-12-05 |
IL262917B (en) | 2022-06-01 |
EP3455345B1 (en) | 2021-03-24 |
US11629337B2 (en) | 2023-04-18 |
WO2017194711A1 (en) | 2017-11-16 |
EP3455345A1 (en) | 2019-03-20 |
JP7224646B2 (ja) | 2023-02-20 |
CA3024296A1 (en) | 2017-11-16 |
IL262917A (en) | 2019-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4891884B2 (ja) | 分化中の胚幹細胞、成体幹細胞および胚生殖系細胞を細胞特異的および成長特異的に選択するためのシステム | |
EP1438418B1 (en) | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus | |
Sofikitis et al. | Efforts to create an artificial testis: culture systems of male germ cells under biochemical conditions resembling the seminiferous tubular biochemical environment | |
KR101386690B1 (ko) | 래트 배아 줄기 세포 | |
EA011953B1 (ru) | Pdx1-экспрессирующая энтодерма | |
JP2001521380A (ja) | ヒト胚生殖細胞系およびその使用方法 | |
US9474254B2 (en) | Production and use of rat spermatogonial stem cell lines | |
EP2768948B1 (en) | Production of a human beta cell line from an early post natal pancreas | |
Scharfmann et al. | Beta cells within single human islets originate from multiple progenitors | |
JP2009523024A (ja) | 発光性トランスジェニック非ヒト動物、子孫、派生細胞(cellderivatives)およびそれらの使用 | |
JP7224646B2 (ja) | 未熟膵臓からのイヌ科動物β細胞株の生産 | |
Fantuzzi et al. | In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo | |
KR20040080430A (ko) | 인간의 베타 세포주 생산 방법 | |
AU2018220843B2 (en) | Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue | |
US20100330043A1 (en) | Gpr125 as a marker for stem and progenitor cells and methods use thereof | |
US20210369788A1 (en) | Production of canine pancreatic islets from an immature pancreas | |
WO2007075956A2 (en) | Methods for producing and using pancreatic endocrine cells | |
CN114845727A (zh) | 基于Mycl瞬时表达的可增殖性胰岛前体细胞样细胞的诱导和胰岛素阳性细胞的分化诱导 | |
Ramzy | Removing, replacing, and processing proinsulin in beta-cells | |
Othman | Forcing alpha-cell-mediated beta-cell regeneration | |
Kuipers et al. | Generation of conditionally immortalized murine and human brown pre-adipocytes with preserved adipogenic capacity | |
JP2005168492A (ja) | 不死化マスト細胞株 | |
Stevens | Analysis of putative mutants produced by genetrap technology | |
MXPA99008933A (es) | Linea de celulas germinales embrionicas, humanas y metodos de uso |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200511 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200511 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210105 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210607 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211126 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220426 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220805 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221107 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230106 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230201 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7224646 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |