KR20040080430A - 인간의 베타 세포주 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 발생 10주를 넘지 않는 배아 췌장 세포로부터 기인한 유효량의 기능적 췌장 세포의 이식에 의해 개체 내의 췌장 기능을 재생시키는 방법을 제공하고, 또한, 기능적 동물 췌장 세포, 보다 구체적으로 불멸화된 인간 베타 세포주를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 당뇨병의 치료 방법을 제공하고, 또한, 당뇨병을 치료하는 약제로서 췌장 베타 세포를 제공한다.
Description
제1형 당뇨병은 췌장 베타 세포의 면역 메커니즘에 의한 파괴에 기인하는 것으로서, 인슐린 생산의 부족과 고혈당증을 유발한다. 제공자(donor)로부터의 베타 세포를 이용한 세표 치료는 당뇨병 환자를 치료하기 위한 하나의 방법이었다. 그러나, 이러한 목적을 달성할 수 있기 위해서는 그 이전에 두 가지 주요 문제점을 해결해야만 한다. 첫 번째로, 그래프트(graft)의 면역적 보호를 제공하기 위해서 면역억제 프로토콜을 디자인해야 한다. 최근의 보고에 의하면 본 분야에서 발전이 이루어진 것을 알 수 있다(Shapiro et al., 2000). 해결해야 할 두 번째 점은 그래프팅에 이용할 수 있는 제공자로부터의 소수의 성숙한 베타 세포에 관한 것이다(Weir and Bonner-Weir, 1997). 기능적인 성숙한 베타 세포의 대안적인 소스를 제공할 필요가 있다. 이 점이 본 발명이 해결하고자 하는 문제점이다. 지난 몇 년 동안, 배아기 및 태아기 동안에 일어나는 베타 세포 발생을 이해하고 반복함으로써 제1형 당뇨병의 세포 치료에 이용할 수 있는 새로운 베타 세포를 생산할 수 있다고 제안되어 왔다.
따라서, 설치류에 있어서 태아기의 췌장 발생을 제어하는 분자 메커니즘을 정의하기 위해 많은 노력과 발전이 이루어졌고, 특이적 전사 및 성장 인자의 역할이 정의되었다(Edlund, 1998; St Onge et al., 1999; Wells and Melton, 1999; Scharfmann, 2000; Grapin-Botton and Melton, 2000; Kim and Hebrok, 2001). 전구 세포(precusor cell)가 잠재적으로 풍부한 상이한 조직 소스 또한 성숙한 베타 세포로 분화하는 능력에 대해 현재 테스트되고 있다. 이들 세포는 태아 또는 신생아 돼지 췌장으로부터 얻거나(Yoom et al., 1999; Otonkoski et al., 1999), 도관세포(duct cell)가 풍부하고 전구세포를 포함한다고 생각되는 인간 성인 췌장의 단편으로부터 얻는다(Bonner-Weir, 1997). 지금까지, 태아(fetus)로부터 얻은 모든 조직은 발생의 후기에 있고 다른 시험에 사용될 때 이미 많이 성숙했기 때문에, 태아기의 인간 췌장 조직(14-24주)은 성공적으로 이용되지 못하였다(Tuch et al., 1984; Tuch et al., 1986; Sandla et al., 1985; Hayek et al., 1997; Goldrath et al., 1995). 예를 들어, Tuch et al. (1984), Sandler et al.(1985), Goldrath et al. (1995) 및 Povlsen et al. (1974)는, 다음의 내분비 조직 발생의 목적을 가지고 면역무능(immunoincompetent) 마우스에 이식된 발생 14주 내지 24주의 인간 췌장 단편을 이용하였다. 수용자(recipient) 마우스에서 수 주 또는 수 개월 후에, 인간 조직을 제거했을 때, 모든 내분비 세포형을 발견하였다(Tuch et al., 1984; Sandler et al., 1985). 그러나, 발생 14주 내지 24주(이식시에 조직의 연령) 사이에서, 내분비 세포는 이미 존재하고 랑게르한스섬에 결합된다는 것을 기억하는 것은 중요하다(Bouwens et al., 1997; Stefan et al., 1983; Fukayama et al.,1986; Miettinen et al., 1992). 또한, 후기 인간 태아 조직을 이용한 이들 실험에 있어서, 그래프트에 존재하는 인슐린-발현 세포의 양을 이식 전과 후로 비교할 때, 베타 세포 양에 있어서 뚜렷한 증가를 검출하지 못했다(Tuch et al.). 따라서, 마우스에서 수주 또는 수개월 후에 존재한 인간 내분비 세포가 새롭게 형성된 내분비 세포였는지, 이식 전에 존재하여 살아남은 세포였는지를 판단하는 것은 어렵다.
본 발명은 성숙한 베타 세포를 제공하는 상기 문제점을 해결한다; 실제로 본 발명자들은, 발생 10주를 넘지 않은 미숙한 인간 배아 췌장으로부터 NOD/scid마우스에서 기능적 인간 베타 세포를 발생시킬 수 있다는 것을 보인다. 구체적으로는, 본 발명자들은, 인슐린-발현 세포를 포함하고 있지 않거나 극소수 포함하고 있는 인간 배아 췌장(도 4 참조)을 면역무능 마우스에 이식하였을 때, 췌장 조직이 그 무게를 6개월 내에 200배 증가시키면서 성장한다는 것을 보인다. 동시에, 내분비 세포 분화가 일어나서, 인간 베타 세포의 절대적 수가 5000 배만큼 증가한다. 최종적으로, 발생한 내분비 조직은 기능적이었고, 설치류 베타 세포가 부족한 마우스의 혈당증(glycemia)을 조절할 수 있었다.
생체내에서 일어나는 인간 췌장의 개체발생을 의태하는 것처럼 보이는 NOD/scid마우스에서의 인간 배아 췌장의 이러한 발생 모델은, 적절한 실험 시스템의 부족으로 인해 과거에 부분적으로 이해하지 못했던 의문인, 인간 배아 췌장의 발생을 제어하는 메커니즘을 이제 연구하는데 이용할 수 있다. 또한, 발명자들의 데이터는, 인간 배아 췌장이, 성체 동물에 이식되었을 때 베타 세포로 대량으로 증식하고 분화할 수 있는 미숙 세포의 소스를 나타낸다는 것을 보인다. 따라서, 본 조직은 이식을 위한 베타 세포의 대안적인 소스로서 유용하다.
본 발명은 생물학 분야에 관한 것으로서, 특히 세포 생물학과 세포 치료 분야에 관한 것이다.
도 1: NOD/scid에서 인간 췌장의 발생.
(A) 이식 이전에 발생 8주의 췌장. (B-E) 췌장이 NOD/scid의 신장 피막 아래에 이식되고, (B) 7일, (C) 2달, (D) 6달, 및 (E) 9달 이후 분석된다.
도 2: 이식된 췌장의 중량의 발전도이다.
이식 이후, 지방을 제거하기 위해 미세하게 절개되고 측정된 다른 시간 지점에서 조직 이식이 제거되었다. 총 22의 조직 이식이 분석된다.
도 3: 조직학적 분석이다. 이식 이전의 발생 8주의 인간 췌장 (A), 이식후 1달의 인간췌장 (B), 및 이식후 6달의 인간 췌장 (C). 안티-팬사이토케라틴 항체(녹색으로 나타남) 또는 안티-비멘틴 항체(적색으로 나타남)으로 염색됨.
도 4: NOD/scid쥐의 췌장 내분비 조직의 발생이다.
이식 이전 8주 췌장 (A)의, 이식후 7일 (B), 이식 후 1달 (C), 이식 후 2달 (D), 이식 후 6달 (E) 및 이식 후 9달 (F). 인슐린(녹색으로 나타남) 및 글루카곤(적색으로 나타남) 면역 염색. (A)에서의 화살표는 인슐린과 아밀라아제 양자에 대한 염색 양성 2세포를 나타낸다. G 및 H는 이식 이전 8주 인간 췌장 (G) 및 이식 후 6달의 인간 췌장 (H) 단면의 프로인슐린 프로브의 하이브리다이제이션을 나타낸다.
도 5: 이식 기간 동안 내분비 세포 덩어리의 진화를 도시한다.
인슐린 발현하는 세포의 절대 덩어리를 임의의 단위로 나타낸다. 총 16 그래프트를 분석한다.
도 6: 세포 증식 분석이다.
1달(A 및 B) 동안 또는 3달(C, D) 동안scid마우스에서 발생된 인간 배아췌장 세포의 단면에 BrdU(적색)과 팬사이토케라틴(녹색)(A, C) 또는 BrdU(적색) 및 인슐린(녹색(B, D))용 이중 면역 염색. 마우스는 2시간 BrdU 주입후 희생되었다.
도 7: 마우스에서 발생된 인간 내분비 세포는 성숙한 내분비 세포와 유사하다.
이식후 6달의 인간 배아 췌장 단면 (A). 인슐린(녹색으로 나타남) 및 팩스(PAX) 6(적색으로 나타남); (B). 인슐린(녹색으로 나타남) 및 Nkx6.1 (적색으로 나타남; (C, D). 인슐린(적색으로 나타남) 및 PC1/3(녹색으로 나타남); (E). 인슐린(녹색으로 나타남) 및 사이토케라틴-19(적색으로 나타남); (F). 사이토케라틴 19 단독(적색으로 나타남).
도 8: 인간 췌장 이식의 기능적 발생
(A) 이식 후 3달,scid마우스(적색선)는 알록산(alloxan)이 주입된다. 비이식쥐(청색선)는 또한 알록산을 수용한다. 비이식 쥐의 혈당증이 신속하게 증가하지만, 이식된 쥐는 일정하게 유지된다. 이식이 7일 또는 43일에 신장 절제로 제거될 때, 혈당증이 신속하게 증가된다.
(B) 알록산 처리 이전에 인슐린(적색으로 나타남)과 글루카곤(녹색으로 나타남)으로 얼룩진 실험 (C)의 말기(알록산 처리후 43일)에 마우스 췌장으로서, 알록산이 대부분의 숙주 인슐린 표현 세포를 파괴하는 것을 나타낸다. (D). 인슐린(적색으로 나타남)과 글루카곤(녹색으로 나타남)으로 염색된 실험(알록산 처리후 43일)의 말기에 인간 이식의 단면으로서, 알록산이 발생된 인간 베타 세포에 아무런 효과를 갖지 못하는 것을 나타낸다.
도 9:Scid마우스에 이식된 랫트 배아 췌장의 발생과 재조합 렌티바이러스를 이용한 인슐린 발현 세포를 도입하기 위한 조건에 대한 연구.
E16 쥐 췌장이 해부된다. A에서, 클루카곤(녹색) 및 인슐린(적색)으로 바로 염색된다. B와 C에서, 7일 동안 이식되고 인슐린 프로모터의 제어하에서 렌티바이러스 표현 GFP로 감염된다. B. 인슐린(적색) 및 글루카곤(녹색)으로 염색된다. C. 이런 조건하에서 GFP 표현 세포가 검출될 수 없다. D와 E에서, E16 췌장은 분리된 다음 인슐린 프로모터의 제어하에서 렌티바이러스 표현 GFP로 감염된다. D. 인슐린(적색) 및 글리카곤(녹색)으로 염색됨. E. 이런 조건하에서 GFP 표현 세포가 검출될 수 있다.
도 10: 인슐린 발현 세포에서 GFP의 발현
E16은 분리된 다음 인슐린 프로모터의 제어하에서 렌티바이러스 발현 GFP로 감염된다. A. GFP 염색; B. 인슐린 염색; C. 패널 A 및 B는 첨가된다. D. 클루카곤(녹색) 및 인슐린(적색)으로 염색된다; E. 시토케라틴(적색) 및 GFP(녹색)으로 염색된다:
도 11:인슐린 발현 세포에서의 GFP의 장기간 발현
E16 췌장을 분리하고 이어서 인슐린 프로모터의 제어하에 렌티바이러스 발현 GFP로 감염시킨 후 1개월간 이식시켰다.A, D.GFP 염색;B, E.인슐린 염색;C, F.패널 A+B 및 D+E를 중첩시켰다.
도 12:감염된 선조(progenitor) 세포로부터의 GFP+/INS+세포의 발생
A.이식 이전(제 0일) 또는 7일간의 이식 이후(제 7일)의 E16 췌장내의 인슐린 함유량.B.E16의 임신한 랫트들에 BrdU를 주입하였다. 좌측 패널에서, 조직들을 BrdU(적색) 및 인슐린(녹색)에 대해 염색하였다. 우측 패널에서, 조직들을 BrdU(적색), 인슐린(파랑색) 및 글루카곤(녹색)에 대해 염색하였다. 내분비 세포들은 증식하지 않음을 주목해야 한다.C.E13 췌장을 분리하고, 이어서 인슐린 프로모터의 제어하에 렌티바이러스 발현 GFP로 감염시켜 7일간 이식하였다.좌측.GFP 염색;중간.인슐린 염색;우측.좌측 및 우측 패널들을 중첩시켰다.
본 발명은 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법을 제공하고, 본 방법은,
(a) 발생 10주를 넘지 않는 동물 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency, NOD/scid) 동물의 신장 피막(kidney capsule)에 도입하는 단계; 여기에서, 상기 NOD/scid는 상기 배아 췌장 세포를 얻은 동물과 상이한 종이고,
(b) 동물 배아 췌장 세포를 발생시키고, 분화시키고, 적어도 혈당증의 조절 및 소화 효소의 분비중에서 선택되는 췌장의 기능을 재생시키도록 하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 동물 기능성 췌장 세포의 유효량을 개체에 이식하는 단계를 포함한다.
용어 "개체"는 척추동물을 말하고, 바람직하게는 포유류이다. 포유류는 인간, 설치류(즉, 마우스, 랫트, 햄스터, 가축, 스포츠 동물(sport animal) 및 애완 동물)를 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서는 개체는 포유류이고, 더욱 바람직하게는 인간이다.
바람직한 실시예에 있어서, 동물 배아 췌장 세포는 인간 배아 췌장 세포이다. 대안적으로, 예를 들어 돼지, 소, 염소, 양, 영장류, 설치류(즉, 마우스, 랫트, 햄스터...) 췌장 세포에서 선택할 수도 있다. 본 발명의 동물 배아 췌장 세포는 발생 10주를 넘지 않은, 9주를 넘지 않은, 8주를 넘지 않은, 7주를 넘지 않은,6주를 넘지 않은, 5주를 넘지 않은, 4주를 넘지 않은, 3주를 넘지 않은, 1주를 넘지 않은 세포 중에서 선택되는 세포이다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 동물 배아 췌장 세포는 발생 6주 내지 9주인 것이다. 바람직한 실시예에 따라, 본 발명의 동물 배아 췌장 세포는 발생 9주를 넘지 않는 인간 배아 췌장세포이고, 더욱 바람직하게는, 발생 6주 내지 9주 사이인 것이다.
수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/scid) 동물은 소, 돼지, 말, 양, 염소, 인간을 제외한 영장류, 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치류 중에서 선택된다. 바람직한 실시예에 있어서, NOD/scid동물은 마우스이다. 바람직하게 본 발명의 NOD/scid마우스는 발생의 모든 연령일 수 있고, 바람직하게는 신장 피막에 이식을 수행할 정도로 충분히 나이 들어야 한다. 바람직하게는, NOD/scid마우스는 발생 약 2주 내지 15주인 것이고, 더욱 바람직하게는 발생 6주 내지 8주인 것이다. NOD/scid동물은, T-림프구 및 B-림프구가 부족하고 체액성 면역 또는 세포 매개성 면역을 생성하지 못하는 동물이다.
"유효량"은 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기에 충분한 양이다. 한 번의 투여로 충분한 것이 바람직하지만, 한 번 이상의 적용에서 유효량을 투여할 수도 있다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 배아 췌장 세포의 유효량은 췌장의 하나 이상의 기능을 복원할 수 있는 분화된 췌장 세포를 생산하기에 충분한 양이다. 예를 들어 109세포가 넘는 상대적으로 많은 수의 췌장 세포를 도입함으로써 복원이 신속하게 일어날 수 있다는 것이 깊이 고려된다. 또한, 보다 소수의 췌장 세포를도입하는 경우, 생체내(in vivo)에서 췌장 세포 또는 세포들이 증식할 수 있게 될 때 기능이 복원될 것이라는 것 또한 깊이 고려된다. 따라서, 췌장 세포의 "유효량"은 하나의 췌장 세포 만큼 적은 수에 췌장의 전부 또는 일부를 재생하기 위한 충분한 시간을 허락함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 개체에 투여되는 유효량은 약 101췌장 세포보다 많고, 바람직하게는 약 102내지 약 1015췌장 세포 사이이고, 더욱 바람직하게는 약 103내지 약 1012췌장 세포 사이이다. 본 발명의 방법의 단계 (c)에서 이식되는 동물 췌장 세포의 유효량은 더욱 바람직하게는 103내지 1012동물 췌장 세포 사이이다. 치료(treatment)의 용어에 있어서, 췌장 세포의 "유효량"은 당뇨병등의 췌장 질병의 진행을 개선, 일시적으로 완화, 안정화, 역전, 늦추거나 지연시킬 수 있는 양이다.
바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 동물 배아 췌장 세포는 이종(heterologous)의 제공자(타가이식, allograft), 예컨대 기관 제공자 또는 살아있는 제공자로부터 획득될 수도 있다. 또는, 자가이식(autograft)은, 발생의 초기 단계에서(발생 10주 이전에) 개체의 췌장의 일부를 제거함으로써, 또는 성인 췌장 세포의 분화된 표현형을 역으로 하여, 췌장 기능을 재생성할 수 있는 췌장 세포를 동일 개체에 도입함으로써 수행될 수 있다. 자가이식에 대하여, 제공자 개체의 췌장의 적어도 약 5%가 제거된다. 자가이식에 대하여, 췌장의 적어도 약 5%, 바람직하게는 췌장의 30% 초과, 더욱 바람직하게는 췌장의 80% 초과가 제거된다.본 발명의 방법은 췌장 세포의 타가이식 또는 자가이식를 포함한다. 이식의 각 형태는 그들의 이점들을 가진다. 특히, 자가이식(동일 개체로부터의 췌장 세포들이 췌장 기능을 재생성하도록 사용되는)은 면역반응을 방지하기 위하여 사용된다. 이식에 대한 숙주반응은, 제공자와 수용자가 상이한 개체일 때 발생하고, 제공자의 면역 시스템은 이식에 대한 반응을 개시시킨다. 조직 타입과 주요조직적합유전자복합체(major histocompatibility complex, MHC)의 매칭은 숙주에 대한 이식의 엄격도와 발생율를 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 췌장 세포의 자가조직의 도입은, 개채의 췌장에 질병이 있는 경우에 특히 유용할 것이다. 이러한 경우에서, 미소량의 자가조직의 배아 췌장 조직은 기능적 췌장을 재생성할 것이다. 자가이식은, 췌장이 사용 가능하지 않을 경우, 예컨대 개체의 췌장에 질병이 있을 때 유용하다. MHC 일치된 다양한 췌장 세포는 인 비트로(in virto) 유지되거나, 제공자와 수용자를 일치시키도록 수행된 조직 타이핑과 제공자로부터 분리될 수 있다. 시클로스포린과 같은 면역 억제제가 또한 이식에 대한 숙주반응을 감소시키기 위하여 투여될 수 있다. 본 발명의 방법으로 획득된 세포를 사용하는 타가이식은 또한, 단일의 건강한 제공자가 충분한 세포를 공급하여 다수 수용자에게 적어도 부분적인 췌장 기능을 재생성할 수 있으므로, 유용하다. 본 발명의 췌장 세포는 상당히 효과적으로 증식하여 분화될 수 있으므로, 단지 적은 수만이 췌장을 재위치시키는 데 요구된다. 따라서, 하나의 췌장이 다수의 타가이식에 대하여 분리되어 사용될 수 있다. 유사하게, 하나의 췌장으로부터 적은 수의 세포는 인 비트로 배양된 후, 다수의 이식에 대하여 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예예서, 본 발명의 췌장 세포는그들이 모두 또는 다양한 MHC와 일치하기 위하여 유전적으로 변형될 수 있다(이러한 세포는 보편적 제공자 췌장 세포를 구성한다). 본 발명의 췌장 세포에 의하여, 발생되어 NOD/scid동물로 분화되었던 배아 췌장 세포 또는 기능적 췌장 세포를 의미한다.
제공자 개체로부터 췌장 조직을 분리하는 적절한 기술은 종래 기술에 공지되어 있다. 예컨대, 생체검사 바늘에 의한 췌장 세포의 추출 또는 췌장 조직의 일부 또는 전체의 외과적 제거가 사용될 수 있다.
췌장 조직은 다른 처리 또는 변형없이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 변형이 후술되어 있다. 변형된 세포 또는 비변형된 세포 모두에 대하여, 단일 세포 서스펜션을 조직으로부터 얻는 것이 바람직하다. 세포 서스펜션은 종래에 공지된 방법, 예컨대 원심분리 및 효소 처리로 획득될 수 있따. 췌장 조직 또는 세포 서스펜션은 또한 냉동되어 사용전에 해동될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 분리와 처리후에 신선하다.
또는, 본 발명의 배아 췌장 세포는 장기간 인 비트로 배양될 수 있어서, 췌장-재생성의 안정한 세포주를 생성한다. 여기에 사용된 바와 같이, "인 비트로 배양(in virtoculture)"이라는 용어는 신체 외부에서 세포의 생존에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 배양은, 이들이 연장된 시간동안 안정적으로 인 비트로 증식하는 "장 기간(long-term)" 배양이다. 이들 세포의 안정한 개체군은 배아 췌장 표현형(예컨대, 이들 세포는 "줄기(stem)" 세포일 것이다)으로 생존하여 인 비트로 증식할 수 있다. 다양한 형태의 줄기 세포의 배양 방법은 종래 기술에 공지되어 있다. 예컨대, WO 94/16059 는 노이로날(neuronal) 세포의 장 기간 배양(7 달보다 오래)을 개시한다. 이러한 형태의 줄기세포의 장기간 배양은 또한 종래 기술에 개시되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용가능하다. 인 비트로 배양된 배아 췌장 세포는 치료 유전자와 같은, 중요한 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명에 따르면, 단계 (c)에서 이식된 동물 기능적 췌장 세포는 바람직하게는 상기 개체의 췌장에 도입된다. 또는, 이러한 동물 기능적 췌장 세포는, 임의의 위치에, 보다 바람직하게는 췌장 또는 방광 또는 간의 근처에, 또는 피부 아래에, 개체의 신체로 도입될 수 있는 이식가능한 캡슐로 둘러싸인다.
여기서 사용되는 바와 같이, "도입(introducing)" 이라는 용어는 개체에 제공 또는 투여를 의미한다. 본 발명에서, 기능적 췌장 세포를 재생성할 수 있는 기능적 췌장 세포는 개체로 도입된다. 개체로의 세포 도입 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 주입, 정맥 또는 비경구 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단일, 다수, 연속 또는 간헐 투여가 효과적일 수 있다. 췌장 세포는, 췌장에 제한되지 않고, 복부 강, 신장, 간, 복강 동맥, 간문 정맥 또는 비장을 포함하는 몇몇 상이한 장소들 중 임의 장소에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 췌장 세포는 개체의 췌장에 위치된다.
"췌장"이라는 용어는 척추동물에서 발견되는 큰, 기다란 노란빛의 분비기관에 관한 것이다. 췌장은 내분비 및 외분비 기능 모두를 가지고, 호르몬 인슐린과 글루카곤을 생성하며, 또한 트립시노겐, 키모트립시노겐, 프로카복시펩티다제 A 및B, 엘라스타제, 리보뉴크리아제, 데스옥시리보뉴클리아제 프로포스포리파제 A, 판크레아틱 리파제, 판크레아틱 α-아밀라제와 같은 소화 효소를 분비한다. "췌장 세포" 또는 "췌장의 세포"라는 용어는 췌장으로부터 획득된 세포에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 췌장 기능은 혈당증의 조절이다.
본 발명은 또한, 상기 개체가 인슐린-의존 당뇨병인 방법을 제공한다. 그러므로, 본 발명은 또한 치료가 필요한 인간 환자의 당뇨병 치료 방법을 제공하도록 실현되었으며, 상기 방법은,
(a) 발생 10주를 넘지 않는, 보다 바람직하게는 발생 6주에서 9주의 인간 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/Scid) 동물의 신장 피막으로 도입하는 단계;
(b) 배아 췌장 세포가 발생하고 분화하여 적어도 췌장 기능을 재생하도록 하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 획득된 인간 기능적 췌장 세포의 유효량을 상기 환자에게 이식하는 단계; 및
(d) 혈당증 조절의 상기 췌장 기능의 재생에 의하여 달성되는 당뇨병 치료 단계를 포함한다.
상술된 방법은 특히, 인간 환자의 당뇨병 치료에 기여된다.
여기서 사용되는 바와 같이, "상기 췌장 기능의 재생"이라는 용어는 새로운 조직의 성장 또는 증식에 관한 것이다. 본 발명에서, 재생은 기능적 췌장 조직의 성장 및 발생에 관한다. 대부분의 경우에서, 재생된 췌장 조직은 또한 정상 췌장조직의 세포학 및 조직학적 특성을 가질 것이다. 예컨대, 개체로 도입되며, 기능적 췌장 조직을 생성하도록 하는 췌장 세포는 인슐린과 글루카곤, 및 Nkx6.1, Pax6, 또는 PC1/3과 같은 췌장을 나타내는 다른 마커들과 함께 소화 효소를 발현하도록 예상된다. 췌장의 기능은 인슐린 또는 글루카곤 발현과 같은, 종래에 공지된 측정 및 시험에 의해 면역성 테스트될 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍 동물은 마우스이다.
본 발명은 또한 상기 방법이 다음 단계들을 포함하는 기능성 동물 배아 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 인간을 제외한, 발생 10주를 넘지 않는, 보다 바람직하게 6 내지 9 주의 동물 췌장 배아 세포의 유효량을, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍 동물(NOD/scid)에 도입하는 단계; 여기에서 상기 NOD/scid동물의 종은 상기 췌장 배아세포가 획득되는 동물의 종과 상이하고,
(b) 동물 췌장 배아세포를 발생시키고, 분화시키고, 적어도 혈당증의 조절 및 소화효소의 분비 중으로부터 선택되는 췌장의 기능을 재생시키는 단계. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 췌장의 기능은 혈당증의 조절임;
(c) 단계 (b)에서 얻은 동물 췌장의 세포를 수집하는 단계; 및
(d) 임의로, 단계 (c)에서 얻은 세포를 인 비트로 배양하는 단계.
본 발명은 본 발명에 의한 방법에 의해 획득 가능한 또는 획득된 기능성 동물 배아세포를 포함한다. 바람직하게 상기 세포는 췌장의 알파 세포, 췌장의 베타 세포들, 췌장의 델타 세포들 중에서 선택된다. 바람직하게, 상기 세포는 췌장의베타 세포이다. 이러한 췌장의 베타 세포는 포도당에 대하여 인슐린을 발현시키는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 포도당에 대하여 글루카곤을 발현시키는 기능성 췌장의 베타 세포를 제공한다. 또한, 상기 기능성 췌장 세포는 소화 효소를 발현하고 분비한다. 상기 세포는 인간 세포 또는 랫트 세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 췌장의 세포들(즉 배아 췌장 세포들 또는 기능성 췌장 베타 세포들)은, 예를 들면, 특별한 세포 배양 조건들을 이용하여 또는 유전공학 기술에 의해 변형될 수 있다. 이 후자의 변형은, 상기 세포의 게놈에 결합되거나 또는 염색체외의 레플리콘으로서 존재하는, 상기 세포에의 이식 유전자(trans gene)의 도입을 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 기능성 동물 췌장의 세포를 제조하는 방법은 단계 (d) 에서 획득된 세포를 유전자 변형하는 단계를 더욱 포함하고/또는 상기 발생 10주를 넘지 않는 동물 배아 췌장세포를 유전자 변형하는 단계를 더욱 포함한다. 상기 세포에서 적어도 하나의 이식 유전자(즉 핵산 분자)를 도입하는 것을 의미하는 "유전자 변형"에 의해, 상기 이식 유전자는 세포 자손으로 안정하게 전달된다. 여기서 사용되는 이식 유전자는, 단일 또는 이중으로 꼬인 핵산 분자, 보다 바람직하게 게놈 DNA 또는 RNA, 재조합DNA 또는 RNA, 또는 cDNA 시퀀스를 의미한다.
바람직하게, 이식 유전자는 췌장의 세포에 관심의 유전자의 발현을 지시하는 발현 카세트를 형성하도록 프로모터 시퀀스에 효과적으로 결합된 적어도 관심의 시퀀스를 포함한다. 상기 이식 유전자 또는 발현 카세트는 직선 형태로 존재하고, 바람직하게는, 상기 이식 유전자 또는 DNA 카세트는 핵산 프레그먼트의 일부이거나, 또는 클로닝 및/또는 발현 벡터로 클론된다. 여기서 사용되는 "효과적으로 결합된"은 프로모터 시퀀스와 제2시퀀스(즉, 관심의 시퀀스)간의 기능 결합의 참조를 포함하고, 이 프로모터 시퀀스는 제2시퀀스에 대응하여 상기 DNA 시퀀스의 전사를 초기화하고 조정한다. "프로모터" 또는 "프로모터 시퀀스"는 세포에서 RNA 폴리머라아제를 결합할 수 있거나 또는 전사 하류(3' 방향) 코딩 시퀀스를 초기화할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 시퀀스 내에서는 RNA 폴리머라아제와의 결합할 수 있는 단백질 결합 도메인 이외에 전사 초기화 사이트가 발견될 수 있다. 진핵 프로모터들은, 항상은 아니지만 종종 TATA 박스들과 CAT 박스들을 포함한다. 프로모터 시퀀스 또는 그 근방에는, 활성화 시퀀스("인헨서, enhancer"), 억제 시퀀스("사일렌서, silencer"), 및 상류 시퀀스와 같은 추가의 책임 엘리먼트가 발견될 수 있다. 어디나 존재하는 또는 조직-특이적 프로모터, 및 유도 가능하고, 항상성의 프로모터를 포함하는 각종 프로모터는 관심의 유전자의 발현을 구동시키는데 사용된다. 바람직하게, 프로모터는, 발생 10일을 넘지 않는 췌장 세포, 또는 숙성된 베타 세포에서와 같이, 적어도 췌장의 세포에서, 또는 특정 발생 단계의 췌장의 세포에서 관심의 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 보다 바람직하게, 프로모터는 인슐린 유전자 프로모터이고 보다 바람직하게 랫트 인슐린 유전자 프로모터(Genebank accession N°GBJ00748), 마우스 인슐린 유전자 프로모터(Genebank accession N°GBX04724), 사람 인슐린 유전자 프로모터(Genebank accession N°GBAP001994) 중에서 선택된다. 대안적으로, 프로모터는 테트라사이클린과 같은 항생제에 의해 유도 가능하다. 다른 실시예에서,프로모터는 온도에 따라 관심의 유전자의 발현을 구동시키고, 이 경우에, 프로모터는 SV40의 라아지 T 항원(large T antigen)의 온도 민감형 돌연변이형태의 유전자 코딩의 하나가 바람직하다.
본 발명에 의하면, "벡터"는 다른 폴리뉴클레오티드 세그먼트가 부착되는 레플리콘이 되어, 부착된 세그먼트가 복제 및/또는 발현을 하게 한다. 벡터는 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실없이 DNA 시퀀스가 결정될 수 있도록 절단되는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 인식 사이트를 가질 수 있다. 벡터들은, 프리머 사이트들(예를 들면, PCR에 대해), 전사 및/또는 전이 초기화 및/또는 조절 사이트들, 재조합 신호들, 레플리콘들, 선택가능한 마커들 등을 더욱 제공할 수 있다. 벡터의 예는, 플라스미드(plasmid), 파아지(phage), 코스미드(cosmid), 파아지미드(phagemid), 이스트 아티피셜 염색체(YAC), 박테리아 아티피셜 염색체(BAC), 인간 아티피셜 염색체(HAC), 바이러스, 인 비트로에서 또는 숙주 세포에서 복제하거나 또는 복제될 수 있거나, 원하는 DNA 세그먼트를 숙주 세포 내의 원하는 위치에 보낼 수 있는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 다른 DNA 시퀀스와 같은 바이러스 기초 벡터를 포함한다. 바람직한 실시예에서 벡터는 바이러스 기초 벡터이고, 보다 바람직하게 HIV-1 기초 벡터와 같은 렌티바이러스-기초 벡터이다. 이러한 렌티바이러스-기초 벡터는 본 발명의 배아 췌장의 세포를 감염시키는데 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 발현 벡터의 구성에 사용되는 재조합 DNA 기술은 당업자에게는 공지되어 있고 일반적이다. 표준 기술은, 클로닝, DNA의 분리, 증폭, 및 정제에 사용되고, 제조자의 추천에 따라 DNA 리가아제, DNA 폴라머라아제, 제한 엔도뉴클레아제가 수행된다. 이들 기술과 그 밖의 것은 일반적으로 Sambrook 등(1989)에 따라 수행된다.
본 발명에 의한 이식 유전자와 벡터는, 예를 들면 칼슘 인산염 석출에 의한 트랜스팩션, 리포팩션, 일렉트로포레이션, 열 충격, 생식핵으로의 마이크로 인젝션, "유전자 건", 아티피셜 바이러스 엔벨로프의 이용, 바이러스 감염과 같은 공지의 기술을 이용함으로써, 기능성 췌장 베타 세포에 또는 발생 10주를 넘지 않는 췌장 세포에 도입된다. 이러한 이식 유전자 또는 벡터는, 동종 재조합(hologous recombination)에 의해, 또는 무작위 재조합(random recombination)에 의해 숙주 게놈으로 도입되거나, 또는 염색체외 레플리콘으로서 존재한다.
본 발명의, "관심의 시퀀스"는 임의의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 이것은, 유전자(들), 인트론(들), 엑손(들), 조절 시퀀스(들) 또는 이의 조합 또는 이의 단편과 같은 유전자 DNA 단편이거나, 예를 들면 cDNA 유전자와 같은 재조합 DNA 분자일 수 있다. 관심의 시퀀스가 관심의 단백질을 코딩할 수 있을 때, 상기 관심의 시퀀스는, 선택 유전자(selection gene), 리포터 유전자, 치료 유전자, 불멸화 유전자, 변형 유전자가 될 수 있다. 이러한 관심의 시퀀스는 숙주 세포에 이 관심의 단백질의 올바른 발현에 필요한 임의의 유전자 원소(genetic element)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 이러한 "관심의 시퀀스"는 예를 들면 진단 또는 연구 관심를 갖는 관심의 단백질에 대해 암호화한다. 이러한 연구 관심를 갖는 단백질의 예는선택 단백질이다. 여기서 사용되는 것으로서, "선택 유전자"는 특정 조건, 즉, 선택적 작용제의 존재시 이것을 포함하는 분자 또는 세포에 대해 또는 이것에 반하여 하나를 선택하게 하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 의미한다. 이들 선택 단백질은 다른 독성 화합물(예를 들면, 항생물질)에 대한 저항을 제공하는 산출물을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 예를 들면, 엠피실린 또는 네오마이신 내성 유전자는 본 발명의 선택 마커에 대해 부호화하는 유전자를 구성한다.
이들 선택 마커는 양성 또는 음성 중 하나 일 수 있다(Capecchi et al.)의 US 5 631 153 참조). 바람직한 실시예에 따르면, 상기 선택 마커 단백질은 항생물질 내성 유전자, hisD 유전자, 하이포크산틴 포스포리보실 전이효소 유전자(Hypoxanthine phosphoribosyl transferase gene), 구아닌-포스포리보실-전이효소(Gpt) 유전자(guanine-phosphribosyl-transferase gene)로 구성된 군에서 선택된 유전자에 의해 코딩된 양성 선택 마커 단백질이다. 상기 항생물질 내성 유전자는 하이드로마이신 내성 유전자(hydromycin resistance gene), 네오마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 엠피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 플레오마이신 내성 유전자(phleomycin resistance gene), 블레오마이신 내성 유전자(bleomycin resistance gene), 제네티신 내성 유전자(geneticin resistance gene), 카베니실린 내성 유전자(carbenicinnin resistance gene), 클로람페니콜 내성 유전자(chlroramphenicol resistance gene), 퓨로마이신 내성 유전자(puromycin resistance gene), 블라스티시딘-S-디아미나제 유전자(blasticidin-S-deaminase gene)로 구성된 군에서 선택된다. 이 경우, 선택 약물은 하이그로마이신(hygromycin)이다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 항생물질 내성 유전자는 네오마이신 내성 유전자이다. 이 경우, 선택 약물은 G418이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 양성 선택 마커 단백질는 His D이며, 이 경우, 선택 약물은 히스티디놀(Histidinol)이다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 양성 선택 마커 단백질은 하이포크산틴 포스포리보실 전이효소(HPRT) 또는 하이포크산틴 구아노실 포스포리보실 전이효소(HGPRT)이며, 이 경우, 선택 약물은 하이포크산틴이다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 양성 선택 마커 단백질은 구아닌 포스포리보실 전이효소(Gpt)이며, 이 경우, 선택 약물은 크산틴이다. 음성 선택 마커 단백질을 사용하기 위한 본 발명의 범위가 또 있다. 예컨대, 이러한 단백질을 코딩하는 유전자는 HSV-TK 유전자이며, 이 경우, 선택 약물은 아사이클로비르-간사이클로비르(Acycliovir-Gancyclovir)이다. 예컨대, 이러한 단백질을 엔코딩하는 유전자는 하이포크산틴 포스포리보실 전이효소(HPRT) 유전자 또는 구아닌 포스포리보실 전이효소(Gpt) 유전자이며, 이들 경우에, 선택 약물은 6-티오구아닌(Thioguanine)이다. 예컨대, 이러한 단백질을 엔코딩하는 유전자는 사이토신(cytosin) 디아미나제이며, 이 경우, 선택 약물은 5-플루오로-사이토신(5-fluoro-cytosine)이다. 음성 선택 마커 단백질의 다른 예는 디프테릭 톡신 A(diphteric toxin A)(DTA)과 같은 바이러스성 독소 또는 세균성 독소이다.
연구적인 관심을 갖는 이러한 단백질의 예는 리포터 유전자이다. "리포터 유전자"에 의해 검출될 수 있는 발현을 갖는 생성물(즉, 리포터 단백질)을 코딩하는 어떠한 유전자를 의미한다. 리포터 단백질은 제한 없이 다음과 같은 속성: 형광성, 효소 활성, 또는 제2분자(예컨대, 바이오틴 또는 항체- 인지가능 에피토프(antibody-recognizable epitope))에 의해 특별하게 결합된 능력중 하나를 가질 수도 있다. 리포터 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP)과 같은 오토 형광 단백질과 이들 단백질의 형광 변형물이다. 바람직한 실시예에서, 관심있는 유전자는 GFP를 코딩한 유전자이다. 효소 활성을 갖는 리포터 단백질의 예는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 베타-글루코로니다제(β-glucoronisase), 알카라인 포스파타제(alcaline phosphatase), 루시페라아제(luciferase), 알콜 디하이드로게나제(alclhol deshydrogenase), 클로람페니콜-아세틸(chloramphenicol-acetyl) 전이효소, 페록시다제(peroxydase)이다.
또 다른 실시예에서, 관심있는 서열은 치료 유전자이다. "치료 유전자"는 기초를 이루는 단백질 결손을 중화하거나 보충하고, 또는 임의의 질병 상태 또는 증후군에서 선택적으로 특별한 유전자를 통제하에 두거나 코딩된 생성물의 네가티브 효과를 중화시킬 수 있는 유전자이다. 예컨대, 본 발명의 치료 유전자는 전사 인자 또는 호르몬, 췌장 세포에 인슐린 분비작용을 향상시키는 성장 인자이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 관심있는 서열은 형질전환(transforming) 유전자이다. "형질전환 유전자"는 거기에 함유되어 발현되는 세포에 형질전환되거나 발암성의 표현형(cancerous phenotype)을 갖는 능력을 부여하는 유전자를 의미한다. 형질전환된 세포는 바람직하게는 다음과 같은 특징: 불멸화(또는 무제한 성장), 접촉 억제의 손실, 성장 인자를 향한 독립성, 발암성, 앵커링(anchoring)의 손실을 갖고 있다. 형질전환 유전자의 예는 세포 유전자 라스(ras), 메트(met),NGL(ex-neu), bcl-X, 텔로머라아제(telomerase)유전자, 또는 SV40의 라아지 T 항원과 같은 생물학적 유전자 또는 온도 민감성 돌연변이체 형태이다. 바람직한 실시예에 따르면, 관심이 있는 유전자는 시미안바이러스(simian virus)40 (SV40)의 라아지 T 항원의 온도 민감성 돌연변이체이다.
바람직한 실시예에서, 관심이 있는 서열은 불멸화 유전자이다. "불멸화 유전자"는, 거기에 함유되어 발현되는 세포에 (거의) 무제한적인 성장 능력을 부여하는 유전자를 의미한다. 불멸화 유전자에 의해 감염된 세포는 제한적인 시간수(예컨대, 성숙한 섬유아세포(fibroblast)가 50 분할 이하)로 분할되도록 프로그램된 정상적인 세포와 달리, (거의) 무제한적으로 분할될 수 있다. 불멸화 유전자 중, 하나는 라아지 T 항원과 같은 myc 및 myb 세포 유전자, DNA 바이러스 유전자, 또는 라아지 T 항원 E1A의 온도 민감성 돌연변이체 형태로 열거될 수 있다. 불멸화 유전자는 일반적으로 단백질 인자와 직접 또는 간접적으로 DNA와 결합하는 핵 단백질을 코딩한다.
세포에 불멸화 유전자를 코딩하는 이식 유전자 코딩을 도입함으로써 본 발명의 췌장 세포의 불멸화 이외에, 본 발명은 자연 바이러스, 유전자재조합 바이러스, 또는 그것의 단편, 불멸화 유전자를 포함하는 바이러스 기초 벡터를 포함하는 군에서 선택된 화합물에 의한 감염에 의한 췌장 세포의 불멸화를 또한 포함한다. 이에 의해, 본 발명의 기능적인 동물 췌장 세포를 생산하는 방법은 상기 발생 10주를 넘지 않는 동물 췌장 배아세포를 불멸화하는 단계를 더욱 포함하며, 및/또는 단계(d)에서 얻어진 세포를 불멸화하는 단계를 더욱 포함한다. 이러한 바이러스는 렌티바이러스, 시미안 바이러스 SV40, 엡스테인-바 바이러스, 몰로니루케미아 바이러스 중에서 선택된다. 바람직하게는, 본 발명의 세포는 렌티바이러스 기초 벡터, 더욱 바람직하게는 HIV-1 기초 벡터에 의해 감염된다.
본 발명의 바이러스 기초 벡터, 더욱 바람직하게 본 발명의 HIV-1 기초 벡터는 랫트 인슐린 프로모터 또는 인체 인슐인 프로모터와 같은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 유전자를 포함하는 이미 기술된 발현 카세트를 구비한다. 일 실시예에서, HIV-1 기초 벡터는 관심있는 유전자와 같은 리포터(rapporter) 유전자, 더욱 구체적으로는 랫트 인슐린 유전자 프로모터에 작동가능하게 링크된 GFP 유전자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 HIV-1 기초 벡터는 랫트 인슐린 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 유전자와 같은 인코진(incogene)을 포함하는 발현 카세트이다.
멀티-트랜스제닉(multi-transgenic) 세포는 또한 본 발명의 범위에 있다. 또한, 본 발명의 췌장 세포는 상기 언급된 화합물에 의해 불멸화되고, 관심있는 다른 유전자를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수도 있다.
본 발명의 분리된 기능적인 췌장 세포는 개체 내에 도입 이전에 인 비트로 배양될 수 있다. 적절한 배양 매체는 본 기술의 당업자에게 이미 공지되어 있으며, 성장 인자 또는 생존, 증식을 향상하는 다른 화합물을 포함하거나, 또는 알파, 베타, 델타 췌장 세포와 같은 특정한 서브 타입의 췌장 세포의 성장을 선택적으로증진시킬 수도 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시예는 의약으로서 본 발명의 췌장 세포를 제공한다. 더 정확하게는, 본 발명은 당뇨병, 저혈당증(hypoglycemia), 또는 소화 효소의 기능장애에 연관된 병리를 치료하는 의약으로 본 발명의 췌장 세포를 준비하는 사용방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 당뇨병을 치료하는 의약으로 본 발명의 췌장 세포를 준비하는 사용방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포 치료용으로 본 발명의 췌장 세포를 사용하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 얻어지는 췌장 세포의 개체수로 유전자 전사를 받을 수 있는 질병의 치료 또는 질병과 연관된 증후군의 개선을 포함한다. 호르몬, 효소, 인터페론, 성장 인자 등으로 제한하는 것은 아니지만 특정한 분비 생성물의 결핍에 관한 질병은 유전적으로 변형된 췌장 세포에 의해 치료될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병의 생리 병리학적인 발생을 연구하는데 본 발명의 췌장 세포를 사용하는데 있다.
타가이식 또는 자가이식으로서 개체에 인 비트로 배양되거나 이식되는 이러한 세포는 혈당증 조절 및/또는 소화 효소 발현, 분리 및 조절의 분자학적, 생물학적, 생화학적, 생리학적 및/또는 생리병리학적 메커니즘을 연구하는데 매우 유용하다. 이러한 적용을 위해서는 불멸화된 기능적인 베타 세포가 높이 평가된다. 실제로, 본 발명은 인체 베타 세포주를 생성한다.
또한, 본 발명은 상이한 발생 단계에서 동물 배아 췌장 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 발생 10주를 넘지 않는 동물 췌장 배아세포의 유효량을, 인간을 제외한 수척형 당뇨/중증 복합 면역결핍(NOD/scid) 동물의 신장 피막에 주입하는 단계; 여기에서, 상기 NOD/scid동물의 종은 상기 배아 췌장 세포를 얻는 동물의 종과 상이하고,
(b) 동물 췌장 배아세포를 발생시키고, 임의적으로 분화시키고, 임의적으로, 적어도, 혈당증의 조절 및 소화 효소의 분비 중에서 선택된 췌장 기능을 재생시키는 단계,
(c) 상이한 시간의 주기에 상기 단계 (b)에서 얻어진 동물 췌장 세포를 수집하는 단계, 및
(d) 임의적으로, 상기 단계 (c)에서 얻어진 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법으로 얻어진 이런 췌장 세포는 소화 췌장 발생 연구에 유용하다. 상기 방법에 사용된 이런 췌장 세포와 췌장 배아세포는 유전학적으로 변형가능하다. 바람직하게는, 얻어진 췌장 세포는 불멸화된다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 췌장 배아세포가 접목된 NOD/scid동물이다. 이런 NOD/scid동물은, 이식된 췌장 배아세포로부터 유도되는 임의의 발생 단계에서 본 발명의 적어도 하나의 기능성 췌장 세포를 포함한다.
본 발명은 건강하거나 병적인 췌장효소의 발생과 기능을 연구 및 이해하기 위해 발명의 NOD/scid동물의 이용에 관한 것이다. 이런 동물은 췌장 발생, 주로인간 췌장효소 발생을 이해 및 연구하기 위한 훌륭한 모델을 구성한다. 또한, 이런 동물은, 예컨대, 인슐린 또는 글루카곤 발현에, 또는 혈당증 조절에 연관된 임의의 목적 유전자의 발현 또는 단백질에 조정 또는 작동함으로써, 췌장효소 발생을 조정하거나 혈당증의 조절을 조정할 수 있는 화합물을 스크린할 수 있다. 또한, 이런 동물은 소화효소의 표현을 조정할 수 있는 화합물을 스크린에 유용할 수 있다. "조정하다(modulate)" 라 함은, "향상한다", "감소한다", 또는 "삭제한다"를 의미한다.
달리 정의하지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술용어와 과학용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해되는 동일 의미를 갖는다.
이하에 나타낸 도면과 실시예는 당분야 당업자의 전문의에 추가 안내로서 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 추론해서는 안된다.
실시예
1 -
연구 디자인 및 방법
1.1 인간 조직
인간의 췌장을, 현행 프랑스 법률과 우리 연구소의 가이드라인에 따라, 발생 6주 내지 9주 (WD) 사이에 행해진 자발적인 유산 직후에 얻어진 배아 조직편으로부터 절개하였다. 따뜻한 허혈(ischemia)시간은 30분 미만이었다. 재태 연령은, 무월경(amenorrhea)의 지속주기; 초음파 스캔으로 측정한 크라운 럼프(crown-rump) 길이; 손과 발의 형태학과 같은 몇 가지 발생상의 기준으로부터 결정하였다. 췌장을 절개하여 고정시켜, 파라핀에 파묻거나, 아래에서 설명하는 바와 같이, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/scid) 마우스에 이식하였다.
1.2 동물 및 NOD/
scid
마우스로의 이식
NOD/scid마우스들을 무균-필터링되고 온도-제어되는 공기를 공급받으면서 격리실에서 배양하였다. 우리(cages), 깔깃(bedding) 및 음용수는 오토클래이브(autoclave)하였다. 음식은 X-레이 조사하여 살균처리하였다. 모든 처리는 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)하에서 수행하였다. 배아 췌장(발생 6-9주 (WD))을, 절개용 현미경을 이용하여, 힙노미데이트(Hypnomidate)(Janssen-Cilag)로 마취된 6주 내지 8주 연령의 NOD/scid마우스의 왼쪽 신장 피막 아래에 이식하였다. 이식 후 서로 다른 시간의 점에서(7일-9개월), 마우스들을 희생시키고 그래프트(grafts)를 제거하였으며, 중량을 측정하였고, 포르말린 3.7%에 고정하여 파라핀에 파묻었다. 세포 증식 분석을 위해, 희생되기 2시간 전에 브로모-디옥시 유리딘(Bromo-deoxy Uridine, BrdU)(50mg/kg)을 마우스들에게 주입하였다.
1.3 면역조직화학(Immunohistochemistry)
네 개의 마이크로미터 두께의 섹션들을 젤라틴화된 유리 슬라이드상에서 절단하였다. 면역염색을 위해, 섹션들을 톨루엔에서 탈파라핀화(deparaffinized)시켰고, 재수화 시켰으며, 0.01M, pH 6의 시트레이트 버퍼에서 마이크로웨이브처리한 후, 0.1% 트리톤(Triton)을 함유하는 트리스-버퍼드 셀라인(Tris-Buffered Saline, TBS)에서 20분동안 삼투시켰다. 비특정 부위들(sites)은 3% BSA와 0.1% 트윈(Tween)20을 함유한 TBS에서 30분동안 블록킹시켰으며 섹션들은 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서,섹션들을 세척하고 적절한 2차 항체와 함께 상온에서 1시간동안 배양하였고, 2가지의 서로 다른 형광색소로 라벨링(labelled)하였다. 1차 항체들은: 마우스 안티-휴먼 인슐린(mouse anti-human insulin)(Sigma Aldrich, 1/1000); 기니아 피그 안티-피그 인슐린(guinea pig anti-pig insulin)(Dako; 1/2000); 마우스 안티-휴먼 글루카곤(Sigma Aldrich, 1/2000); 래빗 안티-휴먼 팬-사이토케라틴(rabbit anti-human pan-cytokeratin)(Dako, 1/500); 마우스 안티-휴먼 사이토케라틴 19(Dako; 1/50); 마우스 안티-피그 비멘틴(vimentin) (Dako; 1/30); 래빗 안티-프로콘버타제(proconvertase) 1/3 (Steiner 박사의 증여, 1/200); 래빗 안티-팩스6(pax6) (S. Saule 박사의 증여); 래빗 안티-랫트 Nkx6.1 (Serup 박사의 증여); 마우스 안티-BrdU (Amersham) 등이었다. 형광성의 2차 항체들은: 플루오레세인-안티-기니아 피그 항체(Dako, 1:500); 플루오레세인-안티-래빗 항체(Immunotech, 1/200); 플루오레세인-안티-마우스 항체(Immunotech, 1/200); 텍사스-레드-안티마우스(Texas-red-antimouse) 항체(Jackson, 1/200); 텍사스-레드-안티-래빗 항체(Jackson, 1/200) 등이었다.
1.4 표면 정량화 및 통계적 분석
모든 이미지들에는 하마마츄(Hamamatsu) C5810으로 냉각된 삼중-CCD 카메라를 이용하여 번호를 매겼다. 그림들은 동일한 크기로 만들었고, IPLab 소프트웨어(버전 3.2.4, Scananalytics Inc.)를 이용하여 분석하였다. 이식된 각 조직에 대해, 섹션들을 이식기간 내내 규칙적인 시간간격으로 취한 후, 인슐린에 대해 염색하였다. 3개에서 4개의 섹션들 및 섹션당 3-5회의 관찰을 분석하였다. 이식 주기 동안의 베타 세포 덩어리의 진화는, 상응하는 그래프트(graft)의 중량에 의해 인슐린에 대해 양성으로 염색된 표면의 산출물로써 추산하였다.
1.5 인 시튜 하이브리다이제이션(In situ hybridization)
인 시튜 하이브리다이제이션을 위해, 섹션들을 탈파라핀화시켰고, 재수화시켰으며 1% 트리톤 X-100을 함유한 PBS에 삼투시켰다. 프리하이브리다이제이션(Prehybridization)은, 하이브리다이제이션 버퍼(50% 포르마마이드, 5 X SSC, 5X Denhardts' 용액, 250~㎍/㎖ 효모 RNA, 500㎍/㎖ 청어 정자 DNA)로 70℃에서 처리하였다. RNA 프로브들은 DIG-RNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim)를 이용하여 인 비트로(in vitro) 전사에 의해 DIG-UTP로 라벨링시켰다. 하이브리다이제이션은 Ipg/ml 프로브를 함유한 신선한 하이브리다이제이션 버퍼의 첨가에 의해 개시하여 70℃에서 밤새 계속하였다. 그 이후에, 슬라이드들은 감소된 농도의 SSC로 세척하였다. 노출은 면역조직화학에 의해 진행하였다. 비특정 부위들을 2% 블록킹 시약(Boehringer Mannhein)으로 Tris 25mM pH 7.5, NaCl 140mM, KCl2.7mM Tween 20 0.1%에서 상온 30분동안 블록킹하였다. 슬라이드들은 이어서 알카라인 포스파타제-컨쥬케이티드 폴리클로널 쉽 안티-DIG 항체(alkaline phosphatase-conjugated polyclonal sheep anti-DIG antibody)(1:1000으로 희석, Boehringer Mannheim)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 반응 산출물은 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium)과 5-브로모-4클로로-3-인돌일-포스페이트 미디움(5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate medium)(Bohringer Mannheim)을 이용한 효소-촉진된 채색 반응에 의해 시각화시켰다. 섹션들을 채색된 반응 산출물이 하이브리다이제이션 부위들에서 성장할 때까지 배양하였다. 슬라이드들은 H2O에서 세척하였으며, 라이츠(Leitz) DMRD 광 현미경(Leica)상에 올려져 시각화되었다. 여기서 사용된 프로브는 인간의 프로인슐린에 대응하는 것이었다.
1.6 당뇨 유도 시험
마우스의 혈당증을 조절하기 위한 그래프트의 용량을 결정하기 위하여, 이식된 및 이식되지 않은 NOD/scid마우스들에게, 인간을 제외한, 설치동물의 베타 세포들을 파괴하는 것으로 알려진(Eizirik 등, 1994년) 알록산(alloxan)(Sigma-Aldrich, 90mg/kg 신체 무게)을 정맥 주사하였다. 포도당 수준은 꼬리 정맥으로부터 일주일 동안 매일 채취한 혈액에 대해 휴대용 포도당 측정기(GlucoMen, A. Menarini diagnostics, Firenze, Italy)를 이용하여 측정하였다. 숙주에서의 혈액 포도당 수치의 정상화에 대한 그래프트의 기여도를 확인하기 위해, 그래프트는 알록산의 주사 이후에 서로 다른 시간의 점에서(7일 또는 42일) 일측성 신장절제술(unilateral nephrectomy)에 의해 제거하였고 혈액 포도당 수치를 측정하였다.
1.7 동물과 절개
임신한 마우스들은 장비에르(Janvier) 육종 센터(CERJ, Le Genet, France)에서 구입하였다. 질 마개(vaginal plug)를 발견한 날 아침을 엠브리아닉 데이 0.5(embryonic day 0.5)(E 0.5)로 명명하였다. 임신한 마우스들은 CO2로 도살하고, 배아를 채취한 후, 췌장을 절개하였다. 세포 증식 분석을 위해, 임신한 마우스들에게 도살 30분전에 BrdU(100mg/kg)를 주입하였다.
1.8 HIV-RIP-GFP 벡터의 구성 및 제조 : DNA 구성 및 벡터의 제조
프로모터 없는 pTRIP GFP는 이전에 서술되었다(Zennou 등, 2000년). 랫트 인슐린 프로모터의 408bp 단편(RIP 408)은, 다음과 같은 프라이머를 갖는 증폭 시스템(Roche)을 이용한 PCR에 의해, pBS-RIP-베타 글로빈 플라스미드(P. Herrera에 의해 제공되었음, Sanvito 등, 1995년)로부터 제조하였다.
MluI RIP sens = 5' cgacgcgtGGACACAGCTATCAGTGGGA 3' (SEQ ID N。1)
BamHI RIP antisens = 5' cgggatccTAGGGCTGGGGGTTACT 3' (SEQ ID N。2)
PCR 산출물은 pGEMT-이지 벡터(pGEMT-easy vector, Promega)내로 서브 클로닝되었다. 이엇, MluI-BamHI 단편을, MluI-BamHI 선형화된 프로모터없는 pTRIP GFP 벡터내로 삽입시켰다. PCR에 의해 유도되는 국부 돌연변이를 배제하기 위해, 삽입된 RIP408을 전체적으로 시퀀싱하였다. 벡터의 스탁은, 이전에 서술된 바와 같이(Zennou 등, 2000년), p8.7 인캡시데이션(encapsidation) 플라스미드(ΔVprΔVifΔVpuΔNef, Zufferey 등, 1997년), VSV 엔벨로프와 pTRIP RIP408-GFP 벡터(Yee. 등, 1994년)를 인코딩하는 pHCMV-G를 갖는 293T 세포의 일시적인 코트랜스펙션(cotransfection)에 의해 제조하였다. 상등액을 초원심분리(ultracentrifugation) 이전에 DNAse I로 처리하고, 이어서 PBS에서 재현탁하였으며 사용할 때까지 -80℃로 냉각시켰다.
1.9 배아 췌장의 감염:
재조합 렌티바이러스는 손상되지 않은 또는 분리된 췌장을 감염시키도록 사용된다. 분리를 위하여, 췌장은 디스페이즈 Ⅰ(Dispase I, Roche Bohringer) 0.16 mg으로 조직의 크기에 따라 5분 내지 30분 동안 배양시키고 기계적으로 분리하였다. 감염을 위하여, 분리된 또는 손상되지 않은 조직은 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100 mg/ml), L-글루타민(2 mM) 및 10㎕의 바이러스 입자(p24의 12 ㎍/ml)를 포함하는 200㎕의 RPMI 배지 1640로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 바이러스 감염 속도의 증가를 위하여, DEAE-덱스트란을 10 ㎍/ml의 농도로 부가하였다.
1.10 이식:
중증의 복합 면역 결핍(Scid) 마우스는 살균 여과되고 온도-조절된 공기가 공급되는 격리기에 수용되었다. 수면하고 물을 마시는 새장은 멸균되었다. 음식은 X-선 조사에 의해 살균된다. 모든 조작은 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)하에서 수행하였다. 배아 분리된 췌장은 다음의 변형과 함께 전술된 좌측 신장 피막하에 해부 현미경을 이용하여 이식되었다(Castaing 등, 2001). 좌측 신장을 몸밖으로 꺼내고 작은 횡단 절개를 하위 극 근처에서 신장의 복부면상의 피막을 통해 행하였다. 포켓을 피막 아래에 생성시키고, 작은 실리콘 링을 챔버에 이식된 조직을 제공하기 위하여 피막 아래에 있는 포켓에 부분적으로 밀어 넣었다(Thomas 등, 1997). 이어서, 분리된 세포를 무딘 22개의 게이지 니들을 가지는 50㎕ 해밀튼 주사기를 사용하여 실런더로 도입하였고, 링은 포켓으로 완전히 도입되었으므로, 상부에 있는 피막과 하부에 있는 신장 실질조직은 췌장 세포를 포함하는 밀봉된 공간을 형성하였다. 이 방법은 단일 위치로 세포를 한정하여, 발생이 용이하게 연구될 수 있을 것이다. 이식 이후의 다른 시간의 점에서, 마우스를 이산화탄소로 희생시켰고, 신장을 제거하고, 이식 조직을 포르말린 3.7%로 고정되어 파라핀에 묻었다.
1.11 면역조직화학 :
네 개의 마이크로미터 두께를 다른 문헌에서(CrasMeneur 등, 2001; Miralles 등, 1998) 기재된 것처럼 면역조직화학에 의해 수집하고 분석하였다. 면역 혈청을다음의 희석에 사용하였다: 마우스 안티-휴먼 인슐린(Sigma), 1/2,000; 마우스 안티-휴먼 글루카곤(Sigma), 1/2000; 마우스 안티-휴먼 팬사이토케라틴(Sigma), 1/100; 마우스 안티-BrdU(Amersham), 1/4; 래빗 안티-휴먼 팬사이토케라틴(Dako), 1/500; 토끼 안티-글루카곤(DiaSorin), 1/2000; 토끼 안티-돼지 인슐린(DiaSorin), 1/2000; 및 토끼 안티-GFT(Clontech), 1/200. 잭슨 면역연구 실험실로부터의 플루오레슨트 2차 항체는 FITC 안티-래빗 항체, 1/200; 및 텍사스 레드 안티-마우스 항체, 1/200 이었다. 이중 라벨링 면역형광법을 위하여, 상이한 종에 대하여 생성된 항체를 섹션에 적용하였고, 두개의 상이한 형광색소로 라벨링된 안티-종 항체를 사용하여 나타내었다. 미스 매치된 2차 항체로 배양된 단일 라벨 섹션은 면역염색을 보이지 않았고, 2차 면역혈청의 특성을 확인하였다. 섹션의 사진은 형광 현미경을 사용하여 촬영하였다(Leica, Leitz DMRB). 이들은 하마마츠(Midlesex, NJ) C5810 콜드 3CCD 카메라를 사용하여 디지털화하였다.
1.12 인슐린 함유량 :
인슐린 함유량 결정을 위하여, 배아 췌장 아체(bud) 또는 이식된 췌장을 균질화하였다. 인슐린을 -20℃에서 차가운 산성화된 에틸 알콜(1.5% HCl, 75% EtOH)의 10㎖로 밤새 추출하였다. 추출물을 인슐린에 대하여 분석될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 면역 반응성 인슐린은, 추적자로써 단일 요오드화된125I-라벨의 돼지 인슐린(Sorin Biomedica, Sallugia, Italy)과, 표준으로써 반 슈라벤디크 박사에의해 제공되는 기니 피그 안티-인슐린 항체와 정제된 랫트 인슐린(Novo Nordisk, Boulogne, France)을 이용하여 방사 면역 측정법으로 측정하였다. 결합 호르몬이 없이 분리하기 위하여 목탄을 사용하였다. 분석평가의 감도는 0.25ng/ml 이었다.
2-
결과
2.1 NOD/scid 마우스로의 인간 배아 이식
본 연구에서, 48개의 배아 췌장의 조직(6-9WD)을 NOD/scid마우스로 이식하였다. 마우스는 이식 이후의 서로 다른 시간점(7일-9개월)에서 희생되었고, 그래프트는 해부되었다. 39개의 그래프트를 회수하였다. 9개의 회수되지 않은 그래프트 가운데, 하나의 그래프트된 마우스는 죽었으나, 그래프트는 존재하였다. 8가지 경우에, 마우스는 알 수 없는 이유로 죽었고 그래프트 성장은 분석되지 않았다. 이식된 조직의 부피 및 질량에 있어서의 진화는 다음과 같이 기재한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 인간 배아 조직은scid마우스의 신장 피막하에 이식되었을 때, 대량으로 발생되었다. 이식 이전, 회임의 7-9주에서는 배아 췌장의 부피는 4㎣ 미만이었던 반면(도 1A), 시간이 지남에 따라 마우스 숙주에서 성장하여 6개월 후에는 수 ㎤의 부피에 달하였다(도 1B-1E). 질량의 관점에서 이식된 조직의 진화는 이하에 기재한다. 마우스에 있어서 1주 후에 그래프트 질량은 10㎎ 미만이었으나, 그래프트되지 않은 조직의 동일한 범위에 있어서, 다음 시간이 지남에 따라 빠르게 성장하여 8-12주 후에 100㎎으로, 33-38주 후에 1000㎎(도 2)으로 되었다. 안티-사이토케라틴 및 안티-비멘틴 항체를 사용하는 면역조직화학은 이식 전의 인간 배아 췌장에 존재하는 상피 및 중배엽성 세포의 이식 지속기간 동안 진화를 따르도록 수행하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 이식 전에, 8WD 췌장은 도관을 형성하는 상피 세포와 중배엽성 세포로 구성되어 있다. 이식 후 1개월 및 6개월에서, 조직은 또한 사이토케라틴에 대하여 양성으로 염색된 상피 세포와, 비멘틴에 대하여 양성으로 염색된 중배엽성 세포로 구성되어 있고, 이들 세포 형태 모두가 이식 동안 발생하였음을 지시한다(도 3B 및 도 3C).
2.2 내분비 조직의 발생.
이식 전에, 불과 소수의 내분비 세포만이 글루카곤에 대하여 또는 인슐린과 글루카곤 모두에 대하여 양성으로 염색된 면역조직화학에 의해 검출되었다. 이러한 세포는 췌장 조직에 분산되었고 랑게르한스 섬과 관련되지 않았다(도 4A). 일단 이식이 되면, 내분비 조직은 발생하기 시작하였고 내분비 세포의 수가 시간이 지남에 따라 증가되었다(도 4B-4F). 패널 G 및 H에, 8주 지난 췌장의 6개월 동안의 이식 전후에 프로인슐린에 대한 대표적인 하이브리다이제이션이 도시되어 있다. 프로인슐린 mRNA를 발현하는 세포 수의 큰 증가가 명확히 시각화될 수 있었다. 인슐린 양성 세포 부피의 진화는 면역조직화학 후에 정량화 되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 인슐린-발현 세포에 의해 점유되는 절대 표면은 마우스 내에서 8-12주 후에 300배, 21-28주 후에 5000배만큼 증가되었다.
2.3 이식 지속기간 동안 증식된, 내분비 세포가 아닌, 인간 미분화 상피 세포.
내분비 세포의 절대적인 수의 증가가 전구세포의 분화에 기인하였는지 아니면 이식전에 존재하였던 소수의 내분비 세포의 증식에 기인하였는지를 명확히 하기 위하여, 이식된 마우스를 희생 2시간 전에 BrdU로 주사하였고 면역조직화학 분석을 실행하였다. 도 6에 도시된 것처럼, 마우스에서 1개월 및 3개월 발생 이후에, 사이토케라틴 및 BrdU 모두에 대하여 양성으로 염색된 세포가 자주 검출된 반면, 인슐린 및 BrdU 모두에 대하여 양성인 세포는 매우 드물게 발견되었다. 이러한 결과는 내분비 세포 부피에 있어서의 증가는, 소수의 기존 내분비 세포의 증식으로 인한 것이 아니라, 전구 세포의 분화에 기인한 것임을 강하게 암시한다.
2.4 마우스에서 발생된 인간 내분비 세포는 성숙한 내분비 세포를 닮음.
NOD/scid마우스에서 발생된 인간 내분비 세포가 생체내에서 발생된 인간 베타 세포에 존재하는 것으로 알려진 마커를 발현하는가를 명확히 하기 위하여, 일련의 항체를 면역조직화학에 의해 시험하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, NOD/scid마우스에서 발생된 베타 세포는 PC 1/3, 프로인슐린을 인슐린으로 처리하는데 필요한 효소뿐만 아니라, Nkx6.1 및 Pax6(패널 A, B)과 같은 특정 전사 인자를 발현한다. 또한, 인슐린-발현 세포의 코어가 글루카곤-발현 세포(도 4, 패널 E, F)에 의해 둘러싸인 채, 그래프트에서의 내분비 세포는 종종 랑게르한스 섬과 연관된다. 마지막으로, 전술한 바와 같이(Bouwens 등, 1997), 제1의 내분비 세포가 사이토케라틴에 대하여 양성인 인간의 배아 췌장 염색에서 발견되었지만, NOD/scid마우스에서 발생된 인간의 인슐린을 발현하는 세포는 사이토케라틴 19를 발현하지 않았다(도 7, 패널 E, F).
2.5 인간 췌장 이식의 기능적 발생
이식에서 발생되는 인간 베타 세포가 기능적인지를 명확히하기 위해서, 15 NOD/scid마우스에 인간 배아 췌장을 이식하였다. 3개월 후에 이식되거나 이식되지 않은 NOD/scid마우스에, 쥐과에는 독성이 있으나 인간 베타 세포에 대해서는 독성이 없는 것으로 알려진 약제품(Eizirik et al, 1994)인 알록산(alloxan)을 주사하였다. 알록산을 주사하기 이전에는, 혈당수준이 이식되거나 이식되지 않은 마우스에서 통계적으로 다르지는 않았다. 알록산처리 후에, 모든 이식되지 않은 마우스의 혈당증은 6g/l 까지 증가하였다. 역으로, 혈당증은 15마리의 이식된 마우스 중 12 마리에서 안정한 상태로 유지하였다. 알록산이 주사된 이식된 마우스에서 혈당증의 조절은, 그래프트(graft)의 발생에서 비롯된 것이라는 것을 보여주기 위해, 6마리의 마우스에서 그래프트를 제거하기 위해 일측(unilateral) 신장절제를 행하고, 혈당수준을 모니터 하였다. 도 8A에서 나타나는 바와 같이, 일측 신장절제에 의한 그래프트 제거 후에, 알록산 주사 후, 7일 또는 43일 후에, 마우스는 고혈당(hyperglycemic)이 되었다. 또한, 알록산주사 전, 또는 동물이 죽었을 때의 실험 종료 시에, 인슐린 발현 세포와 글루카곤 발현 세포의 존재에 대하여, 쥐과의 췌장 및 그래프트를 분석하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 매우 적은 수의 인슐린 발현 세포가, 알록산이 처리되지 않은 NOD/scid마우스에 비해, 알록산이 주사되어이식된 NOD/scid마우스의 쥐과의 신장에서 검출되었다. 반면, 매우 많은 인슐린 생산세포가 알록산 처리 후의 인간 그래프트에서 존재하였다.
본 발명자들은, 인간의 초기 배아 췌장이, NOD/scid마우스의 췌장 피막하에서 이식되었을 때에, 발생이 가능함을 증명하고자 한다. 그래프트의 크기와 중량은 상당히 증가하고, 내분비 세포는 분화되어 랑게르한스 섬(islets of Langerhans)으로 조직화되고, 많은 성장 기준을 보여 주었다.
마지막으로, 발생한 인간 내분비 췌장 조직은 마우스에서 당뇨를 역전시킬 수 있었고, 이는 이의 기능성을 표시하는 것이다. 현시점의 연구에서, 발명자들은 이식의 수용자로써 NOD/scid마우스를 사용하였다. NOD/scid마우스는, C.B-17-scid/scid마우스로부터의scid돌연변이를 NOD 백그라운드로 교배(crossing)시킴으로써 준비하였다. 이러한 동물들은 T-림프구 및 B-림프구 결핍이며(Shultz et al., 1995), 체액성(humoral)면역 또는 세포-매개성(cell-mediated)면역을 발생시키지 못한다.scid마우스에서는 이종이식 거부가 존재하지 않으므로, 이들은 인간 또는 태아의 난소피질 헤마토림포이드(hematolymphoid) 조직과 세포 (Roncarolo et al., 1995)에 대한 수용자로써 이미 사용되었다. 난소피질(Weissman et al., 1999), 갑상선(Martin et al., 1993), 피부(Levy et al., 1998) 및 기도(Delplanque et al., 2000)와 같은 비 조혈성 인간 조직은 이러한 모델에서 또한 성공적으로 이식되었다. 그러나, 기능적 특성을 발생시키고 생리학적 기능을 교체할 이러한 조직의 역량은 드물게 입증되어 왔다. 생리학적 기능교체의 한 예는, 부신피질(adrenocortical)조직이 소과 부신피질 세포의 이식에 형성될 수 있으며,마우스 부신분비선의 필수적 기능을 교체할 수 있다는 것(Thomas, et al., 1997)이다. 그러나, 이러한 작업에서 이식된 조직은 인간의 것이 아니고, 소과(bovine)에서 기원한 것이라는 점이다. 더욱이, 조직은 소과 부신피질 세포의 주(primary) 배양으로부터 확장된 것이다. 따라서, 제공자 세포는 이식시에 이미 완전히 분화된다.
본 발명에서, 발명자들은scid마우스에서 미숙한 인간 배아 췌장이 발생할 수 있고, 기능적 특성을 가질 수 있다는 것을 입증한다.
분화되지 않은 상피세포와 간엽(mesenchymal)조직을 포함하나 인슐린 발현세포는 거의 포함하지 않는 이식된 미숙 양배흔적(rudiment)에 의해, 발명자들은 인슐린 발현 세포의 절대량이 마우스에서 6개월 후에 거의 5000배로 증가하였음을 입증한다. 이식 전에 매우 소수의 내분비 세포가 존재하는 반면, 수주 후에는 많은 양의 내분비 세포가 검출된다는 사실은, 현재의 모델에서 내분비 세포의 신형성(neoformation)이 발생한다는 것을 명백히 보여준다.
이론적으로, 인간 베타세포 량에서 관찰된 증가는 드물게 이미 존재하고 있던 인슐린 발현세포의 증식에 기인하는 것이거나, 전구 세포의 분화에 기인하는 것이다. 모체 시기(parental life) 동안에 베타 세포량의 증가는 이미 존재하던 베타 세포에 기인하기보다는 전구 세포의 분화에 주로 기인하는 것으로 생각된다. 이것은 많은 실험이 행해진 설치류에서, 태아 시기동안에 관찰된 내분비 세포량의 증가가 이미 존재하고 있던 내분비 세포의 증식에 의해서는 설명될 수 없다(Swenne, 1992)는 점으로부터 명백하다. 유용할 수 있는 정보가 적은 상황에서, 이것은 인간에 있어서도 마찬가지일 수 있다. 배아/태아 시기 동안 인슐린 발현 세포가 Ki67에 대해 드물게 양성으로 염색되고, 따라서 드물게 사이클링(cycling)하거나 사이클링하지 않는다(Potak et al., 2000; Bouwens et al., 1997). 본 발명자들의 데이터는 키메릭 마우스가 Brdu로 주사될 때, 그래프트에 존재하는 많은 수의 사이토케라틴 양성세포가 Brdu에 대해서 양성으로 염색되는 반면, 인슐린 양성세포에 대해서는 염색되지 않거나, 매우 드물게 염색된다는 것을 보여준다. 따라서, 그래프트에서 새로 형성된 베타세포는 도관상피(duct epithelium)에 존재하며 이식을 행하는 동안에 증식하고 분화하는 전구 세포에서 유래된 것이지, 양배흔적에 존재하는 소수의 내분비물 세포의 증식에서 유래된 것이 아니며, 이러한 메카니즘이 통상적인 발생을 반복시키는 것이라고 가정할 수 있다.
이와 다른 주장은 NOD/scid마우스에서 인비보(in vivo) 발생한 인간 베타세포는 성숙한 것이라고 지적한다. 우선, 이러한 인슐린 발현 세포는 글루카곤을 동시에 발현시키지는 못하고, 따라서, 발생의 초기 단계에 인간 췌장에서 검출되는 초기 인슐린 발현 세포와는 다른 것이다(Polak et al., 2000; Larsson and Hougaard, 1994; De Krijiger et at., 1992). 다음으로, 발생 16주 후에 췌장에 존재하는 인슐린 발현 세포는 사이토케라틴 19를 발현시키는 반면, 발생 동안 나중에 발견된 인슐린 발현 세포는 이러한 마커(marker)를 음성으로 염색한다는 것이다(Bouwens et al., 1997). 본 발명자들의 데이타는, NOD/scid마우스에서 발생된 인간 베타 세포는 사이토케라틴 19를 음성으로 염색시키고, 따라서, 성숙한 베타세포를 닮는다 것을 보여준다. 다음으로, NOD/scid마우스에서 발생한 인간 베타세포는, 프로인슐린(proinsulin)을 인슐린으로 처리하기 위하여 필요한 효소(Kaufman et al., 1997; Furuta et al., 1998)인 프로호르몬 컨버타제(prohormone convertase) PC 1/PC3를 발생시킨다. 마지막으로, 발명자들의 데이터는, NOD/scid마우스에서 발생한 인간 내분비 세포량이 내생적인 베타세포에서 부족한 NOD/scid마우스의 혈당증을 완벽하게 조절할 수 있으므로, 기능적이라는 것을 보여준다. 이러한 인간 내분비 세포는 적어도 43일 동안 (그래프트를 제거하기 전에 시험된 최장기간임), 기능적으로 잔존하여 마우스의 혈당증을 조절하게 된다.
본 발명자들은 여기서, 그 자신의 베타 세포가 제거된 숙주(host)의 혈당증을 조절할 수 있는 새로 분화된 인간 베타 세포는 인간 초기 배아 췌장으로부터 생산될 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 인간 배아 췌장은 이식을 위한 기능적 인간 베타세포를 발생시키는 데에 유용한 조직의 대안적인 근원임을 의미하게 된다. 또한, 인간 배아 췌장이 이식된 마우스의 모델은, 인간 배아 췌장과 적절한 연구시스템의 부족으로 인해 수행하기 어려웠던 인간췌장 발생 연구의 진전을 위해 사용될 수 있다는 것이다.
2.6
Scid
마우스에 이식된 랫트 배아 췌장의 발생과 재조합 렌티바이러스를 사용한 인슐린 발현세포 형질도입 조건의 연구
발명자들은 우선scid마우스에 이식되었들 때 성장하고 발생한 췌장 조직의 용량을 연구하였다. E16,5 췌장을 절개하고scid마우스의 신장피막 아래에 이식하였다. 그래프팅 7일 후에, 마우스는 죽고, 그래프트를 제거하였다. 이미 보인 바와 같이(Rall et al., 1973), 이식 전의 E16에서, 췌장에서의 내분비 세포의 대다수는 글루카곤 발현 세포이고, 매우 드문 수가 현 단계에서의 인슐린 발현 세포이다. 이러한 인슐린 발현 세포는 흩어진 채로 발견된다(도 9A). 반면, E16 췌장이 7일 동안 이식되었을 때, 인슐린 발현 세포가 발생하고 랑게르한스 섬을 형성하는 것이 발견된다(도 9B). 다음으로 본 발명자들은 리포터(reporter)로서, 녹색 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein)을 포함하는 HIV-1 기초 벡터를 사용하였다. GFP는 GFP 발현을 베타 세포에 한정하는 랫트 인슐린 프로모터 (RIP, rat insulin promotor)에 의해 구동된다. E16 췌장은 7일 동안 감염되고 이식된다. 도 9C에서 보이는 바와 같이, 이러한 조건하에서는 GFP 발현 세포가 검출되지 않았다. 다음으로 본 발명자들은 실험을 반복하였으나, 이번에는 감염과 그래프트 이전에 조직을 분리하였다. 도 9D에서 보이는 바와 같이, 이러한 조건에서는 내분비 조직이 적절히 발생하였다. 또한, 감염 이전에 디스파제(Dispase)로 조직이 분리되었을 때(도 9E), 많은 수의 세포가 GFP를 발생시켰다. GFP는 감염되지 않은 조직에서는 전혀 발견되지 않았다(데이터 도시하지 않음).
2.7 인슐린 발현 세포에서의 GFP의 장기간 발현.
다음 단계는 GFP를 발현하는 세포 타입을 정의하는 것이었다. 이중 면역조직 화학은, GFP-발현 세포가 각각 베타 세포, 알파 세포 또는 도관세포인지 아닌지 결정하기 위해, 안티-인슐린, 안티-글루카곤 및 안티-사이토케라틴을 사용하여 실시되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, GFP는 인슐린 발현 세포 중에서 명백히 검출되었다. 다른 한편으로, GFP는 글루카곤-발현 세포 또는 사이토케라틴-발현 세포 중에서 전혀 검출되지 않았다.
마지막으로, 도 11에 도시된 바와 같이, 1개월보다 긴 기간(분석된 최장기 시점)에서 GFP의 지속 발현은 GFP가 랫트 인슐린 프로모터에 의해 촉진되었을 때, 성취될 수 있었다.
2.8 GFP를 발현하는 베타 세포는 감염된 선조로부터 기인한다.
2개의 논의 세트는, GFP 발현 베타 세포가, 우선 RIP-GFP에 감염되고 이어서 베타 세포로 분화되고, 다음에 증식할 E16에 존재하는 소수의 베타 세포의 감염에 의하지 않는 선조로부터 유래한다는 것을 지적하고 있다. 우선, Scid 마우스의 신장 피막하로 이식된 E16 췌장의 발생 모델에 있어서, 베타 세포 분화가 발생한다. 사실, 도 12a에 도시된 바와 같이, 1주 이식 기간에서, 방사성 면역학적 검증에 의해 측정된 췌장당 인슐린 함량은 250배보다 많이 증가되었다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 이 단계에 있어서, 기대한 바와 같이, 췌장 세포의 증식은 높고, 인슐린 발현 세포는 증식하지 않는다. 인슐린/GFP 세포가 감염된 선조 세포로부터 유래하지만, 미리 존재하는 성숙 베타 세포로부터 유래하지 않는다는 것을 추가로 증명하기 위해서, 감염은 E13에서 분리된 췌장을 사용하여 반복하였다. 이전에 도시된 바와 같이, 이 단계에서, 인슐린 발현 세포는 거의 존재하지 않고, 완전히 미성숙하다(Jackerott 외, 1996; Miralles 외, 1998; Pictet 및 Rutter, 1972). 이러한 미성숙 인슐린 발현 세포는 이후에 성숙 베타 세포를 발생하지 않을 것이라고 현재 입증되어 있다(Jensen 외, 2000). 도 12c에서 도시된 바와 같이, 분리된 E13 췌장이 RIP-GFP로 감염되어, Scid 마우스의 신장 피막하로 이식되었을 때, GFP를 발현하는 베타 세포는 1주일 후에 검출될 수 있어, E13에서 감염된 내분비성 선조로부터 인슐린/GFP 이중 양성 세포가 유래한다고 지적된다.
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<223> Description of Artificial Sequence: Antisense
primer BamHI RIP
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Claims (33)
- 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법에 있어서,(a) 발생 10주를 넘지 않는 동물 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency, NOD/scid)동물의 신장 피막(kidney capsule)에 주입하는 단계; 여기에서 상기 NOD/scid동물의 종(species)은 상기 배아 췌장 세포를 얻은 동물의 종과 상이하고,(b) 동물 배아 췌장 세포를 발생시키고, 분화시키고, 적어도 췌장 기능을 재생시키도록 하는 단계; 및(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 동물 기능성 췌장 세포의 유효량을 개체에 이식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 개체는 포유류인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물 배아 췌장 세포는 인간 배아 췌장 세포인 것을특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 인간 배아 췌장 세포는 발생 6주 내지 9주의 배아세포인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/scid)동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 이식되는 동물 췌장세포의 유효량은 약 103내지 1012세포인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 이식되는 동물 췌장세포는 상기 개체의 췌장안으로 도입되는 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 췌장 기능은 혈당증(glycemia) 조절기능인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 개체는 인슐린-의존성 당뇨병 환자인 것을 특징으로 하는 개체의 췌장 기능을 재생하는 방법.
- 치료가 필요한 인간환자에서의 당뇨병의 치료방법에 있어서,(a) 발생 10주를 넘지 않는 인간 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍 동물의 신장피막에 주입하는 단계;(b) 상기 배아 췌장 세포를 발생시키고, 분화시키고, 적어도 췌장기능을 재생시키도록 하는 단계;(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 인간 기능성 췌장 세포의 유효량을 상기 환자에 이식하는 단계; 및(d) 혈당증 조절의 췌장 기능을 재생시킴으로써 당뇨병을 치료하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간환자에서의 당뇨병의 치료방법.
- 제11항에 있어서, 상기 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 인간환자에서의 당뇨병의 치료방법.
- 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법에 있어서,(a) 발생 10주를 넘지 않는 동물 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/scid) 동물의 신장 피막에 주입하는 단계; 여기에서 상기 NOD/scid동물의 종은 상기 동물 배아 췌장 세포를 얻은 동물의 종과 상이하고,(b) 상기 동물 배아 췌장 세포를 발생시키고, 분화시키고, 적어도 췌장기능을 재생시키도록 하는 단계;(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 동물 췌장 세포를 수집하는 단계; 및(d) 임의적으로, 상기 단계 (c)에서 얻은 세포를 인 비트로(in vitro) 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 췌장 기능은 혈당증 조절기능인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 얻은 세포를 불멸화(immortalizing)시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 발생 10주를 넘지 않는 상기 동물 배아 췌장 세포를 불멸화시키는 예비 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 세포는, 자연 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 이들의 단편, 바이러스 기초 벡터로 이루어지는 그룹에서 선택되는 화합물로 불멸화되고, 상기 바이러스는 렌티바이러스(lentivirus), 시미안바이러스(simian virus) SV40, 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Bahr virus), 몰로니 루케미아 바이러스(Moloney leukemia virus) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 화합물은 렌티바이러스 기초 벡터이고, 바람직하게는 HIV-1 기초 벡터인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 바이러스 기초 벡터는, 랫트 인슐린 유전자 프로모터에 효과적으로 연결된 관심의 유전자를 포함하는 발현 카세트(expession cassette)를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 관심의 유전자는 레포터 유전자(rapporter gene)이고, 바람직하게는 녹색형광 단백질(green fluorescence protein, GFP)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 관심의 유전자는 종양 유전자(onco gene)인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 얻은 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 발생 10주를 넘지 않는 동물 췌장 세포를 유전적으로 변형시키는 예비 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 제13항 기재의 방법에 의하여 얻어지고, 췌장 베타 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포.
- 제24항에 있어서, 상기 세포는 포도당에 반응하여 인슐린을 발현시키는 췌장 베타 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는 랫트 세포인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 의약인 것을 특징으로 하는 기능성 동물 췌장 세포.
- 당뇨병 치료의 의약 제조를 위한 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항 기재의 췌장 세포의 용도.
- 세포 치료를 위한 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항 기재의 췌장 세포의 용도.
- 당뇨병의 생리 병리학적 발생을 연구하기 위한 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항 기재의 췌장 세포의 용도.
- 발생의 상이한 단계에서 동물 췌장 세포를 생산하는 방법에 있어서,(a) 발생 10주를 넘지 않는 동물 배아 췌장 세포의 유효량을, 인간을 제외한, 수척형 당뇨/중증의 복합 면역결핍(NOD/scid)동물의 신장 피막에 주입하는 단계; 여기에서 상기 NOD/scid동물의 종은 상기 동물 배아 췌장 세포를 얻은 동물의 종과 상이하고,(b) 동물 배아 췌장 세포를 발생시키고, 임의적으로 분화시키고, 임의적으로 적어도 췌장기능을 재생시키도록 하는 단계;(c) 상이한 시간 간격으로 상기 단계 (b)에서 얻은 동물 췌장 세포를 수집하는 단계;(d) 임의적으로, 상기 단계 (c)에서 얻은 세포를 인 비트로 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 췌장 세포를 생산하는 방법.
- 췌장의 발생을 연구하기 위한, 제32항에 기재된 방법에 의해 얻어진 췌장 세포의 용도.
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