MXPA99008933A - Linea de celulas germinales embrionicas, humanas y metodos de uso - Google Patents

Abstract

Células germinales primordiales aisladas de tejido embrionico humano,tal como los bordes gonadales de embriones humanos,son divulgadas. Las células germinales primordiales son cultivadas,dando como resultado células que se asemejan a las células embriónicas de linaje o células germinales embriónicas en morfología y pluripotencia .Las células son mantenidas varios meses en cultivo y pueden ser manipuladas genéticamente usando tecnología transgenica para insertar material genético heterologo.

Description

-LINEA DE CÉLULAS GERMINALES EMBRIÓN!CAS , HUMANAS, Y MÉTODOS DE USO Antecedentes de la Invención 1. Campo de la Invención La presente invención se refiere en general al campo del cultivo in vitro .de células no diferenciadas, y a métodos para producir estas células. De una manera más específica, la invención se refiere a métodos y composiciones para producir células germinales embriónicas (EG) humanas, y a métodos para utilizar estas células. La invención tiene aplicaciones en las áreas de cultivo celular, trasplante de tejido, descubrimiento de fármacos, y terapia génica. 2. Descripción de la Técnica Relacionada Las células primordiales embriónicas pluripotentes se han derivado tradicionalmente en particular a partir de dos fuentes embriónicas . Un tipo de célula pluripotente de ratón se puede aislar en cultivo a partir de células de la masa celular interna de un embrión previamente al implante, y se denominan células primordiales embriónicas (ES) (Evans y Kaufman, Na ture 292:154-156, 1981) . Un segundo tipo de célula primordial pluripotente de ratón se puede aislar a partir de células germinales primordiales (PGCs) localizadas en los rebordes mesentéricos o genitales de los embriones de ratón de los días 8.5-12.5 después del coito, y se ha denominado célula germinal embriónica (EG) ( atsui y colaboradores, Na ture 353:750-751, 1991; Resnic y colaboradores, Na ture 359:550-551, 1992; Hogan, patente de los Estados Unidos 5,453,357) . Ambos tipos de células son pluripotentes y demuestran transmisión genética de la línea germinal en el ratón. Las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas propagadas in vitro, pueden contribuir eficientemente a la formación de quimeras, incluyendo quimeras de la línea germinal. Es importante que ambos de estos tipos de células se pueden manipular genéticamente in vi tro sin que pierdan su capacidad para generar quimeras de la línea germinal. Por consiguiente, las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas son útiles en métodos para la generación de animales transgénicos. Estos métodos tienen un número de ventajas, comparándose con las técnicas más convencionales para introducir nuevo material genético en estos animales, tales como inyección de cigoto e infección viral. Primero, se puede introducir el gen de interés, y se puede caracterizar su integración y expresión in vitro . Segundo, se puede estudiar el efecto del gen introducido sobre el crecimiento de las células primordiales embriónicas o germinales embriónicas in vi tro . Tercero, las células primordiales embriónicas o germinales embriónicas caracterizadas que tengan los genes novedosos, se pueden introducir de una manera eficiente en embriones mediante inyección de blastocisto o acumulación de embrión, y las consecuencias del gen introducido sobre el desarrollo de las quimeras transgénicas resultantes monitoreadas durante la vida prenatal o postnatal. Cuarto, el sitio en el genoma de células primordiales embriónicas o germinales embriónicas en donde se integra el gen introducido se puede especificar, permitiendo la dirección genética subsecuente y el reemplazo del gen (Thomas y Capecci, Cell 51:503-512, 1987) . Sin embargo, las líneas de células germinales embriónicas o primordiales embriónicas estudiadas hasta la fecha solamente retienen el fenotipo de célula primordiales in vi tro cuando se cultivan bajo condiciones especiales. Las condiciones incluyen cultivar las células sobre una capa alimentadora de fibroblastos (tales como células STO de murino, por ejemplo Martin y Evans, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 72:1441-1445, 1975), cuando se cultivan en un medio condicionado por ciertas células (por ejemplo, Koopman y Cotton, Exp . Cell 154:233-242, 1984; Smith y Hooper, Devel . Biol . 121:1-91, 1987), o mediante la adición exógena del factor inhibidor de leucemia (LIF) . Estas células se pueden cultivar de una manera relativamente indefinida, utilizando las condiciones de cultivo apropiadas. Sin embargo, los factores responsables de mantener la pluripotencia de las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas siguen siendo pobremente caracterizadas, y con frecuencia dependen de la especie a partir de la cual se hayan cosechado las células . En ausencia de células alimentadoras, el factor inhibidor de leucemia (LIF) exógeno, o el medio condicionado, las células primordiales embriónicas o germinales embriónicas se diferencian de una manera espontánea en una amplia variedad de tipos de células, incluyendo las células que se encuentran en cada una de las capas germinales del endodermo, mesodermo, y ectodermo. Con las combinaciones apropiadas de factores de crecimiento y diferenciación, sin embargo, se puede controlar la diferenciación celular. Por ejemplo, las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas de ratón pueden generar células del linaje hematopoyético in vitro (Keller y colaboradores, Mol . Cell . Biol . 13:473-486, 1993;' Palacios y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 92:7530-7534, 1995; Rich, Blood 86:463-472, 1995). Adicionalmente, se han utilizado células primordiales embriónicas de ratón para generar cultivos in vitro de neuronas (Bain y colaboradores, Developmen tal Biology 168:342-357, 1995; Fraichard y colaboradores, J. Cell Science 108:3161-3188, 1995), cardiomiocitos (células del músculo cardíaco) (Klug y colaboradores, Am . J. Physiol . 269 : H1913-H1921 , 1995), células de músculo esquelético (Rohwedel y colaboradores, Dev. Biol . 164:87-101, 1994), y células vasculares (Wang y colaboradores, Development 114:303-316, 1992). Subsecuentemente al trabajo con embriones de ratón, varios grupos han tratado de desarrollar líneas celulares primordiales embriónicas similares a partir e ovejas, cerdos, y vacas. Una línea celular con apariencia de tipo de célula primordial embriónica se ha cultivado como se reporta a partir de embriones porcinos utilizando condiciones de cultivo similares a las de ratón (Evans y colaboradores, solicitud PCT WO 90/03432; Notarianni y colaboradores, J. Reprod. Fert . , Suppl . 41:51, 1990; Piedrahita y colaboradores, Ther iog enol ogy 34:879, 1990; Notarianni y colaboradores, Proceedings of the 4th World Congress on Genetics Applied to Livestock Productions, 58, Edimburgo, julio de 1990) . Otros grupos han desarrollado líneas celulares primordiales de aves a partir de pollos (Pain y colaboradores, Developmen t , 122:1996) . Sin embargo, no se han reportado líneas de células primordiales embriónicas y germinales embriónicas humanas . Cualquier método que permita la producción de células primordiales embriónicas y germinales embriónicas humanas es deseable, debido a que las líneas de células primordiales embriónicas o germinales embriónicas humanas permitirían estudiar más fácilmente el desarrollo humano temprano, y el uso de estas líneas de células germinales embriónicas humanas haría posible el desarrollo de cultivos celulares para trasplante, fabricación de productos biofarmacéuticos, y desarrollo de sensores basados en los aspectos biológicos. Es importante que la capacidad para producir grandes cantidades de células humanas tiene importantes aplicaciones de trabajo para la producción de sustancias, tales como insulina o factor VIII, que actualmente se deben obtener de fuentes o donadores no humanos; implante para tratar enfermedades, tales como enfermedad de Parkinson; tejido para injerto; y rastreos de fármacos y toxinas. Compendio de la Invención La presente invención proporciona una línea de células germinales (EG) pluripotentes embriónicas humanas, y un método para producir estas células. La invención también proporciona métodos para utilizar células germinales embriónicas. Las células germinales embriónicas se derivan a partir de las células germinales primordiales (PGCs) aisladas, de conformidad con una modalidad, a partir de tejidos gonadales, rebordes genitales, mesenterios o sacos de yema embriónica de embriones humanos. Las células germinales primordiales se cultivan bajb condiciones que permitan la derivación de células germinales embriónicas. La presente invención también proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo celular a largo plazo (más de 30 días) de las células germinales embriónicas resultantes . La invención proporciona una línea celular que tiene las características de una célula germinal embriónica humana. En un aspecto, las células se cultivan en un medio que incluye un factor de crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) . En otra modalidad, las células se cultivan en la presencia de un medio de cultivo que contenga una cantidad efectiva de un ligando que se fije a un receptor que pueda asociarse con glicoproteína 130 (gp 130) , o un anticuerpo que se fije a, y estimule la glicoproteína 130; y un factor de crecimiento, que en una modalidad es factor de crecimiento de fibroblastos básico. En otra modalidad, el medio de cultivo de células germinales embriónicas de la invención puede incluir forscolina u otro compuesto elevador de cAMP . En otro aspecto, las células germinales embriónicas son positivas para fosfatasa alcalina. En todavía otro aspecto, las células germinales embriónicas expresan los antígenos de superficie celular SSEA-1 y SSEA-4. En todavía otro aspecto, las células germinales embriónicas expresan los antígenos de superficie celular que se enlazan con anticuerpos que tienen la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales TRA-1-60 (ATCC HB-4783) y TRA-1-81 (ATCC HB-4784) . Las células también pueden expresar el antígeno de superficie celular SSEA-3. En un aspecto, la invención proporciona un método para rastrear e identificar compuestos que afecten a la función de las células germinales embriónicas. En una modalidad, el método incluye incubar componentes que comprendan al compuesto, y cuando menos una célula germinal embriónica, bajo condiciones suficientes para permitir que interactúen el compuesto y la célula; y determinar el efecto del compuesto sobre una función de célula germinal embriónica antes y después de la incubación en la presencia del compuesto. Una función celular que se puede modular (por ejemplo, inhibir o estimular) mediante el compuesto incluye, pero no se limita a, diferenciación, expresión genética, producción de factores de crecimiento, respuesta a factores de crecimiento, y modulación de la permeabilidad de la membrana celular. En otro aspecto, la presente invención proporciona productos farmacéuticos útiles producidos por las células germinales embriónicas o las líneas celulares derivadas a partir de las células germinales embriónicas de la presente invención, incluyendo células y líneas celulares derivadas a partir de células germinales embriónicas que comprendan una o más modificaciones genéticas. En otro aspecto, la invención proporciona un método para utilizar una célula germinal embriónica para producir células de linaje de desarrollo restringido. En una modalidad, se cultiva una célula germinal embriónica bajo condiciones efectivas para inducir la diferenciación de la célula germinal embriónica, con el fin de producir de esta manera una célula de linaje de desarrollo restringido a partir de la célula germinal embriónica. En una modalidad, el agente es un polipéptido induciblemente o constitutivamente expresado a partir de un polinucleótido recombinante establemente transfectado en la célula germinal embriónica. Por ejemplo, se expresa una telomerasa recombinante en una célula de linaje de desarrollo restringido, produciendo de esta manera células humanas inmortalizadas que tienen las características de una célula de linaje de desarrollo restringí-do. En otro aspecto, se expresa un marcador seleccionable en una célula de linaje de desarrollo restringido. La célula de linaje de desarrollo restringido contiene un polinucleótido recombinante que codifica el marcador seleccionable, de tal manera que el marcador se expresa a partir de un promotor específico de la célula de linaje de desarrollo restringido. Las células de linaje de desarrollo restringido pueden ser células neuroepiteliales (por ejemplo, neuronas, glia, o células epiteliales) o miocitos (por ejemplo, cardiomiocitos o células de músculo esquelético) . Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un método para utilizar una célula germinal embriónica con el fin de producir una red neural. En otra modalidad, la invención proporciona un método para utilizar una célula germinal embriónica para producir uniones neuro usculares . En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que pueda hacer que las células germinales embriónicas se diferencien. En una modalidad del método, los componentes, incluyendo el compuesto y cuando menos una célula germinal embriónica, se incuban bajo condiciones suficientes para permitir que interactúen los componentes. El efecto del compuesto sobre la célula germinal embriónica se determina antes y después de la incubación en la presencia del compuesto. La aparición en el cultivo de una célula de linaje de desarrollo restringido, indica la diferenciación de la célula germinal embriónica por el compuesto. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que pueda desdiferenciar una célula de linaje de desarrollo restringido, con el fin de proporcionar una célula germinal embriónica. En una modalidad del método, los componentes, incluyendo el compuesto y cuando menos una célula de linaje de desarrollo restringido humana, se incuban bajo condiciones suficientes para permitir que interactúen los componentes. El efecto del compuesto sobre la célula de linaje de desarrollo restringido humana se determina antes y después de la incubación en la presencia del compuesto. La aparición en el cultivo de una célula que tenga las características de una célula germinal embriónica, indica que el compuesto es efectivo para inducir la desdiferenc-iación de la célula de linaje de desarrollo restringido . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra fotomicrografías de células germinales embriónicas humanas (EGs) , que muestran el teñido histológico positivo para fosfatasa alcalina. La Figura la muestra una célula germinal primordial no móvil con la morfología redondeada característica. La Figura lb muestra una célula germinal primordial migratoria con la morfología seudopodal característica. La Figura 2 muestra fotomicrografías de colonias de células germinales e briónicas humanas .

La Figura 2a demuestra una morfología característica de una colonia de células germinales embriónicas en múltiples capas. La Figura 2b demuestra una morfología característica de una colonia de células germinales embriónicas en una sola capa. La Figura 3 muestra fotomicrografías de colonias de células germinales embriónicas humanas (EG) que muestran el teñido inmunohistoquímico positivo para: (A) antígeno embriónico específico de la etapa-1 (SSEA-1) ; (B) antígeno embriónico específico de la etapa-3 (SSEA-3) ; (C) antígeno embriónico específico de la etapa-4 (SSEA-4); (D) un antígeno de superficie celular que se enlaza con el anticuerpo que tiene la especificidad de enlace del anticuerpo monoclonal designado como TRA-1-60 (ATCC HB-4783) ; (E) un antígeno de superficie celular que se enlaza con el anticuerpo que tiene la especificidad de enlace del anticuerpo monoclonal designado como TRA-1-81 (ATCC HB-4784); (F) actividad de fosfatasa alcalina. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona células germinales embriónicas humanas, y métodos para producir y mantener estas células germinales embriónicas humanas en cultivo. Una ventaja de la invención es que las células germinales embriónicas humanas se pueden producir de una manera eficiente. El desarrollo de cultivos de células germinales embriónicas que se pueden mantener como líneas celulares, permite la investigación de cuestiones fundamentales con respecto a las propiedades bioquímicas y celulares de estas células, y a la dinámica de interacción en su medio ambiente celular y químico. En adición, se pueden producir tejidos y sustancias útiles utilizando las células germinales embriónicas humanas de la invención. Como un ejemplo, las células germinales embriónicas de la invención se pueden utilizar convenientemente para incorporar de una manera estable secuencias genéticas que codifiquen diferentes receptores, ligandos, y neurotransmisores, por ejemplo, para utilizarse en el tratamiento de sujetos con diferentes desórdenes, y para identificar compuestos y moléculas pequeñas que interactúen con las células genéticamente modificadas o las células germinales embriónicas mismas. Esta invención no se limita a las células, composiciones, reactivos, métodos, o usos descritos, debido a que estas células, composiciones, reactivos, métodos, o usos, por supuesto, pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y la terminología utilizada en la presente no pretende limitar el alcance de la presente invención, el cual solamente será limitado por las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Nada de lo contenido en la presente debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a una ante-fecha de dicha divulgación en virtud de una invención anterior. A través de toda esta descripción, la modalidad preferida y los ejemplos mostrados deben considerarse como ejemplos, en lugar de ser limitaciones sobre la presente invención.

Definiciones Los siguientes términos se definirán como se proporciona, a menos que se informe de otra manera. Toda la demás terminología utilizada en la presente será definida con respecto a su uso en la técnica particular a la que pertenece, a menos que se observe de otra manera. Un "anlagén" es el rudimento de la primordia de un órgano, tejido, o parte del mismo. El término "anticuerpo", como se utiliza en esta invención, incluye las moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, Fab', F(ab' )2, y Fv, que pueden fijar el determinante epitópico. Si es necesario, los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, mediante su fijación a, y su elución a partir de, una matriz a la que se fije el polipéptido o un péptido en el que se reprodujeron los anticuerpos. Los expertos en la materia conocerán diferentes técnicas comunes en la técnica de inmunología para la purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como de anticuerpos monoclonales (ver, por ejemplo, Coligan, y colaboradores, Current Protocols in Immuno-logy, Wiley Interscience, edición actual, incorporado como referencia) . "Anticuerpo purificado" significa un anticuerpo que está cuando menos el 60 por ciento en peso exento de proteínas y moléculas orgánicas que se presentan naturalmente con las que está naturalmente asociado. De preferencia, la preparación es cuando menos el 75 por ciento, más preferiblemente el 90 por ciento, y muy preferiblemente cuando menos el 99 por ciento en peso de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico contra SSEA-1. Un anticuerpo purificado se puede obtener, por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad utilizando proteína recombinantemente producida, o péptidos de motivo conservado, y técnicas convencionales. La invención puede emplear no solamente anticuerpos monoclonales o policlonales intactos, sino también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, tal como un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, ó un fragmento Fv genéticamente diseñado (Ladner y colaboradores, patente de los Estados Unidos 4,946,788) . El término "célula", como se utiliza en la presente, también se refiere a células individuales, líneas celulares, o cultivos derivados a partir de estas células. El término "línea celular", como se utiliza en la presente, se refiere a células germinales embriónicas humanas, o a células derivadas de las mismas, tales como se mantienen un cultivo in vitro . "Medio de cultivo germinal embriónico" o "medio de crecimiento germinal embriónico", significa un medio adecuado capaz de soportar el crecimiento de las células germinales embriónicas humanas. Los ejemplos de los medios de cultivo adecuados útiles en la práctica de la presente invención son una variedad de medios de crecimiento de células germinales embriónicas humanas, preparados con una base de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal de becerro al 15 por ciento, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, o glucosa y fosfato exento de medio fluido tubal humano (HTF) modificado complementado con suero fetal de becerro al 15 por ciento, glutamina 0.2 mM, taurina 0.5 mM, y 0.01 mM de cada uno de los siguientes aminoácidos: asparagina, glicina, ácido glutámico, cisteína, lisina, prslina, serina histidina, y ácido aspártico (McKiernan y colaboradores, Molecular Reproduction and Development 42:188-199, 1995). Normalmente, el medio de células germinales embriónicas también contiene antibióticos de cultivo de tejido comúnmente utilizados, tales como penicilina y estreptomicina. Luego se agregan una cantidad efectiva de factores diariamente a cualquiera de estas soluciones base para preparar el medio de crecimiento de células germinales embriónicas humanas de la presente invención. El término "cantidad efectiva", como se utiliza en la presente, es la cantidad del factor descrito que permite un efecto benéfico sobre el crecimiento de células germinales embriónicas humanas, y la viabilidad de células germinales embriónicas humanas utilizando el juicio común para los expertos en la materia del cultivo celular, y por las enseñanzas suministradas en la presente.

"Medio condicionado" se refiere a un medio de crecimiento que es complementado adicíonalmente por factores derivados a partir de medios obtenidos de cultivos de células alimentado-ras, sobre las que se pueden cultivar células germinales embriónicas humanas . "Detectablemente marcado" se refiere a cualquier medio para marcar e identificar la presencia de una célula o parte de la misma, es decir, una sonda o cebador de oligonucleótido, un anticuerpo o fragmenta del mismo, una proteína o fragmento del mismo, un gen o fragmento del mismo, o una molécula de ADNc. Los métodos para marcar detectablemente las células o moléculas son bien conocidos en este- campo, e incluyen, sin limitación, marcado radioactivo (por ejemplo, con un isótopo, tal como 32P ó 35S), y marcado no radioactivo (por ejemplo, marcado quimioluminiscente, marcado fluorescente, productos de reacción enzimáticos codificados por genes, es decir, CAT) . "Células germinales embriónicas" o "células EG", son células derivadas a partir de las células germinales primordiales (PGCs) . El término "célula germinal embriónica" se utiliza para describir las células de la presente invención que exhiben un fenotipo celular pluripotente embriónico. Los términos "célula germinal (EG) embriónica humana" o "célula germinal embriónica" se pueden utilizar de una manera intercambiable en la presente para describir células humanas, o líneas celulares de las mismas, de la presente invención, que exhiben un fenotipo de células primordiales embriónicas pluripotentes, como se define más adelante en la presente. Por consiguiente, las células germinales embriónicas son capaces de diferenciarse en células de las capas germinales ectodérmica, endodérmica, y mesodérmica. Las células germinales embriónicas también se pueden caracterizar por la presencia o la ausencia de marcadores asociados con los sitios de epítopo específicos identificados por el enlace de anticuerpos particulares, y la ausencia de ciertos marcadores, identificada por la falta de enlace de ciertos anticuerpos . "Epítopo" significa cualquier determinante antigénico sobre un antígeno al .que se fija el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. "Factor de crecimiento", como se utiliza para los propósitos de describir la presente invención, se refiere a una sustancia que es efectiva para promover el crecimiento de las células germinales embriónicas humanas, que de otra manera no es un componente del medio de crecimiento. Estas sustancias incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, quimioquinas , moléculas pequeñas, anticuerpos neutralizantes, y proteínas. Los factores de crecimiento también incluyen polipéptidos de señalización intercelular que controlan tanto el desarrollo como el mantenimiento de las células, y la forma y función de los tejidos . "Aminoácidos no esenciales" se refiere a los aminoácidos L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-ácido glutámico, glicina, L-prolina, y L-serina. El término "células germinales primordiales" (PGCs) se utiliza para describir las células germinales embriónicas no diferenciadas aisladas durante un período de tiempo después de la fertilización a partir del anlagén o a partir el saco de yema, los mesenterios, o los rebordes gonadales de embriones/fetos humanos. Las células germinales primordiales son la fuente a partir de la cual se derivan las células germinales embriónicas . Los gonocitos de las etapas testiculares posteriores también pueden ser fuentes útiles de células germinales primordiales . "Pluripotente" se refiere a las células que retienen el potencial de desarrollo para diferenciarse en un amplio rango de linajes celulares, incluyendo la línea germinal. Los términos "fenotipo de célula primordial embriónica" y "célula de tipo primordial embriónica", también se utilizan de una manera intercambiable en la presente, para describir células que no están diferenciadas, y por lo tanto, son células pluripotentes, y que son capaces de distinguirse visualmente de otras células adultas del mismo animal. El término "célula STO" se refiere a las células de ratón de fibroblasto embriónico, tales como están comercialmente disponibles, e incluyen aquellas depositadas como ATCC CRL 1503. "Trasplantes" incluyen células (o partes de las mismas), productos celulares, tejido, o productos de cultivo celular derivados a partir de células germinales embriónicas, que se injertan en un anfitrión humano. Específicamente, un trasplante se produce mediante la manipulación de las células germinales embriónicas, que exhiben un fenotipo de células germinales embriónicas pluripotentes, in vi tro, para producir células primordiales derivadas de germinales embriónicas del linaje de desarrollo restringido. El término "linaje de desarrollo restringido" significa que el destino en perspectiva de las células primordiales derivadas a partir de las células germinales embriónicas está reducido a un número más pequeño de posibles histotipos después de la inducción de la diferenciación. Los métodos para inducir la diferenciación in vi tro de las células germinales embriónicas, incluyen utilizar ácido retinoico, o la remoción de las capas alimentadoras de células o del medio condicionado, como se describe en la presente, las células primordiales resultantes del linaje de desarrollo restringido se pueden manipular adicionalmente para incluir material genético exógeno, tal como un transgen. En el entendido de que la célula que exprese un fenotipo germinal embriónico sea genéticamente manipulada para incluir material exógeno, el trasplante resultante puede incluir material exógeno dentro de algunas de, pero no todas, sus células. Las líneas celulares de trasplante resultan-tes del linaje de desarrollo restringido se pueden mantener o manipular adicionalmente como líneas celulares puras mediante técnicas comunes para los expertos en la materia. "Transgen" significa cualquier pieza de ADN insertada artificialmente en una célula, que llegue a ser parte del genoma de la célula, línea celular, tejido, u organismo (es decir, establemente integrado o como un elemento extracromosomal estable) que se desarrolle a partir de esa célula. Este transgen puede incluir un gen que sea parcialmente o enteramente heterólogo (es decir, extraño) para la célula u organismo en el que se introduzca el gen heterólogo, o puede representar un gen homólogo para un gen endógeno del organismo. Dentro de esta definición se incluye un transgen creado mediante la provisión de una secuencia de ARN que se transcriba al ADN, y luego se incorpore en el genoma . El término "transgénico" incluye cualquier tecnología transgénica familiar para los expertos en este campo, que pueda producir un organismo, célula, cultivo celular, línea celular, tejido, o embrión, que lleve un transgén introducido, o uno en donde un gen endógeno se haya hecho no funcional o se haya "derribado". Un "transgénico" es un animal o cualquier parte del mismo, incluyendo, pero no restringiéndose a, células, cultivos, o tejidos que incluyan material genético exógeno adentro de sus células. Las células de la invención pueden tener ADN agregado a ellas, y estas células se pueden utilizar entonces de una manera similar a aquella para crear un organismo quimérico. El término "gen derribado", como se utiliza en la presente, se refiere a la alteración dirigida de un gen con pérdida parcial o completa de la función, lograda mediante cualquier tecnología transgénica familiar para los expertos en este campo. Por ejemplo, las células transgénicas que tienen genes derribados son aquellas en donde el gen objetivo se ha hecho no funcional mediante una inserción dirigida al gen para hacerlo no funcional, mediante recombinación homologa. "Transfectado" significa una célula en la cual (o en un ancestro de la cual) s-e ha introducido, por medio de cualesquiera técnicas de ácido nucleico recombinantes conocidas por los expertos en este campo, una molécula de ácido nucleico heterólogo. "Acido nucleico heterólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se origina a partir de otra especie, o se modifica ya sea desde su forma original, o desde la forma primariamente expresada en una célula. Células Germinales Embriónicas y Métodos de Cultivo En una modalidad, la invención proporciona células germinales embriónicas humanas, y un método para producir estas células. Un material de partida para aislar las células puede ser el de las células germinales primordiales (PGCs) aisladas durante un período de aproximadamente 9 semanas a aproximadamente 11 semanas desde el último período menstrual (LMP) (3-13 semanas después de la fertilización) , a partir del saco de yema embrióni-co, mesenterios, anlagén gonadal, o reborde genitales de embriones/fetos humanos. De una manera alternativa, los gonocitos de las etapas testiculares posteriores también pueden proporcionar células germinales primordiales. En una modalidad, las células germinales primordiales se cultivan sobre células de fibroblasto mitóticamente inactivadas (por ejemplo, células STO) bajo condiciones efectivas para derivar células germinales embriónicas. Las células germinales embriónicas humanas resultantes se parecen a las células primordiales embriónicas o germinales embriónicas de murino en su morfología y en el histotipo bioquímico. Las células germinales embriónicas humanas resultantes se pueden pasar y mantener durante cuando menos varios meses en cultivo. En el cultivo de las células germinales embriónicas de la invención, se cree que el uso de células alimentadoras, o de una matriz extracelular derivada a partir de células alimentado-ras, proporciona una s" más sustancias necesarias para promover el crecimiento de las células germinales embriónicas, y/o previene o inhibe la velocidad de diferenciación de estas células . Se cree que estas sustancias incluyen productos celulares fijados a membrana y/o solubles que son secretados hacia el medio circundante por las células. Por ejemplo, las células germinales embriónicas se pueden cultivar sobre un sustrato seleccionado a partir del grupo que consiste en células de fibroblasto de embrión de ratón, células STO, fibroblastos humanos, o células de epitelio humano. Por consiguiente, aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que se pueden utilizar líneas celulares adicionales con el medio de cultivo celular para un efecto equivalente, y que estas líneas celulares adicionales se pueden identificar utilizando métodos y materiales convencionales. En adición, los expertos en la materia también reconocerán que se pueden identificar una o más sustancias producidas por las células alimentadoras, o contenidas en la matriz extracelular, y se pueden agregar al medio de cultivo celular de la invención, para obviar la necesidad de estas células alimentadoras y/o de esta matriz extracelular. Utilizando los métodos y materiales descritos en la presente, se han derivado y cultivado dos cultivos de células germinales embriónicas (EG) pluripotenciales humanas, designados como hEG-KH y hEG-GU. Los cultivos celulares hEG-KH y hEG-GU se derivaron a partir del anlagén gonadal y los rebordes genitales de un material fetal humano abortado en el último período menstrual (LMP) de aproximadamente 8 y 11 semanas, respectivamente. Las células germinales embriónicas son pluripotentes y se caracterizan por la presencia de marcadores asociados con los sitios epitópicos específicos que se pueden identificar por el enlace de anticuerpos particulares, y la ausencia de ciertos marcadores que se pueden identificar por la falta de enlace de ciertos anticuerpos . Las células germinales embriónicas también expresan los antígenos de superficie celular SSEA-1 y SSEA-4, y expresan los antígenos de superficie celular que se enlazan a los anticuerpos que tienen la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales TRA-1-60 (ATCC HB-4783) y TRA-1-81 (ATCC HB-4784). Las células germinales embriónicas de la invención también pueden expresar el antígeno de superficie celular SSEA-3. En adición, las células germinales embriónicas se tiñen positivamente para la actividad de fosfatasa alcalina (AP) . Medio de Cultivo Celular La invención utiliza un medio de cultivo celular, factores de crecimiento, y métodos para hacer crecer y mantener cultivos de células germinales embriónicas . El medio proporciona el crecimiento y mantenimiento de las células germinales embriónicas, y se puede utilizar para rastrear factores de crecimiento adicionales y combinaciones útiles de factores de crecimiento. La capacidad para hacer crecer células germinales embriónicas en un estado sustancialmente no diferenciado utilizando el medio de cultivo celular, los factores de crecimiento, y los métodos proporcionados en la presente, proporciona importantes beneficios, incluyendo la capacidad para producir líneas de células germinales embriónicas que tengan múltiples modificaciones genéticas, que tengan aplicaciones terapéuticas importantes, como se describe más adelante. El medio de cultivo celular puede incluir un medio de crecimiento que sea efectivo para soportar el crecimiento de las células germinales embriónicas; un suero nutriente efectivo para soportar el crecimiento de las células germinales embriónicas; aminoácidos no esenciales y esenciales, y una sal de piruvato. Opcionalmente, el medio de cultivo celular también puede incluir un agente reductor. El medio de crecimiento puede incluir cualquier suero o solución basada en suero que suministre nutrientes efectivos para mantener el crecimiento y la viabilidad de las células germinales embriónicas . Los ejemplos de este suero incluyen, sin limitación, suero fetal bovino (FBS) , y suero fetal de becerro (FCS) . Por ejemplo, el suero fetal bovino se puede proporcionar en una concentración de entre aproximadamente el 1 por ciento y aproximadamente el 25 por ciento. En particular, el suero fetal bovino se puede proporcionar en una concentración de entre aproximadamente el 2.5 por ciento y aproximadamente el 20 por ciento. En una modalidad, las células germinales embriónicas se cultivan en suero fetal bovino al 15 por ciento. Las células germinales embriónicas pueden depender de algunos factores de crecimiento para su mantenimiento en el estado cultivado. En una modalidad, el factor de crecimiento es factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) . En otra modalidad, se incluye un ligando que se fije a un receptor sobre la célula germinal embriónica, que pueda asociarse con la glicoproteína 130 (gpl30) en el medio de cultivo. En una modalidad más particular, el ligando es una oncostatina-M o factor inhibidor de leucemia (LIF) . En adición, se puede utilizar un anticuerpo que se fije a, y active, la glicoproteína 130 directamente . También se puede proporcionar un factor de crecimiento para asistir en la derivación y el mantenimiento de cultivos de células germinales embriónicas en un estado sustancialmente no diferenciado. Las identidades y las concentraciones efectivas de estos factores de crecimiento se pueden determinar utilizando los métodos descritos en la presente, o utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica del cultivo de células. Por ejemplo, se pueden utilizar uno o más de los siguientes factores en la concentración final mencionada: forscolina ([3R-(3a, 4oíß, 5B, 6B, 6aa, lOa, lOaß, lOba) ] -5- (acetiloxi) -3-etenildodecahidro-6, 10, 10b-trihidroxi-3, 4a, 7, 7, lOa-pentametil-lH-nafto [2, 1-b] piran-1-ona) a 10 µM, toxina de cólera a 10 µM, isobutilmetil-xantina (IBMX) a 0.1 mM, monofosfato cíclico de dibutiladenosina (dbcAMP) a 1 mM. En otra modalidad, el factor de crecimiento es factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , más específicamente factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF) , en el rango de aproximadamente 1 a 10 nanogramos/mililitro . Las células "germinales embriónicas se pueden cultivar sobre el plato en adición a las células alimentadoras. De una manera alternativa, las células alimentadoras se pueden hacer crecer primero hasta la confluencia, y luego se inactivan mitóticamente (por ejemplo, mediante irradiación) para impedir un crecimiento adicional. Este planteamiento tiene la ventaja de simplificar el manejo del cultivo celular, debido a que solamente se necesita supervisar el crecimiento de un conjunto de células, las células germinales embriónicas . Otro factor es el medio de crecimiento cosechado de los cultivos de células de carcinoma embriónico (EC) humanas. En un ejemplo particular, se hacen crecer células de carcinoma embriónico humanas NTERA-2 (número de acceso de ATCC CRL 1973) hasta la confluencia en DMEM complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento, o se hacen crecer células primordiales embriónicas de ratón hasta la confluencia en DMEM complementado con suero fetal de becerro al 15 por ciento, glutamina 2 mM, 1000 Unidades /mililitro de factor inhibidor de leucemia. El medio de crecimiento se cosecha diariamente durante varios días, se pasa a través de un filtro de 0.22 mieras, y se congela a -80°C. Este medio "condicionado" de carcinoma embriónico humano o de células primordiales embriónicas de ratón se agrega al medio de crecimiento de células germinales embriónicas en cantidades empíricamente determinadas, como sea juzgado por el efecto sobre el crecimiento y la viabilidad de las células germinales embriónicas . En otra modalidad, el medio de crecimiento incluye ligandos para los receptores que activen la glicoproteína 130 de transducción de señal, ya sea mediante el enlace con un receptor que se asocie con la glicoproteína 130, o mediante el enlace directamente con, y la activación de, la glicoproteína 130. Por ejemplo, se puede utilizar factor inhibidor de leucemia (LIF) recombinante humano en aproximadamente 1000 unidades/mililitro a 2000 unidades/mililitro, y oncostatina-M en 10 unidades/ mililitro. Una vez establecidas, las células germinales embriónicas se pueden cultivar bajo el medio condicionado anteriormente descrito, utilizando una variedad de técnicas. En un ejemplo, un recipiente contiene células alimentadoras en un medio no condicionado. Se prepara una matriz de células alimentadoras usadas utilizando métodos convencionales . Las células germinales embriónicas que se van a cultivar se agregan entonces encima de la matriz, junto con el medio condicionado. De una manera alternativa, las células germinales embriónicas se pueden hacer crecer sobre células alimentadoras vivas, utilizando métodos conocidos en la materia. Luego se supervisa el crecimiento de las células germinales embriónicas para determinar el grado hasta el cual se han llegado a diferenciar las células cultivadas. Se puede utilizar un marcador para fosfatasa alcalina, con el fin de aseverar cuáles células se han diferenciado. Cuando se han diferenciado un número suficiente de células, o cuando ha crecido el cultivo hasta la confluencia, se puede pasar cuando menos una poición de las células no diferenciadas. La determinación para el paso de las células, y las técnicas para realizar este paso, se pueden llevar a cabo utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Uso de Células Germinales Ezríbriónicas para Producir Bibliotecas de ADNc Las células germinales embriónicas de la presente invención son una fuente plena de ARNm de células pluripotentes para crear bibliotecas de ADNc y plantillas para experimentación basada en reacción en la cadena de polimerasa. Por ejemplo, las líneas germinales embriónicas se cultivan en la presencia de fibroblastos STO de ratón irradiados como se describe anteriormente. Se toman pasos para eliminar las células STO y el ADNc de STO. En una modalidad, las células STO se remueven como sigue. Se tripsinizan aproximadamente 106 células germinales embriónicas creciendo sobre fibroblastos de STO irradiados, y se vuelven a suspender en un medio de células germinales embriónicas. Las células resuspendidas se recubren sobre un plato de cultivo de tejido, y se dejan asentar durante aproximadamente 1 hora. Durante este tiempo, los fibroblastos de STO se adhieren, mientras que las células germinales embriónicas no. Las células no unidas se remueven suavemente, y se repite dos veces el procedimiento de recubrimiento. Esta serie de enlaces preferenciales remueve efectivamente del 50 al 90 por ciento de las células STO. Las células germinales embriónicas restantes se centrifugan a 1,000 rpm durante 5 minutos, y el granulo se utiliza para generar ARN, ARNm, y luego ADNc. El ADNc se somete a varias rondas de sustracción utilizando ARN de células STO, mediante una metodología comúnmente descrita (Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, edición actual, incorporado a la presente como referencia en su totalidad) . Esto remueve las STO y los ADNcs de fibroblasto. El ADNc restante se enriquece para los ADNcs humanos únicos para las células pluripotentes . Se pueden emplear muchos rastreos de biblioteca de ADNc sobre esta biblioteca de ADNc, así como otras sustracciones de ADN comúnmente conocidas por los expertos en la materia (Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, edición actual, incorporado a la presente como referencia en su totalidad) . Producción de Célulae Dif renciadas Humanas Inmortalizadas Mediante Transfección de Telomerasa Todas las células vivas somáticas normales exhiben el límite de Hayflick - un número finito de réplicas después de las cuales las células entran a una fase senescente en que no se dividen. El límite de Hayflick resulta del acortamiento progresivo de los tramos del telómero (puntas de cromosomas) con cada división de réplica. Se ha demostrado que la enzima telomerasa restaura la longitud de los telómeros, cuando se transfectan en células que se dividen normalmente, y extiende su lapso de vida de réplica indefinidamente sin ocasionar una transformación maligna (Bodnar y colaboradores, Science, 279:349-352, 1998) . Esta tecnología hace posible inmortalizar virtualmente cualquier célula en el cuerpo sin alterar su fisiología normal. Aunque las células germinales embriónicas humanas expresan la actividad de telomerasa, puede ser deseable mejorar esta expresión mediante la transfección de las células germinales embriónicas con telomerasa. De una manera alternativa, puede ser deseable producir células derivadas a partir de células germinales embriónicas que también exhiban actividad de telomerasa, y de una manera más particular, la actividad de telomerasa que se pueda inducir o suprimir bajo condiciones controladas. Por consiguiente, la presente invención incluye células germinales embriónicas transfectadas con telomerasa, así como células derivadas a partir de estas células germinales embriónicas transfectadas. La presente invención incluye además células germinales embriónicas transfectadas con telomerasa que es inducible o suprimible. Células Germinales Embriónicas que tienen Múltiples Modificaciones Genéticas En un aspecto, los métodos y los medios de cultivo de la presente invención se utilizan para producir células germinales embriónicas que tienen múltiples modificaciones genéticas. La múltiple alteración genética de las células es deseable por muchas razones, tales como proporcionar células modificadas para terapia genética y tejidos de reemplazo para injertos o implantes (por ejemplo, para evitar el rechazo de las células por parte del anfitrión) . Esta aplicación se puede utilizar para modelar o tratar desórdenes genéticos contiguos, aneuploidía, u otro fenómeno cromosomal a gran escala. En otra modalidad y uso de la invención, se hacen múltiples cambios al genoma de células germinales embriónicas utilizando las técnicas anteriormente mencionadas . Se pueden utilizar eventos transgénicos en serie utilizando diferentes genes de selección de fármacos en cada construcción, seguidos por una selección de fármaco apropiada de las células, para realizar esto. La manipulación genética a gran escala del genoma de células germinales embriónicas es otro uso de la invención. Las regiones cromosomales grandes (3-4cM) se pueden suprimir, invertir, translocalizar, y duplicar, utilizando ingeniería de cromosomas mediada por cre/LoxP (Ra irez-Solis y colaboradores, Na ture, 378:720-724, 1995) . Se utilizan técnicas de recombinación homologa o de transgénesis de inserción aleatoria para integrar en serie pequeños elementos genéticos denominados sitios loxP en un genoma de célula germinal embriónica. Luego las células se tratan con proteína ere administrada mediante lipofección o transfección transitoria. Entonces las células germinales embriónicas se pueden "mantener en un estado no diferencia, o se les puede permitir diferenciarse como se describe más adelante. La expresión específica del tejido y del desarrollo de ere se puede llevar a cabo utilizando esta técnica. Se introducen construcciones genéticas en las células germinales embriónicas mediante electroincorporación, fosfato de calcio, microinyecciórt, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otros medios. Por diseño, las construcciones no se integran en el genoma de células germinales embriónicas, ni se propagan establemente como, un episoma. Estas construcciones tienen un efecto transitorio sobre las células germinales embriónicas. De una manera alternativa, se permite que las construcciones se incorporen establemente en el genoma de células germinales embriónicas . Por ejemplo, las células germinales embriónicas se hacen crecer utilizando el medio de cultivo y los métodos descritos en la presente. Un primer gen de cuando menos una de las células del cultivo celular, se modifica, y a partir del cultivo resultante, se deriva una primera población de clones de las células germinales embriónicas modificadas. La primera población de clones se hace crecer en el medio de cultivo de la invención, y se modifica un segundo gen en cuando menos una célula de la primera población de clones, para producir una segunda población de clones que tenga los primero y segundo genes modificados . Los métodos utilizados para realizar las modificaciones genéticas a las células, pueden ser cualquiera de aquellos conocidos en la técnica de biología molecular para hacer alternaciones genéticas. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de vectores selectores positivos-negativos, como se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,464,764; 5,487,992; 5,627,059; y 5,631,153 a Capecchi y colaboradores; y en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/781,559. En adición, se pueden emplear cromosomas artificiales de levadura (YACs) para realizar modificaciones genéticas j co o se describen en las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 08/597,532; 08/397,547; 08/187,161; 08/276,565; 08/375,482; 08/485,505; y 08/372,482. Además, se pueden utilizar construcciones de ADN isogénicas con las células germinales embriónicas cultivadas utilizando los métodos y materiales proporcionados por la presente invención, como se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/563,138. Todavía otros métodos incluyen aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos 5,591,625 a Gerson y colaboradores, para la preparación de células primordiales capaces de tener una mayor expresión de ciertos productos genéticos, moléculas de transducción de señales, proteínas de superficie celular, y similares, para aplicaciones terapéuticas. Estas patentes y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos . Se puede incorporar un gen reportero en el ADN de una célula germinal embriónica que se acople funcionalmente con una copia de un gen asociado con un estado de enfermedad particular (por ejemplo, BRCA-1 en el caso de cáncer del pecho) . En un ejemplo, el reportero es sensible tanto a los eventos de transcripción como posteriores a la transcripción. Se permite que las células germinales embriónicas se diferencien, de tal manera que la progenie diferenciada cada una contenga una copia de la construcción del gen/reportero de la enfermedad. De una manera alternativa, una manipulación genética puede ser la incorporación de actividad de telomerasa, como se describe anteriormente. Rastreos para Factores de Medio de Cultivo En otra modalidad y uso de la invención, se utilizan células germinales embriónicas para optimizar las condiciones de crecimiento y cultivo in vi tro para células germinales embriónicas no diferenciadas, y su diferenciación y derivados diferenciados. Se pueden establecer rastreos de alta producción para evaluar los efectos de los componentes del medio, los factores de crecimiento exógenos, y los sustratos de unión. Estos sustratos incluyen las capas alimentadoras de células viables, extractos de células, componentes de matriz extracelular definidos, sustratos que promuevan el crecimiento tridimensional, tales como metilcelulosa y colágeno, moléculas de unión de células novedosas, y/o matrices con factores de crecimiento y otras moléculas de señalización empotradas adentro de ellas. Este último planteamiento puede proporcionar la organización espacial requerida para la réplica de la compleja arquitectura de órganos (para una revisión, ver Saltzman y colaboradores, Na ture Medicine, 4:272-273, 1998) . Se pueden medir una variedad de componentes para cuantificar los efectos del tratamiento experimental. Estos incluyen la actividad de fosfatasa alcalina de las células germinales embriónicas no diferenciadas, sustancias producidas por la diferenciación o derivados diferenciados, o moléculas reporteras . Las células germinales embriónicas y sus derivados se adaptan gradualmente a las condiciones de crecimiento convenientes o experimentalmente esenciales, tales como un requerimiento reducido de factor inhibidor de leucemia y las capas alimentado-ras. Esto permite probar las enzimas de disociación que permiten un paso eficiente, pero no destruyen las moléculas de superficie celular esenciales. En otro aspecto, la presente invención proporciona rastreos para determinar factores de crecimiento que promuevan o inhiban la diferenciación de células germinales embriónicas en cultivo. La presencia de la mayor actividad de fosfatasa alcalina indica que la sustancia que se está probando es un factor de crecimiento. El nivel de expresión de fosfatasa alcalina se puede determinar para cada grupo de células expuestas a un factor de crecimiento supuesto particular, utilizando los métodos descritos en la presente, y se puede correlacionar con la mayor expresión de fosfatasa alcalina en relación con células de control no expuestas a un factor de crecimiento supuesto. En una modalidad, las sustancias que se encuentre que producen un incremento de la expresión de fosfatasa alcalina mayor de aproximadamente el 20 por ciento, comparándose con el control, se consideran factores de crecimiento. Las sustancias identificadas como el rastreo de factores de crecimiento, se pueden probar en un rastreo secundario para determinar la presencia o ausencia de una correlación entre la exposición de las células a la sustancia, y un incremento paralelo en la expresión de marcadores superficiales asociados con la falta de diferenciación, tales como SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 (ATCC HB-4783), y TRA-1-81 (ATCC HB-4784), y/o la expresión de telomerasa. Las células se cultivan como se describe en la presente. Luego las células se exponen a un anticuerpo reproducido contra uno o más de los marcadores superficiales que se estén rastreando, y/o se determina la presencia o ausencia de la expresión de telomerasa en las células expuestas. En algunas modalidades, se incuban anticuerpos marcadores superficiales con un segundo anticuerpo acoplado con un reportero, tal como una marca fluorescente, dental manera que las células que expresen el marcador antigénico apropiado, se hagan fluorescentes. Luego se pueden seleccionar y contar las células marcadas utilizando métodos convencionales, por ejemplo un seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS) . Luego se pueden comparar los números de células marcadas y no marcadas para determinar el efecto del factor de crecimiento supuesto. De una manera alternativa, en seguida de la exposición a anticuerpos marcadores de superficie celular no marcados, las células se pueden exponer a un segundo anticuerpo que sea específico para el anticuerpo marcador de superficie celular en un formato ELISA (Ensayo Inmunosorbente Enlazado con Enzima) , de donde se puede cuantificar el número de- células que expresen el antígeno superficial deseado de una manera colorimétrica, o mediante la medición de fluorescencia. Todavía otros métodos para cuantificar las células que expresen antígenos superficiales serán familiares para aquellos que tengan experiencia en la técnica de cultivos celulares . Las sustancias confirmadas como factores de crecimiento también se pueden probar en combinación (por ejemplo, combinaciones de dos o tres sustancias), para determinar la presencia de cualesquiera propiedades sinérgicas entre los factores de crecimiento. En adición, se pueden identificar sustancias que puedan promover la diferenciación o retardar el crecimiento de células no diferenciadas. Por ejemplo, se pueden agregar anticuerpos dirigidos a las sustancias en el medio de crecimiento para impedir que estas sustancias interactúen con las células que se estén cultivando. Derivados de Células Germinales Embriónicas Humanas La metodología y las células de la presente invención tienen una variedad de usos diferentes . Las células se pueden utilizar para estudiar el desarrollo embriológico humano. Por ejemplo, las células de la invención que inhiben el fenotipo de células germinales embriónicas, se pueden manipular con marcadores detectablemente marcados. Luego las células marcadas se pueden insertar en blastocistos para observar la distribución y los linajes celulares durante el desarrollo del embrión. Algunas ventajas adicionales de utilizar las células de la invención que exhiben un fenotipo de células germinales embriónicas pluripotente, son como sigue: se introduce un transgen de interés en una célula germinal embriónica o una línea de células germinales embriónicas de la presente invención mediante electroincorporación, fosfato de calcio, microinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otro medio, y se caracteriza su integración y expresión in vi tro . Luego se estudia el efecto del gen introducido sobre la célula germinal embriónica transformada in vi tro . Entonces se puede manipular el sitio en el genoma de las células germinales embriónicas en donde se integre el gen introducido, para la dirección genética y el reemplazo del gen (Thomas y Capecci, Cell 51:503-512, 1987) . Las células germinales embriónicas de la invención pueden permitir los mismos tipos de manipulación experimental poderosa actualmente disponibles con células primordiales embriónicas y germinales embriónicas de ratón. En un aspecto de la invención, se hacen modificaciones genéticas estables al genoma de células germinales embriónicas. Un ejemplo de este reemplazo genético y reparación a través de recombinación homologa (Thomas y Capecci, Cell 51:503-512, 1987, Capecchi, Science, 244:1288-1292, 1989; Doetschman y colaboradores, Na ture, 330:576-578, 1987). Las construcciones de ADN que consisten en ADN humano flanqueando la región que se va a reemplazar, reparar, aumentar, o a alterar de cualquier otra manera, junto con el ADN que contiene la región alterada, y el ADN que codifica para casetes de expresión de selección de fármacos positivos y negativos, se transfieren a células germinales embriónicas. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante electroincorporación, fosfato de calcio, mícroinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o. microbiano, u otro medio. Las células en donde las construcciones de ADN han sufrido recombinación homologa, se aislan y se detectan utilizando técnicas convencionales de mancha Southern genómica y reacción en la cadena de polimerasa . La modificación genética estable del genoma de células germinales embriónicas, mediante la adición de ADN homólogo o heterólogo, es otro aspecto de la invención. Las construcciones de ADN que contienen genes humanos normales o modificados, o regiones cromosomales, o combinaciones de genes humanos, otros genes animales, y genes totalmente artificiales, junto con los elementos genéticos que permitan la propagación en una célula anfitriona bacteriana, de levadura, o animal adecuada, se transfieren a las células germinales embriónicas. Esto se hace mediante electroincorporación, fosfato de calcio, microinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otro medio. Las células en las que se han integrado las construcciones de ADN en el genoma de células germinales embriónicas, o que se mantienen establemente como un episoma, se detectan utilizando técnicas convencionales, tales como mancha Southern y reacción en la cadena de polimerasa (PCR) . La inserción mediada por el cromosoma artificial de levadura (YAC) de una porción del cromosoma humano 21 en células primordiales embriónicas de ratón, es un ejemplo de la inserción de una región cromosomal grande en un genoma (Lamb y colaboradores, Na ture Genetics, 5:22-30, 1993) . Otros vectores que se pueden utilizar para agregar ADN homólogo o heterólogo a un genoma, son cromosomas artificiales bacterianos (BAC) , cromosomas artificiales derivados de Pl (PAC) , cósmidos, bacteriófagos o plásmidos, y vectores retrovirales (Helgason y colaboradores, Blood, 87:2740,2749, 1996) . Para la adición a gran escala de ADN a un gensma, se pueden introducir cromosomas artificiales humanos (HACs) construidos de ADN de satélite alfa, ADN telomérico, y ADN genómico (Harrington y colaboradores, Na ture Genetics, 15:345-255, 1997) en las células germinales embriónicas. En otra modalidad y uso de la invención, las células germinales embriónicas humanas se manipulan genéticamente con construcciones comprendidas de moléculas reporteras, tales como ß-galactosidasa, luciferasa, o acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) . Estas construcciones pueden incluir promotores específicos del tejido o del desarrollo, de modo que se puedan estudiar los aspectos de la diferenciación. La integración aleatoria de construcciones reporteras sin promotor o mejorador en el genoma de células germinales embriónicas, seguida por la diferenciación, puede permitir el descubrimiento de nuevos promotores y mejorado-res de genes humanos. Las construcciones reporteras con promotores específicos del tejido o del desarrollo, o constitutivos, se pueden utilizar para rastrear la integración y la sobrevivencia de células germinales embriónicas implantadas, o derivados diferenciados o diferenciadores . Diferenciación Controlada de Células Germinales Embriónicas Humanas Las células germinales embriónicas pueden diferenciarse in vi tro en una amplia variedad de tipos de células, incluyendo los tipos de células embriónicas y más altamente diferenciadas. Por ejemplo, para inducir la diferenciación en cultivos de una sola capa, las células germinales embriónicas se cultivan durante dos semanas sin pasarse sobre una capa alimentadora fresca. Para inducir la diferenciación en el cultivo en suspensión, las células se pasan sobre una placa gelatinizada para eliminar una posible contaminación por fibroblastos. Después de 4 a 7 días en cultivo, las colonias se desalojan suavemente de la placa, y se desagregan después de la incubación en tripsina-EDTA al 0.25 por ciento durante 10 a 15 minutos. Las células disociadas se cultivan en una microgota de medio de cultivo de células germinales embriónicas conteniendo ácido retinoico 0.3 µM sobre un plato de Petri no adhesivo de 35 milímetros. Los cultivos en suspensión se monitorean diariamente para determinar la formación del cuerpo embrioide, que indica un fenotipo diferenciado. (Los experimentos similares que prueban la diferenciación de células germinales embriónicas unidas son bien conocidos por los expertos en la técnica) . El medio de cultivo celular se cambia cada tercer día . Las células germinales embriónicas de la invención se pueden diferenciar en iferentes tipos de células más diferenciadas, algunas de las cuales se enlistan más adelante. Un método ampliamente aplicable para obtener poblaciones puras de tipos de células específicos durante la diferenciación de células germinales embriónicas implica el uso de un promotor específico del tipo de célula que impulse un gen marcador seleccionable (por ejemplo, uno que proporcione resistencia a un fármaco de otra manera tóxico) . Bajo las condiciones de diferenciación apropiadas, en la presencia del fármaco, solamente sobreviven aquellas células que puedan activar el marcador seleccionable (aquellas que sufran la diferenciación deseada) . Células Neuroepiteliales En otro ejemplo, se generan células neuroepiteliales, y se utilizan para aumentar y reemplazar las células dañadas por enfermedad, desórdenes autoinmunes, daño accidental, o desorden genético. Se pueden inducir las células primordiales embriónicas de ratón para diferenciarse in vitro con ácido retinoico, con el fin de formar precursores neuronales y gliales, marcadores positivos para astrocitos (GFAP) u oligodendrocitos (04), y luego posteriormente hasta neuronas funcionales (Fraichard y colaboradores, J. Cell Science 108:3161-3188, 1995). Las células trasplantadas en cerebros adultos se observaron innervando el estriato del anfitrión- (Deacon y colaboradores, Exp . Neurology, 149:28-41, 1998). Las líneas celulares de carcinoma embriónico humanas y de ratón también pueden diferenciarse en neuronas. (Troj ano ski y colaboradores, Exp . Neurology, 144:92-97, 1997; Wojcik y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 90:1305-1309, 1993) . El trasplante de estas neuronas en ratas sometidas a isquemia cerebral promovió un grado de recuperación funcional (Borlongan y colaboradores, Exp . Neurology, 149:310-321, 1998). Se ha demostrado que la expresión del antígeno SV40 T (Tag) permite la proliferación de las células precursoras, y que a diferenciación normal puede reasumirse después de la represión del Tag (Lei y colaboradores, Mol . Endocrinol . 6:7'03-712 , 1992; Lew y colaboradores, Genes Dev. 7:683-693, 1993; Alarid y colaboradores, Dev. 122:3319-3329, 1996). El uso de sistemas de expresión inducibles (por ejemplo, el sistema promotor inducible por tetraciclina) , o de la supresión específica de la construcción de sobreexpresión a través de un evento de recombinación Cre/lox, permitiría reasumir la secuencia de diferenciación normal después de una expansión apropiada de los precursores neuroepiteliales . La presente invención proporciona la modificación y/o diferenciación de células germinales embriónicas para la producción de células primordiales neuronales, utilizando las técnicas de modificación genética y las estrategias descritas anteriormente. Se pueden utilizar dos estrategias traslapadas para obtener poblaciones expandidas de células precursoras neuroepiteliales: (1) el uso de condiciones de cultivo efectivas para inducir la formación de células precursoras neuroepiteliales a partir de células germinales embriónicas, y (2) planteamientos genéticos para incrementar el rendimiento de los precursores neuroepiteliales . En una modalidad, la presente invención proporciona métodos y materiales para producir células primordiales neuroepiteliales a partir de células germinales embriónicas. Se permite que los cuerpos embrioides se vuelvan a recubrir en un medio complementado con insulina-transferina-selenio-fibronectina (ITSN) , un medio que es efectivo para inducir la diferenciación neuronal en células de carcinoma embrionales (Rizzino y Growley, 1980) . Estas células se cultivan durante 6 a 7 días en el mismo medio, se disocian, y se vuelven a recubrir en un medio que contenga factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) . Al removerse del factor de crecimiento de fibroblastos, se espera gue se formen neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos en el sitio. La capacidad para transfectar células primordiales embriónicas no diferenciadas, también permite tener un planteamiento genético para la derivación y expansión de células precursoras neuroepiteliales. Como se describe anteriormente, el uso de promotores específicos del tipo de célula que impulsen los genes de resistencia a los fármacos, permite la selección de células especializadas durante la diferenciación de células germinales embriónicas. De conformidad con lo anterior, si las células germinales embriónicas no diferenciadas se transfectan establemente con un marcador seleccionable, tal como una construcción de promotor de nestina/neor, el uso de las condiciones de cultivo descritas anteriormente, combinadas con selección de fármacos, puede proporcionar un enriquecimiento significativo para los precursores de células neuroepiteliales. Células Progenitoras Hematopoyéticas Los cultivos de células germinales embriónicas también pueden dar lugar a células progenitoras hematopoyéticas (Rich, Blood, 86:463-472, 1995). Las células hematopoyéticas derivadas de células germinales embriónicas se pueden generar y utilizar para aumentar o reemplazar células dañadas por enfermedad, desorden genético, o como una alternativa al uso de trasplante de médula ósea cuando se indique. Los cuerpos embrioides de las células primordiales embriónicas de ratón forman islas sanguíneas (Doetschman y colaboradores, J. Embryol . Exp . Morph . , 87 : 27-45 , 1985) capaces de generar poblaciones de células mixtas linfoides y mieloides (Chen y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 89:2541-2545, 1992). La derivación in vi tro de células hematopoyéticas a partir de células primordiales embriónicas de ratón, se mejora mediante la adición de factor de células primordiales (SCF), IL-3, IL-6, IL-11, GM, CSF, EPO, M-CSF, G-CSF, LIF, y recapitula el desarrollo hematopoyético E6.5 a 7.5 de ratón (Keller y colaboradores, Mol . Cell Biol . , 13:473-486, 1993; Kennedy y colaboradores, Na ture, 386 ( 6624 ): 488-493, 1997; Biesecker y colaboradores, Exp . Hema tology, 21:774-778, 1993). Las células primordiales embriónicas de murino también pueden generar células primordiales hematopoyéticas (thyl+, SCA-I+, receptor c-kit+, marcador negativo de linaje restringido (B-220, Mac-1, TEN 119, JORO 75, para B-linfocitos, mieloides, eritroi-des, T-linfocitos, respectivamente), cuando se cultivan sobre una línea celular estromal en la presencia de IL-3, IL-6, y el sobrenadante de cultivo de la línea celular estromal de hígado fetal) . La hematopoyesis in vitro también se estimula por la sobreexpresión de HOXB4 (Palacios y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 92:7530-7534, 1995). Utilizando métodos similares, se puede inducir a las células germinales embriónicas humanas para diferenciarse y formar células progenitoras hematopoyéticas . Cardiomiocitos En otro ejemplo, se generan cardiomiocitos derivados de células germinales embriónicas humanas . Se pueden inducir las células primordiales embriónicas (ES) de murino para diferenciarse in vitro con el fin de formar cardiomiocitos (Wobus y colaboradores, Differentiation 48:173-182, 1991; Maltsev y colaboradores, Mech Dev. 44:41-50, 1993; Klug y colaboradores, J. Clin . Invest . , 98 (1) : 216-224 , 1996). Estos cardiomiocitos derivados de células primordiales embriónicas expresan genes específicos cardíacos apropiados, incluyendo miosina sarcomérica, desmina, cadena pesada de miosina, y distrofina. Las células se acoplan eléctricamente, y muestran potenciales de acción típicos de los cardiomiocitos de los nodos auricular, ventricular, y del seno. Estos cardiomiocitos exhiben contracciones espontáneas y rítmicas durante tanto tiempo como 11 meses en cultivo (Klug y colaboradores, J. Clin . Invest . , 98 (1) : 216-224, 1996). Se ha observado la formación espontánea de cardiomiocitos derivados a partir de células primordiales embriónicas de primate in vi tro . Las células germinales embriónicas de la invención se pueden mantener en el estado no diferenciado mediante su cultivo sobre capas alimentadoras de fibroblastos embriónicos primarios como se anteriormente. Utilizando los métodos y materiales descritos en la presente, se pueden determinar las condiciones para inducir una diferenciación sustancialmente específica de las células germinales embriónicas humanas de la invención en cardiomiocitos. En una modalidad, para inducir la diferenciación de cardiomiocitos, las células germinales embriónicas se separan de las capas alimentadoras, y se recubren en suspensión en platos de cultivo bacteriológico en un medio típico de células germinales embriónicas, en ausencia de factor inhibidor de leucemia. Bajo estas condiciones, las células forman estructuras tridimensionales denominadas cuerpos embrioides, y empiezan a demostrar la formación de múltiples tipos de células diferenciadas (Doetschman, supra ) . Después de 3 a 7 días de crecimiento en suspensión, los cuerpos embrioides se vuelven a recubrir sobre platos con cultivo de tejido típico, y se les deja unirse. Las regiones que se contraen de una manera espontánea se identifican fácilmente, y se pueden aislar, disociar, y volver a recubrir. En el sistema murino, estas técnicas dieron- como resultado un rendimiento de cardiomiocitos global del 3 al 4 por ciento (Klug y colaboradores, J. Clin . Invest . , 98 ( 1) : 216-224 , 1996). Debido a que las células germinales embriónicas requieren de capas alimentadoras para su crecimiento, puede ser conveniente permitir primero un sobre-crecimiento extenso de las células germinales embriónicas sobre las capas alimentadoras, formando de esta manera estructuras tridimensionales análogas a los cuerpos embrioides, y luego tripsinizar y volver a recubrir para obtener mayores rendimientos de cardiomiocitos. Los cardiomiocitos derivados de células germinales embriónicas se pueden purificar adicionalmente mediante la utilización de promotores específicos de cardiomiocitos, impulsando un marcador seleccionable, por ejemplo el promotor de la cadena pesada de miosina «-cardíaca (MHC) , fusionado con el gen de fosfotransferasa de aminoglicósido (resistencia a la neomicina) . Las células germinales embriónicas no diferenciadas se pueden transfectar con la construcción o--MHC/neor, se pueden hacer crecer como cuerpos embrioides detallados en la presente, y luego se pueden recubrir sobre platos de cultivo de tejido en la presencia del fármaco G418. Bajo estas condiciones, se pueden aislar poblaciones esencialmente puras de cardiomiocitos (Klug y colaboradores, J. Clin . Invest . , 98 (1 ): 216-224 , 1996) . Dada la capacidad para modificar mediante transfección, y expander las células germinales embriónicas no diferenciadas, se pueden derivar grandes cantidades de cardiomiocitos puros, completamente funcionales. En adición, distintos tipos de cardiomiocitos muestran diferentes patrones de expresión genética (por ejemplo, la cadena ligera de miosina (MLC) 2a se expresa en los cardiomiocitos auriculares pero no ventriculares; MLC-2v tiene el patrón de expresión complementario (Klug y colaboradores, J. Clin . Invest . , 98 (1) : 216-224 , 1996)). El uso de un promotor específico del subtipo que impulse un gen marcador seleccionable, puede permitir el aislamiento de poblaciones puras de cardiomiocitos específicos . Células de Músculo Esquelético En otro ejemplo, se pueden generar células de músculo esquelético. Se puede inducir a las células primordiales embriónicas de murino para diferenciarse en músculo esquelético mediante su cultivo como cuerpos embrioides en la presencia de ácido retinoico 10"8 a 10~7M (Wobus y colaboradores, Roux ' s Arch . Dev. Biol . 204:36-45, 1994) . La aplicación de estas condiciones al cultivo de células germinales embriónicas permite derivar músculo esquelético. De una manera alternativa, utilizando los métodos y materiales descritos en la presente, se pueden formar células germinales embriónicas no diferenciadas, establemente transfectadas, incluyendo una construcción inducible MyoDl . MyoDl es una proteína básica de hélice-ciclo-hélice, que tiene la capacidad para inducir la expresión del gen de músculo en una variedad de tipos de células (Weintraub y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 86:5434-5438, 1989) . Se ha demostrado que la transfección de células primordiales embriónicas de murino con MyoDl, junto con el cultivo como cuerpos embrioides en la presencia de -sulfóxido de dimetilo, da como resultado una formación eficiente de músculo esquelético (Dinsmore y colaboradores, Cell Transplant 5:131-143, 1996). Por consiguiente, la inducción de músculo esquelético por el ácido retinoico, o la formación de células germinales embriónicas humanas, incluyendo una construcción inducible MyoDl, permite el crecimiento de grandes cantidades de miocitos esqueléticos. Estas células también se pueden hacer crecer en un co-cultivo con neuronas derivadas de células germinales embriónicas, para proporcionar las uniones neuromusculares, como se describe más adelante. Redes Neuronales Se han creado redes neuronales derivadas a partir de embriones de ratón disociados, sobre arreglos de microelectrodos . Estas redes pueden mostrar patrones de disparo coordinados y casi periódicos que responden a la presencia de agentes farmacológicos mediante la alteración tanto de la amplitud como de la frecuencia de los patrones de ráfaga (Gopal y Gross, Acta Otolaryngol (Stockh) 116:690-696, 697-704, 1996). Las neuronas derivadas de células primordiales embriónicas de murino forman sinapsis tanto de excitación como de inhibición en cultivo; estas sinapsis se forman espontáneamente después de la diferenciación (Okabe y colaboradores, supra; Finley y colaboradores, J. Neurosci . 16:1056-1065, 1996) . Mientras más alta sea la densidad, más frecuente será la posibilidad de formación de sinapsis. Utilizando los métodos anteriormente descritos para formar neuronas a partir de células germinales embriónicas humanas, las neuronas derivadas de células germinales embriónicas humanas se pueden acoplar con arreglos de microelectrodos utilizando métodos y materiales convencionales. Se espera que las células neuronales derivadas de células germinales embriónicas humanas formen redes neurales en funcionamiento. Estas redes se pueden utilizar para rastrear agentes farmacológicos, el estudio de condiciones genéticas (utilizando, por ejemplo, células germinales embriónicas genéticamente modificadas como se describe anteriormente) , y estados de enfermedad. Uniones Neuromus cula es Las células germinales embriónicas proporcionadas por la presente invención son útiles en el desarrollo de las uniones neuromusculares . La "unión neuro uscular es una interacción especializada entre los nervios y los músculos, que da como resultado una transmisión sináptica eficiente. Esta sinapsis especializada es el objetivo de las toxinas químicas y biológicas, tales como aquellas que ejercen su efecto mediante la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa . Esta enzima normalmente es responsable de la degradación del neurotransmisor acetilcolina, atenuando de este modo el estímulo del músculo por el nervio. Las células de la unión neuromuscular exhiben potenciales de membrana eléctricos mensurables y eventos de despolarización que son extremadamente sensibles a las perturbaciones en sus flaíero-medio ambientes. Utilizando los métodos y materiales proporcionados en la presente, se pueden producir uniones neuromusculares que sean uniformes en un suministro constante sin ningún arrastre sustancial en las características de desempeño o en la sensibilidad. Debido a que son de origen humano, representan la distribución apropiada de los receptores de membrana y los patrones de respuesta biológica característicos de los seres humanos. Esto se puede hacer mediante el co-cultivo de miocitos esqueléticos derivados de células germinales embriónicas y neuronas derivadas de células germinales embriónicas, como se describe anteriormente. Por consiguiente, las células germinales embriónicas de la invención pueden proporcio-nar uniones neuromusculares que se pueden utilizar, entre otras cosas, para detectar toxinas, estudiar enfermedades, y rastrear fármacos . Biosensores y Métodos de Rastreo En otra modalidad de la invención, se pueden utilizar las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, para pruebas toxicológicas, mutagénicas, y/o teratogénicas in vi tro, y para biosensores. Estos pueden reemplazar a diferentes modelos animales, y formar pruebas basadas en seres humanos novedosas, y biosensores extremos del medio ambiente. En otra modalidad o uso de la invención, las células germinales embriónicas, o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar para construir biosensores fisiológicos. Estos dispositivos bio-electrónicos implantados podrían funcionar como monitores en vivo del metabolismo y otras funciones biológicas, o como una interfase entre el ser humano y la computadora . En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula una función de células germinales embriónicas de alguna manera (por ejemplo, modula la diferenciación, la proliferación celular, la producción de factores u otras proteínas, la expresión genética) . El método incluye: a) incubar componentes que comprendan al compuesto y células germinales embriónicas bajo condiciones suficientes para permitir que interactúen los componentes; y b) determinar el efecto del compuesto sobre las células germinales embriónicas antes y después de la incubación en la presencia del compuesto. Los compuestos que afectan a la función de las células germinales embriónicas incluyen péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos, compuestos químicos, y agentes biológicos. La diferenciación, la expresión genética, la permeabilidad de la membrana celular, la proliferación, y similares, se pueden determinar mediante métodos comúnmente utilizados en este campo. El término "modulación" se refiere a la inhibición, aumento, o estímulo de una función de células germinales embriónicas particular. La incubación incluye condiciones que permitan el contacto entre el compuesto de prueba y la célula o células germinales embriónicas. El contacto se puede hacer tanto bajo condiciones in vitro como in vivo . Por ejemplo, puede ser deseable probar un arreglo de compuestos o de pequeñas moléculas sobre una sola o unas cuantas células germinales embriónicas en un "chip" u otro soporte sólido. Por ejemplo, los cardiomiocitos o neuronas sobre chips darían una lectura de la velocidad de contracción o el número de disparos, respectivamente, en respuesta a un compuesto, y para la detección de agentes medioambientales dañinos o cuando menos biológicamente activos . Los arreglos de electrodos neuronales biológicamente compatibles permiten a las células primordiales sufrir una diferenciación adicional sobre el arreglo mismo. Estos arreglos permiten la medición de los cambios en tiempo real en la actividad eléctrica en las neuronas derivadas de células germinales embriónicas en respuesta a la presencia de agentes conocidos o no identificados . La actividad eléctrica de los cardiomiocitos se puede supervisar recubriendo las células sobre un arreglo de microelectrodos extracelulares (Connolly y colaboradores, Biosens . Biores . 5:223-234, 1990). Las células muestran contracciones regulares, y la señal extracelular registrada muestra una relación con los registros del voltaje intracelular (Connolly y colaboradores, supra ) . Este método no invasivo permite la superficie a largo plazo, y es más simple y más robusto que las técnicas de sujeción de parche celular entero típicas . El compuesto de prueba opcionalmente puede ser una biblioteca de combinación para rastrear una pluralidad de compuestos. Los compuestos identificados en el método de la invención adicionalmente se pueden evaluar, detectar, clonar, secuenciar, y similares, ya sea en solución o después de fijarse a un soporte sólido, mediante cualquier método normalmente aplicado a la detección de una secuencia de ADN específica, tal como reacción en la cadena de polimerasa, restricción de oligómero (Saiki y colaboradores, Bio/Technology, 3:1008-1012, 1985) , análisis de sonda de oligonucleótido específico del alelo (ASO) (Conner y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 80:278, 1983), ensayos de ligamiento de oligonucleótidos (OLAs) (Landegren y colaboradores, Science, 241:1077, 1988), y similares. Se han revisado técnicas moleculares para el análisis del ADN (Landegren y colaboradores, Science, 242:229-237, 1988). En otro aspecto, las células cultivadas o modificadas utilizando los materiales y métodos proporcionados por la presente invención se montan a superficies de soporte para rastrear las sustancias bioactivas. En un ejemplo, las células se acoplan con un sustrato, de tal manera que se pueden medir los cambios electrofisiológicos en las células en respuesta a estímulos externos, por ejemplo, para utilizarse como un rastreo de alta producción de sustancias bioactivas. Las células se pueden transfectar con ADN que dirija, exprese, o derribe genes específicos o productos genéticos en la célula. Al proporcionar estas células montadas en chip, junto con los dispositivos de medición, tales como una computadora, se pueden rastrear muchos compuestos de una manera rápida y precisa. El biosensor también se podría acoplar con el dispositivo de medición en arreglos para el rastreo paralelo a gran escala. El biosensor proporcionado por la presente invención también se puede utilizar para rastrear, o advertir de, toxinas del medio ambiente, o la exposición a productos químicos peligrosos. En una modalidad, el biosensor anteriormente descrito se expone a sustancias del medio ambiente (por ejemplo, aire, agua, tierra) , o a muestras derivadas de las mismas, y se monitorea la respuesta del biosensor. Si se detecta un agente peligroso, se puede registrar la respuesta del sistema al agente para la evaluación, se puede aislar una porción de la muestra para un estudio adicional, y se suena una alarma. Potencial de Injerto de Células Primordiales, de las Células Germinales Embriónicas En otro aspecto, se utiliza la determinación de la actividad de telomerasa en derivados diferenciados de una célula germinal embriónica modificada para determinar el potencial de injerto de las células germinales embriónicas cultivadas utilizando los métodos y materiales de la presente invención. Las células germinales embriónicas cultivadas utilizando los métodos y materiales de la invención, se transfectan establemente para expresar los componentes de telomerasa, y se les permite diferenciarse, o de una manera alternativa, se inducen para diferenciarse, con el fin de producir células hijas pluripotentes, tales como células primordiales hematopoyéticas, para utilizarse en trasplante. La inducción de la diferenciación se puede realizar como se describe en la presente, incluyendo la utilización de agentes efectivos para inducir la diferenciación, tales como ácido retinoico. Las células pueden llevar modificaciones genéticas adicionales utilizando los métodos de la presente. Las células identificadas por tener una fuerte expresión de telomerasa, se pueden aislar específicamente, y se pueden utilizar para trasplante u otro cultivo y/o modificación, como se describe anteriormente.

Modelos de Enfermedad En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar como modelos in vi tro para enfermedades genéticas humanas. Se hacen manipulaciones genéticas, y luego se permite que las células se diferencien. Entonces se pueden estudiar los efectos de la manipulación. Estas células serán especialmente útiles para el estudio de desórdenes genéticos poligénicos y contiguos, en donde se requieren manipulaciones a gran escala o en serie. Un ejemplo de esto es el estudio de globinopatías humanas mediante la introducción de mutación, y luego estudiar las células a medida que se diferencian en células hematopoyéticas. Otros ejemplos son el estudio de los defectos musculares y los defectos neuronales. En otro uso de la invención, se utilizan células germinales embriónicas no modificadas o genéticamente modificadas, o sus derivados de diferenciación o diferenciados, para trasplante humano en el feto, en el recién nacido, en el bebé, en los niños, y/o en el adulto. Un ejemplo de este uso es el complemento terapéutico de enzimas metabólicas para el tratamiento de desórdenes recesivos autosomales . La producción de oxidasa de ácido homogentísico por las células germinales embriónicas trasplantadas o las células derivadas diferenciadas hacia el hígado, se podría utilizar en el tratamiento de alcaptonuria (para una revisión de este desorden , ver McKusick, Heri table Disorders of Connective Tissue, 4a edición, St. Louis, C.V. Mosby Co., 1972) . De la misma manera, se podría aumentar la expresión de transcarbamilasa de ornitina para el tratamiento de la enfermedad ocasionada por su deficiencia. En otro ejemplo, se podría aumentar la expresión de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato en precursores de eritrocitos o precursores hematopoyéticos para permitir la expresión en los glóbulos rojos sanguíneos, con el objeto de tratar la deficiencia de G6PD (favismo, anemia hemolítica aguda) . Los tratamientos de algunas enfermedades requieren de la producción de un factor circulante. Un ejemplo es la producción de a-L-antitripsina en plasma para tratar una deficiencia que ocasiona destrucción del pulmón, especialmente en los fumadores de tabaco. Otros ejemplos de proporcionar factores circulantes, son la producción de hormonas, factores de crecimiento, proteínas sanguíneas, y reguladores homeostáticos. En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se utilizan para reparar o complementar los tejidos u órganos dañados. Esto puede requerir que las células germinales embrióni-cas sean primeramente "diferenciadas in vi tro en células primordiales restringidas al linaje, o células terminalmente diferenciadas. Un ejemplo de esto es la diferenciación de las células germinales embriónicas en células vasculares y canales, y luego se utilizan para reparar o crear venas y arterias. Se ha demostrado que .los cuerpos embrioides de células primordiales embriónicas de ratón forman canales vasculares (Wang y colaboradores, Development 114:303-316, 1992), y este desarrollo in vi tro se puede mej errar con factores angiogénicos (Doetschman y colaboradores, Hypertension, 22:618-629, 1993) . Un ejemplo del uso de la manipulación genética sobre las células germinales embriónicas, es la reducción o remoción de las moléculas de superficie celular responsables del rechazo de trasplantes, con el objeto de generar células donadoras universales. Los genes de histocsmpatibilidad Clase I de ratón (MHC) se pueden deshabilitar mediante la supresión o alteración dirigida del gen de ß-microglobulina (Zijlstra y colaboradores, Na ture, 342:435-438, 1989) . Esto mejora de una manera significa la función renal en los aloinjertos de riñon de ratón (Coffman y colaboradores, Immunol . , 151:425-435, 1993), y permite la sobrevivencia indefinida de los haloinjertos de islotes pancriá-ticos de murino (Markmann y colaboradores, Transplanta tion , 54:1085-1089, 1992) . Los ratones con un gen de ß-microglobulina suprimido o alterado, se desarrollan normalmente (Koller y colaboradores, Science, 248:1227-1230, 1990) . La supresión de los genes MHC Clase II (Cosgrove y colaboradores, Cell , 66:1051-1066, 1991) mejora adicionalmente el resultado del trasplante. Sin embargo, los ratones que carecen tanto de Clase I como de Clase II, pueden rechazar los injertos de piel halogénicos (Grusby y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 90:3911-3917, 1993) . Las moléculas TAPl y Ii dirigen el tráfico intercelular de las moléculas MHC Clase I y Clase II, respectivamente (Toume y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 93:1464-1469, 1996). La remoción de estas dos moléculas transportadoras, u otros sistemas de tráfico intracelular de MHC, puede proporcionar también un medio para reducir o eliminar el rechazo del trasplante. Como una alternativa a un planteamiento de donador universal para la histocompatibilidad, se podría utilizar manipulación genética para generar perfiles de MHC "a la medida", para satisfacer necesidades individuales. La invención proporciona métodos para generar células y tejidos a partir de líneas germinales embriónicas para trasplante humano. Hacia este fin, puede ser necesario eliminar o reducir las moléculas marcadoras de superficie celular sobre las células o tejidos de trasplante del donador que inducen el rechazo del injerto de órganos. La presente invención abarca todas las modificaciones que reduzcan o eliminen el rechazo de injerto de órganos cuando se emplean células, líneas celulares (o cualesquiera partes o derivados de las mismas) derivadas a partir de células germinales embriónicas de la presente invención. Estas moléculas, denominadas antígenos HLA en los seres humanos, comprende las glicoproteínas de membrana de MHC clase I y II. Para las células y tejidos no hematopoyéticos, la eliminación o reducción -de las moléculas MHC clase I se realiza mediante el derribamiento dirigido del gen de ß2-microglobulina humano, como se ha realizado con las células primordiales embriónicas de ratón (Zijlstra y colaboradores, Na ture 342:435-438, 1989) . Las células no hematopoyéticas normalmente no producen moléculas MHC clase II. Para las células hematopoyéticas, se puede reducir o eliminar la presencia de las glicoproteínas MHC clase II mediante el derribamiento dirigido de los lugares HLA-DP, -DQ, y -DR, que son análogos a los derribamientos de los lugares E y A en las células primordiales embriónicas de ratón (Cosgrove y colaboradores, Cell 66:1051-1066, 1991). En otro uso de la invención, se utilizan células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, para la generación de órganos y tejidos para trasplante. La complejidad de este uso posiblemente requerirá de combinaciones de la modificación genética, diferenciación in vi tro, y utilización de sustrato definido, con el objeto de generar la arquitectura tridimensional requerida para la funcionalidad. Por ejemplo, un órgano de reemplazo puede requerir de vasculatura para suministrar nutrientes, remover productos de desecho, y entregar productos, así como contactos específicos de célula-célula. Se requerirá una población celular diversa para realizar estas y otras funciones especializadas, tales como la capacidad para repoblar de las células primordiales de linaje restringido. En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar para la generación de estructuras no celulares, tales como reemplazos óseos o de cartílago. En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar para trasplantarse a animales o humanos. Si se desea, estas células se pueden modificar genéticamente para los propósitos de la terapia genética. En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar como una fuente de material genético, tal como núcleos, ADN genómico, cromosomas, genes, ARN, y ADNcs. Estos materiales se "pueden utilizar para construir bibliotecas y rastrear arreglos utilizados para descubrir marcadores de pluripotencia y de diferenciación. En otro uso de la invención, se pueden utilizar las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados como una fuente de organelos no modificados o genéticamente modificados, tales como núcleos y mitocondrias . En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados se pueden utilizar como una fuente de células para desarrollar anticuerpos útiles en el estudio del desarrollo humano temprano. Las células de tipo silvestre intactas, genéticamente alteradas, físicamente o bioquímicamente alteradas, o diferenciadas, o sus extractos de membrana, se pueden utilizar como inmunógeno para la formación de anticuerpos mono- ó poli-clonales para las moléculas de superficie celular. En un aspecto de la invención, las líneas de células germinales embriónicas pluripotentes ofrecen un valioso paradigma para la investigación inmunohistológica del desarrollo humano temprano, mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos para los glicolípidos de superficie celular (Chiquoi-ne, A.D., Ana t . Rec . , 118:135-146, 1954; Evans, M.J., y M.H. Kaufman, Na ture 292:154-156), y glicoproteínas (Hogan, B.L.M., patente de los Estados Unidos 5,453,357) de las células de la presente invención. Estos reactivos se desarrollan mediante la inmunización de ratones con líneas celulares de teratocarcinoma de ratón y humanas,^ así como embriones de ratón. Se han producido de esta manera un número de anticuerpos monoclonales que se fijan a los epítopos de superficie celular embriónicos, y son importantes en la elucidación de las trayectorias de glicosilación durante el desarrollo. Los anticuerpos monoclonales que se fijan a los glicolípidos de superficie celular y a las glicoproteínas, se han utilizado para estudiar tumores de células germinales humanas (Labosky y colaboradores, Developmen t 120:3197-3204; Matsui y colaboradores, Na ture 353:750-751, 1991), y otros cánceres (Resnick y colaboradores, Na ture 359:550-551, 1992; Thomson y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 92:7844-7848, 1995) . Con el fin de generar anticuerpos de superficie celular embriónicos específicos de seres humanos, se inmunizan ratones semanalmente con aproximadamente 106 a 107 células germinales embriónicas, y se sangran por la cola semanalmente para probar la reactividad a las células germinales embriónicas. Después de que se detecta el suero reactivo, se producen hibridomas como se describe (Andrews y colaboradores, Hybridoma 3:347-361, 1984), o mediante métodos convencionales . Los anticuerpos monoclonales resultantes se clasifican contra un panel de líneas celulares humanas, incluyendo células germinales embriónicas y de carcinoma embriónico, así como secciones de tejido a partir de una variedad de tumores de células germinales y tejidos humanos normales. También se examinan las líneas de células primordiales embriónicas, germinales embriónicas, y de carcinoma embriónico de ratón. Se conocen otros métodos para la fabricación de fragmentos de anticuerpo en la técnica. (Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antijodies, ; A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (edición actual) , incorporado a .la presente como referencia) . Otro uso de las células germinales embriónicas están en la producción biosintética de macromoléculas. Los ejemplos no limitantes de los productos que se podrían producir son proteínas sanguíneas, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, enzimas, receptores, proteínas de enlace, moléculas de transducción de señales, antígenos de superficie celular, y moléculas estructurales . Los factores producidos por las células germinales embriónicas no diferenciadas, de diferenciación, o diferenciadas, simulan estrechamente el sutil pliegue y procesamiento secundario de los factores humanos nativos producidos en vivo. La producción biosintética por las células germinales embriónicas implica la manipulación genética, seguida por el crecimiento y/o la diferenciación in vitro . Se pueden secretar productos biosintéti-cos en el medio de cultivo, o se pueden producir intracelularmente, o pueden estar contenidos adentro de la membrana celular, y se pueden cosechar después de la alteración celular. Se puede utilizar la modificación genética del gen que codifique la macromolécula que se producirá biosintéticamente, para alterar sus características, con el objeto de complementar o mejorar la funcionalidad. De esta manera, se pueden crear macromoléculas novedosas de mejores propiedades. Adicionalmente, las células germinales embriónicas o las líneas celulares de la invención, son una fuente de ARN para la construcción de bibliotecas de ADNc de células germinales embriónicas pluripotentes de desarrollo temprano y humanas. La expresión genética durante las primeras etapas del desarrollo humano, y en las células que retengan pluripotencia, tradicionalmente ha sido difícil de estudiar, debido a la escasez del ácido nucleico pertinente, moléculas, células, y tejidos. Utilizando las técnicas de la presente invención, un experto ordinario en la materia puede superar estas dificultades mediante la generación de ácido nucleico humano específico de la etapa, moléculas, células, tejidos, y material genético.

También se producen productos farmacéuticos, de diagnóstico, o anticuerpos, utilizados en la fabricación o en el procesamiento, utilizando las células de la presente invención. El ADN exógeno extraño y homólogo se transfiere a las células germinales embriónicas mediante electroincorporación, fosfato de calcio, microinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otro medio. Las células germinales embriónicas se rastrean para determinar la incorporación de este ADN, o se utilizan en sistemas de transferencia nuclear. Estas proteínas u otras moléculas se cosechan de los cultivos celulares resultantes para su purificación adicional. Por ejemplo, se pueden producir factores de coagulación sanguínea humanos VIII y IX para el tratamiento de hemofilia. Los ejemplos no limitantes de las siguientes proteínas farmacéuticas, terapéuticas, de procesamiento, de fabricación, o de composición, que se pueden producir de esta manera, incluyen: proteínas sanguíneas (factores de coagulación VIII y IX, factores o componentes de complemento, hemoglobinas u otras proteínas sanguíneas, y similares) ; hormonas (insulina, hormona de crecimiento, hormona tiroides, gonadotrofinas, PMSG, hormonas tróficas, prolactina, oxitocina, dopamina, catecolaminas, y similares) ; factores de crecimiento (EGF, PDGF, NGF, IGF, y similares) ; citoquinas (interleucinas, CSF, GMCSF, TNF, TGFc-, TGFß, y similares) ; enzimas (activador de plasminógeno de tejido, estreptoquinasa, quinasas, fosfodiesterasas, metilasas, desmeti-lasas, deshidrogenasas, celulasas, proteasas, lipasas, fosfolipasas, aromatasas, citocromos, ciclasas de adenilato o guanilato, y similares, biosintéticas de colesterol o degradativas, digestivas, esteroidogénicas) ; hormonas u otros receptores (LDL, HDL, esteroide, proteína, péptido, lípido, o prostaglandina, y similares) ; proteínas de enlace (proteínas de enlace de esteroide, hormona de crecimiento o proteínas de enlace de factor de crecimiento, y similares) ; proteínas del sistema inmune (anticuerpos, productos genéticos SLA ó MHC); antígenos (bacterianos, parasíticos, virales, alérgenos, y similares); factores de traducción o de transcripción, oncoproteínas o proto-oncoproteí-nas, proteínas de leche (caseínas, lactalbúminas, suero de leche, y similares) , proteínas de músculo (miosina, tropomiosina, y similares) . La secuencia de nucleótidos del transgen puede codificar una forma precursora de la proteína finalmente cosechada de las células o de los cultivos de células transgénicas o transformadas dé la presente invención. De preferencia, la expresión del transgén es inducible. De una manera alternativa, las células se pueden rastrear mediante técnicas bien conocidas por aquellos de una experiencia ordinaria en la materia, para determinar la expresión del transgen mediante su utilización como una sonda para probar el ARNm a partir de las líneas celulares . La producción de células diferenciadas para reemplazo, reparación, o aumento de células o tejidos dañados, no funciona-les, o perjudicados, son otro uso proporcionado por la presente invención. El ADN exógeno extraño u homólogo se transfiere a las células germinales embriónicas mediante electroincorporación, fosfato de calcio, microinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otro medio. Las células germinales embriónicas se rastrean para determinar la incorporación de este ADN, o se utilizan en sistemas de transferencia nuclear. Estas células y/o tejidos se cosechan a partir de cultivos celulares, o de las líneas celulares resultantes, para utilizarse en la reparación o el aumento de un defecto. Por ejemplo, se pueden utilizar células, productos celulares, tejidos, o los productos de los cultivos celulares, en el tratamiento de sujetos que tengan enfermedad de Parkinson, o sujetos que hayan tenido un ataque cardíaco o lesión de la médula espinal . Las células, tejidos, u órganos con histocompatibilidad mayor exógena u otros antígenos extraños o endógenos y/o genes que disminuyan el rechazo por parte del organismo anfitrión de estos materiales trasplantados, se producen por medio de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar los miembros de la familia genética del ligando Fas. El ADN exógeno extraño u homólogo se transfiere al fenotipo de células germinales embriónicas mediante electroincorporación, exposición a fosfato de calcio, microinyección, lipofección, vector retroviral u otro vector viral o microbiano, u otro medio. Las células germinales embriónicas se rastrean para determinar la incorporación de este ADN, o la expresión de antígenos, utilizados en los sistemas de transferencia nuclear, o se hacen crecer en un cultivo in vi tro . Las moléculas, proteínas, células, tejidos, órganos, fluidos, o productos celulares, se cosechan a partir de las células, líneas celulares, cultivos celulares para genotrasplante. De esta manera, son posibles las moléculas, proteínas, células, productos celulares, constituyentes celulares, tejidos, órganos, o fluidos humanizados . En otro uso de la invención, las células germinales embriónicas o sus derivados de diferenciación o diferenciados, se pueden utilizar en la construcción y prueba de cromosomas artificiales humanos. E-iemplos Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la invención. Aunque son típicos de aquellos que se podrían utilizar, de una manera alternativa se pueden utilizar otros procedimientos conocidos por los expertos en este campo. EJEMPLO 1 COLECCIÓN DE CÉLULAS GERMINALES PRIMORDIALES HUMANAS- Y DERIVACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES EMBRIÓNICAS Se disectaran anlagén gonadal o rebordes genitales con mesenterios a partir de un material fetal abortado humano del LMP (último período menstrual) de 8 a 11 semanas. Los rebordes genitales se enjuagaron con 0.5 mililitros de solución salina regulada con fo-sfato u otro regulador isotónico (suero regulado con fosfato 0.21 gramos/litro de KH2P04; 9 gramos/litro de NaCl; 0.726 gramos/litro de Na2HP047H20) , luego se colocaron en 0.1 mililitros de una solución de tripsina al 0.05 por ciento-EDTA de sodio 0.53 mM (BRL), y se cortó en pequeños pedazos (menores de 1 milímetro cúbico) . Entonces los pedazos se molieron adicionalmente con un fórceps fino. Luego se pasó por pipeta el tejido repetidamente a través de una punta de pipeta de 100 microlitros para desagregar adicionalmente las células. La suspensión de tejido y células se incubó a 37°C durante aproximadamente 5 minutos, y luego se agregaron aproximadamente 3.5 mililitros de medio de cultivo de células germinales embriónicas (definido como: D-MEM, 4,500 miligramos/litro de D-glucosa, 2,200 miligramos/litro de bicarbonato de sodio mM; suero fetal de becerro calificado primordial, embriónico al 15 por ciento (BRL) ; glutamina 2 mM (BRL) ; piruvato de sodio 1 mM (BRL) ; 1000-2000 unidades/mililitro de factor inhibidor de leucemia recombinante humano (LIF, Genzyme) ; 1-2 nanogramos/mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF, Genzyme) ; y forscolina 10 µM en sulfóxido de dimetilo) . Se agregaron aproximadamente 0.2 mililitros de la suspensión celular a cada una de 16 cavidades de un plato de cultivo de tejido de 96 cavidades previamente preparado con una capa subconfluente de fibroblastos de ratón STO que se habían cultivado durante 3 días en un medio de crecimiento de células germinales embriónicas modificado, que no contenía factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de fibroblastos básico, o Forscolina, y luego se irradió con 5,000 rad de irradiación gamma. Las células germinales primordiales humanas y los fibroblastos de ratón STO se cultivaron para un primer paso de 7 a 10 días en medio de crecimiento de células germinales embriónicas a 37 °C con C02 al 5 por ciento y una humedad del 90 por ciento. El medio de crecimiento se preparó fresco y fue reemplazado diariamente. De una manera alternativa, las células de fibroblasto , subconfluentes se pueden irradiar, y luego se recubren en los platos de cultivo de tejido para formar una capa alimentadora . Las células se tripsinizaron como se describe en la presente, y cada cavidad se pasó a una cavidad de un plato de cultivo de 24 cavidades previamente preparado con fibroblastos de ratón STO irradiados (90 por ciento de las células), y a una cavidad de un plato de cultivo de tejido de 96 cavidades previamente preparado con fibroblastos de ratón STO irradiados (10 por ciento de las células) . Las células se cultivaron con un reemplazo diario del medio de crecimiento, hasta que se observó una morfología de las células consistente con aquella de las células germinales embriónicas de murino, normalmente de 7 a 30 días con 1 a 4 pasos. Dependiendo de la edad del tejido a partir del cual se obtuvieron las células germinales primordiales, este proceso podría tomar uno o más pasos. En el 13° día del cultivo (3 días después del subcultivo), un subconjunto de células que crecían en el plato de cultivo de 96 cavidades, se fijó y se tiñó para determinar la presencia de fosfatasa alcalina, utilizando un estuche de diagnóstico comercialmente disponible (Sigma Chemicals, número de producto 86-R) . Las células se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato (PBS), y luego se fijaron durante 30 segundos en una mezcla de 25 mililitros de solución de citrato (citrato de sodio 18 mM, cloruro de sodio 9 mM, pH de 3.6), 65 mililitros de acetona, y 8 mililitros de formaldehído al 37 por ciento. Luego se incubaron las células fijadas en la oscuridad durante 15 minutos en mezcla de tinte alcalino. Entonces las células se enjuagaron con agua desionizada durante 2 minutos, y se dejaron secar. Las células germinales primordiales fueron positivas para fosfatasa alcalina, y las células germinales embriónicas se tiñeron de rojo, mientras que las células que carecían de actividad de fosfatasa alcalina, tales como las células STO, permanecieron transparentes. Las células que crecían en el plato de 24 cavidades se pasaron cuatro veces para expander los números de células, y se prepararon múltiples suministros congelados a partir de cada paso. Las células .se fotografiaron a través de los 13 días iniciales del cultivo, utilizando microscopio de contraste de fases, y las células seleccionadas se procesaron para determinar el teñido con fosfatasa alcalina como se describe en la presente. En un planteamiento alternativo, las células germinales embriónicas se aislaron utilizando hialuronidasa/colagenasa/-ADNsa. El anlagén gonadal o los rebordes genitales con mesenterio se disectaron a partir de un material fetal abortado humano del último período menstrual de 8 a 11 semanas. Los rebordes genitales se enjuagaron en suero regulado con fosfato, y luego se colocaron en 0.1 mililitros de solución de digestión HCD (hialuronidasa tipo V al 0.01 por ciento, ADNsa I al 0.002 por ciento, colagenasa tipo IV al 0.1 por ciento (todos de Sigma) preparado en un medio de crecimiento de células germinales embriónicas) . Se cortaron tejidos y se molieron con un fórceps fino en un pequeño plato de vidrio (preferido) o de plástido, y luego se transfirieron con pipeta a un tubo de microcentrifuga-ción, y se incubaron durante 1 hora hasta durante toda la noche a 37 °C. Luego se agregó aproximadamente 1 mililitro de medio de crecimiento de células germinales embriónicas, y la suspensión de tejido y células se centrifugó a 500 rpm durante 5 minutos. El tejido y las células se volvieron a suspender entonces en 1 a 3 mililitros de medio de crecimiento de células germinales embriónicas, y se recubrieron en un plato receptor que contenía una capa alimentadora como se describió anteriormente. Para los pasos subsecuentes, las células se enjuagaron en suero regulado con -fosfato, y luego se agregó una solución de digestión HCD. Los tiempos de digestión fueron desde 20 minutos hasta 2 horas, y se monitorearon microscópicamente para determinar su terminación. Las células se bombearon varias veces con una pipeta, y luego se agregaron aproximadamente 10 volúmenes de medio de crecimiento de células germinales embriónicas. El tejido y las células se removieron luego hacia un tubo, y se centrifugaron a 500 rpm durante 5 minutos. El tejido y las células se volvieron a suspender entonces en un medio de crecimiento de células germinales embriónicas, y se recubrieron en un plato receptor que contenía una capa alimentadora como se describió anteriormente . EJEMPLO 2 PASO DE CÉLULAS PLURIPOTENTES El medio de crecimiento de células germinales embriónicas fue reemplazado diariamente, y las células se hicieron crecer a 37°C, con una humedad relativa del 90 por ciento, C02 al 5 por ciento, durante 4 a 14 días, hasta que se observaron células con una morfología consistente con las células germinales embriónicas de murino. En este momento, las células se tripsinizaron y se subcultivaron en platos de 96 cavidades o de 24 cavidades recién preparados, con una capa alimentadora irradiada. Una subpoblación de estas células se fijó y se tiñó para determinar la actividad de fosfatasa alcalina. Estas células se pasaron cuando menos 4 veces durante un período de 40 días, con demostración continua de la actividad de fosfatasa alcalina, como se demuestra por el teñido positivo.

Después de 1 a 3 pasos (de 7 a 30 días) , algunas células del cultivo de células germinales primordiales humanas cambia desde células germinales primordiales humanas aisladas y solitarias, fácilmente identificadas sólo por el teñido con fosfatasa alcalina o la detección de anticuerpo (ver las Figuras la y lb) , hasta que se observaron colonias celulares con una morfología consistente con las células germinales embriónicas de murino (ver las Figuras 2a y 2b) . Estas colonias se pueden reconocer mediante el microscopio de luz. Las células germinales embriónicas humanas se pueden caracterizar con respecto a la actividad de fosfatasa alcalina, la presencia de antígenos de superficie celular, y/o la capacidad para formar teratocarcinomas en ratones SCID. Las colonias germinales embriónicas se aislaron del resto del cultivo utilizando un cilindro de clonación, se expandieron a través de pasos repetidos, y luego se caracterizaron como líneas celulares separadas. Para probar la formación de teratocarcinoma en ratones SCID, se inyecta un granulo consistente en aproximadamente 500 células germinales embriónicas en el músculo de la pata trasera, los testículos, o la cápsula del riñon de ratones SCID de 8 a 15 semanas de edad. Después de 8 a 20 semanas de desarrollo, los tumores resultantes se fijan en paraformaldehído al 4 por ciento, y se empotran en parafina. Se examinan las secciones de tejido utilizando técnicas de teñido histológico convencionales, y detección inmunohistoquímica de los antígenos de superficie celular y otros epítopos, como se describen en la presente. La presencia de células a partir de las capas germinales del endodermo, ectodermo, y mesodermo, indica que las células son células germinales embriónicas pluripotentes . EJEMPLO 3 PRUEBA DE CÉLULAS COSECHADAS PARA DETERMINAR LA MORFOLOGÍA Y LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ALCALINA Como se describió anteriormente, en una modalidad preferida, se cosechan células germinales primordiales (PGCs) a partir de los rebordes gonadales nacientes, debido a que su edad de desarrollo temprano inhibe la diferenciación subsecuente y la pérdida de pluripotencia . Para aseverar que las células cosechadas fueran de una etapa de desarrollo apropiada, se probaron las células cosechadas para los criterios morfológicos utilizados con el fin de identificar células germinales primordiales que fueran pluripotentes (DeFelici y McLaren, Exp . Cell . 142:476-482, 1982) . Para sustanciar adicionalmente la pluripotencia, subsecuentemente se probó una muestra de las células extraídas para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (AP) . Los marcadores para células pluripotentes con frecuencia son útiles para identificar las células primordiales en cultivo. Las células germinales embriónicas normalmente manifiestan actividad de fosfatasa alcalina (AP) , y las células positivas para fosfatasa alcalina son típicamente pluripotentes. La actividad de fosfatasa alcalina se pierde rápidamente con la diferenciación de las células germinales embriónicas in vi tro . Se ha demostrado la expresión de fosfatasa alcalina en células primordiales embriónicas y de tipo primordial embriónico en el ratón (Wobus y colaboradores, Exp . Cell 152:212-219, 1984; Pease y colaboradores, Dev. Bio . 141:344-352, 1990), en la rata (Ouhibi y colaboradores, Mol . Repro . Dev. 40:311-324, 1995), en el cerdo (Talbot y colaboradores, Mol . Repro . Dev. 36:139-147, 1993b), y en la vaca (Talbot y colaboradores, Mol . Repro . Dev. 42:35-52, 1995) . También se ha detectado la actividad de fosfatasa alcalina en células germinales primordiales de murino (Chiquoine, Ana t . Rec . 118:135-146, 1954), en células germinales embriónicas de murino (Matsui y colaboradores, Cell 70:841-847, 1992; Resnick y colaboradores, Na ture 359:550-551, 1992), y en células embriónicas de ave cultivadas a partir de pollos (Pain y colaboradores, Dev. 122:1996) . En conjunto con la evaluación morfológica de la colonia de células germinales embriónicas, por consiguiente, la expresión de la fosfatasa alcalina es un marcador conveniente para identificar las células germinales embriónicas pluripotentes en cultivo. Se evaluaron muestras celulares tomadas a partir de las líneas de células germinales embriónicas cultivadas como en el Ejemplo 2, utilizando el microscopio de luz, para determinar la presencia de los criterios morfológicos que indicaran las células germinales embriónicas supuestas. Las primeras células germinales embriónicas aparecieron ya sea como células redondas, o como células redondas con dos o más seudopodios extendidos al visualizarse después del teñido para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (AP) . Después de 2 a 30 días en cultivo, se desarrollaron colonias multicelulares de células germinales embriónicas. Primero, de 10 a 100 células individuales formaron una acumulación flojamente asociada. En los pasos subsecuentes, algunas colonias llegaron a ser más grandes, y parecían estar comprendidas de muchas capas celulares. Las células individuales de estas colonias aparecían pequeñas y más estrechamente asociadas. Se mantuvieron cultivos de células germinales embriónicas durante más de 3 meses mediante el paso cada 4 a 10 días sobre fibroblastos STO de ratón irradiados frescos, o fibroblastos de pulmón humanos . Después de aproximadamente 1 semana a 2 meses, algunas células germinales embriónicas formaron colonias con un diámetro más grande, pero menos capas de células. Las células demostraron una morfología estrechamente apretada y de rápido crecimiento que recordaba los cultivos de células primordiales embriónicas y germinales embriónicas de ratón de paso temprano. . Subsecuentemente, se probaron las células para determinar la actividad de fosfatasa alcalina, mediante fijación como se describe en el Ejemplo 1, y su teñido empleando un protocolo de un estuche de citoquímica de fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) . Los resultados indicaron que la actividad de fosfatasa alcalina se expresaba de una manera consistente en las células germinales embriónicas, y en los cultivos primarios y subcultivos de células germinales embriónicas (ver la Figura 3F) . Las células demostraron un teñido histológico fuerte y convincente para la fosfatasa alcalina. Los fibroblastos de ratón STO circundantes no se tiñeron para la fosfatasa alcalina. Por consiguiente, las células que se probaron positivas para tanto los criterios morfológicos como la actividad de fosfatasa alcalina fueron consistentes con aquellas esperadas para células germinales embriónicas humanas. Estas células normalmente forman del 10 al 50 por ciento de todas las células cosechadas, aunque son complicados los conteos celulares precisos por las colonias apretadas formadas. EJEMPLO 4 PLURIPOTENCIA DE CÉLULAS GERMINALES EMBRIÓNICAS, DETERMINADA MEDIANTE TEÑIDO DE ANTICUERPO También se pueden investigar otros indicadores de pluripotencia. Estos incluyen, pero no se limitan a, la presencia de antígenos embriónicos específicos de la etapa, tales como SSEA-1 (Solter, D. y B. Knowles, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 75:5565-5569, 1978), SSEA-3, SSEA-4 (Kannagi, R., y colaboradores, Embo J. 2:2355-2361, 1983), y epítopos reconocidos por los anticuerpos TRA-1-60 (ATCC HB-4783) y TRA-1-81 (ATCC HB-4784) (Andrews, P., y colaboradores, Hybridoma 3:347-361, 1984), y la capacidad de estas células para formar teratocarcinomas o teratomas al inyectarse en ratones inmunocomprometidos (SCID) .

Los cultivos de células germinales embriónicas que crecieron sobre placas de cámara de plástico se tiñeron con 5 anticuerpos monoclonales para antígenos de superficie celular embriónica. Las células se enjuagaron dos veces con suero regulado con fosfato (PBS) , y luego se fijaron en paraformaldehído al 3 por ciento durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces en suero regulado con fosfato, luego se incubaron en una dilución de 1:5 a 1:25 (en suero regulado con fosfato) de cada uno de los siguientes anticuerpos monoclonales durante 1 hora a la temperatura ambiente: TRA-1-81 (ATCC HB-4784) y TRA-1-60 (ATCC HB-4783) (suministrados por Dr. Peter Andrews, Sheffield, Reino Unido) ; MC-480 (anti-SSEA-1) , MC-631 (anti-SSEA-3) , y MC-813-70 (anti-SSEA-4 ) (los anticuerpos anti-SSEA fueron suministrados por el Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA) . Las células subsecuentemente se lavaron dos veces en suero regulado con fosfato. Se utilizaron anticuerpo secundario de inmunoglobulina anti-ratón biotinilado, y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (BioGenex, San Ramón, CA) , como era recomendado por el fabricante. Los anticuerpos para los antígenos SSEA-1 y -4, y TRA-1-60 (ATCC HB-4783) , y -81 (ATCC HB-4784), reaccionaron fuertemente a las células germinales embriónicas, mientras que el anticuerpo para SSEA-3 reacción débilmente (ver las Figuras 3A-3E) . Las células también reaccionaron positivamente para la fosfatasa alcalina. Los resultados son consistentes con las • # -8Í-características esperadas para células germinales embriónicas humanas .

EJEMPLO 5 LAS CÉLULAS GERMINALES EMBRIÓNICAS CULTIVADAS EXHIBEN CARIOTIPOS NORMALES Para determinar si las líneas de células germinales embriónicas humanas aisladas exhibían un cariotipo normal, se probaron aproximadamente 10 a 20 cariotipos en etapa de metafase a partir de cada línea de células germinales embriónicas, mediante el examen de los cromosomas de la célula, para determinar anormalidades tanto estructurales como numéricas . Se cariotiparon cinco (5) cultivos de células germinales embriónicas, y se encontró que eran 46, XY y 46, XX normales. Las colonias de estos cultivos se aislaron y se expandieron dos veces separadas para generar líneas de células germinales embriónicas. Las células se colocaron en platos de cultivo de cuatro cavidades, y se cultivaron durante la noche en un medio de cultivo de células germinales embriónicas conteniendo 0.02 microgramos/mililitro de colcemida (GIBCO BRL) a 39°C en C02 al 5 por ciento, aire al 95 por ciento. Subsecuentemente las células se lavaron en suero regulado con fosfato, se trataron con tripsina-EDTA al 0.25 por ciento durante 10 a 15 minutos a 39°C, se removieron y se centrifugaron durante 5 minutos a 800 g. Las células se fijaron durante 5 minutos en fijador de Carnoy frío (3:1 por volumen del metanol absoluto a ácido acético glacial), se lavaron en suero regulado con fosfato, se centrifugaron como anteriormente, y se volvieron a suspender en 0.5 mililitros de fijador de Carnoy. Se transfirió una gota de pipeta de la suspensión celular resultante a portaobjetos microscópicos que se lavaron previamente con fijador de Carnoy. Los portaobjetos se secaron al aire, se tiñeron con Giembsa (GIBCO, BRL) , y se enjuagaron con agua del grifo. Después de un segundo secado, los portaobjetos se cubrieron y se vieron bajo inmersión en aceite utilizando el microscopio de luz a una amplificación de 4 OOX. Todas las líneas de células germinales embriónicas examinadas tuvieron un complemento normal de cromosomas humanos (es decir, 44 autosomas y 2 cromosomas de sexo) . Adicionalmente, no se observaron rompimientos, supresiones, adiciones, u otras anormalidades en la forma o en el número de los cromosomas. Entre las líneas de células germinales embriónicas aisladas, no se observaron diferencias obvias en la morfología, proliferación, y actividad de fosfatasa alcalina. Después de 8 a 12 pasos, todas las cuatro líneas de células germinales embriónicas aisladas, las dos de la línea celular hEG-KH, y las dos de la línea celular hEG-GU tuvieron un complemento humano normal de 46 cromosomas (44 autosomas y 2 cromosomas de sexo) . No se encontraron anormalidades obvias, adiciones, o supresiones en los cromosomas de las células germinales embríónicas aisladas, como se describió anteriormente . 8^ Tabla 1. Caracteristicas de las Lineas de Células Germinales Embriónicas Humanas EJEMPLO 6 CULTIVO DE CÉLULAS GERMINALES EMBRIÓNICAS En el ratón, las células primordiales embriónicas, pluripotentes, se derivan principalmente de dos fuentes. Las células primordiales embriónicas (ES) se derivan a partir de la masa celular interna de los embriones antes del implante, mientras que las células germinales embriónicas (EG) se derivan a partir de las células germinales primordiales (PGCs) localizadas en el reborde genital del embrión del día 8.5 a 12.5 posterior al coito. Ambos tipos de células son pluripotentes, y demuestran transmisión genética de la línea germinal en el ratón. Las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas de ratón comparten varias características morfológicas, tales como altos niveles de fosfatasa alcalina (AP) intercelular, crecimien-to co o colonias multicelulares estrechamente asociadas, presentación de moléculas de glicolípido y glicoproteína de superficie celular específicas . Algunas características adicionales son un cariotipo normal y estable, y la capacidad para -8d pasarse continuamente. Las células primordiales embriónicas que comparten algunas de estas características se han derivado a partir de especies de aves, mink, hámster, cerdo, bovino, y el mono Rhesus. Cuando se les permite diferenciarse, las células primordiales embriónicas y germinales embriónicas de ratón se diferenciaran in vitr? e in vivo . Con las combinaciones apropiadas de factores de crecimiento y diferenciación, pueden generar células del linaje hematopoyético y cardiomiocitos. Adicionalmente, se han utilizado células primordiales embriónicas de ratón para generar cultivos in vitro de neuronas, músculo esquelético, y células endoteliales vasculares. Cuando se inyectan células primordiales embriónicas y germinales embriónicas no diferenciadas en ratones (inmunocomprometidos, si es apropiado), se forma un teratocarcinoma en el sitio. Estos tumores contienen células no diferenciadas y una amplia variedad de tipos de células diferenciadas . Los cultivos de células primordiales, pluripotentes, humanas y sus derivados restringidos al linaje, podrían utilizarse potencialmente como una fuente ilimitada de células y tejidos para trasplante, biofabricación, e investigación de desarrollo. La manipulación genética de estas células proporcionará vectores adecuados para los futuros planteamientos de terapia genética. En un esfuerzo por generar células primordiales, pluripotentes, humanas, hemos iniciado y caracterizado un número de cultivos %1 celulares derivados a partir de células germinales primordiales humanas . Métodos Se disociaron el reborde gonadal y los mesenterios de embriones humanos de 5 a 9 semanas después de la fertilización, con tripsina-EDTA al 0.25 por ciento y alteración mecánica. Los tejidos inicialmente se cultivaron, y subsecuentemente se pasaron, sobre una capa alimentadora de fibroblastos STO de ratón irradiados en DMEM complementado con suero regulado con fosfato al 15 por ciento, factor inhibidor de leucemia recombinante humano (hrLIF) , factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (hrbFGF) , y forscolina. Para la detección de la actividad de fosfatasa alcalina, las células se fijaron en acetona al 66 por ciento/formaldehído al 3 por ciento, y luego se tiñeron con naftol/sustrato de fosfatasa alcalina-FRV (Sigma) . Para la inmunocitoquí ica, las células se fijaron en paraformaldehído regulado al 3 por ciento. La detección de anticuerpo se hizo utilizando anticuerpos anti-ratón biotinilados, peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina, y cromágeno AEC (BioGe-nex) . Las células preparadas para el análisis citogenético se trataron con 0.1 microgramos/mililitro de Colcemida, KCl 0.075M, y luego fijación en 3:1 de metanol : ácido acético. Resultados -Se han derivado líneas de células primordiales embriónicas, pluripotentes, a partir de cultivos de células germinales primordiales (PGCs) de ratón, y se han referido como células EG (germinales embriónicas) . Con la meta de establecer líneas de células germinales embriónicas humanas, se cultivaron rebordes gonadales y mesenterios de embriones de 5 a 9 semanas después de la fertilización (obtenidos como el resultado de la terminación del embarazo) sobre capas alimentadoras de fibroblastos STO de ratón en la presencia de una variedad de factores de crecimiento, incluyendo factor inhibidor de leucemia recombinante humano (hrLIF) , factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (hrbFGF) , y forscolina. Inicialmente, se visualizaron células germinales primordiales sencillas mediante teñido con fosfatasa alcalina (AP) . Durante un período de 7 a 21 días, estas células germinales primordiales dieron lugar a grandes colonias multicelulares que se parecían a aquellas de las colonias de células germinales embriónicas y primordiales embriónicas (ES) de ratón en el primer paso. A través de todo el período de cultivo, y con los pasos subsecuentes, las células continuaron siendo positivas para fosfatasa alcalina. Las células también fueron positivas cuando se probaron contra un panel de 5 anticuerpos monoclonales (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 (ATCC HB-4783) , TRA-1-81 (ATCC HB 47-84)) utilizados como rutina para caracterizar las células primordiales, pluripotentes. Las células cultivadas se han pasado continuamente, y se ha encontrado que son cariotípicamente normales y estables. Se han obtenido cultivos tanto de células XX y XY como XY. Las propiedades tF -caracterizadas hasta ahora sobre las células humanas derivadas son consistentes con aquellas anticipadas para las células primordiales pluripotentes. (Ver la Tabla 2). Se han obtenido varios cultivos celulares derivados de células germinales primordiales humanas . Todos los cultivos probados han compartido las características morfológicas, inmunológicas, y cariotípicas descritas. Con el objeto de comparar estos cultivos celulares con las células primordiales embriónicas o germinales embriónicas, se debe determinar su potencial para diferenciarse in vitro e in vivo . Durante el cultivo estándar, una pequeña fracción de colonias se diferencian de una manera espontánea en estructuras que se parecen mucho a los cuerpos embrioides (EB) de ratón. Al analizarse mediante el microscopio de electrones, se identificaron una amplia variedad de tipos de células, incluyendo una capa epitelial externa que cubría un núcleo parcialmente sólido de fibroblastos, células endoteliales, y lo que parecían ser glóbulos rojos sanguíneos anucleados .

TABLA 2 Anticuerpo Reactividad Primate Ratón Nombre Antígeno Tipo de Antígeno derivadas de hEC mES EC ES EG pGC humanas MC480 SSEA-1 glicolípido (lacto) + - - + + + MC631 SSEA-3 glicolípido (globo) +/- + + - - - MC813-70 SSEA-4 glicolípido (globo) + + + - +/- + TRA-1-60 glicoproteína + + + - - - TRA-1-81 glicoproteína + + + - - - Reactividad de anticuerpo para líneas celulares de primate y de ratón. Las abreviaturas son como sigue: hEC, carcinoma embrional humano; mES, célula primordial embriónica de mono, EG, célula germinal embriónica. Aunque la invención se ha descrito con referencia a la modalidad actualmente preferida, se debe entender que se pueden hacer diferentes modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención está limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES 1. Una célula que tiene las características de una célula germinal embriónica, pluripotente, humana (EG) .
2. 2. La célula de la reivindicación 2, donde la célula es capaz de diferenciación espontánea en una célula de cada una de las capas germinales de mesodermo, endodermo o ectodermo.
3. 3. La célula de la reivindicación 1, donde la célula es fosfatasa alcalina positiva.
4. 4. La célula de la reivindicación 1, donde la célula es telomerasa positiva.
5. 5. I^a célula de la reivindicación 1, donde la célula expresa los antígenos superficiales celulares SSEA-1 y SSEA-4, y los antígenos superficiales celulares que se ligan con anticuerpos teniendo la especificidad de ligadura de anticuerpos monoclonales TRA-1-60 (ATCC HB-4783) y TRA-1-81 (ATCC HB-4784) .
6. 6. La célula de la reivindicación 5, donde la célula expresa el antígeno superficial celular SSEA-3.
7. 7. La célula de la reivindicación 1, donde la célula está en contacto de fluidos con una célula que sostiene el crecimiento celular EG y medios de cultivo conteniendo una cantidad efectiva de: (a) un ligando que se liga a un receptor que puede asociarse con la glicoproteína 130 (gp 130) o un anticuerpo que se liga a y activa gp 130; y (b) un factor de crecimiento.
8. 8. La célula de la reivindicación 7, donde el ligando es oncostatína-M.
9. 9. La célula de la reivindicación 7, donde el ligando es el factor inhibidor de leucemia (LIF) .
10. 10. La célula de la reivindicación 7, donde el factor de crecimiento es el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) .
11. 11. , La célula de la reivindicación 7, donde las células que sostienen el crecimiento son seleccionadas del grupo que consiste en una célula STO, un fibroblasto de pulmón, embriónico, humano.
12. 12. Un método para producir EG, que comprende cultivar células germinales primordiales humanas (PCGs) en la presencia de células STO en un medio de cultivo que contiene una cantidad efectiva de: (a) un ligando que se liga a un receptor que puede asociarse con la glicoproteína 130 (gp 130) o un anticuerpo que se liga a y activa gp 130; y (b) un factor de crecimiento.
13. 13. El método de la reivindicación 12, donde las PCGs son de tejido de los bordes gonadales.
14. 14. El método de la reivindicación 13, donde el tejido de los bordes gonadales es recolectado 3 a 13 semanas postfertilización.
15. 15. El método de la reivindicación 13, donde el tejido de los bordes gonadales es recolectado 8 a 11 semanas después del último período menstrual.
16. 16. El método de la reivindicación 12, donde el ligando es oncostatina-M.
17. 17. El método de la reivindicación 12, donde el ligando es el factor inhibidor de leucemia (LIF) .
18. 18. El método de la reivindicación 12, donde el factor de crecimiento es el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) .
19. 19. El método de la reivindicación 12, donde el medio de cultivo comprende además un factor que eleva el cAMP intracelular .
20. 20. El método de la reivindicación 19, donde el factor es seleccionado del grupo que consiste en forskolina, toxina del cólera, isobutilmetilxantina y monofosfato cíclico de dibutilade-nosina .
21. 21. Una célula EG humana obtenida usando el método de la reivindicación 12.
22. 22. Un método para identificar un compuesto que modula la función celular EG, que comprende: (a) incubar componentes que comprenden el compuesto y al menos una célula EG bajo condiciones suficientes para permitir que los componentes interactúen; y (b) determinar el efecto del compuesto sobre la función de una célula EG antes y después de la incubación, en la presencia del compuesto.
23. 23. El método de la reivindicación 22, donde la modulación es inhibición de una función celular.
24. 24. El método de la reivindicación 22, donde la modulación es estimulación de una función celular.
25. 25. El método de la reivindicación 22, donde la función celular EG es seleccionada del grupo que consiste en diferenciación, expresión de genes, producción de factores de crecimiento, respuesta a factores de crecimiento y modulación de la permeabilidad de la membrana celular.
26. 26. Un método de usar una célula EG para producir células de linaje de desarrollo restringido, que comprende: poner en contacto la célula EG con un agente de diferenciación, con ello produciendo células de linaje de desarrollo restringido a partir de la célula EG.
27. 27. El método de la reivindicación 26, donde el agente es ácido retinoico.
28. 28. El método de la reivindicación 26, comprendiendo además : (a) expresar un marcador seleccionable en una célula de linaje de desarrollo restringido, donde la célula de linaje de desarrollo restringido contiene un polinucleótido recombinante, y donde el polinucleótido recombinante codifica el marcador seleccionable en enlace operable con un promotor específico de células de linaje de desarrollo restringido; y (b) seleccionar las células de linaje de desarrollo que expresan el marcador seleccionable.
29. 29. El método de la reivindicación 26, donde las células de linaje de desarrollo restringido son células neuroepiteliales .
30. 30. El método de la reivindicación 29, donde las células de linaje de desarrollo restringido son células epiteliales .
31. 31. El método de la reivindicación 26, donde las células de linaje de desarrollo restringido son cardiomiocitos.
32. 32. Un método de usar una célula EG para producir una célula de linaje de desarrollo restringido, humana, inmortalizada, que comprende: (a) generar una señal de diferenciación en una célula EG, con ello produciendo células de linaje de desarrollo restringido a partir de la célula EG; y (b) expresar telomerasa recombinante en la célula de linaje de desarrollo restringido, con ello produciendo células humanas inmortalizadas teniendo las características de una célula de linaje de desarrollo restringido.
33. 33. Un método para identificar un compuesto que puede diferenciar células EG, que comprende: (a) incubar componentes que comprenden el compuesto y una célula EG bajo condiciones suficientes para permitir que interactúen los compuestos; y (b) determinar el efecto del compuesto sobre la célula EG, donde la aparición en cultivo de células de linaje de desarrollo restringido indica diferenciación de la célula EG.