JP2005168492A - 不死化マスト細胞株 - Google Patents

Abstract

【課題】 マスト細胞が本来有する機能・特性を保有する不死化マスト細胞株やその樹立やその樹立方法、かかる不死化マスト細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】 ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、得られた細胞をＩＬ−３の存在下培養することによりマスト細胞を分化・誘導し、継代培養を繰り返し、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有する細胞株を樹立する。
【選択図】なし

Description

本発明は、骨髄に由来する不死化マスト細胞株に関し、詳しくはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス）の骨髄に由来するマスト細胞（mast cell）を継代培養することにより樹立することができる不死化マスト細胞株（ＳＶＭＣ）及びその製法や、その利用に関する。本発明の不死化マスト細胞株は、マスト細胞のインビトロにおける解析やマスト細胞による体内のアレルギー反応と局所的炎症反応の研究に応用できる。

従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。

一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞にｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。

これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することによって不死化細胞を樹立する方法が報告されている。特にｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため、非常に有効であるとされている（例えば、非特許文献１〜８参照。）。

他方、マスト細胞は、生体内において皮下組織や気道、食道ならびに胃・腸管粘膜下など、外界との境界に広く分布し、病原体などの異物の認識・排除に重要な役割を果たしている細胞である。また、各種刺激に応じ、ヒスタミン、ロイコトリエン、セロトニン、ヘパリン、白血球招集因子、グルクロン酸分解酵素、ヘキソースアミン分解酵素などの化学伝達物質を放出し、生体にアレルギー反応を引き起こすことが知られている。一般にマスト細胞は骨髄細胞よりサイトカイン（ＩＬ−３）存在下で容易に誘導可能であるが、長期間の培養による維持は困難であり、***能や脱顆粒など多くの活性を消失する。よって、初代培養と変わらない性質を保持したまま半永久的に培養可能なマスト細胞株は、マスト細胞の機能解析の上で大変有用なツールになると思われる。従来、マスト細胞株として、ラット・マスト細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（ＩＬ−３非存在下で維持可能であり、遺伝子導入の宿主やＩｇＥレセプターを発現しているので脱顆粒の実験に利用される）、マウス・マスト細胞株ＰＴ１８、マウス癌化マスト細胞株Ｐ−８１５（ＩＬ−３レセプターが常に活性化されており、ＲＢＬ−２Ｈ３と同様にＩＬ−３非存在下で維持可能で、遺伝子導入の宿主に利用される）、ＩＬ−３依存型マウス・マスト細胞株ＭＣＰ−５、ヒト未分化マスト細胞株ＨＭＣ −１から限界希釈法でクローニングしたマスト細胞Ｍｃε２７などが知られている。

Transgenic Research 4, 215-225, 1995 Genes to Cells, 2, 235-244, 1997 Exp. Cell Res., 197, 50-56, 1991 Exp. Cell Res., 209, 382-387, 1993 Exp. Cell Res., 218, 424-429, 1995 Blood, 86, 2590-2597, 1995 J. Cell. Physiol., 164, 55-64, 1995 Exp. Hematol., 27, 1087-1096, 1999

マスト細胞は骨髄細胞よりＩＬ−３などのサイトカイン存在下で容易に誘導できる細胞である。しかしながら長期間の培養による維持は困難であり、***能や脱顆粒など多くの活性を消失する。本発明の課題は、マスト細胞が本来有する機能・特性を保持する不死化マスト細胞株やその樹立方法、かかる不死化マスト細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法を提供することにある。

本発明者らは、不死化マスト細胞株を樹立するため、Yanai et,al.により作製されたＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスを用いた。このトランスジェニックマウスには、ＳＶ４０ウイルスがもつ細胞の不死化に関与するlarge Ｔ抗原をコードしている遺伝子がゲノムに組み込まれており、セルラインの樹立が可能であると考えた。そこで、８週齢のＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスの骨髄より骨髄細胞を回収し、マスト細胞の分化を誘導するサイトカインであるＩＬ−３を５ｎｇ／ｍｌ含む培地にて５％ＣＯ²、３３℃インキュベーターで４週間以上培養し、以降は５％ＣＯ²、３７℃インキュベーターで通常の初代培養マスト細胞と同様に継代・維持し、不死化増殖能を有し、ＦｃεＲＩ共架橋によるセロトニン放出が良好であり、かつＦｃεＲＩ⁺、ｃ−ｋｉｔ⁺の細胞が単一集団であった３クローンを選択した。この３種のセルラインをexpandし、詳細な解析を行なったところ、初代培養のマスト細胞がもつ性質をほぼ保持し続けていることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、骨髄に由来することを特徴とする不死化マスト細胞株（請求項１）や、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有することを特徴とする請求項１記載の不死化マスト細胞株（請求項２）や、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が部分的に抑制され、３９℃では増殖が停止することを特徴とする請求項１又は２記載の不死化マスト細胞株（請求項３）や、ＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養することにより、結合組織型成熟マスト細胞に分化することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の不死化マスト細胞株（請求項４）や、齧歯類起源であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の不死化マスト細胞株（請求項５）や、齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項５記載の不死化マスト細胞株（請求項６）に関する。

また本発明は、ＳＶＭＣクローンａ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５５）、ＳＶＭＣクローンｃ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５６）、ＳＶＭＣクローンＥ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５７）、又はこれらのクローンを分離する前のＳＶＭＣ混在物（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５４）であることを特徴とする請求項６記載の不死化マスト細胞株（請求項７）や、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、得られた細胞をＩＬ−３の存在下培養することによりマスト細胞を分化・誘導し、継代培養を繰り返し、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有する細胞株を樹立することを特徴とする不死化マスト細胞株の製造方法（請求項８）や、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が部分的に抑制され、３９℃では増殖が停止し、ＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養することにより、結合組織型成熟マスト細胞に分化する細胞株を樹立することを特徴とする請求項７記載の不死化マスト細胞株の製造方法（請求項９）に関する。

さらに本発明は、被検物質の存在下、請求項１〜６のいずれか記載の不死化マスト細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、マーカータンパク質が、ＦｃεＲＩ分子及び／又はｃ−ｋｉｔ分子であることを特徴とする請求項９記載のマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、被検物質の存在下、請求項１〜６のいずれか記載の不死化マスト細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、被検物質の存在下、請求項１〜６のいずれか記載の不死化マスト細胞株をＦｃεＲＩにより共架橋し、脱顆粒能及び／又はＣａ²⁺濃度上昇誘導能の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、被検物質の存在下、請求項１〜６のいずれか記載の不死化マスト細胞株をＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養し、該細胞のサフラニン染色性の程度を観察・評価することを特徴とするマスト細胞の成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１４）に関する。

本発明によると、ＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスより、初代培養細胞と同様な表面マーカー及び機能を保持した不死化マスト細胞株（ＳＶＭＣ）を樹立することができる。かかる不死化マスト細胞株は、未熟マスト細胞から成熟マスト細胞にも分化するという従来のマスト細胞株には無い特徴を備えており、マスト細胞の機能と分化研究の材料として有用である。

本発明の不死化マスト細胞株としては、骨髄に由来する不死化マスト細胞株であればどのようなものでもよく、３３℃で増殖することができ、３７℃では増殖が部分的に抑制され、３９℃では増殖が停止する細胞株が好ましく、この温度感受性の点を除いては、マスト細胞が本来備えている性質を有するものがより好ましい。例えば、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有する細胞株や、ＮＧＦ（Nerve Growth Factor）及びＳＣＦ（Stem Cell Factor）の存在下で培養することにより、結合組織型成熟マスト細胞に分化する細胞株や、これらの性質を合わせ有する細胞株を好適に例示することができる。また、かかる不死化マスト細胞株の具体例として、３種の不死化マスト細胞株（ＳＶＭＣ）クローンａ，ｃ，Ｅを挙げることができる。なお、ＳＶＭＣクローンａは受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５５として、ＳＶＭＣクローンｃは受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５６として、ＳＶＭＣクローンＥは受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５７として、また、これら３種のＳＶＭＣクローン（clone）ａ，ｃ，Ｅを分離する前のＳＶＭＣ混在物（ＳＶＭＣ Ｂｕｌｋ）は受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５４として、平成１６年１０月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にそれぞれ受領されている。また、本発明の不死化マスト細胞株の由来は特に限定されないが、マウス等の齧歯類などの動物から得られた不死化マスト細胞株は、マウスが豊富な病態モデルを有し、薬理作用の評価に広く用いられていることから好ましい。以下、本発明の不死化マスト細胞株の製造方法を、マウスを用いた方法を例にとって説明する。
ＳＶＭＣ bulkは、表す。

マウス由来の本発明の不死化マスト細胞株は、例えば、ＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスの骨髄細胞を塩化アンモニウムを用いて溶血処理した後、得られた細胞を５ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＩＬ−３を含むＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ）を用いて培養し、マスト細胞を誘導し、継代培養を一ヶ月以上繰り返し、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有する細胞株を樹立することにより製造することができる。

また、ＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスは、次のようにして作製することができる。ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させたｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素ＢａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（OhnoT. et al., Cytotechnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。このラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ断片を常法に従いマウスの全能性細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを作出することができる。かかるトランスジェニックマウスは、その全ての体細胞においてｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げることができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法としては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。

上記マウスの全能性細胞（培養細胞）の核を、除核未受精卵に移植して初期化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入することができる。また、前核期受精卵の雄性前核にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子をマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを効率よく作出することができる。

本発明の不死化マスト細胞株は、３３℃において永久的増殖能を保持し、３７℃においては増殖が部分的に抑制され、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の分化形質の発現を制御することができるという特色を有している。また、この不死化マスト細胞株は、２０ヶ月以上継代培養行っても３３℃で良好な増殖性を示し、マスト細胞としての機能を保持している。本発明の不死化マスト細胞株は、安定的に増殖し続けることができ、また、該マスト細胞のＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ2+濃度上昇誘導能を有することから、マスト細胞の機能と分化の研究、より具体的には、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃeＲＩ）とＩｇＥとの結合を阻害する研究、マスト細胞の刺激伝達後の顆粒の放出（脱顆粒）を阻害する研究、マスト細胞内での化学伝達物質の生合成を特異的に阻害する研究などに有用であり、また、以下に示すように、マスト細胞に対する有用物質のスクリーニングに用いることができることから、新薬開発の研究ベースとしても有用である。

本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記本発明の不死化マスト細胞株を培養し、該細胞株におけるＦｃεＲＩ分子、ｃ−ｋｉｔ分子、トリプターゼ、主要塩基性タンパク質（Major Basic Protein）、ＭＩＳＴ（Mast Cell-specific Immunoreceptor Signal Transductor）等のマーカータンパク質の発現の程度を測定・評価するマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株の増殖の程度を測定・評価するマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株をＦｃεＲＩにより共架橋し、脱顆粒能、Ｃａ²⁺濃度上昇誘導能等の程度を測定・評価するマスト細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株をＮＧＦ、ＳＣＦ等の存在下で培養し、該細胞のサフラニン染色性の程度を観察・評価するマスト細胞の成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を挙げることができる。そして、上記スクリーニング方法により得られるマスト細胞における成熟促進物質や、マスト細胞における細胞増殖促進物質や、マスト細胞の活性化促進物質も本発明に含まれる。

上記マスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化マスト細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に発現したマーカータンパク質の量を検出・測定し、被検物質の非存在下で培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。例えば、マスト細胞の表面に発現するマーカータンパク質であるＦｃεＲＩ分子、ｃ−ｋｉｔ分子等は、それぞれ特異抗体を用いて常法により免疫化学的に検出することにより測定することができる。また、これらに相当するｍＲＮＡの発現量を常法により検出することにより測定することもできる。他の態様のマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化マスト細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に細胞数や細胞の形態を測定・解析し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。また、上記マスト細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニングは、種々の濃度の被検物質の存在下で、不死化マスト細胞株の表面に発現したＦｃεＲＩにＩｇＥを結合させた後、抗ＩｇＥ抗体で架橋させ、顆粒内に貯留した化学伝達物質の放出（脱顆粒）の程度を測定し、また、細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇の程度を測定し、被検物質の非存在下の対照のものと比較・評価することにより行われる。そしてまた、マスト細胞の成熟促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化マスト細胞株を種々の濃度の被検物質とＮＧＦやＳＣＦの共存下で培養し、該細胞のサフラニン染色性の程度を観察し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（トランスジェニックマウスの作出）
ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入したトランスジェニックマウスは、下記の手順で作出した

（導入遺伝子の調製）
マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを遺伝子工学的手法で改変したものを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 1991）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。

（ＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスの作出）
マウス前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟した８週齢のウィスターマウスを明暗サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌マウスにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳゴナドトロピン（pregnanto mare serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰***処理を行った後、雄との同居により交配を行った。ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、ＤＮＡ注入操作までＣＯ²−インキュベーター内（５％のＣＯ²−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存した。この様にして準備したマウス受精卵の雄性前核に前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入ＤＮＡのマウスへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５’−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’（１３６５〜１３８４部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５’−ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３’（１５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、性別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックマウス（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニックマウスとウィスターマウスを交配し、雄ファウンダーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウンダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。

（マウス骨髄からの不死化マスト細胞株の分離・調製）
８週齢のＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの２系統を用いた。また、これらマウスの骨髄細胞を０．１４４Ｍ塩化アンモニウムにて赤血球ｌｙｓｉｓ処理した細胞を、マスト細胞の分化を誘導するサイトカインであるマウスリコンビナントＩＬ−３を５ｎｇ／ｍＬ含む培地（表１）を用いて、５．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でＴ７５フラスコを用い、５％ＣＯ²、３３℃インキュベーターで４週間以上培養し、以降は５％ＣＯ²、３７℃インキュベーターで通常の初代培養マスト細胞と同様に継代・維持した。

不死化マスト細胞株の樹立は，１．０cell/well，０．５cell/well及び０．２cell/wellに希釈して９６ウェルプレートに播いて行なった。１cell/well及び０．５cell/wellからは、１２０ウェルに播いたうち、それぞれ１８ウェル、１５ウェル、０．２cell/wellからは、２４０ウェルに播いたうち、１８ウェルから細胞の増殖が見られた。最終的には、優れた増殖能を有し、ＦｃεＲＩ共架橋によるセロトニン放出が良好であり、かつＦｃεＲＩ+、ｃ−ｋｉｔ+の細胞が単一集団であった３クローンａ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５５），ｃ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５６），Ｅ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５７）を選択した。この３種の不死化マスト細胞株（ＳＶＭＣ）をｅｘｐａｎｄし、以下に示すように詳細な解析を行なったところ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代培養のマスト細胞（Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ；Ｂ６ ＢＭＭＣ）がもつ性質をほぼ保持し続けていることがわかった。

（ＳＶＭＣの形態観察）
ＳＶＭＣの形態を観察するために、ライトギムザ（Wright-Giemsa）染色、トルイジンブルー（Toluidine blue）染色及びアルシャンブルー／サフラニン（Alcian blue/Safranin）染色を行った。ＳＶＭＣとＣ５７ＢＬ／６ ＭＣをそれぞれサイトスピンでスライドグラスに接着させ、ライトギムザ法（ライト染色液・ギムザ染色液、ともにメルク社製）、トルイジンブルー法（トルイジンブルー染色液はクロマ社製）、及びアルシャンブルー／サフラニン法（アルシャンブルー染色液はピアス社製、サフラニン染色液はクロマ社製）にて染色し、可視化した。結果を図１（参考写真１）に示す。図１中、ＳＶＭＣ bulk（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５４）は、３種のＳＶＭＣクローン（clone）ａ，ｃ，Ｅを分離する前のＳＶＭＣ混在物を表す。マスト細胞は、アレルギーや炎症に関わる種々の化学伝達物質を含んだ顆粒を細胞質内に豊富に貯留している。３種のＳＶＭＣをcytospinでスライドガラスに付着させ染色したところ、Wright-Giemsa染色では豊富な顆粒の貯留を認め（図１ａ）、Toluidine blue染色ではマスト細胞の特徴である異染性を認め（図１ｂ）、Alcian blue/Safranin染色ではAlcian blue陽性の典型的な粘膜型マスト細胞の特徴を認めた（図１ｃ）。

（ＳＶ４０ large Ｔ抗原トランスジェニックマウス由来の確認）
ＰＣＲ法でＳＶ４０ large Ｔ抗原遺伝子を増幅したところ、３種のＳＶＭＣクローンよりバンドが検出され、トランスジーンを持つことが確認された（図２ａ；参考写真２）。ＰＣＲにはフォワード５'−ＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＧＴＴＧＡＧ−３'（配列番号３）、リバース５'−ＧＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＧＣ−３'（配列番号４）からなるプライマー配列を用い、９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲ条件下で行った。初代培養であるＣ５７ＢＬ／６ ＭＣや、ネガティブコントロールであるラットマスト細胞株（ＲＢＬ−２Ｈ３）及びマウスマスト細胞株（Ｐ８１５mastocytoma）には、ＳＶ４０ large Ｔ抗原遺伝子を検出されなかった。

また、ＳＶＭＣとＣ５７ＢＬ／６ ＭＣのラージＴ抗原蛋白質を、ウェスタンブロット法（実験医学別冊マニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的アプローチによる癌研究プロトコール」１０８〜１１５頁、羊土社、１９９５年発行）により検出した。ＳＶＭＣとＣ５７ＢＬ／６ ＭＣの細胞株をそれぞれＰＢＳで洗浄後、１ｍＬの可溶化溶液（１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のglycerin）で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心（１００００ｒｐｍで１０分間）して不溶画分を除去した後、フラッドフォード法（ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイ試薬Ａを使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ１０μｇの蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。３％のスキムミルク溶液でブロッキングしたニトロセルロース膜に１次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原マウス抗体（Ａｂ−２；Oncogene社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Birmingham社製）を反応させ、ラージＴ抗原特異的な反応をアマシャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。この結果、３種のＳＶＭＣよりバンドが検出され、ＳＶ４０ large Ｔ抗原の存在がタンパク質レベルで確認された（図２ｂ；参考写真３）。初代培養であるＣ５７ＢＬ／６ ＭＣや、ネガティブコントロールであるＲＢＬ−２Ｈ３及びＰ８１５mastocytomaには、ＳＶ４０ large Ｔ抗原タンパク質の発現は認められなかった。

（ＳＶＭＣの表面マーカー）
マスト細胞は、細胞表面にＦｃεＲＩ及びｃ−ｋｉｔを高発現していることが知られている。そこで、フローサイトメトリーにてＳＶＭＣ上のＦｃεＲＩとｃ−ｋｉｔの発現を調べた。細胞を１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、５ｎｇ／ｍｌマウスＩｇＥ（BD Biosciences）を添加し、３７℃、５％ＣＯ²インキュベーターで２時間培養し、細胞表面のＦｃεＲＩにＩｇＥを結合させた。その後細胞をＦＡＣＳバッファー［９．８ｇ／ｌ ＨＡＮＫＳ（NISSUI）、０．２５ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ³（和光純薬）、２．０ｇ／ｌ bovine serum albumin（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（和光純薬）、０．０２％ sodium azide（ＳＩＧＭＡ）］で２回洗浄し、０．５μｇ／１００μｌ抗マウスＩｇＥ抗体（BD Biosciences）ならびに０．２μｇ／１００μｌＰＥ−抗マウスＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗体（BD Biosciences）にて氷中で１０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄の後、フローサイトメトリー ＢＤ−ＬＳＲ（BD Biosciences）にてＦｃεＲＩならびにｃ−ｋｉｔの発現を調べた。その結果、３種のＳＶＭＣクローンはいずれもＦｃεＲＩ，ｃ−ｋｉｔを高発現していた（図３；参考写真４）。

（ＳＶＭＣの増殖因子要求性）
免疫系細胞は生体外へ単離すると、特定の増殖因子を含む培地で培養する必要性があるものが多い。マスト細胞は、増殖・機能維持にＩＬ−３を必要とされることが知られている。増殖因子は高価であるので、それらを極力減らすことができれば費用の節減に繋がる。ＳＶＭＣは骨髄細胞から誘導当初より、５．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含む培地で培養を行なってきたが、これを減らすもしくは除いた条件下で培養し、〔³Ｈ〕−チミジンの取り込みを指標にＳＶＭＣの増殖を調べてみた。ＩＬ−３を含まないＲＰＭＩ培地で細胞を０．６×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調整した。９６穴マイクロプレートにＩＬ−３濃度を０、０．２、２．０、１０．０及び２０．０ｎｇ／ｍｌに調整した培地を１００μｌずつ加え、細胞懸濁液を１００μｌずつ各ウェルに分注し、ＩＬ−３の最終濃度をそれぞれ０、０．１、１．０、５．０ならびに１０．０ｎｇ／ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１６時間培養した。その後１ＭＢｑ／ｍｌ［³Ｈ］−チミジン（Amersham）を２０μｌずつ各ウェルに分注し再度３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１６時間培養し、［³Ｈ］−チミジンを細胞へ取り込ませた。その後細胞を濾紙へトランスファーし、十分乾燥の後MATRIX 9600 Direct Beta Counter（Packard instrument company）にて比活性を測定し、ＤＮＡ合成量を指標に各ＩＬ−３濃度での細胞の増殖能を調べた。その結果、ＳＶＭＣは通常の初代培養のマスト細胞（Ｂ６ＢＭＭＣ）より低い濃度のＩＬ−３で維持できる可能性が示唆された（図４；参考写真５）。

（ＳＶＭＣにおける脱顆粒能）
ＦｃεＲＩはＩｇＥを結合するα鎖と、刺激の伝達に関わるβ鎖及びγ鎖より構成され、抗原の侵入により、生体にはその抗体に対するＩｇＥ抗体が産生され、ＦｃεＲＩのα鎖にＩｇＥが結合する（感作状態）。再度同一の抗原の侵入により、ＩｇＥを結合した隣接するＦｃεＲＩが抗原により架橋されブリッジ構造をとる（共架橋）。そして共架橋が刺激となり、β鎖及びγ鎖がリン酸化され、細胞内に存在する刺激伝達因子が動員され、細胞内タンパク質をリン酸化することで刺激がリレー状に伝わり、その一部が細胞内Ｃａ2+濃度を上昇させ、細胞内顆粒の放出を引き起こす。このように、マスト細胞はＦｃεＲＩの共架橋により活性化し、顆粒内に貯留した化学伝達物質を放出する（脱顆粒）ことが知られている。そこで³Ｈで標識したセロトニンの放出を指標にＳＶＭＣの脱顆粒能を調べた。その結果、３種のＳＶＭＣクローンはいずれも初代培養のマスト細胞（Ｂ６ＢＭＭＣ）よりも高い脱顆粒能を保持していた（図５；参考写真６）。

（ＳＶＭＣにおける細胞内Ｃａ²⁺動態）
マスト細胞のＦｃεＲＩの共架橋は、種々の細胞内シグナルを伝達分子を活性化し、細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇を誘導することが知られている。そこでＣａ²⁺配位結合することで蛍光を発する色素Ｉｎｄｏ−１ＡＭ（ＳＩＧＭＡ社製）をＳＶＭＣ内に取り込ませ、ＦｃεＲＩの共架橋の蛍光強度の変化を指標に細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇を調べた。通常（Ｃａ²⁺ｆｒｅｅ）は５００ｎｍ付近の蛍光を発するが、Ｃａ²⁺結合状態では４００ｎｍ付近の蛍光を発するので、その変化を指標に細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を測定した。その結果、３種のＳＶＭＣクローンはいずれも初代培養のマスト細胞（Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ）よりも高い細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を認めた（図６；参考写真７）。

（結合組織型成熟マスト細胞の誘導）
マスト細胞をＮＧＦ（Nerve Growth Factor）やＳＣＦ（Stem Cell Factor）などの成長因子の存在下で培養すると、サフラニン（Safranin）陽性の結合組織型成熟マスト細胞に分化することが知られている。そこで、ＩＬ−３、ＮＧＦ及びＳＣＦ存在下で３週間培養し、結合組織型マスト細胞への分化誘導を試みた。５．０ｎｇ／ｍｌ組換えＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌ組換え−ＮＧＦ（R&D Systems, Inc.）及び１００ｎｇ／ｍｌ組換えＳＣＦ（Peprotech EC. Ltd.）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地を用い、２．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度で培養した。コンフルエントになり次第、等量の新しい培地を加え、３５ｍｍディッシュ、１００ｍｍディッシュ、Ｔ７５フラスコの順に移し、細胞を増殖させた。培養を開始して４、８、１２、１６および２０日経過した時点で培養細胞の一部を回収し、アルシャンブルー／サフラニン染色を行い、サフラニン陽性の細胞の有無を検討した。その結果、初代培養のマスト細胞（Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ）は約１週間後に、３種のＳＶＭＣクローンのうち１つのクローン（クローンａ）が約２週間後にサフラニン陽性の結合組織型成熟マスト細胞を認めた（図７；参考写真８）。

（まとめ）
以上の結果から、樹立した３種の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣは初代培養マスト細胞の性質をほぼ兼ね備えたものであることがわかった。これらマスト細胞株ＳＶＭＣはこれまでに報告されているマスト細胞株よりも初代培養マスト細胞に近い性質を有し、また未熟型から成熟型のマスト細胞への分化を誘導できる。したがって、本発明のマスト細胞株ＳＶＭＣは、マスト細胞の機能・分化の研究に大いに有用であると思われる。

本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣのWright-Giemsa染色、Toluidine blue染色及びAlcian blue/Safranin染色の結果を示す図である。 本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣのＰＣＲとウェスタンブロッドの結果を示す図である。 フローサイトメトリーによる本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣ上のＦｃεＲＩとｃ−ｋｉｔの発現結果を示す図である。 〔³Ｈ〕−チミジンの取り込みによる本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣがＩＬ−３要求性であることを示す図である。 ³Ｈ標識セロトニン放出を指標とした本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣの脱顆粒能を調べた結果を示す図である。 蛍光強度の変化を指標とした本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣの細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を調べた結果を示す図である。 本発明の不死化マスト細胞株ＳＶＭＣが結合組織型成熟マスト細胞へ誘導されることを示すサフラニン染色の結果を示す図である。

Claims (14)

1. 骨髄に由来することを特徴とする不死化マスト細胞株。
2. 細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有することを特徴とする請求項１記載の不死化マスト細胞株。
3. ３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が部分的に抑制され、３９℃では増殖が停止することを特徴とする請求項１又は２記載の不死化マスト細胞株。
4. ＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養することにより、結合組織型成熟マスト細胞に分化することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の不死化マスト細胞株。
5. 齧歯類起源であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の不死化マスト細胞株。
6. 齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項５記載の不死化マスト細胞株。
7. ＳＶＭＣクローンａ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５５）、ＳＶＭＣクローンｃ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５６）、ＳＶＭＣクローンＥ（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５７）、又はこれらのクローンを分離する前のＳＶＭＣ混在物（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０２５４）であることを特徴とする請求項６記載の不死化マスト細胞株。
8. ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、得られた細胞をＩＬ−３の存在下培養することによりマスト細胞を分化・誘導し、継代培養を繰り返し、細胞表面にＦｃεＲＩ分子及びｃ−ｋｉｔ分子を発現し、顆粒を細胞質内に豊富に貯留し、ＦｃεＲＩの共架橋による活性化により脱顆粒能及びＣａ²⁺濃度上昇誘導能を有する細胞株を樹立することを特徴とする不死化マスト細胞株の製造方法。
9. ３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が部分的に抑制され、３９℃では増殖が停止し、ＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養することにより、結合組織型成熟マスト細胞に分化する細胞株を樹立することを特徴とする請求項８記載の不死化マスト細胞株の製造方法。
10. 被検物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化マスト細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
11. マーカータンパク質が、ＦｃεＲＩ分子及び／又はｃ−ｋｉｔ分子であることを特徴とする請求項１０記載のマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
12. 被検物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化マスト細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
13. 被検物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化マスト細胞株をＦｃεＲＩにより共架橋し、脱顆粒能及び／又はＣａ²⁺濃度上昇誘導能の程度を測定・評価することを特徴とするマスト細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
14. 被検物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化マスト細胞株をＮＧＦ及びＳＣＦの存在下で培養し、該細胞のサフラニン染色性の程度を観察・評価することを特徴とするマスト細胞の成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。