JP2019194168A - ヒト癌型Ｋｒａｓ遺伝子発現型癌に有効な抗腫瘍剤の製法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対し優れた抗腫瘍効果を有する抗腫瘍剤が得られる抗腫瘍剤の製法の提供。【解決手段】 ヒメマツタケ（Agaricus blazei Murill）の菌糸体に１０倍量の精製水を加え、１００℃で２時間、撹拌しつつ煮沸下で熱水抽出し、抽出液を得た。その抽出液を１／１０に減圧濃縮し、冷却した後、遠心分離して上澄液を得た。この上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて沈澱を生じさせたものから遠心分離した沈澱物を、凍結乾燥させて抗腫瘍剤とする。【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対する抗腫瘍剤の製法に関する。

変異した癌型Kras遺伝子は肺腺癌ドライバー遺伝子の一つであり、ヒト肺腺癌では約２５乃至３０％に検出される。またヒト膵腺癌では約７０乃至９０％、ヒト大腸癌では約５０％でヒト癌型Kras遺伝子の検出が報告されている。ヒト癌型Kras遺伝子発現誘導型肺腺癌マウスモデルでは、誘導的にヒトの癌型Kras遺伝子を肺細胞で発現するだけで肺腺癌を発症する。

しかしながら、Kras変異型の癌については、従来の抗腫瘍剤の効果が期待できないことも少なくない。

特許第４０５７１０７号公報には、サルコーマ１８０腹水癌に対し、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される、β−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンが腹腔内に投与により抗腫瘍活性を示すことが示されているが、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌についての記述はない。

特許第４０５７１０７号公報

本発明は、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対し優れた抗腫瘍効果を有する抗腫瘍剤の製法を提供することを目的とする。

本発明の抗腫瘍剤の製法は、次のように表すことができる。

(1) ヒメマツタケの菌糸体を熱水抽出して得られた抽出液又はヒメマツタケの培養濾液を、アルコール沈澱させ、その沈殿物を抗腫瘍剤として得ることを特徴とする、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対する抗腫瘍剤の製法。

(2) 上記抗腫瘍剤が経口投与剤である上記(1)記載の製法。

(3) 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した肺腺癌である上記(1)又は(2)記載の製法。

(4) 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存したII型肺胞上皮腺癌様の非小細胞癌である上記(1)又は(2)記載の製法。

(5) 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した膵臓癌である上記(1)又は(2)記載の製法。

(6) 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した大腸癌である上記(1)又は(2)記載の製法。

(7) ヒメマツタケの菌糸体に精製水を加えて熱水抽出することにより抽出液を得、その抽出液を濃縮した後、上澄液を得、その上澄液に９９％エチルアルコールを加えて沈澱させた沈澱物を抗腫瘍剤として得る上記(1)乃至(6)の何れか１項に記載の製法。

本発明の抗腫瘍剤の製法によれば、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対し優れた抗腫瘍効果を有する抗腫瘍剤が得られる。

また、本発明の抗腫瘍剤の製法により得られる抗腫瘍剤は、経口投与剤として、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対し極めて優れた抗腫瘍効果を発揮する。

特に、本発明の抗腫瘍剤の製法により得られる抗腫瘍剤は、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した肺腺癌、特にII型肺胞上皮腺癌様の非小細胞癌に対し極めて優れた抗腫瘍効果を発揮する。

抗腫瘍効果試験の検査日に被験物質非投与群から摘出した肺の写真を肺腺癌腫瘍数と共に示す。 抗腫瘍効果試験の検査日に被験物質経口投与群（隔日250mg/kg/日）から摘出した肺の写真を肺腺癌腫瘍数と共に示す。 抗腫瘍効果試験検査日に被験物質腹腔内投与群（隔日250mg/kg/日）から摘出した肺の写真を肺腺癌腫瘍数と共に示す。

(1) 本発明の製法においては、ヒメマツタケ（Agaricus blazei Murill）の菌糸体を熱水抽出して得られた抽出液（好ましくは、抽出液を濃縮した濃縮液）又はヒメマツタケの培養濾液（好ましくは、培養濾液を濃縮した濃縮液）を、アルコール沈澱（好ましくはエチルアルコール沈殿）させ、その沈殿物を抗腫瘍剤として得ることができる。

より具体的には、ヒメマツタケの菌糸体に１０倍量の精製水を加え、煮沸下で２時間熱水抽出し、抽出液を得る。この抽出液を１／１０に減圧濃縮した後、遠心分離して上澄液を得、その上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて生じた沈殿物を抗腫瘍剤として得ることができる。

この抗腫瘍剤は、β-1,2結合したD-mannopyranosylを主鎖とし、β-D-gulcopyranosyl-3-O-D-gulcopyranosyl残基を側鎖にもつグルコマンナン蛋白多糖体を含有する。

(2) 本発明の製法により得られた抗腫瘍剤は、例えば経口投与により適用することができるが、投与方法は必ずしも経口投与に限らない。

本発明における抗腫瘍剤の経口投与の形態に特に限定はないが、例えば、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、水に溶解した液剤若しくはその他の液剤とすることができる。

また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。

賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。

結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチルセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。

崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。

滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。

コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フィルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。

着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。

(3) ヒトに対する投与量は、例えば４乃至１０ｇ／日とすることができる。

なお、ヒメマツタケの安全性については、国立医薬品食品衛生研究所の変異遺伝部長（林真）らによる「既存天然添加物等の変異原性を中心とした安全性研究」（厚生科学特別研究事業）においてもヒメマツタケの安全性が確認されている。また、ヒメマツタケ抽出物のラット亜慢性毒性試験においても、国立医薬品食品衛生研究所・病理部 黒岩有一らによって安全性が確認されている（Lack of subchronic toxicity of an aqueous extract of Agaricus blazei Murill in F344 rats; Y.Kuroiwa, et al.; Food and Chemical Toxicology 43(2005) 1047-1053）。

本発明の製法により得られた抗腫瘍剤のヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対する抗腫瘍効果について試験を行った。

(1) 被験物質

ヒメマツタケ（Agaricus blazei Murill）の菌糸体に１０倍量の精製水を加え、１００℃で２時間、撹拌しつつ煮沸下で熱水抽出し、抽出液を得た。その抽出液を１／１０に減圧濃縮し、冷却した後、遠心分離して上澄液を得た。この上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて沈澱を生じさせたものから遠心分離した沈澱物を、凍結乾燥させて被験物質とした。

(2) 供試動物

Ryr2^tmINobs/+(flox-KrasG12V-IRES-NL-LacZ-KI)、129/SVJ:C57BL/6J Jms S1c mix backgroundの８週令雄マウスを用いた。

6×10^９PFU/mlに調整したCre遺伝子発現アデノウイルスを、Ryr2^tmINobsマウスに麻酔下で20μl経鼻感染させ、肺胞上皮細胞特異的に、癌型ヒトKrasGl2V、LacZ遺伝子の発現を誘導した。

供試動物の通常飼育は、平均温湿度２５℃、６０％、明暗サイクル１２時間で、固形飼料（CE-7 日本クレア社製）と滅菌水を自由摂取させて行った。

(3) 被験物質経口投与による抗腫瘍効果試験

癌型ヒトKrasをドライバーとする肺腺癌に対する被験物質経口投与の抗腫瘍効果について試験を行った。

被験物質が有する多様なBRMによる、アデノウイルス感染のCre発現によるがん幹細胞の形成およびそれを取り巻く炎症性の微小環境の初期形成への影響を排除するために、Cre発現アデノウイルス感染の１か月後を被験物質経口投与開始時期とした。

前記のように発癌誘導した供試動物を感染日から１か月間通常飼育した後、被験物質非投与群（対照群）と被験物質250mg/kg/日の隔日経口投与群の２グループ（何れも個体数は５）に分け、固形飼料（CE-7 日本クレア社製）と滅菌水を自由摂取させつつ３か月間飼育を行った。

検査日（被験物質投与期間経過後、通常飼育により１か月間経過した日）にエーテル麻酔下で供試動物から肺を摘出し、4%パラホルムアルデヒド（和光純薬工業社製）/Phosphate buffered saline溶液(4%PFA/PBS)中で４℃１時間固定し、さらに室温PBS中で３０分３回洗浄した。その後、室温LacZ染色液［2mM MgCl_２（和光純薬工業社製）、5mMフェリシアン化カリウム（和光純薬工業社製）、5mMフェロシアン化カリウム（和光純薬工業社製）、1mg/ml Bluo-Gal(lnvitrogen)/PBS］中で２日間染色し、実体顕微鏡（Leica社製）下で肺腺癌腫瘍数を数えた。

その結果、肺腺癌腫瘍数は、被験物質非投与群（対照群）では180.4±49.8（個／匹）（図１）、被験物質経口投与群では10.6±4.9（個／匹）（図２）であり、被験物質経口投与群の肺腺癌腫瘍数は、被験物質非投与群の肺腺癌腫瘍数に比し、有意に少なく、その差は極めて顕著であった。すなわち、被験物質の経口投与が、癌型ヒトKrasをドライバーとする肺腺癌に対し極めて優れた抗腫瘍効果を示した。

(4) 被験物質腹腔内投与による抗腫瘍効果試験

癌型ヒトKrasをドライバーとする肺腺癌に対する被験物質腹腔内投与の抗腫瘍効果について試験を行った。

前記のように発癌誘導した供試動物を感染日から１か月間通常飼育した後、被験物質経口投与による抗腫瘍効果試験と共通の対照群（被験物質非投与群）、被験物質50mg/kg隔日腹腔内投与群、及び被験物質250mg/kg隔日腹腔内投与群（何れも個体数は５）に分け、固形飼料（CE-7 日本クレア社製）と滅菌水を自由摂取させつつ、３か月間飼育を行った。

被験物質経口投与による抗腫瘍効果試験と同様に処理して肺腺癌腫瘍数を数えたところ、50mg/kg隔日腹腔内投与群で93.5±35.8（個／匹）、250mg/kg隔日腹腔内投与群で48.2±9.1（個／匹）（図３）であり、被験物質腹腔内投与群の肺腺癌腫瘍数は、被験物質非投与群の肺腺癌腫瘍数に比し、有意に少なかった。すなわち、被験物質の腹腔内投与が、癌型ヒトKrasをドライバーとする肺腺癌に対し抗腫瘍効果を示した。

なお、何れの試験においても、統計学的検定についてはStudent's t-testにより検定を行いP＜O.05を有意差ありと判定した。

Claims (7)

1. ヒメマツタケの菌糸体を熱水抽出して得られた抽出液又はヒメマツタケの培養濾液を、アルコール沈澱させ、その沈殿物を抗腫瘍剤として得ることを特徴とする、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した癌に対する抗腫瘍剤の製法。
2. 上記抗腫瘍剤が経口投与剤である請求項１記載の製法。
3. 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した肺腺癌である請求項１又は２記載の製法。
4. 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存したII型肺胞上皮腺癌様の非小細胞癌である請求項１又は(2)記載の製法。
5. 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した膵臓癌である請求項１又は２記載の製法。
6. 上記癌が、ヒト癌型Kras遺伝子発現に依存した大腸癌である請求項１又は２記載の製法。
7. ヒメマツタケの菌糸体に精製水を加えて熱水抽出することにより抽出液を得、その抽出液を濃縮した後、上澄液を得、その上澄液に９９％エチルアルコールを加えて沈澱させた沈澱物を抗腫瘍剤として得る請求項１乃至６の何れか１項に記載の製法。