JP6144997B2

JP6144997B2 - 補体第３成分活性化剤

Info

Publication number: JP6144997B2
Application number: JP2013175440A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　均; 均伊藤; 浩子伊藤; 雅基藤島; ゆかり荒川
Original assignee: SUN CHLORELLA CORP
Current assignee: SUN CHLORELLA CORP
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: JP2015044753A

Description

本発明は、特定のクロレラ抽出物を有効成分とする補体第３成分活性化剤に関する。

防御機構の中で一番原始的な機構は、マクロファージに代表される食作用と補体の活性化に始まる一連の防御機構である。

補体とマクロファージは病原微生物を含む外因性の異物の侵入、自己由来の異物的成分、老廃物、過剰生産物、不用となった活性化物などを処理し、生体の恒常性（ホメオスターシス）を保つうえで大変重要な役割を果たしている。

これまでに、クロレラ抽出液は、Th1（タイプ１ヘルパーＴ細胞）活性を誘導し、IFN-γ（インターフェロンガンマ）、IL-12（インターロイキン１２）の産生を促進することが知られている（Hasegawa T, Ito K, et al.: Oral administration of hot water of extracts of chlorella vulgaris reduces IgE production against milk casein in mice. Int J Immunopathol pharmacol 21(5): 311-323 1999）。

その効能成分の一つとして、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）の抽出液からガラクトースまたはラムノースを主な構成糖とする二つの多糖体が単離され肺癌細胞（A549 human lung adenocarcinoma cell）の増殖阻害が報告されている（Sheng J, Yu F, et al.: Preparation, identification and their antitumor activities in vitro of polysaccharides from Chlorella pyrenoidosa. Food Chem 105: 533-539 2007）。

しかしながら、クロレラ抽出物による補体第３成分の活性化については知られていない。

Hasegawa T, Ito K, et al.: Oral administration of hot water of extracts of chlorella vulgaris reduces IgE production against milk casein in mice. Int J Immunopathol pharmacol 21(5): 311-323 1999 Sheng J, Yu F, et al.: Preparation, identification and their antitumor activities in vitro of polysaccharides from Chlorella pyrenoidosa. Food Chem 105: 533-539 2007

本発明は、特定のクロレラ抽出物を有効成分とする補体第３成分活性化剤を提供することにある。

本発明の補体第３成分活性化剤は、次のように表すことができる。

(1) クロレラの細胞壁破砕物から熱水で抽出された、分子量１万以上の多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤。

(2) 補体を活性化する経路が補体第２経路である(1)記載の補体第３成分活性化剤。

(3) 上記多糖体が、クロレラの細胞壁破砕物から９５乃至１００℃の熱水で抽出されたものである(1)又は(2)記載の補体第３成分活性化剤。

(4) 上記クロレラがクロレラ・ピレノイドサである(1)乃至(4)の何れかに記載の補体第３成分活性化剤。

(5) 経口投与剤である(1)乃至(5)の何れかに記載の補体第３成分活性化剤。

本発明のクロレラの細胞壁破砕物から熱水で抽出された、分子量１万以上の多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤は、補体第３成分（Ｃ３）を効果的に活性化し得る。

補体第３成分（Ｃ３）の交叉免疫電気泳動パターン

本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。

本発明の補体第３成分活性化剤の製造に用いるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。

上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。

このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。

本発明の補体第３成分活性化剤の有効成分である分子量１万以上の多糖体は、例えばクロレラの細胞壁破砕物からの熱水抽出物を濾過することにより得ることができる。

本発明の補体第３成分活性化剤は、経口投与の他、補体第３成分活性化剤として通常採用し得る他の各種剤形において適用可能である。

本発明の補体第３成分活性化剤における経口投与の形態に特に限定はないが、例えば、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤とすることができる。

また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。

賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。

結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。

崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。

滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。

コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。

着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。

なお、本発明の補体第３成分活性化剤のヒトの服用量は、有効成分であるクロレラ細胞壁破砕物から熱水で抽出された分子量１万以上の多糖体の含有量において例えば５ｍｇ乃至５０ｍｇ／日程度が好ましい。

本発明の補体第３成分活性化剤は、例えば栄養食品、栄養補助食品又は飲料用液体等を構成する飲食組成物中に有効成分であるクロレラ細胞壁破砕物から熱水で抽出された分子量１万以上の多糖体を含有した形態とすることもでき、本発明の効果を損なわない各種成分を含むものとすることもできる。

クロレラの細胞壁破砕物から熱水で抽出された分子量１万以上の多糖体の補体第３成分活性化効果について、試験を行った。

１．被験物質の製造

細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）の乾燥粉末（以下、単に「クロレラ」とも言う。）を、次のように製造した。

冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］ WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、被験物質である細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末が得られた。

得られた細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末を水に懸濁させた後、９５乃至１００℃で２時間煮沸した。

これを常温に冷却した後、静置状態で上澄をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バイオエンジニアリング社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過して第１の濾過残渣を得た。

前記静置状態における沈殿物を、再度、９５乃至１００℃で２時間にわたり水で煮沸し、これを常温に冷却した後、静置状態で上澄をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バイオエンジニアリング社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過して第２の濾過残渣を得、第１の濾過残渣と第２の濾過残渣を混合した。

この混合物を３℃で１２時間静置した後、室温で10,000 rpmで２０分間遠心分離処理し、上澄と沈殿に分けた。

この上澄を回収して３℃でダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バイオエンジニアリング社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過することにより、非濾過画分（M.W. 10,000 以上）と濾過画分（M.W. 10,000 以下：Filter 3) を得た。

この非濾過画分に、容量の３倍の無水エタノールを加えて室温で10,000 rpmで遠心分離処理し、上澄と沈殿に分けた。沈殿は、無水エタノールで３回洗浄後、無水エーテルで１回洗浄した。その後、４０℃で真空乾燥したものをSample F1 (CP)とした。CPの収率は2.75%であった。

Filter 3に容量の３倍の無水エタノールを加えて４０℃で減圧濃縮した後、室温で10,000 rpmで遠心分離処理して上澄と沈殿に分けた。沈殿を無水エタノールで３回洗浄後、無水エーテルで１回洗浄し、その後、４０℃で真空乾燥したものをSample F2とした。

得られた分子量１万以上の多糖体からなる非濾過画分CP（F1）と、分子量１万未満の多糖体からなる濾過画分F2を、それぞれ生理食塩水に溶解させ、１１５℃で１０分間高圧滅菌して使用した。

２．交叉免疫電気泳動法による補体第３成分（Ｃ３）活性能の測定

補体第３成分（Ｃ３）の免疫電気泳動像の変化を捉えることにより、補体第３成分活性能を測定した。

血清0.2 mlを分注した蓋付き遠心管 (2ml)に前記CP（分子量１万以上の多糖体からなる非濾過画分） 300μgを加え、陰性対照としてdextran 300μg、陽性対照としてカワラタケ由来のATSO 300μgを用い、native C3とconverted C3の泳動パターンを、交叉免疫電気泳動法により測定した。

ATSOは、β-1,3グルコシド結合をもつ直鎖のグルコース残基３個に対して、１個の割合で１分子のグルコースがβ-1,6グルコシド結合を介して分岐する抗腫瘍性グルカンである。

その結果、図１に示すように、ATSOとCPでは電気泳動パターンに大きな変化が認められ、三峰性を示し（＋）側に易動するのに対して、陰性対照のdextranでは泳動パターンに変化が認められず、classical及びalternative pathway におけるいずれの補体活性も認められなかった。

また、前記分子量１万未満の濾液画分（F2）も陰性対照と同様の泳動パターンを示した。

以上の結果より、クロレラの細胞壁破砕物から熱水で抽出された分子量１万以上の多糖体が補体第３成分活性化効果を発揮することが明らかとなった。

すなわち、alternative pathwayの活性化因子であるB因子（C3 proactivator, GBG）は、D因子（C3 proactivator convertase）により活性化されてBb（C3 activator, GGG）になり、泳動度がβ領域からγ領域に変化し、図１に示すようにCPやATSOを加えた場合、β₁-Aのピークが低下し、β₁-Cのピークが上昇した。

補体活性化経路としては、classical pathway（古典経路）といわれるC1→C4→C2→C3→C5→ C6→C7→C8→C9の順で活性化する経路と、alternative pathway（補体第２経路）といわれるC1, C4, C2を活性化することなく、C3以降のC5→C6→C7→C8→C9を活性化する経路が知られている。

補体第１成分のC1は、C1q, C1r, C1sの３つの成分がCa²⁺を介して結合した複合体である。そこでキレート試薬EGTA［エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）N, N, N', N'−四酢酸］10 mM 存在下で電気泳動を行っても同様の泳動パターンが認められることより、CP、ATSOはalternative pathwayに働き、補体C3を活性化したことが明らかになった。

CPは病原微生物による感染防御の面からも生体に有利に働くことが推定される。

Claims

クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から熱水で抽出したものを濾過することにより分子量１万未満のものを除いた多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤を製造する方法。
上記補体第３成分活性化剤が補体を活性化する経路が補体第２経路である請求項１記載の製造方法。
クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から９５乃至１００℃の熱水で抽出するものである請求項１又は２記載の製造方法。
上記濾過が、分画分子量１００００のフィルターでの限外濾過である請求項１乃至３の何れか１項に記載の製造方法。
上記補体第３成分活性化剤が経口投与剤である請求項１乃至４の何れか１項に記載の製造方法。