JP2019107028A - Lgr5+体性幹細胞 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
Description
本出願は、2012年12月6日に出願された米国仮出願第61/734,106号に
基づいて優先権を主張し、その内容が、全体として参照により本明細書に組込まれる。
幹細胞は、インビボまたはインビトロで、多くのまたは全ての細胞系列へと分化され得
る、多能性(pluripotent)、または全能性(totipotent)の細胞
である。その多能性により、胚性幹(embryonic stem)(ES)細胞は、
変性性(degenerative)または遺伝した疾患を治療するための、偉大な見込
みを有している。それでもなお、道徳的配慮は、ヒトES細胞の使用を妨げている。非胚
性由来の幹細胞は、この障害を回避するであろう。これらの成体幹細胞は、分化について
、ES細胞がするのと同じ能力(capability)を有している。
nt)成体前駆細胞が単離されている。髄単離された成体多系列誘導細胞(marrow
−isolated adult multi−lineage inducible
cell)および骨髄由来の単一細胞クローンを含む細胞の他の型も、分化について同じ
マルチ潜在的能力(multi−potential)を有している。そのような多分化
能体細胞は、獲得し、培養し、および拡張する(expand)ことが困難である。
1つ以上の実施形態の詳細が、以下の説明で明らかにされている。
5陽性である、単離された体性幹細胞が提供される。
組織試料を対象から得る工程、前記試料が上層と下層とに分離されるまで、容器内でED
TAまたはヘパリンと共に前記試料をインキュベートする工程、前記上層を回収する工程
、および、2マイクロメートル以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr
5+である体性幹細胞の集団を前記上層から単離する工程を含む。
異なる対象から得られた血液または骨髄試料から上記の方法により調製されてなる、細胞
バンクが記載される。
疾患または状態は、筋変性疾患、神経変性疾患、筋損傷、癌、または自己免疫疾患である
。上述した方法によって調製された体性幹細胞の有効量が、それを必要とする対象に投与
され得る。
目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。
6.0μm未満のサイズの成体幹細胞であり、CD9について染色陽性、すなわちCD
9+であるSB−1細胞、およびCD9−細胞を含む、SB細胞が本明細書に記載される
。US2012/0034194を参照。CD9−細胞集団のうち、2.0マイクロメー
トル以上6.0マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+である細胞の、珍
しい亜集団である。Lgr5+SB細胞はまた、CD133−、CD66e−、Sox2
−、CD4−、CD8−、CD9−、CD10−、CD11−、CD16−、CD17−
、CD18−、CD19−、CD20−、CD21−、CD31−、CD42−、CD6
3−、CD34−、Lin−、CD38−、CD90−、CD45−およびCD349−
であるだけでなく、Oct4+およびNanog+である。
Lgr5+SB細胞は、3つの胚芽期の胚葉、すなわち外胚葉、内胚葉および中胚葉、と
関連する細胞型へと分化され得る。一実施形態において、細胞は、非接着性である。した
がって、様々な変性疾患または組織損傷の治療において、分化した機能的な細胞を再生す
るために使用され得る。以下の実施例に示されるように、集団は、インビトロで容易に調
製され、維持されおよび拡張され、ならびにルーチンの技術的アプローチを用いて分化へ
誘導され得る。また、動物対象(例えば、マウス)へと集団中の幹細胞を移植した後、悪
性増殖の証拠が無い。正常な染色体対を含み、これらの幹細胞は系列未決定であり(li
neage−uncommitted)、身体の全ての体細胞(非生殖細胞)を形成し得
る。それらはまた、生殖配偶子***および/または卵子、ならびに胎盤のうち胚および胎
児の部分の細胞および組織を形成し得る。これらの幹細胞は、系列誘導剤(lineag
e−induction agents)、増殖剤および分化抑制剤に応答する。これら
の利点により、それらは、他の幹細胞の代替となる。
の多数に分化することができる細胞を指す。全能性幹細胞は、典型的には、任意の細胞型
に発達する潜在的能力(capacity)を有する。全能性幹細胞は、起源が胚性およ
び非胚性の両方であり得る。多能性細胞は、典型的には、いくつかの異なる最終分化した
細胞型へと分化することができる細胞である。単能性幹細胞はただ一つの細胞型を産生し
得るが、非幹細胞からそれらを区別する自己複製の性質を有する。これらの幹細胞は、血
液、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺等を含む、種々の組織または器
官系に由来し得る。
e)である。用語「実質的に純粋」は、幹細胞またはそれに由来する細胞(例えば、分化
した細胞)に関して使用されるときは、指定された細胞が、調製物(preparati
on)中の細胞の大部分(すなわち、20%、30%、40%、50%、60%、70%
、80%、90%、または95%を超える)を構成することを意味する。一般に、実質的
に精製された細胞の集団は、調製物中の細胞の少なくとも約70%、通常は調製物中の細
胞の約80%、特には調製物中の細胞の少なくとも約90%(例えば、95%、97%、
99%または100%)を構成する。このように、本明細書に記載される方法は、Lgr
5+SB細胞の実質的に純粋な集団が、他の細胞型によって汚染されることなく得られる
、という利点を提供する。
の例としては、これらに限定されないが、非ヒト霊長類、イヌ、げっ歯類、モルモット、
ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタが挙げられる。つまり、Lgr5+SB細胞の供
給源は、ペット動物、家畜、実験動物、および疾患モデル動物を含む。一実施形態におい
て、Lgr5+SB細胞はヒトから単離される。
る。一実施形態において、Lgr5+SB細胞は血液から単離される。好ましい実施形態
では、血液ドナーはヒトである。
層と下層とに分離されるまで、組織試料中の細胞は、二価カチオンキレート剤(例えば、
EDTA、EGTA、およびクエン酸ナトリウム)またはヘパリンと共に、容器内でイン
キュベートされる。インキュベーションは、4℃の温度で6〜48時間行われ得る。好ま
しくは、インキュベーションは、4℃で48時間行われる。
以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+である体性幹細胞の集団が
、この上層から単離される。
およびフィルタリング)または細胞表面マーカーに基づくもの(例えば、フローサイトメ
トリー)によって行われ得る。
われることができ、かつ、回収する工程と単離する工程との間で、回収された上層がED
TAと共にインキュベートされ得る。
微粒子が沈殿するようにADPと共にインキュベートすることを含むことができる。さら
に、それはまた、幹細胞の細胞周期をG0からG1へと活性化するため、ヘパリン処理し
た試料から得られた上層を二価カチオンキレート剤とインキュベートすることを含むこと
ができる。
とインキュベートする工程との間に、細胞外マトリックスから個々の細胞を放出するため
にコラゲナーゼで組織試料を消化することを含むことができる。
.0μm以上6.0μm未満、例えば2.0〜5.0μmの間である懸濁液中の細胞のサ
イズ;および(2)細胞表面マーカー、を含む多くの特徴を、調べることができる。Lg
r5などの細胞表面マーカーに対する抗体が使用され得る。これらは、フルオレセインイ
ソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、または量子ドットなどの、
適切な標識と結合させられ得る。Lgr5+SB細胞は、フローサイトメトリーを用いて
さらに濃縮され得る。
+SB幹細胞の分化能を確認するため、本技術分野で公知の方法によって、それらは、例
えば、神経膠細胞、骨細胞、および脂肪細胞を形成するように誘導され得る。例えば、こ
れらの細胞は継代され(passed)、コンフルエンスまで培養され、骨形成培地また
は脂肪生成培地に交換され、および適切な期間(例えば、3週間)インキュベートされ得
る。骨形成についての分化能は、フォン・コッサ染色によって可視化され得るカルシウム
蓄積の鉱化、によって評価される。脂肪細胞への分化を調べるため、細胞内の脂肪滴がオ
イルレッドOにより染色され、顕微鏡下で観察され得る。神経分化については、これらの
細胞は、適切な時間(例えば、7日)神経原性(neurogenic)培地中でインキ
ュベートされ、次いで、血清枯渇およびβ−メルカプトエタノールのインキュベーション
に供され得る。分化後、それらは、ネットワークへと配置された拡張した神経突起様構造
を有する屈折性細胞体の形態を呈する。系列特異的マーカーのRT PCRおよび免疫細
胞化学染色が、神経分化を確認するためにさらに行われる。マーカーの例は、ニューロン
特異的クラスIIIβチューブリン(Tuj−1)、ニューロフィラメント、およびGF
APを含む。
剤(EDTA)に応答して迅速に増殖する、という発見を利用し得る。この目的のために
、単離した細胞を、例えばEDTAと共に培養することができる。その状態で、Lgr5
+SB細胞は増殖する。
ロンへと分化する能力の変化について、兆候無しで、10、20、50または100を超
える集団倍加(population doublings)のため、非分化培地培養中
(non−differentiating medium culture)でさらに
増殖させられ得る。これらの幹細胞は、使用前に標準的な方法によって保存され得る。
ion)」および「拡張(expansion)」は、***による同じ型の細胞の数の増
加を指す。用語「分化」は、例えば、最初の細胞型のものとは異なる1つ以上の形態的特
徴および/または機能を細胞が獲得する、特定の機能のために特殊化された細胞になる発
達過程を指す。用語「分化」は、系列決定(lineage commitment)お
よび最終分化過程の両方を含む。分化は、例えば、免疫組織化学または当業者に公知の他
の手順を用いて、系列マーカーの存在または非存在をモニターすることにより、評価され
てもよい。前駆細胞に由来する分化した子孫細胞は、必ずとは言えないが、幹細胞の供給
源組織と同じ胚葉または組織に関連することもある。例えば、神経前駆細胞および筋肉前
駆細胞は、造血細胞系列に分化することができる。
on)」は、分化した細胞型の特に限定された範囲を形成することが決定された前駆細胞
を幹細胞が生じる、幹細胞が経る過程を指す。決定された前駆細胞は、しばしば、自己複
製または細胞***が可能である。
した、完全に分化した細胞への細胞の最後の分化を指す。例えば、神経前駆細胞および筋
肉前駆細胞は造血細胞系列に分化することができ、その最終分化は特定の細胞型の成熟血
液細胞に至る。通常、最終分化は、細胞周期からの離脱および増殖の停止と関連している
。本明細書で使用される用語「前駆細胞」は、特定の細胞系列に決定され、一連の細胞分
裂によりこの系列の細胞を生じる細胞を指す。前駆細胞の例は、ただ1つの細胞の型のみ
に分化することができるが、それ自体は完全には成熟しまたは完全には分化していない、
筋芽細胞であろう。
Lgr5+SB細胞の複数の集団は、細胞バンクを生成するために使用され得る。集団
は、上述した方法により異なる対象から、体液試料、例えば血液および骨髄から、別々に
調製される。バンクまたはライブラリー内のLgr5+SB細胞集団は、健常者または公
知の病状もしくは病徴を有する対象に由来し得る。これらの幹細胞は、ヒト細胞または非
ヒト細胞であり得る。
1つの所定の特徴をそれぞれについて得るためにLgr5+SB細胞集団を特徴付けるこ
と、および前記少なくとも1つの所定の特徴に従ってLgr5+SB細胞集団のそれぞれ
をカタログ化することにより製造され得る。特徴の例としては、対象者の名前、性別、身
体的状態(遺伝的障害およびMHC情報を含む)が挙げられる。バンクを製造するために
、Lgr5+SB細胞集団をさらに拡張し得る。
され得る。幹細胞から分化した細胞の例としては、脳細胞、ニューロン、アストロサイト
、グリア細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、膵島細胞、脂肪細胞、心臓細胞、肝
細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、および眼細胞が挙げられる。対象は、ヒトまたはヒト以
外の脊椎動物であってもよい。幹細胞は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシ、ブタなどのよう
な、任意の哺乳動物に由来し得る。
、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの疾患状態、または遺伝子型情報(例えば
、遺伝子に関連する特定の核酸配列の単一有核多型(SNPs)、またはゲノムもしくは
ミトコンドリアDNA)を含む所定の特徴に従って、カタログ化される。幹細胞を生存さ
せおよび機能させ続けるために、細胞は、適切な条件下で(典型的には凍結により)保存
される。カタログ化することは、限定されるものではないが、まとめられた記録文書、ま
たは情報が入力されたコンピュータデータベースのような、各細胞集団について得られた
特徴の集約された記録を作成することを構成してもよい。本質的には、この実施形態は、
幹細胞バンクの作製に関する。幹細胞バンクは、複数の試料から、ユーザーのニーズに適
した特定の幹細胞試料の選択を容易にする。従って、本発明の別の実施形態は、別々の供
給源から得られた複数の幹細胞試料を含み、少なくとも1つの所定の特徴に従って特徴付
けられおよびカタログ化された、幹細胞バンクに関する。さらなる実施形態は、複数の供
給源から幹細胞試料を回収すること;少なくとも1つの所定の特徴に従って試料をカタロ
グ化すること、および細胞を生存させ続ける条件下で細胞を保存することを含む、幹細胞
バンクを確立する方法に関する。
なくとも一つの処理モジュール、ディスプレイ、および各幹細胞集団についての少なくと
も1つの特徴の情報を含む記憶媒体を含むデータベースコンピュータ;ならびにユーザー
による指示により前記ディスプレイ上に前記情報が閲覧可能なようにするための少なくと
も1つのプログラム・コード・モジュール、を含む幹細胞バンク化システムは、本発明の
範囲内である。特定の実施形態において、本発明は、幹細胞集団が疾患状態を有する対象
から得られた幹細胞を有する、幹細胞バンク化システムを特徴とする。疾患状態は、上述
の変性疾患を含んでもよい。Lgr5+SB細胞集団は異なる疾患を有する異なる対象か
ら採取され、幹細胞が特徴付けられる。特徴(複数可)は、データベースコンピュータへ
と入力される。加えてまたは代替的に、細胞は、疾患状態と必ずしも関連付けられていな
い特定の表現型に基づいて特徴付けられる。例えば、肝細胞は、カフェイン、アルコール
、薬剤などのような特定の化合物を代謝するその能力に基づき、そのような異なる代謝能
力の遺伝的基礎またはそれらに関連する基礎となる生理学を研究するために、特徴付けら
れることができる。細胞の他の型は、機能的および/または形態的表現型に基づいて特徴
付けられることができる。
ターまたは他の遺伝物質の導入によって、分化または脱分化に影響を与える条件に供され
てもよい。脱分化は、分化程度が低い細胞の性質を呈するような、細胞の操作を含む。
治療するために使用されてもよい薬剤または化合物をスクリーニングするために使用され
得る。ライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適しており、特定の対象のた
めに特に有効な薬剤を同定するために有用である。ハイスループットスクリーニングのた
めには、幹細胞は、マルチウェルプレートもしくはガラススライドのウェル内またはマイ
クロチップに導入されることができ、試験薬剤と接触させられ得る。細胞および溶液を操
作するために、ならびに、検査されている機能に関して特に、細胞をモニターするために
、ロボットが都合良く使用されるよう、一般的には、細胞は整列して、特にアドレス可能
に整列して編成される。ハイスループット形式を使用する利点は、多数の試験薬剤が並列
に検査されることができ、および、所望により、試験条件と同一の条件下で対照反応も実
行され得ることである。このようにして、本発明のスクリーニング方法は、例えば細胞が
所望の細胞型に分化するように誘導する薬剤のような、幹細胞の機能を変化させることが
できる薬剤、または、例えば制御分子の発現のレベルを高く維持することで自発的分化を
防止する薬剤を同定する目的で、1つの、いくつかのまたは多数の試験薬剤をスクリーニ
ングする手段を提供する。
上記の幹細胞は、移植のための組織適合ドナー細胞または組織を生成するために遺伝的
に操作され得る。より具体的には、本明細書に記載の幹細胞は、MHCクラスII分子を
その表面上に発現しないように遺伝的に操作され得る。より好ましくは、細胞は、実質的
に全ての細胞表面クラスIおよびクラスII MHC分子を発現しないように、操作され
る。本明細書で使用される用語「発現しない」とは、応答を誘発するには不十分な量が細
胞の表面に発現されること、または発現されるタンパク質が欠損しているため応答を誘発
しないことのいずれかを、意味する。
ラスII HLA DP、DQおよびDR、ならびにそのサブクラスを意味する。この用
語は一般に、ヒトMHCに特異的なものとして解釈されるが、本明細書ではドナー細胞種
からの同等のMHC遺伝子を含むことが意図され、例えば、細胞がブタ由来のものである
場合、用語HLAは、同等のブタMHC分子、MHC IまたはIIのいずれかを指すで
あろう。クラスII MHC分子が除去されると、CD4+T細胞は、遺伝的に操作され
た内皮細胞を認識せず;クラスIおよびクラスII MHC分子の両方が除去されると、
CD4+やCD8+細胞はいずれも改変された細胞を認識しない。
胞表面への輸送、ならびに抗原ペプチドの装填に機能する内因性の不変鎖遺伝子を破壊す
ること、ならびに2)すべてのクラスI MHC分子の細胞表面発現に必要なタンパク質
をコードする内因性β2−ミクログロブリン遺伝子(β2Μ遺伝子)を破壊することを含
む。あるいは、単に不変鎖遺伝子が破壊されている。不変鎖は、抗原性ペプチド断片のM
HCクラスII分子への挿入のために必要であると考えられている。併せて、抗原ペプチ
ドとMHCは、T細胞によって認識される。抗原性ペプチドの非存在下では、T細胞認識
は通常得られず、また、MHCクラスII分子は適切に折り畳まれない。したがって、不
変鎖を欠く細胞においては、ペプチドの提示が廃止され、細胞表面MHCの微小量が得ら
れたとしても、それらはペプチドを欠き、それゆえ非免疫原性であり得る。
これらの技術は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第6,916,654号およ
び6,986,887号を参照。
上述したLgr5+SB幹細胞は、細胞型と関連付けられた疾患を治療するために薬物
が有用であり得ることを示す方法において、特定の細胞型に影響を与え得る薬剤を同定す
るためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、疾患(例えば、変性疾
患)を治療するための医薬候補を同定するための方法において、幹細胞を使用することが
できる。前記方法は、試験化合物を幹細胞と接触させる工程、および病気においてダウン
レギュレートされるポリペプチドの発現レベルを測定する工程を含む。試験化合物の存在
下での発現レベルが、化合物の非存在下のときよりも高い場合、化合物が病気を治療する
ための候補であることを示す。病気の例としては、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、癌、
または自己免疫疾患が挙げられる。発現レベルは、mRNAレベルまたはタンパク質レベ
ルのいずれかで測定され得る。
集団における未分化細胞の機能を変化させる薬剤を同定するための方法に関する。試験薬
剤の非存在下の機能と比較した場合に、試験薬剤の存在下で細胞の機能または遺伝子発現
が変化することは、試験薬剤が細胞の機能または細胞内での遺伝子発現を変化させる薬剤
であることを示している。用語「試験薬剤」は、細胞の機能または細胞内での遺伝子発現
を変化させる能力について調べられている任意の分子を指す。方法は、一般に、所望の活
性を有するそれまで非公知の分子を同定するためのスクリーニングアッセイとして使用さ
れるが、本発明のスクリーニング方法はまた、特定の活性を有することが知られている薬
剤を確認するために使用され得る。
剤は、発現した遺伝子の発現レベルを増加させもしくは減少させることによって、または
細胞内で発現していない遺伝子を発現させる(例えば、系列特異的抗原の発現を誘導する
)ことによって、機能を変えることができる。
って分化した細胞を産生するものである。そのような分化した細胞は、多分化能ヒト幹細
胞(例えば、造血幹細胞)であってもよく、または最終的な分化細胞(例えば、筋細胞、
神経細胞、血液細胞、結合組織、および上皮細胞)であってもよい。このように、本方法
は、膵臓ベータ細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、または任意の他の細胞型を含む最
終的な分化細胞へ、Lgr5+SB細胞集団における幹細胞の分化を誘導する薬剤を同定
するため、使用され得る。このようにして同定された薬剤または化合物は、変性疾患、癌
、または免疫疾患を治療するために使用され得る。
料中のmRNAレベルを測定する方法は、本分野で周知である。mRNAレベルを測定す
るため、細胞は溶解されてもよく、溶解物中のmRNAのレベルは、精製されたか否かを
問わず、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ(検出可能に標識された遺伝子特異的
DNAまたはRNAプローブを使用する)、および定量的または半定量的RT−PCR(
適切な遺伝子特異的プライマーを使用する)によって測定され得る。あるいは、定量的ま
たは半定量的インサイチュハイブリダイゼーションアッセイが、検出可能に(例えば、蛍
光または酵素)標識されたDNAまたはRNAプローブを用いて、組織切片または非溶解
細胞懸濁物に対して実施され得る。追加のmRNA定量化方法は、RNAプロテクション
アッセイ(RPA)法および遺伝子発現の連続分析(serial analysis
of gene expression、SAGE)法だけでなく、アレイ−ベースの技
術を含む。
つかは、標的タンパク質に特異的に結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体)を使用する。このようなアッセイでは、抗体そのものまたはそれに結
合する二次抗体は、検出可能に標識され得る。あるいは、抗体は、ビオチンと結合される
こともある。その存在は、検出可能に標識されたアビジン(ビオチンに結合するポリペプ
チド)によって測定され得る。これらのアプローチの組み合わせ(「多層サンドイッチ」
アッセイを含む)は、方法の感度を高めるために使用され得る。いくつかのタンパク質測
定アッセイ(例えば、ELISAまたはウェスタンブロット)が体液または細胞の溶解物
に適用されることができ、および他のもの(例えば、免疫組織学的方法または蛍光フロー
サイトメトリー)が組織切片または非溶解細胞懸濁に適用されることができる。適切な標
識は、放射性核種(例えば、125I、131I、35S、3H、または32P)、酵素
(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ま
たはβ−ガラクトシダーゼ)、蛍光/発光剤(例えば、フルオレセイン、ローダミン、フ
ィコエリトリン、GFP、BFP、およびナノ粒子(例えば、クァンタム ドット コー
ポレーション(Quantum Dot Corporation),パロアルト,カリ
フォルニア州,から供給されるQdot(登録商標)))を含む。他の適用可能な方法は
、定量的免疫沈降および補体結合アッセイを含む。
ニル性ペプトイド(vinylogous peptoids)のようなペプトイド、小
型有機分子などの、任意の型の分子であってもよく、Lgr5+SB細胞集団中の幹細胞
の機能を変化させる様々な方法のいずれかで作用し得る。例えば、試験薬剤は、細胞によ
って発現される細胞表面受容体に結合することによって細胞外で作用することができ、そ
れにより、一般的には受容体に結合して受容体を介して作用するリガンドの結合によって
仲介される機能を、変化させる。あるいは、試験薬剤は、受動的にまたは能動輸送機構の
いずれかを介して細胞膜を横断し、機能を変化させるために細胞内で作用するものであっ
てもよい。
、約3〜4残基から数百または数千にまで変化しうる。ペプチド試験薬剤は、化学合成に
よって、もしくは、タンパク質精製に続いてタンパク質分解、および所望であればクロマ
トグラフィーもしくは電気泳動法による更なる精製の方法を用いて調製されてもよく、ま
たは、コードするポリヌクレオチドから発現されてもよい。ペプチド試験薬剤は、公知の
ペプチド、例えば天然に存在するペプチドに基づくものでもよいが、例えば、1つ以上の
アミノ酸類似体を含むことで天然に存在する配列と異なっていてもよい。
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列であり得る。これは、遺伝子ま
たはその一部、cDNA、RNAi薬剤、合成ポリデオキシ−リボ核酸配列などのRNA
またはDNAであってもよく、および、一本鎖または二本鎖のみならずDNA/RNAハ
イブリッドであってもよい。これは、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子だけ
でなく、例えば、化学合成法やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などによる酵素的方法に
よって調製され得る合成分子であってもよい。様々な実施形態において、本発明のポリヌ
クレオチドは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド類似体、またはホスホジエステル結合
以外の骨格結合を含み得る。ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチド(Pagrat
is et al.,Nature Biotechnol. 15:68−73,19
97)のように、そのようなヌクレオチド類似体は本技術分野で周知であり、市販されて
いる。
法を用いてLgr5+SB細胞集団中の幹細胞と接触させられ、またはLgr5+SB細
胞集団中の幹細胞へと導入され得る。一般に、必ずではないが、ポリヌクレオチドは細胞
に導入され、直接的にその機能に対して、またはこれに続く転写もしくは翻訳もしくは両
方に対して影響を与える。例えば、細胞内で発現させられて細胞の機能を変化させるペプ
チド試験薬剤を、ポリヌクレオチドはコードしてもよい。ポリヌクレオチド試験薬剤はま
た、1つ以上の特定の標的核酸分子を標的化するように設計され得るアンチセンス分子、
リボザイムまたは三重らせん化剤(triplexing agent)であってもよく
、またはこれらをコードしてもよい。
プチド模倣物、ペプトイド、抗体、低分子、または他の薬)は、本分野で公知のコンビナ
トリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて入手され得る。こ
のようなライブラリーとしては:ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー(ペプ
チドの機能性を有するが、酵素分解に抵抗性がある新規な非ペプチド骨格を有する分子の
ライブラリー);空間的にアドレス可能(spatially addressable
)な並列固相または液相ライブラリー;デコンボリューションまたはアフィニティークロ
マトグラフィー選別によって得られる合成ライブラリー;および、「1ビーズ1化合物」
ライブラリー、が挙げられる。Lam,1997,Anticancer Drug D
es. 12:145、を参照。分子ライブラリーの合成方法の例は、例えばAngew
.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2061;および、Gallop et
al.,1994 J.Med.Chem. 37:1233、において見出され得る
。化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten,1992,Biote
chniques 13:412−421)、またはビーズ上(Lam,1991,Na
ture 354:82−84)、チップ上(Fodor,1993,Nature 3
64:555−556)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特
許第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al.,1992,PN
AS USA 89:1865−1869)、もしくはファージ上(Felici 19
91,J.Mol.Biol. 222:301−310;および米国特許第5,223
,409号)に示されても良い。
変性性または遺伝性疾患を治療するために、本明細書に開示されたLgr5+SB細胞
を使用することができる。
欠くような患者から、Lgr5+SB細胞集団を単離することができる。次いで、遺伝子
の機能的なバージョンをコードする発現核酸ベクターを、Lgr5+SB細胞集団中の幹
細胞へと導入することができる。ベクターは、リン酸カルシウム共沈殿、DEAE−デキ
ストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイ
クロインジェクション、またはウイルス媒介技術を含む、様々な技術を介して幹細胞に導
入され得る。細胞の多能性に影響を与えない方法が好ましい。そのような技術の説明は、
例えば、米国特許第7,422,736号および5,591,625号に見出され得る。
幹細胞へ機能的な遺伝子を輸送した後、本技術分野で公知の方法を用いて患者へそれらを
移植して戻すことができる。幹細胞は患者から製造されるので、治療は免疫拒絶反応を引
き起こさない。
sal)ドナー細胞を作製することができる。万能ドナー細胞を作製する方法は本技術分
野で知られており、Lgr5+SB細胞集団から万能多能性幹細胞を作製するための方法
が、以下に説明される。
できる。この発達を促すために、患者は、細胞の発達を誘導する因子が投与されてもよい
。このような因子は、低分子化合物、ペプチド、および核酸でありえる。例としては、制
限されるものではないが、トランスフォーミング成長因子β、骨形成タンパク質、および
神経成長因子が挙げられる。
ために有用である。そのような細胞をモデル系として用い、全能性多能性幹細胞の発達を
特定の組織または臓器に誘導する条件を、同定することができる。さらに、本技術分野で
公知のディファレンシャルcDNAスクリーニングを用いて、発達の間に役割を果たして
いる遺伝子を単離することができる。例えば、上記の神経グリア細胞系列のような特定の
系列に発達するように誘導された細胞から、cDNAライブラリーを調製することができ
る。ライブラリーは、次いで、差次的に発現される遺伝子を単離および研究するために使
用され得る。これらの単離された遺伝子はさらに、個別のプロセスにおけるそれらの役割
を明らかにするために研究され得る。関連技術は、本技術分野で知られている。例えば、
米国特許第7,422,736号を参照。多能性幹細胞はまた、本技術分野で公知の方法
を用いて動物の臓器またはクローンへと発達させるために使用され得る。従って、これら
の細胞は、ペットおよび家畜産業にとって有益であり、絶滅危惧動物を保持するために使
用され得る。
方法は、上述したLgr5+SB幹細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するこ
とを含む。一実施形態では、これらの細胞のうちの少なくとも一つは、組換え核酸を含む
ことができる。組換え核酸はポリペプチドをコードすることができ、幹細胞は、ポリペプ
チドをコードするmRNAを含むことができる。変性疾患は、例えば、糖尿病、神経変性
疾患、および関節炎であり得る。神経変性疾患の例としては、パーキンソン病、アルツハ
イマー病、ハンチントン病、およびALSが挙げられる。
技術によって同定され得る。「治療すること(treating)」は、その疾患を罹患
しているか発症するリスクがある対象へ、疾患、疾患の症状、疾患に続発する病状、また
はダメージ/疾患に対する素因を、治癒させ、和らげ、緩和させ、治療し、発症を遅らせ
、予防し、または改善する目的での、組成物(例えば、細胞組成物)の投与を指す。「有
効量」とは、治療される対象において医学的に望ましい結果を生じさせることができる、
組成物の量を指す。治療方法は、単独で、または他の薬もしくは療法と組み合わせて行わ
れ得る。
けるもの)、正常な身体の摩耗、またはライフスタイルの選択により、影響を受けた組織
または器官の機能または構造が、時間をかけて漸進的に悪化する疾患を指す。変性疾患の
例としては、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン
病、多発性硬化症およびALS);他の神経系障害(例えば、横断性脊髄炎、脳または脊
髄への外傷後に生じる脱髄、急性脳損傷、頭部外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷、虚血性脳
損傷、CNSの遺伝性ミエリン障害、てんかん、周生期仮死、仮死、酸素欠乏症、てんか
ん重積症、シャイ−ドレーガー症候群、自閉症、および脳卒中);筋変性疾患(例えば、
筋ジストロフィー、線維筋痛、ミオパチー、皮膚筋炎、多発性筋炎、横紋筋融解症、およ
び心筋炎);癌もしくは抗癌治療(例えば、化学療法)から生じる症状;代謝性疾患(例
えば、糖尿病(diabetes)/糖尿病(diabetes mellitus)お
よびニーマンピック病);自己免疫または炎症関連疾患(例えば、エリテマトーデス、炎
症性腸疾患(IBD)、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、狼瘡、糖尿
病、および喘息);眼障害(例えば、緑内障、網膜色素変性症、ノリエ病、および黄斑変
性症);心臓および循環器疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症、心不全、心筋梗塞、
および心血管疾患);血液疾患(例えば、ウィスコット−アルドリッチ症候群);消化器
疾患;腎臓疾患;肝臓疾患;肺疾患、副腎疾患(例えば、アジソン病);傷害から生じる
症状(例えば、熱傷、脳卒中、軽傷を含むダメージを受けた組織、加齢ダメージを受けた
細胞、および加齢ダメージを受けた組織);老化に関連する症状(例えば、男性型脱毛お
よび円形脱毛症を含む脱毛);ウイルス症状(例えば、C型肝炎感染および後天的免疫不
全症);ならびに、疾患に関連する徴候および/または症状を回復させ、再生させ、そう
でなかったら改善するために臓器移植または幹細胞が使用され得る任意の他の疾患、を含
む。本発明の方法は、***不全の治療、および形成外科手術または女性のための***移植
に用いられ得る。
における疾患の症状を緩和する方法が本明細書に記載される。この方法は、脳組織ダメー
ジを罹患しているまたは発症するリスクがある対象を同定することを含む。対象は、ヒト
、または例えばネコ、イヌもしくはウマなどの非ヒト哺乳動物であり得る。脳組織ダメー
ジの例としては、脳虚血(例えば、慢性脳卒中)または神経変性疾患(例えば、パーキン
ソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳疾患、およびハンチントン病)によって引き起こさ
れるものが挙げられる。治療される対象は、関心のある症状または疾患を診断するための
標準的な技術によって同定され得る。治療方法は、上述した幹細胞または活性薬剤/化合
物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを伴う。
血管新生を促進する有効性を確認するためには、コンピュータ断層撮影(CT)、ドップ
ラー超音波イメージング(DUI)、磁気共鳴イメージング(MRI)、およびプロトン
磁気共鳴分光法(1H−MRS)のような、標準的な脳画像化技術により、治療前後の対
象を検査することができる。例えば、1H−MRSは、脳の代謝活性に関する生化学的情
報を得るための、非侵襲的手段を表す(Lu et al., 1997,Magn.R
eson.Med. 37,18−23)。この技術は、幹細胞移植の有無による脳虚血
に関与する代謝変化を評価するために、適用され得る。例えば、それは、ニューロンの完
全性のマーカーであるN−アセチルアスパラギン酸(NAA)の脳内濃度を調べるために
、使用され得る。神経破片(neuronal debris)におけるNAAの再分配
および捕捉は、定量神経マーカーとしてのその使用を制限するが、脳虚血における脳NA
A濃度の減少は神経損失(neuronal loss)または機能不全の指標と考えら
れ得る(Demougeot et al., 2004,J.Neurochem.
90,776−83)。したがって、1H−MRSにより測定されるNAAレベルは、脳
虚血後の幹細胞移植の効果を追跡するために有用な指標である。
本明細書に記載の幹細胞は、外因性の組換えポリペプチドを発現するために使用され得
る。従って、組換え核酸を含むような幹細胞は、本発明の範囲内である。組換え核酸はポ
リペプチドをコードすることができ、幹細胞は、ポリペプチドをコードするmRNAを含
むことができる。
球媒介性反応を誘発するクラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)遺伝子によってコ
ードされる1つ以上のタンパク質を発現しないように、これらの幹細胞は遺伝的に操作さ
れ得る。これらの細胞は移植片の宿主拒絶に至らないので、万能ドナー細胞として使用さ
れ得る。
法は、上述した幹細胞を得る工程において、幹細胞の少なくとも1つがヘテロ核酸を含み
、およびそれを必要とする対象に細胞を投与することを含む。ヘテロ核酸は、ポリペプチ
ドをコードすることができる。
して使用される場合は、天然で互いに同じ関係(realtionship)で見出され
ない2つ以上の部分配列を含む、核酸を指す。例として、組換え的に作製される核酸は、
典型的には、新たな機能的核酸を作るために合成的に配置された、無関係の遺伝子由来の
2つ以上の配列を有し、例えば、1つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来
のコード領域である。2つの核酸は、それゆえ、この文脈において互いにヘテロである。
細胞に添加されると、組換え核酸はまた、細胞の内在性遺伝子に対してヘテロであろう。
従って、染色体において、ヘテロ核酸は、染色体に組み込まれた非天然(非自然的に発生
する(non−naturally occurring))核酸、または非天然(非自
然的に発生する)染色体外核酸を含むであろう。一方、自然に転座した染色体の一部は、
変異細胞にとって天然な内因性核酸配列を含むため、本特許出願の文脈においてヘテロと
はみなされないであろう。同様に、ヘテロタンパク質は、天然で互いに同じ関係で見出さ
れない、2つ以上の部分配列を含むタンパク質(例えば、2つの部分配列が単一の核酸配
列によってコードされる「融合タンパク質」)を示す。このようなタンパク質は、組換え
技術によって生成され得る。
はベクターに関して用いられる場合は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、ヘテ
ロ核酸もしくはタンパク質の導入や、天然の核酸もしくはタンパク質の変化によって改変
されていること、または、細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。従
って、例えば、組換え細胞は、天然の(自然に発生する)形態の細胞の中には見出されな
い遺伝子を発現し、または、発現されたもしくは全く発現されない下で、そうでなかった
ら正常に発現されもしくは異常に発現する、天然の遺伝子の二次複製物(second
copy)を発現する。
る。遺伝子治療は、エキソビボ(ex vivo)およびインビボの両方の技術を含む。
具体的には、上述した幹細胞は、オリゴヌクレオチドモジュレータまたはモジュレータを
コードする核酸分子によってエキソビボで遺伝的に操作され、次いで、操作された細胞は
治療されるべき患者に提供されている。細胞培養物は、例えば、細胞を解離し(例えば、
機械的解離による)、薬学的に許容される担体(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)と細胞
を密接に混合することにより、患者への投与のために製剤化されてもよい。あるいは、細
胞は、適当な生体適合性サポート上で培養され、患者に移植されてもよい。操作された細
胞は、異種またはアロタイプ拒絶反応を回避するよう、特徴的には自己由来である。その
ようなエキソビボ法は、本分野で周知である。
より、操作され得る。例えば、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸分子は、「裸の(na
ked)」核酸分子(米国特許第5,679,647号)、もしくはサポニン(例えば、
米国特許第5,739,118号を参照)もしくはカチオン性ポリアミン(例えば、米国
特許第5,837,533号参照を参照)のような細胞による核酸分子の取り込みを促進
する1つ以上の他の薬剤との組成物に製剤化された核酸分子の直接注射により;微粒子衝
撃(microparticle bombardment)(例えば、「遺伝子銃」の
使用を介して;バイオリスティック(Biolistic),デュポン)により;脂質、
細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤によって核酸分子をコーティングするこ
とにより;リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル中に核酸分子をカプセル化する
ことにより;核に移行することが知られたペプチドに連結された核酸分子の投与により;
または、受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するために使用され得る、受容体媒介
エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結された核酸分子の投与により、投与されるこ
とができる。
破壊する融合性ウイルスペプチドをリガンドが含むように形成されてもよく;または、特
定の受容体を標的化することによって、インビボでの細胞特異的な取り込みおよび発現の
ために核酸分子が標的化されるように形成されてもよい。また、細胞核中へのアンチセン
スオリゴヌクレオチドの導入、発現および蓄積のための効率的な方法が米国特許第6,2
65,167号に記載されており、これは核内のセンスmRNAに対してアンチセンスオ
リゴヌクレオチドがハイブリダイズすることを可能にし、それゆえアンチセンスオリゴヌ
クレオチドが切断されたり細胞質に輸送されたりすることを防止する。本発明はまた、当
技術分野で公知の相同組換えによる発現のため、核酸分子の細胞内導入、続けて、宿主細
胞DNA内への取り込みを意図する。
した多数のベクターが、当技術分野で知られている(例えば、Viral Vector
s: Basic Science and Gene Therapy, Eaton
Publishing Co.(2000)を参照)。
精製方法は、迅速かつ簡単である。さらに、プラスミドDNAは、典型的には、宿主細胞
のゲノムに組み込まれないが、染色体組込みが起こすことがある遺伝毒性の問題を排除す
る別個の存在として、エピソームの位置に維持される。種々のプラスミドは、現在容易に
商業的に入手可能であり、特に哺乳動物システムで使用するように設計されている多くと
共に、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus su
btilis)由来のものを含む。本発明において使用され得るプラスミドの例としては
、限定されるものではないが、真核生物発現ベクターpRc/CMV(Invitrog
en)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMVおよびpAd/TR5
/GFPq(Massie et al.,(1998) Cytotechnolog
y 28:53−64)が挙げられる。例示的な実施形態では、プラスミドは、pRc/
CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB−NRC
)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB−NRC)、また
はPVAX(Invitrogen)である。
としては、制限されるものではないが、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するものが挙げられる。レトロウイルスベク
ターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは現在、インビボで、特にヒトへの、外来オリゴ
ヌクレオチドまたは遺伝子の移送のための選択肢である、組換え遺伝子輸送システムであ
る。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率的な輸送を提供し、輸送された核酸は、
宿主の染色体DNAに安定に組み込まれる。レトロウイルスの使用のための主要な必要条
件は、その使用の安全性を確保することであり、特に、細胞集団内での野生型ウイルスの
伝播の可能性に関するものである。レトロウイルスベクターが由来し得るレトロウイルス
としては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血
病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および
乳癌ウイルスが挙げられる。特定のレトロウイルスとしては、当業者に周知であるpLJ
、pZIP、pWEおよびpEMが挙げられる。
他の活性物質と共にまたは他の活性物質なしで上述のLgr5+SB細胞を含む医薬組
成物は、治療上の有効量の細胞または活性薬剤/化合物、および任意に他の活性物質を、
医薬的に許容される担体と混合することによって調製され得る。担体は、投与経路に応じ
て、様々な形態を採り得る。他の活性物質の例としては、既知のまたは上述のスクリーニ
ング方法により同定された活性化合物が挙げられる。
の賦形剤は、崩壊剤、溶媒、造粒剤、保湿剤、および結合剤と混合されてもよい。本明細
書で使用されるとき、用語「有効量(effective amount)」または「治
療上の有効量(therapeutically effective amount)
」は、特定の疾患の少なくとも1つの症状またはパラメータの測定可能な改善をもたらす
量を指す。上述した幹細胞の治療上の有効量は、当技術分野で公知の方法によって決定さ
れ得る。疾患を治療するための有効量は、当業者に公知の経験的方法によって容易に決定
され得る。患者に投与される正確な量は、疾患の状態および重症度、ならびに患者の体調
に応じて異なる。任意の症状またはパラメータの測定可能な改善は、当業者によって決定
され、または患者によって医師に報告され得る。上記の疾患の任意の症状またはパラメー
タの任意の臨床的または統計的に有意な減衰または改善は、本発明の範囲内であることが
理解されるであろう。臨床的に有意な減衰または改善は、患者および/または医師に知覚
されることを意味する。
および望ましくない反応を特徴的に生じないような、分子部分(molecular e
ntities)と他の成分との組成物を指す。好ましくは、用語「薬学的に許容される
」は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認され、または哺乳類での、特にヒトで
の、使用について、米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されているこ
とを意味する。薬学的に許容される塩、エステル、アミドおよびプロドラッグは、健全な
医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに患者の組織と
の接触に使用されることに適しており、妥当な利益/リスク比に相応し、およびその意図
される使用に有効であるような塩(例えば、カルボキシレート塩、アミノ酸付加塩)、エ
ステル、アミドおよびプロドラッグを指す。
ビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水および油などの殺菌された液体であり得る。
水または水溶液、食塩水、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、担体
として、特に注射用溶液として、好ましく使用される。適切な医薬担体は、E.W.Ma
rtin,18th Editionによる「Remington’s Pharmac
eutical Sciences」に記載されている。
、腔内、気管内、腹腔内もしくは皮下)、経口的、経皮的または当技術分野で公知の他の
方法を介して、個体に投与され得る。投与は、2週間に1回、週に1回、またはより頻繁
であり得るが、頻度は、病気または疾患の維持段階において減少させてもよい。
HLAマッチングは、宿主反応を回避または最小化するために行われるべきである。後者
の場合、自己細胞は対象から濃縮および精製され、ならびに、後の使用のために保存され
る。細胞は、エキソビボで宿主または移植(graft)T細胞の存在下で培養され、お
よび宿主に再導入されてもよい。これは、宿主が細胞を自分自身として認識し、およびT
細胞活性の低下を良好に提供するという利点を有することもある。
以上についての、好ましくは1つを超えるものについての減少または非存在下で、寛解期
の維持を確認する臨床徴候に依存する。より一般的には、用量および頻度は、上記組成物
を用いた治療が意図された病状または疾患の病理学的徴候ならびに臨床的および亜臨床症
状の後退に部分的に依存する。投薬量および投与レジメン(regimen)は、当業者
によって評価されるように、治療を受ける患者または哺乳動物対象における年齢、性別、
および体調だけでなく共役効果の利益および副作用、ならびに、医師の判断に応じて、調
節され得る。上記方法の全てにおいて、幹細胞は、1×104〜1×1010/回で対象
に投与され得る。
本明細書に開示されるLgr5+SB幹細胞および方法は、対象を評価するために使用
され得る。一般的に、若い健康な対象は、幹細胞の相対的に高い割合を有している。これ
らの細胞の数またはパーセンテージは、対象の年齢に応じて、または遺伝的欠陥もしくは
好ましくない環境要因への暴露により、減少することが示されている。この減少は、損傷
後の組織を修復する能力を含む、対象の幹細胞関連の能力を損なう。
使用され得る。例えば、対象が平均より高いレベルを有する場合、彼または彼女は、損傷
後に組織を修復するための優れた能力および癌を発症する高いリスクを有する。言い換え
れば、対象からの試料中の上記幹細胞の高レベルは、(1)組織の損傷を修復し、傷害か
ら回復し、および病原体から守るより良い能力を有し、ならびに(2)自己免疫疾患、心
臓血管疾患、糖尿病、および老化に関連する他の疾患を発症する低い確率を有する、若い
発達状態を対象が有することを示す。一方、そのようなより高いレベルは、癌を有する高
いリスクと正に相関している。
ものであれ、限定するものではないと解釈されるべきである。さらに詳述されることなし
に、当業者は、本明細書の記載に基づいて、最大限に本発明を利用できると考えられる。
本明細書で引用された全ての刊行物は、その全体が参照されて本明細書中に援用される。
さらに、以下に提案されるいずれのメカニズムも、請求される発明の範囲を決して限定す
るものではない。
ヒトの血液試料および骨髄試料を得て、以前に記載および上記のように抗凝固EDTA
チューブまたはヘパリンチューブに入れられた。US2012/0034194を参照。
4℃で6〜48時間チューブをインキュベートした後、試料が二層に分離した。
し、最上層はSB細胞を含有した。SB細胞は最上層にあったので、我々は、それらは6
μm幅の赤血球よりも小さいと仮定した。この分離は、最上層中の細胞の同一性を、SB
細胞、血小板、および細胞外小胞へ狭め、微粒子、微小胞およびアポトーシス小体を含む
。これらは全てこのサイズ制限に該当するためである。血小板および細胞外小胞は核を欠
いているため、DAPIまたはSYTO染色下で陰性として現れた。同様に、アポトーシ
ス小体は完全な染色体を欠き、陰性なFISH染色体染色を生成する。我々の結果は、最
上層細胞の平均10%未満がDAPI陽性であったことを示した;このようなDAPI陽
性細胞は、血小板および細胞外小胞を除外した。完全な染色体構造の存在を確認するため
に、我々は、SB細胞についてFISH Y染色体染色を行った。男性ドナーからのSB
細胞がトランスウェルのトップに播種され、女性ドナーからのラージストローマ細胞(l
arge stromal cells)がボトムに置かれた。2〜3日のインキュベー
ション後に、SB細胞はトランスウェルの5μmフィルターを通過させられた。男性ドナ
ーからの細胞は、Y染色体蛍光を用いて標的化された。大ストローマ細胞の周囲において
、1個の小細胞が、FISHおよびDAPI染色の両方について陽性であり、SB細胞が
完全な染色体構造を含むことを示している。SB細胞の陰性アネキシンV染色は、それら
の同一性をさらに確かめる。したがって、SB細胞は、アポトーシス小体、血小板または
細胞外小胞ではなかった。
トリーを用いて分析された。参考であるビーズサイズと非精製血液試料を比較することに
より、我々は、ゲートG2の大きさが1μm未満であることを見出し、この領域が主に微
粒子または微小胞から成ることを示している。1μmよりも大きい直径を有する細胞を含
むゲートG3は、3つの集団を含んだ:G4、G5、およびG6。RBC溶解緩衝液を用
いた分析がG6領域におけるRBCの存在を示し、この領域内の細胞の99.6%がCD
235a陽性およびSYTO核について陰性であると確認された。G5領域内の細胞も、
RBC(G6)よりも大きく、これらの細胞はCD11bに対して陽性染色であったこと
から、白血球(WBC)であると推定された。
認した。精製後の手順は、ヒトの血液や骨髄試料中のほぼすべてのRBC(G6)および
WBC(G5)を取り除いた。G4のみで、ヒト血液由来の細胞の80%超が、血小板マ
ーカーCD9について陽性に染色した;これらの細胞のほぼ全てが、P1領域によって捕
捉された。CD9陰性細胞はG4集団の10〜20%を構成し、P2領域で捕捉された。
この領域のゲーティングは、細胞の78%がSYTO核染色について陽性であり、細胞の
61.7%がLgr5について陽性であったことを明らかにした。30個の骨髄および7
0個の末梢血試料からの細胞が、分析された。
、CD66e−、Sox2−、CD4−、CD8−、CD9−、CD10−、CD11−
、CD16−、CD17−、CD18−、CD19−、CD20−CD21−、CD31
−、CD42−、CD63−、CD34−、Lin−、CD38−、CD90−、CD4
5−、およびCD349−であることが判明した。
の幹細胞、すなわち割球様幹細胞(BLSCs)および超小型胚様幹細胞(VSELs)
、の存在の可能性について調べられた。SB混合物中の細胞の1%未満が、CD66eま
たはCD133のいずれかを発現した。
Lgr5+SB細胞は、2つの方法を使用してSB細胞集団から単離された:FACS
orting、および磁気濃縮(magnetic enrichment)。PE S
election Kit(StemCell Technologies、カタログ番
号18551)が、Lgr5+細胞を単離するために使用された。SB細胞集団は、室温
(RT)で、PE選択カクテル(Lgr5−PE抗体を用いて)と共に15分間、および
磁性ナノ粒子と共に10分間インキュベートされた。混合物は磁石に置かれ、RTで5分
間置かれた。上清がその後捨てられ、細胞はさらなる培養のためにプレーティングされた
。あるいは、SB集団の細胞は、Lgr5−PEで染色され、UCLA Flow Cy
tometry Core FacilityでBD FACSAriaを使用して、F
ACSortingを経て単離された。
細胞は、直径6〜25μmに成長した。この増殖およびサイズの増加は、小型幹細胞の存
在を示唆した。
前述したように、肝細胞の分化のために、細胞は3つの異なるタイプの培地中で培養され
た:3%ウマ血清、1X抗生物質、1X L−グルタミン、および5ng/mLアクチビ
ンを含むDMEM高グルコース培地で4日間; 3%ウマ血清、1X抗生物質、1X L
−グルタミン、20ng/ml bFGF、および5ng/mL hBMP2を含むDM
EM高グルコース培地で10日間;ならびに、2%ウマ血清、1X抗生物質、10ng/
ml HGF、1x10−8M Dex、およびOSM 10ng/mLを含むHepa
to ZYME SFM(Life Technologies Gibcoから)で1
0〜15日間。Talens−Visconti et al., World J G
astroenterol 12:5834−5845を参照。神経原性(neurog
enic)、骨原性(osteogenic)、および脂肪生成性(adipogeni
c)分化のために、細胞は、それぞれLife Technologiesから入手され
、製造業者により提供されたプロトコルに従って使用された、神経細胞、骨細胞および脂
肪細胞分化培地中で、成長させられた。骨細胞および脂肪細胞の染色/検出のため、骨細
胞(Millipore、カタログ番号ECM815)および脂肪細胞検出キットが使用
された。このインビトロ特徴付けは4回行われた(StemCell PE単離キットを
使用して精製された細胞で3回、およびFACSortingを使用して精製された細胞
で1回)。
ドO染色は、陰性対照と比較して、脂肪細胞の数の有意な増加を示した。細胞はまた、肝
細胞分化培地中で、肝細胞および内胚葉細胞に転換された。これらの細胞は培地中に50
ng/mlのアルブミンを分泌し、アルブミン、FoxA2、およびα−フェトプロテイ
ンのようないくつかの肝細胞特異的遺伝子を発現した。外胚葉分化の潜在能力を調べるた
め、細胞は、同様に神経分化培地で培養された。ニューロフィラメントおよびMAPTの
発現は、培養中の各連日に増加した。ICCニューロフィラメント染色からの結果もまた
、神経系に分化する細胞の潜在能力を確認した。これらのデータは、精製されたLgr5
+細胞が、3つの異なる胚葉細胞にインビトロで分化することができたことを示す。
単離されたLgr5+SB細胞によるインビボ追跡アッセイが行われた。ヒト男性の骨
髄試料からLgr5+SB細胞が精製され、チャールズ・リバー・ラボラトリーズにて注
射のために5%ヒトアルブミンを含むPBS中に再懸濁された。6匹の雌SCIDマウス
(6〜8週齢)の二つの群は、注射前に亜致死の(sub−lethal)(2Gγ)ガ
ンマ線照射を受けた。各マウスは、最初は照射後直ちに、24時間後さらにもう一度、1
×105細胞で2回注射された。陰性対照群は、PBSを注射されたマウスから成る。組
織は、最初の注射後60日目に採取された。組織の半分は、チャールズ・リバー・ラボラ
トリーズにより凍結切片として調製され、残りの組織はRNAレベルでの遺伝子発現分析
のためにRNAlater試薬中でStemBiosに送られた。蛍光ヒト特異的Y染色
体プローブを使用するFISH法は、インビボでヒト細胞を検出するために使用された。
しめ得るNK細胞を亜致死照射が排除するであろうことを、確実にした。さらに、そのよ
うな照射は、修復のための損傷部位への幹細胞のガイダンスに重要であり得る損傷シグナ
ルを、マウス体内で生じるであろう。
I二重陽性であった細胞は、ヒトから由来していた。これらの結果は実験群の6匹全ての
マウスについて一致し、損傷シグナルがLgr5+SB細胞の損傷部位への移動を案内し
たことを示唆する。器官に移動した細胞が分化することができるかどうかを測定するため
に、RT−PCRが行われた。β−アクチン、α1−アンチトリプシン、myogeni
c factor 4、およびTau遺伝子発現は、これらの器官で評価された。このア
ッセイでは、マウスβ−アクチンに対するプライマーが陽性対照としての役割を果たし、
肝臓、脳、および骨格筋のためのプライマーは、ヒト特異的であった。結果は、ヒトLg
r5+SB細胞がマウスの脳、肝臓、および骨格筋に存在し、宿主内で肝細胞、神経細胞
、および骨格筋に分化したことを実証した。これらのデータはまた、実験群の6匹全ての
マウスについて一致した。
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本
明細書で開示した各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替的特徴によって
置き換えられてもよい。したがって、別段の記載がないかぎり、開示された各特徴は、同
等または類似の特徴の包括的なシリーズの一例に過ぎない。
ることなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施
形態は、以下の請求項の範囲内である。
Claims (18)
- 2マイクロメートル以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+、CD9−、およびCD349−であり、血液または骨髄試料由来である、単離された体性幹細胞。
- 前記単離された体性幹細胞が、多能性(pluripotent)である、請求項1に記載の単離された体性幹細胞。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項1または2に記載の単離された体性幹細胞。
- 前記細胞が非接着性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離された体性幹細胞。
- 前記細胞がOct4+、Nanog+、CD133−、CD66e−、およびSox2−である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離された体性幹細胞。
- 体性幹細胞の集団を調製する方法であって、
対象から得られた血液または骨髄試料が上層と下層とに分離されるまで、容器内でEDTAまたはヘパリンと共に前記試料をインキュベートすること(incubating)、
前記上層を回収すること(collecting)、および
2マイクロメートル以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+、CD9−、およびCD349−である体性幹細胞の集団を、前記上層から単離すること(isolating)、
を含む方法。 - 前記対象がヒトである、請求項6に記載の方法。
- 前記単離する工程(isolating step)が、フローサイトメトリーによって行われる、請求項6または7に記載の方法。
- 前記回収する工程(collecting step)の後に、前記上層をADPと共にインキュベートすることをさらに含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程がヘパリンと共に試料をインキュベートすることによって行われ、ならびに前記回収する工程(collecting step)の後であって前記単離する工程(isolating step)の前に、前記回収された上層がEDTAと共にインキュベートされる、請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 2マイクロメートル以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+、CD9−、およびCD349−であり、血液または骨髄試料由来である、単離された体性幹細胞を含む、体性幹細胞の集団。
- 前記体性幹細胞が、Oct4+、Nanog+、CD133−、CD66e−、およびSox2−である、請求項11に記載の集団。
- 前記血液または骨髄試料がヒト由来である、請求項11または12に記載の集団。
- 前記体性幹細胞が非接着性である、請求項11〜13のいずれか1項に記載の集団。
- 体性幹細胞の複数の集団を含む細胞バンクであり、前記複数の集団は、2マイクロメートル以上6マイクロメートル未満のサイズであり、かつLgr5+、CD9−、およびCD349−であり、異なる対象から得られた血液または骨髄試料由来である、単離された体性幹細胞を含む、細胞バンク。
- 対象における疾患または状態を治療するための請求項11〜14のいずれかに記載の体性幹細胞の集団を含む組成物であって、前記疾患または状態が、筋変性疾患、神経変性疾患、筋損傷、癌、または自己免疫疾患からなる群から選択される、組成物。
- 前記筋変性疾患が、筋ジストロフィー、線維筋痛、ミオパチー、皮膚筋炎、多発性筋炎、横紋筋融解症、および心筋炎からなる群から選択される、請求項16に記載の組成物。
- 分化した細胞型を生成するのに適した分化培地中で請求項11〜14のいずれか1項に記載の体性幹細胞の集団を培養することを含む、脳細胞、ニューロン、アストロサイト、グリア細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、膵島細胞、脂肪細胞、心臓細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、および眼細胞から選択される分化した細胞型をインビトロで生成する方法。
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