CN104822827A - Lgr5+体干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示尺寸为2至小于6微米且为Lgr5+的分离体干细胞。本发明也揭示制备并使用该细胞的方法。

Description

LGR5+体干细胞
相关申请案的交互参照
本申请案主张2012年12月6日提申的美国临时申请案号61/734,106的优先权，其整体内容以参照方式并入本案。
发明背景
干细胞是可在体内或体外分化成许多或所有细胞系的多能或全能细胞。由于其多能性，胚胎干(ES)细胞对治疗变性或遗传性疾病保持很大希望。但是，道德方面的考虑阻碍人类ES细胞的利用。非胚胎来源干细胞就规避了此障碍。这些成体干细胞具有如同ES细胞的同样分化能力。
来自骨髓、可分化成外胚层、中胚层和内胚层的多能成体祖细胞已被分离。其他类型的细胞，包括从骨髓分离的成体多谱系诱导型细胞和从骨髓衍生的单细胞无性繁殖系也有同样的多潜能分化能力。该类多能体细胞难以取得、培养、及扩展。
于是，对于可容易分离并维持的成体体干细胞有所需求。
发明概要
一或多个实施方案的细节载列于以下的说明。
提供了尺寸为2.0至小于6.0微米且为Lgr5阳性的分离体干细胞。
也提供了一种制备体干细胞群的方法。该方法包括下列步骤：从受试者取得含多个细胞的组织样品，在容器内以EDTA或肝素培育样品，直至该样品分成上层与下层，收集上层，及从上层分离尺寸为2至小于6微米且为Lgr5+的体干细胞群。
在一个方面中，体干细胞群是以上述方法制备。
在另一个方面中，所说明的是一种含有多个体干细胞群的细胞库，该多个群是由不同受试者的血液或骨髓样品以上述方法制备。
此外，描述了体干细胞的群体用于治疗病症或病况的用途。该病症或病况为肌肉变性病症、神经变性病症、肌肉受伤、癌症、或自身免疫疾病。有效量的以上列方法制备的体干细胞可给予对其有需求的受试者。
一个或多个实施方案的细节载列于以下的说明。本发明其他特征、目的与优点将由说明与申请专利范围显而易见。
详细说明
本案所说明的是SB细胞，其是尺寸为小于6.0μm的成体干细胞并包括CD9染色阳性的SB-1细胞，即CD9+，还有CD9-细胞。参阅US2012/0034194。在CD9-细胞群中，有尺寸为2.0至小于6.0μm且为Lgr5+的独特细胞亚群。Lgr5+SB细胞也为Oct4+与Nanog+、以及CD133-、CD66e-、Sox2-、CD4-、CD8-、CD9-、CD10-、CD11-、CD16-、CD17-、CD18-、CD19-、CD20-、CD21-、CD31-、CD42-、CD63-、CD34-、Lin-、CD38-、CD90-、CD45-、与CD349-。
Lgr5+SB细胞为由非胚胎来源制备的多能或全能干细胞。Lgr5+SB细胞能分化成和三个胚层-也就是外胚层、内胚层和中胚层相关的细胞类型。在一个实施方案中，该细胞是非粘附型。因此可用来再生治疗各式变性病症或组织损伤的已分化功能细胞。如以下实施例所示，该群可容易在体外制备、维持、扩展，并使用常规的技术方式诱导分化。此外，在将该群的干细胞接植至动物受试者(例如小鼠)后，无证据显示恶性增长。含有普通染色体补体，这些干细胞未谱系定型并可形成身体的所有体(非生殖)细胞。它们也可形成生殖配子***及/或卵，以及胎盘胚胎与胎儿部分的细胞与组织。这些干细胞可应答谱系诱导剂、增殖剂、及分化抑制剂。由于这些优点，它们代表其他干细胞的替代物。
“干细胞”术语在本案是指全能或多能的细胞，即能够分化成众多最终的已分化细胞类型。全能干细胞通常具有发育成任何细胞类型的能力。全能干细胞在来源上可为胚胎与非胚胎两者。多能细胞通常为能够分化成数种不同的最终已分化细胞类型的细胞。单能干细胞可产生唯一一种细胞类型，但具有和非干细胞有所区别的自体新生特性。这些干细胞可源自各式组织或器官***，包括血液、神经、肌肉、皮肤、内脏、骨骼、肾脏、肝脏、胰腺、胸腺、及类似物。
本案揭示的干细胞是实质上纯的。在提到干细胞或从其衍生的细胞(例如已分化细胞)时所用的″实质上纯的″术语的意思是特定细胞占了制备物细胞的多数(即多于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％)。一般而言，实质上纯的细胞群占了制备物的至少约70％细胞，通常为制备物的约80％细胞，及尤其为制备物的至少约90％细胞(例如95％、97％、99％或100％)。因此，本案所说明的方法提供了可取得实质上纯的Lgr5+SB细胞群而不被其他细胞类型污染的优点。
Lgr5+SB细胞可自人类或自非人类分离。非人类来源的例子包括，但不限于非人类灵长类动物、狗、啮齿类、豚鼠、猫、马、牛、羊、及猪。换言之，Lgr5+SB细胞的来源包括宠物动物、农场动物、实验动物、及疾病模型动物。在一个实施方案中，Lgr5+SB细胞是分离自人类。
Lgr5+SB细胞可自诸如血液、骨髓、骨骼肌、或脂肪组织的组织分离。在一个实施方案中，Lgr5+SB细胞是分离自血液。在一个优选实施方案中，血液供给者为人类。
Lgr5+SB细胞可以下列方法从组织样品分离。首先，在容器内以二价阳离子螯合剂(例如EDTA、EGTA、及柠檬酸钠)或肝素培育组织样品的细胞，直至样品分成上层与下层。培育可于4℃的温度进行6至48小时。优选地，培育于4℃进行48小时。
收集通过以上培育步骤所产生的上层，自此上层分离尺寸为2至小于6微米且为Lgr5+的体干细胞群。
Lgr5+SB细胞从上层的分离动作可通过以细胞尺寸为基础的方法(例如离心过滤)或这些以细胞表面标记为基础的方法(例如流式细胞术)执行。
培育步骤可通过以肝素培育样品来进行，以及，在收集步骤与分离步骤之间，所收集的上层以EDTA培育。
该方法可又包括，在已收集上层后，以ADP培育上层，以容许血小板/微粒子沉淀，使得SB体干细胞进一步富集。此外，该方法也可包括以二价阳离子螯合剂培育取自经肝素处理样品的上层，以将干细胞的细胞周期从G0活化至G1。
在组织样品为骨骼肌或脂肪组织的实施方案中，该细胞分离方法可包括，在取得步骤与培育步骤之间，以胶原酶消化组织样品，以从细胞外基质释放个别细胞。
为确认此分离群确实含有Lgr5+SB细胞，我们可检验众多特性，包括(1)悬浮液的细胞尺寸介于2.0至小于6.0μm，例如2.0至5.0μm；及(2)细胞表面标记。可使用针对细胞表面标记的抗体，例如Lgr5。它们可和适宜标记结合，例如荧光异硫氰酸盐(FITC)、藻红蛋白(PE)、或量子点。Lgr5+SB细胞可使用流式细胞术进一步富集。
所分离或富集的细胞稍后可以标准技术测试。为确认Lgr5+SB干细胞的分化潜能，它们可通过本领域现有方法诱导以形成，举例来说，神经胶质细胞、骨细胞、及脂肪细胞。举例来说，可将这些细胞传递培养至汇合，转移至成骨培养基或成脂培养基，并培育一段适宜时间(例如3周)。就成骨而言的分化潜能是以可通过冯卡氏(von Kossa)染色法目视的积钙矿化作用来评估。为检验成脂分化，胞内脂滴可通过油红O染色并在显微镜下观察。就神经分化而言，这些细胞可于神经生成培养基培育适宜时期(例如7天)，然后施以血清耗竭及以β-巯基乙醇培育。待分化后，它们表现出折射细胞体伴随着排列成网络的延长轴突的形态。再进行RT PCR与谱系特异性标记的免疫细胞化学染色，以确认神经分化。标记的例子包括神经元特异性第III类β-微管蛋白(Tuj-1)、神经丝蛋白、及GFAP。
或者，为确认分离细胞身份，我们可利用SB细胞-响应于二价阳离子螯合剂(EDTA)-增殖得很快的发现。为此，我们可以例如EDTA培养分离细胞。在该条件下，Lgr5+SB细胞将会增殖。
Lgr5+SB细胞可进一步在非分化培养基中繁殖超过10、20、50、或100倍数目，而无自发性分化、衰老、形态变化、生长速度提高、或分化成神经元的能力改变的征兆。这些干细胞在使用前可以标准方法储存。
在本案可互换使用的″增殖(proliferation)″与″扩展(expansion)″术语是指同样类型细胞的数量因***而增加。″分化″术语是指细胞藉以变得专对特定功能的发育过程，举例来说，细胞通过其获取一或多个异于初始细胞类型的形态特征及/或功能。″分化″术语包括谱系定型与末端分化过程。分化可通过，举例来说，监测谱系标记出现或缺失来评估，其是使用免疫组织化学或本领域技术人员现有的其他程序。衍生自祖细胞的已分化子代细胞也许，但不一定，和干细胞来源组织的同样胚层或组织相关。举例来说，神经祖细胞与肌肉祖细胞可分化成造血细胞系。
在本案可互换使用的″谱系定型(lineage commitment)″与″指定(specification)″术语是指在干细胞成为认定形成特定有限范围的已分化细胞类型的祖细胞时，干细胞所经历的过程。已谱系定型的祖细胞通常能够自体新生或细胞***。
″末端分化(terminal differentiation)″术语是指细胞成为成熟、已完全分化细胞的最终分化作用。举例来说，神经祖细胞与肌肉祖细胞可分化成造血细胞系，其末端分化引导成为专一细胞类型的成熟血液细胞。通常，末端分化系和撤出细胞周期与停止增殖相关联。本案所用″祖细胞(progenitorcell)″术语是指被认定为特定细胞系的细胞，并通过一连串细胞***引导成为此系细胞。祖细胞的一例为成肌细胞，成肌细胞能够分化成唯一一种细胞类型，但其本身并不完全成熟或完全分化。
上述Lgr5+SB细胞可以众多方式使用。
细胞库作业
多个Lgr5+SB细胞群可用于产生细胞库。该些群通过上述方法由来自不同受试者的体液样品，例如血液与骨髓分别制备。细胞库或文库中的Lgr5+SB细胞群可衍生自健康受试者或具有现有疾病状态或疾病症状的受试者。这些干细胞可为人类细胞或非人类细胞。
细胞库可通过下列制造：分别采集来自不同受试者的Lgr5+SB细胞群；将Lgr5+SB细胞群定性，为各群取得至少一个预定特征，根据该至少一个预定特征将各个Lgr5+SB细胞群编目。特征的例子包括受试者姓名、性别、身体病况(包括基因病症与MHC信息)。为制造细胞库，我们可进一步扩展Lgr5+SB细胞群。
也可产生具有由上述干细胞分化的细胞的细胞库或文库。从干细胞分化的细胞例子包括脑细胞、神经元、星状细胞、神经胶质细胞、T细胞、B细胞、软骨细胞、骨细胞、胰岛细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肝细胞、肾细胞、肺细胞、肌肉细胞、及眼细胞。该受试者可为人类或非人类脊椎动物。干细胞可衍生自任何哺乳动物生物体，例如人、小鼠、兔、牛、猪、及类似动物。
细胞库或文库中的细胞是根据预定特征编目，包括表型信息、形态特征、分化数据、血型、主要组织相容性复合物、供给者的疾病状态、或基因型信息(例如，与基因相关的特定核酸序列的单核苷酸多型性(SNPs)、或是基因组或粒线体DNA)。将细胞储存于适当条件下(通常通过冷冻)，以使干细胞保持存活并保有功能。编目可构成创立在各个细胞群所取得的特征集中记录，例如但不限于，集合式书面记录或是有输入信息的电脑数据库。基本上，此实施方案是有关制造干细胞库。干细胞库有助于从多个样品挑选适合用户需求的特定干细胞样品。于是，本发明另一个实施方案是有关干细胞库，其包含取自分别来源的多个干细胞样品且该样品是经定性及根据至少一个预定特征编目。另外的实施方案是有关建立干细胞库的方法，其包含收集来自多种来源的干样品；根据至少一个预定特征将样品编目，并于保持细胞存活的条件下储存细胞。
在本发明范畴以内的是一种含有下列的干细胞库操作***：多个干细胞群，其于保持干细胞群存活的条件下、配置于个别容器中；数据库电脑，其包含至少一个处理模块、显示器、及包含各个干细胞群至少一个特征的信息的储存媒体；以及至少一个程序码模块，其致使信息可随着使者者命令而在该显示器上被检视。在特定实施方案中，本发明的特色是在于一种干细胞库操作***，其中干细胞群是取自具有疾病病况受试者的干细胞。疾病病况可包括上述变性疾病。Lgr5+SB细胞群是采集自具有不同疾病的不同受试者，该干细胞系被定性。将(多个)特征输入数据库电脑。此外，任选的，该细胞基于不一定和疾病病况相关的特定表型定性。举例来说，肝细胞可基于其代谢某些化合物的能力来定性，例如咖啡因、酒精、药剂等等，以研究该类不同代谢能力的遗传基础、或与此相关的潜在生理学。其他细胞类型可基于功能及/或形态表型定性。
在某些实施方案中，可经由引入改造载体或其他遗传物质对自Lgr5+SB细胞群分化的细胞施以影响分化或去分化的条件。去分化作用包含操作细胞，从而使其呈现出分化程度较低细胞的性质。
本发明的干细胞库可通过上述方式用来筛选可用于治疗变性病症、癌症或免疫病症的药剂或化合物。该库适用于高通量筛选并有益于鉴定对特定受试者专一地有效的药剂。就高通量筛选而言，可将干细胞引进多孔盘或载玻片的多个孔中或微芯片，并可和测试药剂接触。一般而言，将细胞组织为阵列，尤其是可寻址阵列，从而使可方便地使用机器人操作细胞与溶液并监测细胞，尤其是关于所检验的功能。使用高通量形式的优点是可并行地检验众多测试药剂，而且，如果需要的话，对照反应也可在如同测试条件的相同条件下运行。因此，本发明的筛选方法提供筛选一个、一些、或大量测试药剂的方式，以鉴定可更改干细胞功能的药剂，举例来说，诱发细胞分化成所欲细胞类型、或-举例来说-通过维持调控分子的高水平表达来阻止自发分化的药剂。
通用型供给者细胞
上述干细胞可经基因工程改造，以产生移植用的组织兼容供给者细胞或组织。更明确地说，本案所说明的干细胞可经基因工程改造，以在其表面上不表达第II类MHC分子。更优选地，该细胞经改造，以不表达实质上所有细胞表面的第I类与第II类MHC分子。如本案所用者，″不表达″术语意指细胞表面上所表达的量不足以引发响应，或所表达的蛋白质有缺陷，因此没引发响应。
MHC分子指的是HLA分子，明确地说是HLA A、B与C类群和第II类HLA DP、DQ、与DR，及其亚类。此命名法一般解读为专对人类MHC，但本案意图包括来自供给者细胞物种的等效MHC基因，举例来说，假使细胞源自猪，则HLA术语将指等效的猪MHC分子，无论MHC I或II。当第II类MHC分子被移去时，CD4+T-细胞就无法鉴定经基因工程改造的内皮细胞；当第I类与第II类MHC分子都被移去时，不论CD4+或DS+细胞都无法鉴定修饰过的细胞。
在干细胞上进行的基因修饰可包括1)干扰内源性恒定链基因，其作用于组装并运送第II类MHC分子至细胞表面及加载抗原肽，以及2)干扰内源性β2-微球蛋白基因(β2M基因)，其编码所有第I类MHC分子在细胞表面表达所需的蛋白质。或者，只干扰内源性恒定链基因。据信恒定链在抗原肽片段嵌入MHC第II类分子时是必要的。共同地，抗原肽与MHC被T细胞识得。在无抗原肽时，T细胞就不能正常鉴定，MHC第II类分子也不能正确折叠。于是，在缺少恒定链的细胞中，肽的呈现会被废除且即便获得极少量的细胞表面MHC，它们可能不含肽且因此，不具免疫性。
这些基因的干扰可通过同源重组基因靶向技术完成。这些技术为本领域众所周知。参阅，例如US专利号6,916,654与6,986,887。
筛选方法
上述Lgr5+SB干细胞可用在鉴定以某方式影响特定细胞类型的药物的筛选试验，该方式可指出该药物是有益于治疗和该细胞类型相关的病症。举例来说，我们可在用于鉴定供治疗疾病(例如变性疾病)的药物候选者的方法中使用干细胞。该方法包括下列步骤：使测试化合物和干细胞接触并测定在该疾病呈负调控的多肽的表达水平。有测试化合物存在时的表达水平，假使高于无该化合物存在时的表达水平，指出该化合物为治疗疾病的候选者。疾病的例子包括糖尿病(diabetes)、神经变性疾病、关节炎、癌症、或自身免疫病症。表达水平可以mRNA水平或以蛋白质水平测定。
于是，一个方面涉及通过使细胞和测试药剂接触来鉴定更改Lgr5+SB细胞群中的未分化细胞功能的药剂的方法。有测试药剂存在时的细胞功能或基因表达相比于无测试药剂存在时的功能的变化指出了该测试药剂为更改细胞功能或基因表达的药剂。″测试药剂″术语指的是经检验更改细胞功能或基因表达的能力的任何分子。尽管该方法是一般用作鉴定具有所欲活性的先前未知分子的筛选试验，但本发明筛选方法也可用来确认现有具有特定活性的药剂。
该功能可为在细胞中通常表达(或未表达)的基因表达，而该药剂通过增加或降低已表达基因的表达水平或通过启动细胞未表达基因的表达(例如诱发谱系特异性抗原的表达)来更改功能。
在一个实施方案中，影响细胞功能的药剂为诱发干细胞分化的药剂，由此制造已分化细胞。该类已分化细胞可为多能人类干细胞(例如造血干细胞)或可为末端分化细胞(例如肌肉细胞、神经元细胞、血液细胞、连接组织、及表皮细胞)。因此，该方法可用于鉴定诱发Lgr5+SB细胞群的干细胞分化成末端分化细胞的药剂，该末端分化细胞包括胰腺β细胞，肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、或任何其他细胞类型。由此鉴定的药剂或化合物可用于治疗变性病症、癌症或免疫病症。
表达水平可以mRNA水平或以蛋白质水平测定。测量样品mRNA水平的方法为本领域众所周知。为测量mRNA水平，可使细胞裂解且裂解物中的mRNA水平-无论纯化与否-可通过例如杂交试验(使用以可检测方式标记的基因特异性DNA或RNA探针)与定量或半定量RT-PCR(使用适当的基因特异性引物)测定。或者，可在组织切片上或未裂解细胞悬浮液使用以可检测方式(例如荧光或酶)标记的DNA或RNA探针进行定量或半定量原位杂交试验。另外的mRNA-定量方法包括RNA保护试验(RPA)方法与基因表达序列分析(SAGE)法，还有以阵列为基础的技术。
测量样品蛋白质水平的方法也为本领域众所周知。其中有些运用专一地结合至目标蛋白质的抗体(例如单克隆或多克隆抗体)。在该类试验中，抗体本身或结合至抗体的二级抗体可以可检测方式标记。或者，抗体可与生物素接合。其存在可以可检测方式标记的抗生物素蛋白(结合至生物素的多肽)测定。这些方式的组合(包括″多层夹心式″测定法)可用来提高方法的灵敏度。一些蛋白质测量试验(例如ELISA或蛋白质印迹法)可应用于体液或细胞裂解物，其余(例如免疫组织方法或荧光流式细胞术)可应用于组织切片或未裂解细胞悬浮液。适当标记包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H、或32P)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、荧光素酶、或β-半乳糖苷酶)、荧光/发光药剂(例如荧光素、玫红、藻红蛋白、GFP、BFP、及纳米颗粒(例如Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA供应的QdotTM)。其他可应用方法包括定量免疫沉淀或补体固定试验。
测试化合物或药剂可为任何分子类型，举例来说，多核苷酸、肽、拟肽物(peptidomimetic)、类肽(peptoids)，例如乙烯化类肽(vinylogouspeptoids)、小型有机分子、或类似物，并可以各种方式的任一种作用，以更改Lgr5+SB细胞群的干细胞功能。举例来说，测试药剂可通过结合至细胞所表达的细胞表面受体而在胞外作用，由此更改通常结合至该受体并经由受体作用的配体结合所介导的功能。或者，测试药剂可穿过细胞膜，以被动方式或经由主动运送机制，并于细胞内作用而更改功能。
肽测试药剂可为氨基酸或氨基酸类似物的任何聚合物，并可为约三到四个残基至数百或数千个不等。肽测试药剂可通过下列制备：化学合成；或使用蛋白质纯化方法，接着蛋白质水解，如果需要的话，进一步以层析或电解方法纯化；或可从编码多核苷酸表达。肽测试药剂可以现有肽为基础，举例来说，天然存在的肽，但可和天然存在序列有所不同，举例来说，含有一或多个氨基酸类似物。
多核苷酸药剂可为二或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以磷酸二酯键联结在一起的序列。其可为RNA或DNA，该RNA或DNA可为基因或其一部份、cDNA、RNAi药剂、合成的聚脱氧核糖核酸序列、或类似物，并可为单链或双链，还有DNA/RNA杂交物。其可为天然存在的核酸分子，该核酸分子可从细胞分离，以及合成分子，合成分子可以，举例来说，通过化学合成方法或通过酶的方法，例如聚合酶链反应(PCR)制备。在各式实施方案中，本发明的多核苷酸可含有核苷或核苷酸类似物或除了磷酸二酯键以外的骨架键。该类核苷酸类似物为本领域众所周知并可在市面上购得，例如含有该类核苷酸类似物的多核苷酸(Pagratis et al.，NatureBiotechnol.15:68-73，1997)。
多核苷酸测试药剂可使用本案揭示方法或本领域现有的其他方法接触或引进Lgr5+SB细胞群中的干细胞。一般而言，但不一定，多核苷酸是引进细胞内，其中多核苷酸直接、或在转录或转译或两者之后影响其功能。举例来说，多核苷酸可编码肽测试药剂，该肽测试药剂于细胞内表达并更改细胞功能。多核苷酸测试药剂也可为或可编码反义分子、核糖酶或三联剂(triplexing agent)，它们可设计成靶向一或多个特定目标核酸分子。
欲筛选的候选药剂或化合物(例如蛋白质、肽、拟肽物、类肽、抗体、小分子、或其他药物)可使用本领域现有组合库方法中众多方式的任意方式取得。该类库包括：肽库、类肽库(具有肽官能性但带有可抵抗酶降解的新颖非肽骨架的分子的库)；空间可寻址平行固相或液相库；以反褶积法或亲和性层析选择法取得的合成库；及“一珠一化合物(one-beadone-compound)”库。参阅，例如Lam，1997，Anticancer Drug Des.12:145。分子库的合成方法例子可在，例如Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；与Gallop et al.，1994J.Med.Chem.37:1233中找到。化合物库可出现在溶液(例如Houghten，1992，Biotechniques 13:412-421)、或珠(Lam，1991，Nature354:82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364:555-556)、细菌(U.S.专利号5,223,409)、孢子(U.S.专利号5,223,409)、质体(Cull et al.，1992，PNAS USA89:1865-1869)、或噬菌体(Felici 1991，J.Mol.Biol.222:301-310；及U.S.专利号5,223,409)上。
治疗变性病症
我们可使用本案揭示的Lgr5+SB细胞治疗变性或遗传疾病。
要做到这一点，我们可从例如缺少就组织或器官适当发育而言至关重要的功能性基因的患者分离Lgr5+SB细胞群。我们随后可将编码该基因功能性版本的表达核酸载体引进Lgr5+SB细胞群中的干细胞。载体可经由各式技术引进干细胞内，包括磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚醣-介导转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、或病毒介导技术。优选的是不影响细胞多能性的方法。该类技术的说明可在，例如US专利号7,422,736与5,591,625找到。在将功能性基因输送进入干细胞后，我们可使用本领域现有方法将它们植回患者。随着干细胞从患者产生，治疗并无引致免疫排斥。
或者，我们可从制备自健康受试者的Lgr5+SB细胞群制造通用型供给者细胞。制造通用型供给者细胞的方法是本领域所现有且从Lgr5+SB细胞群制造通用型多能干细胞的方法说明于下。
在适当条件下，所移植的干细胞可发育成功能性组织或器官。为帮助此发育，可将诱发细胞发育的因子给予患者。该类因子可为小分子化合物、肽、及核酸。例子包括，但不限于，转化生长因子β、成骨蛋白质、及神经生长因子。
通用型多能干细胞也有益于研究谱系发展与分化的发展或分化机制。我们可使用该类细胞作为模型***来鉴定诱发全能多能干细胞发育成特定组织或器官的条件。另外，我们可使用本领域现有的分化cDNA筛选法分离在发育期间扮演角色的基因。我们可从被诱发发育成某系-例如上述神经胶质系-的细胞制备cDNA库。该库随后可用于分离并研究以分化方式表达的基因。可进一步研究这些分离基因，以定义其于个别过程中的角色。相关技术为本领域所现有。参阅，例如美国专利号7,422,736。使用本领域现有方法，多能干细胞也可用于发育成动物的器官或无性繁殖系。因此，这些细胞对宠物与家畜产业是有价值的，并可用于保护濒危动物。
如上所提，本案所说明的是一种治疗受试者变性疾病的方法。该方法包括将有效量之上述Lgr5+SB干细胞给予对其有需求的受试者。在一个实施方案中，这些细胞中至少一个可包括重组核酸。重组核酸可编码多肽，而干细胞可含有编码多肽的mRNA。变性疾病可为，例如糖尿病、神经变性病症、及关节炎。神经变性病症的例子包括帕金森病(Parkinson’sdisease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿病(Huntington’sdisease)、及ALS。
欲就上述病症之一受治疗的受试者可通过就该特定病症而言的标准诊断技术鉴定。“治疗”指的是将组成物(例如细胞组成物)给予受试者，该受试者罹患该病症或面临发生该病症的风险，其目的为治愈、减轻、缓解、补偿、推迟发作、预防、或改善病症、病症症状、病症继发的疾病状态、或对损伤/病症的倾向。“有效量”指的是能够在受治疗受试者产生医学上所希望结果的组成物份量。治疗方法可单独进行或和其他药物或疗法共同进行。
变性疾病指的是受影响组织或器官的功能或结构随着时间逐渐恶化的病症，无论起因是基因缺失、受伤、缺少适当的细胞分化(例如于细胞增生性病症)、身体正常损耗、或生活方式的选择。变性疾病的例子包括神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森症(Parkinson disease)、亨廷顿病、多发性硬化、及ALS)；其他神经***病症(例如横断性脊髓炎、脑或脊髓创伤后发生的髓鞘脱失、急性脑伤、头部创伤、脊髓受伤、周围神经受伤、缺血性脑伤、CNS的遗传性髓鞘病症、癫痫、产期窒息(perinatal asphxia)、窒息、缺氧、癫痫重积状态(status epilepticus)、夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager syndrome)、自闭症、及中风)；肌肉变性疾病(例如肌营养不良(muscular dystrophy)、纤维肌痛(fibromyalgia)、肌病变(myopathy)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、横纹肌溶解症(rhabdomyolysis)、及心肌炎(myocarditis))；癌症或相关癌症疗法(例如化疗)所导致的病况；代谢病症(例如糖尿病/糖尿症(diabetes mellitus)及尼曼匹克病(Niemann Pick disease))；自身免疫或发炎相关病症(例如红斑(erythematosis)、炎性肠病(IBD)、***炎、骨关节炎、骨质疏松症、风湿性关节炎、狼疮、糖尿病、及气喘)；眼部病症(例如青光眼、色素性视网膜炎、诺里病(Norrie disease)、及黄斑变性)；心脏和循环***病症(例如动脉粥状硬化、心脏衰竭心肌梗塞、及心血管疾病)；血液病症(例如威-奥综合征(Wiscott Aldrich syndrome))；胃肠疾病；肾脏疾病；肝脏疾病；肺脏疾病；肾上腺病症(例如爱迪生病(Addison′s disease))；受伤所导致的病况(例如烧伤、中风、受损组织，包括皮肉伤、老化受损细胞、及老化受损组织)；和老化有关的病况(例如掉发，包括雄性秃和斑秃)；病毒病况(例如C型肝炎感染与获得性免疫缺陷病症)；以及器官移植或干细胞可用于恢复、再生、或以其他方式改善和病症有关的征兆及/或症状的任何其他病症。本发明方法可用于治疗***功能障碍及用于整形手术或女性隆胸。
上述Lgr5+SB干细胞可用于治疗受试者的脑或CNS组织损伤或减轻该病症症状的方法。该方法包括鉴定罹患脑组织损伤或面临发生脑组织损伤的风险的受试者。该受试者可为人类或非人类哺乳动物，例如猫、狗、或马。脑组织损伤的例子包括脑缺血所导致者(例如慢性中风)或神经变性疾病(例如帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑性疾病、及亨廷顿病)。欲受治疗的受试者可通过诊断感兴趣病况或病症的标准技术鉴定。该治疗方法必须将有效量之上述干细胞或活性药剂/化合物给予对其有需求的受试者。
Lgr5+SB干细胞的疗效可根据标准方法评估。举例来说，为确认促进脑血管血管新生作用的功效，我们可通过诸如电脑断层(CT)、多普勒超声波造影(DUI)、磁振造影(MRI)、及质子磁振光谱(1H-MRS)的标准脑造影技术来检验治疗前后的受试者。举例来说，1H-MRS代表取得脑代谢活性的相关生化信息的非侵入方式(Lu et al.，1997，Magn.Reson.Med.37，18-23)。此技术可应用于评估有或无干细胞移植的脑缺血所涉及的代谢变化。举例来说，其可用于研究脑内的N-天门冬氨酸乙酰酯(NAA)浓度-神经元完整性的标记。尽管NAA再分布与神经元碎片捕获限制其用作定量神经元标记，但脑缺血时脑NAA浓度的减少可被视为神经元缺失或功能障碍的指针(Demougeot et al.，2004，J.Neurochem.90，776-83)。因此，以1H-MRS测得的NAA水平为追踪脑缺血后的干细胞移植效果的有利指示。
基因治疗
本案所述干细胞可用于表达外源性重组多肽。于是，在本发明范畴内的是该类含有重组核酸的干细胞。重组核酸可编码一多肽且干细胞可含有编码该多肽的mRNA。
这些干细胞可经基因操纵，因此它们不表达β2-微球蛋白基因或不表达第I类主要组织相容性复合物(MHC)基因所编码、引发对抗细胞的T淋巴细胞介导反应的一或多个蛋白质。这些细胞可用作通用型供给者细胞，因为它们不会引起移植物的宿主排斥作用。
因此，本案所说明的是将异源性核酸引进受试者的方法。该方法包括下列步骤：取得上述干细胞，其中干细胞的至少一个包括异源性核酸，并将该细胞给予对其有需求的受试者。异源性核酸可编码多肽。
″异源性″术语为相对用词，当该词提及核酸部份使用时指的是该核酸包含在大自然中未找到彼此同样关联性的二或多段亚序列。举例而言，以重组方式制造的核酸通常具有以合成方式排列、来自不相干基因的二或多段序列，以制得新颖功能性核酸，例如来自一来源的促进子与来自另一来源的编码区。在上下文中，该两核酸因而彼此异源。在加至细胞时，该重组核酸就细胞的内源性基因而言也为异源性。于是，在染色体中，异源性核酸将包括嵌入染色体的非天然(非天然存在)核酸、或非天然(非天然存在)的染色体外核酸。反之，在此专利申请案上下文中，自然转位的染色体片段将不被视为异源性，因其包含突变细胞的天然内源性核酸序列。同样地，异源性蛋白质表明该蛋白质包含在大自然中未找到彼此同样关联性的二或多段亚序列(例如″融合蛋白″，其中两段亚序列是由单一核酸序列编码)。该类蛋白质可以重组技术产生。
在提及例如细胞、核酸、蛋白质、或载体使用时的″重组″术语表明该细胞、核酸、蛋白质、或载体已通过引进异源性核酸或蛋白质或更改天然核酸或蛋白质来修饰，或细胞是衍生自依此修饰的细胞。于是，举例来说，重组细胞系表达细胞天然(天然存在)形式未发现的基因或表达以其他方式正常或异常表达、低度表达或根本不表达的天然基因的第二副本。
上述干细胞与方法可用于本领域现有的各式基因治疗方法。基因治疗包括离体(ex vivo)和体内技术二者。明确地说，上述干细胞可通过寡核苷酸调节子或编码该调节子的核酸分子进行基因改造，随后将改造细胞提供给欲受治疗的患者。细胞培养物可经调配以供给药至患者，举例来说，通过解离细胞(例如通过机械解离)并使细胞和药学上可接受的载剂(例如磷酸缓冲生理盐水溶液)密切混合。或者，该细胞可在适宜生物可兼容承载物上培养并植入患者。改造细胞通常为自体的，以回避异种或同种异型排斥作用。该类离体方法为本领域众所周知。
细胞可使用本领域现有技术通过给予寡核苷酸或核酸分子来改造。举例来说，寡核苷酸及其他核酸分子可通过下列给予：直接注射″裸露″核酸分子(U.S.专利5,679,647)或调配成组成物的核酸分子，其是连同有助于核酸分子被细胞提取之一或多个其他药剂，例如皂素(参阅，举例来说，U.S.专利5,739,118)或阳离子型聚胺(参阅，举例来说，U.S.专利5,837,533)；通过微粒体轰击(举例来说，经由使用″基因枪″；Biolistic，Dupont)；通过以脂质、细胞-表面受体或转染剂包复核酸分子；通过将核酸分子封于微脂体、微粒体、或微胶囊内；通过给予联结至现有进入细胞核的肽的核酸分子；或通过给予联结至参与受体介导内吞作用的配体的核酸分子，其可用于专对特异地表达该受体的细胞类型。
可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含膜融合病毒肽，以干扰内体，使得核酸免于被溶酶体降解；或该核酸分子可靶向细胞特异性摄取且通过靶向特异性受器而于体内表达。此外，一个在细胞核引进、表达与累积反义寡核苷酸的有效方法说明于U.S.专利6,265,167，该方法使反义寡核苷酸和细胞核内的正义mRNA杂交，由此防止反义寡核苷酸被处理或运送到细胞质。本发明也设想通过本领域现有的同源重组将核酸分子引进细胞内并随后并入宿主细胞DNA来表达。
多核苷酸也可并入适宜表达载体。适用于基因治疗应用的众多载体为本领域所现有(参阅，举例来说，Viral Vectors：Basic Science andGeneTherapy，Eaton Publishing Co.(2000))。
表达载体可为质体载体。生成与纯化质体DNA的方法是快速直接。此外，质体DNA通常不嵌入宿主细胞基因组，而是作为一独立单位维持游离基因体定位，避免染色体镶嵌可能会引发的基因毒性问题。现今很容易在市面上购得各式各样质体并包括这些衍生自大肠杆菌和枯草芽孢杆菌者，同时许多被特别设计用于哺乳动物***。可用于本发明的质体例子包括，但不限于，真核表达载体pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV与pAd/TR5/GFPq(Massie et al.，(1998)Cytotechnology28:53-64)。在例示实施方案中，质体为pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)、或PVAX Invitrogen)。
表达载体可为以病毒为基础的载体。以病毒为基础的载体例子包括，但不限于，这些衍生自复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒与腺相关病毒者。逆转录病毒载体与腺相关病毒载体是目前用于将外源性寡核苷酸或基因转移至体内，尤其至人类的首选重组基因传递***。这些载体提供基因进入细胞的有效传递，所转移的核酸稳定地嵌入宿主染色体DNA。对于使用反转录病毒的一个重要前提是确保其使用的安全性，尤其是论及在细胞群散布野生型病毒的可能性。可衍生逆转录病毒型载体的逆转录病毒包括，但不限于，莫罗尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)、脾坏死病毒(spleen necrosis virus)、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽类白血症病毒(avian leukosis virus)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus)、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒(Myeloproliferative Sarcoma Virus)、和乳腺瘤病毒(mammary tumour virus)。特定逆转录病毒包括pLJ、pZIP、pWE与pEM，它们为本领域技术人员众所周知。
组成物
含上述Lgr5+SB细胞及有或无其他活性药剂的药学组成物可通过将治疗有效量的细胞或活性药剂/化合物，以及任择的其他活性物质和药学上可接受的载剂混合来制备。取决于给药途径，载剂可具不同形式。其他活性物质例子包括现有或以上述筛选方法鉴定的活性化合物。
上述药学组成物可使用习用药学赋形剂与制备方法制备。所有赋形剂可和崩解剂、溶剂、粒化剂、保湿剂、及黏结剂混合。如本案所用者，“有效量”或‘治疗有效量’术语指的是致使特定病症的至少一个症状或参数有可测量改善的份量。上述干细胞的治疗有效量可通过本领域现有方法测定。治疗病症的有效量可轻易地以具本领域通常技术者现有的经验方法测定。欲给予患者的确切量将视病症状态和严重程度及患者身体状况而有所不同。任何症状或参数的可测量改善可由本领域技术人员测定或由患者告知医师。将理解到的是上述病症的任何症状或参数的任何临床上或统计学上的显著减退或改善落于本发明范畴以内。临床上显著减退或改善意指患者及/或医师可察觉到。
“药学上可接受的”术语是指该类组成物的分子单位及其他成份是生理上可耐受的且在给予人类时通常不会产生非所欲的反应。优选地，″药学上可接受的″术语意指经联邦或州政府管理机构批准或列示于美国药典或用于哺乳动物且更尤其用于人类的其他公认药典。药学上可接受的盐类、酯类、酰胺、及前药指的是这些-在可靠的医学判断范围内-适用于接触患者组织而无过度毒性、刺激性、过敏反应等等、相称于合理利益/风险比且就其预期用途而言有效的盐类(例如羧酸盐、氨基酸加成盐)、酯类、酰胺、及前药。
应用于上述药学组成物的载剂是指稀释剂、赋形剂、或用以给予化合物的载体。该类药学载剂可为无菌液体，例如水与油类。水或水性溶液、盐水溶液、及葡萄糖水溶液与甘油溶液是优选运用作为载剂，尤其用于可注射溶液。适宜的药学载剂说明于E.W.Martin所著″Remington′sPharmaceutical Sciences″，第18版。
上述Lgr5+SB干细胞可经由输液或注射(举例来说，静脉内、鞘内、肌内、腔内、气管内、腹腔内、或皮下)、口服、经皮、或其他本领域现有方法给予受试者。给药可为每两周一次、一周一次、或更经常，但在疾病或病症维护阶段期间的频率可减少。
异源与自体细胞两者都可使用。在前者情况中，应进行HLA-配对，以避免或尽量减少宿主反应。在后者情况中，来自受试者的自体细胞经富集与纯化并储存以供后续使用。该细胞可在宿主或接植T细胞的存在下离体培养并再次引进宿主内。此可具有宿主将细胞认作自身的优点且更优选提供了T细胞的活性降低。
剂量与给药频率将取决于临床体征，其确认维持缓解期且本领域技术人员现有的至少一个或多个、优选多于一个急性期临床体征减少或不存在。更通常地，剂量与频率将部份取决于预期以上述组合物治疗的疾病病况或病症的病理征兆及临床与亚临床症状的减退。剂量与给药方案可视给药者年龄、性别、身体状况还有就待治疗患者或哺乳动物而言的共轭物益处与副作用以及医师的判断来调整，如同本领域技术人员所理解者。在上述所有方法中，干细胞可以每次1x104至1x1010个给予受试者。
评估方法
本案揭示的Lgr5+SB干细胞与方法可用于评估受试者。一般而言，年轻健康受试者有相对高百分比的干细胞。已显示这些细胞的数量或百分比是随着受试者年纪或由于基因缺陷所致或暴露在不良环境因素而减少。此减少现象危害受试者的干细胞相关能力，包括受伤后修复组织的能力。
这些变化可用于评估罹患老化相关病症的受试者风险。举例来说，假使受试者具高于平均的水平，他或她则有受伤后修复组织的优越能力及发生癌症的高风险。换言之，来自该受试者的样品中的上述干细胞的高水平指出受试者有着具备下列的年轻发展状态：(1)修复组织损伤、从受伤中恢复、防御病原体的能力较好以及(2)发生自身免疫疾病、心血管疾病、糖尿病、及其他和老化相关的病症的机率较低。另一方面，该类较高水平和罹癌的较高风险为正相关。
以下特定实施例应解读成仅为例示，而非以任何方式限制揭示内容的其余部分。无需进一步阐述，相信本领域技术人员可基于本案说明利用本揭示内容至其最大限度。本案引用的所有出版物是以参照方式将其整体内容并入。另外，以下推论的任何机制不以任何方式局限请求保护的范围。
实施例1：分离Lgr5+SB细胞群
如先前上文所述取得人类血液样品与骨髓样品并置于抗凝结EDTA管或肝素管。参阅US2012/0034194。于4℃培育该管6至48小时后，样品分成两层。
底层-呈现红色-几乎全由红(RBC)与白血细胞构成，同时顶层含有SB细胞。由于SB细胞在顶层，所以我们假设它们小于6μm-宽RBCs。此分隔将顶层内的细胞身份限缩在SB细胞、血小板、以及包括微粒体、微泡、及凋亡小体的细胞外囊泡，因为它们都落于此尺寸限制以内。血小板与细胞外囊泡在DAPI或SYTO染色呈现阴性，因为它们缺少细胞核。同样地，凋亡小体缺少完整染色体，从而产生阴性FISH染色体染色。我们的结果指出平均少于10％顶层细胞为DAPI阳性；该类DAPI阳性细胞排除血小板与细胞外囊泡。为了验证完整染色体结构的存在，我们对SB细胞进行FISH Y染色体染色。将来自男性供给者的SB细胞接种在通透孔(transwell)顶部并将来自女性供给者的大型***涂在底部。待培育两至三天后，SB细胞通过通透孔的5μm滤网。使用Y-染色体荧光靶向来自男性供给者的细胞。在大型***周围，有一个小型细胞在FISH与DAPI染色都为阳性，指出SB细胞含有完整染色体结构。SB细胞的阴性膜联蛋白V(Annexin V)染色进一步确认其身份。于是，SB细胞非为凋亡小体、血小板或细胞外囊泡。
为了另外地将SB混合物(即顶层)定性，使用流式细胞术分析样品。通过以小珠尺寸作为参照比对未纯化血液样品，我们发现闸门G2的尺寸小于1μm，指出此区大部分由微粒体或微泡构成。闸门G3，其包括直径大于1μm的细胞，包括三群：G4、G5、与G6。使用RBC裂解缓冲液的分析指出RBCs出现在G6区，其中此区的99.6％细胞确认为CD235a-阳性与SYTO核阴性。G5区的细胞也比RBCs(G6)大并推定为白血细胞(WBCs)，因这些细胞为CD11b染色阳性。
SB混合物的细胞出现在G4区，确认了SB细胞小于RBCs。后期纯化流程移除人类血液与骨髓样品中的所有RBCs(G6)与WBCs(G5)。只有在G4，多于80％的衍生自人类血液的细胞为CD9染色阳性，CD9为血小板标记；近乎所有这些细胞被P1区捕获。CD9阴性细胞包含G4群的10-20％并为P2区所捕获。在此区的闸控透露78％细胞为SYTO核染色阳性，而61.7％细胞为Lgr5阳性。分析了30个骨髓与70个末稍血液样品的细胞。
Lgr5+细胞也被发现为Oct4+与Nanog+、以及CD133-、CD66e-、Sox2-、CD4-、CD8-、CD9-、CD10-、CD11-、CD16-、CD17-、CD18-、CD19-、CD20-、CD21-、CD31-、CD42-、CD63-、CD34-、Lin-、CD38-、CD90-、CD45-、及CD349-。
也调查SB混合物中存在其他小型干细胞-即卵裂球样干细胞(BLSCs)、及极小型胚胎样干细胞(VSELs)的可能性，其分别使用CD66e与CD133标记。SB混合物中少于1％细胞表达CD66e或CD133。
实施例2：Lgr5+SB细胞的增殖与分化
Lgr5+SB细胞使用两种方法从SB细胞群分离：FACS分类法(FACSorting)与磁性富集法。PE选择试剂盒(StemCell Technologies，目录号18551)用于分离Lgr5+细胞。使SB细胞群于室温(RT)和PE选择掺合物(使用Lgr5-PE抗体)培育15分钟并和磁性纳米颗粒培育10分钟。将混合物放入磁体并于RT静置5分钟。随后将上清液丢弃，并涂布细胞以进一步培养。或者，将SB群的细胞以Lgr5-PE染色并使用UCLA流式细胞术核心实验室的BD FACSAria经由FACS分类法分离。
这些纯化的Lgr5+细胞于体外收集与试验。培养一段时间后，细胞成长至直径介于6与25μm之间。此增殖与尺寸增加暗示小型干细胞的存在。
将Lgr5+细胞培养在不同类型的分化培养基中，每2-3天做更换。如先前所述，就肝细胞分化而言，细胞系培养在三种不同类型的培养基中：含3％马血清的DMEM高糖培养基、1X抗生素、1X L-谷氨酰胺、与5ng/mL活化素，历时4天；含3％马血清的DMEM高糖培养基、1X抗生素、1XL-谷氨酰胺、20ng/mL bFGF、与5ng/mL hBMP2，历时10天；以及含2％马血清的Hepato ZYME SFM(得自Life Technologies Gibco)、1X抗生素、10ng/mL HGF、1x 10-8M Dex、与OSM 10ng/mL，历时10至15天。参阅Talens-Visconti et al.，World J Gastroenterol 12:5834-5845。就神经、成骨与成脂分化而言，细胞系分别生长在神经元、骨细胞、与脂肪细胞分化培养基中，这些系获自Life Technologies并根据制造商提供的方案使用。就骨细胞与脂肪细胞染色/检测而言，使用骨细胞(Millipore，目录号ECM815)与脂肪细胞检测试剂盒。此体外定性系进行四次(三次以使用StemCell PE分离试剂盒纯化的细胞及一次以FACS分类法纯化的细胞)。
为测试中胚层分化，将细胞培养在脂肪生成培养基中。相比于负对照组，油红O染色指出脂肪细胞的数量显著增加。该细胞在肝细胞分化培养基中也转成肝细胞和内胚层细胞。这些细胞分泌50ng/ml白蛋白至培养基中并表达数种肝细胞特异性基因，例如白蛋白、FoxA2、及甲胎蛋白。为调查外胚层分化潜能，将细胞以类似方式培养在神经元分化培养基中。神经丝蛋白和MAPT表达随着培养一天天增加。ICC神经丝蛋白染色的结果也确认细胞分化成神经元的潜能。这些数据显示所纯化的Lgr5+细胞能够在体外分化成三种不同胚层的细胞。
实施例3：Lgr5+SB细胞植入SCID小鼠
进行所分离Lgr5+SB细胞的体内追踪试验。于查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)将来自人类男性骨髓样品的Lgr5+SB细胞纯化并再次悬浮于供注射用的含5％人类白蛋白的PBS。使两组六只雌性SCID小鼠(6-8周龄)在注射前接受亚致死(2Gγ)伽玛辐射。以1x 105个细胞注射各小鼠两次，第一次就在辐射后及24小时之后再一次。负对照组由注射PBS的小鼠组成。在第一次注射后60天收集组织。一半组织由查尔斯河实验室制成冷冻切片，将其余组织送至StemBios公司的RNAlater试剂，以用于RNA水平的基因表达分析。FISH技术-运用荧光人类特异性Y-染色体探针-系用于在体内检测人类细胞。
使用缺少T细胞与B细胞的SCID小鼠确定了亚致死辐射将清除NK细胞，其可能导致Lgr5+SB细胞被排斥。此外，该类辐射会在鼠身创造受伤信号，这对于引导干细胞至受伤部位进行修复是很重要的。
如同在收集的脑、肝、与肌肉组织样品所观察到的，cyc3-DAPI双阳性的细胞系源自人类。这些结果在实验组的全部六只小鼠是一致的，暗示受伤信号引导Lgr5+SB细胞移至受伤部位。为测定移至该器官的细胞是否能够分化，进行RT-PCR。在这些器官中评估β肌动蛋白、α1-抗胰蛋白酶、生肌因子4、及Tau基因表达。在此试验中，专对小鼠β肌动蛋白的引物作为正对照且肝、脑与骨骼肌的引物是人类特有的。结果证明人类Lgr5+SB细胞驻留在小鼠的脑、肝、与骨骼肌并在宿主内分化成肝细胞，神经元与骨骼肌。这些资料在实验组的全部六只小鼠也是一致的。
其他实施方案
本说明书揭示的所有特征可以任何组合结合。本说明书揭示的各项特征可以适用于相同、等效或类似目的的另一特征置换。于是，除非另有明确表示，否则揭示的各项特征仅为等效或类似特征的通称系列的例子。
已说明许多实施方案。然而，将理解到的是，可以进行各种修改而不逸离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案系落于下列请求保护的范畴内。

Claims (22)

1.一种分离的体干细胞，其尺寸为2至小于6微米且为Lgr5+。
2.如权利要求1的分离的体干细胞，其中该分离的体干细胞为多能或全能。
3.如权利要求1的分离的体干细胞，其中该细胞为人类细胞。
4.如权利要求1的分离的体干细胞，其中该细胞为非粘附型。
5.如权利要求1的分离的体干细胞，其中该细胞为CD9-CD349-。
6.如权利要求5的分离的体干细胞，其中该细胞为Oct4+、Nanog+、CD133-、CD66e-和Sox2-。
7.一种制备体干细胞群体的方法，该方法包括：
从受试者取得含多个细胞的组织样品，
在容器内以EDTA或肝素培育该样品，直至该样品被分成上层与下层，
收集该上层，和
从该上层分离出尺寸为2至小于6微米且为Lgr5+的体干细胞群体。
8.如权利要求7的方法，其中该组织样品为血液、骨髓、骨骼肌或脂肪组织。
9.如权利要求7的方法，其在取得步骤与培育步骤之间进一步包括，以胶原酶消化该组织样品，其中该组织样品为骨骼肌或脂肪组织。
10.如权利要求7的方法，其中该受试者为人类。
11.如权利要求7的方法，其中分离步骤通过流式细胞术进行。
12.如权利要求7的方法，其在收集步骤后进一步包括，以ADP培育该上层。
13.如权利要求7的方法，其中培育步骤通过以肝素培育该样品进行，并且在收集步骤之后和分离步骤之前，以EDTA培育该收集的上层。
14.一种通过权利要求7的方法所制备出的体干细胞群体。
15.如权利要求14的群体，其中该体干细胞为CD9-CD349-。
16.如权利要求15的群体，其中该体细胞为Oct4+、Nanog+、CD133-、CD66e-和Sox2-。
17.如权利要求14的群体，其中该群体是由取自受试者的血液或骨髓样品所制备。
18.如权利要求14的群体，其中该受试者为人类。
19.如权利要求14的群体，其中该体干细胞为非粘附型。
20.一种细胞库，其包含体干细胞的多个群体，该多个群体通过权利要求7的方法，由取自不同受试者的血液或骨髓样品所制备。
21.权利要求14-19任一项的体干细胞的群体用于治疗受试者的疾病或病况的用途，其中该疾病或病况选自由下列组成的组：肌肉变性病症、神经变性病症、肌肉受伤、癌症或自身免疫病症。
22.如权利要求21的用途，其中该肌肉变性病症选自由下列组成的组：肌营养不良、纤维肌痛、肌病变、皮肌炎、多发性肌炎、横纹肌溶解和心肌炎。
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