CN105687245A

CN105687245A - 制备注射液的方法

Info

Publication number: CN105687245A
Application number: CN201510830889.0A
Authority: CN
Inventors: 王俊麟
Original assignee: Stembios Technologies Inc
Current assignee: Stembios Technologies Inc
Priority date: 2014-12-13
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2016-06-22
Also published as: TW201629212A; EP3031463A1; US20190105346A1; US20160166611A1; HK1223283A1; JP2016113452A

Abstract

本发明公开了一种制备注射液的方法，其包括：(1)将血液样本和二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使混合液分成两层或两层以上(即混合液形成两个或两个以上的分离层)，其中一个分离层内的液体含有小体干细胞，例如SB细胞；(2)从混合液收集或取得该液体；以及(3)在收集或取得该液体之后，将该液体和无钙离子(Ca²⁺)的溶液进行混合，继而形成所述的注射液。此注射液可以用于治疗自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。

Description

制备注射液的方法

技术领域

本发明涉及一种制备含有细胞的溶液的方法，特别涉及一种制备含有(体)干细胞的注射液的方法。

背景技术

干细胞具有自我更新(self-renewal)的能力，因此可以产生更多的干细胞并变成几乎任何一种的特化细胞(specializedcell)。干细胞研究被视为是生物医学未来最重要的领域之一，再加上近年来相关产业也加速成长，突显人们对于干细胞在医疗应用上的需求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种制备或制作干细胞溶液(或称为含有干细胞的溶液)的方法，其中该溶液可以做为用于治疗自体免疫疾病的注射液。

本发明的另一目的在于提供一种治疗自体免疫疾病的方法。

为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)的方法，该溶液可作为一种治疗自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。所述方法包括以下步骤：(1)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)均匀混合后所形成的第一混合液放在温度为2至12摄氏度(较佳为2至7摄氏度)的环境中静置3至72小时、3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时，使第一混合液分成两层或两层以上，即第一混合液形成两个或两个以上的分离层(例如包含一上分离层和一下分离层)，其中一个分离层(例如上分离层或最上层的分离层)内的液体(例如上清液)含有血小板(尺寸可为小于6微米[μm])、一种或多种的体干细胞(例如是CD349(+)体干细胞和Lgr5(+)体干细胞)、二价阳离子螯合剂与生长因子；(2)从第一混合液取得该液体；以及(3)在取得该液体之后，将该液体和无钙离子(Ca²⁺)的溶液或培养液进行混合，继而形成第二混合液。无钙离子的溶液或培养液也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水(normalsaline)。第二混合液可以是前述的含有干细胞的溶液。或者，上述方法可以进一步包括：过滤第二混合液，继而制备出或制作出含有干细胞的溶液。

为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)的方法，该溶液可作为一种治疗自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。所述方法包括以下步骤：(1)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)在温度为2至12摄氏度(最佳为2至7摄氏度)的环境中培养或培育一段时间(例如3至72小时、3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时)，使血液样本分成两层或两层以上，即血液样本形成两个或两个以上的分离层(例如包含一上分离层和一下分离层)；以及(2)取得该些分离层其中之一，成为含有干细胞的溶液。取得的分离层含有血小板(尺寸可为小于6μm)、体干细胞(包括CD349(+)体干细胞和Lgr5(+)体干细胞)、二价阳离子螯合剂以及生长因子。或者，上述方法可以进一步包括：将取得的分离层和一种无钙离子(Ca²⁺)的溶液或培养液进行混合，继而形成含有干细胞的溶液。无钙离子的溶液或培养液也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水。

在上述两种方法中，体干细胞的尺寸(如大小)可为1μm至6μm，较佳为大于1或2μm至小于6μm。体干细胞可以包含尺寸大于2μm至小于6μm的CD66e(+)体干细胞(也就是类卵裂球干细胞)。CD349(+)体干细胞也为CD9(+)，而且尺寸可为大于2μm至小于6μm。Lgr5(+)体干细胞也为Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD66e(-)、Sox2(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)与CD349(-)。Lgr5(+)体干细胞的尺寸可为大于2μm至小于6μm。在含有干细胞的溶液中，Lgr5(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD349(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，白血球占尺寸大于2μm至小于20μm的细胞的百分比为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2μm至小于10μm的细胞的百分比为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，含有干细胞的溶液中少于1％细胞表现或表达CD133。含有干细胞的溶液可以含有一盐类，例如氯化钠(NaCl)。当干细胞驱动剂(例如含有褐藻糖胶的化合物)施用在一个体(如人或动物)一段时间(如1-6小时)时，血液样本可取自于该个体的周边血液。

为达到上述的目的，本发明提供一种用于治疗自体免疫疾病(如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。该注射液(即上述的含有干细胞的溶液)含有尺寸大于2μm至小于6μm的CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)、尺寸大于2μm至小于6μm的Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)以及尺寸大于2μm至小于6μm的CD66e(+)体干细胞(即类卵裂球干细胞)。注射液也还可以含有二价阳离子螯合剂(如乙二胺四乙酸)、生长因子以及/或是盐类(如氯化钠)。在注射液中，Lgr5(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD349(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD66e(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为小于6％(较佳为小于5％或4.5％)，白血球占尺寸大于2μm至小于20μm的细胞的百分比为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2μm至小于10μm的细胞的百分比为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，注射液中少于1％细胞表现或表达CD133。

为达到上述的目的，本发明提供一种治疗人类个体自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的方法。这个方法包括将一有效量的上述注射液投予对其有需求的一人类个体，以治疗该人类个体的自体免疫疾病。注射液中的Lgr5(+)体干细胞、CD349(+)体干细胞与CD66e(+)体干细胞是该人类个体自体的。上述对人类个体投予注射液的步骤可包括：将与无钙离子(Ca²⁺)的溶液或培养液混合的注射液通过静脉注射到该人类个体。无钙离子的溶液或培养液可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水。

下面将结合具体实施例以及附图对本发明进行详细的描述，使本发明的此等以及其他组件、步骤、特征、效益及优势变得明朗。

附图说明

图1为本发明一实施例的治疗自体免疫疾病的流程图；

图2为褐藻补充品的内容/成分信息；

图3为制作或制备含有干细胞的溶液的流程图；

图4为六位人类受试者在口服褐藻补充品前后的干细胞数据；

图5A和图5B为一人类受试者在接受颗粒性白血球聚落刺激因子(granulocyte-colonystimulatingfactor，简称GCSF)注射疗程前后的流式细胞仪数据(flowcytometrydata)；

图6A为前向散射系数(forwardscatteringcoefficient，简称FSC)对侧向散射系数(sidescatteringcoefficient，简称SSC)的流式细胞仪点状图(flowcytometrydotplot)；

图6B为使用流式细胞分析(flowcytometryanalysis)获得的荧光直方图；

图6C为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；

图7A为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；

图7B至图7G为使用流式细胞分析获得的荧光直方图。

本代表图的符号简单说明：

2a垂直线

10-14步骤

21-23步骤

虽然在附图中已描绘某些实施例，但本领域技术人员应了解，所描绘的实施例为说明性的，且可在本发明的范畴内构想并实施彼等所示实施例的变化以及本文所述的其他实施例。

具体实施方式

附图揭示本发明的说明性实施例，但其并未阐述所有实施例。可另外或替代使用其它实施例。为节省空间或更有效地说明，可省略显而易见或不必要的细节。相反，可实施一些实施例而不揭示所有细节。当相同数字或标号出现在不同附图中时，其是指相同或类似组件或步骤。当以下描述连同随附附图一起阅读时，可更充分地理解本发明，随附附图的性质应视为说明性而非限制性的。

以下先介绍本发明的各种定义与描述，然后再详细说明本发明的实施例。

细胞尺寸(Z)的定义:

在本发明中，后续段落提及的尺寸(Z)可用于描述细胞(例如干细胞或生物细胞)的大小。尺寸(Z)可以(但不限定)被描述或定义为：(1)细胞生物学领域或干细胞领域对于细胞的大小或代表长度的传统定义、(2)细胞的直径(特别是当细胞的形状实质上为球体时)、(3)细胞的长轴长度(特别是当细胞的形状实质上为椭圆体时)、(4)细胞的宽度(当细胞的形状近似于正方体时)、(5)细胞的长度(当细胞的形状近似于长方体时)或是(6)细胞的最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)获得的细胞影像或是通过流式细胞仪(flowcytometer)获得的数据(例如二维点、轮廓或密度图)可以用来判定或测量尺寸(Z)—不论是直径、长度、宽度或是最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜获得的细胞影像可以是细胞的二维剖面图或立体结构。举例来说，经由光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)可获得一个二维剖面影像，然后通过测量二维剖面影像中细胞的最大横断面或横向尺寸就可以获得细胞的尺寸(Z)。

干细胞定义:

体干细胞(somaticstemcell)，也称为成体干细胞(adultstemcell)，可以在骨髓、脂肪或周边血液等器官或组织中发现，并且具有与所有干细胞相同的基本特征。体干细胞是未特化的细胞(unspecializedcell)或未分化的细胞(undifferentiatedcell)，而且能够分化成特定的细胞种类。“体干细胞”术语在本发明中不属于或不包含胚胎干细(embryonicstemcell)；换句话说，本发明中的体干细胞不是取自于或来自于胚胎或胚胎组织。

体干细胞有许多不同的种类，包括全能干细胞(totipotentstemcell)、多功能干细胞(pluripotentstemcell)、多潜能干细胞(multipotentstemcell)以及先驱干细胞(progenitorstemcell)。先驱干细胞也可以称为专一性干细胞或单能干细胞(unipotentstemcell)。类卵裂球干细胞(blastomere-likestemcell，简称BLSC)属于全能干细胞或多功能干细胞。极小类胚胎干细胞(verysmallembryonic-likestemcell，简称VSEL)属于多功能干细胞。SB-1细胞和SB-2细胞属于多功能干细胞或多潜能干细胞。间质干细胞(mesenchymalstemcell，简称MSC)、造血干细胞(hematopoieticstemcell，简称HSC)、多潜能成体先驱细胞(multipotentadultprogenitorcell，简称MAPC)、骨髓多潜能干细胞(bonemarrowderivedmultipotentstemcell，简称BMSC)以及多潜能成体干细胞(multipotentadultstemcell，简称MASC)属于多潜能干细胞。神经干细胞(neuralstemcell)、视网膜干细胞(retinastemcell)、嗅球干细胞(olfactorybulbsstemcell)、上皮干细胞(epidermalstemcell)、肌肉干细胞(musclestemcell)、肠道干细胞(intestinestemcell)、胰脏干细胞(pancreaticstemcell)、心脏干细胞(heartstemcell)、肝脏干细胞(liverstemcell)、肾脏干细胞(kidneystemcell)、内皮干细胞(endothelialstemcell)、脂肪干细胞(adipocyteoradipose-derivedstemcell)、成体骨髓多元性诱导细胞(marrow-isolatedadultmultilineageinduciblecell)、前间质干细胞(pre-mesenchymalstemcell，简称pre-MSC)、间质先驱细胞(mesenchymalprogenitorcell)、造血先驱细胞(hematopoieticprogenitorcell，简称HPC)、多潜能先驱细胞(multipotentprogenitorcells，简称MPP)、谱系限制先驱细胞(lineage-restrictedprogenitorcell，简称LRP)、共同髓原先驱细胞(commonmyeloidprogenitorcell，简称CMP)以及共同淋巴球先驱细胞(commonlymphocyteprogenitorcell，简称CLP)属于先驱干细胞。

在后续段落中，跟随在一细胞(表面)标记后面的符号“+”表示细胞(例如干细胞)可以表现或表达该细胞(表面)标记，也就是说流式细胞仪可以经由(特定标记用的)抗体侦测到存在于细胞表面的该细胞(表面)标记。跟随在一细胞(表面)标记后面的符号“-”表示细胞(例如干细胞)无法表现或表达该细胞(表面)标记，也就是说该细胞(表面)标记没有存在于细胞的表面，而且流式细胞仪也无法经由(特定标记用的)抗体侦测到该细胞(表面)标记。因此，正号“+”是指细胞(例如干细胞)可以表现或表达细胞(表面)标记，负号“-”则是指细胞(例如干细胞)无法表现或表达细胞(表面)标记。

SB-1细胞为含有细胞核的多功能或多潜能干细胞，并且是CD349(+)细胞。CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)也被发现为CD9(+)、Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD90(-)、CD34(-)与Sox2(-)。CD349(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米(micrometer，符号μm)、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，SB-1细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。SB-1细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD349，因而能够以CD349(+)为特征。

SB-2细胞为含有细胞核的多功能或多潜能干细胞，并且是Lgr5(+)细胞。Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)也被发现为Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD66e(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)、CD349(-)与Sox2(-)。Lgr5(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，SB-2细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。SB-2细胞可以表现或表达细胞(表面)标记Lgr5，因而能够以Lgr5(+)为特征。在本发明中，SB细胞包含CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)和Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)。

类卵裂球干细胞(BLSC)为含有细胞核的全能或多功能干细胞，并且是CD66e(+)细胞。CD66e(+)体干细胞(即类卵裂球干细胞)的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，类卵裂球干细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。类卵裂球干细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD66e，因而能够以CD66e(+)为特征。

极小类胚胎干细胞(VSEL)为含有细胞核的多功能干细胞，而且可以是CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞。属于极小类胚胎干细胞的CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞也被发现为CD45(-)与Lin(-)。CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)可以是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。就CD133(+),CD45(-),Lin(-)体干细胞而言，这种极小类胚胎干细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD133，但是无法表现或表达细胞(表面)标记CD45和Lin，因此这种极小类胚胎干细胞能够以CD133(+)、CD45(-)和Lin(-)为特征。就CD34(+),CD45(-),Lin(-)体干细胞而言，这种极小类胚胎干细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD34，但是无法表现或表达细胞(表面)标记CD45和Lin，因此这种极小类胚胎干细胞能够以CD34(+)、CD45(-)和Lin(-)为特征。

间质干细胞(MSC)为含有细胞核的多潜能干细胞，并且可以是CD13(+)体干细胞、CD29(+)体干细胞、CD44(+)体干细胞、CD73(+)体干细胞、CD90(+)体干细胞或CD105(+)体干细胞。间质干细胞可以表现下列一种或多种的细胞(表面)标记：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。因此，间质干细胞可以具有下列一种或多种的特征：CD13(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD73(+)、C90(+)和CD105(+)。间质干细胞有各种非常不同的细胞群，因而具有各种的尺寸及形状。例如，某些类型的间质干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。其它类型的间质干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)则是大于6微米、7微米或10微米。

造血干细胞(HSC)为含有细胞核的多潜能干细胞，而且可以是CD150(+),CD244(-),CD48(-)细胞与CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)细胞。属于造血干细胞的CD150(+),CD244(-),CD48(-)体干细胞与CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)可以是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。就CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)体干细胞而言，这种造血干细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD34，但是无法表现或表达细胞(表面)标记cKit、CD38和Lin，因此这种造血干细胞能够以CD34(+)、cKit(-)、CD38(-)和Lin(-)为特征。就CD150(+),CD244(-),CD48(-)体干细胞而言，这种造血干细胞可以表现或表达细胞(表面)标记CD150，但是无法表现或表达细胞(表面)标记CD244和CD48，因此这种造血干细胞能够以CD150(+)、CD244(-)和CD48(-)为特征。

行为或方法(X)的描述：

以下列出行为或方法(X)的范例。这些行为或方法被认为可以有效增加一个体(例如人体或非人体)体内某一种或特定几种干细胞的数量。该非人体可以是动物。

行为或方法(X)包括：

1.服用药物，例如合成药物或含有天然萃取物的药物；

2.服用草药或中药，例如冬虫夏草、人参、枸杞、灵芝、牛樟芝以及/或是巴西蘑菇；

3.服用营养品或膳食补充品(dietarysupplement)，例如营养片或营养粉，该营养品或膳食补充品可以含有下列一种或多种的物质或成分：维他命(如维他命A、维他命B、维他命B群、维他命B₁₂、维他命D、维他命D₃、维他命E等)、大量与微量矿物质(如钙、钠、钾、氟、溴、铬、碘、硅、硒、铍、锂、钴、钒、镍等)、多糖(polysaccharide)、含岩藻糖的高分子活性糖蛋白(highmolecularweightfucose-containingglycoprotein)、海藻(包括绿藻、蓝绿藻、褐藻等)、岩藻糖(fucose)、褐藻的主要成分—褐藻糖胶(fucoidan)、小分子褐藻糖胶(oligofucoidan)、藻类、含有褐藻糖胶的褐藻(如生长或生产在日本冲绳县的褐藻)、日本的水云(mozuku)、绿藻、蓝绿藻(或称蓝藻)、褐藻(包括水云、昆布(kelp)、裙带菜(undariapinnatifida)、羊栖菜(sargassumfusiforme)等)、植化素(phytochemical)(如异黄酮素(isoflavones)、植物***(phytoestrogen)等)、茄红素(lycopene)、表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechingallate，简称EGCG)、绿茶素(greenteaessence)、糖质营养素(gluconutrients)(如半乳糖(Galactose)、木糖(Xylose)、葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Mannose)、乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)、乙酰神经胺酸(N-acetylneuraminicacid)等)、鱼油、香桩、取自植物、叶子、果实、蔬菜、鱼、海藻或藻类的营养素；

4.励行素食饮食；

5.食用健康食品或有机食品；

6.服用另类(非传统的)药物；

7.接受另类疗法或另类治疗，例如葛森疗法(Gersontherapy)或布鲁士癌症疗法(theBreusscancercure)；

8.接受针灸治疗；

9.接受按摩，例如足底按摩；

10.做运动，例如走路、慢跑、跳舞、体操、瑜珈、有氧运动以及/或是太极拳；

11.睡觉(其目的在于评估睡眠质量)；

12.冥想；

13.进行由个人、保健专家或医生设计的健康改善计划或疾病治疗计划；

14.服用某种可以改善体内器官健康状况的营养品，例如服用可以改善***健康状况的茄红素；

15.进行复健计划，以治疗伤害、治疗由手术造成的创伤或是治疗疾病；

16.饮用药酒(药酒乃是将一种或数种药材浸泡在酒里存放一段时间而制成)，例如饮用人参药酒(人参药酒是将人参浸泡在高酒精浓度米酒里一个月的时间而制成)；

17.服用政府部门或机构(如美国食品药物管理局)核准用于治疗特定疾病(如癌症、皮肤病、肾脏病等)的一种或数种药物；

18.接受政府部门核准用于治疗特定疾病(如癌症、皮肤病、肾脏病等)的一种或数种治疗方法；

19.从事或参与宗教活动，例如祷告或拜神等；

20.接受阳光(或日光)直接照射或间接照射，接受照射的时间可以是:(1)日出前10分钟至日出后50分钟的早晨时段(此时含有大量的红外线)、(2)上午11点30分(11:30AM)至下午12点30分(12:30PM)的中午时段(此时含有大量的紫外线)、或是(3)日落前50分钟至日落后10分钟的下午时段(此时含有大量的红外线)；

21.照射日光灯或发光二极管(LED)发出的光源，日光灯或发光二极管发出的光源可包含可见光的整个光谱(spectrum)、红外线的整个光谱、红光的整个光谱、绿光的整个光谱、蓝光的整个光谱、紫外线的整个光谱或混合上述一种以上光线的整个光谱；

22.进行或接受改善身体自愈力的计划、治疗、方法、仪器以及/或是***，例如病后、伤后或术后用于改善身体自愈力的方法或治疗(如高压氧治疗)；

23.饮用咖啡，例如黑咖啡；

24.喝茶，例如绿茶、红茶或茉莉花茶；

25.饮用红酒；

26.服用褪黑激素(melatonin)；

27.聆听音乐，例如莫扎特交响曲或贝多芬交响曲；

28.注射含有褐藻糖胶或小分子褐藻糖胶的物质，例如含有褐藻糖胶或小分子褐藻糖胶的营养品或补充品；

29.服用荷尔蒙补充品或是注射荷尔蒙；

30.注射颗粒性白血球聚落刺激因子(GCSF)，该因子为细胞激素(cytokine)或荷尔蒙(糖蛋白)，能够刺激骨髓产生颗粒性白血球(granulocyte)和干细胞，以释放它们到血流里；

31.接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程；以及

32.服用营养品、营养产品、营养液、营养饮料、营养补充剂或营养食品，其系含有：(1)各种的胺基酸(例如精胺酸(Arginine)、组胺酸(Histidine)、离胺酸(Lysine)、天门冬胺酸(Asparticacid)、麸胺酸(Glutamicacid)、丝胺酸(Serine)、羟丁胺酸(或称苏胺酸，Threonine)、天门冬酰胺酸(Asparagine)、麸酰胺酸(Glutamine)、半胱胺酸(Cysteine)、硒半胱胺酸(Selenocysteine)、甘胺酸(Glycine)、脯胺酸(Proline)、色胺酸(Tryptophan)、丙胺酸(Alanine)、缬胺酸(Valine)、异白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、甲硫胺酸(Methionine)、***酸(Phenylalanine)、酪胺酸(Tyrosine)等)、(2)均衡胺基酸(balancedaminoacid)、或是(3)九种人体必需胺基酸(也就是，组胺酸、异白胺酸、白胺酸、离胺酸、甲硫胺酸、***酸、羟丁胺酸、色胺酸以及缬胺酸)。例如，(a)含红豆、绿豆或黑豆发酵物的产品、(b)含一种或数种水果(例如甜菜(sugarbeet)、苹果、番石榴、奇异果、葡萄、菠萝、火龙果、青木瓜、西红柿、酪梨等)发酵物的液态物、饮料或饮品、(c)将一种或数种药材浸泡在酒里存放一段时间而制成的药酒，例如将人参浸泡在高酒精浓度的米酒里一个月时间而制成的人参药酒。

实施例：

图1为本发明一实施例的治疗自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的流程图。在本发明中，葛瑞夫兹氏症(Grover’sdisease)也称为短暂性棘皮松解皮肤病(transientacantholyticdermatosis)。请参阅图1所示，在步骤10中，一受治疗者(即一个体)进行或接受一行为或方法，例如上述行为或方法(X)其中之一。受治疗者可以是一人类(例如孩童、青少年、成年人或老年人)或是一动物(例如哺乳动物)。该动物可以是：灵长类动物(如猴子或大猩猩)、狗、啮齿动物(如老鼠或豚鼠)、猫、马、牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、鸟或大象。

例如，受治疗者可以在步骤10中服用或摄取一干细胞驱动剂，例如含褐藻糖胶的化合物。该含褐藻糖胶的化合物可以是褐藻补充品。图2为褐藻补充品的内容/成分信息。在图2中，一颗褐藻补充品含有重量百分比为80％的水云粉(mozukupowder)、重量百分比为15％的结晶纤维素(crystallinecellulose)、重量百分比为3％的蔗糖脂肪酸酯(sucrosefattyacidesters)以及重量百分比为2％的精细二氧化硅。水云粉可以萃取自或提取自生长在日本冲绳县周围海域中的水云褐藻(其为一种海藻)。然后，将水云粉混合结晶纤维素、蔗糖脂肪酸酯以及精细二氧化硅，以形成褐藻补充品颗粒(每颗含有0.1克的褐藻糖胶)。在步骤10中，受治疗者可以是服用或摄取20颗或20颗以上(例如至少30颗)的褐藻补充品，也就是说受治疗者服用或摄取2克或2克以上(例如至少3克)的褐藻糖胶。或者，在步骤10中，受治疗者也可以是注射颗粒性白血球聚落刺激因子(其系为一种干细胞驱动剂)或是接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程。

在图1的步骤11中，受治疗者在进行或接受上述行为或方法后等待一段(预定的)时间，例如15分钟至60分钟、20分钟至100分钟、30分钟至4小时、60分钟至90分钟、0.5小时至3小时、1小时至6小时、1小时至12小时、12小时至36小时或是36小时至50小时。经由步骤10和11，一种或多种特定种类的体干细胞(例如SB细胞)可以从受治疗者的骨髓流动到受治疗者的周边血液里，使受治疗者的周边血液变成富含前述的一种或多种特定种类的体干细胞(以下称为“特定体干细胞”)。特定体干细胞可以是或包含上述“干细胞定义”中的一种或多种干细胞。例如，特定体干细胞可以是或包含尺寸小于6μm(较佳则是大于1或2μm至小于6μm)的体干细胞，如CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)以及/或是Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)。或者，特定体干细胞可以是或包含尺寸介于1μm至6μm的体干细胞，如SB-1细胞、SB-2细胞、类卵裂球干细胞、极小类胚胎干细胞、间质干细胞以及/或是造血干细胞。

图4为一图表，示出一个实验中六位人类受试者C、L、M、W、Y和P的干细胞资料，而这些干细胞资料是由受试者C、L、M、W、Y和P的周边血液获得。在这个实验中，受试者C、L、M、W和Y每个人口服20颗图2描述的褐藻补充品。换句话说，受试者C、L、M、W和Y每个人以口服的方式摄取至少2克的褐藻糖胶。受试者P在这个实验中是作为一对照者(对照组)，因此没有服用前述的褐藻补充品。在图4中，0hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“服用褐藻糖胶前”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始时”；1.5hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖胶后的第1.5小时”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始后的第1.5小时”；24hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖胶后的第24小时”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始后的第24小时”。如图4所示，CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞(即SB细胞)的数量在服用褐藻糖胶后的第1.5小时有显著的增加，然而CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞的数量在对照试验开始后的第1.5小时并没有显著的增加。因此，服用或摄取褐藻糖胶(如褐藻补充品)可以驱动SB细胞(如CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞)移动到周边血液或血流里，让周边血液或血流富含SB细胞。

图5A示出第一血液样本里有关Lgr5(+)细胞(即SB-2细胞)的流式细胞仪数据，其中第一血液样本来自于一人类受试者在进行颗粒性白血球聚落刺激因子(GCSF)注射疗程前的周边血液。图5B显示第二血液样本里有关Lgr5(+)细胞的流式细胞仪数据，其中第二血液样本来自于该人类受试者在进行颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程后的周边血液。前述的颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程为：连续五天注射每日每公斤体重5微克(即5micrograms/kg/day)剂量的颗粒性白血球聚落刺激因子。在这个实验中，人类受试者连续五天每天注射一次剂量为5micrograms/kg/day的颗粒性白血球聚落刺激因子。第二血液样本来自于受试者在注射最后一次颗粒性白血球聚落刺激因子后大约第3.5小时的周边血液。图5A和图5B是利用流式细胞仪获得的结果或数据。在图5A和图5B中，区域Q5-LR中的黑点代表Lgr5(+)细胞。有关第一血液样本获得的图5A，区域Q5-LR中的Lgr5(+)细胞数量占区域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或细胞数量的百分比为1.6％。有关第二血液样本获得的图5B，区域Q5-LR中的Lgr5(+)细胞数量占区域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或细胞数量的百分比为8％。因此，注射颗粒性白血球聚落刺激因子可以驱动SB细胞(特别是Lgr5(+)细胞)移动到周边血液或血流里，让周边血液或血流富含SB细胞。

从上述的结果或数据可知，步骤10的行为或方法(例如食用褐藻补充品或接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程)可以驱动特定体干细胞(例如SB细胞)到受治疗者的周边血液里，使受治疗者的周边血液可以在进行或接受上述行为或方法后的一时间点(例如第1.5小时或1～6小时内)增加特定体干细胞的数量。因此，经由步骤10和步骤11可以使受治疗者的周边血液富含特定体干细胞，例如SB-1细胞以及/或是SB-2细胞。

请参阅图1所示，在步骤12中，立即从完成步骤11的受治疗者的周边血液取出、采集、获得或提取一血液样本，并放入到一个或多个含有二价阳离子螯合剂的第一容器(例如一个储存袋、一个或多个注射器、或是一个或多个采血管)中，然后让血液样本与二价阳离子螯合剂均匀混合，致使第一容器里有血液样本和二价阳离子螯合剂的第一混合液。在本发明中，治疗者的周边血液属于非胚胎组织。二价阳离子螯合剂为一抗凝剂(anticoagulant)。在本发明中，二价阳离子螯合剂可以是乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，简称EDTA)，譬如K2EDTA抗凝剂或K3EDTA抗凝剂，或者是柠檬酸盐(citrate)。每一个第一容器里可以含有70毫克(milligram，简称mg)以上的二价阳离子螯合剂，譬如含有90～900毫克的二价阳离子螯合剂、含有120～450毫克的二价阳离子螯合剂或是含有150～400毫克的二价阳离子螯合剂。血液样本含有许多细胞，包括尺寸小于或等于6微米的小细胞和尺寸大于6微米的大细胞。小细胞例如包含血小板(其尺寸为小于6微米)和小体干细胞(其尺寸为小于或等于6微米，较佳为大于1或2微米至小于或等于6微米)。譬如，小体干细胞包括特定体干细胞(例如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞以及造血干细胞。大细胞例如包含尺寸大于6微米的大体干细胞以及红血球和白血球等谱系细胞(lineagecell)。血液样本的量(体积)可以大于或等于20、30或45毫升，例如20～250毫升、60～500毫升、80～250毫升或100～200毫升。为了获得或形成第一混合液，每毫升的血液样本可混合1.5毫克或以上(较佳为1.6～2.0毫克)的二价阳离子螯合剂(例如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)。

接着，在图1的步骤13中，对第一混合液进行图3所示的步骤21至步骤23，继而成为含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)。请参阅图3所示，在步骤21中，将第一混合液存放在温度为2至12摄氏度(较佳为2至7摄氏度或大约4摄氏度)的设备中静置一段时间，例如3至72小时，较佳为3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时。前述的设备可以是冰箱或是可使物品保持低温的装置。在已存放一段上述时间的第一混合液中，特定体干细胞(例如SB细胞)通过二价阳离子螯合剂(如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)而被活化；换言之，特定体干细胞的细胞周期从G₀期被活化到(或称进入到)G₁期。该活化作用与二价阳离子螯合剂(例如K2EDTA或K3EDTA)抑制p53功能的能力(可能通过螯合Zn²⁺)有关，通过抑制p53的功能，可让特定体干细胞离开G₀静止期并进入细胞周期G₁。由于P53蛋白质需要Zn²⁺才能适当地折叠来形成功能性蛋白质，因此通过二价阳离子螯合剂螯合Zn²⁺会是活化特定体干细胞的关键步骤。另外，二价阳离子螯合剂也有可能螯合其它的二价离子(如Ca²⁺)来活化特定体干细胞。

在第一混合液已经处于上述温度一段前述时间之后，第一混合液会因重力的关系分成两层或以上，即第一混合液形成两个或两个以上的分离层(例如包含一上分离层和一下分离层)。该些分离层其中之一，例如上分离层或最上层的分离层，可以是上清液(supernatantliquid)，并可分为三个部分：血小板(尺寸可为小于6微米)、血清(serum)和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。上清液的量(体积)可以是20毫升至250毫升、40毫升至125毫升或是50毫升至100毫升。上述分离层中的上清液可含有二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)及/或生长因子。该些分离层的另一层，例如下分离层，包含了第一混合液中绝大多数的或非常高百分比的大细胞(其系包括红血球和白血球等谱系细胞以及大体干细胞)。例如，该另一分离层可以含有第一混合液中95％、98％、99％或以上的大细胞。因此，上清液大体上不含有大细胞(如红血球和白血球)或是含有第一混合液中不到0.5％、1％、2％或5％的大细胞。例如，上清液可以含有第一混合液中不到1％或2％的红血球以及第一混合液中不到1％或2％的白血球；第一混合液中至少98％或99％的红血球以及第一混合液中至少98％或99％的白血球可聚集在上述的另一分离层中。上清液的量(体积)除以血液样本或第一混合液的量(体积)所得到的比值可在1/3至1/2之间。综上所述，按照步骤12和步骤21，来自受治疗者的血液样本会与二价阳离子螯合剂在上述的温度中培养或培育一段前述的时间，使血液样本分成两层或以上，即血液样本形成两个或两个以上的分离层(该些分离层包括上清液)。

接着，在步骤22中，绝大部分的或大体上所有的上清液被聚集或转移到一个第二容器(例如一储存袋、一玻璃瓶或一注射器)中。第二容器中的上清液(以下称为“第二混合液”)含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。尺寸大于2微米至小于6微米的体干细胞在第二混合液中的数量可大于或等于1000万颗或3000万颗，较佳为2500万～30000万颗、3000万～50000万颗或1000万～50000万颗。第二混合液可以含有二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)及/或生长因子。在第二混合液中，大细胞的数量占全部粒子或细胞的数量的百分比可小于5％、1％或0.5％(较佳为小于0.1％或0.01％)，小细胞的数量占全部粒子或细胞的数量的百分比可大于95％、99％或99.5％(较佳为大于99.9％或99.99％)。

根据图6A和图6B的数据，可以计算出每毫升第二混合液中的红血球数量。图6A是以流式细胞仪分析10微升(microliter，简称μl)的第二混合液后所得到的。红血球，即CD235a(+)细胞，是位在图6A的区域R3中；区域R3中的细胞总数为25000。图6B示出与区域R3中所有细胞有关的CD235a荧光强度的分布。在图6B中，荧光直方图被垂直线2a(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图6B的区域V3-R表示细胞对CD235a染色呈阳性，即红血球；图6B的区域V3-L表示细胞对CD235a染色呈阴性。图6B的结果显示区域R3中的红血球数占区域R3中的细胞总数的百分比为0.1％。将区域R3中的细胞总数(即25000)乘以区域R3中的红血球数占区域R3中的细胞总数的百分比(即0.1％)可计算出10微升第二混合液中的红血球数(其为25)。然后，利用10微升第二混合液中的红血球数计算出每毫升第二混合液中的红血球数量，其计算出的数量为2500。由上述结果可知，每毫升第二混合液中的红血球数量为小于10⁵或10⁴。较佳地，每毫升第二混合液中的红血球数量为小于10³。另外，在第二混合液中，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3％，较佳为小于2％、1％或0.5％。

根据图6C的流式细胞仪数据，可以计算出每毫升第二混合液中的白血球数量。图6C的流式细胞仪资料是以流式细胞仪分析50微升的第二混合液后所得到的。在图6C中，区域R1为分析白血球所作的设门(gating)。50微升第二混合液中的白血球数可经由图6C的流式细胞仪数据来获得，其计算出的数量为30。然后，利用50微升第二混合液中的白血球数计算出每毫升第二混合液中的白血球数量，其计算出的数量为600。由上述结果可知，每毫升第二混合液中的白血球数量为小于10⁴或10³。较佳地，每毫升第二混合液中的白血球数量为小于10²。另外，在第二混合液中，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2％，较佳为小于1％、0.5％或0.1％。

图7A示出前向散射系数(forwardscatteringcoefficient，简称FSC)对侧向散射系数(sidescatteringcoefficient，简称SSC)的流式细胞仪点状图(flowcytometrydotplot)。图7A的点状图是以流式细胞仪分析5.6微升的第二混合液后所得到的。在图7A中，尺寸大于2微米至小于6微米的细胞位在区域R5。换句话说，区域R5中的所有细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。图7B示出与区域R5中所有细胞有关的CD61荧光强度的分布。在图7B中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V1-L和高荧光强度的区域V1-R。图7B的区域V1-R表示细胞对CD61染色呈阳性，即血小板；图7B的区域V1-L表示细胞对CD61染色呈阴性。图7B的结果显示区域R5中的血小板数占区域R5中的细胞总数的百分比为80.5％。因此，在第二混合液中，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75％或80％，较佳为介于75％至85％。

图7C示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD133荧光强度的分布。在图7C中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图7C的区域V3-R表示细胞对CD133染色呈阳性，即极小类胚胎干细胞；图7C的区域V3-L表示细胞对CD133染色呈阴性。图7C的结果显示区域R5中的CD133(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为0.3％。由上述可知，第二混合液中少于1％细胞表现或表达CD133。图7D示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD34荧光强度的分布。在图7D中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V1-L和高荧光强度的区域V1-R。图7D的区域V1-R表示细胞对CD34染色呈阳性，即极小类胚胎干细胞；图7D的区域V1-L表示细胞对CD34染色呈阴性。图7D的结果显示区域R5中的CD34(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为0.4％。因此，在第二混合液中，CD133(+)细胞和CD34(+)细胞共占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2％，较佳为小于1％或0.5％。

图7E示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD66e荧光强度的分布。在图7E中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V2-L和高荧光强度的区域V2-R。图7E的区域V2-R表示细胞对CD66e染色呈阳性，即类卵裂球干细胞；图7E的区域V2-L表示细胞对CD66e染色呈阴性。图7E的结果显示区域R5中的CD66e(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为4％。因此，在第二混合液中，CD66e(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6％，较佳为小于5％或4.5％。

图7F示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD349荧光强度的分布。在图7F中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图7F的区域V3-R表示细胞对CD349染色呈阳性，即SB-1细胞；图7F的区域V3-L表示细胞对CD349染色呈阴性。图7F的结果显示区域R5中的CD349(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为5.6％。因此，在第二混合液中，CD349(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％，较佳为介于4.5％至10％。

图7G示出与图7A区域R5中所有细胞有关的Lgr5荧光强度的分布。在图7G中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V2-L和高荧光强度的区域V2-R。图7G的区域V2-R表示细胞对Lgr5染色呈阳性，即SB-2细胞；图7G的区域V2-L表示细胞对Lgr5染色呈阴性。图7G的结果显示区域R5中的Lgr5(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为5.4％。因此，在第二混合液中，Lgr5(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％，较佳为介于4.5％至10％。

在本实施例中，步骤22可以被视为是一种对干细胞纯化/分离的方法。“纯化/分离”术语是指分离一混合液或血液样本内的小细胞(请参阅步骤12的描述，譬如是尺寸大于2微米至小于6微米的细胞)和大细胞(请参阅步骤12的描述，譬如是尺寸大于6微米的细胞)的行为，换句话说，是指通过除去该混合液或血液样本内绝大部分的或大体上所有的大细胞来获得该混合液或血液样本内的小细胞的行为。

接着，在步骤23中，第二混合液(即第二容器中的上清液)被转移去混合一种无钙离子(Ca²⁺)的溶液或培养液，继而形成含有干细胞的溶液(或称为干细胞溶液)。含有干细胞的溶液因此含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。无钙离子的溶液或培养液的量(体积)可以是400毫升以上，例如500毫升至900毫升。无钙离子的溶液或培养液，例如一盐溶液，还可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。上述的盐溶液可以是含有氯化钠(NaCl)的溶液，譬如生理盐水(normalsaline)。生理盐水通常是指重量/体积百分比为0.9％的氯化钠溶液，约300mOsm/L或每公升9.0克。另外，为了去除含有干细胞的溶液中的杂质，也可以选择将含有干细胞的溶液再通过一过滤器，例如170微米的过滤器。经过过滤的含有干细胞的溶液仍然含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。以下叙述的含有干细胞的溶液也可以是经过过滤的含有干细胞的溶液。

根据来自图6A至图6C和图7A至图7G的结果，可以估算出、假定出、推测出或得出以下数据。在含有干细胞的溶液中，SB-1细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，SB-2细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，类卵裂球干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6％(较佳为小于5％或4.5％)，极小类胚胎干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％或0.5％)，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75％或80％(较佳为介于75％至85％)，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，含有干细胞的溶液中少于1％细胞表现或表达CD133。含有干细胞的溶液中每毫升的白血球数可为小于10⁴或10³，较佳为小于10²。含有干细胞的溶液中每毫升的红血球数可为小于10⁵或10⁴，较佳为小于10³。含有干细胞的溶液可包含二价阳离子螯合剂(如乙二胺四乙酸)、生长因子以及/或是盐类(例如氯化钠)。

请参阅图1所示，在步骤14中，将一有效量的含有干细胞的溶液以静脉注射方式注入到前述受治疗者(以下称为“第一个体”)体内(即静脉注射自体体干细胞)或注入到另一受治疗者(以下称为“第二个体”)体内(即静脉注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或短暂性棘皮松解皮肤病(即葛瑞夫兹氏症)。也就是说，将一有效量的含有干细胞的溶液投予第一个体(例如通过静脉注射的方式注射自体体干细胞)或投予第二个体(例如通过静脉注射的方式注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种，并可具有与第一个体相同的血型。“自体体干细胞”是指来自个体本身的体干细胞。“异体体干细胞”是指来自相同物种的另一个体的体干细胞(基因上不同)。“有效量”是指能够在受治疗个体产生像医学上所欲结果的组成物、药剂或物质(例如含有干细胞的溶液)的分量。“治疗”指的是将组成物、药剂或物质(如含有干细胞的溶液)投予一个体，该个体罹患一疾病(如自体免疫疾病)或面临发展该疾病的风险，其目的为治愈、抑制、减轻、缓解、补偿、延缓发作、预防或改善该疾病、该疾病的症状、继发于该疾病的疾病状态或对损伤/疾病的倾向。

本发明也可以省略步骤10和步骤11。换句话说，本发明可以通过步骤12和步骤13获得或制备出含有干细胞的溶液或经过过滤的含有干细胞的溶液，并按照步骤14的描述将含有干细胞的溶液或经过过滤的含有干细胞的溶液以静脉注射的方式注入到第一个体体内或第二个体体内，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。

在本发明的另一实施例中，第二混合液(没有再与任何东西--例如无钙离子的溶液或培养液--进行混合)可以利用静脉注射方式注入到第一个体体内(即静脉注射自体体干细胞)或注入到第二个体体内(即静脉注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。也就是说，将一有效量的第二混合液投予第一个体(例如通过静脉注射的方式注射自体体干细胞)或投予第二个体(例如通过静脉注射的方式注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。在本实施例中，第二混合液被视为是含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)。换句话说，该含有干细胞的溶液是经由步骤10至步骤12、步骤21和步骤22所制备或是经由步骤12、步骤21和步骤22所制备。

僵直性脊椎炎(ankylosingspondylitis)是一种发炎的、自体免疫的疾病。这种疾病主要侵袭或影响中轴骨(axialskeleton)、骨盆的荐髂关节(sacroiliacjoint)与胸廓(thoraciccage)。随着疾病进展，僵直性脊椎炎患者将经历疼痛和关节僵硬，最后丧失脊椎的活动能力。数以百万计的人患有僵直性脊椎炎，因此需要一个安全有效的方法来治疗僵直性脊椎炎。

在本发明中，含有干细胞的溶液、经过过滤的含有干细胞的溶液或第二混合液可以作为供静脉注射或输液用的注射液(或称针剂)。该注射液可以用来治疗一个体(如人类)的自体免疫疾病，例如关节炎或短暂性棘皮松解皮肤病(即葛瑞夫兹氏症)。该关节炎可以是：类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、干癣性关节炎(psoriaticarthritis)或僵直性脊椎炎。

实验研究：

在第一个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎疼痛的病患接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名病患已经超过4个月没有感到因僵直性脊椎炎造成的肋骨疼痛。因此，图1描述的治疗方法可以有效地缓解、抑制、治疗或治愈因僵直性脊椎炎造成的肋骨疼痛。

在第二个实验研究中，一位患有短暂性棘皮松解皮肤病的病患(其身体有红斑性丘疹)接受了图1描述的治疗方法。结果发现红斑性丘疹从病人的身体消失。因此，图1描述的治疗方法可以有效地缓解、抑制、治疗或治愈因短暂性棘皮松解皮肤病造成的症状。

在第三个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎和干癣性关节炎的病患(女性，26岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名女性觉得她的健康状况已经改善及好转。她能够轻易地做更多日常活动。她身体受到干癣(psoriasis)困扰的几个地方已经改善了很多。她声称自己有更多的精力，而且跟治疗前睡眠时间平均为3小时相比，治疗后睡眠时间平均为6小时。另外，在接受治疗之后，复发至康复的时间(复发时会造成关节活动困难)从4～5天减少到24小时。

在第四个实验研究中，一位患有纤维肌痛(fibromyalgia)、关节炎和间质性肺疾病(interstitiallungdisease)的病患(女性，70岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名女性的膝盖有更多的活动度(跟治疗之前相比)。自从2012年被诊断为罹患间质性肺疾病，她最近一次就诊时显示肺部的混浊(cloudiness)已经减少了10％。她的呼吸分析测试(breathalyzertest)得到了自2012年诊断以来最好的结果。

在第五个实验研究中，一位患有葛瑞夫兹氏症及关节炎的病患(男性，69岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，因葛瑞夫兹氏症出现的皮肤病变开始消失(医生原本告知该皮肤病变是无法治愈的)。另外，他的视力已经改善到不需要使用阅读眼镜(如老花眼镜)的程度。治疗前，他的双腿只要走楼梯就会产生疼痛。治疗后，膝盖和左脚的疼痛已经消失一个星期。他的第一次治疗有非常好的效果，他和他太太可以在治疗后连续45天进行滑雪活动，他只有因为滑雪导致腿部受伤而回来接受第二次的治疗。

在第六个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎和高血压的病患(男性，33岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名男性的睡眠时间比治疗前更长，走路距离也比治疗前更远。他的手不再周期性地抽筋，发炎情况也已经明显下降。配合服用高血压药，他的血压稳定。治疗前，他会服用抗焦虑止痛药来处理疼痛问题，但自从治疗后，他已停止服用该药物。

因此，图1描述的治疗方法可以用于治疗一个体(如人类)的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎、干癣性关节炎或葛瑞夫兹氏症。

以上所述是通过实施例说明本发明的特点，其目的在使熟本领域技术人员能了解本发明的内容并据以实施，而非限定本发明的专利范围，故，凡其他未脱离本发明所揭示的精神所完成的等效修饰或修改，仍应包含在以下所述的申请专利范围中。

Claims

1.一种制备一注射液的方法，其包括下列步骤：

将一血液样本和一二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使该混合液形成复数个分离层，其中位于该些分离层其中之一的一液体含有复数个体干细胞，该些体干细胞的尺寸介于1微米至6微米之间；

取得该液体；以及

在取得该液体之后，将该液体和一无钙离子的溶液进行混合。

2.如权利要求1所述的方法，其中该二价阳离子螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。

3.如权利要求1所述的方法，其中该注射液用于治疗僵直性脊椎炎。

4.如权利要求1所述的方法，其中该些体干细胞包含CD349(+)干细胞和Lgr5(+)干细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中该血液样本来自于服用褐藻糖胶后经过30分钟至4小时的一个体的周边血液。

6.一种制备一干细胞溶液的方法，其包括下列步骤：

将一血液样本和一二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使该混合液形成复数个分离层，其中位于该些分离层其中之一的一液体含有复数个体干细胞，该些体干细胞的尺寸介于1微米至6微米之间；以及

取得该液体，其中该干细胞溶液用于治疗僵直性脊椎炎。

7.如权利要求6所述的方法，其中该些体干细胞包含CD349(+)干细胞和Lgr5(+)干细胞。

8.如权利要求6所述的方法，其中该二价阳离子螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。

9.如权利要求6所述的方法，其中该液体包含该二价阳离子螯合剂。

10.一种注射液，其包括尺寸大于2微米至小于6微米的Lgr5(+)体干细胞与尺寸大于2微米至小于6微米的CD349(+)体干细胞，其中该注射液用于治疗僵直性脊椎炎。