JP2019052932A - Data analyzer, program and recording medium, and data analysis method - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、プロテオームやトランスクリプトーム、ゲノムなどの生体分子の総体についてのデータ解析を行うデータ解析装置に関し、特に、解析対象の生体分子を一分子レベルで判別して解析することができるデータ解析装置、データ解析を行うためのプログラム及びその記録媒体、並びにデータ解析方法に関する。 The present disclosure relates to a data analysis apparatus that performs data analysis on a total of biomolecules such as proteome, transcriptome, and genome, and in particular, data analysis that can discriminate and analyze a biomolecule to be analyzed at a single molecule level. The present invention relates to a device, a program for performing data analysis, a recording medium thereof, and a data analysis method.
細胞や細胞からの分泌物など生体由来の検体に含まれている生体分子をデータ解析することによって、被験者の疾病の診断や健康状態の把握、また、薬品の作用などの検証などが行われている。このような生体分子データ解析の代表的なものとして、生体を構成するタンパク質の網羅的なデータ解析を行うプロテオーム解析が知られている。 By analyzing data on biomolecules contained in biological samples such as cells and cell secretions, it is possible to diagnose a subject's disease, grasp the health condition, and verify the effects of drugs, etc. Yes. As a representative example of such biomolecular data analysis, proteome analysis for performing comprehensive data analysis of proteins constituting a living body is known.
プロテオーム解析は、被験者の細胞や細胞からの分泌物を測定対象試料として、その試料中に含まれるタンパク質全体について種類毎の定性・定量解析を行う解析手法である。例えば、プロテーム解析によって、特有の疾病時に増加するタンパク質を手かがりとして、被験者の病気の状態を把握することができる。 Proteome analysis is an analysis method for performing qualitative / quantitative analysis for each type of the whole protein contained in a sample using a subject's cells and secretions from the cells as a measurement target sample. For example, the state of a subject's illness can be grasped by proteome analysis using a protein that increases during a specific illness as a clue.
ペプチドマスフィンガープリンティング法（peptide mass fingerprinting; ＰＭＦ）は、タンパク質試料を二次元電気泳動した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）やエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦ）などの飛行時間型質量分析を行う解析方法である。この方法は、微量タンパク質の解析方法として優れているが、ＴＯＦ型分析の工程でタンパク質のペプチド分解を余技なくされるため、ペプチド断片から元のアミノ酸配列の再構築に専用の解析ソフトウェアが必要であり、データ解析に時間がかかる上、装置が高価となる。また、検出限界は１０7分子程度である。 Peptide mass fingerprinting (PMF) involves two-dimensional electrophoresis of protein samples, followed by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI-TOF) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-TOF). This is an analysis method for performing time-of-flight mass spectrometry. This method is excellent as a method for analyzing trace amounts of protein. However, since the peptide must be decomposed in the TOF type analysis process, dedicated analysis software is required to reconstruct the original amino acid sequence from the peptide fragment. In addition, data analysis takes time and the apparatus is expensive. The detection limit is about 10 7 molecules.
タンパク質をペプチド分解せずに解析する方法としてはウェスタンブロッティングや二次元電気泳動法（２Ｄ−ＤＩＧＥ）がある。これらの解析方法は分子生物学の古典的な解析方法であるが、近年でも汎用されており、例えば下記特許文献１のように、複数の二次元電気泳動画像のデータを画像センサで読み込み、泳動ポイントの二次元的な位置情報と画像の濃度値の情報からプロテオーム解析を行う試みもなされている。検出限界は１０10分子程度であり、微量分析の手法としては感度が劣る。 Methods for analyzing proteins without degrading peptides include Western blotting and two-dimensional electrophoresis (2D-DIGE). Although these analysis methods are classical analysis methods of molecular biology, they have been widely used in recent years. For example, as in Patent Document 1 below, a plurality of two-dimensional electrophoresis image data is read by an image sensor, and electrophoresis is performed. Attempts have also been made to perform proteomic analysis from the two-dimensional position information of the points and the density value information of the image. The detection limit is about 10 10 molecules, and the sensitivity is inferior as a technique for microanalysis.
上記のように、プロテオーム解析をより容易に、短時間で、安価に、かつ、高い精度で行うことができる手法を開発する要望が高まっている。昨今の分子生物学や生物物理学では、１分子生物学（Single molecule biology）や１分子イメージング技術（Single-molecule imaging techniques）の飛躍的進歩があったが、プロテオーム解析でも１分子の検出感度での解析が求められているといえる。生体内でのタンパク質発現量のダイナミックレンジは１０11ともいわれており、発現量が極めて少ない微量タンパク質分子を正確に検出することが極めて重要である。 As described above, there is an increasing demand for developing a technique that can perform proteome analysis more easily, in a short time, at low cost, and with high accuracy. In recent molecular biology and biophysics, there has been dramatic progress in single molecule biology and single-molecule imaging techniques, but proteome analysis also has a single molecule detection sensitivity. It can be said that the analysis of is required. The dynamic range of the protein expression level in vivo is said to be 10 11, and it is extremely important to accurately detect a trace amount of protein molecule with a very small expression level.
このようなプロテオーム解析についての課題は、タンパク質以外の生体分子の総体を対象としたデータ解析、例えば遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）全体を対象とするトランスクリプトームデータ解析、ゲノムデータ解析、メタボロームデータ解析など、あらゆるオミックス（Ｏｍｉｃｓ）の解析に共通するものである。 The problem with such proteome analysis is data analysis for the entire biomolecule other than protein, for example, transcriptome data analysis, genome data analysis, metabolome data analysis for the entire gene transcript (mRNA), etc. It is common to the analysis of all omics.
本願は、上記従来の課題を解決して、生体細胞内やその分泌物などに含まれる生体分子の総体を、容易、かつ、短時間で、高精度なデータ解析を行うことができるデータ解析装置、このデータ解析装置を動作させるためのプログラム、プログラムを記憶する記憶媒体、並びに生体分子のデータ解析方法を得ることを目的とする。 The present application solves the above-mentioned conventional problems, and is a data analysis apparatus capable of performing high-accuracy data analysis easily and in a short time for a total of biomolecules contained in living cells and their secretions. Another object of the present invention is to obtain a program for operating the data analysis apparatus, a storage medium for storing the program, and a biomolecule data analysis method.
上記課題を解決するために、本願で開示するデータ解析装置は、発光する部分を有する生体分子の１分子レベルの光学像を取得可能な光学イメージング装置と、前記光学像における前記発光を１分子レベルで検出する発光検出部と、検出された前記発光の強さを測定結果数値として算出する結果算出部とを備え、所定の移動分離手段によって分離された状態の前記生体分子の総体を測定対象試料として前記光学イメージング装置により順次走査しながら観察し、得られた前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うデータ解析部とを備えたことを特徴とする。 In order to solve the above problems, a data analysis apparatus disclosed in the present application includes an optical imaging apparatus capable of acquiring a single-molecule level optical image of a biomolecule having a light-emitting portion, and a single-molecule level of the emission in the optical image. And a result calculation unit for calculating the detected intensity of the light emission as a measurement result numerical value, and the total of the biomolecules in a state separated by a predetermined moving separation means is measured And a data analysis unit for performing data analysis of the biomolecule based on the obtained measurement result numerical value and the acquisition timing at which the measurement result numerical value was acquired. It is characterized by that.
また、本開示にかかるデータ解析方法は、発光する部分を有し、所定の移動分離手段により分離された生体分子の総体を前記生体分子の１分子レベルでの光学像を取得可能な光学イメージング装置で順次走査しながら観察し、前記光学像から前記発光を検出し、当該発光の強さを測定結果数値として算出して、前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うことを特徴とする。 In addition, the data analysis method according to the present disclosure includes an optical imaging apparatus having a light emitting portion and capable of acquiring an optical image of the biomolecule at a single molecule level from a total of biomolecules separated by a predetermined moving separation unit. Observe while sequentially scanning with, detect the light emission from the optical image, calculate the intensity of the light emission as a measurement result numerical value, based on the measurement result numerical value and the acquisition timing obtained the measurement result numerical value The data analysis of the biomolecule is performed.
本願で開示するデータ解析装置、および、データ解析方法は、発光する部分を有する分離された状態の生体分子を、１分子レベルの光学像を取得可能な光学イメージング装置で走査しながら観察し、発光の強さとその取得タイミングとを把握してデータ解析を行う。このため、測定対象試料に含まれる生体分子の総体に対して、１分子レベルの精度での定量解析や、測定対象試料の状態の判定を行うことができる。 The data analysis device and the data analysis method disclosed in the present application observe a separated biomolecule having a light emitting portion while scanning with an optical imaging device capable of acquiring an optical image of a single molecule level, and emitting light. Analyzing data by grasping the strength of data and its acquisition timing. For this reason, it is possible to perform quantitative analysis with a single molecule level accuracy and determination of the state of the measurement target sample with respect to the total of biomolecules contained in the measurement target sample.
本願で開示するデータ解析装置は、発光する部分を有する生体分子の１分子レベルの光学像を取得可能な光学イメージング装置と、前記光学像における前記発光を１分子レベルで検出する発光検出部と、検出された前記発光の強さを測定結果数値として算出する結果算出部とを備え、所定の移動分離手段によって分離された状態の前記生体分子の総体を測定対象試料として前記光学イメージング装置により順次走査しながら観察し、得られた前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うデータ解析部を備える。 The data analysis device disclosed in the present application includes an optical imaging device capable of acquiring a single-molecule level optical image of a biomolecule having a light-emitting portion, a luminescence detection unit that detects the luminescence in the optical image at a single-molecule level, A result calculation unit that calculates the detected intensity of the emitted light as a numerical value of a measurement result, and sequentially scans the whole of the biomolecules separated by a predetermined moving separation unit with the optical imaging apparatus as a measurement target sample. A data analysis unit that performs data analysis of the biomolecule based on the measurement result numerical value obtained while observing and the acquisition timing at which the measurement result numerical value is acquired.
本開示にかかるデータ解析装置は、上記構成を備えることで、測定対象試料である生体分子の総体について、所定の条件で分離された状態を１分子レベルの光学像を取得可能な光学イメージング装置で順次走査しながら観察することによって、分離条件に対応して存在する生体分子の量を把握することができる。このため、一連の操作での観察結果に基づいて、生体分子の総体についてのデータ解析を行うことができる。 A data analysis apparatus according to the present disclosure is an optical imaging apparatus that can acquire a single-molecule-level optical image of a state of being separated under a predetermined condition with respect to a total of biomolecules that are measurement target samples by including the above-described configuration. By observing while sequentially scanning, the amount of biomolecules existing corresponding to the separation conditions can be grasped. For this reason, based on the observation result in a series of operations, data analysis can be performed on the total biomolecule.
本願発明において、「生体分子の総体」とは、プロテオーム、トランスクリプトーム、ゲノム、メタボロームなどあらゆるオミックスであり、１分子検出が可能な生体分子の総体である。 In the present invention, “total biomolecule” is any omics such as proteome, transcriptome, genome, metabolome, etc., and is a total biomolecule capable of detecting one molecule.
本願において、「１分子」とは、前記の「１分子生物学」や「１分子イメージング」の概念における「１分子」の意味と同義である。従って、生体分子の総体がプロテオームの場合は、タンパク質１分子、または多量体タンパクの１サブユニットである。一般的なタンパク質１分子の物理的なサイズは、直径が数ｎｍの球状である。 In the present application, “one molecule” is synonymous with the meaning of “one molecule” in the concepts of “one molecule biology” and “one molecule imaging”. Therefore, when the total biomolecule is a proteome, it is one protein molecule or one subunit of a multimeric protein. The physical size of a general protein molecule is a sphere with a diameter of several nanometers.
生体分子の総体がゲノムＤＮＡである場合、「１分子」とは、ある制限酵素で切断された一定の長さのＤＮＡフラグメントである。例えばヒトゲノムを構成するＤＮＡ２重螺旋の物理的なサイズは、幅約２ｎｍ、長さ約１ｍの紐状である。これを各種の制限酵素で数百〜数百万のフラグメントに切断して解析を行う。 When the entire biomolecule is genomic DNA, “one molecule” is a DNA fragment of a certain length cleaved with a certain restriction enzyme. For example, the physical size of the DNA double helix constituting the human genome is a string having a width of about 2 nm and a length of about 1 m. This is cleaved into hundreds to millions of fragments with various restriction enzymes for analysis.
生体分子の総体がトランスクリプトームである場合、「１分子」とは、遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の１分子である。一般的な遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）１分子のサイズは、幅約０．３ｎｍ、長さ１０〜５０００ｎｍの紐状である。ＤＮＡフラグメントに比べると、トランスクリプトームの１分子は物理サイズが小さいことが多いが、１分子イメージングは可能である。 When the entire biomolecule is a transcriptome, “one molecule” is one molecule of a gene transcript (mRNA). The size of one molecule of a general gene transcript (mRNA) is a string having a width of about 0.3 nm and a length of 10 to 5000 nm. Compared to DNA fragments, one molecule of the transcriptome is often smaller in physical size, but single molecule imaging is possible.
生体分子の総体がメタボロームである場合、生体内の代謝産物（メタボライト）には、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのほか、脂肪酸、アミノ酸、その他の有機酸、糖など種々の低分子化合物も含まれるが、「１分子」とは、上記のメタボライトのうち本願所定の移動分離手段によって移動分離が可能なものであり、かつ、光学イメージング装置の観察系の空間分解能を考慮して「1分子」の検出が可能な生体分子である。 When the total biomolecules are metabolomes, metabolites in the body (metabolites) include proteins, RNA, DNA, as well as various low molecular compounds such as fatty acids, amino acids, other organic acids, and sugars. , "One molecule" is one of the above metabolite that can be moved and separated by the predetermined moving separation means of the present application, and "one molecule" is considered in consideration of the spatial resolution of the observation system of the optical imaging apparatus. It is a biomolecule that can be detected.
プロテオーム解析の場合、本願所定の「生体分子の総体」として想定されるのは、少なくとも１０種類以上のタンパク質分子または多量体構成タンパクのサブユニットを含む試料である。発現タンパクの網羅的解析という観点から少なくとも１０種類以上の同時解析は必要であると考えられる。この場合において、本願開示のデータ解析装置は、少なくとも１０種類以上のタンパク質分子または前記サブユニットを、１分子定量で、一度に解析することができるプロテオーム解析装置として機能する。 In the case of proteomic analysis, a sample including at least 10 types of protein molecules or multimeric protein subunits is assumed as the “total biomolecule” defined in the present application. From the viewpoint of comprehensive analysis of expressed proteins, it is considered that at least 10 types of simultaneous analysis are necessary. In this case, the data analysis apparatus disclosed in the present application functions as a proteome analysis apparatus that can analyze at least 10 kinds of protein molecules or the subunits at a time by single molecule quantification.
トランスクリプトーム解析の場合、本願所定の「生体分子の総体」として想定されるのは、上記と同様の理由から、少なくとも１０種類以上の遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）分子を含む試料であり、この場合において、本願開示のデータ解析装置は、少なくとも１０種類以上の遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）を、１分子定量で、一度に解析することができるトランスクリプトーム解析装置として機能する。 In the case of transcriptome analysis, a sample that includes at least 10 types of gene transcript (mRNA) molecules is assumed as the “total biomolecule” defined in the present application for the same reason as described above. The data analysis device disclosed in this application functions as a transcriptome analysis device that can analyze at least 10 gene transcripts (mRNA) at a time by single molecule quantification.
ゲノム解析の場合、本願所定の「生体分子の総体」として想定されるのは、上記と同様の理由から、少なくとも１００種類以上の前記のＤＮＡフラグメントを含む試料であり、この場合において、本願開示のデータ解析装置は、少なくとも１００種類以上のＤＮＡフラグメントを、１分子定量で、一度に解析することができるゲノム解析装置として機能する。 In the case of genome analysis, the “total biomolecule” defined in the present application is assumed to be a sample containing at least 100 types of the above-mentioned DNA fragments for the same reason as described above. The data analysis device functions as a genome analysis device that can analyze at least 100 kinds of DNA fragments at a time by single molecule quantification.
メタボローム解析の場合、本願所定の「生体分子の総体」として想定されるのは、上記と同様の理由から、少なくとも１０種類以上のメタボライトを含む試料であり、この場合において、本願で開示するデータ解析装置は、少なくとも１０種類以上のメタボライトを、１分子定量で、一度に解析することができるメタボローム解析装置として機能する。なお、そのほかのオミックス解析の場合も上記同様である。 In the case of metabolomic analysis, a sample that includes at least 10 types of metabolite is assumed as the “total biomolecule” defined in the present application for the same reason as described above. In this case, the data disclosed in the present application is used. The analyzer functions as a metabolome analyzer that can analyze at least 10 types of metabolite at a time by single molecule quantification. The same applies to the other omics analysis.
その他のオミックス解析においても、上記と同様の理由から、本願所定の「生体分子の総体」としては、網羅的データ解析という本願発明の目的に見合った適切な種類数の生体分子を含む試料が想定される。 In other omics analyses, for the same reason as described above, a sample containing an appropriate number of types of biomolecules suitable for the purpose of the present invention, ie, comprehensive data analysis, is assumed as the predetermined “total biomolecule” of the present application. Is done.
生体内での分子濃度のダイナミックレンジは、タンパク質分子がおおよそ１０11（１００ｆＭ〜１０ｍＭ）、ｍＲＮＡ分子がおおよそ１０5（１００ｆＭ〜１０ｎＭ）、メタボロームがおおよそ１０11（１００ｆＭ〜１０ｍＭ）である。本願開示のデータ解析装置は、１分子感度であることから、従来法では検出限界以下であった分子のデータも確実に拾うことができ、網羅的なオミックス解析が可能となる。 The dynamic range of the molecular concentration in vivo is approximately 10 11 (100 fM to 10 mM) for protein molecules, approximately 10 5 (100 fM to 10 nM) for mRNA molecules, and approximately 10 11 (100 fM to 10 mM) for metabolome. Since the data analysis apparatus disclosed in the present application has single-molecule sensitivity, it is possible to reliably pick up molecular data that was below the detection limit in the conventional method, and comprehensive omics analysis is possible.
本願で開示するデータ解析装置において、「１分子レベルでの光学像を取得」とは、前記の「１分子イメージング」とおおよそ同義であるが、従来法においては、観察対象の生体分子の種類ごとに発光波長の異なる発光指標でラベルし、１分子のダイナミクスを観察することが主眼であったのに対し、本願では、後述する全分子種ラベルのプロトコルによって、生体分子の総体に対し、種類を問わず、各分子一律に、同一の発光指標でラベルし、各分子の個数・濃度を定量化することが主眼としている点が新しい。励起光の照射光学系としては、エバネッセント光を用いた全反射照明が１分子レベルの蛍光測定に有利であるが、その限りではなく、広視野照明やライトシート照明などの光学系を用いることもできる。 In the data analysis apparatus disclosed in the present application, “acquiring an optical image at the level of one molecule” is roughly synonymous with the above “single molecule imaging”, but in the conventional method, for each type of biomolecule to be observed. The main objective was to observe the dynamics of a single molecule by labeling with luminescence indicators having different emission wavelengths, but in this application, the type of the whole biomolecule was determined according to the protocol for all molecular species labels described below. Regardless, the main point is to label each molecule uniformly with the same luminescence index and to quantify the number and concentration of each molecule. As the excitation light irradiation optical system, total reflection illumination using evanescent light is advantageous for single-molecule level fluorescence measurement, but not limited thereto, and optical systems such as wide-field illumination and light sheet illumination may be used. it can.
本願で開示するデータ解析装置において、「１分子レベルで検出する発光検出部」とは、１分子の生体分子からの発光を検出可能である発光検出部である。このような発光検出部としては、光学像の視野を画像データとして取得する撮像部を用いてもよく、この撮像部にＣＣＤやＣＭＯＳなど、十分に感度の高い撮像デバイスを用いることにより、発光検出部における１分子検出が可能となる。また、本願開示のデータ解析装置では、発光指標の二次元的位置情報が不要な場合には、フォトマル（光電子増倍管）やフォトセルなどの高感度な受光デバイスを発光検出部として用いることもできる。なお、「１分子レベル」は「検出感度が１分子である」と同義である。 In the data analysis apparatus disclosed in the present application, the “luminescence detection unit that detects at a single molecule level” is a luminescence detection unit that can detect luminescence from a single molecule of a biomolecule. As such a light emission detection unit, an image pickup unit that acquires a field of view of an optical image as image data may be used. By using a sufficiently sensitive image pickup device such as a CCD or CMOS for this image pickup unit, light emission detection is possible. One molecule can be detected in the part. In addition, in the data analysis apparatus disclosed in the present application, when two-dimensional position information of the light emission index is unnecessary, a highly sensitive light receiving device such as a photomultiplier (photomultiplier tube) or a photocell is used as the light emission detection unit. You can also. “One molecule level” is synonymous with “the detection sensitivity is one molecule”.
本願で開示するデータ解析装置において、「所定の移動分離手段」とは、生体分子の総体を、その生体分子が有する性質に応じて成分分離する手段である。 In the data analysis apparatus disclosed in the present application, the “predetermined moving separation unit” is a unit that separates components of the whole biomolecule according to the properties of the biomolecule.
このような移動分離方法の例として、電気泳動法やクロマトグラフィー法がある。電気泳動装置は、生体分子の総体を、電荷や質量に応じて電界中を移動させて成分分離する。クロマトグラフィー装置は、生体分子の総体を、大きさ、吸着力、電荷、質量、疎水性などの違いを利用し、カラム中を移動させて成分分離する。 Examples of such mobile separation methods include electrophoresis and chromatography. The electrophoretic device separates components by moving the entire biomolecule in an electric field according to the charge and mass. The chromatographic apparatus uses the differences in size, adsorption power, charge, mass, hydrophobicity, etc., to separate the components of the entire biomolecule by moving it through the column.
本願で開示するデータ解析装置において、「光学像」は、拡大像であってよく、縮小像または等倍像であってもよい。一態様において、光学像は、１分子観察が可能な倍率まで拡大された拡大像である。別の態様において、光学像は、１分子レベルの観察が可能な等倍像である。また別の態様において、光学像は、１分子レベルの観察が可能な縮小像である。 In the data analysis device disclosed in the present application, the “optical image” may be a magnified image, a reduced image, or an equal-magnification image. In one embodiment, the optical image is a magnified image magnified to a magnification allowing single molecule observation. In another embodiment, the optical image is an equal-magnification image that allows observation at a single molecule level. In another embodiment, the optical image is a reduced image that can be observed at a single molecule level.
本願で開示するデータ解析装置において、「発光する部分」は、所定の波長の励起光を照射した際に蛍光を発光する「蛍光性指標」の発光であってよく、化学発光（化学ミネッセンス）や生物酵素発光（バイオルミネセンス）による「発光性指標」の発光であってもよい。または、この「発光する部分」は、所定の波長の光を照射した際に観察されるラマン散乱光による発光であってもよい。 In the data analysis apparatus disclosed in the present application, the “light emitting portion” may be light emission of a “fluorescence index” that emits fluorescence when irradiated with excitation light of a predetermined wavelength, such as chemiluminescence (chemical minescence) or It may be “luminescence index” luminescence by bioenzyme luminescence (bioluminescence). Alternatively, the “light emitting portion” may be light emission by Raman scattered light observed when light of a predetermined wavelength is irradiated.
「発光する部分」が蛍光性指標の発光である場合、観察対象の生体分子に蛍光性指標を標識して観察する蛍光解析の手法を用いて、多種類の生体分子を観察対象とすることができる。「発光する部分」が化学発光による発光性指標の発光である場合も、同様に、観察対象の生体分子に発光性指標を標識して観察する公知の解析手法を用いて、多種類の生体分子を観察対象とすることができる。 When the “light-emitting part” is the emission of a fluorescent indicator, it is possible to target multiple types of biomolecules using a fluorescence analysis technique in which the fluorescent indicator is labeled and observed. it can. Similarly, when the “light emitting portion” is light emission of a luminescent indicator by chemiluminescence, similarly, using a known analysis method for observing the luminescent indicator by labeling the biomolecule to be observed, Can be the observation target.
本発明では、後述するように、生体分子の総体の全分子種ラベルを行うプロトコルを開示している。ここで、本願において「全分子種ラベルを行う」とは、生体分子の総体を構成する各々の分子に対して、その特異性を問わず、網羅的に、蛍光性指標（蛍光ラベル）や発光性指標等により対象分子を標識化（ラベル化）することをいう。 In the present invention, as will be described later, a protocol for labeling all molecular species of a total of biomolecules is disclosed. Here, in the present application, “performing all molecular species labels” means comprehensively, regardless of the specificity of each molecule constituting the entire biomolecule, a fluorescent indicator (fluorescent label) or light emission. This means that the target molecule is labeled (labeled) with a sex index or the like.
本発明者らは、細胞のライセートに一般的な１分子標識のプロトコルを試したところ、生体分子の性質（分子量等）によってラベル化率に多少ばらつきを生じるものの、生体分子の総体を構成する全分子種を網羅的にラベル化できることを確認した。例えばプロテームを対象とする場合、ほぼどのタンパク質も持っているフリーのアミノ基などをターゲットとしてラベル化を行えば、染まらないタンパク質は殆どない。１分子の生体分子に結合するラベル化分子の数は生体分子の分子種毎に異なり、一般的に１分子の生体分子に対し１〜１００個のラベル化分子が結合しうるが、１分子イメージングにおいては、結合する指標（ラベル化分子）の数にかかわらず、１分子の生体分子は１つの発光スポットとして検出されるので、正確な定量を行うことができる。また、１分子の生体分子に結合したラベル化分子の数はスポット毎の発光強度やブリンキング、分布から求めることが可能である。例えば、タンパク質１分子に結合したラベル化分子の数が求まれば、当該タンパク質が有するフリーのアミノ基の数を求めることができ、タンパク質同定の際の付加情報とすることができる。 The inventors of the present invention have tried a general single-molecule labeling protocol for cell lysates, and although the labeling rate varies somewhat depending on the properties of the biomolecules (molecular weight, etc.), all of the total biomolecules are composed. It was confirmed that the molecular species could be comprehensively labeled. For example, when a target is a protein, there is almost no protein that does not stain if labeling is performed with a free amino group or the like possessed by almost any protein as a target. The number of labeled molecules that bind to one biomolecule differs depending on the molecular species of the biomolecule, and generally 1 to 100 labeled molecules can bind to one biomolecule. In, one molecule of biomolecule is detected as one luminescent spot regardless of the number of indices (labeled molecules) to be bound, and therefore accurate quantification can be performed. Further, the number of labeled molecules bound to one biomolecule can be determined from the emission intensity, blinking, and distribution for each spot. For example, if the number of labeled molecules bound to one protein molecule is obtained, the number of free amino groups possessed by the protein can be obtained, which can be used as additional information for protein identification.
「発光する部分」がラマン散乱光による発光の場合にも、同様に、公知の解析手法を用いて、多種類の生体分子を観察対象とすることができる。本願開示の装置が測定対象とするタンパク質、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子は、総じてラマン活性を有するため、この場合も、全分子検出が可能である。 Similarly, when the “light-emitting portion” is light emission by Raman scattered light, a variety of biomolecules can be observed using known analysis techniques. Since biomolecules such as proteins, genomic DNAs, and RNAs to be measured by the device disclosed in this application generally have Raman activity, all molecules can be detected in this case as well.
上記本開示のデータ解析装置において、前記データ解析部が、前記測定結果数値と前記取得タイミングとの相関を表す測定対象試料のスペクトルデータを作成し、作成された前記スペクトルデータを既存のスペクトルデータと比較して前記測定対象試料の状態のデータ解析を行うことが好ましい。このようにすることで、測定対象試料の各分子種の定量解析を経ずに、生体分子の種類とそれが含まれる量とを示す分布パターンの比較にのみ基づいて、試料における測定対象試料の状態を判別することができる。 In the data analysis device according to the present disclosure, the data analysis unit creates spectrum data of a measurement target sample that represents a correlation between the measurement result numerical value and the acquisition timing, and the created spectrum data is used as existing spectrum data. It is preferable to perform data analysis of the state of the sample to be measured in comparison. In this way, without the quantitative analysis of each molecular species of the sample to be measured, based on the comparison of the distribution patterns indicating the types of biomolecules and the amount of the biomolecules, The state can be determined.
この場合において、所定のデータを記憶するデータ記憶部をさらに備え、前記データ記憶部が前記既存のスペクトルデータを記憶するとともに、新たに測定された測定対象試料の前記スペクトルデータを追加して記憶することが好ましい。このようにすることで、データ解析部における測定対象となる生体分子の種類と量との分布パターンに基づくデータ解析を容易にかつ精度良く行うことができる。 In this case, a data storage unit that stores predetermined data is further provided, and the data storage unit stores the existing spectrum data and additionally stores the spectrum data of the newly measured measurement target sample. It is preferable. By doing in this way, the data analysis based on the distribution pattern of the kind and amount of biomolecules to be measured in the data analysis unit can be easily and accurately performed.
また、上記本開示のデータ解析装置において、前記データ解析部はプロセッサを有していてよく、多数のデータについて機械学習（人工知能エンジン）を用いて前記測定対象試料の状態の分類整理を行うことで、診断精度を自動的に向上させることができるようにしてよい。プロセッサは、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＦＰＧＡ等任意の論理回路を構成するものであってよく、機械学習のアルゴリズムを動作させるために好適に用いられるものであってよい。また、上記本開示のデータ解析装置において、データ解析部は、マイコンその他の論理回路を備えたデータ処理手段として構成されていてもよい。更には、上記本開示のデータ解析装置におけるデータ解析部として特有のデータ処理手段を構成しなくても、パーソナルコンピュータを用いて所定の演算を行う形でデータ解析部の機能を果たすことができる。機械学習アルゴリズムの例については、（実施形態）においてより詳細に記載する。 In the data analysis apparatus of the present disclosure, the data analysis unit may include a processor, and classifies and organizes the state of the measurement target sample using machine learning (artificial intelligence engine) for a large number of data. Thus, the diagnostic accuracy may be automatically improved. The processor may constitute an arbitrary logic circuit such as a CPU, GPU, FPGA or the like, and may be suitably used for operating a machine learning algorithm. In the data analysis apparatus of the present disclosure, the data analysis unit may be configured as data processing means including a microcomputer or other logic circuit. Furthermore, the function of the data analysis unit can be achieved by performing a predetermined calculation using a personal computer without configuring a specific data processing unit as a data analysis unit in the data analysis apparatus of the present disclosure. An example of a machine learning algorithm will be described in more detail in (Embodiment).
なお、上記開示のデータ解析装置において、データ記憶部は、物理的サーバに限られず、例えば、クラウドコンピューティングによって、クラウド上のサーバに記憶データを保管するものであってもよい。この場合、クラウドサーバは、前記既存のスペクトルデータを記憶するとともに、上記本開示のデータ解析装置によって新たに測定された測定対象試料の前記スペクトルデータを追加して記憶し、前記データ解析部からの求めに応じ、記憶データを本開示のデータ解析装置の各部に転送する。 In the data analysis apparatus disclosed above, the data storage unit is not limited to a physical server, and may store stored data in a server on the cloud by, for example, cloud computing. In this case, the cloud server stores the existing spectrum data and additionally stores the spectrum data of the measurement target sample newly measured by the data analysis apparatus of the present disclosure. In response to the request, the stored data is transferred to each unit of the data analysis device of the present disclosure.
また、上記本開示のデータ解析装置において、前記データ解析部が、前記取得タイミングに対応する前記測定対象試料の分離条件を指標値として求め、前記指標値と前記測定結果数値とに基づいて前記生体分子の定量プロファイリングを行うこともできる。このようにすることで、定量解析などによってあらかじめ判明した指標値を用いて、測定対象となる生体分子の各分子種について種類毎の定量的データ解析を行うことができる。 Further, in the data analysis device of the present disclosure, the data analysis unit obtains a separation condition of the measurement target sample corresponding to the acquisition timing as an index value, and the biological body based on the index value and the measurement result numerical value Quantitative profiling of molecules can also be performed. By doing in this way, it is possible to perform quantitative data analysis for each type of each molecular species of a biomolecule to be measured using an index value that has been previously determined by quantitative analysis or the like.
この場合において、所定のデータを記憶するデータ記憶部をさらに備え、前記データ記憶部が、前記指標値が表す前記生体分子の種類を記憶することが好ましい。このようにすることで、データ解析部における生体分子の種類毎の定量プロファイリングを容易に行うことができる。 In this case, it is preferable that the apparatus further includes a data storage unit that stores predetermined data, and the data storage unit stores the type of the biomolecule represented by the index value. By doing in this way, the quantitative profiling for every kind of biomolecule in a data analysis part can be performed easily.
また、前記光学像を撮像して画像データを作成する撮像部をさらに備え、前記発光検出部が前記画像データから前記発光を検出することが好ましい。このようにすることで、光学イメージング装置で取得された光学像から観察対象試料の発光の強さをデータ化するに当たって、光学イメージング装置の画像解析に一般的に用いられる撮像装置を利用して行うことができ、既存のデータ処理プログラムなどを適宜利用することが可能となる。 Further, it is preferable that an imaging unit that captures the optical image to generate image data is further provided, and the light emission detection unit detects the light emission from the image data. In this manner, when the intensity of light emission of the observation target sample is converted into data from the optical image acquired by the optical imaging apparatus, the imaging apparatus generally used for image analysis of the optical imaging apparatus is used. Therefore, existing data processing programs can be used as appropriate.
さらに、前記データ解析部がデータ解析した前記測定対象試料のデータ解析結果を出力するデータ出力部をさらに備えることが好ましい。このようにすることで、測定結果数値と取得タイミングとの関係を示すスペクトルデータや、測定試料を採取した被験者の状態などを、画像表示手段の表示画像やプリンターによって紙媒体に表してユーザにわかりやすく提供したり、得られたデータを他の機器でより発展的に使用したりすることができるようになる。 Furthermore, it is preferable to further include a data output unit that outputs a data analysis result of the measurement target sample analyzed by the data analysis unit. By doing so, the spectral data indicating the relationship between the measurement result numerical value and the acquisition timing, the condition of the subject who collected the measurement sample, etc. are displayed on the paper medium by the display image of the image display means or the printer, and can be understood by the user. It becomes possible to provide easily, and to use the obtained data more extensively with other devices.
また、本願で開示する解析装置は、移動分離手段を更に備えることが好ましく、このような移動分離手段の一例として、電気泳動法によって前記生体分子の総体を分離する移動分離手段、または、クロマトグラフィー法によって前記生体分子の総体を分離する移動分離手段が挙げられる。 The analysis apparatus disclosed in the present application preferably further includes a moving separation unit. As an example of such a moving separation unit, a moving separation unit that separates the whole of the biomolecules by electrophoresis or chromatography. Examples thereof include moving separation means for separating the whole of the biomolecules by a method.
これらの移動分離手段は、移動分離部としてカラムやキャピラリーなどを有している。生体分子の総体を構成する各分子は、光学イメージング装置による走査観察の際に発光検出部による１分子検出が可能となるように、当該移動分離部において各々十分に離れたスポットに分離されることが望ましい。ただし、本願開示のデータ解析装置は、前述のとおり、構成分子のバラエティを１０種類以上からとしており、移動分離部における移動距離があまり長いと、光学イメージング装置による走査観察が困難となる。また、移動分離部における移動距離があまり長いと、そもそも移動分離自体にも高圧負荷が必要となり、解析時間も長びく。 These moving separation means have a column, a capillary, etc. as a moving separation part. Each molecule constituting the entire biomolecule should be separated into sufficiently separated spots in the moving separation unit so that one molecule can be detected by the luminescence detection unit during scanning observation by the optical imaging apparatus. Is desirable. However, as described above, the data analysis apparatus disclosed in the present application uses a variety of constituent molecules of 10 or more, and if the movement distance in the movement separation unit is too long, scanning observation with an optical imaging apparatus becomes difficult. If the moving distance in the moving separation unit is too long, a high pressure load is required for the moving separation itself, and the analysis time is also long.
このため、移動分離手段における移動分離部の長さは、好ましくは、２６ｍｍ以上、１２ｍ以下であり、２８ｍｍ以上、１０．５ｍ以下であってもよく、３０ｍｍ以上、１０ｍ以下であってもよい。なお二次元電気泳動の場合、「移動分離部の長さ」とは、一辺の長さであり、他辺の長さは上記の範囲を下回っていてもよい。 For this reason, the length of the moving separation part in the moving separation means is preferably 26 mm or more and 12 m or less, 28 mm or more, 10.5 m or less, or 30 mm or more and 10 m or less. In the case of two-dimensional electrophoresis, the “length of the moving separation unit” is the length of one side, and the length of the other side may be less than the above range.
このようにすることで、生体分子の分離に用いられる電気泳動法やクロマトグラフィー法などの所定の移動分離手段を用いて、試料の分離からデータ解析までの一連の作業を実施することができるデータ解析装置を得ることができる。 In this way, a series of operations from sample separation to data analysis can be carried out using predetermined moving separation means such as electrophoresis and chromatography used for biomolecule separation. An analysis device can be obtained.
さらに、本願で開示するデータ解析装置は、前記の蛍光性指標、または、発光性指標が付され分離された状態で保存されていた前記生体分子の総体を前記測定対象試料としてデータ解析を行うことができる。 Furthermore, the data analysis apparatus disclosed in the present application performs data analysis using the whole of the biomolecules stored in a separated state with the fluorescence index or the luminescence index attached as the measurement target sample. Can do.
また、本願で開示するデータ解析装置は、前記データ解析装置を構成する各部の動作を制御する制御部をさらに備え、前記制御部が、前記各部を制御して前記生体分子の総体のデータ解析を自動的に行うことが好ましい。このようにすることで、分離された状態の試料から、データ解析結果を自動的に取得することができる生体分子のデータ解析装置として実現することができる。 In addition, the data analysis device disclosed in the present application further includes a control unit that controls the operation of each unit constituting the data analysis device, and the control unit controls the respective unit to perform data analysis of the entire biomolecule. Preferably it is done automatically. By doing in this way, it is realizable as a data analysis device of a biomolecule which can acquire a data analysis result automatically from a sample in a separated state.
なお、この制御部自体もプロセッサを備えていてよい。また、制御部は、前記データ解析部が有するプロセッサと相互に連動するものであってよい。 Note that the control unit itself may also include a processor. The control unit may be linked with a processor included in the data analysis unit.
さらに、本願で開示するコンピュータプログラムは、上記本願で開示したデータ解析装置において、コンピュータを一連のデータ解析作業のために装置全体を動作させる制御部として機能させて、前記生体分子の総体のデータ解析を自動で行わせるものである。 Furthermore, the computer program disclosed in the present application causes the computer to function as a control unit that operates the entire apparatus for a series of data analysis operations in the data analysis device disclosed in the present application, and performs data analysis of the total of the biomolecules. Is performed automatically.
このようなコンピュータプログラムは、汎用性のあるコンピュータを用いて、本願で開示するデータ解析装置を自動的に動作させることができる。 Such a computer program can automatically operate the data analysis apparatus disclosed in the present application using a general-purpose computer.
また、本願で開示する記憶媒体は、本願で開示する上記コンピュータプログラムが記録され、コンピュータによる読み込みが可能なものである。 The storage medium disclosed in the present application stores the above-described computer program disclosed in the present application and can be read by a computer.
このような記憶媒体によって、コンピュータで容易にデータ解析装置全体の制御を行わせることができる。 With such a storage medium, the entire data analysis apparatus can be easily controlled by a computer.
さらにまた、本願で開示するデータ解析方法は、発光する部分を有し、所定の移動分離手段によって分離された生体分子の総体を前記生体分子の１分子レベルでの光学像を取得可能な光学イメージング装置で順次走査しながら観察し、前記光学像から前記発光を１分子レベルで検出し、当該発光の強さを測定結果数値として算出して、前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うものである。 Furthermore, the data analysis method disclosed in the present application is an optical imaging that has a portion that emits light and can acquire an optical image of the biomolecule at a single molecule level from the total of biomolecules separated by a predetermined moving separation means. Observation while scanning sequentially with an apparatus, detecting the emission from the optical image at a single molecule level, calculating the intensity of the emission as a measurement result value, and acquiring the measurement result value and the measurement result value The biomolecule data is analyzed based on the timing.
本開示にかかるデータ解析方法によれば、測定対象試料である生体分子の総体について、所定の条件で分離された状態を１分子レベルの光学像を取得可能な光学イメージング装置で順次走査しながら観察することによって、分離条件に対応して存在する生体分子の量を把握することができ、観察結果に基づいて、測定対象試料の総体の状態についてのデータ解析を行うことができる。 According to the data analysis method according to the present disclosure, the total of biomolecules, which are measurement target samples, is observed while being sequentially scanned with an optical imaging apparatus capable of acquiring an optical image of a single molecule level after being separated under a predetermined condition. By doing so, it is possible to grasp the amount of biomolecules existing corresponding to the separation conditions, and it is possible to perform data analysis on the overall state of the sample to be measured based on the observation result.
（実施の形態）
以下、本開示にかかるデータ解析装置、このデータ解析装置を動作させるためのコンピュータプログラム、さらに、このプログラムを記録する記録媒体、さらに、データ解析方法の実施形態について、図面を参照しながら説明する。本実施形態にかかるデータ解析装置、データ解析方法は、タンパク質、ゲノムなどの生体分子の総体を対象物として、簡易に、かつ、短時間でデータ解析することが可能である。
(Embodiment)
Hereinafter, embodiments of a data analysis apparatus according to the present disclosure, a computer program for operating the data analysis apparatus, a recording medium for recording the program, and a data analysis method will be described with reference to the drawings. The data analysis apparatus and the data analysis method according to the present embodiment can perform data analysis easily and in a short time using a total of biomolecules such as proteins and genomes as objects.
なお、本願で開示する発明において、光学イメージング装置は光学顕微鏡であり、観察対象となるのは、蛍光性指標により標識された生体分子である。 In the invention disclosed in the present application, the optical imaging apparatus is an optical microscope, and an observation target is a biomolecule labeled with a fluorescent index.
以下の実施形態の説明では、最も一般的な蛍光性指標により標識された生体分子のデータ解析を中心に説明する。 In the following description of the embodiment, data analysis of biomolecules labeled with the most common fluorescent indicators will be mainly described.
［データ解析装置の構成］
図１は、本実施形態にかかるデータ解析装置の概略構成を説明するためのブロック図である。
[Configuration of data analysis device]
FIG. 1 is a block diagram for explaining a schematic configuration of a data analysis apparatus according to the present embodiment.
なお、図１においては、本実施形態にかかるデータ解析装置について、それぞれが果たす機能の内容に応じてブロックとして分割して示したものであり、図１の各ブロックの区分は、実際のデータ解析装置を構成する各部材の物理的な区分とは必ずしも一致しない。例えば、図１に示す複数のブロックの機能を果たす一つの電気回路が構成されることがあり、また、図１に記載された１つのブロックが、複数のデバイスの集合体としてデータ解析装置内で機能することがある。 In FIG. 1, the data analysis apparatus according to the present embodiment is divided into blocks according to the contents of the functions performed by the data analysis apparatus. Each block in FIG. 1 is classified into actual data analysis. It does not necessarily match the physical division of each member constituting the apparatus. For example, one electric circuit that functions as a plurality of blocks shown in FIG. 1 may be configured, and one block described in FIG. 1 is formed as an aggregate of a plurality of devices in the data analysis apparatus. May function.
図１に示すように、本実施形態にかかるデータ解析装置１００は、蛍光性指標が付された生体分子が電気泳動法またはクロマトグラフィー法によって分離された状態となっている測定対象試料１０を、順次走査しながら１分子レベルでの拡大像を取得可能な光学顕微鏡１１、光学顕微鏡１１により取得された拡大像から測定対象試料１０における蛍光性指標の発光を１分子レベルで検出する発光検出部１２、発光検出部１２で検出された測定対象試料１０の発光の強さを測定結果数値として算出する結果算出部１３、さらに、結果算出部１３で得られた測定結果数値とその取得タイミングとに基づいて、測定対象試料１０のデータ解析を行うデータ解析部１４とを有している。 As shown in FIG. 1, the data analysis apparatus 100 according to this embodiment includes a measurement target sample 10 in which a biomolecule with a fluorescent index is separated by electrophoresis or chromatography. An optical microscope 11 capable of acquiring magnified images at the level of one molecule while sequentially scanning, and a light emission detector 12 for detecting emission of a fluorescent indicator at the measurement target sample 10 at the level of one molecule from the magnified image acquired by the optical microscope 11. Based on the result calculation unit 13 that calculates the intensity of light emission of the measurement target sample 10 detected by the light emission detection unit 12 as a measurement result numerical value, and the measurement result numerical value obtained by the result calculation unit 13 and its acquisition timing And a data analysis unit 14 that performs data analysis of the measurement target sample 10.
光学顕微鏡１１で得られた測定対象試料１０の拡大像を、撮像画像データとして取得する撮像部１２ａを有している場合には、撮像部１２ａは発光検出部１２の一部となる。 In a case where the image capturing unit 12 a that acquires an enlarged image of the measurement target sample 10 obtained by the optical microscope 11 as captured image data is included, the image capturing unit 12 a becomes a part of the light emission detection unit 12.
また、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、蛍光性指標が付された生体分子を分離する移動分離手段１５を備えることができる。この場合には、蛍光性指標が付された生体分子の電気泳動法またはクロマトグラフィー法による分離を行いつつ、分離された状態の測定対象試料１０を光学顕微鏡１１で観察してデータ解析が行われる。なお、後述のように、本実施形態にかかるデータ解析装置１００は、移動分離手段１５を構成要件としては有さずに、別途用意された分離された状態の測定対象試料１０に対してデータ解析を行うという形態を採り得る。 In addition, the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment can include a moving separation unit 15 that separates a biomolecule with a fluorescent index. In this case, data analysis is performed by observing the measurement target sample 10 in the separated state with the optical microscope 11 while performing separation by electrophoresis or chromatography of biomolecules with a fluorescent index. . As will be described later, the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment does not have the moving separation unit 15 as a constituent element, and performs data analysis on a separately prepared measurement target sample 10 in a separated state. It can take the form of performing.
データ解析装置１００は、光学顕微鏡１１、発光検出部１２、結果算出部１３、データ解析部１４、データ解析装置１００に含まれる場合は移動分離手段１５の各部の動作を制御して、測定対象試料１０に対する一連のデータ解析動作を行う制御部１６を備えることができる。また、データ解析装置１００は、データ解析部１４でのデータ解析を行うために必要な情報や、新たな測定対象試料１０のデータ解析結果をデータとして蓄積することができるデータ記憶部１７、さらに、データ解析部１４でのデータ解析結果をデータ解析装置１００のユーザに報知したり、外部の機器などにデータとして送出したりするデータ出力部１８を備えることができる。 The data analysis apparatus 100 controls the operation of each unit of the optical separation unit 15, the light emission detection unit 12, the result calculation unit 13, the data analysis unit 14, and the moving separation unit 15 when included in the data analysis device 100, thereby measuring the sample to be measured. 10 can be provided. In addition, the data analysis apparatus 100 includes a data storage unit 17 that can accumulate information necessary for performing data analysis in the data analysis unit 14 and a data analysis result of a new measurement target sample 10 as data, A data output unit 18 for notifying the user of the data analysis apparatus 100 of the data analysis result in the data analysis unit 14 or sending it as data to an external device or the like can be provided.
［測定対象試料］
本実施形態にかかるデータ解析装置１００がデータ解析対象とする測定対象試料１０は、細胞、または、細胞からの分泌物などから得られた、タンパク質、ゲノム、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子の総体である。
[Measurement sample]
The measurement target sample 10 that is the data analysis target of the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment is a total of biomolecules such as proteins, genomes, DNAs, and RNAs obtained from cells or secretions from the cells. is there.
ここで総体とは、測定対象とする生体分子を複数種類含んだ状態のものを意味し、例えば、データ解析対象の生体分子がタンパク質の場合に、従来のプロテオーム解析のデータ解析対象とされているもの、すなわち、上述した従来のプロテオーム解析では、データ解析の第１段階である電気泳動法や液体クロマトグラフィー法などの分離方法による分離前の状態のものを指す。 Here, the total means a state in which a plurality of types of biomolecules to be measured are included. For example, when the biomolecule to be analyzed is a protein, it is a data analysis target for conventional proteome analysis. That is, the above-described conventional proteome analysis refers to a state before separation by a separation method such as electrophoresis or liquid chromatography, which is the first stage of data analysis.
なお、測定対象試料を抽出した細胞などに含まれている、測定対象となる分子種のすべての生体分子が含まれていることが総体と称するための必要条件となるのではなく、例えば、被験者の細胞や細胞分泌物からデータ解析の対象となる生体分子を選別することなく総体として取り出す際に、取り出し方法に起因して取り出すことができなかった一部の生体分子が欠如していても、測定対象の生体分子の総体と称することに支障はない。また、例えば、タンパク質をデータ解析するプロテオーム解析を行う場合に、測定対象試料１０をデータ解析装置１００のデータ解析対象であるタンパク質の総体と称する上で、タンパク質以外の生体分子が含まれていてもよいことは言うまでもない。 In addition, it does not become a necessary condition to call all the biomolecules of the molecular species to be measured contained in the cell or the like from which the sample to be measured is extracted. When the biomolecules subject to data analysis are extracted as a whole without selecting them from the cells and cell secretions, even if some biomolecules that could not be extracted due to the extraction method are missing, There is no problem in referring to the total of biomolecules to be measured. Further, for example, when performing proteome analysis for data analysis of proteins, the measurement target sample 10 may be referred to as the total protein that is the data analysis target of the data analysis device 100, and may include biomolecules other than proteins. Needless to say, it is good.
［光学顕微鏡］
光学顕微鏡１１は、対物レンズを有して測定対象物を光学的なレンズ作用により拡大して観察することを可能とする顕微鏡であり、ＳＥＭ、ＴＥＭなどの電子顕微鏡をのぞく概念である。
[Optical microscope]
The optical microscope 11 is a microscope that has an objective lens and enables an object to be measured to be enlarged and observed by an optical lens action, and is a concept that excludes electron microscopes such as SEM and TEM.
本実施形態にかかる光学顕微鏡１１は、測定対象試料１０である生体分子１分子レベルの検出が可能なものであり、観察に十分な感度を備えると共に、一般的に数倍から数百倍程度の拡大倍率を有している。一例として、例として開口数ＮＡ＝１．４９以上、倍率６０倍の対物レンズを用いた観察が挙げられる。 The optical microscope 11 according to the present embodiment is capable of detecting a biomolecule that is the measurement target sample 10 at a single molecule level, has sufficient sensitivity for observation, and is generally several times to several hundred times higher. Has magnification. An example is observation using an objective lens having a numerical aperture NA = 1.49 or more and a magnification of 60 times.
光学顕微鏡１１は、測定対象試料１０に含まれる蛍光性指標を発光させるための励起光を照射する機能を有している。励起光の照射光源としては、サファイヤレーザーやＹＡＧなどの固体レーザー、その他各種の半導体レーザーなどのレーザー光源を用いることができる。また、水銀ランプ、キセノンランプといった高圧放電灯などの周知の発光光源を用いることができ、音響光学素子フィルタ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：ＡＯＴＦ）などの光量調整手段を適宜備えることが好ましい。励起光の波長は、用いられた蛍光性指標が求める波長に対応させて、例えば、５００ｎｍ近傍の発光帯域を持つＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（商品名、登録商標）を用いる場合は、励起光の波長は４８５〜４８８ｎｍ、５８０ｎｍ近傍の発光帯域を持つテトラメチルローダミンを用いる場合は、励起光の波長は５６１ｎｍなどとする。このように、複数種類の蛍光性指標に対応できるように、複数の波長の励起光源を備えておくことが好ましい。 The optical microscope 11 has a function of irradiating excitation light for causing a fluorescent index included in the measurement target sample 10 to emit light. As an irradiation light source of excitation light, a laser light source such as a sapphire laser, a solid laser such as YAG, and other various semiconductor lasers can be used. Further, a known light source such as a high-pressure discharge lamp such as a mercury lamp or a xenon lamp can be used, and it is preferable to appropriately include a light amount adjusting means such as an acousto-optic filter (AOTF). The wavelength of the excitation light corresponds to the wavelength required by the fluorescence index used. For example, when using AlexaFlour 488 (trade name, registered trademark) having an emission band near 500 nm, the wavelength of the excitation light is 485 to 488 nm. When tetramethylrhodamine having an emission band near 580 nm is used, the wavelength of the excitation light is 561 nm or the like. Thus, it is preferable to provide excitation light sources having a plurality of wavelengths so as to be compatible with a plurality of types of fluorescent indicators.
励起光の照射光学系としては、１分子レベルの蛍光測定に有利であるためにいわゆる１分子顕微鏡で使用されるエバネッセント光を用いた全反射照明を採用することができる。なお、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、分離された状態の生体分子に標識された蛍光性指標の発光全体を拡大像としてとらえる必要がある。特に、分離手段としてゲル電気泳動法やキャピラリー電気泳動法、液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）などを用いた場合には、励起光をエバネッセント光として照射すると顕微鏡視野の深さ方向において、全体の蛍光性指標を励起できない場合が生じる。このため、広視野照明型、シート照明型など、エバネッセント照明型以外の励起光が照射できる励起光学系を、選択された分離手段に伴う観察深度の深浅に対応させて備えることが好ましい。また、複数種類の励起光が照射できる照射光学系を備えた構成とすることもできる。 As the excitation light irradiation optical system, total reflection illumination using evanescent light used in a so-called single molecule microscope can be adopted because it is advantageous for fluorescence measurement at a single molecule level. In the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, it is necessary to capture the entire emission of the fluorescent indicator labeled on the separated biomolecule as an enlarged image. In particular, when gel electrophoresis, capillary electrophoresis, liquid chromatography (LC), or the like is used as a separation means, when the excitation light is irradiated as evanescent light, the entire fluorescence is observed in the depth direction of the microscope field. In some cases, the indicator cannot be excited. For this reason, it is preferable to provide an excitation optical system capable of emitting excitation light other than the evanescent illumination type, such as a wide-field illumination type and a sheet illumination type, corresponding to the depth of observation accompanying the selected separation means. Moreover, it can also be set as the structure provided with the irradiation optical system which can irradiate multiple types of excitation light.
光学顕微鏡１１は、オートフォーカス光の照射や撮像画像のコントラストからフォーカス状態を把握して対物レンズ位置を微調整するオートフォーカス機能、測定対象試料が載置された観察テーブルをＸ軸方向、Ｙ軸方向の２次元方向に自動で移動させることができる機能など、光学顕微鏡が一般的に備えている各種機能を備えることができる。 The optical microscope 11 has an autofocus function for finely adjusting the position of the objective lens by grasping the focus state from the irradiation of autofocus light and the contrast of the captured image, and the observation table on which the sample to be measured is placed in the X axis direction and the Y axis. Various functions generally provided in an optical microscope, such as a function capable of automatically moving in a two-dimensional direction, can be provided.
［発光検出部］
発光検出部１２は、光学顕微鏡１１によって観察された測定対象試料１０の拡大像における蛍光性指標の発光を１分子レベルで検出する部材である。
[Light emission detector]
The luminescence detection unit 12 is a member that detects luminescence of the fluorescent indicator in the magnified image of the measurement target sample 10 observed by the optical microscope 11 at a single molecule level.
発光検出部１２としては、光学顕微鏡１１に備えられ、観察している試料の拡大像をモニタで表示可能とするために、顕微鏡視野を画像データとして取得するＣＣＤやＣＭＯＳなどの撮像デバイスによる撮像部１２ｃを用いることができる。特に、高感度でかつ高倍率の電子像倍型ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ：Ｅｌｅｃｔｏｒｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ ＣＣＤ）は、１分子レベルの生体分子に標識された蛍光性指標の発光の検出に好適である。また、冷却ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラを用いてもよい。撮像部１２ａにより取得された画像データをデータ解析して輝点の有無を判定することによって、その画像データが取得された取得タイミングにおける蛍光性指標の発光を検出することができる。 The light emission detection unit 12 is provided in the optical microscope 11 and is an image pickup unit using an image pickup device such as a CCD or CMOS that acquires a microscope field of view as image data so that an enlarged image of the sample being observed can be displayed on the monitor. 12c can be used. In particular, a high-sensitivity and high-magnification electron image multiplying CCD (EM-CCD) is suitable for detecting light emission of a fluorescent indicator labeled on a single-molecule level biomolecule. A cooled CCD camera or a CMOS camera may be used. By analyzing the image data acquired by the imaging unit 12a and determining the presence / absence of a bright spot, it is possible to detect the emission of the fluorescent indicator at the acquisition timing when the image data is acquired.
また、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、光学顕微鏡１１により取得された測定対象試料１０の拡大像における蛍光性指標の二次元的な位置やその動きを把握する必要はない。このため、光学顕微鏡１１の拡大された画像を観察する部分に、フォトマル（光電子増倍管）やフォトセルなどの高感度な受光デバイスを配置して、発光検出部１２とすることができる。 Further, in the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, it is not necessary to grasp the two-dimensional position and movement of the fluorescent index in the enlarged image of the measurement target sample 10 acquired by the optical microscope 11. For this reason, a light-sensitive detection device 12 such as a photomultiplier (photomultiplier tube) or a photocell can be arranged in the portion of the optical microscope 11 where the enlarged image is observed to form the light emission detector 12.
なお、後述のように、測定対象試料に２種類の蛍光性指標を付着させる場合には、それぞれの発光を波長によって分離して検出することとなる。 As will be described later, when two kinds of fluorescent indicators are attached to the sample to be measured, each light emission is separated and detected by the wavelength.
［結果算出部］
結果算出部１３は、発光検出部１２により検出された光学顕微鏡１１の拡大像における蛍光性指標の発光強度を算出し、測定結果数値として出力する。
[Result calculation unit]
The result calculation unit 13 calculates the light emission intensity of the fluorescent indicator in the magnified image of the optical microscope 11 detected by the light emission detection unit 12, and outputs it as a measurement result numerical value.
発光検出部１２が、ＣＣＤカメラなどの撮像部１２ａを用いている場合は、取得された撮像画像の画像データに対して画像解析を行って、視野内に含まれる蛍光性指標の輝点の数をカウントしてその数を測定結果数値とすることができる。また、複数の蛍光性指標が集まっているために発光輝度が他よりも高い輝点がある場合には、その輝度から集まっている蛍光性指標の数を推定して積算することにより、測定結果数値を求めることができる。 When the light emission detection unit 12 uses an imaging unit 12a such as a CCD camera, the image data of the acquired captured image is subjected to image analysis, and the number of bright spots of the fluorescent index included in the field of view. And the number can be used as a measurement result numerical value. In addition, if there are bright spots with higher emission brightness than others due to the collection of multiple fluorescent indicators, the number of fluorescent indicators collected from the luminance is estimated and integrated to obtain the measurement result. A numerical value can be obtained.
一方、発光検出部１２が上述のような受光デバイスである場合には、当該デバイスから出力される輝度信号の値が測定結果数値に対応するものとなる。 On the other hand, when the light emission detection unit 12 is a light receiving device as described above, the value of the luminance signal output from the device corresponds to the measurement result numerical value.
［データ解析部］
データ解析部１４は、結果算出部１３で算出された測定結果数値と、その測定結果数値が取得された取得タイミングとを関連づけて、測定対象試料１０のデータ解析を行う。
[Data analysis section]
The data analysis unit 14 performs data analysis of the measurement target sample 10 in association with the measurement result numerical value calculated by the result calculation unit 13 and the acquisition timing at which the measurement result numerical value is acquired.
本実施形態のデータ解析装置１００では、所定の方法で分離された状態の測定対象試料１０に対して光学顕微鏡１１を順次走査しながら拡大画像を取得し、拡大画像から得られた測定結果数値と、その測定結果数値を算出した拡大画像の取得タイミングの関係から、測定対象試料に含まれる生体分子のデータ解析を行う。 In the data analysis apparatus 100 of this embodiment, an enlarged image is acquired while sequentially scanning the optical microscope 11 with respect to the measurement target sample 10 in a state separated by a predetermined method, and the measurement result numerical value obtained from the enlarged image and From the relationship of the acquisition timing of the enlarged image for which the measurement result numerical value is calculated, data analysis of biomolecules contained in the measurement target sample is performed.
光学顕微鏡１１の拡大観察光学系の視野内に順次捕らえられた拡大画像は、光学顕微鏡１１が分離された状態の測定対象試料１０を走査しながら観察したものであるため、たとえば、光学顕微鏡１１が測定対象試料１０に対して一方向に走査（一次元走査）された場合、相対的な走査速度と拡大画像の取得タイミング間の時間を掛け合わせることで、分離された測定対象試料１０における観察位置が求まる。 The enlarged images sequentially captured in the field of view of the magnification observation optical system of the optical microscope 11 are observed while scanning the measurement target sample 10 in a state where the optical microscope 11 is separated. When the measurement target sample 10 is scanned in one direction (one-dimensional scan), the observation position in the separated measurement target sample 10 is obtained by multiplying the time between the relative scanning speed and the acquisition timing of the enlarged image. Is obtained.
また、光学顕微鏡１１が測定対象試料１０に対して２次元に走査された場合は、走査された際の軌跡と拡大画像の取得タイミングとから、２次元に分離された測定対象試料１０のどの部分を観察して得られた拡大画像かを把握できる。 In addition, when the optical microscope 11 is scanned two-dimensionally with respect to the measurement target sample 10, which part of the measurement target sample 10 is two-dimensionally separated from the trajectory at the time of scanning and the acquisition timing of the enlarged image. It can be grasped whether it is an enlarged image obtained by observing.
さらに、例えば、測定対象試料１０が、分離された状態で所定の条件にしたがってマルチウェルの各ウェル内に収容されたものである場合には、マルチウェルの各ウェルに対する観察順序を把握することで、順次観察された拡大画像が、どのウェル内の試料を拡大観察したものかが判明する。 Furthermore, for example, when the measurement target sample 10 is stored in each well of the multiwell according to a predetermined condition in a separated state, the observation order for each well of the multiwell is grasped. Then, the sequentially observed magnified images reveal which well in which the sample is magnified.
また、分離された状態の測定対象試料１０と光学顕微鏡１１とが、空間的に走査された場合ではなく、光学顕微鏡１１の観察視野内を分離条件に従って測定対象試料が順次通過する場合には、取得タイミングそのものがそのまま測定結果数値を算出した試料の分離条件となる。 In addition, when the measurement target sample 10 and the optical microscope 11 in a separated state are not spatially scanned, the measurement target sample sequentially passes through the observation field of the optical microscope 11 according to the separation condition. The acquisition timing itself is the sample separation condition for which the measurement result numerical value is calculated as it is.
このように、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、分離された状態の測定対象試料１０に対して順次走査されて光学顕微鏡１１が観察した拡大画像から、生体分子の量を表す測定結果数値と、分離条件を表す当該測定結果数値を取得した取得タイミングとの関係から、測定の対称となる生体分子の分離条件に基づいてのデータ解析を行うことができる。 As described above, in the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, the measurement result numerical value representing the amount of the biomolecule from the enlarged image observed by the optical microscope 11 by sequentially scanning the measurement target sample 10 in the separated state. From the relationship between the acquisition timing at which the measurement result numerical value representing the separation condition is acquired, data analysis can be performed based on the separation condition of the biomolecule that is symmetrical to the measurement.
データ解析部１４が把握する測定結果数値の取得タイミングは、連続して測定結果数値が得られている場合には測定時刻、または測定開始時刻からの経過時間のデータとして把握される。また、測定結果数値が断続的に得られる場合には、データの取得順序を測定結果数値の取得タイミングとして把握することができる。このため、図１での図示は省略するが、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、データ解析部１４自体、または、光学顕微鏡１１、発光検出部１２、結果算出部１３のいずれかの部材に、測定結果数値が得られた時刻を把握する現在時刻データ取得手段、または、タイマー手段、および、測定結果数値を取得した順序を把握するためのカウント手段の少なくともいずれかを有している。なお、データ解析部１４が、取得タイミングを示すデータを取得することができる外部の装置として、これらの取得タイミングを示す情報提供手段を備えることもできる。 The measurement result numerical value acquisition timing grasped by the data analysis unit 14 is grasped as measurement time or elapsed time data from the measurement start time when the measurement result numerical value is continuously obtained. In addition, when the measurement result numerical value is obtained intermittently, the data acquisition order can be grasped as the measurement result numerical value acquisition timing. For this reason, although illustration in FIG. 1 is omitted, in the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, the data analysis unit 14 itself, or any member of the optical microscope 11, the light emission detection unit 12, and the result calculation unit 13 Furthermore, at least one of current time data acquisition means for grasping the time when the measurement result numerical value is obtained, timer means, and counting means for grasping the order of obtaining the measurement result numerical value is provided. In addition, the data analysis part 14 can also be provided with the information provision means which shows these acquisition timings as an external apparatus which can acquire the data which show acquisition timings.
なお、データ解析部によるデータ解析手法と、データ解析結果の詳細については、本実施形態にかかるデータ解析方法として後に詳述する。 The details of the data analysis method by the data analysis unit and the data analysis result will be described later as the data analysis method according to the present embodiment.
このようなデータ解析部１４は、得られたデータに基づいてその内容をデータ解析する機能を果たすために、マイコンや論理回路を備えたデータ処理手段として構成できる。また、データ解析部１４として特有のデータ処理手段を構成しなくても、パーソナルコンピュータを用いて所定の演算を行う形でデータ解析部１４の機能を果たすことができる。 Such a data analysis unit 14 can be configured as a data processing means including a microcomputer and a logic circuit in order to fulfill the function of analyzing the contents of the data based on the obtained data. Further, the function of the data analysis unit 14 can be achieved by performing a predetermined calculation using a personal computer without configuring a specific data processing unit as the data analysis unit 14.
［移動分離手段］
本実施形態にかかるデータ解析装置１００において、測定対象試料１０について、総体として取得したものを分離する移動分離手段１５は、必須の構成要件ではない。
[Moving separation means]
In the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, the moving separation means 15 that separates the measurement target sample 10 obtained as a whole is not an essential component.
例えば、データ解析装置１００とは別に設けられた移動分離手段１５によって、測定対象試料１０を分離し、分離した状態を維持して本実施形態にかかるデータ解析装置１００を用いて光学顕微鏡１１による走査を行って、生体分子のデータ解析を行うことができる。 For example, the sample 10 to be measured is separated by the moving separation means 15 provided separately from the data analysis apparatus 100, and the separated state is maintained, and scanning by the optical microscope 11 is performed using the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment. To perform biomolecule data analysis.
一方、測定対象試料１０を分離する移動分離手段１５を、本実施形態にかかるデータ解析装置１００の一構成要件とすることで、測定対象となる生体分子をデータ解析装置１００の所定部分に供給するだけで、測定対象試料の分離と、分離された測定対象試料１０のデータ解析とを一連の動作で実行することかできる全自動のデータ解析装置１００を構成することができる。 On the other hand, the moving / separating means 15 for separating the measurement target sample 10 is set as one constituent requirement of the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, so that the biomolecules to be measured are supplied to a predetermined portion of the data analysis apparatus 100. Thus, it is possible to configure the fully automatic data analysis apparatus 100 that can perform the separation of the measurement target sample and the data analysis of the separated measurement target sample 10 by a series of operations.
データ解析装置１００によってプロテオーム解析を行う場合、移動分離手段１５としては、電気泳動装置を用いることができる。移動分離時の試料の移動距離は、電気泳動装置の泳動カラムやキャピラリーの長さによって決定されるが、高濃度試料の場合であっても、後の走査観察の際に発光検出部における１分子検出が保障されるよう、十分な長さをもって設計される。 When the proteome analysis is performed by the data analysis apparatus 100, an electrophoretic apparatus can be used as the moving separation unit 15. The moving distance of the sample during the moving separation is determined by the length of the electrophoresis column or capillary of the electrophoresis apparatus. Even in the case of a high concentration sample, one molecule in the luminescence detection unit is used in the subsequent scanning observation. Designed with sufficient length to ensure detection.
高濃度試料でなくても、生体由来試料であるから、一定のＰＨ値付近に複数種類のタンパク質分子が局在する場合もある。また、生体を構成するタンパク質の分子量は、１ｋＤ未満から２６０ｋＤ程度と様々であるが、生体内で重要な働きを担うタンパク質はしばしば２０ｋＤ以下で互いに近接した分子量を有しており、そのようなプロテオーム試料の解析の際には、低分子量付近の泳動スポットが過密になることがある。 Even if it is not a high-concentration sample, it is a sample derived from a living body, and therefore, a plurality of types of protein molecules may be localized near a certain PH value. In addition, the molecular weight of proteins constituting a living body varies from less than 1 kD to about 260 kD, but proteins that play an important role in the living body often have molecular weights close to each other at 20 kD or less, and such proteomes. When analyzing a sample, electrophoresis spots near a low molecular weight may become overcrowded.
観察系の空間分解能は一般に半波長程度と考えられており、可視光による観測の場合、光の回折限界から空間分解能はおおよそ２００ｎｍ程度と考えられることから、これを考慮し移動距離を設計することが望ましい。そのため、電気泳動装置における移動分離部の長さは、好ましくは２６ｍｍ以上、１２ｍ以下に設計され、２８ｍｍ以上、１０．５ｍ以下であってもよく、３０ｍｍ以上、１０ｍ以下であってもよい。トランスクリプトーム解析、ゲノム解析、メタボローム解析においても、上記と同様の理由から、当該移動分離手段における移動分離部の長さは、２６ｍｍ以上、１２ｍ以下として良く、２８ｍｍ以上、１０．５ｍ以下であってもよく、３０ｍｍ以上、１０ｍ以下であってもよい。その他のオミックス解析の場合も同様である。 The spatial resolution of the observation system is generally considered to be about half a wavelength, and in the case of observation with visible light, the spatial resolution is considered to be about 200 nm due to the light diffraction limit. Is desirable. Therefore, the length of the moving separation unit in the electrophoresis apparatus is preferably designed to be 26 mm or more and 12 m or less, may be 28 mm or more, 10.5 m or less, and may be 30 mm or more and 10 m or less. In the transcriptome analysis, genome analysis, and metabolome analysis, the length of the moving separation unit in the moving separation means may be 26 mm or more and 12 m or less, and 28 mm or more and 10.5 m or less for the same reason as described above. It may be 30 mm or more and 10 m or less. The same applies to other omics analyses.
なお、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、測定対象試料の分離方法として複数の手法を採用することができる。このため、データ解析装置１００が備える移動分離手段１５は、それぞれの分離方法に応じて異なるものとなる。これらの分離方法と分離手段の構成については、後に詳述する。 In the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, a plurality of methods can be employed as the method for separating the measurement target sample. For this reason, the movement separation means 15 with which the data analysis apparatus 100 is provided differs according to each separation method. The structure of these separation methods and separation means will be described in detail later.
［制御部］
データ解析装置１００の構成要件として移動分離手段１５を含む含まないに関わらず、光学イメージング装置１１による測定対象試料１０の観察と、測定結果数値の取得、さらに、測定結果数値と測定タイミングとの関連に基づいたデータ解析部１４でのデータ解析までを一連の動作とするために、データ解析装置１００は、各部材の動作を制御する制御部１６を備えることが好ましい。
[Control unit]
Regardless of whether or not the moving separation means 15 is included as a constituent element of the data analysis apparatus 100, the observation of the measurement target sample 10 by the optical imaging apparatus 11, acquisition of the measurement result numerical value, and the relationship between the measurement result numerical value and the measurement timing In order to make a series of operations up to data analysis in the data analysis unit 14 based on the above, it is preferable that the data analysis device 100 includes a control unit 16 that controls the operation of each member.
例えば、データ解析装置１００が移動分離手段１５を含んだ自動データ解析装置である場合には、制御部１６は、ユーザによるデータ解析開始の指示に基づいて、移動分離手段１５による測定対象試料の分離を開始し、分離された状態の測定対象試料１０に対して、観察ステージを動作させるなどして光学顕微鏡１１を測定対象試料１０に対して順次走査して、拡大画像を得る。 For example, when the data analysis apparatus 100 is an automatic data analysis apparatus including the moving separation means 15, the control unit 16 separates the measurement target sample by the movement separation means 15 based on an instruction to start data analysis by the user. Is started, and the optical microscope 11 is sequentially scanned with respect to the measurement target sample 10 by operating the observation stage with respect to the measurement target sample 10 in the separated state, thereby obtaining an enlarged image.
制御部１６は、発光検出部１２を経て結果算出部１３で得られた測定結果数値と、その取得タイミングに基づいて、データ解析部１４で測定データのデータ解析を行わせる。 The control unit 16 causes the data analysis unit 14 to perform data analysis of the measurement data based on the measurement result numerical value obtained by the result calculation unit 13 via the light emission detection unit 12 and the acquisition timing thereof.
なお、データ解析装置１００が移動分離手段１５を含んでおらず、分離された状態の測定対象試料のデータ解析を自動的に行うものである場合には、分離された状態の測定対象試料１０がデータ解析装置１００の所定部分にセットされた後に、ユーザがデータ解析開始の指示を行うことで、光学顕微鏡１１による相対的な走査が開始される。 In addition, when the data analysis apparatus 100 does not include the moving separation unit 15 and automatically performs data analysis of the measurement target sample in the separated state, the measurement target sample 10 in the separated state is provided. After being set in a predetermined portion of the data analysis apparatus 100, the user gives an instruction to start data analysis, whereby relative scanning by the optical microscope 11 is started.
［コンピュータプログラム、記録媒体］
このような制御部１６は、データ解析装置１００の各部を制御するためのプログラムで動作するコンピュータとして構成することができる。データ解析装置１００全体の動作を制御する制御部１６を適宜書き換え可能なプログラムで動作するコンピュータで構成することで、測定対象試料１０や、移動分離手段１５における分離方法、また、データ解析部１４におけるデータ解析処理内容の変更や追加にも容易に対応することができる。
[Computer program, recording medium]
Such a control part 16 can be comprised as a computer which operate | moves with the program for controlling each part of the data analysis apparatus 100. FIG. By configuring the control unit 16 that controls the operation of the entire data analysis apparatus 100 with a computer that operates with a rewritable program as appropriate, the measurement target sample 10, the separation method in the moving separation means 15, and the data analysis unit 14 It is possible to easily cope with changes and additions in the contents of data analysis processing.
また、制御部１６を所定のプログラムで動作するコンピュータで構成する場合には、プログラムを記録媒体に記録することが好ましい。記録媒体としては、記録されたプログラムを読み出すためのＲＯＭ形式、プログラムの修正、改善が可能なＲＡＭ形式のいずれの形式も使用可能であり、ＣＤやＤＶＤ、ＢＤなどの光学ディスク、各種の半導体メモリカード、また、ハードディスクや磁気テープ媒体など、プログラムを記録するために使用される媒体を使用することができる。 When the control unit 16 is configured by a computer that operates with a predetermined program, it is preferable to record the program on a recording medium. As a recording medium, any of a ROM format for reading a recorded program and a RAM format capable of modifying and improving the program can be used, such as an optical disk such as a CD, a DVD, and a BD, and various semiconductor memories. A medium used for recording a program, such as a card, a hard disk, or a magnetic tape medium, can be used.
［その他の構成］
本実施形態にかかるデータ解析装置１００は、データ解析部１４が一連のデータ解析を行うために、あらかじめデータ解析に用いられる所定のデータが記録されているデータ記録部１７を備えることができる。
[Other configurations]
The data analysis apparatus 100 according to the present embodiment can include a data recording unit 17 in which predetermined data used for data analysis is recorded in advance so that the data analysis unit 14 performs a series of data analysis.
このデータ記録部１７は、あらかじめデータ解析に必要な情報を記録しておくだけではなく、データ解析装置１００で測定対象試料１０のデータ解析が行われる毎にそのデータ解析結果を随時新たなデータとして記憶することができる書き換え可能な記憶手段を用いて、データ解析を行うほどデータ解析結果の精度が向上する学習機能を果たすようにすることができる。 The data recording unit 17 not only records information necessary for data analysis in advance, but also stores the data analysis result as new data whenever data analysis of the measurement target sample 10 is performed by the data analysis apparatus 100. By using a rewritable storage means that can be stored, it is possible to perform a learning function that improves the accuracy of the data analysis result as data analysis is performed.
本実施形態にかかるデータ解析装置１００は、さらに、データ解析部１４でのデータ解析結果をユーザに対して報知するためのデータ出力部１８を備えることができる。 The data analysis apparatus 100 according to the present embodiment can further include a data output unit 18 for notifying the user of the data analysis result in the data analysis unit 14.
データ出力部１８は、データ解析結果の出力形式に応じて、データ解析結果を画像として表示するＬＣＤディスプレイなどの表示装置、データ解析結果を所定の用紙などに印刷して出力するプリンター、データ解析結果を他のデータ処理装置で利用可能なように所定のデータ形式でアウトプットする有線または無線の通信手段を用いたデータアウトプット装置などとして実現することができる。 The data output unit 18 includes a display device such as an LCD display that displays the data analysis result as an image according to the output format of the data analysis result, a printer that prints and outputs the data analysis result on a predetermined sheet, and the data analysis result Can be realized as a data output device using a wired or wireless communication means for outputting in a predetermined data format so that it can be used by other data processing devices.
また、図１での図示は省略するが、本実施形態にかかるデータ解析装置１００では、データ解析の開始をユーザが指示するための操作部、所定のデータをデータ記憶部１７に追加する場合のデータ入力部など、データ解析装置一般に用いられる各種のユーザインタフェース、外部機器との接続装置などを備えることができる。 Although not shown in FIG. 1, in the data analysis apparatus 100 according to the present embodiment, an operation unit for the user to instruct the start of data analysis, a case where predetermined data is added to the data storage unit 17. Various user interfaces generally used for data analysis devices such as a data input unit, a connection device with an external device, and the like can be provided.
［データ解析方法］
次に、本願で開示するデータ解析方法の実施形態として、上述の本実施形態にかかるデータ解析装置において実行される生体分子のデータ解析の具体的な方法について説明する。また、以下の実施形態では、測定対象となる生体分子がタンパク質である、プロテオーム解析が行われる場合を例示して説明する。
[Data analysis method]
Next, as an embodiment of the data analysis method disclosed in the present application, a specific method of biomolecule data analysis executed in the data analysis apparatus according to the above-described embodiment will be described. Further, in the following embodiments, a case where a proteome analysis in which a biomolecule to be measured is a protein is performed will be described.
図２は、本実施形態で説明するデータ解析方法の手順を説明するためのイメージ図である。 FIG. 2 is an image diagram for explaining the procedure of the data analysis method described in the present embodiment.
まず、図２（ａ）に示すように、測定対象試料である生体分子２１に、蛍光性指標２４を標識する。 First, as shown in FIG. 2A, a fluorescent indicator 24 is labeled on a biomolecule 21 that is a measurement target sample.
本実施形態にかかるデータ解析方法では、生体分子の総体である、例えば被験者の細胞に含まれるタンパク質全体についての定量的なプロファイリングを行う。プロテオーム解析の場合、本願所定の「生体分子の総体」として想定されるのは、少なくとも１０種類以上のタンパク質分子または多量体構成タンパクのサブユニットを含む試料であるが、図２（ａ）では、このうち３種類のタンパク質２１、２２、２３が近接して混在している状態が例示されている。 In the data analysis method according to the present embodiment, quantitative profiling is performed on the entire protein that is a total of biomolecules, for example, contained in the cells of the subject. In the case of proteome analysis, what is assumed as the “total biomolecule” defined in the present application is a sample containing at least 10 types of protein molecules or multimeric protein subunits. In FIG. 2 (a), Of these, a state in which three types of proteins 21, 22, and 23 are mixed in close proximity is illustrated.
次に、この混在している複数種類のタンパク質を、電気泳動法やクロマトグラフィー法など、タンパク質の総体を特定の物理パラメータに沿って種類毎に分離する方法２５によって分離する。図２（ｂ）は、所定の分離条件、例えば電気泳動法であれば印加された電界によってタンパク質２１、２２、２３が分離された状態を示している。 Next, the mixed plural types of proteins are separated by a method 25 such as electrophoresis or chromatography, in which the total protein is separated for each type along specific physical parameters. FIG. 2B shows a state where the proteins 21, 22, and 23 are separated by a predetermined separation condition, for example, an applied electric field in the case of electrophoresis.
本実施形態で説明するデータ解析方法では、この分離されている状態のタンパク質２１、２２、２３を、光学顕微鏡２６で走査しながら観察する。図２（ｃ）に示すように、電気泳動法により分離された状態のタンパク質を、矢印２７に示す方向に走査することで、タンパク質２１が最初の取得タイミングで観察され、その後、所定の間隔を隔てて次の取得タイミングで第２のタンパク質２２が、さらに、所定の間隔をおいて第３のタンパク質２３が観察される。 In the data analysis method described in the present embodiment, the separated proteins 21, 22, and 23 are observed while scanning with the optical microscope 26. As shown in FIG. 2 (c), by scanning the protein separated by electrophoresis in the direction indicated by the arrow 27, the protein 21 is observed at the first acquisition timing, and then a predetermined interval is set. The second protein 22 is observed at the next acquisition timing, and the third protein 23 is further observed at a predetermined interval.
なお、顕微鏡により観察されるのは、タンパク質２１、２２、２３に付着させた蛍光性指標２４の発光であり、蛍光性指標２４の発光の強さがその分離条件で分離されているタンパク質２１、２２、２３の数を表している。 Note that what is observed with a microscope is the emission of the fluorescent indicator 24 attached to the proteins 21, 22, and 23, and the intensity of the emission of the fluorescent indicator 24 is separated under the separation conditions. The numbers 22 and 23 are shown.
図２（ｄ）に示すように、取得タイミングを表す、光学顕微鏡により観察された時間（例えば測定開始時刻からの経過時間）を横軸に、それぞれの取得タイミングにおける蛍光性指標２４の発光強度を縦軸にしてスペクトルを描くことにより、観察された測定対象試料である総体としてのタンパク質の分類とそれぞれのタンパク質の定量化が果たせたこととなる。なお、測定結果のスペクトル表示においては、縦軸を測定時間（分離条件）、横軸を発光強度とすることもできる。 As shown in FIG. 2 (d), the time observed by the optical microscope (for example, the elapsed time from the measurement start time) representing the acquisition timing is shown on the horizontal axis, and the emission intensity of the fluorescent indicator 24 at each acquisition timing is shown. By drawing the spectrum on the vertical axis, the classification of the protein as a whole, which is the observed sample to be measured, and the quantification of each protein can be accomplished. In the spectrum display of measurement results, the vertical axis can be the measurement time (separation conditions), and the horizontal axis can be the emission intensity.
［蛍光性指標の標識］
まず、図２（ａ）で示した、測定対象試料である総体としてのタンパク質に蛍光性指標を付す工程の例を説明する。
[Labeling of fluorescent indicators]
First, an example of the step of attaching a fluorescent index to the protein as a whole that is the measurement target sample shown in FIG.
測定対象試料（サンプル）調製として、 変性／溶解緩衝液（１０ｍＭホウ酸塩と界面活性剤として１％ＳＤＳ、１％Ｔｗｅｅｎ（商品名）を含むもの）を調製し、ＮａＯＨ ２Ｍを用いて変性／溶解緩衝液のｐＨを調整する。変性／緩衝溶液のｐＨは高い値（強アルカリ性）とすることが好ましく、一例としてｐＨ１２とする。 As a sample to be measured (sample), a denaturation / lysis buffer (containing 10 mM borate and 1% SDS as a surfactant, 1% Tween (trade name)) is prepared and denatured with NaOH 2M. Adjust the pH of the lysis buffer. The pH of the denaturing / buffer solution is preferably a high value (strong alkalinity), for example, pH 12.
次に、標識反応によって１００μｌの変性／溶解緩衝液に両性界面活性剤ＣＨＡＰＳ（商品名）を最終２％、および、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ：商品名）最終１０ｍＭを加える。 Next, a final 2% amphoteric surfactant CHAPS (trade name) and a final 10 mM dithiothreitol (DTT: trade name) are added to 100 μl of denaturation / lysis buffer by labeling reaction.
これに、測定対象となるタンパク質の総体１〜５μｌを加える。 To this, a total of 1 to 5 μl of the protein to be measured is added.
直ちに、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に一例として０．３ｍＭに希釈した緑色蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（商品名）、ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エステル１μｌを添加し、室温で１５分間〜１時間インキュベートする。 Immediately, 1 μl of green fluorescent dye (AlexaFluor 488 (trade name), hydroxysuccinimide (NHS), ester) diluted to 0.3 mM as an example in dimethylformamide (DMF) is added, and incubated at room temperature for 15 minutes to 1 hour.
このようにして、各タンパク質に含まれるアミノ基をターゲットとして蛍光色素を付加することで、タンパク質の総体に対して蛍光性指標の全分子種ラベルが可能となる。 In this way, by adding a fluorescent dye with the amino group contained in each protein as a target, it is possible to label all molecular species of the fluorescent index with respect to the total protein.
なお、本実施形態にかかるデータ解析装置において、複数の蛍光性指標を用いることができ、例えば、特定のタンパク質にのみ標識化を行う特定のタンパク質を用い、蛍光性指標の発光波長の違いを区別して測定結果数値を得ることで、分離手段における分離方法以外のさらなる測定対象試料の分離を行うことができる。 In the data analysis apparatus according to the present embodiment, a plurality of fluorescent indices can be used. For example, a specific protein that labels only a specific protein is used, and the difference in the emission wavelength of the fluorescent index is distinguished. Separately, by obtaining the measurement result numerical value, it is possible to further separate the sample to be measured other than the separation method in the separation means.
［試料の分離と光学顕微鏡での観察］
以下、本実施形態で説明するデータ解析方法における、測定対象試料の分離方法と、それぞれの方法により分離された状態の測定対象試料を光学顕微鏡で走査して観察する方法について説明する。
[Sample separation and observation with an optical microscope]
Hereinafter, in the data analysis method described in this embodiment, a method for separating a measurement target sample and a method for observing a measurement target sample separated by each method by scanning with an optical microscope will be described.
なお、それぞれの分離方法と分離された状態の試料を観察するイメージを図３〜図７に示す。 In addition, the image which observes the sample of each separation method and the isolate | separated state is shown in FIGS.
（第１の分離方法）
第１の分離方法は、ゲル電気泳動法によって試料を分離する方法である。
(First separation method)
The first separation method is a method of separating a sample by gel electrophoresis.
図３は、ゲル電気泳動法を用いて測定対象試料の分離を行いつつ、光学顕微鏡で測定対象試料を観察する方法を説明するイメージ図である。 FIG. 3 is an image diagram illustrating a method for observing a measurement target sample with an optical microscope while separating the measurement target sample using gel electrophoresis.
この方法は、タンパク質の分離で一般的に用いられているゲル電気泳動法によって測定対象試料であるタンパク質の総体を分離しつつ、ゲル内で分離された状態の試料を光学顕微鏡で走査しながら観察する方法である。 This method uses a gel electrophoresis method commonly used for protein separation to separate the entire protein as the sample to be measured, while observing the sample separated in the gel while scanning with an optical microscope. It is a method to do.
図３に示すように、光学顕微鏡のガラスステージ３１上にＳＤＳマイクロゲル３２を載置して、その両端に試料を入れた容器３３、３４を配置する。容器３３と試料導入部３２ａを接続して、マイクロゲル３２を介して容器３４との間を試料で接続する。 As shown in FIG. 3, an SDS microgel 32 is placed on a glass stage 31 of an optical microscope, and containers 33 and 34 containing samples are placed on both ends thereof. The container 33 and the sample introduction part 32 a are connected, and the sample is connected to the container 34 via the microgel 32.
試料の両端部に相当する容器３３と容器３４との間に所定の電圧を印加することにより、試料中のタンパク質はその電荷量によって移動し、種類毎にマイクロゲル３２中の特定の位置に留まる。なお、図３中の３５は、マイクロゲル３２の温度が高くなりすぎないようにする冷却プレートである。 By applying a predetermined voltage between the container 33 and the container 34 corresponding to both ends of the sample, the protein in the sample moves according to the amount of electric charge, and remains in a specific position in the microgel 32 for each type. . In addition, 35 in FIG. 3 is a cooling plate which prevents the temperature of the microgel 32 from becoming too high.
このように、試料中のタンパク質が分離された状態のマイクロゲル３２を、光学顕微鏡を走査させて観察する。図３では、ガラスステージ３１の下方から蛍光性指標を発光させる照射光を照射しながら、ガラスステージ３１を図中矢印で示す右方向に移動させている。このようにして、光学顕微鏡で観察するマイクロゲル３２の部分が順次異なることとなり、光学顕微鏡による走査しながらの観察が行われる。 Thus, the microgel 32 in a state where the protein in the sample is separated is observed by scanning the optical microscope. In FIG. 3, the glass stage 31 is moved in the right direction indicated by the arrow in the figure while irradiating the irradiation light for emitting the fluorescent indicator from below the glass stage 31. In this way, the portions of the microgel 32 that are observed with the optical microscope are sequentially different, and observation while scanning with the optical microscope is performed.
第１の分離方法を用いる場合、マイクロゲル内に存在するタンパク質に標識された蛍光性指標の発光を検出する必要がある。マイクロゲルには、一定の厚さ（一例として０．５ｍｍ）の厚さがあり、１分子レベルでの光学顕微鏡において測定対象試料の収容容器として通例使用されるマイクロウェルなどに比べて厚く、光学顕微鏡の拡大光学系からから見た場合の深度が大きくなる。 When the first separation method is used, it is necessary to detect the luminescence of the fluorescent indicator labeled on the protein present in the microgel. The microgel has a certain thickness (as an example, 0.5 mm), and is thicker than an optical well typically used as a container for a sample to be measured in an optical microscope at a single molecule level. The depth when viewed from the magnifying optical system of the microscope is increased.
このため、図３に示す例では、蛍光性指標を発光させる励起光の照射光学系３６として、シート照明を採用している。この場合、シート照明光は、ガラスステージ３１の下面から斜め上方に進んでマイクロゲル中の試料へ照射され、試料から発せられる蛍光は、ガラスステージ３１の下面に設置された対物レンズにて受光される。励起光の照射光学系３６の光軸と光学顕微鏡の拡大光学系３７とが略直交するシート照明方式を採用することで、ガラスステージ３１から約０．５ｍｍ上方に位置する蛍光性指標の発光を観察することができ、撮像装置３８で取得された画像データに基づいて光学顕微鏡の解析部３９で測定結果数値とその取得タイミングとの相関データを得ることができる。 For this reason, in the example shown in FIG. 3, sheet illumination is employed as the excitation light irradiation optical system 36 for emitting a fluorescent indicator. In this case, the sheet illumination light travels obliquely upward from the lower surface of the glass stage 31 and is irradiated onto the sample in the microgel, and the fluorescence emitted from the sample is received by the objective lens installed on the lower surface of the glass stage 31. The By adopting a sheet illumination method in which the optical axis of the excitation light irradiation optical system 36 and the magnifying optical system 37 of the optical microscope are substantially orthogonal to each other, light emission of a fluorescent index located approximately 0.5 mm above the glass stage 31 is achieved. It is possible to observe, and based on the image data acquired by the imaging device 38, the analysis unit 39 of the optical microscope can obtain correlation data between the measurement result numerical value and the acquisition timing.
なお、第１の分離方法の場合には、マイクロゲル３２に対して走査される光学顕微鏡で順次蛍光性指標の発光を得ることとなるため、取得タイミングに走査速度、図３の場合は、ガラスステージ３１の移動速度を乗じることで、マイクロゲル３２内の一方の端部からの距離を算出できる。このようにして得られた、マイクロゲル３２内の距離を第１の分離方法におけるタンパク質の分離状態を表す指標値とすることができる。 In the case of the first separation method, light emission of the fluorescent indicator is sequentially obtained with an optical microscope scanned with respect to the microgel 32, so that the scanning speed is obtained at the acquisition timing, and in the case of FIG. By multiplying the moving speed of the stage 31, the distance from one end in the microgel 32 can be calculated. The distance in the microgel 32 thus obtained can be used as an index value representing the protein separation state in the first separation method.
なお、図３では、マイクロゲル３２が載置されたガラスステージ３１を光学顕微鏡に対して移動させる方法を示したが、分離された状態の試料と光学顕微鏡とが相対的に走査されればよいことから、観察対象となるマイクロゲル３２は移動させずに、光学顕微鏡の拡大光学系を移動機構上に載置して光学顕微鏡が移動する構成とすることも可能である。また、ゲルに対して、縦方向と横方向との２方向から電界を印加して電気泳動を行う２次元の電気泳動法試料を分離する場合には、分離された試料と光学顕微鏡とを相対的に２次元方向に走査して、マイクロゲル内の所定の位置での蛍光性指標の発光を検出する。この場合の、走査方向と走査速度とから、蛍光性指標の発光の強さとして得られた測定結果数値が、ゲル内のどの部分に位置する試料からのものかを判断することで、より多段階に分離された状態のタンパク質についてのデータ解析を行うことができる。 3 shows a method of moving the glass stage 31 on which the microgel 32 is placed with respect to the optical microscope, the separated sample and the optical microscope may be scanned relatively. Therefore, it is also possible to adopt a configuration in which the optical microscope moves by placing the magnifying optical system of the optical microscope on the moving mechanism without moving the microgel 32 to be observed. In addition, when separating a two-dimensional electrophoresis sample in which electrophoresis is performed by applying an electric field to the gel from two directions of the vertical direction and the horizontal direction, the separated sample and the optical microscope are relatively Specifically, scanning in a two-dimensional direction is performed to detect light emission of the fluorescent indicator at a predetermined position in the microgel. In this case, the number of measurement results obtained as the intensity of light emission of the fluorescent index is judged from the sample located in the gel, based on the scanning direction and the scanning speed. Data analysis can be performed on proteins that are separated in stages.
（第２の分離方法）
第２の分離方法は、キャピラリー電気泳動法によって試料を分離する方法である。
(Second separation method)
The second separation method is a method for separating a sample by capillary electrophoresis.
図４に、キャピラリー電気泳動法を用いて測定対象試料の分離を行いつつ、光学顕微鏡で測定対象試料を観察する方法を説明するイメージ図を示す。 FIG. 4 shows an image diagram for explaining a method of observing a measurement target sample with an optical microscope while performing separation of the measurement target sample using capillary electrophoresis.
この方法は、キャピラリーを用いてゲル電気泳動法よりも高い分離能を有するキャピラリー電気泳動法を用い、キャピラリーの途中に設けた観視ユニットの内部を通過する試料を光学顕微鏡により拡大観視するものである。 This method uses a capillary electrophoresis method that has higher resolution than gel electrophoresis using a capillary, and magnifies the sample that passes through the inside of a viewing unit provided in the middle of the capillary with an optical microscope. It is.
図４に示すように、緩衝液を入れた２つの容器４１、４２の間にキャピラリー４３を配置し、容器４１、４２の間に所定の電圧を印加してキャピラリー電気泳動法を実施する。キャピラリー４３の途中に、光学顕微鏡のガラスステージ４４上に配置された観視ユニット４５が設けることで、印加される電圧とキャピラリー４３内で生じる電気浸透流との作用により分離された試料であるタンパク質が、順次観視ユニット４５内を通過し、これを光学顕微鏡で観視することで取得タイミングと関連づけた測定結果数値を得ることができる。 As shown in FIG. 4, a capillary 43 is disposed between two containers 41 and 42 containing a buffer solution, and a predetermined voltage is applied between the containers 41 and 42 to perform capillary electrophoresis. By providing a viewing unit 45 disposed on the glass stage 44 of the optical microscope in the middle of the capillary 43, a protein which is a sample separated by the action of the applied voltage and the electroosmotic flow generated in the capillary 43 However, the measurement result numerical value linked | related with the acquisition timing can be obtained by passing the inside of the viewing unit 45 sequentially, and viewing this with an optical microscope.
図５に、分離された試料の通過を光学顕微鏡で観視するための観視ユニットの構成を説明する斜視図を示す。 FIG. 5 is a perspective view for explaining the configuration of a viewing unit for viewing the separated sample through the optical microscope.
観視ユニット４５は、図５に示すように、光学顕微鏡のガラスステージ４４上に載置される部材であり、ガラスステージ４４と接触する底面に観視流路５２が形成されている。観視流路５２は、少なくとも光学顕微鏡によって観察する部分５２ａの断面が横長の略長方形に形成されていて、底辺に相当する長辺部分がガラスステージ４４に接触するように配置されている。また、光学顕微鏡で観察する部分５２ａの上流と下流側の部分では、観察流路５２の厚みを少し大きくし、観視流路５２の両端部分には、観視ユニット４５の厚さ方向に伸びた流入管５１と流出管５３とが形成されている。流入管５１と流出管５３の先端部分に、それぞれキャピラリー４３が接続されることで、キャピラリー４３により分離された試料が、順次観視流路５２を通過する。 As shown in FIG. 5, the viewing unit 45 is a member placed on the glass stage 44 of the optical microscope, and a viewing flow path 52 is formed on the bottom surface that contacts the glass stage 44. The viewing flow path 52 is formed so that at least the section 52 a observed with an optical microscope has a horizontally long cross-section, and the long side corresponding to the bottom is in contact with the glass stage 44. In addition, the thickness of the observation channel 52 is slightly increased in the upstream and downstream portions of the portion 52a observed with the optical microscope, and the both ends of the viewing channel 52 extend in the thickness direction of the viewing unit 45. An inflow pipe 51 and an outflow pipe 53 are formed. By connecting the capillaries 43 to the tip portions of the inflow pipe 51 and the outflow pipe 53, the sample separated by the capillaries 43 sequentially passes through the viewing channel 52.
なお、一例として、観視流路５２の幅Ｗ＝０．１ｍｍ、光学顕微鏡で観察する部分５２ａの厚さＨ＝０．００１ｍｍ、長さＬ＝０．１ｍｍとすることができる。観視ユニット４５はガラス、石英、または、ＰＤＭＳなどの樹脂材料により構成することができる。観察流路５２は、略直方体形状に構成された観視ユニット４５の一面を所定形状に切削することで、また、樹脂により観視ユニット４５を形成する場合には、観視ユニットを成型する際の型に観察流路５２に相当する突起部を設けておくことなどによって、観視ユニット４５の底面に形成することができる。 As an example, the width W of the viewing channel 52 can be 0.1 mm, the thickness H of the portion 52a observed with an optical microscope can be 0.001 mm, and the length L can be 0.1 mm. The viewing unit 45 can be made of a resin material such as glass, quartz, or PDMS. The observation flow path 52 is obtained by cutting one surface of the viewing unit 45 configured in a substantially rectangular parallelepiped shape into a predetermined shape, and when the viewing unit 45 is formed of resin, Can be formed on the bottom surface of the viewing unit 45 by providing a projection corresponding to the observation channel 52 on the mold.
図４に示すように、ガラステーブル４４の下方から光学顕微鏡で観視ユニット４５の観視流路５２内を観視する際には、観視流路５２の底面が平面であるため、励起光照射系４６を広視野照射型とすることができ、拡大観察光学系４７で得られた１分子レベルの拡大画像を撮像装置４８によって取得して、データ解析部４９でデータ解析することができる。 As shown in FIG. 4, when viewing the inside of the viewing channel 52 of the viewing unit 45 from below the glass table 44 with an optical microscope, the bottom surface of the viewing channel 52 is flat, so that the excitation light The irradiation system 46 can be a wide-field irradiation type, and an enlarged image at a single molecule level obtained by the magnification observation optical system 47 can be acquired by the imaging device 48 and can be analyzed by the data analysis unit 49.
キャピラリー電気泳動法を用いる第２の分離方法の場合は、光学顕微鏡のガラスステージ上に載置された観視ユニット４５内を試料が順次通過するため、光学顕微鏡の拡大光学系とガラスステージとを相対的に動かす必要がなく、測定精度の向上が図りやすく、また、データ解析装置全体を小型化することができるという利点がある。 In the case of the second separation method using capillary electrophoresis, since the sample sequentially passes through the viewing unit 45 placed on the glass stage of the optical microscope, the magnification optical system of the optical microscope and the glass stage are There is an advantage that it is not necessary to move relatively, it is easy to improve measurement accuracy, and the entire data analysis apparatus can be downsized.
なお、別の一例として、上記の観察ユニット４５において、観視流路５２の幅Ｗ＝０．１ｍｍ、光学顕微鏡で観察する部分５２ａの厚さＨ＝０．１ｍｍ、長さＬ＝０．１ｍｍとすることができる。この場合、観察に用いる光学顕微鏡としては、図３に示す例と同様に、励起光の照射光学系の光軸と光学顕微鏡の拡大光学系とが略直交するシート照明方式を採用することができる。この場合も、図３と同様に、照射光学系からのシート照明光は、ガラスステージの下面から斜め上方に進んで試料へ照射され、試料から発せられる蛍光は、ガラスステージ下面に設置された対物レンズにて受光される。 As another example, in the observation unit 45 described above, the width W of the viewing flow path 52 is 0.1 mm, the thickness H of the portion 52a observed with an optical microscope is H = 0.1 mm, and the length L is 0.1 mm. It can be. In this case, as the optical microscope used for observation, a sheet illumination method in which the optical axis of the excitation light irradiation optical system and the magnifying optical system of the optical microscope are substantially orthogonal can be adopted as in the example shown in FIG. . In this case as well, as in FIG. 3, the sheet illumination light from the irradiation optical system travels obliquely upward from the lower surface of the glass stage and irradiates the sample, and the fluorescence emitted from the sample is emitted from the objective placed on the lower surface of the glass stage. Light is received by the lens.
シート照明方式を採用することで、ガラスステージから最大で約０．１ｍｍ上方に位置する蛍光性指標の発光を観察することができ、撮像装置３８で取得された画像データに基づいて光学顕微鏡の解析部３９で測定結果数値とその取得タイミングとの相関データを得ることができる。 By adopting the sheet illumination method, it is possible to observe the light emission of the fluorescent indicator located at a maximum of about 0.1 mm above the glass stage, and the analysis of the optical microscope based on the image data acquired by the imaging device 38 The unit 39 can obtain correlation data between the measurement result numerical value and its acquisition timing.
（第３の分離方法）
第３の分離方法は、クロマトグラフィー法の一つである液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法によって試料を分離する方法である。
(Third separation method)
The third separation method is a method of separating a sample by a liquid chromatography (LC) method which is one of the chromatography methods.
図６に、ＬＣを用いて測定対象試料の分離を行いつつ、光学顕微鏡で測定対象試料を観察する方法を説明するイメージ図を示す。 FIG. 6 shows an image diagram for explaining a method of observing a measurement target sample with an optical microscope while separating the measurement target sample using LC.
図６に示すように、移動相溶媒６１を電動ポンプ６２で送出しながら、試料注入部６３で測定対象試料６４であるタンパク質の総体を溶媒６１に加える。その後、カラム６５によってタンパク質の分離を行い、カラム６５を通過した溶媒６１を光学顕微鏡のガラステーブル６６上に載置された観視ユニット６７で１分子レベルでの拡大観察を行う。 As shown in FIG. 6, the whole protein, which is the sample to be measured 64, is added to the solvent 61 by the sample injection unit 63 while the mobile phase solvent 61 is delivered by the electric pump 62. Thereafter, the protein is separated by the column 65, and the solvent 61 that has passed through the column 65 is magnified and observed at the single molecule level by the viewing unit 67 placed on the glass table 66 of the optical microscope.
第３の分離方法である液体クロマトグラフィーによる分離方法に用いられる観視ユニット６７は、第２の分離方法であるキャピラリー電気泳動法を用いた際に使用した、図５に示す観視ユニット４５と同じものを使用することができる。キャピラリー電気泳動法によって試料を分離する場合と同様に、観視ユニット６７内の断面が半円形の観視流路を通過する試料を観察することができるため、広視野照明型の励起光照射系６８を用いて、拡大光学系６９によって蛍光性指標の発光を拡大像として撮像装置７０で取得し、解析部７１で解析を行う。 The viewing unit 67 used in the separation method by liquid chromatography which is the third separation method is the viewing unit 45 shown in FIG. 5 used when the capillary electrophoresis method which is the second separation method is used. The same can be used. As in the case of separating a sample by capillary electrophoresis, a sample passing through a viewing channel having a semicircular cross section in the viewing unit 67 can be observed. 68, the luminescence of the fluorescent indicator is acquired by the imaging device 70 as an enlarged image by the magnifying optical system 69, and analyzed by the analysis unit 71.
なお、観視ユニット６７を通過した分離された試料を含む溶媒６１は、適宜マイクロウェル７２に収容することができる。このとき、溶媒６１を時間経過に対応して定められたマイクロウェル７２内に順次収容すれば、カラムを通過した順に資料を含む溶媒が得られることとなり、このマイクロウェル内の溶媒６１を改めて光学顕微鏡によって拡大観察することで、測定結果の検証や再測定を行うことが可能となる。 The solvent 61 containing the separated sample that has passed through the viewing unit 67 can be appropriately stored in the microwell 72. At this time, if the solvent 61 is sequentially accommodated in the microwell 72 determined corresponding to the passage of time, the solvent containing the material can be obtained in the order of passing through the column. By magnifying and observing with a microscope, the measurement result can be verified and remeasured.
（第４の分離方法）
第４の分離方法は、クロマトグラフィー法の一つである液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法を用いる点では上記第３の分離方法と同じであるが、カラムによって分離された試料を、一旦、時系列に収容し、カラムによる分離が終了した後に改めて時系列に分離されている試料の拡大観察を行う点が、カラムにより分離された試料をオンタイムで拡大観察した第３の分離方法と異なる。
(Fourth separation method)
The fourth separation method is the same as the third separation method in that the liquid chromatography (LC) method, which is one of the chromatography methods, is used. However, the sample separated by the column is once time-series. The third separation method is different from the third separation method in which the sample separated by the column is enlarged and observed on time, after the separation by the column is completed and the sample separated by time series is newly observed.
図７に、液体クロマトグラフィー用いて測定対象試料の分離を行った後に、改めて分離された測定対象試料を光学顕微鏡で拡大観視するデータ解析方法を説明するイメージ図を示す。 FIG. 7 shows an image diagram for explaining a data analysis method for enlarging an object sample to be separated again with an optical microscope after separating the object sample to be measured using liquid chromatography.
なお、図７では、図６に示した、オンタイムで分離された試料を拡大観視する方法で用いられた部材と同じ部材については、図６と同じ符号を付している。 In FIG. 7, the same members as those used in the method of magnifying the sample separated on time shown in FIG. 6 are assigned the same reference numerals as in FIG.
図７に示すように、移動相溶媒６１を電動ポンプ６２で送出しながら、試料注入部６３で測定対象試料６４であるタンパク質の総体を溶媒６１に加え、さらに、カラム６５によってタンパク質の分離を行う点は、図６に示した方法と同じである。図７に示す方法では、カラム６５を通過した溶媒６１を順次所定の容器に収容する。この場合の容器として、図７に示したようなマルチウェル７３を用いることで、時系列にカラム６５を通過した試料を細分化して順次収容することができると共に、各ウェルの底面を平面形状とするなど、光学顕微鏡による拡大観察を行う際により詳細な拡大画像を得ることを想定した対応が可能となる。また、マルチウェル７３を用いることにより、時系列に分離された試料の保管や光学顕微鏡のガラステーブル上へのセッティングにおいても有利である。 As shown in FIG. 7, while the mobile phase solvent 61 is sent out by the electric pump 62, the total protein that is the measurement target sample 64 is added to the solvent 61 by the sample injection unit 63, and the protein is further separated by the column 65. This is the same as the method shown in FIG. In the method shown in FIG. 7, the solvent 61 that has passed through the column 65 is sequentially stored in a predetermined container. By using a multiwell 73 as shown in FIG. 7 as a container in this case, the sample that has passed through the column 65 in time series can be subdivided and sequentially accommodated, and the bottom surface of each well has a planar shape. For example, it is possible to cope with the assumption that a more detailed enlarged image is obtained when magnifying observation with an optical microscope. Further, the use of the multiwell 73 is advantageous in storing samples separated in time series and setting on a glass table of an optical microscope.
上記、測定対象試料の分離は、プロテオーム解析を行うデータ解析装置とは全く別の装置で行うことができる。分離され、液体クロマトグラフィー法により順次取得された測定対象試料は、真空、高温、マイクロ液滴などの条件下で乾燥させ、長期間保管することができる。 The separation of the sample to be measured can be performed by an apparatus completely different from the data analysis apparatus that performs proteomic analysis. The sample to be measured, which is separated and sequentially obtained by the liquid chromatography method, can be dried under conditions such as vacuum, high temperature, and microdroplet, and stored for a long time.
分離された試料が保管された状態のマルチウェル７４は、光学顕微鏡による１分子観察により適応した形状とすることができるため、蛍光性指標を励起する励起光をエバネッセント照明型の励起光照射系７５で照射し、拡大光学系７６で得られた拡大像を撮像装置７７によって取得して、データ解析部７８でデータ解析することができる。 Since the multiwell 74 in a state where the separated sample is stored can have a shape adapted by single-molecule observation with an optical microscope, the excitation light for exciting the fluorescence index is converted into an evanescent illumination type excitation light irradiation system 75. , And an enlarged image obtained by the magnifying optical system 76 can be acquired by the imaging device 77 and analyzed by the data analysis unit 78.
なお、図示は省略するが、光学顕微鏡を用いて拡大像を取得するために、あらかじめ分離された状態の測定対象試料を準備する方法として、上述のマルチウェルを用いる方法以外に、インクジェット法、その他各種のスプレー法などを用いて分離された試料をカバーガラスに吹き付けたものを作製する方法が考えられる。このように、試料を分離条件に応じてカバーガラスに吹き付けたものを作製することで、光学顕微鏡での観察時の深度を一定でかつ浅くすることができ、エバネッセント光を用いたより正確な拡大像の取得を行うことができる。また、マルチウェルを用いる場合と比較して、観察対象とする資料の厚さを薄くすることができるため、試料の作製、保管などの取り扱い上の利便性も向上する。 Although not shown in the drawings, as a method of preparing a measurement target sample in a separated state in order to obtain a magnified image using an optical microscope, in addition to the above-described method using a multiwell, an inkjet method, and the like A method is conceivable in which a sample separated by using various spraying methods is sprayed on a cover glass. In this way, by making the sample sprayed on the cover glass according to the separation conditions, the depth during observation with an optical microscope can be made constant and shallow, and a more accurate magnified image using evanescent light Can be obtained. In addition, since the thickness of the material to be observed can be reduced compared to the case of using a multiwell, convenience in handling such as sample preparation and storage is improved.
以上のように、測定対象試料である蛍光性指標が付されたタンパク質の総体をその物理的特性を用いて移動分離することができる電気泳動法やクロマトグラフィー法を用いて分離し、分離された状態の試料を光学顕微鏡によって１分子レベルで解析することによって、試料に含まれるタンパク質を種類毎に分離して、測定結果数値とその取得タイミングとを得ることができる。 As described above, the whole protein with a fluorescent index as a sample to be measured was separated using electrophoretic or chromatographic methods that can be separated by migration using its physical properties. By analyzing the sample in a state with an optical microscope at the level of one molecule, the protein contained in the sample can be separated for each type, and the measurement result numerical value and its acquisition timing can be obtained.
なお、上記例では、移動分離方法であるクロマトグラフィー法として液体クロマトグラフィー法を用いた例のみを示したが、観察対象物の条件によっては、ガスクロマトグラフィー法やペーパークロマトグラフィー法などの、気体や固体を用いて分離する方法を使用できる可能性がある。 In the above example, only the example using the liquid chromatography method as the chromatography method, which is the mobile separation method, is shown. However, depending on the conditions of the observation object, gas chromatography, paper chromatography, etc. Or a method of separation using a solid may be used.
［測定結果数値の取得］
図８に、光学顕微鏡の撮像装置により取得された測定対象試料の拡大画像と、拡大画像を数値解析して作成したイメージとを示す。
[Acquisition of measurement result values]
FIG. 8 shows an enlarged image of the measurement target sample acquired by the imaging device of the optical microscope and an image created by numerical analysis of the enlarged image.
図８（ａ）に示すように、光学顕微鏡の拡大像を撮像装置で撮像することで、蛍光性指標が付された測定対象試料の１分子レベルの拡大画像を得ることができる。図８（ｂ）は、図８（ａ）に示した撮像画像に対して、一例としてＴｒｉａｎｇｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ法によって２値化するなどの数値解析を行って、撮像画像内の蛍光性指標を明確に示したものである。 As shown in FIG. 8A, an enlarged image of the optical microscope can be obtained with an imaging device to obtain an enlarged image of a single molecule level of the measurement target sample with the fluorescence index. FIG. 8B clearly shows the fluorescence index in the captured image by performing a numerical analysis such as binarization by the triangle thresholding method on the captured image shown in FIG. 8A as an example. Is.
図８（ｂ）に示した処理後の画像から、さらに画像処理手法を用いて蛍光性指標の数をカウントすることができる。このカウントされた蛍光性指標の数を、測定結果数値としてタンパク質データ解析に使用できる。 From the processed image shown in FIG. 8B, the number of fluorescent indicators can be counted using an image processing method. The counted number of fluorescent indicators can be used as a measurement result numerical value for protein data analysis.
なお、それぞれの撮像画像を、その画像が撮像された撮像時刻と対応して、または、測定された順序を明確化されて記録されることで、図８を用いて示したデータ処理を行って測定結果数値を得ることで、測定結果数値とその取得タイミングとを把握することができる。 In addition, each captured image is recorded corresponding to the imaging time when the image was captured, or the measurement order is clarified, and the data processing shown in FIG. 8 is performed. By obtaining the measurement result numerical value, the measurement result numerical value and its acquisition timing can be grasped.
なお、光学顕微鏡により得られた拡大像を撮像装置で画像データとして得た場合の、測定結果数値を得るまでのデータ処理は、上記例示したものに限られず、各種の画像処理、画像データに基づく各種データ解析手法、さらに、測定結果精度を高める測定結果数値の数学的処理方法などの、手法を利用することができる。 In addition, the data processing until obtaining the measurement result numerical value when the enlarged image obtained by the optical microscope is obtained as image data by the imaging device is not limited to the above-exemplified examples, and is based on various image processing and image data. Various data analysis methods and methods such as a mathematical processing method of measurement result numerical values for improving measurement result accuracy can be used.
また、撮像画像からの解析ではなく、受光デバイスなどによって発光強度を検出した場合には、得られた発光強度をそのまま測定結果数値とすることができる。 In addition, when the emission intensity is detected by a light receiving device or the like instead of analysis from the captured image, the obtained emission intensity can be used as a measurement result numerical value as it is.
［スペクトルデータの作成］
図８に示したような、撮像画像から測定結果数値と取得タイミングとを把握する処理を、図３〜図７に示した分離された試料の観察時に連続して行うことで、測定結果数値と取得タイミングとの相関としてのスペクトルデータを得ることができる。
[Create spectral data]
The processing for grasping the measurement result numerical value and the acquisition timing from the captured image as shown in FIG. 8 is continuously performed during the observation of the separated sample shown in FIGS. Spectral data as a correlation with acquisition timing can be obtained.
以下では、測定対象試料として、「ＭＤＡ ＭＢ ２３１間葉系細胞株」１００細胞から取得されたタンパク質の総体（以下「試料１」と称する）と、「ＨＴＢ １３２上皮基底細胞株」１００細胞から取得されたタンパク質の総体（以下「試料２」と称する）とを用いた場合の、スペクトルデータの作成を説明する。 In the following, as a measurement target sample, a total protein (hereinafter referred to as “sample 1”) obtained from “MDA MB 231 mesenchymal cell line” 100 cells and “HTB 132 epithelial basal cell line” 100 cells are obtained. A description will be given of the creation of spectrum data when using the total protein (hereinafter referred to as “sample 2”).
なお、それぞれのタンパク質の総体についてのデータ取得では、いずれも、試料であるタンパク質の総体をゲル電気泳動法により分離し、ガラスステージを移動させることで相対的に走査して、光学顕微鏡の撮像装置によって、蛍光性指標の発光数を測定結果数値とした。また、取得タイミングは走査時の移動距離として撮像画像の画素（Ｐｉｘｅｌ）を単位として指標化した。なお、走査方向は、電気泳動ゲルの基準点から遠い側から基準点へと向かう方向とした。 In addition, in the acquisition of data about the total of each protein, the total of the protein as a sample is separated by gel electrophoresis and relatively scanned by moving the glass stage, and the imaging device of the optical microscope Thus, the number of luminescence of the fluorescent indicator was used as a measurement result numerical value. In addition, the acquisition timing is indexed with the pixel (Pixel) of the captured image as the unit of the moving distance at the time of scanning. The scanning direction was a direction from the side far from the reference point of the electrophoresis gel toward the reference point.
図９は、第１の測定対象試料である「ＭＤＡ ＭＢ ２３１間葉系細胞株」１００細胞から取得されたタンパク質の総体のスペクトルデータである。また、図１０は、第２の測定対象試料であるＨＴＢ １３２上皮基底細胞株１００細胞から取得されたタンパク質の総体のスペクトルデータである。 FIG. 9 is spectral data of the total protein obtained from 100 cells of “MDA MB 231 mesenchymal cell line” which is the first measurement target sample. FIG. 10 shows spectral data of the total protein obtained from 100 cells of the HTB 132 epithelial basal cell line, which is the second measurement target sample.
このようにして得られた、図９、および、図１０に示すグラフは、それぞれの試料のデータ解析結果として使用することができる。 The graphs shown in FIG. 9 and FIG. 10 thus obtained can be used as the data analysis result of each sample.
例えば、複数の被験者から得られた試料に含まれるタンパク質を比較検討する場合や、同じ被験者から異なるタイミングで取得された試料に含まれるタンパク質を比較検討する場合には、それぞれの測定対象試料のデータ解析結果であるスペクトルデータ同士において、スペクトルにおけるピークの位置やその高さを比較することで測定対象試料に含まれる各種タンパク質ごとの量の変化を把握することができる。 For example, when comparing proteins included in samples obtained from multiple subjects, or when comparing proteins included in samples obtained at different timings from the same subject, the data for each sample to be measured By comparing the peak positions in the spectrum and their heights between the spectral data as the analysis results, it is possible to grasp the change in the amount of each protein included in the measurement target sample.
一方、試料１である「ＭＤＡ ＭＢ ２３１間葉系細胞株」から得られたタンパク質の総体と、試料２である「ＨＴＢ １３２上皮基底細胞株」から得られたタンパク質の総体とを比較してデータ解析を行う場合には、それぞれのスペクトルデータの差異を明確化することが好ましい。 On the other hand, the total protein obtained from the “MDA MB 231 mesenchymal cell line”, which is the sample 1, and the total protein obtained from the “HTB 132 epithelial basal cell line”, the sample 2, were compared. When analyzing, it is preferable to clarify the difference between the respective spectrum data.
図１１は、２つの試料から得られた測定結果を正規化し、さらにその差分を求めた結果を示している。 FIG. 11 shows the result of normalizing the measurement results obtained from the two samples and further obtaining the difference.
図１１に示すグラフ９３は、試料１の測定データ（図９の符号９１）と試料２の測定データ（図１０の符号９２）とをそれぞれ正規化した後に、試料１の測定データから試料２の測定データを差し引いた数値を示している。このように、複数の測定対象試料からのデータ解析結果を比較して、試料１と試料２とにおいて、どのタンパク質が量的にどの程度異なった状態となっているかを容易に把握しデータ解析することができる。 A graph 93 shown in FIG. 11 is obtained by normalizing the measurement data of the sample 1 (reference numeral 91 in FIG. 9) and the measurement data of the sample 2 (reference numeral 92 in FIG. 10). The figure is obtained by subtracting the measurement data. In this way, by comparing the data analysis results from a plurality of samples to be measured, it is easy to grasp and analyze how much protein is in a quantitatively different state between Sample 1 and Sample 2. be able to.
なお、上記例では、２つの試料からの測定データの比較を行う際に、まずそれぞれのデータを正規化したが、それぞれの測定データを正規化せずに比較することで、測定対象試料である生体分子の総体における分子種毎の絶対量を比較することもできる。 In the above example, when the measurement data from the two samples are compared, the respective data are first normalized. However, each measurement data is compared without being normalized, so that it is a measurement target sample. The absolute amount of each molecular species in the total biomolecule can also be compared.
図９〜図１１に示したデータ解析結果によれば、細胞が自らの状態によって有意に各タンパク質の構成量を変化させていることが把握できる。このように、上記実施形態で説明したデータ解析方法を用いることで、例えば上記２つの細胞状態の違いを容易に診断できることがわかる。 According to the data analysis results shown in FIG. 9 to FIG. 11, it can be grasped that the cell significantly changes the constituent amount of each protein depending on its own state. Thus, it can be seen that, for example, the difference between the two cell states can be easily diagnosed by using the data analysis method described in the above embodiment.
［データ解析手法］
データ解析部では、上述の方法により得られた測定結果数値とその取得タイミングとの相関データに基づいて、測定対象試料のデータ解析を行う。
[Data analysis method]
The data analysis unit performs data analysis of the measurement target sample based on correlation data between the measurement result numerical value obtained by the above-described method and the acquisition timing.
本実施形態で説明する上記のデータ解析装置１００のデータ解析部１４でのデータ解析には、以下の２つの手法がある。 There are the following two methods for data analysis in the data analysis unit 14 of the data analysis apparatus 100 described in the present embodiment.
［１．測定結果パターンによる分類］
第１のデータ解析手法は、測定結果から試料に含まれる個々の生体分子の特定と定量化とを行わずに、測定結果数値と、それぞれの測定結果数値の取得タイミングとの関係のみから当該生体分子の総体である試料の状態性を判断する手法である。
[1. Classification by measurement result pattern]
The first data analysis method does not specify and quantify individual biomolecules contained in a sample from the measurement results, but only from the relationship between the measurement result values and the acquisition timing of each measurement result value. This is a technique for judging the state of a sample that is the total of molecules.
本実施形態で説明するデータ解析方法では、電気泳動法やクロマトグラフィー法などによって測定対象となる生体分子を分離して、光学顕微鏡によって、分離状態における生体分子の１分子レベルの量を蛍光性指標の発光を用いて取得する。このため、同じ分離方法によって得られた測定結果数値と当該数値の取得タイミングとを図２（ｄ）にイメージを示すようなスペクトラムデータとしてスペクトラムデータ同士を比較することにより、測定対象の生体分子の状態が同じであることを容易に判別することができる。 In the data analysis method described in the present embodiment, a biomolecule to be measured is separated by electrophoresis, chromatography, or the like, and the amount of one molecule level of the biomolecule in the separated state is measured with a fluorescent indicator using an optical microscope. Acquire using luminescence. Therefore, by comparing the spectrum data with the measurement result numerical value obtained by the same separation method and the acquisition timing of the numerical value as spectrum data as shown in FIG. 2D, the biomolecules to be measured are compared. It can be easily determined that the state is the same.
例えば、図９において符号９１として示されたスペクトルデータは、被験者の「ＭＤＡ ＭＢ ２３１間葉系細胞株」１００細胞から取得されたタンパク質の総体のデータ解析結果が現れている。ここで、スペクトルデータの個々のピークの位置、すなわち、測定結果に表れているタンパク質の種類や、ピークの高さ、すなわち、測定結果として得られた各タンパク質の量を求めることなく、異なる時間に取得した細胞、または、別の被験者から取得した細胞を試料としたプロテオーム解析を行って得られたスペクトルデータ同士を比較する。二つのスペクトルデータが同じ分布傾向を示している場合は、その２つの状態におけるタンパク質の種類と量とが同じ傾向を示していることがわかるため、例えば、特定の遺伝的傾向を有する場合のスペクトルデータがわかっていれば、同じ遺伝的傾向を有するか否かが判断でき、また、特定の疾病時のスペクトルデータがわかっていれば、同じ疾病にかかっているか否かを容易に判断できる。 For example, the spectral data indicated by reference numeral 91 in FIG. 9 shows the data analysis result of the total protein obtained from 100 cells of the “MDA MB 231 mesenchymal cell line” of the subject. Here, without obtaining the position of each peak in the spectrum data, that is, the type of protein appearing in the measurement result and the peak height, that is, the amount of each protein obtained as the measurement result, at different times. Spectral data obtained by performing proteomic analysis using the obtained cells or cells obtained from another subject as a sample are compared. When two spectral data show the same distribution tendency, it can be seen that the type and amount of protein in the two states show the same tendency. For example, the spectrum with a specific genetic tendency If the data is known, it can be determined whether or not they have the same genetic tendency, and if the spectrum data at a specific disease is known, it can be easily determined whether or not the patient has the same disease.
この判定方法の場合は、より多くの種類のスペクトルデータを取得しているかが重要となる。このため、上述のデータ解析装置１００において説明したデータ記憶部１７で、順次測定結果として得られたスペクトルデータをそのデータが表す意味とを対応させて記憶することが好ましい。 In the case of this determination method, it is important whether more types of spectrum data are acquired. For this reason, it is preferable that the data storage unit 17 described in the data analysis apparatus 100 described above stores spectrum data obtained as sequential measurement results in association with the meanings represented by the data.
このように、スペクトラムデータに現れたピークがどの生体分子を示しているかの特定をすることなく試料の状態を分類することで、簡易に精度の高い遺伝診断や病理診断を行うことができる。
また、上記本開示のデータ解析装置において、前記データ解析部は、任意の論理回路を構成するプロセッサを有していても良く、前記プロセッサが前記既存のスペクトルデータを入力データとして受け付け、多数のデータについて機械学習を用いて分類整理することで、診断精度を自動的に向上させることができる。
Thus, by classifying the state of the sample without specifying which biomolecule the peak appearing in the spectrum data indicates, it is possible to easily perform highly accurate genetic diagnosis and pathological diagnosis.
In the data analysis apparatus of the present disclosure, the data analysis unit may include a processor that configures an arbitrary logic circuit, and the processor receives the existing spectrum data as input data, and a large number of data The accuracy of diagnosis can be automatically improved by sorting and organizing the machine using machine learning.
機械学習アルゴリズムとしては、教師あり学習、教師なし学習、半教師あり学習、強化学習など、いずれもでもよい。このような機械学習アルゴリズムの例として、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、遺伝的アルゴリズム、帰納論理プログラミング、ベイズ分類器、決定木、主成分分析、クラスター分析、相関ルール学習（パターンマイニング）などの、種々のアルゴリズムを用いることができる。 The machine learning algorithm may be any of supervised learning, unsupervised learning, semi-supervised learning, reinforcement learning, and the like. Examples of such machine learning algorithms include neural networks, support vector machines, genetic algorithms, inductive logic programming, Bayesian classifiers, decision trees, principal component analysis, cluster analysis, and association rule learning (pattern mining). The following algorithm can be used.
教師あり学習アルゴリズムを適用する場合、データ解析部が有するプロセッサは、複数のスペクトルデータを比較し、特定の遺伝的傾向や特定の疾病に由来することが既知であるプロテオームにおいて観察されるスペクトルデータの波形、ピーク位置、ピークの高さなどから一定の特徴量を抽出し、それらを教師データとしてその特徴量を機械学習することで、検査対象のプロテオームのスペクトルデータを自動分類し、そのプロテオームの由来となる元の細胞について、同じ遺伝的傾向を有しているか否か、あるいは同じ疾病にかかっているか否かを容易に判断することができる。 When applying a supervised learning algorithm, the processor of the data analysis unit compares multiple spectral data and compares the spectral data observed in a proteome known to originate from a specific genetic trend or a specific disease. By extracting certain features from the waveform, peak position, peak height, etc., and using them as machine data, machine features are automatically learned to automatically classify the spectrum data of the proteome to be inspected, and the origin of the proteome It is possible to easily determine whether or not the original cells have the same genetic tendency or whether or not they have the same disease.
教師なし学習アルゴリズムを適用する場合、前記データ解析部において、プロセッサは、複数のスペクトルデータを比較し、それらの複数のスペクトルデータから、波形、ピーク位置、ピークの高さなどの一定の特徴量を抽出し統計的に機械学習を行うことで、検査対象のプロテオームのスペクトルデータを自動分類し、そのプロテオームの由来となる元の細胞について、その遺伝的傾向や病理的傾向を推定し、簡易に精度の高い遺伝診断や病理診断を行うことができる。 In the case of applying an unsupervised learning algorithm, in the data analysis unit, the processor compares a plurality of spectrum data, and calculates a certain feature amount such as a waveform, a peak position, and a peak height from the plurality of spectrum data. By extracting and statistically machine learning, the spectral data of the proteome to be examined is automatically classified, and the genetic and pathological trends of the original cells from which the proteome is derived are estimated for easy accuracy. High genetic diagnosis and pathological diagnosis can be performed.
なお、測定結果数値と取得タイミングとの関係を表す方法としては、上記例示したスペクトルデータである必要はなく、たとえは、レーダーチャートや２次元マップなど、測定結果の分布状態と各状態における強度とを視覚的に表すことができる既存の表現方法を採用することができる。 In addition, as a method of expressing the relationship between the measurement result numerical value and the acquisition timing, it is not necessary to be the above-described spectrum data, for example, the distribution state of the measurement result such as a radar chart or a two-dimensional map and the intensity in each state. It is possible to adopt an existing expression method that can visually represent the image.
［２．取得タイミングを指標化するデータ解析］
データ解析部１４で行われる生体分子のデータ解析手法の第２は、観察対象試料である生体分子の分離条件に基づいて取得タイミングを指標として表し、当該指標を生体分子の種類に対応させて、それぞれの種類における量を表す方法である。
[2. Data analysis to index acquisition timing]
The second of the biomolecule data analysis methods performed in the data analysis unit 14 represents the acquisition timing as an index based on the separation condition of the biomolecule that is the observation target sample, and associates the index with the type of biomolecule, It is a method of expressing the amount in each type.
例えば、電気泳動法の場合は、ゲルや印加される電圧値などの条件によって、どの種類の生体分子がどの位置に分離されているかを判断することができる。このため、得られた測定結果数値が、光学顕微鏡の走査速度などからゲル内のどの位置を観察して得られたものであるかを指標化し、その指標に対応する生体分子の種類が特定できる。このため、この指標値に対応して得られた測定結果数値の値から、測定対象試料に含まれている生体分子の種類と、その量とを知ることができる。 For example, in the case of electrophoresis, it is possible to determine which type of biomolecule is separated at which position according to conditions such as gel and applied voltage value. For this reason, it is possible to index which position in the gel is obtained by observing the obtained measurement result numerical value from the scanning speed of the optical microscope, and the type of biomolecule corresponding to the index can be specified. . For this reason, from the value of the measurement result numerical value obtained corresponding to this index value, the type and amount of the biomolecule contained in the measurement target sample can be known.
この場合、データ解析対象となるデータは、取得タイミングと測定結果数値であるため、図９、および、図１０に示されたようなスペクトルデータとして表すことができる。また、図１１に示したように、それぞれのデータを比較するための差分による表示をスペクトルデータとして行うことで、注目すべきピークの位置などが一目瞭然となり、データ解析結果を容易に捕らえることができる。 In this case, since the data to be analyzed is the acquisition timing and the measurement result numerical value, it can be expressed as spectrum data as shown in FIG. 9 and FIG. Further, as shown in FIG. 11, by displaying the difference data for comparing each data as spectrum data, the position of a peak to be noticed becomes obvious and the data analysis result can be easily captured. .
また、測定結果数値とその取得タイミングに対応した指標値とが把握できればよいことから、得られたデータ解析結果を必ずしもスペクトルデータとして表す必要はなく、例えば、テーブルに表すことができる。特に、得られたデータ解析結果をそのままユーザが表示画面や印刷物として見るのではなく、他の機器にデータを送信してさらなるデータ解析に供する場合などでは、測定結果数値と指標値とが対応したテーブルデータとして得ることが好適である。 Further, since it is only necessary to be able to grasp the measurement result numerical value and the index value corresponding to the acquisition timing, the obtained data analysis result is not necessarily represented as spectrum data, and can be represented in a table, for example. In particular, when the user does not view the obtained data analysis result as it is as a display screen or printed matter, but the data is sent to another device for further data analysis, the measurement result numerical value corresponds to the index value. It is preferable to obtain it as table data.
応用例として、例えば、１細胞データ解析（１細胞プロファイリング）を複数種類の細胞に対して行い、上述の方法により測定結果数値とその取得タイミングの指標値とをテーブルデータとして取得して、最尤法、近隣結合法、ベイズ法などによるクラスター分析によって、細胞間の関係を表す系統樹を構築することもできる。クラスター分析以外の機械学習の手法も適宜活用してよい。 As an application example, for example, one-cell data analysis (one-cell profiling) is performed on a plurality of types of cells, and the measurement result numerical value and the index value of the acquisition timing are acquired as table data by the above-described method. A phylogenetic tree representing the relationship between cells can also be constructed by cluster analysis using a method such as the method of neighborhood, neighborhood connection, or Bayesian method. Machine learning methods other than cluster analysis may be used as appropriate.
［他の生体分子］
以上説明したように、本実施形態にかかるデータ解析装置、データ解析方法によれば、生体化学物物質であるタンパク質の総体を測定対象として、簡便に、かつ、容易にデータ解析することができる。
[Other biomolecules]
As described above, according to the data analysis apparatus and the data analysis method according to the present embodiment, data analysis can be performed easily and easily using the total protein as a biochemical substance as a measurement target.
なお、細胞や細胞からの分泌物内に含まれる総体として、例えば定量解析などが行われる生体分子としては、上述したタンパク質以外にも、トランスクリプトーム、ゲノム、メタボロームなどがある。本実施形態として示したデータ解析装置、データ解析方法は、例示したタンパク質についてのプロテオーム解析と同様に、これらの各種生体分子のデータ解析について良好に用いることができる。また、その他にも、グライコーム、リビドーム、さらには、これらの生体分子複数を含む混合物に対しても、上記実施形態として説明したデータ解析装置、データ解析方法を適用することができる。 In addition, as a whole contained in the cell and the secretion from the cell, for example, biomolecules subjected to quantitative analysis include transcriptome, genome, metabolome and the like in addition to the above-described proteins. The data analysis apparatus and the data analysis method shown as the present embodiment can be used favorably for data analysis of these various biomolecules, similarly to the proteome analysis for the exemplified proteins. In addition, the data analysis apparatus and the data analysis method described as the above embodiment can also be applied to glycocombs, lividomes, and mixtures including a plurality of these biomolecules.
なお、例えば、データ解析対象の生体分子が、トランスクリプトーム、ゲノム、である場合には、蛍光ハイブリダイゼーション法を用いることにより、効率よく蛍光性指標の付加を行うことができる。 For example, when the biomolecule to be analyzed is a transcriptome or a genome, a fluorescent index can be added efficiently by using a fluorescence hybridization method.
［他の蛍光性指標による発光の観察］
本願開示のデータ解析装置において、蛍光性指標としては、上記で例示したもの以外にも、各種の蛍光性残基修飾薬や蛍光性架橋試薬、上記のテトラメチルローダミン以外の各種のローダミン系色素、テトラセン、フルオレセイン等々の有機色素プローブ、量子ドットプローブ等の種々の蛍光指標を用いることができる。
[Observation of luminescence by other fluorescent indicators]
In the data analysis apparatus disclosed in the present application, as the fluorescent index, in addition to those exemplified above, various fluorescent residue modifiers, fluorescent crosslinking reagents, various rhodamine dyes other than the above tetramethylrhodamine, Various fluorescent indicators such as organic dye probes such as tetracene and fluorescein, and quantum dot probes can be used.
［発光性指標による発光の観察］
本願で開示するデータ解析装置において、「発光する部分」が化学発光や生物酵素発光による発光性指標によるものである場合の例として、例えば、ルシフェラーゼ、アクリジニウム等の発光プローブが挙げられる。
[Observation of luminescence by luminous index]
In the data analysis apparatus disclosed in the present application, examples of the case where the “light emitting portion” is based on a luminescent indicator by chemiluminescence or bioenzyme luminescence include luminescent probes such as luciferase and acridinium.
［蛍光性指標以外の発光の観察］
また、本願で開示するデータ解析方法では、励起光によって発光する蛍光性指標を観察する光学イメージング装置を用いて、自ら発光するいわゆる自家発光性の生体分子についてのデータ解析を行うことができる。
[Observation of luminescence other than the fluorescence index]
In addition, in the data analysis method disclosed in the present application, it is possible to perform data analysis on a so-called self-luminous biomolecule that emits light by itself using an optical imaging apparatus that observes a fluorescent index emitted by excitation light.
例えば、リボフラビンやリポフスチンなどの蛍光性色素の発光を、特定のカラーフィルタを用いて蛍光性指標の発光と分離してその発光強度を測定結果数値と得ることで、これら自家発光性を備えた生体分子の存在とその量をより正確に把握することができる。 For example, the emission of a fluorescent dye such as riboflavin or lipofuscin is separated from the emission of a fluorescent indicator using a specific color filter, and the emission intensity is obtained as a measurement result value. It is possible to grasp the existence and amount of molecules more accurately.
また、本願で開示するデータ解析装置によれば、ラマン散乱光を用いて、照射光に対するラマンシフト量を正確に分光して受光することで、生体分子の総体に対して、１分子レベルでのデータ解析が可能となる。ただし、ラマン分光によるデータ解析を行う場合は、蛍光性指標の発光を観察する場合と異なりレーザー光などの高強度光源を用いる必要がある。このため、上記実施形態で示した４つの分類法の内、第１から第３の分類法を用いることはできず、あらかじめ分類された状態の試料を用意する第４の方法を用いることとなる。この場合、特に、分類された状態の生体分子を印刷法、スプレー法などによってカバーガラスまたは金属表面に塗布したものを観察対象とすることが好ましいと考えられる。 Further, according to the data analysis apparatus disclosed in the present application, the Raman shift amount with respect to the irradiation light is accurately dispersed and received using the Raman scattered light. Data analysis is possible. However, when performing data analysis by Raman spectroscopy, it is necessary to use a high-intensity light source such as a laser beam unlike the case of observing the emission of a fluorescent indicator. For this reason, of the four classification methods shown in the above embodiment, the first to third classification methods cannot be used, and the fourth method of preparing samples in a pre-classified state is used. . In this case, in particular, it is considered preferable that the classified biomolecules are applied to a cover glass or a metal surface by a printing method, a spray method or the like as an observation target.
［他の光学イメージング装置による光学像］
上記実施形態では、光学イメージング装置による光学像の例として、光学顕微鏡による拡大像を得る例を例示したが、本願で開示するデータ解析装置において、「光学像」は、１分子レベルでのデータ解析が可能であるならば、等倍像や縮小像であってもよい。
[Optical images from other optical imaging devices]
In the above embodiment, an example of obtaining an enlarged image by an optical microscope is illustrated as an example of an optical image by an optical imaging apparatus. However, in the data analysis apparatus disclosed in the present application, an “optical image” is data analysis at a single molecule level. As long as it is possible, the image may be an equal magnification image or a reduced image.
試料濃度が高く生体分子が密集しているような試料の１分子観察を行う場合には、顕微鏡などの拡大光学系を用い、撮像カメラのピクセルサイズを光の回折限界程度にすると最も効率が良くなる。しかし、１分子検出を行う必須条件は拡大像を得ることではなく、検出系のカメラとして十分感度が高いものを用いることであり、等倍像や縮小像であっても、明るい蛍光性指標を用いること、観察視野面外の蛍光バックグラウンドを十分減らすなどの条件が整えば、発光検出部における１分子検出が可能である。 When performing single-molecule observation of a sample with a high concentration of sample and dense biomolecules, it is most efficient to use a magnifying optical system such as a microscope and set the pixel size of the imaging camera to the light diffraction limit. Become. However, the essential condition for single molecule detection is not to obtain a magnified image, but to use a sufficiently sensitive camera for the detection system. If conditions such as the use and the fluorescence background outside the observation visual field are sufficiently reduced, single molecule detection in the luminescence detection unit is possible.
一般的に等倍像や縮小像を測定する場合には、観察視野が広がる一方で観察に用いる対物レンズの開口数が低くなるため、蛍光検出の感度は低くなる。しかし、１分子の生体分子に、複数の蛍光性指標を結合させたり、蛍光ビーズ、量子ドットなどの蛍光輝度の高い蛍光性指標を結合させたりすることにより、検出感度を補うことができる。また、発光性指標を用いる場合には、発光が消失するまでの間、長時間の露光を行うことによって検出感度を向上できる。 In general, when measuring an equal-magnification image or a reduced image, the observation field is widened, but the numerical aperture of the objective lens used for observation is low, so the sensitivity of fluorescence detection is low. However, detection sensitivity can be supplemented by binding a plurality of fluorescent indicators to a single biomolecule, or by binding a fluorescent indicator having high fluorescence brightness such as fluorescent beads or quantum dots. In addition, when a luminescent indicator is used, detection sensitivity can be improved by performing long exposure until the luminescence disappears.
等倍像、縮小像の観察は、一般的な蛍光顕微鏡筐体において、対物レンズや変倍レンズの倍率を変えたり、検出部に至るまでの光学系を変えたりするほか、縮小光学系を構築することによっても実現できる。また、長時間の露光観察は、ゲルビューア（ＧＥヘルスケア社）のように、観察視野面内に分離した生体分子がすべて収まるように、観察の倍率やカメラの観察領域を設定することにより実現できる。 For observing the same-size image and reduced image, change the magnification of the objective lens and variable magnification lens, change the optical system leading to the detection unit, and construct a reduced optical system in a general fluorescent microscope housing. This can also be realized. In addition, long-time exposure observation is realized by setting the observation magnification and camera observation area so that all the separated biomolecules fit within the observation field, as in Gel Viewer (GE Healthcare). it can.
本願で開示するデータ解析装置、および、データ解析方法は、所定の分離方法によって分離された状態における生体分子を測定対象試料として、１分子観察が可能な高感度を有する光学イメージング装置によって観察するものである。１分子感度のオミックス解析によって、微量試料からの病気診断や高精度での生体異常の発見、１細胞レベルでのデータ解析を実現でき、生命科学・医学分野をはじめとする各種分野での研究への貢献が期待できる。 The data analysis apparatus and the data analysis method disclosed in the present application use a biological molecule in a state separated by a predetermined separation method as a measurement target sample and observe with a high-sensitivity optical imaging apparatus capable of observing one molecule. It is. Single molecule sensitivity omics analysis enables diagnosis of diseases from minute samples, detection of biological abnormalities with high accuracy, and data analysis at the single cell level, leading to research in various fields including life science and medicine Can contribute.
とりわけプロテオーム解析においては、従来法の検出限界が１０7〜１０10分子程度であったのに対し、本願発明では１分子感度を達成しており、飛躍的に検出感度が改善された次世代型のプロテオーム解析装置、プロテオーム解析方法を提供するものである。 In particular, in proteome analysis, the detection limit of the conventional method is about 10 7 to 10 10 molecules, whereas the present invention achieves single-molecule sensitivity and is a next-generation type in which detection sensitivity is dramatically improved. Proteome analysis apparatus and proteome analysis method are provided.
また、装置自体は高価な質量分析器を有していなくても良く、既知の指標値またはデータを利用することで各分子種の量の定量化や、細胞試料の状態性の判別を行うことができるため、安価に装置を実現できることが期待でき、研究施設や病院への幅広い普及が予想される。 In addition, the device itself does not need to have an expensive mass analyzer, and the amount of each molecular species can be quantified and the state of the cell sample can be determined by using known index values or data. Therefore, it can be expected that the device can be realized at low cost, and widespread use in research facilities and hospitals is expected.
本願発明のデータ解析装置、データ解析方法は、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスその他のオミックスに関して貴重な情報を提供するものであり、バイオインフォマティクスの発展に貢献するものであり、ネットワーク生物学、システム生物学の発展へも多大な貢献をするものである。 The data analysis apparatus and data analysis method of the present invention provide valuable information regarding genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics and other omics, and contribute to the development of bioinformatics. It also contributes greatly to the development of system biology.
１０ 測定対象試料
１１ 光学顕微鏡
１２ 発光検出部
１３ 結果算出部
１４ データ解析部
１５ 分離手段
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Sample to be measured 11 Optical microscope 12 Luminescence detection part 13 Result calculation part 14 Data analysis part 15 Separation means
Claims (18)
前記光学像における前記発光を１分子レベルで検出する発光検出部と、
検出された前記発光の強さを測定結果数値として算出する結果算出部とを備え、
所定の移動分離手段によって分離された状態の前記生体分子の総体を測定対象試料として前記光学イメージング装置により順次走査しながら観察し、得られた前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うデータ解析部とを備えたことを特徴とするデータ解析装置。 An optical imaging apparatus capable of acquiring a single-molecule level optical image of a biomolecule having a light-emitting portion;
A luminescence detector for detecting the luminescence in the optical image at a single molecule level;
A result calculation unit that calculates the detected intensity of the light emission as a measurement result numerical value;
The measurement result numerical value obtained by observing the total of the biomolecules separated by a predetermined moving separation means as the measurement target sample while sequentially scanning with the optical imaging apparatus, and the acquisition timing at which the measurement result numerical value is acquired And a data analysis unit that performs data analysis of the biomolecule based on the above.
前記データ記憶部が、前記既存のスペクトルデータを記憶するとともに新たに測定された測定対象試料の前記スペクトルデータを追加して記憶する、請求項３に記載のデータ解析装置。 A data storage unit for storing predetermined data;
The data analysis apparatus according to claim 3, wherein the data storage unit stores the existing spectrum data and additionally stores the spectrum data of the measurement target sample newly measured.
前記データ記憶部が、前記指標値が表す前記生体分子の種類を記憶する、請求項５に記載のデータ解析装置。 A data storage unit for storing predetermined data;
The data analysis apparatus according to claim 5, wherein the data storage unit stores a type of the biomolecule represented by the index value.
前記制御部が、前記各部を制御して前記生体分子の総体のデータ解析を自動的に行う、請求項１〜１３のいずれかに記載のデータ解析装置。 A control unit for controlling the operation of each unit constituting the data analysis device;
The data analysis apparatus according to any one of claims 1 to 13, wherein the control unit automatically controls data analysis of the biomolecules in total by controlling the units.
前記光学像から前記発光を１分子レベルで検出し、当該発光の強さを測定結果数値として算出して、
前記測定結果数値と当該測定結果数値を取得した取得タイミングとに基づいて、前記生体分子のデータ解析を行うことを特徴とするデータ解析方法。 A total of biomolecules having a light emitting part and separated by a predetermined moving separation means are observed while sequentially scanning with an optical imaging apparatus capable of acquiring an optical image of the biomolecule at a single molecule level,
Detecting the luminescence from the optical image at a single molecule level, calculating the intensity of the luminescence as a measurement result numerical value,
A data analysis method, wherein data analysis of the biomolecule is performed based on the measurement result numerical value and the acquisition timing at which the measurement result numerical value is acquired.
前記プロセッサが前記既存のスペクトルデータを入力データとして受け付け、複数のスペクトルデータを機械学習アルゴリズムにより比較することにより前記測定対象試料の状態の分類整理を行う、請求項１７に記載のデータ解析方法。 The data analysis unit has a processor,
The data analysis method according to claim 17, wherein the processor receives the existing spectrum data as input data, and classifies and organizes the state of the measurement target sample by comparing a plurality of spectrum data using a machine learning algorithm.
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