JP5482057B2 - Method for analyzing structure constituting cell nucleus - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、細胞核を構成する構造体や細胞核の形態をイメージング（画像）により解析する方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing a structure constituting a cell nucleus and a morphology of the cell nucleus by imaging (image).
多細胞生物は、基本単位としての細胞の共同体であり、多様な生命活動を行っている。個体を構成する細胞は、細胞核内に遺伝情報を有しており、細胞***や分化の際に、この遺伝情報を子孫細胞に伝達している。すなわち、細胞核は発生、再生、老化、発癌、細胞機能などの生命現象をつかさどる源泉と考えられている。細胞内外からの様々なシグナル情報は細胞核に集約されて、その応答を行っている。 A multicellular organism is a community of cells as a basic unit and performs various life activities. Cells constituting an individual have genetic information in the cell nucleus and transmit this genetic information to progeny cells during cell division and differentiation. That is, the cell nucleus is considered to be a source that controls life phenomena such as generation, regeneration, aging, carcinogenesis, and cell function. Various signal information from inside and outside the cell is collected in the cell nucleus and responds.
一般的に癌細胞では、核サイズの不同、細胞質に対する核面積の増大、核膜の不整、クロマチンの不均一化、核小体の増加を含めた核内構造体形成の異常、核の位置異常、多核、巨核などがみられる。これらは癌細胞の***異常、細胞の過増殖性と分化異常、細胞核内構造体及びクロマチン構造の異常を反映していると考えられる。生体を構成する細胞の中から癌細胞が発生することから、発癌の過程には後成的（エピジェネティック）なメカニズムが関わっており、とりわけ遺伝子発現の変化を伴うと考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。 In general, in cancer cells, nuclear size is not the same, nuclear area increases with respect to the cytoplasm, nuclear membrane irregularity, chromatin heterogeneity, abnormal nuclear structure formation, including increased nucleolus, abnormal nuclear position , Polynuclear, meganuclear, etc. are seen. These are thought to reflect cancer cell division abnormalities, cell hyperproliferation and differentiation abnormalities, abnormal structures in the nucleus and chromatin structure. Since cancer cells are generated from the cells that make up the living body, epigenetic mechanisms are involved in the carcinogenesis process, and are thought to involve gene expression changes (for example, (Refer nonpatent literature 1.).
遺伝子の複雑な発現様式を可能にするために、細胞核内は高度に分画化されており、核スペックル、ＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）ボディ、カハールボディ、核小体を含む多くの核内構造体が存在し、時空間・状況に応じて形成と離散を繰り返し、ダイナミックに変動しながら機能している。様々な核構造体が同定され、その機能解析の研究がすすんでいる。これらの構造体が染色体上の個々の遺伝子群と相互作用を持つことで、エピジェネティックな、遺伝子発現の活性調整に働くことが示唆されている。（例えば、非特許文献２参照。）。 In order to enable complex expression patterns of genes, the cell nucleus is highly fractionated, and many nuclear structures including nuclear speckle, PML (pronelolytic leukemia) body, kahal body, and nucleolus There is a function that repeats formation and dispersion according to the time and space and the situation, and dynamically changes. Various nuclear structures have been identified and their functional analysis has been studied. It has been suggested that these structures interact with individual gene groups on the chromosome to work epigenetic and regulate the activity of gene expression. (For example, refer nonpatent literature 2.).
一方で、ＤＮＡのメチル化やクロマチンの形成異常等のエピジェネティックな異常は、癌における遺伝子制御異常において重要な役割を果たしていることがわかっている（例えば、非特許文献３参照。）。実際に、癌細胞では、ゲノム全体のＤＮＡの低メチル化、染色体不安定性と染色体異常等、クロマチン構造の形成異常、核内構造体の形成や局在の異常等、正常細胞と違いがあることがわかってきており、それらの形態異常を検出できる抗体もつくられるようになってきている（例えば、非特許文献４参照。）。 On the other hand, it is known that epigenetic abnormalities such as DNA methylation and chromatin abnormalities play an important role in abnormal gene regulation in cancer (see, for example, Non-Patent Document 3). Actually, cancer cells are different from normal cells, such as hypomethylation of DNA in the entire genome, chromosomal instability and chromosomal abnormalities, abnormal formation of chromatin structures, formation of nuclear structures and abnormal localization, etc. Thus, antibodies capable of detecting these morphological abnormalities have been produced (see, for example, Non-Patent Document 4).
また、細胞が癌化する過程で様々な変化が現れるが、癌細胞に見られる様々な形態異常のうち、最も重要なものが細胞核の形態異常、すなわち核異型である。具体的には、細胞核の大きさ、形、核小体の大きさや数、核クロマチンの量やパターン等の要素が、正常な細胞核とは異なるものを核異型という。これらは実際の癌細胞の病理学的な診断に用いられている。しかし、なぜ核構造の異常が起こるのか、癌の形質とどう結びつくのか、そのメカニズムについてはほとんどわかっていない。一方で、近年、細胞核構造に関する知見は急速に進歩しており、癌細胞の核異型についての謎に迫ることも可能になりつつある。 In addition, various changes appear in the process of canceration of cells. Among various morphological abnormalities observed in cancer cells, the most important one is a morphological abnormality of a cell nucleus, that is, a nuclear atypia. Specifically, a nuclear atypia is one in which factors such as the size and shape of cell nuclei, the size and number of nucleoli, the amount and pattern of nuclear chromatin differ from normal cell nuclei. These are used for pathological diagnosis of actual cancer cells. However, little is known about the mechanism of why nuclear structural abnormalities occur and how they are linked to cancer traits. On the other hand, in recent years, knowledge about the cell nucleus structure is rapidly progressing, and it is possible to approach the mystery about the nuclear variant of cancer cells.
核スペックルは、ほぼすべての哺乳動物の核に存在しており、エピジェネティクス分野において、又は核内構造体の研究において、先駆的な役割を果たしてきた核内構造体である。核スペックルは、スプライシング因子のＳＣ３５やＳＦ２／ＡＳＦの免疫染色により、２０〜５０個の斑点状の構造物として確認される構造体であり、多くのＲＮＡ関連タンパク質から成る。転写、ＲＮＡスプライシング/プロセシング/核外輸送等、遺伝子の発現の複数のステップに関与するものと考えられている。イントロンをもつ未成熟ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）を蛍光ラベルして細胞核へ導入すると、１５〜３０分後に核スペックルに局在し、スプライシングを受けて安定に核外に輸送される。一方、イントロンをもたないｐｒｅ−ＲＮＡの場合、核内に均一に分布して分解を受けやすくなる（例えば、非特許文献５参照。）。このように、核スペックルは、転写、ＲＮＡスプライシング及びプロセッシング、並びにｍＲＮＡの核外輸送等の遺伝子発現の各過程にかかわる因子の複合体を形成あるいは貯蔵して転写の場に供給することによってこれらの過程全体を連携させ、効率化していると考えられている。スプライシングの異常がヒトの疾患の発生に関わることがあり、核スペックルの適切な形成が細胞機能に重要であると考えられる（例えば、非特許文献５参照。）。 Nuclear speckles are nuclear structures that are present in almost all mammalian nuclei and have played a pioneering role in the field of epigenetics or in the study of nuclear structures. Nuclear speckles are structures that are confirmed as 20-50 spotted structures by immunostaining of splicing factors SC35 and SF2 / ASF, and are composed of many RNA-related proteins. It is thought to be involved in multiple steps of gene expression such as transcription, RNA splicing / processing / nuclear export. When immature RNA having an intron (pre-mRNA) is fluorescently labeled and introduced into the cell nucleus, it is localized in the nuclear speckle after 15 to 30 minutes, and is stably spliced and transported out of the nucleus. On the other hand, in the case of pre-RNA having no intron, it is uniformly distributed in the nucleus and is susceptible to degradation (see, for example, Non-Patent Document 5). In this way, nuclear speckles are formed by storing or forming complexes of factors involved in gene expression processes such as transcription, RNA splicing and processing, and mRNA extranuclear transport, and supplying them to the transcription site. It is thought that the whole process is linked and streamlined. Abnormal splicing may be involved in the development of human diseases, and proper formation of nuclear speckles is thought to be important for cell function (see, for example, Non-Patent Document 5).
Ｃａｊａｌボディ（カハールボディ、別名コイルドボディ）は、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）の成熟や、ヒストンｍＲＮＡのプロセシングに機能する。また、癌化した細胞において、テロメラーゼＲＮＡ因子が局在化したり、細胞ストレスによりｐ５３を含む細胞制御因子が集積すること等のことから、カハールボディは老化とストレス応答経路にかかわる構造体であると考えられている（例えば、非特許文献６及び７参照。）。 The Cajal body (Cajal body, also called coiled body) functions in the maturation of snRNA (small nuclear RNA) and snoRNA (small nuclear RNA) and in the processing of histone mRNA. In addition, because telomerase RNA factors are localized in cancerous cells and cell regulatory factors including p53 accumulate due to cell stress, the Kahal body is a structure involved in aging and stress response pathways. (For example, refer nonpatent literature 6 and 7.).
ＰＭＬボディは、癌抑制遺伝子産物であるＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）タンパク質を主体とした核内構造体であり、ほぼすべての哺乳動物細胞に存在する。通常の細胞内では、直径０．２〜１μｍの粒状の構造体が１０〜３０個存在しているが、その形状は、細胞の種類やその環境状態により異なっている。ＰＭＬボディは、老化、発癌、ウィルス感染、分化、アポトーシス等の様々な生命現象にかかわっており、特に癌化や老化等に密接に関係すること等が報告されている。急性前骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ; ＡＰＬ）の腫瘍細胞においては、染色体転座でＰＭＬとレチノイン酸受容体の融合タンパク質が合成される結果、正常のＰＭＬボディはほとんど形成されていない。この細胞をレチノイン酸で処理すると、融合タンパク質がユビキチン-プロテアソームで分解されることで、正常なアレルからのＰＭＬによってＰＭＬボディが再形成される。この時に白血病細胞が好中球に最終分化することから、分子標的型の癌治療の最初の例となっている。（例えば、非特許文献８参照。）。 The PML body is an intranuclear structure mainly composed of a PML (proneelotic leukemia) protein, which is a tumor suppressor gene product, and is present in almost all mammalian cells. In a normal cell, there are 10 to 30 granular structures having a diameter of 0.2 to 1 μm, but the shape varies depending on the type of cell and the environmental state. PML bodies are involved in various life phenomena such as aging, carcinogenesis, viral infection, differentiation, and apoptosis, and are reported to be particularly closely related to canceration and aging. In tumor cells of acute promyelocytic leukemia (APL), the fusion protein of PML and retinoic acid receptor is synthesized by chromosomal translocation, and as a result, almost no normal PML body is formed. When this cell is treated with retinoic acid, the fusion protein is degraded by the ubiquitin-proteasome, and the PML body is re-formed by PML from the normal allele. Since leukemia cells differentiate into neutrophils at this time, it is the first example of molecular targeted cancer therapy. (For example, refer nonpatent literature 8.).
細胞核内と細胞質は核膜により区画化されており、核膜上には、タンパク質やＲＮＡの核―細胞質間の輸送を担う核膜孔複合体が多数存在している。核内側の核膜近傍にはヘテロクロマチンが豊富に存在し、一般的に核膜は遺伝子抑制の環境を作り上げているとされる。疾患細胞の核異型において、核膜の不整は代表的な要素のひとつである。核膜の裏打ちタンパク質であるラミンＡとラミン結合蛋白質の変異は、筋ジストロフィー、ニューロパチーを含むラミノパチー（核膜病）と総称される様々な遺伝病を引き起こす。核膜病のひとつＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ早老症候群(ＨＧＰＳ) では、ラミンＡのＲＮＡのスプライシング異常により翻訳後の脂質修飾が異常となり、正常な核膜の形成が不能になる。ＨＧＰＳ患者由来の細胞核は陥没したような不整な核膜を示し、ヘテロクロマチンの不形成がみられ、損傷ＤＮＡが蓄積している。 The inside of the cell nucleus and the cytoplasm are partitioned by the nuclear membrane, and there are many nuclear pore complexes responsible for transport of proteins and RNA between the nucleus and the cytoplasm. Heterochromatin is abundant in the vicinity of the inner nuclear membrane, and it is generally said that the nuclear membrane creates an environment for gene suppression. In the nuclear variant of diseased cells, nuclear membrane irregularity is one of the typical factors. Mutations in lamin A and lamin binding protein, which are the proteins that line the nuclear membrane, cause various genetic diseases collectively called laminopathy (nuclear membrane disease) including muscular dystrophy and neuropathy. In Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS), which is one of nuclear membrane diseases, lipid translation after translation is abnormal due to splicing abnormality of RNA of lamin A, and normal nuclear membrane cannot be formed. Cell nuclei derived from HGPS patients show an irregular nuclear membrane that is depressed, heterochromatin is not formed, and damaged DNA is accumulated.
細胞核の形態は細胞状態を評価する指標である。例えば、癌細胞における核構造異常（核異型）は病理学的な診断に広く用いられており、組織や細胞の標本を用いて、核の大きさ、形、核小体の大きさや数、核クロマチンの量、形やパターン等について、目視で観察されている。従来のこの手法は病理医及び細胞診断士の経験的な判断に依存しており、その補助手段として、定量性、客観性や効率性に優れた形態解析法の開発が期待されていた。 The form of the cell nucleus is an index for evaluating the cell state. For example, nuclear structural abnormalities (nuclear atypia) in cancer cells are widely used for pathological diagnosis. Using tissue and cell specimens, the size and shape of the nucleus, the size and number of nucleoli, The amount, shape and pattern of chromatin are visually observed. This conventional method relies on the empirical judgment of a pathologist and cytodiagnologist, and as an auxiliary means, development of a morphological analysis method excellent in quantitativeness, objectivity and efficiency has been expected.
その他、細胞内の生体成分を定量的に解析する方法として、解析対象である生体成分を免疫染色法等により蛍光染色した後、細胞当たりの蛍光強度解析をフローサイトメータにより解析する方法がある。 In addition, as a method for quantitatively analyzing intracellular biological components, there is a method in which a biological component to be analyzed is fluorescently stained by immunostaining or the like, and then fluorescence intensity analysis per cell is analyzed by a flow cytometer.
細胞の蛍光強度解析はフローサイトメータにより解析されているが、核内構造体の形態解析は難しい。しかしながら、核内構造体の検出、解析そして評価を、フローサイトメータを用いた解析法により行うことは非常に困難である。なぜならば、フローサイトメータでは、核内構造体の形状の相違を識別することができず、細胞核内に局在しているのか又は細胞内核外（細胞質）に局在しているのかを区別して判断することができないためである。 Although the fluorescence intensity analysis of cells is analyzed by a flow cytometer, it is difficult to analyze the morphology of the nuclear structure. However, it is very difficult to detect, analyze and evaluate the nuclear structure by an analysis method using a flow cytometer. This is because the flow cytometer cannot identify the difference in the shape of the nuclear structure and distinguish whether it is localized in the cell nucleus or outside the cell nucleus (cytoplasm). This is because it cannot be judged.
また、フローサイトメータを用いた診断方法では、個々の細胞が分離されていることが測定の際の必要条件となってくるが、生体由来の細胞サンプルは基本的には純粋ではなく、細胞以外のごみ等のデブリスや上皮細胞が結合組織につながれているものを含むことが少なくない。このように細胞が個々になっていない試料をフローサイトメータで解析する場合、データを読み取ることができないばかりでなく、フローの流路を塞いでしまう可能性が高い。さらに、細胞以外のごみ等のデブリスの自家蛍光を拾ってしまい、データ結果に誤りをもたらす可能性がある。加えて、一度流してしまったサンプルを、再度顕微鏡下で探すことは不可能である。そのため、このようなフローサイトメータによる解析では、測定解析後に示される結果についての再確認をとることが難しい。 In addition, in the diagnostic method using a flow cytometer, it is a necessary condition for measurement that individual cells are separated, but a cell sample derived from a living body is basically not pure and other than cells. In many cases, it includes debris such as trash and epithelial cells connected to connective tissue. Thus, when analyzing a sample in which cells are not individual with a flow cytometer, not only data cannot be read but also there is a high possibility of blocking the flow channel. Furthermore, there is a possibility of picking up the autofluorescence of debris such as garbage other than cells and causing an error in the data result. In addition, once a sample has been flowed, it is impossible to search again under a microscope. Therefore, it is difficult to reconfirm the results shown after the measurement analysis in the analysis using the flow cytometer.
従来の蛍光顕微鏡は1細胞あたりの詳細な形態観察には適しているが、定量性が乏しく、しかも多数の細胞群を網羅的に解析するためには不適であることが問題点である。また、従来のように、蛍光顕微鏡等により観察することによって核内構造体を評価同定する方法では、長時間蛍光顕微鏡で観察して評価する、あるいは写真をとった後、当該写真を画像解析することによって核内構造体の評価を行うという作業になる。ここで、長時間の蛍光顕微鏡下にサンプルをさらすことは、その蛍光色素の褪色につながり、得られる結果の質を低下させる場合がある。また、マニュアル的に写真をとり、目視観察する作業は非常に労力を費やす上、写真を取得する視野の選抜、核内構造体の評価に対して個人差がでる等の問題点がある。また、マニュアル作業の場合には、解析のための時間、作業効率、サンプル数に限界がでてくる。 Conventional fluorescence microscopes are suitable for detailed morphological observations per cell, but have a problem in that they have poor quantitativeness and are not suitable for comprehensive analysis of a large number of cell groups. In addition, in the conventional method of evaluating and identifying a nuclear structure by observing with a fluorescence microscope or the like, it is observed and evaluated with a fluorescence microscope for a long time, or the photograph is subjected to image analysis. Therefore, the nuclear structure is evaluated. Here, exposing the sample to the fluorescent microscope for a long time may lead to the fading of the fluorescent dye, and may deteriorate the quality of the obtained result. In addition, taking manual photographs and visually observing them are very labor intensive, and there are problems such as selection of the field of view for obtaining photographs and individual differences in the evaluation of nuclear structures. In the case of manual work, there are limits to the time for analysis, work efficiency, and the number of samples.
本発明は、細胞生物学の最新知見に基づいて、イメージングサイトメータと多因子計測解析法を組み合わせたハイスループットの独自な方法を、細胞核構造体の形状や局在の自動検出・数値化・計測・解析に新規導入する改良技術である。核内構造体や核膜等の細胞核を構成する構造体の解析、特に、構造体の形状や細胞内においての局在を、イメージング（画像）を用いて行うことにより、客観的で効率・精度よく細胞形態を解析する方法を提供することを目的とする。 The present invention is based on the latest knowledge of cell biology and uses a unique high-throughput method combining an imaging cytometer and a multi-factor measurement analysis method to automatically detect, quantify, and measure the shape and localization of cell nuclear structures.・ It is an improved technology newly introduced in analysis. Analysis of structures that make up the cell nucleus such as nuclear structures and nuclear membranes, especially the shape of the structure and localization in the cell using imaging, objective efficiency and accuracy It aims at providing the method of analyzing a cell form well.
本発明は、
（１） 細胞核を構成する構造体を解析する方法であって、（ａ）細胞核を構成する１種類又は複数種類の構造体（ただし、核小体を除く。）と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、（ｃ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、（ｅ）前記工程（ｃ）において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定する工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析する工程と、（ｇ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法、
（２） 前記工程（ｇ）において、細胞核領域の全画素の輝度値の合計値と１画素当たりの最大輝度値とにより細胞周期を判断することを特徴とする前記（１）記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（３） 前記構造体が、核膜、核スペックル、カハールボディ、及びＰＭＬボディからなる群より選択される１種であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（４） 前記構造体が核内構造体であり、前記工程（ｄ）において、さらに、決定された細胞核領域に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、前記工程（ｅ）において、さらに、前記工程（ｃ）において取得された前記構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（５） 前記構造体が核内構造体であり、前記工程（ａ）において、さらに、細胞質を標識し、前記工程（ｂ）において、さらに、前記工程（ａ）において標識された細胞の、細胞質の標識画像を取得し、前記工程（ｄ）において、さらに、取得された細胞質の標識画像に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、前記工程（ｅ）において、さらに、前記工程（ｃ）において取得された前記核内構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（６） さらに、（ｈ）前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される１以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（７） 前記核内構造体が、核スペックル、カハールボディ、及びＰＭＬボディからなる群より選択される１種であることを特徴とする前記（４）〜（６）のいずれかに記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（８） 細胞核を構成する構造体（ただし、核小体を除く。）を解析する方法であって、（ａ２）核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、（ｂ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、（ｃ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、（ｄ２−１）前記工程（ｂ２）において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、（ｄ２−２）前記工程（ｄ２−１）において決定された細胞核領域及び前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、（ｅ２）前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像中の、前記工程（ｄ２−２）において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、（ｆ２）前記工程（ｅ２）において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程と、（ｇ２）前記工程（ｂ２）において取得された核酸の標識画像中の、前記工程（ｄ２−１）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、を有し、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態と、細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法、
（９） 前記工程（ｇ２）において、細胞核領域の全画素の輝度値の合計値と１画素当たりの最大輝度値とにより細胞周期を判断することを特徴とする前記（８）記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
（１０） 前記工程（ｆ２）において、核膜が、正常に形成されているか、形成異常であるか、又は不形成かを解析することを特徴とする前記（８）又は（９）記載の細胞核を構成する構造体の解析方法、
を、提供するものである。
The present invention
(1) A method for analyzing a structure constituting a cell nucleus, wherein (a) one or more kinds of structures (excluding nucleolus) constituting the cell nucleus and nucleic acids in the cell nucleus are each A labeling step; (b) a nucleic acid labeling image of the cell labeled in the step (a); and (c) a labeling of the structure of the cell labeled in the step (a). A step of separately acquiring an image for each type of labeled structure, (d) a step of determining a nuclear region based on the labeled image of the nucleic acid acquired in the step (b), and (e) The luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) in the labeled image of the structure acquired in the step (c) is measured, and the luminance value per pixel is equal to or greater than a threshold value Determine one or more regions that are A step of measuring one or more selected from the group consisting of a statistical value of a luminance value of each pixel in the region, a total area of the region, and a total perimeter of the region; (f) measured in the step (e) Analyzing at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and morphology of the structure based on the statistical values obtained, and (g) obtained in the step (b) Measuring the statistical value of the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) of the labeled image of the nucleic acid, and determining the cell cycle of the cell containing the cell nucleus region. Analyzing the correlation between the cell cycle and at least one selected from the group consisting of the abundance, localization and morphology of the structure in the cell, and a method for analyzing the structure constituting the cell nucleus ,
(2) In the step (g), the cell cycle is determined based on the total luminance value of all the pixels in the cell nucleus region and the maximum luminance value per pixel, and the cell nucleus according to (1) is configured Structure analysis method
(3) The cell nucleus according to (1) or (2) above, wherein the structure is one selected from the group consisting of a nuclear membrane, a nuclear speckle, a Kahal body, and a PML body Structure analysis method
(4) The structure is an intranuclear structure, and in the step (d), a cytoplasmic region in each cell is determined based on the determined nuclear region, and in the step (e), Any one of (1) to (3) above, wherein a statistical value of a luminance value of each pixel included in the cytoplasm region in the labeled image of the structure acquired in the step (c) is measured. A method of analyzing a structure constituting the cell nucleus according to claim 1,
(5) The structure is an intranuclear structure, and in the step (a), the cytoplasm is further labeled. In the step (b), the cytoplasm of the cell further labeled in the step (a) In the step (d), a cytoplasmic region in each cell is determined based on the acquired cytoplasmic label image. In the step (e), the step (c) is further performed. Measuring the luminance value of each pixel included in the cytoplasmic region in the labeled image of the intranuclear structure obtained in step 1, and determining one or a plurality of regions where the luminance value per pixel is a threshold value or more, One or more selected from the group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the region, the total area of the region, and the total perimeter of the region are measured (1) to (3) ) Analysis method of the structure
(6) Further, (h) one or more selected from the group consisting of the area of the cell nucleus region determined in the step (d), the perimeter of the cell nucleus region, the convex hull area of the cell nucleus region, and the convex hull perimeter And analyzing the morphology of the cell nucleus of the cell containing the cell nucleus region, and at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and morphology of the structure in the cell; Analyzing the correlation between the morphology of the cell nucleus and the cell cycle, the method for analyzing the structure constituting the cell nucleus according to any one of (1) to (5),
(7) The nuclear structure is one type selected from the group consisting of nuclear speckles, kahal bodies, and PML bodies, according to any one of (4) to (6), A method of analyzing the structure constituting the cell nucleus,
(8) A method for analyzing a structure constituting a cell nucleus (excluding a nucleolus), wherein (a2) a step of labeling a nuclear membrane and a nucleic acid in the cell nucleus, respectively (b2) A step of acquiring a nucleic acid label image of the cell labeled in the step (a2), a step (c2) of acquiring a nuclear membrane label image of the cell labeled in the step (a2), 1) a step of determining a nucleus region in each cell based on the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b2), and (d2-2) a nucleus region determined in the step (d2-1) A step of determining a nuclear envelope region in each cell based on a nuclear envelope labeled image acquired in the step (c2), and (e2) the nuclear membrane labeled image acquired in the step (c2), In the process (d2-2) Measuring the statistical value of the luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region determined in step (f2), and the cell nucleus of the cell including the nuclear membrane region based on the statistical value measured in the step (e2) And (g2) each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d2-1) in the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b2). Measuring the statistic value of the brightness value of the cell, and determining the cell cycle of the cell containing the cell nucleus region, the form of the cell nucleus of the cell containing the nuclear membrane region or the state of the nuclear membrane, the cell cycle, A method for analyzing a structure constituting a cell nucleus, characterized by analyzing a correlation between
(9) The cell nucleus according to (8), wherein in the step (g2), the cell cycle is determined based on a sum of luminance values of all pixels in the cell nucleus region and a maximum luminance value per pixel. Structure analysis method
(10) The cell nucleus according to the above (8) or (9), wherein in the step (f2), it is analyzed whether the nuclear membrane is normally formed, abnormally formed, or not formed. the method of analyzing the structure that constitutes the,
Is provided.
本発明の細胞核を構成する構造体の解析方法により、核内構造体や核膜等の細胞核を構成する構造体や細胞核自体の形状や局在について、解析者の主観を排除した客観的で精度のよい解析結果を得ることができる。
特に、本発明の細胞核を構成する構造体の解析方法は、画像解析を利用しているため、細胞同士が近接している組織切片などの標本を対象とした場合であっても、ソフトウェア上で個々の細胞を判断したり、解析対象である構造体の細胞内における局在等を、画像を見ながら判断することができる。
By the method for analyzing the structure constituting the cell nucleus of the present invention, the objective accuracy of the structure and structure of the cell nucleus such as the intranuclear structure and the nuclear membrane, and the nucleus and the localization of the cell nucleus itself are excluded. It is possible to obtain a good analysis result.
In particular, since the method for analyzing the structure constituting the cell nucleus of the present invention uses image analysis, even when a specimen such as a tissue section in which cells are close to each other is targeted, Individual cells can be determined, and the localization of the structure to be analyzed in the cells can be determined while viewing the image.
＜細胞核を構成する構造体の解析方法＞
本発明の細胞核を構成する構造体の解析方法（以下、「本発明の構造体解析方法」と略記載することがある。）は、解析対象とする構造体の標識画像を取得し、この標識画像を画像解析することにより、当該構造体の細胞内における存在量や局在、細胞核の形態等を多数の細胞で一度に解析するハイスループット解析であることが特徴である。
<Analysis method of structure constituting cell nucleus>
The analysis method of the structure constituting the cell nucleus of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “the structure analysis method of the present invention”) obtains a label image of the structure to be analyzed, and this label It is characterized by high-throughput analysis in which the abundance and localization of the structure in the cell, the morphology of the cell nucleus, etc. are analyzed at once in a large number of cells by analyzing the image.
細胞核の形態は、細胞内外の刺激に応じて大きく変化するため、細胞状態のよい指標である。これらの変化は、核・染色体構成因子の発現の変化など量的なもの、細胞内局在の変化など質的なもの、その組み合わせなど、多岐にわたるが、従来法による解析では客観的な解析が困難であり、今までは主観的な記述にとどまっていた。本発明の構造体解析方法は画像解析を用いているため、核形態を様々なパラメータを用いて多角的に数値化し、客観的な判断基準を確立することが可能である。また、核内構造体の自動検出とハイスループット解析も可能である。例えば、９６検体を同時に解析可能であり、多数の細胞について核内構造の形態を効率的に計測、解析することが可能である。また、本発明の構造体解析方法は、定量性に優れているため、１細胞あたりの細胞核の形態を客観的に評価することができる。同時に、多数の細胞について同一の基準を適応できるため、例えば異常細胞において確率的に起きる核構造の変化について、どのような頻度で起きるかを評価できる。さらに、少数の細胞群における変化は、従来の顕微鏡観察では意義のある変化と認めることが困難であるが、本発明の構造体解析方法では評価することができる。早期癌などの病的組織において、少数細胞群に起こる変化を同定することも可能である。 The morphology of the cell nucleus is a good indicator of the cell state because it greatly changes in response to stimulation inside and outside the cell. These changes vary widely, including quantitative changes such as changes in the expression of nuclear and chromosomal components, qualitative changes such as changes in subcellular localization, and combinations thereof. It was difficult and so far it has been a subjective description. Since the structure analysis method of the present invention uses image analysis, it is possible to establish an objective judgment criterion by quantifying the nuclear morphology from various parameters using various parameters. In addition, automatic detection of nuclear structures and high-throughput analysis are possible. For example, 96 specimens can be analyzed at the same time, and the morphology of the intranuclear structure can be efficiently measured and analyzed for a large number of cells. In addition, since the structure analysis method of the present invention is excellent in quantification, the morphology of cell nuclei per cell can be objectively evaluated. At the same time, since the same standard can be applied to a large number of cells, it is possible to evaluate how often a change occurs in a nuclear structure that occurs stochastically in an abnormal cell, for example. Furthermore, although it is difficult to recognize changes in a small number of cell groups as significant changes by conventional microscope observation, they can be evaluated by the structure analysis method of the present invention. It is also possible to identify changes that occur in a small population of cells in pathological tissues such as early cancer.
また、従来法のようにフローサイトメータを用いて解析した場合には、核内構造体形態の解析、構成因子タンパク質の局在解析は不可能である。フローサイトメータによる細胞周期解析は、細胞集団を対象としているが、本発明の構造体解析方法では、１細胞あたりの細胞周期の同定が可能であることから、ある核内構造を有する細胞がどの細胞周期にあるか、などの複数のパラメータを相関させて解析することが可能である。 Further, when analysis is performed using a flow cytometer as in the conventional method, analysis of the structure of the nuclear structure and localization analysis of the constituent factor protein are impossible. Cell cycle analysis using a flow cytometer is intended for cell populations. However, since the structure analysis method of the present invention can identify the cell cycle per cell, which cell has a certain nuclear structure. It is possible to analyze by correlating a plurality of parameters such as whether they are in the cell cycle.
細胞核は、核膜に包まれた球形の構造体であり、内部に核液や染色質等を含む。本発明及び本願明細書において、細胞核を構成する構造体（以下、単に「構造体」ということがある。）とは、核膜、及び核膜に包まれた内部に存在している核内構造体を意味する。核内構造体としては、少なくとも一定の時期に細胞核内に存在している構造体であればよく、細胞周期等の細胞の状態に依存して細胞核外へ局在する構造体であってもよい。 A cell nucleus is a spherical structure enveloped by a nuclear membrane, and contains nuclear fluid, chromatin, and the like. In the present invention and the specification of the present application, the structure constituting the cell nucleus (hereinafter sometimes simply referred to as “structure”) is a nuclear membrane and a nuclear structure existing inside the nuclear membrane. Means the body. The nuclear structure may be a structure that exists in the cell nucleus at least at a certain time, and may be a structure that is localized outside the cell nucleus depending on the state of the cell such as the cell cycle. .
核内構造体は、核小体、核スペックル、パラスペックル、カハールボディ、ＰＭＬボディ、傍核小体コンパートメント、クラストソーム等を含む。本発明の構造体解析方法においては、核膜、核スペックル、カハールボディ、及びＰＭＬボディより選択される１種以上の構造体を解析対象とすることが好ましい。これらの構造体は、癌や老化等の生体における重要な現象と深い関係があり、これらを解析することにより、癌等の生命現象の解明が期待されるのみならず、癌検査等の臨床検査にも応用することができるためである。 Nuclear structures include nucleolus, nuclear speckles, paraspeckles, cahal bodies, PML bodies, paranuclear compartments, crustsomes, and the like. In the structure analysis method of the present invention, it is preferable that one or more types of structures selected from nuclear membranes, nuclear speckles, cahal bodies, and PML bodies be analyzed. These structures are deeply related to important phenomena in living organisms such as cancer and aging. By analyzing these, it is expected not only to elucidate life phenomena such as cancer, but also clinical tests such as cancer tests. This is because it can also be applied to.
本発明の構造体解析方法に供される細胞は、細胞核を有する細胞（真核細胞）であれば、特に限定されるものではなく、生体から採取された生体試料中に含まれる細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。また、本発明の構造体解析方法に供される細胞は、生細胞であってもよく、細胞観察用容器に固定された細胞や、固定化後、さらに界面活性剤等による細胞膜透過処理を行った細胞であってもよい。 The cell used in the structure analysis method of the present invention is not particularly limited as long as it has a cell nucleus (eukaryotic cell), and is a cell contained in a biological sample collected from a living body. It may also be a cultured cell. The cells to be subjected to the structure analysis method of the present invention may be living cells, or cells fixed in a cell observation container, or after immobilization, further subjected to cell membrane permeabilization with a surfactant or the like. It may be a cell.
本発明の構造体解析方法は、具体的には、下記工程（ａ）〜（ｅ）を有することを特徴とする。
（ａ）細胞核を構成する１種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、
（ｅ）前記工程（ｃ）において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析する工程。
Specifically, the structure analysis method of the present invention includes the following steps (a) to (e).
(A) a step of labeling each of one or more types of structures constituting the cell nucleus and nucleic acids in the cell nucleus;
(B) obtaining a nucleic acid labeled image of the cell labeled in the step (a);
(C) obtaining a labeled image of the structure of the cell labeled in the step (a) separately for each type of labeled structure;
(D) determining a nuclear region based on the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b);
(E) Measuring the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) in the labeled image of the structure acquired in the step (c), and calculating the luminance value per pixel Determining one or more regions having a threshold equal to or greater than a threshold, and selecting one or more selected from the group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the region, the total area of the region, and the total perimeter of the region Measuring process;
(F) Analyzing at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and morphology of the structure in the cell based on the statistical value measured in the step (e).
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、１種類又は複数種類の構造体と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する。なお、標識方法は、細胞内成分（細胞核を構成する構造体や核酸）を、適当な波長の光を照射して撮像された画像上で、他の細胞内成分と視覚的に区別し得るように標識し得る方法であれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、構造体を構成するタンパク質等の物質や核酸と特異的に結合する抗体やリガンド等を用いた免疫染色法を行ってもよく、構造体や核酸に集積し得る色素を用いた色素染色法を行ってもよい。また、免疫染色法では、蛍光物質を結合させた一次抗体や二次抗体を用いた蛍光免疫染色法であってもよく、ＤＡＢ法、ニッケルＤＡＢ法、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ法等の酵素抗体法であってもよい。なお、これらの染色法は、当該技術分野において汎用されている染色法であり、常法により行うことができる。また、本発明においては、検出感度が良好であるため、各構造体や核酸は、蛍光物質により標識することが好ましい。
Hereinafter, it demonstrates for every process.
First, as step (a), one or more types of structures and nucleic acids in the cell nucleus are labeled. It should be noted that the labeling method can visually distinguish intracellular components (structures and nucleic acids constituting the cell nucleus) from other intracellular components on an image captured by irradiating with light of an appropriate wavelength. Any method known in the art may be used as long as it is a method capable of labeling. For example, an immunostaining method using an antibody or a ligand that specifically binds to a nucleic acid or a substance such as a protein constituting the structure may be performed, or a dye staining method using a dye that can accumulate in the structure or the nucleic acid May be performed. The immunostaining method may be a fluorescent immunostaining method using a primary antibody or a secondary antibody to which a fluorescent substance is bound, and may be an enzyme antibody method such as DAB method, nickel DAB method, NBT / BCIP method. May be. In addition, these dyeing | staining methods are dyeing methods currently used widely in the said technical field, and can be performed by a conventional method. In the present invention, since the detection sensitivity is good, each structure or nucleic acid is preferably labeled with a fluorescent substance.
各構造体については、例えば、核スペックルに局在しているＳＣ３５やＳＦ２／ＡＳＦに対する抗体を用いて免疫染色を行うことにより、核スペックルを標識することができる。また、カハールボディに特異的に局在しているｃｏｉｌｉｎやＳＭＮ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行うことにより、カハールボディを標識することができる。また、ＰＭＬボディの主たる構成成分であるＰＭＬタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行うことにより、ＰＭＬボディを標識することができる。さらに、Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ、エメリン、ＲａｎＢＰ２等の核膜や核膜孔複合体に特異的に局在している物質を標的とした免疫染色を行うことにより、核膜を標識することができる。 For each structure, for example, nuclear speckle can be labeled by immunostaining using an antibody against SC35 or SF2 / ASF localized in nuclear speckle. Further, the Kahal body can be labeled by immunostaining using an antibody against coilin or SMN (survival of motor neuron) protein that is specifically localized in the Kahal body. In addition, the PML body can be labeled by performing immunostaining using an antibody against the PML protein, which is the main component of the PML body. Furthermore, the nuclear membrane can be labeled by performing immunostaining targeting a substance that is specifically localized in the nuclear membrane or nuclear membrane pore complex such as Lamin A / C, emerin, RanBP2.
一方、核酸は、公知の核酸染色剤の中から、適宜選択して用いることにより、標識することができる。例えば、核酸染色剤としてＤＮＡインターカレータを用いることができる。ＤＮＡインターカレータとしては、例えば、ＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、７−ＡＡＤ（７Ａｍｉｎｏ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ＤＲＡＱ５（登録商標）（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ社製）、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＹＯＹＯ（登録商標）（インビトロジェン社製）等が挙げられる。 On the other hand, the nucleic acid can be labeled by appropriately selecting from among known nucleic acid stains. For example, a DNA intercalator can be used as a nucleic acid stain. Examples of the DNA intercalator include DAPI (4 ′, 6-diamino-2-phenyllinole), PI (propidium iodide), Hoechst 33258, Hoechst 33342, 7-AAD (7Amino actinomycin D) (manufactured by DRAQ5 (registered trademark), Biost) ), Sytox (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), YOYO (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), and the like.
また、核酸は酸性物質であることから、核酸染色剤として塩基性色素を用いることもできる。このような色素を用いた染色として、例えば、ＨＥ染色、パパニコロウ染色、フォイルゲン染色、メチル緑・ピロニン染色等が挙げられる。 In addition, since nucleic acids are acidic substances, basic dyes can be used as nucleic acid stains. Examples of staining using such a dye include HE staining, Papanicolaou staining, Foilgen staining, methyl green / pyronine staining, and the like.
本発明においては、核酸染色剤としては、ＤＮＡインターカレータ等のように、細胞内の核酸量を反映可能な染色剤であることが好ましい。細胞内の核酸量依存的に染色される核酸染色剤を用いた場合には、一細胞核内に存在するＤＮＡ量が多い場合や凝集している場合には、ＤＮＡ量が少ない場合や凝集していない場合よりも強く染色される。このため、後述するように、撮像された核酸の標識画像を解析することにより、細胞周期を判断することができる。 In the present invention, the nucleic acid stain is preferably a stain capable of reflecting the amount of nucleic acid in the cell, such as a DNA intercalator. When using a nucleic acid stain that stains depending on the amount of nucleic acid in the cell, if the amount of DNA present in one cell nucleus is large or aggregated, if the amount of DNA is small or aggregated Stain more intensely than if not. For this reason, as will be described later, the cell cycle can be determined by analyzing the labeled image of the captured nucleic acid.
本発明においては、１種類の構造体を解析するものであってもよく、複数種類の構造体を解析するものであってもよい。なお、各構造体及び核酸は、標識画像上で互いに区別して検出可能なように、それぞれ異なる種類の染色剤等を用いて標識する。例えば、複数種類の構造体を蛍光免疫染色し、ＤＡＰＩ等の蛍光性核酸染色剤を用いて核酸を染色する場合、各構造体を染色する蛍光物質の蛍光特性と、蛍光性核酸染色剤の蛍光特性とが、互いに異なっていることが好ましい。なお、蛍光特性が異なるとは、ＦＩＴＣとローダミンのように、励起光照射により発される蛍光の波長が、区別して検出し得るほど異なることを意味する。その他、例えば、１種類の構造体をＤＡＢ法等の酵素抗体法により標識し、その他の種類の構造体及び核酸を、互いに蛍光特性の異なる蛍光物質を用いてそれぞれ標識してもよく、また、核酸を非蛍光性の核酸染色剤を用いて標識し、各種構造体を互いに蛍光特性の異なる蛍光物質を用いてそれぞれ標識してもよい。 In the present invention, one type of structure may be analyzed, or a plurality of types of structures may be analyzed. Each structure and nucleic acid are labeled with different types of stains so that they can be distinguished from each other on the label image. For example, when multiple types of structures are immunofluorescently stained and nucleic acids are stained using a fluorescent nucleic acid stain such as DAPI, the fluorescence characteristics of the fluorescent substance that stains each structure and the fluorescence of the fluorescent nucleic acid stain The characteristics are preferably different from each other. The difference in fluorescence characteristics means that the wavelengths of fluorescence emitted by excitation light irradiation are so different that they can be distinguished and detected, such as FITC and rhodamine. In addition, for example, one type of structure may be labeled by an enzyme antibody method such as the DAB method, and the other type of structure and nucleic acid may be labeled with fluorescent substances having different fluorescence characteristics. The nucleic acid may be labeled with a non-fluorescent nucleic acid stain, and the various structures may be labeled with fluorescent substances having different fluorescence characteristics.
その他、遺伝子組み換え技術により、構造体が予め標識された細胞を作製し、この細胞を解析に用いることもできる。例えば、構造体に特異的に局在するタンパク質に適当な蛍光特性を持つ蛍光物質を融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されており、当該融合タンパク質が発現している細胞を用いてもよい。 In addition, a cell in which the structure is labeled in advance can be prepared by gene recombination technology, and the cell can be used for analysis. For example, a gene encoding a fusion protein in which a fluorescent substance having an appropriate fluorescence property is fused to a protein specifically localized in the structure has been introduced, and a cell expressing the fusion protein can be used. Good.
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する。また、工程（ｃ）として、工程（ａ）において標識された細胞の、解析対象である構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する。それぞれの標識画像は、構造体や核酸の標識方法に応じて、常法により取得することができる。具体的には、例えば、１種類又は複数種類の構造体及び核酸を、互いに蛍光特性の異なる蛍光物質を用いて標識した場合、共焦点レーザ顕微鏡等を用いて、解析対象である構造体と核酸が標識された細胞に対して、各蛍光物質の蛍光特性に応じた波長の励起光を順次照射し、発された蛍光を検出して撮像することにより各標識画像を取得することができる。また、構造体や核酸を、酵素抗体法等のように非蛍光物質により標識した場合には、透過光を撮像することにより、各標識画像を取得することができる。なお、同じ細胞に対して、核酸の標識画像と各構造体の標識画像とを取得する。 Next, as the step (b), a labeled image of the nucleic acid of the cell labeled in the step (a) is obtained. In step (c), a labeled image of the structure to be analyzed of the cells labeled in step (a) is separately obtained for each type of labeled structure. Each labeled image can be obtained by a conventional method according to the labeling method of the structure or nucleic acid. Specifically, for example, when one or more types of structures and nucleic acids are labeled with fluorescent substances having different fluorescence characteristics, the structure and nucleic acid to be analyzed can be analyzed using a confocal laser microscope or the like. Each labeled image can be obtained by sequentially irradiating the cells labeled with irradiating excitation light having a wavelength corresponding to the fluorescence characteristics of each fluorescent substance, and detecting and imaging the emitted fluorescence. In addition, when a structure or nucleic acid is labeled with a non-fluorescent substance, such as an enzyme antibody method, each labeled image can be acquired by imaging transmitted light. In addition, the labeled image of a nucleic acid and the labeled image of each structure are acquired with respect to the same cell.
これらの画像は、ＣＣＤカメラ等の細胞の撮像に通常用いられる撮像装置を用いて撮像し取得することができる。例えばＣＣＤカメラによる撮像は、通常、個々のＸＹ位置に対して１枚あるいは複数枚の画像を撮像する。レンズの焦点位置を例えばＺとし、これに垂直な面にＸＹ面を設定して撮像ポイントを特定する場合が多い。ＣＣＤカメラで撮像された各チャンネルの画像は白黒画像であり、明るさごとに例えば０〜４０９６の値を各ＸＹ位置（画像の画素）に割り当て、各画素の輝度を記録している。 These images can be captured and acquired using an imaging device that is normally used for imaging cells such as a CCD camera. For example, imaging with a CCD camera usually captures one or more images for each XY position. In many cases, the focal point of the lens is set to Z, for example, and the imaging point is specified by setting the XY plane to a plane perpendicular thereto. The image of each channel captured by the CCD camera is a black and white image, and a value of 0 to 4096, for example, is assigned to each XY position (image pixel) for each brightness, and the luminance of each pixel is recorded.
また、これらの画像は、細胞を入れた細胞観察用容器を、イメージングサイトメータ等の蛍光画像の取得装置に設置して行うことができる。画像を取得する細胞は、細胞観察用容器に接着していればよく、必ずしも固定化処理がなされている必要はない。なお、細胞観察用容器への細胞の固定方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、自然乾燥させてもよく、ホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒド、メタノール等の細胞固定架橋剤を呈することにより、細胞観察用容器へ細胞を固定することができる。 In addition, these images can be obtained by placing a cell observation container containing cells in a fluorescent image acquisition device such as an imaging cytometer. The cells from which images are to be acquired need only be adhered to the cell observation container, and are not necessarily fixed. The method for fixing cells to the cell observation container is not particularly limited, and can be performed by a conventional method. For example, it may be naturally dried, and cells can be fixed to the cell observation container by presenting a cell-fixing cross-linking agent such as formaldehyde, paraformaldehyde, or methanol.
細胞観察用容器としては、一般的に細胞染色に用いられるものであれば、特に限定されるものではないが、スライドガラス又はマルチウェルプレートであることが好ましい。
スライドガラス又はマルチウェルプレートを用いて、イメージングサイトメータ等を用いることにより、多数の検体も迅速かつ簡便に処理することが可能となる。
The cell observation container is not particularly limited as long as it is generally used for cell staining, but it is preferably a slide glass or a multiwell plate.
By using an imaging cytometer or the like using a slide glass or a multi-well plate, a large number of specimens can be processed quickly and easily.
工程（ｂ）及び（ｃ）は、どちらを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。なお、同時に行うとは、１ショット（１顕微鏡視野）ごとに、構造体の種類ごとの標識画像と核酸の標識画像とを別個に取得し蓄積することを意味する。また、工程（ｂ）は工程（ｄ）の前に終了している必要があるが、工程（ｃ）は、工程（ｄ）において構造体の標識画像を使用しない場合には工程（ｅ）の前に終了していればよい。 Steps (b) and (c) may be performed first or may be performed simultaneously. In addition, performing simultaneously means acquiring and accumulating the labeled image for every kind of structure and the labeled image of a nucleic acid for every shot (one microscope visual field). Further, the step (b) needs to be completed before the step (d), but the step (c) is the step (e) in the case where the structure structure label image is not used in the step (d). It only needs to be finished before.
次いで、工程（ｄ）として、工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像（以下、「核酸標識画像」と略記することがある。）に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する。 Next, as the step (d), the nucleus region in each cell is determined based on the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b) (hereinafter sometimes abbreviated as “nucleic acid labeled image”).
本発明において、標識画像の解析は、公知の画像解析の手法を適宜組み合わせることにより行うことができる。基本的な細胞画像解析や自動細胞認識においては、画像に適当な輝度の閾値を設定することにより、標識画像中の標識された領域の決定は、画像に適当な輝度の閾値を設定することにより行う。例えば、輝度値が設定された閾値より上の点（画素）を１、それ以外を０というように二値化を行い、さらに１となった画素からなる領域を個々に切り分ける（１の島ごとに切り分けて番号付けを行う）ことによって、個々の細胞核や構造体を認識する。 In the present invention, the label image can be analyzed by appropriately combining known image analysis techniques. In basic cell image analysis and automatic cell recognition, an appropriate luminance threshold is set for the image, and the labeled area in the labeled image is determined by setting an appropriate luminance threshold for the image. Do. For example, binarization is performed such that a point (pixel) above a threshold value at which a luminance value is set is 1 and the others are 0, and further, an area composed of pixels that have become 1 is individually cut (for each island) To identify individual cell nuclei and structures.
具体的には、予め、核酸標識画像中の細胞核を認識するための細胞核用閾値及び細胞核用面積閾値を設定しておき、核酸標識画像から、各画素（ピクセル）が細胞核用閾値以上の輝度の値（以下、「輝度値」という。）を有する一塊の領域をメインオブジェクトとして認識する。このオブジェクト中の各画素の輝度値の勾配から、当該オブジェクトの境界を分離し、閉じた領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を抽出し、細胞核領域として決定する。 Specifically, a cell nucleus threshold and a cell nucleus area threshold for recognizing cell nuclei in a nucleic acid label image are set in advance, and each pixel (pixel) has a luminance equal to or higher than the cell nucleus threshold from the nucleic acid label image. A lump area having a value (hereinafter referred to as “luminance value”) is recognized as a main object. The boundary of the object is separated from the gradient of the luminance value of each pixel in the object, and a region having an area equal to or larger than the cell nucleus area threshold is extracted from the closed regions and determined as a cell nucleus region.
なお、ここでいう輝度とは、例えば濃淡画像においては濃淡を表す値であり、画像中の各ピクセル（画素）の明るさを表す値である。また、ここでいう面積とは、領域の正確な面積の数値のみならず、領域に含まれる画素の数を意味しても良い。 Note that the luminance here is a value representing light and shade in a light and shade image, for example, and is a value representing the brightness of each pixel (pixel) in the image. Moreover, the area here may mean not only the numerical value of the accurate area of the region but also the number of pixels included in the region.
ここで、細胞核用閾値及び細胞核用面積閾値は、解析する対象の細胞の種類、核酸の標識に用いた染色剤の種類等を考慮して適宜設定されるものである。例えば、解析対象の細胞と同種の細胞を予め核酸染色剤を用いて染色し、核酸標識画像を取得した後、当該核酸標識画像から細胞核領域の輝度値や面積値を測定し、得られた測定値に基づいて設定することができる。 Here, the cell nucleus threshold and the cell nucleus area threshold are appropriately set in consideration of the type of cell to be analyzed, the type of stain used for labeling the nucleic acid, and the like. For example, the same type of cells as the analysis target cells are pre-stained with a nucleic acid stain to obtain a nucleic acid label image, and then the luminance value and area value of the cell nucleus region are measured from the nucleic acid label image, and the obtained measurement Can be set based on the value.
図１は、画像解析における細胞核領域の具体的な決定方法を模式的に示した図である。図１（Ａ）は１つの細胞を模式的に示した図である。図中、領域１０１は核（細胞核）を、領域１０２は細胞質を、それぞれ示している。まず、画像解析において、細胞一つ一つを自動的に識別するために、ＤＡＰＩ等の核酸染色剤で染色されたこの領域１０１、すなわち細胞核領域１０３をメインオブジェクトとして認識するような領域を設定する｛図１（Ｂ）｝。具体的には、核酸染色剤により染色された部分の面積の最大値と最小値及び蛍光強度を測定し、各画素が細胞核用閾値以上の輝度値を有する領域のうち細胞核用面積閾値以上の面積を有する領域を抽出し、細胞核領域として決定する。 FIG. 1 is a diagram schematically showing a specific method for determining a cell nucleus region in image analysis. FIG. 1A is a diagram schematically showing one cell. In the figure, a region 101 indicates a nucleus (cell nucleus), and a region 102 indicates a cytoplasm. First, in the image analysis, in order to automatically identify each cell, a region that recognizes this region 101 stained with a nucleic acid stain such as DAPI, that is, the cell nucleus region 103 as a main object is set. {FIG. 1 (B)}. Specifically, the maximum and minimum values of the area stained with the nucleic acid stain and the fluorescence intensity are measured, and the area where each pixel has a luminance value greater than or equal to the cell nucleus threshold is greater than or equal to the cell nucleus area threshold. Is extracted and determined as a cell nucleus region.
さらに、細胞密度が高く、細胞が込み合っているような場合がある場合は、領域分割を行う手法の一つとして知られているウォーターシェッド（Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ）アルゴリズム手法を用いることが好ましい。該手法は、マークと呼ばれる領域の中心を隣接画素へと広げていくことによって領域を得るものであり、この機能を同時に使用することにより、個々の細胞を認識するよう設定する｛図１（Ｃ）｝。図１（Ｃ）に示すように、２つの重なり合う細胞は、ウォーターシェッド機能を用いない場合には１つの細胞核として認識されるが｛図１（Ｃ―ａ）｝、ウォーターシェッド機能を用いることにより、２つの細胞核として認識できるようになる｛図１（Ｃ―ｂ）｝。細胞核の認識は、他にも、エッジ認識や隣接する細胞のくびれを認識されることによっても同様に行うことができる。 Furthermore, when the cell density is high and there are cases where cells are crowded, it is preferable to use the Watershed algorithm method, which is known as one of the methods for area division. This method is to obtain a region by expanding the center of a region called a mark to adjacent pixels, and by using this function at the same time, it is set to recognize individual cells {FIG. )}. As shown in FIG. 1 (C), two overlapping cells are recognized as one cell nucleus when the watershed function is not used {FIG. 1 (Ca)}, but by using the watershed function, It can be recognized as two cell nuclei {FIG. 1 (CB)}. The recognition of the cell nucleus can be similarly performed by recognizing the edge recognition and the constriction of the adjacent cell.
測定された輝度値の解析時には、画像処理の一つの方法としてローリングボールを使ったバックグランド補正を行ってもよい。また、決定された全ての細胞核領域に対して、以降の解析を行ってもよいが、核の誤認識を排除するため、細胞核領域の面積（Ａｒｅａ）と、例えば、サーキュラリティーファクターをはじめとする細胞核の形状を記述ファクター（その他、円周ペリメータ、ＭＡＸフェレット、エロンゲーションファクター等）とにより、特定の形状的特徴を備える細胞核を有する細胞集団を選択し、当該細胞集団に含まれる細胞に対してのみ以降の解析を行うことにより、ノイズを排除して解析を行うことが好ましい。 At the time of analyzing the measured luminance value, background correction using a rolling ball may be performed as one method of image processing. Further, subsequent analysis may be performed on all determined cell nucleus regions, but in order to eliminate misrecognition of nuclei, the area (Area) of the cell nucleus region and, for example, a circularity factor are included. Select a cell population having a cell nucleus with a specific shape characteristic according to a description factor (others, circumferential perimeter, MAX ferret, elongation factor, etc.) for the shape of the cell nucleus, and for cells contained in the cell population It is preferable to perform the analysis by eliminating noise by performing the subsequent analysis only.
さらに、工程（ｅ）として、解析対象である標識した構造体の、細胞核領域中における存在量、局在、形態等を測定する。具体的には、まず、工程（ｃ）において取得された各構造体の標識画像（以下、「構造体標識画像」と略記することがある。）のそれぞれに対して、核酸標識画像から決定された各細胞核領域に相当する領域に含まれる各画素の輝度値を測定する。得られた測定値を、予め決定しておいた閾値（構造体用閾値）と比較し、１画素当たりの輝度値がこの構造体用閾値以上である領域（画素の集合）を構造体染色領域として決定する。決定される構造体染色領域は、構造体の種類や細胞の状態等により異なり、１の細胞核領域中で１の領域として決定される場合もあり、複数の領域として決定される場合もある。決定された全構造体染色領域中の各画素の輝度値の統計値、全構造体染色領域の総面積、全構造体染色領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定する。なお、輝度値の統計値とは、当該領域に含まれる全画素の輝度値の合計値であってもよく、１画素当たりの平均値であってもよく、１画素当たりの最大値であってもよい。 Furthermore, as step (e), the abundance, localization, morphology, etc. of the labeled structure to be analyzed in the cell nucleus region are measured. Specifically, first, for each of the labeled images of the respective structures acquired in the step (c) (hereinafter sometimes abbreviated as “structural labeled images”), it is determined from the nucleic acid labeled images. Further, the luminance value of each pixel included in the region corresponding to each cell nucleus region is measured. The obtained measured value is compared with a predetermined threshold value (structure threshold value), and a region (a set of pixels) in which the luminance value per pixel is equal to or greater than the structure threshold value is a structure dyed region. Determine as. The structure staining region to be determined differs depending on the type of structure, the state of the cells, and the like, and may be determined as one region in one cell nucleus region or may be determined as a plurality of regions. One or more selected from the group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the determined all-structure-stained region, the total area of all-structure-stained regions, and the total perimeter of all-structure-stained regions is measured. The statistical value of the luminance value may be a total value of luminance values of all the pixels included in the region, an average value per pixel, or a maximum value per pixel. Also good.
構造体用閾値は、標識の際のノイズを排除し、標識の有無を認識するための閾値である。この閾値は、構造体の種類や標識方法に依存して変動するものであるため、構造体の種類及び標識方法の種類ごとに、それぞれ構造体用閾値を設定しておく。例えば、解析対象の細胞と同種の細胞を予め染色し、構造体標識画像を取得した後、当該標識画像から構造体領域の輝度値や面積値を測定し、得られた測定値に基づいて設定することができる。その他、例えば、構造体標識画像中の当該構造体が存在していないことが明らかな領域（バックグラウンド）の１画素当たりの輝度値やその統計値等を構造体用閾値としてもよく、経験的に取得された閾値であってもよい。 The threshold value for structure is a threshold value for eliminating the noise at the time of marking and recognizing the presence or absence of the marking. Since this threshold varies depending on the type of structure and the labeling method, a threshold for structure is set for each type of structure and type of labeling. For example, after staining a cell of the same type as the analysis target cell in advance and obtaining a structure label image, the brightness value and area value of the structure region are measured from the label image, and set based on the obtained measurement value can do. In addition, for example, a luminance value per pixel in an area (background) where the structure is clearly not present in the structure label image, a statistical value thereof, or the like may be used as the structure threshold, and is empirical. May be the threshold value acquired in
その後、工程（ｆ）として、測定された統計値に基づき、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析する。例えば、測定された統計値が、予め対照細胞を同様に処理して測定された輝度値の統計値よりも大きい場合には、解析された細胞では、対照細胞よりも当該構造体の細胞核内における存在量が多いことが分かる。 Thereafter, as step (f), based on the measured statistical value, at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and morphology of the structure in the cell is analyzed. For example, if the measured statistic is greater than the statistic of the brightness value measured in advance by treating the control cell in the same manner, the analyzed cell is more in the nucleus of the structure than the control cell. It can be seen that the abundance is large.
また、構造体染色領域（細胞核領域中の１画素当たりの輝度値が構造体用閾値以上である領域、すなわち、構造体標識画像中の標識された領域）の面積や周囲長を測定することにより、細胞核領域内における当該構造体の形態や局在を解析することができる。例えば、測定された輝度値の統計値が対照細胞とほぼ同等であるにも関わらず、測定された面積値や周囲長値が、予め対照細胞を同様に処理して測定された面積値や周囲長値よりも大きい場合には、当該構造体は、解析された細胞において、対照細胞よりも細胞核内に広く分散していることが分かる。逆に、測定された面積値や周囲長値が、対照細胞よりも小さい場合には、当該構造体は、解析された細胞において、対照細胞よりも細胞核内で凝集していることが分かる。 In addition, by measuring the area and perimeter of the structure staining region (the region in which the luminance value per pixel in the cell nucleus region is greater than or equal to the structure threshold, that is, the labeled region in the structure marker image) The morphology and localization of the structure in the cell nucleus region can be analyzed. For example, the measured area value and perimeter length value are the same as those measured in advance by treating the control cells in the same way, even though the measured brightness values are almost the same as the control cells. When it is larger than the long value, it can be seen that the structure is more widely dispersed in the cell nucleus in the analyzed cell than in the control cell. On the other hand, when the measured area value or perimeter length value is smaller than that of the control cell, it can be understood that the structure is aggregated in the cell nucleus in the analyzed cell as compared with the control cell.
本発明においては、細胞核領域に加えて、細胞質領域を決定し、解析対象である構造体の細胞核領域の存在量と細胞質領域の存在量とを比較することにより、当該構造体の細胞内における局在を解析することができる。 In the present invention, in addition to the cell nucleus region, the cytoplasmic region is determined, and the abundance of the cell nucleus region of the structure to be analyzed is compared with the abundance of the cytoplasmic region, whereby the structure of the structure in the cell is determined. The presence can be analyzed.
細胞質領域は、工程（ｄ）において決定された細胞核領域に基づいて設定することができる。具体的には、決定された細胞核領域の外周部分を内周とするドーナツ型の領域であって、ドーナツ型の幅が等間隔である（当該領域の外周上の各点から内周までの最短距離（すなわち幅）が、外周上の全ての点において等しい）領域を、細胞質領域として決定することができる。細胞質領域の作成においては、ドーナツ型の幅（細胞核領域の外周部分と内周部分との距離）を自由に設定することができる。例えば、予め、解析に用いる細胞の細胞膜と核酸を染色した染色画像を取得し、細胞核の外周から細胞膜までの距離を測定しておき、この測定値に基づいて細胞質領域の幅（厚み）を決定してもよい。また、一般的に細胞質の厚みは、細胞の種類等にかかわらずほぼ同程度であることから、細胞核領域の外周から細胞質領域の外周までの距離を１０〜３０ピクセル程度とすることもできる。 The cytoplasm region can be set based on the cell nucleus region determined in the step (d). Specifically, it is a donut-shaped region whose inner periphery is the determined outer peripheral portion of the cell nucleus region, and the donut-shaped width is equally spaced (the shortest distance from each point on the outer periphery of the region to the inner periphery) A region where the distance (ie, width) is equal at all points on the circumference can be determined as the cytoplasmic region. In creating the cytoplasmic region, the width of the donut shape (the distance between the outer peripheral portion and the inner peripheral portion of the cell nucleus region) can be freely set. For example, a stained image obtained by staining the cell membrane and nucleic acid of a cell used for analysis is acquired in advance, the distance from the outer periphery of the cell nucleus to the cell membrane is measured, and the width (thickness) of the cytoplasm region is determined based on this measurement value. May be. In general, the thickness of the cytoplasm is approximately the same regardless of the cell type and the like, so the distance from the outer periphery of the cell nucleus region to the outer periphery of the cytoplasm region can be about 10 to 30 pixels.
また、工程（ａ）において、細胞質を別途標識し、工程（ｂ）において、さらに、標識された細胞の細胞質の標識画像を取得し、取得された細胞質の標識画像に基づいて細胞質領域を決定してもよい。細胞質の標識は、撮像された画像上で、核酸や解析対象である構造体と視覚的に区別し得るように標識し得る方法であれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知のいずれの手法を用いてもよい。 Further, in the step (a), the cytoplasm is separately labeled, and in the step (b), a cytoplasmic label image of the labeled cell is further acquired, and a cytoplasm region is determined based on the acquired cytoplasmic label image. May be. The cytoplasm label is not particularly limited as long as it is a method capable of visually distinguishing from a nucleic acid or a structure to be analyzed on a captured image, and is known in the technical field. Any method may be used.
図２は、画像解析における細胞質領域の具体的な決定方法を模式的に示した図である。図中、領域１０３は細胞核領域を、領域１０２は細胞質を、領域１０４は構造体標識領域（１画素当たりの輝度値が構造体用閾値以上である領域）を、領域１０５は細胞質領域を、それぞれ示している。測定対象である構造体が細胞核外に移行している場合、図２に示すように、当該細胞の細胞質が漏れなく含まれ、かつ細胞核領域が除かれるドーナツ型の領域を、細胞質領域として設定する。 FIG. 2 is a diagram schematically showing a specific method for determining a cytoplasmic region in image analysis. In the figure, a region 103 is a cell nucleus region, a region 102 is a cytoplasm, a region 104 is a structure labeling region (a region where the luminance value per pixel is equal to or greater than a structure threshold), and a region 105 is a cytoplasmic region. Show. When the structure to be measured has moved out of the cell nucleus, as shown in FIG. 2, a donut-shaped region in which the cytoplasm of the cell is included without omission and the cell nucleus region is excluded is set as the cytoplasm region. .
また、本発明の構造体解析方法においては、さらに、下記工程（ｇ）を有することが好ましい。
（ｇ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程。
解析対象である細胞の細胞周期を判断することにより、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態と、細胞周期との相関関係を解析することができる。
Moreover, in the structure analysis method of this invention, it is preferable to have the following process (g) further.
(G) A cell including the cell nucleus region by measuring a statistical value of the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) of the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b) Determining the cell cycle.
By determining the cell cycle of the cell to be analyzed, the correlation between the abundance, localization, and morphology of the structure in the cell and the cell cycle can be analyzed.
細胞周期のＳ期には細胞核内の染色体が２ｎ本から４ｎ本となり、これがＭ期には染色体として凝集した後***し、***後の娘細胞（つまり、Ｇ０期）にはもとの２ｎ本となる。つまり、細胞周期の各期によって、ＤＮＡ含有量と凝集度（密度）が変化する。一方で、核酸をＤＮＡインターカレータ等のように、細胞内の核酸量を反映可能な染色剤によって染色した場合、細胞核内のＤＮＡ量（ｐｌｏｉｄｙ）、すなわち染色体数に依存して、細胞核は強く染色される。このため、細胞を蛍光性核酸染色剤により染色した場合に、細胞核領域の全画素の輝度値の合計値（総蛍光量）と１画素当たりの最大輝度値（最大蛍光量）から、およその細胞周期を判断することができる。すなわち、正常な細胞においては、Ｇ０／Ｇ１期の細胞（染色体数＝２ｎ）が最も総蛍光量が小さく、Ｇ２／Ｍ期の細胞（染色体数＝４ｎ）が最も総蛍光量が大きく、Ｓ期の細胞（染色体数＝２ｎ〜４ｎ）の総蛍光量は両者の間の値となる。 In the S phase of the cell cycle, the number of chromosomes in the cell nucleus is changed from 2n to 4n, and in the M phase, it aggregates as chromosomes and then divides, and the daughter cell after division (that is, the G0 phase) has 2n original chromosomes. It becomes. That is, the DNA content and the degree of aggregation (density) change depending on each phase of the cell cycle. On the other hand, when a nucleic acid is stained with a stain capable of reflecting the amount of nucleic acid in the cell, such as a DNA intercalator, the cell nucleus is strongly stained depending on the amount of DNA in the cell nucleus (ie, the number of chromosomes). Is done. For this reason, when cells are stained with a fluorescent nucleic acid stain, an approximate cell is calculated from the total luminance value (total fluorescence amount) of all pixels in the cell nucleus region and the maximum luminance value (maximum fluorescence amount) per pixel. The period can be determined. That is, in normal cells, cells in G0 / G1 phase (chromosome number = 2n) have the smallest total fluorescence amount, cells in G2 / M phase (chromosome number = 4n) have the largest total fluorescence amount, and S phase. The total fluorescence of the cells (number of chromosomes = 2n to 4n) is a value between the two.
このため、核酸標識画像中の決定された細胞核領域に含まれる全画素の総蛍光量と最大蛍光量を測定し、これらの値から、細胞周期を判断することができる。なお、細胞周期の時期ごとに、細胞核領域の総蛍光量や最大蛍光量を予め測定しておき、これを基準値として用いることにより、簡便に各細胞の細胞周期を判断することができる。 Therefore, the total fluorescence amount and the maximum fluorescence amount of all the pixels included in the determined cell nucleus region in the nucleic acid label image can be measured, and the cell cycle can be determined from these values. In addition, the cell cycle of each cell can be easily determined by measuring the total fluorescence amount and the maximum fluorescence amount of the cell nucleus region in advance for each cell cycle period and using them as reference values.
また、本発明の構造体解析方法においては、解析対象である細胞の細胞核の形態も解析することにより、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態と細胞核の形態との相関や、構造体の局在等と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することができる。本発明においては、特に、細胞核の形成が不整である（すなわち、核異型である）のかどうか、正常であるのか否かを解析することが好ましい。細胞核の形態は、癌化や老化、分化等の重要な生命現象に依存して変形する場合がある。このため、細胞核の形態は、このような生命現象の指標とすることができる。つまり、構造体の細胞内における存在量、局在、又は形態と細胞核の形態との相関を解析することにより、癌化等の生命現象と構造体の細胞内における挙動との相関を解析し得ることが期待できる。なお、ここで、細胞内挙動とは、細胞内における発現（存在）の有無、存在量、局在等を意味する。 Further, in the structure analysis method of the present invention, by analyzing the morphology of the cell nucleus of the cell to be analyzed, the abundance, localization, and morphology of the structure in the cell and the morphology of the cell nucleus, It is possible to analyze the correlation between the structure localization, the cell nucleus morphology, and the cell cycle. In the present invention, it is particularly preferable to analyze whether the formation of cell nuclei is irregular (that is, a nuclear atypia) or normal. The morphology of the cell nucleus may be deformed depending on important life phenomena such as canceration, aging and differentiation. For this reason, the morphology of the cell nucleus can be used as an indicator of such a life phenomenon. In other words, by analyzing the correlation between the abundance, localization, or morphology of the structure in the cell and the morphology of the cell nucleus, the correlation between the life phenomenon such as canceration and the behavior of the structure in the cell can be analyzed. I can expect that. Here, intracellular behavior means presence / absence, abundance, localization, etc. of expression (presence) in cells.
具体的には、工程（ａ）〜（ｇ）に加えて、さらに、下記工程（ｈ）を有することにより、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することができる。
（ｈ）前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸方周囲長からなる群より選択される１以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程。
ここで、凸包面積及び凸包周囲長は、当該領域中の各画素の任意の２要素を結ぶ閉線分を内部に含む、最小の凸多角形の面積及び周囲長として測定する。
Specifically, in addition to the steps (a) to (g), the following step (h) is further selected, so that the structure is selected from the group consisting of abundance, localization, and morphology in the cell. The correlation between at least one kind, the form of the cell nucleus, and the cell cycle can be analyzed.
(H) measuring one or more selected from the group consisting of the area of the cell nucleus region determined in the step (d), the perimeter of the cell nucleus region, the convex hull area of the cell nucleus region, and the convex perimeter, A step of analyzing the morphology of a cell nucleus including a cell nucleus region.
Here, the convex hull area and the convex hull perimeter are measured as the area and perimeter of the smallest convex polygon that includes a closed line segment connecting any two elements of each pixel in the region.
細胞核の形態は、画像解析において、オブジェクトの形態を解析する際に用いられる種々のパラメータを用いることにより解析することができる。このようなパラメータとして、例えば、（ｐ）細胞核領域の凸包面積／細胞核領域の面積、（ｑ）（細胞核領域の周囲長）２／細胞核領域の面積、（ｒ）細胞核領域の凸包周囲長／細胞核領域の周囲長等が挙げられる。 The morphology of the cell nucleus can be analyzed by using various parameters used when analyzing the morphology of the object in image analysis. Examples of such parameters include (p) the convex hull area of the cell nucleus region / the area of the cell nucleus region, (q) (peripheral length of the cell nucleus region) 2 / area of the cell nucleus region, and (r) the convex hull circumference of the cell nucleus region. / Peripheral length of the cell nucleus region.
本発明においては、細胞核領域を決定した後、当該領域の周囲長、面積、真円度、当該領域の平均輝度値（当該領域中の各画素の輝度値の平均値）、当該領域の最大輝度値（当該領域中の各画素の輝度値の最大値）といったパラメータを、それぞれ単独で又は組み合わせることにより解析を行うことができるため、様々な方向から細胞核の異型を観察することが可能である。また、標識の強度（輝度値、染色の場合には染色強度）のみならず、形態からも解析を行うため、細胞核の微妙な変化や時間的変化も解析することができる。 In the present invention, after determining the cell nucleus region, the perimeter of the region, the area, the roundness, the average luminance value of the region (the average value of the luminance value of each pixel in the region), the maximum luminance of the region Since analysis such as a value (maximum value of luminance value of each pixel in the region) can be performed individually or in combination, it is possible to observe atypical cell nuclei from various directions. Further, since analysis is performed not only from the intensity of the label (brightness value, staining intensity in the case of staining) but also from the form, subtle changes and temporal changes of the cell nucleus can be analyzed.
このように、本発明の構造体解析方法により、核膜や核内構造体等の構造体の細胞内、特に細胞核内における存在量、局在、形態等を解析することができる。また、細胞周期や細胞核の形態の解析と組み合わせることにより、解析対象である構造体の発現量の増減や形態、細胞核外への移行の有無等が、細胞周期や細胞核異型と相関性があるか否かを、簡便かつ高精度に解析することができる。具体的には、本発明の構造体解析方法を利用することにより、核小体の増加、例えばリボゾームの生合成の亢進（高い***能）や、ＰＭＬボディの低形成、傍核小体コンパートメントの出現等のような核内構造体の存在量の増減と、細胞周期や細胞核の形態との相関を解析することができる。また、細胞核のサイズ（大きさ）の相違や、染色体異常（***異常）、ゲノムＤＮＡの低メチル化、ゲノムＤＮＡの低メチル化やヘテロクロマチンの変化等のクロマチンの不均一化、細胞極性と分化の異常等の核の位置異常等を解析し得る。 As described above, the structure analysis method of the present invention can analyze the abundance, localization, morphology, etc. of a structure such as a nuclear membrane or a nuclear structure in a cell, particularly in the cell nucleus. Also, by combining with analysis of the cell cycle and cell morphology, whether the expression level of the structure to be analyzed is increased or decreased, whether it is transferred to the outside of the cell nucleus, etc. Whether or not can be analyzed easily and with high accuracy. Specifically, by using the structure analysis method of the present invention, an increase in nucleolus, for example, enhanced ribosome biosynthesis (high mitotic ability), low formation of PML bodies, paranuclear compartment It is possible to analyze the correlation between the increase / decrease in the abundance of nuclear structures such as appearance and the cell cycle and the morphology of the cell nucleus. In addition, differences in cell nucleus size, chromosomal abnormalities (mitotic abnormalities), genomic DNA hypomethylation, genomic DNA hypomethylation and heterochromatin changes, heterogeneous chromatin, cell polarity and differentiation It is possible to analyze nuclear position abnormalities such as abnormalities.
本発明の構造体解析方法を、生細胞を用いて行い、解析対象である構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態を、経時的に測定し解析することにより、当該構造体の細胞内挙動の時間変化をも解析することができる。 The structure analysis method of the present invention is performed using living cells, and the abundance, localization, and morphology of the structure to be analyzed in the cell are measured and analyzed over time. Time changes in intracellular behavior can also be analyzed.
構造体のうち、核膜を標識して解析する場合には、細胞核領域に加えて核膜領域を決定し、この核膜領域を解析することにより、核膜の状態と細胞周期との相関関係を解析することができる。具体的には、下記工程（ａ２）〜（ｇ２）を有する。
（ａ２）核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、
（ｂ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
（ｃ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、
（ｄ２−１）前記工程（ｂ２）において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
（ｄ２−２）前記工程（ｄ２−１）において決定された細胞核領域及び前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像中の、前記工程（ｄ２−２）において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程。
In the structure, when the nuclear membrane is labeled and analyzed, the nuclear membrane region is determined in addition to the nuclear region, and the nuclear membrane region is analyzed to correlate the nuclear membrane state with the cell cycle. Can be analyzed. Specifically, the following steps (a2) to (g2) are included.
(A2) a step of labeling the nuclear membrane and the nucleic acid in the cell nucleus, respectively
(B2) obtaining a labeled image of the nucleic acid of the cell labeled in the step (a2);
(C2) obtaining a labeled image of the nuclear membrane of the cell labeled in the step (a2);
(D2-1) determining a nucleus region in each cell based on the nucleic acid label image obtained in the step (b2);
(D2-2) determining the nuclear membrane region in each cell based on the nuclear region determined in the step (d2-1) and the labeled nuclear membrane image obtained in the step (c2);
(E2) a step of measuring a statistical value of a luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region determined in the step (d2-2) in the nuclear membrane labeled image obtained in the step (c2); ,
(F2) A step of analyzing a cell nucleus morphology or a nuclear membrane state of a cell including the nuclear membrane region based on the statistical value measured in the step (e2).
工程（ａ２）〜（ｄ２−１）は、前述の核内構造体を標識した場合と同様に行うことができる。 Steps (a2) to (d2-1) can be performed in the same manner as in the case of labeling the aforementioned nuclear structure.
工程（ｄ２−２）における核膜領域の決定は、具体的には、決定された細胞核領域を中心とし、当該領域の外周部分を含む等間隔のドーナツ型の領域を核膜領域として決定することができる。核膜領域の作成においては、細胞核領域の外周（最外線）からの、核膜領域の最内線（ドーナツ型の内周）までの距離及び最外線（ドーナツ型の外周）までの距離を自由に設定することができる。例えば、予め、解析に用いる細胞の核膜を染色した染色画像を取得し、核膜の厚みを測定しておき、この測定値に基づいて核膜領域の幅（厚み）を決定してもよい。また、一般的に核膜の厚みは、細胞の種類等にかかわらずほぼ同程度であることから、細胞核領域の外周から核膜領域の最内線までの距離を１〜５ピクセル、細胞核領域の外周から核膜領域の最外線までの距離を１〜５ピクセルとすることもできる。 Specifically, the determination of the nuclear envelope region in the step (d2-2) is to determine, as the nuclear envelope region, an equidistant donut-shaped region including the outer peripheral portion of the region centered on the determined nuclear region. Can do. In creating the nuclear envelope region, the distance from the outer periphery (outermost line) of the cell nucleus region to the innermost line (doughnut-shaped inner periphery) and outermost line (doughnut-shaped outer periphery) of the nuclear envelope region can be freely set Can be set. For example, a stained image obtained by staining the nuclear membrane of cells used for analysis may be acquired in advance, the thickness of the nuclear membrane may be measured, and the width (thickness) of the nuclear membrane region may be determined based on this measurement value. . In general, the thickness of the nuclear membrane is almost the same regardless of the cell type, etc., so the distance from the outer periphery of the cell nuclear region to the innermost line of the nuclear membrane region is 1 to 5 pixels, the outer periphery of the cell nuclear region The distance from the outermost line of the nuclear membrane region to 1 to 5 pixels can also be set.
また、核膜領域の決定において、決定された細胞核領域を中心とし、当該領域の外周部分を含む等間隔のドーナツ型の領域を核膜領域として決定する際に、このドーナツ型の領域内に、核膜標識画像中の標識された領域（例えば、蛍光画像の場合には、蛍光強度が検出された画素からなる領域）が含まれるように核膜領域を決定することが好ましい。 Further, in the determination of the nuclear envelope region, when determining the equally spaced donut-shaped region including the outer peripheral portion of the region as the nuclear membrane region with the determined cell nuclear region as the center, in this donut-shaped region, It is preferable to determine the nuclear envelope region so as to include a labeled region in the nuclear envelope labeled image (for example, in the case of a fluorescent image, a region composed of pixels in which fluorescence intensity is detected).
図３に、細胞核領域に基づいて核膜領域を決定する方法を模式的に示す。図中、領域１０３は細胞核領域を、領域１０２は細胞質を、領域１０６は核膜標識画像中の標識された領域を、領域１０７は核膜領域を、それぞれ示している。 FIG. 3 schematically shows a method for determining the nuclear envelope region based on the cell nuclear region. In the figure, a region 103 indicates a cell nucleus region, a region 102 indicates a cytoplasm, a region 106 indicates a labeled region in a nuclear membrane label image, and a region 107 indicates a nuclear membrane region.
ここで、核膜標識画像中の標識された領域は、例えば、予め閾値（核膜用閾値）を設定しておき、核膜標識画像中に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値がこの核膜用閾値以上である領域（画素の集合）を抽出することにより決定することができる。核膜用閾値は、前記の構造体用閾値の一種であり、標識の際のノイズを排除し、標識の有無を認識するための閾値である。この閾値は、核膜の標識方法に依存して変動するものであるため、標識方法の種類ごとに、それぞれ核膜用閾値を設定しておく。例えば、核膜に特異的に局在するタンパク質を免疫染色することにより核膜を標識する場合には、当該タンパク質が発現していないことが既知の細胞や、ノックダウン処理等により当該タンパク質の発現を抑制した細胞を用いて、当該タンパク質の免疫染色を行い、測定された核膜の輝度値の統計値等を閾値とすることができる。その他、核膜標識画像中の核膜が存在していないことが明らかな領域（バックグラウンド）の１画素当たりの輝度値やその統計値等を核膜用閾値としてもよく、経験的に取得された閾値であってもよい。 Here, for the labeled region in the nuclear envelope labeling image, for example, a threshold value (nuclear membrane threshold value) is set in advance, the luminance value of each pixel included in the nuclear membrane labeling image is measured, and one pixel It can be determined by extracting a region (a set of pixels) in which the hit luminance value is equal to or greater than the nuclear membrane threshold. The nuclear membrane threshold value is a kind of the threshold value for the structure, and is a threshold value for eliminating the noise at the time of labeling and recognizing the presence or absence of the label. Since this threshold value varies depending on the labeling method of the nuclear membrane, a nuclear membrane threshold value is set for each type of labeling method. For example, when the nuclear membrane is labeled by immunostaining a protein that specifically localizes to the nuclear membrane, the protein is expressed by knockdown treatment or cells that are known not to express the protein. Immunostaining of the protein is performed using the cells in which the suppression is performed, and the measured statistical value of the brightness value of the nuclear membrane can be used as a threshold value. In addition, a luminance value per pixel in a region (background) where the nuclear membrane is clearly not present in the nuclear membrane label image, a statistical value thereof, or the like may be used as the nuclear membrane threshold value, which is acquired empirically. It may be a threshold value.
その他、核膜領域は、工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像のみに基づいて決定することもできる。具体的には、核膜標識画像中に含まれる各画素の輝度値を測定し、各画素が核膜用閾値以上の輝度値を有する一塊の領域をメインオブジェクトとして認識する。このオブジェクト中の各画素の輝度値の勾配から、当該オブジェクトの境界を分離し、当該境界から一定距離、一定輝度を有する画素からなる領域を核膜領域と設定する。 In addition, the nuclear membrane region can also be determined based only on the labeled image of the nuclear membrane acquired in step (c2). Specifically, the luminance value of each pixel included in the nuclear envelope labeling image is measured, and a lump area where each pixel has a luminance value equal to or higher than the nuclear membrane threshold is recognized as the main object. The boundary of the object is separated from the gradient of the luminance value of each pixel in the object, and an area composed of pixels having a certain distance and a certain luminance from the boundary is set as a nuclear membrane area.
図４は、核膜の染色画像に基づいて核膜領域を決定する方法を模式的に示した図である。図中、領域１０１は細胞核を、領域１０６は核膜標識画像中の標識された領域を、それぞれ示している。当該領域１０６に基づき、核膜領域１０７が決定される。 FIG. 4 is a diagram schematically showing a method for determining a nuclear membrane region based on a nuclear membrane staining image. In the figure, a region 101 indicates a cell nucleus, and a region 106 indicates a labeled region in the nuclear envelope labeled image. Based on the region 106, the nuclear membrane region 107 is determined.
次いで、工程（ｅ２）として、工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像中の、工程（ｄ２−２）において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する。輝度値の統計値の測定方法は、前述の工程（ｅ）と同様にして行うことができる。核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値としては、例えば、平均輝度値や最大輝度値等が挙げられる。 Next, as the step (e2), the statistical value of the brightness value of each pixel included in the nuclear membrane region determined in the step (d2-2) in the labeled image of the nuclear membrane acquired in the step (c2) is measured. To do. The method for measuring the statistical value of the luminance value can be performed in the same manner as in the step (e) described above. Examples of the statistical value of the luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region include an average luminance value and a maximum luminance value.
さらに、工程（ｆ２）として、工程（ｅ２）において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する。例えば、平均輝度値、平均輝度値と最大輝度値との組み合わせ、又は〔核膜領域に含まれる各画素の輝度値／細胞核領域に含まれる各画素の輝度値〕等から、細胞核の形態や核膜の状態を解析することができる。なお、核膜の状態とは、核膜の形態に加えて、核膜が正常に形成されているか、又は形成異常であるかどうか、そもそも形成されていない（不形成）かどうか等を判断することができる。例えば、核膜領域の平均輝度値が小さい場合や、〔核膜領域に含まれる各画素の輝度値／細胞核領域に含まれる各画素の輝度値〕が小さい場合には、核膜が形成不全である、又は不形成であると判断することができる。また、最大輝度値が極端に大きい場合、核膜が形成異常であり、核膜構成要素が偏重していると判断することができる。 Furthermore, as the step (f2), based on the statistical value measured in the step (e2), the morphology of the cell nucleus or the state of the nuclear membrane of the cell including the nuclear membrane region is analyzed. For example, from the average luminance value, the combination of the average luminance value and the maximum luminance value, or [the luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region / the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region], etc. The state of the film can be analyzed. In addition to the form of the nuclear membrane, the state of the nuclear membrane determines whether the nuclear membrane is formed normally, whether it is abnormally formed, or not formed (not formed) in the first place. be able to. For example, when the average luminance value of the nuclear membrane region is small, or when [the luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region / the luminance value of each pixel included in the cell nuclear region] is small, the nuclear membrane is incompletely formed. It can be determined that it is present or not formed. Further, when the maximum luminance value is extremely large, it can be determined that the nuclear membrane is abnormally formed and the nuclear membrane components are biased.
さらに、核内構造体の解析と同様に、細胞周期や細胞核の形態の解析と組み合わせることにより、核膜の形態、形成異常や不形成の有無等が、細胞周期や細胞核異型と相関性があるか否かを、簡便かつ高精度に解析することができる。 Furthermore, similar to the analysis of nuclear structures, by combining with the analysis of the cell cycle and the morphology of the cell nucleus, the morphology of the nuclear membrane, the presence or absence of dysplasia or non-formation, etc. correlate with the cell cycle and the nuclear atypia Whether or not can be analyzed easily and with high accuracy.
＜細胞核の形態の解析方法＞
前述したように、核酸標識画像に基づいて細胞核領域を決定した場合、この細胞核領域のみから、細胞核の形態を解析することができる。具体的には、下記工程を行うことにより、細胞核の形態を解析することができる。
（ａ３）細胞核内の核酸を標識する工程と、
（ｂ３）前記工程（ａ３）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
（ｄ３）前記工程（ｂ３）において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
（ｈ３）前記工程（ｄ３）において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される１以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程。
<Method of analyzing cell morphology>
As described above, when the cell nucleus region is determined based on the nucleic acid label image, the morphology of the cell nucleus can be analyzed only from this cell nucleus region. Specifically, the morphology of the cell nucleus can be analyzed by performing the following steps.
(A3) a step of labeling nucleic acid in the cell nucleus;
(B3) obtaining a labeled image of the nucleic acid of the cell labeled in the step (a3);
(D3) determining a nucleus region in each cell based on the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b3);
(H3) measuring one or more selected from the group consisting of the area of the cell nucleus region determined in the step (d3), the perimeter of the cell nucleus region, the convex hull area of the cell nucleus region, and the convex hull perimeter, A step of analyzing the morphology of a cell nucleus including a cell nucleus region.
工程（ａ３）、（ｂ３）、（ｄ３）、及び（ｈ３）は、それぞれ、前述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｈ）と同様に行うことができる。 Steps (a3), (b3), (d3), and (h3) can be performed in the same manner as steps (a), (b), (d), and (h), respectively.
＜細胞画像解析装置＞
本発明において、工程（ａ）〜（ｃ）以外の工程は、これらの工程を実現可能な一の画像解析装置を用いて解析することができる。例えば、画像解析の分野において一般的に用いられている公知の画像解析装置又はこれを適宜改変した装置を用いることにより、解析することができる。細胞画像解析装置１は、パーソナルコンピュータやワークステーション等の情報処理装置を用いて構成されても良いし、顕微鏡などに組み込まれた専用装置として構成されても良い。例えば、顕微鏡やＣＣＤカメラ等の細胞画像の撮像手段をさらに備える画像解析装置を用いることにより、工程（ａ）以外の全工程を、一の装置を用いて行うこともできる。
<Cell image analyzer>
In the present invention, steps other than steps (a) to (c) can be analyzed using one image analysis apparatus capable of realizing these steps. For example, the analysis can be performed by using a known image analysis device generally used in the field of image analysis or a device obtained by appropriately modifying the same. The cell image analysis apparatus 1 may be configured using an information processing apparatus such as a personal computer or a workstation, or may be configured as a dedicated apparatus incorporated in a microscope or the like. For example, by using an image analysis apparatus that further includes a cell image capturing means such as a microscope or a CCD camera, all the processes other than the process (a) can be performed using one apparatus.
図５（Ａ）は、このような細胞画像解析装置の一実施形態である細胞画像解析装置１の機能構成を表す概略ブロック図である。細胞画像解析装置１は、光源２、ＣＣＤカメラ３、カメラコントローラ４、ステージコントローラ５、結像光学系６、パーソナルコンピュータ（図中、「ＰＣ」）７、ＰＣモニタ８、及びキーボード９を備える。 FIG. 5A is a schematic block diagram showing a functional configuration of a cell image analysis apparatus 1 which is an embodiment of such a cell image analysis apparatus. The cell image analysis apparatus 1 includes a light source 2, a CCD camera 3, a camera controller 4, a stage controller 5, an imaging optical system 6, a personal computer (“PC” in the figure) 7, a PC monitor 8, and a keyboard 9.
ステージコントローラ５は、スライドガラスやマルチウェルプレート等の画像を取得する細胞が含まれている細胞観察用容器が設置されたステージを制御する。光源２は、標識した細胞の画像を取得するために、ステージコントローラ５により制御されたステージに設置された細胞観察用容器中の細胞に、所望の波長の光を照射する。 The stage controller 5 controls a stage on which a cell observation container including cells for acquiring images such as a slide glass and a multiwell plate is installed. The light source 2 irradiates the cells in the cell observation container placed on the stage controlled by the stage controller 5 with light having a desired wavelength in order to acquire an image of the labeled cells.
結像光学系６は、動作制御を指示するソフトウェアを介してフォーカス位置を自動で調整する。また、ＣＣＤカメラ３は、当該細胞観察用容器中の細胞の画像を取得し、カメラコントローラ４は、ＣＣＤカメラ３を制御する。パーソナルコンピュータ７は、光源２、ＣＣＤカメラ３、カメラコントローラ４、ステージコントローラ５、結像光学系６の動作制御を指示するソフトウェアを有している。 The imaging optical system 6 automatically adjusts the focus position via software that instructs operation control. The CCD camera 3 acquires an image of cells in the cell observation container, and the camera controller 4 controls the CCD camera 3. The personal computer 7 has software that instructs operation control of the light source 2, the CCD camera 3, the camera controller 4, the stage controller 5, and the imaging optical system 6.
また、パーソナルコンピュータ７は、ＣＣＤカメラ３により撮像された細胞の標識画像に基づいて、画素当たりの輝度値を測定し、当該測定結果に基づき、細胞核領域を決定したり、各構造体の構造体染色領域を決定したりする。さらに、構造体標識画像中の決定された細胞核領域及び構造体染色領域に基づき、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定する。かつ、工程（ｅ）の結果に基づき、構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析する。すなわち、前記工程（ｅ）〜（ｆ）における解析は、パーソナルコンピュータ７において行われる。さらに、パーソナルコンピュータ７は、得られた結果を保存し、測定及び解析結果を出力することもできる。解析結果等は、画像出力装置に文字又はグラフなどの図形として表示させることによって出力しても良いし、プリンターに印字させることによって出力しても良い。 Further, the personal computer 7 measures the luminance value per pixel based on the labeled image of the cell imaged by the CCD camera 3, and determines the cell nucleus region based on the measurement result, or the structure of each structure. To determine the staining area. Furthermore, based on the determined cell nucleus region and the structure staining region in the structure label image, a group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the region, the total area of the region, and the total perimeter of the region Measure one or more selected. And based on the result of a process (e), at least 1 sort (s) selected from the group which consists of the abundance, localization, and form in a cell of a structure is analyzed. That is, the analysis in the steps (e) to (f) is performed in the personal computer 7. Furthermore, the personal computer 7 can store the obtained results and output the measurement and analysis results. The analysis result or the like may be output by being displayed as a graphic such as a character or a graph on the image output device, or may be output by being printed by a printer.
ＰＣモニタ８やキーボード９は、パーソナルコンピュータ７の操作に用いられる。ＰＣモニタ８は、ＣＣＤカメラ３により撮像された細胞の標識画像やパーソナルコンピュータ７から出力される結果等を表示するための画像出力装置としても用いられる。 The PC monitor 8 and the keyboard 9 are used for operating the personal computer 7. The PC monitor 8 is also used as an image output device for displaying a labeled image of a cell imaged by the CCD camera 3, a result output from the personal computer 7, and the like.
また、図５（Ｂ）は、細胞画像解析装置１の動作例を表すフローチャートである。当該フローチャートでは、構造体として核内構造体を標識した例を示す。まず、ステップ１として、核膜と核酸をそれぞれ標識した細胞の、核内構造体の標識画像（核内構造体標識画像）と核酸の標識画像（核酸標識画像）とを、それぞれ別個に撮像する。具体的には、まず、細胞観察用容器を、細胞画像解析装置１のステージに設置し、ステージコントローラ５により、適当な位置にセットする。次いで、当該細胞観察用容器中の細胞に対して光源２から標識に応じた光を照射し、結像光学系６によりフォーカス調整を行い、ＣＣＤカメラ３により、各標識画像を撮像する。 FIG. 5B is a flowchart showing an operation example of the cell image analysis apparatus 1. The flowchart shows an example in which a nuclear structure is labeled as a structure. First, as Step 1, the labeled images of the nuclear structures (nuclear structure labeled images) and the nucleic acid labeled images (nucleic acid labeled images) of the cells labeled with the nuclear membrane and the nucleic acid, respectively, are separately imaged. . Specifically, first, the cell observation container is set on the stage of the cell image analysis apparatus 1, and is set at an appropriate position by the stage controller 5. Next, the light in the cell observation container is irradiated with light corresponding to the label from the light source 2, the focus is adjusted by the imaging optical system 6, and each labeled image is captured by the CCD camera 3.
次に、ステップ２として、パーソナルコンピュータ７において、核酸標識画像に基づき、細胞核領域を決定する。さらに、ステップ３として、同じくパーソナルコンピュータ７において、核内構造体標識画像に基づき、決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域を核内構造体標識領域として検出する。同様に、核酸標識画像に基づき、前述した方法により、核膜領域を検出する。その後、ステップ４として、核酸標識画像に基づき、前述した方法により、細胞質領域を検出する。なお、ステップ４は省略し、ステップ３から直接ステップ５を行っても良い。 Next, as step 2, in the personal computer 7, a cell nucleus region is determined based on the nucleic acid label image. Further, as step 3, the personal computer 7 also measures the luminance value of each pixel included in the determined cell nucleus region based on the intranuclear structure marker image, and the luminance value per pixel is equal to or greater than the threshold value. Alternatively, a plurality of regions are determined, and the regions are detected as nuclear structure labeling regions. Similarly, the nuclear envelope region is detected by the method described above based on the nucleic acid label image. Thereafter, in step 4, based on the nucleic acid label image, a cytoplasmic region is detected by the method described above. Note that step 4 may be omitted, and step 5 may be performed directly from step 3.
次いで、ステップ５として、ステップ２〜４において検出された各領域、特に細胞核領域中における核内構造体の存在量、局在、形態等を測定し、これらを示すパラメータの数値等を特徴量として抽出する。具体的には、ステップ３において決定された核内構造体標識領域中の各画素の輝度値の統計値、当該核内構造体標識領域の総面積、及び当該核内構造体標識領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定し、測定された統計値を、標識された核内構造体の特徴量として抽出する。 Next, in step 5, the abundance, localization, morphology, etc. of the nuclear structure in each region detected in steps 2-4, particularly in the cell nucleus region, are measured, and the numerical values of the parameters indicating these are used as feature amounts. Extract. Specifically, the statistical value of the luminance value of each pixel in the nuclear structure labeling area determined in step 3, the total area of the nuclear structure labeling area, and the total circumference of the nuclear structure labeling area One or more selected from the group consisting of the length is measured, and the measured statistical value is extracted as a feature quantity of the labeled nuclear structure.
最後に、ステップ６として、ステップ５で得られた特徴量に基づき、核内構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析し、結果を出力する。 Finally, as Step 6, based on the feature amount obtained in Step 5, at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and morphology of the nuclear structure in the cell is analyzed, and the result is Output.
上述した本発明の細胞画像解析装置の一態様である細胞画像解析装置１の機能をコンピュータで実現するようにしても良い。その場合、各機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現しても良い。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでも良い。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。 You may make it implement | achieve the function of the cell image analyzer 1 which is the one aspect | mode of the cell image analyzer of this invention mentioned above with a computer. In that case, a program for realizing each function may be recorded on a computer-readable recording medium, and the program recorded on the recording medium may be read into a computer system and executed. Here, the “computer system” includes an OS and hardware such as peripheral devices. The “computer-readable recording medium” refers to a storage device such as a flexible medium, a magneto-optical disk, a portable medium such as a ROM and a CD-ROM, and a hard disk incorporated in a computer system. Furthermore, the “computer-readable recording medium” dynamically holds a program for a short time like a communication line when transmitting a program via a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line. In this case, a volatile memory inside a computer system serving as a server or a client in that case may be included and a program that holds a program for a certain period of time. The program may be a program for realizing a part of the functions described above, and may be a program capable of realizing the functions described above in combination with a program already recorded in a computer system.
本発明の構造体解析方法は、このような細胞画像解析装置と、細胞画像を取得するための顕微鏡部及び撮像部、並びに撮像された画像を蓄積し記録する画像記録部とを備える、イメージングサイトメータを用いて行うことが好ましい。なお、本発明においてイメージングサイトメータとは、自動的に染色画像の取得と得られた染色画像の解析を行うことができる画像解析装置を意味する。例えば、スライドガラス上の細胞集団に対して、レーザを収束させたスポットで走査し、この細胞集団の個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理することにより、個々の細胞のデータを抽出して測定するレーザ走査型サイトメータ（例えば、特開平３−２５５３６５号公報参照。）やこれを適宜改良したサイトメータ等が挙げられる。 The structure analysis method of the present invention includes such a cell image analysis apparatus, a microscope unit and an imaging unit for acquiring a cell image, and an image recording unit for accumulating and recording the captured images. It is preferable to use a meter. In the present invention, the imaging cytometer means an image analysis apparatus capable of automatically acquiring a stained image and analyzing the obtained stained image. For example, a cell population on a glass slide is scanned with a laser focused spot, the fluorescence emitted by individual cells of this cell population is detected, and the scanned image data is image-processed. Examples thereof include a laser scanning cytometer that extracts and measures data (for example, see JP-A-3-255365), a cytometer obtained by appropriately improving the cytometer, and the like.
特に、取得された顕微鏡画像に基づき得られた解析データから、顕微鏡画像の画像データを呼び出す手段を有するイメージングサイトメータを用いることが好ましい。各解析データ、例えば、細胞核領域、細胞周期判定用画像の輝度値の統計値等のデータに対して画像データを迅速に確認することができるため、より信頼性の高い診断結果を得ることができるためである。また、解析結果をヒストグラムやドットプロットにより表示する手段を有していることが好ましい。本発明においては、ドットプロット表示がより望ましい。ドットプロット表示では、個々の細胞が１つ１つのドットとして表示されるため、解析結果をドットプロット表示することにより、個々の細胞情報を画像とともに瞬時に確認できる利点がある。 In particular, it is preferable to use an imaging cytometer having means for calling up image data of a microscope image from analysis data obtained based on the acquired microscope image. Since image data can be quickly confirmed with respect to each analysis data, for example, data such as a cell nucleus region and a brightness value statistical value of a cell cycle determination image, a more reliable diagnosis result can be obtained. Because. Moreover, it is preferable to have a means for displaying the analysis result by a histogram or dot plot. In the present invention, dot plot display is more desirable. In the dot plot display, each cell is displayed as a single dot. Therefore, there is an advantage that the individual cell information can be confirmed instantaneously together with the image by displaying the analysis result in the dot plot display.
また、本発明における標識画像の解析に、イメージングサイトメータを用いることにより、細胞核に加えて、構造体、核膜構造体や核膜の発現量に加えて、これらの位置情報、時間情報、形態情報をも得ることができる。すなわち、核内構造体の形状や細胞内においての局在、核異型及び核膜の有無や形状、時間的変化等から、ターゲットとする核内構造体や核異型、核膜を精度よくスループット解析することができる。特に、イメージングサイトメータを用いることにより、細胞が個々になっていない場合でも、ソフトウェア上で細胞個々を判断したり、解析対象を、画像を見ながら判断することができる。これらに基づき、様々な情報や画像の再確認等を行うことができ、精度の高い解析を行うことができる。また、様々な解析を組み合わせることで核異型と細胞の係わり合いも解析することが可能である。 In addition, by using an imaging cytometer for analysis of the labeled image in the present invention, in addition to cell nuclei, in addition to the expression level of structures, nuclear membrane structures and nuclear membranes, these positional information, time information, and morphology Information can also be obtained. In other words, throughput analysis of the target nuclear structure, nuclear variant, and nuclear membrane with high accuracy based on the shape of the nuclear structure, localization in the cell, presence / absence and shape of the nuclear variant and nuclear membrane, temporal changes, etc. can do. In particular, by using an imaging cytometer, even when cells are not individual, it is possible to determine individual cells on the software, or to determine an analysis target while viewing an image. Based on these, various information and images can be reconfirmed, and a highly accurate analysis can be performed. It is also possible to analyze the relationship between nuclear variants and cells by combining various analyses.
さらに、標識画像の撮影から解析までの一連の工程を全て自動で行うことができるため、１視野ずつ細胞を探すことなく撮影し解析することができる。つまり、目視により解析対象とする細胞を探した後に撮像する場合よりも、細胞を長時間露光することなく観察、評価することができるため、細胞へのダメージも最小限にとどめ、精度の高い評価が可能である。 Furthermore, since a series of steps from the photographing of the labeled image to the analysis can be performed automatically, it is possible to photograph and analyze each field of view without looking for cells. In other words, it is possible to observe and evaluate cells without exposing them for a long time, compared with the case of imaging after looking for cells to be analyzed by visual inspection. Is possible.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］
核スペックルに特異的に局在するＳＣ３５を免疫染色することにより、核スペックルを標識し、正常及び変異細胞群における核スペックルの形態を定量解析した。核膜孔複合体構成タンパク質で、細胞核内構造体の形成に関与するＲａｎＢＰ２（ＲＡＮ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）が減弱したＨｅＬａ細胞を変異細胞として用いた。
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種後、ＲａｎＢＰ２、及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ（ＧＬ３）を標的としたｓｉＲＮＡ (日本バイオサービス社製)をＲＮＡｉＭＡＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でトランスフェクションしノックダウン処理を行い、７２時間培養した。各細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温１５分間固定処理した後、ＰＢＳで３回洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で氷上５分間浸透処理した。その後、各ウェルに対して、０．５％のＮＧＳ(Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ)で３回洗浄・ブロッキング操作を行った後、一次抗体として抗ＳＣ３５抗体（ｍｏｕｓｅ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、カタログ番号：５５６３６３）及び抗ＲａｎＢＰ２抗体（Ｒａｂｂｉｔ、九州大学西本毅治教授より供与）を０．２％のＢＳＡで希釈した溶液を添加し、１時間インキュベートした。さらに０．２％のＮＧＳで３回洗浄を行った後、二次抗体としてｃｙ３標識抗ｍｏｕｓｅ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：７１５−１６５−１５１）及びＡｌｅｘａ４８８標識抗Ｒａｂｂｉｔ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：Ａ１１０３４）を０．２％のＮＧＳで希釈した溶液を添加し、１時間インキュベートすることにより、細胞中のＳＣ３５及びＲａｎＢＰ２を標識（ラベル化）した。ラベル化した細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した後、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ−ＰＢＳ溶液中で５分間インキュベートし、核酸を染色した。ＰＢＳで１回洗浄後、ウェル中にＰＢＳを満たした状態で撮像を行った。核酸標識画像（以下、「ＤＡＰＩ染色画像」）、核スペックル標識画像（以下、「Ｃｙ３（ＳＣ３５）染色画像」）、及び核膜標識画像（以下、「Ａｌｅｘａ４８８（ＲａｎＢＰ２）染色画像」）は、ＣＥＬＡＶＩＥＷ（オリンパス社製）を使用し、２０倍対物レンズを用いて撮像し、ＣＥＬＡＶＩＥＷ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔ（オリンパス社製）を用いて解析を行った。各標識画像を図６に示す。図中、「Ｃｏｎｔｏｒｏｌ」がＲａｎＢＰ２ノックダウン未処理細胞を、「Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ」がＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞を、それぞれ示す。
[Example 1]
The nuclear speckle was labeled by immunostaining SC35 specifically localized to the nuclear speckle, and the morphology of the nuclear speckle in normal and mutant cell groups was quantitatively analyzed. A HeLa cell, which is a nuclear pore complex constituent protein and in which RanBP2 (RAN binding protein 2) involved in the formation of a structure in the cell nucleus is attenuated, was used as a mutant cell.
After seeding HeLa cells in a 96-well plate, RanBP2 and, as a control, siRNA (manufactured by Nihon Bioservices) targeting firefly luciferase (GL3) were transfected with RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) and knocked down, 72 Incubate for hours. Each cell was washed once with PBS, fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 15 minutes at room temperature, then washed 3 times with PBS, and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes on ice. Thereafter, each well was washed and blocked three times with 0.5% NGS (Normal Goat Serum), and then anti-SC35 antibody (mouse, manufactured by BD Pharmingen, catalog number: 556363) as a primary antibody. A solution of anti-RanBP2 antibody (Rabbit, provided by Professor Koji Nishimoto, Kyushu University) diluted with 0.2% BSA was added and incubated for 1 hour. Further, after washing three times with 0.2% NGS, cy3 labeled anti-mouse antibody (manufactured by Jackson ImmunoResearch Laboratories, catalog number: 715-165-151) and Alexa488 labeled anti-Rabbit antibody (Invitrogen) were used as secondary antibodies. Manufactured by Cat. No. A11034) diluted with 0.2% NGS and incubated for 1 hour to label (label) SC35 and RanBP2 in the cells. The labeled cells were washed once with PBS and then incubated in 1 μg / ml DAPI-PBS solution for 5 minutes to stain the nucleic acid. After washing once with PBS, imaging was performed with wells filled with PBS. Nucleic acid labeling images (hereinafter “DAPI stained images”), nuclear speckle labeled images (hereinafter “Cy3 (SC35) stained images”), and nuclear membrane labeled images (hereinafter “Alexa488 (RanBP2) stained images”) are: Using CELAVIEW (manufactured by Olympus), images were taken using a 20 × objective lens, and analysis was performed using CELAVIEW Analysis Software (manufactured by Olympus). Each marker image is shown in FIG. In the figure, “Control” indicates RanBP2 knockdown-untreated cells, and “Knockdown” indicates RanBP2 knockdown-treated cells.
まず、ＤＡＰＩ染色画像に基づき、細胞核をメインオブジェクトとして設定し、予め定めておいた蛍光強度の閾値により細胞核領域を決定し、その形態を認識させた。図７は、決定された細胞核領域を含む細胞（ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞とコントロール細胞の両方を含む）に対して、細胞核領域の面積（Ａｒｅａ；横軸）とサーキュラリティーファクター（Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ；縦軸）とをパラメータとして２次元に展開した図である。図中、実線で囲った領域（エリア１）に含まれる細胞を、以下の解析対象とする細胞集団として選択した。 First, based on a DAPI-stained image, a cell nucleus was set as a main object, a cell nucleus region was determined based on a predetermined threshold value of fluorescence intensity, and its form was recognized. FIG. 7 shows the area of the nuclear region (Area; horizontal axis) and the circularity factor (circularity factor; vertical axis) for cells containing the determined nuclear region (including both RanBP2 knockdown treated cells and control cells). ) Are two-dimensionally developed as parameters. In the figure, cells included in a region (area 1) surrounded by a solid line were selected as the following cell population to be analyzed.
エリア１の細胞集団の各細胞に対して、１画素当たりの最大輝度値（Ｍａｘ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＤＡＰＩ；縦軸）と細胞核領域の全画素の輝度値の合計値（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＤＡＰＩ；横軸）をパラメータとして２次元に展開し（図８）、各細胞の細胞周期を決定した。エリア２をＧ１期の細胞、エリア３をＧ２期の細胞、エリア４を異数体細胞（ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）、エリア５をＭ期の細胞群として、それぞれ分類した。 For each cell of the cell population of area 1, the maximum luminance value per pixel (Max Intensity DAPI; vertical axis) and the total value of the luminance values of all pixels in the cell nucleus region (Total Intensity DAPI; horizontal axis) are used as parameters. Expanded in two dimensions (FIG. 8), the cell cycle of each cell was determined. Area 2 was classified as G1 cell, area 3 as G2 cell, area 4 as aneuploidy, and area 5 as M phase cell group.
次に、決定された細胞核領域を中心とし、当該領域の外郭（外周部分）から２ピクセル内側を内側開始地点とする幅４ピクセルのドーナツ型の領域を核膜領域として設定し、Ａｌｅｘａ４８８（ＲａｎＢＰ２）染色画像から、核膜に発現しているＲａｎＢＰ２を解析した。ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞とコントロール細胞群の各細胞に対して核膜領域を決定し、ＲａｎＢＰ２の平均蛍光強度（核膜領域内の１画素当たりの平均蛍光強度：Ｍｅａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＲａｎＢＰ２）を求め、細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）に対してプロットした。プロットした結果を図９に示す。図９（Ａ）がＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞群の結果であり、図９（Ｂ）がコントロール細胞群の結果である。ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞群では、コントロール細胞群よりも、細胞分布のピークが、ＲａｎＢＰ２の平均蛍光強度が低い方にシフトしていた。そこで、ＲａｎＢＰ２が核膜に存在しているか否かを決定する閾値（図中の矢印）を決定し、ＲａｎＢＰ２の発現が抑制された細胞集団をゲーティングした。その結果、ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞では、９５％以上の細胞においてＲａｎＢＰ２の発現が抑制されていることが分かった。 Next, a doughnut-shaped region having a width of 4 pixels with the determined cell nucleus region as the center and an inner start point 2 pixels inside from the outline (peripheral portion) of the region is set as a nuclear membrane region, and Alexa 488 (RanBP2) From the stained image, RanBP2 expressed in the nuclear membrane was analyzed. The nuclear membrane region is determined for each cell of the RanBP2 knockdown-treated cell and the control cell group, and the average fluorescence intensity of RanBP2 (average fluorescence intensity per pixel in the nuclear membrane region: Mean Intensity RanBP2) is determined. Plotted against (Counts). The plotted results are shown in FIG. FIG. 9A shows the results of the RanBP2 knockdown treated cell group, and FIG. 9B shows the results of the control cell group. In the RanBP2 knockdown treated cell group, the peak of cell distribution was shifted to the lower average fluorescence intensity of RanBP2 than in the control cell group. Therefore, a threshold value (arrow in the figure) for determining whether or not RanBP2 is present in the nuclear membrane was determined, and a cell population in which RanBP2 expression was suppressed was gated. As a result, it was found that the expression of RanBP2 was suppressed in 95% or more of RanBP2 knockdown-treated cells.
さらに、決定された細胞核領域を中心とし、当該領域の外郭（外周部分）を内側開始地点とする幅３０ピクセルのドーナツ型の領域を細胞質領域として設定し、Ｃｙ３（ＳＣ３５）染色画像から、細胞核領域（つまり細胞核内）に存在する核スペックル量と、細胞質領域（つまり細胞核外）に存在する核スペックル量とを、それぞれ解析した。具体的には、エリア１の細胞集団の各細胞に対して細胞質領域を決定し、各細胞の細胞核領域と細胞質領域とのそれぞれの領域に対して、各領域内におけるＣｙ３（ＳＣ３５）の平均蛍光強度（領域内の１画素当たりの平均蛍光強度）を測定し、ＳＣ３５が細胞核内と細胞核外のいずれに存在しているのかを解析した。図１０は、ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞（Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）とノックダウン未処理のコントロール細胞（Ｃｏｎｔｏｒｏｌ）のそれぞれにおける、ＳＣ３５が細胞核内に存在していた細胞の割合と、細胞核外に存在していた細胞の割合を示した図である。この結果、コントロール細胞では、細胞核外にＳＣ３５（核スペックル）が存在する細胞はほぼ観察されなかったが、ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞では、３０％前後の細胞において、ＳＣ３５が細胞核外に局在していた。また、各細胞の細胞周期ごと（Ｇ０Ｇ１期、Ｇ２期、及びａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）に分類したところ、図１１に示すように、ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞において、ｓｃ３５（核スペックル）が細胞核外に局在する細胞は、Ｇ０Ｇ１期の細胞である割合が高かった。 Furthermore, a donut-shaped region having a width of 30 pixels centering on the determined cell nucleus region and having the outer outline (peripheral portion) of the region as an inner start point is set as a cytoplasm region, and from the Cy3 (SC35) stained image, In other words, the amount of nuclear speckle present in (inside the cell nucleus) and the amount of nuclear speckle present in the cytoplasmic region (that is, outside the cell nucleus) were analyzed. Specifically, a cytoplasmic region is determined for each cell of the cell population of area 1, and the average fluorescence of Cy3 (SC35) in each region is determined for each of the nucleus region and the cytoplasmic region of each cell. The intensity (average fluorescence intensity per pixel in the region) was measured, and it was analyzed whether SC35 was present inside or outside the cell nucleus. FIG. 10 shows the ratio of the cells in which SC35 was present in the cell nucleus in the RanBP2 knockdown-treated cells (Knockdown) and the control cells (Control) that had not been knocked down, It is the figure which showed the ratio. As a result, in the control cells, almost no cells having SC35 (nuclear speckle) were observed outside the cell nucleus, but in the RanBP2 knockdown-treated cells, SC35 was localized outside the cell nucleus in about 30% of the cells. It was. Further, when the cells were classified according to the cell cycle (G0G1, G2, and aneuploidy) of each cell, as shown in FIG. 11, sc35 (nuclear speckle) is localized outside the cell nucleus in the RanBP2 knockdown treated cells. A high percentage of cells were in the G0G1 phase.
実施例１の結果から、本発明の構造体解析方法を用いることにより、核内構造体の形態、核膜の状態、さらに細胞周期との複合的な相関を簡便に解析し得ることが明らかである。 From the results of Example 1, it is clear that by using the structure analysis method of the present invention, it is possible to easily analyze the form of the nuclear structure, the state of the nuclear membrane, and the complex correlation with the cell cycle. is there.
［実施例２］（参考例）
カハールボディに特異的に局在しているｃｏｉｌｉｎを免疫染色することにより、細胞中のカハールボディを標識し、細胞内における存在量や局在等を解析した。解析対象とする細胞としては、実施例１と同様に、ＲａｎＢＰ２及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ（ＧＬ３）を標的とするｓｉＲＮＡでノックダウン処理したＨｅＬａ細胞を用いた。
具体的には、ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍ細胞培養ディッシュ中に設置したカバースリップ上に播種後、ＲａｎＢＰ２、及びコントロールとしてホタルルシフェラーゼ（ＧＬ３）を標的としたｓｉＲＮＡ (日本バイオサービス社製)をＲＮＡｉＭＡＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でトランスフェクションしノックダウン処理を行い、７２時間培養した。各細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温１５分間固定処理した後、ＰＢＳで３回洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で氷上５分間浸透処理した。その後、各ウェルに対して、０．５％のＮＧＳ(Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ)で３回洗浄・ブロッキング操作を行った後、一次抗体として抗ｃｏｉｌｉｎ抗体（ｍｏｕｓｅ、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：６１２０７４）を用い、二次抗体として抗ｃｙ３標識抗ｍｏｕｓｅ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：７１５−１６５−１５１）を用いて実施例１と同様に細胞をラベル化した。その後ＰＢＳで１回洗浄した後、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ−ＰＢＳ溶液中で５分間インキュベートし、核酸を染色した。ラベル化した細胞が付着したカバースリップを８０％グリセロール−ＤＡＢＣＯ（１，４−ｄｉａｃｏｂｉｃｙｃｌｏ−［２，２，２］−ｏｃｔａｎｅ）溶液中で封入し、蛍光顕微鏡ＩＸ−７１（オリンパス社製）で撮像を行った。画像取得には２０倍対物レンズ、ＣＣＤカメラＣ４７４２−９５−１２ＥＲＧ（浜松ホトニクス社製）及び画像取得ソフトウェアＬｕｉｍｉｎａ ｖｉｓｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４（三谷商事）を用いた。核酸標識画像（以下、「ＤＡＰＩ染色画像」）及びカハールボディ標識画像（以下、「Ｃｙ３（ｃｏｉｌｉｎ）染色画像」）について、ＴＩＦＦフォーマットにて保存した画像を、ＣＥＬＡＶＩＥＷ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔ（オリンパス社製）を用いて解析を行った。各標識画像を図１２に示す。図中、「Ｃｏｎｔｏｒｏｌ」及び「Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ」は図６と同様である。この結果、ｃｏｉｌｉｎは、未処理細胞では細胞核内に点状の像を示し、ＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞では細胞核全体に斑状の像を示した。
[Example 2] (Reference Example)
By immunostaining the coilin specifically localized in the Kahal body, the Kahal body in the cell was labeled, and the abundance and localization in the cell were analyzed. As the cells to be analyzed, HeLa cells knocked down with siRNA targeting RanBP2 and firefly luciferase (GL3) as a control were used as in Example 1.
Specifically, after seeding HeLa cells on a coverslip placed in a 35 mm cell culture dish, RNAiMAX (manufactured by Nihon Bioservices) was used to target RanBP2 and firefly luciferase (GL3) as a control RNAiMAX (Invitrogen) Manufactured) and knocked down, and cultured for 72 hours. Each cell was washed once with PBS, fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 15 minutes at room temperature, then washed 3 times with PBS, and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes on ice. Thereafter, each well was washed and blocked with 0.5% NGS (Normal Goat Serum) three times, and then anti-coilin antibody (mouse, manufactured by BD Transduction Laboratories, catalog number: 612074) as a primary antibody. ) And an anti-cy3 labeled anti-mouse antibody (manufactured by Jackson Immuno Research Laboratories, catalog number: 715-165-151) as a secondary antibody, the cells were labeled in the same manner as in Example 1. Thereafter, the plate was washed once with PBS and incubated in a 1 μg / ml DAPI-PBS solution for 5 minutes to stain the nucleic acid. Coverslip with labeled cells attached is sealed in 80% glycerol-DABCO (1,4-diacoticcyclo- [2,2,2] -octane) solution and imaged with fluorescence microscope IX-71 (Olympus) Went. For image acquisition, a 20 × objective lens, a CCD camera C4742-95-12ERG (manufactured by Hamamatsu Photonics) and image acquisition software Lumina version Version 2.4 (Mitani Corporation) were used. For the nucleic acid label image (hereinafter referred to as “DAPI-stained image”) and the Kahal body label image (hereinafter referred to as “Cy3 (coilin) -stained image”), an image stored in the TIFF format was used using CELAVIEW Analysis Soft (manufactured by Olympus). Analysis. Each marker image is shown in FIG. In the figure, “Control” and “Knockdown” are the same as those in FIG. As a result, coilin showed a dot-like image in the cell nucleus in untreated cells, and a patchy image in the whole cell nucleus in RanBP2 knockdown-treated cells.
まず、実施例１と同様にして、ＤＡＰＩ染色画像に基づき、各細胞の細胞核領域を決定し、その形態を認識させた。
次に、各細胞の細胞核領域内に存在するカハールボディの形状を、面積を指標として解析した。具体的には、各細胞の細胞核領域内中の、１画素当たりのＣｙ３（ｃｏｉｌｉｎ）の蛍光強度が予め定められた閾値以上である画素数を、Ｃｙ３（ｃｏｉｌｉｎ）が局在する構造体（カハールボディ）の総面積とした。図１３は、各細胞の細胞核領域に存在するカハールボディの総面積（Ａｒｅａ ｃｏｉｌｉｎ）を横軸とし、各面積の細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を縦軸として示した図である。この結果、ＲａｎＢＰ２ノックダウン細胞とコントロール細胞とでは、カハールボディの総面積に顕著な差があることが確認された。すなわち、総面積を指標とした画像解析により、撮像された標識画像と同様に、構造体の形状の差を解析し得ることが明らかとなった。
First, as in Example 1, the nucleus region of each cell was determined based on the DAPI-stained image, and its form was recognized.
Next, the shape of the Kahal body existing in the nucleus region of each cell was analyzed using the area as an index. Specifically, the number of pixels in which the fluorescence intensity of Cy3 (coilin) per pixel is greater than or equal to a predetermined threshold in the cell nucleus region of each cell is expressed as a structure (Cajal) where Cy3 (coilin) is localized. The total area of the body). FIG. 13 is a diagram in which the total area (Area coil) of the Kahal body existing in the cell nucleus region of each cell is shown on the horizontal axis, and the number of cells (Counts) in each area is shown on the vertical axis. As a result, it was confirmed that there was a significant difference in the total area of the Kahal body between RanBP2 knockdown cells and control cells. That is, it has been clarified that the difference in the shape of the structure can be analyzed by the image analysis using the total area as an index in the same manner as the captured marker image.
［実施例３］（参考例）
細胞核領域の形態から、各細胞の細胞核の形態を解析した。解析対象とする細胞としては、実施例１と同様に、ＲａｎＢＰ２ノックダウン、及びコントロールＨｅＬａ細胞を用いた。細胞の培養、ラベル化と撮像は、一次抗体として抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（ｍｏｕｓｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、カタログ番号：ｓｃ−７２９２）、二次抗体としてＣｙ３標識抗ｍｏｕｓｅ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、社製、カタログ番号：７１５−１６５−１５１）を使用した以外は実施例２と同様である。各標識画像を図１４に示す。図中、「Ｃｏｎｔｏｒｏｌ」及び「Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ」は図６と同様である。
[Example 3] (Reference Example)
From the morphology of the cell nucleus region, the morphology of the cell nucleus of each cell was analyzed. As cells to be analyzed, RanBP2 knockdown and control HeLa cells were used as in Example 1. Cell culture, labeling and imaging are performed using anti-LaminA / C antibody (mouse, manufactured by Santa Cruz, catalog number: sc-7292) as the primary antibody, and Cy3-labeled anti-mouse antibody (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) as the secondary antibody. And catalog number: 715-165-151). Each sign image is shown in FIG. In the figure, “Control” and “Knockdown” are the same as those in FIG.
実施例１と同様にして、ＤＡＰＩ染色画像に基づき、各細胞の細胞核領域を決定し、その形態を認識させた。次いで、この決定された細胞核領域の面積（細胞核面積）、周囲長（細胞核周囲長）、凸包の面積（凸包面積）、及び凸包の周囲長（凸包周囲長）をそれぞれ測定し、（ｐ）細胞核領域の凸包面積／細胞核領域の面積、（ｑ）（細胞核領域の周囲長）２／細胞核領域の面積、（ｒ）細胞核領域の凸包周囲長／細胞核領域の周囲長を算出した。図１５は、各細胞の〔（細胞核領域の周囲長）２／細胞核領域の面積〕（Ｐｅｒｉｘ２／Ａｒｅａ）を横軸とし、細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を縦軸として分布を示した図であり、図１６は、各細胞の〔細胞核領域の凸包面積／細胞核領域の面積〕（ＣｏｎｖｅｘＨｕｌｌＲｅｌａｔｉｖｅ＿Ａｒｅａ）を横軸とし、細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を縦軸として分布を示した図であり、図１７は、各細胞の〔細胞核領域の凸包周囲長／細胞核領域の周囲長〕（ＣｏｎｖｅｘＨｕｌｌＲｅｌａｔｉｖｅ）を横軸とし、細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を縦軸として分布を示した図である。各図のうち、（Ａ）がＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞群の結果であり、（Ｂ）がコントロール細胞群の結果である。また、（Ｃ）は、図（Ａ）中の括弧で示した細胞群中の細胞のＤＡＰＩ染色画像である。 In the same manner as in Example 1, the nucleus region of each cell was determined based on the DAPI-stained image, and its morphology was recognized. Next, the area of the determined cell nucleus region (cell nucleus area), circumference (cell nucleus circumference), convex hull area (convex hull area), and convex hull circumference (convex hull circumference) are respectively measured. (P) Convex hull area of cell nucleus region / area of cell nucleus region, (q) (peripheral length of cell nucleus region) 2 / area of cell nucleus region, (r) convex hull circumference of cell nucleus region / peripheral length of cell nucleus region did. FIG. 15 is a diagram showing the distribution of each cell with [(peripheral length of the cell nucleus region) 2 / area of the cell nucleus region] (Peri x 2 / Area) as the horizontal axis and the number of cells (Counts) as the vertical axis. FIG. 16 is a diagram showing the distribution of each cell with [convex hull area of cell nucleus region / area of cell nucleus region] (ConvexHullRelative_Area) as the horizontal axis and the number of cells (Counts) as the vertical axis, and FIG. It is the figure which showed distribution by making [horizontal axis of convex hull circumference of cell nucleus area | region] (ConvexHullRelativate) of each cell into a horizontal axis | shaft, and the number of cells (Counts) as a vertical axis | shaft. In each figure, (A) shows the result of the RanBP2 knockdown treated cell group, and (B) shows the result of the control cell group. (C) is a DAPI-stained image of cells in the cell group indicated by parentheses in FIG.
次に、細胞核の形態を、核膜領域に存在するＬａｍｉｎＡ／Ｃ量に基づいて解析した。具体的には、決定された細胞核領域を中心とし、当該領域の外郭（外周部分）から３ピクセル内側を内側開始地点とする幅６ピクセルのドーナツ型の領域を核膜領域として設定し、Ｃｙ３（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ）染色画像に基づいて、決定された各核膜領域内におけるＣｙ３（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ）の平均蛍光強度（領域内の１画素当たりの平均蛍光強度）を測定した。図１８は、各細胞の〔核膜領域内におけるＣｙ３（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ）の平均蛍光強度〕（Ｍｅａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｃｙ３）を横軸とし、細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を縦軸として分布を示した図である。図１８（Ａ）がＲａｎＢＰ２ノックダウン処理細胞群の結果であり、図１８（Ｂ）がコントロール細胞群の結果である。また、図１８（Ｃ）は、図１８（Ａ）中の括弧で示した細胞群中の細胞のＣｙ３（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ）染色画像である。 Next, the morphology of the cell nucleus was analyzed based on the amount of Lamin A / C present in the nuclear membrane region. Specifically, a donut-shaped region having a width of 6 pixels and having an inner start point 3 pixels inside from the outline (peripheral portion) of the determined cell nucleus region is set as a nuclear membrane region, and Cy3 ( Based on the Lamin A / C) stained image, the average fluorescence intensity of Cy3 (Lamin A / C) in each determined nuclear membrane region (average fluorescence intensity per pixel in the region) was measured. FIG. 18 is a diagram showing the distribution of each cell with [average fluorescence intensity of Cy3 (Lamin A / C) in the nuclear membrane region] (Mean Intensity Cy3) as the horizontal axis and the number of cells (Counts) as the vertical axis. . FIG. 18 (A) shows the results of the RanBP2 knockdown treated cell group, and FIG. 18 (B) shows the results of the control cell group. FIG. 18C is a Cy3 (Lamin A / C) -stained image of cells in the cell group indicated by parentheses in FIG.
これらの結果から、ＲａｎＢＰ２ノックダウン細胞では、細胞核膜の形態が変形した核異型となることが分かった。本手法は癌組織などで見られる核膜の不整の定量解析に応用が可能である。また、本発明の構造体解析方法を用いることにより、細胞核の形態と核膜の状態との相関を簡便に解析し得ることが明らかである。 From these results, it was found that in the RanBP2 knockdown cell, a nuclear variant with a deformed cell nuclear membrane was formed. This method can be applied to quantitative analysis of nuclear membrane irregularities found in cancer tissues. It is also clear that the correlation between the morphology of the cell nucleus and the state of the nuclear membrane can be easily analyzed by using the structure analysis method of the present invention.
本発明の構造体解析方法を用いることにより、核内構造体や核膜の細胞内挙動、具体的には、核内構造体の細胞内における存在量や局在、細胞核の形態、並びに核膜の形成異常や不形成の有無を、イメージング解析により簡便かつ高精度に解析することができるため、試験試料の形態学的情報から疾患の診断及び治療に対するモニタリングのような医学的実施への応用において有用となり得るため、学術的分野のみならず、臨床検査等の分野においても利用が可能である。 By using the structure analysis method of the present invention, the intracellular behavior of the nuclear structure and nuclear membrane, specifically, the abundance and localization of the nuclear structure in the cell, the morphology of the cell nucleus, and the nuclear membrane The presence or absence of dysplasia or non-formation can be easily and accurately analyzed by imaging analysis, so it can be applied to medical practice such as monitoring of disease diagnosis and treatment from morphological information of test samples. Since it can be useful, it can be used not only in the academic field, but also in fields such as clinical examinations.
１…細胞画像解析装置１、２…光源、３…ＣＣＤカメラ、４…カメラコントローラ、５…ステージコントローラ、６…結像光学系、７…パーソナルコンピュータ、８…ＰＣモニタ、９…キーボード、１０１…核、１０２…細胞質、１０３…細胞核領域、１０４…構造体標識領域、１０５…細胞質領域、１０６…核膜標識画像中の標識された領域、１０７…核膜領域。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Cell image analyzer 1, 2 ... Light source, 3 ... CCD camera, 4 ... Camera controller, 5 ... Stage controller, 6 ... Imaging optical system, 7 ... Personal computer, 8 ... PC monitor, 9 ... Keyboard, 101 ... Nucleus, 102 ... cytoplasm, 103 ... cell nucleus region, 104 ... structure labeling region, 105 ... cytoplasm region, 106 ... labeled region in the nuclear membrane labeling image, 107 ... nuclear membrane region.
Claims (10)
（ａ）細胞核を構成する１種類又は複数種類の構造体（ただし、核小体を除く。）と細胞核内の核酸とをそれぞれ標識する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）において標識された細胞の、前記構造体の標識画像を、標識された構造体の種類ごとに別個に取得する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像に基づいて、細胞核領域を決定する工程と、
（ｅ）前記工程（ｃ）において取得された前記構造体の標識画像中の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）において測定された統計値に基づき、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種を解析する工程と、
（ｇ）前記工程（ｂ）において取得された核酸の標識画像の、前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、
を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法。 A method for analyzing a structure constituting a cell nucleus,
(A) a step of labeling one or more types of structures (excluding nucleolus) constituting the cell nucleus and nucleic acids in the cell nucleus,
(B) obtaining a nucleic acid labeled image of the cell labeled in the step (a);
(C) obtaining a labeled image of the structure of the cell labeled in the step (a) separately for each type of labeled structure;
(D) determining a nuclear region based on the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b);
(E) Measuring the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) in the labeled image of the structure acquired in the step (c), and calculating the luminance value per pixel Determining one or more regions having a threshold equal to or greater than a threshold, and selecting one or more selected from the group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the region, the total area of the region, and the total perimeter of the region Measuring process;
(F) analyzing at least one selected from the group consisting of the abundance, localization and morphology of the structure based on the statistical value measured in the step (e);
(G) A cell including the cell nucleus region by measuring a statistical value of the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d) of the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b) Determining the cell cycle of
A structure constituting a cell nucleus, characterized by analyzing a correlation between a cell cycle and at least one selected from the group consisting of abundance, localization, and morphology of the structure in a cell Analysis method.
前記工程（ｄ）において、さらに、決定された細胞核領域に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、
前記工程（ｅ）において、さらに、前記工程（ｃ）において取得された前記構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 The structure is an intranuclear structure;
In the step (d), a cytoplasmic region in each cell is further determined based on the determined nucleus region,
In the step (e), a statistical value of a luminance value of each pixel included in the cytoplasm region in the labeled image of the structure acquired in the step (c) is further measured. Item 4. A method for analyzing a structure constituting the cell nucleus according to any one of Items 1 to 3.
前記工程（ａ）において、さらに、細胞質を標識し、
前記工程（ｂ）において、さらに、前記工程（ａ）において標識された細胞の、細胞質の標識画像を取得し、
前記工程（ｄ）において、さらに、取得された細胞質の標識画像に基づいて、各細胞における細胞質領域を決定し、
前記工程（ｅ）において、さらに、前記工程（ｃ）において取得された前記核内構造体の標識画像中の、前記細胞質領域に含まれる各画素の輝度値を測定し、１画素当たりの輝度値が閾値以上である１又は複数の領域を決定し、当該領域中の各画素の輝度値の統計値、当該領域の総面積、及び当該領域の総周囲長からなる群より選択される１以上を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 The structure is an intranuclear structure;
In the step (a), the cytoplasm is further labeled,
In the step (b), a cytoplasmic labeling image of the cell labeled in the step (a) is further obtained,
In the step (d), a cytoplasmic region in each cell is further determined based on the acquired cytoplasmic label image.
In the step (e), the luminance value of each pixel included in the cytoplasm region in the labeled image of the intranuclear structure obtained in the step (c) is further measured. Determining one or more regions having a threshold equal to or greater than a threshold, and selecting one or more selected from the group consisting of the statistical value of the luminance value of each pixel in the region, the total area of the region, and the total perimeter of the region The method for analyzing a structure constituting a cell nucleus according to any one of claims 1 to 3, wherein the structure is measured.
（ｈ）前記工程（ｄ）において決定された細胞核領域の面積、当該細胞核領域の周囲長、当該細胞核領域の凸包面積及び凸包周囲長からなる群より選択される１以上を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞核の形態を解析する工程と、
を有し、前記構造体の細胞内における存在量、局在、及び形態からなる群より選択される少なくとも１種と細胞核の形態と細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞核を構成する構造体の解析方法。 further,
(H) measuring one or more selected from the group consisting of the area of the cell nucleus region determined in the step (d), the perimeter of the cell nucleus region, the convex hull area of the cell nucleus region and the convex hull perimeter, Analyzing the morphology of the cell nucleus including the cell nucleus region;
And analyzing the correlation between the form of the cell nucleus and the cell cycle, and at least one selected from the group consisting of the abundance, localization, and form of the structure in the cell. The analysis method of the structure which comprises the cell nucleus as described in any one of 1-5.
（ａ２）核膜と細胞核内の核酸とを、それぞれ標識する工程と、
（ｂ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核酸の標識画像を取得する工程と、
（ｃ２）前記工程（ａ２）において標識された細胞の、核膜の標識画像を取得する工程と、
（ｄ２−１）前記工程（ｂ２）において取得された核酸の標識画像に基づいて、各細胞における細胞核領域を決定する工程と、
（ｄ２−２）前記工程（ｄ２−１）において決定された細胞核領域及び前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像に基づいて、各細胞における核膜領域を決定する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｃ２）において取得された核膜の標識画像中の、前記工程（ｄ２−２）において決定された核膜領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定する工程と、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）において測定された統計値に基づき、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態を解析する工程と、
（ｇ２）前記工程（ｂ２）において取得された核酸の標識画像中の、前記工程（ｄ２−１）において決定された細胞核領域に含まれる各画素の輝度値の統計値を測定し、当該細胞核領域を含む細胞の細胞周期を判断する工程と、
を有し、前記核膜領域を含む細胞の細胞核の形態又は核膜の状態と、細胞周期との相関関係を解析することを特徴とする細胞核を構成する構造体の解析方法。 A method for analyzing a structure constituting a cell nucleus (excluding a nucleolus),
(A2) a step of labeling the nuclear membrane and the nucleic acid in the cell nucleus, respectively
(B2) obtaining a labeled image of the nucleic acid of the cell labeled in the step (a2);
(C2) obtaining a labeled image of the nuclear membrane of the cell labeled in the step (a2);
(D2-1) determining a nucleus region in each cell based on the nucleic acid label image obtained in the step (b2);
(D2-2) determining the nuclear membrane region in each cell based on the nuclear region determined in the step (d2-1) and the labeled nuclear membrane image obtained in the step (c2);
(E2) a step of measuring a statistical value of a luminance value of each pixel included in the nuclear membrane region determined in the step (d2-2) in the nuclear membrane labeled image obtained in the step (c2); ,
(F2) based on the statistical value measured in the step (e2), analyzing the form of the cell nucleus of the cell containing the nuclear membrane region or the state of the nuclear membrane;
(G2) The statistical value of the luminance value of each pixel included in the cell nucleus region determined in the step (d2-1) in the labeled image of the nucleic acid obtained in the step (b2) is measured, and the cell nucleus region Determining the cell cycle of a cell comprising:
And analyzing the correlation between the cell nucleus morphology and nuclear membrane state of the cell containing the nuclear membrane region and the cell cycle, and a method for analyzing a structure constituting the cell nucleus.
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