JP2018533939A - Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法 - Google Patents

Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法 Download PDF

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Abstract

Ｒａｓアンタゴニストを選択するための組成物、反応混合物、変異体Ｒａｓタンパク質、キット、基材およびシステム、ならびにそれらを使用する方法が、本明細書中に提供される。本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、変異体Ｒａｓ（ここで、その変異体Ｒａｓは、システイン変異を含む）；競合プローブおよび試験化合物を含み；変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合を検出する工程；試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓと競合プローブとの結合を比較する工程を含み；ここで、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少は、試験化合物のＲａｓアンタゴニスト活性を示す。

Description

相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１５年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２４３，４３９号に対する優先権を主張し、これは、その全体が本明細書に参考として援用される。
発明の背景
ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳおよびＮＲＡＳなどのＲａｓタンパク質における変異は、結腸直腸がん、肺がん、甲状腺がんおよび卵巣がんを含むがこれらに限定されないヒト悪性腫瘍に存在する共通の発癌性変異である。Ｒａｓ、特にＫＲＡＳは、原発性がんを引き起こすタンパク質として３０年超にわたって周知であったが、Ｒａｓ変異体腫瘍に対する有効な処置は、現在のところ利用可能ではない。製薬業界は、Ｒａｓ阻害剤およびＲａｓ経路阻害剤の開発に巨額の資金を投資してきたが、これまで、ある程度の成功しか収めていない。最近、Ｒａｓ下流のシグナル伝達に関わるキナーゼ（例えば、ＲＡＦキナーゼおよびＭＥＫキナーゼ）を標的化する薬物が承認された。しかしながら、これらの場合でさえ、Ｒａｓ変異体腫瘍における有効性は、まだ実証されていない。
Ｒａｓを直接標的化することは、複数の試みが失敗したことおよびこのタンパク質がドラッガブル結合ポケットを欠いているという認識に起因して、長年、実現不可能であるとみなされてきた。Ｒａｓの結晶構造は、概して、明らかに深い結合ポケットが無いことと一致するが、このタンパク質のいくつかの部分は、非常にフレキシブルであり（スイッチ領域）、小分子薬物との結合にとって好ましいコンフォーメーションをとり得る。潜在的な直接的なＲａｓ阻害剤を同定するために化学的空間を徹底的に探索することは、現在まで、スクリーニングに適したロバストなハイスループットアッセイが無いことによって部分的に妨げられてきた。直接的なＲａｓ阻害剤を同定するために使用されるアッセイは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、または比較的ロースループットのＲａｓ機能アッセイ（例えば、ヌクレオチド交換またはエフェクター結合）と併用されるコンピュータによるスクリーニングもしくはデザインの組み合わせのいずれかに依拠してきた。これらの方法は、大きな化合物ライブラリーを偏りなくスクリーニングすることを可能にしない。さらに、特にＮＭＲおよび他の偏りのない結合アッセイの場合、典型的には、その結合事象がＲａｓ活性の阻害をもたらすかどうかを決定するために各ヒット分子または各ヒットクラスに対して著しい努力が為される。
発明の要旨
Ｒａｓの機能を変化させると知られている部位におけるＲａｓへの結合剤を同定するために適合するハイスループットスクリーニング方法が非常に必要とされている。本開示は、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットなどにおけるＲａｓ結合のロバストかつハイスループット照会を可能にするアッセイストラテジーを提供し、他の利点も同様に提供する。このポケットは、Ｒａｓの機能を生化学的にかつ細胞において阻害すると示されている（例えば、Ｏｓｔｒｅｍ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｕ．；Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．；Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３，５０３，５４８−５５１（この全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。それらのアッセイは、Ｒａｓの任意のアイソフォーム（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳおよびＮＲＡＳ）における優勢な発癌性変異に適用できる。以前のＲａｓ結合アッセイとは異なり、本明細書中に記載される方法は、小分子によって標的化可能であってＲａｓの機能に影響すると示されたＲａｓ上の特異的な部位（例えば、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケット）への結合の直接的な基準を提供する。その方法は、実行の容易さ、その処理能力、およびその方法が間接的な作用（例えば、Ｒａｓエフェクターへの結合またはタンパク質複合体界面への結合）を有する化合物からヒットを示す確率が非常に低い直接的なＲａｓバインダーを特異的に同定できるという事実のため、インビトロ機能アッセイ（例えば、ヌクレオチド交換、エフェクター結合）を超える利点も示す。本開示は、高特異性かつ高感度でＲａｓアンタゴニストを選択するための方法、組成物、反応混合物、変異体Ｒａｓタンパク質、キット、基材およびシステムを提供する。本開示に記載のＲａｓアンタゴニストの選択は、処理能力および効率が有意に高い。
１つの態様において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）反応混合物中で、変異体Ｒａｓ、競合プローブおよび試験化合物を合わせる工程；および（ｂ）該試験化合物の非存在下における該変異体Ｒａｓへの該競合プローブの結合と比べたときの、該変異体Ｒａｓと該競合プローブとの間の結合の減少を検出する工程を含み、ここで：（ｉ）該変異体Ｒａｓは、システイン変異を含み；（ｉｉ）該競合プローブは、該変異体Ｒａｓに結合して共有結合的に修飾することができ；（ｉｉｉ）該変異体Ｒａｓと該競合プローブとの間の該結合の減少は、該試験化合物のＲａｓアンタゴニスト活性を示す。いくつかの実施形態において、前記競合プローブは、前記変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、前記競合プローブは、前記システイン変異のシステイン残基と反応することによって、前記変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができる。いくつかの実施形態において、競合プローブは、表２または表３における化合物から選択される。いくつかの実施形態において、競合プローブは、ＣＰ−００１、ＣＰ−００２、ＣＰ−００３、ＣＰ−００４、ＣＰ−００５、ＣＰ−００６、ＣＰ−００７、ＣＰ−００８、ＣＰ−００９、ＣＰ−０１０、ＣＰ−０１１、ＣＰ−０１２、ＣＰ−０１３、ＣＰ−０１４、ＣＰ−０１５、ＣＰ−０１６、ＣＰ−０１７、ＣＰ−０１８、ＣＰ−０１９、ＣＰ−０２０およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しない。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在する。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在し、前記変異体Ｒａｓは、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、非保存アミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に対する変異である。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＥ６２Ｃ；ＭＲＡＳのＥ７２Ｃ；ＥＲＡＳのＡ１００Ｃ；ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＥ７３Ｃ；ＲＩＴ１のＡ８０Ｃ）、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＤ９２Ｃ；ＭＲＡＳのＨ１０２Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３０Ｃ；ＲＲＡＳ２のＥ１０３Ｃ；ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＡ１０３Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１０Ｃ）、または最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９５位（例えば、ＫＲＡＳのＨ９５Ｃ；ＨＲＡＳのＱ９５Ｃ；ＮＲＡＳのＬ９５Ｃ；ＭＲＡＳのＲ１０５Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３３Ｃ；ＲＲＡＳ２のＫ１０６Ｃ；ＲＡＬＡのＤ１０６Ｃ；ＲＡＬＢのＥ１０６Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１３Ｃ）に存在する。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、変異体Ｒａｓサブファミリータンパク質である。いくつかの実施形態において、前記Ｒａｓは、Ｒａｓサブファミリータンパク質である。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記Ｒａｓは、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む、請求項１に記載の方法。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、試験化合物は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化学結合を介してＲａｓと相互作用する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットと相互作用する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＧＤＰに結合したＲａｓタンパク質に高くても１００μＭのＫｄで結合し、それによって、Ｒａｓ活性をアンタゴナイズする。いくつかの実施形態において、Ｒａｓ活性をアンタゴナイズすることは、ＧＴＰアーゼ活性、ヌクレオチド交換、エフェクタータンパク質の結合、エフェクタータンパク質の活性化、グアニン交換因子（ＧＥＦ）の結合、ＧＥＦによって促進されるヌクレオチド交換、ホスフェートの放出、ヌクレオチドの放出、ヌクレオチドの結合、Ｒａｓの細胞内局在化、Ｒａｓの翻訳後プロセシングまたはＲａｓの翻訳後修飾を調整することを含む。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＧＤＰもしくはＧＴＰのＲａｓタンパク質への結合または放出を阻害する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＣＰ−０２３（１−（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン）、ＣＰ−０２４（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−カルバルデヒド）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記結合の減少を検出する工程は、質量分析によって決定される、前記競合プローブによって共有結合的に修飾されたＲａｓの割合を測定する工程を含む。
１つの態様において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、本明細書中に記載される方法のいずれかに従ってＲａｓアンタゴニストを選択する工程およびその化合物を合成する工程を含む。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って選択されたＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩を含む薬学的組成物を提供する。
１つの態様において、本開示は、変異体Ｒａｓ、その変異体Ｒａｓに結合することができる競合プローブ、および試験化合物を含む反応混合物を提供する。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、システイン変異を含み；競合プローブは、そのシステイン変異において変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができ；試験化合物は、その競合プローブによる変異体Ｒａｓの共有結合修飾を阻害する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しない。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在する。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在し、前記変異体Ｒａｓは、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、前記システイン変異は、非保存アミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＥ６２Ｃ；ＭＲＡＳのＥ７２Ｃ；ＥＲＡＳのＡ１００Ｃ；ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＥ７３Ｃ；ＲＩＴ１のＡ８０Ｃ）、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＤ９２Ｃ；ＭＲＡＳのＨ１０２Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３０Ｃ；ＲＲＡＳ２のＥ１０３Ｃ；ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＡ１０３Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１０Ｃ）、または最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９５位（例えば、ＫＲＡＳのＨ９５Ｃ；ＨＲＡＳのＱ９５Ｃ；ＮＲＡＳのＬ９５Ｃ；ＭＲＡＳのＲ１０５Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３３Ｃ；ＲＲＡＳ２のＫ１０６Ｃ；ＲＡＬＡのＤ１０６Ｃ；ＲＡＬＢのＥ１０６Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１３Ｃ）に存在する。いくつかの実施形態において、前記Ｒａｓは、Ｒａｓサブファミリータンパク質である。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む、請求項１に記載の方法。いくつかの実施形態において、試験化合物は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化学結合を介してＲａｓと相互作用する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットと相互作用する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＣＰ−０２３（１−（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン）、ＣＰ−０２４（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−カルバルデヒド）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの置換アミノ酸を含む変異体Ｒａｓを提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）置換アミノ酸は、変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする該反応性アミノ酸であり；（ｂ）置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸ではない。いくつかの実施形態において、前記反応性アミノ酸は、システイン、リジン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、前記反応性アミノ酸は、システインである。いくつかの実施形態において、前記競合プローブは、前記変異体Ｒａｓに結合することができる。いくつかの実施形態において、前記競合プローブは、前記変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、前記置換アミノ酸は、Ｒａｓにおける非保存位置に存在する。いくつかの実施形態において、前記置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位に存在する。
いくつかの実施形態において、前記置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＥ６２Ｃ；ＭＲＡＳのＥ７２Ｃ；ＥＲＡＳのＡ１００Ｃ；ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＥ７３Ｃ；ＲＩＴ１のＡ８０Ｃ）に存在するシステイン、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９２位（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳまたはＮＲＡＳのＤ９２Ｃ；ＭＲＡＳのＨ１０２Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３０Ｃ；ＲＲＡＳ２のＥ１０３Ｃ；ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢのＡ１０３Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１０Ｃ）に存在するシステイン、または最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する９５位（例えば、ＫＲＡＳのＨ９５Ｃ；ＨＲＡＳのＱ９５Ｃ；ＮＲＡＳのＬ９５Ｃ；ＭＲＡＳのＲ１０５Ｃ；ＥＲＡＳのＱ１３３Ｃ；ＲＲＡＳ２のＫ１０６Ｃ；ＲＡＬＡのＤ１０６Ｃ；ＲＡＬＢのＥ１０６Ｃ；ＲＩＴ１のＥ１１３Ｃ）に存在するシステインである。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、。いくつかの実施形態において、前記変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異、例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１８、６１、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、前記１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２および１３位から選択される位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、前記１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２位にシステイン、１２位にアスパラギン酸、１３位にシステイン、１３位にアスパラギン酸またはそれらの任意の組み合わせを含む。
１つの態様において、本開示は、置換アミノ酸を含む変異体Ｒａｓであって、ここで、
（ａ）該置換アミノ酸は、該変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする該反応性アミノ酸であり；（ｂ）該置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸であり；（ｃ）該変異体Ｒａｓが、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、変異体Ｒａｓを提供する。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸は、システインである。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体Ｒａｓに結合することができる。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせ、例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１８、６１、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置に変異を含む。
いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、Ｇ１２ＤおよびＤ９２Ｃの変異またはＧ１２ＤおよびＨ９５Ｃの変異を有するＫｒａｓである。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される任意の変異体Ｒａｓをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供する。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞を提供する。１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
１つの態様において、本開示は、キットを提供する。いくつかの実施形態において、そのキットは、（ａ）最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位以外の位置にシステイン変異を有する変異体Ｒａｓ；および（ｂ）競合プローブと試験化合物との間の競合反応において変異体Ｒａｓを使用するための指示を含む。いくつかの実施形態において、そのキットは、競合プローブをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのキットは、１つまたはそれより多い試験化合物をさらに含む。
１つの態様において、本開示は、変異体Ｒａｓおよび競合プローブを含む複合体が結合した基材を提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）変異体Ｒａｓは、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする反応性アミノ酸である置換アミノ酸を含み；（ｂ）その置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸ではなく；（ｃ）その競合プローブは、その反応性アミノ酸において変異体Ｒａｓに共有結合的に結合される。いくつかの実施形態において、その基材は、ビーズ、微小粒子、ナノ粒子、ナノ結晶、繊維、マイクロ繊維、ナノ繊維、ナノワイヤ、ナノチューブ、マット、平面シート、平面ウエハまたはスライド、マルチウェルプレート、光学スライド、フローセル、チャネルおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される形態である。いくつかの実施形態において、その基材は、ガラス、水晶、溶融シリカ、ケイ素、金属、ポリマー、プラスチック、セラミックス、複合材料およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される材料を含む。
１つの態様において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを選択するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態において、そのシステムは、（ａ）競合反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うというユーザーの要求を受信するように構成されたコンピュータ；（ｂ）競合反応を準備する反応モジュール（ａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ ｔｈａｔ ｐｒｅｐａｒｅｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（その競合反応は、変異体Ｒａｓ、その変異体Ｒａｓに結合することができる競合プローブ、および試験化合物を含む）；（ｃ）試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓの結合と比べて変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少を検出する検出モジュール；および（ｄ）リポートをレシピエントに送るリポートジェネレーター（ここで、そのリポートは検出モジュールからの結果を含む）を備え；ここで、（ｉ）その変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しないシステイン変異を含み；（ｉｉ）その競合プローブは、そのシステイン変異において変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができ；（ｉｉｉ）その試験化合物は、その競合プローブによる変異体Ｒａｓの共有結合修飾を阻害する。いくつかの実施形態において、リポートジェネレーターは、試験化合物をＲａｓのインヒビターと同定する。
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個別に参照により援用されると示されたかのように同程度に参照により本明細書中に援用される。
本発明の新規の特徴は、添付の請求項に詳細に示される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例証的な実施形態を示している以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られる。
図１は、ある実施形態による競合結合アッセイの例を図示している。変異体Ｒａｓは、置換アミノ酸（Ｚ）（例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対するＥ６２Ｃ、Ｄ９２Ｃ、Ｈ９５Ｃ）および任意選択で１つまたはそれより多いさらなる変異（例えば、発癌性変異、例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対するＧ１２ＸまたはＱ６１Ｘ）を含む。競合プローブ（ＣＯＭＰ）は、変異体Ｒａｓに、例えば、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケット（１１０）において結合することができる。競合プローブは、反応性部分（Ｙ）（例えば、求電子基）ならびに任意選択の親和性タグおよび／または検出タグ（１２０）を含み得る。競合プローブは、例えば、その反応性部分を通じて置換アミノ酸と反応して共有結合（１３０）を形成することによって、変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができ得る。試験化合物（ＴＥＳＴ）は、潜在的なＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケット結合剤である。試験化合物の存在下の競合反応における反応（例えば、変異体Ｒａｓの結合または共有結合修飾）の程度が、試験化合物の非存在下のコントロール反応における反応の程度と比較される。
図２は、例示的な置換アミノ酸部位（６２位（２２０）、９５位（２４０）および９２位（２６０）を含むがこれらに限定されない）が、Ｒａｓ（２１０）のＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケット（２３０）の近くであることを示している。変異体Ｒａｓは、任意選択で、１２位（２５０）にさらなる変異を含み得る。位置は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する位置である。
図３は、置換アミノ酸の導入のための例示的な部位（黒色で強調されている）（６２位、９５位および９２位を含むがこれらに限定されない）が、ＲａｓファミリーのＧＴＰアーゼにおいて高度に保存されていないことを示している。位置は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する位置である。
図４は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＬＡおよびＲＡＬＢが、高い配列保存を有することを示している。四角で囲まれた位置は、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける残基を示す。ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳおよびＮＲＡＳにおける１２位は、ＲＡＬＡおよびＲＡＬＢにおける２３位と等価である。
図５は、ＲＡＬタンパク質が、予め形成されたＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットを有することを示している。Ａｐｏ ＲａｌＡ ＧＤＰ構造が示されている。ＲＣＳＢタンパク質データバンク構造１Ｕ９０。
図６は、ＣＰ−０２３（１−（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン）およびＣＰ−０２４（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−カルバルデヒド）から選択される試験化合物の存在下におけるＤ９２Ｃ Ｋ−Ｒａｓによる競合プローブ枯渇の阻害を示している。Ｋ−Ｒａｓ（２μＭ）、ＣＰ−００８（１００ｎＭ）および試験化合物を６時間インキュベートした。ＣＰ−００８の枯渇を、非反応性の内部標準化合物に対する質量分析によって測定した。
発明の詳細な説明
用語「約」または「およそ」は、当業者が決定した特定の値についての許容され得る誤差範囲内を意味し、それは、その値がどのようにして計測または決定されたか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該分野における慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、１５％まで、１０％まで、５％までまたは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内を意味し得る。特定の値が本願および請求項に記載される場合、別段述べられない限り、その特定の値についての許容され得る誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
「Ｒａｓ」は、Ｒａｓサブファミリーなどにおける、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーのタンパク質をいう。Ｒａｓスーパーファミリーには、Ｒａｓサブファミリー、Ｒｈｏサブファミリー、Ｒａｂサブファミリー、Ｒａｐサブファミリー、Ａｒｆサブファミリー、Ｒａｎサブファミリー、Ｒｈｅｂサブファミリー、ＲＧＫサブファミリー、Ｒｉｔサブファミリー、Ｍｉｒｏサブファミリーおよび未分類のサブファミリーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒａｓタンパク質は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＩＴ１およびその任意の組み合わせからなる群から、例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢおよびその任意の組み合わせから選択される。Ｒａｓサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＤＩＲＡＳ１；ＤＩＲＡＳ２；ＤＩＲＡＳ３；ＥＲＡＳ；ＧＥＭ；ＨＲＡＳ；ＫＲＡＳ；ＭＲＡＳ；ＮＫＩＲＡＳ１；ＮＫＩＲＡＳ２；ＮＲＡＳ；ＲＡＬＡ；ＲＡＬＢ；ＲＡＰ１Ａ；ＲＡＰ１Ｂ；ＲＡＰ２Ａ；ＲＡＰ２Ｂ；ＲＡＰ２Ｃ；ＲＡＳＤ１；ＲＡＳＤ２；ＲＡＳＬ１０Ａ；ＲＡＳＬ１０Ｂ；ＲＡＳＬ１１Ａ；ＲＡＳＬ１１Ｂ；ＲＡＳＬ１２；ＲＥＭ１；ＲＥＭ２；ＲＥＲＧ；ＲＥＲＧＬ；ＲＲＡＤ；ＲＲＡＳおよびＲＲＡＳ２が挙げられる。Ｒｈｏサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＨＯＡ；ＲＨＯＢ；ＲＨＯＢＴＢ１；ＲＨＯＢＴＢ２；ＲＨＯＢＴＢ３；ＲＨＯＣ；ＲＨＯＤ；ＲＨＯＦ；ＲＨＯＧ；ＲＨＯＨ；ＲＨＯＪ；ＲＨＯＱ；ＲＨＯＵ；ＲＨＯＶ；ＲＮＤ１；ＲＮＤ２；ＲＮＤ３；ＲＡＣ１；ＲＡＣ２；ＲＡＣ３およびＣＤＣ４２が挙げられる。Ｒａｂサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＡＢ１Ａ；ＲＡＢ１Ｂ；ＲＡＢ２；ＲＡＢ３Ａ；ＲＡＢ３Ｂ；ＲＡＢ３Ｃ；ＲＡＢ３Ｄ；ＲＡＢ４Ａ；ＲＡＢ４Ｂ；ＲＡＢ５Ａ；ＲＡＢ５Ｂ；ＲＡＢ５Ｃ；ＲＡＢ６Ａ；ＲＡＢ６Ｂ；ＲＡＢ６Ｃ；ＲＡＢ７Ａ；ＲＡＢ７Ｂ；ＲＡＢ７Ｌ１；ＲＡＢ８Ａ；ＲＡＢ８Ｂ；ＲＡＢ９；ＲＡＢ９Ｂ；ＲＡＢＬ２Ａ；ＲＡＢＬ２Ｂ；ＲＡＢＬ４；ＲＡＢ１０；ＲＡＢ１１Ａ；ＲＡＢ１１Ｂ；ＲＡＢ１２；ＲＡＢ１３；ＲＡＢ１４；ＲＡＢ１５；ＲＡＢ１７；ＲＡＢ１８；ＲＡＢ１９；ＲＡＢ２０；ＲＡＢ２１；ＲＡＢ２２Ａ；ＲＡＢ２３；ＲＡＢ２４；ＲＡＢ２５；ＲＡＢ２６；ＲＡＢ２７Ａ；ＲＡＢ２７Ｂ；ＲＡＢ２８；ＲＡＢ２Ｂ；ＲＡＢ３０；ＲＡＢ３１；ＲＡＢ３２；ＲＡＢ３３Ａ；ＲＡＢ３３Ｂ；ＲＡＢ３４；ＲＡＢ３５；ＲＡＢ３６；ＲＡＢ３７；ＲＡＢ３８；ＲＡＢ３９；ＲＡＢ３９Ｂ；ＲＡＢ４０Ａ；ＲＡＢ４０ＡＬ；ＲＡＢ４０Ｂ；ＲＡＢ４０Ｃ；ＲＡＢ４１；ＲＡＢ４２およびＲＡＢ４３が挙げられる。Ｒａｐサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＡＰ１Ａ；ＲＡＰ１Ｂ；ＲＡＰ２Ａ；ＲＡＰ２Ｂ；およびＲＡＰ２Ｃが挙げられる。Ａｒｆサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＡＲＦ１；ＡＲＦ３；ＡＲＦ４；ＡＲＦ５；ＡＲＦ６；ＡＲＬ１；ＡＲＬ２；ＡＲＬ３；ＡＲＬ４；ＡＲＬ５；ＡＲＬ５Ｃ；ＡＲＬ６；ＡＲＬ７；ＡＲＬ８；ＡＲＬ９；ＡＲＬ１０Ａ；ＡＲＬ１０Ｂ；ＡＲＬ１０Ｃ；ＡＲＬ１１；ＡＲＬ１３Ａ；ＡＲＬ１３Ｂ；ＡＲＬ１４；ＡＲＬ１５；ＡＲＬ１６；ＡＲＬ１７；ＴＲＩＭ２３、ＡＲＬ４Ｄ；ＡＲＦＲＰ１およびＡＲＬ１３Ｂが挙げられる。Ｒａｎサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＡＮが挙げられる。Ｒｈｅｂサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＨＥＢおよびＲＨＥＢＬ１が挙げられる。ＲＧＫサブファミリーのタンパク質の非限定的な例として、ＲＲＡＤ；ＧＥＭ；ＲＥＭおよびＲＥＭ２が挙げられる。Ｒｉｔサブファミリータンパク質の非限定的な例としては、ＲＩＴ１およびＲＩＴ２が挙げられる。Ｍｉｒｏサブファミリータンパク質の非限定的な例としては、ＲＨＯＴ１およびＲＨＯＴ２が挙げられる。未分類のサブファミリータンパク質の非限定的な例としては、ＡＲＨＧＡＰ５；ＤＮＡＪＣ２７；ＧＲＬＦ１；およびＲＡＳＥＦが挙げられる。ＲＡＬタンパク質の非限定的な例としては、ＲＡＬＡおよびＲＡＬＢが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｒａｓは、検出可能な標識との結合体化などによって、さらに修飾され得る。いくつかの実施形態において、Ｒａｓは、完全長または切断型のポリペプチドである。例えば、Ｒａｓは、残基１〜１６９または残基１１〜１８３（例えば、ＲＡＬＡまたはＲＡＬＢの残基１１〜１８３）を含む切断型のポリペプチドであり得る。
「変異体Ｒａｓ」および「Ｒａｓ変異体」は、（例えば、野生型（ＷＴ）配列などの共通の参照配列に関して）１つまたはそれより多いアミノ酸変異を有するＲａｓタンパク質をいう。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢおよびそれらの任意の組み合わせ）から選択される。いくつかの実施形態において、変異は、導入された変異、天然に存在する変異または天然に存在しない変異であり得る。いくつかの実施形態において、変異は、置換（例えば、置換アミノ酸）、挿入（例えば、１つまたはそれより多いアミノ酸の付加）または欠失（例えば、１つまたはそれより多いアミノ酸の除去）であり得る。いくつかの実施形態において、２つまたはそれより多い変異は、連続的、非連続的またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、変異は、Ｒａｓの任意の位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対するＲａｓの１２位、１３位、６２位、９２位、９５位またはその任意の組み合わせに存在し得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５０より多くの変異を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０の変異を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、約または最大約５００、４００、３００、２５０、２４０、２３３、２３０、２２０、２１９、２１０、２０８、２０６、２０４、２００、１９５、１９０、１８９、１８８、１８７、１８６、１８５、１８０、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６０、１５５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０または５０未満のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、変異のアミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、天然アミノ酸、標準的なアミノ酸、非標準的なアミノ酸、非カノニカルアミノ酸、必須アミノ酸、非必須アミノ酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、変異のアミノ酸は、正に帯電した側鎖、負に帯電した側鎖、極性の無電荷側鎖、非極性の側鎖、疎水性側鎖、親水性側鎖、脂肪族側鎖、芳香族側鎖、環状側鎖、非環状側鎖、塩基性側鎖または酸性側鎖を有する。いくつかの実施形態において、変異は、反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、検出可能な標識との結合体化などによってさらに修飾され得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、完全長または切断型のポリペプチドである。例えば、変異体Ｒａｓは、残基１〜１６９または残基１１〜１８３（例えば、変異体ＲＡＬＡまたは変異体ＲＡＬＢの残基１１〜１８３）を含む切断型のポリペプチドであり得る。
「Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケット」および「スイッチＩＩ結合ポケット」は、Ｒａｓの「Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ」ループの下に形成される結合ポケットをいう（図２および図５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケットは、Ｒａｓの中央のβ−シートとα２−およびα３−ヘリックスとの間に位置する。いくつかの実施形態において、スイッチＩＩ結合ポケットは、１２位、６０位、９９位またはこれらの任意の組み合わせから約または少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎｍに位置する。いくつかの実施形態において、スイッチＩＩ結合ポケットは、１２位、６０位、９９位またはこれらの任意の組み合わせから最大約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎｍに位置する。
「競合プローブ」は、変異体Ｒａｓに結合することができる化合物をいう。いくつかの実施形態において、競合プローブは、Ｒａｓに結合することができる。いくつかの実施形態において、競合プローブは、例えば反応性部分を通じて、変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができ得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおいて結合することができ得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、Ｒａｓアンタゴニストであり得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、反応性部分（例えば、求電子基、求核基）を含む。
「試験化合物」は、変異体Ｒａｓに結合する能力についてスクリーニングされる化合物をいう。いくつかの実施形態において、試験化合物は、Ｒａｓおよび／または変異体Ｒａｓに結合することができ得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、Ｒａｓおよび／または変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおいて結合することができ得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、Ｒａｓアンタゴニストであり得る。
アミノ酸位置は、別段示されない限り、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する位置である。例えば、図３は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡおよびＲＩＴ１の５１アミノ酸セグメントならびにＥＲＡＳの４８アミノ酸セグメントについての最適にアラインメントされたアミノ酸配列を示している。例えば、ＫＲＡＳの６２位、ＨＲＡＳの６２位、ＮＲＡＳの６２位、ＭＲＡＳの７２位、ＥＲＡＳの１００位、ＲＲＡＳ２の７３位、ＲＡＬＡの７３位およびＲＩＴ１の８０位は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の６２位に対応する。例えば、図４は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＬＡおよびＲＡＬＢのセグメントについての最適にアラインメントされたアミノ酸配列を示している。例えば、ＫＲＡＳの６２位、ＨＲＡＳの６２位、ＮＲＡＳの６２位、ＲＡＬＡの７３位およびＲＡＬＢの７３位は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の６２位に対応する。例えば、ＫＲＡＳの１２位、ＨＲＡＳの１２位、ＮＲＡＳの１２位、ＲＡＬＡの２３位およびＲＡＬＢの２３位は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の１２位に対応する。
アミノ酸変異は、別段示されない限り、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対するアミノ酸変異である。例えば、ＫＲＡＳのＧ１２Ｃ、ＨＲＡＳのＧ１２Ｃ、ＮＲＡＳのＧ１２Ｃ、ＲＡＬＡのＧ２３ＣおよびＲＡＬＢのＧ２３Ｃは、最適にアラインメントされたときの配列番号１のＧ１２Ｃに対応する。例えば、ＫＲＡＳのＥ６２Ｃ、ＨＲＡＳのＥ６２Ｃ、ＮＲＡＳのＥ６２Ｃ、ＲＡＬＡのＥ７３ＣおよびＲＡＬＢのＥ７３Ｃは、最適にアラインメントされたときの配列番号１のＥ６２Ｃに対応する。例えば、ＫＲＡＳのＤ９２Ｃ、ＨＲＡＳのＤ９２Ｃ、ＮＲＡＳのＤ９２Ｃ、ＲＡＬＡのＡ１０３ＣおよびＲＡＬＢのＡ１０３Ｃは、最適にアラインメントされたときの配列番号１のＤ９２Ｃに対応する。例えば、ＫＲＡＳのＨ９５Ｃ、ＨＲＡＳのＱ９５Ｃ、ＮＲＡＳのＬ９５Ｃ、ＲＡＬＡのＤ１０６ＣおよびＲＡＬＢのＥ１０６Ｃは、最適にアラインメントされたときの配列番号１のＨ９５Ｃに対応する。
「反応性部分」は、化学反応（例えば、共有結合の形成）または結合相互作用によって結合を促進する任意の部分をいう。いくつかの実施形態において、反応性部分は、求核基（例えば、硫黄含有基（例えば、チオール、チオレート、システイン）、窒素含有基（例えば、アミン、アジド、アルコキシアミン、ヒドラジン）、炭素含有基（例えば、エノール、エノレート、チロシン、アニリン、アルケン、アルキン）、リン含有基（例えば、トリアリールホスフィンなどのホスフィン化合物）または酸素含有基（例えば、アルコール、アルコキシド））である。いくつかの実施形態において、反応性部分は、求電子基（例えば、アルケン、アルキン、アルデヒド、ケトン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、塩化スルホニル、カルボジイミド、アシルアジド、フルオロベンゼン、カーボネート、フルオロフェニルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、２−チオピリドン、３−カルボキシ−４−ニトロチオフェノール、エポキシド、イソチオシアネート、ジアゾニウム化合物、イソシアネート、無水物、共役二重結合、α，β−不飽和カルボニル、アクリルアミド、ビニルスルホンアミドまたはα，β−不飽和チオカルボニル）である。いくつかの実施形態において、反応性部分は、ビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンである。
「求電子剤」および「求電子基」は、求核剤（例えば、孤立電子対、負電荷、部分的負電荷、および／または過剰な電子を有する部分、例えば、−ＳＨ基）と反応することができる任意の部分を指す。求電子剤（ｅｌｅｃｔｒｏｈｉｌｅ）は、典型的には、電子不足であるか、電子不足の原子を含む。一定の実施形態では、求電子剤（ｅｌｅｃｔｒｏｈｉｌｅ）は、正電荷または部分的正電荷を含むか、正電荷または部分的正電荷を含む共鳴構造を有するか、電子の非局在化または分極により１つまたはそれを超える正電荷または部分的正電荷を含む原子が得られる部分である。いくつかの実施形態では、求電子剤は、共役二重結合を含む（例えば、α，β−不飽和カルボニル化合物、アクリルアミド、ビニルスルホンアミドまたはα，β−不飽和チオカルボニル化合物）。いくつかの実施形態において、求電子剤は、システインチオール基への共有結合性の結合および／または不可逆的な結合が可能である。いくつかの実施形態において、求電子剤は、変異体Ｒａｓの６２、９２または９５位などにおいて、変異体Ｒａｓタンパク質と共有結合を形成することができる。
用語「アンタゴニスト」および「インヒビター」を互換的に使用し、これらの用語は、標的タンパク質（例えば、ＲＡＳ、変異体Ｒａｓ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）の生物学的機能（例えば、活性、発現、結合、タンパク質間相互作用）をアンタゴナイズする能力を有する化合物をいう。したがって、用語「アンタゴニスト」および「インヒビター」を、標的タンパク質の生物学的役割の文脈で定義する。本明細書中の好ましいアンタゴニストが標的と特異的に相互作用する（例えば、結合する）一方で、標的タンパク質がメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーとの相互作用によって標的タンパク質の生物学的活性を阻害する化合物も本定義内に具体的に含まれる。アンタゴニストによって阻害される好ましい生物学的活性は、腫瘍の発生、成長、または拡大に関連する。
用語「アゴニスト」は、例えば、標的タンパク質の活性または発現を引き起こすことによって、標的タンパク質の生物学的機能を開始または増強する能力を有する化合物をいう。したがって、用語「アゴニスト」を、標的ポリペプチドの生物学的役割の文脈で定義する。本明細書中の好ましいアゴニストが標的と特異的に相互作用する（例えば、結合する）一方で、標的ポリペプチドがメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーとの相互作用によって標的ポリペプチドの生物学的活性を開始または増強する化合物も本定義内に具体的に含まれる。
「シグナル伝達」は、細胞内応答を誘発するために刺激シグナルまたは阻害シグナルが細胞中または細胞内に伝達される過程である。シグナル伝達経路の調整因子は、同一の特異的シグナル伝達経路にマッピングされる１つまたはそれを超える細胞タンパク質の活性を調整する化合物をいう。調整因子は、シグナル伝達分子の活性を増強する（アゴニスト）または抑制する（アンタゴニスト）ことができる。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体型をいい、それらには、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログが含まれる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から導かれる遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、発現ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、検出可能な標識との結合体化などによって、さらに修飾され得る。
「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために本明細書中で交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または他の任意の操作（例えば、検出可能な標識との結合体化）によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、天然および／もしくは非天然のアミノ酸または合成アミノ酸（グリシン、システインおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む）が含まれる。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、天然アミノ酸、標準的なアミノ酸、非標準的なアミノ酸、非カノニカルアミノ酸、必須アミノ酸、非必須アミノ酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、正に帯電した側鎖、負に帯電した側鎖、極性の無電荷側鎖、非極性の側鎖、疎水性側鎖、親水性側鎖、脂肪族側鎖、芳香族側鎖、環状側鎖、非環状側鎖、塩基性側鎖または酸性側鎖を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、求核性または求電子性の側鎖を有する。
用語「結合体化する」および「〜に結合体化される」は、１つまたはそれより多いタンパク質または小分子と、本明細書中に記載される本発明の物品のいずれかとの共有結合による複合分子の形成を示すことを意図している。「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」は、記載される２つのエレメントが、互いに直接共有結合的に連結されるか（例えば、炭素−炭素結合を介して）、または介在性の化学構造物（例えば、架橋、スペーサー、リンカー、連結基またはそれらの任意の組み合わせ）を介して互いに間接的に共有結合的に連結されることを意味する。用語「架橋」は、２つの異なる化学エレメント（例えば、インヒビターおよびフルオロフォア）を接続する分子フラグメントをいう。用語「スペーサー」または「リンカー」は、単一の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）、または２つもしくはそれより多い異なる化学エレメントを共有結合的に接続するＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群より選択される１〜３０個の非水素原子を組み込む一続きの安定した共有結合をいうために交換可能に使用される。用語「連結基」は、２つまたはそれより多い化学元素を共有結合的に連結することができる化学的官能基（例えば、ホスホリル基またはスルホニル基）を意味することを意図している。
「コントロール」は、実験において比較目的で使用される代替の被験体またはサンプルをいう。「コントロール反応」は、競合反応と比較される反応をいう。いくつかの実施形態において、コントロール反応は、変異体Ｒａｓおよび競合プローブを含むが、コントロール反応と比較される競合反応の試験化合物を含まない。いくつかの実施形態において、コントロール反応は、同一性および量が競合反応と同じ内容物からなり得るが、試験化合物は含まない。
用語「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること」および「解析すること」は、任意の形態の測定をいうために本明細書中で交換可能に使用され得、これらの用語には、エレメントが存在するか否かを決定すること（例えば、検出）が含まれる。これらの用語には、定量的および／または定性的な決定の両方が含まれ得る。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「〜の存在を検出すること」には、存在するものの量を決定することおよび／または存在するか存在しないかを決定することが含まれ得る。
配列の比較、例えば、同一性、変異、または試験配列の１つもしくはそれより多い位置が参照配列（例えば、配列番号１）の１つもしくはそれより多い指定された位置と比較して減少するところを評価する目的の配列の比較は、任意の適切なアラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナー（任意選択でデフォルトの設定を用いる）を参照のこと）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで利用可能なＢＬＡＳＴアラインメントツール（任意選択でデフォルトの設定を用いる）を参照のこと）およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／で利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナー（任意選択でデフォルトの設定を用いる）を参照のこと）を含むがこれらに限定されない）によって行われ得る。最適なアラインメントは、デフォルトのパラメータを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを用いて評価され得る。
通常、「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチドとの正確な対応またはアミノ酸とアミノ酸との正確な対応をいう。典型的には、配列同一性を決定するための技法は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。２つまたはそれより多い配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較され得る。より長い分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）内の配列であり得る参照配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）に対する同一性パーセントは、最適にアラインメントされた２つの配列の間の正確なマッチ数を参照配列の長さで除算し、１００を乗算して計算され得る。同一性パーセントはまた、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手可能な高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（バージョン２．２．９を含む）を用いて配列情報を比較することによっても決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）の、ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）において論じられているようなアラインメント方法に基づく。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、アラインメントされた同一のシンボル（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短いほうの配列におけるシンボルの総数で除算した値として同一性を定義する。そのプログラムは、比較されている配列の全長にわたって同一性パーセントを決定するために使用され得る。短いクエリー配列、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで検索を最適化するためにデフォルトのパラメータが提供される。そのプログラムは、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるとき、クエリー配列のセグメントをマスクオフするためにＳＥＧフィルターの使用も可能にする。所望の程度の配列同一性の範囲は、およそ８０％〜１００％およびそれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と特許請求される配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％である。通常、正確なマッチは、参照配列の長さにわたる１００％同一性を示す。
用語「有効量」または「治療有効量」は、意図する適用（以下に定義の疾患処置が含まれるが、これらに限定されない）を達成するのに十分な本明細書中に記載の化合物の量をいう。治療有効量は、意図する処置への適用（ｉｎ ｖｉｖｏ）、または処置される被験体および病状（例えば、被験体の体重および年齢、病状の重症度、および投与様式など）に応じて変動してよく、当業者によって容易に決定することができる。本用語は、標的細胞における特定の応答（例えば、血小板接着および／または細胞遊走の低下）を誘導する用量にも適用する。特定の用量は、選択した特定の化合物、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、投与される組織、および保有される物理的送達系に応じて変動する。
本明細書中で使用する場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害、または病状に関して有利または望ましい結果（治療的利点および／または予防的利点が含まれるが、これらに限定されない）を得るためのアプローチをいう。治療的利点は、処置される基礎障害の根絶または改善を意味する。また、治療的利点は、被験体が依然として基礎障害を罹患し得るにもかかわらず、被験体において改善が認められるように基礎障害に関連する１つまたはそれを超える生理学的症状の根絶または改善をもって達成される。一定の実施形態では、予防的利点について、組成物を、疾患が診断されていないかもしれない場合でさえ、特定の疾患を発症するリスクのある被験体または疾患の１つまたはそれを超える生理学的症状が報告されている被験体に投与する。
「治療効果」は、本用語を本明細書中で使用する場合、上記の治療的利点および／または予防的利点を含む。予防効果には、疾患もしくは状態の出現の遅延もしくは除去、疾患もしくは状態の症状の発生の遅延もしくは除去、疾患もしくは状態の進行の遅延、停止、もしくは逆転、またはその任意の組み合わせが含まれる。
用語「共投与」、「〜と組み合わせた投与」、およびその文法上の等価物は、本明細書中で使用する場合、２つまたはそれを超える薬剤の動物（ヒトが含まれる）への投与であって、両方の薬剤および／またはそれらの代謝産物が同時に被験体内に存在する、投与を含む。共投与には、個別の組成物の共投与、個別の組成物の異なる時間の投与、または両薬剤が存在する組成物での投与が含まれる。
「薬学的に許容され得る塩」には、薬学的に許容され得る酸付加塩および薬学的に許容され得る塩基付加塩の両方が含まれる。
「薬学的に許容され得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および性質が保持され、生物学的またはその他の点で望ましいわけではなく、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などであるが、これらに限定されない）または有機酸（例えば、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびウンデシレン酸などであるが、これらに限定されない）を使用して形成される塩をいう。
「薬学的に許容され得る塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的有効性および性質が保持され、生物学的またはその他の点で望ましいわけではない塩をいう。これらの塩を、遊離酸への無機塩基または有機塩基の付加から調製する。無機塩基由来の塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、およびアルミニウム塩などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。有機塩基由来の塩には、第一級アミン、第二級アミン、
および第三級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンが含まれる）、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂（例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、およびポリアミンの樹脂など）の塩が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
本明細書中で使用する場合、「薬剤」または「生物学的に活性な薬剤」は、生物学的、薬学的、または化学的な化合物をいう。非限定的な例には、単純または複雑な有機分子または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素、および化学療法化合物が含まれる。種々の化合物（例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、および種々のコア構造に基づいた合成有機化合物）を合成することができる。さらに、種々の天然供給源（例えば、植物性または動物性の抽出物など）からスクリーニングのための化合物を得ることができる。
「抗がん剤」、「抗腫瘍剤」、または「化学療法剤」は、新生物性状態の処置で有用な任意の薬剤をいう。１つの抗がん剤クラスは、化学療法薬を含む。「化学療法」は、種々の方法（静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、嚢内、皮下、経皮、口内、もしくは吸入、または坐剤の形態が含まれる）による被験体への１つまたはそれを超える化学療法薬の投与を意味する。
用語「被験体」および「個体」は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトのことをいうために本明細書中で交換可能に使用される。「被験体」は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物をいう。本明細書中に記載の方法は、ヒト治療および動物への応用の両方で有用であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物であり、いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
「哺乳動物」には、ヒトならびに飼育動物（実験動物および愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）など）および非飼育動物（例えば、野生動物など）の両方が含まれる。哺乳動物としては、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、競技用動物、飼いならされた動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。インビボにおいて得られたまたはインビトロにおいて培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。
用語「インビボ」は、被験体の身体内において生じる事象をいう。
用語「インビトロ」は、被験体の身体の外で生じる事象をいう。例えば、インビトロアッセイは、被験体の外で実行される任意のアッセイを包含する。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が用いられる細胞ベースのアッセイを包含する。インビトロアッセイは、インタクトな細胞が用いられない無細胞アッセイも包含する。
「プロドラッグ」は、生理学的条件下または加溶媒分解によって本明細書中に記載の生物学的に活性な化合物（例えば、Ｒａｓアンタゴニスト）に変換することができる化合物を示すことを意味する。用語「プロドラッグ」は、薬学的に許容され得る生物学的に活性な化合物の前駆体を含む。いくつかの態様では、プロドラッグは、被験体への投与時は不活性であるが、例えば、加水分解によってインビボで活性な化合物に変換される。プロドラッグ化合物は、しばしば、哺乳動物において溶解性、組織適合性、または遅延放出といった利点を付与する（例えば、Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｈ．，Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（１９８５），ｐｐ．７−９，２１−２４（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を参照のこと）；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ら，”Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”（１９８７）Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１４およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（その各々が本明細書中で参考として完全に組み込まれる）。用語「プロドラッグ」はまた、かかるプロドラッグを哺乳動物被験体に投与した場合にインビボで活性化合物を放出する任意の共有結合したキャリアが含まれることを意味する。活性化合物のプロドラッグを、本明細書中に記載されるように、典型的には、日常的な操作またはインビボのいずれかにて修飾を切断して親活性化合物となるような方法で活性化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製する。プロドラッグには、ヒドロキシ基、アミノ基、またはメルカプト基を、活性化合物のプロドラッグを哺乳動物被験体に投与した場合にこれらの基が切断されて遊離ヒドロキシ基、遊離アミノ基、または遊離メルカプト基をそれぞれ形成する任意の基に結合した化合物が含まれる。プロドラッグの例には、ヒドロキシ官能基の酢酸誘導体、ギ酸誘導体、および安息香酸誘導体またはアミン官能基のアセトアミド誘導体、ホルムアミド誘導体、およびベンズアミド誘導体を含む活性化合物などが含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本明細書中に開示されるタンパク質または化合物は、同位体標識される。同位体標識されたタンパク質または化合物（例えば、アイソトポログ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅ））は、異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられた１つまたはそれより多い原子を有し得る。開示の化合物中に組み込むことができる同位体の非限定的な例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、硫黄、フッ素、塩素、およびヨウ素の同位体（それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ、および１２５Ｉなど）が含まれる。ある特定の同位体標識された化合物、例えば、安定同位体を組み込んでいる化合物は、質量分析研究において有用である。例えば、安定同位体タンパク質が、質量分析ベースのアッセイにおいて参照標準として使用され得る。ある特定の同位体標識された化合物、例えば、放射性同位体を組み込んでいる化合物は、薬物および／または基質の組織分布研究において有用である。組み込みやすさおよび検出手段が整っていることに照らして、放射性同位体であるトリチウム（３Ｈ）および炭素−１４（１４Ｃ）が、この目的にとって特に有用である。これらの放射性標識された化合物は、例えば、作用部位もしくは作用様式、または薬理学的に重要な作用部位に対する結合親和性を特徴づけることによって化合物の有効性を決定または測定するのを補助するのに有用であり得る。重水素（２Ｈ）などのより重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性に起因する一定の治療上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増大または必要な投薬量の減少）を得ることができ、それ故、いくつかの状況下で好ましい。陽電子放出同位体（１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎなど）での置換は、基質受容体占有率の試験のための陽電子放出断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）研究で有用であり得る。同位体標識された化合物を、一般に、当業者に公知の従来技術または非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用した本明細書に記載のプロセスに類似のプロセスによって調製することができる。
「任意選択的な」および「任意選択的に」は、その後に記載の環境事象が起こっても起こらなくてもよいこと、および記載事項が前記事象または環境が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、「任意選択的に置換されたアリール」は、アリール基が置換されていてもされていなくてもよいこと、および記載事項が置換されたアリール基および置換されていないアリール基の両方を含むことを意味する。
「薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、または賦形剤」には、米国食品医薬品局によってヒトまたは飼育動物での使用が許容できるとして承認されている任意のアジュバント、キャリア、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味強化剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される種々の実施形態の化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、１つまたはそれを超える不斉中心を含むことができ、従って、絶対立体化学の観点から、（Ｒ）型または（Ｓ）型としてか、アミノ酸の場合（Ｄ）型または（Ｌ）型として定義される鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の立体異性体を生じ得る。本開示は、全てのかかる可能な異性体、ならびにそのラセミ体および光学的に純粋な形態が含まれることを意味する。「立体異性体」は、同一の結合によって結合した同一の原子で構成されているが、互換的でない異なる三次元構造を有する化合物をいう。本開示は、様々な立体異性体およびそれらの混合物を企図しており、２つの立体異性体であって、それらの分子が互いに重ね合わせることができない鏡像である２つの立体異性体のことをいう「エナンチオマー」を含む。光学的に活性な（＋）および（−）、（Ｒ）異性体および（Ｓ）異性体、または（Ｄ）異性体および（Ｌ）異性体を、キラルシントンまたはキラル試薬を使用して調製することができるか、従来技術（例えば、クロマトグラフィおよび分別晶出）を使用して分割することができる。各鏡像異性体の調製／単離のための従来技術には、適切な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成または、例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用したラセミ体（またはラセミ体の塩もしくは誘導体）の分離が含まれる。本明細書中に記載の化合物がオレフィン二重結合または他の幾何学非対称の中心を含む場合、特に指定されない限り、該化合物がＥ幾何異性体およびＺ幾何異性体の両方を含むことを意図する。
「互変異性体」は、ある分子の１つの原子からその同じ分子の別の原子へのプロトン移動をいう。本開示は、任意の化合物の互変異性体を含み、また、すべての互変異性形態が含まれると意図されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「求電子剤」、「求電子基」または「求電子性の部分」は、求核剤（例えば、電子の孤立電子対、負電荷、部分負電荷および／または過剰な電子を有する部分、例えば、−ＳＨ基）と反応することができる任意の部分をいう。求電子剤は、典型的には、電子不足であるか、または電子不足である原子を含む。ある特定の実施形態において、求電子剤は、正電荷もしくは部分正電荷を含むか、正電荷もしくは部分正電荷を含む共鳴構造を有するか、または電子の非局在化もしくは分極によって正電荷もしくは部分正電荷を含む１つもしくはそれより多い原子がもたらされる部分である。いくつかの実施形態において、求電子剤は、共役二重結合を含み、例えば、α，β−不飽和カルボニル化合物またはα，β−不飽和チオカルボニル化合物である。いくつかの実施形態において、求電子剤は、システインスルフヒドリル基への共有結合性の結合および／または不可逆的な結合が可能である。いくつかの実施形態において、求電子剤は、Ｒａｓタンパク質（例えば、Ｒａｓタンパク質のシステイン）と不可逆的な共有結合を形成することができる。
「リガンド」は、本明細書中で使用されるとき、レセプターに選択的に結合し得る、小分子、小分子フラグメントまたは生物学的ポリマー（例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物）をいう。その結合は、共有結合性または非共有結合性であり得る。用語「選択的に」は、定量的アッセイを介しての、非特異的な相互作用に優る検出可能な結合相互作用をいう。
「アシル」は、基−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ（ここで、Ｒａは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合される）、ヘテロアルキルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択される）をいう。本明細書において別段明確に述べられない限り、アシル基は、任意選択で置換される。
「アルキル」は、炭素原子および水素原子のみからなり、飽和または不飽和であり（すなわち、１つまたはそれを超える二重結合および／または三重結合を含む）、１〜１２個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）、好ましくは１〜８個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、または１〜６個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）を有し、分子の残部が単結合によって結合している直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖部分をいう（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、エテニル、プロパ−１−エニル、ブタ−１−エニル、ペンタ−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルなど）。アルキルには、アルケニル（１つまたはそれを超える炭素−炭素二重結合）およびアルキニル（１つまたはそれを超える炭素−炭素三重結合）が含まれる。本明細書中で具体的に他の意味を示さない限り、アルキル基は、任意選択的に置換される。
「アルコキシ」は、式−ＯＲａの部分（ここで、Ｒａは、１〜１２個の炭素原子を含む本明細書中で定義されるようなアルキル基である）をいう。本明細書において別段明確に述べられない限り、アルコキシ基は、任意選択で置換される。
「アルキルアミノ」は、式−ＮＨＲａまたは−ＮＲａＲｂの部分（ここで、ＲａおよびＲｂは、各々独立して、１〜１２個の炭素原子を含む本明細書中で定義されるようなアルキル基である）をいう。本明細書において別段明確に述べられない限り、アルキルアミノ基は、任意選択で置換される。
「アミノアルキル」は、少なくとも１つのアミノ置換基を含むアルキル部分をいう。そのアミノ置換基は、第３級、第２級または第１級炭素上に存在し得る。本明細書において別段明確に述べられない限り、アミノアルキル基は、任意選択で置換される。
「アリール」は、６〜１８個の炭素原子、および少なくとも１つの芳香環を含む炭化水素環系部分をいう。本発明の目的のために、アリール部分は、単環式環系、二環式環系、三環式環系、または四環式環系であり、この環系は縮合環系または架橋環系を含むことができる。アリール部分には、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、およびトリフェニレンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で具体的に他の意味を示さない限り、用語「アリール」は、任意選択的に置換されたアリール基を含むことを意味する。
「複素環」は、１つまたはそれより多いヘテロ原子を含む飽和環、不飽和環または芳香環をいう。例示的なヘテロ原子としては、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子、Ｂ原子およびＳ原子が挙げられる。複素環には、３〜１０員の単環式環、６〜１２員の二環式環および６〜１２員の架橋環が含まれる。二環式複素環の各環は、飽和環、不飽和環および芳香環から選択され得る。複素環は、原子価が許せば（ｖａｌｅｎｃｅ ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ）、その複素環の任意の原子（例えば、その複素環の炭素原子または窒素原子）を介して分子の残りの部分に結合され得る。いくつかの実施形態において、複素環は、ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、複素環は、ヘテロシクロアルキルである。例示的な実施形態において、複素環、例えば、ピリジルは、飽和環または不飽和環、例えば、シクロヘキサン、シクロペンタンまたはシクロヘキセンに縮合され得る。例示的な複素環としては、ピロリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピペリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、チオフェニル、オキサゾリル、チアゾリル、モルホリニル、インダゾリル、インドリルおよびキノリニルが挙げられる。本明細書において別段明確に述べられない限り、複素環は、１つまたはそれより多い置換基（例えば、本明細書中に記載される置換基）によって任意選択で置換される。
「ヘテロアリール」は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む３〜１２員の芳香環（ここで、各ヘテロ原子は、独立して、Ｎ、ＯおよびＳから選択され得る）をいう。本明細書中で使用されるとき、ヘテロアリール環は、単環式または二環式の縮合環系または架橋環系から選択され得、ここで、その環系における環の少なくとも１つは、芳香族であり、すなわち、それはヒュッケル則に従う環状の非局在化（４ｎ＋２）π電子系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子（複数可）は、任意選択で酸化され得る。１つまたはそれより多い窒素原子は、存在する場合、任意選択で四級化される。ヘテロアリールは、原子価が許せば、そのヘテロアリールの任意の原子（例えば、そのヘテロアリールの炭素または窒素原子）を介して分子の残りの部分に結合され得る。ヘテロアリールの例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドリル、１，３−ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル（ｂｅｎｚｏｏｘａｚｏｌｙｌ）、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｙｌ）、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８−メタノ−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジニル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］ピリジニル（ｐｒｉｄｉｎｙｌ）およびチオフェニル（すなわち、チエニル）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において別段明確に述べられない限り、ヘテロアリールは、１つまたはそれより多い置換基（例えば、本明細書中に記載される置換基）によって任意選択で置換される。
用語「置換される」は、その構造の１つまたはそれより多い炭素またはヘテロ原子上の水素を置き換える置換基を有する部分をいう。「置換」または「〜で置換される」には、そのような置換が置換原子および置換基の許される原子価に従い、その置換によって、安定した化合物（例えば、再配列、環化、脱離などによるなど自発的に変換を起こさない化合物）がもたらされるという暗黙の条件が含まれることが理解される。本明細書中で使用されるとき、用語「置換される」は、有機化合物の許容できるすべての置換基を含むと企図される。広範な態様において、許容できる置換基には、有機化合物の非環式および環式の、分枝状および非分枝状の、炭素環式および複素環式の芳香族および非芳香族の置換基が含まれる。許容できる置換基は、適切な有機化合物について、１つまたはそれより多くてもよく、同じであっても異なっていてもよい。本開示の目的で、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはそのヘテロ原子の原子価を充足する本明細書中に記載される有機化合物の任意の許容できる置換基を有し得る。置換基には、本明細書中に記載される任意の置換基、例えば、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミルまたはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテートまたはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、炭素環、複素環、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、芳香族部分および複素環式芳香族部分が含まれ得る。いくつかの実施形態において、置換基には、本明細書中に記載される任意の置換基、例えば：ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、シアノ（−ＣＮ）、ニトロ（−ＮＯ２）、イミノ（＝Ｎ−Ｈ）、オキシモ（＝Ｎ−ＯＨ）、ヒドラジノ（＝Ｎ−ＮＨ２）、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（ここで、ｔは、１または２である）および−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（ここで、ｔは、１または２である）；ならびにアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキル（これらのいずれもが、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、シアノ−（−ＣＮ）、ニトロ−（−ＮＯ２）、イミノ（＝Ｎ−Ｈ）、オキシモ（＝Ｎ−ＯＨ）、ヒドラジン（＝Ｎ−ＮＨ２）、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（ここで、ｔは、１または２である）および−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（ここで、ｔは、１または２である）で、任意選択で置換され得；式中、各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルから選択され、式中、各Ｒａは、原子価が許せば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、シアノ−（−ＣＮ）、ニトロ（−ＮＯ２）、イミノ（＝Ｎ−Ｈ）、オキシモ（＝Ｎ−ＯＨ）、ヒドラジン（＝Ｎ−ＮＨ２）、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（ここで、ｔは、１または２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（ここで、ｔは、１または２である）および−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（ここで、ｔは、１または２である）で、任意選択で置換され得；式中、各Ｒｂは、独立して、直接結合または直鎖もしくは分枝のアルキレン、アルケニレンもしくはアルキニレン鎖から選択され、各Ｒｃは、直鎖または分枝のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン鎖である）が含まれ得る。
置換基は、適切な場合に、それ自体が置換され得ることが当業者によって理解される。「非置換」と具体的に述べられていない限り、本明細書中の化学的部分に対する言及は、置換されたバリアントを含むと理解される。例えば、「ヘテロアリール」基または「ヘテロアリール」部分に対する言及は、置換バリアントと非置換バリアントの両方を暗に含む。
「競合結合アッセイ」は、特異的結合部位に対してスクリーニングするためのロバストかつ適合性のハイスループットアッセイストラテジーである。典型的には、競合結合アッセイは、高親和性の可逆的リガンドを使用し、蛍光（例えば、蛍光偏光、ＦＲＥＴ）、免疫化学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）または他の検出方法（例えば、ＳＰＲ、ビーズベースの方法）を利用することにより、スクリーニングライブラリー由来の競合分子の存在下におけるリガンド結合の程度を決定する。そのような方法は、通常、目的の標的および標的部位に対する高親和性リガンドを利用する。Ｒａｓタンパク質の場合、高親和性の可逆的リガンドは、ＧＴＰポケットに対するものが存在するが、この標的部位は、細胞内のＧＴＰレベルが高いことと相俟ってＧＴＰ親和性が高いことに起因して、ドラッガブルでないと広く考えられている。
Ｒａｓタンパク質の場合、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケットが、阻害剤スクリーニングにとって魅力的な標的部位に相当する。最近、共有結合性のリガンドが、徐々に競合結合アッセイに使用されてきており、このアプローチは、複数のハイスループットスクリーニングにおいて首尾良く使用されている（Ｌｏｎｅ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１１６６５−７４（全体が参照により本明細書中に援用される）；Ｄｉｌｌｏｎ，Ｍ．Ｂ．；Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ，Ｄ．Ａ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｒｏｓｅｎ，Ｈ．；Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．；Ｍｏｗｅｎ，Ｋ．Ａ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，１１９８−２０４（全体が参照により本明細書中に援用される）；Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ，Ｄ．Ａ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｒｏｓｅｎ，Ｈ．；Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，２７，３８７−９４（全体が参照により本明細書中に援用される）；Ａｄｉｂｅｋｉａｎ，Ａ．ら、Ｐｒｏｂｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＮＩＨ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ ２０１０（全体が参照により本明細書中に援用される））。原則として、共有結合性のＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｃ標的化化合物、例えば、Ｏｓｔｒｅｍらが報告した化合物（Ｏｓｔｒｅｍ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｕ．；Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．；Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３，５０３，５４８−５５１（全体が参照により本明細書中に援用される））が、競合結合アッセイに使用され得る。別の１２位変異体（例えば、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｓ）が、ヒトのがんにおいて共通しており、好ましいＲａｓスクリーニングストラテジーは、複数またはすべての著明なＲａｓ変異体のスクリーニングを可能にさせ得る。Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおいて結合するＲａｓアンタゴニストは、１２位の部位の近くまで広がり、１２位の残基と相互作用し得、ある程度の変異体結合選択性を提供し得る。変異体選択的阻害剤は、スクリーニングの所望の結果であり得るので、目的の変異体を特異的にスクリーニングできることが同様に望ましい。スクリーニングされる標的（例えば、スクリーニングされるべき特異的なＲａｓ変異体）の柔軟性は、好ましいＲａｓスクリーニングアッセイの特徴である。
１つの態様において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法を提供する。例示的な実施形態の図解が、図１に提供されている。いくつかの実施形態において、その方法は、競合反応において、変異体Ｒａｓ、競合プローブおよび試験化合物を合わせる工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓの結合と比べたときの、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少を検出する工程を含む。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、反応性部分（例えば、求核基または求電子基、例えば、システインチオール基への共有結合性の結合および／または不可逆的な結合が可能な任意の求電子基）を含む。いくつかの実施形態において、競合プローブは、式
の化合物または薬学的に許容され得るその塩であり、式中、Ｅは、反応性部分（例えば、求核基または求電子基、例えば、システインチオール基への共有結合性の結合および／または不可逆的な結合が可能な任意の求電子基）を含む。競合プローブのさらなる例が、表２および表３に提供されている。１つまたはそれより多い競合プローブが、単一の反応において使用され得る。例えば、競合反応は、１、２、３、４、５個またはそれより多い競合プローブを含み得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、ＣＰ−００１、ＣＰ−００２、ＣＰ−００３、ＣＰ−００４、ＣＰ−００５、ＣＰ−００６、ＣＰ−００７、ＣＰ−００８、ＣＰ−００９、ＣＰ−０１０、ＣＰ−０１１、ＣＰ−０１２、ＣＰ−０１３、ＣＰ−０１４、ＣＰ−０１５、ＣＰ−０１６、ＣＰ−０１７、ＣＰ−０１８、ＣＰ−０１９，ＣＰ−０２０およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、約または少なくとも約１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μＭまたは５００μＭより大きなＫｄでＲａｓに結合する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、最大約１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭまたは５００μＭのＫｄでＲａｓに結合する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、１００ｐＭ〜５０ｎｍまたは５００ｐＭ〜１ｎＭのＫｄでＲａｓに結合する。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾する。共有結合修飾は、修飾されたタンパク質のパーセンテージとして表現され得る。修飾されたタンパク質のパーセンテージは、反応条件（例えば、選択される競合プローブ、研究中のＲａｓ変異体、競合プローブの濃度および反応の持続時間）に基づいて較正され得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、競合反応、コントロール反応または反応混合物における、あるパーセンテージの変異体Ｒａｓタンパク質を共有結合的に修飾する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、競合反応、コントロール反応または反応混合物における、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の変異体Ｒａｓタンパク質を共有結合的に修飾する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、競合反応、コントロール反応または反応混合物における、最大約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の変異体Ｒａｓタンパク質を共有結合的に修飾する。コントロール反応（例えば、１つまたはそれより多い試験化合物の非存在下における競合プローブおよび変異体Ｒａｓを含む反応）は、１つまたはそれより多い試験化合物による競合の効果を比較するためのベースラインを形成し得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、少なくとも約５μＭ（例えば、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたはそれより高い）の濃度で提供され、試験化合物の非存在下において約１０時間でまたは約１０時間より短い時間（例えば、８、７、６、５、４、３、２時間またはそれより短い時間）で少なくとも約８０％の修飾（例えば、８５％、９０％、９５％またはそれより高い）を達成する。いくつかの実施形態において、試験化合物の存在下における共有結合修飾は、試験化合物を欠くコントロール反応において得られる修飾の程度に対するパーセンテージとして表現される。例えば、試験化合物の存在は、変異体Ｒａｓの共有結合修飾を、コントロール反応と比べて約１０％、２５％、５０％、７５％、９０％もしくはそれを超えて、または少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、９０％もしくはそれを超えて、減少させ得る。
いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＣＰ−０２３（１−（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン）、ＣＰ−０２４（４−（６−クロロ−２−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）−８−フルオロ−７−（３−ヒドロキシナフタレン−１−イル）キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−カルバルデヒド）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
本開示の方法および組成物において有用なＲａｓ変異体は、１つまたはそれより多い変異（例えば、本明細書中に記載される変異体Ｒａｓタンパク質のいずれか）を含み得る。変異は、天然に存在する変異、または非特異的なもしくは標的化された変異誘発手順などによって人工的に作製された変異であり得る。導入され得る変異の例としては、挿入、欠失、置換および再配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、変異は、置換（例えば、アミノ酸の置換における）である。置換アミノ酸を導入するための位置は、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ結合競合プローブと反応できるほどＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットに十分近いが、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩポケット結合剤の結合特性を変更しないように、そのポケットの外側であるように、選択され得る（例えば、図２を参照のこと）。さらに、図３および図４に示されているように、低分子量ＧＴＰアーゼの配列空間にわたってある程度のバリエーションを示す位置が選択され得る。対照的に、コアの低分子量ＧＴＰアーゼの折り畳みにおける多くの位置が、そのファミリー全体にわたって変化しない。例えば、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の６２、９２または９５位に対する変異であり得る。
本開示のいくつかの実施形態において有用な変異は、システイン変異である。いくつかの実施形態において、そのシステイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しない。いくつかの実施形態において、そのシステイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在する。いくつかの実施形態において、そのシステイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在し、その変異体Ｒａｓは、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、そのシステイン変異は、非保存アミノ酸位置に存在する。通常、「保存アミノ酸」は、あるタンパク質ファミリーの同種の種またはメンバーにわたって類似の位置において同一であるかまたは機能的もしくは構造的に等価であるアミノ酸をいう。同一のアミノ酸または機能的もしくは構造的に等価なアミノ酸が、あるファミリーの少なくとも２、３、４、５個またはそれより多いメンバーにおいて見出される場合、そのようなアミノ酸は、高度に保存されていると見なされ得る。保存アミノ酸の例は、本明細書中に提供され、その他のものは、当該分野において認識されている。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、システイン変異のシステイン残基と反応することによって、変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾する。修飾は、（例えば、修飾されるべきシステイン残基のすぐ近くにおいて）変異体Ｒａｓに選択的に結合することなどによって、選択的であり得る。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に対する変異である。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２、９５位またはそれらの任意の組み合わせに存在する。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多いさらなる変異を含む。それらのさらなる変異は、１つまたはそれより多いシステイン変異を含み得る。いくつかの実施形態において、それらのさらなる変異は、システイン変異を含まない。さらなる変異の非限定的な例としては、置換、欠失および挿入が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７および１４６位のうちの１つまたはそれより多い位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対して１２、１３、１８、６１、１１７および１４６位のうちの１つまたはそれより多い位置に変異を含む。変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２位および１３位の一方または両方に変異を含み得る（例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２および／または１３位のアスパラギン酸）。例示的なＲａｓおよび変異体Ｒａｓの配列を表１に提供する。
いくつかの実施形態において、競合反応は、競合プローブに加えて、１つまたはそれより多い試験化合物（例えば、１、２、３、４、５、１０、２５、５０個またはそれより多い試験化合物）を含む。試験化合物は、試験化合物のライブラリー（例えば、１００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００個またはそれより多い化合物のライブラリー）から取り出され得る。いくつかの実施形態において、競合プローブと結合について競合する試験化合物は、変異体Ｒａｓに結合すると同定される。試験化合物は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化学結合を介してＲａｓと相互作用し得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットと相互作用する。通常、競合プローブとの競合の程度は、変異体Ｒａｓに対する試験化合物の親和性を示す。いくつかの実施形態において、試験化合物は、約または少なくとも約１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭまたは５００μＭのＫｄでＲａｓに結合する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、最大約１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭまたは５００μＭのＫｄでＲａｓに結合する。いくつかの実施形態において、競合プローブは、１００ｐＭ〜５０ｎｍまたは５００ｐＭ〜１ｎＭのＫｄでＲａｓに結合する。
いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＧＤＰに結合したＲａｓタンパク質に高くても１００μＭのＫｄで結合し、それによって、Ｒａｓ活性をアンタゴナイズする。Ｒａｓ活性のアンタゴナイズは、１つまたはそれより多いＲａｓの機能または下流の作用に関して、種々の方法で測定され得る。試験化合物によってアンタゴナイズされ得るＲａｓ活性の非限定的な例には、ＧＴＰアーゼ活性、ヌクレオチド交換、エフェクタータンパク質の結合、エフェクタータンパク質の活性化、グアニン交換因子（ＧＥＦ）の結合、ＧＥＦによって促進されるヌクレオチド交換、ホスフェートの放出、ヌクレオチドの放出、ヌクレオチドの結合、Ｒａｓの細胞内局在化、Ｒａｓの翻訳後プロセシングまたはＲａｓの翻訳後修飾の調整が含まれる。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＧＤＰもしくはＧＴＰのＲａｓタンパク質への結合または放出を阻害する。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれより多い試験化合物の存在下における変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少（例えば、競合プローブによる変異体Ｒａｓの修飾の減少によって示されるとき）は、その１つまたはそれより多い試験化合物のＲａｓアンタゴニスト活性を示す。したがって、競合プローブ結合のそのような減少に関連する試験化合物は、Ｒａｓアンタゴニストとして選択され得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、競合プローブの結合が、少なくとも指定された閾値の程度（例えば、パーセンテージとして表現される）だけ減少する場合、Ｒａｓアンタゴニストとして選択される。結合の減少は、コントロール反応（例えば、同じ量の時間にわたって反応される同じ濃度の競合プローブおよび変異体Ｒａｓを含むがいかなる試験化合物も含まない反応）に対して測定され得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少は、約５、１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％、または少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％である。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少は、少なくとも約７５％である。
競合プローブと変異体Ｒａｓとの間の結合の程度（およびその減少）は、任意の適切な方法によって測定され得る。選択される方法は、変異体Ｒａｓへの修飾の性質（例えば、検出可能な標識の付加および／または変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の複合体の形成）に依存し得る。アッセイ中に形成された競合プローブ−変異体Ｒａｓ複合体の好都合な検出のために、Ｒａｓ、変異体Ｒａｓまたは競合プローブが、検出可能な標識に結合体化され得る。適切な検出可能な標識としては、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれ得る。多種多様の適切な検出可能な標識が、当該分野で公知であり、それらとしては、蛍光標識、化学発光標識、放射性同位体標識、安定同位体標識、酵素標識およびリガンドが挙げられる。
検出可能な標識は、化合物の結合を切断しない任意の周知の化学的方法によって競合プローブまたは試験化合物に付加され得る。これは、適切なＸ線結晶構造（例えば、図２）において溶媒と接触する化合物の骨格上の位置を同定することによって、または長い置換基の付加が、その化合物がＲａｓに結合する能力に劇的に影響しない分子上の位置を同定することによって、および検出可能な標識をコアに直接または間接的に結合体化することによって確認され得る。ＣＰ−００１などの４−（ピペラジニル）キナゾリンコアに基づく化合物において、結合体化に適切な位置としては、Ｒ１が占有しているピペラジニル部分の４位の窒素またはキナゾリル部分の２位の炭素が挙げられる（がこれらに限定されない）。
いくつかの実施形態において、競合プローブまたは試験化合物は、式Ｉ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩を有し、式中：
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各々は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６の複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールは、５または６員環である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６の置換複素環、置換アリールまたは置換ヘテロアリールは、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたはそれより多い置換基で置換される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１またはＲ２は、検出可能な標識に結合体化されるか、または求電子剤を含む。いくつかの実施形態において、その求電子剤は、
およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシルおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、複素環、置換複素環およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｈである。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｈ、Ｃｌ、
ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン（例えば、Ｃｌ）および
からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｆ）である。
いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＩ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩によって表され、式中：
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換アルキルおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＩＩ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩によって表され、式中：
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換アルキルおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、複素環、置換複素環およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＶ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩によって表され、式中：
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｖ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩によって表され、式中：
Ｒ１１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式ＶＩ：
の構造または薬学的に許容され得るその塩によって表され、式中：
Ｒ１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、複素環、置換複素環、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ１２は、検出可能な標識に結合体化されるか、または求電子剤を含む。
いくつかの実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの化合物は、検出可能な標識に結合体化される。
本明細書中に記載される化学的実体は、本明細書中の１つもしくはそれより多い例証的なスキームおよび／または当該分野で公知の技法に従って合成され得る。本明細書中で使用される材料は、商業的に入手可能であるか、または当該分野で広く公知の合成方法によって調製される。これらのスキームは、実施例に列挙される化合物に限定されないか、またはいかなる特定の置換基によっても限定されず、それらは、例証的な目的で使用される。
様々な工程が、スキームＡ〜Ｃに記載され、示されるが、これらの工程は、場合によっては、スキームＡ〜Ｃに示されている順序と異なる順序で行われることがある。これらの合成反応スキームに対する様々な改変が、行われることがあり、本願に含まれる開示を参照した当業者に示唆される。
反対のことが明示されない限り、本明細書中に記載される反応は、大気圧で、通常、−１０℃〜２００℃の温度範囲内で行われる。さらに、別段明示される場合を除き、反応時間および反応条件は、近似である、例えば、ほぼ大気圧、約−１０℃〜約１１０℃の温度範囲内で約１〜約２４時間の期間にわたって行われると意図され；反応は、一晩平均して約１６時間の期間行われる。
いくつかの実施形態において、式ＩＩＩの競合プローブまたは試験化合物は、スキームＡによって合成的に入手される：
いくつかの実施形態において、式ＩＶの競合プローブまたは試験化合物は、スキームＢによって合成的に入手される：
いくつかの実施形態において、式Ｖの競合プローブまたは試験化合物は、スキームＣによって合成的に入手される：
検出可能な標識は、タンパク質の折り畳み／活性を乱さない種々の化学的方法のいずれかによってＲａｓ変異体に付加され得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、生理学的ｐＨの緩衝液中のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の存在下における、マレイミドに結合体化された適切なプローブとの反応を介して、Ｒａｓ上のシステインに結合体化される。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に結合体化された適切なプローブとの反応を介して、Ｒａｓ上のリジンに結合体化される。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ａ）まず、Ｌ−アジドホモアラニンまたはＬ−ホモプロパルギルグリシン（両方ともメチオニン残基の部位において組み込まれる）の存在下においてＲａｓを翻訳して、非天然のアミノ酸残基を組み込んだＲａｓを生成すること、およびｂ）その非天然のアミノ酸残基を有するＲａｓを、アジドまたはアルキンで誘導体化された検出可能なプローブと、適切な「クリック」化学反応条件下で反応させることによって、Ｒａｓに結合体化される。
蛍光標識には、タンパク質と非タンパク質の両方の有機フルオロフォア、ならびに有機金属フルオロフォアが含まれる。当業者に公知のタンパク質フルオロフォアとしては、緑色蛍光タンパク質（スペクトルの緑色領域の蛍光を発し、通常、５００〜５５０ナノメートルの波長を有する光を放射する蛍光タンパク質であるＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（スペクトルの青色領域の蛍光を発し、通常、４５０〜５００ナノメートルの波長を有する光を放射する蛍光タンパク質であるＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（スペクトルの赤色領域の蛍光を発し、通常、６００〜６５０ナノメートルの波長を有する光を放射する蛍光タンパク質であるＲＦＰ）が挙げられる。当業者に公知のタンパク質フルオロフォアの特定の実施形態は、さらに、これらのタンパク質の蛍光の特性を保持するそれらの変異体およびスペクトルバリアントを含み、それらの非限定的な例は、ＡｃＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ、ＡｍＣｙａｎ１、ＡＱ１４３、ＡｓＲｅｄ２、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＰ、ＣＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｃｏｐＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＤｓＲｅｄ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥｏｓＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＪＲｅｄ、Ｋａｔｕｓｋａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＥＣＦＰ、ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴｅａｌ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＷａｓａｂｉ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲｅＡｓＨ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｔｏｐａｚ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎおよびＺｓＹｅｌｌｏｗ１である。タンパク質フルオロフォアの特定の実施形態は、フィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質のフラグメントも含み、その非限定的な例は、Ａ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニン、ＸＬ６６５またはｄ２である。当業者に公知の非タンパク質有機フルオロフォアとしては、キサンテン誘導体（その一般例は、フルオレセイン、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、エオシンおよびテキサスレッドである）、シアニン誘導体（その一般例は、シアニン、インドカルボシアニン、オキサコルボシアニン、チアカルボシアニンおよびメロシアニンである）、スクアライン誘導体（その一般例は、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびＳｑｕａｒｅ色素である）、ナフタレン誘導体（その一般例は、ダンシルおよびプロダンである）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体（その一般例は、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾールである）、アントラセン誘導体（その一般例は、アントラキノン、例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅである）、ピレン誘導体（その一般例は、カスケードブルーである）、オキサジン誘導体（その一般例は、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｒｅｓｙｌ Ｖｉｏｌｅｔおよびオキサジン１７０である）、アクリジン誘導体（その一般例は、プロフラビン、アクリジンオレンジおよびアクリジンイエローである）、アリールメチン誘導体（その一般例は、オーラミン、クリスタルバイオレットおよびマラカイトグリーンである）およびテトラピロール誘導体（その一般例は、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、フタロシアニンおよびビリルビンである）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような有機フルオロフォアは、化学的結合を容易にするために、アミノ、ヒドロキシルまたはスクシンイミド基でさらに誘導体化され得る。非タンパク質有機フルオロフォアは、近ＩＲ ＨＴＲＦアクセプターｄ２も含む。有機金属フルオロフォアには、ランタニドイオンキレートが含まれ、その非限定的な例としては、トリス（ジベンゾイルメタン）モノ（１，１０−フェナントロリン）ユウロピウム（ｌｌｌ）、トリス（ジベンゾイルメタン）モノ（５−アミノ−１，１０−フェナントロリン）ユウロピウム（ｌｌｌ）およびＬｕｍｉ４−Ｔｂクリプテートが挙げられる。
化学発光標識としては、適切な基質および補因子と組み合わされたとき光を発するルシフェラーゼクラスの酵素が挙げられる。異なる一次配列および異なる補因子の要件を有する商業的に使用される様々な組換えルシフェラーゼがある。非限定的な例としては、ウミホタル、ガウシア、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼが挙げられる。
酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよび他の周知の標識が挙げられる。そのような標識の存在または結合は、検出域において上記酵素と反応した際に検出可能なシグナルを生成する基質を含む組成物である検出試薬の適用によって検出され得る。検出可能なシグナルは、比色シグナルまたは発光シグナルであり得る。酵素−検出試薬対の一例として、ＨＲＰは、Ｈ２Ｏ２の存在下においてルミノールと反応すると青色光を生成する。酵素−検出試薬対の別の例として、ＡＰは、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）と組み合わされると、黄色の反応産物を生成する。酵素標識は、それらを抗体に結合体化するために用いられる方法と同様の方法によって、Ｒａｓのアミノ基またはスルフヒドリル基に結合体化され得る。そのような方法としては、グルタルアルデヒドを用いる架橋、またはヘテロ二官能性架橋剤（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ））を用いる２工程の架橋が挙げられる。
放射性同位体標識としては、３Ｈ、１４Ｃ、２２Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、４２Ｋ、４５Ｃａ、５９Ｆｅ、１２５Ｉ、および２０３Ｈｇなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような放射性同位体標識は、本発明の小分子もしくはタンパク質に結合体化され得るか、または本発明のタンパク質もしくは小分子の明確な構造に組み込まれ得る。前者の一例として、タンパク質上または小分子上のアミノ基が、１４Ｃ−パラホルムアルデヒドと反応した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応することにより、還元的アミノ化を介して、検出可能な１４Ｃ−メチル基が付加され得る。後者の一例として、あるタンパク質が、３５Ｓ−メチオニンの存在下において翻訳されることにより、メチオニン残基の部位に検出可能な３５Ｓ原子を有するタンパク質が生成され得る。
検出に適した安定同位体標識は、本発明の小分子もしくはタンパク質に結合体化され得るかまたは本発明のタンパク質もしくは小分子の明確な構造に組み込まれ得る、生体分子に存在する元素の特定の重同位体（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓ）を組み込んでいる化学的部分を含む。前者の一例として、アミノ基（タンパク質上または小分子上の）が、１３Ｃ−アセトアルデヒドまたは１３Ｃ−塩化アセチルと反応することにより、検出され得るアセチル部分が共有結合的に付加され得る。後者の一例として、あるタンパク質が、１３Ｃ−アルギニンの存在下において翻訳され得る（ことにより、アルギニン残基の部位に検出可能な１３Ｃ原子を含むタンパク質が生成される）か、または無水酢酸を利用する小分子合成工程が、１３Ｃ−無水酢酸を代わりに用いて、既存のアセチル基の部位に検出可能な１３Ｃ原子を有する分子を生成し得る。安定同位体標識に対する商業的用途および研究用途での多くの一般的合成法は、放射性同位体標識にも有用であり、逆もまた同じである。
検出に適したリガンドは、十分に特徴づけられたレセプターパートナーが利用可能であるリガンドであり、リガンド−レセプター相互作用が、そのリガンドの検出または単離に役立つ。リガンド／レセプター対は、天然または非天然であり得る。天然のリガンド−レセプター対の非限定的な例としては、マルトース／マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合タンパク質、ＩｇＧ／プロテインＧ、ＩｇＧ／プロテインＡおよびビオチン／ストレプトアビジンが挙げられる。非天然のリガンド／レセプター対の非限定的な例としては、ポリヒスチジン／Ｎｉ−ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）、ＦＬＡＧペプチド／抗ＦＬＡＧ抗体が挙げられる。リガンド／レセプター対は、「クリック」反応対の場合のように２つの小分子フラグメントも含み得る（例えば、アジド／アルキン（Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化）、アジド／シクロオクチン（Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化）またはアジドとホスフィンまたはホスファイト（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション））。
標識を検出または定量するために用いられる検出方法は、典型的には、選択された標識に依存する。例えば、放射標識（例えば、放射性同位体標識）は、写真フィルムまたはホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を用いて検出され得る。安定同位体標識（例えば、１３Ｃ−アセチル）は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）または質量分析（ＭＳ）によって検出され得る。蛍光標識（例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質）は、放射光を検出する光検出器を用いて、検出され、定量され得る。いくつかの実施形態において、単一反応における複数のプローブの各々が、異なる標的に対応するシグナルを区別できるように、異なる検出可能な標識（例えば、異なる発光スペクトルを有する蛍光色素）に結合体化される。いくつかの実施形態において、検出可能な標識として使用される蛍光色素は、その蛍光色素に結合体化された元素の結合または近接がフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出され得るように、発光スペクトルと吸収スペクトルとが重複する。ＦＲＥＴの検出に適したいくつかの方法が当業者に知られており、その非限定的な例は、増感発光（ＳＥ）、アクセプターブリーチング（ＡＢ）、ドナークエンチングおよび蛍光寿命分光法である。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供すること、および基質に対する酵素の作用によって生成された反応産物を測定することによって検出される。比色標識は、典型的には、有色の標識を可視化することによって検出されるか、または分光光度計を用いて定量される。いくつかの実施形態において、競合プローブへの結合または競合プローブによる修飾は、質量分析によって測定される。
競合プローブは、その検出を容易にする標識を保持し得る。特定の実施形態において、その標識は、蛍光標識である。しかしながら、検出可能な標識は、蛍光標識である必要はない。競合プローブの変異体Ｒａｓへの結合の、または競合プローブによる変異体Ｒａｓの共有結合修飾の検出を可能にする任意の標識を使用してよい。蛍光標識された競合プローブを検出するための１つの方法は、標識された競合プローブに特異的な波長のレーザー光を使用すること、または他の適切な照射源を使用することを含む。競合プローブ上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段によって検出され得る。
本明細書中に記載される変異体Ｒａｓタンパク質および競合プローブは、ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットに対する可逆的バインダーをスクリーニングするための競合結合アッセイに使用され得る。実施形態に従った例示的な図解が、図１に示されている。いくつかの実施形態において、質量分析ベースのアッセイは、タンパク質−リガンド複合体を評価することによって、または過剰なタンパク質の存在下において競合プローブの枯渇をモニタリングすることによって、行われる。これらのアッセイの両方において、試験化合物の大きなライブラリー（例えば、１００，０００個を超える化合物のライブラリー）のスクリーニングを可能にするために、自動化されたハイスループット固相抽出−質量分析プラットフォーム（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲａｐｉｄＦｉｒｅ）が使用され得る。蛍光タグを導入するために本明細書中に記載される競合プローブを修飾することによって、蛍光偏光またはＦＲＥＴなどのさらなるアッセイ形式が、使用され得る。親和性タグ（例えば、ビオチン）による競合プローブの修飾は、ＥＬＩＳＡまたはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎなどのさらなるアッセイ形式を可能にし得る。
１つの態様において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、本明細書中に記載される方法のいずれかに従ってＲａｓアンタゴニストを選択する工程およびその化合物を合成する工程を含む。化合物は、任意の適切なプロセスに従って合成され得る。本明細書中に開示される方法に従ってＲａｓアンタゴニストと同定された化合物は、１つまたはそれより多いＲａｓ活性（それらの例は上に記載されている）に対する影響を評価するためにさらに試験され得る。化合物は、個体における変異体Ｒａｓに媒介される状態の処置に使用するためにも調製され得る。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って選択されたＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩を含む薬学的組成物を提供する。本開示の組成物および方法は、処置を必要とする個体を処置するために利用され得る。ある特定の実施形態において、その個体は、ヒトなどの哺乳動物または非ヒト哺乳動物である。ヒトなどの動物に投与したとき、上記組成物または化合物は、好ましくは、例えば、本明細書中に記載される方法、キット、システムまたはコンピュータ可読媒体のいずれかに従って選択されるＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物として投与されるか、または上記薬学的組成物として投与するために製剤化される。
本開示に係るＲａｓアンタゴニストは、任意の適切な投与経路（その経路は製剤の性質に依存し得る）によって個体に投与され得る。適切な投与経路には、経口、静脈内、直腸、エアロゾル、非経口、眼、肺、経粘膜、経皮、膣、耳、鼻、および局所への投与が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ほんの一例として、非経口送達には、筋肉内、皮下、静脈内、髄内への注射、ならびに髄腔内、直接的な脳室内、腹腔内、リンパ管内、および鼻腔内への注射が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は経口投与のために製剤化されている。他の実施形態では、薬学的組成物は注射のために製剤化されている。なおさらなる実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に開示の化合物およびさらなる治療薬（例えば、抗がん剤）を含む。かかる治療薬の非限定的な例を、本明細書中の以下に記載する。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書中に記載される方法、キット、システムまたはコンピュータ可読媒体のいずれかに従って選択されるＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩、および他の化学的成分（例えば、キャリア、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および／または賦形剤）を含む薬学的に許容され得るキャリアの混合物である。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。本明細書中に提供される処置方法もしくは使用方法を実施するいくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法、キット、システムもしくはコンピュータ可読媒体のいずれかに従って選択される治療有効量のＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩が、薬学的組成物として、処置されるべき疾患、障害または病状を有する哺乳動物に投与される。特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。ある特定の実施形態において、治療有効量は、種々の因子（疾患の重症度、被験体の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効力および他の因子を含むがこれらに限定されない）のうちの１つまたはそれより多くの因子に応じて変動する。本明細書中に記載される方法、キット、システムまたはコンピュータ可読媒体のいずれかに従って選択されるＲａｓアンタゴニストまたは薬学的に許容され得るその塩および薬学的に許容され得るキャリアは、単独で、または混合物の成分として１つもしくはそれより多くの治療薬と組み合わせて、使用され得る。
１つの態様において、本開示は、１つまたはそれより多い変異体Ｒａｓ、その変異体Ｒａｓに結合することができる１つまたはそれより多い競合プローブ、および１つまたはそれより多い試験化合物を含む反応混合物を提供する。変異体Ｒａｓは、本明細書中に記載される任意の変異体Ｒａｓであり得る。１つまたはそれより多い競合プローブは、２つまたはそれより多い競合プローブ（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２５、５０個またはそれより多い競合プローブ）の組み合わせを含む、本明細書中に記載される任意の競合プローブであり得る。１つまたはそれより多い試験化合物は、化合物のライブラリーからの１つまたはそれより多い試験化合物（例えば、１０００、１００００、５００００、１０００００個またはそれより多い化合物のライブラリーからの約１、２、３、４、５、１０、１５、２５、５０個またはそれより多い試験化合物）を含む種々の試験化合物のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、システイン変異を含み；競合プローブは、そのシステイン変異において変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができ；試験化合物は、競合プローブによる変異体Ｒａｓの共有結合修飾を阻害する。反応混合物は、様々な態様のいずれかに関して本明細書中に開示される１つまたはそれより多いエレメントを任意の組み合わせで含み得る。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しない。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の１２または１３位に対する変異である。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在し、変異体Ｒａｓは、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、システイン変異は、非保存アミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態において、システイン変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１の６２、９２または９５位に対する変異である。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む。いくつかの実施形態において、試験化合物は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化学結合を介してＲａｓと相互作用する。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットと相互作用する。
競合反応、コントロール反応または反応混合物における１つまたはそれより多い反応パラメータ（例えば、添加の順序、温度、反応の持続時間または反応時間、反応成分の量または同一性（例えば、変異体Ｒａｓ、競合プローブ、試験化合物）、濃度（例えば、変異体Ｒａｓの濃度、競合プローブの濃度、試験化合物の濃度）、化学量論（例えば、競合プローブと変異体Ｒａｓとの比、試験化合物と変異体Ｒａｓとの比、試験化合物と競合プローブとの比）、バッファ組成、ｐＨおよび反応サイト）が、調整され得る。１つまたはそれより多い反応パラメータは、反応の程度（例えば、結合または共有結合修飾）に影響するように調整され得る。
変異体Ｒａｓ、競合プローブおよび試験化合物は、競合反応または反応混合物に同時にまたは任意の順序で逐次的に添加され得る。変異体Ｒａｓおよび競合プローブは、競合反応、コントロール反応または反応混合物に同時にまたは任意の順序で逐次的に添加され得る。競合反応、コントロール反応または反応混合物は、複数の工程を含み得、それらの工程としては、結合、反応、共有結合修飾、混合、加熱、冷却、変性および再生が挙げられるが、これらに限定されない。競合反応、コントロール反応または反応混合物における工程は、所与の工程の目的を達成するために適した任意の温度または温度勾配を含み得る。適切な温度としては、室温；約１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０℃；ならびにそれより高い温度が挙げられ得るが、これらに限定されない。競合反応、コントロール反応または反応混合物における工程は、所与の工程の目的を達成するために適した任意の持続時間のものであり得る。適切な持続時間としては、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０および５５秒；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０および５５分；ならびに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４時間およびそれより長い時間（手作業で中断されるまで無期限に含む）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、競合プローブは、本明細書中に開示される１つまたはそれより多いパラメータに従って選択される。いくつかの実施形態において、競合プローブは、試験化合物の非存在下において、変異体Ｒａｓの約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％が、結合されるかまたは共有結合的に修飾される（例えば、システイン変異などの置換アミノ酸において）ように選択され得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、試験化合物の非存在下において、変異体Ｒａｓの最大約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、結合されるかまたは共有結合的に修飾される（例えば、システイン変異などの置換アミノ酸において）ように選択され得る。コントロール反応（例えば、１つまたはそれより多い試験化合物の非存在下における競合プローブおよび変異体Ｒａｓを含む反応）は、１つまたはそれより多い試験化合物による競合の効果を比較するためのベースラインを形成し得る。いくつかの実施形態において、競合プローブは、少なくとも約５μＭ（例えば、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたはそれより高い）の濃度で提供され、試験化合物の非存在下において約１０時間でまたは約１０時間より短い時間（例えば、８、７、６、５、４、３、２時間またはそれより短い時間）で少なくとも約８０％の修飾（例えば、８５％、９０％、９５％またはそれより高い）を達成する。
いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物は、１つまたはそれより多い変異体Ｒａｓタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物は、約１、２、３、４、５、１０、１５、２５、５０種またはそれより多い変異体Ｒａｓタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物は、例えば、部位飽和変異誘発によって、１つまたはそれより多い位置にタンパク新生のアミノ酸変異を有するすべてのＲａｓ変異体を含み得る。いくつかの実施形態において、部位飽和変異誘発は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、１２、１３、１８、６１、１４６位およびそれらの任意の組み合わせ）から選択される１つまたはそれより多い位置において行われる。複数の異なるＲａｓ変異体との結合を評価するためのアッセイは、別個の反応混合物中の各Ｒａｓ変異体について並行して行われ得る。
反応混合物の様々な成分の濃度は、所与の条件セット下において、適切性について選択され得る。例えば、競合反応、コントロール反応または反応混合物における変異体Ｒａｓの濃度は、約５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１ｍＭまたはそれより大きいか、またはおよそこれを上回り得る。変異体Ｒａｓの濃度は、競合プローブの濃度に基づいて選択することができ、または逆でもよい。例えば、変異体Ｒａｓは、競合プローブの濃度に対して１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、またはそれより大きく過剰に存在し得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブの濃度は、約５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたは２００μＭであるか、またはおよそこれを上回る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブの濃度は、約５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ未満である。いくつかの実施形態において、競合反応または反応混合物における試験化合物の濃度は、約５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたは２００μＭであるか、またはおよそこれを上回る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における試験化合物の濃度は、約５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ未満である。
いくつかの実施形態において、競合プローブ、試験化合物またはその両方は、競合反応、コントロール反応または反応混合物において変異体Ｒａｓと比べて過剰な量で提供され得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブ、試験化合物またはその両方と比べて過剰な量で提供され得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブおよび／または試験化合物の変異体Ｒａｓに対する比は、飽和していてよい。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブおよび／または試験化合物の変異体Ｒａｓに対する比は、飽和していなくてよい。その比は、濃度、モルまたは質量に関して計算され得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブおよび／または試験化合物の変異体Ｒａｓに対する比は、約または少なくとも約０．００１；０．００２；０．００３；０．００４；０．００５；０．００６；０．００７；０．００８；０．００９；０．０１；０．０２；０．０３；０．０４；０．０５；０．０６；０．０７；０．０８；０．０９；０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００または１，０００であり得る。いくつかの実施形態において、競合反応、コントロール反応または反応混合物における競合プローブおよび／または試験化合物の変異体Ｒａｓに対する比は、最大約０．００１；０．００２；０．００３；０．００４；０．００５；０．００６；０．００７；０．００８；０．００９；０．０１；０．０２；０．０３；０．０４；０．０５；０．０６；０．０７；０．０８；０．０９；０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００または１，０００であり得る。いくつかの実施形態において、比は、０．００１〜１０００、０．０１〜１００、０．１〜５０または１〜１０である。
いくつかの実施形態において、試験化合物は、競合反応または反応混合物において、競合プローブと比べて過剰な量で提供され得るか、またはその逆も同じである。いくつかの実施形態において、競合反応または反応混合物における試験化合物の競合プローブに対する比は、飽和していてよい。いくつかの実施形態において、競合反応または反応混合物における試験化合物の競合プローブに対する比は、飽和していなくてよい。その比は、濃度、モルまたは質量に関して計算され得る。いくつかの実施形態において、競合反応または反応混合物における試験化合物の競合プローブに対する比は、約０．００１；０．００２；０．００３；０．００４；０．００５；０．００６；０．００７；０．００８；０．００９；０．０１；０．０２；０．０３；０．０４；０．０５；０．０６；０．０７；０．０８；０．０９；０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００または１，０００あるいはおよそこれを上回るであり得る。いくつかの実施形態において、競合反応または反応混合物における試験化合物の競合プローブに対する比は、最大約０．００１；０．００２；０．００３；０．００４；０．００５；０．００６；０．００７；０．００８；０．００９；０．０１；０．０２；０．０３；０．０４；０．０５；０．０６；０．０７；０．０８；０．０９；０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００または１，０００であり得る。いくつかの実施形態において、比は、０．００１〜１０００、０．０１〜１００、０．１〜５０または１〜１０である。
競合反応、コントロール反応または反応混合物は、１つまたはそれより多いバッファを含み得、その非限定的な例としては、炭酸ナトリウムバッファ、炭酸水素ナトリウムバッファ、ホウ酸バッファ、リン酸バッファ、Ｔｒｉｓバッファ、ＭＯＰＳバッファ、ＨＥＰＥＳバッファおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。バッファは、任意選択で、塩化ナトリウム、塩化カリウム、１つまたはそれより多い他の塩およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。競合反応、コントロール反応または反応混合物は、任意の適切な反応サイトに含められ得る。その反応サイトは、容器（例えば、マルチウェルプレートのウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、マイクロ流体デバイスのチャンバーもしくはチャネル、またはチップ）であり得る。その反応サイトは、溶液内の区画、例えば、液滴（例えば、エマルジョン（ｅｍｅｒｓｉｏｎ）混合物内の）であり得る。
開示されるアッセイは、反復様式で行われ得る。例えば、本明細書中に開示されるＲａｓタンパク質のいずれかに対する所望の結合特性を有する最初の試験化合物が、スクリーニングアッセイのその後のラウンドにおいて競合プローブとして使用され得る。所望であれば、その試験化合物が本明細書中に開示されるＲａｓ変異体に共有結合的に結合するように、まず、その試験化合物を修飾して、反応性部分を組み込むことができる。そのような試験化合物は、例えば、最初の試験化合物と比較してＲａｓ変異体タンパク質に対してより高い結合親和性を有する試験化合物を他の候補についてスクリーニングするための競合プローブとして役立ち得る。この反復プロセスによって、改善された確認された特性（より高い結合親和性、特定のＲａｓタンパク質に対するより高い選択性、またはより高い結合の会合速度もしくは解離速度を含むがこれらに限定されない）を有する試験化合物の継続的なスクリーニングが可能になり得る。
１つの態様において、本開示は、置換アミノ酸を含む変異体Ｒａｓを提供する。変異体Ｒａｓにおけるアミノ酸置換の例は、上に提供されている。いくつかの実施形態において、（ａ）置換アミノ酸は、変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする反応性アミノ酸であり；（ｂ）置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸でない。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸は、システイン、リジン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸は、システインである。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、Ｒａｓにおける非保存位置に存在する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、６４、６５、６９、７４、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０６位およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２、９５位およびそれらの任意の組み合わせ）から選択される位置に存在する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位におけるシステインである。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、天然アミノ酸、標準的なアミノ酸、非標準的なアミノ酸、非カノニカルアミノ酸、必須アミノ酸、非必須アミノ酸または非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、正に帯電した側鎖、負に帯電した側鎖、極性の無電荷側鎖、非極性の側鎖、疎水性側鎖、親水性側鎖、脂肪族側鎖、芳香族側鎖、環状側鎖、非環状側鎖、塩基性側鎖または酸性側鎖を有する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、求核性または求電子性の側鎖を有する。
いくつかの実施形態において、（ａ）置換アミノ酸は、変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする反応性アミノ酸であり；（ｂ）置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸であり；（ｃ）変異体Ｒａｓは、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸は、システインである。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体Ｒａｓに結合することができる。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、本明細書中に記載されるＲａｓ変異のうちのいずれか１つまたはそれより多いＲａｓ変異を含む１つまたはそれより多いさらなる変異を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１８、６１、１４６位およびそれらの任意の組み合わせ）から選択される位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対するＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｖ１４Ｇ、Ｖ１４Ｉ、Ａ１８Ｄ、Ａ１８Ｔ、Ｌ１９Ｆ、Ｑ２２Ｋ、Ａ５９Ｔ、Ｇ６０Ｅ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖおよびその任意の組み合わせから、例えば、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ａ１８Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔおよびその任意の組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＫＲＡＳである。いくつかの実施形態において、変異体ＫＲＡＳにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１または配列番号２に対するＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ａ１４６Ｔ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１２Ｇ１３Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１３Ｄ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ａ１４６Ｔ、Ｇ１３Ｄ、Ａ５９Ｔ、Ｖ１４Ｉ、Ｑ２２Ｋ、Ｇ１２Ｆ、Ｋ１１７Ｎ、Ｑ６１Ｐ、Ｌ１９Ｆ、Ｋ１１７Ｎ、Ｇ１２Ｃ、Ｌ１９Ｆ、Ｑ６１Ｅ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｇ、Ｑ６１Ｋ、Ｖ１４Ｇ、Ｑ６１Ｌ、Ａ１８Ｄ、Ｇ１２Ｇ、Ｅ６３Ｋ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ｇ、Ｇ１０＿Ａ１１ｉｎｓＧ、Ｇ１２Ｖ、Ｌ１９Ｆ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ｉ、Ｇ６０Ｇ、Ｇ１２Ｎ、Ｄ１７３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｔ５８Ｉ、Ｇ１２＿Ｇ１３ｉｎｓＧ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ｋ５Ｅ、Ｇ１２Ｇ、Ｇ６０Ｄ、Ｌ２３Ｒ、Ｑ２２Ｑ、Ｇ１２Ｙ、Ａ１１Ｖ、Ｇ１２Ｗ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１３＿Ｖ１４ｉｎｓＧ、Ａ１１＿Ｇ１２ｉｎｓＧＡ、Ｇ１０Ｒ、Ａ６６＿Ｍ６７ｉｎｓＥＥＹＳＡ、Ｇ１３Ｇ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１２Ｅ、Ｑ２２Ｒ、Ｄ３３Ｅ、Ｖ８Ｖ、Ｐ３４Ｌ、Ｖ９Ｉ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｅ、Ｓ１７Ｇ、Ｄ５７Ｎ、Ｔ３５Ｉ、Ｍ７２Ｖ、Ｇ６０Ｇ、Ｙ６４Ｎ、Ｉ２４Ｎ、Ｅ３１Ｋ、Ｇ１３Ｅ、Ｇ１３Ｆ、Ｔ３５Ａ、Ｇ１３Ｎ、Ｇ１０Ｅ、Ａ１１Ｐ、Ａ１８Ｖ、Ｄ９２Ｙ、Ａ５９Ｔ、Ｇ１５Ｄ、Ｑ６１Ｒ、Ｄ６９Ｇ、Ｇ１２Ｄ、Ｙ６４Ｈ、Ｔ２０Ｔ、Ｇ１０Ｇ、Ｋ５Ｒ、Ｋ１４７Ｎ、Ｌ２３Ｌ、Ｒ１６４Ｑ、Ｔ２０Ｍ、Ｄ１５４ｄｅｌＤ、Ｇ１０Ｇ、Ｇ１０＿Ａ１１ｉｎｓＧ、Ｓ１３６Ｎ、Ｍ７２Ｔ、Ｇ１３Ｎ、Ｔ２０Ｔ、Ｅ３ｆｓ＊３、Ｇ１２Ｇ、Ｓ１７Ｎ、Ｋ８８Ｋ、Ｐ１４０Ｓ、Ｇ１２Ｌ、Ｒ１６１＊、Ｅ３１Ｑ、Ｑ６１Ｄ、Ｋ１１７Ｅ、Ｇ１２ｆｓ＊３、Ｒ１０２ｆｓ＊２、Ｖ７Ｅ、Ｇ６０Ｒ、Ｑ７０Ｐ、Ｈ２７Ｎ、Ｔ２０Ｓ、Ｃ１８５Ｓ、Ｅ６２Ｋ、Ｇ１３８Ｒ、Ｇ６０Ａ、Ｉ２４Ｖ、Ｖ１４Ｌ、Ｅ６２Ｄ、Ｒ１６４Ｒ、Ｓ６５Ｉ、Ｑ６１Ｋ、Ｐ３４Ｓ、Ｋ５Ｎ、Ｇ１３Ｙ、Ｈ９５Ｌ、Ｉ２１Ｒ、Ｎ８６Ｋ、Ｇ１２Ｗ、Ｄ９２Ｇ、Ｄ６９ｆｓ＊４、Ｍ７２Ｉ、Ｖ１４Ａ、Ｇ１５Ｇ、Ｅ６３Ｋ、Ｇ１５Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ｑ２２＊、Ｔ７４Ｔ、Ｇ１３Ｒ、Ｍ６７Ｌ、Ｇ１３８Ｅ、Ｃ１８５Ｒ、Ｐ１２１Ｈ、Ｌ１９＿Ｔ２０＞ＦＡ、Ｇ１２＿Ｇ１３ｉｎｓＧ、Ｉ３６Ｍ、Ｅ６３Ｅ、Ｒ６８Ｇ、Ｋ１１７Ｒ、Ｅ６３ｄｅｌ、Ｔ３５Ｔ、Ｔ２０Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｌ６Ｆ、Ａ５９Ａ、Ｃ８０Ｓ、Ｈ２７Ｌ、Ｇ７７Ａ、Ｍ７２＿Ｒ７３ｉｎｓ１５、Ｑ６１Ｒ、Ｐ１２１Ｓ、Ｃ１１８Ｓ、Ｇ１３Ｍ、Ｆ１５６Ｌ、Ｉ３６Ｌ、Ｅ４９＊、Ｄ３０Ｅ、Ｔ５８Ｔ、Ｇ１２Ｖ、Ｄ３３Ｅ、Ａ１３４Ｔ、Ｇ１３Ｒ、Ｃ５１Ｃ、Ｔ５８＿Ａ５９ｉｎｓＶＡ、Ｄ３３Ｅ、Ｇ１２Ｅ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ８８＊、Ｒ１６４Ｒ、Ｇ１２Ｖ９Ｆ、Ｒ９７Ｉ、Ｇ１３Ｐ、Ｇ１３Ｃ、Ａ１４６Ａ、Ｅ６２＿Ｓ６５＞Ｄ、Ａ５９Ａ、Ｋ１６＿Ｓ１７ｉｎｓＷ、Ａ１１Ｔ、Ａ１１Ａ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ９＿Ｇ１０ｉｎｓＶ、Ｋ５Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｖ８Ａ、Ｇ６０Ｖ、Ｇ１５Ｇ、Ｆ２８Ｓ、Ａ１４６Ｇ、Ｒ７３Ｍ、Ｔ１２７Ｉ、Ｍ１８８Ｌ、Ｅ９８＊、Ｓ６５＿Ａ６６ｉｎｓ１５、Ａ５９ｄｅｌ、Ｔ７４Ｐ、Ｔ１８３＿Ｋ１８４ｄｅｌＴＫ、Ｔ７４Ｔ、Ｄ１５３Ｖ、Ｇ１３Ｅ、Ｖ７Ｍ、Ｇ１２Ｌ、Ｙ６４Ｄ、Ｅ９１Ｋ、Ｇ６０Ｖ、Ｇ１３＿Ｖ１４＞ＤＩ、Ｈ２７Ｈ、Ｉ２４Ｆ、Ｃ８０Ｙ、Ｋ１６Ｒ、Ｈ２７Ｎ、Ｇ６０ｆｓ＊２７、Ｅ３７Ｋ、Ｄ１５３Ｎ、Ｅ６２Ｇ、Ｅ４９Ｋ、Ｐ１１０Ｓ、Ｙ７１Ｃ、Ｌ５２Ｆ、Ｖ４５Ｖ、Ｖ１４＿Ｇ１５ｉｎｓＧ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２＿Ｇ１３ｉｎｓＡＧ、Ａ５９Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｔ５８Ｉ、Ｇ１３Ｖ、Ｒ６８Ｍ、Ｇ１２Ｔ、Ｋ１１７Ｒ、Ｖ９Ｖ、Ｌ２３Ｉ、Ｒ１３５Ｔ、Ｔ２０Ｒ、Ａ１３０Ｖ、Ｒ６８Ｓ、Ｇ１３Ｉ、Ｇ１２＿Ｇ１３ｉｎｓＡ、Ｒ１６４Ｌ、Ｅ４９Ｋおよびその任意の組み合わせから；例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ａ１４６Ｔ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１３Ａ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ｖ、Ａ５９Ｔ、Ｖ１４Ｉ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ６１Ｐ、Ｌ１９Ｆ、Ｋ１１７Ｎ、Ｇ１２Ｌ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ１４Ｇ、Ａ１４６Ｐ、Ｅ６３Ｋ、Ａ１８Ｄおよびその任意の組み合わせから；例えば、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ａ１８Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、Ｋ１１７Ｎおよびその任意の組み合わせから選択され得る。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＨＲＡＳである。いくつかの実施形態において、変異体ＨＲＡＳにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号３に対するＧ１３Ｒ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｈ２７Ｈ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｇ１３Ｓ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１２Ｒ、Ｑ６１Ｒ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｙ４Ｈ、Ｅ６２Ｇ、Ｑ６１Ｋ、Ｙ４ｆｓ＊２、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｖ８１Ｍ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１１Ｓ、Ａ１１Ａ、Ｇ１３Ｉ、Ａ１８Ｖ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｒ、Ｍ７２Ｉ、Ｒ１２３Ｈ、Ｐ１７９Ｌ、Ｅ３ｆｓ＊１７、Ｇ１０＿Ａ１１ｉｎｓＧ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２＿Ｇ１３ｉｎｓＡＧ、Ｇ１２Ｇ１２Ｔ、Ｇ１３Ｇ、Ｖ１４Ｇ、Ｖ１４Ｖ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｄ、Ｓ１７Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ａ１８Ａ、Ｔ２０Ｉ、Ｑ２２＊、Ｑ２５Ｌ、Ｙ３２＊、Ｙ３２Ｙ、Ｇ４８Ｒ、Ｔ５８Ｉ、Ａ５９Ａ、Ｇ６０Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｑ、Ａ６６Ｔ、Ｍ７２Ｉ、Ｔ７４Ｔ、Ｆ７８Ｆ、Ａ８３Ｄ、Ａ８３Ｖ、Ｅ９１Ｋ、Ｄ９２Ｎ、Ｒ１０２Ｌ、Ｄ１０８Ｙ、Ｐ１１０Ｐ、Ｋ１１７Ｅ、Ｄ１１９Ｎ、Ｄ１１９Ｈ、Ｄ１１９Ｄ、Ｌ１２０Ｖ、Ｒ１２８Ｌ、Ａ１３０Ｔ、Ｌ１３３Ｒ、Ａ１３４Ｓ、Ｒ１３５＊、Ｒ１３５Ｑ、Ｉ１３９Ｉ、Ｅ１４３Ｋ、Ｒ１４９ｆｓ＊２３、Ｌ１８８Ｆおよびその任意の組み合わせから；例えばＧ１３Ｒ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｓ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１３Ｃおよびその任意の組み合わせから選択され得る。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＮＲＡＳである。いくつかの実施形態において、変異体ＮＲＡＳにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号４に対するＱ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｌ、Ｇ１２Ｓ、Ｑ６１Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ａ１８Ｔ、Ｑ６１Ｅ、Ｇ６０Ｅ、Ｑ６１Ｑ、Ａ５９Ｔ、Ｒ６８Ｔ、Ｇ１２Ｄ、Ａ１４６Ｔ、Ｑ６１Ｒ、Ｇ１３Ｇ、Ｅ６２Ｑ、Ａ５９Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ａ１１Ｔ、Ｇ１０Ｅ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｌ、Ｄ９２Ｎ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ７５Ｇ、Ｓ６５Ｃ、Ｇ１２Ｖ、Ｅ６２ｆｓ＊６、Ｔ５８Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ２２Ｋ、Ｄ１５４Ｇ、Ｇ１２Ｎ、Ｙ６４Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ５９Ａ、Ｔ５８Ｉ、Ｐ１８５Ｓ、Ｇ１２Ｓ、Ｅ１３２Ｋ、Ｔ５０Ｉ、Ｇ１０Ｇ、Ｑ６１Ｒ、Ｇ１２Ｇ、Ｇ１２Ｇ、Ｇ１２Ｐ、Ｈ１３１Ｒ、Ｙ４Ｃ、Ｔ２０Ｉ、Ｌ１９Ｌ、Ｑ４３＊、Ｋ１６Ｎ、Ｓ８７Ｃ、Ｐ１４０Ｐ、Ｔ５８Ｉ、Ｓ８７ｆｓ＊１７、Ｖ１１２Ｌ、Ｓ６５Ｒ、Ｒ９７Ｇ、Ｑ６１Ｋ、Ｔ５８Ａ、Ｇ１３８Ｒ、Ｔ７４Ｓ、Ｑ６１Ｓ、Ｇ６０Ｅ、Ｇ１５Ｒ、Ａ５９ｆｓ＊４、Ｍ７２Ｉ、Ｇ１２Ｅ、Ｓ６５Ｇ、Ｄ１７５Ｎ、Ｉ１００Ｔ、Ａ１８Ａ、Ｅ１６２＊、Ａ１３０Ｄ、Ｇ１５Ｅ、Ｄ３３Ｅ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｎ、Ｇ１２Ｔ、Ｖ８Ａ、Ａ１４６Ｐ、Ｇ１２Ｙ、Ｅ４９Ｋ、Ｙ４０＊、Ｋ１６Ｑ、Ｔ２０Ｔ、Ｙ７１Ｃ、Ｇ１３Ｙ、Ｓ８７Ｎ、Ｖ４５Ａ、Ｅ１５３Ａ、Ｒ１６７＊、Ａ６６Ｔ、Ｑ６１Ｔ、Ｇ６０Ｖ、Ｃ５１Ｙ、Ｒ６８Ｒ、Ａ５９Ｇ、Ｒ１６４Ｃ、Ｅ４９Ｅ、Ｓ６５Ｓ、Ａ１４６Ｖ、Ｌ７９Ｆ、Ｙ６４Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ａ９１Ｖ、Ｅ６３Ｋ、Ｅ６２Ｋ、Ｉ５５ｆｓ＊１７、Ｉ８４Ｔ、Ｅ６３＊、Ｑ６１＿Ｅ６２＞ＨＫ、Ｇ１０＊、Ｌ７９Ｉ、Ｐ１８５Ａ、Ａ５９Ｔ、Ｌ７９＿Ｃ８０ｉｎｓＱＹＭＲＴＧＥＧＦ、Ｖ２９Ｖ、Ｔ１４８Ｓ、Ｒ６８Ｇ、Ｄ３３Ｈ、Ａ１８Ａ、Ｐ３４Ｌ、Ｍ７２Ｉ、Ｐ３４Ｌ、Ｅ４９＊、Ｑ６１Ｐ、Ｇ６０Ｒ、Ｓ１０６Ｌ、Ｌ１７１Ｌ、Ｔ２０Ｔ、Ｑ６１Ｅ、Ｉ２４Ｌ、Ｙ３２＊、Ｓ１７Ｎ、Ｄ５７Ａ、Ｑ６１＊、Ｄ５４Ｇ、Ｃ８０Ｙおよびその任意の組み合わせから；例えば、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｇ１２Ｄ、Ｑ６１Ｌ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｇ１３Ａ、Ａ１８Ｔ、Ｇ１３Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｇ６０Ｅおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＭＲＡＳである。いくつかの実施形態において、変異体ＭＲＡＳにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号５に対するＥ１５４＊、Ｖ９４Ｉ、Ｐ１２０Ｐ、Ｐ１５１Ｌ、Ｅ４７Ｇ、Ｍ１＿Ａ２＞ＩＳ、Ｖ１１３Ｉ、Ｌ１３３Ｆ、Ｖ６Ｉ、Ｔ１３７Ｓ、Ｉ９０Ｉ、Ｌ１６Ｌ、Ｒ１３８Ｋ、Ｄ１６５Ｎ、Ｅ１４３Ｑ、Ａ２８Ｔ、Ｒ１３８Ｓ、Ｉ９０Ｍ、Ｑ１４０Ｋ、Ｄ１２９Ｎ、Ｒ１７３Ｔ、Ｐ１２０Ｌ、Ｉ１３６Ｓ、Ｔ５４Ｍ、Ｎ１４９Ｓ、Ａ１４５Ａ、Ｌ１７１Ｌ、Ｒ１１２Ｃ、Ｌ２９Ｆ、Ｒ１３８Ｍ、Ｄ１９５Ｄ、Ｄ１２９Ｇ、Ｒ７８Ｑ、Ａ２Ｖ、Ｒ１０５Ｈ、Ｄ６４Ｄ、Ｇ１４１Ｒ、Ｄ９Ｎ、Ｓ９９Ｓ、Ｖ１６４Ｖおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＥＲＡＳである。いくつかの実施形態において、変異体ＥＲＡＳにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号６に対するＦ１７７Ｆ、Ｒ１８５Ｗ、Ａ９７Ｔ、Ｇ１７４Ｒ、Ｓ１９３Ｓ、Ｇ４８Ｓ、Ｄ７１Ｎ、Ｐ１４０Ｓ、Ｇ１３９Ｖ、Ｌ１９４Ｌ、Ｖ１４９Ｍ、Ｖ１１９Ｉ、Ｓ１８１Ｌ、Ｖ５２Ｍ、Ｃ２２６＊、Ｆ１２０Ｌ、Ｖ１８８Ｍ、Ａ９７Ｖ、Ｒ１０３Ｒ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３２Ｈ、Ｄ６９Ｎ、Ｌ１１７Ｌ、Ｋ６Ｔ、Ａ１６５Ａ、Ｌ６１Ｖ、Ｈ７０Ｈ、Ｄ６９Ｄ、Ｅ２４＊、Ｒ１０３Ｉ、Ｈ１７１Ｌ、Ｒ２７Ｒ、Ｅ２４Ｋ、Ｉ１２９Ｉ、Ｅ４１Ｄ、Ｈ２２７Ｑ、Ａ１６５Ｓ、Ｉ５９Ｓおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＲＲＡＳ２である。いくつかの実施形態において、変異体ＲＲＡＳ２における１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号７に対するＡ７０Ｔ、Ｑ７２Ｌ、Ｖ２０２Ａ、Ｖ２０２Ｖ、Ｑ７２Ｈ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ１３４Ｑ、Ｇ２４Ｄ、Ｒ１４７Ｑ、Ｓ１８６ｆｓ＊＞１６、Ｄ８Ｎ、Ｙ８２＊、Ｆ２０４Ｌ、Ｇ２４Ｇ、Ａ２９Ａ、Ａ１５８Ｖ、Ｒ１１７Ｃ、Ｒ６３Ｑ、Ｑ７２Ｈ、Ｇ２４Ｖ、Ａ１５８Ｔ、Ｒ６３Ｒ、Ａ１６７Ａ、Ｄ４４Ｅ、Ｋ５３Ｍ、Ｋ１７７Ｔ、Ｄ４９Ｙ、Ｋ１５９Ｑおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは、変異体ＲＡＬＡである。いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＬＡにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号８に対するＲ１７６＊、Ｖ２０Ａ、Ｇ２３Ｄ、Ａ１５８Ｓ、Ｇ２３Ｓ、Ｎ８１Ｓ、Ｄ４２Ｎ、Ｇ５９Ｗ、Ｖ２５Ｅ、Ｇ８８Ｗ、Ｉ１８Ｉ、Ｆ１６８Ｃ、Ｎ１０Ｋ、Ｅ１７４＊、Ｒ８４＊、Ｅ１１６Ｄ、Ｋ１９３＊、Ｒ１０８Ｍ、Ｄ４９Ｇ、Ｑ６３＊、Ｑ６３Ｈ、Ｌ１４Ｆ、Ｑ６３Ｒ、Ｓ１１Ｙ、Ｇ２１Ａ、Ｒ１７６Ｒ、Ｒ１９８Ｉ、Ｑ１１０Ｈ、Ｋ７Ｅ、Ｙ８２Ｃ、Ｌ１１２Ｖ、Ｅ１４１Ｋ、Ａ１７７Ａ、Ｖ１５４Ｍ、Ｌ３２Ｑ、Ｉ６４Ｉ、Ｑ６３Ｑ、Ｅ１４７＊、Ｇ５９Ｒ、Ｒ８４Ｑ、Ｋ１３４Ｅおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは変異体ＲＡＬＢである。いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＬＢにおける１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号９に対するＥ１０６Ｋ、Ｇ２３Ｖ、Ｒ１４４Ｓ、Ｍ１９Ｋ、Ｖ１２５Ｖ、Ｋ１２９Ｎ、Ｋ１９４Ｋ、Ｓ８５Ｒ、Ｅ１４１Ｋ、Ｔ６９Ｔ、Ｓ９４Ｌ、Ｇ２４Ｃ、Ｐ１２２Ｓ、Ｉ１８Ｔ、Ｑ１１０Ｈ、Ｓ２２Ｓ、Ｋ１９６Ｎ、Ｌ１１２Ｉ、Ｒ７９＊、Ｋ１９７Ｒ、Ｅ６０＊、Ｔ３１Ｔ、Ｒ８４Ｗ、Ｋ２００Ｉ、Ｉ１１１Ｔ、Ｐ４５Ｐ、Ｋ１８０Ｋ、Ｇ７１Ｒ、Ｅ１７５Ｋ、Ｍ１９Ｔ、Ｒ１３５Ｑ、Ｓ１００Ｓ、Ｆ１６９Ｌ、Ｒ７９Ｑ、Ｍ１９Ｉ、Ｖ１２５Ｆ、Ｒ５２Ｇ、Ｌ１２４Ｌ、Ｇ２３Ｒ、Ｒ１３６Ｓ、Ｎ１８８Ｓ、Ｇ２３Ｅ、Ｔ１６１Ｔ、Ｉ１１１Ｎ、Ｅ１０６Ｅ、Ｒ１６２Ｗ、Ｇ２３Ａおよびその任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、変異体ＲＡＳは変異体ＲＩＴ１である。いくつかの実施形態において、変異体ＲＩＴ１における１つまたはそれより多いさらなる変異は、最適にアラインメントされたときの配列番号１０に対するＭ９０Ｉ、Ｆ２１１Ｌ、Ａ５７Ｇ、Ｄ５１Ｖ、Ｒ１６８Ｈ、Ｄ１７３Ｎ、Ｒ１２２＊、Ｒ１１２Ｃ、Ｍ９０Ｉ、Ａ１５３Ｖ、Ｒ１２２Ｌ、Ｒ１８３Ｈ、Ｋ３４Ｔ、Ｆ１６１ｆｓ＊４７、Ｑ４０Ｌ、Ａ１９２Ｔ、Ｇ１３３Ｅ、Ｖ１７４Ｖ、Ｌ１３８Ｌ、Ｌ７１Ｖ、Ｒ１２２Ｑ、Ｒ４５Ｑ、Ａ１６６ｄｅｌＡ、Ｓ１９Ｌ、Ｉ７３Ｓ、Ｄ２１６Ｙ、Ｅ８１Ｑ、Ｍ９０Ｉ、Ｌ７４Ｍ、Ｄ５６Ｙ、Ｋ１９６ｆｓ＊１２、Ｓ１０ｄｅｌＳ、Ｒ８６Ｗ、Ｆ８２Ｃ、Ｔ３８Ａ、Ａ７７Ｐ、Ｆ４１Ｆ、Ｒ６３Ｒ、Ｋ２３Ｅ、Ｆ１０８Ｌ、Ｄ１７２Ｎ、Ｒ１２０＊、Ｒ２１２Ｒ、Ｔ１２４Ｔ、Ａ７７Ｓ、Ｆ８２Ｌ、Ｄ８７Ｎ、Ｄ１７２Ｅ、Ｋ３４Ｎ、Ｐ１９９Ｐおよびその任意の組み合わせから選択される。
一態様において、本開示は、本明細書に記載のいずれかの変異体Ｒａｓをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６およびその任意の組み合わせからなる群から選択される変異体Ｒａｓをコードする。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、化学合成法、分子クローニング法もしくは組換え法、ＤＮＡもしくは遺伝子アセンブリ法、人工的な遺伝子合成、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせを用いて得ることができる。化学的なポリヌクレオチドの合成方法が、当該分野で周知であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書中に提供される配列および市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製する場合、本明細書中でさらに論じられるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドが、適切なクローニングベクターまたは発現ベクターに挿入され得、そしてそのクローニングベクターまたは発現ベクターが、複製および増幅のために、適切な宿主細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞に挿入され得る。細胞は、外来性ポリヌクレオチドを導入することによって、例えば、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合、化学的形質転換またはエレクトロポレーションによって、形質転換され得る。外来性ポリヌクレオチドは、いったん導入されると、インテグレートされない発現ベクター（例えば、プラスミド）として細胞内で維持され得るか、または宿主細胞ゲノムにインテグレートされ得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野において周知の方法によって宿主細胞から単離され得る。あるいは、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）によって、ＤＮＡ配列の再生が可能である。
ＲＮＡは、適切な発現ベクターにおいて単離されたＤＮＡを使用すること、およびそれを適切な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。その細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、そのＲＮＡは、当業者に周知の方法を用いて単離され得る。あるいは、ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを転写することによって、例えば、ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写反応によって、得ることができる。あるいは、ＲＮＡは、化学合成を用いて得ることができる。
適切なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築され得るか、または当該分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用することを意図されている宿主細胞に応じてさまざまであり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して単一の標的を有し得、かつ／または発現ベクターを含んでいるクローンを選択する際に使用され得るマーカーのための遺伝子を有し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）が挙げられる。これらのおよび他の多くのクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供する。ポリヌクレオチドは、発現ベクター内に位置し得る。発現ベクターは、宿主細胞において、目的の１つもしくはそれより多い遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達すること、および好ましくは、発現することができる構築物であり得る。発現ベクターの例としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルス）、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、ファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核細胞（例えば、プロデューサー細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、簡便かつ効率的な複製、クローニングおよび／または選択を可能にし得る。したがって、発現ベクターは、宿主細胞において発現ベクターの複製を可能にする核酸配列、例えば、複製起点、１つまたはそれより多い治療遺伝子および／または選択可能なマーカー遺伝子、ならびに当該分野で公知の他の遺伝的エレメント（例えば、コードされるタンパク質の転写、翻訳および／または分泌を指示する調節エレメント）をさらに含み得る。発現ベクターの成分としては、一般に、以下のうちの１つまたはそれより多いものが挙げられ得るが、これらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１つまたはそれより多いマーカー遺伝子；および適切な転写性の制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）。発現（例えば、翻訳）のために、１つまたはそれより多い翻訳制御エレメント（例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、内部リボソーム進入部位および終止コドン）も通常、必要とされる。発現ベクターは、細胞に形質導入するため、細胞を形質転換するため、または細胞に感染するために使用され得、それにより、その細胞は、その細胞にとって天然のもの以外の核酸および／またはタンパク質を発現するようになる。発現ベクターは、任意選択で、細胞内に核酸を侵入させることを助ける材料（例えば、ウイルス粒子、リポソーム、およびタンパク質コーティングなど）を含む。標準的な分子生物学技法によるタンパク質発現に適切な数多くのタイプの発現ベクターが、当該分野で公知である。そのような発現ベクターは、昆虫、例えば、バキュロウイルス発現系、または酵母、真菌、細菌もしくはウイルス発現系を含む従来のベクタータイプの中から選択される。他の適切な発現ベクター（その数多くのタイプが当該分野で公知である）も、この目的のために使用され得る。クローニングベクターおよび発現ベクターを得るための方法は、周知である（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）を参照のこと）。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞を提供する。１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを発現することができる任意の宿主細胞が、Ｒａｓタンパク質もしくは変異体Ｒａｓタンパク質またはＲａｓタンパク質もしくは変異体Ｒａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離する目的で使用され得る。適切な宿主細胞としては、哺乳動物（例えば、ヒト、例えば、ＨＥＫまたはＨｅＬａ；マウス、例えば、３Ｔ３、またはＳｗｉｓｓ、ＢＡＬＢ／ｃもしくはＮＩＨマウスに由来する細胞；ハムスター、例えば、ＣＨＯ；サル、例えば、ＣＯＳ）、細菌（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、真菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）または昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｄｅｒａ Ｓｆ９）宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されない。目的のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが、いくつかの適切な手段のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得、その手段としては、エレクトロポレーション、化学的形質転換、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランもしくは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）が挙げられる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。次いで、トランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞が、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、宿主細胞から精製される。
いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、インビトロまたは無細胞のタンパク質合成を用いて、例えば、細胞抽出物（例えば、大腸菌細胞抽出物、ウサギ網状赤血球細胞抽出物、コムギ胚芽細胞抽出物または昆虫細胞抽出物）を含む無細胞翻訳系を用いて、生成される。発現されたタンパク質は、当業者に公知の適切な手段によって、細胞、細胞抽出物または培養液から回収、単離および／または任意選択で精製され得る。例えば、タンパク質は、細胞溶解の後に可溶型で単離されるか、または公知の技法を用いて、例えば、塩化グアニジン中で抽出される。タンパク質は、種々の従来の方法のいずれかを用いてさらに精製され得、それらの方法としては、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを用いる順相または逆相）；無機リガンドまたはモノクローナル抗体などを用いるアフィニティークロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、最も適切な単離技法および精製技法を選択し得る。さらに他の適切な宿主細胞、ならびにトランスフェクション、培養、増幅、スクリーニング、産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される任意の方法を行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、そのキットは、Ｒａｓアンタゴニストを選択するためのキットである。いくつかの実施形態において、そのキットは、変異体Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、その変異体Ｒａｓは、本明細書中に記載される変異体Ｒａｓタンパク質のいずれかである。いくつかの実施形態において、その変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位以外の位置にシステイン変異を有する。いくつかの実施形態において、そのキットは、競合プローブと試験化合物との間の競合反応において変異体Ｒａｓを使用するための指示を含む。いくつかの実施形態において、そのキットは、競合プローブをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのキットは、１つまたはそれより多い試験化合物をさらに含む。キットは、様々な態様のいずれかに関して本明細書中に開示される１つまたはそれより多いエレメントを任意の組み合わせで含み得る。キットにおける試薬および他の材料は、任意の適切な容器内に含められ得、かつ直ちに使用可能な形態であり得るか、またはそのキット内の他の試薬もしくはユーザーによって供給される試薬と合わせること（例えば、濃縮された組成物の希釈または凍結乾燥された組成物の再構成）を必要とし得る。キットは、１種またはそれより多いバッファを提供し得、それらのバッファの非限定的な例としては、炭酸ナトリウムバッファ、炭酸水素ナトリウムバッファ、ホウ酸バッファ、リン酸バッファ、Ｔｒｉｓバッファ、ＭＯＰＳバッファ、ＨＥＰＥＳバッファおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。キットは、コントロールサンプル、例えば、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールまたは定量標準として使用するためのコントロールサンプルを含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に開示される１つまたはそれより多い方法に従ってキットを使用するための指示を含む。いくつかの実施形態において、キットを使用するための方法は、反応混合物中または競合反応において変異体Ｒａｓ、競合プローブおよび試験化合物を合わせる工程、ならびに試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓの結合と比べて変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少を検出する工程を含む。
１つの態様において、本開示は、変異体Ｒａｓおよび競合プローブを含む複合体が結合した基材を提供する。その変異体Ｒａｓは、本明細書中に記載される変異体Ｒａｓタンパク質のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、その変異体Ｒａｓは、変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする反応性アミノ酸である置換アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸ではない。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体Ｒａｓに反応性アミノ酸において共有結合的に結合される。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸は、反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、競合プローブは、変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおいて結合する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、Ｒａｓにおける非保存位置に存在する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位に存在する。いくつかの実施形態において、置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位におけるシステインである。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、１つまたはそれより多いさらなる変異を含み得る。
上記基材は、種々の形態のいずれかをとり得る。いくつかの実施形態において、基材は、ビーズ、微小粒子、ナノ粒子、ナノ結晶、繊維、マイクロ繊維、ナノ繊維、ナノワイヤ、ナノチューブ、マット、平面シート、平面ウエハまたはスライド、マルチウェルプレート、光学スライド、フローセル、チャネルおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される形態である。基材には、さらに、１つまたはそれより多いさらなる構造、キャピラリー、ウェル、フローセル、チャネル（例えば、マイクロ流体チャネル）などが含まれ得る。種々の適切な基材材料が、利用可能である。基材材料の例としては、無機材料（例えば、シリカベースの基材（例えば、ガラス、水晶、溶融シリカ、ケイ素など）、金属（例えば、金）、セラミックスまたは二酸化チタン）；半導体材料；複合材料；有機材料（例えば、ポリマーまたはプラスチック材料（例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、環状オレフィンポリマー、天然ポリマー、合成ポリマー、または反応性媒体に対する支持体として従来使用される種々の有機基材材料のいずれか））；およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、基材は、ガラス、水晶、溶融シリカ、ケイ素、金属、ポリマー、プラスチック、セラミックス、複合材料およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される材料を含む。
基材に対する分子（例えば、競合プローブ、変異体Ｒａｓ）の固定化または結合に言及するとき、用語「固定化された」および「結合された」は、本明細書中で交換可能に使用され、両方の用語が、別段示されない限り、直接的な、間接的な、共有結合性のまたは非共有結合性の結合を包含すると意図されている。いくつかの実施形態において、共有結合が、好ましい場合がある。通常、分子（例えば、競合プローブ、変異体Ｒａｓ）は、その基材を使用することが意図される条件下で、例えば、競合プローブと変異体Ｒａｓとの間の結合を検出するための用途において、基材に固定化されたまたは結合されたままである。
いくつかの実施形態において、基材材料は、特定の条件下において分子（例えば、競合プローブ、変異体Ｒａｓ）が基材の表面に直接結合され得るような反応性の材料を含む。いくつかの実施形態において、基材材料は、例えば、分子（例えば、タンパク質または小分子）への結合（例えば、共有結合）を可能にする反応性部分を含む中間体材料の層またはコーティングの適用によって「官能化された」不活性な基材またはマトリックス（例えば、スライドガラス、金表面、ポリマービーズまたは他の基材材料）を含む。そのような基材の例としては、金などの不活性な基材上に支持されるカルボキシメチル化デキストランが挙げられるが、これに限定されない。そのような実施形態において、分子（例えば、競合プローブ、変異体Ｒａｓ）は、中間体材料（例えば、デキストラン）に直接、共有結合的に結合され得るが、その中間体材料自体は、その基材またはマトリックス（例えば、金の基材）に非共有結合的に結合され得る。
いくつかの実施形態において、複合体は、変異体Ｒａｓによって基材に結合される。いくつかの実施形態において、複合体は、競合プローブによって基材に結合される。結合は、反応性部分によって行われ得る。いくつかの実施形態において、基材に結合されるべき分子（例えば、競合プローブ、変異体Ｒａｓ）は、反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、分子が結合する基材は、反応性部分を含む。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に記載される方法のいずれかを行うためのシステムを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、Ｒａｓアンタゴニストを選択するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態において、そのシステムは、競合反応を行うというユーザーの要求を受信するように構成されたコンピュータを含む。いくつかの実施形態において、そのシステムは、競合反応を準備する反応モジュールを含み、その競合反応は、変異体Ｒａｓ、その変異体Ｒａｓに結合することができる競合プローブ、および試験化合物を含む。いくつかの実施形態において、そのシステムは、試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓの結合と比べて変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少を検出する検出モジュールを含む。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、本明細書中に記載される変異体Ｒａｓタンパク質のいずれかである。いくつかの実施形態において、変異体Ｒａｓは、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しないシステイン変異を含む。いくつかの実施形態において、競合プローブは、システイン変異において変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができる。いくつかの実施形態において、試験化合物は、競合プローブによる変異体Ｒａｓの共有結合修飾を阻害する。
いくつかの実施形態において、サンプルの処理、競合反応の準備、競合反応の実施、結合の検出および／または解析における１つまたはそれより多い工程は、上記システムによって自動化される。いくつかの実施形態において、自動化は、１つまたはそれより多い液体ハンドラーおよび関連するソフトウェアの使用を含み得る。いくつかの商業的に入手可能な液体ハンドリングシステムを利用することにより、そのようなプロセスの自動化を実行することができる（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ａｐｒｉｃｏｔ ＤｅｓｉｇｎおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製の液体ハンドラーを参照のこと）。いくつかの実施形態において、検出は、リアルタイム検出装置を含む。
様々な工程が、様々なブロック、操作、ツール、モジュールまたは技法として実行され得、そしてそれらは、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアまたはそれらの任意の組み合わせにおいて実行され得る。ハードウェアにおいて実行されるとき、そのブロック、操作、技法などの一部または全部が、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定アプリケーション向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルロジックアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）などにおいて実行され得る。いくつかの実施形態において、コンピュータは、試験化合物に対して競合反応を行うというユーザーの要求を受け取るように設定される。そのコンピュータは、ユーザーの要求を直接（例えば、ユーザーによって操作されるキーボード、マウスまたはタッチスクリーンなどの入力デバイスによって）または間接的に（例えば、インターネットを介することを含む有線または無線の接続を介して）受け取り得る。ユーザーの非限定的な例としては、個人、医療関係者、臨床医、検査技師、保険会社職員、ヘルスケア提供者、ヘルスケア管理者、その他のヘルスケア産業の人または電子システム（例えば、１つもしくはそれより多いコンピュータおよび／または１つもしくはそれより多いサーバー）が挙げられる。
コンピュータは、１つまたはそれより多いプロセッサーを備え得る。プロセッサーは、１つまたはそれより多いコントローラー、計算ユニットおよび／もしくはコンピュータシステムの他のユニットと関連付けられ得るか、または所望のとおりファームウェアに埋め込まれ得る。ソフトウェアにおいて実行される場合、ルーチンは、任意のコンピュータ可読メモリー（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）または他の記録媒体）に記憶され得る。同様に、このソフトウェアは、任意の公知の送達方法を介してコンピューティングデバイスに送達され得、その送達方法としては、例えば、コミュニケーションチャネル（例えば、電話回線、インターネット、無線接続など）、または可搬型媒体（例えば、コンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなど）が挙げられる。
コンピュータシステムは、媒体（例えば、ソフトウェア）および／またはネットワークポート（例えば、インターネットからの）からの指示を読むことができる論理装置と理解され得、その論理装置は、任意選択で、固定媒体を有するサーバーに接続され得る。コンピュータシステムは、ＣＰＵ、ディスクドライブ、入力デバイス（例えば、キーボードおよび／またはマウス）およびディスプレー（例えば、モニター）のうちの１つまたはそれより多いものを備え得る。データ通信（例えば、命令またはリポートの伝送）は、ローカル位置またはリモート位置におけるサーバーへの通信媒体を通じて達成され得る。通信媒体は、データを伝送するおよび／または受け取る任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールドワイドウェブを通じて通信を提供し得る。
システムは、質量分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴、固相抽出、液体クロマトグラフィーまたはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたはそれより多いものを行うための１つまたはそれより多い検出モジュールを備え得る。いくつかの実施形態において、検出モジュールは、結合、共有結合修飾、質量電荷比、気相イオン、吸光度、蛍光、ルミネセンス、色、電気化学的シグナル、電流またはそれらの任意の組み合わせを検出し得る。
いくつかの実施形態において、そのシステムは、レシピエントにリポートを送るリポートジェネレーターを備える。いくつかの実施形態において、そのリポートは、検出モジュールからの結果を含む。いくつかの実施形態において、リポートジェネレーターは、１つまたはそれより多い試験化合物をＲａｓのインヒビターと同定する。いくつかの実施形態において、リポートジェネレーターは、１つまたはそれより多い試験化合物をＲａｓのインヒビターでないと同定する。リポートジェネレーターは、システムによるデータ（例えば、結合、断片化または蛍光強度）（例えば、質量分析または表面プラズモン共鳴解析のソフトウェアが行うデータ解析の形態で）の生成に応答してリポートを自動的に送り得る。あるいは、リポートジェネレーターは、ユーザーからの指令に応答してリポートを送り得る。
本明細書中に記載される方法の結果は、典型的には、リポートに組み立てられる。リポートは、生のシグナル強度データ、処理されたシグナル強度データ（例えば、グラフィック表示、結合親和性の計算値）、１つもしくはそれより多い試験化合物がＲａｓアンタゴニストであるという結論、１つもしくはそれより多い試験化合物がＲａｓアンタゴニストではないという結論、および／または濃度、結合親和性もしくは共有結合修飾の程度の定量を含み得る。いくつかの実施形態において、リポートは、Ｒａｓのアンタゴニストと同定された試験化合物を含み、Ｒａｓのアンタゴニストと同定されなかった試験化合物を除外する。いくつかの実施形態において、リポートは、Ｒａｓのアンタゴニストと同定された試験化合物およびＲａｓのアンタゴニストと同定されなかった試験化合物を含む。
リポートを生成するために使用されるソフトウェアルーチンは、コンピュータにおいて実行され得る。リポートは、データを受け取ると自動的に生成され得る。リポートは、ユーザーの要求に応答して生成され得る。リポートは、任意の適切な媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）または他の記録媒体）にも記憶され得る。リポートは、任意の公知の送達方法を介してコンピューティングデバイスに送達され得、その送達方法としては、例えば、コミュニケーションチャネル（例えば、電話回線、インターネット、無線接続など）、または可搬型媒体（例えば、コンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなど）が挙げられる。リポートは、任意の適切な通信媒体を用いてローカル位置またはリモート位置におけるレシピエントに伝送され得る。例えば、その通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続であり得る。リポートは、受領のためおよび／またはレシピエントによる再調査のために、そのようなネットワークまたは接続（または情報を伝送するための他の任意の適切な手段（プリントアウトなどの物理的リポートの郵送が挙げられるがこれらに限定されない））を通じて伝送され得る。そのレシピエントは、ユーザー、個人、医療関係者、臨床医、検査技師、保険会社職員、ヘルスケア提供者、ヘルスケア管理者、その他のヘルスケア産業の人または電子システム（例えば、１つもしくはそれより多いコンピュータおよび／または１つもしくはそれより多いサーバー）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リポートジェネレーターは、レシピエントのデバイス（例えば、パーソナルコンピュータ、電話、タブレットまたは他のデバイス）にリポートを送る。リポートは、オンラインで閲覧され得るか、レシピエントのデバイス上に保存され得るか、または印刷され得る。
１つの態様において、本開示は、１つまたはそれより多いプロセッサーによって実行されたとき本明細書中に開示される方法のいずれかに記載の方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。いくつかの実施形態において、コンピュータ可読媒体の実行は、Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法を実行する。１つの実施形態において、コンピュータ可読媒体の実行は、Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法を実行し、その方法は、試験化合物に対して競合反応を行うというユーザーの要求に応答する工程（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）、ユーザーの要求に応答して試験化合物に対して競合反応を行う工程（ここで、その競合反応は、変異体Ｒａｓ、その変異体Ｒａｓに結合することができる競合プローブ、および試験化合物を含む）；試験化合物の非存在下における変異体Ｒａｓの結合と比べて変異体Ｒａｓと競合プローブとの間の結合の減少を検出する工程；および結合の減少の検出に対する結果を含むリポートを生成する工程を含む。競合プローブ、変異体Ｒａｓ、および競合反応を行うためのパラメータの例は、上に提供されている。いくつかの実施形態において、リポートジェネレーターは、試験化合物をＲａｓのインヒビターと同定する。
コンピュータ可読媒体は、有形の記録媒体、搬送波媒体または物理的な伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、光学ディスクまたは磁気ディスク（例えば、任意のコンピュータ（複数可）などにおける任意の記憶デバイス）が挙げられ、例えば、計算工程、プロセシング工程などを実行するために使用され得る。揮発性記憶媒体としては、ダイナミックメモリー（例えば、コンピュータのメインメモリー）が挙げられる。有形の伝送媒体としては、同軸ケーブル；銅線および光ファイバー（コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含む）が挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号または音波もしくは光波の形態（例えば、無線周波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信において生成されるもの）をとり得る。ゆえに、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光学媒体、パンチカード 紙テープ、穴のパターンを有する他の任意の物理的記録媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリーチップまたはカートリッジ、データもしくは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる他の任意の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くが、実行するために、プロセッサーへの１つまたはそれより多い順序の１つまたはそれより多い命令を保持することに関わり得る。
実施例
実施例１：ＲａｌＡ ＷＴおよびＲａｌＡ Ｇ２３Ｃの組換えタンパク質発現
ヘキサヒスチジンでタグ化された組換えヒトＲａｌＡ（残基１１〜１８３、ＷＴまたはＧ２３Ｃのいずれか）を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ））に形質転換した。その細菌が、３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む３７℃のＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中で０．４〜０．６というＯＤ（６００）にまで成長した後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて１８℃で誘導を行い、成長を１８℃で約１８時間続けた。その細菌を遠心分離により回収し、得られたペレットを−８０℃で保存するか、またはすぐにその後の工程に使用した。
ペレットを、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒタブレット、ＥＤＴＡ非含有）を含む細菌タンパク質抽出試薬（Ｂ−Ｐｅｒ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。溶解反応（ｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、超遠心分離による清澄化を行い、さらなる溶解緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝８、５ｍＭイミダゾール）を２ｍＭ ＢＭＥ（最終）とともに添加した。上清を、Ｃｏ−親和性ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ ＨｉｓＰｕｒ樹脂、１Ｌの初期培養物あたり約２ｍＬベッド体積）とともに４℃で１時間インキュベートした。次いで、ロードされたビーズを、２ｍＭ ＢＭＥを含む溶解緩衝液で洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液でタンパク質を溶出した。
粗タンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝８、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３倍過剰量のＧＤＰを含む緩衝液に対して透析した。そのタンパク質を約３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ−１５、分子量１００００カットオフ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終）を添加した後、以下の緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２とともにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ，Ｈｉｌｏａｄ １６／６０）を用いるゲル濾過によって精製した。次いで、調製され精製されたばかりのタンパク質を、約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、後でアッセイにおいて使用するために液体窒素中で急速冷凍した。
Ｘ線結晶構造解析に向けて、Ｃｏ−ビーズ溶出から得られた粗タンパク質を、ヘキサヒスチジンでタグ化されたＴＥＶ−プロテアーゼを用いて切断して（２５ｍｇの粗ＲａｌＡ Ｇ２３Ｃあたり１ｍｇの組換えＴＥＶ、２０ｍｇの粗ＲａｌＡあたり１ｍｇのＧＤＰを添加）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝８、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３倍過剰量のＧＤＰを含む緩衝液に対して透析した。次いで、切断されたタンパク質を、低塩緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝８）で５倍希釈し、Ｎｉ−アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）とともにインキュベートして、未切断タンパク質およびプロテアーゼを除去し、５ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＧＤＰを添加して、その金属およびＲａｌＡのヌクレオチド部位に完全にロードした。次いで、そのタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム、５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配）によってさらに精製して、部分的に精製されたタンパク質を、通常、以下の緩衝液（約２３０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝８、少量のＧＤＰ）中において得た。その部分的に精製されたタンパク質を、所望の化合物で完全に標識し（過剰量の化合物とともに、室温において一晩および３７℃で数時間（必要であれば）インキュベーションし、質量分析によって標識を確認し）、−８０℃で凍結および保管するか、またはさらなる精製に使用した。
標識されたまたは未標識のタンパク質に対する最後の精製工程は、以下の緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌとともにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ，１０／３００ ＧＬ）を用いるゲル濾過であった。次いで、調製され精製されたばかりのタンパク質を５〜２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、Ｘ線結晶構造解析トレー（Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ｔｒａｙｓ）に使用した。
この記載されたアッセイは、切断型または未切断型のタンパク質のいずれかを用いて行われ得る。
両方のＲａｌＡ構築物についての配列をコドン最適化し、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１ベクターを用いてＤＮＡ２．０によって合成した。
変異体Ｋ−Ｒａｓを調製するための精製プロトコルは、同様であったが、対応するＫ−Ｒａｓ構築物を、最適にアラインメントされた配列に基づく変異で置換した。
実施例２：競合プローブによるＲａｓ変異体の共有結合修飾
Ｅ６２Ｃ、Ｄ９２ＣおよびＨ９５Ｃから選択される１つの置換アミノ酸、ならびに最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２位にグリシンを有する（ＷＴ）かまたは１２位にアスパラギン酸へのさらなる変異（Ｇ１２Ｄ）を有するＫＲＡＳ変異体タンパク質を作製した。これらの変異は、図２のＸ線結晶構造に示されている。Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットに結合し、かつモデリング／ドッキング研究に基づいて適切に配置された求電子剤で置換アミノ酸を共有結合的に修飾する、競合プローブのパネルとの反応性（例えば、ＫＲＡＳ変異体の共有結合修飾）について、これらの変異体を試験した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＲａｐｉｄＦｉｒｅシステムにおける飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析によって、スクリーニングを行った。有意な反応（６時間において＞２５％）が、６つのうち５つの変異体に対する少なくとも１つの競合プローブで観察された（表２）。Ｇ１２Ｄ変異体または他の１２位の変異体との競合プローブの反応性は、構造修飾と試験を反復することによって最適化され得る。
実施例３：競合プローブによるＲａｓ変異体およびＲＡＬ変異体の共有結合修飾
最適にアラインメントされたときの配列番号８に対する２３位にシステインへの１つの変異（Ｇ２３Ｃ）を有するＲＡＬＡ変異体タンパク質を作製した。最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２位にシステインへの１つの変異（Ｇ１２Ｃ）を有するＫＲＡＳ変異体タンパク質を作製した。Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ結合ポケットに結合し、かつモデリング／ドッキング研究に基づいて適切に配置された求電子剤で置換アミノ酸を共有結合的に修飾する、競合プローブのパネルとの反応性（例えば、変異体の共有結合修飾）について、そのＲＡＬＡ変異体およびＫＲＡＳ変異体を試験した。そのようなＲＡＳに（Ｇ１２を介して）共有結合的に結合された１つのインヒビターを図２に示す。Ａｇｉｌｅｎｔ ＲａｐｉｄＦｉｒｅまたはＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅシステムにおける質量分析によって、スクリーニングを行った。
実施例４：競合プローブが律速である条件下（［変異体Ｒａｓ］＞＞［競合プローブ］）での変異体Ｒａｓのインヒビターについてのインタクトなタンパク質のスクリーニング
変異体Ｒａｓを、結合に適した条件下で競合プローブとともにインキュベートする。遊離変異体Ｒａｓおよび競合プローブに結合した変異体Ｒａｓの濃度を、質量分析を用いて検出し、定量する。親和性タグ化された競合プローブと変異体Ｒａｓとの間の結合相互作用を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使用することによって測定する。変異体Ｒａｓへの結合による遊離競合プローブの枯渇を質量分析によってモニターする。
実施例５：変異体Ｒａｓタンパク質が律速である条件下（［競合プローブ］＞＞［変異体Ｒａｓ］）での変異体Ｒａｓのインヒビターについてのインタクトなタンパク質のスクリーニング
変異体Ｒａｓを、結合に適した条件下で競合プローブとともにインキュベートする。遊離競合プローブの濃度を、質量分析を用いて検出し、定量する。変異体Ｒａｓへ結合する際の、蛍光標識された競合プローブの蛍光偏光をモニターする。
実施例６：タンパク分解性消化
変異体Ｒａｓを、結合に適した条件下で競合プローブとともにインキュベートする。Ｒａｓ変異体をタンパク分解性に消化する。競合プローブによって誘導される、未修飾の変異体Ｒａｓの減少を、質量分析によってモニターする。
実施例７：競合プローブＣＰ−００８を用いたＫ−Ｒａｓ Ｄ９２Ｃ結合に対する三重四重極（ＱＱＱ）質量分析プロトコル
ＧＤＰをロードされたＫ−Ｒａｓ Ｄ９２Ｃタンパク質（ヒスチジンタグも含む）を、ＱＱＱ−アッセイで使用する直前にＨＥＰＥＳ含有アッセイ緩衝液に希釈した。
アッセイを開始するために、非反応性の内部標準化合物および競合プローブ化合物（ＣＰ−００８）をそのタンパク質溶液に添加して、マスターミックスを形成した。そのマスターミックスを、すぐに９６ウェルプレートに分配した後、目的の化合物のＤＭＳＯ原液を添加した。その反応プレートを密封し、混合し、短時間遠心分離し、次いで、振盪しながら（約３００ｒｐｍ）室温において約５時間インキュベートした。
反応をクエンチするために、その反応混合物を、第２のプレートにおける２％のギ酸水溶液（クエンチされた反応中で最終０．２％）に移した。第２のプレートを密封し、迅速に遠心分離した後、サンプルを−８０℃で凍結した。
各ウェル内のプローブおよび内部標準化合物（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の量を決定するＱＱＱ−定量のために、凍結サンプルをドライアイス上でＰｕｒｅ Ｈｏｎｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに送った。得られたデータを解析するために、プローブと内部標準化合物との比を各ウェルについて計算した。アッセイウィンドウを、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯのみ、阻害なし）およびポジティブコントロール（プローブがタンパク質と完全に反応した時点における最終１００μＭのＣＰ−００８；１００％阻害が割り当てられる）によって決定し、そのアッセイウィンドウによって、目的の化合物によるプローブ枯渇の阻害の計算が可能になった。図６は、Ｋ−Ｒａｓに対する阻害曲線を作成するために試験化合物ＣＰ−０２３またはＣＰ−０２４を一連の濃度にわたって使用した、このＱＱＱアッセイを示している。Ｋ−ＲａｓおよびＣＰ−００８を含む反応中に滴定される（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｋ−Ｒａｓ ａｎｄ ＣＰ−００８）ＣＰ−０２３またはＣＰ−０２４の量が増加するにつれて、Ｋ−Ｒａｓに結合されるＣＰ−００８が少なくなり、その曲線は、ｙ軸上の０％阻害値（１００％のＫ−ＲａｓがＣＰ−００８に結合している状態、図１の上のパネルに図示されている）からｙ軸上の１００％阻害値（ＣＰ−００８がＫ−Ｒａｓに結合していない状態、図１の下のパネルに図示されている）に向かって進む。
実施例８：競合プローブを用いるＲａｓ結合についての蛍光偏光アッセイ
Ｒａｓ競合プローブを、そのプローブとＲａｓとの結合を干渉しない適切な位置においてフルオロフォアに結合体化して、蛍光競合プローブ（ＦＬ−ＣＰ）を作製する。適切なフルオロフォアは、本明細書中に開示される様々な蛍光プローブのいずれかを含み得る。ＧＤＰをロードされたＲａｓを、適切なアッセイ緩衝液で希釈する。
一連の較正蛍光測定を行うことにより、ａ）アッセイ緩衝液のバックグラウンド蛍光強度；ｂ）アッセイ緩衝液中のアッセイ濃度のＦＬ−ＣＰのみの蛍光偏光；およびｃ）ＣＰとＲａｓとの間の結合が最大になる条件下におけるアッセイ緩衝液中の、ＧＤＰをロードされたアッセイ濃度のＲａｓに添加されたアッセイ濃度のＦＬ−ＣＰの蛍光偏光を決定する。解析の目的において、（ａ）は、バックグラウンド蛍光に相当し、（ｂ）は、試験化合物の１００％結合に相当し、（ｃ）は、試験化合物の０％結合に相当する。
試験化合物の結合を測定するために、ＦＬ−ＣＰが律速になるように（［ＦＬ−ＣＰ］＜［Ｒａｓ］）、試験化合物をアッセイ緩衝液中でＲａｓおよびＦＬ−ＣＰとともにインキュベートし、蛍光偏光値を測定し、この値を、先に決定された蛍光較正値と比較する。
実施例９：競合プローブを用いるＲａｓ結合についてのＦＲＥＴクエンチングアッセイ
Ｒａｓ競合プローブを、そのプローブとＲａｓとの結合を干渉しない適切な位置においてＦＲＥＴドナーフルオロフォアに結合体化して、蛍光競合プローブ（ＦＬ−ＣＰ）を作製する。適切なフルオロフォアは、本明細書中に開示される様々な蛍光プローブのいずれかを含む。Ｒａｓタンパク質を、蛍光Ｒａｓ−アクセプターを作製するために、スイッチＩＩ結合ポケットのＦＲＥＴ半径内の位置において適切なＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアに結合体化し、ＧＤＰをロードし、適切なアッセイ緩衝液で希釈する。
ＦＬ−ＣＰフルオロフォアの発光波長あたりで一連の較正蛍光測定を行うことにより、（ａ）アッセイ緩衝液のバックグラウンド蛍光強度；（ｂ）アッセイ緩衝液中のアッセイ濃度のＦＬ−ＣＰのみの蛍光強度（クエンチなし）；および（ｃ）ＦＬ−ＣＰとＲａｓ−アクセプターとの間の結合が最大になる条件下におけるアッセイ緩衝液中の、ＧＤＰをロードされたアッセイ濃度のＲａｓ−アクセプターに添加されたアッセイ濃度のＦＬ−ＣＰの蛍光偏光（この場合、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの会合はドナー蛍光をクエンチする）を決定する。解析の目的において、上記の（ａ）の蛍光測定値は、バックグラウンド蛍光に相当し、（ｂ）の蛍光測定値は、試験化合物の１００％結合に相当し、（ｃ）の蛍光測定値は、試験化合物の０％結合に相当する。試験化合物の結合を測定するために、試験化合物をＲａｓ−アクセプターおよびＦＬ−ＣＰの存在下のアッセイ緩衝液中でインキュベートし、ドナーの蛍光を測定し、この値を、先に決定された蛍光較正値と比較する。
別のデザインは、ＦＲＥＴ対を利用して競合アッセイを行うものであり、この競合アッセイでは、ＦＲＥＴクエンチャー（すなわち、この別のデザインにおけるアクセプター）に結合体化された競合プローブを、適切なＦＲＥＴドナーに結合体化された蛍光Ｒａｓタンパク質と接触させる。一連の較正蛍光測定をＲａｓ−ドナーの発光波長あたりで行うことにより、（ｉ）アッセイ緩衝液のバックグラウンド蛍光強度；（ｉｉ）アッセイ緩衝液中のアッセイ濃度のＲａｓ−ドナーのみの蛍光強度（クエンチなし）；および（ｉｉｉ）アッセイ濃度のＦＬ−ＣＰが、ＦＬ−ＣＰとＲａｓ−アクセプターとの間の結合が最大になる条件下におけるアッセイ緩衝液中の、ＧＤＰをロードされたアッセイ濃度のＲａｓ−ドナーに添加されたときの、Ｒａｓ−アクセプターの蛍光（この場合、ＦＬ−ＣＰアクセプターとＲａｓ−ドナーとの会合はドナー蛍光をクエンチする）を決定する。解析の目的において、上記の（ｉ）の蛍光測定値は、バックグラウンド蛍光に相当し、（ｉｉ）の蛍光測定値は、試験化合物の１００％結合に相当し、（ｉｉｉ）の蛍光測定値は、試験化合物の０％結合に相当する。試験化合物の結合を測定するために、試験化合物をＲａｓ−ドナーおよびＦＬ−ＣＰアクセプターの存在下のアッセイ緩衝液中でインキュベートし、ドナーの蛍光を測定し、この値を、先に決定された蛍光較正値と比較する。
実施例１０：競合プローブを使用したＲａｓ結合についてのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｒａｓ競合プローブを、そのプローブとＲａｓとの間の結合を干渉しない適切な位置において検出可能なリガンドに結合体化して、リガンドに結合体化した競合プローブ（Ｌ−ＣＰ）を作製する。適切な検出可能なリガンドは、本明細書中に開示されるリガンドのいずれかを含む。ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓタンパク質にＧＤＰをロードし、適切なアッセイ緩衝液で希釈する。
アッセイを開始するために、試験化合物、ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓおよびＬ−ＣＰをアッセイ緩衝液に添加する。アッセイを終結するために、ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓを、Ｎｉ−ＮＴＡでコーティングされた基材上に固定化し、アッセイ緩衝液で洗浄して、未結合の化合物を除去する。Ｒａｓに結合した競合プローブのレベルを検出するために、抗リガンド−ＨＲＰ結合体抗体を、ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓに添加し、基材をアッセイ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ基質を添加し、溶液の６５０ｎｍにおける吸光度を読み出す。アッセイウィンドウを、ポジティブコントロール（ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓ、Ｌ−ＣＰなし、１００％阻害が割り当てられる）およびネガティブコントロール（共有結合性の標識が完了まで進んだ時点におけるヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓおよびＬ−ＣＰ、０％阻害が割り当てられる）によって決定する。
あるいは、アッセイは、競合プローブではなくＲａｓを検出するために行われ得る。このアッセイは、試験化合物、ヘキサヒスチジンでタグ化されたＲａｓおよびＬ−ＣＰをアッセイ緩衝液に添加することによって、同様に開始される。しかしながら、この形式では、反応は、リガンドに相補的なレセプターでコーティングされた基材上にＬ−ＣＰ−Ｒａｓ複合体を固定化すること（１つの実施形態において、リガンドはビオチンであり、基材はストレプトアビジンでコーティングされる）および洗浄することによってクエンチされる。Ｌ−ＣＰによる共有結合修飾を介して基材上に固定化されたＲａｓを検出するために、抗Ｒａｓまたは抗ポリヒスチジンＨＲＰ結合体抗体を添加し、適切なＨＲＰ基質（例えば、ＴＭＢ）を添加した後、６５０ｎｍにおける分光測定法を行う。アッセイウィンドウを、ネガティブコントロール（Ｌ−ＣＰのみ、Ｒａｓなし、０％阻害が割り当てられる）およびポジティブコントロール（共有結合性の標識が完了まで進んだ時点におけるＬ−ＣＰおよびＲａｓ、１００％阻害が割り当てられる）によって決定する。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され、記載されてきたが、そのような実施形態は単なる例として提供されていることが当業者に明らかである。数多くのバリエーション、変更および置換が、本発明から逸脱することなく当業者には想起される。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において使用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がこれらの請求項によって包含されることが意図されている。

Claims (44)

  1. Ｒａｓアンタゴニストを選択する方法であって、該方法は、
    （ａ）反応混合物中で、変異体Ｒａｓ、競合プローブおよび試験化合物を合わせる工程；および
    （ｂ）該試験化合物の非存在下における該変異体Ｒａｓへの該競合プローブの結合と比べたときの、該変異体Ｒａｓと該競合プローブとの間の結合の減少を検出する工程
    を含み、ここで：
    ｉ．該変異体Ｒａｓは、システイン変異を含み；
    ｉｉ．該競合プローブは、該変異体Ｒａｓに結合して共有結合的に修飾することができ；
    ｉｉｉ．該変異体Ｒａｓと該競合プローブとの間の該結合の減少は、該試験化合物のＲａｓアンタゴニスト活性を示す、方法。
  2. 前記競合プローブが、前記変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記競合プローブが、前記システイン変異のシステイン残基と反応することによって、前記変異体Ｒａｓを共有結合的に修飾することができる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記競合プローブが、
    およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記システイン変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在しない、請求項１に記載の方法。
  6. 前記システイン変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位に存在する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記変異体Ｒａｓが、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記システイン変異が、非保存アミノ酸位置に存在する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記システイン変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に対する変異である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記システイン変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位に存在する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記変異体Ｒａｓが、変異体Ｒａｓサブファミリータンパク質である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記Ｒａｓが、Ｒａｓサブファミリータンパク質である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記変異体Ｒａｓが、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  14. 前記Ｒａｓが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  15. 前記変異体Ｒａｓが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記変異体Ｒａｓが、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記結合の減少を検出する工程が、質量分析によって決定される、前記競合プローブによって共有結合的に修飾されたＲａｓの割合を測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  18. 置換アミノ酸を含む変異体Ｒａｓであって、ここで、
    （ａ）該置換アミノ酸は、該変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする該反応性アミノ酸であり；
    （ｂ）該置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸ではない、
    変異体Ｒａｓ。
  19. 前記反応性アミノ酸が、システイン、リジン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸または非天然アミノ酸である、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  20. 前記反応性アミノ酸が、システインである、請求項１９に記載の変異体Ｒａｓ。
  21. 前記競合プローブが、前記変異体Ｒａｓに結合することができる、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  22. 前記競合プローブが、前記変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  23. 前記置換アミノ酸が、Ｒａｓにおける非保存位置に存在する、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  24. 前記置換アミノ酸が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する６２、９２または９５位に存在する、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  25. 前記置換アミノ酸が、システインである、請求項２４に記載の変異体Ｒａｓ。
  26. 前記変異体Ｒａｓが、変異体ＫＲＡＳ、変異体ＨＲＡＳ、変異体ＮＲＡＳ、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  27. 前記変異体Ｒａｓが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  28. 前記変異体Ｒａｓが、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む、請求項１８に記載の変異体Ｒａｓ。
  29. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置に変異を含む、請求項２８に記載の変異体Ｒａｓ。
  30. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１８、６１、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置に変異を含む、請求項２８に記載の変異体Ｒａｓ。
  31. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２および１３位から選択される位置に変異を含む、請求項３０に記載の変異体Ｒａｓ。
  32. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２位にシステイン、１２位にアスパラギン酸、１３位にシステイン、１３位にアスパラギン酸またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３１に記載の変異体Ｒａｓ。
  33. 置換アミノ酸を含む変異体Ｒａｓであって、ここで、
    （ａ）該置換アミノ酸は、該変異体Ｒａｓと、反応性アミノ酸と反応する能力を示す競合プローブとの間の共有結合性の結合体化を可能にする該反応性アミノ酸であり；
    （ｂ）該置換アミノ酸は、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２または１３位におけるシステインまたはアスパラギン酸であり；
    （ｃ）該変異体Ｒａｓが、変異体ＭＲＡＳ、変異体ＥＲＡＳ、変異体ＲＲＡＳ２、変異体ＲＡＬＡ、変異体ＲＡＬＢ、変異体ＲＩＴ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、
    変異体Ｒａｓ。
  34. 前記反応性アミノ酸が、システインである、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  35. 前記競合プローブが、前記変異体Ｒａｓに結合することができる、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  36. 前記競合プローブが、前記変異体ＲａｓのＳｗｉｔｃｈ ＩＩポケットにおける結合について競合する、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  37. 前記変異体Ｒａｓが、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  38. 前記変異体Ｒａｓが、１つまたはそれより多いさらなる変異を含む、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  39. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する１２、１３、１４、１８、１９、２２、５９、６０、６１、６３、１１７、１４６位およびそれらの任意の組み合わせから選択される位置に変異を含む、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  40. 前記変異体Ｒａｓが、Ｇ１２ＤおよびＤ９２Ｃの変異またはＧ１２ＤおよびＨ９５Ｃの変異を有するＫｒａｓである、請求項３３に記載の変異体Ｒａｓ。
  41. 前記１つまたはそれより多いさらなる変異が、最適にアラインメントされたときの配列番号１に対する、１２位から選択される位置に変異を含み、かつ９２または９５位にさらなる１つの変異を含む、請求項４０に記載の変異体Ｒａｓ。
  42. 請求項１８〜４１のいずれか１項に記載の変異体Ｒａｓをコードする、ポリヌクレオチド。
  43. 請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  44. 請求項４２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

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