JP2018529317A - メソテリン及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物に関する。更に、本発明は、前記抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び該ポリヌクレオチドもしくはベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。更に、本発明は、本発明の抗体構築物の製造方法、前記抗体構築物の医学的使用及び前記抗体構築物を含むキットを提供する。

Description

本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物に関する。更に、本発明は、上記抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び該ポリヌクレオチドもしくはベクターによって形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）またはトランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）宿主細胞を提供する。更に、本発明は、本発明の抗体構築物の製造方法、上記抗体構築物の医学的使用及び上記抗体構築物を含むキットを提供する。

緒言
メソテリンは、当初ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣がん細胞株によるマウスの免疫化によって誘導されたモノクローナル抗体であるＫ１により認識された抗原として発見された、細胞表面タンパク質である（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １９９２）。発現クローニング法が用いられて、ＨｅＬａライブラリーからメソテリンｃＤＮＡが同定された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １９９６）。分子分析により、メソテリン遺伝子は６９ｋＤの前駆体タンパク質内にコードされ、該タンパク質はフューリンによって切断されて２種の別個のタンパク質、すなわち、放出される３１ｋＤのタンパク質である巨核球増強因子（ＭＰＦ）、及び、グリコホスファチジルイノシトール結合（ＧＰＩアンカー）によって細胞膜と連結する４０ｋＤのタンパク質であるメソテリンを与えることが実証された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １９９６）。上記メソテリンタンパク質は、ＡＲＭ型リピートを有する超らせんドメイン中に組織化される。

メソテリンは、卵巣がんならびに、膵臓がん、中皮腫、肺がん、胃がん及びトリプルネガティブ乳がんを含む他の腫瘍種において高度に発現される。正常な組織では、メソテリンは主として、胸膜、心膜、及び腹腔の中皮細胞層において発現される。メソテリンはまた、正常な卵巣、卵管及び扁桃の表面上皮上でも発現する。

メソテリンはまた、細胞表面上でのその発現に加えて、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥの作用によって血清中に放出もされる。卵巣がん及び他のがんを有する患者においては、放出されたメソテリンの血清レベルが上昇する。放出血清メソテリンに対するＥＬＩＳＡ試験であるＭＥＳＯＭＡＲＫ（登録商標）が人道的使用に関してＦＤＡにより認可されており、中皮腫の診断または監視に役立つ場合がある。放出メソテリンは、他のがん種の診断または予後を支援するために、単独または他のマーカーと共に用いられてもいる。

放出メソテリンの血清レベルと疾患との相関性によって、がんの進行におけるメソテリンタンパク質の潜在的な役割が示唆された。メソテリンの生物学的機能は十分に解明されてはいない − ノックアウトマウスは正常に見える − が、メソテリンはムチンＭＵＣ１６／ＣＡ−１２５に結合することが明らかになっている。細胞接着、浸潤及び転移において機能するメソテリン−ＣＡ−１２５相互作用が提案されている。

治療的介入用にメソテリンに対して生み出された最初の抗体は、メソテリンとＣＡ−１２５との間の相互作用を妨げるように設計された。ファージディスプレイによってＦｖ ＳＳが同定され、該Ｆｖ ＳＳは親和性最適化され、メソテリンを標的とする組換え免疫毒素であるＳＳ１Ｐを生成させるために用いられた。ＭＯＲＡｂ−００９抗体アマツキシマブは、これもＳＳ１を用いるが、メソテリンのアミノ末端の６４アミノ酸における非線形エピトープを認識する。上記ＳＳ１ Ｆｖはまた、キメラ抗原受容体を操作したＴ細胞を生成させるためにも用いられた。抗メソテリン抗体はまた、ＤＭ４と組み合わせたＭＦ−Ｔ抗体、及びモノメチルオーリスタチンＥと複合化した７Ｄ９抗体を含む、アネツマブ・ラブタンシンなどの薬物複合体を生成させるためにも用いられている。これらの抗メソテリン抗体はまた、メソテリンタンパク質のアミノ末端領域（アミノ酸２９６〜３９０）も認識するが、但し競合はしない。現在臨床治験中であるこれらの抗メソテリン標的治療薬は、単一の薬剤としては限定された有効性しか示していない。

ごく最近、メソテリンタンパク質の他の領域を認識する新たな抗メソテリン抗体が報告されている。ＳＳ１／ＭＯＲＡｂ−００９とは異なるメソテリンのエピトープに対する抗体（例えば、放出メソテリンまたは放出ＣＡ−１２５と競合しない抗体）において、患者における有効性が向上するかどうかを解明する必要性が依然として残っている。

卵巣がん、膵臓がん、中皮腫、肺がん、胃がん及びトリプルネガティブ乳がんなどの、ＭＳＬＮの過剰発現に関連する固形腫瘍疾患の治療のための利用可能な更なる選択肢が依然として必要であることから、腫瘍標的細胞の表面上のＭＳＬＮを対象とする結合ドメイン、及びＴ細胞の表面上のＣＤ３を対象とする第２の結合ドメインを有する二重特異性抗体構築物の形態の、この問題の解決のための手段及び方法が本明細書に提供される。

したがって、第１の態様において、本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物であって、第１の結合ドメインが、配列番号２３１、２３２、及び２３３に示されるＭＳＬＮ変異体内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合し、且つ配列番号２３４に示されるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＳＬＮにも結合する、二重特異性抗体構築物を提供する。

本明細書では、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の言及を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「試薬」への言及は、１種または複数種のかかる異なる試薬を包含し、「上記方法」への言及は、本明細書に記載される方法に対して修飾し得るまたはそれらに代わり得る、当業者に公知の等価のステップ及び方法を包含する。

別段の指示がない限り、一連の要素の前に記載される用語「少なくとも」とは、当該一連の要素のいずれをも指すと理解されるべきものである。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するかまたは日常的な実験のみを用いて確認することができよう。かかる均等物は本発明に包含されることが意図される。

本明細書ではいずれの場合においても、用語「及び／または」とは、「及び」、「または」及び「該用語によって接続された要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を包含する。

本明細書では、用語「約」または「およそ」とは、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内、最も好ましくは±５％以内を意味する。

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通じて、文脈に別段の必要性がない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を包含することを意味するが、いずれの他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群も排除することは意味しないと理解されるべきものである。本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または本明細書中で場合により、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」に置き換えることもできる。

本明細書では、「からなる」は、本請求項の要素に特定されていないいずれの要素、ステップ、または成分をも排除する。本明細書では、「から本質的になる」は、本請求項の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を与えない物質またはステップを排除するものではない。

本明細書の各例において、用語「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」は、他の２の用語のいずれかで置き換えてもよい。

用語「抗体構築物」とは、構造及び／または機能が、抗体、例えば、全長のすなわち完全な免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく分子をいう。したがって、抗体構築物はその特異的な標的すなわち抗原に結合することができる。更に、本発明に係る抗体構築物は、標的への結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３種の軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３種の重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６種のＣＤＲの全ての存在によって定義することができる。本発明に係る構築物が依拠する抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が挙げられる。

本発明に係る「抗体構築物」の定義の範囲内には、ラクダ科動物の抗体及び生物工学的もしくはタンパク質工学的方法またはプロセスによって生成される他の免疫グロブリン抗体も含む、全長のすなわち完全な抗体がある。これらの全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体であってよい。「抗体構築物」の定義の範囲内には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）などの全長抗体のフラグメントもある。本発明に係る抗体構築物はまた、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、以下、すなわち、（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２のような構造によって例示される「ミニボディ」、トリアボディまたはテトラボディなどのマルチボディ、及び、ナノボディまたは、他のＶ領域もしくはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬであってよい、単に１つの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体などの、抗体変異体とも呼ばれる抗体の修飾フラグメントであってもよい。

結合ドメインは、一般的に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。但し、両方を含む必要はない。例えば、Ｆｄフラグメントは２つのＶＨ領域を有し、多くの場合完全な抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持する。抗体フラグメント、抗体変異体または結合ドメインのフォーマットの更なる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する１価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（２）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１ ：５４４−５４６）、（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、（例えば、ｓｃＦＶライブラリーに由来する）（７）が好ましい。本発明に係る抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ ００／００６６０５、ＷＯ ２００５／０４０２２０、ＷＯ ２００８／１１９５６７、ＷＯ ２０１０／０３７８３８、ＷＯ ２０１３／０２６８３７、ＷＯ ２０１３／０２６８３３、ＵＳ ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ ２０１４／１４４７２２、ＷＯ ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ ２０１５／０４８２７２に記載されている。

更に、用語「抗体構築物」の定義は、１価、２価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）構築物、したがって唯一の抗原性構造に特異的に結合する単一特異性構築物、ならびに、別個の結合ドメインによって、２種以上、例えば、２種、３種、またはそれ以上の抗原性構造に特異的に結合する二重特異性及び多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）構築物を包含する。更に、用語「抗体構築物」の定義は、唯一のポリペプチド鎖から構成される分子、ならびに同一である（ホモ二量体、ホモ三量体もしくはホモオリゴマー）かまたは異なっている（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体もしくはヘテロオリゴマー）かのいずれであってもよい、２種以上のポリペプチド鎖から構成される分子を包含する。上記の識別された抗体及びそれらの変異体または誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９９）， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２ｎｄ ｅｄ． ２０１０ならびにＬｉｔｔｌｅ， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９に記載されている。

本発明の抗体構築物は、好ましくは、「イン・ビトロで生成させた抗体構築物」である。この用語は、可変領域（例えば、少なくとも１のＣＤＲ）の全てまたは一部が非免疫細胞選択、例えばイン・ビトロでのファージディスプレイ、タンパク質チップまたは、候補の配列を、該配列の抗原に結合する能力に関して試験することができる任意の他の方法において生成される、上記定義に係る抗体構築物をいう。したがって、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ生成される配列を排除する。「組換え抗体」とは、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学を用いて作製される抗体である。

本明細書では、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物とは、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、該集団を構成する個々の抗体が、起こり得る自然発生の突然変異及び／または僅かな量で存在する場合がある翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一である、から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、一般的に異なる決定基（またはエピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、高度に特異的であり、抗原上の単一の抗原部位すなわち決定基を対象とする。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、ハイブリドーマ培養によって合成され、したがって、他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとしての抗体の特性を示すものであって、いずれかの特定の方法による当該抗体の産生を要件とすると解釈されるべきものではない。

モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５ （１９７５）によって最初に報告されたハイブリドーマ法によって作製するか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。）によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生する更なる技法の例としては、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４ （１９８３）， ７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８５）， ７７−９６）が挙げられる。

次いで、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を用いてハイブリドーマをスクリーニングして、指定された抗原と特異的に結合する抗体を産生する１種または複数種のハイブリドーマを識別することができる。関連する抗原の任意の形態、例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、それらの任意の変異体またはフラグメント、ならびにそれらの抗原ペプチドを免疫原として用いることができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、ＭＳＬＮまたはＣＤ３イプシロンなどの標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を向上させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７ （１９９６）， ９７−１０５； Ｍａｌｍｂｏｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３ （１９９５）， ７−１３）。

モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７， Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ （１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１）に記載がある。

ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連する抗原を用いて、非ヒト動物、例えばげっ歯動物（マウス、ハムスター、ウサギまたはラットなど）を免疫化することができる。一実施形態において、上記非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きなフラグメントでマウス抗体産生が欠失したマウス株を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１、ＵＳ ２００３−００７０１８５、ＷＯ ９６／３４０９６、及びＷＯ ９６／３３７３５を参照されたい。

モノクローナル抗体はまた非ヒト動物からも得ることができ、次いで、本技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を用いて、例えばヒト化する、脱免疫化する、キメラにする等、修飾することができる。修飾された抗体構築物の例としては、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟した」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５４， ８８９−８９６ （１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １０８３２−１０８３７ （１９９１）を参照のこと。）ならびに改変されたエフェクター機能（複数可）を有する抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ （２０１０），前掲，及びＬｉｔｔｌｅ （２００９），前掲，を参照のこと。）が挙げられる。

免疫学において、親和性成熟とは、Ｂ細胞が、免疫応答の経過中に、抗原に対する親和性が増大した抗体を産生する過程である。同一の抗原への反復した接触によって、宿主は次々に大きくなる親和性の抗体を産生することとなる。天然の原型のように、上記イン・ビトロでの親和性成熟は、突然変異及び選択の原理に基づく。イン・ビトロでの親和性成熟をうまく用いて、抗体、抗体構築物、及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内部のランダムな突然変異は、放射線照射、化学的突然変異誘発剤またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。更に、鎖混合法（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって遺伝子多様性を増加させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ法を用いた２〜３回の突然変異及び選択の繰返しによって、通常、低いナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが生じる。

好ましい型式の本抗体構築物のアミノ酸置換変異は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１または複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、更なる開発に向けて選択されて得られる変異体（複数可）は、該変異体が生成される基となる親抗体と比較して向上した生物学的特性を有することとなる。かかる置換変異体を生成させる簡便な方法はファージディスプレイを用いた親和性成熟を含む。簡単に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成した抗体変異体は、各粒子内に収納されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として繊維状ファージ粒子から１価の形で提示される。次いで、上記ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるように、該変異体の生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。修飾に対する候補となる超可変領域部位を識別するために、アラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を識別することができる。あるいは、またはこれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、結合ドメインと、例えば、ヒトＭＳＬＮとの間の接触点を識別することが有益である場合がある。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。かかる変異体が生成した後、変異体パネルを本明細書に記載のスクリーニングに供して、１または複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、更なる開発に向けて選択してもよい。

本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物としては、詳細には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の、相当する配列と同一あるいは相同である一方、当該連鎖（複数可）の残余部が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の、相当する配列と同一あるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、かかる抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１−６８５５ （１９８４））。本明細書において対象とするキメラ抗体としては、非ヒト霊長動物（例えば、旧世界サル、類人猿等）及びヒトの定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１， １９８５； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２， １９８５； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号； Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号； Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ ０１７１４９６； ＥＰ ０１７３４９４；及びＧＢ ２１７７０９６を参照されたい。

抗体、抗体構築物、抗体フラグメントまたは抗体変異体はまた、例えばＷＯ ９８／５２９７６またはＷＯ ００／３４３１７に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特定の欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によって修飾されてもよい。簡単に説明すると、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析することができ、これらのペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ ９８／５２９７６及びＷＯ ００／３４３１７に定義される。）を表す。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピューターモデリング手法を適用することができ、更に、ＷＯ ９８／５２９７６及びＷＯ ００／３４３１７に記載されるように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨ及びＶＬ配列中に存在するモチーフに関して検索することができる。これらのモチーフは１８種の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、したがって潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、単一のアミノ酸の置換によって除去することができる。一般的には保存的置換が行われる。多くの場合、但し限定はされないが、ヒト生殖系列抗体配列の位置に共通のアミノ酸を用いることができる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６−７９８； Ｃｏｏｋ， Ｇ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ． １６ （５）： ２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＥＭＢＯ Ｊ． １４： １４：４６２８−４６３８に開示される。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， ＬＡ． ｅｔ ａｌ． ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫにより編集されている）。これらの配列は、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲのためのヒト配列の供給源として用いることができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されるように、コンセンサスヒトフレームワーク領域もまた用いることができる。

（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは他の抗体の抗原結合部分配列などの）「ヒト化」抗体、抗体構築物、変異体またはそれらのフラグメントは、殆どヒト配列の抗体または免疫グロブリンであり、これらは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列（複数可）を含有する。殆どの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲも）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び容量を有する、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどの、非ヒト（例えば、げっ歯動物）種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、上記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、相当する非ヒト残基によって置換される。更に、本明細書では、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に精密化し最適化するために行われる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれも含んでいてもよい。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２： ３２３−３２９ （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２： ５９３−５９６ （１９９２）を参照されたい。

ヒト化抗体またはそれらのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列で置換することによって生成させることができる。ヒト化抗体またはそれらのフラグメントを生成させるための例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７によって；Ｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；ならびにＵＳ ５，５８５，０８９；ＵＳ ５，６９３，７６１；ＵＳ ５，６９３，７６２；ＵＳ ５，８５９，２０５；及びＵＳ ６，４０７，２１３によって提供されている。これらの方法としては、重鎖または軽鎖の少なくとも１から免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列を単離する、操作する、及び発現させることが挙げられる。かかる核酸は、上記のような、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、ならびに他の供給源から得ることができる。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを適宜の発現ベクター中にクローニングすることができる。

ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどの形質転換動物を用いて産生することもできる。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載のヒト化抗体を調製するために用いることができる例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体の全てのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換してもよく、または該ＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置換してもよい。上記ヒト化抗体の所定の抗原に対する結合に必要とされる数のＣＤＲを置換するだけでよい。

ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換及び／または逆突然変異の導入によって最適化することができる。かかる改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知のいくつかの技術（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０： ７３０８−７３１２， １９８３； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４： ７２７９， １９８３； Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２： ３−１６， １９８２，及びＥＰ ２３９ ４００）のいずれかによって作製することができる。

用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）（前掲）に記載されるものを含む、本技術分野で公知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に相当する可変及び定常領域またはドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体構築物及び結合ドメインを包含する。本発明のヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、イン・ビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってまたはイン・ビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）によってコードされないアミノ酸残基を含む場合がある。上記ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１、２、３、４、５またはそれ以上の位置を有することができる。本明細書では、ヒト抗体、抗体構築物及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術またはシステムを用いることによって誘導することができるもののような、非人工的に及び／または遺伝的に改変されたヒトの抗体の配列のみを含む、完全ヒト抗体をも企図する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。本明細書中に開示される抗体構築物を記述するのに用いられる場合、「単離された」または「実質的に純粋な」とは、その産生環境の成分から識別、分離、及び／または回収された抗体構築物を意味する。好ましくは、本抗体構築物は、その産生環境由来の他の全ての成分を同伴しないまたは実質的に同伴しない。組換えの、トランスフェクトされた細胞由来の汚染成分などの、その産生環境の汚染成分は、一般的に当該ポリペプチドの診断上または治療上の使用を妨げることとなる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。本抗体構築物は、例えば、所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成していてもよい。上記単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成してもよいことを理解されたい。上記ポリペプチドは、誘導可能なプロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって有意により高い濃度で作製することができ、その結果高濃度レベルで作製される。上記定義は、本技術分野で公知の多種多様な生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生を包含する。好ましい実施形態において、本抗体構築物は、（１）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によって少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、あるいは（２）クーマシーブルー染色もしくは、好ましくは、銀染色を用いた非還元または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで、精製されることとなる。但し、通常は、単離された抗体構築物は少なくとも１の精製ステップによって調製されることとなる。

用語「結合ドメイン」は、本発明との関連において、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、ここではそれぞれＭＳＬＮ及びＣＤ３、に（特異的に）結合する／相互作用する／それらを認識するドメインの特徴を示す。第１の結合ドメイン（ＭＳＬＮを認識する）の構造及び機能、及び好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能も、抗体の、例えば、全長のすなわち完全な免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３種の軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３種の重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第２の結合ドメインもまた、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３種の軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３種の重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／または第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植するのではなく、ファージディスプレイまたはライブラリースクリーニング法によって産生されるかまたは入手可能であることが想定される。

本発明によれば、結合ドメインは、１種または複数種のポリペプチドの形態である。かかるポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたはグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含んでいてもよい。タンパク質（通常３０未満のアミノ酸を有するそれらのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、及びペプチドを含む）は、（アミノ酸の連鎖を生じる）共有結合のペプチド結合によって互いに結合した２以上のアミノ酸を含む。本明細書では、用語「ポリペプチド」とは、通常３０を超えるアミノ酸からなる一群の分子をいう。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマー、すなわち２種以上のポリペプチド分子からなる多量体を更に形成してもよい。かかる二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても非同一であってもよい。したがって、かかる多量体の相当するより高次の構造は、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、その天然に存在する形態において、２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖及び２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質であって、該修飾が、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾によって行われる上記ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、本明細書において言及される場合、ペグ化など、化学修飾されていてもよい。かかる修飾は本技術分野において周知であり、本明細書中で以後に記載される。

好ましくは、ＭＳＬＮに結合する上記結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する上記結合ドメインはヒト結合ドメインである。少なくとも１種のヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、げっ歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）などの非ヒト可変領域及び／または定常領域を有する抗体または抗体構築物に伴ういくつかの問題を回避する。かかるげっ歯動物由来のタンパク質の存在によって、患者により、上記抗体もしくは抗体構築物の迅速なクリアランスが生じる場合があり、または上記抗体もしくは抗体構築物に対する免疫応答が生起させる場合がある。げっ歯動物由来の抗体または抗体構築物の使用を避けるために、げっ歯動物が完全ヒト抗体を産生するように、ヒト抗体機能を当該げっ歯動物に導入することによって、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物を作製することができる。

ＹＡＣにおけるメガベースの大きさのヒト遺伝子座をクローニング及び再構成し、それらをマウス生殖系列に導入することが可能であることにより、非常に大きくまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明し、ヒト疾患の有用なモデルを生み出す強力な手法が提供される。更に、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するためのかかる技術を用いることにより、発症に際してのヒト遺伝子産物の発現及び調節、他の系とのそれらの伝達、及び疾患の誘導及び進行におけるそれらの関与に関して独自に洞察することができる場合がある。

かかる方法の重要且つ実際的な応用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入によって、プログラムされた発現及び抗体の構築の基礎となる機構ならびにＢ細胞発生におけるそれらの役割を検討する機会が提供される。更に、かかる方法は、ヒト疾患における抗体療法への期待の実現に向けた重要なマイルストーンである、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生の理想的な供給源を提供することができる場合がある。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスまたはマウス誘導ｍＡｂに固有の免疫原性の及びアレルギー性の応答を最小限に抑え、したがって、投与された抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を向上させることが期待される。完全ヒト抗体または抗体構築物を用いることによって、反復して化合物を投与することが必要とされる、炎症、自己免疫、及びがんなどの慢性ならびに再発性のヒト疾患の治療において、実質的な利点が提供されることが期待できる。

この目的に対する１つの手法は、マウス抗体産生が欠損したマウス株を、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントで操作することであって、かかるマウスが、マウス抗体の非存在下でヒト抗体の大きなレパートリーを産生することを期待しての上記操作であった。大きなヒトＩｇフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体産生及び発現の適切な調節を維持することとなる。抗体の多様化及び選択、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠如に関するマウスの機構を利用することにより、これらのマウス株において複製されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を始めとする任意の対象とする抗原に対する高親和性抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製し選択することができた。この概括的な方法は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス株の創出に関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１ （１９９４）を参照のこと。）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株を、コアの可変及び定常領域配列を含有する、それぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂの大きさのヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座の生殖系列配置フラグメントを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）で操作した。ＹＡＣを含有する上記ヒトＩｇは、抗体の再構成及び発現の両方に対して当該マウス系と適合性であることが判明し、不活化マウスＩｇ遺伝子を置換することができた。このことは、Ｂ細胞発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを生成する能力によって実証された。これらの結果はまた、より多数のＶ遺伝子、更なる調節要素、及びヒトＩｇ定常領域を含有する上記ヒトＩｇ遺伝子座のより大きな部分を導入することによって、感染及び免疫化に対するヒトの体液性応答の特徴である完全なレパートリーが実質的に再現される可能性があることを示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の研究が、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のメガベースの大きさの生殖系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、およそ８０％を超えるヒト抗体レパートリーの導入まで拡大された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号を参照されたい。

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの産生については、米国特許出願第０７／４６６，００８号、第０７／６１０，５１５号、第０７／９１９，２９７号、第０７／９２２，６４９号、第０８／０３１，８０１号、第０８／１１２，８４８号、第０８／２３４，１４５号、第０８／３７６，２７９号、第０８／４３０，９３８号、第０８／４６４，５８４号、第０８／４６４，５８２号、第０８／４６３，１９１号、第０８／４６２，８３７号、第０８／４８６，８５３号、第０８／４８６，８５７号、第０８／４８６，８５９号、第０８／４６２，５１３号、第０８／７２４，７５２号、及び第０８／７５９，６２０号；及び米国特許第６，１６２，９６３号；第６，１５０，５８４号；第６，１１４，５９８号；第６，０７５，１８１号、及び第５，９３９，５９８号ならびに日本特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号、及び第３ ０６８ ５０７ Ｂ２に更に議論及び詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：４８３−４９５ （１９９８）、ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１、ＷＯ ９４／０２６０２、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ００／７６３１０、及びＷＯ ０３／４７３３６も参照されたい。

これに代わる手法において、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．を始めとする他の研究者は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」手法を利用している。ミニ遺伝子座手法においては、Ｉｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）の組み込みによって外因性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。かくして、１種または複数種のＶＨ遺伝子、１種または複数種のＤＨ遺伝子、１種または複数種のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、及び第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が、動物への挿入のための構築物中に形成される。この手法は、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．に与えられた米国特許第５，５４５，８０７号、及びそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに与えられた米国特許第５，５４５，８０６号；第５，６２５，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；第５，７７０，４２９号；第５，７８９，６５０号；第５，８１４，３１８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９；及び第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに与えられた米国特許第５，５９１，６６９号及び第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．に与えられた米国特許第５，６１２，２０５号；第５，７２１，３６７号；及び第５，７８９，２１５号、Ｃｈｏｉ及びＤｕｎｎに与えられた米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、第０７／５７５，９６２号、第０７／８１０，２７９号、第０７／８５３，４０８号、第０７／９０４，０６８号、第０７／９９０，８６０号、第０８／０５３，１３１号、第０８／０９６，７６２号、第０８／１５５，３０１号、第０８／１６１，７３９号、第０８／１６５，６９９号、第０８／２０９，７４１号に記載される。ＥＰ ０ ５４６ ０７３ Ｂ１、ＷＯ ９２／０３９１８、ＷＯ ９２／２２６４５、ＷＯ ９２／２２６４７、ＷＯ ９２／２２６７０、ＷＯ ９３／１２２２７、ＷＯ ９４／００５６９、ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９６／１４４３６、ＷＯ ９７／１３８５２号、及びＷＯ９８／２４８８４ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたい。更に、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２）， Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， ａｎｄ Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９６）も参照されたい。

Ｋｉｒｉｎもまた、微小核融合によって、染色体の大きな断片、または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成を実証している。欧州特許出願第７７３ ２８８号及び第８４３ ９６１号を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは潜在的なヒト抗体産生のための技術を開発している。この技術において、ＳＣＩＤマウスがヒトリンパ細胞、例えば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞により再構成される。次いでマウスを抗原で免疫化し、当該の抗原に対する免疫応答を生起させることができる。米国特許第５，４７６，９９６号、第５，６９８，７６７号、及び第５，９５８，７６５号を参照されたい。

ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答によって、業界はキメラ抗体または他の方法でヒト化した抗体を調製するようになった。しかしながら、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に当該抗体の長期にわたるまたは多数回の利用において認められることになることが予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念及び／または影響をなくすために、ＭＳＬＮに対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３に対するヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましいと思われる。

用語「（特異的に）〜に結合する」、「（特異的）に認識する」、「（特異的に）〜を対象とする」、及び「（特異的に）〜と反応する」とは、本発明によれば、結合ドメインが、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、ここではそれぞれＭＳＬＮ及びＣＤ３、に相互作用するかまたは特異的に相互作用することを意味する。

用語「エピトープ」とは、抗体もしくは免疫グロブリン、あるいは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメントまたは変異体などの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位をいう。「エピトープ」は抗原性であり、したがって、用語「エピトープ」は、本明細書において、場合により「抗原性構造」または「抗原決定基」とも呼ばれる。したがって、上記結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。上記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義するとも理解されるべきものである。

「エピトープ」は、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続したアミノ酸または非連続のアミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されたエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、一般に、独自の配列中に少なくとも３または少なくとも４、より通常には少なくとも５または少なくとも６または少なくとも７、例えば約８〜約１０のアミノ酸を含む。

線状エピトープとは対照的に、「立体構造エピトープ」は、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを規定する唯一の要素ではないエピトープである（例えば、アミノ酸の一次配列は上記結合ドメインによって必ずしも認識されないエピトープ）。一般的に、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関し、上記結合ドメインは、当該抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメントの三次元構造を認識する（本発明の文脈において、上記結合ドメインの１つに対する当該の抗原性構造はＭＳＬＮタンパク質内に含まれる。）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド主鎖は並置された状態となって、当該抗体がエピトープを認識することができる。エピトープの高次構造を決定する方法としては、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光法及び部位特異的スピンラベル及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定はされない。

エピトープマッピングのための方法を以下に記載する。すなわち、ヒトＭＳＬＮタンパク質中の領域（連続するアミノ酸ストレッチ）が、その相当する非ヒト及び非霊長動物ＭＳＬＮ抗原の領域（例えば、マウスＭＳＬＮ、但し、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどの他のものも想定される場合がある。）によって交換／置換される場合、当該結合ドメインが用いられる非ヒト、非霊長動物ＭＳＬＮに対して交差反応性でない限り、結合ドメインの結合の減少が起こると予想される。上記減少は、当該のヒトＭＳＬＮタンパク質中のそれぞれの領域に対する結合と比較して、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％であり、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、または８０％であり、最も好ましくは９０％、９５％、または更には１００％であり、それによって、該ヒトＭＳＬＮタンパク質中のそれぞれの領域に対する結合を１００％とする。前述のヒトＭＳＬＮ／非ヒトＭＳＬＮキメラがＣＨＯ細胞中で発現されることが想定される。該ヒトＭＳＬＮ／非ヒトＭＳＬＮキメラはまた、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合することもできるが、かかる技法は実施例１及び２に記載の方法には必要でない。

エピトープマッピングのための上記に代わるまたは追加の方法において、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、いくつかのトランケートした形態のヒトＭＳＬＮ細胞外ドメインを生成させることができる。これらのトランケートした形態においては、異なる細胞外ＭＳＬＮドメイン／サブドメインまたは領域が、Ｎ末端から開始して段階的に除去される。ＣＨＯ細胞において発現させることができるトランケートしたＭＳＬＮ形態。上記トランケートしたＭＳＬＮ形態は、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合することもできることも想定される。上記トランケートしたＭＳＬＮ形態は、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドを包含し得ることも想定される。上記トランケートしたＭＳＬＮ形態は、それらのＮ末端に（上記シグナルペプチドに続いて）、細胞表面上でそれらの正しい発現を確認することができるｖ５ドメインを包含し得ることが更に想定される。当該結合ドメインによって認識されるいずれかの更なるＭＳＬＮ領域を包含しないトランケートしたＭＳＬＮ形態では、結合の減少または消失が起こることが予想される。上記結合の減少は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％であり、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％であり、最も好ましくは９０％、９５％、または更には１００％であり、それによって、ヒトＭＳＬＮタンパク質全体（またはその細胞外領域もしくはドメイン）に対する結合を１００％とする。

抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定の残基の寄与を判定する更なる方法はアラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ ＆ Ｗｅｉｓｓ ＧＡ． Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照のこと。）、該分析において、分析する各残基は、例えば、部位特異的突然変異誘発によってアラニンに置換される。アラニンを用いる理由は、嵩高くなく、化学的に不活性であり、それにもかかわらず、他の多くのアミノ酸が有する二次構造の参照（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を模倣するアラニンのメチル官能基にある。突然変異した残基の大きさの保存が所望の場合には、バリンまたはロイシンなどの嵩高いアミノ酸を用いることができる。アラニンスキャニングは長い間用いられてきた、成熟した技術である。

上記結合ドメインと上記エピトープまたは該エピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原（ここでは、それぞれＭＳＬＮ及びＣＤ３）上の上記エピトープ／該エピトープを含む領域に対する認識可能な親和性を示し、ＭＳＬＮもしくはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との有意な反応性を示さないことを含意する。「認識可能な親和性」は約１０^−６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性での結合を含む。上記結合親和性が約１０^−１２〜１０^−８Ｍ、１０^−１２〜１０^−９Ｍ、１０^−１２〜１０^−１０Ｍ、１０^−１１〜１０^−８Ｍである、好ましくは約１０^−１１〜１０^−９Ｍの親和性である場合に、結合は特異的であると見なされることが好ましい。結合ドメインが特異的に標的と反応または結合するかは、なかんずく、上記結合ドメインの標的タンパク質または抗原との反応を、該結合ドメインのＭＳＬＮもしくはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって容易に試験することができる。本発明の結合ドメインは、ＭＳＬＮもしくはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインはＭＳＬＮ以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインはＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）ことが好ましい。

用語「本質的に／実質的に結合しない」または「結合できない」とは、本発明の結合ドメインがＭＳＬＮもしくはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、ＭＳＬＮもしくはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との、３０％を超える、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％以下の反応性を示さず、それによってＭＳＬＮまたはＣＤ３に対する結合をそれぞれ１００％とすることを意味する。

特異的結合は、上記結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列中の特定のモチーフによって生じると考えられる。したがって、それらの一次、二次及び／または三次構造の結果として、ならびに上記構造の二次修飾の結果として結合が生じる。上記抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用によって、上記部位の上記抗原に対する単純な結合が生じ得る。更に、上記抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用によって、例えば、当該抗原の高次構造の変化の誘導、該抗原のオリゴマー化などに起因して、シグナルが開始される場合がある。

本発明の一実施形態においては、第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンに結合することも好ましい。

別の態様において、本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、第１の結合ドメインが、配列番号２４４（クラスター１＋２）、配列番号２４５（クラスター２＋３）及び配列番号２４１（クラスター４）からなる群より選択される配列番号に示される配列を有するヒトＭＳＬＮの領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する、二重特異性抗体構築物を提供する。

本発明の二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、
ａ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｂ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｃ）配列番号１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｄ）配列番号１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｅ）配列番号１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｆ）配列番号２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｇ）配列番号２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、ならびに
ｈ）配列番号２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが好ましい。

用語「可変」とは抗体の部分または免疫グロブリンドメインであって、それらの配列における可変性を示し、且つ特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する上記抗体の部分または免疫グロブリンドメイン（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）をいう。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とが互いに対になることにより、単一の抗原結合部位を形成する。

可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、三次元空間に、抗原結合表面を形成するための６種のＣＤＲのためのスキャフォールドを提供する。天然起源の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、多くはβシート構造をとり、３つの超可変領域によって連結された４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、上記３つの超可変領域は、上記βシート構造を結合し、且つ場合によっては該βシート構造の一部を形成するループを形成する。各連鎖中の上記超可変領域は、上記ＦＲＭによって互いに極めて近接して、且つ他の連鎖由来の超可変領域と共に保持され、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲，を参照のこと。）。

用語「ＣＤＲ」及びその複数形は、相補性決定領域であって、その内の３種が軽鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）の結合特性を形作り、３種が重鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）の結合特性を形作る、上記相補性決定領域をいう。ＣＤＲは、抗体の抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含有し、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する、すなわち、ＣＤＲは抗原特異性の主要な決定因子である。

厳密な定義上のＣＤＲの境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムの主題である。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔまたは本明細書に記載の番号付けシステムを含む任意の他の境界の定義によって参照され得る。異なる境界にもかかわらず、これらのシステムのそれぞれは、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有する。したがって、これらの系によるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域が異なる場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的検討に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９８７， １９６： ９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９９６， ２６２： ７３２）を参照されたい。抗原結合部位を特徴付ける更に別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭの定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ． Ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ （Ｅｄ．： Ｄｕｅｂｅｌ， Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ハイデルベルグ）を参照されたい。２つの残基同定技術が、重複はするが同一ではない領域を規定する限りにおいて、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。但し、いわゆるＫａｂａｔシステムによる番号付けが好ましい。

一般的には、ＣＤＲは、カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造として分類される場合があるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」とは、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖立体構造をいう。比較構造検討から、６種の抗原結合ループのうちの５種が、利用可能な立体構造の限られたレパートリーしか有さないことが判明している。各カノニカル構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、高いアミノ酸配列の可変性にもかかわらず、該ループの殆どの部分において非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９８７， １９６： ９０１； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ８７７； Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９９６， ２６３： ８００）。更に、上記ＣＤＲがとるループ構造と該構造の周囲のアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラス（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｌａｓｓ）の立体配座は、当該のループの長さ及び該ループ内の重要な位置、ならびに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて特定のカノニカルクラスが決定され得る。

用語「カノニカル構造」はまた、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）によって分類されるように、抗体の線状配列に関する考察も含む場合がある。Ｋａｂａｔの番号付けスキーム（システム）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した方法で番号付けするために広く採用されている基準であり、本明細書の他の箇所でも言及している、本発明に適用される好ましいスキームである。更なる構造的考察を用いて抗体のカノニカル構造を決定することもできる。例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによって完全には反映されない相違は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．の番号付けシステムによって記述することができ、及び／または他の技法、例えば、結晶学及び２次元または３次元計算モデル化によって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、他のものがある中でも、適切なシャーシ配列（例えば、ライブラリー中の様々なカノニカル構造を含むことを望むことに基づく）を識別することを可能にするカノニカルクラスに分類してもよい。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔの番号付け及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，前掲，によって報告された構造上の考察、ならびに抗体構造のカノニカルな側面を解釈するために上記考察から推測されることは文献に記載されている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は本技術分野において周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｅｄｓ． Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９８８を参照されたい。

軽鎖のＣＤＲ３及び、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子を構成し得る。いくつかの抗体構築物において、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成するように思われる。ＣＤＲ３のみが変化するイン・ビトロ選択スキームを用いて、抗体の結合特性を変化させる、またはどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は一般的に、抗体結合部位内の分子多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基のように短くてもよく、または２６のアミノ酸より大きくてもよい。

古典的な全長抗体または免疫グロブリンにおいては、各軽（Ｌ）鎖は１つのジスルフィド共有結合によって重（Ｈ）鎖に連結されるが、上記２つのＨ鎖は、当該Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１または複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは通常ＣＨ１と呼ばれる。定常（「Ｃ」）ドメインは抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性、細胞性細胞傷害性及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。

組立て及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は非常に多様であり、これらの多様な遺伝子は、１０^１０の異なる抗体分子をコードすると見積もられている（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ， ２^ｎｄ ｅｄ．， ｅｄｓ． Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」とは、少なくとも１種の免疫グロブリンをコードする少なくとも１種の配列に、全体的にまたは部分的に由来する少なくとも１種のヌクレオチド配列をいう。上記配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントのイン・ビボでの再配列によって生成し得る。あるいは、上記配列（複数可）は、細胞であって、該細胞に応答して再配列、例えばイン・ビトロ刺激が起こる上記細胞から生成する場合がある。あるいは、上記配列（複数可）の一部または全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、及び他の方法によって得ることができ、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。レパートリーは１つの配列のみを含んでいてもよく、または遺伝子的に多様なコレクション中の配列を含む複数の配列を含んでいてもよい。

本発明に係る好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の（好ましくはヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物であって、第１の結合ドメインが、ＭＳ＿１〜ＭＳ＿８からなる群より選択される抗体、すなわち、
ａ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｂ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｃ）配列番号１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｄ）配列番号１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｅ）配列番号１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｆ）配列番号２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｇ）配列番号２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、ならびに
ｈ）配列番号２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む抗体と同一のＭＳＬＮのエピトープに結合する、上記二重特異性抗体構築物として定義することもできる。

抗体構築物が別の所与の抗体構築物と同一のＭＳＬＮのエピトープに結合するかどうかは、例えば本明細書中で前述したように且つ添付の実施例１及び２に記載するように、例えばキメラまたはトランケートした標的分子を用いたエピトープマッピングにより判定することができる。

本発明に係る好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の（好ましくはヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、第１の結合ドメインが、ＭＳ＿１〜ＭＳ＿８からなる群より選択される抗体、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域であって、上述のものからなる群より選択される上記ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む抗体と結合に関して競合する、二重特異性抗体構築物として定義することもできる。

抗体構築物が別の所与の抗体構築物と結合に関して競合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞ベース競合アッセイなどの競合アッセイで判定することができる。アビジン結合微粒子（ビーズ）も用いることができる。アビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させた場合、これらのビーズのそれぞれを、その上でアッセイを実施することができる基質として用いることができる。抗原をビーズ上に被覆し、次いで第１の抗体をプレコートする。第２の抗体を添加し、任意の更なる結合を測定する。読み取りのための可能な手段としてはフローサイトメトリーが挙げられる。

一実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、及び配列番２２７＋２２８に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域とＶＬ領域とを含む。

一層更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む。

上述の第１の結合ドメイン（それらのＣＤＲ、ＶＨ領域及びＶＬ領域ならびにそれらの組合せによって特定される）は、配列番号２３１，２３２、及び２３３に示されるＭＳＬＮのエピトープに結合する結合ドメインとして特徴付けられる。

本明細書では、用語「二重特異的」とは、「少なくとも二重特異性」である抗体構築物をいい、すなわち、該抗体構築物は少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは１種の抗原または標的（ここでは：ＭＳＬＮ）に結合し、第２の結合ドメインは別の抗原または標的（ここでは：ＣＤ３）に結合する。したがって、本発明に係る抗体構築物は、少なくとも２種の異なる抗原または標的に対する特異性を含む。用語本発明の「二重特異性抗体構築物」はまた、多重特異性抗体構築物、例えば、三重特異性抗体構築物（後者は３つの結合ドメインを含む）、または３を超える（例えば、４、５・・・の）特異性を有する構築物なども包含する。

本発明にかかる抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であることを考えると、該抗体構築物は天然には存在せず、天然由来の産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２種の別個の結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築物は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって製造することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５−３２１（１９９０）を参照されたい。

本発明の抗体構築物の少なくとも２種の結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでいても含んでいなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、それによって、本発明の抗体構築物の１つの（可変及び／または結合）ドメイン及び別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに連結されたアミノ酸配列を含む。かかるペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、如何なる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーとしては、中でも、米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号またはＷＯ ８８／０９３４４に記載されているものがある。上記ペプチドリンカーはまた、他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期を延長するドメインなど）を本発明の抗体構築物に結合するために用いることもできる。

リンカーが用いられる場合、このリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインのそれぞれが、互いに独立して、それらの異なる結合特異性を保持することができることを確保するのに十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体構築物中の少なくとも２種の結合ドメイン（または２種の可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーについては、例えば１２アミノ酸残基以下である、僅かな数のアミノ酸残基のみを含むペプチドリンカーが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６または５のアミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２または１のアミノ酸（複数可）を含み、Ｇｌｙに富むリンカーが好ましい。上記「ペプチドリンカー」の文脈における特に好ましい「単一の」アミノ酸はＧｌｙである。したがって、上記ペプチドリンカーは単一のアミノ酸Ｇｌｙから構成されてもよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１）、またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘ、但し、ｘは１以上の整数（例えば２または３）である。好ましいリンカーは配列番号１〜９に示される。二次構造を促進しないことを含む上記ペプチドリンカーの特徴は本技術分野において公知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９８） ３７， ９２６６−９２７３）， Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９９２） ２９， ２１−３０）及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ （ＦＡＳＥＢ （１９９５） ９（１）， ７３−８０）に記載される。更に如何なる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。上記ドメインの相互の連結は、実施例に記載のように、例えば遺伝子工学によって行うことができる。融合された及び作動可能に連結された二重特異性一本鎖構築物の調製方法及び哺乳動物細胞または細菌中におけるそれらの発現方法は、本技術分野で周知である（例えば、ＷＯ ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク， ２００１）。

本明細書に上述のように、本発明は、上記抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、それらのフォーマットのいずれかのダイアボディ及びオリゴマーからなる群より選択されるフォーマットである、好ましい実施形態を提供する。

特に好ましい実施形態によれば、且つ添付の実施例に記載されるように、本発明の抗体構築物は、「二重特異性一本鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いて、上記ＶＬ及びＶＨを、該ＶＬ及びＶＨ領域が対合して１価の分子を形成したタンパク質一本鎖として作製することを可能にする本明細書に上述する合成リンカーにより、結合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。）。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、該フラグメントは、完全な、すなわち全長の抗体を評価するのと同様の方法で機能に関して評価が行われる。したがって、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常は約１０〜約２５のアミノ酸、好ましくは約１５〜２０のアミノ酸の短いリンカーペプチドによって結合された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。上記リンカーは、通常、柔軟性を目的としてグリシン、ならびに可溶性を目的としてセリンまたはトレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはその逆のいずれかで結合することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。

二重特異性一本鎖分子は本技術分野で公知であり、ＷＯ ９９／５４４４０， Ｍａｃｋ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９７）， １５８， ３９６５−３９７０， Ｍａｃｋ， ＰＮＡＳ， （１９９５）， ９２， ７０２１−７０２５， Ｋｕｆｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， （１９９７）， ４５， １９３−１９７， Ｌｏｆｆｌｅｒ， Ｂｌｏｏｄ， （２０００）， ９５， ６， ２０９８−２１０３， Ｂｒｕｈｌ， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， （２００１）， １６６， ２４２０−２４２６， Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， （１９９９）， ２９３， ４１−５６に記載される。一本鎖抗体の産生に関して記載された技術（なかんずく、米国特許第４，９４６，７７８号， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ （２０１０），前掲，及びＬｉｔｔｌｅ （２００９），前掲，を参照のこと。）は、選択された標的（複数可）を特異的に認識する一本鎖抗体構築物を産生するように適合させることができる。

フォーマット（ｓｃＦｖ）_２を有する２価の（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（２価の（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）または二重特異性の一本鎖可変フラグメント（ｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ）を、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書に上記したリンカーを用いて）連結することによって操作することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同一の結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子は好ましくは２価（すなわち、同一の標的エピトープに対する２の結合価を有する。）と呼ばれることとなる。当該の２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子は好ましくは二重特異性と呼ばれる。上記連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有するペプチド一本鎖を生成させ、タンデムｓｃＦｖを与えることによって行うことができる（例えば、 Ｋｕｆｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８−２４４を参照のこと。）。別の可能性としては、短過ぎて上記２つの可変領域を共に折り畳むことができず（例えば、約５のアミノ酸）、ｓｃＦｖ分子が二量化せざるを得ないようにするリンカーペプチドを有するｓｃＦｖ分子を生み出すことがある。このタイプはダイアボディとして知られる（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ， Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， （Ｊｕｌｙ １９９３） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０ （１４）： ６４４４−８を参照このこと。）。

本発明の抗体構築物の別の好ましい実施形態によれば、標的抗原ＭＳＬＮまたはＣＤ３のいずれかに結合する結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、上述のペプチドリンカーを介して直接結合するのではなく、上記結合ドメインはダイアボディに関して説明した二重特異性分子の形成に起因して形成される。したがって、上記ＣＤ３結合ドメインの上記ＶＨ鎖はかかるペプチドリンカーを介して上記ＭＳＬＮ結合ドメインの上記ＶＬに融合されてもよいのと同時に、上記ＭＳＬＮ結合ドメインの上記ＶＨ鎖はかかるペプチドリンカーを介して上記ＣＤ３結合ドメインの上記ＶＬに融合される。

単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインとは無関係に、特異的抗原に選択的に結合することができる、１つの（単量体）抗体可変ドメインのみを含む。最初の単一ドメイン抗体はラクダ科動物において見出された重鎖抗体から操作され、これらはＶ_ＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）であって、そこからＶ_ＮＡＲフラグメンと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる上記重鎖抗体を有する。これらに代わる手法としては、一般的な免疫グロブリン由来の、例えばヒトまたはげっ歯動物由来の二量体可変ドメインを単量体へと分割し、その結果として単一ドメインＡｂとしてＶＨまたはＶＬを得ることがある。単一ドメイン抗体に関する殆どの研究は現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが明らかになっている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディまたは単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。

したがって、（単一ドメインｍＡｂ）_２は、（少なくとも）２種の単一ドメインモノクローナル抗体からなるモノクローナル抗体構築物であり、上記単一ドメインモノクローナル抗体は、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ_ＨＨ及びＶ_ＮＡＲからなる群より個々に選択される。上記リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ」は、上述の少なくとも１種の単一ドメイン抗体及び上述の１種のｓｃＦｖ分子からなるモノクローナル抗体構築物である。この場合もまた、上記リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。

更に、本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインが配列番号２４５（クラスター２＋３）に示される領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する二重特異性抗体構築物を提供することが想定される。

したがって、本発明の更なる態様において、上記二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、
ａ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｂ）配列番号１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｃ）配列番号１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｄ）配列番号１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
ｅ）配列番号２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む。

一実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、及び配列番号２０７に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、及び配列番号２０８に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、及び配列番号２０７＋２０８に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域とＶＬ領域とを含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、及び配列番号２０９に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む。

本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、第１結合ドメインが、配列番号２４４（クラスター１＋２）に示される領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する二重特異性抗体構築物を提供することも想定される。

したがって、本発明の更なる態様において、本二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、以下、すなわち、
（ａ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３、または
（ｂ）配列番号２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３
のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む。

一実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７または配列番号２２７に示されるＶＨ領域を含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５８、及び配列番号２２８に示されるＶＬ領域を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７＋１５８、及び配列番号２２７＋２２８に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域とＶＬ領域とを含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５９、及び配列番号２２９に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む。

本発明はまた、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、第１の結合ドメインが、配列番号２４１（クラスター４）に示される領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する二重特異性抗体構築物を提供することも想定される。

したがって、本発明の更なる態様において、本二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ配列番号２１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＨ領域を含む。

一実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号２１７に示されるＶＨ領域を含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号２１８に示されるＶＬ領域を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号２１７＋２１８に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

更なる実施形態において、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号２１９に示されるポリペプチドを含む。

本発明に係る別の好ましい抗体構築物はまた、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の（好ましくはヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含み、第１の結合ドメインが、ＭＳ−３、ＭＳ−４及びＭＳ−５からなる群より選択される抗体、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域であって、上述のものからなる群より選択される上記ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む抗体と結合に関して競合する、二重特異性抗体構築物として定義することもできる。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１種（それ自体が白血球の１種）である。それぞれ別個の機能を有する、いくつかのサブセットのＴ細胞がある。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することを担い、２種の異なるタンパク質鎖から構成される。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲはアルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原性ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と係合すると、Ｔリンパ球は、関連する酵素、共受容体、特殊化されたアダプター分子、及び活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象によって活性化される。

上記ＣＤ３受容体複合体はタンパク質複合体であり、４つの連鎖から構成される。哺乳動物においては、該複合体はＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの連鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを発生する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内テールには免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）、すなわち略してＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフが含まれており、これはＴＣＲのシグナル伝達能力にとって不可欠である。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトにおいては染色体１１上に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。

多重特異性、少なくとも二重特異性の抗体構築物によるＴ細胞の動員による標的細胞の再指向された溶解は、細胞溶解性シナプス形成ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。関与するＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示、またはクローン性Ｔ細胞分化を妨害する免疫逃避機構によって影響されない。例えば、ＷＯ ２００７／０４２２６１を参照されたい。

ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害性は様々な方法で測定することができる。実施例５を参照されたい。エフェクター細胞は、例えば、刺激され富化された（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または刺激されていない（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってよい。標的細胞がマカク起源の細胞であるかまたはマカクＭＳＬＮを発現しているかもしくはマカクＭＳＬＮでトランスフェクトされている場合、当該エフェクター細胞もまた、マカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源の細胞である必要がある。上記標的細胞は、ＭＳＬＮ（少なくともその細胞外ドメイン）、例えばヒトまたはマカクＭＳＬＮを発現する必要がある。標的細胞は、ＭＳＬＮ、例えばヒトもしくはマカクＭＳＬＮで安定にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株（ＣＨＯなど）であってよい。あるいは、上記標的細胞は、ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８などのＭＳＬＮ陽性天然発現細胞株であってよい。通常ＥＣ５０値は、細胞表面上でより高レベルのＭＳＬＮを発現する標的細胞株ではより低いことが予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は通常約１０：１であるが、変化させることもできる。ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）またはＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベーション時間）で測定することができる。アッセイのインキュベーション時間の修正（細胞傷害性反応）も可能である。他の細胞傷害性の測定方法は当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン化アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含むＡＴＰに基づくアッセイが挙げられる。

本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定される。上記細胞傷害活性はまた、５１−クロム放出アッセイにおいて測定することもできる。上記細胞傷害活性はＥＣ_５０値によって表され、ＥＣ_５０値は最大半量有効濃度（ベースラインと最大値との間の中間の細胞傷害性応答を誘導する本抗体構築物の濃度）に対応する。好ましくは、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ_５０値は、≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭまたは≦２０００ｐＭ、更により好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、更により好ましくは≦４００ｐＭまたは≦３００ｐＭ、更により好ましくは≦２００ｐＭ、更により好ましくは≦１００ｐＭ、更により好ましくは≦５０ｐＭ、更により好ましくは≦２０ｐＭまたは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。

上記で与えられるＥＣ_５０値は種々のアッセイにおいて測定することができる。当業者は、エフェクター細胞として刺激され／富化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞が用いられる場合、刺激されていないＰＢＭＣと比較して、ＥＣ_５０値がより低いと予想され得ることを認識している。当該の標的細胞が低い標的発現ラットと比較して多数の標的抗原を発現する場合、ＥＣ_５０値がより低いことが更に予測され得る。例えば、エフェクター細胞として刺激され／富化されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞が用いられる（且つＣＨＯ細胞などのＭＳＬＮトランスフェクト細胞またはＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８のいずれかが標的細胞として用いられる）場合、本ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ_５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、更により好ましくは≦２５０ｐＭ、更により好ましくは≦１００ｐＭ、更により好ましくは≦５０ｐＭ、更により好ましくは≦１０ｐＭ、最も好ましくは≦５ｐＭである。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣが用いられる場合、本ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ_５０値は、好ましくは≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ（特に、標的細胞がＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８である場合）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に、標的細胞がＣＨＯ細胞などのＭＳＬＮトランスフェクト細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、更により好ましくは≦２００ｐＭ、更により好ましくは≦１５０ｐＭ、更により好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭ、またはそれ未満である。エフェクター細胞としてＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株が用いられ、且つ標的細胞株としてＣＨＯ細胞などのマカクＭＳＬＮトランスフェクト細胞株が用いられる場合、本ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ_５０値は、好ましくは≦２０００ｐＭまたは≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、更により好ましくは≦３００ｐＭまたは≦２５０ｐＭ、更により好ましくは≦１００ｐＭ、最も好ましくは≦５０ｐＭである。

本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＭＳＬＮ陰性細胞の溶解を誘導／媒介せず、または該溶解を本質的に誘導／媒介しないことが好ましい。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「溶解を本質的に媒介しない」とは、本発明の抗体構築物は、３０％を超える、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％以下のＭＳＬＮ陰性細胞の溶解を誘導または媒介せず、それによってＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８（上記参照）の溶解が１００％となることを意味する。これは通常、５００ｎＭまでの本抗体構築物の濃度に適用される。当業者であれば、更なる面倒を伴うことなく細胞溶解を測定する方法を承知している。更に、本明細書は細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。

個々のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソタイプと二量体アイソタイプとの間の細胞傷害活性の差は「効力ギャップ（ｐｏｔｅｎｃｙ ｇａｐ）」と呼ばれる。この効力ギャップは、例えば、当該の分子の単量体形態と二量体形態とのＥＣ_５０値の間の比率として計算することができる（実施例５．８を参照のこと。）。本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力ギャップは、好ましくは≦５、より好ましくは≦４、更により好ましくは≦３、更により好ましくは≦２、更に好ましくは≦１、最も好ましくは≦０．３である。

本発明の抗体構築物の第１及び／または第２の（またはそれ以上の）結合ドメインは、好ましくは、哺乳類霊長目のメンバーに対して異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ ２００８／１１９５６７に記載される。一実施形態によれば、第１及び／または第２の結合ドメインは、それぞれヒトＭＳＬＮ及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長動物（コモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルなど）、旧世界の霊長動物（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル、オランウータン、及び非ヒトｈｏｍｉｎｉｎａｅを含む（ただしこれに限定されない）霊長動物のＭＳＬＮ／ＣＤ３にも結合することとなる。標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、少なくともマカクＭＳＬＮにも結合し、及び／またはＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、少なくともマカクＣＤ３にも結合することが想定される。好ましいマカクはカニクイザルである。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（Ｒｈｅｓｕｓ））も想定される。

本発明の一態様において、第１の結合ドメインはヒトＭＳＬＮに結合し、且つカニクイザルのＭＳＬＮなどのマカクＭＳＬＮ、より好ましくは、マカク細胞の表面上で発現するマカクＭＳＬＮに結合する。好ましいカニクイザルＭＳＬＮは配列番号２３４に示される。第１の結合ドメインのマカクＭＳＬＮに対する親和性は、好ましくは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、更により好ましくは≦５ｎＭ、更により好ましくは≦１ｎＭ、更により好ましくは≦０．５ｎＭ、更により好ましくは≦０．１ｎＭ、最も好ましくは≦０．０５ｎＭであり、または≦０．０１ｎＭである場合すらある。

好ましくは、本発明に係る抗体構築物のマカクＭＳＬＮ対ヒトＭＳＬＮへの結合に関する親和性ギャップ［ｍａ ＭＳＬＮ：ｈｕ ＭＳＬＮ］（例えば、ＢｉａＣｏｒｅまたはスキャッチャード解析によって測定される）は＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、更に好ましくは＜１０、更により好ましくは＜８、より好ましくは＜６、最も好ましくは＜２である。本発明に係る抗体構築物のマカクＭＳＬＮ対ヒトＭＳＬＮへの結合に関する親和性ギャップの好ましい範囲は０．１〜２０であり、より好ましくは０．２〜１０、更により好ましくは０．３〜６、更により好ましくは０．５〜３または０．５〜２．５、最も好ましくは０．５〜２または０．６〜２である。例３を参照されたい。したがって、本発明によれば、エピトープクラスター２＋３に対するＭＳＬＮ結合剤を含む抗体構築物が好ましく、それら全てが≦１５の親和性ギャップを有することが示される。ＭＳ−３、ＭＳ−４またはＭＳ−５ベースの二重特異性抗体構築物などの≦６の親和性ギャップを有するエピトープクラスター２＋３に対するＭＳＬＮ結合剤を含む抗体構築物が更に好ましい。

本発明の抗体構築物の一実施形態において、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザルのＣＤ３イプシロンに結合する。第２の結合ドメインは、これらのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することが好ましい。第２の結合ドメインは、ヒト及びＭａｃａｃａ ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することも想定される。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。更により詳細には、上記エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む。コモンマーモセット及びワタボウシタマリンはマーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）に属する新世界霊長動物である一方、コモンリスザルはオマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）に属する新世界霊長動物である。

本発明の抗体構築物に関しては、Ｔ細胞表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、
（ａ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３、
（ｂ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３、及び
（ｃ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい。

上記に代わるものとして好ましい本発明の抗体構築物の実施形態において、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインは、
（ａ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｂ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｃ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３ＷＯ ２００８／１１９５６７、
（ｄ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｅ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｆ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｇ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｈ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３、
（ｉ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３、ならびに
ｊ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。

本発明の抗体構築物に関して、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２（ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１または１６５も参照のこと。）に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含むことが更に好ましい。

あるいは、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１（ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７または１８１も参照のこと。）に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。

本発明の抗体構築物は、
（ａ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域、
（ｂ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域、
（ｃ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域、
（ｄ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域、
（ｅ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域、
（ｆ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域、
（ｇ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域、
（ｈ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域、
（ｉ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域、ならびに
（ｊ）ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域及びＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域
からなる群より選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２結合ドメインを特徴とすることがより好ましい。

本発明の抗体構築物に関連して、配列番号１０２に示されるＶＬ領域及び配列番号１０１に示されるＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインもまた好ましい。

本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、結合ドメイン及び特に（Ｔ細胞表面上のヒトＣＤ３に結合する）第２の結合ドメインは以下のフォーマットを有する。すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域の対が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットである。上記ＶＨ及びＶＬ領域がＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順に配置される。上記ＶＨ領域がリンカー配列のＮ末端に位置し、上記ＶＬ領域が上記リンカー配列のＣ末端に位置することが好ましい。

上述の本発明の抗体構築物の好ましい実施形態は、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３（ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７も参照のこと。）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを特徴とする。

本発明の抗体構築物は、標的分子ＭＳＬＮ及びＣＤ３に結合するその機能に加えて、更なる機能を有することも想定される。このフォーマットにおいては、本抗体構築物は、ＭＳＬＮに結合することを通じて標的細胞を標的化し、ＣＤ３結合を通じて細胞傷害性Ｔ細胞活性を媒介し、且つ、ＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の動員、標識（蛍光など）、毒素または放射性核種などの治療薬、及び／または血清半減期を高める手段などを通じて、完全機能性Ｆｃ定常ドメイン媒介性の抗体依存性細胞傷害性などの更なる機能を提供することによる、三官能性または多官能性抗体構築物である。

本発明の抗体構築物の血清半減期を延長する手段の例としては、当該の抗体構築物に融合されたまたは他の方法で結合されたペプチド、タンパク質またはタンパク質のドメインが挙げられる。上記ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインの群は、血清アルブミンなどの人体における好ましい薬物動態プロファイルを有する他のタンパク質に結合するペプチドを含む（ＷＯ ２００９／１２７６９１を参照のこと。）。かかる半減期を延長するペプチドの別の概念としては、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ ２００７／０９８４２０を参照のこと。）に結合するペプチドが挙げられ、これも本発明の構築物に用いることができる。より大きなタンパク質のドメインまたは完全なタンパク質を結合させる概念としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの変異体もしくは突然変異体の融合物（ＷＯ ２０１１／０５１４８９、ＷＯ ２０１２／０５９４８６、ＷＯ ２０１２／１５０３１９、ＷＯ ２０１３／１３５８９６、ＷＯ ２０１４／０７２４８１、ＷＯ ２０１３／０７５０６６を参照のこと。）またはそれらのドメインならびに免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメイン）及びその変異体の融合が挙げられる。かかるＦｃドメインの変異体を、二量体または多量体の所望の対合を可能にするために、Ｆｃ受容体結合（例えばＦｃγ受容体）を破壊するために、または他の理由で最適化／修飾してもよい。人体における小さいタンパク質化合物の半減期を延長するための本技術分野で公知の更なる概念としては、本発明の抗体構築物などの化合物のペグ化がある。

好ましい実施形態において、本発明の抗体構築物は以下のように、すなわち、
（ａ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド、
（ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１０４〜１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド、
（ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・アミノ酸配列

（配列中、Ｘ_１はＹまたはＨである）
を有するポリペプチドと、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・アミノ酸配列

を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド、
（ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、
（ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、
（ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、ならびに
・配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、
（ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド、または
（ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド
と記述される。

上述のように、本発明のいくつかの好ましい抗体構築物は、アルブミンまたはアルブミン変異体などの別の部分との融合によって修飾される。これらの融合構築物が該構築物の特性、特に標的に対する親和性または細胞傷害活性に関してキャラクタライズされれば、当業者は、類似の融合構築物または未修飾二重特異性抗体構築物が類似の（またはより良好である場合すらある）特性を有することを予想することができることを認識することとなろう。例えば、アルブミンと融合した二重特異性抗体構築物が明らかなまたは所望の細胞傷害活性／標的に対する親和性を有するならば、アルブミンを伴わない上記構築物に関して、同様の／類似のまたはより高い場合すらある細胞傷害活性／標的に対する親和性が認められることとなることが予想される。

別の好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体構築物は（上記２種の結合ドメインに加えて）、それぞれがヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインであって、上記２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）がペプチドリンカーを介して互いに融合している上記第３のドメインを含む。上記第３のドメインは、Ｎ末端からＣ末端への順で、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むことが好ましい。上記第３のドメインに関する好ましいアミノ酸配列は配列番号２６０〜２６７に示される。上記２つのポリペプチド単量体のそれぞれは、好ましくは、配列番号２５２〜２５９からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらの配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列有する。別の好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体構築物の第１及び第２の結合ドメインは、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９からなる群より選択されるペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合している。

本発明によれば、「ヒンジ」とはＩｇＧヒンジ領域である。この領域はＫａｂａｔの番号付けを用いた類推によって識別することができ、Ｋａｂａｔの位置２２３〜２４３を参照されたい。上記によれば、「ヒンジ」に関する最小要件は、Ｋａｂａｔの番号付けによるＤ２３１〜Ｐ２４３のＩｇＧ_１配列区間に相当するアミノ酸残基である。用語ＣＨ２及びＣＨ３とは、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３をいう。これらの領域も同様に、Ｋａｂａｔの番号付けを用いた類推によって識別することができ、ＣＨ２に関してはＫａｂａｔの位置２４４〜３６０を、ＣＨ３に関してはＫａｂａｔの位置３６１〜４７８を参照されたい。免疫グロブリンの間には、それらのＩｇＧ_１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ_２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ_３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ_４ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域及びＩｇＥ Ｆｃ領域に関していくつかの変異体が存在する（例えば、Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３１（３）， １６９−２１７ （１９９３）を参照のこと。）ことを理解されたい。用語Ｆｃ単量体とは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域をいう。上記Ｆｃ単量体はまた、Ｎ末端からこれらのドメインまでの柔軟なヒンジも含むことができる。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、上記Ｆｃ単量体はＪ鎖を含んでいてもよい。ＩｇＧについては、上記Ｆｃ部分は免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３ならびに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。免疫グロブリンの上記Ｆｃ部分の境界は変化し得るが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、ＩｇＧ_４に関しては、それぞれ（上記ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１〜（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６、またはＤ２３１〜Ｌ４７６（但し、番号付けはＫａｂａｔによる。）を含むと定義することができる。

したがって、本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端への順で、
（ａ）第１の結合ドメインと、
（ｂ）配列番号２、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｃ）第２の結合ドメインと、
（ｄ）配列番号１、２、４、５、６、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）と、
（ｆ）配列番号３０１、３０２、３０３及び３０４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）と
を含んでいてもよい。

本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端への順で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合ドメインと、
・配列番号２、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３（ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７も参照のこと）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合ドメインと、
・配列番号１、２、４、５、６、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号２６０〜２６７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメインと
を含むことも好ましい。

したがって、好ましい実施形態において、本発明の抗体構築物は、配列番号２６８〜２９９に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含むまたは該ポリペプチドからなる。

本発明の一実施形態において、本発明の抗体構築物は、配列番号２７６〜２８７に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含むまたは該ポリペプチドからなることも好ましい。

また、本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体構築物は、配列番号２７６、２８０及び２８４に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含むまたは該ポリペプチドからなり、より好ましくは、配列番号２８０に示されるポリペプチドを含むまたは該ポリペプチドからなる。

本抗体構築物の共有結合による修飾も本発明の範囲内に包含され、一般的に、但し常にではないが、翻訳後に行われる。例えば、いくつかのタイプの本抗体構築物の共有結合による修飾が、当該抗体構築物の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することが可能な誘導体形成剤と反応させることによって、当該分子中に導入される。

システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセタート（及び相当するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第２水銀安息香酸塩、２−クロロ第２水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体形成される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体形成されるが、これは該反応剤が比較的にヒスチジル側鎖に対して特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、その反応は好ましくは０．１Ｍのカルコジ酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行われる。リシニル残基及びアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応させる。これらの反応剤による誘導体形成はリシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。α−アミノ含有残基の誘導体形成に好適な他の反応剤としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシル酸との反応が挙げられる。

アルギニル残基は、１種またはいくつかの従来からの反応剤、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオール、１，２−シクロヘキサンジオール、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニ残基の誘導体形成は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、当該の反応をアルカリ性条件で行うことを必要とする。更に、これらの反応剤はリシンの基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応し得る。

チロシル残基の特定の修飾が、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基中へのスペクトル上の標識の導入において、特に関心をもって行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を生成させる。チロシル残基を^１２５Ｉまたは^１３１Ｉを用いてヨウ素化して、放射免疫アッセイに用いるための標識タンパク質を調製し、上述のクロラミンＴ法が好適である。

カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）、但しＲ及びＲ’は任意選択で異なるアルキル基である、との反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニルに転換される。

二官能性反応剤による誘導体形成が、本発明の抗体構築物を、多様な方法に用いるための水に不溶な担体マトリクスまたは表面に架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸によるエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）などのジスクシンイミジルエステルを始めとするホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体形成剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、ブロモシアンによって活性化された炭水化物などの反応性の水に不溶なマトリクス及び米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号、及び第４，３３０，４４０号に記載される反応性基材がタンパク質固定化に用いられる。

グルタミニル及びアパラギニル残基はよく、それぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基へと脱アミド化される。あるいは、これらの残基は温和な酸性条件下で脱アミド化される。何れの形態のこれらの残基も本発明の範囲内に入る。

その他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，サンフランシスコ， １９８３， ｐｐ． ７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及びいずれかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

本発明の範囲内に含まれる、本抗体構築物の別のタイプの共有結合による修飾は、当該タンパク質のグリコシル化パターンの改変を含む。本技術分野において公知のように、グリコシル化パターンは当該タンパク質の配列（例えば、以下に議論する、特定のアミノ酸残基のグリコシル化の有無）または当該タンパク質が産生される宿主細胞もしくは宿主生物の両方に依存する可能性がある。特定の発現系が以下に議論される。

ポリペプチドのグリコシル化は一般的にＮへの連結またはＯへの連結のいずれかである。Ｎへの連結とは、アスパラギン残基の側鎖への上記炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（但しＸはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、上記炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏに連結したグリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンが用いられてもよい。

本抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を、該アミノ酸配列が１または複数の上述のトリペプチド配列を含有するように改変することによって簡便に行われる（Ｎに連結したグリコシル化部位の場合）。上記改変はまた、元の配列に対する１もしくは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加あるいはセリンまたはトレオニン残基による置換によっても行うことができる（Ｏに連結したグリコシル化部位の場合）。容易に行うためには、抗体構築物のアミノ酸配列が、好ましくはＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸へと翻訳することとなるコドンが生成されるように予め選択された塩基で当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって改変される。

本抗体構築物上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、当該タンパク質に対するグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。これらの操作は、Ｎ及びＯに連結したグリコシル化に対するグリコシル化能を有する宿主細胞中で当該タンパク質を産生させる必要がないとの点で有利である。用いるカップリング様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基などの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離水酸基などの遊離水酸基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法はＷＯ ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ， １９８１， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６に記載される。

元の抗体構築物上に存在する炭水化物の除去は、化学的にまたは酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化には当該タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価の化合物に接触させることが必要である。この処理によって、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どのまたは全ての糖が切断される一方、ポリペプチドは無傷のまま残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２５９：５２によって及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８：１３１によって報告されている。Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ １３８：３５０によって報告されているように、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることによって行うことができる。Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：３１０５によって報告されているように、潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、化合物ツニカマイシンを用いることによって防ぐことができる。ツニカマイシンはタンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。

本明細書においては、本抗体構築物の他の修飾も企図される。例えば、本抗体構築物の別のタイプの共有結合による修飾は、該抗体構築物を、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７に示される様式でポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体などの種々のポリオールを含む、但しこれらに限定されない種々の非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。加えて、本技術分野において公知のように、本抗体構築物中の種々の位置において、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために、アミノ酸の置換を行ってもよい。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体構築物の上記共有結合による修飾は、１種または複数種の標識の付加を含む。標識基は、生じる可能性のある立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーアームを介して当該抗体構築物に結合してもよい。タンパク質を標識するための種々の方法が本技術分野において公知であり、これらの方法を本発明の実施において用いることができる。用語「標識」または「標識基」とは任意の検出可能な標識をいう。一般に、標識は、該標識が検出されるアッセイに応じて種々のクラスに分類され、以下の例は、限定はされないが、
ａ）放射性同位元素すなわち放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）などの放射性同位元素または重同位元素であってよい同位元素標識
ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光性基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドりん光体）、化学発光性基、及び「低分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれであってもよい蛍光体などの、（限定はされないが、発色団、りん光体及び蛍光体を含む）光学的色素
ｅ）酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）２次受容体によって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）
を含む。

蛍光標識とは、その固有の蛍光特性によって検出することができる任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）が挙げられるが、これらに限定はされない。蛍光体を始めとする好適な光学的色素はＲｉｃｈａｒｄ Ｐ． ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。

好適なタンパク質性蛍光標識としてはまた、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＧＦＰのＡｅｑｕｏｒｅａ種を含む緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ， Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． カナダ国Ｈ３Ｈ １Ｊ９ ケベック州モントリオール市 ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ． Ｗｅｓｔ １８０１、８階；Ｓｔａｕｂｅｒ， １９９８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２−４７１； Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：１７８−１８２）、強化された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号、第５，４１８，１５５号、第５，６８３，８８８号、第５，７４１，６６８号、第５，７７７，０７９号、第５，８０４，３８７号、第５，８７４，３０４号、第５，８７６，９９５号、第５，９２５，５５８号）も挙げられるが、これらに限定はされない。

ロイシンジッパードメインは、該ドメインが存在するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは当初いくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、それ以来多様な異なるタンパク質中に見出されている。既知のロイシンジッパーの中には、二量化または三量化する天然起源のペプチド及びそれらの誘導体がある。可溶性のオリゴマータンパク質の産生に適したロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーがＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載される。修飾ロイシンジッパーであって、該ロイシンジッパーに融合した異種性タンパク質の安定した三量化を可能にする上記ロイシンジッパーの使用がＦａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７−７８に記載されている。1つの手法において、ＭＳＬＮ抗体フラグメントまたは誘導体を含む、ロイシンジッパーペプチドに融合した組換え融合タンパク質が適宜の宿主細胞中で発現され、生成する可溶なオリゴマーＭＳＬＮ抗体フラグメントまたは誘導体が培養物の上清から回収される。

本発明の抗体構築物は更なるドメインも含み、該ドメインは、例えば、当該分子の単離に役立ち、または当該分子の薬物動態プロファイルの適応化と関係する。抗体構築物の単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離カラムにおいて捕捉することができるペプチドモチーフまたは２次的に導入される部分から選択することができる。かかる更なるドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びそれらの変異体（例えばＳｔｒｅｐＩＩタグ）ならびにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。上記特定されたＣＤＲを特徴とする、本明細書に開示される全ての抗体構築物はＨｉｓタグドメインを含むことが好ましく、Ｈｉｓタグドメインは一般に、分子のアミノ酸配列中の、好ましくは５の、より好ましくは６のＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン）の連続したＨｉｓ残基のリピートとして知られる。上記Ｈｉｓタグは、例えば、本抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に位置していてもよく、好ましくはＣ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１０）が本発明に係る抗体構築物のＣ末端にペプチド結合を介して連結する。

本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する。好ましいヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列は番号２３１、２３２、及び２３３によって表される。したがって、本発明に係る第１の結合ドメインは、好ましくは、ＭＳＬＮが、自然に発現する細胞もしくは細胞株によって、及び／またはＭＳＬＮで形質転換されたまたは（安定的に／一過性で）トランスフェクトされた細胞もしくは細胞株によって発現される場合に、ＭＳＬＮに結合する。好ましい実施形態において、第１の結合ドメインはまた、ＭＳＬＮがＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャードなどのイン・ビトロ結合アッセイにおいて「標的」または「リガンド」として用いられる場合にも、ＭＳＬＮに結合する。上記「標的細胞」は、いずれかの原核細胞または真核細胞であって、その表面上にＭＳＬＮを発現する上記細胞であってよく、該標的細胞は、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、中皮腫細胞、肺がん細胞、胃がん細胞及びトリプルネガティブ乳がん細胞などの、ヒトまたは動物の体の一部である細胞であることが好ましい。

第１の結合ドメインのヒトＭＳＬＮに対する親和性は、好ましくは≦２０ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、更により好ましくは≦５ｎＭ、更により好ましくは≦２ｎＭ、更により好ましくは≦１ｎＭ、更により好ましくは≦０．６ｎＭ、更により好ましくは≦０．５ｎＭ、最も好ましくは≦０．４ｎＭである。上記親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいてまたはスキャッチャードアッセイにおいて、例えば、実施例に記載されるようにして測定することができる。上記親和性の他の測定方法も当業者に周知であり、例えば、添付の実施例３を参照されたい。

本明細書に記載の抗体構築物のアミノ酸配列の修飾もまた企図される。例えば、本抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。本抗体構築物のアミノ酸配列の変異体は、本抗体構築物の核酸中に適宜のヌクレオチドの変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。以下に記載のアミノ酸配列の修飾の全てによって、未修飾の親分子の所望の生物学的活性（ＭＳＬＮ及びＣＤ３への結合）を依然として保持している抗体構築物を生じることが必要である。

用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」とは、一般的に、アミノ酸であって、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ｔｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群より選択されるアミノ酸などの、その本技術分野で認識される定義を有する上記アミノ酸をいう。但し、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または希アミノ酸を所望のとおりに用いてもよい。一般的に、アミノ酸は、非極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負に荷電した側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正に荷電した側鎖を有するもの（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）として群に分けることができる。

アミノ酸修飾としては、例えば、本抗体構築物のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／または上記アミノ酸配列への残基の挿入、及び／または上記アミノ酸配列における残基の置換が挙げられる。最終的な構築物が所望の特性を有するとの前提で、該最終的な構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われる。上記アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変えるなど、本抗体構築物の翻訳後プロセスを改変してもよい。

例えば、１、２、３、４、５、または６のアミノ酸を上記ＣＤＲのそれぞれに挿入してもよく、または該アミノ酸が上記ＣＤＲのそれぞれから欠失してもよい（当然に、それらの長さに応じて）一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５のアミノ酸をＦＲのそれぞれに挿入してもよく、または該アミノ酸が上記ＦＲのそれぞれから欠失してもよい。アミノ酸配列の挿入は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲での、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内部への挿入を包含することが好ましい。本発明の抗体構築物の挿入変異体は、酵素の本抗体構築物のＮ末端もしくはＣ末端への融合物、または本抗体構築物の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合物を包含する。

置換による突然変異誘発に対して最も着目される部位としては、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。上記置換は、本明細書に記載のように、好ましくは保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、ＣＤＲにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸を置換してもよい一方、フレームワーク領域（ＦＲ）において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５のアミノ酸を置換してもよい。例えば、ＣＤＲ配列が６のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２または３が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５または６が置換されることが想定される。

突然変異誘発に対して好ましい位置である本抗体構築物の特定の残基または領域を識別するために有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）によって報告されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。上記方法では、本抗体構築物中の残基または標的残基の群が識別され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基）、且つ中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置換され、当該アミノ酸の当該エピトープとの相互作用に影響を与える。

次いで、上記置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、更なるもしくは他の変異体を上記置換部位に導入するまたは該部位のための上記変異体を導入することによって精密化される。したがって、アミノ酸配列の変異を導入するための部位または領域は予め決定されるが、当該突然変異の性質それ自体は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析または最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発異が標的コドンまたは領域において実施されてもよく、発現された抗体構築物の変異体は所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡにおいて予め決定された部位での置換による突然変異を行うための技法は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発である。上記突然変異体のスクリーニングは、ＭＳＬＮまたはＣＤ３結合などの抗原結合のアッセイを用いて行われる。

一般的に、重鎖及び／または軽鎖の１または複数または全てのＣＤＲにおいてアミノ酸が置換される場合、その結果得られる「置換された」配列は、「元の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、更により好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一であることが好ましい。このことは、それが、当該ＣＤＲの長さであって、元のＣＤＲ配列が「置換された」配列に対して同一である程度の上記長さに依存することを意味する。例えば、５のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１のアミノ酸が置換されるためには、その置換された配列に対して好ましくは８０％同一である。したがって、本抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換された配列に対して異なる同一性、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％の同一性を有する一方、ＣＤＲＬ３は９０％の同一性を有する場合がある。

好ましい置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））は保存的置換である。但し、当該抗体構築物が、第１の結合ドメインを介してＭＳＬＮに、且つ第２の結合ドメインを介してＣＤ３またはＣＤ３イプシロンに結合するその能力を保持し、且つ／またはそのＣＤＲが、結果として得られる置換された配列に対する同一性（「元の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、更により好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一である）を有する限りにおいて、（非保存的置換または１もしくは複数の、下記の表１に掲載した「例示的な置換」を含む）任意の置換が想定される。

保存的置換を表１の「好ましい置換」との見出しの下に示す。かかる置換によって生物学的活性が変化する場合は、表１において「例示的な置換」と名付けた、またはアミノ酸クラスに関連して更に下記する、より実質的な変化が導入される場合があり、生成物が所望の特性に関してスクリーニングされる。

（表１）アミノ酸置換

本発明の抗体構築物の生物学的特性における実質的な修飾は、置換であって、（ａ）当該置換の領域における当該ポリペプチド骨格の、例えば、シート構造またはヘリカル構造としての構造、（ｂ）標的部位における当該分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）当該側鎖の嵩高さの維持に対する該置換の効果が有意に異なる、上記置換を選択することによって実現される。天然起源の残基は共通の側鎖の特性に基づいて群、すなわち、（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性で親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅに分けられる。

非保存的置換は、これらのクラスの１種のメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。本抗体構築物の適当な立体構造の維持に関与しないいずれかのシステイン残基を、当該分子の酸化安定性を向上させ、且つ異常な架橋を防止するために、一般的にはセリンで置換してもよい。これとは逆に、本抗体構築物に、その安定性を向上させるために（特に該抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合に）、システイン結合（複数可）を付加してもよい。

アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／または類似性は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４の類似性法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータを用いた実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ ５７５）、好ましくはデフォルト設定を用いて、または検定による、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５によって報告されているＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを含む、但しこれらに限定されない、本技術分野において公知の標準的な技法を用いることによって判定される。％表記の同一性は、以下のパラメータ、すなわち、１のミスマッチペナルティー、１のギャップペナルティー、０．３３のギャップサイズペナルティー、及び３０の結合ペナルティー（ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）、‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，’’ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ １２７−１４９ （１９８８）， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ.に基づくＦａｓｔＤＢによって算出されることが好ましい。

有用なアルゴリズムの例としてはＰＩＬＥＵＰがある。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブアラインメント、ペアワイズアラインメントを用いて、関連する配列の群から多重配列アラインメントを創出する。ＰＩＬＥＵＰはまた、上記アラインメントを創出するのに用いられるクラスタリングの関係を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易形を用い、上記プログレッシブアラインメント法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， １９８９， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３によって報告された同法と類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、デフォルトの３．００のギャップ重量、デフォルトの０．１０のギャップ長さ、及び重み付けされたエンドギャップが挙げられる。

有用なアルゴリズムの別の例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：５８７３−５７８７に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを用いており、それらの殆どはデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは以下の値、すなわち、オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝ＩＩに設定する。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の構成及び対象とする配列を検索している特定のデータベースの構成に応じて当該プログラム自体によって確定される。但し、当該の値を感度を高めるように調整してもよい。

更なる有用なアルゴリズムとしては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２によって報告されたｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴがある。ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定される閾値Ｔパラメータ；ｕｎｇａｐｐｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎをトリガーし、ｋのギャップ長さに対して１０＋ｋのコストを負わせるツーヒット法、１６に設定されるＸｕ、及び当該アルゴリズムの検索段階については４０に設定され、出力段階については６７に設定されるＸｇを用いる。ギャップ付アラインメント（Ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、約２２ビットに相当するスコアによってトリガーされる。

一般的に、個々の変異ＣＤＲ間のアミノ酸の相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より一般的には、相同性または同一性は少なくとも６５％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び殆ど１００％に好ましく増加する。同様の形態で、本明細書において特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）表記の核酸配列同一性」は、本抗体構築物のコード配列中の核酸残基と同一の候補配列中の核酸残基のパーセンテージとして定義される。特定の方法は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定された、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＮモジュールのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を利用する。

一般的に、個々の変異ＣＤＲをコードする核酸配列と本明細書に示される配列との間の核酸配列の相同性、類似性、または同一性は少なくとも６０％であり、より一般的には、相同性または同一性は、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及び殆ど１００％に増加する。したがって、「変異ＣＤＲ」とは、本発明の親ＣＤＲに対する特定された相同性、類似性、または同一性を有する変異ＣＤＲであり、上記親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、但しこれらに限定されない、生物学的機能を共有する。

一実施形態において、本発明に係る抗体構築物のヒト生殖系列に対する同一性のパーセンテージは、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、更により好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％であり、または≧９６％である場合すらある。ヒト抗体生殖系列遺伝子産物の同一性は、治療の際に患者において当該薬物に対する免疫応答を誘発する、治療タンパク質の危険性を低減する重要な特徴と考えられる。Ｈｗａｎｇ ＆ Ｆｏｏｔｅ （“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”； Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６ （２００５） ３−１０）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分を低減することが、治療の際に患者において抗薬物抗体を誘発する危険性の減少に繋がることを実証している。網羅的な数の臨床的に評価された抗体薬物及びそれぞれの免疫原性データを比較することによって、抗体のＶ領域のヒト化によって、未改変の非ヒトＶ領域を有する抗体（平均で患者の２３．５９％）よりも当該タンパク質の免疫原性がより低くなる（平均で患者の５．１％）という傾向が明らかになっている。したがって、抗体構築物の形態のＶ領域に基づくタンパク質治療薬にとっては、ヒト配列に対するより高い程度の同一性が望ましい。上記生殖系列の同一性を測定することのこの目的のために、ＶＬのＶ領域を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア及びパーセントで表記した、同一のアミノ酸残基を当該のＶＬのアミノ酸残基の全数で除すことによって算出したアミノ酸配列を用いて、ヒト生殖系列Ｖセグメント及びＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインすることができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても、ＶＨ ＣＤＲ３が、その高い多様性及びヒト生殖系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントの相手が存在しないことに起因して除外される場合があること以外は、同様とすることができる。次いで、組換え技法を用いて、ヒト抗体生殖系列に対する配列同一性を高めることができる。

更なる実施形態において、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究スケールの条件下で、例えば、標準的な２段階精製過程において、高い単量体収量を示す。本発明に係る抗体構築物の単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ−上清であることが好ましく、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、更により好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ−上清である。

同様にして、二量体抗体構築物アイソタイプの収量、及びそれ故に、本抗体構築物の単量体のパーセンテージ（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を測定することができる。単量体及び二量体の抗体構築物の生産性及び算出される単量体のパーセンテージは、例えば、ローラーボトル中での標準的な研究スケールの産生由来の培養上清のＳＥＣ精製ステップにおいて得ることができる。一実施形態において、本抗体構築物の上記単量体のパーセンテージは、≧８０％、より好ましくは≧８５％、更により好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。

一実施形態において、本抗体構築物は、≦５または≦４の好ましい血漿安定性（血漿なしでのＥＣ５０に対する血漿ありでのＥＣ５０の比率）、より好ましくは≦３．５または≦３、更により好ましくは≦２．５または≦２、最も好ましくは≦１．５または≦１の血漿安定性を有する。抗体構築物の上記血漿安定性は、当該構築物を３７℃で２４時間、ヒト血漿中でインキュベーションし、その後５１−クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を測定することによって試験することができる。上記細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激され富化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞であってよい。標的細胞は、例えば、ヒトＭＳＬＮでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であってよい。標的細胞に対するエフェクター細胞の（Ｅ：Ｔ）比は１０：１を選択してもよい。この目的のために用いられるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡ被覆したシリンジによって採取した健常なドナーの血液に由来する。遠心分離によって細胞成分を除去し、血漿の上相を採取し、続いてプールする。対照として、上記細胞傷害性アッセイの直前に抗体構築物をＲＰＭＩ−１６４０培地中で希釈する。上記血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿中でのインキュベーション後）の比率として算出される。実施例６を参照されたい。

本発明の抗体構築物の単量体から二量体への変換率は低いことが更に好ましい。上記変換率は種々の条件下で測定することができ、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。実施例９を参照されたい。例えば、本抗体構築物の単量体アイソタイプのインキュベーションは、インキュベーター中、３７℃で７日間、例えば１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度で行うことができる。これらの条件下では、本発明の抗体構築物が≦５％である二量体のパーセンテージを示すことが好ましく、より好ましくは≦４％であり、更により好ましくは≦３％であり、更により好ましくは≦２．５％であり、更により好ましくは≦２％であり、更により好ましくは≦１．５％であり、最も更に好ましくは≦１％もしくは≦０．５％であり、または０％の場合すらある。

本発明の二重特異性抗体構築物は、多数の凍結／融解サイクル後に非常に低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、本抗体構築物の単量体は、例えば一般的な製剤緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整され、３回の凍結／融解サイクル（−８０℃で３０分間凍結の後室温で３０分間融解）、続いて高速ＳＥＣに供されて、二量体の抗体構築物へと変換した当初単量体であった抗体構築物のパーセンテージを測定する。本二重特異性抗体構築物の上記二量体のパーセンテージは、例えば３回の凍結／融解サイクル後で、≦５％であることが好ましく、より好ましくは≦４％、更により好ましくは≦３％、更により好ましくは≦２．５％、更により好ましくは≦２％、更により好ましくは≦１．５％、最も好ましくは≦１％であり、または≦０．５％の場合すらある。

本発明の二重特異性抗体構築物は、好ましくは、≧４５℃または≧５０℃、より好ましくは≧５１℃、≧５２℃、≧５３℃または≧５４℃、更により好ましくは≧５６℃または≧５７℃、最も好ましくは≧５８℃または≧５９℃の凝集温度の好適な熱安定性を示す。上記熱安定性パラメータは、抗体の凝集温度の観点から以下のようにして測定される。すなわち、２５０μｇ／ｍｌの濃度の抗体溶液を使い捨てキュベット中に移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に載置する。この試料を、定常的に径の測定値を取得しながら、４０℃から７０℃まで０．５℃／分の昇温速度で加熱する。当該タンパク質の融解及び凝集を示す径の増加を用いて該抗体の凝集温度を算出する。実施例１０を参照されたい。

あるいは、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって熱−融解曲線を測定して、当該抗体構築物の固有の生物物理学的なタンパク質安定性を判定することができる。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ(米国マサチューセッツ州ノーサンプトン)のＶＰ−ＤＳＣ装置を用いて実施される。抗体構築物を含有する試料のエネルギー取込みを２０℃から９０℃まで記録し、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較する。本抗体構築物を、例えばＳＥＣ運転緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整する。それぞれの融解曲線を記録するために、全体の試料温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔにおいて試料及び製剤緩衝液対照のエネルギー取込みを記録する。試料から対照を差し引いたエネルギー取込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差分をそれぞれの温度に対してプロットする。融解温度はエネルギー取込みの最初の最大点における温度として定義される。

本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、≦０．２の、好ましくは≦０．１５の、より好ましくは≦０．１２の、更により好ましくは≦０．１のまたは≧０．０９の場合すらある、及び最も好ましくは≦０．０８のまたは≧０．０７である濁度（精製した単量体の抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、終夜インキュベーションを行った後にＯＤ３４０により測定）を有することも想定される。実施例１１を参照されたい。

更なる実施形態において、本発明に係る抗体構築物は酸性のｐＨにおいて安定である。本抗体構築物が、ｐＨ５．５といった非生理学的ｐＨ（例えばカチオン交換クロマトグラフィーを行うのに必要なｐＨ）においてより耐性であるほど、ロードしたタンパク質の全量に対するイオン交換カラムから溶離する抗体構築物の回収率がより高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの本抗体構築物の回収率は、好ましくは≧３０％、より好ましくは≧４０％、更により好ましくは≧５０％、更により好ましくは≧６０％、更により好ましくは≧７０％、更により好ましくは≧８０％、更により好ましくは≧９０％、更により好ましくは≧９５％、最も好ましくは≧９９％である。実施例７を参照されたい。

本発明の二重特異性抗体構築物は治療上の有効性または抗腫瘍活性を示すことが更に想定される。このことは、例えば、以下の進行期ヒト腫瘍異種移植片モデルの例に開示される検討において評価することができる。

検討の１日目に、５×１０^６個のヒトＭＳＬＮ陽性がん細胞株（例えばＯＶＣＡＲ−８）を雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側背部に皮下注射する。平均腫瘍容積が約１００ｍｍ^３に達した時点で、イン・ビトロで増殖させたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、上記マウスの腹腔への約２×１０^７個の注射により該マウスに移植した。ビヒクル対照群１のマウスはエフェクター細胞の移植を受けず、ビヒクル対照群２（エフェクター細胞の移植を受ける）との比較のための移植を受けない対照として用いられ、腫瘍の増殖に対するＴ細胞単独の影響を監視する。平均腫瘍容積が約２００ｍｍ^３に達した時点で抗体治療が開始される。治療開始の日における各治療群の平均腫瘍サイズは、いずれの他の群とも統計的に異なっていない必要がある（分散分析）。マウスは、静脈内ボーラス注射により、約１５〜２０日間、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物による治療を受ける。本検討の間、腫瘍をノギスにより計測し、進行を腫瘍容積（ＴＶ）の群間比較によって評価する。Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析した群の中央値ＴＶ）／（対照群２の中央値ＴＶ）としてＴＶを算出することにより腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］を求める。

当業者であれば、依然として意味のある且つ再現性のある結果に到達しつつ、注射する腫瘍細胞、注射する部位、移植するヒトＴ細胞、投与する二重特異性抗体構築物の量、及びスケジュールなどの、本検討の特定のパラメータを修正するまたは適応させる方法を承知している。腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０もしくは≦６０、より好ましくは≦５０もしくは≦４０、更により好ましくは≦３０もしくは≦２０、最も好ましくは≦１０もしくは≦５であり、または≦２．５である場合すらある。

本発明は本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を更に提供する。

ポリヌクレオチドとは、連鎖中に共有結合で結合した１３以上のヌクレオチド単量体からなる生体高分子である。（ｃＤＮＡなどの）ＤＮＡ及び（ｍＲＮＡなどの）ＲＮＡは別個の生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドとは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとしての役割を果たす有機分子である。上記核酸分子またはポリヌクレオチドは２本鎖及び１本鎖、線状及び環状であってよい。ポリヌクレオチドは、好ましくは宿主細胞中に含まれるベクター中に含まれることが好ましい。上記宿主細胞は、例えば本発明のベクターもしくはポリヌクレオチドによる形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）またはトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後に、本抗体構築物を発現することができる。この目的のためには、上記ポリヌクレオチドまたは核酸分子は作動的に制御配列に連結されている。

遺伝暗号とは、一連の規則であって、遺伝物質（核酸）内にコードされた情報が該規則によってタンパク質へと翻訳される上記規則である。生体細胞中での生物学的復号は、ｔＲＮＡを用いてアミノ酸を搬送し且つｍＲＮＡの３つのヌクレオチドを同時に読み取って、該ｍＲＮＡによって指定される順にアミノ酸を連結させるリボソームによって実現される。上記暗号は、コドンと呼ばれるこれらのヌクレオチドトリプレットの配列が、タンパク質合成の際にどのアミノ酸が次に付加されることとなるかを指定する手順を規定する。一部例外はあるが、核酸配列中の３つのヌクレオチドコドンが単一のアミノ酸を指定する。大多数の遺伝子は厳密に同一の暗号でコードされることから、この特定の暗号は多くの場合、カノニカルまたは標準遺伝暗号と呼ばれる。上記遺伝暗号は所与のコード領域に対して当該のタンパク質配列を決定する一方、他のゲノム領域はこれらのタンパク質が産生される時期及び場所に影響を与えることができる。

更に、本発明は本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。

ベクターとは、（外来）遺伝物質を細胞内に導入するためのビヒクルとして用いられる核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに限定はされない。一般的に、操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択可能なマーカーを含む。上記ベクターそれ自体は、一般的に、インサート（導入遺伝子）及び当該ベクターの「骨格」としての役割を果たす、より大きな配列を含むヌクレオチド配列、通例ではＤＮＡ配列である。最新のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格以外の更なる特徴、すなわち、プロモーター、遺伝マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを含むことができる。特に発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞中における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般的に制御配列を有する。

用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。

核酸は、該核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、上記ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが当該配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結しており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が近接し、分泌リーダーの場合には、近接し且つ読み取り相に存在することを意味する。但し、エンハンサーは近接している必要はない。連結は都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。かかる部位が存在しない場合には、従来からの慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。

「トランスフェクション」とは、標的細胞中に意図して核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を導入する過程である。この用語は、殆どの場合、真核細胞における非ウイルス法に対して用いられる。形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）とは、多くの場合、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルスが媒介する導入を記述するために用いられる。動物細胞のトランスフェクションは一般的に、細胞膜に一過性の孔すなわち「ホール」を開けて物質の取込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、電気穿孔法によって、ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ法によって、またはカチオン性脂質を当該物質と混合し、リポソームであって、細胞膜と融合し、該リポソームのカーゴを内部に蓄積する上記リポソームを生成させることによって行うことができる。

用語「形質転換」とは、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌中への、また植物細胞を始めとする非動物真核細胞中への非ウイルスによる導入を記述するために用いられる。したがって形質転換は、細胞膜（複数可）を通したその環境からの直接的な取込み、及びその後の外因性遺伝物質（核酸分子）の組み込みによって生じる、細菌細胞または非動物真核細胞の遺伝子の改変である。形質転換は人工的手段によって実現することができる。形質転換が起こるためには、細胞または細菌が、飢餓及び細胞密度などの、環境条件に対する時期が制限された応答として生じる場合がある、形質転換受容性の状態にあることが必要である。

更に、本発明は、上記ポリヌクレオチド／核酸分子でまたは本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

本明細書では、用語「宿主細胞」または「受容細胞」とは、本発明の抗体構築物をコードするベクター、外因性核酸分子、及びポリヌクレオチドの受容体、及び／または本抗体構築物自体の受容体となり得るまたは該受容体である／あった任意の個々の細胞または細胞培養物を包含することが意図される。上記それぞれの物質の上記細胞への導入は形質転換、トランスフェクションなどの手段によって行われる。用語「宿主細胞」はまた、単一の細胞の後代または潜在的な後代を包含することも意図される。後続の世代において、天然の、偶然の、もしくは意図した突然変異のいずれかに起因してまたは環境の影響に起因して、特定の修飾が起こる場合があるため、かかる後代は、実際には親細胞と（形態学またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において）完全に同一ではない場合があるが、それでも本明細書におけるこの用語の範囲内に包含される。好適な宿主細胞としては原核細胞または真核細胞があげられ、また限定はされないが、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、マカクまたはヒトも挙げられる。

本発明の抗体構築物は細菌中で産生することができる。発現後に、本発明の抗体構築物を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞ペーストから可溶画分中に単離し、例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び／またはサイズ排除によって精製することができる。最終的な生成は、例えば、ＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行うことができる。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、本発明の抗体構築物に好適なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母が、下等真核宿主生物の中でも最も一般的に用いられる。但し、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッケルハミ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属宿主；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）属（ＥＰ ４０２ ２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３ ０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４ ２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属；ならびにニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属などの糸状菌、及びＡ．ニデュランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属宿主などの、多くの他の属、種、及び株が、本明細書において一般的に利用可能且つ有用である。

本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の多様なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が公開されており、かかるウイルスを、本発明に係る本明細書のウイルス、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクション用のウイルスとして用いてもよい。

ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物もまた宿主として用いることができる。植物細胞培養物中でのタンパク質の産生において有用なクローニング及び発現ベクターは当業者に公知である。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ３４２： ７６−７８， Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７９０−７９４， Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８： ７４５−７５０，及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２： ９７９−９８６を参照されたい。

但し、脊椎動物細胞において最も重要性が高まっており、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が日常的な操作となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養にてサブクローニングして増殖させた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６ ： ５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６ （１９８０））；マウスセリトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３： ２４３−２５１ （１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ． Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８２） ３８３： ４４−６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。

更なる実施形態において、本発明は、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、該培養物から産生された抗体構築物を回収することとを含む、本発明の抗体構築物の製造方法を提供する。

本明細書では、用語「培養する」とは、培地中、適宜の条件下での細胞の、イン・ビトロでの維持、分化、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、及び／または増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）をいう。用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、本訳後修飾、及び分泌を含む、但しこれらに限定されない、本発明の抗体構築物の産生に関与する任意のステップを包含する。

組換え技法を用いる場合、本抗体構築物は細胞内に、細胞膜周辺腔内に産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。本抗体構築物が細胞内に産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解した断片のいずれであってもよい粒子状デブリが、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： １６３−１６７ （１９９２）は大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離手順を記載している。簡単に説明すると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって融解させる。細胞デブリは遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合には、一般的に、まずかかる発現系由来の上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を任意の前述のステップにおいて添加してタンパク質分解を抑制してもよく、また抗生物質を添加して外来の汚染物質の増殖を防止してもよい。

上記宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収または精製することができる。イオン交換カラム上での分別、エタノールによる沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウムによる沈殿などの他のタンパク質精製技法も、回収する抗体に応じて利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合には、精製にＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フォリップスバーグ）が有用である。

アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドが結合したマトリクスは最も多くの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。制御された細孔のガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスによって、アガロースで得られる流速及び処理時間よりも、より大きな流速及びより短い処理時間が可能になる。

更に、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って製造された抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に関しては、本抗体構築物の均一性が≧８０％であることが好ましく、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、または≧８５％であり、更に好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、または≧９０％であり、一層更に好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、または≧９５％であり、最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％または≧９９％である。

本明細書では、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒトの患者への投与に対して安定している組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１種または複数種の本発明の抗体構築物を、好ましくは治療上有効な量で含む。本医薬組成物は、適宜の処方の１種または複数種の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤及び／またはアジュバントを更に含むことが好ましい。本組成物の許容される構成成分は、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度において受容者に対して非毒性である。本発明の医薬組成物としては、液体の、凍結した、及び凍結乾燥した組成物が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の組成物は薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。全般的には、本明細書では、「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与、特に非経口投与に適合する、任意且つ全ての水性及び非水性溶液、無菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水乳化液などの乳化液、種々のタイプの湿潤剤、リポソーム、分散媒体及びコーティングを意味する。かかる媒体及び薬品の医薬組成物における使用は本技術分野において周知であり、かかる担体を含む組成物は周知の従来の方法によって製剤することができる。

特定の実施形態は、本発明の抗体構築物及び、本明細書の本節及び他所に例証として記載される１種または複数種の医薬品添加剤を更に含む医薬組成物を提供する。医薬品添加剤は、本件に関する発明において、有効性を向上させるため及び／またはかかる製剤及び方法を、例えば、製造、輸送、貯蔵、使用前の調製、投与、及びその後の間に生じるストレスに起因する分解及び損傷に対して安定化させるために、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的、または生物学的特性、及び／または本明細書の方法を調整することなどの、多種多様な目的に用いることができる。

特定の実施形態において、本医薬組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色相、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、当該組成物の吸収または浸透を改変する、維持するまたは保存する目的で、製剤物質を含有してもよい（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， １８’’ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｒｍｏ， ｅｄ．）， １９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。）。かかる実施形態において、好適な製剤物質としては、
・荷電したアミノ酸、好ましくはリシン、酢酸リシン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／またはヒスチジンを含む、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、プロリン、２−フェニルアラニンなどのアミノ酸
・殺菌剤または抗真菌剤などの抗生剤、
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、
・本組成物を、一般的には約５〜約８または９以内のｐＨ範囲である生理学的ｐＨに、またはやや低いｐＨに維持するために用いられる緩衝液、緩衝系及び緩衝剤；緩衝液の例としては、ホウ酸、炭酸水素、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸、コハク酸、リン酸、ヒスチジン及び酢酸；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液がある、
・プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどの非水性溶媒、
・水、アルコール性／水性溶液、生理的食塩水及び緩衝培地を含む乳化液または懸濁液を含む水性担体、
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー、
・マンニトールまたはグリシンなどの増容剤、
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、
・等張剤及び吸収遅延剤、
・カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどの錯化剤、
・充填剤、
・単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；炭水化物は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタ硫酸、ソルビトールまたはキシリトールであってよい、
・ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンもしくは、好ましくはヒト起源の免疫グロブリンなどの、（低分子量）タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質性担体、
・着色料及び香味料、
・グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどのイオウ含有還元剤、
・希釈剤、
・乳化剤、
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー）
・ナトリウムなどの塩形成対イオン、
・抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤；例としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素がある）、
・Ｚｎ−タンパク質複合体などの金属複合体、
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、
・トレハロース、スクロース、オクタ硫酸、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールスタキオースなどの糖及び糖アルコール、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール、
・懸濁剤、
・プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなどの界面活性剤または湿潤剤；界面活性剤は好ましくは＞１．２ＫＤの分子量の洗剤、及び／または好ましくは＞３ＫＤの分子量のポリエーテルであってよく；好ましい洗剤の非限定的な例としては、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｗｅｅｎ ８５があり；ポリエーテルの非限定的な例としては、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００及びＰＥＧ ５０００がある、
・スクロースまたはソルビトールなどの安定性増強剤、
・ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトールソルビトールなどの張度増強剤、
・塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む非経口送達ビヒクル、
・流体及び栄養補液、電解質補液（デキストロースリンゲル液をベースとするものなど）を含む静脈送達ビヒクル
を挙げることができるが、これらに限定はされない。

本医薬組成物の異なる構成成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは当業者には明確であり、例えば、アミノ酸は緩衝剤、安定化剤及び／または抗酸化剤として作用することができ；マンニトールは増容剤及び／または張度増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムは送達ビヒクル及び／または張度増強剤として作用することができるなどである。

本発明の組成物は、本明細書で規定される本発明のポリペプチドに加えて、当該組成物の意図する用途に応じて、更なる生物学的活性薬剤を含む場合があることが想定される。かかる薬剤は胃腸管系上で作用する薬物、細胞***阻害剤として作用する薬物、高尿酸血症を防止する薬物、免疫反応を抑制する薬物（例えばコルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系上で作用する薬物及び／または本技術分野で公知のサイトカインなどの薬剤であってよい。本発明の抗体構築物は、併用療法、すなわち、別の抗がん剤との併用で適用されることも想定される。

特定の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、送達方式及び所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されることとなる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，前掲，を参照されたい。特定の実施形態において、かかる組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、イン・ビボでの放出の速度及びイン・ビボでのクリアランスの速度に影響する。特定の実施形態において、医薬組成物中の主たるビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれであってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、場合により、非経口投与用の組成物に一般的な他の物質を補った、注射用水、生理学的食塩水溶液または人工脳脊髄液であってもよい。中性の緩衝生理的食塩水または血清アルブミンを混合した生理的食塩水が更なる例示的なビヒクルである。特定の実施形態において、本発明の抗体構築物の組成物は、貯蔵のために、所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤薬品（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，前掲）と混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製されてもよい。更に、特定の実施形態において、本発明の抗体構築物は、スクロースなどの適宜の医薬品添加剤を用いて、凍結乾燥物として製剤されてもよい。

非経口投与が企図される場合、本発明に用いるための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の本発明の抗体構築物を含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態として提供されてもよい。非経口注射用に特に好適なビヒクルは、無菌の蒸留水であって、その中に、本発明の抗体構築物が無菌の等張溶液として製剤される、適切に保存された上記蒸留水である。特定の実施形態において、上記調製は、所望の分子の、蓄積注射によって送達することができる本生成物の制御放出または徐放を提供することができる、注射可能なミクロスフェアー、生分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬品との製剤を含んでもよい。特定の実施形態において、循環において長時間の継続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸を用いてもよい。特定の実施形態において、所望の抗体構築物を導入するために、移植可能な薬物送達デバイスを用いてもよい。

更なる医薬組成物は当業者には明らかであろうが、本発明の抗体構築物を、持続するまたは制御された送達／放出の製剤中に含む製剤が挙げられる。リポソーム担体、生分解性微粒子または多孔性ビーズ及び蓄積注射などの種々の他の持続するまたは制御された送達手段を製剤化する技法もまた当業者には公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔質ポリマー微粒子の制御された放出を記述する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。徐放製剤としては、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリクスを挙げることができる。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ ０５８４８１号に開示される）、Ｌ−グルタミン酸とγ−Ｌ−グルタミン酸エチルとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ， １９８２， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：９８−１０５）、エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１，前掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシブタン酸（欧州特許出願公開第ＥＰ １３３，９８８号）を挙げることができる。徐放組成物としては、本技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げることができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：３６８８−３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ ０３６，６７６号、第ＥＰ ０８８，０４６号及び第ＥＰ １４３，９４９号を参照されたい。

本抗体構築物はまた、例えば、コアセルベーション技法によってまたは界面重合によって（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）調製されるマイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェアー、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に封入されていてもよい。かかる技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ．， Ｅｄ．， （１９８０）に開示される。

イン・ビボでの投与に用いるための医薬組成物は、一般的には無菌製剤として提供される。無菌化は無菌ろ過膜を通すろ過によって実現することができる。本組成物が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた無菌化は凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれに行われてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で貯蔵することができる。非経口組成物は一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈溶液バッグまたはバイアルに入れられる。

本発明の別の態様は、自己緩衝性の、本発明の抗体構築物の製剤を含み、該製剤は国際特許出願ＷＯ ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載の医薬組成物として用いることができる。Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，” Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ８（３）： ２８５−９１ （１９９１）； Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” ｉｎ： ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ： ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ， ｅｄｓ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． １３： ６１−８４ （２００２），及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”， Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３： １５９−７５ （２００２）などの、タンパク質の安定化ならびにこの点に関して有用な製剤物質及び方法に対する種々の解説が利用可能であり、特には、本発明に係る自己緩衝性のタンパク質製剤のための医薬品添加剤及びそれらの方法に関連する部分、特に、獣医学的及び／またはヒトの医学的使用のためのタンパク質医薬製品及び方法に関する部分を参照されたい。

本発明の特定の実施形態によれば、例えば、製剤のイオン強度及び／または等張性を調整するために、及び／または本発明に係る組成物のタンパク質または他の成分の溶解性及び／または物理的安定性を向上させるために、塩を用いてもよい。周知のとおり、イオンは、天然状態のタンパク質を、該タンパク質の表面上の荷電した残基に結合することによって、ならびに該タンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し且つそれらの静電的相互作用、引き合う、及び反発する相互作用を低減することによって安定化することができる。イオンはまた、タンパク質の変性した状態を、特に当該タンパク質の変性したペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって、安定化することもできる。更に、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン性相互作用はまた、分子間の静電的な相互作用を低減することもでき、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防止または低減する。

イオン種によってタンパク質に対する効果が顕著に異なる。イオン及びそれらのタンパク質に対する効果の分類別のランキングが多数開発され、これらを本発明に係る医薬組成物の製剤化に用いることができる。一例がＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズであり、これは、イオン性の及び極性非イオン性の溶質を、溶液中でのタンパク質の立体構造上の安定性に対する該溶質の効果によってランク付けしている。安定化させる溶質は「コスモトロピックな（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ）」と呼ばれる。不安定化させる溶質は「カオトロピックな（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）」と呼ばれる。コスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅｓ）は、通常、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル濃度の硫酸アンモニウム）で用いられる。カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）は、通常、タンパク質をｄｅｎｔｕｒｅ及び／または可溶化（「塩溶」）させるために用いられる。イオンの「塩析」及び「塩溶」に対する相対的な有効性によって、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズにおけるそれらの位置が規定されている。

本発明の種々の実施形態に係る、本発明の抗体構築物の製剤において、遊離アミノ酸を増容剤、安定化剤、及び抗酸化剤として、ならびに他の標準的な用途に用いてもよい。リシン、プロリン、セリン、及びアラニンを製剤中のタンパク質の安定化に用いることができる。グリシンは凍結乾燥において妥当なケーキの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質の凝集を抑制するのに有用である場合がある。メチオニンは抗酸化剤として有用である。

ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、ならびに、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、及び、本明細書における議論の目的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連する物質などの多価アルコールを包含する。ポリオールはカオトロピックである。ポリオールは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質を物理的及び化学的な分解過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールはまた、製剤の張度の調整にも有用である。ポリオールの中でも、本発明の選択された実施形態において有用なのはマンニトールであり、凍結乾燥製剤におけるケーキの構造安定性を確保するために一般的に用いられる。マンニトールは上記ケーキに対する構造安定性を確保する。マンニトールは一般的に、凍結乾燥保護剤、例えば、スクロースと共に用いられる。ソルビトール及びスクロースは張度の調整に及び、輸送または製造工程の間のバルクの調製の際の凍結−融解ストレスに対して保護するための安定化剤として、他のものがある中でも好ましい薬品である。グルコース及びラクトースなどの、（遊離のアルデヒドまたはケトン基を含有する）還元糖は、表面リシン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、これら還元糖は一般的に、他のポリオールがある中で、本発明に係る使用にとって好ましいポリオールではない。加えて、酸性条件下でフルクトース及びグルコースへと加水分解されて、結果として糖化を起こすスクロースなどの、かかる反応性種を形成する糖もまた、他のポリオールがある中で、この点において本発明の好ましいポリオールではない。ＰＥＧはタンパク質を安定化するのに及び凍結保護剤として有用であり、本発明においてこの点で用いることができる。

本発明の抗体構築物の製剤の実施形態は界面活性剤を更に含む。タンパク質分子は表面上への吸着を受けやすく且つ変性しやすく、その結果として空気−液、固−液、及び液−液界面で凝集しやすい場合がある。これらの影響は一般にタンパク質濃度と逆に増減する。これらの有害な相互作用は一般にタンパク質濃度と逆に増減し、一般的に、製品の輸送及び取り扱いの際に生じるような物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は表面吸着を防止、最少化、または低減するために日常的に用いられる。本発明におけるこの点で有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリオエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般的に用いられる。この点に関する界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。というのも、いずれかの所与の界面活性剤は、一般的にいくつかのタンパク質を安定化し、他のタンパク質を不安定化することとなるからである。

ポリソルベートは酸化的分解を受けやすく、多くの場合、供給された状態では、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を生じさせるのに十分な量の過酸化物を含有している。したがって、ポリソルベートは注意して使用する必要があり、用いる場合には、それらの最低有効濃度で用いる必要がある。この点に関し、ポリソルベートは、医薬品添加剤はそれらの最低有効濃度で用いる必要があるとの一般的なルールの好例である。

本発明の抗体構築物の製剤の実施形態は、１種または複数種の抗酸化剤を更に含む。医薬組成物中において、タンパク質の有害な酸化は、周囲の酸素及び温度を適切なレベルに維持することによって、且つ光への曝露を回避することによってある程度までは防ぐことができる。その上、タンパク質の酸化的分解を防止するために、抗酸化添加剤も用いることができる。その他のものがある中でも、この点に関して有用な抗酸化剤は還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、及びキレート剤である。本発明に係る治療用タンパク質製剤に使用する抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、且つ製品の有効期間を通して該抗酸化剤の活性を維持する。ＥＤＴＡはこの点に関して、好ましい本発明に係る抗酸化剤である。抗酸化剤はタンパク質に損傷を与える場合がある。例えば、特にグルタチオンなどの還元剤は、分子内ジスルフィド結合を切断する場合がある。したがって、本発明において用いられる抗酸化剤は、他の事項もある中で、本製剤中で抗酸化剤自体がタンパク質に損傷を与える可能性を排除するまたは十分に低減するように選択される。

本発明に係る製剤は、特定のインスリン懸濁液を形成するために必要な亜鉛のような、タンパク質補助因子であり且つタンパク質配位複合体を形成するために必要な金属イオンを含んでいてもよい。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかの過程を抑制する場合もある。但し、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程を触媒もする。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）はアスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を抑制するために用いることができる。Ｃａ^＋２イオン（最大１００ｍＭ）はヒトデオキシリボ核酸の安定性を増加させる場合がある。しかしながら、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、及びＺｎ^＋２はｒｈＤＮアーゼを不安定化させる場合がある。同様に、Ｃａ^＋２及びＳｒ^＋２は第ＶＩＩＩ因子を安定化する場合があり、該因子はＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２及びＺｎ^＋２、Ｃｕ^＋２及びＦｅ^＋２によって不安定化される場合があり、その凝集がＡｌ^＋３イオンによって増加する場合がある。

本発明の抗体構築物の製剤の実施形態は、１種または複数種の防腐剤を更に含む。同一の容器からの２回以上の抜き取りを伴う複数回投与分の非経口製剤を開発する場合には、防腐剤が必要である。防腐剤の主要な機能は、微生物の増殖を抑制し、当該薬物製品の有効期間または使用期間を通して製品の無菌性を確保することである。一般的に用いられる防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。低分子非経口薬については、防腐剤は長い使用の歴史があるが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難を伴う場合がある。防腐剤はほぼ常にタンパク質に対する不安定化作用（凝集）を有し、このことが複数回投与分のタンパク質製剤における防腐剤の使用を制限する主要な因子になっている。今日まで、殆どのタンパク質薬は単回使用のみに対して製剤されてきた。しかしながら、複数回投与分の製剤が可能になれば、該製剤は患者の利便性を可能にするという追加の利点、及び市場性の向上を有する。よい例がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であり、この場合は、防腐剤処方された製剤の開発が、より利便性のある、複数回使用の注射ペン形態の実用化に繋がっている。現在、少なくとも４種の、防腐剤処方されたｈＧＨの製剤を含有するかかるペン型装置が市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥製剤−−二重チャンバ・カートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）はｍ−クレゾールを用いて製剤されている。防腐剤処方した剤形の製剤及び開発の際にいくつかの側面を考慮する必要がある。薬物製品中の有効な防腐剤濃度を最適化する必要がある。このことによって、タンパク質の安定性を損なうことなく抗菌の有効性を付与する濃度範囲の剤形において、所与の防腐剤の試験を行うことが必要となる。

予想されたとおり、防腐剤を含有する液体製剤の開発は凍結乾燥製剤よりもより困難を伴う。凍結乾燥した製品を防腐剤なしで凍結乾燥し、使用時に防腐剤を含有した希釈剤で再構成することができる。これにより、防腐剤がタンパク質と接触している時間が短縮され、防腐剤に伴う安定性のリスクが顕著に低減される。液体製剤については、防腐剤の有効性及び安定性が製品の有効期間（約１８〜２４ヶ月）の全体にわたって維持される必要がある。注記すべき重要な点は、防腐剤の有効性は活性薬物及び全ての添加剤成分を含有する最終的な製剤において実証される必要があることである。

本明細書に開示の抗体構築物はまた、イムノリポソームとして製剤されてもよい。「リポソーム」とは、哺乳動物への薬物の送達に有用な、種々のタイプの脂質、リン脂質及び／または界面活性剤からなる小ベシクルである。上記リポソームの構成成分は一般的に、生物学的膜の脂質の配置と類似した二重層の構成に配置されている。本抗体構築物を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；ならびにＷ０ ９７／３８７３１に記載されるものなどの、本技術分野において公知の方法によって調製される。循環時間が増大したリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧで誘導体形成されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法によって生成させることができる。規定された細孔サイズのフィルターを通してリポソームを押し出して、所望の径のリポソームを得る。本発明の抗体構築物のＦａｂ’フラグメントをＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されるリポソームにジスルフィド交換反応によって結合することができる。化学療法剤を任意選択で上記リポソーム内に含有させる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１ （１９） １４８４ （１９８９）を参照されたい。

本医薬組成物が製剤された後、該製剤は無菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、乳化液、固体、結晶として、または脱水されたもしくは凍結乾燥された粉末として貯蔵されてもよい。かかる製剤はそのまま使用できる形態または投与の前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態の何れかで貯蔵されてもよい。

本明細書に規定される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の例、すなわち、ＷＯ ９９／５４４４０またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １−１２）に記載される細胞傷害性アッセイによって測定することができる。本明細書では、「有効性」または「イン・ビボでの有効性」とは、例えば、標準化されたＮＣＩの応答基準を用いた、本発明の医薬組成物による治療に対する応答をいう。本発明の医薬組成物を用いた治療の成功またはイン・ビボでの有効性とは、本組成物のその意図する目的に対する有効性、すなわち、本組成物のその所望の効果、すなわち、病的細胞、例えば腫瘍細胞の除去を起こす能力をいう。上記イン・ビボでの有効性は、白血球数、白血球百分率、蛍光活性化セルソーティング、骨髄穿刺を含む、但しこれらに限定されない、それぞれの疾患単位に対する確立された標準的方法によって監視することができる。加えて、種々の疾患特異的な臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法を用いてもよい。更に、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、国立がん研究所の基準に基づく応答評価のための［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ， Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ， Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ， Ｓｈｉｐｐ ＭＡ， Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ， Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ， Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ， Ｖｏｓｅ Ｊ， Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ Ａ， Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ， Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ， Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ， Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ， Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ， Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ， Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ， Ｃａｒｔｅｒ Ｗ， Ｈｏｐｐｅ Ｒ， Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影スキャン、白血球数、白血球百分率、蛍光活性化セルソーティング、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学的検査、ならびに種々のリンパ腫特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）及び他の確立した標準的な方法を用いてもよい。

本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態学的特性の予期可能な調整である。この目的のために、当該薬物候補の薬物動態学的プロファイル、すなわち、特定の薬物の所与の疾病を治療する能力に影響を与える薬物動態学的パラメータのプロファイルを確立してもよい。特定の疾患単位を治療するための薬物の能力に影響を与える、本薬物の薬物動態学的パラメータとしては、半減期、分布容積、肝臓初回通過代謝及び血清結合度が挙げられるが、これらに限定はされない。所与の薬剤の有効性は上述のパラメータのそれぞれによって影響される場合がある。

「半減期」とは、生物学的過程、例えば代謝、排出等により、投与された薬物の５０％が除去される時間を意味する。「肝臓初回通過代謝」とは、肝臓と最初に接触する際に、すなわち、薬物が最初に肝臓を通過する際に代謝される、該薬物の性向を意味する。「分布容積」とは、例えば細胞内空間及び細胞外空間、組織及び器官などの身体の種々の区画にわたる、薬物を保持する度合いならびにこれらの区画内の当該薬物の分布を意味する。「血清結合度」とは、薬物の性向であって、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用及び結合して、当該薬物の生物学的活性の低下または消失に繋がる上記薬物の性向を意味する。

薬物動態学的パラメータはまた、生物学的利用能、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、投与された薬物の所与の量に対するより大きな効果発現及び／またはＣｍａｘも包含する。「生物学的利用能」とは、血液区画中の薬物の量を意味する。「遅延時間」とは、当該薬物の投与と血液または血漿中における当該薬物の検出及び測定可能となるまでの間の時間的遅れを意味する。「Ｔｍａｘ」とは当該薬物の最大血液濃度に達するまでの時間であり、「Ｃｍａｘ」とは所与の薬物に関して得られる最大の血液濃度である。本薬物の生物学的効果にとって必要とされる該薬物の血液濃度または組織濃度に達するまでの時間は全てのパラメータによる影響を受ける。上記に概説した非チンパンジー霊長動物における臨床前動物試験において測定することができる、異種間特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態学的パラメータもまた、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．による刊行物（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １−１２）に示される。

一実施形態は、腫瘍もしくはがん疾患のまたは転移性がん疾患の予防、治療あるいは改善に用いるための、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って製造された抗体構築物を提供する。

本発明の好ましい実施形態によれば、上記腫瘍またはがん疾患は固形がん疾患である。

本明細書に記載の製剤は、それを必要とする患者における、本明細書に記載の病態の治療、改善及び／または予防において、医薬組成物として有用である。用語「治療」とは、治療的な処置と予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）すなわち予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段との両方をいう。治療は、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に罹患しやすい傾向を有する患者の身体、該患者から単離された組織、または該患者由来の細胞への、該疾患、該疾患の症状、または該疾患に罹患しやすい傾向を治療する（ｃｕｒｅ）、治癒する、緩和する、軽減する、改変する、治療する（ｒｅｍｅｄｙ）、改善する、好転させる、または影響を与えることを目的とする、本製剤の適用または投与を含む。

本明細書では、用語「改善」とは、本発明に係る抗体構築物を、それを必要とする対象に投与することによる、本明細書の以下に特定される腫瘍もしくはがんまたは転移性がんを有する患者の病態のいずれかの好転をいう。かかる好転はまた、上記患者の上記腫瘍もしくはがんまたは転移性がんの進行の減速または停止としても見られる。本明細書では、用語「予防」とは、本発明に係る抗体構築物を、それを必要とする対象に投与することによる、本明細書の以下に特定される腫瘍もしくはがんまたは転移性がんを有する患者の発病または再発の回避を意味する。

用語「疾患」とは、本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物による治療から利益を得ることとなる任意の疾病をいう。該用語は、当該哺乳動物を問題の疾患に罹患しやすくする病態を含む慢性及び急性の障害または疾患を包含する。

「新生物」とは、通常、但し常にではないが、塊を形成する組織の異常な増殖である。塊も形成する場合には、該新生物は一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物または腫瘍は、良性、可能性として悪性（前がん状態）、または悪性の場合がある。悪性の新生物は一般にがんと呼ばれる。悪性の新生物は通常周囲の組織に浸潤してこれを破壊し、転移性がんを形成する場合がある、すなわち、身体の他の部分、組織または器官に拡大する。「転移性がん」（ｍｅｔａｔｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は原発性腫瘍の組織または器官以外の他の組織または器官への転移性がん（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）を包含する。リンパ腫及び白血病はリンパ系新生物である。本発明の目的に対しては、リンパ腫及び白血病もまた用語「腫瘍」または「がん」に包含される。

本発明の好ましい実施形態において、上記腫瘍またはがん疾患は固形腫瘍疾患であり、上記転移性がん疾患は任意の上記固形腫瘍疾患から生じる。

本発明との関係で好ましい腫瘍またはがん疾患は、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部がん、中皮腫、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、腎臓がん及び胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される。好ましくは固形腫瘍疾患である上記腫瘍またはがん疾患は、卵巣がん、膵臓がん、中皮腫、肺がん、胃がん及びトリプルネガティブ乳がんからなる群より選択することができる。上記転移性がん疾患は任意の上記のがんから生じることができる。

本発明はまた、腫瘍もしくはがん疾患または転移性がん疾患の治療または改善方法であって、該方法を必要とする対象に、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って製造された抗体構築物を投与するステップを含む上記方法も提供する。

用語「必要とする対象」または「治療を必要とする」対象は、当該障害を既に有している対象、ならびに当該障害が予防されるべき対象を包含する。上記必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的な処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物の対象を包含する。

本発明の抗体構築物は概して、特定の投与経路及び投与方法に対して、特定の投薬量及び投与の頻度に対して、特定の疾患の特定の治療に対して、他の事項もある中で生物学的利用能及び残留性の範囲で設計されることとなる。本組成物の物質は、好ましくは投与部位に対して許容される濃度で製剤される。

したがって、本発明に係る製剤及び組成物は、任意且つ適宜の投与経路による送達に対して設計することができる。本発明の文脈において、上記投与経路としては、
・局所経路（経皮、吸入、経鼻腔、経眼球、経耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ／ａｕｒａｌ）、経膣、経粘膜など）、
・経腸経路（経口、経消化管、舌下、経直腸など）及び、
・非経口経路（静脈内、動脈内、骨内、筋内、脳内、脳室内、硬膜外、クモ膜下腔内、皮下、腹膜内、羊膜外、関節内、心内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液内、管腔内など）
が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、非経口投与、例えば、皮下送達または、例えばボーラス注射などの注射による、もしくは連続的注入などの注入による静脈内送達に対して特に有用である。医薬組成物は医療装置を用いて投与してもよい。医薬組成物を投与するための医療装置の例が、米国特許第４，４７５，１９６号、第４，４３９，１９６号、第４，４４７，２２４号、第４，４４７，２３３号、第４，４８６，１９４号、第４，４８７，６０３号、第４，５９６，５５６号、第４，７９０，８２４号、第４，９４１，８８０号、第５，０６４，４１３号、第５，３１２，３３５号、第５，３１２，３３５号、第５，３８３，８５１号、及び第５，３９９，１６３号に記載されている。

特に、本発明は、適宜の組成物の途切れのない投与を提供する。非限定的な例として、途切れのないまたは実質的に途切れのない、すなわち連続した投与は、当該の患者が装着した、該患者の体内への治療薬の流入量を計量するための小型ポンプシステムによって実現することができる。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物を、上記ポンプシステムを用いることによって投与することができる。かかるポンプシステムは本技術分野で一般的に知られており、通例では、注入される治療薬を収納したカートリッジの定期的な交換に依存している。かかるポンプシステムの上記カートリッジを交換する場合には、結果として、該交換がなければ途切れることのない当該患者の体内への治療薬の供給の一時的な中断が起こり得る。かかる場合、カートリッジの交換前の投与期間及びカートリッジの交換後の投与期間は、それでもなお、薬学的手段及び本発明の方法の意味の範囲内で、かかる治療薬の一つの「途切れのない投与」を共に構成すると見なされることとなる。

本発明の抗体構築物の上記連続的な、すなわち途切れのない投与は、容器から流体を送り出すための流体送り出し機構及び上記送り出し機構を作動させるための作動機構を備える、流体送達装置もしくは小型ポンプシステムを手段とした静脈内または皮下投与であってよい。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、適宜の組成物を当該患者の体内に送達するための針またはカニューレを備えていてもよい。上記ポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは無関係に直接当該患者の皮膚に固定されまたは貼付けられてもよく、それによって上記ポンプシステムと患者の皮膚との直接の接触が可能になる。上記ポンプシステムは２４時間から最長で数日間当該患者の皮膚に貼付けることができる。該ポンプシステムは、小容量用の容器を有する小型のポンプシステムであってよい。非限定的な例として、投与される適宜の医薬組成物用の容器の用量は０．１〜５０ｍｌとすることができる。

上記連続的投与はまた、皮膚上に装着し、時間間隔を置いて交換する貼付剤を手段とした経皮投与であってもよい。当業者はこの目的のために好適な薬物送達用の貼付剤システムを承知している。注目すべきは、第１の枯渇した貼付剤の交換を新品の第２の貼付剤の装着と同時に、例えば、第１の枯渇した貼付剤に隣接した皮膚上に、第１の枯渇した貼付剤の除去の直前に好都合に行うことができることから、経皮投与が途切れのない投与に特に適していることである。供給の中断または動力電池の故障の問題も生じない。

本医薬組成物が凍結乾燥されている場合、当該凍結乾燥された物質は投与の前にまず適宜の液体中で再構成される。上記凍結乾燥された物質は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、または当該タンパク質が凍結乾燥の前に存在したものと同一の製剤中で再構成される。

本発明の組成物は、例えば、非チンパンジー霊長動物、例えばマカクに対して、増加していく用量の、本明細書に記載の異種間特異性を示す本発明の抗体構築物を投与することによる用量を漸増させる検討によって決定することができる好適な用量で、対象に投与することができる。上記に示したように、本明細書に記載の異種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、好都合に、非チンパンジー霊長動物における臨床前試験において及びヒトにおける薬物として、同一の形態で用いることができる。投与計画は担当医及び臨床学的因子によって決定されることとなる。医学分野において周知のとおり、任意の一人の患者に対する投薬量は、当該患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的な健康状態、及び併用される他の薬物を含む多くの因子に依存する。

用語「有効用量」または「有効投薬量」は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。用語「治療有効用量」は、当該疾患に既に罹患している患者における該疾患及びその合併症を治療または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量として定義される。本使用に有効な量または用量は、治療をうける疾病（適応症）、送達される抗体構築物、治療環境及び目的、疾患の重篤度、以前の治療、患者の病歴及び治療薬に対する応答、投与経路、体格（体重、体表面積または器官の大きさ）及び／または患者の状態（年齢及び全般的な健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全般的な状態に依存することとなる。適正な用量は、該用量が当該患者に１回または一連の投与にわたって投与できるように、且つ最適な治療効果を得るために、担当医の判断に従って調整することができる。

典型的な投薬量は、上述の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大で約３０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってよい。特定の実施形態において、上記投薬量は、１．０μｇ／ｋｇから最大で約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で１０μｇ／ｋｇから最大で約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇから最大で約５ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。

治療有効量の本発明の抗体構築物によって、好ましくは、疾患症状の重篤度が減少し、疾患症状のない期間の頻度もしくは継続期間が増加し、または疾患の苦しみに起因する障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）または障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）が防止される。ＭＳＬＮを発現する腫瘍を治療するためには、治療有効量の本発明の抗体構築物、例えば、抗ＭＳＬＮ／抗ＣＤ３抗体構築物は、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を、未治療の患者に比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％抑制する。化合物の腫瘍増殖を抑制する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルにおいて評価することができる。

本医薬組成物は単一の治療薬として、または必要に応じて、抗がん剤、例えば、他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物などの更なる治療薬との併用で投与されてもよい。これらの薬物は本明細書に規定される本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に、または別個に、時宜にかなって規定された間隔及び用量で、上記抗体構築物の投与の前もしくは後に投与されてもよい。

本明細書では、用語「有効且つ非毒性の用量」とは、主たる毒性作用なしにまたは本質的になしに、病的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の収縮または疾患の安定化を起こすのに十分高い、本発明の抗体構築物の忍容可能な用量をいう。かかる有効且つ非毒性の用量は、例えば、本技術分野で報告されている用量を漸増させる検討によって決定することができ、重篤な有害な副作用を誘発する用量（用量規制毒性、ＤＬＴ）未満とする必要がある。

本明細書では、用語「毒性」とは、有害事象または重篤な有害事象において顕在化した薬物の毒性作用をいう。これらの副作用は、投与後の当該薬物の全般的な忍容性の欠如及び／または局所耐容性の欠如をいう場合もある。毒性は当該薬物によって引き起こされる催奇作用または発がん作用も包含する場合がある。

本明細書では、用語「安全性」、「イン・ビボでの安全性」または「忍容性」とは、薬物の投与の直後に（局所耐容性）及びより長期の適用に際して、重篤な有害事象を誘発することのない薬物の投与と定義される。「安全性」、「イン・ビボでの安全性」または「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に一定の間隔で評価することができる。測定としては、臨床評価、例えば、器官の徴候、及び検査による異常のスクリーニングが挙げられる。臨床評価を実施し、正常所見からの逸脱を、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ基準に準拠して記録／コード化してもよい。器官の徴候としては、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ （ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、不整脈、凝固等を挙げることができる。試験を行ってもよい検査パラメータとしては、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿分析ならびに血清、血漿、リンパ液または髄液（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、髄液（ｌｉｑｕｏｒ）などの他の体液の検査が挙げられる。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技法（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像（ＭＲＩ））、技術的装置による他の測定（すなわち、心電図）、生命徴候によって、検査パラメータを測定すること及び有害事象を記録することによって評価することができる。例えば、本発明に係る使用及び方法における非チンパンジー霊長動物での有害事象を、病理組織学的及び／または組織化学的方法によって調べてもよい。

上記用語はまた、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６； ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ； ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６， １９９７においても参照される。

更なる実施形態において、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明の方法に従って製造された抗体構築物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。

本発明の文脈において、用語「キット」とは、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）中にまたは他の方法で一緒に包装された２種以上の構成要素であって、その内の1つが本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクターまたは宿主細胞に相当する上記構成要素を意味する。したがって、キットは、単一の単位として販売することができる、特定の目的を果たすのに十分な一組の製品及び／または用具として記述することができる。

上記キットは、１または複数の、任意且つ適宜の形状、大きさ及び材質（好ましくは防水性の、例えばプラスチックまたはガラス）の、投与に対して適切な投薬量（上記を参照のこと。）で本発明の抗体構築物または医薬組成物を収納した容器（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）（バイアル、アンプル、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）、シリンジ、ビン、バッグなど）を備える。上記キットは使用上の注意書き（例えば、パンフレットまたは取扱説明書）、シリンジ、ポンプ、注入器などの本発明の抗体構築物の投与手段、本発明の抗体構築物の再構成手段及び／または本発明の抗体構築物の希釈手段を更に収納していてもよい。

本発明はまた、単回投与単位用のキットも提供する。本発明のキットはまた、乾燥した／凍結乾燥した抗体構築物が入った第１の容器及び水性製剤が入った第２の容器を収納していてもよい。本発明の特定の実施形態において、単一のチャンバをもつ及び複数のチャンバをもつ、予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥剤）を収納したキットが提供される。

ヒト−マウスＭＳＬＮキメラの概略図である。該ＭＳＬＮキメラは６種の別個の配列ストレッチのヒトＭＳＬＮからマウスＭＳＬＮへの交換によって生成させた。それぞれの変異体はＣＨＯ細胞クローン（Ｅ１−Ｅ６）の表面上で発現させた。実施例１を参照されたい。 フローサイトメトリーによって検出した抗ＭＳＬＮ抗体構築物の交差反応性：ヒト及びマカクのＭＳＬＮならびにＣＤ３に対する結合を示す図である。実施例４を参照されたい。 フローサイトメトリーによって検出した抗ＭＳＬＮ抗体構築物の交差反応性：ヒト及びマカクのＭＳＬＮならびにＣＤ３に対する結合を示す図である。実施例４を参照されたい。 フローサイトメトリーによる抗ＭＳＬＮ抗体構築物の分析：ヒト変異ｖ２及びｖ６に対する結合を示す図である。実施例４を参照されたい。 フローサイトメトリーによる抗ＭＳＬＮ抗体構築物の分析：ヒト変異ｖ２及びｖ６に対する結合を示す図である。実施例４を参照されたい。 １８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力を示す図である。 １８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をＭＳＬＮ陽性ＯＶＣＡＲ−８に対して再指示する効力を示す図である。 ４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、可溶性ＭＳＬＮの非存在下及び存在下で、未刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４⁻／ＣＤ５６⁻）中のＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力を示す図である。 ４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定した、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、未刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４⁻／ＣＤ５６⁻）中のＴ細胞をＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８に対して再指示する効力を示す図である。 交差反応性ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＴ細胞をマカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示することができることの確認を示す図である。エフェクターＴ細胞としてマカクＴ細胞株ＬｎＰｘ４１１９を用いて、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイを実施した（エフェクター標的比 １０：１）。 １８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した、ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体及び二量体のアイソタイプ間の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞中のＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力ギャップを示す図である。 ヒト血漿中での９６時間のインキュベーション後のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の安定性を示す図である。１８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ。エフェクター細胞：刺激され富化されたヒトＣＤ８ Ｔ細胞。標的細胞：ｈｕ ＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞。エフェクターの標的細胞に対する（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。表示したＢｉＴＥタンパク質。 高分解能カチオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸによって分析した、本発明の抗体構築物のタンパク質均一性を示す図である。 フロースルーモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィー ＨＩＣにおいて試験した、本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を示す図である。 ３回の凍結／融解サイクル後の単量体から二量体への変換を示す図である。 ２５０μｇ／ｍｌでの７日間のインキュベーション後の単量体から二量体への変換を示す図である。 メソテリン（ＭＳ） ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物による標的非依存性Ｔ細胞活性化の評価を示す図である。２（ａ）ヒトＰＢＭＣ（３×）を用いた４８時間の活性化アッセイにおける抗体構築物；ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）段階希釈液（開始 ２０ｎＭ；１：５、７× ＋ブランク）；ＦｃＲブロッキング［１０ｍｇ／ｍＬ ｈｕＩｇＧ （Ｋｉｏｖｏｇ， Ｂａｘｔｅｒ）］なしまたはあり；ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９及びＣＤ２５［表示せず］発現のＦＡＣＳ測定。２（ｂ）ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ１４^＋／ＣＤ３３^＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（３×）を用いた４８時間の活性化アッセイにおけるヘテロ−Ｆｃ抗体構築物；ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）段階希釈液（開始 ２０ｎＭ；１：５、７× ＋ブランク）；ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９及びＣＤ２５［表示せず］発現のＦＡＣＳ測定。 ＣＤＨ１９ ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物による標的非依存性Ｔ細胞活性化の評価を示す図である。３（ａ）ヒトＰＢＭＣ（３×）を用いた４８時間の活性化アッセイにおける抗体構築物；ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）段階希釈液（開始 ２０ｎＭ；１：５、７× ＋ブランク）；ＦｃＲブロッキング［１０ｍｇ／ｍＬ ｈｕＩｇＧ （Ｋｉｏｖｏｇ， Ｂａｘｔｅｒ）］なしまたはあり；ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９及びＣＤ２５［表示せず］発現のＦＡＣＳ測定。３（ｂ）ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ１４^＋／ＣＤ３３^＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（３×）を用いた４８時間の活性化アッセイにおけるヘテロ−Ｆｃ抗体構築物；ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）段階希釈液（開始 ２０ｎＭ；１：５、７× ＋ブランク）；ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９及びＣＤ２５［表示せず］発現のＦＡＣＳ測定。３（ｃ）ヒトＰＢＭＣ及びＣＤ１４^＋／ＣＤ３３^＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣ（３×）を用いた４８時間の活性化アッセイにおけるＸ−ボディ（Ｘ−ｂｏｄｙ）構築物；ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）段階希釈液（開始 ２０ｎＭ；１：５、７× ＋ブランク）；ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９及びＣＤ２５［表示せず］発現のＦＡＣＳ測定。 ＢｉＴＥ（登録商標）Ｆｃ融合抗体構築物の補体Ｃ１ｑへの結合を示す図である。ＢｉＴＥ（登録商標）Ｆｃ融合抗体構築物（ＢｉＴＥ（登録商標）一本鎖Ｆｃ（三角形）、ＢｉＴＥ（登録商標）ヘテロＦｃ（四角形）、カノニカルＢｉＴＥ（登録商標）（円））をＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に（段階希釈液で）被覆し、その後プールしたヒト血清でのインキュベーション及びポリクローナル抗ヒトＣＣ１ｑマウス抗体でのインキュベーションを行い、ヤギ抗マウスＦｃ−ＡＰ複合体により可視化した。 カニクイザルへの単回投与後の、４対のＢｉＴＥ（登録商標）−ＨＬＥ融合タンパク質の平均のＰＫプロファイルを示す図である。相互比較しやすくするために、血清濃度を１５μｇ／ｋｇに用量規格化し、ｎｍｏｌで示した。 それぞれｓｃＦｃ半減期延長部分と融合した５種の異なるＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の平均のＰＫプロファイルを示す図である。相互比較しやすくするために、血清濃度を１５μｇ／ｋｇに用量規格化し、ｎｍｏｌで示した。

以下の実施例は本発明を例証する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。本発明は特許請求の範囲のみによって限定される。

実施例１
野生型及びキメラＭＳＬＮを発現するＣＨＯ細胞の生成
ＭＳＬＮ抗体は、実施例１及び２のために定義される、６種のサブドメインまたは領域に細分化することができる。これらの６種のサブドメインのａａ配列は配列番号２３８〜２４３に示される。

以下の分子を生成させた。図１も参照されたい。
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ１ ｍｕ 配列番号２４６
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ２ ｍｕ 配列番号２４７
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ３ ｍｕ 配列番号２４８
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ４ ｍｕ 配列番号２４９
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ５ ｍｕ 配列番号２５０
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−Ｅ６ ｍｕ 配列番号２５１
・ｈｕ ｏｒｌ ＭＳＬＮ−完全ヒト 配列番号２３１

ヒト、カニクイザルマカク（「ｃｙｎｏ」）及びトランケートしたヒトＮ末端Ｖ５タグ付ＭＳＬＮを発現するＣＨＯ細胞の生成のために、ヒトＭＳＬＮ(配列番号２３１；ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５８２３も参照のこと。）、ｃｙｎｏ ＭＳＬＮ（配列番号２３４、ＬＭＲ Ｃ５２４５７を参照のこと。）及び６種のキメラヒト／マウスＭＳＬＮバージョン（上記を参照のこと。）に対するそれぞれのコード配列を、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと命名されたプラスミド中にクローン化した（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＲａｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０ （２００１） １４１−１５０に記載される。）。ヒト及びｃｙｎｏ ＭＳＬＮの細胞表面発現に対しては独自のシグナルペプチドを用いた。全てのクローニング操作は標準的なプロトコルに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１））。それぞれの構築物に対して、真核細胞発現のために、Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６によって報告されたように、相当するプラスミドをＤＨＦＲが欠失したＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。

ＣＨＯ細胞上でのヒト、キメラ及びｃｙｎｏ ＭＳＬＮの発現を、モノクローナルマウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＭＳＬＮ抗体を用いたＦＡＣＳアッセイで検証した。陰性対照として、細胞を、第１の抗体に代えてアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした。試料をフローサイトメトリーによって測定した。

実施例２
抗ＭＳＬＮ抗体構築物のエピトープマッピング
ヒトＭＳＬＮ及び上記キメラヒトＭＳＬＮ分子でトランスフェクトした細胞（実施例１を参照のこと。）を、ＰＢＳ／１，５％ＦＣＳ中で、ヒトアルブミンに融合した二重特異性ＭＳＬＮ×ＣＤ３抗体構築物（Ｉ２Ｃと命名されたＣＤ３結合ドメインを有する）（変異体１）を含有する粗製、未希釈のペリプラズム抽出液で染色した。結合した分子を、自家製のマウスモノクローナル抗ＣＤ３結合ドメイン抗体（５０μｌ）、続いて抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−γ−ＰＥ（１：１００、５０μｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１１５−１１６−０７１）によって検出した。全ての抗体をＰＢＳ／１．５％ ＦＣＳで希釈した。陰性対照として、細胞をペリプラズム抽出液に代えてＰＢＳ／２％ ＦＣＳでインキュベートした。これらの試料をフローサイトメトリーによって測定した。

それぞれのＭＳＬＮ結合ドメインによって認識された領域をシーケンス表（表２）に示す。上記マウスエピトープクラスターを含むそれぞれのキメラＭＳＬＮ構築物におけるＦＡＣＳシグナルの減損は、それぞれのクラスターの結合への関連度に関する読み取り値であった。ＦＡＣＳシグナルが、２種以上の、それぞれ２種のキメラＭＳＬＮクローンに関して負の影響を受けた場合は、両方のクラスターが関連すると結論付けた。

（表２）ＭＳ−１〜ＭＳ−８に関するエピトープクラスターのマッピング

実施例３
ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、標的抗体陽性細胞上のヒト及びマカクＭＳＬＮに対する親和性のスキャッチャード法に基づく解析及び異種間親和性ギャップの測定
ヒトまたはマカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性を、ヒトＭＳＬＮとマカクＭＳＬＮとの間の潜在的な親和性ギャップを測定するための最も信頼性のある方法として、スキャッチャード解析によって測定することも行った。スキャッチャード解析に関して、それぞれの細胞株に対するＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の１価での結合を正確に測定するために、１価での検出システムを用いて飽和結合実験を行う。

２×１０^４個のそれぞれの細胞株（組換えによってヒトＭＳＬＮを発現するＣＨＯ細胞株、組換えによってマカクＭＳＬＮを発現するＣＨＯ細胞株）を、それぞれ、５０μｌのそれぞれのＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の３倍での段階希釈液（１：２での１２種の希釈液）と共に、１０〜２０ｎＭで開始し、次いで撹拌下、４℃での１６時間のインキュベーション及び１回の残留物の洗浄を行って、（飽和に達するまで）インキュベートした。その後、上記細胞を３０μｌのＣＤ３×ＡＬＥＸＡ４８８複合体溶液と共に更に１時間インキュベートした。1回の洗浄ステップの後、上記細胞を１５０μｌの３．５％ ホルムアルデヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、更に１５分間インキュベートし、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて分析した。２組の独立した実験からデータを得、それぞれの組において３回の繰返し実験を用いた。それぞれのスキャッチャード解析を計算し、最大結合（Ｂｍａｘ）を外挿した。それぞれのＫＤを反映する最大半量の結合におけるＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の濃度を決定した。３回の繰返し測定の値を双曲線及びＳ字曲線としてプロットし、最小結合から最適結合までの範囲を表示させた。

表３に示す値はＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物毎に２種の実験に由来していた。細胞ベースのスキャッチャード解析により、本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物では、ヒトＭＳＬＮ及びマカクＭＳＬＮに対する親和性がナノモル濃度未満であり、該抗体構築物は約１の小さいｃｙｎｏ／ヒト異種間親和性ギャップを示すことが確認された。

（表３）細胞ベースのスキャッチャード解析において決定されたＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性（ＫＤ）及び算出された親和性ギャップ ＫＤマカクＭＳＬＮ／ＫＤヒトＭＳＬＮ。抗体構築物を２種の独立した実験で測定し、それぞれの実験において３回の繰返し実験を用いた。

実施例４
二重特異性結合及び異種間交差反応性
ヒトＭＳＬＮ及びＣＤ３に対するならびにｃｙｎｏ ＭＳＬＮ及びＣＤ３に対する結合の確認のために、本発明の二重特異性抗体構築物を、
・ヒトＭＳＬＮ、ヒトＭＳＬＮアイソタイプ（ＮＭ＿０１３４０４＝配列番号２３２及びＡＹ７４３９２２＝配列番号２３３）、及びマカクＭＳＬＮでそれぞれトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、
・ヒトＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８、
・ＣＤ３発現ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ４８３）、ならびに
・カニクイザルＣＤ３発現Ｔ細胞株ＬｎＰｘ ４１１９
を用いたフローサイトメトリーによって試験した。

フローサイトメトリー用に、２００，０００個のそれぞれの細胞株を、５μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌの精製した二重特異性抗体構築物と共に、４℃で６０分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳ中で２回洗浄し、次いで自家製の、上記二重特異性抗体構築物のＣＤ３結合部分に対して特異的なマウス抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体をヤギ抗マウスＦｃ γ−ＰＥ（１：１００）を用いて４℃で３０分間検出した。試料をフローサイトメトリーによって測定した。未トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として用いた。

結果を図２及び３に示す。本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＭＳＬＮ、人工ＭＳＬＮアイソタイプ及びｃｙｎｏ ＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色し、該抗体構築物はヒトＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８（天然の発現細胞）も染色した。ＣＤ３を発現するヒト及びｃｙｎｏ Ｔ細胞株はまた、上記二重特異性抗体構築物によっても認識された。更に、上記陰性対照細胞（未トランスフェクトＣＨＯ）の染色は起らなかった。

実施例５
細胞傷害活性
本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、エフェクターＴ細胞をＭＳＬＮを発現する標的細胞に対して再指示する効力を、以下の５種のイン・ビトロ細胞傷害性アッセイにおいて分析した：
・ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力を、１８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した。図４及び表４
・ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をＭＳＬＮ陽性細胞株ＯＶＣＡＲ−８に対して再指示する効力を、１８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した。図５及び表５
・ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、可溶性ＭＳＬＮの非存在下及び存在下で、未刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４⁻／ＣＤ５６⁻）中のＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した。図６及び表６
・ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、未刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４⁻／ＣＤ５６⁻）中のＴ細胞をＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８に対して再指示する効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定した。図７
・交差反応性ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＴ細胞をマカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示することができることの確認のために、エフェクターＴ細胞としてマカクＴ細胞株ＬｎＰｘ４１１９を用いた、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイを実施した（エフェクター標的比 １０：１）。図８
・ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体及び二量体のアイソタイプ間の、刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞中のＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力ギャップを、１８時間の^５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比 １０：１）において測定した。図９

実施例５．１
刺激されたヒトＴ細胞を用いたクロム放出アッセイ
ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を富化させた刺激されたＴ細胞を以下に記載するようにして得た。ペトリ皿（１４５ｍｍ径、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ、クレムスミュンスター）を、市販の抗ＣＤ３特異性抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）で、最終濃度１μｇ／ｍｌ、３７℃にて１時間被覆した。未結合のタンパク質を１回のＰＢＳによる洗浄ステップによって除去した。３〜５×１０^７のヒトＰＢＭＣを、１２０ｍｌの、安定化グルタミン／１０％ ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で上記プレコートしたペトリ皿に添加し、２日間刺激を行った。３日目に上記細胞を採取し、ＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、上記細胞を上記と同様の細胞培養培地中で１日間再度培養した。Ｄｙｎａｌ−Ｂｅａｄｓを製造元のプロトコルに従って用いて、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞及びＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞を除去することにより、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を富化させた。

ｃｙｎｏ ＭＳＬＮまたはヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ ＦＣＳを含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中の１１．１ＭＢｑの^５１Ｃｒによって、３７℃で６０分間標識した。その後、上記標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで細胞傷害性アッセイに用いた。上記アッセイは９６穴プレート中、合計容量２００μｌの補充ＲＰＭＩ中、１０：１のＥ：Ｔ比で実施した。０．０１〜１μｇ／ｍｌの開始濃度の精製した二重特異性抗体構築物及びそれらの３倍希釈液を用いた。上記アッセイのためのインキュベーション時間は１８時間であった。細胞傷害性は上清中に放出されたクロムの、最大溶解（トリトン−Ｘの添加）と自発的溶解（エフェクター細胞なし）との差に対する相対的な値として測定される。全ての測定は４回の繰返しで実施した。上清中のクロム活性の測定はＷｉｚａｒｄ ３’’ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ国ケルン）において実施した。結果の解析はＷｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ ５（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて実施した。上記解析プログラムによりシグモイド用量応答曲線から算出したＥＣ５０値を細胞傷害活性の比較に用いた。

実施例５．２
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力
本発明に係るＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、標的細胞としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、且つエフェクター細胞として刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を用いた５１−クロム（^５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて分析した。実験は実施例８．１に記載したようにして実施した。

結果を表４に示す。上記ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して、１桁のピコモル濃度範囲の非常に強力な細胞傷害活性を示した。

（表４）標的細胞としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、且つエフェクター細胞として刺激されたヒトＣＤ８ Ｔ細胞を用いた５１−クロム（^５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて分析したＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］

実施例５．３
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８に対して再指示する効力
ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、標的細胞の供給源としてＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８を、且つエフェクター細胞として刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を用いた５１−クロム（^５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて分析した。アッセイは実施例８．１に記載したようにして実施した

エフェクター細胞として刺激され富化されたヒトＣＤ８＋ Ｔリンパ球を、且つ標的細胞としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた上記５１−クロム放出アッセイの結果によれば、本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、天然の発現標的細胞に対しても細胞傷害活性が強力である（表５を参照のこと。）。

（表５）標的細胞の供給源としてＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８を、且つエフェクター細胞として刺激され富化されたヒトＣＤ８ Ｔ細胞を用いた１８時間の５１−クロム（^５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて分析したＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］

実施例５．４
未刺激のヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、輸血用に血液を収集する血液バンクの副生物である、富化させたリンパ球製剤（バフィーコート）からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法によって調製した。バフィーコートは地元の血液バンクにより供給され、ＰＢＭＣは血液採取の同日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離及びダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）による綿密な洗浄後に、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、１００μＭ ＥＤＴＡ）を用いたインキュベーションにより、ＰＢＭＣから残留した赤血球を除去した。血小板を、１００×ｇでのＰＢＭＣの遠心分離の際の上清により除去した。残留したリンパ球は主としてＢ及びＴリンパ球、ＮＫ細胞及び単球を含む。ＰＢＭＣを、３７℃／５％ ＣＯ_２で、１０％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に保管した。

ＣＤ１４^＋及びＣＤ５６^＋細胞の除去
ＣＤ１４^＋細胞を除去するために、ヒトＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０−０５０−２０１）を用い、ＮＫ細胞を除去するために、ヒトＣＤ５６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０−０５０−４０１）を用いた。ＰＢＭＣの計数を行い、室温で１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離緩衝液［８０μＬ／１０^７個；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２００１２−０４３）、０．５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０−１０６）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ−６５１１）］中に再懸濁させた。ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ及びＣＤ５６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（２０μＬ／１０^７個）を添加し、４〜８℃で１５分間インキュベートした。上記細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（１〜２ｍＬ／１０^７個）で洗浄した。遠心分離（上記を参照のこと。）後に上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μＬ／１０^８個）中に再懸濁させた。次いでＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）を用いてＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を単離した。ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を含まないＰＢＭＣをＲＰＭＩ完全培地、すなわち、１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号Ｓ０１１５）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号Ｋ０２９３）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号Ｌ１６１３）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号Ｌ０４７３）及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号Ａ２２１３）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、カタログ番号ＦＧ１２１５）中、３７℃、インキュベーター中で必要なだけ培養した。

標的細胞の標識
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞融解の分析に対して、蛍光膜色素ＤｉＯＣ_１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｖ２２８８６）を用いて、標的細胞としてのヒトＭＳＬＮまたはマカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標識し、該細胞をエフェクター細胞と区別した。簡単に説明すると、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μＬ／１０^６個）を含有するＰＢＳ中で１０^６個／ｍＬに調整した。３７℃で３分間のインキュベーションの後に、完全ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０^５個／ｍＬに調整した。細胞の生存率を０．５％（ｖ／ｖ）等張性ＥｏｓｉｎＧ溶液（Ｒｏｔｈ、カタログ番号４５３８０）で測定した。

フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイは、ＭＳＬＮ二重特異性抗体構築物の段階希釈液の存在下での、ｃｙｎｏまたはヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の溶解を定量化するために設計した。等容のＤｉＯ標識標的細胞とエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４^＋細胞を含まないＰＢＭＣ）とを混合し、１０：１のＥ：Ｔ細胞比とした。１６０μｌのこの懸濁液を９６穴プレートの各ウェルに移した。４０μｌのＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の段階希釈液及び陰性対照の二重特異性（無関係な標的抗原を認識するＣＤ３ベースの二重特異性抗体構築物）または更なる陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を添加した。７％ ＣＯ_２の加湿したインキュベーター中において４８時間、二重特異性抗体に媒介される細胞傷害反応が進行した。次いで細胞を新しい９６穴プレートに移し、１μｇ／ｍＬの最終濃度でヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加することによって、標的細胞の膜の完全性の減損を監視した。ＰＩは、通常は生存細胞から排除される不浸透性色素である一方、死細胞はこれを取込み、蛍光の発色によって識別可能になる。

試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ装置上でのフローサイトメトリーによって測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（共にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）によって解析した。標的細胞はＤｉＯ陽性細胞として識別した。ＰＩ陰性標的細胞は生存標的細胞として区分した。細胞傷害性のパーセンテージは以下の式に従って算出した。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ）を用いて、上記細胞傷害性のパーセンテージを相当する二重特異性抗体構築物の濃度に対してプロットした。用量応答曲線を、シグノイド用量応答曲線の評価ための４パラメータロジスティック回帰モデルにより、固定した傾斜を用いて解析し、ＥＣ５０値を算出した。

実施例５．５
可溶性ＭＳＬＮの非存在下及び存在下で、未刺激のヒトＰＢＭＣをヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して再指示する効力
ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の上記細胞傷害活性を、標的細胞としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、且つエフェクター細胞として未刺激のヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて分析した。このアッセイは上述の実施例８．４に記載したようにして実施した。

エフェクター細胞として未刺激のヒトＰＢＭＣを、且つ標的としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた上記ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果を表７に示す。

（表６）可溶性ＭＳＬＮの非存在下及び存在下でのヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する未刺激のヒトＰＢＭＣの細胞傷害活性

予想されたように、エフェクター細胞として未刺激のＰＢＭＣを用いた細胞傷害性アッセイにおいては、刺激されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を用いた細胞傷害性アッセイと比較して、ＥＣ５０値は概してより高かった（実施例８．２）。

実施例５．６
ヒトＰＢＭＣをＭＳＬＮ陽性細胞株ＯＶＣＡＲ−８細胞に対して再指示する効力
ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、標的細胞の供給源としてＭＳＬＮ陽性ヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８を、且つエフェクター細胞として未刺激のヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて更に分析した。このアッセイは上述の実施例８．４に記載したようにして実施した。結果を表７に示す。

（表７）エフェクター細胞として未刺激のヒトＰＢＭＣを、且つ標的細胞の供給源としてヒト細胞株ＯＶＣＡＲ−８を用いた４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定したＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］

実施例５．７
マカクＴ細胞をマカクＭＳＬＮ発現ＣＨＯ細胞に対して再指示する効力
ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、標的細胞としてマカク（ｃｙｎｏ）ＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、且つエフェクター細胞の供給源としてマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９５：３２５６−６１ （２０００））を用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて分析した。マカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の標的細胞標識及びフローサイトメトリーに基づく細胞傷害活性の分析は上述のようにして実施した。

結果を表８に示す。細胞株４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞は、本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって誘導されて、マカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を効率的に殺した。

（表８）エフェクター細胞としてマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを、且つ標的細胞としてマカクＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定したＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性のＥＣ５０値［ｐＭ］

実施例５．８
二重特異性抗体構築物の単量体及び二量体アイソタイプ間の効力ギャップ
個々のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体及び二量体アイソタイプ間の細胞傷害活性の相違（効力ギャップという。）を測定するために、精製した二重特異性抗体構築物の単量体及び二量体を用いて、１８時間の５１−クロム放出細胞傷害性アッセイを本明細書に上述（実施例８．１）したようにして実施した。エフェクター細胞は刺激され富化されたヒトＣＤ８ ＋Ｔ細胞であった。標的細胞はヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞であった。標的細胞に対するエフェクター細胞の（Ｅ：Ｔ）比は１０：１であった。上記効力ギャップはＥＣ５０値間の比率として算出した。

エフェクター細胞として刺激され富化されたヒトＣＤ^＋ Ｔ細胞を、且つ標的としてヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた上記アッセイの結果を表９に示す。

（表９）単量体及び二量体のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物を用いた、ヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する未刺激のヒトＰＢＭＣの細胞傷害活性

実施例６
ヒト血漿中での２４時間のインキュベーション後の安定性
精製した二重特異性抗体構築物をヒト血漿プール中、１：５の比、２〜２０μｇ／ｍｌの最終濃度で、３７℃にて９６時間インキュベートした。血漿インキュベーション後に、上記抗体構築物を、刺激され富化されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞及びヒトＭＳＬＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの開始濃度で用い、１０：１の標的細胞に対するエフェクター細胞の（Ｅ：Ｔ）比での５１−クロム放出アッセイ（実施例８．１に記載のアッセイ）において比較した。インキュベートしていない、新たに融解させた二重特異性抗体構築物を対照として含めた。

結果を以下の表１０に示す。全ての被験抗体構築物が非常に良好な血漿安定性（≦４のＥＣ_５０血漿／ＥＣ_５０対照）を有していた。

（表１０）血漿でのインキュベーションの有無における抗体構築物のＥＣ５０値及び血漿／対照の計算値

実施例７
高分解能カチオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質均一性
本発明の抗体構築物のタンパク質均一性を高分解能カチオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸによって分析した。

５０μｇの抗体構築物の単量体を５０ｍｌの結合緩衝液Ａ（２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で希釈し、４０ｍｌのこの溶液を、Ａｋｔａ Ｍｉｃｒｏ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ国）に連結した１ｍｌ ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ−Ｆカラム（ＹＭＣ、ドイツ国）に印加した。試料が結合した後、更なる結合緩衝液を用いた洗浄ステップを行った。タンパク質を溶離させるために、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を最大で緩衝液Ｂが５０％になるまで用いた直線的に増加する塩の勾配をカラム容量の１０倍にわたって印加した。運転全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍにおける吸光度で監視した。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの運転評価シートに記録された２８０ｎｍのシグナルのピークの積分によって行った。

結果を以下の表１１に示す。殆ど全ての被験抗体構築物が≧８０％（主ピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ））の非常に良好な均一性を有する。唯一の例外は、均一性が６７％に過ぎないＭＳ−２×ＣＤ３−ＨＡＬＢ二重特異性構築物である。

（表１１）抗体構築物のタンパク質均一性（主ピークの％表示のＡＵＣ）

実施例８
ＨＩＣブチルによって測定した表面疎水性
本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を、フロースルーモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィー ＨＩＣにおいて試験した。

５０μｇの抗体構築物の単量体を一般的な製剤緩衝液で５００μｌの最終容量に希釈し（１０ｍＭ クエン酸、７５ｍＭ リシンＨＣｌ、４％ トレハロース、ｐＨ７．０）、Ａｋｔａ Ｐｕｒｕｆｉｅｒ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ国）に連結した１ｍｌ Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ国）に印加した。運転全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍにおける吸光度で監視した。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの運転評価シートに記録された２８０ｎｍのシグナルのピークの積分によって行った。タンパク質のシグナルの面積ならびに上昇及び下降の速度を比較することによって溶離挙動を比較し、それによってＢｉＴＥアルブミン融合体のマトリクスとの相互作用の強度が示される。

上記抗体構築物は良好な溶離挙動を有しており、該挙動は殆どが迅速且つ完全であった。表１２を参照のこと。

（表１２）二重特異性抗体構築物の表面疎水性

実施例９
（ｉ）３回の凍結／融解サイクル及び（ｉｉ）２５０μｇ／ｍｌでの７日間のインキュベーション後の単量体から二量体への変換
二重特異性ＭＳＬＮ×ＣＤ３抗体単量体構築物を異なるストレス条件に供し、次に高速ＳＥＣに供して、初期に単量体であり、二量体抗体構築物へと変換した抗体構築物のパーセンテージを測定した。
（ｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を一般的な製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、次いで−８０℃で３０分間凍結させ、その後室温で３０分間融解させた。３回の凍結／融解サイクルの後、二量体含有率をＨＰ−ＳＥＣによって測定した。
（ｉｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を一般的な製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、その後３７℃で７日間インキュベートした。二量体含有率をＨＰ−ＳＥＣによって測定した。

高分解能ＳＥＣカラムＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ、日本国、東京）を、Ａ９０５自動試料供給装置を備えたＡｋｔａ Ｐｕｒｕｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に連結した。カラムの平衡化及び運転緩衝液はｐＨ６．６に調整した１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４から構成されていた。上記抗体溶液（２５μｇのタンパク質）を上記平衡化したカラムに印加し、最大圧力７ＭＰａ、０．７５ｍｌ／分の流速で溶離を行った。運転全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍにおける吸光度で監視した。解析は、Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの運転評価シートに記録された２１０ｎｍのシグナルのピークの積分によって行った。二量体ピークの面積を単量体ピーク＋二量体ピークの合計の面積で除すことによって二量体含有率を算出した。

結果を以下の表１３に示す。本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、３回の凍結／融解サイクル後に０．０％の二量体のパーセンテージを示し、３７℃での７日間のインキュベーション後に≦２，２％の二量体のパーセンテージを示した。

（表１３）高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって測定した単量体対二量体ＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のパーセンテージ

実施例１０
熱安定性
抗体の凝集温度を以下のようにして測定した。４０μｌの、２５０μｇ／ｍｌの抗体構築物溶液を使い捨てキュベット中に移し、Ｗｙａｔｔ動的光散乱装置ＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）中に載置した。この試料を、定常的に径の測定値を取得しながら、４０℃から７０℃まで０．５℃／分の昇温速度で加熱した。上記ＤＬＳ装置と共に提供されたソフトウェアパッケージによって、当該タンパク質の融解及び凝集を示す径の増加を用いて、上記抗体構築物の凝集温度を算出した。

以下の表１４に示すように、全ての本発明のＭＳＬＮ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が≧４９℃の凝集温度の熱安定性を示した。エピトープクラスター２＋３に結合する抗体構築物の群は、≧５１℃、及び最大で５６℃を超える凝集温度すら有していた。

（表１４）ＤＬＳ（動的光散乱）によって測定した本二重特異性抗体構築物の熱安定性

実施例１１
２５００μｇ／ｍｌの抗体濃度における濁度
２５０μｇ／ｍｌの濃度の精製した抗体構築物溶液１ｍｌを、スピン濃縮（ｓｐｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）装置によって２５００μｇ／ｍｌまで濃縮した。５℃で１６時間保存した後、この抗体溶液の濁度を、一般的な製剤緩衝液対比でのＯＤ３４０ｎｍの吸光度測定によって測定した。

結果を以下の表１５に示す。全ての被験抗体構築物が≦０．０９の非常に良好な濁度を有する。

（表１５）終夜の２．５ｍｇ／ｍｌへの濃縮後の抗体構築物の濁度

実施例１２：標的細胞非存在下でのＴ細胞上でのＢｉＴＥ（登録商標）に誘導されるＣＤ６９発現
健常なヒトドナーから単離したＰＢＭＣを、増加していくＣＤＨ１９／ＣＤ３またはＭＳＬＮ／ＣＤ３ ＨＬＥ二重特異性抗体構築物と共に４８時間培養した。Ｔ細胞上での活性化マーカーＣＤ６９発現を免疫染色及びフローサイトメトリーならびに抗原特異性複合体ｍＡｂによって測定した。

ＣＤ６９の上方制御から見た標的非依存性Ｔ細胞の活性化が全ての抗ＣＤＨ １９構築物について認められたが、ヘテロＦｃ及びクロスボディ（ｃｒｏｓｓｂｏｄｙ）分子について最も顕著であった。抗ＣＤＨ１９−ｓｃＦｃによるＣＤ６９の上方制御はより高濃度で起こり、その大きさは他の２種のＦｃベースの構築物と比較して幾分低かった。

抗ＭＳＬＮに関し、ｓｃＦｃ含有分子については標的非依存性Ｔ細胞の活性化が殆ど認められない一方、上記ヘテロＦｃ構築物は、標的細胞非存在下で、Ｔ細胞の表面上においてＣＤ６９の強力な上方制御を誘導した。

Ｃ末端に一本鎖Ｆｃ、またはヘテロ−ＦＣ融合体を含有するＢｉＴＥ（登録商標）構築物によって誘導された標的非依存性Ｔ細胞の活性化を以下の構築物、すなわち、
ＢｉＴＥ（登録商標）構築物（段階希釈液：０．１ｐＭ〜２μＭ）
ａ．ＭＳＬＮ ｓｃＦｃ；１．１４ｍｇ／ｍＬ、
ｂ．ＭＳＬＮ ヘテロＦｃ；１．０２ｍｇ／
ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（３ドナー；＃０６５、＃８２３、＃８３６ （ｓｃＦｃ） ＃４０１、＃４１５、＃４３３（ヘテロＦｃ）；＃５９０、＃５９５、５９８、＃６０５（Ｘ−ボディ））
に関して評価した。
４８時間インキュベーション時間。

フローサイトメトリー及び抗原特異性複合体ｍＡｂによるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現の測定。結果は図１５を参照されたい。

Ｃ末端に一本鎖Ｆｃ、ヘテロ−ＦＣまたはクロスボディ融合体を含有するＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物によって誘導された標的非依存性Ｔ細胞の活性化を以下の構築物、すなわち、
ＢｉＴＥ（登録商標）構築物（段階希釈液：０．１ｐＭ〜２μＭ）
ｃ．ＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ；２４５．３μｇ／ｍＬ（
ｄ．ＣＤＨ１９ ヘテロＦｃ；１ｍｇ／ｍＬ
ｅ．ＣＤＨ１９ Ｘボディ；６．３ｍｇ／ｍＬ
ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（３〜４ドナー；＃３８６、＃３９２、＃４０１ （ｓｃＦｃ） ＃２８２、＃２８４、＃２８７（ヘテロＦｃ）
に関して評価した。
４８時間インキュベーション時間。

フローサイトメトリー及び抗原特異性複合体ｍＡｂによるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現の測定。結果は図１６を参照されたい。

実施例１３
Ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｐｌａｔｅ上に減少していく濃度（１００ｎＭ、１：４希釈）で精製したＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物を被覆した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ／３％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ（３７℃で６０分間）でブロックした後に、プールしたヒト血漿を８０ｒｐｍ、室温で６０分間インキュベートした。３回の洗浄後、ヒトＣ１ｑサブユニットＡ（ＣＣ１ｑ）に特異的なマウスモノクローナル抗体を８０ｒｐｍ、室温で６０分間添加し（Ｔｈｅｒｍｏ ＭＡ１−８３９６３。１：５００）、記載した洗浄ステップの後に、ヤギ抗マウスＦｃ−ＰＯＸ ｍＡｂ（１：５，０００）を８０ｒｐｍ、室温で６０分間インキュベートした。更に洗浄を行った後、ＴＭＢ基質をインキュベートし、発色反応後にＨ_２ＳＯ_４の添加によって停止させた。４５０ｎｍで吸光度を測定した。

結果：図１７に示すように、高濃度において、ＢｉＴＥ（登録商標）ヘテロＦｃ構築物（四角形）は、ＢｉＴＥ（登録商標）一本鎖Ｆｃ構築物（三角形）に比較して、ヒトＣＣ１ｑに対してより高い結合シグナルを示した。陰性対照として、有意なＣＣ１ｑ結合を示さないカノニカルＢｉＴＥ（登録商標）（円）を用いた。

実施例１４：一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）及びヘテロ−Ｆｃ（ｈｅｔＦｃ）タンパク質に融合したＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の薬物動態
種々の標的結合ＢｉＴＥ（登録商標）抗体を、２種の異なる半減期延長部分に融合させた。後にＢｉＴＥ（登録商標）−ｓｃＦｃ及びＢｉＴＥ（登録商標）−ｈｅｔＦｃと命名された、上記ＢｉＴＥ（登録商標）抗体毎に２種の異なるＨＬＥ変異体を、薬物動態学（ＰＫ）的検討の観点で、カニクイザルにおいて試験した。これらの分子の対応する名称を以下の表１６に簡単にまとめる。

（表１６）９種の単回投与したＢｉＴＥ（登録商標）ＨＬＥ抗体構築物の名称

上記ＢｉＴＥ（登録商標）ＨＬＥ抗体構築物を、静脈内ボーラス注射（化合物１ｂ〜５ｂ）及び静脈内注入（化合物１ａ、３０分間かけて）として、それぞれ６μｇ／ｋｇ（化合物２ｂ）、１２μｇ／ｋｇ（化合物２ａ及び３ａ〜５ｂ）及び１５μｇ／ｋｇ（化合物１ａ及び１ｂ）で投与した。上記で命名した化合物のそれぞれに対して少なくとも２〜３頭の１群のカニクイザルを用いた。血液試料を採取し、血清濃度を測定するために血清を調製した。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の血清レベルを、免疫学的アッセイを用いて測定した。ＢｉＴＥ（登録商標）をその標的部分によって捕捉することによって上記アッセイを実施し、上記構築物のＣＤ３結合部分を対象とする抗体を検出に用いた。血清濃度−時間プロファイルを用いてＰＫパラメータを決定した。血液の採取時点を以下の表１７に掲載する。

（表１７）ＰＫ検討時の血液試料採取時点

４対のＢｉＴＥ（登録商標）ＨＬＥ抗体構築物の薬物動態を図１８に例示的に示す。それぞれの対はｓｃＦｃまたはｈｅｔＦｃ延長部分のいずれかに融合させた同一のＢｉＴＥ（登録商標）タンパク質を表わす。全てのタンパク質に関して、ＢｉＴＥ（登録商標）ＨＬＥの投与後に、全てのカニクイザルにおいて全ての時点に対して、血清レベルが定量可能であった。それぞれの単一の被験項目の投与後に、ＰＫプロファイルは二相性の指数関数的な減衰を描く。

薬物動態パラメータを標準的なノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）法を用いて決定した。ノンコンパートメント解析を用いて、以下のＰＫパラメータを見積もった。すなわち、ＡＵＣｉｎｆ（血清濃度−時間曲線下面積）、Ｖｓｓ（定常状態における分布容積）、ＣＬ（全身クリアランス）及び終末ｔ１／２（終末半減期）である。

以下の表１８に、各被験化合物に関する上記ＰＫパラメータを、それぞれｎ＝２及びｎ＝３の平均値としてまとめた。

（表１８）カニクイザルにおける異なるＢｉＴＥ（登録商標）標的バインダー由来のｓｃＦｃ及びヘテロＦｃ変異体の薬物動態学的パラメータ

全体として、−ｓｃＦｃ及び−ｈｅｔＦｃ部分のいずれかに融合させた標的バインダーの種々のＢｉＴＥ（登録商標）ＨＬＥ対に関する上記ＡＵＣｉｎｆは、ＢｉＴＥ（登録商標）標的の状況に応じて、それぞれ、３２９３ｈ＊ｎｇ／ｍＬ〜２４７６９ｈ＊ｎｇ／ｍＬの範囲であった。分析した全てのＨＬＥ融合体が０．４８〜３．６ｍＬ／ｈ／ｋｇの全身クリアランス値を達成した。対応する分布容積は７８〜２６１ｍＬ／ｋｇの範囲であった。

実施例１５
それぞれ精製したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、ＭＳＬＮ−ｈＦｃ、及びＭＳＬＮ−ｓｃＦｃを含有する予め製剤された薬物物質を、１０ｋＤａで分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を行う膜を用いた限外ろ過／透析ろ過によって緩衝液交換した。濃縮原液を添加することによって最終的な製剤を得た。各構築物に対して得られた製剤を表１９に掲載し、これらの製剤は、ｐＨ６．０の、２０ｍＭ リン酸カリウム、１５０ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ） トレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／Ｖ） ポリソルベート８０からなるＫ６０ＲＴｒＴ及びｐＨ４．０の、１０ｍＭ グルタミン酸塩、４％（ｗ／Ｖ） マンニトール、２％（ｗ／Ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／Ｖ） ポリソルベート８０からなるＧ４０ＭＳｕＴを含む。標的タンパク質濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった。製剤したＭＳＬＮ構築物を１ｍＬのＩ型ガラスバイアルに充填し、これにブチルゴム製詮で詮をし、アルミニウム製封止具によって圧着した。充填したバイアルを−２０、５、２５及び３７℃でインキュベートした。各バージョンの１つのバイアルを５回の凍結及び融解（Ｆ／Ｔ）サイクルに供した。目標凍結温度は−２９℃であった。目標融解温度は２℃であった。温度昇降速度はおよそ０．３Ｋ／分であった。

目に見える粒子を、Ｐｈ Ｅｕｒ ２．９．２０に準拠して熟練した測定者によって評価した。バイアル当たりの目に見える粒子の計測数を表７に示す。上記目に見える（１２５μｍより大）タンパク質粒子の数は、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ及びＭＳＬＮ−ｓｃＦｃの両方と比較した場合、ＭＳＬＮ−ｈＦｃに関する数がより大きかった。

（表１９）種々の半減期が延長された抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ＢｉＴＥ（登録商標）構築物を含有するストレスを掛けた及び掛けていない（Ｔ０）試料に関する、バイアル当たりの目に見えるタンパク質性粒子の数。Ｋ６０ＲＴｒＴは２０ｍＭ リン酸カリウム、１５０ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ） トレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／Ｖ） ポリソルベート８０、ｐＨ６．０を含有する製剤を表わす。Ｇ４０ＭＳｕＴは、１０ｍＭ グルタミン酸塩、４％（ｗ／Ｖ） マンニトール、２％（ｗ／Ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／Ｖ） ポリソルベート８０、ｐＨ４．０を含有する製剤を表わす。

上述の試料について、高分子量種（ＨＭＷＳ）のパーセント表示とした含有量を定量するために、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）による分析も行った。ＳＥ−ＵＰＬＣはＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １５０ ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いたＡｃｑｕｉｔｙＨ−Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。カラム温度は２５℃であった。サイズの変異体の分離は０．４ｍＬ／分の流速で一定溶媒法を適用することによって実現した。移動相はｐＨ６．８の１００ｍＭ リン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌで構成されていた。運転時間は合計で６．０分間である。試料を自動試料供給装置内で分析まで８℃に維持した。全量３μｇのタンパク質を注入した。前回の試料の影響（ｃａｒｒｙ ｏｖｅｒ）を回避するために、各試料の後に４０％ アセトニトリルを用いた中間の注入を行った。検出は蛍光発光（２８０ｎｍでの励起、３２５ｎｍでの発光）に基づくものであった。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いてピークの積分を行った。ＨＭＷＳの相対的曲線下面積を報告した（表２０）。

Ｆｃをベースとする構築物は、ストレス条件に対して独立に、製剤変化形Ｇ４０ＭＳｕＴにおいて、Ｋ６０ＲＴｒＴにおけるよりもより低いＨＭＷＳ含有量を示した。Ｇ４０ＭＳｕＴならびにＫ６０ＲＴｒＴ製剤の両方において、ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃはＭＳＬＮ−ｈＦｃよりもより少ないＨＭＷＳを含有していたことが明らかになった。ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃはその好ましい製剤（Ｇ４０ＭＳｕＴ）において、Ｋ６０ＲＴｒＴ中で製剤化したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢよりもＨＭＷＳをより生じ難かった。以前の実験において、この緩衝液は、より酸性のｐＨ値を有する処方と比較した場合、ｈＡＬＢベースの構築物に対して安定化の潜在能力の向上を示した。

（表２０）ＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ストレスを掛けた及び掛けていない（Ｔ０） ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤中のＨＭＷＳ含有量の概要

n.t.＝試験せず

熱ストレス（３７℃でのインキュベーション）後の多くの化学的改変をペプチドマッピングによって監視した。タンパク質試料を酵素的に消化し、得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーを用いて分離した。カラム溶離液を直接質量分析計のイオン源中に注入して上記ペプチドの同定及び定量を行った。

最大の範囲を実現するために、２種の別個の酵素消化を行った。すなわち、1回はトリプシンを用い1回はキモトリプシンを用いた。それぞれの場合において、当該タンパク質を塩化グアニジウムで変性させ、次いでジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した。ＤＴＴ中でのインキュベーションの後に、遊離のシステイン残基を、ヨード酢酸を添加することによってアルキル化した。次いで試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．８へと緩衝液交換して消化した。トリプシン及びキモトリプシンを別個の反応管にそれぞれ１：１０（試料：酵素）で添加した。試料を３７℃で３０分間消化し、トリフルオロ酢酸を添加することによって反応をクエンチした。

５μｇの投入量のそれぞれの消化物を別個に、０．１％（Ｖ／Ｖ） ギ酸（ＦＡ）で平衡化したＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ カタログ番号８５９７００−９０２）逆相カラムに注入した。１５６分間における０．１％ ＦＡ含有９０％ アセトニトリルまでの勾配を用いて、上記タンパク質をＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のエレクトロスプレーイオン源中に直接溶出させた。フルスキャン（解像度 ７０ ０００；スキャン範囲２００〜２０００ｍ／ｚ）に続いて１２種の最も多いイオンの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）（解像度 １７ ５００）を行うｔｏｐ １２法を用いたデータ依存モードでデータを収集した。

社内ソフトウェアを用いて、精密なマススペクトル及びタンデムマススペクトルに基づいてペプチドを同定した。同定を手動で検証した。改変された及び未改変のペプチドの相対量をＰｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、イオン量に基づいて算出した。

ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤において検出された相補性決定領域（ＣＤＲ）及び半減期延長部分（ｈＡＬＢまたはＦｃのいずれか）の化学的改変のパーセンテージを表２１に示す。類似する製剤条件を比較した場合、全体としての化学的改変はｓｃＦｃ構築物が最も少ないことが明らかになった。

（表２１）ペプチドマッピングによって測定した、ストレスを掛けた及び掛けていない（Ｔ０） ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤における化学的改変の概要

n.a.＝適用外；n.t.＝試験せず

実施例１６
実施例１５に記載したようにして製剤したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、−ｓｃＦｃをｐＨジャンプ実験に供した。出発物質の濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった。０．３８ｍＬの容量のそれぞれの出発物質をガラスバイアルに充填した。３７℃における事前調質後に、上記溶液に、２０倍の、０．０９０Ｍ リン酸カリウム、０．４８０Ｍ リン酸ナトリウム（共に二塩基性）、０．０５２Ｍ 塩化カリウム及び２．７６Ｍ ＮａＣｌからなるリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を添加した。上記添加した試料を３７℃で２週間インキュベートした。インキュベーション後にこれらの試料を実施例１５に記載した方法を用いてＳＥ−ＵＰＬＣによって分析し、パーセンテージ表記でのＨＭＷＳの含有量を報告した(表２２)。Ｋ６０ＲＴｒＴ中で製剤した全ての構築物を比較した場合、ＨＭＷＳ含有量は以下の順、すなわちｈＡＬＢ＜ｓｃＦｃ＜ｈＦｃで増加した。ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃはまた、Ｇ４０ＭＳｕＴ中で製剤した場合でも、ＭＳＬＮ−ｈＦｃよりも低いＨＭＷＳ含有量を示した。

（表２２）ＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ストレス（ｐＨジャンプ＋２週間 ３７℃）を掛けたＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤中のＨＭＷＳ含有量の概要

実施例１７
実施例１５に記載したようにして製剤したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃを撹拌ストレスに供した。出発物質の濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった。０．５ｍＬの用量のそれぞれの溶液を適切な０．２２μｍフィルターを通してろ過し、３ｃｃのガラスバイアル中に充填した。これらのバイアルを、撹拌中に中で該バイアルの位置が確実にずれないようにしたプラスチック製の箱の中に載置した。この箱をオービタルシェーカーに載置した。上記試料を５００ｒｐｍで６５時間撹拌した。Ｐｈ Ｅｕｒ ２．９．２０に記載される方法に準拠して目に見える粒子を評価した。この方法は熟練した測定者が実施した。バイアル当たりの目に見える粒子の計測数を表２３に示す。目に見えるタンパク質性粒子はＭＳＬＮ−ｈＦｃ製剤においてのみ認められた。

（表２３）撹拌した試料におけるバイアル当たりの目に見えるタンパク質性粒子の数

上記試料について、パーセンテージ表記での高分子量種（ＨＭＷＳ）の含有量を定量するために、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）による分析も行った。実施例１５に記載したものと同様の方法を適用した。撹拌した試料のＨＭＷＳ含有量の概要を表２４に示す。Ｋ６０ＲＴｒＴ製剤を比較した場合、ＨＭＷＳの生成はＭＳＬＮ−ｈＦｃにおいて最も顕著であった。Ｆｃベースの構築物に関しては、製剤のｐＨを低下させることによって（Ｇ４０ＭＳｕＴ）、ＨＭＷＳ含有量を低減することができた。但し、ここでもまた、ＨＭＷＳはＭＳＬＮ−ｓｃＦｃの場合よりもＭＳＬＮ−ｈＦｃの場合により多かった。

（表２４）ＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ストレスを掛けた（ｐＨジャンプ＋２週間 ３７℃）ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤中のＨＭＷＳ含有量の概要

実施例１７
実施例１５に記載したようにして製剤したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃを可視光及びＵＶＡ光に曝露した（光ストレス）。全ての製剤においてタンパク質濃度は合計で１ｍｇ／ｍＬであった。タンパク質溶液を細孔サイズ０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、０．５ｍＬのＩ型ガラスバイアルに充填した。ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ及び−ｓｃＦｃを、それぞれ０．２ＭＬｕｘの可視光／２５Ｗ＊ｈ／ｍ^２のＵＶＡ光及び１．２ＭＬｕｘの可視光／１７３Ｗ＊ｈ／ｍ^２を含む２種の異なる試験に供した。ＭＳＬＮ−ｈＦｃを、それぞれＵＶＡ光なしの０．２ＭＬｕｘの可視光及び１．２ＭＬｕｘの可視光／３０Ｗ＊ｈ／ｍ^２のＵＶＡ光を含む２種の異なる試験に供した。チャンバ温度は２５℃に調整した。光曝露後に、試料を目視検査（表２５）、ＳＥ−ＵＰＬＣ（表２６）及びペプチドマップ（表２７）によって分析した。上述の方法を実施例１５に記載した手順に従って実施した。ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、及び−ｓｃＦｃは高照射量のＵＶＡ光に曝露したにもかかわらず、可視タンパク質性粒子は認められなかった一方、ＭＳＬＮ−ｈＦｃ試料は製剤に無関係に両方の試験についてバイアル当たり１個の可視タンパク質性粒子を示した。

（表２５）光曝露後に測定した、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤におけるバイアル当たりの可視タンパク質性粒子の数の概要

^１）０．２ＭＬｕｘの可視光／２５Ｗ＊ｈ／ｍ^２のＵＶＡ光、^２）ＵＶＡ光なしの０．２ＭＬｕｘの可視光、^３）１．２ＭＬｕｘの可視光／１７３Ｗ＊ｈ／ｍ^２、^４）１．２ＭＬｕｘの可視光／３０Ｗ＊ｈ／ｍ^２

上記タンパク質をＫ６０ＲＴｒＴ中で製剤した場合、ＨＭＷＳは以下の順、すなわちＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ＜−ｓｃＦｃ＜−ｈＦｃで増加した。Ｆｃベースの構築物に関しては、Ｇ４０ＭＳｕＴ中で製剤した場合にＨＭＷＳを低減することができた。但し、ここでもまた、ＨＭＷＳはＭＳＬＮ−ｓｃＦｃの場合により顕著でなかった。ＭＳＬＮ−ｈＦｃが特にＵＶＡ光曝露に対して敏感であることが明らかになった。

（表２６）光曝露後にＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤中のＨＭＷＳ含有量の概要

^１）０．２ＭＬｕｘの可視光／２５Ｗ＊ｈ／ｍ^２のＵＶＡ光、^２）ＵＶＡ光なしの０．２ＭＬｕｘの可視光、^３）１．２ＭＬｕｘの可視光／１７３Ｗ＊ｈ／ｍ^２、^４）１．２ＭＬｕｘの可視光／３０Ｗ＊ｈ／ｍ^２

ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤において検出された相補性決定領域（ＣＤＲ）及び半減期延長部分（ｈＡＬＢまたはＦｃのいずれか）の化学的改変のパーセンテージを表２７に示す。類似する製剤条件を比較した場合、全体としての化学的改変はｓｃＦｃ構築物が最も少ないことが明らかになった。

（表２７）光曝露後にペプチドマッピングによって測定した、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、−ｈＦｃ、及び−ｓｃＦｃ製剤における化学的改変の概要

n.a.＝適用外、n.t.＝試験せず

実施例１８
実施例１５に記載した手順に従って、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢをＫ６０ＲＴｒＴ中で製剤し、ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃをＧ４０ＭＳｕＴ中で製剤した。タンパク質濃度は合計で０．０５ｍｇ／ｍＬであった。ガラス製（ホウケイ酸ガラス、Ｉ型、１３ｍｍ ３ｃｃバイアル、Ｗｅｓｔ、商品番号６８０００３７５）及びポリプロピレン製試験容器（２ｍＬ、Ｏ−リング付、例えばＳａｒｓｔｅｄｔ、商品番号７２．６９４．００５）に５００μＬの被験溶液を充填する。この被験溶液を第１の試験容器中で５分間静置した。次いで１５０μＬのアリコートを採取して分析を行った。残余の被験溶液（３５０μＬ）を、1つの試験容器から次の容器へと（合計で５つの容器）逐次移していった。各バイアルにおいて、該溶液を５分間静置し、その後次に移した。各移動ステップには同一のピペットチップを用いた。同様の試験を３０ｍＬのポリカーボネート製のビン（Ｎａｌｇｅｎｅ、ＰＣＳ−０００２９５ 栓付き、ＰＰ／２０−４１５／ＺＴＰＥ）を用いて実施した。この容器のタイプについては、第１の容器に５ｍＬを充填した。１５０μＬのアリコートを採取し、残余の容量を１つの試験容器から次の容器へと（上述の手順に従って）移した。第１の容器及び第５の容器から試料を抜き出してＳＥ−ＵＰＬＣによって分析した（方法は実施例１５に記載のとおり）。更に、タンパク質濃度を測定するために、ＰＤＡ検出器（２８０ｎｍ）を用いてタンパク質の検出を行った。各試験容器からの、パーセンテージ表記でのタンパク質回収率を表２８に示す。容器のタイプに無関係に、ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃに関するタンパク質回収率はＭＳＬＮ−ｈＡＬＢに関する回収率よりも際立っていることが明らかになった。

（表２８）ＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、及び−ｓｃＦｃに関する異なる容器のタイプからのタンパク質回収率

実施例１９
実施例１５に記載した手順に従って、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢをＫ６０ＲＴｒＴ中で製剤し、ＭＳＬＮ−ｓｃＦｃをＫ６０ＲＴｒＴ及びＧ４０ＭＳｕＴ中で製剤した。タンパク質濃度は合計で１．０ｍｇ／ｍＬであった。１９５０μＬの核被験溶液に５０μＬの、１０００ｐｐｍのケイ素標準溶液（Ｓｐｅｃｐｕｒｅ、ＡｌｆａＡｅｓａｒ、商品番号３８７１７）を添加し、２５ｐｐｍの添加とした。未添加の被験溶液は対照試料としての役割を果たした。添加した試料溶液ならびに上記対照試料を３ｃｃのＩ型ガラスバイアル中に充填し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＨＭＷＳの量を定量するために、実施例１５に記載した方法に従って全ての試料をＳＥ−ＵＰＬＣによって分析した(表２９)。Ｋ６０ＲＴｒＴ及び中で製剤した場合、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ及び−ｓｃＦｃは、ケイ素添加に際してＨＭＷＳの類似した増加を示した。ｓｃＦｃに関しては、製剤のｐＨを４．０に低下させることによってこの増加を低減することができることを明らかにすることができた。予備実験によれば、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢに関してはこの手法は実施可能性がない。というのは、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢは、５．０以下の製剤のｐＨ値において分解を受けることが明らかになったことによる。

（表２９）２５ｐｐｍのケイ素の添加後にＳＥ−ＵＰＬＣによって測定した、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ、及び−ｓｃＦｃ製剤中のＨＭＷＳ含有量の概要

（表３０）配列表

したがって、第１の態様において、本発明は、標的細胞の表面上のヒトＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築物であって、第１の結合ドメインが、配列番号２３１、２３２、及び２３３に示されるＭＳＬＮ変異体内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合し、且つ配列番号２３４に示されるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＳＬＮにも結合する、二重特異性抗体構築物を提供する。
[本発明1001]
標的細胞の表面上のヒト及びマカクＭＳＬＮに結合する第1の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ3に結合する第2の結合ドメインとを含む、二重特異性抗体構築物であって、第1の結合ドメインが、配列番号231、232、及び233に示されるＭＳＬＮ変異体内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合し、且つ配列番号234に示されるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＳＬＮにも結合する、前記二重特異性抗体構築物。
[本発明1002]
第2の結合ドメインが、ヒトＣＤ3イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ3イプシロンに結合する、本発明1001の抗体構築物。
[本発明1003]
（ｓｃＦｖ） ₂ 、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びこれらのフォーマットのオリゴマーからなる群より選択されるフォーマットである、先行本発明のいずれかの抗体構築物。
[本発明1004]
第1の結合ドメインが、配列番号244、配列番号245、及び配列番号241からなる群より選択される配列番号に示される配列を有するヒトＭＳＬＮの領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する、先行本発明のいずれかの抗体構築物。
[本発明1005]
第1の結合ドメインが、
ａ）配列番号151に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号152に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号153に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号154に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号155に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号156に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｂ）配列番号161に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号162に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号163に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号164に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号165に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号166に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｃ）配列番号171に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号172に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号173に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号174に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号175に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号176に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｄ）配列番号181に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号182に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号183に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号184に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号185に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号186に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｅ）配列番号191に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号192に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号193に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号194に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号195に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号196に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｆ）配列番号201に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号202に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号203に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号204に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号205に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号206に示されるＣＤＲ−Ｌ3；
ｇ）配列番号211に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号212に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号213に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号214に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号215に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号216に示されるＣＤＲ−Ｌ3；ならびに
ｈ）配列番号221に示されるＣＤＲ−Ｈ1、配列番号222に示されるＣＤＲ−Ｈ2、配列番号223に示されるＣＤＲ−Ｈ3、配列番号224に示されるＣＤＲ−Ｌ1、配列番号225に示されるＣＤＲ−Ｌ2及び配列番号226に示されるＣＤＲ−Ｌ3
からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2及びＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2及びＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬ領域を含む、本発明1004の抗体構築物。
[本発明1006]
第1の結合ドメインが、配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、及び配列番号227に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む、本発明1004または1005の抗体構築物。
[本発明1007]
第1の結合ドメインが、配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、及び配列番号228に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む、本発明1004〜1006のいずれかの抗体構築物。
[本発明1008]
第1の結合ドメインが、配列番号157＋158、配列番号167＋168、配列番号177＋178、配列番号187＋188、配列番号197＋198、配列番号207＋208、配列番号217＋218、及び配列番号227＋228に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、本発明1004〜1007のいずれかの抗体構築物。
[本発明1009]
第1の結合ドメインが、配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、本発明1004〜1008のいずれかの抗体構築物。
[本発明1010]
（ａ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号10に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド；
（ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号104〜134からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号10に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド；
（ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・アミノ酸配列

（配列中、Ｘ ₁ はＹまたはＨである）
を有するポリペプチドと、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・アミノ酸配列

を有するポリペプチドと、
・任意選択で、配列番号10に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
を含むポリペプチド；
（ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号17、配列番号26、配列番号35、配列番号44、配列番号53、配列番号62、配列番号71、配列番号80、配列番号89、配列番号98、及び配列番号101からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、及び配列番号228からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号140に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、及び配列番号227からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号18、配列番号27、配列番号36、配列番号45、配列番号54、配列番号63、配列番号72、配列番号81、配列番号90、配列番号99、及び配列番号102からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号141に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；
（ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号17、配列番号26、配列番号35、配列番号44、配列番号53、配列番号62、配列番号71、配列番号80、配列番号89、配列番号98、及び配列番号101からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、及び配列番号228からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号142に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、及び配列番号227からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号18、配列番号27、配列番号36、配列番号45、配列番号54、配列番号63、配列番号72、配列番号81、配列番号90、配列番号99、及び配列番号102からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
・配列番号143に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；
（ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号144に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号145に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；
（ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号146に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号147に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；
（ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号148に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号149に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド；または
（ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
・配列番号150に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
を含むポリペプチド
を含む、本発明1001〜1007のいずれかの抗体構築物。
[本発明1011]
Ｎ末端からＣ末端への順で、
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第1の結合ドメインと、
・配列番号2、8及び9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103（ＷＯ 2008／119567の配列番号23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185または187も参照のこと）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第2の結合ドメインと、
・配列番号1、2、4、5、6、8及び9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号260〜267からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインと
を含む、本発明1001〜1009のいずれかの抗体構築物。
[本発明1012]
配列番号276〜287からなる群より選択される配列を含む、本発明1011の抗体構築物。
[本発明1013]
マカクＭＳＬＮ／ヒトＭＳＬＮに対する第1の結合ドメインの結合親和性の比率（スキャッチャード解析において測定）が、＜100、好ましくは＜20、より好ましくは＜15、更に好ましくは＜10、一層より好ましくは＜8、より好ましくは＜6、最も好ましくは＜2である、本発明1001〜1012のいずれかの抗体構築物。
[本発明1014]
先行本発明のいずれかに規定される抗体構築物をコードするポリヌクレオチド。
[本発明1015]
本発明1014に規定されるポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1016]
本発明1014に規定されるポリヌクレオチドによってまたは本発明1015に規定されるベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
[本発明1017]
本発明1016に規定される宿主細胞を、本発明1001〜1013のいずれかに規定される抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養すること、及び産生された抗体構築物を培養物から回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの抗体構築物の製造方法。
[本発明1017]
本発明1001〜1014のいずれかの抗体構築物または本発明1017の方法に従って製造された抗体構築物を含む、医薬組成物。
[本発明1019]
固形腫瘍疾患または転移性がん疾患の予防、治療または改善に使用するための、本発明1001〜1013のいずれかの抗体構築物または本発明1017の方法に従って製造された抗体構築物。
[本発明1020]
固形腫瘍疾患または転移性がん疾患の治療または改善方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1013のいずれかの抗体構築物または本発明1017の方法に従って製造された抗体構築物を投与するステップを含む、前記方法。
[本発明1021]
前記固形腫瘍疾患が、卵巣がん、膵臓がん、中皮腫、肺がん、胃がん及びトリプルネガティブ乳がん疾患からなる群より選択されるか、または前記のいずれかに由来する転移性がん疾患である、本発明1020の方法または本発明1019の抗体構築物。
[本発明1022]
本発明1001〜1013のいずれかの抗体構築物、本発明1017の方法に従って製造された抗体構築物、本発明1014に規定されるポリヌクレオチド、本発明1015に規定されるベクター、及び／または本発明1016に規定される宿主細胞を含む、キット。

Claims (22)

1. 標的細胞の表面上のヒト及びマカクＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインとを含む、二重特異性抗体構築物であって、第１の結合ドメインが、配列番号２３１、２３２、及び２３３に示されるＭＳＬＮ変異体内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合し、且つ配列番号２３４に示されるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＳＬＮにも結合する、前記二重特異性抗体構築物。
2. 第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１に記載の抗体構築物。
3. （ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びこれらのフォーマットのオリゴマーからなる群より選択されるフォーマットである、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
4. 第１の結合ドメインが、配列番号２４４、配列番号２４５、及び配列番号２４１からなる群より選択される配列番号に示される配列を有するヒトＭＳＬＮの領域内に含まれるＭＳＬＮのエピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
5. 第１の結合ドメインが、
   ａ）配列番号１５１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｂ）配列番号１６１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１６３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１６６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｃ）配列番号１７１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１７３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｄ）配列番号１８１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１８３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１８４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｅ）配列番号１９１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１９３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１９４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｆ）配列番号２０１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２０２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２０３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２０４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
   ｇ）配列番号２１１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２１３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２１４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１６に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
   ｈ）配列番号２２１に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２２に示されるＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２２３に示されるＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２２４に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２５に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２６に示されるＣＤＲ−Ｌ３
   からなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項４に記載の抗体構築物。
6. 第１の結合ドメインが、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含む、請求項４または５に記載の抗体構築物。
7. 第１の結合ドメインが、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体構築物。
8. 第１の結合ドメインが、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、及び配列番号２２７＋２２８に示されるＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
9. 第１の結合ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９に示されるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
10. （ａ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
    を含むポリペプチド；
    （ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・任意選択で、配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１０４〜１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
    を含むポリペプチド；
    （ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・アミノ酸配列
    

    

    （配列中、Ｘ_１はＹまたはＨである）
    を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・アミノ酸配列
    

    

    を有するポリペプチドと、
    ・任意選択で、配列番号１０に示されるＨｉｓタグなどのＨｉｓタグと
    を含むポリペプチド；
    （ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；ならびに
    Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；
    （ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、及び配列番号２２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；ならびに
    Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、及び配列番号２２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびにＣ末端におけるセリン残基を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；
    （ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；
    （ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；ならびに
    Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；
    （ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；ならびに
    Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド；または
    （ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
    ・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
    を含むポリペプチド
    を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
11. Ｎ末端からＣ末端への順で、
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合ドメインと、
    ・配列番号２、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３（ＷＯ ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７も参照のこと）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合ドメインと、
    ・配列番号１、２、４、５、６、８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
    ・配列番号２６０〜２６７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメインと
    を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体構築物。
12. 配列番号２７６〜２８７からなる群より選択される配列を含む、請求項１１に記載の抗体構築物。
13. マカクＭＳＬＮ／ヒトＭＳＬＮに対する第１の結合ドメインの結合親和性の比率（スキャッチャード解析において測定）が、＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、更に好ましくは＜１０、一層より好ましくは＜８、より好ましくは＜６、最も好ましくは＜２である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体構築物。
14. 先行請求項のいずれか１項に規定される抗体構築物をコードするポリヌクレオチド。
15. 請求項１４に規定されるポリヌクレオチドを含むベクター。
16. 請求項１４に規定されるポリヌクレオチドによってまたは請求項１５に規定されるベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
17. 請求項１６に規定される宿主細胞を、請求項１〜１３のいずれか１項に規定される抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養すること、及び産生された抗体構築物を培養物から回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体構築物の製造方法。
18. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項１７の方法に従って製造された抗体構築物を含む、医薬組成物。
19. 固形腫瘍疾患または転移性がん疾患の予防、治療または改善に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項１７の方法に従って製造された抗体構築物。
20. 固形腫瘍疾患または転移性がん疾患の治療または改善方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項１７の方法に従って製造された抗体構築物を投与するステップを含む、前記方法。
21. 前記固形腫瘍疾患が、卵巣がん、膵臓がん、中皮腫、肺がん、胃がん及びトリプルネガティブ乳がん疾患からなる群より選択されるか、または前記のいずれかに由来する転移性がん疾患である、請求項２０に記載の方法または請求項１９に記載の抗体構築物。
22. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体構築物、請求項１７の方法に従って製造された抗体構築物、請求項１４に規定されるポリヌクレオチド、請求項１５に規定されるベクター、及び／または請求項１６に規定される宿主細胞を含む、キット。

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