JP2018517413A - ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(b)二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ/鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ/ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(c)NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(d)リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(e)酢酸キナーゼをコードするackA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(f)フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(g)アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強、
(h)アラニンレダクターゼをコードするdadX遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(i)アラニントランスポーターをコードするygaW遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強、
(j)Zリングアセンブリに関与する細胞***タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強、並びに
(k)リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするlpd遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強
(ここで、遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制、欠失、増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される)
の群より選択される特徴の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、よりさらに好ましくは少なくとも5つ、よりさらに好ましくは少なくとも6つ、よりさらに好ましくは少なくとも7つ、よりさらに好ましくは少なくとも8つ、最も好ましくは全てをさらに有する。
(i) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、
(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号2を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
上で定義した変異型遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は発酵におけるアラニン収量の改善を有する。
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、
(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号46を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
上で定義した変異型遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は発酵におけるアラニン収量の改善を有する。
(i) 配列番号53の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号53の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号53を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号54のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号54のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、
(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号54を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
上で定義した変異型遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は発酵におけるアラニン収量の改善を有する。
(i) 配列番号58の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号58の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号58を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
の群から選択され、
(ii)、(iii)又は(v)によりコードされる非タンパク質コードRNAは、配列番号58を有する非タンパク質コードRNAの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
上で定義した変異型遺伝子を含む微生物は発酵におけるアラニン収量の改善を有する。
(i) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、
ここで配列番号49の43〜45位に対応する(i)〜(v)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の15位に対応する(i)〜(v)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、
(1)〜(5)において上で定義した遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して活性及び/又は発現が改変されており、
上で定義された変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵においてアラニン収量の改善を有する。
pflB遺伝子は、以下の核酸分子:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(C) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(B)、(C)又は(E)によりコードされるポリペプチドは、配列番号6を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
adhE遺伝子は、以下の核酸分子:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(H) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(G)、(H)又は(J)によりコードされるポリペプチドは、配列番号8を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
ldhA遺伝子は、以下の核酸分子:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(M) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(L)、(M)又は(O)によりコードされるポリペプチドは、配列番号10を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
pta遺伝子は、以下の核酸分子:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(R) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(Q)、(R)又は(T)によりコードされるポリペプチドは、配列番号12を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
ackA遺伝子は、以下の核酸分子:
(U) 配列番号120の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号120の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(W) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号120を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号121のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号121のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(V)、(W)又は(Y)によりコードされるポリペプチドは、配列番号121を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
frdA遺伝子は、以下の核酸分子:
(Z) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(BB) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(AA)、(BB)又は(DD)によりコードされるポリペプチドは、配列番号14を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
alaD遺伝子は、以下の核酸分子:
(EE) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(FF) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(GG) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(HH) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(II) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(FF)、(GG)又は(II)によりコードされるポリペプチドは、配列番号16を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
dadX遺伝子は、以下の核酸分子:
(JJ) 配列番号118の配列を含む核酸分子、又は
(KK) 配列番号118の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(LL) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号118を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(MM) 配列番号119のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(NN) 配列番号119のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(KK)、(LL)又は(NN)によりコードされるポリペプチドは、配列番号119を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
ygaW遺伝子は、以下の核酸分子:
(OO) 配列番号109の配列を含む核酸分子、又は
(PP) 配列番号109の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(QQ) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号109を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(RR) 配列番号110のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(SS) 配列番号110のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(PP)、(QQ)又は(SS)によりコードされるポリペプチドは、配列番号110を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
zipA遺伝子は、以下の核酸分子:
(TT) 配列番号111の配列を含む核酸分子、又は
(UU) 配列番号111の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(VV) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号111を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(WW) 配列番号112のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(XX) 配列番号112のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(UU)、(VV)又は(XX)によりコードされるポリペプチドは、配列番号112を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
lpd遺伝子は、以下の核酸分子:
(YY) 配列番号113の配列を含む核酸分子、又は
(ZZ) 配列番号113の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(AAA) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号113を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(BBB) 配列番号114のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(CCC) 配列番号114のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(ZZ)、(AAA)又は(CCC)によりコードされるポリペプチドは、配列番号114を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
(1) 配列番号115若しくは116の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号115若しくは116の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号115若しくは116を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号115若しくは116を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドの断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドの断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号115若しくは116の断片は、配列番号115若しくは116の3’領域を含む断片であり、したがって配列番号115若しくは116の5’末端に欠失を含む。
1〜5g、好ましくは3.5gのKH2PO4、及び
1〜10g、好ましくは5.0gのK2HPO4、及び
1〜5g、好ましくは3.5gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜1g、好ましくは0.25gのMgSO4-7H2O、及び
5〜25mg、好ましくは15mgのCaCL2-2H2O、及び
0.1〜1mg、好ましくは0.5mgのチアミン、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.1M HCLの1リットル当たり、0.5〜5g、好ましくは1.6gのFeCL3-6H2O;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのCoCl2-6H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.1gのCuCl2-2H2O;0.1〜0.5g、好ましくは0.2gのZnCl2;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのNaMoO4-2H2O;0.001〜0.1g、好ましくは0.05gのH3BO3を含む。
1〜10g、好ましくは2.6gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜5g、好ましくは0.87gのNH4H2PO4、及び
0.05〜2.5g、好ましくは0.15gのKCl、及び
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.12M HCLの1リットル当たり、1〜5g、好ましくは2.4gのFeCL3-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのCoCl2-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.21gのCuCl2-2H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのZnCl2;0.1〜1g、好ましくは0.27gのNaMoO4-2H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.068gのH3BO3及び0.1〜1g、好ましくは0.5gのMnCl2-4H2Oを含み、場合により1〜30g、好ましくは15gの(NH4)2SO4を含んでもよい。
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜10g、好ましくは1gの(NH4)2SO4、及び
0.05〜5g、好ましくは0.46gのベタイン、及び
0.001〜0.5g、好ましくは0.05gのシアノコバラミン(B12)、及び
1〜10g、好ましくは3.74gのKH2PO4、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、10〜100mM、好ましくは60mM硫酸の1リットル当たり、1〜10g、好ましくは3.48gの(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.35gのCoSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.31gのCuSO4-5H2O;0.1〜5g、好ましくは0.63gのZnSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.27gのMnSO4-H2O;0.01〜1g、好ましくは0.07gのNaMoO4-2H2O及び0.1〜5g、好ましくは0.43gのH3BO3を含む。
(I) i) 微生物において、brnQ遺伝子又は上の(i)〜(v)で定義されているようなものの1以上の活性及び/又は発現を低減、抑制又は欠失する、並びに/あるいは ii) 上の(i)〜(v)で定義されているようなargP遺伝子の1以上の活性及び/又は発現を導入、増大又は増強する、並びに/あるいは iii) 上の(i)〜(v)で定義されているようなgcvA遺伝子の1以上の活性及び/又は発現を導入、増大又は増強する、並びに/あるいは iv) 上の(i)〜(v)で定義されているようなgcvB遺伝子の1以上の活性及び/又は発現を低減、抑制又は欠失する、並びに/あるいは v) 上の(i)〜(v)に定義されているようなlpxD遺伝子の活性を改変するステップと、
(II) 上の(I)で定義された改変を有しない対応する微生物と比較して、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び/又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量又は生産性が増強された組換え微生物を作出、同定及び単離するステップと
を含む方法である。
(1) 配列番号115若しくは116の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号115若しくは116の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号115若しくは116を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号115若しくは116を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドの断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドの断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号115若しくは116の断片は、配列番号115若しくは116の3’領域を含む断片、したがって配列番号115若しくは116の5’末端に欠失を含む断片である。
(I) 発酵槽中で上で定義した本発明に係る微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び/又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは L-アラニンを回収するステップ
を含む方法である。
同化可能な炭素源:グルコース
温度:30〜45℃
pH:6.0〜7.0
微好気的条件
である。
(6) 配列番号3の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号3の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号3を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号4のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号4のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質(但し野生型遺伝子及び/又はタンパク質ではない)を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(1) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号45の286〜288位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の96位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強又は増大した活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(6) 配列番号47の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号47の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号47を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号48のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号47の286〜288位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミン酸又は関連するアミノ酸をコードするか、又は配列番号48の96位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミン酸又は関連するアミノ酸であり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号48を有するタンパク質と比較して増強又は増大した活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(11) 配列番号53の配列を含む核酸分子、又は
(12) 配列番号53の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(13) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号53を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(14) 配列番号54のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(15) 配列番号54のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を含む組換え核酸分子であって、
上記核酸分子とは異種の変異型プロモーター又は微生物において活性を有するプロモーターと機能的に連結されており、
上で定義した過剰発現の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(16) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(17) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(18) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(19) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(20) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号49の43〜45位に対応する(16)〜(20)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の15位に対応する(6)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、
上で(16)〜(20)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して改変された発現及び/又は活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(21) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(22) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(23) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号51を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(24) 配列番号52のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(25) 配列番号52のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号51の43〜45位に対応する(21)〜(25)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸スレオニン又は関連するアミノ酸をコードするか、あるいは配列番号52の15位に対応する(21)〜(25)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がスレオニン又は関連するアミノ酸であり、
上で(21)〜(25)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して改変された活性及び/又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(26) 配列番号4の配列を含むアミノ酸分子、又は
(27) 配列番号4のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
上で定義した変異型のタンパク質(但し野生型タンパク質ではない)を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(28) 配列番号48の配列を含むアミノ酸分子、又は
(29) 配列番号48のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号48の96位に対応する(29)に属するタンパク質のアミノ酸がグルタミン酸又は関連するアミノ酸であり、
上で(29)に定義されるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型のタンパク質(但し野生型タンパク質ではない)を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(30) 配列番号52の配列を含むアミノ酸分子、又は
(31) 配列番号52のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号52の15位に対応する(31)に属するタンパク質のアミノ酸がスレオニン又は関連するアミノ酸であり、
上で(31)に定義されるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して改変された活性及び/又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
理解すべきこととして、本発明は特別な手法又はプロトコルに限定されるものでない。理解すべきこととしてまた、本明細書で使用する用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、添付した特許請求の範囲によって限定されうる本発明の範囲を限定することを意図しない。注意しなければならないこととして、本明細書及び添付した特許請求の範囲における使用で、単数形の冠詞「a」「an」及び「the」は、文脈が明確に断らない限り、複数の言及を含むものである。従って、例えば、ベクター(a vector)は1以上のベクターへの言及であり、当業者に公知のその等価物などを含むものである。本明細書で使用する用語「約」は、およそ、大雑把に、大体、又はその範囲のを意味する。用語「約」を数字の範囲と共に用いる場合、この用語は記載した数値の上限及び下限の境界を拡げることにより範囲を改変する。一般に、本明細書では用語「約」を用いて、記載した値の上限及び下限の数値を20%、好ましくは10%上方若しくは下方(高い若しくは低い)の変動によって値を改変する。本明細書で使用する用語「又は(若しくは、あるいは)」は特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含むものである。用語「含む(compriseとその変化形)」「含む(includeとその変化形)」は、本明細書及び以下の特許請求の範囲で使用する場合、1以上の記載した特徴、整数、成分、又はステップの存在を説明することを意図するが、これらの用語は他の特徴、整数、成分、又はステップ、又はその群の存在若しくは付加を排除するものではない。明確にするために述べると、本明細書に使用するある特定の用語は次の通り定義されかつ使用される。
好ましくは少なくとも150、よりさらに好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子に対して、50℃における7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと50℃(中程度ストリンジェンシー)又は65℃(高ストリンジェンシー)における1X SSC、0.1%SDS中での洗浄である。他の好適なハイブリダイゼーション条件は、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、よりさらに好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子に対して、50℃における7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと65℃における0.1X SSC、0.1%SDS中での洗浄である(非常に高度なストリンジェンシー)。
特に示さない限り、制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、形質転換、細菌細胞の選択及び培養をはじめとする、本発明の目的のために行なわれるクローニング手順は、記載される通りに行なわれる(Sambrook et al., 1989)。組換えDNAの配列分析は、Sangerの技術(Sanger et al., 1977)を用いて、レーザー蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行なわれる。特に記載しない限り、化学物質及び試薬は、Sigma Aldrich社(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)、Promega社(Madison, WI, USA)、Duchefa社(Haarlem, The Netherlands)又はInvitrogen社(Carlsbad, CA, USA)から入手される。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社(Ipswich, MA, USA)又はRoche Diagnostics GmbH(Penzberg, Germany)からのものである。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon社(Ebersberg, Germany)により合成される。
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFの不活性化並びにalaD遺伝子のコドン最適化変異体(alaD-gstear)によるldhA ORFの置換により、L-アラニン産生に関して大腸菌W株(LU17032)を遺伝子操作した。
細菌培養
大腸菌W株(LU17032)は、Luria-Bertani(LB)液体培地中又はLuria-Bertani固体培地上で培養した。時折、W株の同一性を確認するために、10mMスクロースを含有するM9最小寒天上にクローンを継代した。抗生物質を、15μg/mL(カナマイシン、クロラムフェニコール)、25μg/mL(ゼオシン)又は3μg/mL(テトラサイクリン)の最終濃度まで、適宜、液体培地及び固体培地に添加した。
Red/ET組換えは、Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)の標準的プロトコールを用いて行なった。簡潔には、Red/ET能の高い大腸菌W株を、30℃にて、OD600nmが約0.3になるまで好気的に増殖させた。red遺伝子の発現は、50μLの10%(w/v) L-アラビノースの添加及びそれに続く37℃までの温度上昇により誘導した。アラビノースは、非誘導対照培養では省略した。37℃での35分間のインキュベーション後、細胞を、氷冷10%(v/v)グリセロールを用いて2回洗浄し、1.35kV、10μF、600Ωで500ngのPCR産物を用いてエレクトロポレーションした。次に、細胞を1mL氷冷LB培地中に再懸濁し、約1.5時間、37℃にて好気的に増殖させた。次に、培養物を、15μg/mLカナマイシン(ノックアウト)又は25μg/mLゼオシン(ノックイン)を含有するLB寒天上に播種した。
隣接するFRT部位は、大腸菌染色体の改変に続くFLP組換えによる抗生物質耐性マーカーの除去を可能にした。FLP組換えは、1箇所のFRT部位(34bp)並びに短い隣接配列(それぞれ約20bp)を残し、これは、カセットの増幅でのプライマー結合部位として用いられる。
大腸菌ゲノムDNA(gDNA)を、Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて一晩培養物から単離した。ノックアウト又はノックインカセットを保持するPCR産物を、PRECISOR高忠実性DNAポリメラーゼ(BioCat, Heidelberg)を用いて鋳型プラスミドから増幅し、分析用PCR反応は、PCR Extender System(5PRIME GmbH, Hamburg, Germany)を用いて、製造業者の推奨に従って行なった。PCRアンプリコンを、GeneJET PCR Purification Kit又はGeneJET Gel Extraction Kit(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて精製し、配列決定はGATC BioTech社(Konstanz, Germany)又はBioSpring社(Frankfurt am Main, Germany)により行なわれた。
約500ngのΔackA-pta PCR構築物(1737bp)を、Red/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。3種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔadhE PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。2種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔfrdABCD PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT及びΔadhE::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔpflB PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT及びΔfrdABCD::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。4種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔldhA::alaD-gstear PCR構築物(1783bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT及びΔpflB::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。4種類のZeoR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
細胞培養培地中でのアラニン検出のために、以下のHPLC法を用いた:
カラム:Aminex HPX-87Cカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm, i.d.粒径9μm
移動相:0.1mol/LのCa(NO3)290%、アセトニトリル10%
流速:0.6mL/分
カラム温度:60℃
検出:屈折率検出器
用いたHPLC法:
カラム:Aminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm、i.d.粒径9μm
移動相:H2SO44mM
流速:0.4mL/分
カラム温度:45℃
検出:屈折率検出器
大腸菌Ex1株又はQZ16株と命名された、実施例1に記載される通りのすべての突然変異を含む大腸菌ステム株を、大腸菌Ex1ステム株のアラニン収量を改善するために、代謝的進化手順のために用いた。
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g (NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mgチアミン
1mL微量金属ストック
19.92mm (NH4)2HPO4=2.6g/L MW:132.07
7.56mm NH4H2PO4=0.87g/L MW:115
2.0mm KCl=0.15g/L MW:74.55
1.5mm MgSO4-7H2O=0.37g/L MW:246.5
15g/L硫酸アンモニウムを、最終ステップで添加した。
1mmベタイン
1mL微量金属ストック”
微量金属ストックは、0.12M HCL中、2.4g FeCL3-6H2O;0.3g CoCl2-6H2O;0.21g CuCl2-2H2O;0.3g ZnCl2;0.27g NaMoO4-2H2O;0.068g H3BO3;0.5g MnCl2-4H2Oを用いて調製した。
ステム大腸菌Ev4株の増大したアラニン生産性をもたらす突然変異を決定するために、大腸菌ステム株である大腸菌Ev4株及び大腸菌Ev3株のゲノムを配列決定し、結果を比較した。
ArgP(又はiciA)は転写調節因子である。これはアルギニン輸送系に関与する遺伝子及びDNA複製に関与する遺伝子を制御する。ArgPタンパク質におけるA96E変異を生じるSNPを大腸菌QZ23株において同定し、アラニン生産性に対するその影響について評価した。
選択可能なクロラムフェニコール耐性マーカー及び対抗選択可能なsacBマーカー(スクロース感受性を付与する)を含むargP-cat-sacBカセットを、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ(Thermo社)を用いて、プライマーPargP_1_F及びPargP_1_R(表1参照)により鋳型ベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。PCR産物を、プラスミド鋳型バックグラウンドを減少させるために37℃にて1時間、DpnI(NEB社)消化し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen社)を用いて1%アガロースゲルからゲル抽出した。argP SNPカセット(543bp)を、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ(Thermo社)を用いて、プライマーPargP_2_F及びPargP_2_R(表1参照)でQZ23ゲノムDNAから増幅し、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen社)を用いて精製した。
大腸菌QZ48株を、実験室規模のバイオリアクター中での発酵中のその性能について試験した。細胞増殖及びアラニン形成を、大腸菌QZ20株と比較してモニタリングした。
argP過剰発現の影響を試験するため、プラスミドpACYC184-argP(p15 ori, CmR、1細胞当たり約15コピー)を、市販のInFusionクローニング技術(Clontech, Mountain View, CA, USA)によって構築した。最初に、ベクターpACYC184(表1)をNEB社(Ipswich, MA, USA)を介して入手し、これもまたNEB社からのHindIII及びSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化した。この消化は、テトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去した。それとは別に、argP ORFを、プライマーPargP-pACYC_F及びPargP-pACYC_R(表1)と共にPhusionポリメラーゼ(Thermo Scientific, Waltham, MA)を用いて、野生型大腸菌W株DNAからPCR増幅した。
前培養物を、37℃かつ200rpmにて一晩、20%の充填容量のLB培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた。発酵は、AM 1培地中で14%グルコースを含むDASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステムにて行なった。発酵条件は全て以前に記載したものとした。
QZ58株及びQZ66株の菌株構築
gcvA-cat-sacBカセットは、プライマーPgcvA_1_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。gcvA/B SNPカセット(320bp)は、プライマーPgcvA_2_F/R(表1)を用いてQZ23株のゲノムDNAから増幅した。Red/ET組み換えを既に記載した通りに行なった。PgcvA_seq_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。gcvA/Bプロモーター領域中のSNPを大腸菌QZ20株へと導入し、得られた菌株は、QZ58株と称された。このSNPをQZ48株(argP SNP)へも導入し、得られた菌株は、QZ66株と称された。
QZ58株(gcvA/BプロモーターSNP)を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ20株と比較してモニタリングした。
定量的逆転写PCRを(RT-qPCR)によって、gcvA及びgcvBの転写レベルを測定した。iTaq Universal One-Step Kit(Biorad社)を、SYBR Greenベースのワンステップ逆転写(RT)-qPCR反応のために用いた。前述の通りに行なわれた大腸菌QZ20株及び大腸菌QZ23株の並行バッチ発酵から、8時間、11時間及び28時間で培養物サンプルを採取した。サンプルを、RNAを安定化させるために直ちにRNAprotect Bacteria Reagent(Qiagen社)を用いて処理した。AurumTotal RNA Mini Kit(Biorad社)を製造業者のマニュアルに従って用いて、サンプルからRNAを抽出した。混入したゲノムDNAを除去して、qPCR中のバックグラウンドを低下させるために、DNA-free DNA Removal Kit(lifetechnologies社)を用いて単離されたRNAをさらに処理した。RNAを、λ=260nmにて分光光度法で定量した。
gcvA/BプロモーターSNPはgcvAの過剰発現を生じるため、実際にgcvA過剰発現がアラニン生産性の増大を生じることを確認する必要があった。したがって、プラスミドpACYC184-gcvAを、市販のInFusionクローニング技術(Clontech, Mountain View, CA, USA)によって構築した。最初に、ベクターpACYC184(表1)をNEB社(Ipswich, MA, USA)を介して入手し、これもまたNEB社からのHindIII及びSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化した。この消化は、テトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去した。それとは別に、gcvA ORFを、プライマーPgcvA-pACYC_F及びPgcvA-pACYC_R(表1)と共にPhusionポリメラーゼ(Thermo Scientific, Waltham, MA)を用いて、野生型大腸菌W株DNAからPCR増幅した。同様に、gcvB過剰発現の影響を試験するため、プラスミドpACYC184-gcvBを構築した。gcvB転写ユニットをプライマーPgcvB-pACYC_F及びPgcvB-pACYC_R(表1)を用いてPCR増幅した。
前培養物を、37℃かつ200rpmにて一晩、20%の充填容量のLB培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた。発酵は、AM 1培地中で14%グルコースを含むDASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステムにて行なった。発酵条件は全て以前に記載したものとした。
プラスミドpACYC184-gcvBからの調節性RNA gcvBの過剰発現がアラニン生産性の有意な低減を生じたため、gcvBをQZ20株においてノックアウトし、性能について試験した。gcvB-cat-sacBカセットは、プライマーPgcvB_1_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。gcvB欠失カセット(400bp)は、IDTからdsDNA gBlockとして注文した(配列番号98)。Red/ET組み換えは、上記の通りに行なった。PgcvB_seq_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。大腸菌QZ20株にgcvB欠失を導入し、得られた株をQZ71株と称した。
QZ71株(gcvBノックアウト)を、以前に記載したように発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ20株と比較してモニタリングした。
BrnQは、ロイシン、バリン及びイソロイシンをナトリウム/分枝鎖アミノ酸輸送体(sympoter)として細胞中に運搬する推定439アミノ酸の分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。QZ23株では、リーディングフレームのシフトを生じる97bpの欠失(Δ667-764)を同定した。439アミノ酸タンパク質の最初の222アミノ酸は改変されないが、31アミノ酸がフレームシフトにより変化し、終止コドンを生じることに起因して残りのC末端鎖がトランケートされる。QZ23株中のbrnQ遺伝子に見出された97bpの部分欠失はBrnQ活性の無効を生じると推定されたため、brnQ部分欠失に加えてbrnQ遺伝子の完全な欠失(ノックアウト)を試験した。
brnQ-cat-sacBカセットは、プライマーPbrnQ_1_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。brnQ部分欠失カセット(462bp)は、プライマーPbrnQ_2_F/R(表1)を用いてQZ23株のゲノムDNAから増幅した。brnQ KOカセット(500bp)は、IDTからdsDNA gBlockとして注文した(配列番号117)。Red/ET組み換えは、上記の通りに行なった。PbrnQ_seq_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。大腸菌QZ20株にbrnQ部分欠失を導入し、得られた株をQZ57株と称した。大腸菌QZ20株にbrnQ完全欠失を導入し、得られた株をQZ69株と称した。
QZ57株(brnQ Δ667-764)及びQZ69株(brnQ KO)を、以前に記載したように発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ20株と比較してモニタリングした。
QZ23株において、コードされる酵素のA15T変異を生じるlpxD遺伝子中のSNPが検出された。LpxDによりコードされるUDP-3-O-(3-ヒドロキシミリストイル)グルコサミン-N-アセチルトランスフェラーゼは、リピドAの生合成に関与する必須酵素である。リピドAは、大腸菌の外膜リポ多糖(LPS)の不可欠な部分である。
lpxD-cat-sacBカセットは、プライマーPlpxD_1C_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。lpxD SNPカセット(2588bp)は、プライマーlpxD_fix_F/R(表1)を用いてQZ23株のゲノムDNAから増幅した。Red/ET組み換えは、上記の通りに行なった。PlpxD_flank_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。大腸菌QZ20株にlpxD SNPを導入し、得られた株をQZ56株と称した。大腸菌QZ68株(argP SNP, gcvA/BプロモーターSNP, brnQ Δ667-764)にlpxD SNPを導入し、得られた株をQZ70株と称した。
QZ56株(lpxD SNP)を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ20株と比較してモニタリングした。QZ56株におけるLpxD A15T変異は、QZ20株と比較して増大したアラニン力価を生じた(図22)。QZ56株の体積測定アラニン生産性は、46時間後のQZ20株における1.15±0.06g/(Lh)と比較して、1.34±0.06g/(Lh)であった(図23)。
大腸菌QZ23株のゲノムからアラニンラセマーゼdadX遺伝子(配列番号118)を欠失させることによって、大腸菌QZ30株を構築した。dadX ORFは、FRT隣接カナマイシン耐性カセットの挿入と、それに続く上記FLP組換えによる抗生物質耐性カセットの除去により不活性化された。Genebridges Red/ET組み換えキットを、製造業者のプロトコルに従って用いた。FRT隣接カナマイシンカセットを、各々がカナマイシン耐性カセットの挿入のためにdadX ORFに対して50 bpの相同性領域を含むプライマーPdadX_KO_F(配列番号122)及びPdadX_KO_R(配列番号123)を用いて、pRED/ETプラスミド(Gene Bridges)から増幅した。dadX ORFの欠失の成功を、プライマーPdadX_seq_F(配列番号124)及びPdadX_seq_F(配列番号125)を用いるPCRによりチェックし、ゲノム領域の配列決定により確認した。
不活性化されたdadX遺伝子を有する大腸菌QZ30株が、インタクトなdadXを有する大腸菌QZ23と比べて、より高いL-アラニン>95%の鏡像体過剰率(ee)でアラニンを一貫して産生したことが見出された(図26)。培養の20時間後、QZ30は、QZ23によって産生された82.5%と比較して、98.09%の鏡像体過剰率でL-アラニンを産生した。培養の34時間後、QZ23の81.65%と比較して、QZ30によって産生されたL-アラニンのeeは97.27%であり、培養の42時間後、QZ23によって産生された82.2%と比較して、QZ30によって産生されたL-アラニンのeeは97.49%であった。
Claims (51)
- 以下の核酸分子:
(I) 配列番号3、45、49、56、57、60若しくは61の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号3、45、49、56、57、60若しくは61の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号3、45、49、56、57、60若しくは61を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号4、46若しくは50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号4、46若しくは50のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群より選択される配列を有する組換え核酸分子であって、
配列番号45の286〜288位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の96位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、かつ終止コドンでなく、かつ
配列番号49の43〜45位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、かつ終止コドンでない、
上記組換え核酸分子。 - 配列番号45の配列又は(II)〜(V)に記載のその相同体を有する請求項1に記載の組換え核酸分子であって、配列番号45の286〜288位に対応するアミノ酸アラニンをコードするコドンが、アミノ酸グルタミン酸又はグルタミン酸に関連するアミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
- 配列番号49の配列又は(II)〜(V)に記載のその相同体を有する請求項1に記載の組換え核酸分子であって、43〜45位に対応するアミノ酸アラニンをコードするコドンが、アミノ酸スレオニン又はスレオニンに類似のアミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
- 以下のアミノ酸分子:
(VI) 配列番号46の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号46の核酸分子に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号46の96位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアラニンでない、上記組換えアミノ酸分子。 - 以下のアミノ酸分子:
(VI) 配列番号50の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号50の核酸分子に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号50の15位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアラニンでない、上記組換えアミノ酸分子。 - 配列番号46の96位に対応する位置におけるアミノ酸アラニンがグルタミン酸又はグルタミン酸に関連するアミノ酸により置換されている、請求項4に記載の組換えアミノ酸分子。
- 配列番号50の15位に対応する位置におけるアミノ酸アラニンがスレオニン又はスレオニンに類似のアミノ酸により置換されている、請求項5に記載の組換えアミノ酸分子。
- 請求項1〜3のいずれか1項に規定されるタンパク質コード核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的な少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現構築物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に規定される核酸分子又は請求項8に規定される組換え発現構築物のうちの少なくとも1つを含む、組換えベクター。
- (a) brnQ遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(b) argP遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(c) gcvA遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(d) gcvB遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(e)(I) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
のうちの少なくとも1つを含む組換え微生物であって、
配列番号49の43〜45位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、かつ終始コドンでない、上記組換え微生物。 - brnQ遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、請求項10に記載の組換え微生物。 - argP遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、請求項10に記載の組換え微生物。 - gcvA遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号53の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号53の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号53を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号54のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号54のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、請求項10に記載の組換え微生物。 - gcvB遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号58の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号58の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号58を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子
の群から選択される、請求項10に記載の組換え微生物。 - 請求項1〜3のいずれか1項に規定される組換え核酸分子又は請求項8に記載の組換え発現構築物又は請求項9に記載の組換えベクターのうちの少なくとも1つを含む、組換え微生物。
- alaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、請求項10〜15のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- pflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜16のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- adhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜17のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- ldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜18のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- pta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜19のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- ackA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜20のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- frdA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜21のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- dadX遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項10〜22のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- ygaW遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、請求項10〜23のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- zipA遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、請求項10〜24のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- lpd遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、請求項10〜25のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- alaD遺伝子が、以下の核酸分子:
(EE) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(FF) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(GG) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(HH) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(II) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項16〜26のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - alaD遺伝子が、配列番号115若しくは116を有するプロモーター、又は以下の核酸分子: (I) 配列番号115若しくは116の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(II) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号115若しくは116を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(III) 配列番号115を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドの断片
に機能可能に連結されている、請求項16〜26のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - pflB遺伝子が、以下の核酸分子:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項17〜28のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - adhE遺伝子が、以下の核酸分子:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項18〜29のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - ldhA遺伝子が、以下の核酸分子:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項19〜30のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - pta遺伝子が、以下の核酸分子:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項20〜31のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - ackA遺伝子が、以下の核酸分子:
(U) 配列番号120の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号120の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(W) ストリンジェントな条件下で配列番号120を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号121のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号121のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項21〜32のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - frdA遺伝子が、以下の核酸分子:
(Z) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(BB) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項22〜33のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - dadX遺伝子が、以下の核酸分子:
(JJ) 配列番号118の配列を含む核酸分子、又は
(KK) 配列番号118の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(LL) ストリンジェントな条件下で配列番号118を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(MM) 配列番号119のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(NN) 配列番号119のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項23〜34のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - ygaW遺伝子が、以下の核酸分子:
(OO) 配列番号109の配列を含む核酸分子、又は
(PP) 配列番号109の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(QQ) ストリンジェントな条件下で配列番号109を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(RR) 配列番号110のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(SS) 配列番号110のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項24〜35のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - zipA遺伝子が、以下の核酸分子:
(TT) 配列番号111の配列を含む核酸分子、又は
(UU) 配列番号111の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(VV) ストリンジェントな条件下で配列番号111を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(WW) 配列番号112のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(XX) 配列番号112のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項25〜36のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - lpd遺伝子が、以下の核酸分子:
(YY) 配列番号113の配列を含む核酸分子、又は
(ZZ) 配列番号113の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(AAA) ストリンジェントな条件下で配列番号113を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(BBB) 配列番号114のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(CCC) 配列番号114のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項26〜37のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属及びサッカロミセス属からなる群の属から選択される、請求項10〜34のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 請求項10〜39のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を含む組成物。
- 培地及び炭素源をさらに含む、請求項40に記載の組成物。
- 以下のステップ:
(I) 請求項1〜3のいずれか1項に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は請求項4〜7のいずれか1項に規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は請求項8に記載の発現構築物又は請求項9に記載のベクターを、微生物に導入するステップ;及び
(II) 請求項1〜3のいずれか1項に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は請求項4〜7のいずれか1項に規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は請求項8に記載の発現構築物又は請求項9に記載のベクターを含まない対応する微生物と比較して、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物の作製方法。 - 前記方法で用いられる組換え微生物が、請求項16、24〜28及び36〜38のいずれか1項に規定される遺伝子の少なくとも1つの活性及び/又は発現の増大又は増強、並びに/あるいは請求項17〜23及び29〜35のいずれか1項に規定される少なくとも1つの遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属及びサッカロミセス属からなる群の属から選択される、請求項42又は43に記載の方法。
- ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの産生を可能にする条件下で、請求項10〜39のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を培養するステップを含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの製造方法。
- 前記微生物が、0.5%〜30%(w/v)の糖を含む培地中で培養される、請求項45に記載の方法。
- ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が少なくとも80%である、請求項45又は46に記載の方法。
- L-アラニンのキラル純度が少なくとも95%である、請求項45〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項10〜39のいずれか1項に記載の1種以上の遺伝的に改変された微生物を培養培地に接種するステップ及び該培養培地中で該遺伝的に改変された微生物を培養する又は増殖させるステップを含む、遺伝的に改変された微生物を培養する又は増殖させる方法。
- ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項4〜7のいずれか1項に記載の組換えアミノ酸分子、請求項8に記載の組換え発現構築物、請求項9に記載の組換えベクター、請求項10〜39のいずれか1項に記載の組換え微生物又は請求項40若しくは41に記載の組成物の使用。
- 以下のステップ:
(I) 発酵槽中で請求項10〜39のいずれか1項に記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンを回収するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための方法。
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