JP6572206B2 - ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 - Google Patents
ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6572206B2 JP6572206B2 JP2016516528A JP2016516528A JP6572206B2 JP 6572206 B2 JP6572206 B2 JP 6572206B2 JP 2016516528 A JP2016516528 A JP 2016516528A JP 2016516528 A JP2016516528 A JP 2016516528A JP 6572206 B2 JP6572206 B2 JP 6572206B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- gene
- acid molecule
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 221
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 29
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 14
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 421
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 388
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 388
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 255
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 224
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 215
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 198
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 198
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 180
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 147
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 133
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 132
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 131
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 115
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 112
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 106
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 106
- 101100055245 Escherichia coli (strain K12) alaE gene Proteins 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 86
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 82
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 73
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 67
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 67
- 101150040445 lpd gene Proteins 0.000 claims description 64
- 101150096853 zipA gene Proteins 0.000 claims description 64
- 101150082527 ALAD gene Proteins 0.000 claims description 49
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 47
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 40
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 40
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 31
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 28
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims description 23
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 23
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 22
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 15
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 15
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 14
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 12
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 claims description 12
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 11
- 101150075213 frdA gene Proteins 0.000 claims description 11
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 7
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 6
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 6
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 claims description 5
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 5
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 claims description 5
- 108010065064 acetaldehyde dehydrogenase (acylating) Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 3
- 101710181816 Pyruvate-formate-lyase deactivase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 claims 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 210
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 161
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 157
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 76
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 73
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 63
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 58
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 58
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 58
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 57
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 56
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 56
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 47
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 102220582878 Cellular tumor antigen p53_Q5H_mutation Human genes 0.000 description 34
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 30
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 30
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 30
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 30
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 30
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 30
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 28
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 28
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 28
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 28
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 27
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 27
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 27
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 27
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 26
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 26
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 26
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 26
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 23
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 23
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 21
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 20
- 239000002585 base Substances 0.000 description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 19
- 241000894007 species Species 0.000 description 18
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 15
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 14
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 14
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 13
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 11
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 description 11
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 10
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 10
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 9
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 8
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 8
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 8
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 6
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 6
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 5
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- OHOTVSOGTVKXEL-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-[bis(carboxylatomethyl)amino]propanoate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C(C)N(CC([O-])=O)CC([O-])=O OHOTVSOGTVKXEL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 241001523626 Arxula Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- 101100330872 Bacillus subtilis (strain 168) dctA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 4
- 101100213151 Escherichia coli (strain K12) ydbH gene Proteins 0.000 description 4
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 4
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 101150070691 ydbH gene Proteins 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 3
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 3
- 241001328122 Bacillus clausii Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000015473 Schizothorax griseus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 3
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 3
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 102220097797 rs781595324 Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 3
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 2
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 2
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 2
- 241000186984 Kitasatospora aureofaciens Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 2
- 240000001131 Nostoc commune Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 description 2
- 241000157304 Prauserella rugosa Species 0.000 description 2
- 241000157935 Promicromonospora citrea Species 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- 241001524101 Rhodococcus opacus Species 0.000 description 2
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000958303 Streptomyces achromogenes Species 0.000 description 2
- 241000187758 Streptomyces ambofaciens Species 0.000 description 2
- 241000971005 Streptomyces fungicidicus Species 0.000 description 2
- 241000187122 Streptomyces virginiae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- JHWZWIVZROVFEM-UHFFFAOYSA-N 4-(2-methylpropyl)-1,3-oxazolidine-2,5-dione Chemical compound CC(C)CC1NC(=O)OC1=O JHWZWIVZROVFEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical group BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000000073 Achillea millefolium Species 0.000 description 1
- 235000007754 Achillea millefolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000187254 Actinomadura madurae Species 0.000 description 1
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000192531 Anabaena sp. Species 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 101100345345 Arabidopsis thaliana MGD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000185996 Arthrobacter citreus Species 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 244000177578 Bacterium linens Species 0.000 description 1
- 235000012539 Bacterium linens Nutrition 0.000 description 1
- 241001430265 Beijerinckia indica subsp. indica Species 0.000 description 1
- 241000680806 Blastobotrys adeninivorans Species 0.000 description 1
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 description 1
- 241000218649 Brevibacterium fuscum Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000907717 Candida freyschussii Species 0.000 description 1
- 241001049176 Charis Species 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000983382 Curtobacterium pusillum Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000588700 Dickeya chrysanthemi Species 0.000 description 1
- 241000589566 Elizabethkingia meningoseptica Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000589586 Empedobacter brevis Species 0.000 description 1
- 240000000664 Eriochloa polystachya Species 0.000 description 1
- 241000588694 Erwinia amylovora Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 238000012357 Gap analysis Methods 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241001518248 Gluconobacter cerinus Species 0.000 description 1
- 241000589232 Gluconobacter oxydans Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 235000005612 Grewia tenax Nutrition 0.000 description 1
- 241000193004 Halobacillus Species 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000204057 Kitasatospora Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000215457 Leptolyngbya Species 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241001134700 Lyngbya lagerheimii Species 0.000 description 1
- 241000042870 Lyngbya majuscula Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000144155 Microbacterium ammoniaphilum Species 0.000 description 1
- 241000983412 Microbacterium saperdae Species 0.000 description 1
- 241000203815 Microbacterium testaceum Species 0.000 description 1
- 241000191936 Micrococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000424623 Nostoc punctiforme Species 0.000 description 1
- 241000192673 Nostoc sp. Species 0.000 description 1
- 241001611244 Nostoc sphaericum Species 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001112159 Ogataea Species 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 241001489174 Ogataea minuta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 241000227676 Paenibacillus thiaminolyticus Species 0.000 description 1
- 241000576909 Phormidium tenue Species 0.000 description 1
- 241000193804 Planococcus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 241000186334 Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 1
- 241000185994 Pseudarthrobacter oxydans Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000589614 Pseudomonas stutzeri Species 0.000 description 1
- 241000218902 Pseudomonas synxantha Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000186652 Sporosarcina ureae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186990 Streptomyces cacaoi Species 0.000 description 1
- 241000187435 Streptomyces griseolus Species 0.000 description 1
- 241000187389 Streptomyces lavendulae Species 0.000 description 1
- 241000218589 Streptomyces olivaceus Species 0.000 description 1
- 241000946755 Streptomyces tanashiensis Species 0.000 description 1
- 241000946734 Streptomyces violaceochromogenes Species 0.000 description 1
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 1
- 241001453296 Synechococcus elongatus Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241000866060 Terrabacter tumescens Species 0.000 description 1
- 241001313699 Thermosynechococcus elongatus Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241001135144 Vibrio metschnikovii Species 0.000 description 1
- 241000589655 Xanthomonas citri Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235029 Zygosaccharomyces bailii Species 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 1
- 241000512905 [Candida] sonorensis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 101150027729 alaE gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 description 1
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N loratadine Chemical compound C1CN(C(=O)OCC)CCC1=C1C2=NC=CC=C2CCC2=CC(Cl)=CC=C21 JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 101150070013 pfl gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 108010060146 pyruvate formate-lyase activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 102220014646 rs150075979 Human genes 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 102000040811 transporter activity Human genes 0.000 description 1
- 108091092194 transporter activity Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(a)ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(b)二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ/鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ/ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(c)NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(d)リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(e)フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(f)アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強
(ここで、遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制、欠失、増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される)
からなる群より選択される特徴の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、よりさらに好ましくは少なくとも4つ、よりさらに好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは全てをさらに有する。
(i) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号50を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号46を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
(i) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、、
ここで配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、
(1)〜(5)において上で定義した遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して活性及び/又は発現が改変されており、
上で定義された変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵においてアラニン収量の改善を有する。
pflB遺伝子は、以下の核酸分子:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(C) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(B)、(C)又は(E)によりコードされるポリペプチドは、配列番号6を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
adhE遺伝子は、以下の核酸分子:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(H) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(G)、(H)又は(J)によりコードされるポリペプチドは、配列番号8を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
ldhA遺伝子は、以下の核酸分子:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(M) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(L)、(M)又は(O)によりコードされるポリペプチドは、配列番号10を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
pta遺伝子は、以下の核酸分子:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(R) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(Q)、(R)又は(T)によりコードされるポリペプチドは、配列番号12を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
frdA遺伝子は、以下の核酸分子:
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(W) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(V)、(W)又は(Y)によりコードされるポリペプチドは、配列番号14を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
alaD遺伝子は、以下の核酸分子:
(Z) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(BB) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(AA)、(BB)又は(DD)によりコードされるポリペプチドは、配列番号16を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、よりさらに好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
(1) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54若しくは55の3’領域を含む断片であり、したがって配列番号54若しくは55の5’末端に欠失を含む。
1〜5g、好ましくは3.5gのKH2PO4、及び
1〜10g、好ましくは5.0gのK2HPO4、及び
1〜5g、好ましくは3.5gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜1g、好ましくは0.25gのMgSO4-7H2O、及び
5〜25mg、好ましくは15mgのCaCL2-2H2O、及び
0.1〜1mg、好ましくは0.5mgのチアミン、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.1M HCLの1リットル当たり、0.5〜5g、好ましくは1.6gのFeCL3-6H2O;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのCoCl2-6H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.1gのCuCl2-2H2O;0.1〜0.5g、好ましくは0.2gのZnCl2;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのNaMoO4-2H2O;0.001〜0.1g、好ましくは0.05gのH3BO3を含む。
1〜10g、好ましくは2.6gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜5g、好ましくは0.87gのNH4H2PO4、及び
0.05〜2.5 g、好ましくは0.15gのKCl、及び
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.12M HCLの1リットル当たり、1〜5g、好ましくは2.4gのFeCL3-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのCoCl2-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.21gのCuCl2-2H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのZnCl2;0.1〜1g、好ましくは0.27gのNaMoO4-2H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.068gのH3BO3及び0.1〜1g、好ましくは0.5gのMnCl2-4H2Oを含み、場合により1〜30g、好ましくは15gの(NH4)2SO4を含んでもよい。
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜10g、好ましくは1gの(NH4)2SO4、及び
0.05〜5 g、好ましくは0.46gのベタイン、及び
0.001〜0.5g、好ましくは0.05gのシアノコバラミン(B12)、及び
1〜10g、好ましくは3.74gのKH2PO4、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、10〜100mM、好ましくは60mM硫酸の1リットル当たり、1〜10g、好ましくは3.48gの(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.35gのCoSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.31gのCuSO4-5H2O;0.1〜5g、好ましくは0.63gのZnSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.27gのMnSO4-H2O;0.01〜1g、好ましくは0.07gのNaMoO4-2H2O及び0.1〜5g、好ましくは0.43gのH3BO3を含む。
(I) (i) lpd遺伝子の1以上の活性及び/又は発現の少なくとも1つを導入、増大又は増強する、並びに/あるいは(ii) zipA遺伝子の1以上の活性及び/又は発現を導入、増大、増強又は改変する、並びに/あるいは(iii) 配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子を導入する(該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び/又は発現を改変する)、並びに/あるいは、場合によりさらに微生物における上の(a)〜(e)で定義される改変の1つ以上を導入するステップと、
(II) 上の(I)で定義された改変を有しない対応する微生物と比較して、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び/又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量又は生産性が増強された組換え微生物を作出、同定及び単離するステップと
を含む方法である。
(1) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54又は55の3’領域を含む断片、したがって配列番号54又は55の5’末端に欠失を含む断片である。
(I) 発酵槽中で上で定義した本発明に係る微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び/又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは L-アラニンを回収するステップ
を含む方法である。
同化可能な炭素源:グルコース
温度:30〜45℃
pH:6.0〜7.0
微好気的条件
である。
(1) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号49の208〜210位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の70位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(6) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号51を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号52のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号52のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号51の208〜210位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸プロリンをコードするか、又は配列番号52の70位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がプロリンであり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号52を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(1) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号45の913〜915位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アルギニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の305位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアルギニンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強又は増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(6) 配列番号47の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号47の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号47を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号48のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号47の913〜915位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又は配列番号48の305位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号48を有するタンパク質と比較して増強、増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(1) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号1の13〜15位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された発現及び/又は活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(6) 配列番号3、56、58若しくは60の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号3、56、58若しくは60の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号3、56、58若しくは60を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号4、57、59若しくは60のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号4、57、59若しくは60のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号3の13〜15位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸ヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸アスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸アルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸チロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸をコードするか、あるいは配列番号2の5位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸であり、又はアスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、又はアルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、又はチロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸であり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された活性及び/又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(11) 配列番号52の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号52のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号52の70位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がプロリンであり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(11) 配列番号48の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号48のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号48の305位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がグリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強、増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(11) 配列番号4、57、59若しくは61の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号4、57、59若しくは61のポリペプチドに対して60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、よりさらに好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号4の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸であり、
配列番号57の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がアスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
配列番号59の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がアルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
配列番号61の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がチロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸であり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された活性及び/又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び/又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
(I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、よりさらに好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の群から選択される配列を有する微生物(例えば大腸菌)中で機能的なプロモーターである。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54若しくは55の3’領域を含む断片であり、したがって配列番号54若しくは55の5’末端に欠失を含む。
理解すべきこととして、本発明は特別な手法又はプロトコルに限定されるものでない。理解すべきこととしてまた、本明細書で使用する用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、添付した特許請求の範囲によって限定されうる本発明の範囲を限定することを意図しない。注意しなければならないこととして、本明細書及び添付した特許請求の範囲における使用で、単数形の冠詞「a」「an」及び「the」は、文脈が明確に断らない限り、複数の言及を含むものである。従って、例えば、ベクター(a vector)は1以上のベクターへの言及であり、当業者に公知のその等価物などを含むものである。本明細書で使用する用語「約」は、およそ、大雑把に、大体、又はその範囲のを意味する。用語「約」を数字の範囲と共に用いる場合、この用語は記載した数値の上限及び下限の境界を拡げることにより範囲を改変する。一般に、本明細書では用語「約」を用いて、記載した値の上限及び下限の数値を20%、好ましくは10%上方若しくは下方(高い若しくは低い)の分散をもつ値に改変する。本明細書で使用する用語「又は(若しくは、あるいは)」は特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含むものである。用語「含む(compriseとその変化形)」「含む(includeとその変化形)」は、本明細書及び以下の特許請求の範囲で使用する場合、1以上の記載した特徴、整数、成分、又はステップの存在を説明することを意図するが、これらの用語は他の特徴、整数、成分、又はステップ、又はその群の存在若しくは付加を排除するものではない。明確にするために述べると、本明細書に使用するある特定の用語は次の通り定義されかつ使用される。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
1.以下の核酸分子:
(I) 配列番号1、45若しくは49の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1、45若しくは49の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号1、45若しくは49を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2、46若しくは50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号2、46若しくは50のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群より選択される配列を有する組換え核酸分子であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、かつ終止コドンでなく、かつ
配列番号45の913〜915位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アルギニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の305位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアルギニンでなく、かつ終止コドンでなく、かつ
配列番号49の208〜210位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の70位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、かつ終止コドンでない、
上記組換え核酸分子。
2.配列番号1の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、13〜15位のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジン又はヒスチジンに類似のアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸アスパラギン又はアスパラギンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸アルギニン又はアルギニンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸チロシン又はチロシンに類似のアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
3.配列番号45の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、913〜915位のアミノ酸アルギニンをコードするコドンが、アミノ酸グリシン又はグリシンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
4.配列番号49の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、208〜210位のアミノ酸アラニンをコードするコドンが、アミノ酸プロリンをコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
5.以下のアミノ酸分子:
(VI) 配列番号2の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号2の核酸分子に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号2の5位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がグルタミンでない、上記組換えアミノ酸分子。
6.以下のアミノ酸分子:
(VI) 配列番号46の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号46の核酸分子に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号46の305位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアルギニンでない、上記組換えアミノ酸分子。
7.以下のアミノ酸分子:
(VI) 配列番号50の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号50の核酸分子に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号50の70位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアラニンでない、上記組換えアミノ酸分子。
8.5位のアミノ酸グルタミンが、ヒスチジン又はヒスチジンに類似のアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸により、あるいはアスパラギン又はアスパラギンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により、あるいはアルギニン又はアルギニンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により、あるいはチロシン又はチロシンに類似のアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸により置換されている、実施形態2に記載の組換えアミノ酸分子。
9.305位のアミノ酸アルギニンがグリシン又はグリシンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により置換されている、実施形態3に記載の組換えアミノ酸分子。
10.70位のアミノ酸アラニンがプロリンにより置換されている、実施形態4に記載の組換えアミノ酸分子。
11.実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的な少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現構築物。
12.実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子又は実施形態11に規定される組換え発現構築物のうちの少なくとも1つを含む、組換えベクター。
13. (a) lpd遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(b) zipA遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(c)(I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
のうちの少なくとも1つを含む組換え微生物であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(c)(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(c)(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでない、上記組換え微生物。
14.lpd遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、実施形態13に記載の組換え微生物。
15.zipA遺伝子が、以下の核酸分子:
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、実施形態13に記載の組換え微生物。
16.実施形態1〜4のいずれかに規定される組換え核酸分子又は実施形態11に記載の組換え発現構築物又は実施形態12に記載の組換えベクターのうちの少なくとも1つを含む、組換え微生物。
17.alaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、実施形態16に記載の組換え微生物。
18.pflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16又は17に記載の組換え微生物。
19.adhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜18のいずれかに記載の組換え微生物。
20.ldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜19のいずれかに記載の組換え微生物。
21.pta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜20のいずれかに記載の組換え微生物。
22.frdAの活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜21のいずれかに記載の組換え微生物。
23.alaD遺伝子が、以下の核酸分子:
(AA) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(BB) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(CC) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(EE) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態17〜22のいずれかに記載の組換え微生物。
24.alaD遺伝子が、配列番号54若しくは55を有するプロモーター又は以下の核酸分子:
(I) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(II) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(III) 配列番号54を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
に機能可能に連結されている、実施形態17〜23のいずれかに記載の組換え微生物。
25.pflB遺伝子が、以下の核酸分子:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は (C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態18〜24のいずれかに記載の組換え微生物。
26.adhE遺伝子が、以下の核酸分子:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は (H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態19〜25のいずれかに記載の組換え微生物。
27.ldhA遺伝子が、以下の核酸分子:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は (M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態20〜26のいずれかに記載の組換え微生物。
28.pta遺伝子が、以下の核酸分子:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は (R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態21〜27のいずれかに記載の組換え微生物。
29.frdA遺伝子が、以下の核酸分子:
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は (W) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態22〜28のいずれかに記載の組換え微生物。
30.前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、実施形態13〜29のいずれかに記載の組換え微生物。
31.実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の組換え微生物を含む組成物。
32.培地及び炭素源をさらに含む、実施形態31に記載の組成物。
33.以下のステップ:
(I) 実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態5〜10のいずれかに規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態11に記載の発現構築物又は実施形態12に記載のベクターを、微生物に導入するステップ;及び
(II) 実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態5〜10のいずれかに規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態11に記載の発現構築物又は実施形態12に記載のベクターを含まない対応する微生物と比較して、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物の作製方法。
34.前記方法で用いられる組換え微生物が、実施形態8若しくは14に規定される遺伝子の活性及び/又は発現の増大又は増強、並びに/あるいは実施形態9〜13若しくは15〜19のいずれかに規定される少なくとも1種の遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態33に記載の方法。
35.前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、実施形態33又は34に記載の方法。
36.アラニン産生を可能にする条件下で、実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の組換え微生物を培養するステップを含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの製造方法。
37.前記微生物が、0.5%〜30%(w/v)の糖を含む培地中で培養される、実施形態36に記載の方法。
38.ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が少なくとも80%である、実施形態36又は37に記載の方法。
39.L-アラニンのキラル純度が少なくとも98%である、実施形態36〜38のいずれかに記載の方法。
40.実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の遺伝的に改変された微生物を培養培地に接種するステップ及び該培養培地中で該遺伝的に改変された微生物を培養又は増殖させるステップを含む、遺伝的に改変された微生物を培養又は増殖させる方法。
41.ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための、実施形態1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子、実施形態5〜10のいずれかに記載の組換えアミノ酸分子、実施形態11に記載の組換え発現構築物、実施形態12に記載の組換えベクター、実施形態13〜30のいずれかに記載の組換え微生物又は実施形態31若しくは32に記載の組成物の使用。
42.以下のステップ:
(I) 発酵槽中で実施形態13〜30のいずれかに記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンを回収するステップ
を含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための方法。
43.以下の核酸分子:
(I) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を、
(VI) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(VII) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(VIII) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IX) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中で機能的なプロモーターと機能的に連結されて有する核酸分子を含む、組換え発現構築物。
44.実施形態43に規定される組換え発現構築物を含む、組換えベクター。
45. (I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
の群から選択される配列を有する、微生物中で機能的なプロモーター。
46.発現対象の異種核酸分子と機能的に連結された実施形態45に記載のプロモーター
を含む、組換え発現構築物。
47.実施形態45に記載のプロモーター又は実施形態46に記載の組換え発現構築物を含む、ベクター。
48.実施形態45に記載のプロモーター、実施形態46に記載の組換え発現構築物又は実施形態47に記載のベクターを含む、組換え微生物。
49.実施形態45に記載のプロモーターを、発現対象の核酸分子に機能的に連結し、それにより組換え発現構築物を作製するステップ、及び該発現構築物を微生物に導入するステップを含む、微生物中で核酸分子を発現させる方法。
50.微生物中で核酸分子を発現させるための、実施形態45に記載のプロモーター、実施形態46に記載の組換え発現構築物又は実施形態47に記載のベクターの使用。
特に示さない限り、制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、形質転換、細菌細胞の選択及び培養をはじめとする、本発明の目的のために行なわれるクローニング手順は、記載される通りに行なわれる(Sambrook et al., 1989)。組換えDNAの配列分析は、Sangerの技術(Sanger et al., 1977)を用いて、レーザー蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行なわれる。特に記載しない限り、化学物質及び試薬は、Sigma Aldrich社(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)、Promega社(Madison, WI, USA)、Duchefa社(Haarlem, The Netherlands)又はInvitrogen社(Carlsbad, CA, USA)から入手される。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社(Ipswich, MA, USA)又はRoche Diagnostics GmbH(Penzberg, Germany)からのものである。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon社(Ebersberg, Germany)により合成される。
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFの不活性化並びにalaD遺伝子のコドン最適化変異体(alaD-gstear)によるldhA ORFの置換により、L-アラニン産生に関して大腸菌W株(LU17032)を遺伝子操作した。
細菌培養
大腸菌W株(LU17032)は、Luria-Bertani(LB)液体培地中又はLuria-Bertani固体培地上で培養した。時折、W株の正体を確認するために、10mMスクロースを含有するM9最小寒天上にクローンを継代した。抗生物質を、15μg/mL(カナマイシン、クロラムフェニコール)、25μg/mL(ゼオシン)又は3μg/mL(テトラサイクリン)の最終濃度まで、適宜、液体培地及び固体培地に添加した。
Red/ET組換えは、Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)の標準的プロトコールを用いて行なった。簡潔には、Red/ET能の高い大腸菌W株を、30℃にて、OD600nmが約0.3になるまで好気的に増殖させた。red遺伝子の発現は、50μLの10%(w/v) L-アラビノースの添加及びそれに続く37℃までの温度上昇により誘導した。アラビノースは、非誘導対照培養では省略した。37℃での35分間のインキュベーション後、細胞を、氷冷10%(v/v)グリセロールを用いて2回洗浄し、1.35kV、10μF、600Ωで500ngのPCR産物を用いてエレクトロポレーションした。次に、細胞を1mL氷冷LB培地中に再懸濁し、約1.5時間、37℃にて好気的に増殖させた。次に、培養物を、15μg/mLカナマイシン(ノックアウト)又は25μg/mLゼオシン(ノックイン)を含有するLB寒天上に播種した。
隣接するFRT部位は、大腸菌染色体の改変に続くFLP組換えによる抗生物質耐性マーカーの除去を可能にした。FLP組換えは、1箇所のFRT部位(34bp)並びに短い隣接配列(それぞれ約20bp)を残し、これは、カセットの増幅でのプライマー結合部位として用いられる。
大腸菌ゲノムDNA(gDNA)を、Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて一晩培養物から単離した。ノックアウト又はノックインカセットを保持するPCR産物を、PRECISOR高忠実性DNAポリメラーゼ(BioCat, Heidelberg)を用いて鋳型プラスミドから増幅し、分析用PCR反応は、PCR Extender System(5PRIME GmbH, Hamburg, Germany)を用いて、製造業者の推奨に従って行なった。PCRアンプリコンを、GeneJET PCR Purification Kit又はGeneJET Gel Extraction Kit(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて精製し、配列決定はGATC BioTech社(Konstanz, Germany)又はBioSpring社(Frankfurt am Main, Germany)により行なわれた。
約500ngのΔackA-pta PCR構築物(1737bp)を、Red/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。3種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔadhE PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。2種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔfrdABCD PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT及びΔadhE::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔpflB PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT及びΔfrdABCD::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。4種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
約500ngのΔldhA::alaD-gstear PCR構築物(1783bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT及びΔpflB::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。4種類のZeoR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった(データ示さず)。
細胞培養培地中でのアラニン検出のために、以下のHPLC法を用いた:
カラム:Aminex HPX-87Cカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm, i.d.粒径9μm
移動相:0.1mol/LのCa(NO3)290%、アセトニトリル10%
流速:0.6mL/分
カラム温度:60℃
検出:屈折率検出器
用いたHPLC法:
カラム:Aminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm、i.d.粒径9μm
移動相:H2SO44mM
流速:0.4mL/分
カラム温度:45℃
検出:屈折率検出器
大腸菌Ex1株又はQZ16株と命名された、実施例1に記載される通りのすべての突然変異を含む大腸菌ステム株を、大腸菌Ex1ステム株のアラニン収量を改善するために、代謝的進化手順のために用いた。
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g (NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mgチアミン
1mL微量金属ストック
19.92mm (NH4)2HPO4=2.6g/L MW:132.07
7.56mm NH4H2PO4=0.87g/L MW:115
2.0mm KCl=0.15g/L MW:74.55
1.5mm MgSO4-7H2O=0.37g/L MW:246.5
15g/L硫酸アンモニウムを、最終ステップで添加した。
1mmベタイン
1mL微量金属ストック”
微量金属ストックは、0.12M HCL中、2.4g FeCL3-6H2O;0.3g CoCl2-6H2O;0.21g CuCl2-2H2O;0.3g ZnCl2;0.27g NaMoO4-2H2O;0.068g H3BO3;0.5g MnCl2-4H2Oを用いて調製した。
ステム大腸菌Ev3株の増大したアラニン収量をもたらす突然変異を決定するために、大腸菌ステム株である大腸菌Ex1株及び大腸菌Ev3株のゲノムを配列決定し、結果を比較した。
大腸菌Ev3/QZ20株で検出されたalaD遺伝子の上流での欠失の、アラニン収量及び生産性に対する影響を確認するために、大腸菌Ex1(QZ16)株のゲノムに欠失を導入して、大腸菌QZ32株を作製した。
選択可能なクロラムフェニコール耐性マーカー及び対抗選択可能なsacBマーカー(スクロース感受性を付与する)を含むydbH-ldhA-cat-sacBカセット(3091bp)を、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ(Thermo社)を用いて、プライマーRec1_1_F及びRec1_1_Rにより鋳型ベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。PCR産物を、プラスミド鋳型バックグラウンドを減少させるために37℃にて1時間、DpnI(NEB社)消化し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen社)を用いて1%アガロースゲルからゲル抽出した。ydbH-ldhA欠失カセット(116bp)を、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ(Thermo社)を用いて、自己アニーリングプライマーRec1_2_F及びRec1_2_Rのセットから増幅し、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen社)を用いて精製した。
529bpのydbH-ldhAプロモーター欠失によりalaDの過剰発現が達成されるメカニズムをさらに特徴付けるため、かつ部分的なydbH遺伝子の欠失がそこで役割(roll)を有するか否かを決定するために、大腸菌QZ16株に基づく2種類の菌株を構築した。大腸菌QZ63株では、50bpのldhAプロモーター配列のみが欠失され、新規プロモーター(配列番号55)を形成させるために、新規alaDプロモーター配列を補完することが予測される追加の塩基対TATTGが追加された。大腸菌QZ64株では、ydbH遺伝子全体が欠失され、一方で生来のldhAプロモーターは損傷されずに残っている。
大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株の菌株構築は、上記の通りに行なった。ΔPldhA-cat-sacBカセット(3091bp)をプライマーRec1B_1_F及びRec1B_1_Rを用いて増幅し、ΔydbH-cat-sacBカセット(3091bp)をプライマーRec1C_1_F及びRec1C_1_Rを用いて増幅した。生成されたPCRアンプリコンを、大腸菌QZ16株でのRed/ET組換えの基質として用いた。PldhA欠失カセット(125bp)及びydbH欠失カセット(108bp)は、自己アニーリングプライマーRec1B_2_F及びRec1B_2_R並びにRec1C_2_F及びRec1C_2_Rをそれぞれ用いて増幅した。PCRアンプリコンを、cat-sacBマーカーカセットを置き換え、所望の遺伝子型の大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株を作製するために用いた。大腸菌QZ63株のコロニーを、ゲノム特異的プライマーRec1B_seq_F及びRec1B_seq_Rを用いるPCRにより試験し、少なくとも1種類の陽性クローンを配列決定により確認した。大腸菌QZ64株のコロニーを、ゲノム特異的プライマーRec1C_seq_F及びRec1C_seq_Rを用いるPCRにより試験し、少なくとも1種類の陽性クローンを配列決定により確認した。
alaDの発現レベルに対するydbH-ldhAプロモーター欠失の影響を調べるために、作製された大腸菌QZ32株のSDS-PAGE分析を、大腸菌W株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株と比較して行なった。37℃、200rpmでのLB培地中の一晩培養物由来の細胞を、OD600に対して正規化し、回収して、溶解させた。可溶性タンパク質画分を、比較のためにSDS-PAGEにロードした。
大腸菌QZ32株を、大腸菌W株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株細胞溶解物と比較して、in vitroにて粗精製細胞溶解物中でのAlaD活性について試験した。
(L-アラニン+H2O+NAD+→ ピルビン酸+NH3+NADH+H+)
←
は可逆的であり、L-アラニンからピルビン酸への逆変換を、λ=340nmにて分光光度計を用いて、NADHの形成を介して間接的にモニタリングした。
alaDタンパク質発現をモニタリングするためのSDS-PAGE分析の他に、定量的逆転写PCRを(RT-qPCR)によって、alaD転写レベルを測定した。iTaq Universal One-Step Kit(Biorad社)を、SYBR Greenベースのワンステップ逆転写(RT)-qPCR反応のために用いた。前述の通りに行なわれた大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株の並行バッチ発酵から、8、11、22、28及び48時間で培養物サンプルを採取した。サンプルを、RNAを安定化させるために直ちにRNAprotect Bacteria Reagent(Qiagen社)を用いて処理した。AurumTotal RNA Mini Kit(Biorad社)を製造業者のマニュアルに従って用いて、サンプルからRNAを抽出した。混入したゲノムDNAを除去して、qPCR中のバックグラウンドを低下させるために、DNA-free DNA Removal Kit(lifetechnologies社)を用いて単離されたRNAをさらに処理した。RNAを、λ=260nmにて分光光度法で定量した。
大腸菌QZ32株を、実験室規模のバイオリアクター中での発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、大腸菌QZ16株及びQZ20株と比較してモニタリングした。
発酵は、上記の通りに行なった。大腸菌QZ63株、大腸菌QZ64株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ32株を、2回反復で並行して実験した。
大腸菌QZ20株ゲノム配列では、ygaW遺伝子中のG15TがQ5Hアミノ酸交換を生じさせることが明らかにされた。YgaW(alaEとも称される)は、以前に、アラニンエクスポーターであることが決定された。プラスミドからのygaWの過剰発現が、アラニン排出を引き起こすことが示された(国際公開第2012/172822号)。アラニン収量に対するygaW遺伝子中のSNPの影響を試験するために、それぞれの突然変異を、QZ16株と比較してalaD発現が増強された大腸菌QZ32株遺伝的バックグラウンドへと導入した。他のアミノ酸交換がアラニン収量に対する有益な影響を有するか否かを試験するために、さらなる突然変異を、同じコドンに導入した。
菌株構築を、上記の通りに行なった。ygaW-cat-sacBカセット(3091bp)は、プライマーRec2_1_F及びRec 2_1_Rを用いて増幅した。ygaW-SNP-カセット(130bp)は、自己アニーリングプライマーRec2_2_F及びRec2_2_Rを用いて増幅した。対照PCRを、ゲノム特異的プライマーRec2_seq_F及びRec 2_seq_Rを用いて行なった。ydbH-ldhAプロモーター欠失及びYgaW Q5H SNPを有する作製された菌株を、QZ33株と命名した。
QZ33株(ygaW Q5H、ydhB-ldha欠失突然変異体)を、大腸菌QZ32株と比較して、発酵中のその性能について試験した。バッチ発酵を、上記の通りに行なった。
YgaWのN末端領域中の単一SNPが、増強されたアラニンエクスポーター活性を付与する正確なメカニズムは不明である。本発明者らは、遺伝子特異的プライマーygaW_RT_F及びygaW_RT_R(表1)を用いて、上述した通りのRT-qPCRによって、QZ16株及びQZ20株のRNAサンプルでのygaWの遺伝子発現レベルを試験した。遺伝子発現データは、参照遺伝子としてrrsAを用いて正規化して、較正因子としての大腸菌QZ16株8時間での遺伝子発現レベルに対して計算した。
zipA SNPがアラニン生産性に対して果たす役割を決定するために、zipA SNPを、大腸菌QZ33株(ydbH-ldhAプロモーター欠失、YgaW Q5H)へと導入した。
zipAは必須遺伝子であるので、zipA cat-sacB組み込みカセットを、zipAに干渉せず、しかしその下流に組み込むために設計した。カセットは、プライマーRec4B_1_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅した。zipA SNPカセット(197bp)は、プライマーRec4B_2_F/Rを用いてQZ20株のゲノムDNAから増幅した。Red/ETを上記の通りに行なった。Rec4_seq_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。zipA SNPを、ldhAプロモーター欠失及びygaW SNPを有する大腸菌QZ33株へと導入した。作製された菌株は、QZ41株と称された。
QZ41株(zipA SNP、ygaW Q5H、Δldha突然変異体)を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ33株と比較してモニタリングした。
アラニン生産性に対するlpd SNPの影響を試験するために、大腸菌WZ33株(ydbH-ldhA del、ygaW Q5H)へとこれを導入して大腸菌QZ52株を作製し、QZ41株(ydbH-ldhA del、ygaW Q5H、zipA SNP)へと導入して大腸菌QZ53株を作製した。
lpd cat-sacB組み込みカセット(3087bp)を、lpdに干渉せず、しかしその上流に組み込むために設計した。カセットは、プライマーRec3B_1_F/R(表1)を用いてベクターpQZ11(Genescript社)から増幅し、lpd SNPを担持するQZ20株へと組み込むために用いた。lpd_SNP-cat-sacBカセット(3527bp)は、プライマーRec3B_2_F/Rを用いて、組み込まれたcat-sacBカセットを有するQZ20株のゲノムDNAから増幅し、大腸菌QZ33株及び大腸菌QZ41株へとそれぞれ組み込むために用いた。cat-sacB置換カセットは、QZ20株のゲノムからプライマーRec3B_F/Rを用いて増幅し、QZ33株及びQZ41株中のcat-sacBマーカーカセットを除去するために用いた。Red/ETは、上記の通りに行なった。Rec3_seq_F及びRec_3B_FR配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。
QZ52株(ΔydbH-ldhaプロモーター、ygaW Q5H、lpd SNP)を、炭素源として10g/Lグルコースを用いて、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ33株と比較してモニタリングした。
lpd SNPが大腸菌QZ41株に導入されたQZ53株(ΔydbH-ldhaプロモーター、ygaW Q5H、zipA SNP、lpd SNP)を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ41株と比較してモニタリングした。
その生来のプロモーターの制御下にあるlpdの追加コピーを、pACYC184プラスミドへと導入した。pACYC184-Lpd(p15 ori、ChlR、1細胞当たり約15コピー)を、市販のInFusionクローニング技術(Clontech, Mountain View, CA, USA)によって構築した。最初に、ベクターpACYC184(p15 ori、chlR、tetR)をNEB社(Ipswich, MA, USA)を介して入手し、これもまたNEB社からのHindIII及びSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化した。この消化は、テトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去した。それとは別に、lpd ORFを、以下のプライマー(lpd-pACYC_F、配列番号114及びlpd-pACYC_R、配列番号115)と共にPhusionポリメラーゼ(Thermo Scientific, Waltham, MA)を用いて、野生型大腸菌W株DNAからPCR増幅した。
lpd発現ベクターを含む菌株(QZ33/pACYC184-lpd)のアラニン生産性を、空の対照ベクターを含む菌株(QZ33/pACYC184)と比較した。前培養物を、37℃かつ200rpmにて一晩、20%の充填容量のLB培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた。発酵は、8%グルコースのNBS培地を用いて、DASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステムにて行なった。他の条件は上記と同様であった。
Claims (13)
- 以下の核酸分子:
(I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも90%の同一性を有する核酸分子、又は (III) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群より選択される配列を有する組換え核酸分子であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジンをコードするコドンにより、又はアミノ酸アルギニンをコードするコドンにより、又はアミノ酸チロシンをコードするコドンにより置換されているか、あるいは配列番号2の5位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、アミノ酸ヒスチジンにより、又はアミノ酸アルギニンにより、又はアミノ酸チロシンにより置換されており、かつ
(I)〜(IV)に規定される核酸分子によりコードされるポリペプチドが、配列番号2を有するポリペプチドと比較して活性及び/又は発現が改変されている、
上記組換え核酸分子。 - 以下のポリペプチド分子:
(I) 配列番号2の配列を含むポリペプチド分子、又は
(II) 配列番号2のポリペプチド分子に対して少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド分子
の群より選択される配列を有する組換えポリペプチド分子であって、
配列番号2の5位に対応する(I)又は(II)に属するポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、ヒスチジンにより、又はアルギニンにより、又はチロシンにより置換されており、かつ (I)又は(II)に規定されるポリペプチド分子が、配列番号2を有するポリペプチドと比較して活性及び/又は発現が改変されている、上記組換えポリペプチド分子。 - 請求項1に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的な少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現構築物。
- 請求項1に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含み、該プロモーターが、以下:
(I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも90%の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する核酸分子
からなる群より選択される核酸分子を有する、請求項3に記載の組換え発現構築物。 - 請求項1に規定される核酸分子又は請求項3若しくは4に規定される組換え発現構築物のうちの少なくとも1つを含む、組換えベクター。
- 請求項1に規定される組換え核酸分子又は請求項3若しくは4に記載の組換え発現構築物又は請求項5に記載の組換えベクターのうちの少なくとも1つを含む、組換え微生物。
- (I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも90%の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
を含む、請求項6に記載の組換え微生物であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジンをコードするコドンにより、又はアミノ酸アルギニンをコードするコドンにより、又はアミノ酸チロシンをコードするコドンにより置換されているか、あるいは配列番号2の5位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、アミノ酸ヒスチジンにより、又はアミノ酸アルギニンにより、又はアミノ酸チロシンにより置換されており、かつ
上記の変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び/又は発現を改変するものであり、
上記組換え微生物はさらに以下:
(a)ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(b)二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ/鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ/ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(c)NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(d)リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、
(e)フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
(f)アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強
からなる群より選択される特徴の少なくとも2つを有し、ここで、遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制、欠失、増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される、上記組換え微生物。 - リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び/又は発現の増大又は増強、並びに/あるいはZリングアセンブリに関与する細胞***タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大、増強又は改変をさらに含む、請求項6又は7に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 請求項6〜9のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を含む組成物。
- アラニン産生を可能にする条件下で、請求項6〜9のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を培養するステップを含む、アラニンの製造方法。
- アラニンの発酵生産のための、請求項1に記載の組換え核酸分子、請求項2に記載の組換えポリペプチド分子、請求項3若しくは4に記載の組換え発現構築物、請求項5に記載の組換えベクター、請求項6〜9のいずれか1項に記載の組換え微生物又は請求項10に記載の組成物の使用。
- 以下のステップ:
(I) 発酵槽中で請求項6〜9のいずれか1項に記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、アラニンを回収するステップ
を含む、アラニンの発酵生産のための方法。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361881968P | 2013-09-25 | 2013-09-25 | |
US201361881972P | 2013-09-25 | 2013-09-25 | |
US201361881969P | 2013-09-25 | 2013-09-25 | |
US201361881975P | 2013-09-25 | 2013-09-25 | |
US61/881,969 | 2013-09-25 | ||
US61/881,975 | 2013-09-25 | ||
US61/881,968 | 2013-09-25 | ||
US61/881,972 | 2013-09-25 | ||
PCT/IB2014/064426 WO2015044818A1 (en) | 2013-09-25 | 2014-09-11 | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016535977A JP2016535977A (ja) | 2016-11-24 |
JP6572206B2 true JP6572206B2 (ja) | 2019-09-04 |
Family
ID=52742164
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016516528A Expired - Fee Related JP6572206B2 (ja) | 2013-09-25 | 2014-09-11 | ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10047364B2 (ja) |
EP (1) | EP3052630A4 (ja) |
JP (1) | JP6572206B2 (ja) |
KR (1) | KR102400332B1 (ja) |
CN (1) | CN105683378B (ja) |
BR (1) | BR112016006606A2 (ja) |
CA (1) | CA2924088A1 (ja) |
MX (1) | MX2016003737A (ja) |
MY (1) | MY181068A (ja) |
RU (1) | RU2712510C2 (ja) |
WO (1) | WO2015044818A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
EP1654344B1 (de) | 2003-08-01 | 2018-10-17 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen |
AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
RU2712510C2 (ru) * | 2013-09-25 | 2020-01-29 | Басф Се | Рекомбинантный микроорганизм для улучшенного получения химических веществ тонкого органического синтеза |
US10208324B2 (en) | 2013-12-13 | 2019-02-19 | Basf Se | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals |
CN107750273B (zh) | 2015-03-18 | 2023-01-31 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于改善精细化学品生产的重组微生物 |
CN104774790B (zh) * | 2015-04-03 | 2020-11-06 | 江南大学 | 一种高效发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌 |
KR20180011313A (ko) | 2015-06-04 | 2018-01-31 | 바스프 에스이 | 정제 화학약품의 개선된 제조를 위한 재조합 미생물 |
MY189932A (en) | 2015-06-12 | 2022-03-22 | Basf Se | Recombinant microorganism for improved production of alanine |
MX2018006535A (es) | 2015-12-02 | 2018-08-15 | Basf Se | Metodo para producir proteinas en hongos filamentosos con accion clr2 reducida. |
EP3384003A1 (en) | 2015-12-02 | 2018-10-10 | Basf Se | Method of producing proteins in filamentous fungi with decreased clri activity |
CN108660142A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-16 | 河北大学 | 一种高产l-丙氨酸的基因及其工程菌的构建方法 |
CN110904062B (zh) * | 2018-09-18 | 2022-03-15 | 安徽华恒生物科技股份有限公司 | 一株高产l-丙氨酸的菌株 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5948889A (en) | 1996-05-21 | 1999-09-07 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for screening antimicrobials |
US6610836B1 (en) * | 1999-01-29 | 2003-08-26 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics |
DE102004026152A1 (de) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Basf Ag | Fermentative Herstellung von Feinchemikalien |
CN102224165A (zh) * | 2008-09-23 | 2011-10-19 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增加的产量的转基因植物 |
MY187676A (en) | 2009-06-04 | 2021-10-08 | Genomatica Inc | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods |
RU2460793C2 (ru) * | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
JP2013000064A (ja) * | 2011-06-17 | 2013-01-07 | Tohoku Univ | 組換え微生物、当該組換え微生物を用いたアラニンの製造方法 |
CA2920814A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Basf Se | Modified microorganism for improved production of alanine |
RU2712510C2 (ru) | 2013-09-25 | 2020-01-29 | Басф Се | Рекомбинантный микроорганизм для улучшенного получения химических веществ тонкого органического синтеза |
US10208324B2 (en) | 2013-12-13 | 2019-02-19 | Basf Se | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals |
-
2014
- 2014-09-11 RU RU2016115777A patent/RU2712510C2/ru active
- 2014-09-11 KR KR1020167010312A patent/KR102400332B1/ko active IP Right Grant
- 2014-09-11 WO PCT/IB2014/064426 patent/WO2015044818A1/en active Application Filing
- 2014-09-11 EP EP14847532.0A patent/EP3052630A4/en not_active Withdrawn
- 2014-09-11 BR BR112016006606A patent/BR112016006606A2/pt active Search and Examination
- 2014-09-11 US US15/024,464 patent/US10047364B2/en active Active
- 2014-09-11 CA CA2924088A patent/CA2924088A1/en not_active Abandoned
- 2014-09-11 MX MX2016003737A patent/MX2016003737A/es active IP Right Grant
- 2014-09-11 JP JP2016516528A patent/JP6572206B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-09-11 CN CN201480057268.7A patent/CN105683378B/zh active Active
- 2014-09-11 MY MYPI2016000496A patent/MY181068A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3052630A4 (en) | 2017-08-16 |
KR102400332B1 (ko) | 2022-05-20 |
EP3052630A1 (en) | 2016-08-10 |
RU2016115777A (ru) | 2017-10-30 |
KR20160057478A (ko) | 2016-05-23 |
CN105683378A (zh) | 2016-06-15 |
MY181068A (en) | 2020-12-17 |
CN105683378B (zh) | 2021-06-29 |
MX2016003737A (es) | 2017-01-12 |
RU2712510C2 (ru) | 2020-01-29 |
US10047364B2 (en) | 2018-08-14 |
US20160355829A1 (en) | 2016-12-08 |
RU2016115777A3 (ja) | 2018-09-03 |
BR112016006606A2 (pt) | 2017-09-19 |
CA2924088A1 (en) | 2015-04-02 |
JP2016535977A (ja) | 2016-11-24 |
WO2015044818A1 (en) | 2015-04-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6572206B2 (ja) | ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 | |
US10731188B2 (en) | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals | |
JP7071124B2 (ja) | ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 | |
JP6914846B2 (ja) | ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 | |
US20210032667A1 (en) | Recombinant microorganism for improved production of alanine | |
RU2708312C1 (ru) | Рекомбинантный микроорганизм для улучшенного получения химических продуктов тонкого органического синтеза |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161007 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170906 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190304 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190326 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190620 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190627 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190716 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190809 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6572206 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |