CN106661595A - 在发酵中使用甘油和限制进料的碳水化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过发酵生产有机酸的方法,包括方法步骤:I)在培养基中培养微生物,其中向培养基中进料甘油和其他含碳化合物作为可同化碳源,以允许微生物产生有机酸,由此获得包含有机酸的发酵液;II)从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机酸或其盐;其中,在方法步骤I)中至少在特定一段时间中,其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)。
Description
发明领域
本发明涉及一种通过发酵生产有机酸的方法。
背景技术
有机化合物,如具有6个或更少碳的小的二羧酸类化合物,是商业上重要的化学品,具有许多用途。例如,小的二酸包括1,4-二酸,如琥珀酸、苹果酸和酒石酸,以及5-碳分子衣康酸。其他二酸包括两个碳的草酸、三个碳的丙二酸、五个碳的戊二酸和6个碳的己二酸,并且还存在这些二酸的许多衍生物。
总的来说,小的二酸具有一些化学相似性,其在聚合物生产中的使用可以给树脂提供专门的特性。这样的多用性使其能够容易地融入下游化学基础结构市场。例如,1,4-二酸分子可以实现大规模化学品马来酸酐的许多用途,其可以被转化成各种工业化学品(四氢呋喃、丁内酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)和琥珀酸衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、丁二胺和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金属和印刷工业中具有许多用途。衣康酸形成用于3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO、甲基-THF等生产的起始材料。
特别地,琥珀酸或琥珀酸盐——这些术语在本文中可互换使用——已经引起了相当大的兴趣,因为其已经用作食品、化学和药物工业中许多工业上重要化学品的前体。实际上,来自美国能源部的报道称,琥珀酸是从生物质制造的前12个化学结构单元之一。因此,在细菌中制备二酸的能力将具有显著的商业重要性。
WO-A-2009/024294公开了琥珀酸生产细菌菌株,其是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成员,最初从瘤胃分离,并且能够利用甘油作为碳源,WO-A-2009/024294还公开了从其衍生的保留了所述能力的变体和突变菌株,特别是,保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心,Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,因霍夫街,7B,D-38124布劳恩斯切魏格,德国)、具有保藏号DSM 18541(ID 06-614)、具有生产琥珀酸能力的命名为DD1的细菌菌株。如Kuhnert等,2010分类的,DD1-菌株属于产琥珀酸巴斯夫菌(Basfia succiniciproducens)种和巴斯德氏菌科。WO-A-2010/092155中公开了这些菌株的突变体,其中ldhA-基因和/或pflD-或pflA-基因已经被破坏,这些突变株的特征在于,与WO-A-2009/024294中公开的DD1-野生型相比,在厌氧条件下,从碳源(如甘油或甘油和碳水化合物(如麦芽糖)的混合物)产生显著提高的琥珀酸产量。
然而,在例如WO-A-2009/024294和WO-A-2010/092155中公开的生产有机酸的方法中,使用甘油作为唯一碳源时,时空产率仍然是可提高的。
因此,本发明的一个目的是克服现有技术的缺陷。
特别地,本发明的一个目的是,提供发酵生产有机酸(如琥珀酸)的方法,所述方法与现有技术的已知方法相比,允许在使用甘油作为主要碳源时以较高的时空产率生产这些有机酸。
发明内容
通过发酵生产有机酸的如下方法,促进了上述目的的实现,所述方法包括方法步骤:
I)在培养基中培养微生物,其中向培养基中进料(feed)甘油和其他含碳化合物作为可同化碳源,以允许微生物产生有机酸,由此获得包含有机酸的发酵液;
II)从方法步骤I)获得的发酵液,回收有机酸或其盐;
其中,所述其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)低于该其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)。
本申请的发明人已经发现,在甘油用作主要碳源的发酵方法中生产有机酸(如琥珀酸)时,如果以限制的方式加入其他含碳化合物,如蔗糖或D-葡萄糖,有机酸(如琥珀酸)的时空产率可以显著提高。通过以限制的方式加入其他含碳化合物,其他含碳化合物的消耗速率低于该其他含碳化合物的最大理论消耗速率。
在根据本发明方法的方法步骤I)中,在培养基中培养微生物,其中向培养基中进料甘油和其他含碳化合物作为可同化碳源,以允许微生物产生有机酸,由此获得包含有机酸的发酵液。
根据本发明的合适微生物可以是酵母、真菌或细菌。合适的细菌、酵母或真菌特别是已经作为细菌、酵母或真菌菌株保藏在德国微生物保藏中心Deutsche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSMZ),Brunswick(德国)的那些细菌、酵母或真菌。根据本发明合适的细菌属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm下详述的属,根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm下详述的那些属,根据本发明合适的真菌属于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm下详述的那些真菌。
优选,方法步骤I)中使用的微生物是细菌细胞。如本文中使用的术语“细菌细胞”是指原核生物,即,细菌。细菌可以基于其生化和微生物学特性及其形态来分类。这些分类标准是本领域熟知的。根据本发明方法的一个优选实施方案,微生物属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科、芽孢杆菌科(Bacillaceae)或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。
“肠杆菌科”是一个大的细菌科,包括许多较熟悉的细菌,如沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichia coli)。它们属于变形菌纲(Proteobacteria),被给予了它们自己的目(肠杆菌目(Enterobacteriales))。肠杆菌科的成员是杆状的。与其他变形菌纲细菌一样,它们具有革兰氏阴性株,并且它们是兼性厌氧菌,发酵糖以产生乳酸和各种其他终产物,如琥珀酸。大部分还可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐。与大部分相似的细菌不同,肠杆菌科通常缺乏细胞色素C氧化酶。大部分具有许多鞭毛用于游动,但少数属是不动的。它们不形成孢子,并且大多是过氧化氢酶阳性的。这个科的许多成员是人和其他动物肠道中发现的肠道菌群的正常部分,而其他在水或土壤中被发现,或是各种不同动物和植物上的寄生物。Escherichia coli(大肠杆菌),更多称为E.coli,是最重要的模式生物之一,并且其遗传学和生物化学已经得到详细研究。肠杆菌科的大部分成员具有有缘毛的I型菌毛,参与将该细菌细胞粘附到其宿主上。肠杆菌科的实例为大肠杆菌(E.coli)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。
“巴斯德氏菌科”包括革兰氏阴性变形菌纲的一个大家族,成员从细菌(如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))至动物和人粘膜的共生菌。大部分成员作为共生菌生活在鸟类和哺乳动物的粘膜表面上,尤其是在上呼吸道中。巴斯德氏菌科通常是杆状的,是显著的兼性厌氧菌组。它们可以通过氧化酶的存在而与相关的肠杆菌科区分开来,并且通过不存在鞭毛而与其他相似的细菌区分开来。巴斯德氏菌科中的细菌已经基于代谢特性及其16S RNA和23S RNA的序列,归类至各个属中。巴斯德氏菌科中的许多细菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因并且能够厌氧地将碳源发酵成有机酸。
“芽孢杆菌科”是可以产生内生孢子的革兰氏阳性、异养、杆状细菌家族。这个科的能动型成员的特征在于有缘毛的鞭毛。一些芽孢杆菌科是需氧的,而其他是兼性或严格厌氧菌。大部分是非致病的,但已知芽孢杆菌属(Bacillus)种引起人的疾病。这个科还包括杆菌类(Bacilli),其包括两个目,芽孢杆菌目(Bacillales)和乳杆菌目(Lactobacillales)。芽孢杆菌属种是可以在37℃需氧条件下生长的、大的圆柱状细菌。它们通常是非致病的。芽孢杆菌目包括脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、显核菌科(Caryophanaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、游动球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)、苏黎士杆菌科(Turicibacteraceae)。杆菌类中的许多含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因并且能够厌氧地将碳源发酵成有机酸。
“棒状杆菌科”是由真杆菌目(Eubacteriales)的大部分为革兰氏阳性的需氧不动杆状细菌组成的一个大家族。这个科还包括棒状杆菌属(Corynebacterium),其是革兰氏阳性、杆状细菌属。棒状杆菌在自然界广泛分布并且大部分是无害的。一些在工业情况中是有用的,如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)。
特别优选,方法步骤I)中使用的微生物是修饰的微生物。术语“修饰的微生物”包括已经在遗传上被改变、修饰或工程化(例如,遗传工程化)的微生物,由此其与产生其的天然野生型微生物相比呈现出改变、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如,当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。根据本发明方法的特别优选的实施方案,方法步骤I)中使用的修饰微生物是重组微生物,这表示所述微生物是使用重组DNA获得的。如本文中使用的表述“重组DNA”是指,使用实验室方法(分子克隆)将来自多个来源的遗传物质结合在一起形成生物学有机体中原本不存在的序列而获得的DNA序列。这样的重组DNA的一个实例是其中已经***了异源DNA序列的质粒。
优选,方法步骤I)中所使用的微生物,特别是修饰的微生物,源自属于巴斯德氏菌科的野生型。在这点上,更优选修饰微生物源自属于巴斯夫菌属(Basfia)的野生型,特别优选修饰微生物源自属于物种产琥珀酸巴斯夫菌(Basfia succiniciproducens)的野生型。最优选,方法步骤I)中使用的修饰微生物所源自的野生型微生物是,依据布达佩斯条约保藏在德国DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH)具有保藏号DSM 18541的产琥珀酸巴斯夫菌DD1株。该菌株最初从德国来源的奶牛的瘤胃分离。可以从动物并优选哺乳动物的胃肠道分离巴斯德氏菌属(Pasteurella)细菌。特别地,细菌菌株DD1可以从牛瘤胃分离并且能够利用甘油(包括粗制甘油)作为碳源。可以用于制备根据本发明的修饰微生物的其它巴斯夫菌属菌株有,已经保藏在DSZM具有保藏号DSM22022的巴斯夫菌属菌株、或已经保藏在瑞典哥德堡大学保藏中心(Culture Collection of theUniversity of)(CCUG)具有保藏号CCUG57335、CCUG 57762、CCUG 57763、CCUG57764、CCUG 57765或CCUG57766的巴斯夫菌属菌株。所述菌株最初从德国或瑞士来源的奶牛的瘤胃分离。
在这点上,特别优选,根据本发明方法的方法步骤I)中使用的修饰微生物来源于如下野生型微生物,所述野生型微生物具有SEQ ID NO:1的16S rDNA、或显示出与SEQ IDNO:1至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或至少99.9%序列同源性的序列的16SrDNA。还优选,根据本发明的修饰微生物所源自的野生型具有SEQ ID NO:2的23S rDNA、或显示出与SEQ ID NO:2至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或至少99.9%序列同源性的序列的23S rDNA。
就用于本发明修饰微生物的各种多肽或多核苷酸提及的同一性百分数值,优选按照在比对序列的全长上的残基同一性来计算,例如,使用来自生物信息学软件包EMBOSS(版本5.0.0,http://emboss.source-forge.net/what/)的程序针、使用缺省参数计算的同一性(对于相当相似的序列),所述参数为空位开放(开放空位的罚分):10.0,空位延伸(延伸空位的罚分):0.5,和数据文件(数据包中包括的评分矩阵文件):EDNAFUL。
应当注意,根据本发明方法的方法步骤I)中使用的修饰微生物不仅可以源自上述野生型微生物,尤其源自产琥珀酸巴斯夫菌株DD1,也可以源自这些菌株的变体。在这点上,表述“菌株的变体”包括与野生型菌株具有相同或基本上相同特征的每个菌株。在这点上,特别优选,变体的16S rDNA与该变体所源自的野生型具有至少90%,优选至少95%,更优选至少99%,更优选至少99.5%,更优选至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少99.8%和最优选至少99.9%的同一性。还特别优选,变体的23S rDNA与该变体所源自的野生型具有至少90%,优选至少95%,更优选至少99%,更优选至少99.5%,更优选至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少99.8%和最优选至少99.9%的同一性。在该定义下的菌株的变体,例如,可以通过用诱变化学剂、X-射线或UV光处理野生型菌株,或通过重组方法缺失、超表达基因或将异源基因引入细胞中来获得。
根据本发明方法的优选实施方案,方法步骤I)中使用的修饰微生物是与其野生型相比,具有以下活性的微生物:
i)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性,
ii)降低的乳酸脱氢酶活性,或
iii)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性和降低的乳酸脱氢酶活性。
在表述“与其野生型相比,修饰微生物具有降低的由x-基因编码的酶的活性”中,其中x-基因是ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因,术语“野生型”是指由x-基因编码的酶的活性尚没有降低的微生物,即,该微生物的基因组以引入x-基因(特别是ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因)的遗传修饰之前的状态存在。优选,表述“野生型”指,微生物的基因组,特别是其x-基因,以作为进化结果而天然形成的状态存在。该术语可以用于整个微生物,但优选用于单个基因,例如,ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因。
如本文中使用的,与野生型中的相应酶的活性相比,术语“降低的酶活性”优选对应于相应酶的活性的至少50%,优选至少75%和更优选至少95%的降低。
术语“降低的酶活性”包括,例如,所述遗传修饰(例如,遗传工程化)的微生物的酶表达水平低于所述微生物的野生型的酶表达水平。用于降低酶表达的遗传操纵可以包括,但不限于,缺失编码所述酶的基因或其部分,改变或修饰与编码酶的基因的表达相关的调控序列或位点(例如,通过除去强启动子或阻抑型启动子),修饰参与酶编码基因的转录和/或基因产物翻译的蛋白(例如,调控蛋白、阻遏物、增强子、转录激活物等),或本领域常规的降低特定基因表达的任何其他常规方式(包括,但不限于,使用反义核酸分子或iRNA或其他方法来敲除或阻断靶标蛋白的表达)。此外,可以将去稳定化元件引入mRNA中或引入遗传修饰导致RNA的核糖体结合位点(RBS)劣化。还可以以使翻译效率和速度降低的方式来改变基因的密码子使用。
还可以通过引入一个或多个导致降低的酶活性的基因突变来获得降低的酶活性。此外,酶活性的降低还可以包括激活酶的失活(或降低的表达),所述激活酶是激活其活性待降低的酶所必需的。通过后一种方法,其活性待降低的酶优选保持在失活状态。
具有乳酸脱氢酶缺陷和/或丙酮酸甲酸裂解酶活性缺陷的修饰微生物公开于WO-A-2010/092155、US 2010/0159543和WO-A-2005/052135中,其公开中关于降低微生物,优选是巴斯德氏菌属的细菌细胞,特别优选产琥珀酸巴斯夫菌株DD1中乳酸脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的活性的不同方法,按引用并入本文中。测定丙酮酸甲酸裂解酶活性的方法例如公开于Asanuma N.和Hino T.,“Effects of pH and Energy Supply on Activity andAmount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”(pH和能量供应对牛链球菌中的丙酮酸甲酸裂解酶的活性和含量的影响),Appl.Environ.Microbiol.(2000),Vol.66,第3773-3777页;测定乳酸脱氢酶活性的方法例如公开于Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.和Grassl,M.(1983-1986),“Methods of Enzymatic Analysis”(酶分析方法),第3版,第III卷,第126-133页,Verlag Chemie,Weinheim。
在这点上,优选,通过失活ldhA-基因(其编码乳酸脱氢酶LdhA;EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)来实现乳酸脱氢酶活性的降低,通过失活pflA-基因(其编码丙酮酸甲酸裂解酶的激活物PflA;EC 1.97.1.4)或pflD-基因(其编码丙酮酸甲酸裂解酶PflD;EC 2.3.1.54)来实现丙酮酸甲酸裂解酶的降低,其中优选通过缺失这些基因或其部分,通过缺失这些基因的调控元件或其至少一部分,或通过将至少一个突变引入这些基因中来实现这些基因(即,ldhA、pflA和pflD)的失活,其中优选通过如上所述的“坎贝尔重组”(Campbellrecombination)来进行这些修饰。
其活性在修饰微生物中降低的ldhA-基因优选包括选自以下的核酸:
α1)具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸;
α2)编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核酸;
α3)与α1)或α2)的核酸具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的核酸,所述同一性是在α1)或α2)的核酸的整个长度上的同一性;和
α4)编码与α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的氨基酸序列的核酸,所述同一性是在α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列的整个长度上的同一性。
其活性在修饰微生物中降低的pflA-基因优选包括选自以下的核酸:
β1)具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸;
β2)编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核酸;
β3)与β1)或β2)的核酸具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的核酸,所述同一性是在β1)或β2)的核酸的整个长度上的同一性;和
β4)编码与β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的氨基酸序列的核酸,所述同一性是在β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列的整个长度上的同一性。
其活性在修饰微生物中降低的pflD-基因优选包括选自以下的核酸:
γ1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核酸;
γ2)编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的核酸;
γ3)与γ1)或γ2)的核酸具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的核酸,所述同一性是在γ1)或γ2)的核酸的整个长度上的同一性;和
γ4)编码与γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%同一性的氨基酸序列的核酸,所述同一性是在γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列的整个长度上的同一性。
在这点上,优选根据本发明方法的方法步骤I)中使用的修饰微生物包括:
A)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入;
B)pflD-基因或其至少一部分的缺失,pflD-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflD-基因中至少一个突变的引入;
C)pflA-基因或其至少一部分的缺失,pflA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflA-基因中至少一个突变的引入;
D)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入
和
pflD-基因或其至少一部分的缺失,pflD-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflD-基因中至少一个突变的引入;
或
E)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入
和
pflA-基因或其至少一部分的缺失,pflA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflA-基因中至少一个突变的引入。
优选,在本发明方法的方法步骤I)中由微生物产生的有机酸包括羧酸,如甲酸、乳酸、丙酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或这些羧酸的盐,二羧酸,如丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其盐,或三羧酸,如柠檬酸或其盐。根据本发明方法的特别优选的实施方案,有机酸是琥珀酸。在本发明的内容中使用的术语“琥珀酸”必须以其最宽的含义来理解,还包括其盐(即,琥珀酸盐),例如,碱金属盐,如Na+和K+-盐,或碱土金属盐,如Mg2+和Ca2+盐,或铵盐或琥珀酸酐。
优选在约10至60℃或20至50℃或30至45℃的温度下在2.5至9.0或3.5至8.0或4.5至7.0的pH下在培养基中孵育微生物。
优选,有机酸,尤其是琥珀酸,在厌氧条件下产生。可以通过常规技术建立厌氧条件,例如,通过将反应介质的组分脱气并通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮气或其混合物和任选地氢气来维持厌氧条件。可以通过常规技术,例如通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入空气或氧气,来建立需氧条件。如果合适,在过程中可以使用0.1至1.5巴的轻微超压力。
根据本发明的方法的特征在于,其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)低于该其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)。如果其他含碳化合物的量(即,进料至培养基中的量和可能已经包含在培养基中且尚未消耗的量)低于细胞理论上可以消耗的其他含碳化合物的最大量,则其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率。由此,其他含碳化合物的量是受到限制的。
在本发明的方法中,例如,可以通过其他含碳化合物的进料速率来控制其他含碳化合物的消耗速率(条件是,培养基中可能已经存在且尚未消耗的其他含碳化合物的量足够低)。在这点上,优选其他含碳化合物的进料速率不高于其他含碳化合物的最大消耗速率的50%,更优选不高于25%,更优选不高于10%和最优选不高于5%。当培养基基本上不含任何(尚未消耗的)其他含碳化合物,或当其他含碳化合物的量低于0.5g/l,优选低于0.05g/l,最优选低于检测限,则尤其可以通过其他含碳化合物的进料速率来控制其他含碳化合物的消耗速率。在优选实施方案中,进料至培养基中的其他含碳化合物被细胞立即且完全消耗。在这样的条件下,以限制方式进料其他含碳化合物。
此外,优选在本发明的方法中,维持如下条件特定长度的一段时间,其中在所述条件下其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率,优选维持所述条件至少30分钟,优选至少1小时,更优选至少6小时,甚至更优选至少12小时和最优选至少20小时的培养时间。通常,在总培养时间的至少25%,优选至少50%和最优选至少70%中,实现其他含碳化合物限制进料的条件。
优选,其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)不高于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)的50%,更优选不高于25%,更优选不高于10%和最优选不高于5%。如果其他含碳化合物的最大消耗速率为例如1g/L/h,则所述消耗速率不高于0.5g/L/h(50%),优选不高于0.25g/L/h(25%),更优选不高于0.1g/L/h(10%)和最优选不高于0.05g/L/h(5%)。
在这点上,此外优选,同时(即,在其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率的相同时间段内),甘油的量不受限制,而是优选过量存在(这表示,优选甘油以如下的量添加和/或甘油以如下的量存在于培养基中,所述量使得细胞消耗甘油的速度不快于甘油加入细胞培养物中的速度和/或使得细胞消耗甘油的量不超过其在培养基中的存在量)。在这点上,优选甘油的消耗速率(CRg;以g/升/小时计)为甘油的最大理论消耗速率(CRg.max;以g/升/小时计)的25%以上,优选50%以上,更优选75%以上,甚至更优选90%以上和最优选95%以上。如果甘油的最大消耗速率为例如1g/L/h,则消耗速率为0.5g/L/h(50%)以上,优选0.75g/L/h(75%)以上,更优选0.9g/L/h(90%)以上和最优选0.95g/L/h(95%)以上。
根据本发明方法的优选实施方案,在至少30分钟,优选至少1小时,更优选至少6小时,甚至更优选至少12小时和最优选至少20小时的培养时间中,
-其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)不高于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)的50%,更优选不高于25%,更优选不高于10%和最优选不高于5%
和,同时,
-甘油的消耗速率(CRg;以g/升/小时计)为甘油的最大理论消耗速率(CRg.max;以g/升/小时计)的25%以上,优选50%以上,更优选75%以上,甚至更优选90%以上和最优选95%以上。
为了确定其他含碳化合物的最大理论消耗速率CRc.c.max和甘油最大理论消耗速率CRg.max,可以分别在过量的其他含碳化合物和甘油的存在下孵育细胞。如果在至少特定的一段时间中可以在培养基中检测到特定最小量的尚未消耗的底物(即,其他含碳化合物或甘油),优选至少1g/L的量,更优选至少2.5g/L,则存在过量的其他含碳化合物和甘油。
为了测定其他含碳化合物的最大理论消耗速率CRc.c.max,可以在用于测定CRc.c(即,在含碳化合物以限制量存在时,含碳化合物的实际消耗速率的测定)的完全相同的培养条件下,培养细胞一小时,但其中使用至少5g/升的含碳化合物的初始量、并且以使培养基中尚未消耗的含碳化合物的浓度总是在1g/L以上的量连续添加含碳化合物。此外,在本文中,在CRc.c.max测定的上下文中,表述“在完全相同的培养条件下”表示,在与CRc.c测定时相比存在相同量的甘油但具有过量的含碳化合物的情况下,进行CRc.c.max的测定。为了测定甘油的最大理论消耗速率CRg.max,也在用于测定CRg(即,甘油的实际消耗速率)的完全相同的培养条件下,培养细胞一小时,但其中作为唯一碳源的甘油的初始量为至少5g/升,且进一步连续添加甘油,添加量使得培养基中尚未消耗的甘油的浓度总是在1g/L以上。如本文中使用的,在CRg.max测定的上下文中,表述“在完全相同的培养条件下”表示,在与测定CRg时相比存在相同量的其他含碳化合物但具有过量甘油的情况下,进行CRg.max的测定。
可以在培养开始时立刻将碳源(即,甘油和其他含碳化合物)加入培养物中,或可以周期性地或连续地添加碳源。当然,还可以例如在培养开始时立刻加入一种碳源(例如,甘油),而周期性地或连续地加入其他碳源(例如,其他含碳化合物)。不管碳源加入发酵培养基中的方式如何,优选,将用于其他含碳化合物的限制进料和甘油的优选非限制进料的上述条件,维持至少30分钟,优选至少1小时,更优选至少6小时,甚至更优选至少12小时和最优选至少24小时的培养时间。
优选,以至少5:1,更优选至少7.5:1和最优选至少10:1的甘油:其他含碳化合物的总重量比,向培养基中进料甘油和其他含碳化合物。如本文中使用的,术语“总重量比”定义方法步骤I)中添加的其他含碳化合物总量与甘油总量的比。
根据本发明方法的一个实施方案,向发酵培养基中进料其他含碳化合物,其中进料量使得发酵培养基中其他含碳化合物的浓度增加低于0.1g/l/h,优选低于0.01g/l/h。最优选,发酵培养基中其他含碳化合物的浓度完全没有提高(因为添加的含碳化合物立即被消耗)。在这点上,还优选,培养基中的其他含碳化合物的浓度为0至1g/L,优选0.6g/L以下,更优选0.3g/L以下,甚至更优选0.1g/L以下,其中最优选地,由于其他含碳化合物被微生物快速消耗,如使用合适的标准试验(优选通过HPLC,如本文实验部分中的描述)测量的,例如,作为培养基中的残留浓度测定的,培养基中的其他含碳化合物的浓度低于检测限。
其他含碳化合物优选是除了甘油以外的碳水化合物,更优选选自蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-***糖、D-半乳糖、D-甘露糖及其混合物的碳水化合物或含有至少一种所述化合物的组合物。最优选,其他含碳化合物选自蔗糖和D-葡萄糖,最优选蔗糖、D-葡萄糖及其混合物。
用作可同化碳源的甘油可以以纯甘油的形式或以未经之前纯化的粗制甘油的形式来使用,所述粗制甘油例如获自生物柴油或生物乙醇生产。
可同化碳源的初始浓度(即,甘油和至少一种其他含碳化合物的总和)优选被调节至0至100g/l,优选0至75g/l,更优选0至50g/l,甚至更优选0至25g/l范围中的值,并且在培养过程中维持在所述范围中(如果其他含碳化合物的消耗速度快于其进料至细胞培养物中的速度,可同化碳源的初始浓度可以为0g/l)。反应培养基的pH可以通过加入合适的碱来控制,例如,气态氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果在发酵过程中形成的有机酸是羧酸或二羧酸,这些碱中和剂尤为需要。在琥珀酸作为有机酸的情况中,Mg(OH)2和MgCO3是特别优选的碱。
根据本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌式发酵罐、泡罩塔和环管反应器中进行。有关可能的方法类型(包括搅拌器类型和几何设计)的综述可以见于Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,第1卷。在根据本发明的方法中,可用的典型变量是本领域技术人员已知的或例如在Chmiel,Hammes和Bailey:“Biochemical Engineering”中解释的以下变量:如分批、补料-分批、重复的补料-分批或者连续发酵,使用和不用生物质的再循环。根据生产菌株,为了获得良好的产量(YP/S),可以喷射空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或合适的气体混合物。
方法步骤I)中用于生产有机酸(尤其是琥珀酸)的特别优选的条件为:
进一步优选,方法步骤I)中,可同化碳源(即,甘油和其他含碳化合物)转化成有机酸,优选转化成琥珀酸,碳产率YP/S(有机酸/碳,优选琥珀酸/碳)为至少0.75g/g,优选至少0.85g/g和最优选至少1.0g/g。
进一步优选,方法步骤I)中,可同化碳源(即,甘油和其他含碳化合物)转化成有机酸,优选转化成琥珀酸,比生产产率为至少0.6g g DCW-1h-1有机酸,优选琥珀酸,或至少0.65g g DCW-1h-1,至少0.7g g DCW-1h-1,至少0.75g g DCW-1h-1或至少0.77g g DCW-1h-1有机酸,优选琥珀酸。
进一步优选,方法步骤I)中,可同化碳源(即,甘油和其他含碳化合物)转化成有机酸,优选转化成琥珀酸,其中有机酸,优选琥珀酸,的时空产率为至少2.2g/(L×h)或至少2.5g/(L×h),至少2.75g/(L×h),至少3g/(L×h),至少3.25g/(L×h),至少3.5g/(L×h),至少3.7g/(L×h),至少4.0g/(L×h),至少4.5g/(L×h)或至少5.0g/(L×h)有机酸,优选琥珀酸。根据本发明方法的另一个优选实施方案,在方法步骤I)中,微生物将至少20g/L,更优选至少25g/L和甚至更优选至少30g/L的可同化碳源(即,甘油和至少一种其他含碳化合物的总和)转化成至少20g/l,更优选至少25g/l和甚至更优选至少30g/l的有机酸,优选琥珀酸。
如本文中描述的不同产率参数(“碳产率”或“YP/S”;“比生产产率”;或“时空产率(STY)”)是本领域公知的,并且可以按照例如Song和Lee,2006中所述来测定。“碳产率”和“YP/S”(均以产生的有机酸质量/消耗的可同化碳源的质量来表示)在本文中按照同义词来使用。比生产产率描述每g干生物质每h每L发酵液产生的产物(如琥珀酸)的量。表示为“DCW”的干细胞重量描述生物化学反应中生物活性微生物的量。该值以每h每g DCW的g产物来给出(即,g g DCW-1h-1)。时空产率(STY)定义为,在整个培养时间中考虑,发酵过程中形成的有机酸的总量与培养物体积的比。时空产率也称为“容积生产力”(volumetricproductivity)。
在方法步骤II)中,从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机酸,优选琥珀酸,或其盐。
通常,回收过程包括从发酵液分离微生物(称为“生物质”)的步骤。用于移出生物质的方法是本领域技术人员已知的,并且包括过滤、沉淀、浮选或其组合。因此,例如,可以使用离心机、分离器、倾析器、滤器或在浮选装置中,移出生物质。为了有价值产物的最大回收,常常建议洗涤生物质,例如,以渗滤(diafiltration)的形式来洗涤。方法的选择取决于发酵液中生物质的含量和生物质的性质、以及生物质与有机酸(即,有价值的产物)的相互作用。在一个实施方案中,可以将发酵液灭菌或巴氏杀菌。在进一步的实施方案中,将发酵液浓缩。根据需要,这种浓缩可以分批或连续进行。应当选择压力和温度范围,使得首先没有产物损失,并且其次需要最少使用装置和能量。对于多阶段蒸发的压力和温度水平的熟练选择特别能够节约能量。
回收过程可以进一步包括其他纯化步骤,其中将有机酸,优选琥珀酸,进一步纯化。然而,如果有机酸通过以下所述的化学反应转化成次级有机产物,则取决于反应的种类和反应条件,有机酸的进一步纯化不一定是必需的。对于方法步骤II)中获得的有机酸的纯化,优选针对琥珀酸的纯化,可以使用本领域技术人员已知的方法,例如结晶、过滤、电渗析和色谱。在琥珀酸作为有机酸的情况中,例如,可以通过使用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和,将琥珀酸沉淀为琥珀酸钙产物,并过滤沉淀物,以分离琥珀酸。通过用硫酸酸化,接着过滤除去沉淀的硫酸钙(石膏),可以从沉淀的琥珀酸钙回收琥珀酸。可以通过离子交换色谱进一步纯化所得到的溶液,以除去不合需要的残留离子。或者,如果已经使用氢氧化镁、碳酸镁或其混合物来中和发酵液,则可以将方法步骤I)中获得的发酵液酸化,以将培养基中所含的琥珀酸镁转化成酸形式(即,琥珀酸),随后可以通过将酸化的培养基冷却而结晶琥珀酸。更多合适的纯化方法的实例公开于EP-A-1 005 562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268和WO-A-2011/064151和EP-A-2 360 137。
根据本发明方法的优选实施方案,所述方法进一步包括方法步骤:
I)通过至少一个化学反应,将方法步骤I)中获得的包含在发酵液中的有机酸、或将方法步骤II)中获得的回收的有机酸,转化成不同于所述有机酸的次级有机产物。
在琥珀酸作为有机酸的情况中,优选的次级有机产物选自琥珀酸酯及其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
根据用于生产THF、BDO和/或GBL的优选实施方案,该方法包括:
b1)将方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL,或
b2)将方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二-低级烷基酯,和将所述酯随后催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。
根据用于生产吡咯烷酮的优选实施方案,该方法包括:
b)将方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸铵盐以本身已知的方式化学转化成吡咯烷酮。
对于制备这些化合物的详细内容,可以参考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。
现在借助附图和非限制性实施例来更详细地解释本发明。
附图简述
图1显示了质粒pSacB(SEQ ID NO:9)的示意图。
图2显示了质粒pSacBΔldhA(SEQ ID NO:10)的示意图。
图3显示了质粒pSacBΔpflA(SEQ ID NO:11)的示意图。
图4显示了质粒pSacBΔpflD(SEQ ID NO:12)的示意图。
实施例
实施例1:用于产琥珀酸巴斯夫菌转化的一般方法
表1:本实施例涉及的DD1-野生型和突变株的命名
菌株 |
野生型DD1(保藏号DSM18541) |
DD1ΔldhAΔpflA |
DD1ΔldhAΔpflD |
使用以下实验方案,通过电穿孔,用DNA转化产琥珀酸巴斯夫菌DD1(野生型)。
为了制备预培养物,自冷冻储备物,接种DD1于100ml摇瓶中的40ml BHI(脑心浸液;Becton,Dickinson and Company)中。在37℃;200rpm,孵育过夜。为了制备主培养物,将100ml BHI放入250ml摇瓶中并用预培养物接种至0.2的终OD(600nm)。孵育在37℃;200rpm进行。在大约0.5、0.6和0.7的OD,收集细胞,用4℃的10%冷甘油洗涤沉淀物一次并重悬浮于2ml 10%甘油(4℃)中。
将100μl感受态细胞与2-8μg质粒-DNA混合并在具有0.2cm宽度的电穿孔杯中在冰上保持2min。在以下条件下进行电穿孔:400Ω;25μF;2.5kV(Gene Pulser,Bio-Rad)。在电穿孔后立即加入1ml的冷却BHI并且在37℃孵育大约2h。
将细胞铺在含有5mg/L氯霉素的BHI上,并且在37℃孵育2-5d,直至转化体的菌落可见。分离克隆并且在5mg/L氯霉素的BHI上重新划线培养,直至获得克隆的纯度。
实施例2:缺失/突变构建体的产生
缺失构建体的产生:
基于载体pSacB(SEQ ID NO:9)构建了缺失质粒。图1显示了质粒pSacB的示意图。使用标准技术,通过PCR从产琥珀酸巴斯夫菌的染色体DNA扩增了应当缺失的染色体片段的5’-和3’-侧翼区(各自大约1500bp),并引入所述载体中。通常,对于缺失,靶向至少80%的ORF。以这样的方式,构建了用于乳酸脱氢酶ldhA的缺失质粒pSacB_delta_ldhA(SEQ IDNO:10)、用于丙酮酸甲酸裂解酶激活酶pflA的缺失质粒,pSacB_delta_pflA(SEQ ID NO:11)、和用于丙酮酸甲酸裂解酶pflD的缺失质粒pSacB_delta_pflD(SEQ ID NO:12)。图2、3和4分别显示了质粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA和pSacB_delta_pflD的示意图。
在pSacB的质粒序列(SEQ ID NO:9)中,碱基2380-3801包含sacB基因。碱基3802-4264包含sacB启动子。碱基526-984包含氯霉素基因。碱基1477-2337包含大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图1)。
在pSacB_delta_ldhA的质粒序列(SEQ ID NO:10)中,碱基1519-2850包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的ldhA基因的5’侧翼区,而碱基62-1518包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的ldhA基因的3’侧翼区。碱基5169-6590包含sacB基因。碱基6591-7053包含sacB启动子。碱基3315-3773包含氯霉素基因。碱基4266-5126包含大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图2)。
在pSacB_delta_pflA的质粒序列(SEQ ID NO:11)中,碱基1506-3005包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的pflA基因的5’侧翼区,而碱基6-1505包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的pflA基因的3’侧翼区。碱基5278-6699包含sacB基因。碱基6700-7162包含sacB启动子。碱基3424-3882包含氯霉素基因。碱基4375-5235包含大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图3)。
在pSacB_delta_pflD的质粒序列(SEQ ID NO:12)中,碱基1533-2955包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的pflD基因的5’侧翼区,而碱基62-1532包含与产琥珀酸巴斯夫菌基因组同源的pflD基因的3’侧翼区。碱基5256-6677包含sacB基因。碱基6678-7140包含sacB启动子。碱基3402-3860包含氯霉素基因。碱基4353-5213包含大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图4)。
实施例3:产生改良的琥珀酸生产菌株
缺失突变体的产生:
a)按照以上所述的,用pSacB_delta_ldhA转化产琥珀酸巴斯夫菌DD1,并“Campbelled in”,产生“Campbell in”菌株。通过PCR产生针对质粒整合至产琥珀酸巴斯夫菌基因组中事件的条带,证实了转化和整合至产琥珀酸巴斯夫菌的基因组中。
然后使用含有蔗糖的琼脂平板作为反向选择培养基,将“Campbelled in”菌株“Campbelled out”,选择sacB-基因的(功能)的丢失。因此,将“Campbelled in”菌株在25-35ml非选择性培养基(不含抗生素的BHI)中,在37℃,220rpm孵育过夜。然后将过夜培养物在新鲜制备的含有蔗糖的BHI平板(10%,无抗生素)上划线培养并且在37℃下孵育过夜(“第一次蔗糖转移”)。将从第一次转移获得的单菌落再次在新鲜制备的含有蔗糖的BHI平板(10%)上划线培养并且在37℃下孵育过夜(“第二次蔗糖转移”)。重复该程序,直至最少完成蔗糖中的五次转移(“第三次、第四次、第五次蔗糖转移”)。术语“第一次至第五次蔗糖转移”是指,在含有sacB-果聚糖-蔗糖酶基因的载体染色体整合后菌株在含有蔗糖和生长培养基的平板上转移,用于选择失去sacB-基因和周围质粒序列的菌株。将来自第五次转移平板的单菌落接种至非选择性培养基(不含抗生素的BHI)上并且在37℃,220rpm下孵育过夜。将过夜培养物连续稀释并且涂布在BHI平板上以获得分离的单菌落。
通过氯霉素敏感性,证实了含有ldhA-基因座的野生型或ldhA-基因的突变/缺失的“Campbelled out”菌株。通过PCR分析鉴定并证实了这些菌株中的突变/缺失突变株。这导致了ldhA-缺失突变株产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhA。
b)按照以上所述的用pSacB_delta_pflA转化产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhA并且“Campbelled in”,产生“Campbell in”菌株。通过PCR证实了转化和整合。然后按照之前所述的,将“Campbell in”菌株“Campbelled out”。通过PCR分析鉴定并证实了这些菌株中的缺失突变株。这导致了ldhA pflD-双缺失突变株产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflA。
c)按照以上所述的用pSacB_delta_pflD转化产琥珀酸巴斯夫菌ΔldhA并且“Campbelled in”,产生“Campbell in”菌株。通过PCR证实了转化和整合。然后按照之前所述的,将“Campbell in”菌株“Campbelled out”。通过PCR分析鉴定并证实了这些菌株中的缺失突变株。这导致了ldhA pflD-双缺失突变株产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD。
实施例4:DD1ΔldhAΔpflA的葡萄糖或甘油消耗速率的测定
1.培养基制备
用于种子培养的培养基的组成描述于表1中。对于主培养物发酵,使用的培养基描述于表2中。
表1:用于种子培养物培养的培养基组成
化合物 | 浓度[g/L] |
酵母提取物(Bio Springer) | 12.5 |
(NH4)2SO4 | 0.05 |
琥珀酸 | 2.5 |
Na2CO3 | 2 |
KH2PO4 | 1 |
MgCO3 | 50 |
葡萄糖 | 50 |
表2:用于主培养物培养的培养基组成
化合物 | 浓度[g/L] |
酵母提取物(Bio Springer) | 12.5 |
(NH4)2SO4 | 0.05 |
甜菜碱 | 0.23 |
Na2CO3 | 2 |
KH2PO4 | 1 |
聚丙二醇(消泡) | 50 |
葡萄糖 | 50 |
2.培养和分析
一个种子培养步骤后,接种主培养物。对于种子培养,在2L瓶中高压灭菌水、MgCO3和Na2CO3,制备表1中所述的培养基。准备其他组分并分开灭菌,此后以无菌方式加入瓶中。将1%低温储备物接种至含有1800mL上述液体培养基的2L瓶中。在瓶中施加CO2气氛。由于MgCO3和CO2气氛的存在,培养基的起始pH在7.5至8.0的范围中。孵育在37℃,170rpm(振荡直径:2.5cm)在厌氧条件下进行12小时。培养物达到了21的OD600nm。
将总共5%的上述种子培养物用于接种主培养物。主培养在含有初始体积500mL的表2所述液体培养基的1L-发酵罐中进行。通过在发酵罐中高压灭菌水、Na2CO3和消泡剂来制备培养基。其他组分分开制成溶液并在此后以无菌方式加入发酵罐中。葡萄糖用作这些发酵的碳源,以测定琥珀酸生产菌株对其的消耗速率。按分批方式(batch)在培养基中加入45g/L葡萄糖,并且在发酵中还通过2g/L/h的速率补料来提供葡萄糖。发酵开始后4h,开始补料。整个发酵时间过程中,葡萄糖是过量的,并且按照下一部分所述的通过HPLC来测量(通过发酵中可检测葡萄糖浓度总是高于1g/L,证实了葡萄糖的过量)。在发酵过程中保持恒定的pH6.5,并且通过添加15wt.%氢氧化镁来控制。在发酵罐中以0.1vvm流速施加CO2,并且转向速度为500rpm。种子培养物和主培养物的分析描述于下一部分中。
3.分析
通过HPLC来定量羧酸的产生。关于所用的HPLC方法的详细内容描述于表3和4中。通过使用分光光度计(Ultrospec3000,Amersham Biosciences,Uppsala Sweden)测量600nm的吸光度(OD600nm)来测量细胞生长。
表3:用于甘油、葡萄糖和琥珀酸分析的HPLC方法(ZX-THF50)
4.结果
为了计算葡萄糖消耗速率,进行了葡萄糖分批发酵(fermentation with batchedglucose)。在该发酵中,葡萄糖是过量的,以允许随着时间计算葡萄糖消耗速率。在发酵过程中通过HPLC离线检查葡萄糖的浓度,在培养基中总是检测到葡萄糖。测量结果证实了葡萄糖在培养基中总是过量的。在这个实验中,以分批模式加入了45g/L葡萄糖,并且在4小时后应用2g/L/h的补料速率。
表5:使用上述的巴斯夫菌属DD1ΔldhAΔpflD,针对琥珀酸发酵的不同时间间隔的葡萄糖消耗速率。
时间间隔[h] | 0-9 | 9-15 | 15-23 | 23-40 |
葡萄糖消耗速率[g/L/h] | 2.76 | 3.87 | 2.22 | 1.61 |
为了计算消耗速率,测定了特定时间间隔中消耗的葡萄糖量。
实施例5:使用甘油结合限制的或非限制的葡萄糖,比较DD1ΔldhAΔpflD的发酵
5.培养基制备
用于种子培养和用于主培养的培养基的组成描述于之前的部分中(实施例4)。
6.培养和分析
从由一个种子培养组成的种子罐(seed train),接种主培养物。对于种子培养,将1%低温储备物接种于含有1800mL表1所述液体培养基的2L瓶中,并使用CO2气氛。由于MgCO3和CO2气氛的存在,培养基的起始pH在7.5至8.0的范围中。在37℃和170rpm(振荡直径:2.5cm)在厌氧条件下过夜孵育12小时(21的OD600nm)。
将总共5%的种子培养物用于接种含有500mL初始体积的表2所述液体培养基的1L-发酵罐中的主培养物。甘油和葡萄糖是碳源。在发酵开始前,以分批模式提供了54g/L甘油和8g/L葡萄糖。甘油在整个发酵过程中保持过量,并且以给细胞提供限制量的或非限制量的葡萄糖的速率补料葡萄糖。当补料速率低于之前测定的葡萄糖的消耗速率时,认为补料是限制性的。在发酵4小时后开始补料,并且葡萄糖的补料速率为2.5g/L/h(非限制的)或0.25g/L/h(限制的)。利用的碱是15wt.%氢氧化镁。在发酵罐中以0.1vvm流速施加CO2,并且转向速度为500rpm。按照之前部分(表3)中所述的,进行了种子培养物和主培养物的分析。在发酵过程中通过HPLC离线检测葡萄糖的浓度,以2.5g/L/h补料时培养基中总是检测到葡萄糖。当使用限制的葡萄糖补料(0.25g/L/h)时,在特定时间间隔中在培养物上清液中没有检测到该糖。
7.结果
7a.葡萄糖消耗速率的测定
在本实验中,在发酵开始前,以分批模式加入了8g/L葡萄糖和54g/L甘油,并且在发酵4小时后使用2.5g/L/h的葡萄糖补料速率。按照实施例4中所述的计算葡萄糖消耗速率,针对此具体实验设定,每个时间间隔的结果描述于表6中。在此实验中,发酵中可检测的葡萄糖浓度总是高于1g/L。表6中给出的葡萄糖消耗速率因此是在给定培养条件下“其他含碳化合物的最大理论消耗速率CRcc.max”。
表6:使用产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD,针对琥珀酸发酵的不同时间间隔的葡萄糖消耗速率
7b.比较在限制的和非限制的葡萄糖补料下产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD发酵的琥珀酸滴度和时空产率
在测定以上所述的葡萄糖消耗速率后,在发酵中使用限制的或非限制的葡萄糖补料。表7显示了提供限制的和非限制的葡萄糖浓度的不同补料速率。琥珀酸滴度和时空产率也显示于表7中。
表7:比较琥珀酸生产中限制的和非限制的葡萄糖补料
以0.25g/L/h的速率补加葡萄糖(限制性补料)时,发酵中的葡萄糖浓度总是低于检测限。
结果表明,以限制性方式添加葡萄糖时,所产生的琥珀酸滴度的增加以及更高的时空产率。
实施例6:在产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD发酵中比较不同的葡萄糖限制补料
8.培养基制备
用于种子培养和主培养的培养基的组成描述于部分1中(实施例4)。
9.培养和分析
从由一个种子培养组成的种子罐,接种主培养物。对于种子培养,将1%低温储备物接种于含有1800mL表1所述液体培养基的2L瓶中,并使用CO2气氛。由于MgCO3和CO2气氛的存在,培养基的起始pH在7.5至8.0的范围中。在37℃和170rpm(振荡直径:2.5cm)在厌氧条件下过夜孵育12小时(21的OD600nm)。
将总共5%的种子培养物用于接种含有500mL初始体积的表2所述液体培养基的1L-发酵罐中的主培养物。甘油和葡萄糖是碳源。在发酵开始前,以分批模式提供了50g/L甘油和8g/L葡萄糖。甘油在整个发酵过程中保持过量,并且以给细胞提供限制量葡萄糖的速率补加葡萄糖。当补料速率低于之前测定的葡萄糖消耗速率时,认为补料是限制的。在发酵4小时后开始补料,并且葡萄糖的补料速率描述于表8中。利用的碱是15wt.%氢氧化镁。在发酵罐中以0.1vvm流速施加CO2,并且转向速度为500rpm。按照之前部分(表3)中所述,进行了种子培养物和主培养物的分析。在发酵过程中通过HPLC离线检测葡萄糖的浓度,在特定时间间隔过程中在培养物上清液中没有检测到葡萄糖。
10.结果
按照实施例1中所述的计算葡萄糖消耗速率后,进行了葡萄糖的补料速率低于消耗速率(限制补料)的发酵。甘油在发酵中过量。琥珀酸滴度和时空产率受到补入发酵罐中的葡萄糖量的直接影响(表8)。表8中观察到的结果证实,在甘油是主要碳源的发酵中,使用限制量的葡萄糖,可以提高琥珀酸的量和时空产率。葡萄糖的补料速率越低,琥珀酸滴度和时空产率越高。
表8:限制性葡萄糖补料速率结合过量的甘油对通过产琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD的琥珀酸发酵的滴度和时空产率的影响。
这些实施例显示,使用甘油作为琥珀酸发酵的主碳源时,限制的葡萄糖量是有益的。
序列表
SEQ ID NO:1(菌株DD1的16S rDNA的核苷酸序列)
tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg
SEQ ID NO:2(菌株DD1的23S rDNA的核苷酸序列)
agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccgaaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgcaaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagaccgccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatcatttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggcatcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcgaatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcagggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggggacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaacaccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataataaaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaatagcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtatacccttgaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggctgcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacgaaagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattgatggcgttatcgcaagagaagcgcctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccgtgaagatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttgaattttgatgtgtaggataggtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaataccaccctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccggaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactggggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgctaatgacggtcggacatcgtcaggttagtgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcaggtcatagtgatccggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgcccaagagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcccaagggtatggctgttcgccatttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctatctgccgtgggcgttggagaattgagaggggctgctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggtgttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaagagataagtgctgaaagcatctaagcacgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgacgacgtagataggccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgctcaagtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggct
SEQ ID NO:3(来自菌株DD1的1dhA-基因的核苷酸序列)
ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
SEQ ID NO:4(来自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)
MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEG
SEQ ID NO:5(来自菌株DD1的pf1A-基因的核苷酸序列)
atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaatgtgacatattag
SEQ ID NO:6(来自菌株DD1的Pf1A的氨基酸序列)
MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEVVTYRHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLVLLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVVVPGYTDSDEDLHMLGNFIKDMKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
SEQ ID NO:7(来自菌株DD1的pf1D-基因的核苷酸序列)
atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgactttatccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtgatggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctggttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaatgatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaaggcgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatcggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaagcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatggcggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggttaaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatcactgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattattctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgtattacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgtgcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcatgctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaacggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcgaacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatgaagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatccgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcgacttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaaaaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaaaccggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggtgcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattaggtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaacacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcaggttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa
SEQ ID NO:8(来自菌株DD1的Pf1D的氨基酸序列)
MAELTEAQKKAWEGFVPGEWQNGVNLRDFIQKNYTPYEGDESFLADATPATSELWNSVMEGIKIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGRKLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYLMKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQWTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRTPEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAFKRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAALMAFHDRDVFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDGYFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
SEQ ID NO:9(质粒pSacB的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO:10(质粒pSacB_delta_1dhA的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO:11(质粒pSacB_delta_pf1A的完整核苷酸序列)
tcgagtcaatgcggatttgacttatgatgtggcaaacaaccgatttccgattattactacacgtaaaagttattggaaagcggcgattgcggagtttctgggttatatccgcggctacgataatgcggcggatttccgtaaattaggagcaaaaacctgggatgccaacgctaatgaaaatcaggtatggctgaataaccctcatcgcaaaggcaccgacgacatggggcgcgtttacggcgtacagggcagagcctggcgtaagcctaacggcgaaaccgttgatcaattacgcaaaattgtcaacaatttaagtcgcggcattgatgatcgcggcgaaattctgacctttttaaacccgggcgaattcgatctcggttgtctgcgcccttgtatgtacaatcacacgttttctttgctgggcgatacgctttatttaaccagttatcaacgctcctgtgacgtacctttaggcttgaatttcaatcaaattcaagtatttacattcttagctttaatggcgcagattaccggtaaaaaagccggtcaggcatatcacaaaatcgtcaatgcgcatatttacgaagaccagctggaactaatgcgcgacgtgcagttaaaacgcgaaccgttcccgtcgccaaaactggaaattaatccggacattaaaacccttgaagatttagaaacctgggtaaccatggatgatttcaacgtcgttggttaccaatgccacgaaccgataaaatatccgttctcggtataaaccgacaaaagtgcggtcaaaaatttaatattttcatctgttatagaaaatatttttcaacataaaatctagggatgcctgtttggcgtccgtaaatacgcagaaaaatattaaatttttgaccgcacttttttcatctcaattaacagcctgataattcttatggatcaacaaattagctttgacgaaaaaatgatgaatcgagctcttttccttgccgacaaggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattggtggatgaacggggcaatatcattggtgaaggctggaacctctctattgtgaactcggatcccaccgcccatgccgaaattattgcgttgcgtaacgccgcgcagaaaatccaaaattaccgcctgctcaataccactttatacgtgactttagaaccctgcaccatgtgcgccggcgcgattttacacagccgaatcaaacgcttggtattcggggcgtccgattacaaaaccggtgcggtgggttccagatttcatttttttgaggattataaaatgaatcatggggttgagatcacaagcggtgtcttacaggatcaatgcagtcagaagttaagccgctttttccaaaagcgcagggaacagaaaaaacaacaaaaagctaccgcacttttacaacacccccggcttaactcctctgaaaaatagtgacaaaaaaaccgtcataatgtttacgacggtttttttatttcttaatatgcccttaaataatcaacaaaatatagcaagaagattatagcaaagaatttcgtttttttcagagaatagtcaaatcttcgcaaaaaactaccgcacttttatccgctttaatcaggggaattaaaacaaaaaaattccgcctattgaggcggaatttattaagcaataagacaaactctcaattacattgattgtgtaaacgtacgagtgatgacgtcttgttgttgctctttagttaatgagttgaaacgaaccgcgtaacctgaaacacgaatggttaattgcgggtatttttccggattttccatcgcgtctaacaacatttcacggttaagaacgttaacattcaagtgttgaccgccttccactgtcgcttcatgatggaaataaccgtccattaaaccggcaaggttgcgtttttgcgcttcgtcatctttacctaatgcgttcggtacgatagagaaggtatatgaaataccgtctttcgcgtaagcgaacggaagtttagccacagaagtaagtgaagcaaccgcacctttttggtcacgaccgtgcattgggtttgcacccggtccgaatggcgcgcctgctcgacgaccgtccggagtattaccggttttcttaccgtataccacgttagaagtgatagtcaggatagattgtgtcggagttgcgttgcggtaagttttgtgtttttgaacttttttcatgaaacgttcaactaagtctaccgctaaatcatcaacacgcggatcattgttaccgaattgcggatattcgccttcaatttcgaagtcgatagcaacattcgaggccacgacattaccgtctttatctttgatgtcgccgcgaatcggtttaactttcgcatatttgattgcggataatgagtccgcagccacggaaagacccgcgataccgcaagccattgtacggaatacgtcgcgatcgtggaacgccatcaatgccgcttcatatgcatatttatcgtgcatgaagtggatgatgttcaatgcggttacatattgagtcgccaaccagtccatgaaactgtccatacgttcgattacggtatcgaaattcaatacttcgtctgtaatcggcgcagttttaggaccgacttgcataccatttttctcatcgataccgccgttaattgcgtataacatagttttagctaagtttgcgcgcgcaccgaagaattgcatttgtttacctacgaccatcggtgatacgcagcatgcgattgcatagtcatcgttgttgaagtcaggacgcattaagtcatcattttcgtattgtacggaggaagtatcaatagatactttcgcacagaaacgtttgaacgcttcaggtaattgttcggaccaaagaatagttaagtttggttccggagaagtacccatagtgtataaagtatgtaatacgcggaagctgtttttagttaccaacggacgaccgtctaagcccataccggcgatagtttcggttgccctctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctc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SEQ ID NO:12(质粒pSacB_delta_pf1D的完整核苷酸序列)
tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggatcgagctcttttccttgccgacaaggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattggtggatgaacggggcaatatcattggtgaaggctggaacctctctattgtgaactcggatcccaccgcccatgccgaaattattgcgttgcgtaacgccgcgcagaaaatccaaaattaccgcctgctcaataccactttatacgtgactttagaaccctgcaccatgtgcgccggcgcgattttacacagccgaatcaaacgcttggtattcggggcgtccgattacaaaaccggtgcggtgggttccagatttcatttttttgaggattataaaatgaatcatggggttgagatcacaagcggtgtcttataggatcaatgcagtcagaagttaagccgctttttccaaaagcgcagggaacagaaaaaacaacaaaaagctaccgcacttttacaacacccccggcttaactcctctgaaaaatagtgacaaaaaaaccgtcataatgtttacgacggtttttttatttcttctaatatgtcacattaagcccgtagcctgcaagcaaccccttaacatgctccattaattcttttgtcggcggttttacatcttcaagctcgtatttatcgccgagtacttcccatttatgggcgcctagacggtgataaggtaataattccactttttcgatattcttcatatctttaatgaaattccccagcatgtgcaaatcttcgtcactatctgtataacccggcactacaacatggcggatccaggtacgctgatttcgatccgctaaatattttgcgaattcgagcactcttttattcggcacgccaatcaggctttcgtgaacccgttcattcatttctttcaggtcaagcaacacaagatccgtgtcatcaatcaattcatcaataatatgatcatgatgacggacgaaaccgttggtatccaagcaagtattaattccttctttatggcaggctctgaaccagtcccgtacaaattccgcctgtaaaatagcttcaccgccggaagcggtaactccgccgcccgaggcgttcataaaatggcgataggtcaccacttctttcattaattcttcaacggaaatttctttaccgccgtgcaaatcccaggtgtctctgttatggcaatatttacaacgcattaagcagccttgtaaaaataaaataaagcggattcccggcccgtcaactgtcccgcaggtttcaaatgaatgaattcgtcctaaaaccgacataatatgcccttaaataatcaacaaaatatagcaagaagattatagcaaagaatttcgtttttttcagagaatagtcaaatcttcgcaaaaaactaccgcacttttatccgctttaatcaggggaattaaaacaaaaaaattccgcctattgaggcggaatttattaagcaataagacaaactctcaattttaatacttccttcttttctagtattgataagattgaaaccttgcaaggatgacggcggatttgccgtcactctcacccaactaatgtggacgactggtaaaccattgcattagaccaatgcaaacaccaccaccgacgatgttacctaaagtaacaggaattaaatttttaattactaaatggtacatatctaaatttgcaaactgctcggcatttaaacccgttgcctgccagaattccggcgatgcgaaatttgcaattaccatgcccatagggatcataaacatatttgctacgcagtgttcaaagcctgaagcgacaaayaacccgatcggcaggatcataataaaagctttatccgttagagtyttgccggcataggccatccaaacggcaatacataccataatgttgcaaagaatacctaaacagaaggcttcaayccaggtatgttctattttatgttgtgccgtatttaaaatggttaatccccactgaccgtttgccgccatgatctgaccggaaaaccaaattaatgcaacaataaataaaccgccgacaaaattaccgaartaaaccacaatccagttacgtaacatctgaattgttgtaattttactctcaaagcgggcaatagtcgataaagttgatgaagtaaatagttcacagccgcaaaccgccaccataattaccccgagagagaacaccaaaccgccgaccagtttagttaatccccaaggcgctcccgcagaggctgtttgagttgttgtataaaaaacgaatgcaagagcaataaacataccggcagagatcgccgataaaaatgaataggcttgttttttcgtagctttataaacgccgacgtctaacccggtttgagccatctcggttggcgaagccatccaagccaatttaaaatcttccgatttcattgagctttccttagtaataaaactactcggaaatgagtagaactgccttaaagcataaatgatagattaaaaaatccaaaattgttgaatattatttaacggggggattataaaagattcataaattagataatagctaatttgagtgatccatatcaccttttacagattttttgacctaaatcaaaattacccaaatagagtaataataccattataaagggtgtggatttattcctttggtttacgagataaattgctatttaagctgatttctgataaaaagtgcggtagatttttcccaaaaataaggaaacacaaaatggcagaagaaacaattttcagtaaaattattcgtaaagaaattcccgccgacattatatatcaagacgatcttgtcaccgcatttcgcgatattgcgccgcaggcaaaaactcatattttaattattccgaataaattgattccgacagtaaacgacgtaaccgcccatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagactttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgg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PCT/RO/134表
Claims (16)
1.一种通过发酵生产有机酸的方法,包括方法步骤:
I)在培养基中培养微生物,其中向培养基中进料甘油和其他含碳化合物作为可同化碳源,以允许微生物产生有机酸,由此获得包含有机酸的发酵液;
II)从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机酸或其盐;
其中其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)。
2.根据权利要求1的方法,其中,在至少30分钟的培养时间中,其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)低于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)。
3.根据权利要求1或2的方法,其中,其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.;以g/升/小时计)不高于其他含碳化合物的最大理论消耗速率(CRc.c.max;以g/升/小时计)的50%。
4.根据之前任一项权利要求的方法,其中在方法步骤I)中,以至少5:1的甘油:其他含碳化合物总重量比,将甘油和其他含碳化合物进料至培养基中。
5.根据之前任一项权利要求的方法,其中有机酸是琥珀酸。
6.根据之前任一项权利要求的方法,其中其他含碳化合物是碳水化合物。
7.根据权利要求6的方法,其中碳水化合物选自蔗糖、D-葡萄糖或其混合物。
8.根据之前任一项权利要求的方法,其中方法步骤I)中使用的微生物是修饰的微生物。
9.根据权利要求8的方法,其中,修饰微生物来自野生型微生物,所述野生型微生物属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)。
10.根据权利要求9的方法,其中,修饰微生物来自野生型微生物,所述野生型微生物属于巴斯夫菌属。
11.根据权利要求10的方法,其中方法步骤I)中使用的微生物属于物种产琥珀酸巴斯夫菌。
12.根据权利要求11的方法,其中,修饰微生物来自野生型微生物,所述野生型微生物具有SEQ ID NO:1或显示出与SEQ ID NO:1至少96%序列同源性的序列的16S rDNA。
13.根据权利要求8至12任一项的方法,其中与其野生型相比,修饰微生物具有
i)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性,
ii)降低的乳酸脱氢酶活性,或
iii)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性和降低的乳酸脱氢酶活性。
14.根据权利要求13的修饰微生物,其中微生物包括:
A)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入;
B)pflD-基因或其至少一部分的缺失,pflD-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflD-基因中至少一个突变的引入;
C)pflA-基因或其至少一部分的缺失,pflA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflA-基因中至少一个突变的引入;
D)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入
和
pflD-基因或其至少一部分的缺失,pflD-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflD-基因中至少一个突变的引入;
或
E)ldhA-基因或其至少一部分的缺失,ldhA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或ldhA-基因中至少一个突变的引入
和
pflA-基因或其至少一部分的缺失,pflA-基因的调控元件或其至少一部分的缺失,或pflA-基因中至少一个突变的引入。
15.根据之前任一项权利要求的方法,其中所述方法还包括方法步骤:
III)通过至少一个化学反应,将方法步骤I)中获得的包含在发酵液中的有机酸、或将方法步骤II)中获得的回收的有机酸,转化成不同于所述有机酸的次级有机产物。
16.根据权利要求15的方法,其中所述有机酸为琥珀酸,并且其中次级有机产物选自琥珀酸酯或其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
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