JP6914846B2 - ファインケミカルの生産改善のための組換え微生物 - Google Patents
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Description
(a) ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(b) 二機能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ/鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ/ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(c) NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(d) リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(e) フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(f) アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強、
(ここで遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制、欠失、増加又は増強は、各参照微生物と比較して決定される)
の群から選択される特徴の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは全てをさらに有する。
(i) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 配列番号51を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46、48及び50のポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、及び配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチド
の群から選択され、
ここで(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号46、48又は50のそれぞれを有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
ここでpflB遺伝子は、以下:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(C) 配列番号5を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(B)、(C)又は(E)によりコードされるポリペプチドは、配列番号6を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
adhE遺伝子は、以下:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(H) 配列番号7を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(G)、(H)又は(J)によりコードされるポリペプチドは、配列番号8を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
ldhA遺伝子は、以下:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(M) 配列番号9を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(L)、(M)又は(O)によりコードされるポリペプチドは、配列番号10を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
pta遺伝子は、以下:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(R) 配列番号11を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(Q)、(R)又は(T)によりコードされるポリペプチドは、配列番号12を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
frdA遺伝子は、以下:
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(W) 配列番号13を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(V)、(W)又は(Y)によりコードされるポリペプチドは、配列番号14を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有し、
alaD遺伝子は、以下:
(Z) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、例えば少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一性を有する核酸分子、又は
(BB) 配列番号15を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(AA)、(BB)又は(DD)によりコードされるポリペプチドは、配列番号16を有するポリペプチドの少なくとも10%、20%、好ましくは少なくとも30%又は50%、より好ましくは少なくとも60%又は70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、85%又は90%、最も好ましくは少なくとも95%の活性を有する。
1〜5g、好ましくは3.5gのKH2PO4、及び
1〜10g、好ましくは5.0gのK2HPO4、及び
1〜5g、好ましくは3.5gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜1g、好ましくは0.25gのMgSO4-7H2O、及び
5〜25mg、好ましくは15mgのCaCL2-2H2O、及び
0.1〜1mg、好ましくは0.5mgのチアミン、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.1M HCLの1リットル当たり、0.5〜5g、好ましくは1.6gのFeCL3-6H2O;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのCoCl2-6H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.1gのCuCl2-2H2O;0.1〜0.5g、好ましくは0.2gのZnCl2;0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのNaMoO4-2H2O;0.001〜0.1g、好ましくは0.05gのH3BO3を含む。
1〜10g、好ましくは2.6gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜5g、好ましくは0.87gのNH4H2PO4、及び
0.05〜2.5g、好ましくは0.15gのKCl、及び
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.12M HCLの1リットル当たり、1〜5g、好ましくは2.4gのFeCL3-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのCoCl2-6H2O;0.1〜1g、好ましくは0.21gのCuCl2-2H2O;0.1〜1g、好ましくは0.3gのZnCl2;0.1〜1g、好ましくは0.27gのNaMoO4-2H2O;0.01〜0.5g、好ましくは0.068gのH3BO3及び0.1〜1g、好ましくは0.5gのMnCl2-4H2Oを含み、場合により1〜30g、好ましくは15gの(NH4)2SO4を含む。
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜10g、好ましくは1gの(NH4)2SO4、及び
0.05〜5g、好ましくは0.46gのベタイン、及び
0.001〜0.5g、好ましくは0.05gのシアノコバラミン(B12)、及び
1〜10g、好ましくは3.74gのKH2PO4、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、10〜100mM、好ましくは60mM硫酸の1リットル当たり、1〜10g、好ましくは3.48gの(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.35gのCoSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.31gのCuSO4-5H2O;0.1〜5g、好ましくは0.63gのZnSO4-7H2O;0.1〜1g、好ましくは0.27gのMnSO4-H2O;0.01〜1g、好ましくは0.07gのNaMoO4-2H2O及び0.1〜5g、好ましくは0.43gのH3BO3を含む。
(I) 微生物において、gcvTHPオペロン又は上記の(i)〜(v)に定義されるようなものの1以上の活性及び/若しくは発現を導入、増加又は増強するステップ;及び
(II) gcvTHPオペロン又は上記の(i)〜(v)に定義されるようなものの活性及び/若しくは発現が導入、増加又は増強されていない対応する微生物と比較して、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び/又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率又は生産性が増強された組換え微生物を作出、同定及び単離するステップ
を含む、上記方法である。
I) 発酵槽中で、上に定義される本発明による微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵ブロスから、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び/又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンを回収するステップ
を含む、上記方法である。
同化可能な炭素源:グルコース
温度:30〜45℃
pH:6.0〜7.0
微好気的条件
である。
本発明は、特定の方法論又はプロトコルに限定されるものでないことを理解されたい。また、本明細書中で使用される用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。本明細書及び添付した特許請求の範囲において使用される単数形の「a」「an」及び「the」は、文脈が明らかに別段に指示しない限り複数参照を含むものであることに留意しなければならない。従って、例えば、「ベクター(a vector)」との言及は1つ以上のベクターを指し、当業者に公知のその等価物などを包含する。本明細書中で使用される用語「約」は、ほぼ、大まかに、およそ、又はその領域内を意味する。用語「約」が数値範囲と共に用いられる場合、「約」は、示される数値の上限及び下限の境界を拡げることによって、その範囲を変更する。一般的に、用語「約」は、本明細書において、記載される値の上限及び下限の数値を20%、好ましくは10%上方若しくは下方(高い若しくは低い)の変動により変更するために使用される。本明細書中で使用される用語「又は(若しくは、あるいは)」は、特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも包含する。用語「含む(「comprise」、「comprising」、「include」、「including」、及び「includes」)」との語は、本明細書及び以下の特許請求の範囲において使用される場合、1つ以上の記載される特徴、整数、成分、又はステップの存在を特定することを意図するが、これらの用語は1つ以上の他の特徴、整数、成分、ステップ、又はそれらの群の存在若しくは付加を排除するものではない。明確性のため、本明細書において使用される特定の用語は以下の通りに定義及び使用される。
−p プログラム名 [文字列];−d データベース [文字列];デフォルト = nr;−i クエリーファイル[File In];デフォルト = stdin;−e 期待値 (E) [実数];デフォルト = 10.0;−m アラインメントビューオプション:0 = ペアワイズ;1 = 同一性を示すクエリー−アンカー;2 = 同一性を示さないクエリー−アンカー;3 = フラットクエリー−アンカー、同一性を示す;4 = フラットクエリー−アンカー、同一性を示さない;5 = フラットクエリー−アンカー、同一性なし、且つ平滑末端;6 = フラットクエリー−アンカー、同一性なし、且つ平滑末端;7 = XML Blast出力;8 = 表形式;9 コメントラインを含む表形式[整数];デフォルト = 0;−o BLASTリポート出力ファイル[File Out] オプション;デフォルト = stdout;−F フィルタークエリー配列(blastnではDUST、他ではSEG) [文字列];デフォルト = T;−G ギャップを開くためのコスト(0はデフォルト動作を引き起こす) [整数];デフォルト = 0;−E ギャップを拡張するためのコスト(0はデフォルト動作を引き起こす) [整数];デフォルト = 0;−X ギャップ付加されたアラインメントに関するX下落値(ビット)(0はデフォルト動作を引き起こす);blastn 30、megablast 20、tblastx 0、他の全て15 [整数];デフォルト = 0;−I デフラインにGIを示す[T/F];デフォルト = F;-q ヌクレオチド不一致に関するペナルティ(blastnのみ) [整数];デフォルト = -3;-r ヌクレオチド一致に関する報酬(blastnのみ) [整数];デフォルト = 1;-v (V)に関する1行記述を示すデータベース配列の数 [整数];デフォルト = 500;-b (B)に関するアラインメントを示すデータベース配列の数 [整数];デフォルト = 250;-f 拡張ヒットに関する閾値、デフォルト 0の場合;blastp 11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13;tblastx 13、megablast 0 [整数];デフォルト = 0;-g ギャップ付加アラインメントを実行(tblastxでは利用不可) [T/F];デフォルト = T;-Q 使用するクエリー遺伝子コード[整数];デフォルト = 1;-D DB遺伝子コード(tblast[nx]についてのみ) [整数];デフォルト = 1;-a 使用するプロセッサーの数[整数];デフォルト = 1;-O SeqAlignファイル[File Out] オプション;-J クエリーデフラインを信じる[T/F];デフォルト = F;-M マトリックス[文字列];デフォルト = BLOSUM62;-W ワードサイズ、デフォルト 0の場合 (blastn 11、megablast 28、その他全て 3) [整数];デフォルト = 0;-z データベースの有効長さ(実際のサイズについては0を使用する) [実数];デフォルト = 0;-K 保持する領域から得られる最良のヒットの数(デフォルトによりオフ、使用する場合、100の値が推奨される) [整数];デフォルト = 0;-P 複数ヒットについては0、単一ヒットについては1[整数];デフォルト = 0;−Y 検索スペースの有効長さ(実際のサイズについては0を使用する) [実数];デフォルト = 0;-S データベースに対して検索するためのクエリー・ストランド(blast[nx]、及びtblastxについて);3は両方、1は最高値、2は最低値である[整数];デフォルト = 3;-T HTML出力を作成[T/F];デフォルト = F;-l GIの一覧に対するデータベースの限定的検索 [文字列] オプション;-U FASTA配列のフィルタリングには小文字を使用する [T/F] オプション;デフォルト = F;-y ビットで示される非ギャップ付加拡張に関するX下落値(0.0はデフォルト動作を引き起こす);blastn 20、megablast 10、その他全て 7 [実数];デフォルト = 0.0;-Z ビットで示される最終的なギャップ付加アラインメントに関するX下落値(0.0はデフォルト動作を引き起こす);blastn/megablast 50、tblastx 0、その他全て 25 [整数];デフォルト = 0;-R PSI-TBLASTN チェックポイントファイル[File In] オプション;-n MegaBlast検索 [T/F];デフォルト = F;-L クエリー配列上の位置[文字列] オプション;-A 複数ヒットウィンドウサイズ、デフォルト 0の場合(blastn/megablast 0、その他全て 40 [整数];デフォルト = 0;-w フレームシフトペナルティ(blastxに関するOOFアルゴリズム) [整数];デフォルト = 0;-t HSPsを連結するためにtblastnにおいて許容される最大のイントロンの長さ (0は連結不可) [整数];デフォルト = 0。
別段に示されない限り、本発明の目的のために行なわれるクローニング手順、例えば制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、形質転換、細菌細胞の選択及び培養は、記載される通りに行なわれる(Sambrook et al., 1989)。組換えDNAの配列分析は、レーザー蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City、CA, USA)により、Sangerの技術(Sanger et al., 1977)を用いて行なわれる。別段に記載されない限り、化学物質及び試薬は、Sigma Aldrich社(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)、Promega社(Madison, WI, USA)、Duchefa社(Haarlem, The Netherlands)又はInvitrogen社(Carlsbad、CA, USA)から入手される。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社(Ipswich, MA, USA)又はRoche Diagnostics GmbH社(Penzberg、ドイツ)から入手される。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon社(Ebersberg、ドイツ)により合成される。
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFの不活性化並びにalaD遺伝子のコドン最適化変異体(alaD-gstear)によるldhA ORFの置換により、L-アラニン産生について大腸菌W株(LU17032)を遺伝子操作した。
細菌培養
大腸菌W株(LU17032)を、Luria-Bertani(LB)液体培地中又はLuria-Bertani固体培地上で培養した。W株の同一性を確認するために、時々、10mMスクロースを含有するM9最小寒天上にクローンを継代した。抗生物質を、15μg/mL(カナマイシン、クロラムフェニコール)、25μg/mL(ゼオシン)又は3μg/mL(テトラサイクリン)の最終濃度まで、適宜、液体培地及び固体培地に添加した。
Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)の標準プロトコルを用いて、Red/ET組換えを行った。手短に言えば、Red/ET能を有する大腸菌W株を、OD600nmが0.3になるまで30℃で好気的に増殖させた。red遺伝子の発現を、50μlの10%(w/v) L-アラビノースの添加及びそれに続く37℃までの温度上昇によって誘導した。アラビノースは、非誘導対照培養物には添加しなかった。37℃での35分間のインキュベーション後、細胞を、氷冷10%(v/v)グリセロールで2回洗浄し、1.35kV、10μF、600Ωで500ngのPCR産物を用いてエレクトロポレーションした。次に、細胞を1mL氷冷LB培地中で再懸濁し、37℃で約1.5時間好気的に増殖させた。次に、培養物を、15μg/mLカナマイシン(ノックアウト)又は25μg/mLゼオシン(ノックイン)を含有するLB寒天上にプレーティングした。
隣接するFRT部位は、大腸菌染色体の改変後、FLP組換えによる抗生物質耐性マーカーの除去を可能にした。FLP組換えは、単一のFRT部位(34bp)並びに短い隣接配列(それぞれ約20bp)を残し、これは、カセットの増幅においてプライマー結合部位として用いられる。
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B(Qiagen, Hilden、ドイツ)を用いて、大腸菌ゲノムDNA(gDNA)を一晩培養物から単離した。ノックアウトカセット又はノックインカセットを有するPCR産物を、PRECISOR高忠実度DNAポリメラーゼ(BioCat, Heidelberg)を用いて鋳型プラスミドから増幅し、PCR Extender System(5PRIME GmbH, Hamburg、ドイツ)を用いて、製造業者の推奨に従い分析PCR反応を行った。PCR増幅産物は、GeneJET PCR Purification Kit又はGeneJET Gel Extraction Kit(Fermentas, St. Leon-Rot、ドイツ)を用いて精製し、配列決定はGATC BioTech社(Konstanz、ドイツ)又はBioSpring社(Frankfurt am Main, ドイツ)により行なった。
約500ngのΔackA-pta PCR構築物(1737bp)を、Red/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。3種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
約500ngのΔadhE PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。2種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
約500ngのΔfrdABCD PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT及びΔadhE::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
約500ngのΔpflB PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT及びΔfrdABCD::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。4種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
約500ngのΔldhA::alaD-gstear PCR構築物(1783bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT及びΔpflB::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。4種類のZeoR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
細胞培養培地におけるアラニン検出のため、以下のHPLC法を用いた:
カラム:Aminex HPX−87Cカラム(Bio−Rad社)、300×7.8mm (内径)、粒径9μm
移動相:0.1mol/LのCa(NO3)2 90%、アセトニトリル10%
流速:0.6mL/分
カラム温度:60℃
検出:屈折率検出器
使用したHPLC法:
カラム:Aminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm (内径) 粒径 9μm
移動相:H2SO4 4mM
流速:0.4mL/分
カラム温度:45℃
検出:屈折率検出器
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g (NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mg チアミン
1ml 微量金属ストック
19.92mM (NH4)2HPO4 = 2.6g /L MW:132.07
7.56 mM NH4H2PO4 = 0.87g/L MW:115
2.0mM KCl = 0.15g/L MW:74.55
1.5 mM MgSO4-7H2O = 0.37g/L MW:246.5
15g/L 硫酸アンモニウムは最終ステップで添加した
1mM ベタイン
1ml 微量金属ストック
微量金属ストックは、0.12M HCL、2.4gのFeCL3-6H2O;0.3gのCoCl2-6H2O;0.21gのCuCl2-2H2O;0.3gのZnCl2;0.27gのNaMoO4-2H2O;0.068gのH3BO3;0.5gのMnCl2-4H2Oで調製した。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[1] gcvTHPオペロン又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強を含む組換え微生物。
[2] alaD遺伝子の活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強をさらに含む、実施形態1に記載の組換え微生物。
[3] pflB遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態1又は2に記載の組換え微生物。
[4] adhE遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態1〜3のいずれかに記載の組換え微生物。
[5] ldhA遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態1〜4のいずれかに記載の組換え微生物。
[6] pta遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態1〜5のいずれかに記載の組換え微生物。
[7] frdAの活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態1〜6のいずれかに記載の組換え微生物。
[8] gcvTHPオペロンが、以下:
(i) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で、配列番号51を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46、48及び50のポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態1〜7のいずれかに記載の組換え微生物。
[9] alaD遺伝子が、以下:
(AA) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(BB) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は (CC) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(EE) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態2〜8のいずれかに記載の組換え微生物。
[10] pflB遺伝子が、以下:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態3〜9のいずれかに記載の組換え微生物。
[11] adhE遺伝子が、以下:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態4〜10のいずれかに記載の組換え微生物。
[12] ldhA遺伝子が、以下:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態5〜11のいずれかに記載の組換え微生物。
[13] pta遺伝子が、以下:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態6〜12のいずれかに記載の組換え微生物。
[14] frdA遺伝子が、以下:
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80%同一性を有する核酸分子、又は
(W) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態7〜13のいずれかに記載の組換え微生物。
[15] 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、実施形態1〜14のいずれかに記載の組換え微生物。
[16] 実施形態1〜15のいずれかに記載の1以上の組換え微生物を含む組成物。
[17] 培地及び炭素源をさらに含む、実施形態16に記載の組成物。
[18] 以下のステップ:
(I)微生物において実施形態1又は8に定義される遺伝子の活性及び/若しくは発現を導入、増加又は増強するステップ;及び
(II) 実施形態1又は8に定義される遺伝子の活性及び/若しくは発現が低下、抑制又は欠失されていない参照微生物と比較して、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの収率及び/又は生産性が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの収率及び/又は生産性が増強された組換え微生物の作製方法。
[19] 前記方法で用いられる組換え微生物が、実施形態2又は9に定義される遺伝子の活性及び/若しくは発現の増加又は増強、並びに/あるいは実施形態3〜8又は10〜14のいずれかに定義される少なくとも1つの遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態18に記載の方法。
[20] 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、実施形態18又は19のいずれかに記載の方法。
[21] ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの製造を可能にする条件下で、実施形態1〜15のいずれかに記載の1以上の組換え微生物を培養するステップを含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの製造方法。
[22] 前記微生物が、0.5%〜30%(w/v)の糖を含む培地中で培養される、実施形態21に記載の方法。
[23] ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの収率が少なくとも80%である、実施形態21又22に記載の方法。
[24] L-アラニンのキラル純度が少なくとも95%である、実施形態21〜23のいずれかに記載の方法。
[25] キラル純粋なL-アラニンが製造される、実施形態21〜23のいずれかに記載の方法。
[26] 実施形態1〜15のいずれかに記載の1以上の遺伝子改変微生物を培養培地に接種するステップ、及び前記遺伝子改変微生物を培地で培養又は増殖させるステップを含む、遺伝子改変微生物を培養する又は増殖させる方法。
[27] ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの発酵生産のための、実施形態1〜15のいずれかに記載の組換え微生物あるいは実施形態16又は17のいずれかに記載の組成物の使用。
[28] 以下のステップ:
(I) 発酵槽中で実施形態1〜15のいずれかに記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) I)で得られた発酵ブロスから、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンを回収するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び/若しくはアラニンの発酵生産のための方法。
[29] 実施形態1又は8に定義される核酸に機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物。
[30] 実施形態1又は8に定義される核酸あるいは実施形態29に定義される組換え発現構築物を含む組換えベクター。
Claims (23)
- gcvTHPオペロンの活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、さらにadhE遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失を含む、アラニン産生のための組換え微生物、
ここで前記gcvTHPオペロンは、以下:
(i) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で、配列番号51を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46、48及び50のポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド、及び配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド、及び配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
前記組換え微生物は、
alaD遺伝子の活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強をさらに含み、
pflB遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、
ldhA遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、
pta遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、かつ
frdAの活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、
gcvTHPオペロンの活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強を有しない微生物と比較してアラニン産生が向上している、
前記組換え微生物。 - alaD遺伝子が、以下:
(AA) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(BB) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(CC) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(EE) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1に記載の組換え微生物。 - pflB遺伝子が、以下:
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1又は2に記載の組換え微生物。 - adhE遺伝子が、以下:
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - ldhA遺伝子が、以下:
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - pta遺伝子が、以下:
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - frdA遺伝子が、以下:
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも90%の配列相同性を有する核酸分子、又は
(W) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の1以上の組換え微生物を含む組成物。
- 培地及び炭素源をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
- 以下のステップ:
(I)微生物においてgcvTHPオペロンの活性及び/若しくは発現を導入、増加又は増強し、さらにadhE遺伝子の活性及び/若しくは発現を低下、抑制又は欠失させるステップ;及び
(II) gcvTHPオペロンの活性及び/若しくは発現が導入、増加又は増強されていない参照微生物と比較して、アラニンの収率及び/又は生産性が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、アラニンの収率及び/又は生産性が増強された組換え微生物の作製方法、
ここで前記組換え微生物は、
alaD遺伝子の活性及び/若しくは発現の導入、増加又は増強をさらに含み、
pflB遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、
ldhA遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、
pta遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含み、かつ
frdAの活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、
前記作製方法。 - 前記方法で用いられる組換え微生物が、請求項2に定義される遺伝子の活性及び/若しくは発現の増加又は増強、並びに/あるいは請求項3〜7のいずれか1項に定義される少なくとも1つの遺伝子の活性及び/若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、請求項11又は12に記載の方法。
- アラニンの製造を可能にする条件下で、請求項1〜8のいずれか1項に記載の1以上の組換え微生物を培養するステップを含む、アラニンの製造方法。
- 前記微生物が、0.5%〜30%(w/v)の糖を含む培地中で培養される、請求項14に記載の方法。
- アラニンの収率が少なくとも80%である、請求項14又15に記載の方法。
- L-アラニンのキラル純度が少なくとも95%である、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
- キラル純粋なL-アラニンが製造される、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の1以上の遺伝子改変微生物を培養培地に接種するステップ、及び前記遺伝子改変微生物を培地で培養又は増殖させるステップを含む、遺伝子改変微生物を培養する又は増殖させる方法。
- アラニンの発酵生産のための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換え微生物あるいは請求項9又は10のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 以下のステップ:
(I) 発酵槽中で請求項1〜8のいずれか1項に記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) 前記(I)で得られた発酵ブロスから、アラニンを回収するステップ
を含む、アラニンの発酵生産のための方法。 - 請求項1に定義される核酸に機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物。
- 請求項1に定義される核酸あるいは請求項22に定義される組換え発現構築物を含む組換えベクター。
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