JP2018193446A - 新規多糖類 - Google Patents
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Abstract
Description
上記中性糖が、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースであり、
全中性糖中、ガラクトースの含有量が40質量%以上であり且つグルコースの含有量が15質量%以上であることを特徴とする多糖類。
微細藻類およびその培養液の少なくとも一方より熱水抽出する工程、
上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、および、
上記イオン交換カラムクロマトグラフィーで得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有するフラクションを特定する工程を含むことを特徴とする方法。
本工程では、微細藻類およびその培養液の少なくとも一方と水系溶媒とを混合して加熱することにより、熱水抽出を行う。
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室
(ii) 受託日: 2013年9月3日
(iii) 受託番号: FERM BP−22256
本発明に係るKNK−A001株の形態的特徴などは、以下のとおりである。
(3) 上記(1)に規定される塩基配列に対して98.5%以上の配列同一性を有する塩基配列
なお、欠失などの変異の導入により18S rRNAの塩基配列の塩基数が変化する場合においても、変異数が上記のとおり1以上、31以下の範囲内にあるか、配列同一性のパーセンテージが上記のとおり98.5%以上の範囲内にあれば、変異導入後の配列において、変異導入前の特定位置に相当する位置を特定することは当業者にとり容易である。具体的には、塩基配列の多重アライメント用プログラムで比較すべき配列をアライメントし、位置を決定することが可能である。また、塩基配列の同一性も、多重アライメント用プログラムで容易に求めることができる。
次に、上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、多糖類を精製する。イオン交換カラムクロマトグラフィーによれば、電荷の違いにより成分を分離できるため、中性多糖が主成分であると考えられる本発明に係る多糖類は、高電荷化合物と良好に分離できるといえる。使用するカラムとしては、陰イオン交換カラムがより好適である。藻類由来の多糖類としてはアルギン酸など酸性多糖類が多いため、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより本発明に係る多糖類をより効率的に精製でき得る。
本工程では、上記カラムクロマトグラフィー工程で得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有する多糖類を含むフラクションを特定する。
(1) KNK−A001株の培養
殺菌した液体培地にパラクロレラ・ケスレリ(Parachlorella kessleri)KNK−A001株(受託番号:FERM BP−22256)を接種し、アルミホイルで遮光した後、30℃で72時間前培養した。次に、より大容量の殺菌液体培地に前培養培地を加え、アルミホイルで遮光した後、内温30℃、通気量2L/分、撹拌数450rpm、pH6〜7で143時間培養した。次いで、ダブルドラム型乾燥機により培養液を乾燥し、得られた乾燥凝集体をフェザーミルで粉砕することによりKNK−A001株の細胞乾燥物を得た。
上記KNK−A001株の細胞乾燥物20gを200mLの蒸留水に懸濁し、分子量カット8,000の透析バックを用い、4℃で3日間透析して低分子化合物を除去した。透析後、バッグ内サンプルを三角フラスコに移し、121℃で10分間オートクレーブした。放冷後、50mLチューブに移し、4℃、17,000×gで30分間遠心処理した。遠心後、2mLチューブに移し、さらに4℃、15,000×gで30分間遠心処理した。上清を孔径0.22μmのフィルターを用いて濾過して抽出液とした。
マウスマクロファージ株細胞RAW264.7を96ウェルプレートに1ウェルあたり5×104個となるように100μL播種後、一夜培養して付着細胞とした。各ウェルから培地を除去し、上記実施例1で得られたフラクションF1〜F5を1,000μg/mLの濃度で含む培地を添加し、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した。その後、細胞培養上清に含まれる腫瘍壊死因子TNF−αの単位重量あたり及び単位糖濃度あたりの濃度をELISA法により求めた。結果を図2に示す。図2の通り、単位重量あたり及び単位糖濃度あたりの濃度ともに、F2とF5に免疫賦活活性が認められ、且つF2の活性に比べてF5の免疫賦活活性は明らかに高いものであった。
上記免疫賦活試験で活性が認められたF2およびF5の各サンプル50μLに8Mトリフルオロ酢酸50μLを添加し、100℃で3時間加水分解処理した。反応液を乾固させた後、超純水100μLに溶解した。当該溶液を4℃、10,000×gで10分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を超純水にて10倍希釈した希釈液50μLを無水酢酸でN−アセチル化し、さらにABEE化試薬にて蛍光標識した。次いで、水/クロロホルム抽出により水層から蛍光標識化単糖を回収し、分析に供した。分析は、タンパク質精製装置(「BioAssist eZ」東ソー社製)を用い、カラムとして逆相カラム(「PN−PAK C18」Walters社製)を用い、溶離液としてホウ酸バッファー/アセトニトリル混合溶媒を用い、流速を0.5mL/分に調製し、Ex:305nm,Em:360nmの条件で蛍光を検出する逆相液体クロマトグラフィーにより行い、サンプル1mL当たりに含まれる各単糖の重量から、糖全体に対する各糖の含有割合を算出した。分析結果を表2に示す。なお、上記条件では未検出(ND)の糖であっても、その含有量が完全に0質量%であるとは限らないため、各糖の含有割合の合計は100質量%とはならないことが多い。
Claims (7)
- 構成糖として中性糖を含み、
上記中性糖が、少なくとも、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースであり、
全中性糖中、ガラクトースの含有量が40質量%以上であり且つグルコースの含有量が15質量%以上であることを特徴とする多糖類。 - 全中性糖に対して、上記ラムノースおよびマンノースの含有量がそれぞれ5質量%以上であり、上記アラビノースの含有量が1質量%以上である請求項1に記載の多糖類。
- 請求項1または2に記載の多糖類を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
- 請求項1または2に記載の多糖類を製造する方法であって、
微細藻類およびその培養液の少なくとも一方より熱水抽出する工程、
上記熱水抽出工程で得られた抽出物をイオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、および、
上記イオン交換カラムクロマトグラフィーで得られたフラクションを免疫賦活試験に付し、免疫賦活活性を有するフラクションを特定する工程を含むことを特徴とする方法。 - 上記微細藻類がパラクロレラ属藻類である請求項4に記載の方法。
- 上記パラクロレラ属藻類がパラクロレラ属ケスレリ種藻類である請求項5に記載の方法。
- 上記パラクロレラ属ケスレリ種藻類がKNK−A001株(受託番号:FERM BP−22256)である請求項6に記載の方法。
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---|---|---|---|---|
JP2004107660A (ja) * | 2002-08-28 | 2004-04-08 | Mercian Corp | サイトカイン産生促進剤 |
JP2007507578A (ja) * | 2003-10-02 | 2007-03-29 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 低アセチル化または高アセチル化された髄膜炎菌の莢膜糖類 |
JP2010523789A (ja) * | 2007-04-11 | 2010-07-15 | 73100−セテンタ イ トレス ミル イ セン,エリデーアー | ガラクトースに富む多糖、その製造方法及びその応用 |
JP2015517587A (ja) * | 2012-05-11 | 2015-06-22 | グリコマー リミテッドGlycomar Limited | プラシノコッカス目由来の多糖類 |
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- 2017-05-15 JP JP2017096762A patent/JP2018193446A/ja active Pending
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