JP2018039961A - Polymer compound, coating material, carrier, and use method of carrier - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高分子化合物、被覆材料、担体、担体の使用方法に関する。 The present invention relates to a polymer compound, a coating material, a carrier, and a method for using the carrier.
近年、糖鎖、タンパク質、及び核酸等といった生理活性物質による生理活性能を利用した診断や解析についての研究開発が進んでいる。 In recent years, research and development for diagnosis and analysis using physiologically active ability of physiologically active substances such as sugar chains, proteins, and nucleic acids has been advanced.
例えば、特許文献１には、糖鎖が特定の官能基を有するスペーサー基を介して、糖鎖を固相担体に結合させる糖鎖アレイに関する技術が開示されている。 For example, Patent Document 1 discloses a technique related to a sugar chain array in which a sugar chain is bound to a solid phase carrier via a spacer group having a specific functional group.
また、特許文献２には、三官能性スペーサーを用いて、第１の官能基を糖鎖に、第２の官能基を固相担体に、第３の官能基を発色団にそれぞれ結合させて糖鎖アレイを作成する方法が開示されている。 In Patent Document 2, a trifunctional spacer is used to bind a first functional group to a sugar chain, a second functional group to a solid phase carrier, and a third functional group to a chromophore. A method for producing a sugar chain array is disclosed.
しかしながら、従来の技術では、生理活性物質を担体に結合させる際や、生理活性物質が固定化された担体を使用した際において、生理活性物質が担体から離脱してしまう問題があった。 However, the conventional technique has a problem that the physiologically active substance is detached from the carrier when the physiologically active substance is bound to the carrier or when the carrier on which the physiologically active substance is immobilized is used.
本発明者らは、生理活性物質を安定的に固定化させることに着目し、かかる課題について鋭意検討を行った結果、生理活性物質を固定化するための高分子化合物が特定の条件を満たすことが課題を解決させる指針として有効であるという新たな知見を得た。 The inventors of the present invention focused on stably immobilizing a physiologically active substance, and as a result of earnestly examining such a problem, the polymer compound for immobilizing the physiologically active substance satisfies a specific condition. Obtained new knowledge that is effective as a guideline to solve the problem.
すなわち、本発明者らは、高分子化合物を一定の条件下で成膜し、処理したときの膜残存率を制御することで、意外にも、生理活性物質を安定的に固定できることを見出し、本発明を完成させた。 That is, the present inventors found that a physiologically active substance can be stably immobilized unexpectedly by controlling the film remaining rate when a polymer compound is formed under a certain condition and processed. The present invention has been completed.
本発明は、生理活性物質を固定化するための高分子化合物であって、以下の条件１を満たす、高分子化合物を提供する。
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。
The present invention provides a polymer compound for immobilizing a physiologically active substance, which satisfies the following condition 1.
(Condition 1)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound is prepared. A substrate made of a cycloolefin copolymer formed into a glass slide is immersed in the prepared solution and left to stand for 30 minutes. Next, the substrate is taken out, rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25, and dried by centrifugation. Thereafter, the thickness T 1w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer. Further, the substrate is immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours and dried. Then, the film residual rate (T 2w / T 1w ) × 100 (%) when the thickness T 2w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer is 30 % To 95%.
本発明によれば、生理活性物質を安定的に固定できる高分子化合物を提供できる。 According to the present invention, a polymer compound capable of stably fixing a physiologically active substance can be provided.
以下、本発明の実施の形態について、説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
・高分子化合物
本実施形態における高分子化合物は、生理活性物質を固定化するために用いられる。高分子化合物は、以下の条件１を満たす。
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。
-High molecular compound The high molecular compound in this embodiment is used in order to fix | immobilize a bioactive substance. The polymer compound satisfies the following condition 1.
(Condition 1)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound is prepared. A substrate made of a cycloolefin copolymer formed into a glass slide is immersed in the prepared solution and left to stand for 30 minutes. Next, the substrate is taken out, rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25, and dried by centrifugation. Thereafter, the thickness T 1w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer. Further, the substrate is immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours and dried. Then, the film residual rate (T 2w / T 1w ) × 100 (%) when the thickness T 2w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer is 30 % To 95%.
上記スライドガラス状に成形した基板とは、平滑な平面を有する薄い基板であって、基板表面の少なくとも一方の面に均一な膜を成膜できるものであればよい。
また、膜厚は、平均値である。
The substrate formed in the shape of the glass slide is a thin substrate having a smooth flat surface as long as a uniform film can be formed on at least one surface of the substrate surface.
The film thickness is an average value.
上記膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）は、生理活性物質を安定的に固定化する観点から、３０％以上であり、４０％以上であることが好ましい。一方、高分子化合物の取扱性を向上させ、非特異吸着を抑制する観点から、９５％以下であり、９３％以下であることが好ましい。
本実施形態における高分子化合物によれば、特に生理活性物質を固定化する際、水溶液中に溶解した高分子化合物側に固定化してしまい、その分膜として残った側への生理活性物質の固定化量が少なくなったり、また不安定になったりするのを抑制することで生理活性物質を安定的に固定化できる。
The film remaining rate (T 2w / T 1w ) × 100 (%) is 30% or more and preferably 40% or more from the viewpoint of stably immobilizing the physiologically active substance. On the other hand, from the viewpoint of improving the handleability of the polymer compound and suppressing nonspecific adsorption, it is 95% or less, and preferably 93% or less.
According to the polymer compound in the present embodiment, particularly when the physiologically active substance is immobilized, the physiologically active substance is immobilized on the side of the polymer compound dissolved in the aqueous solution and left as a membrane. The physiologically active substance can be stably immobilized by suppressing the decrease in the amount of formation or instability.
生理活性物質を利用して、対象物の検出などに有効利用するためには、生理活性物質が安定的に固定化されることが重要となる。そのため、単に、生理活性物質を固定化するための高分子化合物を疎水化するだけでは、充分に安定した固定化をえることが困難であった。これに対し、本発明の高分子化合物は、上記のような特定の条件１を満たすことで、生理活性物質を従来にはない水準で安定的に固定できるものである。 In order to use a physiologically active substance effectively for detection of an object, it is important that the physiologically active substance is stably immobilized. For this reason, it has been difficult to obtain sufficiently stable immobilization simply by hydrophobizing a polymer compound for immobilizing a physiologically active substance. In contrast, the polymer compound of the present invention can stably fix a physiologically active substance at an unprecedented level by satisfying the specific condition 1 as described above.
また、高分子化合物は、さらに、以下の条件２を満たすものであってもよい。これにより、より安定的に生理活性物質を固定化できる。
（条件２）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｅをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を２５℃のエタノール中に１０分間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｅをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）が、２０％以上７０％以下である。
Further, the polymer compound may further satisfy the following condition 2. Thereby, a physiologically active substance can be more stably immobilized.
(Condition 2)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound is prepared. A substrate made of a cycloolefin copolymer formed into a glass slide is immersed in the prepared solution and left to stand for 30 minutes. Next, the substrate is taken out, rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25, and dried by centrifugation. Thereafter, the thickness T 1e of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer. Further, the substrate is immersed in ethanol at 25 ° C. for 10 minutes and dried. Then, the film residual rate (T 2e / T 1e ) × 100 (%) when the thickness T 2e of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer is 20 % To 70%.
上記膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）は、生理活性物質を安定的に固定化する観点から、２０％以上であり、３０％以上であることが好ましい。一方、高分子化合物の取扱性を向上し、基板への塗布を効率よく行う観点から、７０％以下であり、６０％以下であることが好ましい。
本実施形態における高分子化合物によれば、特に、残存した膜に生理活性物質含有溶液を反応させる際、疎水性の高い生理活性物質又は界面活性剤等の添加剤を溶解するために微量のアルコール類を混合する場合があったとしても、このような微量のアルコール溶液へポリマーが溶解することを抑制することで生理活性物質を安定的に固定化できる。
The film remaining rate (T 2e / T 1e ) × 100 (%) is 20% or more and preferably 30% or more from the viewpoint of stably immobilizing the physiologically active substance. On the other hand, it is 70% or less and preferably 60% or less from the viewpoint of improving the handleability of the polymer compound and efficiently applying to the substrate.
According to the polymer compound in the present embodiment, a small amount of alcohol is used to dissolve additives such as highly hydrophobic physiologically active substances or surfactants, particularly when the physiologically active substance-containing solution is reacted with the remaining membrane. Even if there is a case of mixing a kind, a physiologically active substance can be stably immobilized by suppressing the dissolution of the polymer in such a small amount of alcohol solution.
高分子化合物を基材に固定化するためには、高分子化合物を溶媒に適切に溶解させることが重要となる。そのため、高分子化合物が溶媒に対して溶解性を有することが重量であるが、単に、溶解性を付与するだけでは、充分に安定した固定化をえることが困難であった。これに対し、本発明の高分子化合物は、上記のような特定の条件２を満たすことで、生理活性物質を従来にはない水準で安定的に固定できるものである。 In order to immobilize the polymer compound on the substrate, it is important to appropriately dissolve the polymer compound in a solvent. Therefore, it is weight that the polymer compound has solubility in the solvent, but it has been difficult to obtain sufficiently stable immobilization simply by imparting solubility. On the other hand, the polymer compound of the present invention can stably fix a physiologically active substance at a level unconventional by satisfying the specific condition 2 as described above.
高分子化合物は、（Ａ）生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位を含む重合体であることが好ましい。
この重合体の由来となるモノマーは、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマーが好ましく、（メタ）アクリルアミド基または（メタ）アクリル基に生理活性物質等を固定化する官能基が結合した構造であることがさらに好ましい。
The polymer compound is preferably a polymer containing (A) a structural unit having a functional group for immobilizing a physiologically active substance.
The monomer from which the polymer is derived is preferably an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a physiologically active substance, and immobilizes the physiologically active substance or the like on a (meth) acrylamide group or a (meth) acryl group. It is more preferable that the structure has a functional group bonded thereto.
官能基としては、特に限定されないが、アミノ基やヒドラジド基、オキシルアミノ基など生理活性物質の還元末端と反応する官能基や、生理活性物質または生理活性物質含有物質に付随する官能基や物質と反応する官能基が好ましい。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、マレイミド基、アジド基、スルホネート基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、受容体基、ビオチンなどが挙げられる。 The functional group is not particularly limited, but includes a functional group that reacts with a reducing end of a physiologically active substance such as an amino group, a hydrazide group, or an oxylamino group, and a functional group or substance that accompanies a physiologically active substance or a physiologically active substance-containing substance. Reactive functional groups are preferred. Specific examples include aldehyde groups, active ester groups, epoxy groups, amino groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, hydroxyl groups, maleimide groups, azide groups, sulfonate groups, hydrazide groups, oxylamino groups, acceptor groups, Examples include biotin.
これらの中でも、糖又は糖鎖を固定化する場合は、その多くが還元末端を有することから、これらとの反応性の高いアミノ基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基が好ましい。アミノ基を有する生理活性物質もしくは生理活性物質含有物質を固定化する場合は、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基が好ましく、アミノ基との反応性と保存安定性のバランスから活性エステル基が最も好ましい。また、ヒドラジド基、オキシルアミノ基は、糖または糖鎖の還元末端であるアルデヒド基と反応して、ヒドラジド結合又はオキシム結合により糖鎖を捕捉することができるが、本発明においては、糖鎖のアルデヒド基との結合の強さから、オキシルアミノ基が特に好ましい。 Among these, when immobilizing a sugar or a sugar chain, since many of them have a reducing end, an amino group, a hydrazide group, and an oxylamino group highly reactive with these are preferable. When immobilizing a physiologically active substance or a physiologically active substance-containing substance having an amino group, an aldehyde group, an active ester group, or an epoxy group is preferable, and the active ester group is the most in view of the balance between reactivity with amino groups and storage stability. preferable. Further, a hydrazide group or an oxylamino group can react with an aldehyde group which is a reducing end of a sugar or a sugar chain to capture the sugar chain by a hydrazide bond or an oxime bond. An oxylamino group is particularly preferred because of its strong bond with an aldehyde group.
前記活性エステル基とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。 The active ester group means an ester group having a highly acidic electron-attracting group in one substituent of the ester group and activated for a nucleophilic reaction, that is, an ester group having a high reaction activity. As such, it is commonly used in various chemical synthesis fields such as polymer chemistry and peptide synthesis. In fact, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, and the like are known as active ester groups having much higher activity than alkyl esters and the like.
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。 Examples of such active ester groups include p-nitrophenyl active ester groups, N-hydroxysuccinimide active ester groups, succinimide active ester groups, phthalimide active ester groups, 5-norbornene-2, and 3-dicarboxyl. Although an imide active ester group etc. are mentioned, a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is most preferable.
本発明の高分子化合物に含まれる、成分（Ａ）の生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位は、特に構造を限定しないが、下記の構造単位（１）ないし（３）いずれかで表されることが好ましい。すなわち、重合後の（メタ）アクリル基と生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキレン基を介して結合した構造であることが好ましい。 The structural unit having a functional group for immobilizing the physiologically active substance of component (A) contained in the polymer compound of the present invention is not particularly limited in structure, but any of the following structural units (1) to (3) It is preferable to be represented by That is, it is a structure in which a (meth) acrylic group after polymerization and a functional group for immobilizing a physiologically active substance or a physiologically active substance-containing substance are bonded via a chain of an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms or an alkylene group. It is preferable.
式（２）は、ヒドラジド基を有する構造単位の一実施形態であり、式（２−１）はその具体例である。 Formula (2) is an embodiment of a structural unit having a hydrazide group, and Formula (2-1) is a specific example thereof.
式（３）は、オキシルアミノ基を有する構造単位の一実施形態であり、式（３−１）はその具体例である。 Formula (3) is an embodiment of a structural unit having an oxylamino group, and Formula (3-1) is a specific example thereof.
（Ａ）生理活性物質を固定化する官能基を有する構造単位を含む重合体の組成割合は、高分子化合物全体に対して、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値以上とすることにより、シグナルが低減するおそれを低減できる。一方、上限値以下とすることにより、相対的に疎水性基を有する重合体の減少を抑制し、塗布した際のムラの発生や、アッセイ中の高分子化合物の溶出を抑制できる。 (A) The composition ratio of the polymer containing a structural unit having a functional group for immobilizing a physiologically active substance is preferably 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 30 mol%, still more preferably based on the entire polymer compound. Is 1 to 20 mol%. By setting the composition ratio to be equal to or higher than the lower limit, it is possible to reduce the possibility that the signal is reduced. On the other hand, by setting it to the upper limit value or less, it is possible to suppress the decrease of the polymer having a relatively hydrophobic group, and to suppress the occurrence of unevenness when applied and the elution of the polymer compound during the assay.
高分子化合物は、生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基を有する重合体に、生理活性物質を固定化する官能基を導入したものでもよい。官能基の導入方法は特に限定されるものではないが、たとえば、高分子化合物中のアルキルエステル基にヒドラジンを反応させてヒドラジド基を導入する方法が挙げられる。アルキルエステル基としては、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基等が好適である。あるいは、高分子化合物中のカルボキシル基をカルボジイミドで活性化させて、そこにＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどを反応させて活性エステル化する方法、高分子化合物中の水酸基にｐ−ニトロフェニルクロロフォーメートなど酸クロライドを反応させて活性エステル化する方法などが挙げられる。
生理活性物質を固体化する官能基を導入しうる官能基を有する重合体の由来となるモノマーは、(メタ)アクリルアミド基又は（メタ）アクリル基に生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基が結合した構造であることが好ましい。
The polymer compound may be a polymer having a functional group capable of introducing a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance into which a functional group capable of immobilizing the physiologically active substance is introduced. The method for introducing a functional group is not particularly limited, and examples thereof include a method for introducing a hydrazide group by reacting an alkyl ester group in a polymer compound with hydrazine. As the alkyl ester group, a methyl ester group, an ethyl ester group, a propyl ester group and the like are preferable. Alternatively, a method in which a carboxyl group in a polymer compound is activated with carbodiimide and N-hydroxysuccinimide or the like is reacted therewith to produce an active ester, an acid such as p-nitrophenyl chloroformate on a hydroxyl group in the polymer compound For example, a method of reacting chloride with an active ester may be used.
The monomer that is derived from the polymer having a functional group capable of introducing a functional group that solidifies the physiologically active substance introduces a functional group that immobilizes the physiologically active substance to the (meth) acrylamide group or (meth) acrylic group. It is preferable that the structure has a functional group bonded thereto.
アルキルエステル基を有するモノマーの具体的な例としては、下記式（５）で表されるようなものが挙げられる。 Specific examples of the monomer having an alkyl ester group include those represented by the following formula (5).
カルボキシル基を有するモノマーの具体的な例としては、下記式（６）で表されるものが挙げられる。 Specific examples of the monomer having a carboxyl group include those represented by the following formula (6).
水酸基を有するモノマーの具体的な例としては、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。 Specific examples of the monomer having a hydroxyl group include polyethylene glycol mono (meth) acrylate.
生理活性物質を固定化する官能基を導入しうる官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマー由来の構造単位を含む重合体に、生理活性物質を固定化する官能基を導入する場合でも、高分子化合物全体に対するその組成割合は、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値以上とすることにより、シグナルが低減するおそれを低減できる。一方、上限値以下とすることにより、相対的に疎水性基を有する重合体の減少を抑制し、塗布した際のムラの発生や、アッセイ中の高分子化合物の溶出を抑制できる。 Even when a functional group for immobilizing a physiologically active substance is introduced into a polymer containing a structural unit derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group capable of introducing a functional group for immobilizing a physiologically active substance, the polymer The composition ratio with respect to the whole compound is preferably 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 30 mol%, still more preferably 1 to 20 mol%. By setting the composition ratio to be equal to or higher than the lower limit, it is possible to reduce the possibility that the signal is reduced. On the other hand, by setting it to the upper limit value or less, it is possible to suppress the decrease of the polymer having a relatively hydrophobic group, and to suppress the occurrence of unevenness when applied and the elution of the polymer compound during the assay.
なお、１級アミンなどラジカル重合の阻害剤として働く官能基やイソシアネートなど加熱により反応が進行しやすい官能基については、予め保護基で保護するのが好ましい。保護基の種類は、その官能基が保護されれば特に制限はない。アミノ基、オキシルアミノ基、ヒドラジド基などの１級アミンを有する官能基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）が用いられる。中でも、脱保護のしやすさからｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）が好ましい。また、イソシアネートはピラゾールやピラゾール誘導体で保護することができる。 In addition, it is preferable to protect beforehand the functional group which acts as an inhibitor of radical polymerization, such as a primary amine, or the functional group where the reaction easily proceeds by heating, such as isocyanate. The kind of the protecting group is not particularly limited as long as the functional group is protected. A tert-butoxycarbonyl group (BOC group) or a benzyloxycarbonyl group (Z group) is used as a functional group having a primary amine such as an amino group, an oxylamino group, or a hydrazide group. Among them, a tert-butoxycarbonyl group (BOC group) is preferable because of easy deprotection. In addition, isocyanates can be protected with pyrazole or pyrazole derivatives.
脱保護条件は保護基に応じて適宜選択してよい。例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）の脱保護は、トリフルオロ酢酸、塩酸、塩酸−ジオキサン溶液、塩酸−酢酸エチル溶液など強酸を作用させるとよい。脱保護のタイミングは任意であるが、より活性の高い状態で生理活性物質と反応させる方が有利であることから、それらとの反応の直前に行うのが好ましい。 Deprotection conditions may be appropriately selected depending on the protecting group. For example, deprotection of a tert-butoxycarbonyl group (BOC group) may be performed by applying a strong acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, hydrochloric acid-dioxane solution, hydrochloric acid-ethyl acetate solution, or the like. Although the timing of deprotection is arbitrary, since it is advantageous to react with a physiologically active substance in a more active state, it is preferably performed immediately before the reaction with them.
具体的なモノマーとしては、下記式（７）又は（８）で表されるモノマーが挙げられる。 Specific examples of the monomer include a monomer represented by the following formula (7) or (8).
（式（７）及び（８）中、Ｒ１３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、及び−ＣＯＮＨ−からなる群から選択される少なくとも一つで中断されてもよい炭素数１以上２０以下の炭化水素鎖を示し、Ｒ１４はＨ、ＣＨ３又は炭素数２以上５以下の炭化水素鎖を示し、［Ｐ］は、保護基を示す。） (In the formulas (7) and (8), R 13 may be interrupted with at least one selected from the group consisting of —O—, —S—, —NH—, —CO—, and —CONH—). A hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms, R 14 represents H, CH 3 or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and [P] represents a protecting group.)
式（７）中、Ｒ１３としては、下記式（９）又は（１０）で表されるものが挙げられる。下記式中、ｅ、ｆ及びｈは１以上５以下の整数を表し、ｇは１以上１０以下の整数を表す。 In formula (7), examples of R 13 include those represented by the following formula (9) or (10). In the following formulae, e, f and h represent an integer of 1 to 5, and g represents an integer of 1 to 10.
式（８）中、Ｒ１３としては、下記式（１１）又は（１２）で表されるものが挙げられる。式（１１）又は（１２）中、ｉ及びｋは１以上５以下の整数を表し、ｊは１以上１０以下の整数を表す。 In formula (8), examples of R 13 include those represented by the following formula (11) or (12). In formula (11) or (12), i and k represent an integer of 1 to 5, and j represents an integer of 1 to 10.
式（７）又は（８）で表される化合物としては、例えば、それぞれ下記式（１３）又は（１４）で表されるものが挙げられる。 Examples of the compound represented by formula (7) or (8) include those represented by the following formula (13) or (14), respectively.
保護基［Ｐ］としては、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、炭素数３から２０個のアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トリメチルシリル基等が挙げられる。 Examples of the protecting group [P] include 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc), tert-butoxycarbonyl group (Boc), benzyloxycarbonyl group (Cbz), and 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group. (Troc), allyloxycarbonyl group (Alloc), 4-methoxytrityl group (Mmt), amino group, alkyl group having 3 to 20 carbon atoms, 9-fluoreneacetyl group, 1-fluorenecarboxylic acid group, 9-fluorene Carboxylic acid group, 9-fluorenone-1-carboxylic acid group, benzyloxycarbonyl group, xanthyl group (Xan), trityl group (Trt), 4-methyltrityl group (Mtt), 4-methoxy 2,3,6-trimethyl -Benzenesulfonyl group (Mtr), mesitylene-2-sulfonyl group (Mts), , 4-dimethoxybenzohydryl group (Mbh), tosyl group (Tos), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl group (Pmc), 4-methylbenzyl group (MeBzl), 4 -Methoxybenzyl group (MeOBzl), benzyloxy group (BzlO), benzyl group (Bzl), benzoyl group (Bz), 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys), 1- (4,4-dimethyl- 2,6-diaxocyclohexylidene) ethyl group (Dde), 2,6-dichlorobenzyl group (2,6-DiCl-Bzl), 2-chlorobenzyloxycarbonyl group (2-Cl-Z), 2- Bromobenzyloxycarbonyl group (2-Br-Z), benzyloxymethyl group (Bom), cyclohexyloxy group (cHxO), t-butoxymethyl Group (Bum), t-butoxy group (tBuO), t-butyl group (tBu), acetyl group (Ac), trifluoroacetyl group (TFA) o-bromobenzyloxycarbonyl group, t-butyldimethylsilyl group, Examples include 2-chlorobenzyl (Cl-z) group, cyclohexyl group, cyclopentyl group, isopropyl group, pivalyl group, tetrahydropyran-2-yl group, trimethylsilyl group and the like.
具体的なモノマーとしては、例えば、下記式（１５−１）、（１５−２）で表される化合物である。 Specific examples of the monomer include compounds represented by the following formulas (15-1) and (15-2).
高分子化合物は、さらに（Ｂ）疎水性基を有する構造単位を含む共重合体であることが好ましい。これにより、高分子化合物を基材に固定化させる役割を果たすとともに、高分子化合物が洗浄工程において溶解しにくくすることができる。 The polymer compound is preferably a copolymer further comprising (B) a structural unit having a hydrophobic group. Thereby, while playing the role which fixes a high molecular compound to a base material, a high molecular compound can be made difficult to melt | dissolve in a washing | cleaning process.
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位の由来となるモノマーは、（メタ）アクリル基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は、特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。 The monomer derived from the structural unit having a hydrophobic group of component (B) preferably has a structure in which a hydrophobic group is bonded to a (meth) acrylic group. The hydrophobic group is not particularly limited, and examples thereof include an alkyl group and aromatics.
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位は、下記式（４）で表される構造であることが好ましい。 The structural unit having a hydrophobic group as the component (B) is preferably a structure represented by the following formula (4).
Ｒ６のアルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは３〜６である。 The structure of the alkyl group for R 6 is not particularly limited, and may be linear, branched or cyclic. Carbon number of an alkyl group becomes like this. Preferably it is 1-10, More preferably, it is 1-6, More preferably, it is 3-6.
成分（Ｂ）の疎水性基を有する構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、ｉｓｏ−ブチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、フェノキシ（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、２−エチルフェノキシ（メタ）アクリレート、２−エチルチオフェニル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、２−フェニルエチル（メタ）アクリレート、３−フェニルプロピル（メタ）アクリレート、４−フェニルブチル（メタ）アクリレート、２−２−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−３−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−４−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−（４−プロピルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−（１−メチルエチル）フェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−メトキシフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−シクロへキシルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（２−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−ブロモフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−フェニルフェニル）エチル（メタ）アクリレートおよび２−（４−ベンジルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、メタクリル酸ｎ−ブチル、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等が挙げられるが、担体上での安定性(膜の保持性)と重合のしやすさのバランスの観点からシクロヘキシル（メタ）アクリレート又はメタクリル酸ｎ−ブチルが好ましい。 Specific examples of the monomer derived from the structural unit having a hydrophobic group as the component (B) include iso-butyl (meth) acrylate, sec-butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, and n-neopentyl. (Meth) acrylate, iso-neopentyl (meth) acrylate, sec-neopentyl (meth) acrylate, neopentyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, iso-hexyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, n -Octyl (meth) acrylate, iso-octyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-nonyl (meth) acrylate, iso-nonyl (meth) acrylate, n-decyl (meth) acrylate, iso-decyl (Me ) Acrylate, n-dodecyl (meth) acrylate, iso-dodecyl (meth) acrylate, n-tridecyl (meth) acrylate, iso-tridecyl (meth) acrylate, n-tetradecyl (meth) acrylate, iso-tetradecyl (meth) acrylate , N-pentadecyl (meth) acrylate, iso-pentadecyl (meth) acrylate, n-hexadecyl (meth) acrylate, iso-hexadecyl (meth) acrylate, n-octadecyl (meth) acrylate, iso-octadecyl (meth) acrylate, cyclohexyl (Meth) acrylate, isobornyl (meth) acrylate, phenoxy (meth) acrylate, phenoxyethyl (meth) acrylate, 2-ethylphenoxy (meth) acrylate, -Ethylthiophenyl (meth) acrylate, phenyl (meth) acrylate, benzyl (meth) acrylate, 2-phenylethyl (meth) acrylate, 3-phenylpropyl (meth) acrylate, 4-phenylbutyl (meth) acrylate, 2- 2-methylphenylethyl (meth) acrylate, 2-3-methylphenylethyl (meth) acrylate, 2-4-methylphenylethyl (meth) acrylate, 2- (4-propylphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4- (1-methylethyl) phenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-methoxyphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-cyclohexylphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- ( 2-Chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate 2- (3-chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-bromophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (3-phenylphenyl) Examples include ethyl (meth) acrylate and 2- (4-benzylphenyl) ethyl (meth) acrylate, n-butyl methacrylate, 2-methoxyethyl (meth) acrylate, and the like. ) And ease of polymerization, cyclohexyl (meth) acrylate or n-butyl methacrylate is preferred.
（Ｂ）疎水性基を有する構造単位が含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基材に対しても密着性が向上し、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。 (B) By including a structural unit having a hydrophobic group, adhesion to a hydrophobic substrate such as plastic is improved, and the polymer compound is eluted during the assay. Can be prevented.
（Ｂ）疎水性基を有する構造単位を含む共重合体における組成の割合は、高分子化合物全体に対して、２０〜９９ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９５ｍｏｌ％である。組成割合を下限値以上とすることにより、アッセイ中の該高分子化合物の溶出を低減できる。一方、上限値以下とすることにより、生理活性物質を固定化する官能基を有する重合体の減少を抑制し、シグナルの低減、非特異吸着の発生を低減できる。 (B) The ratio of the composition in the copolymer containing the structural unit having a hydrophobic group is preferably 20 to 99 mol%, more preferably 30 to 95 mol%, and most preferably 50 to 95 mol% with respect to the entire polymer compound. %. By setting the composition ratio to the lower limit value or more, elution of the polymer compound during the assay can be reduced. On the other hand, by setting it to the upper limit value or less, it is possible to suppress a decrease in the polymer having a functional group that immobilizes the physiologically active substance, and to reduce signal and nonspecific adsorption.
高分子化合物は、さらに（Ｃ）親水性基を有する構造単位を含む共重合体であることが好ましい。これにより、検出対象物質が高分子化合物に非特異的に吸着することを抑制できる。 The polymer compound is preferably a copolymer further comprising (C) a structural unit having a hydrophilic group. Thereby, it can suppress that a detection target substance adsorb | sucks to a high molecular compound nonspecifically.
成分（Ｃ）の親水性基を有する構造単位は、重合後の（メタ）アクリル基または（メタ）アクリルアミド基に親水性基が結合した構造であることが好ましく、下記式（１６）ないし（１８）のいずれかで表されることがより好ましい。これらは１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。 The structural unit having a hydrophilic group as the component (C) preferably has a structure in which a hydrophilic group is bonded to a (meth) acrylic group or (meth) acrylamide group after polymerization, and the following formulas (16) to (18): ) Is more preferable. These can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
式（１６）中、アルキレングリコール残基Ｚの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｚの繰り返し数ｑは１〜１００の整数であり、好ましくは２〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｚの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 In Formula (16), carbon number of alkylene glycol residue Z is 1-10, Preferably it is 1-6, More preferably, it is 2-4, More preferably, it is 2-3, Most preferably 2. The repeating number q of the alkylene glycol residue Z is an integer of 1 to 100, preferably an integer of 2 to 100, more preferably an integer of 2 to 95, and most preferably an integer of 4 to 90. When the number of repeats is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue Z to be repeated may be the same or different.
式（１６）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手容易性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。 Specific examples of the monomer derived from the structural unit represented by the formula (16) include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, methoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxydiethylene glycol. (Meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, and the like can be mentioned, but methoxypolyethylene glycol methacrylate is preferred because of its availability.
式（１７）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル２−（トリメチルアンモニオ）エチル（ＭＰＣ）が挙げられる。 Specific examples of the monomer from which the structural unit represented by the formula (17) is derived include 2- (methacryloyloxy) ethyl 2- (trimethylammonio) ethyl (MPC) phosphate.
式（１８）において、得られる高分子化合物の親水性を向上させる観点から、ｍは２または３であることが好ましい。 In the formula (18), m is preferably 2 or 3 from the viewpoint of improving the hydrophilicity of the resulting polymer compound.
式（１８）で表される構造単位の由来となるモノマーの具体例としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ）、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）等が挙げられる。 Specific examples of the monomer derived from the structural unit represented by the formula (18) include N- (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), and the like.
（Ｃ）親水性基を有する構造単位を含む共重合体の組成割合は、高分子化合物全体に対して、０〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜４０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜３０ｍｏｌ％である。組成割合を上限値以下とすることにより、相対的に生理活性物質を固定化する官能基を有する重合体の減少を抑制し、アッセイ中の高分子化合物の溶出を低減できる。 (C) As for the composition ratio of the copolymer containing the structural unit which has a hydrophilic group, 0-50 mol% is preferable with respect to the whole high molecular compound, More preferably, it is 0-40 mol%, Most preferably, it is 0-30 mol%. It is. By setting the composition ratio to be equal to or less than the upper limit value, it is possible to suppress a decrease in the polymer having a functional group that relatively immobilizes the physiologically active substance, and to reduce elution of the polymer compound during the assay.
本発明の高分子化合物の化学構造は、上記のモノマーが（共）重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。 The chemical structure of the polymer compound of the present invention may be in any form such as random, block, graft, etc., as long as the above monomer is (co) polymerized.
高分子化合物の数平均分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製を容易にし、生理活性物質の固定化を安定させる観点から、５０００以上であることが好ましく、１００００以上であることがより好ましく、１００００００以下であることが好ましく、５０００００以下であることがより好ましく、２０００００以下であることがさらに好ましい。数平均分子量が５０００以上とすることで、溶解性を適度にし、膜の維持性を良好に保持できる。一方、数平均分子量が１００００００以下とすることにより、塗布時のハンドリングを良好に維持できるようになる。 The number average molecular weight of the polymer compound is preferably 5000 or more from the viewpoint of facilitating separation and purification of the polymer compound and unreacted ethylenically unsaturated polymerizable monomer and stabilizing the immobilization of the physiologically active substance. It is more preferably 10,000 or more, preferably 1000000 or less, more preferably 500000 or less, and further preferably 200000 or less. By setting the number average molecular weight to 5,000 or more, the solubility can be made moderate and the maintainability of the film can be satisfactorily maintained. On the other hand, when the number average molecular weight is 1000000 or less, the handling during coating can be favorably maintained.
・高分子化合物の重合法
本発明の高分子化合物の重合方法は、特に限定されるものではないが、重合の容易さから、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン不飽和重合性モノマー（任意に疎水性基を有するエチレン不飽和重合性モノマー）を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。ラジカル重合させるための混合物には、さらに親水性基を有するエチレン不飽和重合性モノマーを含むことができる。また、後述する基材上に重合性官能基や連鎖移動基等を導入し、基材上で上記高分子化合物を合成してもよい。
-Polymer compound polymerization method The method for polymerizing the polymer compound of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of polymerization, ethylenically unsaturated polymerizability having at least a functional group for immobilizing a physiologically active substance. It is preferable to radically polymerize a monomer (optionally an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group) in a solvent in the presence of a polymerization initiator. The mixture for radical polymerization can further contain an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group. Moreover, a polymerizable functional group, a chain transfer group, or the like may be introduced on a base material described later to synthesize the polymer compound on the base material.
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルエチルケトン、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒が基材を変性させないため好ましい。 Any solvent may be used as long as each ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be dissolved. Examples thereof include methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, methyl ethyl ketone, and acetone. be able to. These solvents are used alone or in combination of two or more. When the polymer compound is applied to a plastic substrate, ethanol, methanol, 2-butanone, and a mixed solvent thereof are preferable because they do not denature the substrate.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２'−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１'−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。 The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, such as 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), and the like. Examples thereof include organic peroxides such as azo compounds, benzoyl peroxide, and lauryl peroxide.
・担体
担体は、上述の高分子化合物で基材表面が被覆されているものである。これにより、担体に、特定の生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する性質を容易に付与することが可能となる。高分子化合物が親水性基を有する構造単位を含む場合には、該担体にタンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を付与することが可能である。さらに、高分子化合物が疎水性基を有する構造単位を含む場合には、高分子化合物の基材表面からの脱離を抑制することができる。
-Carrier The carrier is a substrate whose surface is coated with the above-described polymer compound. Thereby, it becomes possible to easily give the carrier the property of immobilizing a specific physiologically active substance or a physiologically active substance-containing substance. When the polymer compound includes a structural unit having a hydrophilic group, the carrier can be imparted with a property of suppressing nonspecific adsorption of protein or the like. Further, when the polymer compound includes a structural unit having a hydrophobic group, the polymer compound can be prevented from being detached from the substrate surface.
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば、有機溶媒に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した被覆材料を調製し、当該被覆材料中に基材を浸漬、または基材に当該被覆材料を吹きつける等の公知の方法で、基材表面に被覆材料を付着させた後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。また、前記記載のとおり、基材上で高分子化合物を合成した場合は、その状態で高分子化合物に被覆されていることとなる。
なお、被覆とは、すべてまたは連続であるものに限られず、一部または非連続であるものも含む。
For coating the substrate surface with the polymer compound, for example, a coating material in which the polymer compound is dissolved in an organic solvent to a concentration of 0.05 to 10% by weight is prepared, and the substrate is immersed in the coating material. Alternatively, the coating material is attached to the surface of the substrate by a known method such as spraying the coating material on the substrate, and then dried at room temperature or under heating. Further, as described above, when a polymer compound is synthesized on a substrate, the polymer compound is coated in that state.
Note that the coating is not limited to all or continuous, but also includes partial or non-continuous.
上記有機溶媒としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶媒が使用される。中でも、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。 As the organic solvent, a single solvent such as ethanol, methanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, or a mixed solvent thereof is used. Among these, ethanol, methanol, 2-butanone, and a mixed solvent thereof are preferable because they do not denature the plastic substrate and can be easily dried.
上記基材としては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、金属、金属酸化物、及びシリカ、ガラス等の珪素酸化物の中から選ばれることが好ましい。表面処理の容易性、量産性の観点から、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂がより好ましく、熱可塑性樹脂がさらに好ましい。 The substrate is preferably selected from thermoplastic resins, thermosetting resins, metals, metal oxides, and silicon oxides such as silica and glass. From the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity, a thermoplastic resin and a thermosetting resin are more preferable, and a thermoplastic resin is more preferable.
基材の形状は特に制限を受けるものではないが、担体をバイオチップとして用いる場合、例えばスライドガラス形状の基材やマルチウェルプレート等が好適に用いられる。 The shape of the substrate is not particularly limited, but when the carrier is used as a biochip, for example, a glass substrate or a multiwell plate is preferably used.
担体をバイオチップとして用いる場合、熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。 When the carrier is used as a biochip, the thermoplastic resin preferably has a small amount of fluorescence generation. For example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, etc. are preferably used. It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in chemical resistance, low fluorescence, and moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.
基材表面と、被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、フッ化アルゴン、フッ化クリプトンなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。 In order to improve the adhesion between the substrate surface and the polymer compound to be coated, it is preferable to activate the substrate surface. As a means for activation, there are a method of plasma treatment under an oxygen atmosphere, an argon atmosphere, a nitrogen atmosphere, an air atmosphere and the like, and a method of treatment with an excimer laser such as argon fluoride and krypton fluoride. A method of plasma treatment in an oxygen atmosphere is preferred.
・生理活性物質などが固定化された担体
本発明の担体を使用して各種の生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することができる。生理活性物質としては、糖、糖質、糖鎖、タンパク質、核酸、細胞、脂質及びこれらを有する生理活性物質が挙げられる。また、糖鎖または糖鎖含有物質としては、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などがある。
-Carrier to which physiologically active substance or the like is immobilized Various physiologically active substances or physiologically active substance-containing substances can be immobilized using the carrier of the present invention. Examples of the physiologically active substance include sugars, carbohydrates, sugar chains, proteins, nucleic acids, cells, lipids, and physiologically active substances having these. Examples of the sugar chain or sugar chain-containing substance include monosaccharides, sugar chains of two or more sugars, sugar amino acids, glycopeptides, glycoproteins, glycolipids, glycosaminoglycans, glycosylphosphatidylinositols, peptidoglycans, lipopolysaccharides, and the like There are derivatives of
担体表面に被覆した高分子化合物における生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が、生理活性物質の還元末端と反応する官能基である場合は、還元末端を有する生理活性物質をｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できる。 When the functional group that immobilizes the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance in the polymer compound coated on the surface of the carrier is a functional group that reacts with the reducing end of the physiologically active substance, the physiologically active substance having a reducing end is added. It can be fixed by dissolving in a pH 4.0-6.0 buffer and allowing the solution to stand on a carrier at room temperature to 100 ° C. for 10 minutes to 24 hours.
一方、生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化する官能基が、活性エステル基などアミノ基と反応する基である場合は、生理活性物質または生理活性物質含有物質にアミノ基が必要である。アミノ基を有する糖鎖や糖アミノ酸、糖ペプチドまたは糖タンパク質をｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できるが、アミノ基を持たない糖鎖の場合はそれを導入する必要がある。この場合、アミノ基は還元末端側に導入されていることが好ましい。
こうして得られた生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した担体は、十分な量の生理活性物質または生理活性物質含有物質が化学結合で強固に固定化され、さらに検出対象以外の非特異吸着が少なくできることから、該生理活性物質または生理活性物質含有物質と特異的に結合する物質を選択的に捕捉することができる。特に、担体が基板である場合、バイオチップとして好適に用いることができる。
On the other hand, when the functional group that immobilizes the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is a group that reacts with an amino group such as an active ester group, an amino group is required for the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance. . An amino group-containing sugar chain, sugar amino acid, glycopeptide or glycoprotein is dissolved in a buffer solution of pH 7.0 to 10.0, and the solution is allowed to stand on a carrier at room temperature to 100 ° C. for 10 minutes to 24 hours. However, in the case of a sugar chain having no amino group, it is necessary to introduce it. In this case, the amino group is preferably introduced on the reducing end side.
The carrier obtained by immobilizing the physiologically active substance or the substance containing the physiologically active substance thus obtained has a sufficient amount of the physiologically active substance or the substance containing the physiologically active substance firmly immobilized by chemical bonding, and is non-specific other than the detection target. Since adsorption can be reduced, a substance that specifically binds to the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance can be selectively captured. In particular, when the carrier is a substrate, it can be suitably used as a biochip.
本発明において生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化する際には、生理活性物質または生理活性物質含有物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。点着後、静置すると、生理活性物質または生理活性物質含有物質が基材上の官能基と化学的に結合し、生理活性物質または生理活性物質含有物質が表面に固定化される。例えばアミノ基を有する糖鎖を用いた場合は、前に示した方法を適用できる。 In the present invention, when the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is immobilized on the biochip carrier, a method of spotting a liquid in which the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is dissolved or dispersed is preferable. When left standing after the spotting, the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is chemically bonded to the functional group on the substrate, and the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is immobilized on the surface. For example, when a sugar chain having an amino group is used, the above-described method can be applied.
生理活性物質または生理活性物質含有物質をバイオチップ用担体上に固定化した後は、生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化した部分以外の担体表面の官能基を不活性化処理するのが好ましい。担体の官能基が活性エステル基やアルデヒド基などの場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。 After the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is immobilized on the biochip carrier, the functional group on the surface of the carrier other than the part where the physiologically active substance or the physiologically active substance-containing substance is immobilized is inactivated. Is preferred. When the functional group of the carrier is an active ester group or an aldehyde group, it is preferable to use an alkali compound or a compound having a primary amino group.
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。 As the alkali compound, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, potassium phosphate, etc. are preferably used. Can do. Examples of the compound having a primary amino group include methylamine, ethylamine, butylamine, glycine, 9-aminoacazine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4 -Pentanol, aminoethanethiol hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6-aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2 -Aminooctane, 2-aminooctanoic acid, 1 Amino 2-propanol, 3-amino-1-propanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide , P-aminopropiophenone, aminophenylacetic acid, aminonaphthalene and the like can be preferably used, and aminoethanol and glycine are most preferable.
また、基材の官能基がヒドラジド基又はオキシルアミノ基などの場合は、例えば、酸無水物との反応やオキソ酸との縮合により行うことができる。酸無水物は特に限定されないが、反応性からカルボン酸無水物が好ましい。カルボン酸無水物の例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸などが挙げられるが、中でも無水酢酸、無水コハク酸がより好ましい。また、オキソ酸も特に限定されないが、反応性からカルボン酸が好ましい。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸等が挙げられるが、中でもギ酸、酢酸が好ましい。 Further, when the functional group of the substrate is a hydrazide group or an oxylamino group, it can be carried out, for example, by reaction with an acid anhydride or condensation with an oxo acid. The acid anhydride is not particularly limited, but a carboxylic acid anhydride is preferable from the viewpoint of reactivity. Examples of carboxylic acid anhydrides include acetic anhydride, propionic anhydride, succinic anhydride, maleic anhydride, phthalic anhydride, benzoic anhydride, etc. Among them, acetic anhydride and succinic anhydride are more preferable. Also, oxo acid is not particularly limited, but carboxylic acid is preferable from the viewpoint of reactivity. Examples of the carboxylic acid include formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, benzoic acid, hydroxybenzoic acid, etc. Among them, formic acid and acetic acid are preferable.
また、前記不活性化処理工程では、担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去することができることが多い。除去できない場合は、不活性化処理前に基材を洗浄することで除去することが好ましい。例えば基材を超純水、界面活性剤含有緩衝液等で１〜５分間浸漬し洗浄することで、除去できる。 Further, in the inactivation treatment step, a physiologically active substance or a physiologically active substance-containing substance that has not been bonded to the functional group of the carrier can often be washed and removed at the same time. When it cannot be removed, it is preferable to remove the substrate by washing it before the inactivation treatment. For example, it can be removed by immersing the substrate in ultrapure water, a surfactant-containing buffer solution or the like for 1 to 5 minutes and washing.
担体は、以下の使用方法を含む。
上記被覆材料を準備する工程と、前記被覆材料を用いて、基材の表面を被覆し、担体を形成する工程と、前記担体に、生理活性物質を固定化する工程と、前記生理活性物質が固定化された前記担体を純水またはバッファで洗浄する工程と、を含む。
純水またはバッファで洗浄する工程としては、上記のように担体の官能基と結合しなかった生理活性物質または生理活性物質含有物質も同時に洗浄・除去する工程や、過剰な検出対象物または非検出対象物を洗浄・除去する工程が挙げられる。
本発明の高分子化合物によれば、特定の条件１を満たすため、上記のような洗浄工程を含む使用方法において好適に用いられる。
The carrier includes the following methods of use.
A step of preparing the coating material, a step of coating a surface of a substrate using the coating material to form a carrier, a step of immobilizing a physiologically active substance on the carrier, and the physiologically active substance Washing the immobilized carrier with pure water or a buffer.
As a process of washing with pure water or a buffer, as described above, a process of simultaneously washing and removing a physiologically active substance or a substance containing a physiologically active substance that did not bind to a functional group of a carrier, an excessive detection target or non-detection A step of cleaning / removing the object is included.
According to the polymer compound of the present invention, in order to satisfy the specific condition 1, it is suitably used in a method of use including the above-described washing step.
このように生理活性物質または生理活性物質含有物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。 The biochip obtained by immobilizing a physiologically active substance or a substance containing a physiologically active substance in this way can be used in many analysis systems including immunodiagnostic systems, sugar chain microarray systems, and microfluidic devices. .
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described, these are illustrations of this invention and various structures other than the above are also employable.
次に、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明の内容は実施例に限られるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, the content of this invention is not restricted to an Example.
［メチルエステル含有モノマーの合成］
以下の（スキーム１）に示すルートで、メチルエステル含有モノマーを合成した。
[Synthesis of monomer containing methyl ester]
A methyl ester-containing monomer was synthesized by the route shown in the following (Scheme 1).
ステップ１：化合物（ｈ）の合成
まず、無水メタクリル酸（ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）（ｆ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇの（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥＡ：２５ｇ，０．１７ｍｏｌ）（ｇ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｈ）を得た。
Step 1: Synthesis of Compound (h) First, a solution of methacrylic anhydride (MAH: 5 g, 0.03 mol) (f) dissolved in 100 mL of chloroform was added to 25 g of (ethylenedioxy) bis (ethylamine) (EDBEA). : 25 g, 0.17 mol) (g) was added dropwise to a solution of 100 mL of chloroform in an ice bath. Nitrogen was sealed therein and stirred overnight. The residue obtained by evaporating the solvent from the obtained reaction solution is applied to a silica gel column (developing solvent: mixed solvent of 90 parts of chloroform / 10 parts of methanol) to fractionate a predetermined fraction, and the solvent is evaporated from this fraction. To give compound (h).
ステップ２：化合物（ｊ）の合成
次に、５ｇの化合物（ｈ）（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチル（ｉ）および１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０体積％／メタノール１０体積％の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｊ）を得た。
また、得られた物質は、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により化合物（ｊ）、すなわち「メチルエステル含有モノマー」であることを確認した。
Step 2: Synthesis of Compound (j) Next, 1.5 equivalents of monomethyl succinate (i) and 1.5 equivalents were added to a solution of 5 g of Compound (h) (0.023 mol) dissolved in 100 mL of chloroform. 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, which is a water-soluble carbodiimide compound (WSC), was added and sealed. Nitrogen was sealed therein and stirred overnight. The residue obtained by evaporating the solvent from the obtained reaction solution was applied to a silica gel column (developing solvent: mixed solvent of 90% by volume of chloroform / 10% by volume of methanol) to fractionate a predetermined fraction. Was evaporated to obtain compound (j).
Further, the obtained substance was confirmed to be the compound (j), that is, “methyl ester-containing monomer” by NMR, matrix-assisted laser ionization-time of flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS).
［高分子化合物の合成例１］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例１とした。
[Synthesis Example 1 of Polymer Compound]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the above methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order of 0.25 mol / L, 0.40 mol / L, and 0.35 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further, azobisisobutyronitrile (AIBN) was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone, and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1 and Evaluation 2” described below.
［高分子化合物の合成例２］
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（平均分子量４７５）、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．１７５ｍｏｌ／Ｌ、０．２８ｍｏｌ／Ｌ、０．２４５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトンを７０／３０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例２とした。
[Synthesis Example 2 of Polymer Compound]
Polyethylene glycol methyl ether methacrylate (average molecular weight 475), the methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order to be 0.175 mol / L, 0.28 mol / L, and 0.245 mol / L, respectively. A mixed solution was prepared. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane and acetone were mixed at a volume ratio of 70/30, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1, Evaluation 2” described below.
［高分子化合物の合成例３］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸ｎ−ブチルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例３とした。
[Synthesis Example 3 of Polymer Compound]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the methyl ester-containing monomer, and n-butyl methacrylate are dissolved in ethanol in order to be 0.25 mol / L, 0.40 mol / L, and 0.35 mol / L, respectively. Was made. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone, and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1, Evaluation 2” described below.
［高分子化合物の合成例４］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．５０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例４とした。
[Synthesis Example 4 of Polymer Compound]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the above methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order of 0.25 mol / L, 0.25 mol / L, and 0.50 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone, and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1, Evaluation 2” described below.
［高分子化合物の合成例５］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．３０ｍｏｌ／Ｌ、０．５０ｍｏｌ／Ｌ、０．２０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例５とした。
[Synthesis Example 5 of Polymer Compound]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order of 0.30 mol / L, 0.50 mol / L, and 0.20 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone, and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1, Evaluation 2” described below.
[高分子化合物の合成例６]
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０８ｍｏｌ／Ｌ、０．０７ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ‐ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。本合成例で使用したポリマーを以下に記載の「評価１、評価２」にて評価した結果を実施例６とした。
[Synthesis Example 6 of Polymer Compound]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in the order of 0.05 mol / L, 0.08 mol / L, and 0.07 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected. The polymer used in this synthesis example was evaluated in “Evaluation 1, Evaluation 2” described below.
［比較例１］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．５７ｍｏｌ／Ｌ、０．４０ｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応溶液を室温に戻し、そこに溶液量の１０％のヒドラジン一水和物を加え、終夜撹拌し、メチルエステル部分にヒドラジド基を導入した。反応溶液をｎ−ヘキサン、アセトン、エタノールを７０／２０／１０の体積比で混合した溶液中に滴下し、沈殿を回収した。
[Comparative Example 1]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order of 0.57 mol / L, 0.40 mol / L, and 0.03 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The reaction solution was returned to room temperature, and 10% of the solution amount of hydrazine monohydrate was added thereto and stirred overnight to introduce a hydrazide group into the methyl ester portion. The reaction solution was dropped into a solution in which n-hexane, acetone, and ethanol were mixed at a volume ratio of 70/20/10, and the precipitate was collected.
［比較例２］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、前記メチルエステル含有モノマー、メタクリル酸シクロヘキシルをそれぞれ順に０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．８０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた。反応途中から高分子化合物が析出し始め、反応終了まで溶解することはなかった。析出した高分子化合物を回収し、乾燥させたのち、０．３ｗｔ％になるようにメタノール、エタノール、イソプロパノール、メチルエチルケトンなどシクロオレフィンコポリマー基板を侵さない溶媒に分散させたが、いずれも完全に溶解させることはできず、基板への塗布はできないと判断した。
[Comparative Example 2]
2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, the methyl ester-containing monomer, and cyclohexyl methacrylate are dissolved in ethanol in order of 0.10 mol / L, 0.10 mol / L, and 0.80 mol / L, respectively, to prepare a monomer mixed solution. did. Further AIBN was added to 0.01 mol / L, and the mixture was stirred until uniform. Then, it was made to react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 6 hours. The polymer compound started to precipitate from the middle of the reaction and did not dissolve until the end of the reaction. The precipitated polymer compound was collected and dried, and then dispersed in a solvent that did not attack the cycloolefin copolymer substrate such as methanol, ethanol, isopropanol, and methyl ethyl ketone so that the concentration was 0.3 wt%. It was determined that application to the substrate was not possible.
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の数平均分子量（ポリオキシエチレン換算値）を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定により求めた。測定条件は以下の通りである。
装置：ゲルパーミエーションクロマトグラフィー装置（日本分光株式会社製、ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ）
カラム：東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬＡＬＰＨＡ−Ｍ、ＡＬＰＨＡ−２５００
検出器：液体クロマトグラム用ＲＩ検出器
測定温度：４０℃
溶媒：メタノール／水＝７／３(ｖｏｌ／ｖｏｌ)混合溶媒（１０ｍＭ臭化リチウム添加）
試料濃度：０．０５ｗｔ％
The number average molecular weight (polyoxyethylene equivalent value) of the polymer compound obtained in Synthesis Examples 1 to 6 and Comparative Example 1 of the polymer compound was determined by gel permeation chromatography (GPC) measurement. The measurement conditions are as follows.
Apparatus: Gel permeation chromatography apparatus (manufactured by JASCO Corporation, LC-2000Plus series)
Column: manufactured by Tosoh Corporation, TSK-GELPHA-M, ALPHA-2500
Detector: RI detector for liquid chromatogram Measurement temperature: 40 ° C
Solvent: methanol / water = 7/3 (vol / vol) mixed solvent (10 mM lithium bromide added)
Sample concentration: 0.05 wt%
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物を用いて、以下の条件１、２を満たすかどうか判定を行った。結果を表１、２に示す。
なお、エリプソメーターは、ファイブラボ株式会社製の「ＭＡＲＹ-１０２」を用いた。
（条件１）
（基板の膜厚測定）
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の０．３ｗｔ％エタノール溶液を調製し、スライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマー基板を浸漬、３０分間静置した。その後、エタノール／純水＝７５／２５の溶液で基板をリンスし、遠心乾燥した。得られた基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ１ｗ）をエリプソメーターで測定した。さらに３７℃の純水中に２４時間浸漬した後の基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ２ｗ）をエリプソメーターで測定し、膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）を算出した。測定は各基板３点測定した。
Using the polymer compounds obtained in Synthesis Examples 1 to 6 and Comparative Example 1 of the polymer compound, it was determined whether the following conditions 1 and 2 were satisfied. The results are shown in Tables 1 and 2.
As the ellipsometer, “MARY-102” manufactured by Fibrabo Inc. was used.
(Condition 1)
(Measurement of substrate film thickness)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound obtained in Synthesis Examples 1 to 6 and Comparative Example 1 of the polymer compound was prepared, and the cycloolefin copolymer substrate molded into a glass slide was immersed and allowed to stand for 30 minutes. . Thereafter, the substrate was rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25 and centrifuged. The film thickness (T 1w ) of the polymer adhered on the obtained substrate was measured with an ellipsometer. Furthermore, the film thickness (T 2w ) of the polymer adhering to the substrate after being immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours was measured with an ellipsometer, and the film remaining rate (T 2w / T 1w ) × 100 (%) Was calculated. The measurement was performed at three points on each substrate.
（３７℃の純水中に２４時間浸漬した基板への糖の固定化の評価）
（ｉ）糖の固定化
ラクトース（和光純薬工業製、１２４−０００９２）を０．５ｍｇ／ｍＬに調製し、３７℃の純水中に２４時間浸漬した後の基板上に５点スポットした。溶媒は１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）を用いた。その後８０℃で１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
（ｉｉ）余剰官能基のキャッピング
基板を水洗した後、１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸（和光純薬工業製、１９８−０４３５５）水溶液に浸漬し、室温にて１時間静置することで余剰官能基のキャッピングを実施した。その後、水洗を３回実施し、基板を乾燥させた。
（ｉｉｉ）ＰＡＳ法による基板上の糖鎖検出
糖を固定化後キャッピングおよび洗浄を施した基板を、１０ｍｇ／ｍＬに調整した過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）水溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて固定化糖鎖を酸化した。次にマイクロアレイを純水で洗浄後、０．１ｍｇ／ｍＬに調整した６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）の３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）溶液に浸漬し、３７℃で３０分反応させて糖鎖をビオチン化した。１０ｍＭ ＨＣｌ水溶液で２回、純水で２回洗浄後、このマイクロアレイを０．５μｇ／ｍＬに調整したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３（アマシャム バイオサイエンス、ＰＡ４３００１）の１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファ溶液に浸漬し、遮光下室温にて１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファで洗浄後、基板を蛍光スキャナーで測定を行った。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝５０）。
評価については、糖を５点スポットした場所全てで有意なシグナルが得られた場合を○、５点中３点又は４点で有意なシグナルが得られた場合を△、有意なシグナルが得られた点が５点中２点以下の場合を×とした。
(Evaluation of immobilization of sugar on a substrate immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours)
(I) Immobilization of sugar Lactose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, 124-00092) was prepared at 0.5 mg / mL and spotted on the substrate after being immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours. As the solvent, 100 mM NaOAc buffer (pH 5.0) + surfactant (0.01% Triton X-100, 0.01% PVA (degree of polymerization = 1500) was used. Thereafter, the substrate was reacted at 80 ° C. for 1 hour, and the substrate was subjected to sugar. The chain was immobilized.
(Ii) Capping of excess functional group After washing the substrate with water, the substrate was immersed in an aqueous solution of 10 mg / mL succinic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, 198-04355) and allowed to stand at room temperature for 1 hour, thereby surplus functional group. Capping was performed. Thereafter, washing with water was carried out three times to dry the substrate.
(Iii) Detection of sugar chains on a substrate by PAS method A substrate subjected to capping and washing after immobilization of sugar was immersed in an aqueous solution of sodium periodate (Wako Pure Chemical, 197-02402) adjusted to 10 mg / mL, The immobilized sugar chain was oxidized by reacting at 37 ° C. for 30 minutes. Next, the microarray was washed with pure water and then immersed in a 300 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) solution of 6- (biotinylamino) hexanoylhydrazine (manufactured by Dojindo, product code: B302) adjusted to 0.1 mg / mL. Then, the reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes to biotinylate the sugar chain. After washing twice with 10 mM HCl aqueous solution and twice with pure water, the microarray was immersed in a 1% BSA / PBS buffer solution of Streptavidin-Cy3 (Amersham Biosciences, PA43001) adjusted to 0.5 μg / mL and protected from light. It left still at room temperature for 1 hour. After washing with 0.05% Tween20 / PBS buffer, the substrate was measured with a fluorescence scanner. Measurement was performed by measuring the fluorescence intensity of Cy3 using an X-100 microarray reader (ScanArrayLite manufactured by PerkinElmer) (Laser = 90, PMT = 50).
For evaluation, a significant signal was obtained when a significant signal was obtained at all the spots where 5 sugars were spotted, and a significant signal was obtained when a significant signal was obtained at 3 or 4 points out of 5 points. The case where the score was 2 or less out of 5 was marked as x.
（条件２）
上記高分子化合物の合成例１〜６および比較例１で得られた高分子化合物の０．３ｗｔ％エタノール溶液を調製し、スライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマー基板を浸漬、３０分間静置した。その後、エタノール／純水＝７５／２５の溶液で基板をリンスし、遠心乾燥した。得られた基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ１ｅ）をエリプソメーターで測定した。さらに２５℃のエタノール中に１０分浸漬した後の基板上に付着しているポリマーによる膜の厚さ（Ｔ２ｅ）をエリプソメーターで測定し、膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）を算出した。測定は各基板３点測定した。２５℃のエタノール中に１０分浸漬した後の基板への糖の固定化確認は前述の評価１と同様に実施した。
(Condition 2)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound obtained in Synthesis Examples 1 to 6 and Comparative Example 1 of the polymer compound was prepared, and the cycloolefin copolymer substrate molded into a glass slide was immersed and allowed to stand for 30 minutes. . Thereafter, the substrate was rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25 and centrifuged. The film thickness (T 1e ) of the polymer adhering on the obtained substrate was measured with an ellipsometer. Further, the film thickness (T 2e ) of the polymer adhering to the substrate after being immersed in ethanol at 25 ° C. for 10 minutes was measured with an ellipsometer, and the film remaining rate (T 2e / T 1e ) × 100 ( %) Was calculated. The measurement was performed at three points on each substrate. The immobilization confirmation of the sugar on the substrate after being immersed in ethanol at 25 ° C. for 10 minutes was carried out in the same manner as in Evaluation 1 described above.
Claims (15)
（条件１）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｗをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を３７℃の純水中に２４時間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｗをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｗ／Ｔ１ｗ）×１００（％）が、３０％以上９５％以下である。 A polymer compound for immobilizing a physiologically active substance, which satisfies the following condition 1.
(Condition 1)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound is prepared. A substrate made of a cycloolefin copolymer formed into a glass slide is immersed in the prepared solution and left to stand for 30 minutes. Next, the substrate is taken out, rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25, and dried by centrifugation. Thereafter, the thickness T 1w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer. Further, the substrate is immersed in pure water at 37 ° C. for 24 hours and dried. Then, the film residual rate (T 2w / T 1w ) × 100 (%) when the thickness T 2w of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer is 30 % To 95%.
（条件２）
前記高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を調製する。調製された当該溶液中にスライドガラス状に成形したシクロオレフィンコポリマーからなる基板を浸漬し、３０分間静置する。次に、当該基板を取り出し、エタノール／純水＝７５／２５の溶液でリンスし、遠心乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ１ｅをエリプソメーターを用いて測定する。さらに、当該基板を２５℃のエタノール中に１０分間浸漬し、乾燥する。その後、当該基板上に付着している前記高分子化合物を含む膜の厚さＴ２ｅをエリプソメーターを用いて測定したときの膜残存率（Ｔ２ｅ／Ｔ１ｅ）×１００（％）が、２０％以上７０％以下である。 Furthermore, the high molecular compound of Claim 1 which satisfy | fills the following conditions 2.
(Condition 2)
A 0.3 wt% ethanol solution of the polymer compound is prepared. A substrate made of a cycloolefin copolymer formed into a glass slide is immersed in the prepared solution and left to stand for 30 minutes. Next, the substrate is taken out, rinsed with a solution of ethanol / pure water = 75/25, and dried by centrifugation. Thereafter, the thickness T 1e of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer. Further, the substrate is immersed in ethanol at 25 ° C. for 10 minutes and dried. Then, the film residual rate (T 2e / T 1e ) × 100 (%) when the thickness T 2e of the film containing the polymer compound adhering to the substrate is measured using an ellipsometer is 20 % To 70%.
前記被覆材料を用いて、基材の表面を被覆し、担体を形成する工程と、
前記担体に、生理活性物質を固定化する工程と、
前記生理活性物質が固定化された前記担体を純水で洗浄する工程と、
を含む、担体の使用方法。 Preparing a coating material according to claim 10;
Coating the surface of the substrate with the coating material to form a carrier;
Immobilizing a physiologically active substance on the carrier;
Washing the carrier on which the physiologically active substance is immobilized with pure water;
A method of using the carrier, comprising:
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