JP2014102194A - High polymer and carrier having surface covered with high polymer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖鎖等の固定に用いられる高分子物質、および当該高分子物質で表面が被覆された担体に関する。 The present invention relates to a polymer substance used for immobilizing sugar chains and the like, and a carrier whose surface is coated with the polymer substance.
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。 In the field of biochemistry, in recent years, sugar chain molecules have attracted attention as the third chain following nucleic acids and proteins. In particular, research on cell differentiation, canceration, immune reaction, fertilization, etc. has been conducted, and attempts to create new medicines and medical materials are continuing.
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルスおよびバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。 In addition, sugar chains are receptors for many toxins, viruses and bacteria, and are also attracting attention as cancer markers. In this field as well, new drugs and medical materials are also being created. Attempts continue.
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。 However, while the importance of research is being recognized on sugar chains, the promotion of research is significantly delayed compared to nucleic acids and proteins, which are the first and second chains, due to their complex structure and diversity.
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製するための方法が種々開発されている。また、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材の開発も行われている（特許文献１、特許文献２）。 For the purpose of promoting this research, various methods for purifying sugar chains have been developed. In addition, sugar chains are often confirmed to function as ligands to cell receptors rather than to function alone, and thus various sugar chains are immobilized for analysis of receptors for sugar chains. Development of the base material for this is also performed (patent document 1, patent document 2).
特許文献１には、三官能性スペーサーを用いて、第１に官能基を糖鎖に、第２の官能基を固相担体に、第３の官能基を発色団にそれぞれ結合させて糖鎖アレイを作製する方法が開示されている。そして、実施例においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために、ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作を行うことが記載されている。しかしながら、糖鎖固定後にブロッキング操作を行うことは煩雑である。 In Patent Document 1, a trifunctional spacer is used to bind a sugar chain by first binding a functional group to a sugar chain, a second functional group to a solid phase carrier, and a third functional group to a chromophore. A method of making an array is disclosed. In the Examples, it is described that a blocking operation using bovine serum albumin is performed in order to prevent nonspecific adsorption after sugar chain fixation. However, it is complicated to perform a blocking operation after sugar chain fixation.
一方、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が開示されており、スペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。しかしながら、この方法においては、糖鎖の基材への固定化において、固相担体にハロゲン化アセチル基の導入の必要があり、基材の材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルスおよびバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。 On the other hand, Patent Document 2 discloses a method of immobilizing a sugar chain to a base material via a spacer, and it is shown that nonspecific adsorption is suppressed by using a hydrophilic compound for the spacer. Yes. However, in this method, it is necessary to introduce a halogenated acetyl group into the solid phase carrier in immobilizing the sugar chain to the base material, and it is relatively easy when the base material is glass. Poor versatility. In addition, as described above, sugar chains are also used in research on many receptors for toxins, viruses, bacteria, and the like. Therefore, incineration is preferable for disposal, and it is disadvantageous that the material is glass.
このように糖鎖を固定化するための適切な手法および基材の開発の遅れも相俟って、検出対象物質と糖鎖との相互作用の解析に有用な糖鎖が固定化された糖鎖アレイの開発も遅れているのが現状である。 In this way, in combination with the appropriate method for immobilizing the sugar chain and the delay in the development of the base material, the sugar in which the sugar chain useful for the analysis of the interaction between the detection target substance and the sugar chain is immobilized. Currently, the development of chain arrays is also delayed.
本発明は、糖鎖もしくは糖鎖含有物質の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、タンパク質等の非特異吸着が少なく、かつ、物理的・化学的に安定している高分子物質を提供することを目的とする。また、本発明は、当該高分子物質が表面に固定化された担体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、糖鎖もしくは糖鎖含有物質を当該高分子物質を介して固定化した複合担体を提供することを目的とする。 The present invention is a polymer substance that has excellent ability to immobilize sugar chains or sugar chain-containing substances, has high adhesion to a carrier, has little non-specific adsorption of proteins, etc., and is physically and chemically stable The purpose is to provide. Another object of the present invention is to provide a carrier having the polymer substance immobilized on the surface thereof. Furthermore, an object of the present invention is to provide a composite carrier in which a sugar chain or a sugar chain-containing substance is immobilized via the polymer substance.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと糖鎖等を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質や、これらモノマーと親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質が、糖鎖等の固定化能力に優れ、担体への密着性が高く、かつ、検出対象物質の非特異的吸着が少ないことを見出した。さらに、洗浄工程において溶解しにくいなど、物理的・化学的に安定していることを見出した。このような特質から、本発明者らは、当該高分子物質で被覆された担体が、バイオチップなどに利用する場合に優れた性能を発揮しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have found that an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a sugar chain or the like. Polymeric substances obtained by copolymerizing these monomers and polymeric substances obtained by copolymerizing these monomers with ethylenically unsaturated polymerizable monomers having a hydrophilic group are excellent in the ability to immobilize sugar chains and the like. The present inventors have found that adhesion to a carrier is high and nonspecific adsorption of a detection target substance is small. Furthermore, it was found to be physically and chemically stable, such as being difficult to dissolve in the washing process. From such characteristics, the present inventors have found that the carrier coated with the polymer substance can exhibit excellent performance when used for biochips, etc., and have completed the present invention. .
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。 More specifically, the present invention provides the following.
（１）（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質。 (1) (a) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group, and (b) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that immobilizes a sugar chain or a sugar chain-containing substance. The resulting polymer material.
（２）前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［１］で表されるモノマーである、（１）に記載の高分子物質。 (2) The polymer substance according to (1), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group is a monomer represented by the following general formula [1].
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）
（３）前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメタクリル酸ｎ−ブチルである、（１）または（２）に記載の高分子物質。
(Wherein R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R2 represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.)
(3) The polymer substance according to (1) or (2), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group is n-butyl methacrylate.
（４）前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［２］で表されるモノマーである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の高分子物質。 (4) The ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing the sugar chain or the sugar chain-containing substance is a monomer represented by the following general formula [2]: (1) to (3) The polymer substance according to any one of the above.
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（５）前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基がｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、（４）に記載の高分子物質。
(Wherein R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents an alkylene group or an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, W represents a sugar chain or a functional group for immobilizing a sugar chain-containing substance. Q Represents an integer of 1 to 20. When q is an integer of 2 or more and 20 or less, the repeated Ys may be the same or different.
(5) The polymer substance according to (4), wherein the functional group for immobilizing the sugar chain or the sugar chain-containing substance is p-nitrophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester.
（６）高分子物質において、さらに、（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが共重合している、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の高分子物質。 (6) The polymer material according to any one of (1) to (5), wherein in the polymer material, (c) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is copolymerized. .
（７）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［３］で表されるモノマーである、（６）に記載の高分子物質。 (7) The polymer substance according to (6), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is a monomer represented by the following general formula [3].
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ５は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（８）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである、（７）に記載の高分子物質。
(Wherein R4 represents a hydrogen atom or a methyl group, R5 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, X represents an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, and p represents 1 to 100) (Indicates an integer. When p is an integer of 2 or more, the repeated Xs may be the same or different.)
(8) The polymer substance according to (7), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is methoxypolyethylene glycol acrylate or methoxypolyethylene glycol methacrylate.
（９）前記メトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である、（８）に記載の高分子物質。 (9) The polymer substance according to (8), wherein an average number of ethylene glycol residues in the methoxypolyethylene glycol acrylate or methoxypolyethylene glycol methacrylate is 3 to 100.
（１０） 前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［４］で表されるモノマーである、（６）に記載の高分子物質。 (10) The polymer substance according to (6), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is a monomer represented by the following general formula [4].
（式中Ｒ６は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜１００のアルキレン基を示
す。）
（１１）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルである、（１０）に記載の高分子物質。
(Wherein R6 represents a hydrogen atom or a methyl group, and Z represents an alkylene group having 1 to 100 carbon atoms.)
(11) The polymer substance according to (10), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is 2-hydroxyethyl (meth) acrylate.
（１２）（１）〜（１１）のいずれか1項に記載の高分子物質で表面が被覆された担体。 (12) A carrier whose surface is coated with the polymer substance described in any one of (1) to (11).
（１３）（１２）に記載の担体に、糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定化した担体。 (13) A carrier obtained by immobilizing a sugar chain or a sugar chain-containing substance on the carrier according to (12).
（１４）前記基板がプラスチック製である、（１２）または（１３）に記載の担体。 (14) The carrier according to (12) or (13), wherein the substrate is made of plastic.
（１５）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである、（１４）に記載の担体。 (15) The carrier according to (14), wherein the plastic is a saturated cyclic polyolefin.
本発明によれば、糖鎖等の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、タンパク質等の非特異吸着が少なく、しかも、洗浄工程において溶解しにくい高分子物質を提供できる。また、当該高分子物質で表面が被覆された担体を提供できる。さらに当該担体に糖鎖等を固定することにより、それらが特異的に結合する物質を選択的に捕捉できる複合担体を提供することができる。特に担体を基板とした場合、ＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することが ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the high molecular substance which is excellent in the ability to fix | immobilize sugar chains etc., has high adhesiveness with a support | carrier, has few nonspecific adsorption | suctions, such as protein, and is hard to melt | dissolve in a washing process can be provided. Further, a carrier whose surface is coated with the polymer substance can be provided. Furthermore, by immobilizing sugar chains or the like on the carrier, it is possible to provide a composite carrier that can selectively capture substances to which they specifically bind. In particular, when a carrier is used as a substrate, it is possible to provide a biochip substrate having a high SN ratio.
＜高分子物質＞
本発明の高分子物質は、（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られることを特徴とする。
<Polymer material>
The polymer substance of the present invention comprises (a) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group, and (b) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that immobilizes a sugar chain or a sugar chain-containing substance. It is obtained by copolymerizing
この高分子物質においては、（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニット（以下、単に「疎水性基を有するユニット」と称する）が、疎水相互作用により高分子物質を基板に固定化させる役割を果たすとともに、高分子物質が洗浄工程において溶解しにくくする役割を果たし、（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニット（以下、単に「糖鎖等を固定化する官能基を有するユニット」と称する）が、その官能基において糖鎖または糖鎖含有物質を固定化させる役割を果たす。 In this polymer substance, (a) a unit derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group (hereinafter simply referred to as a “unit having a hydrophobic group”) is polymerized by hydrophobic interaction. And (b) an ethylenically unsaturated polymerisable having a functional group that immobilizes a sugar chain or a sugar chain-containing substance. A unit derived from a monomer (hereinafter simply referred to as “unit having a functional group for immobilizing a sugar chain or the like”) plays a role of immobilizing a sugar chain or a sugar chain-containing substance in the functional group.
− 疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー −
本発明における「疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」は、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。
-Ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group-
The “ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group” in the present invention is not particularly limited in structure, but preferably has a structure in which a hydrophobic group is bonded to a (meth) acrylic group residue. Although a hydrophobic group is not specifically limited, An alkyl group and aromatics are mentioned.
疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一つの好ましい態様は、一般式［１］で表される化合物である。 One preferred embodiment of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group is a compound represented by the general formula [1].
式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示す。また、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。 In the formula, R1 represents a hydrogen atom or a methyl group. R2 represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. The structure of the alkyl group is not particularly limited, and may be linear, branched, or cyclic.
アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは３〜６であり、最も好ましくは４である。 Carbon number of an alkyl group becomes like this. Preferably it is 1-10, More preferably, it is 1-6, More preferably, it is 3-6, Most preferably, it is 4.
疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの具体例としては、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、フェノキシ（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、２−エチルフェノキシ（メタ）アクリレート、２−エチルチオフェニル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、２−フェニルエチル（メタ）アクリレート、３−フェニルプロピル（メタ）アクリレート、４−フェニルブチル（メタ）アクリレート、２−２−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−３−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−４−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−（４−プロピルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−（１−メチルエチル）フェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−メトキシフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−シクロへキシルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（２−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−ブロモフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−フェニルフェニル）エチル（メタ）アクリレートおよび２−（４−ベンジルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、メタクリル酸ｎ−ブチル等が挙げられるが、塗布の容易さと重合のしやすさのバランスの観点からメタクリル酸ｎ−ブチルが好ましい。 Specific examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group include iso-butyl (meth) acrylate, sec-butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, n-neopentyl (meth) acrylate, iso-neopentyl (meth) acrylate, sec-neopentyl (meth) acrylate, neopentyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, iso-hexyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, n-octyl (meth) Acrylate, iso-octyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-nonyl (meth) acrylate, iso-nonyl (meth) acrylate, n-decyl (meth) acrylate, iso-decyl (meth) acrylate, n-dodecyl (meth) acryl Rate, iso-dodecyl (meth) acrylate, n-tridecyl (meth) acrylate, iso-tridecyl (meth) acrylate, n-tetradecyl (meth) acrylate, iso-tetradecyl (meth) acrylate, n-pentadecyl (meth) acrylate, iso-pentadecyl (meth) acrylate, n-hexadecyl (meth) acrylate, iso-hexadecyl (meth) acrylate, n-octadecyl (meth) acrylate, iso-octadecyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, isobonyl (meth) Acrylate, phenoxy (meth) acrylate, phenoxyethyl (meth) acrylate, 2-ethylphenoxy (meth) acrylate, 2-ethylthiophenyl (meth) acrylate, phenyl (meth) acrylate , Benzyl (meth) acrylate, 2-phenylethyl (meth) acrylate, 3-phenylpropyl (meth) acrylate, 4-phenylbutyl (meth) acrylate, 2--2-methylphenylethyl (meth) acrylate, 2-3 -Methylphenylethyl (meth) acrylate, 2-4-methylphenylethyl (meth) acrylate, 2- (4-propylphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4- (1-methylethyl) phenyl) ethyl ( (Meth) acrylate, 2- (4-methoxyphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-cyclohexylphenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (2-chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- ( 3-chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4 Chlorophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (4-bromophenyl) ethyl (meth) acrylate, 2- (3-phenylphenyl) ethyl (meth) acrylate and 2- (4-benzylphenyl) ethyl (meth) acrylate, Although n-butyl methacrylate etc. are mentioned, n-butyl methacrylate is preferable from the viewpoint of the balance between ease of coating and ease of polymerization.
高分子物質に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基板に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうことを防止することができる。 By including a unit having a hydrophobic group in the polymer substance, the wettability is improved even on a hydrophobic substrate such as plastic, so that it can be applied evenly. Further, since the hydrophobicity increases, it is possible to prevent the polymer substance from being eluted during the assay.
高分子物質に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は、２０〜９９ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９５ｍｏｌ％である。組成割合が下限値を下回ると塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。一方、上限値を上回ると糖鎖等を固定化する官能基を有するユニットが減少するためにシグナルが低減したり、非特異吸着が増加するおそれが出てくる。 The composition ratio of the unit having a hydrophobic group contained in the polymer substance is preferably 20 to 99 mol%, more preferably 30 to 95 mol%, and most preferably 50 to 95 mol%. If the composition ratio is below the lower limit, unevenness may occur when applied, or the polymer substance may be eluted during the assay. On the other hand, when the value exceeds the upper limit, the number of units having a functional group for immobilizing sugar chains and the like is decreased, which may reduce the signal and increase nonspecific adsorption.
− 糖鎖等を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー −
本発明における「糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」は、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に糖鎖等を固定化する官能基が結合した構造であることが好ましい。官能基としては、特に限定されないが、アミノ基やヒドラジド基、オキシルアミノ基など糖鎖の還元末端と反応する官能基や、糖鎖または糖鎖含有物質に付随する官能基や物質と反応する官能基が好ましい。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、マレイミド基、アジド基、スルホネート基、受容体基、ビオチンなどが挙げられる。
-Ethylenically unsaturated polymerizable monomers having functional groups that immobilize sugar chains, etc.-
The “ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a sugar chain or a sugar chain-containing substance” in the present invention is not particularly limited in structure, but a sugar chain or the like is immobilized on a (meth) acrylic group residue. It is preferable that the functional group is bonded to the structure. The functional group is not particularly limited, but a functional group that reacts with a reducing end of a sugar chain, such as an amino group, a hydrazide group, or an oxylamino group, or a functional group or substance that reacts with a sugar chain or a sugar chain-containing substance. Groups are preferred. Specific examples include aldehyde groups, active ester groups, epoxy groups, amino groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, hydroxyl groups, maleimide groups, azide groups, sulfonate groups, acceptor groups, biotin, and the like.
これらの中でも糖鎖の多くが還元末端を有することから、アミノ基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基が好ましい。また、アミノ基を有する糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定化する場合は、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基が好ましく、アミノ基との反応性と保存安定性のバランスから活性エステル基が最も好ましい。 Of these, amino groups, hydrazide groups, and oxylamino groups are preferred because many of the sugar chains have a reducing end. Further, when immobilizing a sugar chain having an amino group or a sugar chain-containing substance, an aldehyde group, an active ester group, and an epoxy group are preferable, and the active ester group is the most in view of the balance between reactivity with amino groups and storage stability. preferable.
なお、１級アミンなどラジカル重合の阻害剤として働く官能基やイソシアネートなど加熱により反応が進行しやすい官能基については、予め保護基で保護するのが好ましい。保護基の種類は、その官能基が保護されれば特に制限はない。アミノ基、オキシルアミノ基、ヒドラジド基などの１級アミンを有する官能基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）が用いられる。中でも、脱保護のしやすさからｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）が好ましい。また、イソシアネートはピラゾールやピラゾール誘導体で保護することができる。 In addition, it is preferable to protect beforehand the functional group which acts as an inhibitor of radical polymerization, such as a primary amine, or the functional group where the reaction easily proceeds by heating, such as isocyanate. The kind of the protecting group is not particularly limited as long as the functional group is protected. A tert-butoxycarbonyl group (BOC group) or a benzyloxycarbonyl group (Z group) is used as a functional group having a primary amine such as an amino group, an oxylamino group, or a hydrazide group. Among them, a tert-butoxycarbonyl group (BOC group) is preferable because of easy deprotection. In addition, isocyanates can be protected with pyrazole or pyrazole derivatives.
脱保護条件は保護基に応じて適宜選択してよい。例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）の脱保護は、トリフルオロ酢酸、塩酸、塩酸−ジオキサン溶液、塩酸−酢酸エチル溶液など強酸を作用させるとよい。脱保護のタイミングは任意であるが、より活性の高い状態で糖鎖または糖鎖含有物質と反応させる方が有利であることから、それらとの反応の直前に行うのが好ましい。 Deprotection conditions may be appropriately selected depending on the protecting group. For example, deprotection of a tert-butoxycarbonyl group (BOC group) may be performed by applying a strong acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, hydrochloric acid-dioxane solution, hydrochloric acid-ethyl acetate solution, or the like. Although the timing of deprotection is arbitrary, since it is advantageous to react with a sugar chain or a sugar chain-containing substance in a more active state, it is preferably performed immediately before the reaction with them.
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。 The “active ester group” used in the present invention is an ester group having a highly acidic electron-withdrawing group in one of the substituents of the ester group and activated for nucleophilic reaction, ie, the reaction activity. As meaning a high ester group, it is commonly used in the fields of various chemical syntheses such as polymer chemistry and peptide synthesis. In fact, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, and the like are known as active ester groups having much higher activity than alkyl esters and the like.
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。 Examples of such active ester groups include p-nitrophenyl active ester groups, N-hydroxysuccinimide active ester groups, succinimide active ester groups, phthalimide active ester groups, 5-norbornene-2, and 3-dicarboxyl. Although an imide active ester group etc. are mentioned, a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is most preferable.
本発明に使用する、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキレン基を介して結合した化合物であることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a sugar chain or a sugar chain-containing substance used in the present invention is not particularly limited in structure, but is represented by the following general formula [2] (meta ) A compound in which an acrylic group and a functional group that immobilizes a sugar chain or a sugar chain-containing substance are bonded via a chain of an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms or an alkylene group is preferable.
式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基を示す。また、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、好ましくは２〜１８の整数であり、より好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは３〜１４の整数である。繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 In the formula, R3 represents a hydrogen atom or a methyl group. Moreover, carbon number of the alkylene glycol residue Y is 1-10, Preferably it is 1-6, More preferably, it is 2-4, More preferably, it is 2-3, Most preferably. The repeating number q of the alkylene glycol residue Y is an integer of 1 to 20, preferably an integer of 2 to 18, more preferably an integer of 3 to 16, and most preferably an integer of 3 to 14. When the number of repetitions is 2 or more and 20 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue to be repeated may be the same or different.
高分子物質に含まれる糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの組成割合は、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値を下回るとシグナルが低減するおそれがでてくる。一方、当該モノマーが上限値を上回る組成割合の高分子物質においては、糖鎖をより高密度に固定化しうるが、糖鎖と比較して巨大な分子（例えば、レクチン）を検出対象物質とする場合には、高分子物質において検出対象物質との結合に関与しない糖鎖が増加してしまう。従って、当該モノマーの組成割合を高めても、シグナルの増加に結びつかないおそれが出てくる。また、上限値を上回ると、相対的に疎水性基を有するユニットが減少するため、塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。 The composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that immobilizes the sugar chain or the sugar chain-containing substance contained in the polymer substance is preferably 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 30 mol%, and most preferably Is 1 to 20 mol%. If the composition ratio falls below the lower limit, the signal may be reduced. On the other hand, in a polymer substance having a composition ratio in which the monomer exceeds the upper limit, sugar chains can be immobilized at a higher density, but a huge molecule (for example, lectin) is used as a detection target substance compared to sugar chains. In some cases, sugar chains that do not participate in binding to the detection target substance in the polymer substance increase. Therefore, even if the composition ratio of the monomer is increased, the signal may not increase. On the other hand, if the upper limit is exceeded, the number of units having a relatively hydrophobic group decreases, which may cause unevenness when applied or the polymer substance may be eluted during the assay.
− 親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー −
本発明の高分子物質においては、さらに（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが共重合していてもよい。この場合、（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、検出対象物質が高分子物質に非特異的に吸着することを抑制する役割を果たす。
− Ethylenically unsaturated polymerizable monomer having hydrophilic group −
In the polymer substance of the present invention, (c) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group may be copolymerized. In this case, (c) the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group plays a role of suppressing the non-specific adsorption of the detection target substance to the polymer substance.
本発明における「親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」としては、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に親水性基が結合した構造であることが好ましい。 The “ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group” in the present invention is not particularly limited in structure, but a structure in which a hydrophilic group is bonded to a (meth) acrylic group residue is preferable.
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一つの好ましい態様は、一般式［３］で表される化合物である。 One preferred embodiment of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is a compound represented by the general formula [3].
式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ５は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。また、アルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、好ましくは２〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 In the formula, R4 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R5 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. Moreover, carbon number of alkylene glycol residue X is 1-10, Preferably it is 1-6, More preferably, it is 2-4, More preferably, it is 2-3, Most preferably. The repeating number p of the alkylene glycol residue X is an integer of 1 to 100, preferably an integer of 2 to 100, more preferably an integer of 2 to 95, and most preferably an integer of 4 to 90. When the number of repeats is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue X to be repeated may be the same or different.
具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。 Specific examples include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, methoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, and the like. However, methoxypolyethylene glycol methacrylate is preferable from the viewpoint of availability.
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの他の好ましい態様は、一般式［４］で表される化合物である。 Another preferred embodiment of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is a compound represented by the general formula [4].
式中Ｒ６は水素原子またはメチル基を示す。また、Ｚは炭素数１〜１００のアルキレン基を示す。アルキレン基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは２〜４であり、最も好ましくは２である。 In the formula, R6 represents a hydrogen atom or a methyl group. Z represents an alkylene group having 1 to 100 carbon atoms. Carbon number of an alkylene group becomes like this. Preferably it is 1-10, More preferably, it is 1-6, More preferably, it is 2-4, Most preferably, it is 2.
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸３−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸４−ヒドロキシブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等が挙げられるが、非特異吸着抑制の観点から（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルが好ましい。 Specific examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group include 3-hydroxypropyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, and the like. However, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate is preferable from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption.
高分子物質に含まれる親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの組成割合は、０〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜４０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜３０ｍｏｌ％である。組成割合が上限値を上回ると相対的に糖鎖等を固定化する官能基を有するユニットが減少するためにシグナルが低減したり、相対的に疎水性基を有するユニットが減少するため、塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。 The composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group contained in the polymer substance is preferably 0 to 50 mol%, more preferably 0 to 40 mol%, and most preferably 0 to 30 mol%. When the composition ratio exceeds the upper limit, the number of units having functional groups that immobilize sugar chains and the like is relatively reduced, so that the signal is reduced or the number of units having relatively hydrophobic groups is reduced. In some cases, unevenness may occur or the polymer substance may be eluted during the assay.
本発明の高分子物質の化学構造は、上記のモノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。 The chemical structure of the polymer substance of the present invention may be in any form such as random, block or graft as long as the above monomers are copolymerized.
（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質の特に好ましい態様は、下記の化学構造を有する高分子物質である。 Highly obtained by copolymerizing (a) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group, and (b) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a sugar chain or a sugar chain-containing substance. A particularly preferable embodiment of the molecular substance is a polymer substance having the following chemical structure.
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数ｑおよび各ユニットの組成割合であるｘとｙは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが８０〜９５ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５〜２０ｍｏｌ％である。 Here, the repeating number q of the alkylene glycol residue and x and y which are the composition ratio of each unit are as described above, but preferably q is 3 to 14 units on average and the composition ratio x is 80 to 95 mol. %, And the composition ratio y is 5 to 20 mol%.
（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質の特に好ましい態様は、下記の化学構造を有する２つの高分子物質である。 (A) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group, (b) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that immobilizes a sugar chain or a sugar chain-containing substance, and (c) a hydrophilic group. A particularly preferable embodiment of the polymer material obtained by copolymerizing the ethylenically unsaturated polymerizable monomer is two polymer materials having the following chemical structures.
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数であるｐおよびｑ、ならびに各ユニットの組成割合であるｘ、ｙおよびｚは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが１０〜３０ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５〜２０ｍｏｌ％であり、組成割合ｚが５０〜８５ｍｏｌ％である。 Here, p and q, which are the repeating number of alkylene glycol residues, and x, y, and z, which are the composition ratio of each unit, are as described above, and preferably q is an average of 3 to 14 units, The composition ratio x is 10 to 30 mol%, the composition ratio y is 5 to 20 mol%, and the composition ratio z is 50 to 85 mol%.
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数であるｑ、ならびに各ユニットの組成割合であるｘ、ｙおよびｚは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが１０〜３０ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５０〜８５ｍｏｌ％であり、組成割合ｚが５〜２０ｍｏｌ％である。 Here, q, which is the number of repeating alkylene glycol residues, and x, y, and z, which are the composition ratios of each unit, are as described above, but preferably q is an average of 3 to 14 units, and the composition ratio x is 10 to 30 mol%, the composition ratio y is 50 to 85 mol%, and the composition ratio z is 5 to 20 mol%.
本発明の高分子物質の分子量は、高分子物質と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。 The molecular weight of the polymer substance of the present invention is preferably 5,000 or more and more preferably 10,000 or more because the polymer substance and the unreacted ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be easily separated and purified.
＜高分子物質の合成法＞
本発明の高分子物質の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。ラジカル重合させるための混合物には、さらに（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含むことができる。
<Synthesis of polymer materials>
The method for synthesizing the polymer substance of the present invention is not particularly limited. From the viewpoint of ease of synthesis, at least (a) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophobic group, and (b) a sugar chain or It is preferable to radically polymerize a mixture containing an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a sugar chain-containing substance in a solvent in the presence of a polymerization initiator. The mixture for radical polymerization can further contain (c) an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group.
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルエチルケトン、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子物質を塗布する場合は、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒が基材を変性させないため好ましい。 Any solvent may be used as long as each ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be dissolved. Examples thereof include methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, methyl ethyl ketone, and acetone. be able to. These solvents are used alone or in combination of two or more. When the polymer substance is applied to a plastic substrate, ethanol, methanol, 2-butanone, and a mixed solvent thereof are preferable because they do not denature the substrate.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。 The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, such as 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), and the like. Examples thereof include organic peroxides such as azo compounds, benzoyl peroxide, and lauryl peroxide.
＜高分子物質による担体表面の被覆＞
本発明の高分子物質で担体表面を被覆することにより、特定の糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。高分子物質が親水性基を有するユニットを含む場合には、該担体にタンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を付与することが可能である。
<Coating of carrier surface with polymer substance>
By coating the carrier surface with the polymer substance of the present invention, it is possible to easily impart the property of immobilizing a specific sugar chain or sugar chain-containing substance. When the polymer substance includes a unit having a hydrophilic group, it is possible to impart a property of suppressing nonspecific adsorption of protein or the like to the carrier.
担体表面への高分子物質の被覆は、例えば有機溶媒に高分子物質を０．０５〜１０重量％ 濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で担体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。 For coating the surface of the polymer material, for example, a polymer solution in which the polymer material is dissolved in an organic solvent so as to have a concentration of 0.05 to 10% by weight is prepared, and then a known method such as dipping or spraying is used. After coating on the surface of the carrier, drying is performed at room temperature or under heating.
有機溶媒としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶媒が使用される。中でも、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒がプラスチック担体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。 As the organic solvent, a single solvent such as ethanol, methanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, or a mixed solvent thereof is used. Among these, ethanol, methanol, 2-butanone, and a mixed solvent thereof are preferable because they do not denature the plastic carrier and can be easily dried.
＜高分子物質で表面が被覆された担体＞
本発明に使用する担体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
<Carrier whose surface is coated with a polymer substance>
Glass, plastic, metal or the like can be used as the material for the carrier used in the present invention. From the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity, plastic is preferable, and thermoplastic resin is more preferable.
担体の形状は特に制限を受けるものではないが、バイオチップとして用いる場合、例えばスライドガラス形状の基板や、マルチウェルプレート等が好適に用いられる。 The shape of the carrier is not particularly limited, but when used as a biochip, for example, a glass substrate or a multiwell plate is preferably used.
担体をバイオチップとして用いる場合、熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。 When the carrier is used as a biochip, the thermoplastic resin preferably has a small amount of fluorescence generation. For example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, etc. are preferably used. It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in chemical resistance, low fluorescence, and moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.
担体表面と被覆される高分子物質との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。 In order to enhance the adhesion between the carrier surface and the polymer substance to be coated, it is preferable to activate the substrate surface. As a means for activation, there are a plasma treatment method under conditions such as an oxygen atmosphere, an argon atmosphere, a nitrogen atmosphere, and an air atmosphere, and a treatment method using an excimer laser such as ArF or KrF. A plasma treatment method is preferred.
本発明の担体を使用して各種の糖鎖または糖鎖含有物質を固定化することができる。固定化する糖鎖または糖鎖含有物質は、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などがある。担体表面に被覆した高分子物質における糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が、糖の還元末端と反応する官能基である場合は、還元末端を有する糖をｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できる。 Various sugar chains or sugar chain-containing substances can be immobilized using the carrier of the present invention. The sugar chain or sugar chain-containing substance to be immobilized is a monosaccharide, a sugar chain of two or more sugars, a sugar amino acid, a glycopeptide, a glycoprotein, a glycolipid, a glycosaminoglycan, a glycosylphosphatidylinositol, a peptidoglycan, a lipopolysaccharide, and the like There are derivatives of When the functional group that immobilizes the sugar chain or the sugar chain-containing substance in the polymer material coated on the surface of the carrier is a functional group that reacts with the reducing end of the sugar, the sugar having the reducing end is adjusted to pH 4.0 to 6. It can be fixed by dissolving in 0 buffer solution and allowing the solution to stand on a carrier at room temperature to 100 ° C. for 10 minutes to 24 hours.
一方、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が、活性エステル基などアミノ基と反応する基である場合は、糖鎖または糖鎖含有物質にアミノ基が必要である。アミノ基を有する糖鎖や糖アミノ酸、糖ペプチドまたは糖タンパク質をｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できるが、アミノ基を持たない糖鎖の場合はそれを導入する必要がある。この場合、アミノ基は還元末端側に導入されていることが好ましい。 On the other hand, when the functional group that immobilizes the sugar chain or the sugar chain-containing substance is a group that reacts with an amino group such as an active ester group, an amino group is required for the sugar chain or the sugar chain-containing substance. An amino group-containing sugar chain, sugar amino acid, glycopeptide or glycoprotein is dissolved in a buffer solution having a pH of 7.0 to 10.0, and the solution is allowed to stand on a carrier at room temperature to 100 ° C. for 10 minutes to 24 hours. However, in the case of a sugar chain having no amino group, it is necessary to introduce it. In this case, the amino group is preferably introduced on the reducing end side.
＜糖鎖等が固定化された担体＞
こうして得られた糖鎖または糖鎖含有物質を固定化した担体は、十分な量の糖鎖または糖鎖含有物質が化学結合で強固に固定化され、さらにタンパク質等の非特異吸着が少ないことから、該糖鎖または糖鎖含有物質と特異的に結合する物質を選択的に捕捉することができる。特に、担体が基板である場合、バイオチップとして好適に用いることができる。
<Carrier with immobilized sugar chains and the like>
The carrier obtained by immobilizing the sugar chain or the sugar chain-containing substance thus obtained has a sufficient amount of sugar chain or sugar chain-containing substance firmly immobilized by chemical bonding, and further has less non-specific adsorption of proteins and the like. The substance that specifically binds to the sugar chain or the sugar chain-containing substance can be selectively captured. In particular, when the carrier is a substrate, it can be suitably used as a biochip.
本発明において糖鎖または糖鎖含有物質をバイオチップ用基板上に固定化する際には、糖鎖または糖鎖含有物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。点着後、静置すると、糖鎖または糖鎖含有物質が基板上の官能基と化学的に結合し、糖鎖または糖鎖含有物質が表面に固定化される。例えばアミノ基を有する糖鎖を用いた場合は、前に示した方法を適用できる。 In the present invention, when the sugar chain or the sugar chain-containing substance is immobilized on the biochip substrate, a method of spotting a liquid in which the sugar chain or the sugar chain-containing substance is dissolved or dispersed is preferable. After standing, the sugar chain or sugar chain-containing substance is chemically bonded to the functional group on the substrate, and the sugar chain or sugar chain-containing substance is immobilized on the surface. For example, when a sugar chain having an amino group is used, the above-described method can be applied.
糖鎖または糖鎖含有物質をバイオチップ用基板上に固定化した後は、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化した部分以外の基板表面の官能基を不活性化処理するのが好ましい。基板の官能基が活性エステル基やアルデヒド基などの場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。 After the sugar chain or sugar chain-containing substance is immobilized on the biochip substrate, it is preferable to inactivate functional groups on the substrate surface other than the part where the sugar chain or sugar chain-containing substance is immobilized. When the functional group of the substrate is an active ester group or an aldehyde group, it is preferable to use an alkali compound or a compound having a primary amino group.
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。 As the alkali compound, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, potassium phosphate, etc. are preferably used. Can do.
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどが好ましく、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。 Examples of the compound having a primary amino group include methylamine, ethylamine, butylamine, glycine, 9-aminoacazine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4 -Pentanol, aminoethanethiol hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6-aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2 -Aminooctane, 2-aminooctanoic acid, 1 Amino 2-propanol, 3-amino-1-propanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide , P-aminopropiophenone, aminophenylacetic acid, aminonaphthalene and the like are preferable, and aminoethanol and glycine are most preferable.
また、前記不活性化処理工程では、基板の官能基と結合しなかった糖鎖または糖鎖含有物質も同時に洗浄・除去することができることが多い。除去できない場合は、不活性化処理前に基板を洗浄することで除去することが好ましい。例えば基板を超純水、界面活性剤含有緩衝液等で１〜５分間浸漬し洗浄することで、除去できる。 Further, in the inactivation treatment step, it is often possible to simultaneously wash and remove sugar chains or sugar chain-containing substances that have not been bonded to the functional group of the substrate. If it cannot be removed, it is preferable to remove the substrate by washing it before the inactivation treatment. For example, it can be removed by immersing the substrate in ultrapure water, a surfactant-containing buffer solution or the like for 1 to 5 minutes and washing it.
このように糖鎖または糖鎖含有物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。 The biochip obtained by immobilizing sugar chains or sugar chain-containing substances in this way can be used in many analysis systems including immunodiagnostic systems, sugar chain microarray systems, and microfluidic devices.
[ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成]
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００（ｎ＝４）、日本油脂（株）製）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬（株）製）およびクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、さらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が平均４．５単位含まれていることを確認した。
[Synthesis of p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP)]
0.01 mol of polyethylene glycol monomethacrylate (Blenmer PE-200 (n = 4), manufactured by NOF Corporation) was dissolved in 20 mL of chloroform and then cooled to −30 ° C. While maintaining at −30 ° C., 0.01 mol of p-nitrophenyl chloroformate (manufactured by Aldrich), 0.01 mol of triethylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 20 mL of chloroform were added to this solution. The homogeneous solution was slowly added dropwise. After reacting at −30 ° C. for 1 hour, the solution was further stirred for 2 hours. Thereafter, salts were removed from the reaction solution by filtration, and the solvent was distilled off to obtain p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP). The obtained monomer was measured by 1H-NMR in deuterated chloroform solvent, and it was confirmed that an average of 4.5 units of ethylene glycol residue was contained.
[高分子物質の合成例１]
メタクリル酸ｎ―ブチル（以下、「ＢＭＡ」と記載する。関東化学株式会社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載する）を２−ブタノンに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は１．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０である。そこにさらに０．０２４ｍｏｌ／Ｌになるように２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載する。和光純薬工業株式会社製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
[Synthesis Example 1 of Polymeric Substance]
N-Butyl methacrylate (hereinafter referred to as “BMA”; manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), p-nitrophenyloxycarbonyl-4.5 polyethylene glycol methacrylate (hereinafter referred to as “MEONP”) as 2-butanone It was dissolved to prepare a monomer mixed solution. The total monomer concentration is 1.2 mol / L, and the respective molar ratios are 90:10 in the order of BMA and MEONP. Further, 2,2-azobisisobutyronitrile (hereinafter referred to as “AIBN”, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 0.024 mol / L and stirred until uniform. . Then, after making it react at 60 degreeC by argon gas atmosphere for 4 hours, the reaction solution was dripped in ethanol and precipitation was collected. The obtained polymer substance was measured by 1H-NMR in deuterated chloroform solvent, and the composition ratio of this polymer substance was calculated. Table 1 shows the results.
[高分子物質の合成例２]
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下、「ＰＥＧＭＡ」と記載する。数平均分子量Ｍｎ＝約４７０、新中村化学株式会社製）、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰを２−ブタノンに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．８５ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２２：６８：１０である。そこにさらに０．０１７ｍｏｌ／ＬになるようにＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をヘキサンとアセトンの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
[Synthesis example 2 of polymer substance]
Polyethylene glycol methyl ether methacrylate (also known as methoxy polyethylene glycol methacrylate, hereinafter referred to as “PEGMA”. Number average molecular weight Mn = about 470, manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.), BMA, and MEONP are dissolved in 2-butanone and mixed with monomers. A solution was made. The total monomer concentration is 0.85 mol / L, and the respective molar ratios are 22:68:10 in the order of PEGMA, BMA, and MEONP. AIBN was further added so that it might become 0.017 mol / L, and it stirred until it became uniform. Then, after making it react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 4 hours, the reaction solution was dripped in the mixed solvent of hexane and acetone, and precipitation was collected. The obtained polymer substance was measured by 1H-NMR in a heavy ethanol solvent, and the composition ratio of the polymer substance was calculated. Table 1 shows the results.
[高分子物質の合成例３]
アクリル酸ヒドロキシエチル（以下、「ＨＥＡ」と記載する。和光純薬工業株式会社製）、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰを２−ブタノンとエタノールとの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は１．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２２：６８：１０である。そこにさらに０．０２４ｍｏｌ／ＬになるようにＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をヘキサンとアセトンの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
[Synthesis example 3 of polymer substance]
Hydroxyethyl acrylate (hereinafter referred to as “HEA”; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), BMA and MEONP were dissolved in a mixed solvent of 2-butanone and ethanol to prepare a monomer mixed solution. The total monomer concentration is 1.2 mol / L, and the respective molar ratios are 22:68:10 in the order of PEGMA, BMA, and MEONP. AIBN was further added so that it might become 0.024 mol / L, and it stirred until it became uniform. Then, after making it react at 60 degreeC under argon gas atmosphere for 4 hours, the reaction solution was dripped in the mixed solvent of hexane and acetone, and precipitation was collected. The obtained polymer substance was measured by 1H-NMR in a heavy ethanol solvent, and the composition ratio of the polymer substance was calculated. Table 1 shows the results.
[固定化基板の作製]
マイクロアレイの作製には、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板（住友ベークライト株式会社製）を使用した。そして、このプラスチックス基板を、高分子物質の合成例にて得られた高分子物質の１．０重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面に高分子物質を含む層を導入した。
[Fabrication of immobilized substrate]
For the production of the microarray, a glass substrate made of cyclic polyolefin resin in the form of a glass slide (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was used. Then, this plastics substrate was immersed in a 1.0 wt% ethanol solution of the polymer material obtained in the polymer material synthesis example, thereby introducing a layer containing the polymer material on the substrate surface.
[糖鎖の固定化]
２種類の糖鎖（ＥＬＩＣＩＴＹＬ社、ＧＭ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ（品番：ＧＬＹ０９０ＡＰ、以下、「ＧＭ３」と記載する）、Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ Ａ ｔｒｉａｓｏｓｅ−ａｍｉｎｏｐｒｏｒｙｌ（品番：ＧＬＹ０３４ＡＰ、以下、「Ａ」と記載する））を溶液１で５０μＭに調製し、基板上にスポットした後に室温で１時間静置して基板に糖鎖を固定化した。
＜溶液１＞３００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）＋０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０
[活性エステルの不活性化処理]
基板を溶液２に１時間浸漬した後に純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
＜溶液２＞１００ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０，２５ｍＭ Ｅｔｈａｎｏｌｅａｍｉｎｅ
[Immobilization of sugar chains]
Two types of sugar chains (ELICITYL, GM3-aminopropyl (product number: GLY090AP, hereinafter referred to as “GM3”), Blood group A trioseose-aminoproyl (product number: GLY034AP, hereinafter referred to as “A”)) 1 to 50 μM, spotted on the substrate, and allowed to stand at room temperature for 1 hour to immobilize sugar chains on the substrate.
<Solution 1> 300 mM phosphate buffer (pH 8.5) + 0.005% Tween 20
[Deactivation treatment of active ester]
The substrate was immersed in the solution 2 for 1 hour, washed with pure water, and dried.
<Solution 2> 100 mM borate buffer (pH 8.5) + 0.01% Tween 20, 25 mM Ethanolamine
[レクチンの検出]
フコースと特異的に結合するレクチンであるＡＡＬレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン(Ｊ−オイルミルズ社、Ｊ２０１)を、下記溶液で１０ｕｇ／ｍＬに調製した。
[Detection of lectins]
Biotin-labeled AAL lectin (J-Oil Mills, J201), which is a biotin-labeled AAL lectin that specifically binds to fucose, was prepared at 10 ug / mL with the following solution.
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
基板上に溶液を展開し、室温で２時間反応した。
Solution: 50 mM Tris.HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , MnCl 2 , MgCl 2 , 0.05% Tween 20
The solution was developed on the substrate and reacted at room temperature for 2 hours.
反応後、下記溶液で洗浄後にさらに純水で洗浄し、基板を乾燥させた。 After the reaction, the substrate was washed with the following solution and further washed with pure water to dry the substrate.
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア社、ＰＡ４３００１）を下記溶液で０．５μｇ／ｍＬに調製し、室温で１時間、基板上で反応させた。
Solution: 50 mM Tris.HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , MnCl 2 , MgCl 2
Cy3-Streptavidin (GE Healthcare, PA43001) was prepared to 0.5 μg / mL with the following solution and allowed to react on the substrate at room temperature for 1 hour.
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、下記溶液で洗浄後にさらに純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
Solution: 50 mM Tris.HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , MnCl 2 , MgCl 2 , 0.05% Tween 20
After the reaction, the substrate was washed with the following solution and further washed with pure water to dry the substrate.
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２
測定はマイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝５０）
表２に結果を示した。フコースを含む糖鎖“Ａ”を特異的に検出できた。
Solution: 50 mM Tris.HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , MnCl 2 , MgCl 2
The measurement was performed by measuring the fluorescence intensity of Cy3 using a microarray reader, ScanArrayLite (manufactured by PerkinElmer). (Laser = 90, PMT = 50)
Table 2 shows the results. The sugar chain “A” containing fucose was specifically detected.
本発明により、高機能な糖鎖固定用の高分子物質および当該高分子物質で被覆された担体を製造することが可能になった。さらに該糖鎖固定用担体に糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定した複合担体を用いることによりバイオチップを簡便に製造することが可能になった。こうして製造されたバイオチップは、免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。 According to the present invention, it has become possible to produce a high-performance polymer substance for immobilizing sugar chains and a carrier coated with the polymer substance. Furthermore, a biochip can be easily produced by using a composite carrier in which a sugar chain or a sugar chain-containing substance is fixed to the sugar chain fixing carrier. The biochip thus produced can be used in many analysis systems including immunodiagnostic systems, sugar chain microarray systems, and microfluidic devices.
Claims (15)
す。） The polymer substance according to claim 6, wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a hydrophilic group is a monomer represented by the following general formula [4].
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