JP2018027095A - 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 - Google Patents
多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018027095A JP2018027095A JP2017206725A JP2017206725A JP2018027095A JP 2018027095 A JP2018027095 A JP 2018027095A JP 2017206725 A JP2017206725 A JP 2017206725A JP 2017206725 A JP2017206725 A JP 2017206725A JP 2018027095 A JP2018027095 A JP 2018027095A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human
- hemangioblasts
- pluripotent stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1394—Bone marrow stromal cells; whole marrow
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/78—Cellulose
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明の実施形態は、概して、ヒト多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させるための方法に関する。本発明の赤血球細胞には、生体外および生体内における様々な用途がある。本発明の赤血球は、様々な治療用途において有用となる。さらに、本発明により得られる増幅された数の赤血球は、造血障害の処置における新規な治療方針、または血液バンクにおいて利用することができる。
本発明は、巨核球または血小板を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、当該多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることと、TPOを含む巨核球(MK)培養培地中で培養することにより、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることと、を含む、方法も提供する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒト血管コロニー形成細胞を生成および増幅するための方法、ヒト血管コロニー形成細胞を含む製剤および組成、血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した様々な細胞型を産生する方法、血管コロニー形成細胞を治療的に使用する方法、および血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した種々の細胞型を治療的に使用する方法を提供する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞、またはヒト胚盤胞または割球に由来するヒト血管芽細胞を生成および増幅するための方法を提供する。そのように産生した血管芽細胞は、精製および/または単離することができる。
本発明のある態様は、血管芽細胞の生体外での増幅に関する。ある実施形態では、本発明の方法によって増幅される血管芽細胞は、上述のようにヒト胚幹細胞に由来する初期胚様体から得られる。
本発明のヒト血管芽細胞を生成および増幅する方法の開始点として使用されるヒト胚幹細胞は、ヒト胚幹細胞のライブラリに由来してもよく、それぞれヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子の半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞の当該ライブラリの各メンバーは、ライブラリの残りのメンバーに関して異なるMHC対立遺伝子の群に対し半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞のライブラリは、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である。本発明の文脈では、1つ以上の組織適合性抗原遺伝子に対しホモ接合である幹細胞は、1つ以上(および一部の実施形態では、すべての)そのような遺伝子に対しヌル欠損である細胞を含む。遺伝子座に対するヌル欠損とは、遺伝子が当該座においてヌルであることを意味し、すなわち、当該遺伝子の両対立遺伝子が削除されるか、または不活性化されることを意味する。すべてのMHC遺伝子に対してヌル欠損である幹細胞は、当該技術分野において知られる標準方法、例えば、遺伝子標的および/またはヘテロ接合性の消失(LOH)によって産生され得る。例えば、米国特許公開第US20040091936号、第US20030217374号、および第US20030232430号、および米国仮出願第60/729,173を参照し、それらすべての開示は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる。
ある態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。これらの細胞は、様々な治療使途および他の使途を有する固有の原始細胞型である。さらに、本細胞型は、少なくとも造血および/または内皮系統の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む様々な製剤(医薬製剤を含む)および組成、ならびに血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した1つ以上の細胞型を含む製剤(医薬製剤を含む)および組成を企図する。
本発明のある実施形態では、哺乳類(ヒトを含む)血管芽細胞を増幅して商業量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用される。特定の実施形態では、血管芽細胞を増幅して、約10,000〜4,000,000個(またはそれ以上)台の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製の開始から3〜4日以内に到達され得る。したがって、本発明は、多数の血管芽細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、または4,000,000個の細胞を含む。
上述のように、血管コロニー形成細胞は、成熟内皮または造血細胞のある特性が欠如している。しかしながら、これらの血管コロニー形成細胞または血管芽細胞は、様々なマーカー、例えば、CD71+、GATA−1およびGATA−2タンパク質、CXCR−4、ならびにTPOおよびEPO受容体によって識別され得る。追加の実施形態では、血管芽細胞はLMO−2を発現する。血管芽細胞は、他のマーカーの発現の非存在または低発現によって追加として特徴付けられ得る。したがって、血管芽細胞は、CD34−、CD31−、およびKDR−であり得る。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、CD34−、CD31−、KDR−、およびCD133−であり得る。
本発明の方法および細胞製剤は、血管芽派生細胞にも関する。本発明によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、および本発明の方法によって増幅した哺乳類血管芽細胞は、造血細胞(造血幹細胞(HSC))または内皮細胞、ならびにこれら2つの系統においてさらに分化される細胞を得るように、生体外で分化されてもよい。これらの細胞は、以下に記載される治療用途および商業用途において、後に使用することができる。
本発明は、以前に識別された血管芽細胞および血管コロニー形成細胞の一部の特性を共有する、新規の細胞集団を提供する。しかしながら、本明細書に説明する新規細胞集団は、免疫不全動物に投与する際に、骨髄に生着しないという点において明らかに異なる。この新規前駆細胞集団は、基本発生生物学および幹細胞生物学の研究に有用であり、分化細胞型を生体外および生体内で部分的および完全に生成するのに有用であり、治療法の開発に有用である。さらに、これらの細胞をスクリーニングアッセイに使用して、例えば、(i)非生着血管細胞の増幅を促進する因子または条件、および(ii)非生着血管細胞からの1つ以上の分化細胞型の生成を促進する因子または条件を識別することができる。識別した因子および条件は、細胞ベースおよび無細胞治療物質の産生、培地および製剤の産生、および発生生物学および幹細胞生物学の研究において使用することができる。
本発明は、非生着血管細胞、非生着血管細胞を含む組成および製剤、非生着血管細胞を産生および増幅する方法、非生着血管細胞から分化細胞型を産生する方法、および非生着血管細胞またはそこから派生する細胞を治療的に使用する方法を提供する。
ある態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を提供する。これらの細胞は、多様な治療上の使用および他の使用を有する、特有の原子細胞型である。さらに、この細胞型は、少なくとも造血系の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む様々な製剤(医薬製剤を含む)および組成物、ならびに非生着血管細胞から部分的または完全に分化した1つ以上の細胞型を含む製剤(医薬製剤を含む)および組成物を企図する。いずれの特定の理論にも束縛されることなく、これらの細胞は、多数の造血細胞型を生成する能力を維持する、明確に異なる(血管コロニー形成細胞よりも)若干より特化した幹細胞集団を表す。
本発明のある実施形態では、哺乳類(ヒトを含む)非生着血管細胞を増幅して商用量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用する。特定の実施形態では、非生着血管細胞を約10,000〜4,000,000個(以上)の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製を開始する3〜4日内に到達され得る。したがって、本発明は、多量の非生着血管細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、または4,000,000個の細胞を含む。
細胞ベースの治療法
ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、造血または内皮細胞に生体内で分化する能力を有するが、これら2つの細胞型のうちのいずれかが必要とされるか、または処置を改善する細胞ベースの処置においてそれらを使用することができる。さらに、血管芽細胞系細胞および非生着血管系細胞(すなわち、造血細胞および/または内皮細胞)を含む任意の治療法または処置で患者を処置することができる。以下の節では、本発明の方法によって生成および増幅した本発明の非生着血管細胞、または本発明の方法によって増幅した、本発明のヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を使用する方法について説明する。
本発明の別の態様は、輸血に適した造血細胞を産生する方法を提供する。そのような細胞および方法は、多数の使途を有するが、特に重要な使途は、輸血用の血液の利用可能性を改善することにおける使途である。ある好適な実施形態では、本発明は、血管芽細胞/血管コロニー形成単位または非生着血管細胞から分化した赤血球細胞を提供する。そのような分化した赤血球細胞は、輸血に使用することができる。
(a)ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップを含む。
(a)ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(c)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
(a)胚様体への当該胚幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト胚幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物においてヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(c)当該ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(d)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
(a)胚様体への当該多能性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(c)当該胚様体を単一の細胞に分解するステップと、
(d)少なくとも1つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(e)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(f)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
本発明の方法によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、または本発明の方法によって増幅したヒト血管芽細胞は、免疫寛容を誘導するように使用することができる。免疫寛容は、そうでなければ起こるであろう、例えば、被移植者への非自己MHC抗原(例えば、移植片および寛容血管芽細胞と共有される抗原)の導入に応答して起こる、移植片の被移植者の免疫応答の阻害を意味する。したがって、寛容は、免疫抑制剤を使用して誘発され得る広範な免疫阻害ではなく、特定のドナー抗原によって誘導される免疫応答の阻害を意味する。寛容は、体液性、細胞性、または体液性および細胞性両方の応答が関与し得る。寛容は、既存の成熟ドナー反応性T細胞の排除および/または不活性化、ならびに新規開発したドナー反応性T細胞の長期(例えば、生涯)排除および/または不活性化を含み得る。
本発明の他の態様は、遺伝子治療における、血管芽細胞、非生着血管細胞、またはそこから分化した造血あるいは内皮細胞、または次に、これらの細胞からさらに分化した細胞の使用に関する。本発明の哺乳類血管芽細胞または非生着血管細胞の調製物を使用して、治療遺伝子の遺伝子産生物による処置に適した状態を有する患者に治療遺伝子を送達してもよい。血管芽細胞および非生着血管細胞は、血管形成(例えば、虚血性組織における側副の形成を誘導するVEGF)、造血(例えば、赤血球の産生を誘導するエリトロポエチン)、血管機能(例えば、動脈瘤を修復するように血管平滑筋の増殖を誘導する成長因子)、または血液細胞機能(例えば、出血を低減する凝固因子)、または成長ホルモン等の分泌タンパク質のコードに関与または影響する治療遺伝子を送達するのに特に有用である。遺伝子治療の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Andersonらによる米国特許第5,399,346号を参照。遺伝子材料を送達するための生体適合カプセルは、Baetgeらによる国際公開第WO95/05452号に記載されている。遺伝子を骨髄由来細胞に転移させる方法も既に報告されている(Gordonらの米国特許第6,410,015号を参照)。治療遺伝子は、疾患予防または処置に関与する遺伝子産生物またはタンパク質をコード化する遺伝子、または疾患予防または処置に関与する細胞調節作用を有する遺伝子等の臨床的有用性を有するいかなる遺伝子でもあり得る。遺伝子産生物は、患者における欠陥または欠損遺伝子産生物、タンパク質、または細胞調節作用を代用してもよく、それによって患者における疾患または状態の予防または処置を可能にする。
本発明のある態様は、商業量に到達するようなヒト血管芽細胞および非生着血管細胞の増幅に関する。特定の実施形態では、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、大規模で産生され、必要に応じて保管され、病院、医師、または他の医療施設に供給される。患者が、例えば、虚血または血管損傷等の兆候を呈するか、または造血再構成を必要とすると、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を、時宜を得た方法で発注および提供することができる。したがって、本発明は、商業規模で細胞を取得するように、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を生成および増幅する方法、当該方法から派生したヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を含む細胞製剤細胞、ならびにヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を病院および医師に提供する(すなわち、産生、任意選択で保管、および販売する)方法を提供する。さらに、血管芽系細胞または非生着血管系細胞は、生体外で産生され、任意選択で保管され、病院および医師に販売されてもよい。
材料および方法
hESCから血管芽細胞を経た赤血球細胞の生成および増幅
本試験では、H1(National Institutes of HealthでWA01として登録される)、MA01およびMA99(Advanced Cell Technologyで得られた)、ならびにHuES−3(Cowanら(N.Engl.J.Med.2004;350:1353−1356)によって確立され、Harvard Stem Cell Instituteから得られた)の4つのヒトESC系を使用した。hESCは、80%のコンフルエンスに達するまで完全hESC培地中のマイトマイシンC処理マウス胎児線維芽(MEF)で成長させた。hESCからの赤血球細胞の生成および増幅に、4つのステップからなる手順を使用した。
0.5%BSAを含有するIMDMで希釈し(1:5希釈)、450gで10分間遠心分離した。細胞をRBCに部分的に濃縮するために、細胞ペレットの白色の上の部分を、先の細長いピペットを使用して除去した。次いで、RBCを、SCF(100ng/ml)およびEpo(3単位/ml)を含有するStemPro−34 SCF(Invitrogen)培地に、2×106個の細胞/mlの密度で播種した。細胞を、2日ごとに培地を変えて6日間培養し、次いで、さらに4〜5日間、Epo(3単位/ml)を含有するStemPro−34に切り替えた。これらの細胞を、βグロビン鎖およびベンジジン染色分析に使用した。
すべての共役した抗体および対応するアイソタイプ対照は、Chemiconから購入したRhDおよびHbFアッセイ(ComDF)を除いて、Pharmingen/BD Biosciencesから購入した。使用された抗体は、HLAabc、Duffy型、CD14、CD15、CD34、CD35、CD36、CD41、CD44、CD45、CD71、CD133、CD184(CXCR4)、GPA、RhD、およびHbFであった。赤血球細胞を19〜21日目に回収し、0.1%BSAを含むPBS中で2回洗浄し、製造者が推奨する共役抗体の濃度に従って、30分間4℃で染色した。次いで、染色した細胞をPBS+0.1%BSA中で2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを添加した洗浄緩衝液で固定した。RhDおよびHbFアッセイは、0.5%グルタルアルデヒド/PBS中の0.1%BSAでの予備固定処置、および0.1%Triton X/PBS中の0.1%BSAでの染色前の透過処理ステップを含む、製造者のプロトコルに従って行った。
19〜21日目に回収した細胞を0.9%NaCl中で3回洗浄し、次いで、9容量の水中に懸濁させ、サポニンで溶解し、600×gの遠心分離によって清澄化した。次いで、ヘモグロビンを酢酸セルロース電気泳動によって分離した。酸素平衡曲線は、Hemox−Analyzer、Model B(TCS Scientific Corp.、New Hope、PA)を使用して決定した。気相の勾配は、窒素および室内の空気を使用して得、その曲線は両方の方向で得た。以前に説明されているようにわずかなヒステリシスを示す連続のみからのデータを使用した(Honig et al.,Am.J.Hematol.1990;34:199−203、Honig et al.,J.Biol.Chem.1990;265:126−132)。グロビン質量スペクトルは、Leeら(Rapid Commun.Mass Spectrom.2005;19:2629−2635)に記載されるように、Voyager−DE Pro MALDI−TOF質量分析計(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して得た。簡潔に述べると、C18およびC4樹脂を充填したZipTip(Millipore、Billerica、MA)を使用して、それぞれペプチドおよびタンパク質のMS分析用の溶液を調製した。シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)およびシナピン酸(SA)を、それぞれペプチドおよびタンパク質のマトリックスとして使用した。一定分量(1.3ml)のマトリックス溶液(0.1%TFAを含有する50%アセトニトリルの1ml水溶液中の3〜10mgのCHCAまたはSA)を使用して、ZipTipからペプチド/タンパク質を溶出し、MALDI−TOF(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型)標的上にスポットした。337nmのパルス状窒素レーザーを備えるVoyager−DE PRO Mass Spectrometer(Applied Biosystems)を使用して、試料を分析した。タンパク質量は、陽イオン直線モードを使用して測定した。外部質量較正は、m/z12362のチトクロムc(ウマ)、m/z16952のアポミオグロビン(ウマ)、およびm/z39212のアルドラーゼ(ウサギ筋肉)の混合物のピークを使用して行った。
PCRによるhES細胞系のRhDの遺伝子型の同定は、Arceら(Blood 1993;82:651−655)および軽微な修正を加えたSimsekら(Blood 1995;85:2975−2980)によって報告されている。すべてのhES細胞がMEF上に維持されたため、発明者らは、ヒトDNA配列のみを増幅した、1対のヒトDNAに特異的なPCRプライマーを設計した。ABO式血液型の遺伝子型の同定は、ABO式血液型の個人の間での糖転移酵素の多型性に基づいて展開した(Yamamoto et al.,Nature 1990;345:229−233)。
異なる時点で回収した細胞を、スーパーフロストプラススライド(VWR)の低速(<1000rpm)で、サイトスピンした。スライトを乾燥させて、Wright−Giemsa色素で5分間染色し、蒸留水で3回洗浄した。免疫蛍光染色を行うために、サイトスピンしたスライドを、4%パラホルムアルデヒド中に15分間固定し、1%BSA中で30分間インキュベートし、一晩4℃で、1:200のCD235a/Glycophorin A(Dako)、CD71(BD Biosciences)、またはヒトβグロビン鎖に特異的な抗体(Santa Cruz Biotechnology)の一次抗体でインキュベートした。次いで、細胞を1時間、1:200のローダミンまたはFITC(Jackson ImmunoResearch Lab)と共役した二次抗マウスIgGでインキュベートした。総ヘモグロビン染色を行うために、上で概略を説明した赤血球増幅成熟プロトコルを用いた、分化の異なる段階にある細胞を回収し、スライド上にサイトスピンした。風乾したサイトスピン試料を、100%メタノール中に10分間固定した。PBSで10分間洗浄した後、製造者の説明に従って、3’3−ジアミノベンジジン試薬(Sigma)で細胞を染色した。ヘモグロビンを含有する細胞(すべてのRBCと同様)を茶色に染色し、細胞の核はWright−Giemsaで青に染色した。
上で概略を説明した赤血球増幅成熟プロトコルを用いて異なる段階で分化した赤血球細胞を回収し、β、γ、およびεグロビン遺伝子の発現をRT−PCRによって分析した。簡潔に述べると、RNAeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して全RNAを単離し、以前に報告されているように(Lu et al.,Blood 2004;103:4134−4141)、SMART cDNA合成キット(Clontech)を使用してcDNAプールを構築した。以前に報告されているように(Qiu et al.,Blood 2008;111:2400−2408)、β、γ、およびεグロビン遺伝子に特異的なプライマーを使用して、対応するメッセージを増幅した。PCR産物を2.5%アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム蛍光で可視化した。
上記のように7日目まで芽細胞を培養した。
サイトスピンし、Wright−Giemsa染色を施したスライド上の細胞および核の面積を、Scion Imageを使用して除核プロトコル中に測定した。細胞質の面積は、総細胞面積と核面積との間の差異、および核細胞質比(N/C)として計算した。核の面積から直径を計算した。それぞれの時点の直径とN/Cとの間の差異を、分散分析(ANOVA)、その後Holm検定で測定した。データは、少なくともP<0.05を有意性として平均+/−標準偏差として示した。
hESCの赤血球への分化
芽細胞(BC)は、以前に記載されているように(Lu et al.,Nat.Methods 2007;4:501−509)、hESCから生成した。4つのステップからなるプロトコルを用いて、BCを赤血球系へと分化させ、これには[1]未分化hESCからのEBの形成、[2]BCの形成および増幅、[3]赤血球の大量集団への分化および増幅、ならびに[4]赤血球の濃縮が含まれた。初期段階のEBを、モルフォゲンおよび初期造血サイトカインの組み合わせを添加した無血清培地中で培養したhESCから生成した。次いで、EBを解離させ、個々の細胞を、BCの成長および増幅のために、無血清で半固体の芽細胞コロニー成長培地(BGM)に播種した。ブドウ様芽細胞コロニーが3日目の初めに現れ、4日目から急速に増幅した。次いで、数日間BGMおよびEpoを添加することにより、BCを赤血球に増殖および分化するように誘導した。赤血球細胞をさらに増幅するために、1週間の間、2日または3日ごとにSCF、Epo、およびメチルセルロースを含有するStemline IIに基づく培地を添加した。次いで、BSAを添加したIMDM中で細胞を希釈し、短い遠心分離により回収し、組織培養フラスコに一晩播種し、非赤血球細胞をさせた。残りの付着しない細胞を回収した(95%を超える赤血球細胞に相当する)(図1A、1B、1C、および1D)。BGM培地にbFGF(20ng/ml)およびHOXB4タンパク質(2μg/ml)を添加した、増幅および分化のこの最適化された(19〜21日)プロトコルを用いて、3.86±1.19×1010個(平均±SD、n=6)のRBCが、1つの6−ウェルプレートのMA01 hESC(約1.2×107個の細胞)から生成された。また、RBCは、H1(n=2)、HuES−3(n=2)、およびMA99(n=1)のhESCから高効率で生成されたが、その収量は、MA01 hESCから得られたものより5〜6倍低かった。発明者らは、hESCの品質が、RBCの高効率の生成にとって最も重要な因子のうちの1つであり、高品質のhESCは(すなわち、hESC培養物は、顕微鏡下で見られるように、約80%のコンフルエンスを有するが互いに接してはいない、分化の最小限の兆候とともに密な境界線を有するコロニーで構成され、1:3分割が3〜5日でコンフルエンスに達する中程度の速度で成長し、多分化能マーカーでほとんどすべての細胞が陽性に染色され、再播種の24時間後に均一なEBを形成すべきである)、通常多数のEB細胞を生成することを認めた(例えば、2×106個の高品質のhESCは、3.5日後に約2〜3×106個のEB細胞を生成する)。また、分化および増幅培地中の0.2〜0.5%メチルセルロースの存在が、細胞の凝集を防止し、増幅の促進をもたらすことにも気付いた。
hESC由来RBCの特徴付け
形態学的に、上記(19〜21日)プロトコルを用いて得られたRBCは有核であり(>95%)、約10μmの平均直径を有し、最終的な赤血球より実質的に大きかった。Giemsa−Wright染色は、細胞質中の豊富なヘモグロビンを示した(図1Cおよび1D)。細胞が何であるかは、免疫学的特徴付けにより確認した(表1および図1F)。65%を超える細胞が胎児ヘモグロビン(HbF)を発現し、75%超がCD71陽性であり、30%の細胞はCD235aを発現したが、細胞の大部分は、骨髄単球性または巨核球抗原(すべての細胞がCD14に対して陰性であったが、0.4%の細胞はCD15を発現し、8.6%の細胞はCD41を発現した)、および前駆体抗原(0.3%の細胞がCD34に対して陽性であり、10%の細胞がCD35を発現し、5%の細胞がCD36に対して陽性であった)を発現しなかった(表1)。発明者らは、BCがケモカイン受容体CXCR413を発現することをすでに示した。しかしながら、発明者らは、hESC由来RBCの表面上にCXCR4またはCD133の発現を検出せず、これは、生体外で臍帯血前駆体から増幅された赤血球細胞からの知見と一致する(Giarratana et al.,Nat.Biotechnol.2005;23:69−74、Miharada et al.,Nat.Biotechnol.2006;24:1255−1256)。興味深いことに、HLA(<5%)またはDuffy(0%)型抗原を発現した細胞はわずかであるか、あるいはほとんどなく、hESCに由来するCD34+CD38造血前駆体からも観察された知見であった(Lu et al.,Blood 2004;103:4134−4141)。
機能分析
6つの別個の実験において、hESC由来赤血球細胞(19〜21日目培養物)の酸素平衡曲線は、通常の成人RBCに対して、非常に類似しているか(図2A)、またはいくらか右にずれているかのいずれかであった。図2Aに図示された酸素平衡曲線は、二相性外観を有する。酸素飽和の低い側では、その曲線は、通常のものの左にあり、双曲形状である(矢印)。その中間点では、2つの曲線は事実上同一であり、より高い飽和レベルでは、ESC由来赤血球細胞の曲線は、再び通常のもののわずかに左に変位する(矢尻)。Hillのn係数も、通常対照のものと類似した(図2C)。ESC由来赤血球細胞は、生理学的およびより高いpH値で匹敵するボーア効果を示したが、より低いpHではより少ないずれであった(図2B)。これらの細胞の2,3−ジホスホグリセレート(2,3−DPG)除去に対する応答は、通常対照においてよりも大幅に低く(図2C)、Hb Fと2,3−DPGとの間の相互作用の既知の欠如に一致した(Maurer et al.,Nature 1970;227:388−390)。これらの知見は、hESC由来RBCが、通常成人赤血球のものに匹敵する酸素輸送特性を有することを示している。
hESCからのRhD(−)RBCの生成
O/RhD(−)RBCの製造は、RhD(−)不適合患者に輸血される際の同種免疫の防止を大幅に補助するだろう。予測される西洋諸国における万能ドナーRBC(O−)の必要性は、RhD(−)型がさほど優勢ではない韓国、日本、および中国等のアジア諸国においてよりも大きい(それぞれ0.5%未満対15%)。PCRによる遺伝子型分析によって、試験された20個のhESC系のうちの2つ、つまりMA99およびMA133のみが、RhD(−)であることが示された(図3A)。19〜21日目の培養物からの赤血球細胞を、FACSおよび免疫学的分析に使用した。FACS分析によって、MA01から生成されたRBCは、それらの表面上にRhD抗原を発現したが、MA99に由来する細胞は、RhD抗原の発現を欠くことが示され(図3D)、ゲノムDNAPCR分析の結果(図3A)を裏付けた。AおよびB抗原に対するモノクローナル抗体を使用した免疫細胞化学分析は、MA01細胞から生成されたRBCの約5%はA抗原を発現したが、B抗原は発現せず(図3E)、MA01細胞がA(+)の表現型を有することを示し、MA99細胞に由来するRBCの約5%はB抗原を発現したが、A抗原は発現せず(図3E)、MA99細胞がB(−)の表現型を有することを示唆し、一方WA01細胞に由来するRBCは、A抗原もB抗原も発現せず、WA01細胞をO型として確認し、ゲノムPCR分析の結果と一致する(図3Bおよび3C)ことを示した。しかしながら、すべての赤血球細胞がA抗原またはB抗原を発現したわけではなく、細胞の初期発生段階を反映している可能性があることは注目に値する(Wada et al.,Blood 1990;75:505−511、Hosoi et al.,Transfusion 2003;43:65−71)。
生体外でのhESC由来赤血球細胞の除核および成熟
極めて重要な科学的および臨床的課題は、hESC由来赤血球細胞が生体外で成熟し、除核赤血球を生成できるかどうかである。これを調査するために、いくつかの異なる方策および培養条件を試験した。造血幹細胞増幅培地である、Giarratanaら(Nat.Biotechnol.2005;23:69−74)によって報告されたサプリメントおよびサイトカインを加えたStemline IIが、他の試験条件よりも著しく高効率でhESC由来赤血球細胞の成長、増幅、成熟、および除核を支持することが認められた。この条件下で間質層を伴わずに培養した芽細胞は、10〜30%の除核をもたらし、一方MSC間質細胞上での培養は、約30%の除核をもたらし、OP9間質細胞層により、除核プロセスがさらに促進された。約30〜65%の赤血球細胞(40±17%[平均±標準偏差、n=4])が、これらの細胞が5週間の非間質培養物からOP9間質層に移され、36〜42日目まで同時培養された時に除核された(図4Cおよび4E)。除核された赤血球は(図4Cおよび4E)、通常のヒト血液からの成熟RBCと類似した染色パターンおよびサイズを示す(図4Dおよび4F)。これらの赤芽細胞は、BD Matrigel系を使用し、MEFなしで成長させたhESCに由来する。非間質条件(MSCまたはOP9へ移されない)に置かれた赤芽細胞が、10〜30%除核できたという事実は、除核が完全に支持細胞なしで達成され得ることを示唆している。
実施例7
RhDおよびABOの遺伝子型の同定
PCRによるhES細胞系のRhDの遺伝子型の同定は、軽微な修正を加えてArceらおよびSimsekらによって報告されている(Arce et al.,Molecular cloning of RhD cDNA derived from a gene present in RhD−positive,but not RhD−negative individuals.Blood 1993;82:651−655、Simsek et al.Rapid Rh D genotyping by polymerase chain reaction−based amplification of DNA.Blood 1995;85:2975−2980)。すべてのhES細胞がMEF上に維持されたため、発明者らは、ヒトDNA配列のみを増幅した1対のヒトDNAに特異的なPCRプライマーを設計した。PCRプライマーは、RhD−F、5’−tgaccctgagatggctgtcacc−3’(配列番号34)およびRhD−R、5’−agcaacgatacccagtttgtct−3’(配列番号35)であり、これらは、エクソン4とエクソン5との間のイントロン4を増幅し、RhD陰性の個人からのDNAを用いて1,200bpの断片のみを生成するが、RhD陽性の個人においては、100bpおよび1,200bp(増幅の断片サイズにより弱い)が生成される。この方策によって、血清学的に決定された表現型(Simsek et al.,Blood 1995)と完全に一致することが確認された。簡潔に述べると、QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen、Valencia、CA)を使用してhES細胞からゲノムDNAを単離し、PCR増幅には、反応あたり50μl中200ngのDNAを使用した。PCR条件:94℃で45秒間、60℃で1.5分間、および72℃で2.0分間を35サイクルし、最後の延長に72℃で7分間。PCR産物を1.2%アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色で可視化した。RhD陽性および陰性の個人の通常のヒト血液の単核細胞からのDNAを、陽性および陰性対照として使用した。
材料および方法
hESCの培養
hESC系WA01(H1)、HUES3、およびMA01を、以前に説明されているように使用および維持した(6)。簡潔には、hESCを、完全hESC培地中のマイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞(MEF)で成長させた。hESCは、0.05%トリプシン−0.53mM EDTAを使用して、コンフルエンスに達する前に3〜5日ごとに継代した。支持細胞なしの培養のために、次いで細胞を、Ludwigら(7、8)の処方に基づく完全Modified TESR(商標)1(mTESR(商標)1)培地(Stem Cell Technologies,Inc)中のhESC−qualified Matrigelマトリックス(BD Biosciences)で成長させた。製造者が推奨する説明に従って細胞を維持する。簡潔には、細胞が約90%コンフルエンスに達した時、通常5〜7日ごとに、1:3から1:6の範囲の分割比でそれらを継代した。細胞をディスパーゼ(1mg/ml BD、Biosciences)で処理し、37℃で3〜5分間インキュベートしてコロニーの採取を始めた。コロニーをDMEM/F12(Mediatech)で洗浄し、ディスパーゼ溶液を除去した。組織培養プラスチックからコロニーを遊離させるために、ウェルをDMEM/F12で被覆し、コロニーのすべてが移動するまで静かに剥がした。コロニーを円錐管に移し、ウェルをDMEM/F12で洗浄し、細胞をプールしてウェル内のいかなる残留物も回収した。それらを5分間1000rpmで遠心分離した。細胞ペレットをTESR(商標)1培地に再懸濁させ、ウェルあたりmTESR(商標)1培地2mlでMatrigel被覆6ウェルプレートに移した。細胞を5%CO2下で37℃で維持し、mTESR(商標)1培地を毎日補充した。
Oct−4およびTra−1−60発現に関し、支持細胞なしのhESCコロニーを、免疫蛍光を使用して分析した。細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、PBSで洗浄し、PBS中5%Normal Goat Serum(Vector Labs)、1%BSA(Sigma)および0.2%Triton−X−100(Sigma)で30分間室温でブロックした。ブロッキング溶液中、Oct−4に対する一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)またはTra−1−60(Millipore/Chemicon)で、細胞を一晩4℃でインキュベートし、PBSで洗浄し、ブロッキング溶液中、ビオチン共役二次抗体(Jackson Immunoresearch Labs)で、45分間室温でインキュベートした。さらなる洗浄後、細胞をAlexa954共役ストレプトアビジン(Invitrogen/Molecular Probes)で15分間室温でインキュベートし、続いてPBS中での長時間の最終洗浄を行った。DAPIを含むProlong Gold(Invitrogen/Molecular Probes)中に細胞を入れた。
MEFで培養したhESCを血管芽細胞に誘導するために、80〜90%コンフルエントなプレートを0.05%トリプシン消化により分離した。支持細胞なしのhESCを血管芽細胞に分化させるために、上述のプロトコルを使用して85〜90%コンフルエントな細胞をMatrigelマトリックスから採取した。両方の条件からの細胞を、以前に説明されているように(2)、BMP−4、VEGF、およびbFGFの異なる用量のStemline II(Sigma)培地内で、Ultra−Low皿(Corning、NY)上に播種した。48時間後に、異なる実験条件に依存して、同じサイトカインまたは同じ培地とSCF、FLT3リガンド(FL)およびTPO(20ng/ml、R&D System)を含有する新鮮な培地で培地の半分を置き換えた。3.5日後、EBを回収し、0.05%トリプシンで分離した。細胞を22ゲージ針および40μm細胞濾過器に通すことにより単一の細胞懸濁液を得、遠心分離により回収し、50〜100μlのStemlineII培地に再懸濁させた。以前に説明されたように(2)細胞(0.75×105から1×105)を芽細胞成長培地(BGM)2.5mlと混合し、Ultra−Low皿に播種して37℃でインキュベートした。MEFおよび支持細胞なしhESCの両方から得られた芽細胞コロニーを、播種から3〜4日後に観察し、そのすぐ後に急速増幅した。芽細胞(BC)は、本試験において6日目の芽細胞コロニーから得られた細胞として定義される。
潜在的BC前駆体表面マーカーCD31、CD34、KDR、CXCR−4、D133、ACE、PCLP1、PDGFRα、Tie−2、Nrp−2、TPO−RおよびbFGFR−1を、細胞濃縮のために選択した。抗体はすべてマウスモノクローナルIgGアイソタイプであり、CD31およびCD34(Dako Cytomation)、KDRおよびTPO−R(R&D Systems,Inc.)、CXCR−4(Abcam Inc.)、Nrp−2、ACE、PCLP1およびPDGFRα(Santa Cruz Biotechnology)、Tie−2(Cell Signaling Technology,Inc.)、bFGFR−1(Zymed Laboratories)、ならびにCD133(Miltenyi Biotech)である。抗体カクテルのアセンブリをEasySep「Do−it−Yourself」Selection Kit(Stem Cell Technologies)により行った。EBから得られた細胞懸濁液を、1200rpmで4分間遠心分離し、2%FBS/1mMEDTA緩衝液を含むPBSに1〜2×106細胞/100μlの濃度で再懸濁した。細胞を異なる抗体カクテルと15分間室温で混合し、次いでEasySep Nanoparticleとともに室温でさらに10分間インキュベートした。上澄みを捨てた後陽性選択細胞を分離し、細胞を有する管をMagnetホルダに設置した。抗体選択陽性細胞(1×105)を2.5mlのBGMと混合し、芽細胞コロニー発達のために播種した。
RNeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、製造者のプロトコルに従い、全RNAをEBまたは未分化hESCから抽出した。CDNAは、BD SMART PCR CDNA Synthesis Kit(BD Biosciences)を使用して、取扱説明書に従い合成した。リアルタイムRT−PCR(qRT−PCR)は、FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene)を使用して行った。反応については、各反応につき以下の成分で3回行う設定とした。テンプレート50ng、各プライマーおよび1×Masterミックス0.2マイクロモル。使用したプライマーの遺伝子特異的配列を表1にリストするが、アニール温度はすべてのプライマーに対して55℃である。増幅およびリアルタイムデータ収集は、MxProバージョン3.0ソフトウェアを備えるStratagene Mx3005Pで行った。以下のサイクル条件を使用した:95℃で10分間の1サイクル、続いて95℃で30秒間、55℃で1分間、72℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で1分間、55℃で30秒間および95℃で30秒間の最終サイクル。各標的遺伝子の相対定量を、ΔΔCT法(9)を使用してβ−アクチン(ΔCT)へのサイクル閾値(CT)正規化に基づき行った。リアルタイム定量PCRおよび2(−デルタデルタC(T))法(9)を使用した相対遺伝子発現データの分析では、実験試料における検査した各遺伝子のΔCTを未分化hESC対照試料(ΔΔCT)の平均ΔCTと比較した。次いで発現の倍数の変化を2-ΔΔCTとして計算した。マイナスの倍数差データは、以下の式を用いて線形の「発現の倍数変化」値に変換した。発現の線形倍数変化=−(1/発現の倍数変化)。
すべてのデータは、平均±標準誤差として示した。GraphPad Prism、バージョン4、ソフトウェア(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)を使用して、対応のないt検定により集団間比較を行った。p<0.05を統計的に有意とみなした。
血管芽細胞の発達にはBMP−4およびVEGFの両方が必要とされる
血管芽細胞および造血系へのhESC分化を誘導するための無血清系は、以前に説明されている(2、10)。BMP−4、VEGF、および初期造血サイトカインのカクテルを使用したが、個々の因子の絶対要件および最適濃度は検査しなかった。将来の研究および臨床的応用のための血管芽細胞の生成に必要な費用および労力を削減するために、発明者らは、VEGF、BMPおよび3つの初期造血サイトカイン(TPO、FLおよびSCF)の最小要件およびhESCからの芽細胞コロニーの効果的な発達に対する効果を具体的に検査した。無血清条件下では、芽細胞コロニーの発達にはBMP−4が絶対的に必要であることが判明した。EB形成の間の培地へのBPM−4の添加がないと芽細胞コロニーは得られず、hESCからの芽細胞コロニーの形成に対するBMP−4の明確な用量反応効果が観察された(図9A)。さらに、BMP−4は、BMPファミリーの他のメンバーにより置換することができなかった。BMP−2およびBMP−7単体、またはこの2つの組み合わせは、BC発達を促進しなかった。さらに、BMP−4を含有するEB培地へのBMP−2およびBMP−7の添加は、効果を示さない(10ng/ml)か、または(20ng/ml)芽細胞コロニー発達(図9B)を阻害した。しかしながら、芽細胞コロニー成長培地(BGM)へのBMP−4、およびBMP−2および/またはBMP−7の添加は、芽細胞コロニーの発達に対しいかなる効果も有さず、これは、BMP−4のみが中胚葉/血管芽細胞特定段階を促進するが、BCの成長および増幅は促進しないことを示唆している。同様に、VEGF165がEB形成培地から排除されると、芽細胞コロニーは発達しなかった。VEGF165は、用量依存的に芽細胞コロニーの発達を促進することが判明した(図9C)。唯一KDRおよびFLT1受容体に結合することができるVEGFメンバーのアイソフォームであるVEGF121 (11)は、hESCからの芽細胞コロニーの発達の促進においてVEGF165の代替として使用することができ、無血清条件下で最適な用量である50ng/mlのVEGF165またはVEGF121がEB培地に添加された場合、ほぼ同数の芽細胞コロニー(68±5対67±12)が発達した。しかしながら、BMP−4と対照的に、VEGFがBGM中に存在しない場合、芽細胞コロニーは得られず、中胚葉/血管芽細胞特定における初期段階ならびにBCの成長および増幅においてVEGFが重要な役割を担うことを示している。
bFGFはhESCからの血管芽細胞の成長を促進するが、特化は促進しない
以前の研究では、初期分化の間のbFGFの添加が、マウスおよびヒトESC造血発生を促進することが示されている(12、13、14、5)。したがって、EB分化段階中におけるbFGFの添加がhESCからの芽細胞コロニー形成を向上させるかどうかを調査した。EB形成中のbFGFの添加は、芽細胞コロニーの発達に効果を有さず、実際には、より高い用量(40ng/ml)においては、複数のhESC系からの芽細胞コロニーの形成を阻害した(図10Aおよび図11)。一方、BGMへのbFGFの添加は、芽細胞コロニーの発達を大きく促進した(図10A、図11)。bFGFを添加しなかったBGMと比較して、芽細胞コロニーの数(p<0.001)およびBCの総数の両方が大きく増加した。BGM中最適用量(20ng/ml)でのbFGFでは、芽細胞コロニーはより大きく、より健全であり、我々は一貫して、6日間の成長後、約1×108個のBCを高品質WA01 hESC(約1.2×107個の細胞)の1つの6ウェルプレートから採取し、これはbFGFの添加なしでBGMから得られたものより8±1倍高い。
hESCからの血管芽細胞の堅調な生成が支持細胞なしで維持された
MEF支持細胞上に維持されたhESCが非ヒトシアル酸N−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)を含有すること(15、7、8)、およびNeu5Gcの動物源はヒト補体との潜在的な免疫原性反応をもたらし得ることが報告されている。MEF支持細胞層上でのhESCの培養は、動物Neu5Gcの完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたhESC系から生成された血管芽細胞の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって我々は、MEF支持細胞なしで維持されたhESCから血管芽細胞が生成され得るかどうかを決定することにした。材料および方法の項に記載のように、hESC−qualifiedMatrigelマトリックスで被覆された平板上で、ディスパーゼで3つのhESC系を継代し、mTESR培地内に維持した。それらの未分化状態を、Oct−4およびTra−1−60抗体の発現およびコロニー形態に対する免疫蛍光染色により確認した(図12A〜12H)。これらの細胞を回収し、上述の最適化された条件を使用したBCの発達に使用した。興味深いことに、同数のEB細胞が播種された場合、MEF支持細胞上で培養されたhESCと比較して、支持細胞なしhESCで極めてより多数のBCが観察された(図12I、p<0.05)。これらの結果は、試験された3つのhESC系WA01、MA01およびHUES−3すべてに対して観察された(データは示されていない)。
血管芽細胞の発達に対するBMP−4およびVEGFの効果の基礎となる機構
hESCからの血管芽細胞の発達に対するBMP−4およびVEGFの効果の基礎となる分子機構を精査するために、発明者らは、BMP−4およびVEGFの各因子を含む、および含まない、ならびにそれらの組み合わせを含むStemline II培地中で形成された3.5日齢のEBにおける血管芽細胞の発達に関連する遺伝子の発現を比較した。遺伝子発現は、リアルタイムRT−PCR(qRT−PCR)により分析し、未分化hESCにおけるそれらのレベルと比較した。いかなる因子もなしに形成されたEBは、未分化hESCより高いレベルのhESCのマーカーOCT−4を発現した。EB培地へのVEGFの添加は、OCT−4発現の中程度の下方制御をもたらしたが、一方BMP−4またはBMP−4およびVEGFの添加は、OCT−4発現の大幅な低下をもたらした(p<0.0005、図13)。OCT−4発現に対するBMP−4およびVEGFの相加効果はなかった。中胚葉細胞において発現する最初期マーカーであるT−ブラキュリ遺伝子の発現は、BMP−4およびVEGFの両方を含有する培養物から得られたEB(これはその発現の大幅な増加を示す(p<0.0005))を除き、すべての試料において下方制御された。CD31およびLMO2に対しても同様の発現パターンが観察され、BMP−4およびVEGF(p<0.0005)の組合せに暴露されたEBにのみ、大幅に増加した発現レベルが検出された。最も研究されたVEGF受容体のうちの1つであるKDRは、すべてのhESC系に発現することが示されているが(4、5)、その発現は、外生要因が添加されていない培地、およびBMP−4またはVEGF単体が添加された培地から得られたEBにおいて劇的に下方制御された。しかしながら、hESCからの血管芽細胞の効率的な発達を促進した条件であるBMP−4およびVEGF(p<0.002)の存在下で形成されたEBにおいて、KDR発現の中程度であるが有意な増加が観察された。驚くべきことに、最近の報告とは対照的に(14)、すべての条件において形成されたEBでMixLおよびSCL/TAL−1遺伝子の発現の実質的な低下が検出された。1つの可能な説明は、異なる無血清培地中での成長が、これらの遺伝子における異なる発現パターンをもたらしたということである。それにもかかわらず、これらの結果は、hESCからの中胚葉/血管芽細胞の特化および発達には、BMP−4およびVEGFの両方が必要であることを示唆しており、芽細胞コロニーの発達の結果と一致している(図9)。
芽細胞の前駆体の表面マーカーの同定
我々の原法(2)では、定義された因子を添加した1%メチルセルロース中に3.5日目のEB細胞を再播種することにより、BCを生成した。この方策は、造血および内皮細胞を形成する可能性を有するBCを同定する場合に重要であり、またhESCからBCを生成する場合に再現可能である。しかしながら、この手法は、標準的な組織培養インキュベータ中の皿を使用し、したがって大量生産のための回転式生物反応器に適合させることができない。この制限は、主に、3.5日目のEBからの細胞は外生であり、未分化hESCを含む(細胞のごく一部がBC前駆体である)ことに起因する。したがって、この外生集団を液体培養物中に再播種することは、未分化hESCからの二次EBの形成を含むすべての細胞の成長をもたらし、臨床的応用における使用の可能性を排除する。しかしながら、BCの前駆体のマーカー(複数可)を同定することができれば、BCの大量生産のための回転式生物反応器に適合された液体培養物中に、精製された前駆体を播種することができる。したがって我々は、中胚葉誘導体の発生と関連した12の細胞表面分子を選択した。対応する抗体を使用して、3.5日目のEBからの細胞を濃縮し、濃縮された細胞を芽細胞コロニー形成能について分析した。図14に示されるように、3.5日目のEBからのKDR+細胞は、未分画対照細胞(p<0.01)よりも3倍多い芽細胞コロニーを生成したが、これは以前の研究(5)と一致している。我々はまた、CD31+およびCD34+濃縮集団の播種後に芽細胞コロニーの中程度の増加(約1.5倍)を認めたが、この増加は統計的優位性に達しなかった。他のすべての濃縮された集団は、未分画対照細胞と比較して同量以下の芽細胞コロニーを産生したが、これはBC前駆体がこれらの分子を発現しないことを示している。試験されたすべての抗体の未結合(通過した)細胞もまた、未分画細胞と同様の数の芽細胞コロニーを形成したが、これは、KDR+、CD34+およびCD31+細胞でも、芽細胞コロニーを形成することができる細胞の非常に限定された部分を示すことを示唆している。
実施例14
ヒトES細胞からのヒト血管コロニー形成細胞の生成
ヒトES細胞培養。この試験において使用されたhES細胞系は、Advanced Cell Technologyで得られた以前に説明されたHIおよびH9(WA01およびWA09としてNIH登録)ならびに4つの系(MA01、MA03、MA40およびMA09)である。未分化ヒトES細胞は、80%コンフルエンスに達するまで完全hES培地中で不活性化(マイトマイシンC処理)マウス胎児線維芽(MEF)細胞上で培養した(Klimanskaya & McMahon;Approaches of derivation and maintenance of human ES cells:Detailed procedures and alternatives,in Handbook of Stem Cells.Volume 1:Embryonic Stem Cells,ed.Lanza,R.et al.(Elsevier/Academic Press,San Diego,2004)。次いで未分化hES細胞を0.05%トリプシン−0.53mM EDTA(Invitrogen)で2〜5分間分離し、1,000rpmで5分間の遠心分離により回収した。
異なる細胞型:非生着血管細胞の増幅
上記および第11/787,262号に詳説されているように、約4〜7日の増幅後に血管コロニー形成細胞を生成した。ある特定の条件下で、7日間を超えるEBのさらなる培養により、大量の異なる細胞型が産生された。全体に記載のように、この異なる前駆細胞型は、非生着血管細胞と呼ばれる。
ヒトiPSCからの効率的な血管芽細胞の生成
本明細書に記載される効率的かつ再生可能に多数の血管芽細胞を生成する方法に基づいて(Lu et al.Nat Methods 2007;4:501−509、Lu et al.Regen Med 2008;3:693−704も参照)、発明者らは、さらに血管芽細胞プラットホームを使用し、hESCを、血管芽細胞前駆体を通して、赤血球細胞へと大規模に(約1010〜1011個の細胞/6ウェル皿hESC)分化したが、これは以前に報告されたものよりも1000倍以上効率的である。上で説明されたように、それらの細胞は、通常のRBCに匹敵する酸素運搬能力を有し、pHの変化(ボーア効果)および2,3−ジホスホグリセレート(DPG)に応答する(Lu et al.Blood 2008;112:4475−4484も参照)。重要なことには、赤血球細胞は、サイズの漸進的な減少、グリコホリンAの発現の増加、クロマチンおよび核の凝縮、最終的な成人βグロビン鎖の発現の増加を含む、生体外での複数の成熟事象を経た。グロビン鎖に特異的な免疫蛍光分析は、それらの細胞(17日目に0%)が、成人βグロビン鎖の発現を、生体外培養の28日後に16.37%に増加させたことを示した。このプロセスは、RBCを生成する、それらの細胞の30〜60%に濃縮した核の突出をもたらし、約6〜8μmの直径を有した。この結果は、hESC由来血管芽細胞を、機能的な酸素を輸送する赤血球へと大規模に分化および成熟させることが実現可能であることを示している。
発明者らの予備的研究のいくつかにおいては、それらは、最適化されたhESC分化条件を使用して、ヒトIMR90(図20c)および成人4−3iPSC(データは示されていない)から血管芽細胞コロニーを生成産生することができる。それらの効率はhESCと比較すると大幅に低いが、それらはヒトiPSCの血管芽細胞分化能を明確に示す。観察される低効率は、複数の因子に起因し得、そのうちの1つはiPSCの品質である。発明者らはこれを、血管芽細胞の高効率生成のための最重要因子の1つとして観察した。高品質hESC培養物は、顕微鏡下で見られるように、約80%のコンフルエンスを有するが互いに接してはいない、分化の最小限の兆候とともに密な境界線を有するコロニーで構成される。それらは、中程度の速度で成長する、つまり、1:3分割継代hESCは、ほぼすべての細胞における多分化能マーカーの陽性染色とともに、3〜5日でコンフルエンスに達する。高品質hESCは、通常、多数のEB細胞を生成する(例えば2×106個の高品質hESCは3.5日後に約2〜3×106個のEB細胞を生成する)。高品質iPSCを得るための重要な段階には以下が含まれる。(1)トリプシンによる継代対コラゲナーゼによる継代。発明者らは、機械的に継代した培養物からの最初の適応を行った後、hESCを日常的にトリプシン/EDTAで継代することができることを示した(Klimanskaya et al.Approaches of derivation and maintenance of human ES cells:Detailed procedures and alternatives.In:Lanza Rea,ed.Handbook of Stem Cells.Volume 1:Embryonic Stem Cells.New York,USA:Elsevier/Academic Press,2004:437−449.)。発明者らの経験では、トリプシンは、より小さい細胞塊(2〜5細胞)およびより均一に分散した同様のサイズのコロニーを形成する単一の細胞を産生するため、広く使用されているコラゲナーゼIVより良好に機能し、コロニー間の時期尚早の接触を排除して自然分化を制限するが、一方コラゲナーゼ継代は、より広範囲の分化を示し、より低い分割比で継代されるか、またはクラスタの所望の密度に達する前に継代される必要がある、より大規模なコロニーをもたらす。全体的に、トリプシン/EDTA継代は、コラゲナーゼよりも3〜4倍速く培養を拡大し、均質な細胞集団を得る能力を提供する。これらの観察はまたヒトiPSCに対しても有効となり得る。発明者らの実験は、ヒトiPSCをトリプシン消化に適応させることができ、これらの細胞は20を超える継代後も未分化状態を維持することを示した;(2)マウス胎児線維芽細胞(MEF支持細胞)または支持細胞なしでの維持:hESCおよびiPSCの長期維持にはMEF支持細胞が必要であった。MEF支持細胞層上でのhESCおよびiPSCの培養は、動物成分の完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたhESCおよびiPSCから生成された誘導体の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって、第1の段階は、血管芽細胞がmTESR培地中のMatrigelマトリックス上で維持されたhESCから生成され得るかどうかを決定するために行われた。発明者らは、MEF支持細胞上で培養されたhESCと比較して、試験された3つのhESC系、WA01、MA01およびHuES−3すべてに対し同数のEB細胞が播種された場合(p<0.05)大幅に多数(3倍の増加)の血管芽細胞が支持細胞なしhESCで生成されたことを実証した(Lu et al.Regen Med 2008;3:693−704)。発明者は、次いで、上記支持細胞なしの系におけるヒトiPSCの培養の実験を開始し、支持細胞なしの条件下で維持されたヒトiPSCは、Nanog、Oct−4、SSEA−4、およびTra−1−60の多分化能マーカーを発現した(図19)。支持細胞なしの条件からのヒトiPSCsが高効率で血管芽細胞に分化するかどうかを試験する。
iPSCは、細胞分化後およびEB形成中において低い生命力を示し、この現象はhESCにおいても観察される。選択的Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632の無血清EB形成培地への添加が、hESCのアポトーシスを防止し、EB形成を高め、分化を促進することが示されている(Watanabe et al.Nat Biotechnol 2007;25:681−686)。実験では、無血清EB形成および分化培地へのY−27632の添加が、対照培地よりも、ヒトiPS(IMR90)−1細胞からのEBの良好な形成をもたらすことが示された、つまり、Stemline II培地およびサイトカインのみにおけるEBは、通常比較的小さく、24時間後に多くの死細胞を伴い、一方Y−27632を添加した培地におけるEBは滑らかで大きく、より少ない死細胞がその回りを囲んでおり(図20aおよび20b)、より健康的なEBが形成されることを示している。芽細胞コロニー形成のための播種後、Y−27632で処理されたEBからの細胞は、Y−27632処理なしのEBから得られた細胞よりも大幅に多く健康的な芽細胞コロニーを発達させ(図20cおよび20d)、2倍を超える数の血管芽細胞を生成した。以前の研究はまた、本明細書に記載のEB形成系において使用されるStemline II培地を含むほぼすべての細胞培養培地における成分であるインスリンが、恐らくはPI3K/Aktシグナル経路を介したhESC中胚葉分化の有効な阻害剤であることを示している。PI3K/Aktシグナル経路の阻害は、無血清条件下でのhESCの中胚葉分化を向上させた(Freund et al.Stem Cells 2008;26:724−733)。結果は、EB形成および分化培地へのPI3K/Aktシグナル経路阻害剤の添加が、MA09 hESCからの血管芽細胞の形成を大幅に増加させることを示した。対照からの皿と比較して、PI3K/Akt阻害剤で処理した皿からは血管芽細胞の2.5倍を超える増加が得られた。同様に、EB形成中における、PI3K/Aktシグナル経路阻害剤のみ、またはそれとY−27632の添加もまた、対照よりも多く健康的なiPS(IMR90)−1からの芽細胞コロニーをもたらし(図20e)、PI3K/Art阻害剤処理EBならびにPI3K/Art阻害剤およびROCK阻害剤処理EBにおいて、それぞれ2.1倍および2.6倍多い血管芽細胞を産生した。次いで、血管芽細胞を精製し、造血または内皮細胞分化の条件下で播種した。図20f〜20jに示されるように、これらの細胞は、適切な条件下での播種後、造血細胞および内皮細胞の両方に分化した。
hESCの巨核球および血小板への誘導された分化
多能性ヒト胚幹細胞(hESC)およびiPS細胞は、輸血治療に使用される血液細胞に対して可能性のある代替源である。さらに、血液への誘導されたhESC分化は、造血の個体発生を研究するために有用なツールを提供することができる。hESCの輸血可能な巨核球/血小板への効率的な誘導された分化には、重要な臨床的意義がある。しかしながら、ヒトESCから巨核球および血小板を生成するための、これまでに報告されている方法は、1)hESCからの巨核球/血小板の収量が低すぎる、2)それらが定義されていない動物間質細胞(例えば、OP9)を必要とする、および3)これらの方法は、大量生産を行うための拡大が困難であるため、可能性のある臨床的応用には問題がある(Gaur et al.J Thromb Haemost 2006;4:436−442、Takayama et al.Blood 2008;111:5298−5306.)。明確な条件を使用して、複数のhESC系から大量の血管芽細胞(芽細胞、BC)を効率的に生成し得る堅調なモデル系を、本明細書に記載する(Lu et al.Nat Methods 2007;4:501−509、Lu et al.Regen Med 2008;3:693−704も参照)。これらのBCは、本明細書に記載されるように、機能的なRBCの大規模な産生をさらに誘導することができる(Lu et al.Blood 2008;112:4475−4484も参照)。RBCおよび巨核球は、共通の前駆体からもたらされるため、我々のhESC由来血管芽細胞から巨核球および血小板を産生する可能性を模索した。
無血清hES細胞→胚様体3.5〜4日目→芽細胞培養6日目→巨核球培養7日目
これまでMK生成について、H1、H7、およびHuES−3の3つのhESC系が試験されている。標準的なプロトコルを使用して、血管芽細胞を生成した(Lu et al.Nat Methods 2007;4:501−509、Lu et al.Regen Med 2008;3:693−704)。簡潔に述べると、ヒトES細胞を無血清培地中で培養し、胚様体(EB)培養のために採取した。3〜4日目にEB細胞を回収し、単一の細胞懸濁液として調製した。血管芽細胞を産生するために、5×105個のEB細胞を、1mlの芽細胞成長培地に再懸濁した。懸濁液中のMK培養懸濁液を設定するために、8日目の血管芽細胞培養物から細胞を採取した。手短に述べると、それらは首尾よく血管芽細胞モデル系の適合し、hESCから巨核球および血小板を効率的に生成した。発明者らは、これで日常的に、改善された本芽細胞培養方法を用いて、6〜8日間の血管眼細胞の培養後、100万個のhESCから1000万個の芽細胞を生成することができる(Lu et al.Regen Med 2008;3:693−704も参照)。巨核球系への分化を誘導するために、これらの芽細胞を採取して、TPOを含む定義された成長因子を添加した無血清培地中の、巨核球の液体成熟培養物中に播種する。通常、この培養物の初期段階で、細胞数の1.5〜2倍の増加が得られる。本条件下での限定された増幅は、おそらく、他の系に特化した細胞の死、および巨核球の核内***の開始に起因する。液体成熟培養物の4日目までに、精製を必要とすることなく、90%を超えるCD41a+巨核球を達成することができる(図21A)。これらのCD41a+巨核球の大半は、巨核球のさらなるマーカーであるCD42bを同時発現する。結果として、100万個のhESCから14〜15日間で、800〜900万個のCD41+巨核球を産生することができる。それに対して、Takayamaらによる最新の論文は、OP9間質細胞およびウシ胎仔血清を用いた同時培養系を使用した、100万個のhESCから200万個のCD41a+巨核球(集団全体の50%)の生成を報告している(Takayama et al.Blood 2008;111:5298−5306)。明らかに、本明細書に記載される血管芽細胞系は、hESCからの巨核球の生体外生成の顕著な改善を示す。
1.Wagner RC:Endothelial cell embryology and growth.Adv.Microcirc.9, 45−75(1980).
2.Lu SJ, Feng Q, Caballero S et al:Generation of functional hemangioblasts from human embryonic stem cells.Nat.Methods 4(6),501−509(2007).
3.Wang L,Li L,Shojaei F et al:Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.Immunity.21(1),31−41(2004).
4.Zambidis ET,Peault B,Park TS,Bunz F,Civin CI:Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial,primitive,and definitive stages resembling human yolk sac development.Blood 106(3),860−870(2005).
5.Kennedy M,D’Souza SL,Lynch−Kattman M,Schwantz S,Keller G:Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures.Blood 109(7),2679−2687(2007).
6.Klimanskaya I,McMahon J.Approaches of derivation and maintenance of human ES cells:Detailed procedures and alternatives.In:Handbook of Stem Cells.Volume 1:Embryonic Stem Cells.Lanza Rea(Eds.).Elsevier/Academic Press,2004)
7.Ludwig TE,Bergendahl V,Levenstein ME,Yu J,Probasco MD,Thomson JA:Feeder−independent culture of human embryonic stem cells.Nat.Methods 3(8),637−646(2006).
8.Ludwig TE,Levenstein ME,Jones JM et al:Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.Nat.Biotechnol.24(2),185−187(2006).
9.Livak KJ,Schmittgen TD:Analysis of relative gene expression data using real−time quantitative PCR and the 2(−Delta Delta C(T)) Method.Methods 25(4),402−408(2001).
10.Lu SJ,Feng Q,Ivanova Y et al:Recombinant HoxB4 Fusion Proteins Enhance Hematopoietic Differentiation of Human Embryonic Stem Cells.Stem Cells Dev.16(4),547−560(2007).
11.Soker S,Takashima S,Miao HQ,Neufeld G,Klagsbrun M:Neuropilin−1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform−specific receptor for vascular endothelial growth factor.Cell 92(6),735−745(1998).
12.Faloon P,Arentson E,Kazarov A et al:Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development.Development 127(9),1931−1941(2000).
13.Pearson S,Sroczynska P,Lacaud G,Kouskoff V:The stepwise specification of embryonic stem cells to hematopoietic fate is driven by sequential exposure to Bmp4,activin A,bFGF and VEGF.Development 135(8),1525−1535(2008).
14.Pick M,Azzola L,Mossman A,Stanley EG,Elefanty AG:Differentiation of human embryonic stem cells in serum−free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4,vascular endothelial growth factor,stem cell factor,and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.Stem Cells 25(9),2206−2214(2007).
15.Martin MJ,Muotri A,Gage F,Varki A:Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.Nat.Med.11(2),228−232(2005).
16.Huber TL,Zhou Y,Mead PE,Zon LI:Cooperative effects of growth factors involved in the induction of hematopoietic mesoderm.Blood 92(11),4128−4137(1998).
17.Winnier G,Blessing M,Labosky PA,Hogan BL:Bone morphogenetic protein−4 is required for mesoderm formation and patterning in the mouse.Genes Dev.9(17),2105−2116(1995).
18.Johansson BM,Wiles MV:Evidence for involvement of activin A and bone morphogenetic protein 4 in mammalian mesoderm and hematopoietic development.Mol.Cell Biol.15(1),141−151(1995).
19.Wiles MV,Johansson BM:Embryonic stem cell development in a chemically defined medium.Exp.Cell Res.247(1),241−248(1999).
20.Nakayama N,Lee J,Chiu L:Vascular endothelial growth factor synergistically enhances bone morphogenetic protein−4−dependent lymphohematopoietic cell generation from embryonic stem cells in vitro.Blood 95(7),2275−2283(2000).
21.Li F,Lu S−J,Vida L,Thomson JA,Honig GR:Bone morphogenetic protein−4 induces efficient hematopoietic differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in vitro.Blood 98(2),335−342(2001).
22.Tian X,Morris JK,Linehan JL,Kaufman DS:Cytokine requirements differ for stroma and embryoid body−mediated hematopoiesis from human embryonic stem cells.Exp.Hematol.32(10),1000−1009(2004).
23.Chadwick K,Wang L,Li L et al:Cytokines and BMP−4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.Blood 2003 102(3),906−915(2003).
24.Cerdan C,Rouleau A,Bhatia M:VEGF−A165 augments erythropoietic development from human embryonic stem cells.Blood 103(7),2504−2512(2004).
25.Park C,Afrikanova I,Chung YS et al:A hierarchical order of factors in the generation of FLK− and SCL−expressing hematopoietic and endothelial progenitors from embryonic stem cells.Development 131(11),2749−2762(2004).
26.Xu C,Rosler E,Jiang J et al:Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.Stem Cells 23(3),315−323(2005).
27.Xu RH,Peck RM,Li DS,Feng X,Ludwig T,Thomson JA:Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.Nat.Methods 2(3),185−190(2005).
28.Levenstein ME,Ludwig TE,Xu RH et al:Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self−renewal.Stem Cells 24(3),568−574(2006).
29.Yeoh JS,van OR,Weersing E et al:Fibroblast growth factor−1 and −2 preserve long−term repopulating ability of hematopoietic stem cells in serum−free cultures.Stem Cells 24(6),1564−1572(2006).
30.Dell’Era P,Ronca R,Coco L,Nicoli S,Metra M,Presta M:Fibroblast growth factor receptor−1 is essential for in vitro cardiomyocyte development.Circ.Res.93(5),414−420(2003).
31.de HG,Weersing E,Dontje B et al:In vitro generation of long−term repopulating hematopoietic stem cells by fibroblast growth factor−1.Dev.Cell 4(2),241−251(2003).
32.Ginis I,Luo Y,Miura T et al:Differences between human and mouse embryonic stem cells.Dev.Biol.269(2),360−380(2004).
33.D’Amour KA,Agulnick AD,Eliazer S,Kelly OG,Kroon E,Baetge EE:Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.Nat.Biotechnol.23(12),1534−1541(2005).
上記発明を実施するための形態において、本発明の様々な実施形態を説明した。これらの説明は上記実施形態を直接的に説明しているが、当業者は、本明細書に示され説明された具体的実施形態の修正および/または変形を着想し得ることが理解される。本説明の範囲内に包含される任意のそのような修正もまた、本発明に含まれることが意図される。特記しない限り、明細書および特許請求の範囲における単語および語句には、元々の意味、および該当する技術分野(複数可)における当業者にとって習慣的な意味が付与されることが、発明者の意図するところである。
Claims (25)
- 巨核球または血小板を産生する方法であって、
多能性幹細胞を提供することと、
前記多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることと、 TPOを含む巨核球(MK)培養培地中で培養することにより、前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を前記巨核球または前記血小板に分化させることと、を含む、方法。 - 前記多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、ヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される、請求項1に記載の方法。
- 前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、前記巨核球または前記血小板に分化される前に増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Epo、IL−3、およびSCFを含むStemline(登録商標)II培地中で増幅される、請求項6に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、前記ヒト多能性幹細胞を前記血管芽細胞に分化させることは、
(a)ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で前記ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含む方法によって生体外で行われ、前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ(b)における前記少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ヒト多能性幹細胞を前記血管芽細胞に分化させることは、
(c)前記胚様体を単一の細胞に分割するステップと、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単一の細胞を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単一の細胞を含む前記培養物中で、ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
をさらに含み、前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ(a)〜(d)にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項8に記載の方法。 - 前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。
- 前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、請求項10に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、請求項11に記載の方法。
- 前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、Flt−3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、または両方は、細胞培養の0〜48時間以内にステップ(a)に付加される、請求項13に記載の方法。
- 前記幹細胞因子(SCF)、Flt−3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48〜72時間以内に前記培養物に付加される、請求項13に記載の方法。
- 前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を前記巨核球または前記血小板に分化させることは、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞の培養の約6〜8日後に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、前記ヒト多能性幹細胞を前記非生着血管細胞に分化させることは、
(a)前記ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップと、
を含む方法によって生体外で行われ、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で前記ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、
前記胚様体は10〜13日間培養され、
前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項1に記載の方法。 - 前記多能性幹細胞を前記非生着血管細胞に分化させることは、
(c)前記胚様体を単一の細胞に分割するステップと、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単一の細胞を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単一の細胞を含む前記培養物中で、前記ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
をさらに含み、前記胚由来細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)〜(d)にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項17に記載の方法。 - 前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、請求項17に記載の方法。
- 前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、請求項19に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、請求項20に記載の方法。
- 前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、Flt−3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、または両方は、細胞培養の0〜48時間以内にステップ(a)に付加される、請求項22に記載の方法。
- 前記幹細胞因子(SCF)、Flt−3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48〜72時間以内に前記培養物に付加される、請求項22に記載の方法。
- 請求項1〜24に記載の方法のうちのいずれか1つによって産生される、巨核球または血小板。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12680308P | 2008-05-06 | 2008-05-06 | |
US61/126,803 | 2008-05-06 | ||
US18949108P | 2008-08-19 | 2008-08-19 | |
US61/189,491 | 2008-08-19 | ||
US19028208P | 2008-08-26 | 2008-08-26 | |
US61/190,282 | 2008-08-26 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014261935A Division JP2015061539A (ja) | 2008-05-06 | 2014-12-25 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020047981A Division JP2020108397A (ja) | 2008-05-06 | 2020-03-18 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018027095A true JP2018027095A (ja) | 2018-02-22 |
Family
ID=41265390
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011508646A Expired - Fee Related JP5748654B2 (ja) | 2008-05-06 | 2009-05-06 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
JP2014261935A Pending JP2015061539A (ja) | 2008-05-06 | 2014-12-25 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
JP2017206725A Pending JP2018027095A (ja) | 2008-05-06 | 2017-10-26 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
JP2020047981A Pending JP2020108397A (ja) | 2008-05-06 | 2020-03-18 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011508646A Expired - Fee Related JP5748654B2 (ja) | 2008-05-06 | 2009-05-06 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
JP2014261935A Pending JP2015061539A (ja) | 2008-05-06 | 2014-12-25 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020047981A Pending JP2020108397A (ja) | 2008-05-06 | 2020-03-18 | 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20110086424A1 (ja) |
EP (2) | EP2288690B1 (ja) |
JP (4) | JP5748654B2 (ja) |
KR (4) | KR20190000928A (ja) |
CN (3) | CN104328087A (ja) |
AU (1) | AU2009244236B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0912517A2 (ja) |
CA (2) | CA2722766A1 (ja) |
MX (1) | MX2010012089A (ja) |
WO (1) | WO2009137629A2 (ja) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2377925A1 (en) | 2006-04-14 | 2011-10-19 | Advanced Cell Technology, Inc. | Hemangio-colony forming cells |
WO2009137624A2 (en) | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Advanced Cell Technology, Inc. | Hemangio colony forming cells and non-engrafting hemangio cells |
KR20190000928A (ko) | 2008-05-06 | 2019-01-03 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 다능성 줄기세포로부터 유도된 탈핵 적혈구계 세포를 생산하는 방법 |
KR20170078862A (ko) | 2008-05-16 | 2017-07-07 | 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 항체 및 그 제조 방법 |
US8703487B2 (en) | 2009-12-01 | 2014-04-22 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for making and using bone marrow mesenchymal stem cells and erythroid progenitor cells |
IN2012DN05053A (ja) | 2009-12-04 | 2015-10-09 | Stem Cell & Regenerative Medicine Internatioinal Inc | |
KR20120128605A (ko) | 2009-12-04 | 2012-11-27 | 스템 셀 앤드 리제너러티브 메디신 인터내셔날, 인크. | 기질 없는 조건 하에서 인간 배아줄기세포로부터 기능적 거핵구 및 혈소판의 대규모 생성 |
WO2011101468A1 (en) * | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Cell culture medium for the growth and differentiation of cells of the hematopoietic lineage |
DK2785359T3 (en) | 2011-11-30 | 2018-10-29 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | MESENKYMAL STROMACELLES AND APPLICATIONS RELATED |
GB201200458D0 (en) * | 2012-01-11 | 2012-02-22 | Nhs Blood & Transplant | Methods of preparing cells and compositions |
GB201210857D0 (en) | 2012-06-19 | 2012-08-01 | Cambridge Entpr Ltd | Transcription factor mediated programming towards megakaryocytes |
KR20140011912A (ko) | 2012-07-20 | 2014-01-29 | 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소 | 인간 적혈구 전구세포주 및 인간 탈핵 적혈구의 제조방법 |
GB201212960D0 (en) * | 2012-07-20 | 2012-09-05 | Common Services Agency | Erythroid production |
US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
ES2896354T3 (es) * | 2012-12-21 | 2022-02-24 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Métodos para la producción de plaquetas a partir de células madre pluripotentes |
US10272115B2 (en) * | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
SG11201507275TA (en) * | 2013-03-13 | 2015-10-29 | Wisconsin Alumni Res Found | Methods and materials for hematoendothelial differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions |
EP2987852A4 (en) | 2013-04-17 | 2016-09-07 | Nissan Chemical Ind Ltd | MIDDLE COMPOSITION AND PROCESS FOR PRODUCING RED GLOBLES USING THE SAME |
CN105378069B (zh) * | 2013-05-15 | 2020-07-28 | 罗切斯特大学 | 人广泛自我更新型成红细胞(esre) |
CN105518127A (zh) * | 2013-09-06 | 2016-04-20 | 上海斯丹赛生物技术有限公司 | 用于血细胞产生的修饰细胞 |
CN103740642A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-04-23 | 娄彩玲 | 一种生产人红细胞的方法 |
CN104694471A (zh) * | 2015-03-25 | 2015-06-10 | 奥思达干细胞有限公司 | 体外诱导胚胎干细胞分化为红系细胞的方法 |
EP3277293A4 (en) * | 2015-03-30 | 2019-01-16 | Jeffrey Thomas Loh | PROCESS FOR IN VITRO PRODUCTION OF BLOOD PLATES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
EP3322800A4 (en) * | 2015-07-13 | 2019-05-01 | University of Utah Research Foundation | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF RED BLOOD BODIES AND BLOOD PLATES IN VITRO AND USES THEREOF |
SG10201913250SA (en) | 2015-08-18 | 2020-03-30 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Clinical formulations |
CN108700565B (zh) | 2015-10-07 | 2021-10-29 | 善威生物私人有限公司 | 血液制备和图谱分析 |
JP2018538343A (ja) | 2015-12-22 | 2018-12-27 | サングイ バイオ ピーティーワイ. エルティーディー | 赤血球を用いる治療方法 |
EP3405204A4 (en) | 2016-08-26 | 2020-03-18 | Restem Llc | COMPOSITION AND METHOD FOR USING CORD STEM CELLS |
CN106834224A (zh) * | 2016-11-18 | 2017-06-13 | 西北农林科技大学 | 一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法 |
CN110366597B (zh) | 2016-12-20 | 2024-03-29 | 善威生物私人有限公司 | 用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析 |
JP2020507329A (ja) * | 2017-02-17 | 2020-03-12 | ルビウス セラピューティクス, インコーポレイテッド | 機能化赤血球系細胞 |
JP2020099202A (ja) * | 2017-04-12 | 2020-07-02 | Agc株式会社 | 分化細胞スフェロイドの製造方法 |
CN107254437A (zh) * | 2017-08-08 | 2017-10-17 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法 |
CN111836886A (zh) * | 2018-01-05 | 2020-10-27 | 血小板生源说股份有限公司 | 用于产生巨核细胞的组合物和方法 |
GB201818045D0 (en) * | 2018-11-05 | 2018-12-19 | Nhs Blood & Transplant | Method for producing erythroid cells |
CN113207297A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-08-03 | 住友化学株式会社 | 包含胚胎型成红细胞的细胞群体及其制备方法、细胞培养组合物以及化合物试验方法 |
CN110093314B (zh) * | 2019-02-28 | 2021-06-15 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 红细胞脱核培养基及试剂盒 |
US20220162556A1 (en) * | 2019-03-28 | 2022-05-26 | The Hospital For Sick Children | Method of Generating Hemangioblasts |
AU2020263513A1 (en) * | 2019-04-26 | 2021-11-18 | Rubius Therapeutics, Inc. | Buffered compositions including enucleated erythroid cells |
JP2023500327A (ja) * | 2019-11-04 | 2023-01-05 | ルビウス セラピューティクス, インコーポレイテッド | ミオイノシトールを使用して除核赤芽球細胞を生成する方法 |
CA3160464A1 (en) * | 2019-11-04 | 2021-05-14 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods of generating enucleated erythroid cells using taurine or hypotaurine |
CN116426472A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-14 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用 |
CN116836920B (zh) * | 2023-08-21 | 2024-05-24 | 广东横琴粤澳深度合作区齐美国际干细胞医院有限公司 | 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050153443A1 (en) * | 2001-04-02 | 2005-07-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells |
JP2007089432A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Reprocell Inc | 幹細胞由来血小板産生増加法 |
US20080014180A1 (en) * | 2006-04-14 | 2008-01-17 | Robert Lanza | Hemangio-colony forming cells |
Family Cites Families (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5128259A (en) * | 1989-10-27 | 1992-07-07 | Hahnemann University | Factor-dependent hematopoietic cell line exhibiting epo-induced erythrocyte maturation |
WO1994013306A1 (en) * | 1992-12-11 | 1994-06-23 | Systemix, Inc. | Megakaryocyte and platelet growth, production and composition |
DK0802800T3 (da) | 1993-08-12 | 2002-10-07 | Neurotech Sa | Biokompatible immunoisolatoriske kapsler indeholdende genetisk ændrede celler for levering af biologisk aktive molekyler |
US5599705A (en) * | 1993-11-16 | 1997-02-04 | Cameron; Robert B. | In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells |
AU1595195A (en) | 1993-12-23 | 1995-07-10 | Abs Global, Inc. | Embryonic stem cells as nuclear donors and nuclear transfer techniques to produce chimeric and transgenic animals |
US5874301A (en) * | 1994-11-21 | 1999-02-23 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US5914268A (en) * | 1994-11-21 | 1999-06-22 | National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US6063593A (en) | 1996-11-12 | 2000-05-16 | University Of Southern California University Park Campus | TGFβ1 responsive bone marrow derived cells to express a recombinant protein |
US6429012B1 (en) | 1997-10-06 | 2002-08-06 | Viacell, Inc. | Cell population containing non-fetal hemangioblasts and method for producing same |
EP1104455A2 (en) | 1998-06-25 | 2001-06-06 | Hemosol Inc. | Media and methods for expansion of erythroid stem cells for the production of hemoglobin |
JP2002523039A (ja) | 1998-08-24 | 2002-07-30 | ティー.ブリーダーズ,インコーポレイテッド | 非胎児血管芽細胞を含む細胞集団、およびその生産方法 |
CA2383790C (en) * | 1999-09-07 | 2016-11-22 | Advanced Cell Technology, Inc. | Telomere restoration and extension of cell life-span in animals cloned from senescent somatic cells |
CA2388497A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | Advanced Cell Technology, Inc. | Method of producing differentiated progenitor cells by culturing morula or inner cell mass cells |
EP1248517A2 (en) * | 2000-01-07 | 2002-10-16 | Oregon Health and Science University | Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting |
WO2001053465A1 (en) * | 2000-01-21 | 2001-07-26 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Human embryoid body-derived cells |
US6602711B1 (en) * | 2000-02-21 | 2003-08-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making embryoid bodies from primate embryonic stem cells |
US7249081B2 (en) * | 2000-02-23 | 2007-07-24 | Financial Engines, Inc. | Load aware optimization |
AU8617301A (en) | 2000-08-01 | 2002-02-13 | Yissum Res Dev Co | Directed differentiation of embryonic cells |
JP2004531262A (ja) | 2001-05-15 | 2004-10-14 | ラッパポート ファミリー インスチチュート フォア リサーチ イン ザ メディカル サイエンシズ | ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞 |
LU91074B1 (en) | 2001-11-02 | 2004-04-30 | Wisconsin Alumni Res Found | Endothelial cells derived from primate embryonic stem cells |
JP2005510232A (ja) | 2001-11-26 | 2005-04-21 | アドバンスド セル テクノロジー、インク. | 再プログラムされたヒト体細胞核ならびに自系および同系なヒト幹細胞の製造および使用方法 |
EP1463803B1 (en) | 2001-12-07 | 2018-02-14 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Hematopoietic cells from human embryonic stem cells |
US20030217374A1 (en) | 2002-01-15 | 2003-11-20 | Advanced Cell Technology | Cloning B and T lymphocytes |
US20040091936A1 (en) | 2002-05-24 | 2004-05-13 | Michael West | Bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank |
EP1563058A4 (en) | 2002-07-12 | 2005-12-28 | Univ Singapore | Haemangioblasts-Progenitor Cells |
US20040052771A1 (en) | 2002-07-12 | 2004-03-18 | Lim Sai Kiang | Hemangioblast progenitor cells |
AU2003273332A1 (en) * | 2002-09-26 | 2004-04-19 | Children's Medical Center Corporation | Method of enhancing proliferation and/or hematopoietic differentiation of stem cells |
AU2002348947A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-19 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Compositions and methods for amplification of human stem cells |
US20040229350A1 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-18 | Nikolai Strelchenko | Morula derived embryonic stem cells |
WO2005049812A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-02 | Australian Stem Cell Centre Limited | Methods for producing blood products from pluripotent cells in cell culture |
CN1302102C (zh) * | 2003-12-29 | 2007-02-28 | 中国医学科学院血液学研究所 | 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 |
CN1286970C (zh) * | 2003-12-30 | 2006-11-29 | 上海伯瑞生物技术发展有限公司 | 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法 |
KR20060114366A (ko) | 2004-02-09 | 2006-11-06 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 | 클론원성 내피 전구 세포의 분리, 팽창 및 용도 |
US20050221482A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Burt Richard K | Methods and compositions for obtaining hematopoietic stem cells derived from embryonic stem cells and uses thereof |
JP5139799B2 (ja) * | 2004-06-04 | 2013-02-06 | ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー(パリ シズエム) | 赤血球細胞の生産方法 |
NZ554866A (en) | 2004-11-01 | 2010-12-24 | Wisconsin Alumni Res Found | Platelets from stem cells |
US7893315B2 (en) * | 2004-11-04 | 2011-02-22 | Advanced Cell Technology, Inc. | Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells |
US8492148B2 (en) | 2005-02-23 | 2013-07-23 | Foundation For Biomedical Research & Innovation | Method for amplification of endothelial progenitor cell in vitro |
CA2610243C (en) | 2005-06-01 | 2016-11-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of forming dendritic cells from embryonic stem cells |
AU2007215276B2 (en) * | 2006-02-09 | 2013-09-19 | Maryna E. Gumenyuk | Erythroid cells producing adult-type beta-hemoglobin generated from human embryonic stem cells |
CN101045914A (zh) * | 2006-03-29 | 2007-10-03 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 体外诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法与应用 |
CN101045915A (zh) | 2006-03-29 | 2007-10-03 | 旭日干 | 一种***生发泡移植技术 |
AU2013201444B2 (en) | 2006-04-14 | 2015-01-22 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Hemangio-colony forming cells |
US20070298496A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Hung-Chih Kuo | Method of deriving pluripotent stem cells from a single blastomere |
US20080108044A1 (en) * | 2006-11-08 | 2008-05-08 | Deepika Rajesh | In vitro differentiation of hematopoietic cells from primate embryonic stem cells |
JP2008307007A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
WO2008151386A1 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Australian Stem Cell Centre Ltd | Megakaryocyte differentiation |
WO2009104825A1 (en) | 2008-02-18 | 2009-08-27 | Kaist | Method for inducing the defferentiation of embryonic stem cells into hemangioblast |
JP5198116B2 (ja) * | 2008-03-28 | 2013-05-15 | 富士フイルム株式会社 | インクジェットプリンタ、およびインクジェット記録方法 |
KR20190000928A (ko) | 2008-05-06 | 2019-01-03 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 다능성 줄기세포로부터 유도된 탈핵 적혈구계 세포를 생산하는 방법 |
WO2009137624A2 (en) | 2008-05-06 | 2009-11-12 | Advanced Cell Technology, Inc. | Hemangio colony forming cells and non-engrafting hemangio cells |
DK2785359T3 (en) | 2011-11-30 | 2018-10-29 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | MESENKYMAL STROMACELLES AND APPLICATIONS RELATED |
ES2896354T3 (es) * | 2012-12-21 | 2022-02-24 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Métodos para la producción de plaquetas a partir de células madre pluripotentes |
JP6459257B2 (ja) | 2014-07-08 | 2019-01-30 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像形成装置 |
CN106834224A (zh) * | 2016-11-18 | 2017-06-13 | 西北农林科技大学 | 一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法 |
US11788065B2 (en) * | 2019-12-23 | 2023-10-17 | Boston Medical Center Corporation | Human iPSC-based derivation of NK and T-cells using early Notch induction |
CN116731967B (zh) * | 2023-08-16 | 2023-11-17 | 南京大学 | 从多能干细胞通过诱导分化制备巨噬细胞的方法 |
-
2009
- 2009-05-06 KR KR1020187037621A patent/KR20190000928A/ko active Search and Examination
- 2009-05-06 CA CA2722766A patent/CA2722766A1/en not_active Abandoned
- 2009-05-06 KR KR1020107027292A patent/KR101803562B1/ko active IP Right Grant
- 2009-05-06 CN CN201410596811.2A patent/CN104328087A/zh active Pending
- 2009-05-06 US US12/991,111 patent/US20110086424A1/en not_active Abandoned
- 2009-05-06 AU AU2009244236A patent/AU2009244236B2/en not_active Ceased
- 2009-05-06 EP EP09743615.8A patent/EP2288690B1/en active Active
- 2009-05-06 CA CA3150872A patent/CA3150872A1/en active Pending
- 2009-05-06 BR BRPI0912517A patent/BRPI0912517A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-05-06 JP JP2011508646A patent/JP5748654B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-06 EP EP17174456.8A patent/EP3282010A1/en not_active Withdrawn
- 2009-05-06 KR KR1020207037706A patent/KR20210003301A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-05-06 KR KR1020177023856A patent/KR20170102048A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-05-06 CN CN200980125862.4A patent/CN102083960B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-06 MX MX2010012089A patent/MX2010012089A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-05-06 WO PCT/US2009/043050 patent/WO2009137629A2/en active Application Filing
- 2009-05-06 CN CN202010783311.5A patent/CN112280739A/zh active Pending
-
2014
- 2014-12-25 JP JP2014261935A patent/JP2015061539A/ja active Pending
-
2016
- 2016-03-24 US US15/080,486 patent/US9988602B2/en active Active
-
2017
- 2017-10-26 JP JP2017206725A patent/JP2018027095A/ja active Pending
-
2018
- 2018-04-25 US US15/962,989 patent/US20190002828A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-02-25 US US16/800,139 patent/US20200263132A1/en not_active Abandoned
- 2020-03-18 JP JP2020047981A patent/JP2020108397A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050153443A1 (en) * | 2001-04-02 | 2005-07-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells |
JP2007089432A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Reprocell Inc | 幹細胞由来血小板産生増加法 |
US20080014180A1 (en) * | 2006-04-14 | 2008-01-17 | Robert Lanza | Hemangio-colony forming cells |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
"Annals of the New York Academy of Sciences", 2007, VOL.1106, PP.219-222, JPN6013055187, ISSN: 0003929768 * |
"Nature Methods", 2007, VOL.4, NO.6, PP.501-509, JPN6013055189, ISSN: 0003929769 * |
"Stem Cells and Development", 2007, VOL.16, PP.547-559, JPN6013055192, ISSN: 0003929770 * |
"Stem Cells", MAY 1, 2008, VOL.26, PP.1537-1546, JPN6013055193, ISSN: 0003929767 * |
INTERNATIONAL JOURNAL OF HEMATOLOGY, vol. V85, JPN5011003794, 2007, pages 371 - 379, ISSN: 0003929771 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2015061539A (ja) | 2015-04-02 |
KR101803562B1 (ko) | 2017-12-01 |
JP5748654B2 (ja) | 2015-07-15 |
AU2009244236B2 (en) | 2015-03-12 |
CA3150872A1 (en) | 2009-11-12 |
EP2288690A2 (en) | 2011-03-02 |
MX2010012089A (es) | 2011-07-28 |
KR20190000928A (ko) | 2019-01-03 |
KR20110006705A (ko) | 2011-01-20 |
EP2288690B1 (en) | 2017-07-12 |
CA2722766A1 (en) | 2009-11-12 |
CN102083960A (zh) | 2011-06-01 |
EP2288690A4 (en) | 2012-02-29 |
BRPI0912517A2 (pt) | 2019-09-24 |
KR20210003301A (ko) | 2021-01-11 |
US20200263132A1 (en) | 2020-08-20 |
KR20170102048A (ko) | 2017-09-06 |
WO2009137629A2 (en) | 2009-11-12 |
AU2009244236A1 (en) | 2009-11-12 |
US20190002828A1 (en) | 2019-01-03 |
CN112280739A (zh) | 2021-01-29 |
WO2009137629A3 (en) | 2010-01-21 |
EP3282010A1 (en) | 2018-02-14 |
CN104328087A (zh) | 2015-02-04 |
CN102083960B (zh) | 2014-12-03 |
US9988602B2 (en) | 2018-06-05 |
US20170121681A1 (en) | 2017-05-04 |
JP2020108397A (ja) | 2020-07-16 |
JP2011519577A (ja) | 2011-07-14 |
US20110086424A1 (en) | 2011-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200263132A1 (en) | Methods for producing enucleated erythroid cells derived from pluripotent stem cells | |
JP7138134B2 (ja) | 血管コロニー形成細胞および非生着血管細胞 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181203 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190603 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20191118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200318 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200318 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20200330 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200526 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200601 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20200703 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20200713 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20201210 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20210524 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20211004 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20211018 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20211117 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20211117 |