CN106834224A - 一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于血细胞的诱导分化领域，提供一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，包括两大步骤：A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞；B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞。本发明提供的方法采用了单层细胞培养结合悬浮细胞培养的两步法诱导方式，简化了诱导程序，缩短了诱导时间，操作简单，具有高效、稳定的技术特点，采用无饲养层细胞的诱导分化体系，诱导得到的血细胞具备生物安全保障，能够满足临床转化和临床实验的要求，医学转化价值高。

Description

一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法
技术领域
本发明属于血细胞的诱导分化领域，具体涉及一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法。
背景技术
输血是重型先天性和获得性贫血疾病的主要治疗手段，这些疾病包括血液***恶性肿瘤，红细胞再生障碍性贫血、地中海贫血、血红蛋白病等，严重威胁人类的生命健康。然而，配型不足和血液代替品稀少仍然制约着这些疾病的治疗。近年来，随着造血祖/干细胞和CD34阳性细胞成功分化成红细胞的技术突破，为血液疾病的治疗带来了新的希望，但是，仍然存在配型困难等问题。
人的血液细胞特别是红细胞不能在体外扩繁，而人的多能干细胞能够在体外大量扩增，并诱导分化为各种血液细胞。而“万能”的Rh阴性O型血不需要配型，可以给任何血型的人输用，但是，在我国自然人群中这种血型的人在1%以下。而采用干细胞诱导技术，可以在体外制备Rh阴性O型血细胞，为血液疾病的治疗带来巨大突破。
通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，对于这类干细胞人们称之为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，简称iPS)，而人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，简称hES)是一种源于人囊胚内细胞团，经体外分离、培养获得的原始多能干细胞。
目前，利用人多能干细胞，采用拟胚体和共培养的传统体外红细胞诱导体系，向血液细胞包括红细胞进行诱导分化，但这些技术获得的红细胞只有极少部分为完全成熟红细胞，产量低，临床应用价值有限。采用拟胚体诱导分化的技术方法，通常涉及三至四个诱导阶段，步骤过于繁琐，成本高。而且，这些细胞诱导技术在不同程度上使用了牛血清FBS、饲养层共培养细胞等动物源性物质，因此，得到的诱导产物不能用于临床转化和临床试验。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法。解决现有技术中诱导技术繁琐、成本高、产量低、存在安全隐患的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞：诱导使用的人多能干细胞均为无饲养层的培养基1体系，培养人多能干细胞后，接入预先铺好四型胶原的培养皿中，移入CO2培养箱培养24小时后，更换BVF-M培养基，记为0天，然后每两天更换BVF-M培养基，培养6天；
B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞：将步骤A获得的细胞重悬后与BGM培养基混匀，加入6孔板中，置于CO2培养箱中进行培养；
其中，所述的培养基1为以Matrigel为基质的mTeSR1培养基；
步骤A所述的BVF-M培养基以Stemline II hematopoietic medium为基础培养液配制成的，含有BMP4 50 ng/mL、VEGF 50 ug/mL、bFGF 50 ng/mL；
步骤B所述的BGM培养基含有：100 mL hematopoietic CFC medium与1 mL 青霉素和链霉素混合、100 µL 浓度为50 ug/mL 的VEGF、200 µL浓度25 ug/mL 的Flt3 ligand和 250µL浓度为8 ug/mL 的bFGF。
上述人多能干细胞为hES或iPS。
上述步骤A的具体操作为：
（1）将人多能干细胞在6孔板中使用无饲养层的培养基1培养，每天更换培养基1，培养4-5天，每孔细胞量达到1.5-2.5 × 106，然后进行消化细胞，弃去培养基，用1mL细胞消化液洗一遍，弃去细胞消化液后，再加入1mL细胞消化液，在37℃培养箱中培养7-8分钟，当细胞克隆呈现分离松散状态时，移去细胞消化液，每孔添加1-2mL培养基1，使细胞呈现漂浮状态；
（2）转移细胞至离心管，调整细胞悬浮液密度，然后接入预先铺好四型胶原的细胞培养皿，并添加浓度为10 μM的ROCK通路抑制剂，移至CO2培养箱培养24小时；
（3）移去上述培养基1和ROCK通路抑制剂，回收漂浮的拟胚体，加入10mL BVF-M培养基，在培养箱中进行培养，记为诱导的0天，每两天更换BVF-M培养基；
（4）在诱导的第四天，更换BVF-M培养基后，将细胞培养皿放在CO2培养箱中继续培养2天；
（5）在第六天，采用流式细胞术检测CD31、CD34的表达量。具体操作为：移去培养基后，加入1 mL预热的Accutase润洗细胞，然后弃去Accutase，再加入1 mL Accutase，37℃培养3分钟，消化至细胞完全分离，使用1 mL吸液器吹打至单细胞，并使用30 μm的细胞过滤器，除去大的细胞团块，按照流式细胞操作制备单细胞悬液，进行检测。
其中，步骤A中所述ROCK通路抑制剂为Y27632。
上述步骤B的具体操作为：
（1）重悬细胞：将步骤A得到的细胞离心分离后，使用造血干细胞培养基重悬细胞，至细胞密度达到2–5 × 106个/mL；
（2）将每1.0–1.5 × 105个细胞与2.5-3 mL BGM培养基混匀，震荡10秒后静置5-10分钟，得到BGM-细胞混合物，将其分装成2.5-3 mL/管，在−20°C下保存；
（3）将步骤（2）得到的BGM-细胞混合物加入到低吸附6孔板中，在37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，记为培养的0天；3天后镜检细胞克隆状态；
（4）培养6-7天后，在每孔的原液面上添加2mL BGM培养基，继续培养3-4天；
（5）添加4 mL BGM培养液，再添加Epo 3 units/ml ，继续培养5天；
（6）转移BGM-细胞混合物至低吸附皿中，加入8 mL造血干细胞培养基，再添加SCF 50ng/ml和Epo 3 unit/ml，继续培养3天；
（7）每个培养皿加入现有体积1/2 的造血干细胞培养基A，继续培养7天，培养过程中每2–3 天添加相同体积的造血干细胞培养基A，当细胞达到汇合时，按照1:3的比例将细胞分盘培养；其中，造血干细胞培养基A是以造血干细胞培养基为基础培养液配制的，其中含有SCF 50 ng/ml，Epo 3 unit/ml，甲基纤维素0.5%，以保持细胞的快速增长；
（8）每个培养皿加入现有体积5倍的IMDM，离心收集细胞，重复此步骤1次后，使用添加0.5% BSA的IMDM进行重悬细胞，并接入组织培养瓶过夜培养，收集红细胞；
（9）为了进一步成熟红细胞，使用添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34SCF培养基进行重悬细胞，保持细胞密度在2 × 106 个/mL，继续培养6天，每2天更换添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34 SCF培养基；
（10）收集细胞，使用仅添加3 unit/mL Epo的StemPro-34培养基继续培养4–5天，即得成熟红细胞。
其中，步骤B所述的造血干细胞培养基为Stemline II hematopietic stem cellexpansion medium。
优选地，所述人多能干细胞为hES，步骤A中步骤（2）调整细胞悬浮液密度为10000-15000个/mL，步骤（3）所述的培养箱为CO2培养箱。
优选地，所述人多能干细胞为iPS，步骤A中步骤（2）调整细胞悬浮液密度为30000-40000个/mL，步骤（3）所述的培养箱为5% O2培养箱。
优选地，步骤B中步骤（1）离心的转速为1000rpm，离心时间为5分钟。
优选地，步骤B中步骤（8）离心的转速为1000rpm，离心时间为5-15分钟。
所述的造血干细胞培养基为Stemline II hematopoieticstem cell expansionmedium。
本发明的优点：
（1）本发明避免了使用拟胚体诱导分化的繁琐技术路线，采用了单层细胞培养结合悬浮细胞培养的两步法诱导方式，简化了诱导程序，缩短了诱导时间，具有高效、稳定的技术特点；
（2）本发明诱导使用的人多能干细胞均为无饲养层的培养基体系，采用无动物血清、无饲养层细胞的诱导分化体系，诱导得到的血细胞具备生物安全保障，能够满足临床转化和临床实验的要求，医学转化价值高；
（3）本发明提供的方法，使用细胞密度作为诱导分化各阶段的判断要求，简化了对诱导细胞的形态等的判定要求，操作简单，有利于技术的推广和应用；在第二阶段CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞时，采用了只需在一定的时间内对培养基进行添加、细胞分盘等技术，减少了实验操作难度；再者，本发明采用单层细胞培养结合悬浮细胞培养的方式，有效的增加了细胞产量，提高了诱导效率，能够诱导产生完全成熟红细胞的效率达15-20%。
附图说明
图1 本方法的流程示意图，包括两大步骤：A.人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞；B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞。
图2 实施例1中iPS细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞的过程中，在显微镜下观察不同时间段的细胞形态。
图3 实施例1中CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞过程中，在显微镜下观察不同时间段的细胞形态。
图4 实施例1的iPS细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞的流式细胞术检测结果图，在第一步诱导完成时，CD31阳性率为31.2%，CD34阳性率为8.2%。
图5 实施例1中最终得到的细胞进行吉姆萨染色试验结果。可以看出：诱导获得的RBC呈现为有核红细胞。
图6 实施例1中采用RT-qPCR检测最终得到的细胞群体中beta-，Gamma-，Epsilon-globin的表达结果。细胞群体中Beta-globin表达含量标志着完全成熟血细胞所占比例为15%。
图7 实施例1最终诱导获得的血细胞。
图8 实施例2的hES细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞的流式细胞术检测结果图，在第一步诱导完成时，CD31阳性率为42.7%，CD34阳性率为8.9%。
图9 实施例2中采用RT-qPCR检测最终得到的细胞群体中beta-，Gamma-，Epsilon-globin的表达结果。细胞群体中Beta-globin表达含量标志着完全成熟血细胞所占比例为20 %。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，包括两大步骤（该方法的流程示意图如图1所示）：A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞；B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞；具体操作如下：
A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞
（1）将iPS细胞在6孔板中使用无饲养层的以Matrigel为基质的mTeSR1培养基培养（Stemcell Technologies），每天更换mTeSR1培养基，培养4天，每孔细胞量达到1.5-2.5 ×106，然后进行消化细胞，消化细胞时，弃去mTeSR1培养基，用1mL细胞消化液（CellDissociation Buffer, 简称CDB, Gibco公司）洗一遍，弃去该细胞消化液后，再加入1mL细胞消化液，在37℃培养箱中培养7分钟，当细胞克隆呈现分离松散状态时，移去细胞消化液，每孔添加1-2mLmTeSR1培养基，这时细胞呈现漂浮状态；
（2）转移细胞至离心管并计数，调整iPS细胞悬液密度为30000-40000个/mL，然后接入预先铺好四型胶原（Advanced Biomatrix公司）的100 mm细胞培养皿，并添加终浓度为10 μM的Y27632（stemRD公司），移至CO2培养箱培养24小时；24小时后，显微镜下检查克隆形态，可见有贴壁的克隆和小团块，也有部分漂浮的小拟胚体EB；
（3）移去上述mTeSR1/Y27632混合物，离心回收漂浮的EB，每个细胞培养皿加入10 mLBVF-M培养基，放在5% O2的低氧培养箱中培养，以此记为诱导的0天，保持细胞皿不移动，每两天更换BVF-M培养基；在第二天，检查细胞贴附和形态，许多细胞集落贴壁生长且状态良好（见图2）；其中，所述的BVF-M培养基以Stemline II hematopoietic medium（Sigma公司）为基础培养液配制成的，含有BMP4 50 ng/mL（Peprotech公司）、VEGF 50 ug/mL（stemRD公司）、bFGF 50 ng/mL（Peprotech公司）；
（4）在诱导的第四天，更换BVF-M培养基后，将细胞培养皿放在CO2培养箱中继续培养2天；
（5）在第六天，采用流式细胞术检测CD31，CD34，CD43 的表达量，具体操作为：移去细胞培养皿中的培养基后，加入1 mL预热的Accutase（Gibco公司）润洗细胞，然后弃去Accutase，再加入1 mL Accutase，37℃培养3分钟，消化至细胞完全分离，使用1 mL吸液器吹打至单细胞，并使用30 μm的细胞过滤器，除去大的细胞团块，按照流式细胞操作制备单细胞悬液，进行检测，CD31阳性表达比率在31.2%，CD34阳性表达率在8.2%，实验结果见图4；通过图2可以看出，在第6天时，细胞培养皿基本长满细胞，细胞汇合＞80%（见图2）；
B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞
（1）重悬细胞：将步骤A得到的细胞离心分离，转速为1000 rpm，离心时间为5分钟，离心后，使用Stemline II hematopietic stem cell expansion medium 重悬细胞，至细胞密度达到2–5×106个/mL；
（2）将每1.0–1.5 × 105个细胞与2.5-3 mL BGM培养基混匀，震荡10秒后静置5分钟，得到BGM-细胞混合物，使用16号针头的5 mL注射器将其分装成2.5-3 mL/管，在−20°C下保存；其中，BGM培养基含有：100 mL hematopoietic CFC medium（Advanced Biomatrix公司）与1 mL 青霉素和链霉素混合、100 µL 浓度为50 ug/mL 的VEGF、200 µL浓度25 ug/mL 的Flt3 ligand（Peprotech公司）和 250 µL浓度为8 ug/mL 的bFGF（Peprotech公司）；
（3）使用16号针头的注射器将步骤（2）得到的BGM-细胞混合物加入到低吸附6孔板中，在37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，记为培养的0天；3天后镜检细胞克隆状态，有可见的克隆团（见图3）；4-6天后有明显的葡萄串样克隆；
（4）6天后，在每孔的原液面上添加2 mL BGM，不要搅动培养液中细胞克隆，继续培养3天，细胞密度保持在1–2 × 106 cells/mL；
（5）添加等体积的BGM培养液，并额外添加 3 units/ml Epo，继续培养5天；在培养的第14天时，可见克隆呈现的颜色偏粉红色（见图3）；
（6）转移BGM-细胞混合物至100mm的低吸附皿中，加入等体积的Stemline IIhematopoieticstem cell expansion medium ，再添加SCF 50 ng/ml（R&D system公司）和Epo 3 unit/ml（Peprotech公司），继续培养3天；
（7）每个培养皿加入现有体积1/2 的造血干细胞培养基A，继续培养7天，培养过程中每2–3 天添加相同体积的造血干细胞培养基A，当细胞达到汇合时，按照1:3的比例将细胞分盘培养；其中，造血干细胞培养基A是以造血干细胞培养基Stemline II hematopoieticstem cellexpansion medium为基础培养液配制的，其中含有SCF 50 ng/ml，Epo 3 unit/ml，甲基纤维素0.5%；在19天时，可见细胞呈现悬浮状态，说明其处于快速增殖阶段（见图3）；
（8）为了进一步富集红细胞，每个培养皿加入现有体积5倍的IMDM（Gibco
公司），离心收集细胞，离心转速1000rpm，离心时间15分钟，重复此步骤1次后，使用添加0.5% BSA（Sigma公司）的IMDM进行重悬细胞，并接入组织培养瓶过夜培养，收集红细胞；
（9）为了进一步成熟红细胞，使用添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34SCF（Invitrogen公司）培养基进行重悬细胞，保持细胞密度在1.5 - 2.5×106个/mL，继续培养6天，每2天更换添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34 SCF培养基，此阶段仍为细胞仍为悬浮细胞，每次更换培养基时需经过短暂离心收集；
（10）收集细胞，使用仅添加3 unit/mL Epo的StemPro-34培养基继续培养5天，即得成熟红细胞；第35天时，细胞已处于成熟阶段。
对最终得到的细胞进行吉姆萨染色试验，结果如图5所示，诱导获得的RBC呈现为有核红细胞。
采用RT-qPCR检测最终得到的细胞群体中beta-，Gamma-，Epsilon-globin的表达，细胞群体中Beta-globin表达含量标志着完全成熟红细胞所占比例为15%，结果见图6所示。
图7为最终诱导获得的红细胞。
实施例2
一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，具体操作如下：
A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞
（1）将hES细胞在6孔板中使用无饲养层的Matrigel为基质的mTeSR1培养基培养，每天更换mTeSR1培养基，培养5天，每孔细胞量达到1.5-2.5 × 106，然后进行消化细胞，消化细胞时，弃去mTeSR1培养基，用1mL细胞消化液（Cell Dissociation Buffer, 简称CDB,Gibco公司）洗一遍，弃去该细胞消化液后，再加入1mL细胞消化液，在37℃培养箱中培养8分钟，当细胞克隆呈现分离松散状态时，移去细胞消化液，每孔添加1-2mL mTeSR1培养基，这时细胞呈现漂浮状态；
（2）转移细胞至离心管并计数，调整hES细胞悬液密度为10,000 -15,000个/mL，然后接入预先铺好四型胶原的100 mm细胞培养皿，并添加终浓度为10 μM的Y27632，移至CO2培养箱培养24小时；24小时后，显微镜下检查克隆形态，可见有贴壁的克隆和小团块，也有部分漂浮的拟胚体EB；
（3）移去上述Matrigel/Y27632混合物，离心回收漂浮的拟胚体EB，每个细胞培养皿加入10 mL BVF-M培养基，放在CO2培养箱中培养，以此记为诱导的0天，保持细胞皿不移动，每两天更换BVF-M培养基；其中，所述的BVF-M培养基同实施例1；
（4）在诱导的第四天，更换BVF-M培养基后，将细胞培养皿放在CO2培养箱中继续培养2天；
（5）在第六天，采用流式细胞术检测CD31，CD34的表达量，具体操作同实施例1；按照流式细胞操作制备单细胞悬液，进行检测，CD31阳性表达比率在42.7%，CD34阳性表达率在8.9%，实验结果见图8；
B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞
（1）重悬细胞：将步骤A得到的细胞离心分离，转速为1000 rpm，离心时间为5分钟，离心后，使用Stemline II hematopietic stem cell expansion medium 重悬细胞，至细胞密度达到2–5×106个/mL；
（2）将每1.0–1.5 × 105个细胞与2.5-3 mL BGM培养基混匀，震荡10秒后静置5分钟，得到BGM-细胞混合物，使用16号针头的5 mL注射器将其分装成2.5-3 mL/管，在−20°C下保存；其中，BGM培养基同实施例1；
（3）使用16号针头的注射器将步骤（2）得到的BGM-细胞混合物加入到低吸附6孔板中，在37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，记为培养的0天；
（4）7天后，在每孔的原液面上添加2 mL BGM，不要搅动培养液中细胞克隆，继续培养4天，细胞密度保持在1–2 × 106 cells/mL；
（5）添加等体积的BGM培养液，并额外添加 3 units/ml Epo，继续培养5天；
（6）转移BGM-细胞混合物至100mm的低吸附皿中，加入等体积的Stemline IIhematopoieticstem cell expansion medium ，再添加SCF 50 ng/ml和Epo 3 unit/ml，继续培养3天；
（7）每个培养皿加入现有体积1/2 的造血干细胞培养基A，继续培养7天，培养过程中每2–3 天添加相同体积的造血干细胞培养基A，当细胞达到汇合时，按照1:3的比例将细胞分盘培养；其中，造血干细胞培养基A是以造血干细胞培养基Stemline II hematopoieticstem cellexpansion medium为基础培养液配制的，其中含有SCF 50 ng/ml，Epo 3 unit/ml，甲基纤维素0.5%；以保持细胞的快速增长；
（8）为了进一步富集红细胞，每个培养皿加入现有体积5倍的IMDM，离心收集细胞，离心转速1000rpm，离心时间5分钟，重复此步骤1次后，使用添加0.5% BSA的IMDM进行重悬细胞，并接入组织培养瓶过夜培养，收集红细胞；
（9）为了进一步成熟红细胞，使用添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34SCF培养基进行重悬细胞，保持细胞密度在1.5 - 2.5×106个/mL，继续培养6天，每2天更换添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34 SCF培养基，此阶段仍为细胞仍为悬浮细胞，每次更换培养基时需经过短暂离心收集；
（10）收集细胞，使用仅添加3 unit/mL Epo的StemPro-34培养基继续培养5天，即得成熟红细胞。
采用RT-qPCR检测最终得到的细胞群体中beta-，Gamma-，Epsilon-globin的表达，细胞群体中Beta-globin表达含量标志着完全成熟红细胞所占比例为 20 %，结果见图9所示。

Claims (10)

1.一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A. 人多能干细胞诱导分化为CD31、CD34的造血祖细胞：诱导使用的人多能干细胞均为无饲养层的培养基1体系，培养人多能干细胞后，接入预先铺好四型胶原的培养皿中，移入CO2培养箱培养24小时后，更换BVF-M培养基，记为0天，然后每两天更换BVF-M培养基，培养6天；
B. CD31、CD34的造血祖细胞诱导分化为人成熟血细胞：将步骤A获得的细胞重悬后与BGM培养基混匀，加入6孔板中，置于CO2培养箱中进行培养；
其中，所述培养基1为以Matrigel为基质的mTeSR1培养基；
步骤A所述的BVF-M培养基以Stemline II hematopoietic medium为基础培养液配制成的，含有BMP4 50 ng/mL、VEGF 50 ug/mL、bFGF 50 ng/mL；
步骤B所述的BGM培养基含有：100 mL hematopoietic CFC medium与1 mL 青霉素和链霉素混合、100 µL 浓度为50 ug/mL 的VEGF、200 µL浓度25 ug/mL 的Flt3 ligand和250 µL浓度为8 ug/mL 的bFGF。
2.根据权利要求1所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：所述的人多能干细胞为hES或iPS。
3.根据权利要求1或2所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：步骤A的具体操作为：
（1）将人多能干细胞在6孔板中使用无饲养层的培养基1培养，每天更换培养基1，培养4-5天，每孔细胞量达到1.5-2.5 × 106，然后进行消化细胞，弃去培养基，用1mL细胞消化液洗一遍，弃去细胞消化液后，再加入1mL细胞消化液，在37℃培养箱中培养7-8分钟，当细胞克隆呈现分离松散状态时，移去细胞消化液，每孔添加1-2mL培养基1，使细胞呈现漂浮状态；
（2）转移细胞至离心管，调整细胞悬浮液密度，然后接入预先铺好四型胶原的细胞培养皿，并添加浓度为10 μM的ROCK通路抑制剂，移至CO2培养箱培养24小时；
（3）移去上述培养基1和ROCK通路抑制剂，回收漂浮的拟胚体，加入10mL BVF-M培养基，在培养箱中进行培养，记为诱导的0天，每两天更换BVF-M培养基；
（4）在诱导的第四天，更换BVF-M培养基后，将细胞培养皿放在CO2培养箱中继续培养2天；
（5）在第六天，采用流式细胞术检测CD31、CD34的表达量。
4.根据权利要求1或2所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：步骤B的具体操作为：
（1）重悬细胞：将步骤A得到的细胞离心分离后，使用造血干细胞培养基重悬细胞，至细胞密度达到2–5 × 106个/mL；
（2）将每1.0–1.5 × 105个细胞与2.5-3 mL BGM培养基混匀，震荡10秒后静置5-10分钟，得到BGM-细胞混合物，将其分装成2.5-3 mL/管，在−20°C下保存；
（3）将步骤（2）得到的BGM-细胞混合物加入到低吸附6孔板中，在37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，记为培养的0天；
（4）培养6-7天后，在每孔的原液面上添加2mL BGM培养基，继续培养3-4天；
（5）添加4 mL BGM培养液，再添加Epo 3 units/ml ，继续培养5天；
（6）转移BGM-细胞混合物至低吸附皿中，加入8 mL造血干细胞培养基，再添加SCF 50ng/ml和Epo 3 unit/ml，继续培养3天；
（7）每个培养皿加入现有体积1/2 的造血干细胞培养基A，继续培养7天，培养过程中每2–3 天添加相同体积的造血干细胞培养基A，当细胞达到汇合时，按照1:3的比例将细胞分盘培养；其中，造血干细胞培养基A是以造血干细胞培养基为基础培养液配制的，其中含有SCF 50 ng/ml，Epo 3 unit/ml，甲基纤维素0.5%；
（8）每个培养皿加入现有体积5倍的IMDM，离心收集细胞，重复此步骤1次后，使用添加0.5% BSA的IMDM进行重悬细胞，并接入组织培养瓶过夜培养，收集红细胞；
（9）使用添加SCF 50 ng/mL和Epo 3 unit/mL的StemPro-34 SCF培养基进行重悬细胞，保持细胞密度在2 × 106 个/mL，继续培养6天，每2天更换添加SCF 50 ng/mL和Epo 3unit/mL的StemPro-34 SCF培养基；
（10）收集细胞，使用仅添加3 unit/mL Epo的StemPro-34培养基继续培养4–5天，即得成熟红细胞。
5. 根据权利要求3所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为hES，步骤（2）中调整细胞悬浮液密度为10000 -15000个/mL，步骤（3）所述的培养箱为CO2培养箱。
6. 根据权利要求3所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为iPS，步骤（2）中调整细胞悬浮液密度为30000-40000个/mL，步骤（3）所述的培养箱为5% O2培养箱。
7.根据权利要求3所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：所述ROCK通路抑制剂为Y27632。
8.根据权利要求4所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：步骤（1）中离心的转速为1000rpm，离心时间为5分钟。
9.根据权利要求4所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：步骤（8）中离心的转速为1000rpm，离心时间为5-15分钟。
10. 根据权利要求4所述的一种建立人多能干细胞诱导分化为成熟血细胞的方法，其特征在于：所述的造血干细胞培养基为Stemline II hematopoieticstem cell expansionmedium。
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