JP2017536341A - 卵巣がんの処置における使用のためのCD3εおよびROR1に対する二特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
CD3イプシロンおよびROR1に対する二特異性抗体は、卵巣がんの処置における使用に有用である。この二特異性抗体は、抗CD3ε抗体の1つのFab断片(CD3 Fab)と、抗ROR1抗体の1つまたは2つのFab断片(ROR1 Fab)と、0または1つのFc断片とを含み得る。この二特異性抗体は、二価であり得、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含み得、またはこの二特異性抗体は、三価であり得、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する抗体の一価Fab断片とを含み得る。
Description
本発明は、卵巣がんの処置における使用のための、CD3εおよびROR1に対する二特異性抗体、そのような医薬および処置方法に関する。
(発明の背景)
ROR1(同義語:チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ROR1、EC=2.7.10.1、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連1、UniProtKB Q01973)はチロシン−プロテインキナーゼ受容体である。この受容体は、Masiakowski P、Carroll R.D.、J. Biol. Chem. 267巻:26181〜26190頁(1992年)「A novel family of cell surface receptors with tyrosine kinase-like domain」において記載されている。WO9218149およびWO9527060では、Rtk−2としてROR−1、およびROR−1に対する抗体について言及されている。WO2002087618では、がんの増殖および分化を、増殖因子受容体を選択的に阻害することによって制御する方法について言及されている。このような受容体は、Ror1またはRor2でありうる。WO2005100605では、乳がんに対する治療標的としてのROR1、ならびに、ROR1、ROR1の細胞外領域(M1〜V406)およびROR1断片Q73〜V139、E165〜I299、K312〜C391に特異的に結合する抗ROR1抗体について言及されている。WO2007051077は、抗ROR1抗体およびリンパ腫細胞検出におけるその使用に関する。WO2008103849でも抗ROR1抗体について言及されている。Rabbani、Blood(ASH Annual Meeting Abstracts)2010年116巻:要約916)には、慢性リンパ球性白血病(CLL)の処置のための抗ROR1抗体の使用が開示されている。Rabbaniは、抗ROR1である、細胞外ドメインに対する抗体、CRD領域(Wntタンパク質のリガンド結合性部位)に対する抗体およびクリングルドメインに対する抗体を使用した。Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁は、細胞外ドメイン断片WNISSELNKDSYLTL(配列番号18)に結合する抗ROR1抗体および細胞内ドメイン断片KSQKPYKIDSKQAS(配列番号20)に結合する抗ROR1抗体に関する。CLLの処置のための、このような抗体の使用に関しても言及されている。
ROR1(同義語:チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ROR1、EC=2.7.10.1、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連1、UniProtKB Q01973)はチロシン−プロテインキナーゼ受容体である。この受容体は、Masiakowski P、Carroll R.D.、J. Biol. Chem. 267巻:26181〜26190頁(1992年)「A novel family of cell surface receptors with tyrosine kinase-like domain」において記載されている。WO9218149およびWO9527060では、Rtk−2としてROR−1、およびROR−1に対する抗体について言及されている。WO2002087618では、がんの増殖および分化を、増殖因子受容体を選択的に阻害することによって制御する方法について言及されている。このような受容体は、Ror1またはRor2でありうる。WO2005100605では、乳がんに対する治療標的としてのROR1、ならびに、ROR1、ROR1の細胞外領域(M1〜V406)およびROR1断片Q73〜V139、E165〜I299、K312〜C391に特異的に結合する抗ROR1抗体について言及されている。WO2007051077は、抗ROR1抗体およびリンパ腫細胞検出におけるその使用に関する。WO2008103849でも抗ROR1抗体について言及されている。Rabbani、Blood(ASH Annual Meeting Abstracts)2010年116巻:要約916)には、慢性リンパ球性白血病(CLL)の処置のための抗ROR1抗体の使用が開示されている。Rabbaniは、抗ROR1である、細胞外ドメインに対する抗体、CRD領域(Wntタンパク質のリガンド結合性部位)に対する抗体およびクリングルドメインに対する抗体を使用した。Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁は、細胞外ドメイン断片WNISSELNKDSYLTL(配列番号18)に結合する抗ROR1抗体および細胞内ドメイン断片KSQKPYKIDSKQAS(配列番号20)に結合する抗ROR1抗体に関する。CLLの処置のための、このような抗体の使用に関しても言及されている。
Zhang H.ら、SCIENTIFIC REPORTS、4巻:5811頁、DOI:10.1038/srep05811(2014年7月24日)では、ROR1タンパク質の発現がヒト卵巣がんにおける臨床転帰不良と相関することが報告されている。
WO2011159847は、リンパ腫または腺癌のようなROR1がんの処置のための、生物活性分子とのコンジュゲートとしての抗ROR1抗体に関する。WO2008076868、WO2008103849、WO201008069、WO2010124188、WO2011079902、WO2011054007、WO2011159847、WO2012076066、WO2012076727、WO2012045085、およびWO2012097313もROR1結合性分子または抗ROR1抗体に関する。WO2012075158は、軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2の配列、および可変重鎖ドメイン(VH)として配列番号6の配列、およびそれぞれのCDRとして配列番号3、4、5、7、8、9の配列を含む抗ROR1抗体に関する。この抗体は、さらに、MAB1とも称される。
WO2005040413は、ROR1を含めた受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定および/または検証するためのスクリーニング方法を対象とする。
WO2008036449、WO2011014659およびWO2011050262では、1つの標的がROR1でありうる二特異性抗体について言及されている。WO2007146968では、エフェクター機能を有する多価単鎖結合性タンパク質について言及されており、ROR1およびCD3が可能性のある標的として言及されている。WO2011054007は、ROR1の細胞外ドメインに結合するアフィニティー試薬を投与する、がんの処置方法を対象とする。CD3との二特異性抗体も言及されている。WO2014031174では、ROR1の2つの異なるエピトープに特異的な二特異性抗体について言及されている。好ましい抗体D10は、MDA MB 231上皮乳腺癌において、37℃で強力に内部化する。YangおよびBaskar PLos ONE 6巻(2011年)e21018頁では、WO2012075158と同じく、抗ROR1抗体R12についても言及されている。Rebagay R.ら、Frontiers in Oncology(2012年)7巻、論文番号34、1〜8頁では、RORが、医薬の標的であり、また、細胞傷害作用薬剤を、細胞表面上に標的を発現する細胞中に送達するための手段であることが言及されている。Rebagayは、BiTEなどの二特異性抗体についても言及している。Rebagayによると、強力な内部化は、武装抗体、すなわち抗体薬物コンジュゲートに有利である。D. MEZZANZANICAら、INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER、41巻(1988年)609〜615頁では、MOv18(ヒト卵巣癌細胞に特異的な、あまり内部化しない抗体)および抗CD3抗体(OKT3またはTR66)からなる二特異性抗体によってCTLを再ターゲティングすることによる治療的手法が調査されている。M.HUDECEKら、BLOOD、116巻(2010年)、4532〜4541頁では、ROR1がB細胞性慢性リンパ球性白血病(B−CLL)およびマントル細胞リンパ腫(MCL)により発現されることが言及されている。このような細胞は、マウス抗ROR1抗体2A2由来のscFvをトランスフェクトし発現させた活性化CD8+T細胞によってターゲティングされうる。このような細胞は、B細胞悪性腫瘍の処置に有用である。Baskar S.ら、mAbs 4:3巻(2012年)349〜361頁は、PE38毒素とコンジュゲートしたscFv 2A2抗ROR1を含む免疫毒素BT−1を用いて悪性B細胞をターゲティングすることに関する。この免疫毒素は、部分的に内部化し、アポトーシスを誘導する。PCT/EP2014/057199は、CD3およびROR1に対する二特異性抗体に関する。EP14188378は、CD3およびROR1に対する二特異性抗体の電荷変異体に関する。
Tリンパ球のTCR/CD3複合体は、ガンマ(γ)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ゼータ(ζ)、およびイータ(η)と標識されるCD3の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、TCRアルファ(α)/ベータ(β)ヘテロ二量体またはTCRガンマ(γ)/デルタ(δ)ヘテロ二量体からなる。ヒトCD3εは、UniProt P07766(CD3E_HUMAN)下に記載されている。最先端技術において記載されている抗CD3ε抗体は、SP34(Yang SJ、The Journal of Immunology(1986年)、137巻:1097〜1100頁)である。SP34は、霊長動物CD3およびヒトCD3のいずれとも反応する。SP34は、PharMingen(登録商標)から入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗CD3抗体は、UCHT−1(WO2000041474を参照されたい)である。最先端技術において記載されている、さらなる抗CD3抗体は、BC−3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute;GvHDについてのフェーズI/II試験において使用された;Anasettiら、Transplantation、54巻:844頁(1992年))である。
最近では、例えば、IgG抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている(Kontermann RE、mAbs、4巻:2号(2012年)、1〜16頁を参照されたい)。可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1を、互いに置きかえた二特異性抗体については、WO2009080251およびWO2009080252において記載されている。
誤対合副生成物の問題を回避する手法であって、「KIH(knob−into−hole)」として公知である手法は、接触界面を修飾するように、突然変異を、CH3ドメインへと導入することにより、2つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目的とする(Ridgway JB, Presta LG, Carter P;およびWO1996027011、Merchant A.M.ら、Nature、Biotech、16巻(1998年)、677〜681頁;Atwell S、Ridgway JB、Wells JA、Carter P.、J Mol Biol、270巻(1997年)、26〜35頁、EP 1870459A1、Xie,Z.ら、J Immunol Methods、286巻(2005年)、95〜101頁、WO2012116927、WO2010145792、WO2009080254)。WO2006093794は、ヘテロ二量体のタンパク質結合性組成物に関する。WO199937791は、多目的の抗体誘導体について記載している。Morrison,S.L.ら、J.Immunol.、160巻(1998年)、2802〜2808頁は、可変領域ドメイン交換の、IgGの機能的特性に対する影響に言及している。
WO201302362は、ヘテロ二量体化されたポリペプチドに関する。WO201312733は、ヘテロ二量体のFc領域を含むポリペプチドに関する。WO2012131555は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。EP2647707は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253、WO2009080254、およびSchaefer,W.ら、PNAS、108巻(2011年)、11187〜1191頁は、ドメインのクロスオーバーを伴う、二特異性の二価IgG抗体に関する。
卵巣がんは、米国における婦人科がんによる死亡の主な原因であり、また、女性において、最も一般的ながんの第7位であり、最も一般的ながんによる死亡の原因の第8位である。2014年に米国において予測される卵巣がんの新規症例は、推定21,980件であり、卵巣がんに関連する死亡は、14,270件である。世界的には、ほぼ225,000名の女性が卵巣がんと診断され、140,000名超がこの疾患により死亡すると思われる(Cancer Facts & Figures 2014;http://www.cancer.org)。卵巣がんの発生率は年齢と共に上昇し、70代で有病率が最も高い。卵巣がんと診断される女性の約半分が63歳またはそれ超である。卵巣がんは、通常、予後が比較的不良である。限局性の段階で診断された場合には5年生存率が92%であるが、この段階で検出されるのは全症例の15%に過ぎない。大多数の症例(61%)は、疾患が既に転移した後に診断される。遠隔転移の診断を受けた女性については、5年生存率は27%である。過去20年にわたる外科手術および化学療法の進歩にも拘らず、卵巣がんの患者における全生存の改善に関してはわずかな進展しか得られていない。進行卵巣がんを有する大多数の女性は第一選択の化学療法に応答するが、ほとんどの応答は長続きしない。患者の80%超に、第一選択の処置後に疾患が再発し、50%超が、診断されてから5年以内に再発疾患により死亡する(http://www.cancerresearch.org)。標的療法は、薬物または他の物質を使用してがん細胞を同定および攻撃するが、正常細胞にはほとんど損傷を与えない、より新しい型のがん治療である。卵巣がんにおいて最も研究されている標的療法薬はベバシズマブ(Avastin(登録商標))である。ベバシズマブは、進行卵巣がんの成長を縮小するまたは遅くすることが研究において示されている。ベバシズマブが、化学療法と共にもたらされた場合により一層良好に働くかどうかを検討するための試験では、腫瘍の縮小(または腫瘍の成長の阻止)については良好な結果が示されているが、女性の寿命を延ばすことへの補助は未だ示されていない(http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer)。
したがって、卵巣がんの処置のための、さらなる手法が必要とされている。
Masiakowski P、Carroll R.D.、J. Biol. Chem. 267巻:26181〜26190頁(1992年)「A novel family of cell surface receptors with tyrosine kinase−like domain」
Rabbani、Blood(ASH Annual Meeting Abstracts)2010年116巻:要約916
Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁
Zhang H.ら、SCIENTIFIC REPORTS、4巻:5811頁、DOI:10.1038/srep05811(2014年7月24日)
YangおよびBaskar PLos ONE 6巻(2011年)e21018頁
Rebagay R.ら、Frontiers in Oncology(2012年)7巻、論文番号34、1〜8頁
D. MEZZANZANICAら、INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER、41巻(1988年)609〜615頁
M.HUDECEKら、BLOOD、116巻(2010年)、4532〜4541頁
Baskar S.ら、mAbs 4:3巻(2012年)349〜361頁
Yang SJ、The Journal of Immunology(1986年)、137巻:1097〜1100頁
Anasettiら、Transplantation、54巻:844頁(1992年)
Kontermann RE、mAbs、4巻:2号(2012年)、1〜16頁
Merchant AMら、Nature、Biotech、16巻(1998年)、677〜681頁
Atwell S、Ridgway JB、Wells JA、Carter P.、J Mol Biol、270巻(1997年)、26〜35頁
Xie,Z.ら、J Immunol Methods、286巻(2005年)、95〜101頁
Morrison,S.L.ら、J.Immunol.、160巻(1998年)、2802〜2808頁
(発明の要旨)
本発明は、卵巣がんの処置における使用のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体に関する。処置は、卵巣がんを患う患者において行われる。
本発明は、卵巣がんの処置における使用のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体に関する。処置は、卵巣がんを患う患者において行われる。
本発明は、卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体の使用に関する。
本発明は、卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、治療有効量の、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体を投与するステップを含む方法に関する。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、抗CD3抗体の1つのFab断片(CD3 Fab)と、抗ROR1抗体の1つまたは2つのFab断片(ROR1 Fab)と、0または1つのFc断片とからなることを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価であり、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する抗体の一価Fab断片とを含むことを特徴とすることが好ましい。
CD3 Fabの軽鎖および重鎖内の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられていることが好ましい(CD3 crossFab)。CD3 Fabは、N末端において、ROR1 FabのC末端に連結されている。CD3 FabのVHドメインは、N末端において、ROR1 FabのCH1ドメインのC末端に連結されていることが好ましい。Fcパートは、そのヒンジ領域を介して、それぞれのFabのC末端に連結されている。本発明に従って使用される二特異性抗体は、構築物、
a)CD3 Fab−ROR1 Fab、
b)CD3 Fab−ROR1 Fab−ROR1 Fab、
c)Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab、および
d)ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab
の群から選択されることが好ましい。
a)CD3 Fab−ROR1 Fab、
b)CD3 Fab−ROR1 Fab−ROR1 Fab、
c)Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab、および
d)ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab
の群から選択されることが好ましい。
好ましい構築物は、CD3 Fabとして、CD3 crossFabを含む。構築物b)およびd)の2つのROR1 Fabは、同じ抗ROR1抗体に由来し、少なくとも、同じCDRまたは同じVH、VL、CH1、およびCLドメインを含む。
好ましい二特異性抗体を図1に示す。
構築物は、配列番号30〜36の構成ブロックから構成される。したがって、本発明は、配列番号30、31、32、33、34、35、および36のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、それぞれの核酸、および構築物の調製のためのそれらの使用を含む。
本発明はさらに、
a)構成ブロック、配列番号30(2×)、31、32、および33からなる構築物(図1A)
b)構成ブロック、配列番号30、31、33、および36からなる構築物(図1B)
c)構成ブロック、配列番号30(2×)、33、および35からなる構築物(図1C)
d)構成ブロック、配列番号30、33、および34からなる構築物(図1D)
の群から選択される構築物にも関する。
a)構成ブロック、配列番号30(2×)、31、32、および33からなる構築物(図1A)
b)構成ブロック、配列番号30、31、33、および36からなる構築物(図1B)
c)構成ブロック、配列番号30(2×)、33、および35からなる構築物(図1C)
d)構成ブロック、配列番号30、33、および34からなる構築物(図1D)
の群から選択される構築物にも関する。
さらなる実施形態では、配列番号31、33、34、35内のCD3 Mab配列(VHおよび/またはVL)が、配列番号21および22のそれぞれのVHおよび/またはVL配列により置きかえられている。
本発明は、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体であって、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、二特異性抗体に関する。
あるいは、二特異性抗体は、Fabの代わりに、同じドメインからなる単鎖を含みうる。このような場合では、可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置きかえられていない。
本発明のさらに好ましい実施形態では、二特異性抗体は、単鎖抗体である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、二特異性抗体は、単一のポリペプチド鎖上に2つの抗体可変ドメインを含み、二特異性抗体の第1の部分は、1つの抗体可変ドメインからなり、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することが可能であり、二特異性抗体の第2の部分は、ROR1に特異的に結合することが可能である。第2の部分は、抗ROR1抗体可変ドメインを1つ含むことが好ましい。第2の部分は、抗ROR1抗体可変ドメインを2つ含むことが好ましい。前記第1の部分は、ヒトCD3εに特異的に結合することが好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。二価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。CD3に特異的に結合する一価抗体は、Fab断片、好ましくは、CD3 crossFabであることが好ましい。このような二価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価抗体であり、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。CD3に特異的に結合する一価抗体は、Fab断片または好ましくは、CD3 crossFabであることが好ましい。三価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、37℃で24時間の間、内部化しないことを特徴とすることが好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、0.1pM〜200nMの間の濃度で使用した場合、内部化しないことが好ましい。
本発明のさらなる実施形態は、表面プラズモン共鳴を使用してKd値により決定される、ROR1とCD3のアフィニティー比が5000:1〜5:1である、本発明に従って使用される抗体である。このような抗体は、悪性細胞への結合がT細胞よりも強力であるので、好都合である。Kd値は、CD3抗体については約100nMであり、ROR1抗体については約50pM〜50nMであることが好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、CD3に特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「CD3−Fab」とも称する)と、ROR1に特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「ROR1−Fab」とも称する)と、Fcパートとからなり、CD3−FabおよびROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されている(図1E)。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、CD3−FabおよびROR1−Fabが、それらのC末端を介して、Fcパートのヒンジ領域へと連結されている1つのCD3−Fabと、1つのROR1−Fabと、前記Fcパートと、C末端によりCD3−FabのN末端へと連結された第2のROR1−Fabとからなる。CD3−Fabは、クロスオーバーを含む(図1A)。ROR1−Fab−Fc−CD3−Fab−ROR1−Fabを含む二特異性抗体であって、CD3−Fabが、CL/CH1クロスオーバーを含む二特異性抗体がとりわけ好ましい(図1A)。両方のROR1−FabがCDRとして抗体MAB1のCDR、またはVH/VLとして、MAB1のVH/VLを含むことが、とりわけ好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、2つのROR1−Fabと、Fcパートとからなり、ROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域およびそのC末端により1つのROR1−FabのN末端へと連結されたCD3−Fabへと連結されている。CD3−Fabは、クロスオーバーを含む(図1F)。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、そのC末端を介して前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された1つのCD3−Fabと、そのC末端によりCD3−FabのN末端へと連結されたROR1−Fabとからなる。CD3−Fabは、クロスオーバーを含む(図1B)。
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、そのC末端を介して前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された1つのROR1−Fabと、そのC末端によりROR1−FabのN末端へと連結されたCD3−Fabとからなる。CD3−Fabは、クロスオーバーを含む(図1G)。
Fab断片は、最先端技術に従う、適切なリンカーの使用により、一緒に化学的に連結される。適切なリンカーは、例えば、US20140242079に記載される。(Gly4−Ser1)2(配列番号19)リンカーを使用することが好ましい(Desplancq DKら、Protein Eng.、1994年8月、7巻(8号):1027〜33頁;およびMack M.ら、PNAS、1995年7月18日、92巻、15号、7021〜7025頁)。2つのFab断片の間の連結は、重鎖の間で実施する。したがって、第1のFab断片のCH1のC末端を、第2のFab断片のVHのN末端(クロスオーバーなし)、またはVL(クロスオーバー)へと連結する。Fab断片とFcパートとの間の連結は、CH1とCH2との間の連結として実施する。
ROR1に特異的に結合する、抗体の第1および第2のFab断片は、同じ抗体に由来することが好ましく、CDR配列、可変ドメイン配列VHおよびVL、ならびに/または定常ドメイン配列CH1およびCLが同一であることが好ましい。ROR1に特異的に結合する、抗体の第1および第2のFab断片のアミノ酸配列は、同一であることが好ましい。ROR1抗体は、抗体MAB1のCDR配列を含む抗体、抗体MAB1のVHおよびVL配列を含む抗体、または抗体MAB1のVH、VL、CH1、およびCL配列を含む抗体であることが好ましい。
二特異性抗体は、Fab断片およびFcパートとして、抗CD3抗体の1つを超えないFab断片、抗ROR1抗体の2つを超えないFab断片、および1つを超えないFcパート、好ましくは、ヒトFcパートを含むことが好ましい。抗ROR1抗体の第2のFab断片は、そのC末端を介して、抗CD3抗体のFab断片のN末端、またはFcパートのヒンジ領域のいずれかへと連結されていることが好ましい。連結は、ROR1−FabのCH1とCD3−FabのVHとの間で実施する(CL/CH1クロスオーバー)ことが好ましい。
本発明のさらなる実施形態では、本発明に従う二特異性抗体は、
a)構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの二特異性抗体であり、
b)抗CD3抗体のFab断片内に、CL/CH1クロスオーバーを含み、
c)ヒトIgG1 Fcパートを含み、
d)Fcパート内に、Pro329のグリシンによる置換ならびにLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含む。
a)構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの二特異性抗体であり、
b)抗CD3抗体のFab断片内に、CL/CH1クロスオーバーを含み、
c)ヒトIgG1 Fcパートを含み、
d)Fcパート内に、Pro329のグリシンによる置換ならびにLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を含む。
ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Fab断片は、配列番号12、13、および14の重鎖CDRを、それぞれ、抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16、および17の軽鎖CDRを、それぞれ、抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Fab断片は、配列番号23、24、および25の重鎖CDRを、それぞれ、抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号26、27、および28の軽鎖CDRを、それぞれ、抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号21および22(VHVL MAB CD3)の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
ヒトROR1に特異的に結合する、抗体部分、好ましくは、Fab断片は、重鎖CDR、配列番号7のCDR1H、配列番号8のCDR2H、配列番号9のCDR3Hを含む可変ドメインVHを含むことと、軽鎖CDR、配列番号3のCDR1L、配列番号4のCDR2L、配列番号5のCDR3Lを含む可変ドメインVLを含むこととを特徴とする(CDR MAB1)ことが好ましい。
ヒトROR1に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Fab断片は、配列番号6のVHと配列番号2のVLとを含むことを特徴とする(VHVL MAB1)ことが好ましい。
本発明はさらに、それぞれの重鎖および軽鎖セットをコードする核酸セットにも関する。
IgG1サブクラスの定常重領域CH2/CH3を含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、FcRおよびC1qへの結合を回避し、ADCC/CDCを最小化するように、突然変異L234A、L235A、およびP239G(Kabatに従う番号付け)を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、T細胞をリダイレクションし/活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびFcRを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
本発明に従って使用される抗体は、配列番号37の(N末端からC末端へ)VH(ROR1)−CH1(ROR1)−VH(CD3)−CL(CD3)−CH2−CH3からなる抗体の重鎖のほか、それぞれのコード核酸も含むことが好ましい。これらのポリペプチドおよびそれぞれの核酸は、本発明に従って使用される二特異性抗体を作製するために有用である。
本発明に従って使用される二特異性抗体のCDRの外部におけるアミノ酸(aa)交換(「電荷変異体」とさらに言及される)は、ROR1への結合などの生物学的特性を変化させずに、作製/精製の大幅な改善をもたらす。アミノ酸交換(電荷変異体)を導入することにより、軽鎖LCの誤対合および作製時における副産物の形成が有意に低減され、したがって、精製が容易になる。
本発明は、2つの標的、ヒトCD3ε、およびヒトROR1の細胞外ドメインに特異的に結合する、内部化しない二特異性抗体の使用に関することが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましく、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される二特異性抗体の、ROR1陽性初代B−CLL細胞への結合時における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。二価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。CD3に特異的に結合する一価抗体は、Fab断片、好ましくは、CD3 crossFabであることが好ましい。このような二価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価抗体であり、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。CD3に特異的に結合する一価抗体は、Fab断片または好ましくは、CD3 crossFabであることが好ましい。三価抗体は、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないものであれば、好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、37℃で24時間の間、内部化しないことが好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、0.1pM〜200nMの間の濃度で使用した場合、内部化しないことが好ましい。
本発明のさらなる実施形態は、表面プラズモン共鳴を使用してKd値により決定される、ROR1とCD3のアフィニティー比が5000:1〜5:1である、本発明に従って使用される抗体である。このような抗体は、悪性細胞への結合がT細胞よりも強力であるので、好都合である。Kd値は、CD3抗体については約100nMであり、ROR1抗体については約50pM〜50nMであることが好ましい。
CD3に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従うCD3 Mabは、抗体H2C(WO2008119567において記載されている)および/もしくは抗体CH2527(WO2013026839において記載されている)と同じCD3εのエピトープに結合するか、または好ましくは抗体H2CもしくはCH2527であることが好ましい。
ROR1に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)が、それぞれの可変軽鎖CDRとして配列番号3、4、5のCDRを含み、可変重鎖ドメイン(VH)が、それぞれの可変重鎖CDRとして配列番号7、8、9のCDRを含むことを特徴とすることが好ましい。ROR1に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2の配列と少なくとも90%同一である配列、および可変重鎖ドメイン(VH)として配列番号6の配列と少なくとも90%同一である配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ROR1に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2の配列、および可変重鎖ドメイン(VH)として配列番号6の配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ROR1に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用されるROR1 Mabは、上で記載したMabと同じROR1のエピトープに結合することが好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、宿主細胞を、それぞれの抗体または断片をコードする核酸分子を含む1つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップとによって生成される。
本発明に従って使用される二特異性抗体を調製するための方法は、
a)宿主細胞を、本発明に従って使用される抗体の重鎖および軽鎖のセットをコードする核酸分子を含む1つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、
b)宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
c)前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含むことが好ましい。
a)宿主細胞を、本発明に従って使用される抗体の重鎖および軽鎖のセットをコードする核酸分子を含む1つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、
b)宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
c)前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含むことが好ましい。
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従って使用される抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
本発明のさらなる実施形態は、第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターと、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターとを含む宿主細胞であって、可変ドメインVLおよびVHが互いに置きかえられている宿主細胞である。
本発明のさらなる好ましい実施形態は、このような抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明のさらなる好ましい実施形態は、医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、ROR1陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。ROR1は、ヒト卵巣がんにおいて、mRNAレベルおよびタンパク質レベルで発現される(Zhang H.ら、Scientific Reports、4巻:5811頁、DOI: 10.1038/srep05811(2014年7月24日)。本発明のさらなる実施形態は、ROR1を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明の好ましい実施形態は、卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。
本発明のさらなる実施形態は、このような処置のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物の使用である。
本発明に従う抗体または医薬組成物は、週1回または週2回、好ましくは、皮下投与によって(例えば、好ましくは、週1回または週2回、0.1〜10mg/m2の用量範囲で)投与することが好ましい。本発明に従う抗体は、細胞傷害作用活性が優れているので、T細胞二特異性ではない(すなわち、1つのアーム上のCD3に結合しない)従来の単一特異性抗体または従来の二特異性抗体と比較して、より小さな大きさの臨床的用量範囲で投与することができる。本発明に従う抗体に関して、皮下投与が臨床状況において好ましいことが想定される(例えば、週1回または週2回、0.1〜10mg/m2の用量範囲で)。本発明に従う抗体は、週に少なくとも1回または2回の投与を可能にする、およそ数日の半減期で消失する。本発明に従う抗体の別の利点は、分子量(すなわち、およそ150〜200kDa)が腎臓での濾過のサイズ限界(50〜70kDa)よりも大きいことである。この分子量は、長い消失半減期を可能とし、週1回または週2回の皮下投与を可能とする。
本発明に従う抗体は、1mg/kg体重(BW)の用量で、週2回または週に1回、静脈内(i.v.)、または皮下(s.c.)、または腹腔内(i.p.)投与され、好ましくは、0.5mg/kg BWで、週2回または週に1回、i.v.またはi.p.またはs.c.投与され、好ましくは、0.1mg/kg BWで、週2回または週に1回、i.v.またはi.p.またはs.c.投与され、好ましくは、0.05mg/kg BWで、週2回または週に1回、i.v.またはi.p.またはs.c.投与され、好ましくは、0.01mg/kg BWで、週2回または週に1回、i.v.またはi.p.またはs.c.投与され、好ましくは、5μg/kg BWで、週2回または週に1回、i.v.またはi.p.またはs.c.投与され、ROR1発現卵巣腫瘍細胞系(例えば、PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626)(好ましくはPA−1および/またはCOLO−704)を用いた異種移植モデルにおいて、70%を超え、好ましくは85%を超え、好ましくは100%に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、12時間より長い、好ましくは、3日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましい。
本発明に従う抗体は、ROR1陽性卵巣がん細胞系(例えば、PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626)、好ましくは、PA−1および/またはCOLO−704への結合についてのEC50値であって、30nMまたはそれを下回る、好ましくは、15nMおよびそれを下回るEC50値を示すことを特徴とすることが好ましい。
本発明に従う抗体は、ヒトT細胞の存在下における、ROR1を発現する卵巣腫瘍細胞(例えば、PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626)、好ましくは、PA−1および/またはCOLO−704のリダイレクトされた殺滅を、10nM未満、好ましくは、1nM、好ましくは、0.05nM、好ましくは、0.02nM、好ましくは、0.002nMおよびそれを下回るEC50で誘導するその能力によって特徴付けられることが好ましい。
本発明に従う抗体は、標準的な製剤緩衝液中、37℃で、好ましくは、40℃で、10日間、好ましくは、最長2週間、好ましくは、最長4週間、保存された前記抗体が、高分子量(HMW)分子種および/または低分子量(LMW)分子種および/または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−80℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、10%を超える変化(Δ)、好ましくは、5%を超える変化(Δ)を結果としてもたらさないことを特徴とすることが好ましい。
(発明の詳細な説明)
本明細書で使用される「ROR1」という用語は、チロシン−プロテインキナーゼ受容体である、ヒトROR1(同義語:チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ROR1、EC=2.7.10.1、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連1、UniProtKB Q01973)に関する。ROR1の細胞外ドメインは、UniProtに従い、アミノ酸30〜406からなる。本明細書で使用される「ROR1に対する抗体、抗ROR1抗体またはROR1 Mab」という用語は、ヒトROR1に特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、ROR1の細胞外ドメイン(配列番号1のアミノ酸M1〜V406)に特異的に結合する。この抗体は、Ig様C2型ドメイン(配列番号1のアミノ酸Q73〜V139)、frizzledドメイン(配列番号1のアミノ酸E165〜I299)、またはクリングルドメイン(配列番号1のアミノ酸K312〜C391)である、細胞外ドメインの断片に特異的に結合する。これらの断片は、WO2005100605において言及されている。この抗体は、ROR1の細胞外ドメイン断片WNISSELNKDSYLTL(配列番号18)に特異的に結合することがさらに好ましい。この断片は、Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁において言及されている。
本明細書で使用される「ROR1」という用語は、チロシン−プロテインキナーゼ受容体である、ヒトROR1(同義語:チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ROR1、EC=2.7.10.1、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連1、UniProtKB Q01973)に関する。ROR1の細胞外ドメインは、UniProtに従い、アミノ酸30〜406からなる。本明細書で使用される「ROR1に対する抗体、抗ROR1抗体またはROR1 Mab」という用語は、ヒトROR1に特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、ROR1の細胞外ドメイン(配列番号1のアミノ酸M1〜V406)に特異的に結合する。この抗体は、Ig様C2型ドメイン(配列番号1のアミノ酸Q73〜V139)、frizzledドメイン(配列番号1のアミノ酸E165〜I299)、またはクリングルドメイン(配列番号1のアミノ酸K312〜C391)である、細胞外ドメインの断片に特異的に結合する。これらの断片は、WO2005100605において言及されている。この抗体は、ROR1の細胞外ドメイン断片WNISSELNKDSYLTL(配列番号18)に特異的に結合することがさらに好ましい。この断片は、Daneshmanesh AHら、Int. J. Cancer、123巻(2008年)1190〜1195頁において言及されている。
本明細書で使用される「CD3εまたはCD3」という用語は、UniProt P07766(CD3E_HUMAN)下に記載されているヒトCD3εに関する。「CD3に対する抗体、抗CD3抗体」という用語は、CD3εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号12、13、および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16、および17の軽鎖CDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号10(VH)および配列番号11(VL)の可変ドメインを含むことが好ましい。抗体は、配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号21(VH)および配列番号22(VL)の可変ドメインを含むことが好ましい。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、CD3の代わりに、異なる標的に特異的に結合することができ、これも、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することが可能である。
「CD3またはROR1に特異的に結合すること」とは、抗体が、CD3またはROR1のターゲティングにおいて治療剤として有用であるように、CD3またはROR1(標的)に、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗CD3またはROR1抗体が、無関係なCD3以外またはROR1以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)、例えば、Biacore(登録商標)、酵素免疫測定法(ELISA)、またはフローサイトメトリー(FACS)により測定される場合、抗体のCD3またはROR1への結合の約10分の1、好ましくは、100分の1未満である。CD3またはROR1に結合する抗体の解離定数(Kd)は、10−8Mまたはそれ未満、好ましくは、10−8M〜10−13M、好ましくは、10−9M〜10−13Mであることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、異なる種に由来するROR1の間で保存されているROR1のエピトープおよび/または異なる種に由来するCD3の間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているCD3のエピトープに結合することが好ましい。「CD3およびROR1に特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの定義を指す。ROR1(またはCD3またはROR1およびCD3)に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ELISAでは、このような無関係な標的についてのOD値は、特異的なアッセイの検出限界のOD値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、1.5pMと等しいかもしくはそれ未満、またはROR1をプレートに結合させていないか、もしくはHEK293細胞にトランスフェクトしていない対照試料のOD値と等しいかもしくはそれ未満である。
本発明に従う抗体は、プレートに結合させたROR1を使用する、ヒトROR1への結合についてのELISAにより解析する。このアッセイでは、好ましくは、1.5nMの量のプレートに結合させたROR1と、好ましくは、1pM〜200nMの範囲の濃度の抗ROR1抗体を使用する。そのROR1結合が、ROR1をプレートに結合させていないか、または本発明に従うHEK293細胞にトランスフェクトしていない対照試料のOD値よりも少なくとも20%高い本発明に従う抗体は、「ELISAアッセイにおいてヒトROR1に結合する」抗体である。
本明細書で使用される「内部化しない、本発明に従う抗体」という用語は、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性B−CLL細胞を使用して、および1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とするMFI低減特性を有する、本発明に従う二特異性抗体を意味し、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるROR1陽性細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって50%を超えて低減せず、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する。本発明に従う二特異性抗体は、ROR1陽性B−CLL細胞において内部化しない、したがって、前記抗ROR1抗体のROR1陽性B−CLL細胞への結合は、本明細書に記載の細胞ベースのアッセイにおいて、前記抗体を37℃で2時間インキュベートしたした場合に、50%を超えて低減せず、好ましくは、30%を超えて低減しない。
本発明に従う二特異性抗体はまた、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性B−CLL細胞を使用して、および1nMの抗体濃度で、37℃で2時間の間に、フローサイトメトリーにより測定される、37℃で0時間から2時間までの内部化による平均蛍光強度の低減(ΔMFI)が、同じ濃度および実験条件における、軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2の配列および可変重鎖ドメイン(VH)として配列番号6の配列を含むヒトIgG1カッパ(κ)型の抗ROR1二価抗体のΔMFIの、120%〜0%の間、好ましくは、100%〜0%であることも好ましい。
抗ROR1抗体を含むT細胞二特異性抗体を使用する治療では、上で定義した通り、腫瘍細胞とT細胞の間の安定な免疫シナプスおよび有効なT細胞媒介性のリダイレクトされた細胞傷害作用を容易にするために、抗体は内部化しないことが好ましい。
本明細書で使用される、「前記抗ROR1抗体のROR1陽性細胞への内部化」を反映する「平均蛍光強度の低減」(ΔMFI)、または「MFI低減」という用語は、式ΔMFI=100−100×[(MFI実験値−MFIバックグラウンド)/(MFI最大−MFIバックグラウンド)]を使用することにより、各ROR1抗体について、非特異的なヒトIgG対照(MFIバックグラウンド)および氷上で維持されたROR1抗体(MFI最大)と比較して計算されるMFI低減の百分率を指す。MFI実験値は、37℃で2時間のインキュベーション後の前記ROR1抗体で測定されるMFIである。10μMのエンドサイトーシス阻害剤フェニルアルシンオキシドによって少なくとも75%遮断および反転されるMFI低減は、例えば、抗体内部化によって引き起こされるのに対し、フェニルアルシンオキシドにより遮断されないMFI低減は、抗体解離によって引き起こされる。内部化する抗ROR1抗体は最先端技術において公知である(Baskarら、Clin. Cancer Res.、14巻(2号):396〜404頁(2008年))。
本発明に従う二特異性抗体は、3μMのフェニルアルシンオキシド(PAO)の存在下で2時間の時点のMFI値の、PAOの非存在下における2時間の時点のMFI値と比較した増大が、30%を超えない、好ましくは、20%を超えない、好ましくは、10%を超えない、さらには、0時間におけるMFI値の検出レベルを超えないことを特徴とすることが好ましい。
本明細書で使用される「標的」という用語は、ROR1またはCD3のいずれかを意味する。「第1の標的および第2の標的」という用語は、第1の標的としてのCD3、および第2の標的としてのROR1を意味するか、または、第1の標的としてのROR1、および第2の標的としてのCD3を意味する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」(LC)および「重鎖」(HC)の2つの対(本明細書では、このような軽鎖(LC)/重鎖対を、LC/HCと略記する)からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、HCVRまたはVHと略記する)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインCH1、CH2、およびCH3(抗体クラス:IgA、IgD、およびIgG)、任意選択で重鎖定常ドメインCH4(抗体クラス:IgEおよびIgM)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインVLおよび軽鎖定常ドメインCLを含む。可変ドメインVHおよびVLは、相補性決定領域(CDR)と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域(FR)と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で並べられる、3つのCDRおよび4つのFRから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、N末端からC末端の方向で、VL−CLと略記される、軽鎖可変ドメイン(VL)および軽鎖定常ドメイン(CL)を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー軽鎖(VH−CL)」とは、VLドメインを、それぞれのVHドメインで置きかえた軽鎖である。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、N末端からC末端の方向で、重鎖可変ドメイン(VH)および定常重鎖ドメイン1(CH1)を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー重鎖(VL−CH1)」とは、VHドメインを、それぞれのVLドメインで置きかえた重鎖である。
ヘテロ二量体化を強化する、CH3修飾のためのいくつかの手法であって、例えば、WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012058768、WO2013157954、WO2013096291において十分に記載されている手法が存在する。このような手法のいずれにおいても、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインの両方を、各CH3ドメイン(またはそれを含む重鎖)がもはや、それ自身とホモ二量体化することができず、操作された相補的な他のCH3ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように(第1のCH3ドメインと、第2のCH3ドメインとが、ヘテロ二量体化し、2つの第1のCH3ドメインまたは2つの第2のCH3ドメインの間でホモ二量体が形成されないように)相補的な形で操作することが典型的である。重鎖のヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、本発明に従う抗体内で、重鎖−軽鎖修飾(1つの結合性アーム内のCH1およびVHの交換/置きかえ)と組み合わせた異なる代替法であって、軽鎖の誤対合を低減する代替法として想定されている。
本発明の好ましい一実施形態では(本発明に従う抗体が、重鎖内にCH3ドメインを含む場合には)、本発明に従う前記多特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO96/027011、Ridgway,J.B.ら、Protein Eng.、9巻(1996年)、617〜621頁;およびMerchant,A.M.ら、Nat.Biotechnol.、16巻(1998年)、677〜681頁;WO98/050431において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「KIH(knob−into−hole)」技術により変更することができる。この方法では、これらの2つのCH3ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させるように、2つのCH3ドメインの相互作用表面を変更する。2つのCH3ドメイン(2つの重鎖の)の各々を「ノブ」としうる一方で、他は「ホール」となる。
こうして、本発明の一実施形態では、本発明に従う前記抗体は(各重鎖内にCH3ドメインを含み)、a)抗体の第1の重鎖の第1のCH3ドメインおよびb)抗体の第2の重鎖の第2のCH3ドメインの各々が、抗体のCH3ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、本発明に従う抗体の形成を促進するように変更されていることもさらに特徴とし、前記変更は、
i)本発明に従う抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
ii)本発明に従う抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、第2のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
i)本発明に従う抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
ii)本発明に従う抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面と向かい合う、第2のCH3ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)からなる群から選択されることが好ましい。
本発明の一態様では、両方のCH3ドメインは、両方のCH3ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されうるように、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン(C)の導入により、さらに変更されている。
ヘテロ二量体化を強化する、CH3修飾のための他の技法も、本発明の代替法として想定されており、例えば、WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/157953、WO2013/096291において記載されている。
一実施形態では、本発明に従う抗体は、IgG2アイソタイプの抗体であり、WO2010/129304において記載されているヘテロ二量体化法を、代替的に使用することができる。
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体(変異体または突然変異体の抗体)を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
二特異性抗体に関して本明細書で使用される「含む(comprising)」という用語は、二特異性抗体が、CD3およびROR1結合剤として、言及されているような結合剤だけを含むことを意味する。したがって、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、CD3およびROR1結合に関しては、CD3に対する結合力価は1だけであり、ROR1に対する力価は1だけであり、したがって、二価である。ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、ROR1結合に関しては結合力価が2であり、CD3結合に関しては力価が1であり、したがって、三価である。CD3に特異的に結合する一価抗体は、そのC末端において、ROR1に特異的に結合する抗体の1つの可変鎖のN末端と共有結合していることが好ましい。
本明細書で使用される「抗体のFab断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のFab断片は、2つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のFab断片は、重鎖(CH1、およびVH)および軽鎖(CLおよびVL)の各々の1つの定常ドメインおよび1つの可変ドメインから構成される。本発明に従えば、このようなドメイン対はまた、クロスオーバーのために、VH−CLおよびVL−CH1でもありうる。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Fab断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、scFv(単鎖可変断片)ではない。本発明に従う「クロスオーバー」とは、好ましくは、1つのFabドメイン内で、VLとVHとが、互いに置きかえられていることを意味する。「Fab断片」という用語は、Fab’断片のようなヒンジ領域の一部または全部も包含する。本明細書で使用される場合、「F(ab)2断片」とは、Fcパートを有することが好ましい、二価の単一特異性抗体断片を指す。
本発明中で使用される「ROR1 Fab」という用語は、ROR1に特異的に結合する抗体のFab断片を指す。抗ROR1抗体Fab断片(ROR1 Fab)内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなROR1 Fabは、「ROR1 cross Fab」または「クロスオーバーROR1 Fab断片」と称される。本発明に従って、ROR1 Fabは、ROR1 crossFabではない。「接続されている」とは、Fab断片が、ペプチド結合により、直接、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介してのいずれかで連結されていることが好ましいことを意味する。本発明中で使用される「CD3 Fab」という用語は、CD3に特異的に結合する抗体のFab断片を指す。CD3 Fabは、そのN末端において、ROR1 FabのC末端に連結されている。CD3 Fab内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなCD3 Fabは、「CD3 crossFab」または「クロスオーバーCD3 Fab断片」と称される。本発明に従って、CD3 Fabは、crossFabであることが好ましい。
本発明中で使用される「ペプチドリンカー」という用語は、合成起源のものであることが好ましいアミノ酸配列を有するペプチドを指す。本発明に従うこれらのペプチドリンカーを使用して、Fab断片のうちの1つを他のFab断片のC末端またはN末端に接続して本発明に従う多特異性抗体を形成する。前記ペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸の長さ、好ましくは、5〜100アミノ酸の長さ、より好ましくは、10〜50アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは(GxS)nまたは(GxS)nGmであり、G=グリシン、S=セリンであり(x=3、n=3、4、5または6、およびm=0、1、2または3)または(x=4、n=2、3、4または5およびm=0、1、2または3)、好ましくは、x=4およびn=2または3、より好ましくは、x=4、n=2である。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域(その一部)を含みうる。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは(G4S)2(配列番号19)である。
ギリシャ文字:α、δ、ε、γ、およびμで示される、5種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する(Janeway CA,Jrら(2001年)、Immunobiology、5版、Garland Publishing)。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、IgA抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG抗体、およびIgM抗体において見出される(Rhoades RA、Pflanzer RG(2002年)、Human Physiology、4版、Thomson Learning)。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約450アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約550アミノ酸を有する。各重鎖は、2つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、3つの定常ドメインCH1、CH2、およびCH3(一列の)と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し(Woof J、Burton D、Nat Rev Immunol、4巻(2004年)、89〜99頁)、重鎖μおよびεは、4つの定常ドメインCH1、CH2、CH3、およびCH4から構成される定常領域を有する(Janeway CA,Jrら(2001年)、Immunobiology、5版、Garland Publishing)。重鎖の可変領域は、異なるB細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のB細胞またはB細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約110アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。哺乳動物では、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)と呼ばれる、2種類の軽鎖しか存在しない。軽鎖は、2つの連続ドメイン:1つの定常ドメインCLと、1つの可変ドメインVLとを有する。軽鎖のおおよその長さは、211〜217アミノ酸である。
本発明に従って使用される「二特異性抗体」は、任意の適切なフォーマットを有しうる。二特異性フォーマットは、例えば、Kontermann RE、mAbs、4巻:2号(2012年)、1〜16頁、Mueller D.およびKontermann RE.BioDrugs(2010年)、24巻、2号、89〜98頁)に開示されている。このような二特異性抗体は、例えば、Fab、IgGおよびIgG様分子、ダイアボディ、単鎖FV(scFV)、DARPins−、tandAb、DART、ナノボディ、トリプルボディ(triple body)、トリプルヘッド(triple head)、CH3融合タンパク質に基づきうる。Fcパートを含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、任意のクラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、好ましくは、IgGまたはIgE)、またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2、好ましくは、IgG1)の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従って使用される二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス(例えば、IgG1、IgG4など、好ましくは、IgG1)、好ましくは、同じアロタイプ(例えば、白色人種)のFcパートを有する。
「抗体のFcパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。Fcパートを含む本発明に従って使用される抗体は、Fcパートとして、好ましくは、ヒト由来のFcパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のFcパートは、補体の活性化、C1qへの結合、C3の活性化、およびFc受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fcパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Lukas,TJ.ら、J. Immunol.、127巻(1981年)、2555〜2560頁;Brunhouse,R.、およびCebra,J.J.、MoI.Immunol.、16巻(1979年)、907〜917頁;Burton,D.R.ら、Nature、288巻(1980年)、338〜344頁;Thommesen,J.E.ら、MoI.Immunol.、37巻(2000年)、995〜1004頁;Idusogie,E.E.ら、J.Immunol.、164巻(2000年)、4178〜4184頁;Hezareh,M.ら、J.Virol.、75巻(2001年)、12161〜12168頁;Morgan,A.ら、Immunology、86巻(1995年)、319〜324頁;ならびにEP0307434により記載されている。このような結合性部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329(KabatによるEUインデックスに従う番号付け(下記を参照されたい))である。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体が通例、補体の活性化、C1qへの結合、C3の活性化を示すのに対し、IgG4は、補体系を活性化させず、C1qに結合せず、C3を活性化させない。Fcパートは、ヒトFcパートであることが好ましい。Fcパートは、ヒトIgG1 Fcパートであることが好ましい。本発明に従って使用される抗体は、ヒトIgG1 Fcパート内に、Pro329の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに/または置換L234AおよびL235A、好ましくは、Pro329のグリシンによる置換、ならびに置換L234AおよびL235Aを含むことが好ましい。
IgG1サブクラスの定常重領域CH2/CH3を含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、FcRおよびC1q結合を回避し、ADCC/CDCを最小化するように、変異L234A、L235AおよびP239G(Kabatに従う番号付け)を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、T細胞をリダイレクションし/活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびFcRを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
本発明に従って使用される抗体は、Fcパートとして、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変異体であって、位置Pro329におけるアミノ酸置換と、少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、KabatによるEUインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型IgG Fc領域を含む抗体と比較して、ヒトFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAおよび/またはFcγRIに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるADCCが、野生型ヒトIgG Fc領域を含む抗体により誘導されるADCCの少なくとも20%まで低減されるFc変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従って使用される抗体内の野生型ヒトFc領域のPro329を、グリシンもしくはアルギニン、またはFcのプロリン329と、FcγRIIIのトリプトファン(tryptophane)残基Trp87およびTip110との間で形成される、Fc/Fcγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ(Sondermannら、Nature、406巻、267〜273頁(2000年7月20日))を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Fc変異体内の、少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトIgG1 Fc領域のL234A(ロイシン234が、アラニンにより置換されていることを示す)およびL235A、またはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eである。このようなFc変異体については、WO2012130831において、詳細に記載されている。
本発明に従って使用される抗体の定常重鎖は、ヒトIgG1型のものであることが好ましく、定常軽鎖は、ヒトラムダ(λ)型、またはカッパ(κ)型、好ましくは、ヒトカッパ(κ)型のものであることが好ましい。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
「キメラ抗体」という用語は、1つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えDNA技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、C1qへの結合および/またはFc受容体(FcR)への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするDNAセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするDNAセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えDNAおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばMorrison,S.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻(1984年)、6851〜6855頁;米国特許第5,202,238号、および同第5,204,244号を参照されたい。
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」(CDR)が、親免疫グロブリンのCDRと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのCDRを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスCDRを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばRiechmann,L.ら、Nature、332巻(1988年)、323〜327頁;およびNeuberger,M.S.ら、Nature、314巻(1985年)、268〜270頁を参照されたい。特に好ましいCDRは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すCDRに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、C1qへの結合および/またはFc受容体(FcR)への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である(van Dijk,M.A.およびvan de Winkel,J.G.、Curr.Opin.Chem.Biol.、5巻(2001年)、368〜374頁)。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物(例えば、マウス)によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす(例えば、Jakobovits,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻(1993年)、2551〜2555頁;Jakobovits,A.ら、Nature、362巻(1993年)、255〜258頁;Bruggemann,M.ら、Year Immunol.、7巻(1993年)、33〜40頁を参照されたい)。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom,H.R.およびWinter,G.、J.MoI.Biol.、227巻(1992年)、381〜388頁;Marks,J.D.ら、J.MoI.Biol.、222巻(1991年)、581〜597頁)で作製することもできる。ColeらおよびBoernerらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss、77頁(1985年);およびBoerner,P.ら、J.Immunol.、147巻(1991年)、86〜95頁)。本発明に従って使用されるキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、C1qへの結合および/またはFcRへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Fcパートの変化または突然変異(例えば、IgG1からIgG4への突然変異、および/またはIgG1/IgG4突然変異)により、定常領域において修飾される抗体も含む。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、NSO細胞もしくはCHO細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従って使用される組換えヒト抗体は、in vivoにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVHおよびVL配列に由来し、これらと類縁であるが、in vivoのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
本明細書で使用される「可変ドメイン」(軽鎖(VL)の可変ドメイン、重鎖(VH)の可変領域)は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、3つの「超可変領域」(または相補性決定領域、CDR)により接続されている、4つのフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、CDRは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のCDRは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するCDRと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖CDR3領域は、本発明に従って使用される抗体の結合特異性/アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性部分」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「FR」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端へと、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各鎖上のCDRは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のCDR3は、標的への結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991年)による標準的な規定に従い、決定する。
本明細書で使用される「標的」または「標的分子」という用語は互換的に使用され、ヒトROR1およびヒトCD3εを指す。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および/または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
一般に、第1の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする2つのベクターと、第2の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードするさらなる2つのベクターが存在する。2つのベクターのうちの一方は、それぞれの軽鎖をコードし、2つのベクターの他方は、それぞれの重鎖をコードする。しかし、本発明に従って使用される二特異性抗体を調製するための代替法では、第1の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ1つの第1のベクターおよび第2の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ1つの第2のベクターを宿主細胞の形質転換に使用することができる。
本明細書で使用される「核酸または核酸分子」という用語は、DNA分子およびRNA分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖DNAであることが好ましい。
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような呼称は、子孫細胞を含む。こうして、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、およびこれに由来する培養物であって、継代数に関わらない培養物を含む。また、全ての子孫細胞は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、DNA含量が正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する、変異体の子孫細胞も含まれる。顕著に異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、ベクター/核酸の、宿主細胞への移入のプロセスを指す。透過しにくい細胞壁バリアを伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、GrahamおよびVan der Eh、Virology、52巻(1978年)、546頁以降により記載されている、リン酸カルシウム沈殿法により実行する。しかし、また、核注射によるまたはプロトプラスト融合によるなど、DNAを細胞へと導入するための他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁の構築を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの1つの方法は、Cohen SNら、PNAS、1972年、69巻(8号):2110〜2114頁により記載されている通り、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
最先端技術では、形質転換を使用する、抗体の組換え産生が周知であり、例えば、Makrides,S.C、Protein Expr.Purif.、17巻(1999年)、183〜202頁;Geisse,S.ら、Protein Expr.Purif.、8巻(1996年)、271〜282頁;Kaufman,RJ.、MoI.Biotechnol.、16巻(2000年)、151〜161頁;Werner,R.G.ら、Arzneimittelforschung、48巻(1998年)、870〜880頁による総説論文;ならびにUS6331415およびUS4816567において記載されている。
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をmRNAへと転写するプロセス、および/または転写されたmRNA(転写物ともまた称する)を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムDNAに由来する場合、真核細胞内の発現は、mRNAのスプライシングを含みうる。
「ベクター」とは、核酸分子、特に、自己複製型核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞内および/または宿主細胞間に移入する核酸分子である。用語は、主にDNAまたはRNAの、細胞への挿入(例えば、染色体の組込み)のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製、ならびにDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載される機能のうちの1つを超える機能を提供するベクターも含まれる。
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチドへと転写および翻訳されるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。
本発明に従って使用される二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、またはE.coli細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞(上清または溶解の後における細胞)から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ/SDS処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ausubel,F.ら編、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley Interscience、New York(1987年)を参照されたい。
NS0細胞内の発現は、例えば、Barnes,L.M.ら、Cytotechnology、32巻(2000年)、109〜123頁;およびBarnes,L.M.ら、Biotech.Bioeng.、73巻(2001年)、261〜270頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher,Y.ら、Nucl.Acids.Res.、30巻(2002年)、E9頁により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻(1989年)、3833〜3837頁;Carter,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻(1992年)、4285〜4289頁;およびNorderhaug,L.ら、J.Immunol.Methods、204巻(1997年)、77〜87頁により記載されている。好ましい一過性発現系(HEK293)は、Schlaeger,E.−J.およびChristensen,K.、Cytotechnology、30巻(1999年)、71〜83頁;ならびにSchlaeger,E.−J.、J.Immunol.Methods、194巻(1996年)、191〜199頁により記載されている。
原核細胞に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを活用することが公知である。
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのDNAに作動可能に連結されているか;プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか;またはリボソーム結合性部位は、翻訳を容易とするように位置づけられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているDNA配列が連続であり、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で連続であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
二特異性抗体は、例えば、プロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAまたはRNAは、従来の手順を使用して、たやすく単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAおよびRNAの供給源として用いることができる。単離されたら、DNAを、発現ベクターへと挿入することができ、次いで、宿主細胞内で組換えモノクローナル抗体の合成を得るように、HEK293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞であって、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトする。
二特異性抗体のアミノ酸配列の変異体(または突然変異体)は、適切なヌクレオチド変化を、抗体DNAへと導入することにより、またはヌクレオチドの合成により調製する。このような修飾は、実施しうるが、例えば、上で記載した通り、非常に限定的な範囲内に限られる。例えば、修飾は、IgGアイソタイプおよび標的への結合など、上述の抗体特徴を変更しないが、組換え作製の収率、タンパク質の安定性を改善する、または精製を容易とすることが可能である。
T細胞二特異性(TCB)結合剤は、細胞の殺滅(例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、in vitro細胞殺滅アッセイにおけるEC50;Dreierら、Int J Cancer、2002年)において、非常に高度な、濃度/腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有するが、T細胞二特異性結合剤(TCB)は、従来の単一特異性抗体よりはるかに低用量で施されている。例えば、ブリナツモマブ(CD19×CD3)は、急性リンパ性白血病の処置のための、5〜15μg/m2/日(すなわち、わずか、0.035〜0.105mg/m2/週)、または非ホジキンリンパ腫の処置のための、60μg/m2/日の連続静脈内投与で施され、これらの投与時における血清濃度は、0.5〜4ng/mlの範囲である(Klingerら、Blood、2012年、Toppら、J Clin Oncol、2011年、Goebelerら、Ann Oncol、2011年)。ブリナツモマブの消失半減期は非常に短いので、臨床投与は、患者の体に携行するポンプを介した持続注入による。本発明に従って使用される抗体の消失半減期はより長いので、本発明に従う抗体では、皮下投与が可能であり、臨床状況において好ましいことが想定される(週1回または週2回、0.1〜10mg/m2の用量範囲が好ましく、さらにより低い用量が好ましい)。これらの低濃度/用量/受容体占有度であってもなお、TCBは、無視できない有害事象を引き起こしうる(Klingerら、Blood、2012年)。本発明の抗体の薬物動態的特性の改善は、有害事象を潜在的に低減する1つの尺度である。
原理上は、CD3およびROR1に対する二特異性抗体を最先端技術において公知の全てのフォーマットで作製することが可能である。最近では、例えば、IgG抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている(例えば、Kontermann RE、mAbs、4巻:2号(2012年)、1〜16頁を参照されたい)。可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1を、互いに置きかえた二特異性抗体については、WO2009080251およびWO2009080252において記載されている。抗体フォーマットならびに二特異性抗体および多特異性抗体のフォーマットはまた、ペップボディ(pepbody)(WO200244215)、新規抗原受容体(「NAR」)(WO2003014161)、ダイアボディ−ダイアボディ二量体「TandAb」(WO2003048209)、ポリアルキレンオキシド改変scFv(US7150872)、ヒト化ウサギ抗体(WO2005016950)、合成免疫グロブリンドメイン(WO2006072620)、共有結合性ダイアボディ(WO2006113665)、フレキシボディ(flexibody)(WO2003025018)、ドメイン抗体、dAb(WO2004058822)、ワクシボディ(vaccibody)、(WO2004076489)、新世界霊長類フレームワークを有する抗体(WO2007019620)、切断可能なリンカーを用いた抗体−薬物コンジュゲート(WO2009117531)、ヒンジ領域が除去されたIgG4抗体(WO2010063785)、IgG4様CH3ドメインを有する二特異性抗体(WO2008119353)、ラクダ科動物抗体(US6838254)、ナノボディ(US7655759)、CATダイアボディ(US5837242)、標的抗原およびCD3を対象とする二特異性scFv2(US7235641)、sIgA Pl抗体(US6303341)、ミニボディ(US5837821)、IgNAR(US2009148438)、ヒンジおよびFc領域が改変された抗体(US2008227958、US20080181890)、三官能性抗体(US5273743)、トリオマブ(US6551592)、トロイボディ(troybody)(US6294654)である。
本発明に従って使用される抗体は、週1回または週2回、s.c.投与することができる。
本発明に従って使用される二特異性三価抗体は、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有する。
ROR1に対して二価性を有し、CD3に対して一価性を有する、本発明に従って使用される抗体は、悪性細胞上の腫瘍標的ROR1への結合に、循環中のT細胞上のCD3εへの結合よりも有利であり、CD3シンクを回避し、したがって、腫瘍における薬物曝露が増大する。
以下の例、配列表、および図は、本発明の理解の一助とするために提示するものであり、本発明の真の範囲は、付属の特許請求の範囲で記される。本発明の精神から逸脱することなく、記される手順に改変を施しうることが理解される。
配列表
以下の、本発明に従って使用される抗ROR1/抗CD3 TCBを制作するためには、上で記載した表で言及した、それぞれの構築物/配列番号が必要とされる:
ROR1−TCB(2+1)、Fc含有:30(2×)、31、32、および33(図1A)
ROR1−TCB(1+1)、Fc含有:30、31、33、および36(図1B)
ROR1−TCB(2+1)、Fc非含有:配列番号30(2×)、33、および35(図1C)
ROR1−TCB(1+1)、Fc非含有:配列番号30、33、および34(図1D)
ROR1−TCB(2+1)、Fc含有:30(2×)、31、32、および33(図1A)
ROR1−TCB(1+1)、Fc含有:30、31、33、および36(図1B)
ROR1−TCB(2+1)、Fc非含有:配列番号30(2×)、33、および35(図1C)
ROR1−TCB(1+1)、Fc非含有:配列番号30、33、および34(図1D)
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する。
実施形態1.卵巣がんの処置における使用のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体。
実施形態1.卵巣がんの処置における使用のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体。
実施形態2. 初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とする、実施形態1に従う二特異性抗体。
実施形態3. 細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、実施形態2のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態4. 抗CD3ε抗体の1つのFab断片(CD3 Fab)と、抗ROR1抗体の1つまたは2つのFab断片(ROR1 Fab)と、0または1つのFc断片とからなることを特徴とする、実施形態1から3のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態5. 二価であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とする、実施形態1から4のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態6. 三価であり、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する抗体の一価Fab断片とを含むことを特徴とする、実施形態1から5のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態7. 構築物、
a)CD3 Fab−ROR1 Fab、
b)CD3 Fab−ROR1 Fab−ROR1 Fab、
c)Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab、および
d)ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab
の群から選択されることを特徴とする、実施形態1から6のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)CD3 Fab−ROR1 Fab、
b)CD3 Fab−ROR1 Fab−ROR1 Fab、
c)Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab、および
d)ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab
の群から選択されることを特徴とする、実施形態1から6のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態8. 構築物が、
a)構成ブロック、配列番号30(2×)、31、32、および33からなる構築物、
b)構成ブロック、配列番号30、31、33、および36からなる構築物、
c)構成ブロック、配列番号30(2×)、33、および35からなる構築物、
d)構成ブロック、配列番号30、33、および34からなる構築物
の群から選択されることを特徴とする、実施形態1から7のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)構成ブロック、配列番号30(2×)、31、32、および33からなる構築物、
b)構成ブロック、配列番号30、31、33、および36からなる構築物、
c)構成ブロック、配列番号30(2×)、33、および35からなる構築物、
d)構成ブロック、配列番号30、33、および34からなる構築物
の群から選択されることを特徴とする、実施形態1から7のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態9. 配列番号31、33、34、35、37、39内の抗CD3ε抗体配列VHおよびVLが、配列番号21および22のそれぞれのVHおよびVL配列により置きかえられていることを特徴とする、実施形態1から8のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態10. Fcドメインを含むことを特徴とする、実施形態1から9のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態11. a)前記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
b)前記標的のうちの他の一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と
を含み、可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられている
ことを特徴とする、実施形態1から10のいずれか一つに従う二特異性抗体。
b)前記標的のうちの他の一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と
を含み、可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられている
ことを特徴とする、実施形態1から10のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態12. 前記抗CD3抗体の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられていることを特徴とする、実施形態11に従う二特異性抗体。
実施形態13. ヒトCD3εに特異的に結合する抗体部分が、
a)配列番号12、13および14のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号15、16および17のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号26、27および28のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする、実施形態1から12のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)配列番号12、13および14のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号15、16および17のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号26、27および28のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする、実施形態1から12のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態14. ヒトROR1に特異的に結合する抗体部分が、配列番号7、8および9のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号3、4および5のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から13のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態15. さらに、前記第1の抗体の第2のFab断片(「ROR1−Fab」)を含むことを特徴とする、実施形態14に従う二特異性抗体。
実施形態16. CD3に特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「CD3−Fab」とも称する)と、ROR1に特異的に結合する抗体の1つのFab断片(さらにまた、「ROR1−Fab」とも称する)と、Fcパートとからなり、前記CD3−Fabおよび前記ROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されており、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態1から15のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態17. 前記CD3−Fabおよび前記ROR1−Fabが、それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されている、1つのCD3−Fabと、1つのROR1−Fabと、Fcパートと、そのC末端により前記CD3−FabのN末端へと連結された第2のROR1−Fabとからなり、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含み、前記CD3−Fabまたは両方のROR1−Fabのいずれかが、アミノ酸置換を含む(図1A)ことを特徴とする、実施形態1から16のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態18. ROR1−Fab−Fc−CD3−Fab−ROR1−Fabからなり、前記CD3−Fabが、CL/CH1クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態1から17のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態19. それらのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結されている2つのROR1−Fabと、Fcパートと、そのC末端により1つのROR1−FabのN末端へと連結されているCD3−Fabとからなり、前記CD3−Fabが、クロスオーバーを含む(図1F)ことを特徴とする、実施形態1から18のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態20. そのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された、1つのCD3−Fabと、そのC末端により、前記CD3−FabのN末端へと連結されたROR1−Fabとからなる(図1B)ことを特徴とする、実施形態1から19のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態21. そのC末端を介して、前記Fcパートのヒンジ領域へと連結された、1つのROR1−Fabと、そのC末端により、前記ROR1−FabのN末端へと連結されたCD3−Fabとからなる(図1G)ことを特徴とする、実施形態1から20のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態22. 抗ROR1抗体MAB1のCDR配列を含むことを特徴とする、実施形態1から21のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態23. 抗ROR1抗体MAB1のVHおよびVL配列を含むか、または抗ROR1抗体MAB1のVH、VL、CH1、およびCL配列を含む抗体であることを特徴とする、実施形態1から22のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態24. ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Fab断片が、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から23のいずれか一つに従う二特異性抗体。
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から23のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態25. ヒトCD3に特異的に結合する前記抗体部分が、
前記可変ドメインが、
a)配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)の可変ドメインであるか、または、
b)配列番号21および22(VHVL MAB CD3 CH2527)の可変ドメインである
ことを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から24のいずれか一つに従う二特異性抗体。
前記可変ドメインが、
a)配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)の可変ドメインであるか、または、
b)配列番号21および22(VHVL MAB CD3 CH2527)の可変ドメインである
ことを特徴とすることを特徴とする、実施形態1から24のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態26. ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、重鎖CDR、配列番号7のCDR1H、配列番号8のCDR2H、配列番号9のCDR3Hを含む可変ドメインVHを含むことと、軽鎖CDR、配列番号3のCDR1L、配列番号4のCDR2L、配列番号5のCDR3Lを含む可変ドメインVLを含むこととを特徴とする(CDR MAB1)ことを特徴とする、実施形態1から25のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態27. ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、配列番号10のVHと配列番号11のVLとを含むことを特徴とする(VHVL MAB1)ことを特徴とする、実施形態1から26のいずれか一つに従う二特異性抗体。
実施形態28. ヒトCD3εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられること、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられることを特徴とする、実施形態27に従う抗体。
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられること、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられることを特徴とする、実施形態27に従う抗体。
実施形態29. 一方の重鎖のCH3ドメインおよび他方の重鎖のCH3ドメインの各々が、抗体のCH3ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
a)前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
b)前記二特異性抗体内の前記第1のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第2のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第2のCH3ドメインの前記界面内に、前記第1のCH3ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態1から28のいずれか一つに従う抗体。
a)前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
b)前記二特異性抗体内の前記第1のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第2のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第2のCH3ドメインの前記界面内に、前記第1のCH3ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態1から28のいずれか一つに従う抗体。
実施形態30. ヒトIgG1 Fcパート内に、Pro329のグリシンによるアミノ酸置換および/または置換L234AおよびL235Aを含むことを特徴とする、実施形態1から29のいずれか一つに従う抗体。
実施形態31. 構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの抗体であり、前記抗CD3抗体のFab断片内にCL/CH1クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態30に従う抗体。
実施形態32. 構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの抗体であり、Pro329のグリシンによるアミノ酸置換ならびにLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を伴うヒトIgG1 Fcパートを含むことを特徴とする、実施形態30または31に従う抗体。
実施形態33. 2つの標的、ヒトCD3ε(CD3)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(ROR1)に特異的に結合することを特徴とし、初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とする、実施形態1から32のいずれか一つに従う抗体。
実施形態34. 2つの標的、ヒトCD3ε(CD3)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(ROR1)に特異的に結合することを特徴とし、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、実施形態1から33のいずれか一つに従う抗体。
実施形態35. 実施形態1から34に従う抗体は、マウスにおける、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、12時間より長い、好ましくは、3日間またはそれより長い消失半減期を特徴とする。
実施形態36. 実施形態1から35に従う抗体は、ROR1陽性卵巣がん細胞系(例えば、PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626、好ましくはPA−1および/またはCOLO−704)への結合についてのEC50値であって、30nMまたはそれを下回る、好ましくは、15nMおよびそれを下回るEC50値を示すことを特徴とする。
実施形態37. 実施形態1から36に従う抗体は、ヒトT細胞の存在下における、ROR1発現卵巣がん細胞(例えば、PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626、好ましくはPA−1および/またはCOLO−704)のリダイレクトされた殺滅を、10nM未満、好ましくは、1nM、好ましくは、0.05nM、好ましくは、0.02nM、好ましくは、0.002nMおよびそれを下回るEC50で誘導するその能力を特徴とする。
実施形態38. 実施形態1から37に記載の抗体は、標準的な製剤緩衝液中、37℃で、好ましくは、40℃で、10日間、好ましくは、最長2週間、好ましくは、最長4週間保存された前記抗体が、高分子量(HMW)分子種および/または低分子量(LMW)分子種および/または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−80℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、10%を超える変化(Δ)、好ましくは、5%を超える変化(Δ)を結果としてもたらさないことを特徴とする。
実施形態39. 卵巣がんの処置における使用のための実施形態1から38のいずれか一つに従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
実施形態40. 卵巣がんの処置における使用のための医薬としての使用のための、実施形態1から38のいずれか一つに従う抗体、または実施形態39に従う医薬組成物。
実施形態39. ROR1陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態1から38のいずれか一つに従う抗体、または実施形態39に従う医薬組成物。
実施形態40. 卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態1から38のいずれか一つに従う抗体、または実施形態39に従う医薬組成物。
実施形態41. 卵巣がんの処置のため、およびROR1を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態1から38のいずれか一つに従う抗体、または実施形態39に従う医薬組成物。
実施形態42.卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、実施形態1から38のいずれか一つに従う二特異性抗体または実施形態39に記載の医薬組成物の使用。
実施形態43.卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、前記患者に、治療有効量の、実施形態1から38のいずれか一つに従う二特異性抗体または実施形態39に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
材料および一般的方法
組換えDNA技法
Sambrook,J.ら、Molecular cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年において記載されている、標準的方法を使用して、DNAを取り扱う。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用する。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.ら、(1991年)、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、NIH刊行物番号91−3242において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、(1991年)に従い番号付けされ、言及される。
組換えDNA技法
Sambrook,J.ら、Molecular cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年において記載されている、標準的方法を使用して、DNAを取り扱う。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用する。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.ら、(1991年)、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、NIH刊行物番号91−3242において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、(1991年)に従い番号付けされ、言及される。
遺伝子の合成
a)所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Kpnl/SadまたはAscl/Paclを介して、pPCRScript(Stratagene)ベースのpGA4クローニングベクターへとクローニングする。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Geneart(Regensburg、Germany)で提供されている仕様に従い、注文する。
b)要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するPCRにより作出するか、またはGeneart AG(Regensburg、Germany)によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成する。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングする。プラスミドDNAは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製する。プラスミド濃度を、UV分光法により決定する。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認する。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインする。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列によりデザインする。
a)所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Kpnl/SadまたはAscl/Paclを介して、pPCRScript(Stratagene)ベースのpGA4クローニングベクターへとクローニングする。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Geneart(Regensburg、Germany)で提供されている仕様に従い、注文する。
b)要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するPCRにより作出するか、またはGeneart AG(Regensburg、Germany)によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成する。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングする。プラスミドDNAは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製する。プラスミド濃度を、UV分光法により決定する。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNAシークエンシングにより確認する。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインする。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列によりデザインする。
DNAの配列決定
DNA配列は、二本鎖シークエンシングにより決定する。
DNA配列は、二本鎖シークエンシングにより決定する。
DNAおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理
Clone Manager(Scientific & Educational Software)ソフトウェアパッケージバーション9.2を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用する。
Clone Manager(Scientific & Educational Software)ソフトウェアパッケージバーション9.2を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用する。
発現ベクター
a)下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルする。サブクローニングされた核酸配列は、DNAシークエンシングにより検証する。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたE.coli培養物(Nucleobond AX、Macherey−Nagel)からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
a)下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルする。サブクローニングされた核酸配列は、DNAシークエンシングにより検証する。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたE.coli培養物(Nucleobond AX、Macherey−Nagel)からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
b)抗ROR1抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトIgG1定常重鎖またはhum IgG1定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングする。抗体の発現は、CMVエンハンサーおよびMPSVプロモーターに続いて、5’UTR、イントロン、およびIgカッパMARエレメントを含むキメラMPSVプロモーターにより駆動する。転写は、CDSの3’末端における合成ポリAシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列を保有する。加えて、各ベクターは、EBV EBNA発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのEBV OriP配列も含有する。
c)ROR1×CD3二特異性抗体ベクターを作出するために、IgG1由来の二特異性分子は、少なくとも、2つの顕著に異なる抗原性決定基CD3およびROR1に特異的に結合することが可能な、2つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるFab断片である。Fab断片のうちの少なくとも1つは、CH1とCLを交換した、「Crossfab」断片であった。Fab断片内のCH1とCLの交換により、特異性の異なるFab断片が、同一のドメインの並びを有さないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価(1+1)でありうるか、またはCD3に対して一価、ROR1に対して二価でありえ、この場合、1つのFab断片を内側のCrossFabのN末端と融合する(2+1)。二特異性分子は、Fcパートを、分子が長い半減期を有するような順序で含有した。構築物の概略表示を図1に示し、構築物の好ましい配列を配列番号30〜36に示す。分子は、ポリマーを使用して、懸濁液中で成長するHEK293 EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを共トランスフェクトすることにより作製する。1+1 CrossFab−IgG構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、1:1:1:1の比(「Fc(ノブ)ベクター」:「軽鎖ベクター」:「軽鎖 CrossFabベクター」:「重鎖−CrossFabベクター」)でトランスフェクトする。2+1 CrossFab−IgG構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、1:2:1:1の比(「Fc(ノブ)ベクター」:「軽鎖ベクター」:「軽鎖 CrossFabベクター」:「重鎖−CrossFabベクター」)でトランスフェクトする。
細胞培養技法
Current Protocols in Cell Biology(2000年)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott−Schwartz,J.、およびYamada,K.M.(編)、John Wiley&Sons,Inc.において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
Current Protocols in Cell Biology(2000年)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott−Schwartz,J.、およびYamada,K.M.(編)、John Wiley&Sons,Inc.において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
HEK293細胞(HEK293−EBNA系)内の一過性発現
二特異性抗体は、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターのポリマーベースの一過性共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個/mLで播種する。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離する(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製する。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置する。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置く。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加する。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加する。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。組換え抗BCMAヒト抗体および二特異性抗体は、懸濁液中で、HEK293−EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して、共トランスフェクトをすることにより作製する。細胞には、フォーマットに応じて、2つまたは4つのベクターをトランスフェクトする。ヒトIgG1では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、4つのプラスミドを共トランスフェクトする。これらのうちの2つにより、2つの異なる重鎖をコードし、他の2つにより、2つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、F17 Medium中に、生細胞150万個/mLで播種する。
二特異性抗体は、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターのポリマーベースの一過性共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個/mLで播種する。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離する(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製する。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置する。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置く。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加する。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加する。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。組換え抗BCMAヒト抗体および二特異性抗体は、懸濁液中で、HEK293−EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して、共トランスフェクトをすることにより作製する。細胞には、フォーマットに応じて、2つまたは4つのベクターをトランスフェクトする。ヒトIgG1では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、4つのプラスミドを共トランスフェクトする。これらのうちの2つにより、2つの異なる重鎖をコードし、他の2つにより、2つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、F17 Medium中に、生細胞150万個/mLで播種する。
タンパク質の決定
抗体濃度の決定は、0.1%の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、280nmにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、GPMAWソフトウェア(Lighthouse data)により計算する。
抗体濃度の決定は、0.1%の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、280nmにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、GPMAWソフトウェア(Lighthouse data)により計算する。
SDS−PAGE
NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の指示書に従い使用する。特に、10%または4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−TRIS Pre−Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)Antioxidantランニングバッファー添加剤を伴う)、またはMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用する。
NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の指示書に従い使用する。特に、10%または4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−TRIS Pre−Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)Antioxidantランニングバッファー添加剤を伴う)、またはMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用する。
タンパク質の精製
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、pH7.5 6CVで平衡化させたプロテインAカラム(HiTrap Protein A FF、5mL、GE Healthcare)上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、20mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、100mMのグリシン、pH3.0による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、0.5Mのリン酸ナトリウム、pH8.0(1:10)で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、pH7.5 6CVで平衡化させたプロテインAカラム(HiTrap Protein A FF、5mL、GE Healthcare)上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、20mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、100mMのグリシン、pH3.0による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、0.5Mのリン酸ナトリウム、pH8.0(1:10)で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
カチオン交換クロマトグラフィーによる精製
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、1:10に希釈し、カチオン交換カラム(Poros 50 HS、Applied Biosystems)へとロードする。それぞれ、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、pH5.0、および20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH5.0である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、2回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH8.5を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、1:10に希釈し、カチオン交換カラム(Poros 50 HS、Applied Biosystems)へとロードする。それぞれ、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、pH5.0、および20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH5.0である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、2回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH8.5を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
解析用サイズ除外クロマトグラフィーによる精製
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Tween20を伴うかまたは伴わない、20mMのヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム、pH6.0と共に、XK16/60 HiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Tween20を伴うかまたは伴わない、20mMのヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム、pH6.0と共に、XK16/60 HiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
純度および単量体含量の測定
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、25mMのリン酸カリウム、125mMの塩化ナトリウム、200mMのL−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v)のアジ化ナトリウム、pH6.7による緩衝液中で、CE−SDS(Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Life Sciences))およびHPLC(TSKgel G3000 SW XL解析用サイズ除外カラム(Tosoh))のそれぞれにより決定する。
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、25mMのリン酸カリウム、125mMの塩化ナトリウム、200mMのL−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v)のアジ化ナトリウム、pH6.7による緩衝液中で、CE−SDS(Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Life Sciences))およびHPLC(TSKgel G3000 SW XL解析用サイズ除外カラム(Tosoh))のそれぞれにより決定する。
LC−MS解析による分子量の確認
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、LC−MS解析により解析する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、PNGaseF(ProZyme)で処理する。したがって、2Mのトリス2μlを、濃度を0.5mg/mlとする20μgのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のpHを、pH7.0へと調整する。0.8μgのPNGaseFを、添加し、37℃で12時間インキュベートする。
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、LC−MS解析により解析する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、PNGaseF(ProZyme)で処理する。したがって、2Mのトリス2μlを、濃度を0.5mg/mlとする20μgのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のpHを、pH7.0へと調整する。0.8μgのPNGaseFを、添加し、37℃で12時間インキュベートする。
LC−MS解析−オンライン検出
LC−MS法は、TOF 6441質量分析計(Agilent)へとカップリングさせた、Agilent HPLC 1200上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Macherey Nagel Polystereneカラム;RP1000−8(粒子サイズを8μmとする、4.6×250mm;カタログ番号719510)上で実施する。溶離液Aは、水中に5%のアセトニトリル、および0.05%(v/v)のギ酸であり、溶離液Bは、95%のアセトニトリル、5%の水、および0.05%のギ酸である。流量は、1ml/分であり、分離は、40℃で実施し、前に記載した処理により、6μg(15μl)のタンパク質試料を得る(表2)。
LC−MS法は、TOF 6441質量分析計(Agilent)へとカップリングさせた、Agilent HPLC 1200上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Macherey Nagel Polystereneカラム;RP1000−8(粒子サイズを8μmとする、4.6×250mm;カタログ番号719510)上で実施する。溶離液Aは、水中に5%のアセトニトリル、および0.05%(v/v)のギ酸であり、溶離液Bは、95%のアセトニトリル、5%の水、および0.05%のギ酸である。流量は、1ml/分であり、分離は、40℃で実施し、前に記載した処理により、6μg(15μl)のタンパク質試料を得る(表2)。
最初の4分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づける。ESI源は、乾燥ガス流量を12l/分とし、温度を350℃とし、噴霧器圧力を60psiとして動作させる。MSスペクトルは、陽イオンモードにおいて、380Vのフラグメンター電圧および700〜3200m/zの質量範囲を使用して取得する。MSデータは、計器ソフトウェアにより、4〜17分間にわたり取得する。
PBMCからの初代ヒト汎T細胞の単離
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーから収集した採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトPBCMは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。略述すると、血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、H8889)にわたり、注意深く層化させる。450×g、室温で30分間遠心分離の後(ブレーキをオフに切り替える)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄する。PBMCを、新しい50ml Falconチューブへと移し、チューブを、PBSで、50mlの総容量まで満たす。混合物を、400×g、室温で10分間遠心分離する(ブレーキをオンに切り替える)。上清を廃棄し、PBMCペレットを、滅菌PBSで2回洗浄する(350×g、4℃で10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、アッセイ開始まで、インキュベーター内、37℃、5%のCO2、10%のFCS、および1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中で保存する。
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーから収集した採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトPBCMは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。略述すると、血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、H8889)にわたり、注意深く層化させる。450×g、室温で30分間遠心分離の後(ブレーキをオフに切り替える)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄する。PBMCを、新しい50ml Falconチューブへと移し、チューブを、PBSで、50mlの総容量まで満たす。混合物を、400×g、室温で10分間遠心分離する(ブレーキをオンに切り替える)。上清を廃棄し、PBMCペレットを、滅菌PBSで2回洗浄する(350×g、4℃で10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、アッセイ開始まで、インキュベーター内、37℃、5%のCO2、10%のFCS、および1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中で保存する。
PBMCからのT細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Pan T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec型番130−091−156)を使用して実施する。略述すると、細胞ペレットを、細胞1000万個当たり40μlの低温緩衝液(滅菌濾過された、0.5%のBSA、2mMのEDTAを伴うPBS)中で希釈し、細胞1000万個当たり10μlのビオチン−抗体カクテルと共に、4℃で10分間インキュベートする。細胞1000万個当たり30μlの低温緩衝液および20μlの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、4℃でさらに15分間インキュベートする。現行容量の10〜20倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、300×gで10分間遠心分離ステップにかける。最大1億個の細胞を、500μlの緩衝液中に再懸濁させる。標識されていないヒト汎T細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、LSカラム(Miltenyi Biotec型番130−042−401)を使用して実施する。結果として得られるT細胞集団を、自動的にカウントし(ViCell)、アッセイ開始まで、インキュベーター内、37℃、5%のCO2、AIM−V培地中で保存する(24時間より長くない)。
PBMCからの初代ヒトナイーブT細胞の単離
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーもしくは卵巣がん患者に由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトPBCMは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。PBMCからのT細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Miltenyi Biotec(型番130−093−244)製のNaive CD8+ T cell isolation Kitを使用して実施するが、CD8+T細胞の最後の単離ステップは省略する(初代ヒト汎T細胞の単離についての記載もまた参照されたい)。
末梢血単核細胞(PBMC)は、Histopaque密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーもしくは卵巣がん患者に由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトPBCMは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。PBMCからのT細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Miltenyi Biotec(型番130−093−244)製のNaive CD8+ T cell isolation Kitを使用して実施するが、CD8+T細胞の最後の単離ステップは省略する(初代ヒト汎T細胞の単離についての記載もまた参照されたい)。
(実施例1)
抗ROR1抗体の作出
配列番号2〜9のROR1抗体(MAB1)のVHおよびVL領域のタンパク質配列は、WO2012/075158において記載されている。略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをPCRによって繋ぎ合わせて、それぞれ抗ROR1抗体のVHおよびVL配列をコードするcDNAを合成する。
抗ROR1抗体の作出
配列番号2〜9のROR1抗体(MAB1)のVHおよびVL領域のタンパク質配列は、WO2012/075158において記載されている。略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをPCRによって繋ぎ合わせて、それぞれ抗ROR1抗体のVHおよびVL配列をコードするcDNAを合成する。
抗ROR1抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターにあらかじめ挿入されたヒトIgG1定常重鎖またはhum IgG1定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、CMVエンハンサーおよびMPSVプロモーターに続いて、5’UTR、イントロン、およびIgカッパMARエレメントを含むキメラMPSVプロモーターにより駆動した。転写は、CDSの3’末端における合成ポリAシグナル配列により終結させた。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞において分泌にターゲティングするリーダーペプチドをコードする5’末端のDNA配列を保有する。加えて、各ベクターは、EBV EBNA発現細胞内での、エピソームとしてのプラスミド複製のためのEBV OriP配列も含有する。
ROR1抗体を、懸濁液中で培養したHEK293−EBNA細胞において、それぞれの哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して、一過性の共トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充したEx−Cell培地中に、生細胞150万個/mLで播種した。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離した(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:軽鎖の比=1:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製した。0.27μLのポリマー含有溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置した。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器に移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置いた。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加した。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加した。7日後、または細胞生存率が、70%と等しいか、またはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップを使用した。HEK293−EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用してトランスフェクトすることにより、懸濁液中で組換え抗ROR1ヒト抗体を生成した。細胞に2つのベクターをトランスフェクトした。ヒトIgG1については、一方のプラスミドが重鎖をコードするものであり、他方のプラスミドが軽鎖をコードするものであった。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充したF17 Medium中に、生細胞150万個/mLで播種した。
(実施例2)
細胞表面におけるROR1の発現のレベルが異なるヒト卵巣がん細胞系
1)卵巣奇形癌に由来するヒト卵巣がん細胞系PA−1は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−1572)から入手する。PA−1細胞系を、10%ウシ胎仔血清(熱不活化)、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1500mg/Lの炭酸水素ナトリウムを補充したEagle’s Minimum Essential Medium(MEM)(ATCC、カタログ番号30−2003)中で培養する。
細胞表面におけるROR1の発現のレベルが異なるヒト卵巣がん細胞系
1)卵巣奇形癌に由来するヒト卵巣がん細胞系PA−1は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−1572)から入手する。PA−1細胞系を、10%ウシ胎仔血清(熱不活化)、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1500mg/Lの炭酸水素ナトリウムを補充したEagle’s Minimum Essential Medium(MEM)(ATCC、カタログ番号30−2003)中で培養する。
2)卵巣の粘液性嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系MCASは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB0240)から入手する。MCAS細胞系は、20%のFBSを伴うEagle’s MEM中で成長させる。
3)卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系EFO−21は、Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ;カタログ番号ACC235)から入手する。EFO−21細胞系は、80%のRPMI1640、20%の熱不活化ウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミン、1×MEM非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム中で培養する。
4)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COLO−704は、Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ;カタログ番号ACC198)から入手する。COLO−704細胞系を90%のRPMI1640および10%の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
5)グレードIII腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系SW−626は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−78)から入手する。SW−626細胞系は、ATCCにより配合されたLeibovitz’s L−15 Medium(カタログ番号30−2008)および10%ウシ胎仔血清中で培養する。
6)未分化癌(腹水)に由来するヒト卵巣がん細胞系KURAMOCHIは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB0098)から入手する。KURAMOCHI細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
7)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVSAHOは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB1046)から入手する。OVSAHO細胞系は、10%ウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
8)卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系SNU−119は、Korean Cell Line Bank(KCLB;カタログ番号00119)から入手する。SNU−119細胞系は、52.5%のRPMI1640培地、40%のウシ胎仔血清および7.5%のDMSO中で培養する。
9)上皮性−類内膜癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COV362は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号07071910)から入手する。COV362細胞系は、DMEM、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
10)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVCAR−4は、EZ Biosystems(カタログ番号EZT−OVC4−1)から入手する。OVCAR−4細胞系は、10%ウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
11)上皮性−類内膜癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COV318は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号07071903)から入手する。COV318細胞系は、DMEM、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
12)未分化癌に由来するヒト卵巣がん細胞系TYK−nuは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB0234.0)から入手する。TYK−nu細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
13)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVKATEは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB1044)から入手する。OVKATE細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
14)腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系CAOV−4は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−76)から入手する。CAOV−4細胞系は、ATCCにより配合されたLeibovitz’s L−15 Medium(カタログ番号30−2008)および20%のウシ胎仔血清中で培養する。
15)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OAW28は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号85101601)から入手する。OAW28細胞系は、DMEM、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム(NaP)、20IU/lのウシインスリンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
16)腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系CAOV−3は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−75)から入手する。CAOV−3細胞系は、ATCCにより配合されたDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(カタログ番号30−2002)および10%ウシ胎仔血清中で培養する。
17)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系59Mは、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号89081802)から入手する。59M細胞系は、DMEM、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム(NaP)、20IU/lのウシインスリンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
18)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ONCO−DG−1は、Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ;カタログ番号ACC507)から入手する。ONCO−DG−1細胞系は、90%のRPMI1640および10%の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
19)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系NIH:OVCAR−3は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−161)から入手する。NIH:OVCAR−3細胞系は、ATCCにより配合されたRPMI−1640 Medium(カタログ番号30−2001)、0.01mg/mLのウシインスリンおよび20%のウシ胎仔血清中で培養する。
20)卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ES−2は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−1978)から入手する。ES−2細胞系を、ATCCにより配合されたMcCoy’s 5a Medium Modified(カタログ番号30−2007)および10%ウシ胎仔血清中で培養する。
21)卵巣上皮性−漿液性癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COV−504は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号07071902)から入手する。COV−504細胞系は、DMEM、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
22)卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OV−90は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−11732)から入手する。OV−90細胞系は、最終濃度1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムを含有するMCDB 105培地と最終濃度2.2g/Lの炭酸水素ナトリウム、および15%のウシ胎仔血清を含有するMedium 199の1:1混合物中で培養する。
23)卵巣粘液性嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系RMUG−Sは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号IFO50320)から入手する。RMUG−S細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
24)卵巣上皮性−粘液性癌に由来するヒト卵巣がん細胞系COV−644は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号07071908)から入手する。COV−644細胞系は、DMEM、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
25)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系SNU−840は、Korean Cell Line Bank(KCLB;カタログ番号00840)から入手する。SNU−840細胞系は、52.5%のRPMI1640培地、40%のウシ胎仔血清および7.5%のDMSO中で培養する。
26)卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVISEは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB1043)から入手する。OVISE細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
27)卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OAW42は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号85073102)から入手する。OAW42細胞系は、DMEM、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム(NaP)、20IU/lのウシインスリンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
28)卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVTOKOは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB1048)から入手する。OVTOKO細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
29)卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVMANAは、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB;カタログ番号JCRB1045)から入手する。OVMANA細胞系は、10%のウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
30)卵巣顆粒膜腫瘍に由来するヒト卵巣がん細胞系COV−434は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号07071909)から入手する。COV−434細胞系は、DMEM、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
31)卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OV56は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号96020759)から入手する。OV56細胞系は、DMEM:HAMS F12(1:1)、2mMのグルタミン、5%ウシ胎仔血清、0.5ug/mlのヒドロコルチゾンおよび10ug/mlのインスリン中で培養する。
32)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系SK−OV−3は、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号HTB−77)から入手する。SK−OV−3細胞系を、ATCCにより配合されたMcCoy’s 5a Medium Modified(カタログ番号30−2007)および10%ウシ胎仔血清中で培養する。
33)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系A2780は、European Collection of Cell Cultures(ECACC;カタログ番号93112519)から入手する。A2780細胞系は、RPMI1640、2mMのグルタミンおよび10%ウシ胎仔血清中で培養する。
34)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系IGROV−1は、EZ Biosystems(カタログ番号EZT−IGRO−1)から入手する。IGROV−1細胞系は、10%ウシ胎仔血清を伴うRPMI1640培地中で培養する。
35)卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系TOV−21Gは、American Type Culture Collection(ATCC;カタログ番号CRL−11730)から入手する。TOV−21G細胞系は、最終濃度1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムを含有するMCDB 105培地と最終濃度2.2g/Lの炭酸水素ナトリウムおよび15%のウシ胎仔血清を含有するMedium 199の1:1混合物中で培養する。
36)卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系OVCAR−5は、US National Cancer Institute NCI−60ヒトがん細胞系パネルから入手する。OVCAR−5細胞系を90%のRPMI1640および10%の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
(実施例3)
ROR1 IgG抗体の、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系への結合(フローサイトメトリーにより検出される)
a)PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626、KURAMOCHI、OVSAHO、SNU−119、COV362、OVCAR−4、COV318、TYK−nu、OVKATE、CAOV−4、OAW28、CAOV−3、59M、ONCO−DG−1、OVCAR−3、OVCAR−5、ES−2、COV−504、OV−90、RMUG−S、COV−644、SNU−840、OVISE、OAW42、OVTOKO、OVMANA、COV−434、OV56、SK−OV−3、A2780、IGROV−1、および/またはTOV−21Gを含めたヒト卵巣がん細胞系におけるROR1の発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定する。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、96ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞50,000個で再懸濁させ、Alexa488で標識された抗ヒトROR1抗体と共に4℃で30分間インキュベートする。全てのROR1およびアイソタイプ対照抗体を滴定し、0.01〜100nMの間の最終濃度範囲で解析する。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、FACS緩衝液で2回洗浄し、100ulのFACS緩衝液中に再懸濁させ、FACS Divaソフトウェアを作動させるCantoIIデバイス上で解析する。次いで、ROR1の発現を蛍光強度中央値(MFI)として定量化し、MFIをROR1抗体濃度の関数として示すグラフをプロットする。次いで、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用してEC50値を測定する。表2.1は、Mab1抗ROR1抗体の、ROR1陽性SK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系への結合についてのEC50を示す。ROR1 Mab1のSK−OV−3に対する結合について計算されるEC50は推定値であり、実際よりも低く見積もられる可能性がある。Mab1抗ROR1抗体は、PA−1細胞系(高レベルのROR1を発現することが後で見出された)に、SK−OV−3(低レベルのROR1を発現することが後で見出された)に対するよりも大きな効力で結合する。図2は、SK−OV−3細胞(A、白抜きの四角)およびPA−1細胞(B、白抜きの三角形)におけるMFIの増大をROR1 Mab2 IgGの濃度の関数として示す。最大強度は、10μg/mLの抗体濃度で、PA−1細胞において、SK−OV−3細胞に対しておよそ3倍に達することができた。
ROR1 IgG抗体の、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系への結合(フローサイトメトリーにより検出される)
a)PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626、KURAMOCHI、OVSAHO、SNU−119、COV362、OVCAR−4、COV318、TYK−nu、OVKATE、CAOV−4、OAW28、CAOV−3、59M、ONCO−DG−1、OVCAR−3、OVCAR−5、ES−2、COV−504、OV−90、RMUG−S、COV−644、SNU−840、OVISE、OAW42、OVTOKO、OVMANA、COV−434、OV56、SK−OV−3、A2780、IGROV−1、および/またはTOV−21Gを含めたヒト卵巣がん細胞系におけるROR1の発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定する。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、96ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞50,000個で再懸濁させ、Alexa488で標識された抗ヒトROR1抗体と共に4℃で30分間インキュベートする。全てのROR1およびアイソタイプ対照抗体を滴定し、0.01〜100nMの間の最終濃度範囲で解析する。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、FACS緩衝液で2回洗浄し、100ulのFACS緩衝液中に再懸濁させ、FACS Divaソフトウェアを作動させるCantoIIデバイス上で解析する。次いで、ROR1の発現を蛍光強度中央値(MFI)として定量化し、MFIをROR1抗体濃度の関数として示すグラフをプロットする。次いで、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用してEC50値を測定する。表2.1は、Mab1抗ROR1抗体の、ROR1陽性SK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系への結合についてのEC50を示す。ROR1 Mab1のSK−OV−3に対する結合について計算されるEC50は推定値であり、実際よりも低く見積もられる可能性がある。Mab1抗ROR1抗体は、PA−1細胞系(高レベルのROR1を発現することが後で見出された)に、SK−OV−3(低レベルのROR1を発現することが後で見出された)に対するよりも大きな効力で結合する。図2は、SK−OV−3細胞(A、白抜きの四角)およびPA−1細胞(B、白抜きの三角形)におけるMFIの増大をROR1 Mab2 IgGの濃度の関数として示す。最大強度は、10μg/mLの抗体濃度で、PA−1細胞において、SK−OV−3細胞に対しておよそ3倍に達することができた。
b)ヒト卵巣がん細胞PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、SW−626、KURAMOCHI、OVSAHO、SNU−119、COV362、OVCAR−4、COV318、TYK−nu、OVKATE、CAOV−4、OAW28、CAOV−3、59M、ONCO−DG−1、OVCAR−3、OVCAR−5、ES−2、COV−504、OV−90、RMUG−S、COV−644、SNU−840、OVISE、OAW42、OVTOKO、OVMANA、COV−434、OV56、SK−OV−3、A2780、IGROV−1および/またはTOV−21Gの細胞表面上の、ROR1抗原のコピー数を決定するために、Qifikit(Dako)法を使用する。卵巣腫瘍細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し(100μl/ウェル;350×gで5分間)、細胞100万個/mlに調整する。50μl(=細胞50万個)の細胞懸濁液を、示されている通り、96丸底ウェルプレートの各ウェルに移す。次いで、FACS緩衝液(PBS、0.1%のBSA)中で、25μg/mlの最終濃度まで(または飽和濃度に)希釈された、50μlのマウス抗ヒトROR1 IgG抗体(BioLegend、#357802)、またはマウスIgG2aアイソタイプ対照抗体(BioLegend、#401501)を添加し、暗所内、4℃で30分間、染色を実施する。次に、100μlのSet−up BeadsまたはCalibration Beadsを、別々のウェルに添加し、細胞ならびにビーズを、FACS緩衝液で2回洗浄する。細胞およびビーズを、Qifikitにより提供されている、フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体(飽和濃度の)を含有する、25μlのFACS緩衝液中に再懸濁させる。細胞およびビーズを、暗所内、4℃で45分間染色する。細胞を1回洗浄し、全ての試料を、100μlのFACS緩衝液に再懸濁させる。試料を、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア(例えば、FACS Divaソフトウェアを作動させるCantoIIデバイスまたはCellQUESTを使用するFACSCaliburフローサイトメーター)上で解析する。
表2.2に示される通り、ROR1抗原のコピー数/結合性部位を5つのヒト卵巣がん細胞系(ES−2、SK−OV−3、OVCAR−5、COLO−704およびPA−1)において測定し、発現のレベルは異なった。ES−2細胞は、ヒトROR1の抗原コピーを少しも発現しなかったのに対し、SKOV−3細胞は、低レベルのヒトROR1、OVCAR−5を発現し、COLO−704細胞は、中程度のレベルのヒトROR1を発現し、PA−1細胞は、高レベルのヒトROR1を発現した。
ROR1の発現の結果に基づいて、ROR1の発現レベルが高度、中程度および/または低度であるヒト卵巣がん細胞系を選択し、リダイレクトされたT細胞による細胞傷害作用アッセイにおいて腫瘍標的細胞として使用する。
(実施例4)
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作出
(実施例4.1)
抗CD3抗体の作出
以下のVHおよびVL領域のタンパク質配列を使用して、ヒトおよびカニクイザル交差反応性CD3ε抗体を作出した。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作出
(実施例4.1)
抗CD3抗体の作出
以下のVHおよびVL領域のタンパク質配列を使用して、ヒトおよびカニクイザル交差反応性CD3ε抗体を作出した。
CH2527_VH(配列番号21):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CH2527_VL(配列番号22)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CH2527_VL(配列番号22)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをPCRにより繋ぎ合わせて、それぞれ抗CD3抗体のVHおよびVL配列をコードするcDNAを合成した。
抗CD3抗体CH2527(配列番号21〜28)を使用して、以下の実施例において使用するT細胞二特異性抗体を作出した。
(実施例4.2)
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性1+1フォーマット:ROR1に対して一価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)x(Fab)抗体の作出
1+1の1アームフォーマット(すなわち、ROR1に対して一価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)×(Fab)抗体)の抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、実施例1で作出された抗ROR1抗体を用いて作製した。実施例1に記載されている、対応する抗ROR1 IgG1抗体の完全Fab(重鎖VHドメインおよび重鎖CH1ドメインに加えた、軽鎖VLドメインおよび軽鎖CLドメイン)をコードするcDNA、ならびに実施例4.1に記載されている抗CD3 VHおよび抗CD3 VLのcDNAを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ROR1抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗CD3抗体の重鎖および軽鎖を含む、4つのタンパク質鎖が関与した。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性1+1フォーマット:ROR1に対して一価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)x(Fab)抗体の作出
1+1の1アームフォーマット(すなわち、ROR1に対して一価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)×(Fab)抗体)の抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、実施例1で作出された抗ROR1抗体を用いて作製した。実施例1に記載されている、対応する抗ROR1 IgG1抗体の完全Fab(重鎖VHドメインおよび重鎖CH1ドメインに加えた、軽鎖VLドメインおよび軽鎖CLドメイン)をコードするcDNA、ならびに実施例4.1に記載されている抗CD3 VHおよび抗CD3 VLのcDNAを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ROR1抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗CD3抗体の重鎖および軽鎖を含む、4つのタンパク質鎖が関与した。
ROR1×CD3二特異性抗体ベクターを作出するために、IgG1由来の二特異性分子は、少なくとも、2つの顕著に異なる抗原性決定基CD3およびROR1に特異的に結合することが可能な、2つの抗原結合性部分を含む。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるFab断片である。Fab断片のうちの少なくとも1つは、Fab重鎖とFab軽鎖の定常ドメインを交換した、「Crossfab」断片である。Fab断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるFab断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価(1+1)でありうるか、またはCD3に対して一価、ROR1に対して二価でありえ、この場合、1つのFab断片を内側のCrossFabのN末端と融合する(2+1)。構築物の概略表示を図1に示す。構築物の配列を配列番号30〜36に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するHEK293 EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用してトランスフェクトすることによって作製する。1+1 CrossFab−IgG構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、1:1:1:1の比(「Fc(ノブ)ベクター」:「軽鎖ベクター」:「軽鎖CrossFabベクター」:「重鎖−CrossFabベクター」)でトランスフェクトする。
以下のFc含有抗ROR1/抗CD3 TCB(1+1)を制作するためには、配列表(表1)で言及した、それぞれの構築物/配列番号が必要とされる:
ROR1−TCB(1+1)、Fc含有:配列番号30、31、33、および36(図1B)
ROR1−TCB(1+1)、Fc含有:配列番号30、31、33、および36(図1B)
(実施例4.3)
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性2+1フォーマット:ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体の作出
2+1フォーマットによる抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体、すなわち、ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体は、腫瘍標的ROR1に優先的に結合し、CD3抗体シンクを回避し、したがって、腫瘍に焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いので、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有し得る。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性2+1フォーマット:ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体の作出
2+1フォーマットによる抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体、すなわち、ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体は、腫瘍標的ROR1に優先的に結合し、CD3抗体シンクを回避し、したがって、腫瘍に焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いので、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有し得る。
2+1フォーマットの抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体(すなわち、ROR1に対して二価であり、CD3に対して一価である、二特異性(Fab)2×(Fab)抗体を、実施例1において作出した抗ROR1抗体を用いて作製する。実施例1に記載されている、対応する抗ROR1 IgG1抗体の完全Fab(重鎖VHドメインおよび重鎖CH1ドメインに加えた、軽鎖VLドメインおよび軽鎖CLドメイン)をコードするcDNA、ならびに実施例4.1に記載されている抗CD3 VHおよび抗CD3 VLのcDNAを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ROR1抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗CD3抗体の重鎖および軽鎖を含む、4つのタンパク質鎖が含まれる。
ROR1×CD3二特異性抗体ベクターを作出するために、IgG1由来の二特異性分子は、少なくとも、2つの顕著に異なる抗原性決定基CD3およびROR1に特異的に結合することが可能な、2つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖を含むFab断片である。Fab断片のうちの少なくとも1つは、Fab重鎖と、Fab軽鎖の定常ドメインを交換した、「Crossfab」断片である。Fab断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるFab断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価(1+1)でありうるか、またはCD3に対して一価、ROR1に対して二価でありえ、この場合、1つのFab断片を内側のCrossFabのN末端と融合する(2+1)。構築物の概略表示を図1に示す;構築物の配列を配列番号30〜36に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するHEK293 EBNA細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して共トランスフェクトすることによって作製する。2+1 CrossFab−IgG構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、1:2:1:1の比(「Fc(ノブ)ベクター」:「軽鎖ベクター」:「軽鎖CrossFabベクター」:「重鎖−CrossFabベクター」)でトランスフェクトする。
以下の抗ROR1/抗CD3 TCB(2+1)を制作するためには、配列表(表1)で言及した、それぞれの構築物/配列番号が必要とされる:
ROR1−TCB(2+1)、Fc含有:配列番号30(2×)、31、32、および33(図1A)
ROR1−TCB(2+1)、Fc含有:配列番号30(2×)、31、32、および33(図1A)
(実施例4.4)
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性のポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個で/mLで播種する。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離する(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製する。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置する。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置く。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加する。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加する。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離する。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、懸濁液中で培養される、HEK293−EBNA細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性のポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの1日前に、HEK293−EBNA細胞を、6mMのL−グルタミンを補充した、Ex−Cell培地中に、生細胞150万個で/mLで播種する。最終的な産生容量1mL当たり、生細胞200万個を遠心分離する(210×gで5分間)。上清を吸引し、細胞を、100μLのCD CHO培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量1mL当たりのDNAは、1μgのDNA(重鎖:修飾重鎖:軽鎖:修飾軽鎖の比=1:1:2:1)を、100μLのCD CHO培地中で混合することにより調製する。0.27μLのポリマー溶液(1mg/mL)を添加した後で、混合物を、15秒間ボルテックスし、室温で10分間放置する。10分後、再懸濁させた細胞およびDNA/ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス(37℃、5%のCO2)内に置く。3時間のインキュベーション時間後に、6mMのL−グルタミン、1.25mMのバルプロ酸、および12.5%のPepsoy(50g/L)を補充した、800μLのEx−Cell Mediumを、最終的な産生容量1mL当たり添加する。24時間後、70μLのフィード溶液を、最終的な産生容量1mL当たり添加する。7日後、または細胞の生存率が、70%と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離する。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、1つまたは2つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。
アフィニティーステップのために、上清を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、pH7.5 6CVで平衡化させたプロテインAカラム(HiTrap Protein A FF、5mL、GE Healthcare)上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、20mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、100mMのグリシン、pH3.0による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、0.5Mのリン酸ナトリウム、pH8.0(1:10)で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、1:10に希釈し、カチオン交換カラム(Poros 50 HS、Applied Biosystems)へとロードする。それぞれ、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、pH5.0、および20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH5.0である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、2回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム、20mMのクエン酸ナトリウム、20mMのトリス、100mMの塩化ナトリウム、pH8.5を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Tween20を伴うかまたは伴わない、20mMのヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム、pH6.0と共に、XK16/60 HiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
抗体濃度の決定は、0.1%の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、280nmにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、GPMAWソフトウェア(Lighthouse data)により計算する。
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、25mMのリン酸カリウム、125mMの塩化ナトリウム、200mMのL−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v)のアジ化ナトリウム、pH6.7による緩衝液中で、CE−SDS(Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Life Sciences))およびHPLC(TSKgel G3000 SW XL解析用サイズ除外カラム(Tosoh))のそれぞれにより決定する。
最終タンパク質調製物の分子量を検証し、最終タンパク質溶液中の分子が均質になるように調製されたことを確認するために、液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)を使用する。脱グリコシル化ステップをまず実施する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、PNGaseF(ProZyme)で処理する。したがって、2Mのトリス2μlを、濃度を0.5mg/mlとする20μgのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のpHを、pH7.0へと調整する。0.8μgのPNGaseFを、添加し、37℃で12時間インキュベートする。次いで、LC−MSオンライン検出を実施する。LC−MS法は、TOF 6441質量分析計(Agilent)へとカップリングさせた、Agilent HPLC 1200上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Macherey Nagel Polystereneカラム;RP1000−8(粒子サイズを8μmとする、4.6×250mm;カタログ番号719510)上で実施する。溶離液Aは、水中に5%のアセトニトリル、および0.05%(v/v)のギ酸であり、溶離液Bは、95%のアセトニトリル、5%の水、および0.05%のギ酸である。流量は、1ml/分であった。分離は、40℃で実施し、前に記載した処理により、6μg(15μl)のタンパク質試料を得る(表3)。
最初の4分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づける。ESI源は、乾燥ガス流量を12l/分とし、温度を350℃とし、噴霧器圧力を60psiとして動作させた。MSスペクトルは、陽イオンモードにおいて、380Vのフラグメンター電圧および700〜3200m/zの質量範囲を使用して取得する。MSデータは、計器ソフトウェアにより、4〜17分間にわたり取得する。
(実施例5)
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、卵巣がん細胞およびT細胞への結合(フローサイトメトリーにより測定される通り)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626およびヒト白血病性T細胞Jurkat(ATCC TIB−152)上に発現するヒトCD3へのそれらの結合について解析する。Jurkat T細胞を10%のウシ胎仔血清を補充したRPMI中で培養する。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ViCellを使用して細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、0.1%のBSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、1ml当たりの細胞2×106個に調整する。この細胞懸濁液100μlを、丸底96ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割する。細胞を含有するウェルに、30μlの、Alexa488で標識された抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体または対応するIgG対照を添加して、1nM〜500nM(Jurkat T細胞)、または0.1nM〜100nM(ヒト卵巣がん細胞)の最終濃度を得た。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体および対照IgGは同じモル濃度で使用する。4℃で30分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、150μl/ウェルの、BSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、次いで、細胞を、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、ヒト卵巣がん細胞およびT細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ヒト卵巣がん細胞またはCD3を発現するJurkat T細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムおよびドットプロットにプロットする。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートする。次いで、細胞を、Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体についての蛍光強度中央値を抗体濃度の関数としてプロットする。抗ROR1/抗CD3抗体のヒト卵巣がん細胞への結合についてのEC50値(最大結合の50%に達するのに要請される抗体の濃度を示す)を、Prism(GraphPad)を使用して測定する。図2に示される通り、抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される通り、ROR1 Mab1 IgG(白抜きの四角)およびROR1 Mab1−TCB(塗りつぶし四角)の、SK−OV−3卵巣がん細胞系(A)およびPA−1ヒト卵巣がん細胞系(B)における濃度依存的結合が見られた。このような陽性シグナルは、CD3だけに結合し、ROR1に結合しない対照TCBをSK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系の両方で試験した場合には観察されなかった(AおよびB;塗りつぶし丸)。図3に示される通り、ROR1 Mab1−TCBcvおよび対照TCBの、Jurkat T細胞における濃度依存的結合が見られ、これにより、両方のTCB抗体が、T細胞上のCD3に結合することが確認される。
抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、卵巣がん細胞およびT細胞への結合(フローサイトメトリーにより測定される通り)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626およびヒト白血病性T細胞Jurkat(ATCC TIB−152)上に発現するヒトCD3へのそれらの結合について解析する。Jurkat T細胞を10%のウシ胎仔血清を補充したRPMI中で培養する。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ViCellを使用して細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、0.1%のBSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、1ml当たりの細胞2×106個に調整する。この細胞懸濁液100μlを、丸底96ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割する。細胞を含有するウェルに、30μlの、Alexa488で標識された抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体または対応するIgG対照を添加して、1nM〜500nM(Jurkat T細胞)、または0.1nM〜100nM(ヒト卵巣がん細胞)の最終濃度を得た。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体および対照IgGは同じモル濃度で使用する。4℃で30分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、150μl/ウェルの、BSAを含有するFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、次いで、細胞を、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の、ヒト卵巣がん細胞およびT細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ヒト卵巣がん細胞またはCD3を発現するJurkat T細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムおよびドットプロットにプロットする。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し(350×gで5分間)、120μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートAlexaFluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti−human IgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;109−606−008)と共に、4℃でさらに30分間インキュベートする。次いで、細胞を、Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体についての蛍光強度中央値を抗体濃度の関数としてプロットする。抗ROR1/抗CD3抗体のヒト卵巣がん細胞への結合についてのEC50値(最大結合の50%に達するのに要請される抗体の濃度を示す)を、Prism(GraphPad)を使用して測定する。図2に示される通り、抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される通り、ROR1 Mab1 IgG(白抜きの四角)およびROR1 Mab1−TCB(塗りつぶし四角)の、SK−OV−3卵巣がん細胞系(A)およびPA−1ヒト卵巣がん細胞系(B)における濃度依存的結合が見られた。このような陽性シグナルは、CD3だけに結合し、ROR1に結合しない対照TCBをSK−OV−3卵巣がん細胞系およびPA−1卵巣がん細胞系の両方で試験した場合には観察されなかった(AおよびB;塗りつぶし丸)。図3に示される通り、ROR1 Mab1−TCBcvおよび対照TCBの、Jurkat T細胞における濃度依存的結合が見られ、これにより、両方のTCB抗体が、T細胞上のCD3に結合することが確認される。
(実施例6)
卵巣がん細胞の存在下における、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体との会合時のT細胞の活性化(フローサイトメトリー)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体をまた、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626の存在下における、CD4+およびCD8+T細胞上の、早期活性化マーカーCD69および/または後期活性化マーカーCD25の表面発現を査定することにより、フローサイトメトリーにより、T細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せる。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たす。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄する(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系供給元(実施例2を参照されたい)に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体によって誘導されるT細胞の活性化を調査するために、ヒト卵巣がん細胞を示されている濃度の二特異性抗体に曝露する(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。次いで、PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に、最終的なエフェクターと標的の比(E:T)比、10:1で添加する。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後に、T細胞の活性化を評価する。インキュベーション期間後、細胞を、遠心分離により(350×gで5分間)ウェルから収集し、ペレット化し、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄する。ヒトCD4(マウスIgG1、K;クローンRPA−T4)、CD8(マウスIgG1、K;クローンHit8a;BD型番555635)、CD69(マウスIgG1;クローンL78;BD型番340560)およびCD25(マウスIgG1、K;クローンM−A251;BD型番555434)に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、FACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、製造元のプロトコールに従って、4℃で30分間実施する。細胞を、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液で2回洗浄し、次いで、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。CD69活性化マーカーまたはCD25活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、CD4+およびCD8+T細胞集団をゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することによって決定する。図4に示される通り、ROR1 Mab1−TCB(四角)は、ROR1の発現が低度なSK−OV−3標的細胞の存在下で、CD4+T細胞(A)およびCD8+T細胞(B)において観察された、CD69早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照TCB(三角形)は、T細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である1nMのROR1 Mab1−TCBにおいて、48時間のインキュベーション後、最大25%の活性化CD4 T細胞および20%の活性化CD8 T細胞が既に存在していた。
卵巣がん細胞の存在下における、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体との会合時のT細胞の活性化(フローサイトメトリー)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体をまた、ROR1陽性ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626の存在下における、CD4+およびCD8+T細胞上の、早期活性化マーカーCD69および/または後期活性化マーカーCD25の表面発現を査定することにより、フローサイトメトリーにより、T細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せる。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たす。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄する(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系供給元(実施例2を参照されたい)に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存する。抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体によって誘導されるT細胞の活性化を調査するために、ヒト卵巣がん細胞を示されている濃度の二特異性抗体に曝露する(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。次いで、PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に、最終的なエフェクターと標的の比(E:T)比、10:1で添加する。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後に、T細胞の活性化を評価する。インキュベーション期間後、細胞を、遠心分離により(350×gで5分間)ウェルから収集し、ペレット化し、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄する。ヒトCD4(マウスIgG1、K;クローンRPA−T4)、CD8(マウスIgG1、K;クローンHit8a;BD型番555635)、CD69(マウスIgG1;クローンL78;BD型番340560)およびCD25(マウスIgG1、K;クローンM−A251;BD型番555434)に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、FACS Stain緩衝液(BD Biosciences)中、製造元のプロトコールに従って、4℃で30分間実施する。細胞を、150μl/ウェルのFACS Stain緩衝液で2回洗浄し、次いで、ウェル1つ当たり100ulのBD Fixation緩衝液(BD Biosciences、型番554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μlのFACS緩衝液中に再懸濁させ、BD FACS CantoIIを使用して解析する。CD69活性化マーカーまたはCD25活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、CD4+およびCD8+T細胞集団をゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することによって決定する。図4に示される通り、ROR1 Mab1−TCB(四角)は、ROR1の発現が低度なSK−OV−3標的細胞の存在下で、CD4+T細胞(A)およびCD8+T細胞(B)において観察された、CD69早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照TCB(三角形)は、T細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である1nMのROR1 Mab1−TCBにおいて、48時間のインキュベーション後、最大25%の活性化CD4 T細胞および20%の活性化CD8 T細胞が既に存在していた。
(実施例7)
ヒト卵巣がん細胞の細胞溶解(LDH放出アッセイ)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、ヒト卵巣がん細胞におけるT細胞媒介性細胞傷害作用の誘導について解析する。ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せる。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たす。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄する(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系供給元(実施例2を参照されたい)の示唆に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存する。殺滅アッセイのために、抗体を、示されている濃度で添加する(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に最終的なエフェクターと標的の比(E:T)比、10:1で添加する。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後、アポトーシス性/壊死性細胞により細胞の上清中に放出されるLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により、製造元の指示書に従い、標的細胞による殺滅を評価する。標的細胞の最大溶解(=100%)は、1%のTriton X−100を伴う、標的細胞のインキュベーションによって実現される。最小溶解(=0%)は、エフェクター細胞を伴い、二特異性構築物を伴わずに共インキュベートされた標的細胞を指す。LDH放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットする。IC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定し、LDH放出の50%を結果としてもたらすT細胞二特異性抗体の濃度として決定した。図5に示される通り、ROR1 Mab1−TCB(四角)は、ROR1の発現が高度なPA−1卵巣がん細胞(A)、ROR1の発現が中程度なCOLO−704(B)およびOVCAR−5(C)卵巣がん細胞およびROR1の発現が低度なSK−OV−3卵巣がん細胞(D)の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、CD3だけに結合する対照TCB(A、B、C;丸)は、臨床的に関与性の濃度(すなわち、最大10nM)において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
ヒト卵巣がん細胞の細胞溶解(LDH放出アッセイ)
実施例4において作出した抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体を、ヒト卵巣がん細胞におけるT細胞媒介性細胞傷害作用の誘導について解析する。ヒト卵巣がん細胞系PA−1、MCAS、EFO−21、COLO−704、および/またはSW−626。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン/EDTAにより採取し、洗浄し、平底96ウェルプレートを使用して、細胞25,000個/ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物(軟膜)から調製する。採取したての血液を、滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma、#H8889)上に、層状に載せる。遠心分離の後(室温、450×gで30分間)、PBMCを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、PBMCを、新しいfalconチューブに移し、その後、50mlのPBSを満たす。混合物を遠心分離し(室温、400×gで10分間)、上清を廃棄し、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄する(350×gで10分間の遠心分離ステップ)。結果として得られるPBMC集団を、自動的にカウントし(ViCell)、さらなる使用まで(24時間を超えない)、細胞系供給元(実施例2を参照されたい)の示唆に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、5%のCO2、37℃で保存する。殺滅アッセイのために、抗体を、示されている濃度で添加する(0.1pM〜200nMの範囲、三連で)。PBMCを、ヒト卵巣がん標的細胞に最終的なエフェクターと標的の比(E:T)比、10:1で添加する。5%のCO2、37℃で24〜48時間のインキュベーション後、アポトーシス性/壊死性細胞により細胞の上清中に放出されるLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により、製造元の指示書に従い、標的細胞による殺滅を評価する。標的細胞の最大溶解(=100%)は、1%のTriton X−100を伴う、標的細胞のインキュベーションによって実現される。最小溶解(=0%)は、エフェクター細胞を伴い、二特異性構築物を伴わずに共インキュベートされた標的細胞を指す。LDH放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ROR1/抗CD3 T細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットする。IC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定し、LDH放出の50%を結果としてもたらすT細胞二特異性抗体の濃度として決定した。図5に示される通り、ROR1 Mab1−TCB(四角)は、ROR1の発現が高度なPA−1卵巣がん細胞(A)、ROR1の発現が中程度なCOLO−704(B)およびOVCAR−5(C)卵巣がん細胞およびROR1の発現が低度なSK−OV−3卵巣がん細胞(D)の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、CD3だけに結合する対照TCB(A、B、C;丸)は、臨床的に関与性の濃度(すなわち、最大10nM)において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
Claims (39)
- 卵巣がんの処置における使用のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体。
- 初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とする、請求項1に記載の二特異性抗体。
- 細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、請求項2のいずれかに記載の二特異性抗体。
- 抗CD3ε抗体の1つのFab断片(CD3 Fab)と、抗ROR1抗体の1つまたは2つのFab断片(ROR1 Fab)と、0または1つのFc断片とからなることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 二価であり、ROR1に特異的に結合する一価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 三価であり、ROR1に特異的に結合する二価抗ROR1抗体と、CD3に特異的に結合する抗体の一価Fab断片とを含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 構築物、
a)CD3 Fab−ROR1 Fab、
b)CD3 Fab−ROR1 Fab−ROR1 Fab、
c)Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab、および
d)ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fab
の群から選択されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - 構築物が、
a)構成ブロック、配列番号30(2×)、31、32、および33からなる構築物(図1A)
b)構成ブロック、配列番号30、31、33、および36からなる構築物(図1B)
c)構成ブロック、配列番号30(2×)、33、および35からなる構築物(図1C)、
d)構成ブロック、配列番号30、33、および34からなる構築物(図1D)
の群から選択されることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - 配列番号31、33、34、35内の抗CD3ε抗体配列VHおよびVLが、配列番号21および22のそれぞれのCH1およびCL配列により置きかえられていることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- Fcドメインを含むことを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- a)前記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
b)前記標的のうちの他の一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と
を含み、可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられている
ことを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - 前記抗CD3抗体の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置きかえられていることを特徴とする、請求項11に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3εに特異的に結合する抗体部分が、
a)配列番号12、13および14のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号15、16および17のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号26、27および28のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - ヒトROR1に特異的に結合する抗体部分が、配列番号7、8および9のCDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変重鎖ドメインVHと、配列番号3、4および5のCDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることを特徴とする、請求項1から13のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- さらに、前記第1の抗体の第2のFab断片(「ROR1−Fab」)を含むことを特徴とする、請求項14に記載の二特異性抗体。
- 抗ROR1抗体MAB1のCDR配列を含むことを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- 抗ROR1抗体MAB1のVHおよびVL配列を含むか、または抗ROR1抗体MAB1のVH、VL、CH1、およびCL配列を含む抗体であることを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Fab断片が、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 H2C)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むか、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHと、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体(CDR MAB CD3 CH2527)の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLとを含むことを特徴とすることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - ヒトCD3に特異的に結合する前記抗体部分が、
前記可変ドメインが、
a)配列番号10および11(VHVL MAB CD3 H2C)の可変ドメインであるか、または、
b)配列番号21および22(VHVL MAB CD3 CH2527)の可変ドメインである
ことを特徴とすることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の二特異性抗体。 - ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、重鎖CDR、配列番号7のCDR1H、配列番号8のCDR2H、配列番号9のCDR3Hを含む可変ドメインVHを含むことと、軽鎖CDR、配列番号3のCDR1L、配列番号4のCDR2L、配列番号5のCDR3Lを含む可変ドメインVLを含むこととを特徴とする(CDR MAB1)ことを特徴とする、請求項1から19のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトROR1に特異的に結合する前記Fab断片が、配列番号10のVHと配列番号11のVLとを含むことを特徴とする(VHVL MAB1)ことを特徴とする、請求項1から20のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
- ヒトCD3εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
a)配列番号12、13および14の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号15、16および17の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられること、または、
b)配列番号23、24および25の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHにより、前記可変ドメインVHが置きかえられ、配列番号26、27および28の軽鎖CDRを、それぞれ、前記抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLにより、前記可変ドメインVLが置きかえられることを特徴とする、請求項21に記載の抗体。 - 一方の重鎖のCH3ドメインおよび他方の重鎖のCH3ドメインの各々が、抗体のCH3ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
a)前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のCH3ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと、
b)前記二特異性抗体内の前記第1のCH3ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第2のCH3ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第2のCH3ドメインの前記界面内に、前記第1のCH3ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のCH3ドメインが変更されていることと
を特徴とする、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒトIgG1 Fcパート内に、Pro329のグリシンによるアミノ酸置換および/または置換L234AおよびL235Aを含むことを特徴とする、請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体。
- 構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの抗体であり、前記抗CD3抗体のFab断片内にCL/CH1クロスオーバーを含むことを特徴とする、請求項24に記載の抗体。
- 構築物ROR1 Fab−Fc−CD3 Fab−ROR1 Fabの抗体であり、Pro329のグリシンによるアミノ酸置換ならびにLeu234のアラニンによる置換およびLeu235のアラニンによる置換を伴うヒトIgG1 Fcパートを含むことを特徴とする、請求項24または25に記載の抗体。
- 2つの標的、ヒトCD3ε(CD3)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(ROR1)に特異的に結合することを特徴とし、初代B−CLL細胞において、1nMの濃度で、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体。
- 2つの標的、ヒトCD3ε(CD3)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(ROR1)に特異的に結合することを特徴とし、細胞ベースのアッセイにおいて、ROR1陽性初代B−CLL細胞を使用し、1nMの抗体濃度で使用した場合、37℃で2時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、0時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のROR1陽性初代B−CLL細胞への結合の際における平均蛍光強度(MFI)が、37℃で2時間のインキュベーション後の再測定のときに、50%を超えて低減しない、好ましくは30%を超えて低減しないことを意味する、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体。
- マウスにおける、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、12時間より長い、好ましくは、3日間またはそれより長い消失半減期を特徴とする、請求項1から28に記載の抗体。
- ROR1陽性卵巣がん細胞系PA−1および/またはCOLO−704への結合についてのEC50値であって、30nMまたはそれを下回る、好ましくは、15nMおよびそれを下回るEC50値を示すことを特徴とする、請求項1から29に記載の抗体。
- ヒトT細胞の存在下における、ROR1発現卵巣がん細胞PA−1および/またはCOLO−704のリダイレクトされた殺滅を、10nM未満、好ましくは、1nM、好ましくは、0.05nM、好ましくは、0.02nM、好ましくは、0.002nMおよびそれを下回るEC50で誘導するその能力を特徴とする、請求項1から30に記載の抗体。
- 標準的な製剤緩衝液中、37℃で、好ましくは、40℃で、10日間、好ましくは、最長2週間、好ましくは、最長4週間保存された前記抗体が、高分子量(HMW)分子種および/または低分子量(LMW)分子種および/または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−80℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、10%を超える変化(Δ)、好ましくは、5%を超える変化(Δ)を結果としてもたらさないことを特徴とする、請求項1から31に記載の抗体。
- 卵巣がんの処置における使用のための請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 卵巣がんの処置における使用のための医薬としての使用のための、請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体、または請求項33に記載の医薬組成物。
- ROR1陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体、または請求項33に記載の医薬組成物。
- 卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体、または請求項33に記載の医薬組成物。
- 卵巣がんの処置のため、およびROR1を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体、または請求項33に記載の医薬組成物。
- 卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、2つの標的、ヒトCD3ε(さらにまた、「CD3」とも称する)およびヒトROR1の細胞外ドメイン(さらにまた、「ROR1」とも称する)に特異的に結合する二特異性抗体の使用。
- 卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、前記患者に治療有効量の二特異性抗体を投与するステップを含む方法。
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