JP2017532955A - 造血幹細胞におけるヌクレアーゼ媒介性ゲノム工学および補正のための方法および組成物 - Google Patents

造血幹細胞におけるヌクレアーゼ媒介性ゲノム工学および補正のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、ゲノム工学の分野、特に、造血幹細胞のゲノムの標的化された改変の分野にある。鎌状赤血球症等、遺伝性疾患に関与するタンパク質をコードする１種または複数の遺伝子の発現を変更するため、またはそれらを補正するための（例えば、疾患において欠如する、欠乏するもしくは異常なタンパク質および／またはこれらのタンパク質を調節するタンパク質を産生するための）方法および組成物が本明細書で開示される。本発明は、遺伝子療法およびゲノム工学における使用のための組成物および方法について記載する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年９月１６日に出願された米国仮出願第６２／０５１，１５９号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
本開示は、ゲノム工学の分野、特に、造血細胞のゲノムの標的化された改変の分野にある。
多数の疾患のための遺伝子療法における最も有望なアプローチの１つは、幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子改変の使用と、その後の患者における改変された細胞の移植および生着に関与する。導入された幹細胞が、長期持続および多系列分化を呈する場合が特に有望である。最も一般的にはＣＤ３４細胞表面マーカーの発現に基づき濃縮される細胞の形態である造血幹細胞は、容易に得ることができ、移植後に全造血系列を再構築することができる長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含有するため、特に有用な細胞集団である。
ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための種々の方法および組成物が説明されてきた。かかる標的化された開裂事象を使用して、例えば、標的化された変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、任意の生物由来の細胞中の所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号、および同第２０１５００５６７０５号ならびに米国出願第１４／７０６，７４７号を参照されたい。これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等、エラーボーン過程による切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同性誘導型修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための操作された開裂系の使用に関与する。続いて起こる修復経路（ＮＨＥＪ対ＨＤＲまたはその両方）は典型的に、修復鋳型の存在および数種類の競合する修復経路の活性に依存する。
外部から供給される修復鋳型（例えば、ドナー）の非存在下における二本鎖切断の導入は、細胞ＮＨＥＪ経路により導入された変異による、標的化された遺伝子の不活性化のために一般的に使用される。ＮＨＥＪ経路は、標準的なＫｕ依存性経路、および開裂部位付近の直列反復配列の短いひとつながりを活用するマイクロホモロジー媒介末端結合に基づく代替的なＫｕ非依存性経路に分けることができる。これら２種のＮＨＥＪ経路による遺伝子編集後の挿入および／または欠失（「インデル」）のパターンは異なり、これにより、適用に応じて変異の機能的意義に差を生じ得る。
二本鎖切断に隣接する配列に対し相同性を有する区間を保有する外部から供給されるドナーの存在下で、ドナー分子を使用した相同性誘導型遺伝子修復（ＨＤＲ）を使用して、ＤＮＡの単一塩基または小区間の配列を変化させることができる（「遺伝子補正」）、あるいはその一方で、所定のゲノム位置への発現カセット全体の標的化挿入（「遺伝子付加」）のために使用することができる。
操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の特異的ヌクレアーゼの使用により、または特異的開裂をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、開裂を生じることができる。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および第８，９３２，８１４号ならびに米国特許公開第２０１５００５６７０５号を参照のこと。さらに、標的化ヌクレアーゼは、ゲノム編集および遺伝子療法における使用の可能性も有し得るアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）系（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Ｓｗａｒｔｓら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁を参照）に基づき開発されている。
上述のヌクレアーゼ系のうち１種を使用した標的化開裂を開発して、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ媒介性過程のいずれかを使用して特異的標的位置へと核酸を挿入することができる。しかし、細胞へのヌクレアーゼ系およびドナーの両方の送達が問題となる場合がある。例えば、細胞へのプラスミドの形質導入によるドナーまたはヌクレアーゼの送達は、レシピエント細胞、特に、初代細胞であるため細胞株由来の細胞ほど頑強ではない細胞にとって有毒性となり得る。
ＣＤ３４＋幹または前駆細胞は、自己再生するその能力、および／またはリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および骨髄系列（例えば、単球、赤血球、好酸球、好塩基球および好中球）の細胞に分化するその能力によって特徴付けられる、不均一な細胞セットである。これらの不均一な性質は、ＣＤ３４＋幹細胞集団内には、特異的な群の多分化能（系列が拘束されているか否か）を反映することが多い複数の亜群が存在するという事実に起因する。例えば、ＣＤ３８−であるＣＤ３４＋細胞は、より始原的で未熟なＣＤ３４＋前駆細胞（長期造血前駆細胞とも称される）である一方、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋である細胞（短期造血前駆細胞）は、系列が拘束されている（Ｓｔｅｌｌａら（１９９５年）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８０巻：３６７〜３８７頁を参照）。続いてこの集団が、分化経路を下ってさらに進行すると、ＣＤ３４マーカーは失われる。ＣＤ３４＋幹細胞は、臨床細胞療法における莫大な潜在力を有する。
赤血球細胞（ＲＢＣ）または赤血球は、血液の主要な細胞構成成分である。実際に、ＲＢＣは、ヒトにおける細胞の４分の１を占める。成熟ＲＢＣは、核およびヒトにおける多くの他の細胞小器官を欠き、組織へと酸素を運搬し、組織から二酸化炭素を運び出し、除去のために肺に戻すように機能する、ＲＢＣ中に存在する金属結合タンパク質であるヘモグロビンに満ちている。このタンパク質は、ＲＢＣの乾燥重量のおよそ９７％を構成し、血液の酸素運搬能力を約７０倍増加させる。ヘモグロビンは、２本のα様グロビン鎖および２本のβ様グロビン鎖ならびに４個のヘム基を含むヘテロ四量体である。成体では、α２β２四量体は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）または成体ヘモグロビンと称される。典型的には、アルファおよびベータグロビン鎖は、およそ１：１の比で合成され、この比は、ヘモグロビンおよびＲＢＣ安定化の観点から重大な意味を持つと思われる。実際に、ある１種類のグロビン遺伝子が不適切に発現される事例において（後述を参照）、この１：１の比を回復させるような他の種類のグロビンの発現の低下（例えば、特異的ｓｉＲＮＡを使用）は、変異体細胞表現型のある側面を軽減する（Ｖｏｏｎら（２００８年）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９３巻（８号）：１２８８頁を参照）。胎児の発達において、異なる型のヘモグロビンである胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）が産生され、このヘモグロビンは、母親の血流を経て胎児の系へと酸素を送達することができるように、ヘモグロビンＡよりも高い酸素に対する結合親和性を有する。胎児性ヘモグロビンは、２本のαグロビン鎖も含有するが、成体β−グロビン鎖の代わりに、２本の胎児γ−グロビン鎖を有する（すなわち、胎児性ヘモグロビンはα２γ２）。妊娠のおよそ３０週目に、胎児におけるγグロビンの合成が降下し始める一方、βグロビンの産生が増加する。およそ１０ヶ月齢までに、新生児のヘモグロビンは、ほとんど全てα２β２であるが、一部のＨｂＦは成人期まで存続する（総ヘモグロビンのおよそ１〜３％）。γからβへの産生の切り換えの調節は極めて複雑であり、γグロビンの発現下方調節と同時のβグロビン発現の上方調節に主に関与する。
ヘモグロビン鎖をコードする配列における遺伝的欠損は、鎌状赤血球貧血およびサラセミアを含む、異常ヘモグロビン症として公知の多数の疾患の原因となり得る。異常ヘモグロビン症患者の大部分において、γグロビンをコードする遺伝子は存在し続けるが、上述の通り分娩前後に生じる正常遺伝子抑制のため、発現は相対的に低くなる。
その大部分はサハラ以南のアフリカ系の人々であるが、米国における５０００名に１名が、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有することが推定される。鎌状赤血球ヘテロ接合性には、マラリアからの保護に対して利益があると思われるため、サハラ以南のアフリカでは集団の３分の１が鎌状赤血球の形質を有すると推定されるように、この形質は、長い時間選択されてきた可能性がある。鎌状赤血球症は、アミノ酸番号６のグルタミン酸の代わりにバリンが使用された（ＤＮＡレベルではＧＡＧからＧＴＧ）、β−グロビン遺伝子における変異に起因し、その結果得られるヘモグロビンは、「ヘモグロビンＳ」または「ＨｂＳ」と称される。より低酸素の条件下では、デオキシ型のＨｂＳのコンフォメーションシフトは、ＥおよびＦヘリックスの間のタンパク質における疎水性パッチを露出させる。ヘモグロビンのベータ鎖の６位の疎水性残基のバリンは、疎水性パッチと会合することができ、ＨｂＳ分子を凝集させ、線維性沈殿物を形成する。このような凝集物は続いて、ＲＢＣの異常または「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性の損失を生じる。鎌状化ＲＢＣは、毛細血管床に押し込むことができなくなり、鎌状赤血球患者における血流閉塞発作を生じ得る。加えて、鎌状化したＲＢＣは、正常ＲＢＣよりも脆弱であり、溶血する傾向があり、最終的に、患者に貧血を引き起こす。
鎌状赤血球患者の処置および管理は、急性エピソードにおける抗生物質処置、疼痛管理および輸血に関与する一生の命題である。アプローチの１つは、一部にはγグロビンの産生を増加させることによりその効果を発揮する、ヒドロキシ尿素の使用である。慢性ヒドロキシ尿素療法の長期副作用は未だ不明であるが、処置は、望まれない副作用を生じ、患者毎に可変的な有効性を有する場合がある。鎌状赤血球処置の有効性の増加にもかかわらず、患者の平均余命は依然として、５０代半ばから後半でしかなく、疾患の関連する罹患率は、患者のクオリティオブライフに著明な影響を有する。
米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書
よって、ゲノム編集に使用して、異常遺伝子を補正またはその他の発現を変更し、例えば、鎌状赤血球症等の異常ヘモグロビン症を処置することができる、追加的な方法および組成物の必要が依然としてある。
鎌状赤血球症等、遺伝性疾患に関与するタンパク質をコードする１種または複数の遺伝子の発現を変更するため、またはそれらの遺伝子を補正するための（例えば、疾患において欠如する、欠乏するもしくは異常なタンパク質および／またはこれらのタンパク質を調節するタンパク質を産生する）方法および組成物が、本明細書に開示されている。本発明は、遺伝子療法およびゲノム工学における使用のための組成物および方法について記載する。
このようなタンパク質の変更は、これらの遺伝性疾患の処置をもたらすことができる。特に、ゲノム編集は、異常遺伝子の補正、野生型遺伝子の挿入または内在性遺伝子の発現変化に使用される。アプローチの１つは、欠陥のある内在性βグロビン遺伝子が標的化され、変異体配列が置き換えられる遺伝子補正の使用に関与する。アプローチの１つは、幹細胞（例えば、造血幹細胞またはＲＢＣ前駆体）の改変の使用にさらに関与し、この幹細胞は次に、異常ヘモグロビン症の処置のために、患者への生着に使用することができる。
一態様では、例えば、同じ種類の細胞または細胞株の野生型ゲノム配列と比較して、遺伝子改変された細胞または細胞株が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、細胞は、遺伝子改変されたＲＢＣ前駆体（「ＨＳＣ」として公知の造血幹細胞）を含む。細胞または細胞株は、改変についてヘテロ接合またはホモ接合となることができる。改変は、挿入、欠失および／またはこれらの組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＨＳＣは、野生型遺伝子（例えば、グロビン遺伝子）が挿入および発現されるように、ならびに／または内在性異常遺伝子が補正されるように、操作されたヌクレアーゼおよびドナー核酸により改変される。ある特定の実施形態では、改変（例えば、挿入）は、ヌクレアーゼ結合および／もしくは開裂部位においてまたはその付近のものであり、開裂および／もしくは結合部位の部位の上流もしくは下流の１〜３００（もしくはその間のいずれかの数の塩基対）塩基対以内の配列に対する改変；結合および／もしくは開裂部位のいずれか一方の側の１〜１００塩基対（もしくはその間のいずれかの数の塩基対）以内の改変；結合および／もしくは開裂部位のいずれか一方の側における１〜５０塩基対（もしくはその間のいずれかの数の塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合部位および／もしくは開裂部位の１もしくは複数塩基対に対する改変が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号２３もしくは２４においてまたはその付近（例えば、１〜３００塩基対もしくはその間のいずれかの数の塩基対）のものである。他の実施形態では、改変は、配列番号２３または２４の１〜１００塩基対（またはその間のいずれかの数の塩基対）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号２３および／または配列番号２４内にあり、例えば、配列番号２３または２４のいずれかにおける１または複数塩基対の改変である。一部の事例において、挿入のための野生型遺伝子配列は、野生型βグロビンをコードする。他の事例において、内在性異常遺伝子は、βグロビン遺伝子であり、例えば、内在性異常ヒトベータ−ヘモグロビン（Ｈｂｂ）遺伝子における少なくとも１個の変異を補正する１個または複数のゲノム改変がなされる。一部の態様では、ベータグロビン遺伝子の改変は、転写されたＲＮＡの適切なスプライシングを可能にする。他の態様では、ポリペプチド配列の第６位における不正確なバリンアミノ酸をコードするコドンＧＴＧが、野生型ポリペプチドに存在するグルタミン酸をコードするＧＡＧに変更されるように、ベータグロビン遺伝子の改変は、鎌状アレルにおける変異を補正する。本明細書に記載されている遺伝子改変された幹細胞に由来する、部分的にまたは完全に分化した細胞も提供される（例えば、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆体細胞）。本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物等、組成物も提供される。
別の態様において、ゲノムにおける目的の領域（例えば、βグロブリン遺伝子）における標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、１個または複数個の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含むＺＦＰが、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を開裂させるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、１個または複数個の操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含むＺＦＮである。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態において、開裂ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子における標的部位を認識する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、５または６個のジンクフィンガードメインを含み、グロビン遺伝子における標的部位を認識する（例えば、表１に示す認識ヘリックス領域を有する５または６個のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質）。
別の態様において、ゲノムにおける目的の領域（例えば、βグロブリン遺伝子）における標的部位に結合するＴＡＬＥタンパク質（転写活性化因子様）であって、ＴＡＬＥが、１個または複数個の操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含むＴＡＬＥタンパク質が、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を開裂するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であって、１個または複数個の操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含むＴＡＬＥＮである。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態において、開裂ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。
別の態様では、ゲノム中の目的の領域（例えば、疾患関連遺伝子）における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔＡｇｏ系が、本明細書に記載されており、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単一ガイドＲＮＡ）を含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔＡｇｏ系は、グロビン遺伝子における標的を認識する。
一部の実施形態では、細胞のゲノム工学を容易にするヌクレアーゼは、ペプチドとして送達されるが、他方では、ヌクレアーゼをコードする核酸として送達される。一部の実施形態では、１種より多くのヌクレアーゼが使用され、核酸形態、タンパク質形態またはこれらの組合せで送達することができる。一部の好まれる実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり、一部の事例において、ｍＲＮＡは、保護されている。さらに好まれる実施形態では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含むことができる、および／または改変されたおよび改変されていないヌクレオチドの混合物を含むことができる。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系またはこれらの組合せを含むことができる。好まれる実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、エレクトロポレーションにより送達される。別の態様では、細胞におけるヌクレアーゼ媒介性開裂後に標的化組込み（例えば、ＨＤＲによる）を増加させるための方法が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）１種または複数のドナー分子と共に１種または複数のヌクレアーゼ（および／またはヌクレアーゼを発現するｍＲＮＡもしくは発現構築物と、必要に応じて１種または複数の単一ガイドＲＮＡ）を宿主細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ヌクレアーゼの導入の前、その間および／またはその後に、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）または分化に損失を与えることなく幹細胞増大に影響するおよび／またはこれを増加させる１種または複数の因子を細胞および／または細胞を含有する培養培地に導入するステップとを含む。ドナーは、ヌクレアーゼをコードする核酸に先立ち、その後にまたはそれと共に送達することができる。
ドナーは、ウイルスおよび／または非ウイルス性遺伝子移入方法によって送達することができる。他の実施形態では、ドナーは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により細胞に送達される。一部の事例において、ＡＡＶは、カプシド血清型と比較して異種血清型のものであるＬＴＲを含む。他の実施形態では、ドナーは、レンチウイルスにより細胞に送達される。一部の事例において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。
ある特定の実施形態では、ドナー核酸は、非相同性依存的方法（例えば、ＮＨＥＪ）により組み込まれる。上に記す通り、ｉｎ ｖｉｖｏ開裂の際に、ドナー配列は、細胞のゲノムのＤＳＢ位置に標的化様式で組み込むことができる。ドナー配列は、ＤＳＢ作製に使用されるヌクレアーゼのうち１種または複数のための同じ標的部位のうち１種または複数を含むことができる。よって、ドナー配列は、組込みが所望される内在性遺伝子の開裂に使用される同じヌクレアーゼのうち１種または複数によって開裂され得る。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ＤＳＢ誘導に使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム中のＤＳＢは、いずれかの機構によって作製することができる。ある特定の実施形態では、ＤＳＢは、１種または複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、目的の領域内の配列に結合するように操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、および開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインによって作製される。他の実施形態では、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメイン（ＴＡＬＥＮ）に融合された１種または複数のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（天然起源または非天然起源）によって作製される。なおさらなる実施形態では、ＤＳＢは、操作された単一ガイドＲＮＡまたはその機能的等価物が、ゲノム中の標的化部位へのヌクレアーゼのガイドに使用される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して作製される。なおさらなる実施形態では、ＤＳＢは、ＴｔＡｇｏ系を使用して作製される。
別の態様では、本発明は、細胞のゲノムのヌクレアーゼ媒介性開裂後の遺伝子破壊および／または標的化組込み（例えば、遺伝子補正）の増加に有用なキット（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬ−エフェクタードメインヌクレアーゼ融合タンパク質、ＴｔＡｇｏ系または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する操作されたガイドＲＮＡ）を提供する。キットは、典型的に、標的部位に結合する１種または複数のヌクレアーゼ、幹細胞増大および／または分化に影響する１種または複数の因子、ならびにヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊および／または標的化組込みが増強されるように、細胞にヌクレアーゼおよび幹細胞に影響を与える因子を導入するための指示を含む。任意選択で、ヌクレアーゼの標的部位を含有する細胞も、本明細書に記載されているキットに含まれてよい。ある特定の実施形態では、キットは、標的遺伝子を有する少なくとも１種の構築物および標的遺伝子内において開裂することができる公知ヌクレアーゼを含む。このようなキットは、種々の変動する宿主細胞型における開裂条件の最適化に有用である。本発明によって企図される他のキットは、ゲノム内の公知標的遺伝子座内において開裂することができる公知ヌクレアーゼを含むことができ、その上、ドナー核酸を含むことができる。一部の態様では、ドナーＤＮＡは、ポリペプチド、調節領域または構造的核酸をコードすることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）である。このようなキットは、ドナー組込みのための条件の最適化に、または、遺伝子破壊もしくは標的化挿入を含有する特異的に改変された細胞、細胞株および動物の構築に有用である。
他の態様では、本明細書に記載されている遺伝子改変された幹細胞を被験体に投与する方法が記載される。本明細書に記載されている遺伝子改変された血液細胞前駆体（「ＨＳＣ／ＰＣ」）は、典型的に、骨髄移植片において与えられ、ＨＳＣ／ＰＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで分化および成熟する。一部の実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣは、Ｇ−ＣＳＦ誘導性動員後に単離され、他方では、細胞は、ヒト骨髄または臍帯から単離される。一部の態様では、ＨＳＣ／ＰＣは、特異的遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理により編集される。他の態様では、ＨＳＣ／ＰＣは、野生型遺伝子または他の目的の遺伝子が挿入され発現されるように、および／または内在性異常遺伝子が補正されるように、操作されたヌクレアーゼおよびドナー核酸により改変される。一部の実施形態では、改変されたＨＳＣ／ＰＣは、軽度骨髄破壊的プレコンディショニング後に患者に投与される。他の態様では、生着後に、造血細胞の１００％が、改変されたＨＳＣ／ＰＣに由来するように、ＨＳＣ／ＰＣは、完全な骨髄破壊後に投与される。さらに、細胞は、細胞周期のＧ２期で停止されていてよい。
一部の実施形態では、トランスジェニックＨＳＣ／ＰＣ細胞および／または動物は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。一部の事例において、トランスジェニック動物は、外因性導入遺伝子に相当する内在性遺伝子座にノックアウトを含み、これにより、ヒトタンパク質を隔絶された状態で研究することができるｉｎ ｖｉｖｏ系の開発を可能にする。このようなトランスジェニックモデルは、目的のヒトタンパク質と相互作用するまたはこれを改変することができる小分子または大型の生体分子または他の実体を同定するためのスクリーニング目的で使用することができる。一部の態様では、導入遺伝子は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって得られる幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞等）または動物胚中の選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）に組み込まれ、続いて生きた動物が生まれるように、この胚を着床させる。続いて、性的に成熟するまで動物を育て、子孫の少なくとも一部が、編集された内在性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む子孫を産生させる。
上述および他の態様は、開示を全体として踏まえることにより、当業者であれば容易に明らかとなるであろう。
図１Ａ〜図１Ｅは、ＩＤＬＶドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における開裂および補正を示す。図１Ａ（配列番号３）は、開始コドン（太字）の上のＺＦＮ標的部位（下線）および鎌状変異（太字、イタリック体）を示す、ベータ−グロビンのエクソンＩ ＤＮＡ配列の部分を示す。図１Ｂは、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における標的化開裂を示すゲルである。ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによるエレクトロポレーションの３日後に、細胞を解析した。「偽」は、未処理ＣＤ３４＋細胞を表す。矢印は、ＰＣＲ増幅およびＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（登録商標））による消化後のカットされたバンドを示す。図１Ｃは、エクソン１および２と比べた、ベータグロビン遺伝子における鎌状変異における部位特異的遺伝子補正の模式図である。ドナー構築物ならびにＺＦＮによる開裂およびＨＤＲによる修復の結果得られるゲノムＤＮＡに関する詳細も図解されている。鎌状変異およびＨｈａＩ ＲＦＬＰ（星印）の位置が示されている。ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＲＦＬＰアッセイのためのプライマー位置を下に示す。エクソンは一定の拡大比であり；斜めのハッシュマークは、一定の拡大比ではない区画を示す。図１Ｄは、ＺＦＮおよびドナーの存在下におけるベータ−グロビンの標的化遺伝子改変のためのＲＦＬＰゲルである。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞に、ゲルの上部に示されている通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、および／またはＩＤＬＶを含むドナーを形質導入した。処理の４日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ酵素で消化し、アガロースゲルにおいて分離した。矢印は、開裂した産物を示し、ゲノムの標的部位へのＲＦＬＰの取込みを示す。図１Ｅは、表示条件下のＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変パーセンテージを示すグラフである。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶを形質導入した。処理の３日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ ＲＦＬＰを生成するサイレントな塩基変化の取込みを特異的に検出するように設計されたプライマーによりｑＰＣＲを完了し、アンプリコンにおけるベータ−グロビン遺伝子座のエクソン２におけるプライマー結合に対し正規化した（全条件に対しｎ＝４）。遺伝子改変は、ＺＦＮおよびドナーの両方で処理した細胞のおよそ１８％に見出された。 図１Ａ〜図１Ｅは、ＩＤＬＶドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における開裂および補正を示す。図１Ａ（配列番号３）は、開始コドン（太字）の上のＺＦＮ標的部位（下線）および鎌状変異（太字、イタリック体）を示す、ベータ−グロビンのエクソンＩ ＤＮＡ配列の部分を示す。図１Ｂは、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における標的化開裂を示すゲルである。ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによるエレクトロポレーションの３日後に、細胞を解析した。「偽」は、未処理ＣＤ３４＋細胞を表す。矢印は、ＰＣＲ増幅およびＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（登録商標））による消化後のカットされたバンドを示す。図１Ｃは、エクソン１および２と比べた、ベータグロビン遺伝子における鎌状変異における部位特異的遺伝子補正の模式図である。ドナー構築物ならびにＺＦＮによる開裂およびＨＤＲによる修復の結果得られるゲノムＤＮＡに関する詳細も図解されている。鎌状変異およびＨｈａＩ ＲＦＬＰ（星印）の位置が示されている。ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＲＦＬＰアッセイのためのプライマー位置を下に示す。エクソンは一定の拡大比であり；斜めのハッシュマークは、一定の拡大比ではない区画を示す。図１Ｄは、ＺＦＮおよびドナーの存在下におけるベータ−グロビンの標的化遺伝子改変のためのＲＦＬＰゲルである。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞に、ゲルの上部に示されている通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、および／またはＩＤＬＶを含むドナーを形質導入した。処理の４日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ酵素で消化し、アガロースゲルにおいて分離した。矢印は、開裂した産物を示し、ゲノムの標的部位へのＲＦＬＰの取込みを示す。図１Ｅは、表示条件下のＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変パーセンテージを示すグラフである。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶを形質導入した。処理の３日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ ＲＦＬＰを生成するサイレントな塩基変化の取込みを特異的に検出するように設計されたプライマーによりｑＰＣＲを完了し、アンプリコンにおけるベータ−グロビン遺伝子座のエクソン２におけるプライマー結合に対し正規化した（全条件に対しｎ＝４）。遺伝子改変は、ＺＦＮおよびドナーの両方で処理した細胞のおよそ１８％に見出された。 図１Ａ〜図１Ｅは、ＩＤＬＶドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における開裂および補正を示す。図１Ａ（配列番号３）は、開始コドン（太字）の上のＺＦＮ標的部位（下線）および鎌状変異（太字、イタリック体）を示す、ベータ−グロビンのエクソンＩ ＤＮＡ配列の部分を示す。図１Ｂは、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における標的化開裂を示すゲルである。ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによるエレクトロポレーションの３日後に、細胞を解析した。「偽」は、未処理ＣＤ３４＋細胞を表す。矢印は、ＰＣＲ増幅およびＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（登録商標））による消化後のカットされたバンドを示す。図１Ｃは、エクソン１および２と比べた、ベータグロビン遺伝子における鎌状変異における部位特異的遺伝子補正の模式図である。ドナー構築物ならびにＺＦＮによる開裂およびＨＤＲによる修復の結果得られるゲノムＤＮＡに関する詳細も図解されている。鎌状変異およびＨｈａＩ ＲＦＬＰ（星印）の位置が示されている。ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＲＦＬＰアッセイのためのプライマー位置を下に示す。エクソンは一定の拡大比であり；斜めのハッシュマークは、一定の拡大比ではない区画を示す。図１Ｄは、ＺＦＮおよびドナーの存在下におけるベータ−グロビンの標的化遺伝子改変のためのＲＦＬＰゲルである。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞に、ゲルの上部に示されている通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、および／またはＩＤＬＶを含むドナーを形質導入した。処理の４日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ酵素で消化し、アガロースゲルにおいて分離した。矢印は、開裂した産物を示し、ゲノムの標的部位へのＲＦＬＰの取込みを示す。図１Ｅは、表示条件下のＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変パーセンテージを示すグラフである。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶを形質導入した。処理の３日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ ＲＦＬＰを生成するサイレントな塩基変化の取込みを特異的に検出するように設計されたプライマーによりｑＰＣＲを完了し、アンプリコンにおけるベータ−グロビン遺伝子座のエクソン２におけるプライマー結合に対し正規化した（全条件に対しｎ＝４）。遺伝子改変は、ＺＦＮおよびドナーの両方で処理した細胞のおよそ１８％に見出された。 図１Ａ〜図１Ｅは、ＩＤＬＶドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における開裂および補正を示す。図１Ａ（配列番号３）は、開始コドン（太字）の上のＺＦＮ標的部位（下線）および鎌状変異（太字、イタリック体）を示す、ベータ−グロビンのエクソンＩ ＤＮＡ配列の部分を示す。図１Ｂは、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における標的化開裂を示すゲルである。ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによるエレクトロポレーションの３日後に、細胞を解析した。「偽」は、未処理ＣＤ３４＋細胞を表す。矢印は、ＰＣＲ増幅およびＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（登録商標））による消化後のカットされたバンドを示す。図１Ｃは、エクソン１および２と比べた、ベータグロビン遺伝子における鎌状変異における部位特異的遺伝子補正の模式図である。ドナー構築物ならびにＺＦＮによる開裂およびＨＤＲによる修復の結果得られるゲノムＤＮＡに関する詳細も図解されている。鎌状変異およびＨｈａＩ ＲＦＬＰ（星印）の位置が示されている。ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＲＦＬＰアッセイのためのプライマー位置を下に示す。エクソンは一定の拡大比であり；斜めのハッシュマークは、一定の拡大比ではない区画を示す。図１Ｄは、ＺＦＮおよびドナーの存在下におけるベータ−グロビンの標的化遺伝子改変のためのＲＦＬＰゲルである。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞に、ゲルの上部に示されている通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、および／またはＩＤＬＶを含むドナーを形質導入した。処理の４日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ酵素で消化し、アガロースゲルにおいて分離した。矢印は、開裂した産物を示し、ゲノムの標的部位へのＲＦＬＰの取込みを示す。図１Ｅは、表示条件下のＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変パーセンテージを示すグラフである。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶを形質導入した。処理の３日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ ＲＦＬＰを生成するサイレントな塩基変化の取込みを特異的に検出するように設計されたプライマーによりｑＰＣＲを完了し、アンプリコンにおけるベータ−グロビン遺伝子座のエクソン２におけるプライマー結合に対し正規化した（全条件に対しｎ＝４）。遺伝子改変は、ＺＦＮおよびドナーの両方で処理した細胞のおよそ１８％に見出された。 図１Ａ〜図１Ｅは、ＩＤＬＶドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における開裂および補正を示す。図１Ａ（配列番号３）は、開始コドン（太字）の上のＺＦＮ標的部位（下線）および鎌状変異（太字、イタリック体）を示す、ベータ−グロビンのエクソンＩ ＤＮＡ配列の部分を示す。図１Ｂは、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における標的化開裂を示すゲルである。ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによるエレクトロポレーションの３日後に、細胞を解析した。「偽」は、未処理ＣＤ３４＋細胞を表す。矢印は、ＰＣＲ増幅およびＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（登録商標））による消化後のカットされたバンドを示す。図１Ｃは、エクソン１および２と比べた、ベータグロビン遺伝子における鎌状変異における部位特異的遺伝子補正の模式図である。ドナー構築物ならびにＺＦＮによる開裂およびＨＤＲによる修復の結果得られるゲノムＤＮＡに関する詳細も図解されている。鎌状変異およびＨｈａＩ ＲＦＬＰ（星印）の位置が示されている。ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＲＦＬＰアッセイのためのプライマー位置を下に示す。エクソンは一定の拡大比であり；斜めのハッシュマークは、一定の拡大比ではない区画を示す。図１Ｄは、ＺＦＮおよびドナーの存在下におけるベータ−グロビンの標的化遺伝子改変のためのＲＦＬＰゲルである。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞に、ゲルの上部に示されている通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした、および／またはＩＤＬＶを含むドナーを形質導入した。処理の４日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ酵素で消化し、アガロースゲルにおいて分離した。矢印は、開裂した産物を示し、ゲノムの標的部位へのＲＦＬＰの取込みを示す。図１Ｅは、表示条件下のＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変パーセンテージを示すグラフである。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶを形質導入した。処理の３日後に細胞を収集し、ドナー領域の外側からＰＣＲ増幅し、ＨｈａＩ ＲＦＬＰを生成するサイレントな塩基変化の取込みを特異的に検出するように設計されたプライマーによりｑＰＣＲを完了し、アンプリコンにおけるベータ−グロビン遺伝子座のエクソン２におけるプライマー結合に対し正規化した（全条件に対しｎ＝４）。遺伝子改変は、ＺＦＮおよびドナーの両方で処理した細胞のおよそ１８％に見出された。
図２Ａ〜図２Ｄは、形質導入に使用されるＺＦＮおよびＩＤＬＶ用量の最適化の結果を示す。図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、ＺＦＮ ｍＲＮＡの用量決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）後の結果を示すグラフである。ＣＤ３４＋細胞に、増加量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、一定量のドナーＩＤＬＶを形質導入した。偽は、未処理細胞を示し、ＺＦＮのみの試料は、３０ｕｇ／ｍＬの各ＺＦＮをエレクトロポレーションされ、ＩＤＬＶのみの試料は、パルスを適用され、２Ｅ＋０７ＴＵ／ｍｌのドナーＩＤＬＶを形質導入される。図２Ａは、ＲＦＬＰのｑＰＣＲによって決定される、エレクトロポレーション後３日目の遺伝子改変率を示す。図２Ｂは、エレクトロポレーション後１日目の増大倍率（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示し、図２Ｃは、トリパン色素排除（ｔｒｙｐａｎ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｄｙｅ）によって決定されるエレクトロポレーション後１日目の細胞生存率を示す（全条件に対しｎ＝８）。図２Ｄは、ドナーインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）の模式図を示す：ベータ−グロビンの１．１ｋｂ領域を、３’ＬＴＲが、プロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲへ逆転写の際に移入される自己不活性化（ＳＩＮ）欠失を含有するレンチウイルス骨格へと、末端反復配列（ＬＴＲ）におけるプロモーターエレメントに関して逆にクローニングした。ＵＴＲ：非翻訳領域、ＲＲＥ：ｒｅｖ応答エレメント、Ｉｎｔ：イントロン。
図３Ａ〜図３Ｃは、ドナーＩＤＬＶの用量決定を示すグラフである。ＣＤ３４＋細胞に、一定量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、増加量のドナーＩＤＬＶを形質導入した。偽は、未処理細胞を示し、ＺＦＮのみの試料は、１０ｕｇ／ｍＬの各ＺＦＮをエレクトロポレーションされ、ＩＤＬＶのみの試料は、パルスを適用され、６Ｅ＋０７ＴＵ／ｍｌのドナーＩＤＬＶを形質導入される。図３Ａは、ＲＦＬＰのｑＰＣＲによって決定される、エレクトロポレーション後３日目の遺伝子改変率を示す。図３Ｂは、エレクトロポレーション後１日目の増大倍率を示し、図３Ｃは、トリパン色素排除によって決定される、エレクトロポレーション後１日目の細胞生存率を示す（全条件に対しｎ＝６）。
図４Ａ〜図４Ｆは、オリゴヌクレオチドドナーを使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座におけるＺＦＮ対３３４８８／３３５０１を使用した補正を示す。図４Ａは、オリゴヌクレオチドが導く遺伝子改変の模式図を示す（配列番号４および５）。図４Ｂは、ベータ−グロビン遺伝子座のＡｖｒＩＩ消化されたＰＣＲアンプリコンのゲルである。断片は、ネイティブＡｖｒＩＩ部位を含有し、その開裂は、ＡｖｒＩＩ消化の内部対照として機能する（ゲルの下の方のバンド）。矢印は、ＡｖｒＩＩ開裂産物を示す。オリゴドナーおよびＺＦＮの存在下では、１５％遺伝子補正率が存在する。図４Ｃは、ＳＢＳ番号３３５０１のＺＦＮ結合部位（ＷＴは配列番号５３、ＳＭＳは配列番号５４）におけるサイレント変異の６個の可能な部位を示す。鎌状変異はイタリック体で書かれ、可能なサイレント変異部位（ＳＭＳ）は太字で書かれている。図４Ｄは、サイレント変異が、ベータ−グロビンにおける遺伝子補正を増加させたことを示す。ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞に、ＺＦＮおよび表示のドナーオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。関連するサイレント変異の導入をハイスループット配列決定によりアッセイした。白色バーは、挿入および欠失（インデル）を示す；灰色バーは、遺伝子補正を示す。図４Ｅは、サイレント変異が、ＺＦＮ再開裂を遮断することを示す。インデルを有するアレルを、相同性媒介性改変の証拠に関して試験した。ＮＨＥＪ駆動性インデルの証拠も有する遺伝子改変を有するアレルのパーセンテージが示されている。図４Ｆは、ＺＦＮ濃度およびドナー型の最適化を示す。ＮＨＥＪ駆動インデル（白色バー）および遺伝子補正（灰色バー）をハイスループットＤＮＡ配列決定によりアッセイした。ハイスループットＤＮＡ配列決定の深さを考慮すると、測定誤差は非常に低いと予想される。ＷＴ：野生型；ＳＭＳ：サイレント変異部位；オリゴ：オリゴヌクレオチド。
図５は、ドナーの長さおよび鎖の最適化を示す。ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞に、ベータ−グロビン遺伝子座に３塩基対配列を導入するように設計されたＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドの組合せをトランスフェクトした。細胞を収集し、この短い配列のＮＨＥＪ駆動性インデルおよび標的化組込み（「ＴＩ」）のレベルをハイスループットＤＮＡ配列決定（ＨＴＳ）によりアッセイした。試料毎におよそ４〜９，０００種の配列リードを得た。
図６Ａおよび図６Ｂは、部分的ＨＤＲ事象を描写し、オリゴ媒介性遺伝子改変における合成が、左から右に進むことを明らかにする。図６Ａは、部分的ＨＤＲ産物（ＳＭＳ１、ＳＭＳ１２、ＳＭＳ２４およびＳＭＳ４アレル）の証拠に関してアッセイされた、図３ＦのＺＦＮプラスＳＭＳ１２４ドナー由来のハイスループットＤＮＡ配列決定データを示す。本実験における約４１％の遺伝子改変のうち、６％の改変は、ＳＭＳ１２事象に由来した一方、ＳＭＳ２４アレルは、ほとんど完全に存在しなかった（０．０３％）。このような非対称は、ＤＮＡ合成が、左から右に進むことを暗示する。図６Ｂは、示されている全３種のＺＦＮ濃度のデータの平均を使用してこれを実証し、３０および６０μｇ／ｍＬの試料に由来する事象を、上向きに正規化して、１５μｇ／ｍＬの試料に観察される約４１％の遺伝子改変をマッチさせる。
図７Ａ〜図７Ｄは、ベータ−グロビン遺伝子クラスターにおけるオンターゲット開裂解析を示す。図７Ａは、次の通りのＧＦＰ捕捉の図解である：Ｋ５６２赤白血病細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＧＦＰを発現するＩＤＬＶベクターを形質導入した。細胞を６０日間培養して、あらゆる非トラップＧＦＰを希釈排除し、その後に蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ陽性細胞を選別した。試料に対してｎｒＬＡＭ−ＰＣＲを行い、ベクター組込み部位解析を完了した。クラスター解析を使用して決定される、ベータ−グロビンおよびデルタ−グロビンにおける最も一般的な組込み部位の概要を示す。ＨＢＢ：野生型ヒトヘモグロビンベータ；ＨＢＤ：ヒトヘモグロビンデルタ。図７Ｂは、第１１染色体上のＺＦＮカット部位前後のベータ−グロビン遺伝子クラスターにおける部分的グロビン遺伝子配列のアラインメントを示す（配列番号６〜１１）。ＺＦＮ結合部位に下線を引き、鎌状変異は太字、イタリック体で書く。ＨＢＢ：野生型ヒトヘモグロビンベータ；ＨＢＤ：ヒトヘモグロビンデルタ；ＨＢＥ１：ヒトヘモグロビンイプシロン；ＨＢＢＰ１：ヒトヘモグロビンベータシュードジーン１；ＨＢＧ１：ヒトヘモグロビンガンマＡ；ＨＢＧ２：ヒトヘモグロビンガンマＧ。図７Ｃは、ＺＦＮ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡで処理したまたは未処理の（偽）ＣＤ３４＋細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを示すゲルである。表示のベータグロビンクラスター遺伝子のそれぞれを、標的部位と最高相同性の領域周囲で増幅し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼにより開裂した。バンドをデンシトメトリーにより定量化した。図７Ｄは、図７Ｂと同様のＳＣＤ患者骨髄試料のＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを示すゲルである。ガンマ−グロビン遺伝子における一塩基多型のヘテロ接合性は、ＺＦＮに曝露されていない試料であっても、バックグラウンド開裂を産生した（細い矢印）。 図７Ａ〜図７Ｄは、ベータ−グロビン遺伝子クラスターにおけるオンターゲット開裂解析を示す。図７Ａは、次の通りのＧＦＰ捕捉の図解である：Ｋ５６２赤白血病細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＧＦＰを発現するＩＤＬＶベクターを形質導入した。細胞を６０日間培養して、あらゆる非トラップＧＦＰを希釈排除し、その後に蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ陽性細胞を選別した。試料に対してｎｒＬＡＭ−ＰＣＲを行い、ベクター組込み部位解析を完了した。クラスター解析を使用して決定される、ベータ−グロビンおよびデルタ−グロビンにおける最も一般的な組込み部位の概要を示す。ＨＢＢ：野生型ヒトヘモグロビンベータ；ＨＢＤ：ヒトヘモグロビンデルタ。図７Ｂは、第１１染色体上のＺＦＮカット部位前後のベータ−グロビン遺伝子クラスターにおける部分的グロビン遺伝子配列のアラインメントを示す（配列番号６〜１１）。ＺＦＮ結合部位に下線を引き、鎌状変異は太字、イタリック体で書く。ＨＢＢ：野生型ヒトヘモグロビンベータ；ＨＢＤ：ヒトヘモグロビンデルタ；ＨＢＥ１：ヒトヘモグロビンイプシロン；ＨＢＢＰ１：ヒトヘモグロビンベータシュードジーン１；ＨＢＧ１：ヒトヘモグロビンガンマＡ；ＨＢＧ２：ヒトヘモグロビンガンマＧ。図７Ｃは、ＺＦＮ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡで処理したまたは未処理の（偽）ＣＤ３４＋細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを示すゲルである。表示のベータグロビンクラスター遺伝子のそれぞれを、標的部位と最高相同性の領域周囲で増幅し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼにより開裂した。バンドをデンシトメトリーにより定量化した。図７Ｄは、図７Ｂと同様のＳＣＤ患者骨髄試料のＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを示すゲルである。ガンマ−グロビン遺伝子における一塩基多型のヘテロ接合性は、ＺＦＮに曝露されていない試料であっても、バックグラウンド開裂を産生した（細い矢印）。
図８は、ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチド改変ＨＳＰＣのコロニー形成能を示すグラフである。ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞は、偽トランスフェクション、１０ｕｇ／ｍＬ ＺＦＮのトランスフェクション、またはＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドドナー３μＭのトランスフェクションのいずれかを行った。培養５日後に、細胞をメチルセルロースおよびサイトカイン含有培地に蒔き、分化させた。育成１５日後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数し、赤芽球（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）（Ｅ）、バースト形成単位−赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球／マクロファージ（ＧＭ）または顆粒球／赤芽球／マクロファージ／巨核球（ＧＥＭＭ）のいずれかとして形態学的に分類した。
図９Ａおよび図９Ｂは、赤芽球分化における改変された細胞の安定性を示す。図９Ａは、ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞に、０、３．７５、７．５、１５もしくは３０μｇ／ｍＬのＺＦＮおよび３μＭのオリゴヌクレオチドドナーをトランスフェクトした、またはオリゴヌクレオチドドナー単独をトランスフェクトしたことを示す。細胞を赤血球細胞へと分化するように誘導し、０、６、１２、１５および１８日後にアリコートを取り出した。細胞からゲノムＤＮＡを調製し、遺伝子改変された細胞の頻度をハイスループット配列決定によりアッセイした。時点毎の試料毎におよそ１０〜５０，０００種の配列リードを得た。図９Ｂは、操作された細胞におけるグロビンタンパク質のＨＰＬＣ解析を示す。
図１０Ａ〜図１０Ｅは、ＮＳＧマウスへのＺＦＮおよびドナー処理細胞の移植を示す。図１０Ａは、エレクトロポレーション後７日目のＲＦＬＰのｑＰＣＲによって決定される、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶで処理しｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したバルク移植された細胞の遺伝子改変率を示す。偽細胞は未処理である（ｎ＝３独立実験）。図１０Ｂは、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ改変ＣＤ３４＋細胞のハイスループット配列決定によって評価される、鎌状塩基における改変を示すグラフである。鎌状塩基（Ｔ）へと変化された野生型塩基ならびにカット部位における挿入および欠失（インデル）を含有するアラインメントされた総リードのパーセンテージを示す、ベータ−グロビン遺伝子座の配列決定の結果。図１０Ａと同じ試料。変化した塩基、白色；インデル、灰色。図１０Ｃは、移植後５週および８週目の移植されたマウスの末梢血における生着を示すグラフである。偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞のフローサイトメトリーによる、総ｈＣＤ４５＋およびｍＣＤ４５＋細胞のうちｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして決定されたヒト生着。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形（ｎ＝３独立実験；偽 ｎ＝５、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝１２）。図１０Ｄは、ＣＤ３４＋細胞に、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴをエレクトロポレーションし、ＮＳＧマウスへの移植前にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したことを示すグラフである。鎌状塩基およびインデルにおける改変率（ｎ＝１）を図１０Ｃと同様に示す。図１０Ｅは、図１０Ｃと同様に、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の末梢血における生着を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形（オリゴ ｎ＝８、ＺＦＮ ｎ＝７、ＺＦＮ＋オリゴ ｎ＝９）、ｎ．ｓ．：有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、８週目における移植されたＮＳＧマウスの系列解析を示す。移植後８週目における、偽ならびにＺＦＮおよびドナー処理細胞を移植したＮＳＧマウスの末梢血の免疫表現型解析。Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、造血前駆細胞（ＣＤ３４）、骨髄系前駆細胞（ＣＤ３３）およびナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）のマーカーについて陽性であるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して数え上げた。図１１Ａは、偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞を移植したマウス由来の細胞を示すグラフである（ｎ＝３独立実験；偽 ｎ＝５、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝１２）。図１１Ｂは、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞を移植したマウス由来の細胞を示すグラフである（オリゴ ｎ＝８、ＺＦＮ ｎ＝７、ＺＦＮ＋オリゴ ｎ＝９）。ｎ．ｓ．：有意ではない；星印は有意性を示す、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
図１２Ａ〜図１２Ｄは、最終末梢血生着および系列解析を示す。図１２Ａは、移植後１６週目の移植マウスの末梢血における生着を示すグラフである。偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞のフローサイトメトリーにより、総ｈＣＤ４５＋およびｍＣＤ４５＋細胞のうちのｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして決定されたヒト生着。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形。図１２Ｂは、移植後１６週目の移植ＮＳＧマウスの末梢血の免疫表現型解析を示すグラフである。Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、造血前駆細胞（ＣＤ３４）、骨髄系前駆細胞（ＣＤ３３）およびナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）のマーカーについて陽性であるｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを、偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞のフローサイトメトリーを使用して数え上げた。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形；（ｎ＝３独立実験；偽 ｎ＝５、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝１２）。図１２Ｃは、図１２Ａと同様の、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の、末梢血における生着を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形。図１２Ｄは、図１２Ｂと同様の、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の、末梢血の系列解析を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形；（オリゴ ｎ＝８、ＺＦＮ ｎ＝７、ＺＦＮ＋オリゴ ｎ＝９）。ｎ．ｓ．：有意ではない、＊ｐ＜０．０５。
図１３Ａ〜図１３Ｃは、遺伝子改変された細胞が、ＮＳＧマウスにおいて存続することを示す。図１３Ａは、偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞における、１６週目の移植マウスの骨髄および脾臓における遺伝子改変率を示すグラフである。組織を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出および増幅し、取り込まれたＲＦＬＰのｑＰＣＲを解析した。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形。図１３Ｂは、図１３Ａに記載されている試料のハイスループット配列決定によって評価される、鎌状変異における補正を示すグラフである。鎌状変異に改変された塩基を含有するアラインメントされた総リードのパーセンテージを示す、ベータ−グロビン遺伝子座の配列決定の結果。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形（ｎ＝３独立実験；偽 ｎ＝５、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝１２）。図１３Ｃは、図１３Ｂに記載されている通り、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の鎌状変異における補正を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形（オリゴ ｎ＝８、ＺＦＮ ｎ＝７、ＺＦＮ＋オリゴ ｎ＝９）。ｎ．ｓ．：有意ではない；星印は有意性を示す、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
図１４Ａ〜図１４Ｄは、最終骨髄生着および系列解析を示す。図１４Ａは、移植後１６週目の移植マウスの骨髄における生着を示すグラフである。偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞のフローサイトメトリーにより、総ｈＣＤ４５＋およびｍＣＤ４５＋細胞のうちのｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして決定されたヒト生着。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形。図１４Ｂは、移植後１６週目の移植ＮＳＧマウスの骨髄の免疫表現型解析を示すグラフである。Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、造血前駆細胞（ＣＤ３４）、骨髄系前駆細胞（ＣＤ３３）およびナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６）のマーカーについて陽性であるｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを、偽またはＺＦＮ＋ＩＤＬＶ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞のフローサイトメトリーを使用して数え上げた。偽、白色菱形；ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ、黒色菱形；（ｎ＝３独立実験；偽 ｎ＝５、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝１２）。図１４Ｃは、図１４Ａと同様の、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の、骨髄における生着を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形。図１４Ｄは、図１４Ｂと同様の、オリゴ、ＺＦＮまたはＺＦＮ＋オリゴ処理細胞のいずれかを与えたマウス由来の細胞の、骨髄の系列解析を示すグラフである。オリゴ、丸形；ＺＦＮ、三角形；ＺＦＮ＋オリゴ、菱形；（オリゴ ｎ＝８、ＺＦＮ ｎ＝７、ＺＦＮ＋オリゴ ｎ＝９）。ｎ．ｓ．：有意ではない、＊ｐ＜０．０５。
図１５Ａ〜図１５Ｃは、鎌状骨髄ＣＤ３４＋細胞の分化を示す。図１５Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションされ、鎌状位置にＷＴ塩基を保有するドナーＩＤＬＶを形質導入され、赤芽球条件下で育成されたＳＣＤ患者骨髄ＣＤ３４＋細胞の増大倍率を示すグラフである。図１５Ｂは、蒔かれた２００個の細胞毎に同定された、各種類の造血コロニーの総コロニー形成単位のグラフである。図１５Ｃは、蒔かれた細胞総数と比べた、形成されたコロニーのパーセンテージを示すグラフである。ＣＦＵ：コロニー形成単位；ＢＦＵ：バースト（ｂｌａｓｔ）形成単位；ＧＥＭＭ：顆粒球、赤血球、単球およびマクロファージ；Ｅ：赤芽球、ＧＭ：顆粒球およびマクロファージ；Ｇ：顆粒球；Ｍ：単球、星印は有意性を示す、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＝２独立実験；偽 ｎ＝３；ＺＦＮのみ ｎ＝４；ＩＤＬＶのみ ｎ＝３、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝６）。
図１６Ａ〜図１６Ｄは、鎌状骨髄ＣＤ３４＋細胞の機能補正を示す。鎌状赤血球症患者骨髄ＣＤ３４＋細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、鎌状位置にＷＴ塩基を保有するドナーＩＤＬＶを形質導入し、赤芽球条件下で育成した。図１６Ａは、エレクトロポレーション後１２日目における、取り込まれたＲＦＬＰのｑＰＣＲによって解析される、遺伝子改変率を示すグラフである。図１６Ｂは、ハイスループット配列決定によって評価される、鎌状変異における補正を示すグラフである。鎌状変異における補正されたＷＴ塩基（Ａ）ならびにカット部位における挿入および欠失（インデル）を含有するアラインメントされた総リードのパーセンテージを示す、ベータ−グロビン遺伝子座の配列決定の結果。補正された塩基、白色；インデル、灰色。図１６Ｃは、培養終了時の分化した赤芽球細胞のＨＰＬＣ解析を示す。細胞をペレットにし、溶解し、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。左パネルは、ＳＣＤ偽試料を示し、右パネルは、ＳＣＤ ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ試料を示す。陰影は、ＨｂＡ：ＷＴ成体ヘモグロビンピークを示す。図１６Ｄは、主要ピークによって表される総曲線下面積のうちのＨｂＡのパーセントの定量化のグラフである。ＨｂＡ：ＷＴ成体ヘモグロビン、ＨｂＦ：胎児性ヘモグロビン、ＨｂＳ：鎌状ヘモグロビン。ｎ．ｓ．：有意ではない（ｎ＝２独立実験；偽 ｎ＝３；ＺＦＮのみ ｎ＝４；ＩＤＬＶのみ ｎ＝３、ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ ｎ＝６）。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、オリゴヌクレオチドドナーおよび変動濃度のジンクフィンガーヌクレアーゼ対４７７７３／４７８１７を使用した、ＣＤ３４＋細胞のベータ−グロビン遺伝子座における補正を示す。図１７Ａは、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復の頻度を示す。図１７Ｂは、相同性依存性ＤＮＡ修復の頻度を示す。鎌状赤血球変異に加えて、オリゴヌクレオチドドナーは、図４Ｃに示すＳＭＳ１２変異（黒色バー）またはＳＭＳ０１２変異（灰色バー）のいずれかを含む。
遺伝子療法またはゲノム工学における使用のための細胞の形質導入のための組成物および方法が、本明細書に開示されている。特に、外因性配列のヌクレアーゼ媒介性（すなわち、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）標的化組込みまたは標的化開裂によるゲノム変更が、細胞において効率的に達成される。ＨＳＣ／ＰＣの形質導入および操作に特に有用であるが、本方法および組成物を他の細胞型に使用して、グロビン遺伝子に挿入および／または欠失を含む遺伝子改変された細胞を提供することもできる。特に、本発明の方法および組成物は、鎌状赤血球症の処置および防止のために疾患関連アレルを補正することによる、グロビン遺伝子の編集に有用である。
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらの反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；および同第８，５８６，５２６号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；第８，５８６，５２６号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。（例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書、Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、（２０１３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１１巻、６５２頁を参照されたい）。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による開裂のためのガイドＤＮＡを含めた、必要な構成成分の全てである。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指し、限定するものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組み換えによるドナー捕捉を含む。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性誘導型修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連する過程に関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる。ＤＳＢは、相同性誘導型修復または非相同性誘導型修復機構による欠失および／または挿入をもたらすことができる。欠失は、いずれかの数の塩基対を含むことができる。同様に、挿入は、いずれかの数の塩基対を含むことができ、例えば、切断の領域におけるヌクレオチド配列に対する相同性を任意選択で有する「ドナー」ポリヌクレオチドの組込みを含む。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるジンクフィンガータンパク質の対、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
本明細書に記載される方法のいずれも、任意のサイズのドナーの挿入ならびに／あるいは目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数種の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性のヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
「操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，８２３，６１８号もまた参照されたい。
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１００，０００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００ヌクレオチド長と２０，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは約５ｋｂと１５ｋｂとの間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
「到達可能領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造内にパッケージされていない領域であることが考えられる。到達可能領域の別個の構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出され得る。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリー過程によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。植物細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、その例として、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃（例えば、「遺伝子銃」を使用）、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるがこれらに限定されない。
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
本明細書において、用語「外因性核酸の産物」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡ等、ポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が含まれるがこれらに限定されない。
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば幹細胞（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）および複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ））を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
用語「被験体」および「患者」は、互換的に使用されており、ヒト患者および非ヒト霊長類等の哺乳動物ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物等の実験動物を指す。したがって、用語「被験体」または「患者」は、本明細書において、本発明のヌクレアーゼ、ドナーおよび／または遺伝子改変された細胞を投与することができるいずれかの哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、障害を有する被験体を含む。
「幹細胞性」は、幹細胞様様式で作用するいずれかの細胞の相対的な能力、すなわち、いずれか特定の幹細胞が有し得る全能性、多能性または寡能性および増大または無限の自己再生の程度を指す。
幹細胞増大を増強する因子
幹細胞増大および／または分化を増強するいずれかの因子（単数または複数）を、本発明の実施において使用することができる。因子は、細胞へと直接的に導入することができる（例えば、因子をコードする遺伝子として）、および／または周囲の培養培地（フィーダー層および他の固体培養基を含む）へと導入して、細胞に影響を与えることができる。例えば、ヌクレアーゼ媒介性改変が誘導される前、その間またはその後の、培養条件におけるこのような因子の使用は、幹細胞のヌクレアーゼ媒介性改変の率を増加させる。
使用することができる因子の非限定例として、ＳＲ１、アリール炭化水素受容体アンタゴニスト、ｄｍＰＧＥ２、プロスタグランジン、ＵＭ１７１およびＵＭ７２９、ライブラリースクリーニングにおいて同定される化合物（Ｐａｂｓｔら（２０１４年）Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １１巻：４３６〜４４２頁を参照）、ラパマイシン（Ｗａｎｇら（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ． ｐｉｉ： ｂｌｏｏｄ−２０１３−１２−５４６２１８を参照）、アンジオポエチン様タンパク質（「Ａｎｇｐｔｌ」、例えば、ノッチ／デルタ／ＡＮＧＰＴＬ５（Ｚｈａｎｇら（２００８年）Ｂｌｏｏｄ．１１１巻（７号）：３４１５〜３４２３頁を参照）、Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ５、Ａｎｇｐｔｌ７およびＭｆａｐ４）、銅キレート剤テトラエチレンペンタミン（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｔｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）（ＴＥＰＡ、ｄｅ Ｌｉｍａら（２００８年）Ｂｏｎｅ Ｍａｒ Ｔｒａｎｓ ４１巻：７７１〜７７８頁を参照）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＰＡＣ）阻害剤、例えば、バルプロ酸（Ｃｈａｕｒａｓｉａら（２０１４年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４巻：２３７８〜２３９５頁を参照）、ＩＧＦ結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、ニコチンアミド（Ｈｏｒｗｉｔｚら（２０１４年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １２４巻：３１２１〜３１２８頁を参照）、Ｔａｔ−ｍｙｃ（ＷＯ２０１００２５４２１を参照）およびｔａｔ−Ｂｃｌ２（ＷＯ２０１４０１５３１２を参照）融合タンパク質、ＭＡＰＫ１４／ｐ３８ａ Ｌｙ２２２８８２０（Ｂａｕｄｅｔら（２０１２年）Ｂｌｏｏｄ １１９巻（２６号）：６２５５〜６２５８頁を参照）、ＨＯＸＢ４、ＯＣＴ３／４等の自己再生遺伝子の産物、Ｅ４＋ＥＣと呼ばれる臍帯血および／またはＭＳＣ由来フィーダー層もしくはｅｘ ｖｉｖｏ血管微小環境共培養系（Ｂｕｔｌｅｒら（２０１２年）Ｂｌｏｏｄ．１２０巻（６号）：１３４４〜１３４７頁を参照）、サイトカイン（非限定例として、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＣＣ１１０、ＣＣ１００および／またはＨ３０００（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ）が挙げられる。
一部の実施形態では、因子は、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ（ＳＲ１、例えば、米国特許第８，７４１，６４０号；Ｂｏｉｔａｎｏら（２０１０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９巻（５９９７号）：１３４５〜１３４８頁を参照）を含み、ｅｘ ｖｉｖｏでのＣＤ３４＋細胞の増大を促進するアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストが、本明細書に記載されている方法および組成物において使用される。他の実施形態では、因子は、幹細胞再生のアゴニストであるＵＭ１７１（Ｆａｒｅｓら（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ：１２２巻（２１号）を参照）を含む。さらに他の態様では、因子は、１種または複数のプロスタグランジン、例えば、ｄｍＰＧＥ２を含む。例えば、米国特許第８，１６８，４２８号；Ｎｏｒｔｈら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ ４４７巻（７１４７号）：１００７〜１０１１頁）を参照されたい。一部の態様では、因子は、アンジオポエチン様タンパク質（「Ａｎｇｐｔｌ」、例えば、Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ５、Ａｎｇｐｔｌ７およびＭｆａｐ４）およびＩＧＦ結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）等、１種または複数のホルモンを含み、これらが使用される。例えば、米国特許第７，８０７，４６４号；Ｚｈａｎｇら（２００８年）１１１巻（７号）：３４１５〜３４２３頁）を参照されたい。他の態様では、因子は、ＨＯＸＢ４またはＯＣＴ等、自己再生遺伝子の１種または複数のタンパク質産物を含む。例えば、米国特許第８，７３５，１５３号；Ｗａｔｔｓら（２０１２年）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．４０巻（３号）：１８７〜１９６頁）を参照されたい。あるいは、これらの遺伝子は、培養培地および／または幹細胞において一過的に発現させることができる。
幹細胞増大に影響を与える因子は、ストロマ細胞および／またはＭＳＣ由来細胞に由来するフィーダー層が挙げられるがこれらに限定されない、細胞支持方法を含むこともできる。例えば、Ｂｒｅｅｍｓら（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ ９１巻（１号）：１１１〜１１７頁およびＭａｇｉｎら（２００９年）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２００９年１〜２月；１８巻（１号）：１７３〜８６頁を参照されたい。
ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ媒介性ゲノム改変の増加に有効である限り、幹細胞増大を増強するいかなる適した量の１種または複数の因子を使用することもできる。使用される特定の濃度は、当業者であれば容易に決定することができる。ある特定の実施形態では、０．１ｎＭ〜１００μＭの間が使用され、例えば、０．５μＭ〜２５μＭの間の濃度が使用され、これは、その間のいずれかの量を含む（例えば、１μＭ〜２０μＭ、３μＭ〜１０μＭ等）。
融合分子
細胞、特に、幹細胞における選択された標的遺伝子の開裂に有用な組成物、例えば、ヌクレアーゼが、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、融合分子の１種または複数の構成成分（例えば、ヌクレアーゼ）は、天然起源である。他の実施形態では、融合分子の構成成分のうち１種または複数（例えば、ヌクレアーゼ）は、非天然起源である、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または開裂ドメインにおいて操作されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
Ａ．ＤＮＡ結合分子
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、ドナー分子に結合するために、および／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）を用いる。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の開裂部位を認識し、一般的に、４種のファミリーへとグループ化される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。
他の実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物において使用されるヌクレアーゼのうち１種または複数のＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５種よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中したドメインを含有し、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ、ら（２００６年）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ ４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５塩基対の欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデム反復中に見出される配列に依存する。反復される配列は、およそ１０２塩基対を含み、これらの反復は、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらの反復の多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基（ＲＶＤ）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合反復は、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよび反復数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０年）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているＮ−キャップおよび／またはＣ−キャップを含む。
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ ｖｉｖｏ開裂および／または標的化開裂に使用されるヌクレアーゼのうち１種または複数のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための標的部位の選択および方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。この系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列）遺伝子座と、タンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．１巻：ｅ６０頁）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸開裂の特異性をプログラムすることができる、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、連続的４ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。第一に、２種の非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介して、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡとする。第三に、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーと、標的認識の追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のとなりの標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーとの間のワトソンクリック塩基対形成により、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、標的ＤＮＡにＣａｓ９を方向付ける。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３ステップからなる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来的な攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの異質（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングと、続く（ｉｉｉ）異質核酸のＲＮＡ媒介性干渉。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与し、異質ＤＮＡの挿入等、機能における役割を果たす。
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、対応するネイティブ配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有するのであれば、ネイティブ配列の断片ならびにネイティブ配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に企図される生物学的活性とは、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性修飾物およびこれらの融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体として、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合性修飾物が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることができるもしくは化学的に合成することができるまたはこれら２つの手順の組み合わせによるものであることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、または内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得る。場合によっては、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するよう遺伝子操作されている。
一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書を参照のこと）。真核細胞において、遺伝子サイレンシングは、アルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合される。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さなＲＮＡと標的の間のワトソンクリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼとして（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）開裂する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核細胞Ａｇｏタンパク質は小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（しばしばウイルス性の）ＤＮＡを検出して除去するように機能するようである（Ｙｕａｎら、（２００５年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ １９巻、４０５頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、（２０１３年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ５１巻、５９４頁；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質には、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のタンパク質が挙げられる。
最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のタンパク質である（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合したこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体がＤＮＡのサードパーティー分子におけるワトソン−クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように方向付けるために役立つ。一旦、これらのガイドＤＮＡにおける配列情報によって標的ＤＮＡの特定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを開裂する。このような機構はまた、その標的ＤＮＡに結合する間のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によって支持される（Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡは、ＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ開裂の特異性はガイドＤＮＡによって方向付けられるので、したがって、研究者が特定した外因性ガイドＤＮＡによって形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ開裂を研究者が特定した相補的な標的ＤＮＡに方向付ける。このようにして、ＤＮＡにおいて標的化二本鎖切断を作製することができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソログであるＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用によって、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化開裂が可能である。このような開裂は、一本鎖または二本鎖であることができる。哺乳動物のゲノムＤＮＡの開裂の場合、哺乳動物細胞における発現のために最適化されたＴｔＡｇｏコドンのバージョンを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞貫通ペプチドに融合した、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましい場合がある。さらに、変異誘発によって摂氏３７度で活性が改善するように改変されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ開裂は、ＤＮＡ切断を活用するために当該分野で標準的な技法を使用する遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子修正、標的化遺伝子欠失を含む、一連の結果に影響を及ぼすように使用することができた。
よって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれるいずれかの遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
Ｂ．開裂ドメイン
いずれか適した開裂ドメインをＤＮＡ結合ドメインに操作可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ（種々の生物におけるゲノム改変における使用のためを含む、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインによりその意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性によりＺＦＰ結合部位付近でＤＮＡをカットすることができる機能的な実体）を作製した。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを作製した。例えば、米国特許第８．５８６，５２６号を参照されたい。標的化開裂を誘導するための、ＤＮＡに結合し、開裂ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）に会合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系についても記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，９３２，８１４号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。
上に記す通り、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対し異種であり得る：例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン；ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン；ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）；ならびに／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００７０３０５３４６号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または予防する１種または複数種の操作された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
１つより多くの変異を有する開裂ドメインを使用してもよく、例えば、一方の開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される操作された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される操作された開裂ハーフドメインを産生する；４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）；４９０位、５３８位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む、操作された開裂ハーフドメイン；ならびに／あるいは操作された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。例えば、その開示全体が全ての目的のために参考として援用される米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一直列反復配列（ＤＲ）によって間を置いたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する、２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム工学を達成するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在する必要がある（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物によりまたは別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給）に融合されて、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ばれる）を作製する、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ、前記箇所およびＣｏｎｇ、前記箇所参照）。
標的部位
上で詳細に記載されるように、ＤＮＡ結合ドメインは、任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。
適した標的遺伝子の非限定例として、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（δ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、肺サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミンおよびＣＣＲ５遺伝子ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号を参照）ならびに植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許Ｕ．Ｓ．８，３２９，９８６を参照）等、「セーフハーバー」遺伝子座を標的化する。
ドナー
ある特定の実施形態では、本開示は、幹細胞のゲノムのヌクレアーゼ媒介性改変に関する。上に記す通り、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、指定の領域の欠失のため、および／または変異体遺伝子の補正のため、または野生型遺伝子の発現増加のためになされる。ドナー配列が、典型的には、これが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなるであろう。ドナー配列は、目的の位置における効率的ＨＤＲを可能にするため、２個の相同性領域に挟まれた非相同配列を含有することができる、または非相同性誘導型修復機構により組み込むことができる。その上、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの不連続領域を含有することができる。さらに、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子に存在して、目的の領域における配列と相同性の領域に挟まれることができる。
ヌクレアーゼにより、ドナーは、何れかの形態で導入することができる。ある特定の実施形態では、改変された細胞における残渣ウイルスを排除するために、ドナーは、ｍＲＮＡ形態で導入される。他の実施形態では、ドナーは、当該技術分野で公知の方法により、ＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを使用して導入することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。ドナーは、環状または直鎖状形態で細胞に導入することができる。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加の方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ドナーは、１ｋｂを超える長さの、例えば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはその間のいずれかの値）の配列（例えば、導入遺伝子とも称されるコード配列）を含む。ドナーは、少なくとも１個のヌクレアーゼ標的部位を含むこともできる。ある特定の実施形態では、ドナーは、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの対のための、少なくとも２個の標的部位を含む。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の開裂のため、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列に対し５’および／または３’にある。ヌクレアーゼ開裂部位は、あらゆるヌクレアーゼに対するものであってもよい。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位は、開裂されたドナーが相同性非依存的方法により組み込まれる内在性標的の開裂に使用される同じヌクレアーゼに対するものである。
ドナーは、組込み部位における内在性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによってその発現が駆動されるように挿入することができる。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることが明らかとなるであろう。内在性遺伝子の全てまたは一部が発現されるまたは全く発現されないように、ドナー分子を内在性遺伝子へと挿入することができる。さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。
本明細書に記載されているドナー配列において運ばれる導入遺伝子は、ＰＣＲ等、当該技術分野で公知の標準技法を使用して、プラスミド、細胞または他の供給源から単離することができる。使用のためのドナーは、環状スーパーコイル、ほどけた環状、直鎖状その他を含む、変動する種類のトポロジーを含むことができる。あるいは、ドナーは、標準オリゴヌクレオチド合成技法を使用して化学合成することができる。加えて、ドナーは、メチル化されていても、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態となることができる。
本明細書に記載されているドナーポリヌクレオチドは、１個または複数の非天然塩基および／または骨格を含むことができる。特に、メチル化シトシンを有するドナー分子の挿入は、本明細書に記載されている方法を使用して行われ、目的の領域における転写静止状態を達成することができる。
外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、いずれかの目的の配列（外因性配列）を含むことができる。例示的な外因性配列として、いずれかのポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位および様々な種類の発現構築物が挙げられるがこれらに限定されない。マーカー遺伝子として、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグは、例えば、１または複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたはいずれかの検出可能アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ドナーは、細胞におけるその発現が望まれるいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、その例として、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子および上述のいずれかの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡとなることができる。
ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的化組込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述の）および追加的な機能性をコードする連結された配列を含むことができる。マーカー遺伝子の非限定例として、ＧＦＰ、薬物選択マーカーその他が挙げられる。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、変異した内在性配列を置き換えるための野生型遺伝子を含むことができる。例えば、野生型（または他の機能的）遺伝子配列は、遺伝子の内在性コピーが変異した幹細胞のゲノムへと挿入することができる。導入遺伝子は、内在性遺伝子座に挿入することができる、あるいはセーフハーバー遺伝子座に標的化することができる。
本明細書の教示に従ったこのような発現カセットの構築は、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照）。トランスジェニック動物を生成するための発現カセットの使用前に、選択された制御エレメントに関連するストレス誘導因子に対する発現カセットの応答性は、適した細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞または不死化細胞株）へと発現カセットを導入することにより検査することができる。
さらに、発現には必要とされないが、外因性配列は、転写もしくは翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結して、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作製することができる。例示的なスプライスアクセプター部位配列は、当業者に公知であり、ほんの一例として、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号１）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号２）（ヒト免疫グロブリン−ガンマ遺伝子由来）を含む。
非コード核酸配列の標的化挿入を達成することもできる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列を、標的化挿入のために使用することもできる。
追加的な実施形態では、ドナー核酸は、追加的なヌクレアーゼ設計に特異的な標的部位である非コード配列を含むことができる。その後に、本来のドナー分子が開裂され、別の目的のドナー分子の挿入により改変されるように、細胞において追加的なヌクレアーゼを発現させることができる。このようにして、特定の目的の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座における形質の積み重ねを可能にする、ドナー分子の反復的組込みを生成することができる。
細胞
よって、本明細書に記載されている方法によって産生される細胞を含む、不活性化された遺伝子および／または導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞、例えば、幹細胞が本明細書に提供される。導入遺伝子は、１種または複数のヌクレアーゼを使用して、細胞のゲノムへと標的化様式で組み込まれる。ランダムな組込みとは異なり、標的化組込みは、導入遺伝子が、指定の遺伝子へと組み込まれることを確実にする。導入遺伝子は、標的遺伝子におけるいずれの箇所にも組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ヌクレアーゼ結合および／または開裂部位にまたはその付近に、例えば、開裂部位および／または結合部位の上流または下流の１〜３００（またはその間のいずれかの数の塩基対）塩基対以内に、より好ましくは、開裂および／または結合部位のいずれか一方の側の１〜１００塩基対（またはその間のいずれかの数の塩基対）以内に、さらにより好ましくは、開裂および／または結合部位のいずれか一方の側の１〜５０塩基対（またはその間のいずれかの数の塩基対）以内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、組み込まれた配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。ある特定の実施形態では、細胞は、改変が、ベータ−グロビン遺伝子のエクソン内、例えば、エクソン１、２または３内に存在するような、本明細書に記載されているヌクレアーゼによって作製される改変（例えば、挿入および／または欠失）を含む。ある特定の実施形態では、改変は、ベータグロビン遺伝子のエクソン１における鎌状赤血球変異を補正する。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号２３または２４にまたはその付近（例えば、１〜３００塩基対またはその間のいずれかの数の塩基対）に存在する。他の実施形態では、改変は、配列番号２３または２４の１〜１００塩基対（またはその間のいずれかの数の塩基対）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号２３および／または配列番号２４内に存在する、例えば、配列番号２３または２４のいずれかにおける１または複数塩基対の改変である。
細胞および細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、いかなる細胞型も、導入遺伝子を含むように、本明細書に記載されている通りに遺伝子改変し得る。本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞の他の非限定例として、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋等）；樹状細胞；Ｂ細胞；自家（例えば、患者由来）が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、異種多能性、全能性または複能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞その他）を含む幹細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞は、患者に由来する幹細胞である。
本明細書に記載されている細胞は、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ治療法による、障害を有する被験体における障害の処置および／または防止において有用である。標準技法を使用して、ヌクレアーゼ改変された細胞を増やしてから、患者に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓら（２０１４年）Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。幹細胞の場合、被験体への注入後に、これらの前駆体から、（挿入されたドナーから）機能的タンパク質を発現する細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ分化も起こる。本明細書に記載されている細胞を含む医薬組成物も提供される。加えて、細胞は、患者への投与に先立ち凍結保存することができる。
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって送達してもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、ｉｎ ｖｉｖｏで送達される。他の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのｅｘ ｖｉｖｏ送達において有用な改変された細胞の提供のために、単離された細胞（例えば、自家または異種幹細胞）へと送達される。
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数種の構成成分をコードする配列を含有する任意の核酸送達機構（ネイキッドＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにベクターを含む）を使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどならびにこれらの組み合わせを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号ならびに米国特許出願第１４／２７１，００８号も参照されたい。さらに、任意のこれらの系が、処置のために求められる１種または複数種の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数種のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じ送達系または異なる送達機構に保有させてもよい。複数の系が使用される場合、各送達機構は、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（例えば、１種もしくは複数のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび／または１種もしくは複数のドナー構築物を保有するｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含むことができる。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ネイキッド核酸、およびリポソーム、脂質ナノ粒子、ポリ乳酸−グリコール酸ナノ粒子、ポリアミン錯化剤またはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子療法手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、キャップドＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ）、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
追加の例示の核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
追加の送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与（ｉｎ ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は被験体に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非***細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞***を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等のシュードタイプ化ＡＡＶを含む、いずれかのＡＡＶ血清型を使用することができる。
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）の逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１巻：９１１７号 １７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびに全てのそれらのバリアントを含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非***性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを操作して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の被験体への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドをＡＡＶによって保有することができ、一方、１種または複数種のヌクレアーゼを異なるｍＲＮＡによって保有することができる。さらに、これらの異なる系を、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
キット
上述の方法のいずれかを行うためのキットも提供される。キットは、典型的に、１種もしくは複数のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、幹細胞増大に影響を与える１種もしくは複数の因子、および／または本明細書に記載されているドナーポリヌクレオチド、ならびに幹細胞に影響を与える因子を、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドが導入される細胞（または周囲の培地）へと投与するための指示を含有する。キットは、細胞、細胞の形質転換のためのバッファー、細胞のための培養培地および／またはアッセイを行うためのバッファーを含有することもできる。典型的には、キットは、キットの他の構成成分に添付または他の仕方で添えられた指示、包装または広告チラシ等、いずれかの材料を含むラベルも含有する。
以下の実施例は、ヌクレアーゼが１種もしくは複数種のＺＦＮまたは１種もしくは複数種のＴＡＬＥＮを含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼが使用され得ること、例えば、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物、メガＴＡＬ、コンパクトＴＡＬＥＮおよび操作された単一ガイドＲＮＡを使用するＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼ系が使われ得ることであることは理解されよう。
（実施例１：ジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計、構築および一般的特徴付け）
基本的にＵｒｎｏｖら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ ４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁、Ｐｅｒｅｚら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６巻（７号）：８０８〜８１６頁に記載され、米国特許第６，５３４，２６１号に記載されている通りにジンクフィンガータンパク質を設計し、プラスミド、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクターに取り込み、結合に関して検査した。ヒトベータグロビン遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに関しては、共有の米国特許第７，８８８，１２１号ならびに米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号および同第２０１３０１２２５９１号を参照されたい。
（実施例２：グロビン特異的ＺＦＮの活性）
ヒトグロビン遺伝子座を標的化するＺＦＮ対を使用して、特異的標的部位においてＤＳＢを誘導するこのようなＺＦＮの能力を検査した。示されているＺＦＮの各フィンガーの認識ヘリックス領域のアミノ酸配列を下表１に示す。標的部位（ＤＮＡ標的部位を大文字で示し；非接触ヌクレオチドを小文字で示す）を表２に示す。
次の通りにヒトＣＤ３４＋細胞を得て、加工した。全臍帯血（ＣＢ）検体は、カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって承認されるガイドラインに従って得られ、ＩＲＢ審査から免除された匿名医療廃棄物であると考慮された。採取４８時間以内に細胞を加工した。ＵＣＬＡ ＩＲＢプロトコール番号１０−００１３９９に基づくインフォームドコンセントにより、ＳＣＤを有するボランティアドナー由来の骨髄（ＢＭ）吸引液を得た。Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）密度遠心分離を使用して、ＢＭおよびＣＢから単核細胞（ＭＮＣ）を単離した。次に、免疫磁気カラム分離を使用して、抗ＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）と共にＭＮＣを４℃で３０分間インキュベートすることにより、ＣＤ３４＋細胞を濃縮した。次に、磁気カラムを通して細胞を送り、ＣＤ３４＋細胞を採取し、凍結培地（１０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、９０％ＦＢＳ）の入ったクライオバイアルに置き、液体窒素中に凍結保存した。動員されたＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢ）は、Ａｌｌｃｅｌｌｓから購入した。
エレクトロポレーションのためのｍＲＮＡを産生するために、表１に示すＺＦＮをコードするプラスミドをＳｐｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で直鎖化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型としての使用前に、フェノール：クロロホルム（ｃｈｏｌｏｒｆｏｒｍ）により精製した。ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーのプロトコールに従って使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡを産生し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）清浄化キット（Ｑｉａｇｅｎ）により清浄化した。エレクトロポレーションのため、次のプロトコールに従った：ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を３７℃で解凍し、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および（１×グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補充したイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において洗浄し、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ−３および５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において４８時間予め刺激した。エレクトロポレーションのため、反応当たり２００，０００個の細胞を９０ｇで１５分間スピンさせ、１００μｌのＢＴＸプレスバッファー（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に再懸濁し、表示量のＺＦＮ ｍＲＮＡおよび／または適用できる場合はオリゴヌクレオチドと混合し、ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）において２５０Ｖで５ミリ秒のパルスを１回適用した。
エレクトロポレーション後に、細胞を１０分間室温で休ませ、その後、培養培地を添加し、合計５００ｕｌにおいてプレートに移した。ドナーＩＤＬＶは、適切な試料のために記載されている濃度で最終培養培地において存在した。
次の通りに遺伝子補正および遺伝子破壊を解析した：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイ（Ｃｅｌ−１）を使用して、ＺＦＮ誘導性部位特異的アレル破壊を決定した。２００ｎｇのゲノムＤＮＡから、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｈｉ−Ｆｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｃｅｌ１Ｆｗｄ（５’−ｇａｃａｇｇｔａｃｇｇｃｔｇｔｃａｔｃａ−３’配列番号２５）およびＣｅｌ１Ｒｅｖ（５’−ｃａｇｃｃｔａａｇｇｇｔｇｇｇａａａａｔ−３’配列番号２６）を使用して、ＺＦＮ結合部位周囲の４１０ｂｐ領域をＰＣＲ増幅した。変性、再アニーリング、消化ならびに電気泳動およびデンシトメトリー解析を記載されている通りに完了した（例えば、Ｊｏｇｌｅｋａｔら（２０１３年）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ： Ｊ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１巻：１７０５〜１７頁）。部位特異的遺伝子改変を制限断片長多型（ＲＦＬＰ）により検出した。
プライマーＢｇｌｏＯｕｔｅｒＦｗｄ（５’−ａｔｇｃｔｔａｇａａｃｃｇａｇｇｔａｇａｇｔｔｔ−３’、配列番号２７）およびＢｇｌｏＯｕｔｅｒＲｅｖ（５’−ｃｃｔｇａｇａｃｔｔｃｃａｃａｃｔｇａｔｇ−３’、配列番号２８）ならびにＡｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｈｉ−Ｆｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＺＦＮ結合部位周囲の１．１ｋｂ領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ清浄化キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、１０ユニットのＨｈａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して３７℃で３．５時間消化した。ＧｅｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で予め染色した１．０％ＴＢＥ−アガロースゲルにおいて消化産物を分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９０００ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において画像化した。
遺伝子改変を定量化するために、定量的ＰＣＲに基づくアッセイを使用した。上述の１．１ｋｂ ＰＣＲ産物を鋳型として使用して、２回のＰＣＲ反応のセットを行った。未精製のＰＣＲ鋳型を１：５，０００希釈し、そのうち１ｕｌを、次の２５ｕｌ反応物のそれぞれにおいて使用した。プライマーＨｈａＩＦｗｄ（５’−ｇａａｇｔｃｔｇｃｃｇｔｔａｃｔｇｃｇ−３’、配列番号２９）およびＨｈａＩＲｅｖ（５’−ｃｃｃａｇｔｔｔｃｔａｔｔｇｇｔｃｔｃｃ−３’、配列番号３０）を使用して第１のＰＣＲを行って、改変されたゲノムを増幅した。プライマーＥｘｏｎＩＩＦｗｄ（５’−ｃｔｃｇｇｔｇｃｃｔｔｔａｇｔｇａｔｇｇ−３’、配列番号３１）およびＥｘｏｎＩＩＲｅｖ（５’−ｇａｃｔｃａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃｔｃ−３’、配列番号３２）を使用して第２のＰＣＲを行って、インプット鋳型を正規化した。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、これらのＰＣＲの両方は定量的となり、ＶｉｉＡ７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において取得した。２回の反応の間のＣｔ（閾値までのサイクル数）差およびプラスミド検量線を使用して、遺伝子改変の頻度を決定した。全ＺＦＮが活性であることが判明した。
グロビンパラログをＰＣＲ増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機械においてディープシーケンシングして、オフターゲット改変をアッセイした。ＰＣＲに使用したプライマーを次に示す：ＨＢＢ：５’−ａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｎｎｎｎｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔａａａａｇｔｃａｇ−３’（配列番号３３）および５’−ｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｔｃｃａｃａｔｇｃｃｃａｇｔｔｔｃｔａｔｔ−３’（配列番号３４）；ＨＢＤ：５’−ａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｎｎｎｎｔａａａａｇｇｃａｇｇｇｃａｇａｇｔｃｇａ−３’（配列番号３５）および５’−ｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔａｃａｔｇｃｃｃａｇｔｔｔｃｃａｔｔｔｇｃ−３’（配列番号３６）；ＨＢＥ１：５’−ａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｎｎｎｎｃｔｇｃｔｔｃｃｇａｃａｃａｇｃｔｇｃａａ−３’（配列番号３７）および５’−ｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｔｃａｃｃｃｔｔｃａｔｔｃｃｃａｔｇｃａｔ−３’（配列番号３８）；ＨＢＧ１およびＨＢＧ２：５’−ａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｎｎｎｎｇｇａａｃｇｔｃｔｇａｇｇｔｔａｔｃａａｔ−３’（配列番号３９）および５’−ｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃｔｔｇｔｃｃ−３’（配列番号４０）。ＨＢＧ１およびＨＢＧ２は同時増幅し、アンプリコン内の遺伝子座特異的ＳＮＰを使用して、配列リードをＨＢＧ１またはＨＢＧ２のいずれかに割り当てた。フォワードプライマー内の混合された塩基は、配列決定の際のクラスターデコンボリューションを可能にする。
ＺＦＮは、細胞型に依存してベータ−グロビン遺伝子座における３５〜６５％アレル破壊（インデル）を誘導したが、下表３に示す通り、ベータグロビンパラログにおいて検出された改変は、より低かった。
ヒト臍帯血（ＣＢ）および動員末梢血（ｍＰＢ）の両方から単離されたＣＤ３４＋への、ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡのエレクトロポレーションは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイによって決定される通り、標的遺伝子座の有効な開裂をもたらした（図１Ｂ）。
結果は、ＺＦＮが、ベータ−グロビン遺伝子座における高レベルの遺伝子改変を駆動することを示した。
（実施例４：鎌状赤血球塩基におけるＺＦＮに駆動された補正）
標的化されたベータ−グロビン遺伝子座における開裂が成功した後に、本発明者らは、相同ドナー鋳型を使用して、この部位における鎌状塩基の補正が可能であるか決定することを試みた。この目的のため、２種類の遺伝子補正鋳型を並行して設計し、検査した：短いＤＮＡオリゴおよびＩＤＬＶ。ＩＤＬＶへとクローニングされた１．１ｋｂのヒトベータ−グロビン遺伝子断片ドナー鋳型は、鎌状変異に補正的変化を含むと共に、相同組換えの代替解析のためのＨｈａＩ制限部位を作製するためのサイレント制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含むように設計した（図１Ｃ）。ＩＤＬＶによりドナー鋳型を送達し（図２Ｄを参照）、最小の細胞傷害性でのＣＤ３４＋ＨＳＰＣの効率的形質導入を可能にし、最小のゲノム組込みでの高い鋳型コピー数を一過的に産生する。
ＺＦＮ（対３３４８８／３３５０１）プラスＩＤＬＶドナーで処理したＣＤ３４＋細胞における遺伝子改変レベルを、ＨｈａＩ ＲＦＬＰ消化（図１Ｄ）およびアレルの平均１８．０±２．２％における定量的ＰＣＲに基づく（ｑＰＣＲ）アッセイ（図１Ｅ）により最初に決定した。ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＩＤＬＶドナー濃度の最適化を行い（図２および図３）、細胞数および生存率を維持しながら高レベル改変を達成するには、目的の細胞型におけるＺＦＮ試薬の用量決定が重要であることを実証した。
遺伝子改変／補正鋳型としてのオリゴヌクレオチドの使用は、スピード、費用、再現性および実験の容易さに関する利点を有するであろう。ベータ−グロビン遺伝子（ＨＢＢ）にＡｖｒＩＩ ＲＦＬＰを作製するように設計された３塩基対配列を導入した、ｍＰＢ由来のＨＳＰＣにおいてオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）ドナー鋳型を使用した最初の実験は、１５％遺伝子改変を生じた（図４を参照）。
オリゴドナーの使用を緻密化するために、一方または他方の鎖に相当し、ＺＦＮ開裂部位に中心を有する対称的に増加する長さのオリゴヌクレオチドのパネルを検査し（下表４を参照）、この表において、太字は、野生型配列に対して変異した塩基を示す。「ｓ」と標識されたオリゴヌクレオチドは、野生型遺伝子へと鎌状変異を導入するように設計された配列を含む。表に示す通り、「Ｓ」と標識された列において、野生型配列は、この位置にＡを含む一方、鎌状変異は、Ｔを含む。
より長い逆向き鎖オリゴヌクレオチドの使用は、最高レベルの遺伝子改変をもたらした（図５を参照）。ＳＣＤ変異部位における遺伝子改変または補正は、ＺＦＮ結合部位の配列またはスペーシングを変化させないため、ドナー鋳型にサイレント変異を設計し、染色体へと同時導入して、改変されたアレルのＺＦＮ結合および再開裂を防止または低下させた。逆向き鎖ドナーの使用は、３’ＺＦＮ結合部位におけるサイレント変異の導入と適合性である（図４Ｃ）。
サイレント変異の様々な組合せをドナーオリゴへと導入し、遺伝子改変の頻度をアッセイした。サイレント変異部位（ＳＭＳ）１および２（ＳＭＳ１２）の組合せは、最高レベルのＨＢＢ改変を生じ、全部分配列のその後の実験において使用した（図４Ｄ）。遺伝子改変されたＨＢＢアレルおよび改変された後に再開裂されたアレルの間の反比例関係は、ＳＭＳドナーが、ＺＦＮ再開裂を遮断するために実際に機能することを示唆する（図４Ｅ）。ＨＳＰＣプールおよび赤芽球バースト形成細胞コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）におけるＨＢＢ転写物の試験は、いかなるＳＭＳアレルからもｍＲＮＡのスプライシングの変更の証拠を見出さなかった。
高いＺＦＮ ｍＲＮＡ（対４７７７３／４７８１７）濃度において、ＳＭＳ０１２を含有するドナーオリゴヌクレオチドの使用は、ＳＭＳ１２ドナーの使用よりも多くのＨＢＢ改変されたアレルを生じた（図１７Ｂ）。
ＺＦＮおよびＳＭＳ１２４ドナーによる処理後のＨＢＢにおける分子的結果の網羅的解析は、相同性誘導型およびＮＨＥＪに基づく遺伝子改変の組合せ（１．５％）またはＮＨＥＪに基づくオリゴヌクレオチド捕捉（０．４％）に由来する事象等、ごく軽微なレベルの予想外のＤＮＡ修復事象を明らかにした（下表５を参照）。
最後に、部分的相同性誘導型遺伝子改変事象の過多（ＳＭＳ１２対ＳＭＳ２４）は、切除されたＤＳＢの左側３’一本鎖末端を使用して、オリゴヌクレオチド鋳型による遺伝子改変の際に新たなＤＮＡ合成が起こるという考えに強い支持を与えた（図６を参照）。ＺＦＮ、オリゴヌクレオチドおよびＨＳＰＣドナーの最適な組合せは、アレルの３０〜４０％の遺伝子改変を可能にした（図４Ｆを参照）。
よって、ＺＦＮは、相同ドナー鋳型と一緒に送達されると、初代ＨＳＰＣにおける高レベルの標的化ＤＳＢおよび高レベルの部位特異的遺伝子改変の両方を誘導することができる。
（実施例５：ＺＦＮ特異性）
ベータ−グロビンは、他のグロビン遺伝子（デルタ−、イプシロン−、Ａガンマ−、Ｇガンマ−およびシュード−ベータ−グロビン）に対し高い相同性を有するため、これらの領域における開裂を回避するようにＺＦＮを設計した（図６Ａ）。３３４８８／３３５０１対を使用した相同グロビン遺伝子における開裂率を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用して、また、ハイスループットＤＮＡ配列決定によりアッセイした。これらの領域のそれぞれの解析は、ｍＰＢ、ＣＢおよびＳＣＤ ＢＭ ＣＤ３４＋細胞における高度に相同なデルタ−グロビン遺伝子のみにおけるオフターゲット改変を明らかにした（図６Ｂ、表３）。本発明者らは、より網羅的な不偏ゲノムワイドアプローチにより、オフターゲットＺＦＮ開裂のこのような直接的検査を補完して、オフターゲット部位を同定した。このアッセイは、二本鎖切断の部位において捕捉される非相同ＩＤＬＶの傾向に基づき、ＩＤＬＶ捕捉に対するその寛容性のために選択されたＫ５６２細胞における組込みの下流クラスター化組込み部位解析（ＣＬＩＳ）を使用する。用いた手順について、下に概要を述べる：
ベータ−グロビン遺伝子クラスター部位を次のプライマー：ＨＢＤ：５’−ｇｇｔｔｃａｔｔｔｔｔｃａｔｔｃｔｃａｃａ−３’（配列番号４１）および５’−ｇｔａａｔｃｔｇａｇｇｇｔａｇｇａａａａｃ−３’（配列番号４２）；ＨＢＢＰ１：５’−ｃａｃｃｃｔｔｇａｃｃａａｔａｇａｔｔｃ−３’（配列番号５２）および５’−ｇａｇａｃｔｇｔｇｇｇａｔａｇｔｃａｔａ−３’（配列番号４３）；ＨＢＥ１：５’−ｃａｔｔａｔｃａｃａａａｃｔｔａｇｔｇｔｃｃ−３’（配列番号４４）および５’−ａｇｔｃｔａｔｇａａａｔｇａｃａｃｃａｔａｔ−３’（配列番号４５）；ＨＢＧ１：５’−ｇｃａａａｇｇｃｔａｔａａａａａａａａｔｔａｇｃ−３’（配列番号４６）および５’−ｇａｇａｔｃａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｔｔｇ−３’（配列番号４７）；ＨＢＧ２：５’−ｇｇｃａａａｇｇｃｔａｔａａａａａａａａｔｔａａｇｃａ−３’（配列番号４８）および５’−ｇａｇａｔｃａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｔｔａ−３’（配列番号４９）によりＰＣＲ増幅し、上述のＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼによって解析した。
Ｋ５６２細胞に、１５μｇ／ｍＬのＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＭＮＤプロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ， Ｐ． Ｍ．ら（１９９５年）Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ６９巻、７４８〜５５頁を参照）によって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を含有し、ベータ−グロビン遺伝子座に対するいかなる相同性も欠く２Ｅ＋０８ Ｔ Ｕ／ｍＬ（ＭＯＩ＝２５０）のＩＤＬＶを形質導入して、二本鎖切断における組込みが、ＮＨＥＪ媒介性捕捉によるものであることを確実にした（図７Ａを参照）。ＺＦＮ＋ＩＤＬＶの４種の個々の生物学的複製を完了して、潜在的ゲノムワイドオフターゲット部位に対する高感度を維持した一方で、２種の対照を完了して、バックグラウンド組込みのレベルを決定した。ＺＦＮの作用なしでＩＤＬＶを捕捉する天然起源のＤＳＢの部位を検出するために、対照細胞には、ＧＦＰ ＩＤＬＶを与えたが、ＺＦＮ ｍＲＮＡは与えなかった。１０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ）において、Ｋ５６２細胞を６０日間培養した。この期間において、ＧＦＰ陽性のフローサイトメトリー解析を定期的に行って、あらゆる組み込まれていないＩＤＬＶが試料から希釈されていったことを確実にした。６０日目に、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により試料を選別して、ＧＦＰ＋細胞を単離し、５日間増やし、ゲノムＤＮＡを抽出し、非制限的線形増幅媒介性ＰＣＲ３５によるベクター組込み部位の配列決定のために試料を調製した。以前に概要を述べた通りに（Ｇａｂｒｉｅｌ， Ｒ．ら（２０１１年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２９巻（９号）：８１６〜２３頁）５００塩基対のＣＬＩＳウィンドウによりクラスター化組込み部位（ＣＬＩＳ）解析を行って、ＺＦＮ開裂の部位を明らかにした。全ＣＬＩＳを解析して、ＺＦＮ対配列に対する各部位の相同性のレベルを決定した。相同性のパーセンテージは、最大２０ヌクレオチドのスペーサー長による、ＺＦＮ結合の全反復（ホモ二量体およびヘテロ二量体）に対する部位におけるマッチする塩基対の数として規定した。ＣＬＩＳ毎の最高パーセンテージ相同性を下表６に報告する。この表に関して、同定されたＣＬＩＳは全て、それらの組込み部位の２００塩基対以内のＺＦＮ標的部位に対する相同性の最高パーセンテージで収載する。ＺＦＮ結合のあらゆる可能な反復（ヘテロ二量体およびホモ二量体）を評価し、最大２０ｎｔのスペーサー長を解析した。開裂の２種のＺＦＮ部位を太字で強調する。ＣＬＩＳによって同定された他の脆弱部位は全て、イタリック体で書かれている。Ｃｈｒ、染色体；ＣＬＩＳ、クラスター化組込み部位；Ｌ、「左」ＺＦＮ単量体（ＳＢＳ番号３３４８８）；Ｒ、「右」ＺＦＮ単量体（ＳＢＳ番号３３５０１）；ただし、ＺＦＮ二量体における数字は、ＺＦＮ標的部位に対する相同性の最大パーセンテージをもたらしたスペーサーサイズに相当する。この方法を使用して、２０，０００種のランダムなゲノム部位を解析して、ゲノム全域にわたるＺＦＮ相同性のバックグラウンドレベルを決定した。
予測される通り、ＣＬＩＳ解析は、ベータ−グロビンおよびデルタ−グロビンにおけるトラッピングを明らかにした（図７、表６）。ＺＦＮ結合部位に対し有意な相同性を有するＣＬＩＳ解析における他の推定オフターゲット部位は見出されなかった。
これらの結果は、ゲノムワイドスケールにおける、その意図される標的部位に対するこのＺＦＮ対の高レベルの特異性を実証する。
（実施例６：改変されたＨＳＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化）
遺伝子改変されたＨＳＰＣが、正常な広範囲の赤芽球および骨髄系分化が可能であることを確実にするために、処理された細胞を単一細胞としておよびバルク培養においての両方でアッセイした。ＨＳＰＣ分化を促進するサイトカインを含有するメチルセルロース培地におけるコロニー形成能に関して単一細胞をモニターした。簡潔に説明すると、エレクトロポレーション１日後に、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｏｐｔｉｍｕｍメチルセルロースに基づく培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、３５ｍｍ細胞培養皿毎に１００および３００個の生細胞を二連で蒔いた。オリゴヌクレオチドドナーによる実験に関して、エレクトロポレーション５日後に細胞を蒔いた。５％ＣＯ２、３７℃および加湿雰囲気下の培養における２週間後に、その形態に基づき、異なる種類のコロニーを特徴付け、数え上げた。ＺＦＮ単独（対３３４８８／３３５０１）で処理したまたはＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドドナーで処理したＨＳＰＣは、同様の数およびパターンの赤芽球および骨髄系クローンを生成した。
ＳＣＤ ＢＭ試料のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ赤芽球分化技法は、Ｇｉａｒｒａｔａｎａら（（２００５年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３巻：６９〜７４頁）から適応させ、ＲｏｍｅｒｏおよびＵｒｂｉｎａｔｉら（（２０１３年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３巻（８号）：３３１７〜３３３０頁）に記載されている。エレクトロポレーション１日後に、細胞を赤芽球培養に置いた。下流の解析のために多数の細胞を得るために、赤芽球増大を増加させるための８日目とは対照的に、プロトコールの１２日目に細胞を共培養に置いた。実験２２日目に細胞を収集し、ペレットとし、ＨＰＬＣ解析に付した（後述を参照）。５’−ａｃａｔｔｔｇｃｔｔｃｔｇａｃａｃａａｃ−３’（エクソン１、配列番号５０）および５’−ｇａａａｔｔｇｇａｃａｇｃａａｇａａａｇｃ−３’（エクソン３、配列番号５１）を使用したＲＴ−ＰＣＲによりＨＢＢスプライシングのアッセイも行ったところ、エクソンスキッピングもイントロン保持も観察されなかった。
個々の赤芽球コロニーの遺伝子型判定は、予想される頻度での意図される編集の存在を確認した。加えて、ＨＳＰＣを誘導して、バルク培養において赤血球細胞に分化させた（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ， Ｍ．ら（２０１１年）Ｂｌｏｏｄ １１８巻、５０７１〜９頁）。赤血球細胞分化を通して細胞を試料採取し、編集された細胞の頻度をハイスループットＤＮＡ配列決定により測定した。メチルセルロースにおいて育成した赤芽球コロニーの本発明者らの単一細胞解析と一致して、プールにおける遺伝子改変の出発レベルに関係なく、バルク培養における赤血球細胞への分化において、改変された細胞の頻度の変化は基本的に見出されなかった（図９Ａ）。
グロビン鎖の解析のため、ＨＰＬＣを行った（図９Ｂ）。ＳＣＤ ＢＭ試料のため、Ｗｉｌｂｅｒ， Ａ．ら（（２０１１年）Ｂｌｏｏｄ １１７巻：２８１７〜２６頁）の記載を一部僅かに修正しつつ、末期赤芽球細胞によって産生されるヘモグロビン（Ｈｂ）種のＨＰＬＣを行った。赤芽球培養の終わり（２２日目）に赤芽球細胞（１−２Ｅ＋０７）を収集し、ペレットとし、溶解するまで−８０℃で凍結貯蔵した。解凍後に、２５ｕＬの溶血血液試薬（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に細胞を再懸濁し、一晩冷蔵し、その後、２０，８００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。カチオン交換カラム（Ｕｌｔｒａ２ Ｖａｒｉａｎｔ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｒｉｍｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用したＨＰＬＣによるＨｂ産生の特徴付けのために、清澄になった上清を使用し、ヒトヘモグロビンに対して試料を較正した。ＨＰＬＣ機器付属のソフトウェアにより、保持時間に基づきＨｂ種に相当するピークを同定した。主要ヘモグロビンピークのそれぞれの曲線下面積の総計に基づき、試料毎に産生されるＨｂＡの相対的パーセンテージを計算し、これらのピークは、アセチル化胎児性ヘモグロビン、ＨｂＦＡｃ；胎児性ヘモグロビン、ＨｂＦ；野生型ヘモグロビン、ＨｂＡ；および鎌状ヘモグロビン、ＨｂＳを含んだ。
ｍＰＢ試料のため、赤芽球培養１８日目に赤芽球細胞を収集した。細胞をペレットにし、ＲＴで１０分間水に溶解した。細胞デブリを除去するための２０，０００ｇ、５分間の遠心分離後に、細胞溶解物を−８０℃で凍結貯蔵した。解凍後に、細胞溶解物を移動相Ａにおいて１：１０希釈し、弱いカチオン交換カラム（ＰｏｌｙＣＡＴ ＡＴＭ、ＰｏｌｙＬＣＩＮＣ．）を使用したＨＰＬＣ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０、Ａｇｉｌｅｎｔ）により特徴付けた。ＦＡＳＣ参照材料（Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、一般的なヘモグロビン（ＨｂＦ、ＨｂＡ、ＨｂＳ、ＨｂＣ）の溶出時間を規定した。ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、解析およびピーク積分を行った。ヘモグロビンピークのそれぞれの曲線下面積の総計に基づき、試料毎に産生されるＨｂＡの相対的パーセンテージを計算し、これらのピークは、アセチル化胎児性ヘモグロビン、ＨｂＦＡｃ；胎児性ヘモグロビン、ＨｂＦ；野生型ヘモグロビン、ＨｂＡ；および鎌状ヘモグロビン、ＨｂＳを含んだ。
並行実験において、本発明者らは、ＨＢＢアレルの１４％を鎌状型に変換し、１８日間の赤芽球分化の後に存在するグロビン鎖をＨＰＬＣによりアッセイした。これらの細胞によって産生されるヘモグロビンのおよそ１８％は、鎌状ヘモグロビンであり、タンパク質レベルでの遺伝子改変事象の影響を実証した（図９Ｂ）。
（実施例７：マウスへの改変された細胞の生着）
ＺＦＮ改変された細胞が、その造血再増殖能を維持するか決定するために、ＺＦＮおよびドナー処理したまたは偽処理したＣＢ由来ＨＳＰＣを、免疫不全ＮＳＧマウスに異種移植した。
簡潔に説明すると、複数の健康な個体由来の新鮮ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を２日間予め刺激し、その後に、ＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ドナーＩＤＬＶ（２Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ；ＭＯＩ＝５０）を形質導入した。グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、５０ ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ−３および５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）を含む事前刺激培地を使用した。１日間の回復後に、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を有するＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）における１Ｅ＋０６生細胞を、尾静脈注射により、２５０ｃＧｙの全身照射後の６〜８週齢のＮＳＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に移植した。並行して培養したが、ｍＲＮＡ、エレクトロポレーションまたはＩＤＬＶに曝露されていない（偽処理）ＣＤ３４＋細胞の対照試料を使用した。複数の解析のために、少量のアリコートをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。エレクトロポレーション１日後にｍＰＢ試料を凍結し、後日解凍し、上述通り移植前に１日間回復させた。
Ｖ４５０コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ４５対ＡＰＣコンジュゲートされた抗マウスＣＤ４５を使用して、移植後５週目に、ヒト細胞の生着をフローサイトメトリーにより評価した。抗体とのインキュベーション後に、ＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により赤血球細胞を溶解させた。生着のパーセンテージを％ｈｕＣＤ４５＋／（％ｈｕＣＤ４５＋ ＋ ％ｍｕＣＤ４５＋）として規定した。Ｖ４５０コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ４５、Ｖ５００コンジュゲートされた抗マウスＣＤ４５、ＦＩＴＣコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３３、ＰｅｒＣＰコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３、ＰＥ−コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ５６、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートされた抗ヒトＣＤ１９およびＡＰＣコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３４（全抗体、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、移植後８週および１６週目に、末梢血およびＢＭにおける生着および系列分布をフローサイトメトリーにより評価した。
結果変数の平均および標準偏差を含む記述統計学は両者共に、図表により報告および提示した。遺伝子改変レベル、生着および系列に関する定量的結果のため、独立ｔ検定により、または３群以上が存在する場合は一元配置ＡＮＯＶＡのフレームワーク内で、ペアワイズ比較を行った。用量応答解析を行って、ＺＦＮおよびドナー比最適化を評価した。特に、本発明者らは、線形混合型モデルアプローチを使用したが、連続的および固定された効果として用量を、ランダム効果として実験を処理した。ＳＣＤ患者ＢＭ細胞の経時的な増大倍率を反復測定ＡＮＯＶＡにより評価した。本発明者らの統計学的研究において、仮説検定は両側性であり、ｐ値の有意性閾値０．０５を使用した。あらゆる統計解析は、ＳＡＳバージョン９．３（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．２０１２）を使用して行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の並行培養は、遺伝子改変率が、ｑＰＣＲ ＲＦＬＰ解析による５％〜２０％に及び、平均値が１４．５±６．４％であることを示した（図１０）。ハイスループット配列決定は、アレルの１０．５±４．０％が、鎌状位置に交換された塩基を含有し、挿入または欠失（インデル）が、３２．０±９．９％に観察されたことを明らかにした。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成アッセイにおいてこれらの細胞の造血能を評価した；細胞は、解析可能な系列の全てにおいて、未処理偽試料と比べて、その広範囲のコロニー形成能力を維持した。
注射後５および８週目に、ヒトおよびマウスの両方の総ＣＤ４５＋細胞のうちのヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして測定されるヒトＨＳＰＣの生着に関して、移植されたマウスを評価した。ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理ＨＳＰＣの生着レベルは、未処理対照に匹敵し、５週目に平均１４．８±１１．４％であり、８週目に４５％まで増加した（図１０Ｃ）。マウスの末梢血の系列解析（Ｔ細胞についてはＣＤ３、骨髄系細胞についてはＣＤ３３、ＨＳＰＣについてはＣＤ３４、Ｂ細胞についてはＣＤ１９、ＮＫ細胞についてはＣＤ５６）は、このモデルにおいて予想通りであった（図１１）。ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドドナーの両方で処理した細胞を与えたマウスにおけるヒト細胞の解析は、ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理ＨＳＰＣと同様のＨＳＰＣ分化スペクトルを明らかにした（図１０Ｅ）。
移植後１６週目にマウスを安楽死させ、ヒト細胞生着および遺伝子改変レベルの評価を可能にした。ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理細胞を与えたマウスについて、末梢血の評価は、高レベルの生着および予想される系列分布を明らかにした。骨髄（ＢＭ）区画の解析は同様であった（図１２）。同様に、ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドの両方で処理した細胞を与えたマウスにおいて、生着レベルおよび系列分布は、末梢血およびＢＭにおけるＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理ＨＳＰＣを与えたマウスのコホートに観察されるものと同様であった。
マウスに存在するヒト細胞が、実際にＺＦＮ試薬により改変された細胞であるか決定するために、各マウスのＢＭおよび脾臓組織からゲノムＤＮＡを単離し、ヒトベータ−グロビン遺伝子を調べた。ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理細胞を与えたマウスの組織におけるｑＰＣＲによるＨｈａＩ ＲＦＬＰの解析は、インプット細胞に観察される１０．５％の遺伝子改変レベルよりも低い頻度（それぞれＢＭおよび脾臓で０．１４±０．３２％および０．１６±０．１８％）であったが、これらのマウスにおける遺伝子改変の存在を明らかにした（図１３）。配列解析は、ＢＭおよび脾臓におけるヒト細胞の鎌状変異における遺伝子改変を確認し、それぞれ０．２１±０．３９％および０．２７±０．３１％における匹敵する平均であった（図１３Ｂ）。カット部位におけるＮＨＥＪに起因する挿入および欠失（インデル）の解析は、ＨＤＲよりも高レベルの変化を明らかにし、インデルを含有するＢＭ由来の全配列リードの４．８±７．８％および脾臓由来の３．８±３．７％であった（図１４）。
投与に先立つバルク集団における、鎌状塩基に１７．３％の遺伝子改変および１９．８％のインデルを有する、ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチド処理細胞を与えたマウスのＢＭおよび脾臓のゲノム解析も、遺伝子改変の維持を実証した。これらの組織由来のＤＮＡをハイスループット配列決定に付し、それぞれＢＭおよび脾臓における０．８５±０．８１％および２．１１±１．１９％標的化遺伝子改変を明らかにした（図１３Ｃ）。これらの組織におけるインデルの評価は、ＢＭにおける３．３４±２．６５％および脾臓における５．８６±２．３０％のレベルを示した（図１４）。
これらの結果は、ＺＦＮによる部位特異的ＤＮＡ開裂および相同性誘導型遺伝子改変を受けたＣＤ３４＋細胞が、生着し、多系列分化を起こすことができることを実証する。
（実施例８：鎌状骨髄における遺伝子補正）
鎌状赤血球症患者は、Ｇ−ＣＳＦによる幹細胞動員の候補ではないため、本発明者らは、これらの患者のＢＭ吸引液からＣＤ３４＋ＨＳＰＣを得た。ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびＩＤＬＶドナーを使用して、部位特異的遺伝子補正を行った。細胞を赤芽球増大培地に置き、その後に確立された方法を使用して分化させた（Ｒｏｍｅｒｏら、前記箇所、Ｇｉａｒｒａｔａｎａら、前記箇所）。加えて、細胞の一部をそのコロニー形成能に関して評価した。ＺＦＮ＋ＩＤＬＶ（対３３４８８／３３５０１）で処理した細胞は、偽、非エレクトロポレーション対照試料と比較して、やや低い（３５％）コロニー形成能力を示した（図１５）。
初期赤芽球増大後に（ただし脱核前に）、ゲノム解析のために細胞を収集した。これらの試料のｑＰＣＲによるＲＦＬＰ解析は、平均２０．１±８．８％の遺伝子改変レベルを明らかにした（図１６Ａ）。これらの結果は、ディープシーケンシングにより確認され、リードの１８．４±６．７％におけるＳＣＤ変異の補正を示す（図１６Ｂ）。その上、配列決定は、ＳＣＤ変異の補正を含有する大部分のアレルが、ＨｈａＩ位置にも塩基変化を含有したことを確認し、ＨＤＲ駆動事象の大部分が、これら２塩基の間に少なくとも２２ｂｐの距離を包含することを示す。赤芽球培養の終了後に、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるグロビン四量体の解析のために試料を採取した（図１６Ｃ）。
ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理試料に由来する赤芽球細胞におけるＨｂＡピークの存在は、遺伝子補正が、ベータＳアレルからベータＡアレルへの機能的変換をもたらしたことを実証する。このようなピークは、偽処理細胞に由来する赤血球には観察されなかった。ＨｂＦピークは、ＺＦＮ処理試料におけるＨｂＳピークの減少により、相対的増加を示した。ＺＦＮおよびＩＤＬＶ処理試料におけるＨｂＡの相対的誘導は、平均５．３±０．０２％であり、タンパク質補正レベルは最大１０．０％であった（図１６Ｄ）。
これらの結果は、鎌状赤血球症患者の骨髄由来のＨＳＰＣの表現型を補正する、ＩＤＬＶドナーと組み合わせたＺＦＮの能力を実証する。
本明細書に示されている結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した、ヒト造血幹／前駆細胞における鎌状赤血球症変異の高レベルの遺伝子補正を実証する。本研究において、本発明者らは、ベータ−グロビン遺伝子座を開裂するためのＺＦＮ対を設計した。相同ドナー鋳型（オリゴヌクレオチドとしてまたはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターにより送達）と組み合わせて、これらのＺＦＮは、前駆細胞において高レベルで相同性誘導型修復を誘導することができる。
ＺＦＮ開裂部位の解析は、ヌクレアーゼ活性の大多数がベータ−グロビン遺伝子座標的部位で起こり、相同デルタ−グロビン遺伝子での開裂はそれより少ない割合であったことを明らかにした。成体赤芽球細胞における低レベルのデルタ−グロビン発現のため（全グロビンの＜３．５％）、細胞のサブセットにおけるこの遺伝子におけるＺＦＮ活性が有害である可能性は低い。ＩＤＬＶ末端捕捉を使用した、Ｋ５６２細胞におけるＺＦＮオフターゲット開裂部位の不偏、ゲノムワイド評価は、ＺＦＮの高い特異性を実証し、天然に脆弱な部位へのバックグラウンド組込みのみが観察された。
ＺＦＮおよびドナー処理細胞が、マウスに移植されると、細胞の生着および系列分布は、偽処理ならびにＺＦＮおよびドナー処理試料の間で同等であった。しかし、移植前のｉｎ ｖｉｔｒｏ試料における１０〜２０％の遺伝子改変の平均レベルにもかかわらず、生着１６週間後のマウスの脾臓およびＢＭにおけるヒト細胞における遺伝子補正レベルは、著しくより低かった。これらの知見は、当該分野の近年公表された研究と一致し（Ｇｅｎｏｖｅｓｅら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ ５１０巻：２３５〜２４０頁）、より成熟した前駆細胞は、効率的に補正されるが、持続的な利益（例えば、臨床利益）は、より初期の、より始原的な造血幹細胞の改変によってもたらされることを暗示し得る。
部位特異的遺伝子破壊（ＣＣＲ５破壊に関してＨｏｌｔら（２０１０年）Ｎａｔ ｂｉｏｔｅｃｈ：８３９〜４７頁を参照）の効率と比較した、より始原的なＨＳＰＣにおける相同性誘導型遺伝子補正の効率は、同時送達される補正的塩基を含有するドナー鋳型の使用における差によるものである可能性があり、細胞ＤＮＡ損傷修復経路は、ＮＨＥＪよりもＨＤＲを使用してＤＳＢを消散させる必要がある。ＮＨＥＪは、静止状態の始原的ＨＳＣで好まれるため（Ｍｏｈｒｉｎら（２０１０年）Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ７巻：１７４〜８５頁を参照）、修復経路選択におけるバイアスは、始原的ＨＳＣにおける遺伝子補正を限定し得る。よって、ある理論に拘束されることなく、ＺＦＮは、成熟および始原的細胞集団において同様の効率で作用しているが、ＨＤＲが、より成熟した細胞においてより活性が高く、始原的ＨＳＣにおいてより活性が低くなるように、各細胞型において活性な修復経路が異なる可能性がある。特に、マウスに移植された細胞は、遺伝子改変についてのものよりも優れた程度まで、そのインデルのインプットレベルを維持した（それぞれＩＤＬＶおよびオリゴ実験の、遺伝子改変における４３．９および１１．７倍変化と比較した、インデルにおける７．４および４．３倍変化）。
鎌状赤血球症患者由来のＢＭ ＣＤ３４＋細胞における実験は、臨床への転換の見込みをもたらした。正準鎌状変異の補正のレベル（少なくとも赤芽球前駆細胞における）は、これらの実験に対して平均１８％であり、分化後に、これらの細胞は、補正された野生型ヘモグロビン（ＨｂＡ）を産生した。ＳＣＤの同種異系造血幹細胞移植由来のデータに基づき、１０〜３０％のドナーキメラ現象は、正常ドナー由来赤血球細胞の選択的利点の結果として有意な臨床改善をもたらし得る（Ａｎｄｒｅａｎｉら（２０１１年）Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ２巻（１号）：２１〜２２頁およびＷａｌｔｅｒｓら（２００１年）Ａｍ Ｓｏｃ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ ７巻：６６５〜７３頁を参照）。加えて、ＳＣＤ変異のヘテロ接合体は通常、疾患の症状を経験しない。よって、各ＨＳＣにおける１アレルのみの補正が、ＳＣＤに伴う症状の大部分の軽減に十分であることを立証することができる。
異常ヘモグロビン症、特にＳＣＤのためのレンチウイルスに基づく遺伝子療法における近年の進歩にもかかわらず（Ｒｏｍｅｒｏら、前記箇所ならびにＣｈａｎｄｒａｋａｓａｎおよびＭａｌｉｋ（２０１４年）Ｈｅｍａｔｏｌ／ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ ２８巻：１９９〜２１６頁を参照）、治療導入遺伝子の長く続き適切に調節される発現が必要であるため、潜在的合併症が残る。標的化ヌクレアーゼを使用した、ＨＳＣにおける正準ＡからＴへの疾患を引き起こす鎌状トランスバージョンの部位特異的補正は、その内在性プロモーターおよび遺伝子座制御領域の下で、ベータ−グロビンの発現を維持する特有の能力を提供する。さらに、ゲノム補正試薬は、永続的な補正をもたらすために、細胞の１回きりの一過的なｅｘ ｖｉｖｏ処置のみを必要とする。
まとめると、これらのデータは、ＳＣＤの有望な処置としてのＨＳＰＣにおけるゲノム編集の継続した開発を支持する。
本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示は、理解を明確にする目的で、説明および実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。

Claims (26)

  1. 内在性ヒトベータ−ヘモグロビン（Ｈｂｂ）遺伝子の配列番号２３または配列番号２４にまたはその付近にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞であって、前記ゲノム改変が、挿入、欠失およびこれらの組合せからなる群から選択される、遺伝子改変された細胞。
  2. 幹細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変された細胞。
  3. 前記幹細胞が、造血幹細胞である、請求項２に記載の遺伝子改変された細胞。
  4. 前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項３に記載の遺伝子改変された細胞。
  5. 請求項１〜４のいずれかに記載の幹細胞に由来する遺伝子改変された分化細胞。
  6. 赤血球細胞（ＲＢＣ）である、請求項５に記載の遺伝子改変された細胞。
  7. 前記遺伝子改変が、ヌクレアーゼを使用してなされる、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
  8. 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項７に記載の遺伝子改変された細胞。
  9. 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含み、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、認識ヘリックスを含む５または６個のジンクフィンガードメインを含み、さらに、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、請求項８に記載の遺伝子改変された細胞。
  10. 前記挿入が、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組込みを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
  11. 前記ドナーポリヌクレオチドが、鎌状赤血球変異を補正する、請求項１０に記載の遺伝子改変された細胞。
  12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物。
  13. 認識ヘリックス領域を含む５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１の単一の行に示す順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
  14. 請求項１３に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型または操作された開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
  15. 請求項１３または請求項１４に記載の１種または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  16. 請求項１４に記載の１種もしくは複数の融合タンパク質または請求項１５に記載の１種もしくは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
  17. 赤血球細胞（ＲＢＣ）または前駆体細胞（例えば、ＣＤ４＋造血幹細胞）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
  18. ｉ）請求項１５に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはｉｉ）請求項１３もしくは請求項１４に記載のタンパク質のうち少なくとも１種を含むキット。
  19. 細胞におけるＨｂｂ発現を変更する方法であって、
    請求項１５に記載の１種または複数のポリヌクレオチドを、１種または複数のタンパク質が発現され、Ｈｂｂ遺伝子の発現が変更されるような条件下で、前記細胞に導入するステップを含む、方法。
  20. 前記Ｈｂｂ遺伝子の発現が増加される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記細胞のゲノムにドナー配列を組み込むステップをさらに含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細胞が、赤血球細胞（ＲＢＣ）前駆体細胞および造血幹細胞からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記ドナー配列が、前記Ｈｂｂ遺伝子のｍＲＮＡプロセシングのためのスプライスドナー部位を変更する変異を補正するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 内在性Ｈｂｂ遺伝子内にゲノム改変を含む遺伝子改変された細胞を産生する方法であって、
    ａ）請求項１４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと細胞を接触させるステップと、
    ｂ）前記ポリヌクレオチドからの前記融合タンパク質の発現を促進する条件に前記細胞を供するステップと、
    ｃ）前記遺伝子改変された細胞の産生に十分な発現された前記融合タンパク質により前記内在性Ｈｂｂ遺伝子を改変するステップと
    を含む、方法。
  25. 少なくとも１種のサイトカインで前記細胞を刺激するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. β−サラセミアを有する患者を処置する方法であって、前記患者におけるＨｂｂ遺伝子発現を増加させるのに十分な量の請求項１２に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
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