RU2691102C2 - Способы и композиции для лечения болезни хантингтона - Google Patents
Способы и композиции для лечения болезни хантингтона Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691102C2 RU2691102C2 RU2016147932A RU2016147932A RU2691102C2 RU 2691102 C2 RU2691102 C2 RU 2691102C2 RU 2016147932 A RU2016147932 A RU 2016147932A RU 2016147932 A RU2016147932 A RU 2016147932A RU 2691102 C2 RU2691102 C2 RU 2691102C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- zfp
- htt
- dna
- cells
- Prior art date
Links
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 92
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 176
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 74
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000009427 motor defect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 74
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 68
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 claims description 17
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 claims description 17
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 5
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 claims description 3
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 93
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 31
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 30
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 28
- 239000011701 zinc Substances 0.000 abstract description 28
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 158
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 90
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 70
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 64
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 60
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 55
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 54
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 50
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 44
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 27
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 26
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 26
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 101100520968 Homo sapiens PPP1R1B gene Proteins 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 102100024556 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 1B Human genes 0.000 description 13
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 12
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- -1 but not limited to Substances 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 5
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 4
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 4
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 2
- 101001030716 Arabidopsis thaliana Histone deacetylase HDT1 Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 108010090047 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Proteins 0.000 description 2
- 102000012749 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Human genes 0.000 description 2
- 241000589599 Francisella tularensis subsp. novicida Species 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000821100 Homo sapiens Synapsin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101150043003 Htt gene Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101001030698 Mus musculus Huntingtin Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 2
- 101100087805 Ralstonia solanacearum rip19 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 2
- ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N [methyl(oxido){1-[6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]ethyl}-lambda(6)-sulfanylidene]cyanamide Chemical compound N#CN=S(C)(=O)C(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1 ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 2
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000021127 protein binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100033647 Activity-regulated cytoskeleton-associated protein Human genes 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241001323275 Andex Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 1
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 101710155335 DELLA protein SLR1 Proteins 0.000 description 1
- 108010009540 DNA (Cytosine-5-)-Methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024812 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A Human genes 0.000 description 1
- 102100024810 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B Human genes 0.000 description 1
- 101710123222 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B Proteins 0.000 description 1
- 108010024491 DNA Methyltransferase 3A Proteins 0.000 description 1
- 102000011724 DNA Repair Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010076525 DNA Repair Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical group O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101100049549 Enterobacteria phage P4 sid gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001467 Envelope glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000310 HNH endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108050008753 HNH endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 102100022846 Histone acetyltransferase KAT2B Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000916283 Homo sapiens Cardiotrophin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000931098 Homo sapiens DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000926140 Homo sapiens Gem-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001047006 Homo sapiens Histone acetyltransferase KAT2B Proteins 0.000 description 1
- 101000615495 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001109800 Homo sapiens Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform Proteins 0.000 description 1
- 101000716750 Homo sapiens Protein SCAF11 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000723833 Homo sapiens Zinc finger E-box-binding homeobox 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000802101 Homo sapiens mRNA decay activator protein ZFP36L2 Proteins 0.000 description 1
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021291 Methyl-CpG-binding domain protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000984544 Mus musculus Bleomycin hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101100046877 Oryza sativa subsp. japonica TRAB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101100440941 Petroselinum crispum CPRF1 gene Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101710081489 Protein argonaute Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101150065817 ROM2 gene Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101100272715 Ralstonia solanacearum (strain GMI1000) brg11 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241001162933 Therophilus Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N Vesnarinone Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C=2C=C3CCC(=O)NC3=CC=2)CC1 ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028458 Zinc finger E-box-binding homeobox 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 108091006090 chromatin-associated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002060 circadian Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940110767 coenzyme Q10 Drugs 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 102000055650 human NRG1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013490 limbo Nutrition 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100034703 mRNA decay activator protein ZFP36L2 Human genes 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- DYKFCLLONBREIL-KVUCHLLUSA-N minocycline Chemical class C([C@H]1C2)C3=C(N(C)C)C=CC(O)=C3C(=O)C1=C(O)[C@@]1(O)[C@@H]2[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C1=O DYKFCLLONBREIL-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 210000001152 parietal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005962 plant activator Substances 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108010000222 polyserine Proteins 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007100 striatal neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/54—Mixtures of enzymes or proenzymes covered by more than a single one of groups A61K38/44 - A61K38/46 or A61K38/51 - A61K38/53
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Psychology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для уменьшения экспрессии мутантного гена хантингтина (mHTT) для уменьшения или предотвращения образования агрегатов Htt у субъекта с болезнью Хантингтона (БХ). Для этого проводят введение в стриатуму субъекта полинуклеотида, кодирующего репрессор мутантного аллеля Htt (mHtt), где репрессор включает белок «цинковые пальцы», обозначенный 30640, 30645 или 33074, где полинуклеотид содержит аденоассоциированный вирусный вектор (AAV), введенный в 2x10векторных геномов, где репрессор транскрипционного фактора снижает экспрессию mHtt по меньшей мере на 85% в БХ-нейронах в стриатуме субъекта. Изобретение обеспечивает уменьшение и/или устранение агрегатов хантингтина (Htt), уменьшение двигательных дефектов, повышение клеточной активности (например, АТФ-активности) и/или уменьшение апопотоза у субъекта с БХ. 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/990521 поданной 8 мая 2014 г., и предварительной заявки на патент США № 62/051724, поданной 17 сентября 2014 г., содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящая заявка относится к области диагностических и терапевтических средств болезни Хантингтона.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Болезнь Хантингтона (БХ), также известная как хорея Хантингтона, представляет собой прогрессирующее нарушение двигательных, когнитивных и психических функций. Средний возраст начала данного заболевания составляет 35-44 лет, хотя приблизительно в 10% случаев начало приходится на возраст до 21 года, а средняя продолжительность жизни после диагностирования заболевания составляет 15-18 лет. Уровень распространенности составляет около 3-7 случаев на 100000 человек среди населения Западной Европы.
[0004] Болезнь Хантингтона является примером нарушений, связанных с экспансией тринуклеотидных повторов, описанной в ранние 1990-е (см. Di Prospero and Fischbeck (2005) Nature Reviews Genetics 6:756-765). Эти нарушения включают локализованную экспансию нестабильных повторов групп из трех нуклеотидов и могут приводить к потере функциональности гена, в котором находится экспандированный повтор, приобретению токсической функции или к обоим последствиям сразу. Тринуклеотидные повторы могут быть расположены в любой части гена, включая некодирующие и кодирующие области гена. Повторы, расположенные в пределах кодирующей области, как правило, включают повторяемый кодирующий глутамин триплет (CAG) или кодирующий аланин триплет (CGA). Экспандированные повторяющиеся области в пределах некодирующих последовательностей могут приводить к аберрантной экспрессии гена, в то время как экспандированные повторы в пределах кодирующих областей (также известные как нарушения реитерации кодонов) могут вызывать неправильную укладку и агрегацию белка. Точная причина патофизиологии, связанной с аберрантными белками, зачастую неизвестна. Как правило, в генах дикого типа, в которых наблюдается тринуклеотидная экспансия, эти области содержат варьирующееся число повторяемых последовательностей в нормальной популяции, но в пораженных популяциях число повторов может увеличиваться от удвоения до логарифмического роста числа повторов. При БХ повторы находятся в N-концевой кодирующей области крупного цитозольного белка хантингтина (Htt). Нормальные аллели Htt содержат 15-20 повторов CAG, в то время как аллели, содержащие 35 или более повторов, могут считаться аллелями, потенциально вызывающими БХ и связанными с риском развития болезни. Аллели, содержащие 36-39 повторов, считаются не полностью проявляющимися, а у людей, несущих такие аллели, может развиться, а может не развиться болезнь (или симптомы могут развиться позже), в то время как аллели, содержащие 40 или более повторов, считаются полностью проявляющимися. В действительности, не было фактов, чтобы среди людей, имеющих аллели БХ с таким количеством повторов, были бессимптомные. Часто обнаруживается, что у людей с ювенильным началом БХ (в возрасте <21 лет) количество CAG повторов составляет 60 и более. Кроме увеличения числа CAG повторов также было обнаружено, что в БХ могут быть вовлечены +1 и +2 сдвига рамки в пределах повторяемых последовательностей, приводящие к тому, что данная область будет кодировать полисериновый полипептидный (кодируемый AGC повторами в случае +1 сдвига рамки) фрагмент, а не полиглутаминовый (Davies and Rubinsztein (2006) Journal of Medical Genetics 43: 893-896).
[0005] При БХ аллель мутантного Htt обычно наследуется от одного из родителей как доминантный признак. Любой ребенок, рожденный от пациента с БХ, имеет 50% шанс развития болезни, если у второго из родителей не наблюдается этого нарушения. В некоторых случаях один из родителей может иметь промежуточный аллель БХ и быть бессимптомным, в то время как вследствие экспансии повторов у ребенка проявляется болезнь. Кроме того, для аллеля БХ также может проявляться явление, известное как антиципация, когда у нескольких поколений наблюдается возрастание степени тяжести или уменьшение возраста начала заболевания вследствие нестабильной природы области повторов во время сперматогенеза.
[0006] Кроме того, тринуклеотидная экспансия в Htt приводит к нейрональным потерям среди средних проекционных шипиковых нейронов, чувствительных к гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК), в стриатуме, при этом нейрональные потери также происходят в неокортексе. Средние шипиковые нейроны, которые содержат энкефалин и которые проецируют во внешний бледный шар, вовлечены больше, чем нейроны, которые содержат субстанцию Р и проецируют во внутренний бледный шар. Другие участки мозга, сильно поражаемые у людей с болезнью Хантингтона, включают черное вещество, кортикальные слои 3, 5 и 6, область гиппокама CA1, угловую извилину в теменной доле, клетки Пуркинье мозжечка, латеральные серобугорные ядра гипоталамуса и срединный центр и парафасцикулярный комплекс таламуса (Walker (2007) Lancet 369:218-228).
[0007] Роль нормального белка Htt известна плохо, но он может быть вовлечен в нейрогенез, апоптотическую гибель клеток и миграцию везикул. Кроме того, есть свидетельства, что Htt дикого типа стимулирует выработку нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), профактора выживания для стриарных нейронов. Было показано, что в мышиных моделях БХ прогрессирование БХ коррелирует с уменьшением экспрессии BDNF (Zuccato et al (2005) Pharmacological Research 52(2): 133-139), а доставка BDNF или нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF) путем генной доставки, опосредованной вектором на основе аденоассоциированного вируса (AAV), может защищать стриарные нейроны в мышиных моделях БХ (Kells et al, (2004) Molecular Therapy 9(5): 682-688).
[0008] В настоящий момент диагностирование и варианты лечения БХ очень ограничены. В контексте диагностики уровни измененного (мутантного) Htt (mHTT) сильно связаны с показателем тяжести заболевания, а концентрация растворимых видов mHTT возрастает с прогрессированием заболевания. Однако малораспространенный mHTT трудно количественно оценить в ЦНС пациентов, что ограничивает изучение роли нейропатобиологии при БХ in vivo и препятствует демонстрации поражения мишени лекарственными препаратами, понижающими уровень HTT. См., например, Wild et al. (2014) J Neurol Neurosurg Psychiatry 85:e4.
[0009] В контексте лечения некоторые эффективные методологии, разработанные, чтобы предотвратить токсичность, связанную с агрегацией белка, которая возникает вследствие удлинения полиглутаминового тракта, такую как сверхэкспрессия шаперонинов или индукция ответа теплового шока соединением гелданамицином, продемонстрировали уменьшение такой токсичности в in vitro моделях. Другие виды лечения нацелены на роль апоптоза в клинических проявлениях заболевания. Например, было продемонстрировано замедление симптомов заболевания посредством блокирования активности каспазы в животных моделях у потомков пар мышей, в которых один из родителей содержат аллель БХ, а второй из родителей имел доминантный негативный аллель в отношении каспазы 1. Кроме того, расщепление каспазой мутантного Htt БХ может играть роль в патогенности заболевания. Было обнаружено, что у трансгенных мышей, несущих устойчивый к каспазе-6 мутантный Htt, сохраняется нормальная нейрональная функция и не развивается стриарная нейродегенерация по сравнению с мышами, несущими не устойчивый к каспазе мутантный аллель Htt (см. Graham et al (2006) Cell 125: 1179-1191). Также было показано, что молекулы, нацеленные на участников апоптотического пути, оказывают замедляющее действие на симптомологию. Например, было показано, что соединения zVAD-fmk и миноциклин, которые оба ингибируют активность каспазы, замедляют проявление заболевания у мышей. Лекарственный препарат ремацемид также применяли в небольших клинических исследованиях БХ на людях, чтобы предотвратить токсическое воздействие на нервные клетки, так как считалось, что это соединение предотвращает связывание мутантного Htt с рецептором NDMA. Однако в этих клинических исследованиях никаких статистически значимых улучшений в функции нейронов не наблюдали. Кроме того, группа по изучению болезни Хантингтона проводила рандомизированное, двойное слепое исследование с применение кофермента Q. Хотя среди пациентов, проходящих лечение коферментом Q10, наблюдали тенденцию к замедлению прогрессирования болезни, значительных изменений в уровне уменьшения общей функциональной способности не наблюдали. (Di Prospero and Fischbeck, ibid).
[0010] Рекомбинантные транскрипционные факторы, содержащие ДНК-связывающие домены из белков «цинковые пальцы» («ZFP»), TAL-эффекторные домены («TALE»), и транскрипционные факторы на основе системы CRISPR/Cas обладают способностью регулировать генную экспрессию эндогенных генов (см., например, патенты США № 8586526; 6534261; 6599692; 6503717; 6689558; 7067317; 7262054; Perez-Pinera et al. (2013) Nature Methods 10:973-976; Platek et al. (2014) Plant Biotechnology J. doi: 10.1111/pbi.12284). Клинические исследования, в которых применяли подобные сконструированные транскрипционные факторы, содержащие белки «цинковые пальцы», продемонстрировали, что эти новые транскрипционные факторы способны лечить различные патологические состояния. (См., например, Yu et al. (2006) FASEB J. 20:479-481). Кроме того, искусственные нуклеазы, содержащие ДНК-связывающие домены из белков «цинковые пальцы» («ZFP»), TAL-эффекторные домены («TALE»), Ttago и нуклеазные системы на основе CRISPR/Cas или Ttago, обладают способностью модифицировать генную экспрессию эндогенных генов путем опосредованной нуклеазами модификации гена, включая направляемую гомологией репарацию (НГР), следующую за негомологичным соединением концов (НГСК), и/или путем захвата концов во время негомологичного соединения концов (НГСК). См., например, 8623618; 8034598; 8586526; 6534261; 6599692; 6503717; 6689558; 7067317; 7262054; 7888121; 7972854; 7914796; 7951925; 8110379; 8409861; публикации патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130177960 и 20150056705, содержание которых в полном объеме и во всех смыслах включено в данный документ посредством ссылки. Таким образом, эти способы часто включают применение сконструированных расщепляющих систем для внесения двухцепочечного разрыва (ДЦР) или ника в целевую последовательность ДНК так, чтобы репарация разрыва путем порождающего ошибки процесса, такого как негомологичное соединение концов (НГСК), или репарация при помощи репарационной матрицы (направляемая гомологией репарация или НГР) могла приводить к выключению гена или вставке представляющей интерес последовательности (направленной интеграции). Внесение двухцепочечного разрыва в отсутствие предоставляемой извне репарационной матрицы (например, «донора» или «трансгена») обычно используется для инактивации целевого гена при помощи мутаций (инсерций и/или делеций, известных как «инделы»), вносимых посредством клеточного пути НГСК. Например, в патентной публикации США 20110082093 раскрыты специальные белки «цинковые пальцы», нацеленные на Htt, а патентная публикация США № 20130253040 относится к ДНК-связывающим белкам, которые модулируют экспрессию аллеля БХ, такого как Htt.
[0011] Однако остается потребность в способах диагностирования, изучения, лечения и/или предотвращения болезни Хантингтона, включая выявление mHTT для отслеживания прогрессирования болезни для повышения понимания нейропатобиологии БХ и для оценки модифицирующих течение БХ терапевтических средств.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В данном документе раскрыты способы и композиции для диагностирования и/или лечения болезни Хантингтона. В частности, в данном документе предложены способы и композиции для выявления, уменьшения количества и/или уничтожения агрегатов Htt, уменьшения степени двигательных дефектов, повышения клеточной активности (например, активности АТФ) и/или уменьшения степени апоптоза у субъекта с БХ.
[0013] Таким образом, в одном аспекте в данном документе описан способ модификации нейрона у субъекта с БХ, включающий введение субъекту репрессора аллеля мутантного Htt так, чтобы происходила модификация нейрона. В определенных вариантах реализации изобретения нейрон представляет собой нейрон, который содержит аллель мутантного Htt и/или который содержит повышенное количество внутриклеточного агрегированного Htt (БХ-нейрон). В определенных вариантах реализации изобретения модификация включает уменьшение агрегации Htt в нейроне (например, БХ-нейроне); повышение энергетического метаболизма нейрона (например, БХ-нейрона), например, путем повышения внутриклеточных уровней АТФ; и/или уменьшение восприимчивости к апоптозу в нейроне (например, БХ-нейроне). В определенных вариантах реализации изобретения субъект является млекопитающим.
[0014] Таким образом, в других аспектах в данном документе описан способ предотвращения и/или уменьшения образования агрегатов Htt в БХ-нейронах субъекта с БХ, включающий введение субъекту репрессора аллеля мутантного Htt.
[0015] В других аспектах в данном документе описан способ повышения клеточной активности (например, АТФ-активности) в нейроне (например, БХ-нейроне), включающий введение в нейрон репрессора аллеля мутантного Htt.
[0016] В других аспектах в данном документе описан способ уменьшения апоптоза в нейроне (например, БХ-нейроне), включающий введение в нейрон репрессора аллеля мутантного Htt.
[0017] В другом аспекте в данном документе описан способ уменьшения двигательных дефектов (например, хватательных) у нуждающихся в этом субъектов с БХ, включающий введение в нейрон репрессора аллеля мутантного Htt.
[0018] В другом аспекте в данном документе описан способ выявления mHtt у субъекта (например, в ЦСЖ), включая выявление mHtt в ответ на терапию (например, в ответ на введение репрессора Htt, как описано в данном документе). В определенных вариантах реализации изобретения выявление включает оценку количества mHtt в организме субъекта. Любой из описанных в данном документе способов выявления можно применять для диагностирования БХ и/или для отслеживания прогрессирования болезни, так как уровни mHTT в значительной мере связаны с тяжестью заболевания, при этом уровни mHTT возрастают при прогрессировании заболевания. Кроме того, любой из способов выявления (например, количественная оценка) mHtt в организме субъекта можно применять для оценки нейропатобиологии БХ и/или для оценки эффективности терапевтических средств модифицирующих течение БХ.
[0019] В любом из описанных в данном документе способов репрессор аллеля мутантного Htt может представлять собой ZFP-TF, например, слитый белок, содержащий ZFP, который специфически связывается с аллелем мутантного Htt, и домен транскрипционной репрессии (например, KOX, KRAB и т.д.). В других вариантах реализации изобретения репрессор аллеля мутантного Htt может представлять собой TALE-TF, например, слитый белок, содержащий полипептид TALE, который специфически связывается с аллелем мутантного Htt, и домен транскрипционной репрессии (например, KOX, KRAB и т.д.). В некоторых вариантах реализации изобретения репрессор аллеля мутантного Htt представляет собой CRISPR/Cas-TF, в котором были инактивированы нуклеазные домены в белке Cas так, чтобы белок больше не расщеплял ДНК. Полученный в результате РНК-управляемый ДНК-связывающий домен Cas сливают с транскрипционным репрессором (например, KOX, KRAB и т.д.), чтобы репрессировать аллель мутантного Htt. В других вариантах реализации изобретения репрессор может содержать нуклеазу (например, ZFN, TALEN и/или систему CRISPR/Cas), которая репрессирует аллель мутантного Htt посредством расщепления и, следовательно, инактивации аллеля мутантного Htt. В определенных вариантах реализации изобретения нуклеаза вноси инсерцию и/или делецию («индел») посредством негомологичного соединения концов (НГСК) после расщепления нуклеазой. В других вариантах реализации изобретения нуклеаза вносит донорную последовательность (гомологичными или негомологичными способами), при этом интеграция донора инактивирует аллель мутантного Htt.
[0020] В любом из описанных в данном документе способов репрессор можно доставлять в нейрон (например, БХ-нейрон) в виде белка, полинуклеотида или любой комбинации белка и полинуклеотида. В определенных вариантах реализации изобретения репрессор(ы) доставляют при помощи экспрессионной конструкции, например, плазмиды или вирусного вектора (например, лентивирусного вектора, аденовирусного (Ад) вектора, аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора и тому подобного). В других вариантах реализации изобретения репрессор доставляют в виде мРНК. В других вариантах реализации изобретения репрессор(ы) доставляют при помощи комбинации любых описанных в данном документе экспрессионных конструкций, например, один репрессор (или его часть) в одной экспрессионной конструкции, а один репрессор (или его часть) в другой экспрессионной конструкции.
[0021] Кроме того, в любом из описанных в данном документе способов репрессоры можно доставлять в любой концентрации (дозе), которая обеспечивает необходимый эффект. В определенных вариантах реализации изобретения репрессор доставляют при помощи лентивирусного вектора при МЗ, составляющей от 250 и 1000 (или любое промежуточное значение). В других вариантах реализации изобретения репрессор доставляют при помощи плазмидного вектора при 150-1500 нг/100000 клеток (или любом промежуточном значении). В других вариантах реализации изобретения репрессор доставляют при помощи аденоассоциированного вирусного вектора при 10000-500000 векторного генома/клетку (или любом промежуточном значении). В других вариантах реализации изобретения репрессор доставляют в виде мРНК при 150-1500 нг/100000 клеток (или любом промежуточном значении).
[0022] В любом из описанных в данном документе способов указанный способ может обеспечить около 85% или более, около 90% или более, около 92% или более или около 95% или более репрессии аллелей мутантного Htt в одном или более БХ-нейронах субъекта.
[0023] В дополнительных аспектах в описанное в данном документе изобретение включены один или более Htt-модулирующих транскрипционных факторов, таких как Htt-модулирующие транскрипционные факторы, содержащие один или более белков «цинковые пальцы» (ZFP TF), TALE (TALE-TF) и CRISPR/Cas-TF, например, ZFP-TF, TALE-TF или CRISPR/Cas-TF. В определенных вариантах реализации изобретения Htt-модулирующий транскрипционный фактор может репрессировать экспрессию аллеля мутантного Htt в одном или более БХ-нейронах субъекта. Репрессия аллеля мутантного Htt в одном или более БХ-нейронах субъекта может быть на около 85% или более, около 90% или более, около 92% или более или около 95% или более большей по сравнению с необработанными (дикого типа) нейронами субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения Htt-модулирующий транскрипционный фактор можно применять для осуществления одного или более описанных в данном документе способов.
[0024] Также предложен набор, содержащий один или более Htt-модуляторов (например, репрессоров) и/или полинуклеотидов, содержащих компоненты и/или кодирующих Htt-модуляторы (или их компоненты), как описано в данном документе. Наборы могут дополнительно содержать клетки (например, нейроны), реагенты (например, для выявления и/или количественной оценки белка mHtt, например, в ЦСЖ) и/или инструкции по применению, включая описанные в данном документе способы.
[0025] Эти и другие аспекты станут понятны для специалиста в данной области техники в свете описания изобретения в целом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0026] Фигура 1
представляет собой график, иллюстрирующий относительные внутриклеточные уровни АТФ в БХ-нейронах (3 столбца слева, как указано) и не-БХ-нейронах (3 столбца справа, как указано) после введения указанных конструкций в нейроны. «33074» относится к репрессору ZFP-TF, включая ZFP 33074 (Таблица 1A, который является специфическим в отношении мутантного Htt), слитый с доменом транскрипционной репрессии (KOX), а также последовательностями, кодирующими GFP; «GFP» относится к конструкции, которая кодирует только GFP (не ZFP-TF); а «ложный» относится к конструкциям без кодирующих последовательностей.
[0027] Фигура 2 представляет собой график, иллюстрирующий процентное содержание апоптотических клеток в БХ-нейронах (3 столбца слева, как указано) и не-БХ-нейронах (3 столбца справа, как указано), определенное методом анализа TUNEL после введения указанных конструкций (см. Фигуру 1) в нейроны.
[0028] Фигуры от 3A до 3K иллюстрируют предотвращение агрегации мутантного Htt у мышей Q175 после обработки ZFP-TF-репрессорами аллелей мутантного Htt. На Фигурах 3A-3H приведены типовые изображения иммуногистохимического анализа срезов головного мозга, полученных от мышей, обработанных экспрессионными конструкциями ZFP-TF. На Фигурах от 3A до 3D приведены изображения окрашивания 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), которым метят ядерную ДНК и антитело в отношении эпитопной метки FLAG (которая указывает на присутствие ZFP-TF). ZFP-TF присутствует только с той стороны, с которой его вводили (ипсилатерально). На Фигурах от 3E до 3H приведены типовые изображения после окрашивания антителом (mEM48), направленным на агрегаты мутантного Htt. В контралатеральной части полосатого тела, куда не проводили инъекцию, агрегацию мутантного Htt легко выявляли при помощи антитела mEM48 по сравнению с ипсилатеральной частью полосатого тела, куда путем инъекции вводили экспрессионную конструкцию ZFP-TF и в которой наблюдали очень низкие уровни агрегации мутантного Htt. Фигура 3I представляет собой график, иллюстрирующий число агрегатов ядерного Htt на клетку (оцененное для клеток FLAG(+) и GFP(+)) в ипсилатеральной части полосатого тела, нормированное относительно числа агрегатов на клетку в необработанной указанными конструкциями контралатеральной части полосатого тела. Фигура 3J представляет собой график, иллюстрирующий интенсивность окрашивания ядерным mEM48 в отношении агрегатов Htt в клетках, получавших указанные конструкции, нормированную относительно интенсивности для нейронов из контралатеральной части полосатого тела. Фигура 3K представляет собой график, иллюстрирующий плотность агрегатов околоядерного мутантного Htt в клетках, экспрессирующих репрессор ZFP-TF или GFP, нормированную относительно плотности в нейронах контралатеральной части полосатого тела. На Фигурах от 3I до 3K «GFP» относится к конструкции, которая кодирует GFP, но не кодирует репрессор Htt ZFP-TF; «30640» и «30645» относятся к конкретным формам ZFP, применяемым в инъецируемых конструкциях (Таблица 1). Статистический анализ проводили, используя критерий Краскела-Уоллиса и множественное сравнение Данна; * p<0,05; ** p<0,01, *** p<0,001; данные представлены в виде гистограммы со средними значениями+СПС.
[0029] Фигуры от 4A до 4D иллюстрируют обращение агрегации мутантного Htt у мышей Q175 после обработки ZFP-TF-репрессорами аллелей мутантного Htt. На Фигуре 4A приведены типовые изображения срезов головного мозга обработанных ZFP-TF и контрольных животных, окрашенные DARPP-32 (специфическим в отношении полосатого тела белком) и направленным против агрегатов Htt антителом mEM48, в контралатеральной и ипсилатеральной частях полосатого тела. Фигура 4B представляет собой график, иллюстрирующий число агрегатов ядерного Htt на клетку (оцененное для клеток FLAG(+) и GFP(+)) в ипсилатеральной части полосатого тела, нормированное относительно числа агрегатов на клетку в необработанной указанными конструкциями контралатеральной части полосатого тела. Фигура 4C представляет собой график, иллюстрирующий интенсивность окрашивания ядерным mEM48 в отношении агрегатов Htt в клетках, получавших указанные конструкции, нормированную относительно интенсивности в нейронах из контралатеральной части полосатого тела. Фигура 4D представляет собой график, иллюстрирующий плотность агрегатов околоядерного мутантного Htt в клетках, экспрессирующих репрессор ZFP-TF или GFP, нормированную относительно плотности в нейронах контралатеральной части полосатого тела. На Фигурах от 4B до 4D «GFP» относится к конструкции, которая кодирует GFP, но не кодирует репрессор Htt ZFP-TF; «GFP-2A-30640» и «GFP-2A-30645» относятся к конструкциям, кодирующим GFP и конкретные формы ZFP, применяемые в инъецируемых конструкциях (Таблица 1). Статистический анализ проводили, используя критерий Краскела-Уоллиса и множественное сравнение Данна; * p<0,05; ** p<0,01, *** p<0,001; данные представлены в виде гистограммы со средними значениями+СПС.
[0030] Фигуры от 5A до 5C иллюстрируют предотвращение агрегации мутантного Htt в стриатуме мышей Q175 после инъекции AAV-ZFP-33074. AAV вектор доставляли в полосатое тело в возрасте 2 месяцев, а анализ проводили в возрасте 4 месяцев. Фигура 5A представляет собой график, иллюстрирующий число агрегатов ядерного Htt в AAV-трансдуцированных (меченых GFP) средних шипиковых нейронах (СШН, меченые антителом DARPP32). Фигура 5B представляет собой график, иллюстрирующий плотность агрегатов внеклеточного мутантного Htt в AAV-трансдуцированных СШН. Фигура 5C представляет собой график, иллюстрирующий интенсивность окрашивания ядерным антителом mEM48 в отношении агрегатов Htt в AAV-трансдуцированных СШН. «Контрольный AAV» относится к AAV вектору, который экспрессирует GFP, «ZFP 33074» относится к AAV вектору, который экспрессирует как ZFP 33074, так и GFP, связанные саморасщепляющимся пептидом 2А. Данные представлены в виде точечных графиков со средними значениями +/- СПС. Статистический анализ проводили, используя критерий Краскела-Уоллиса и апостериорный критерий Данна в сравнении с контролем; ***= p<0,001. Для количественной оценки использовали по 6 срезов от каждого животного для n из 4 животных в каждой группе.
[0031] Фигуры от 6A до 6C иллюстрируют уменьшение агрегации мутантного Htt в стриатуме мышей Q175 после инъекции AAV-ZFP-33074. AAV вектор доставляли в полосатое тело в возрасте 6 месяцев, а анализ проводили в возрасте 10 месяцев. Фигура 6A представляет собой график, иллюстрирующий число агрегатов ядерного Htt в AAV-трансдуцированных (меченых GFP) средних шипиковых нейронах (СШН, меченые антителом DARPP32). Фигура 6B представляет собой график, иллюстрирующий плотность агрегатов внеклеточного мутантного Htt в AAV-трансдуцированных СШН. Фигура 6C представляет собой график, иллюстрирующий интенсивность окрашивания ядерным антителом mEM48 в отношении агрегатов Htt в AAV-трансдуцированных СШН. «Контрольный AAV» относится к AAV вектору, который экспрессирует GFP, «ZFP 33074» относится к AAV вектору, который экспрессирует как ZFP 33074, так и GFP, связанные саморасщепляющимся пептидом 2А. «ZFP ΔДСД» относится к контрольному AAV вектору, сходному с «ZFP 33074» за исключением того, что в нем отсутствует «цинковые пальцы» ДНК-связывающий домен (ДСД). Данные представлены в виде точечных графиков со средними значениями +/- СПС. Статистический анализ проводили, используя критерий Краскела-Уоллиса и апостериорный критерий Данна в сравнении с контролем; ***= p<0,001; н.з.=не значимый. Для количественной оценки использовали по 6 срезов от каждого животного для n из 4 животных в каждой группе.
[0032] Фигуры 7A и 7B иллюстрируют повышенную экспрессию DARPP32 посредством иммуноокрашивания в стриатуме мышей Q175 после инъекции AAV-ZFP-33074. AAV вектор доставляли в полосатое тело в возрасте 6 месяцев, а анализ проводили в возрасте 10 месяцев. Фигура 7A иллюстрирует, что экспрессия DARPP32 была снижена у 10-месячных мышей Q175 по сравнению с мышами дикого типа того же возраста. Фигура 7B иллюстрирует уровни DARPP32 в стриатуме Q175, обработанном AAV вектором, для AAV вектора ZFP 33074 или контрольного AAV вектора. «Контрольный AAV» относится к AAV вектору, который экспрессирует GFP, «ZFP 33074» относится к AAV вектору, который экспрессирует как ZFP 33074, так и GFP, связанные саморасщепляющимся пептидом 2А. «ZFP ΔДСД» относится к контрольному AAV вектору, сходному с «ZFP 33074» за исключением того, что в нем отсутствует «цинковые пальцы» ДНК-связывающий домен (ДСД). Данные представлены в виде точечных графиков со средними значениями +/- СПС. Статистический анализ проводили, используя критерий Краскела-Уоллиса и апостериорный критерий Данна в сравнении с контролем; *=p<0,05, ***= p<0,001; н.з.=не значимый. Для количественной оценки использовали по 6 срезов от каждого животного для n из 4 животных в каждой группе.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0033] В данном документе раскрыты композиции и способы для выявления, отслеживания прогрессирования болезни, лечения и/или предотвращения болезни Хантингтона (БХ). В частности, описанные в данном документе способы позволяют осуществлять изменения в головном мозге (например, в БХ-нейронах) у субъекта с БХ, тем самым обеспечивая терапию БХ. Используя Htt-модулирующие транскрипционные факторы, такие как Htt-модулирующие транскрипционные факторы, содержащие белки «цинковые пальцы» (ZFP TF), TALE (TALE-TF) или CRISPR/Cas-TF, например, ZFP-TF, TALE-TF или CRISPR/Cas-TF, которые репрессируют экспрессию аллеля мутантного Htt, можно модифицировать БХ-нейроны в организме субъекта с БХ так, чтобы снизить или устранить проявления и/или симптомы БХ, например, путем уменьшения агрегации Htt в БХ-нейронах, путем повышения энергетики БХ-нейронов (например, повышения уровней АТФ), путем уменьшения апоптоза в БХ-нейронах и/или путем уменьшения двигательных дефектов у субъектов. Кроме того, описанные в данном документе композиции и способы позволяют выявлять БХ в полученном от пациента образце (например, ЦСЖ). Определение уровней mHtt в полученных от пациентов образцах может позволить диагностировать БХ; отслеживать прогрессирование болезни на основании уровней mHtt; а также оценивать БХ-терапию.
Общие сведения
[0034] При практической реализации способов, а также приготовлении и применении композиций, раскрытых в данном документе, используют, если не указано иное, традиционные методы молекулярной биологии, биохимии, структуры и анализа хроматина, компьютерной химии, клеточного культивирования, рекомбинантных ДНК и родственных областей, которые находятся в компетентности данной области техники. Эти способы полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 и третье издание, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 и периодические дополнения; серию METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, третье издание, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, ʺChromatinʺ (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; и METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, ʺChromatin Protocolsʺ (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Определения
[0035] Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к дезоксирибонуклеотидному или рибонуклеотидному полимеру, находящемуся в линейной или кольцевой конформации и в одно- или двухцепочечной форме. В контексте настоящего изобретения эти термины не следует воспринимать как ограничивающие в отношении длины полимера. Данные термины могут включать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды с модифицированными компонентами оснований, сахаров и/или фосфатов (например, тиофосфатных остовов). В общем случае аналог конкретного нуклеотида обладает такой же специфичностью в отношении спаривания оснований; т.е. аналог А будет спариваться с T.
[0036] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и обозначают полимер из аминокислотных остатков. Также этот термин применим к аминокислотным полимерам, в которых одна или более аминокислот являются химическими аналогами или модифицированными производными соответствующих аминокислот природного происхождения.
[0037] «Связывание» относится к специфическому в отношении последовательности, нековалентному взаимодействию между макромолекулами (например, между белком и нуклеиновой кислотой). Не все компоненты связывающего взаимодействия должны быть специфическими в отношении последовательности (например, контакты с фосфатными остатками в остове ДНК) в той мере, пока взаимодействие в целом остается специфическим в отношении последовательности. Такие взаимодействия в общем случае характеризуются константой диссоциации (Kд), составляющей 10-6 M-1 или менее. «Аффинность» относится к силе связывания: повышение аффинности связывания коррелирует с более низкой Kд.
[0038] «Связывающий белок» представляет собой белок, который способен нековалентно связываться с другой молекулой. Связывающий белок может связываться, например, с молекулой ДНК (ДНК-связывающий белок), молекулой РНК (РНК-связывающий белок) и/или белковой молекулой (белоксвязывающий белок). В случае белоксвязывающего белка он может связываться с самим собой (образуя гомодимеры, гомотримеры и т.д.) и/или он может связываться с одной или более молекулами другого связывающего белка или белков. Связывающий белок может проявлять более одного вида связывающей активности. Например, белки «цинковые пальцы» проявляют ДНК-связывающую, РНК-связывающую и белоксвязывающую активность.
[0039] «ДНК-связывающий белок «цинковые пальцы»» (или связывающий домен) представляет собой белок или домен в рамках более крупного белка, который связывает ДНК специфическим в отношении последовательности образом посредством одного или более цинковых пальцев, которые представляют собой участки аминокислотной последовательности в пределах связывающего домена, чья структура стабилизируется посредством координации ионом цинка. Термин «ДНК-связывающий белок «цинковые пальцы»» часто сокращают до белка «цинковые пальцы» или ZFP (от англ. «zinc finger protein»).
[0040] «ДНК-связывающий домен TALE» или «TALE» представляет собой полипептид, содержащий один или более повторяемые доменов/единиц TALE. Повторяемые домены вовлечены в связывание TALE со своей когнатной целевой последовательностью ДНК. Одна «повторяемая единица» (также называемая «повтором») имеет длину, как правило, в 33-35 аминокислот и демонстрирует по меньшей мере некоторую степень гомологии последовательностей с другими повторяемыми последовательностями TALE в белке TALE природного происхождения. См., например, патент США № 8586526.
[0041] «TtAgo» представляет собой прокариотический белок Argonaute, который считается вовлеченным в сайленсинг генов. TtAgo получают из бактерий Thermus thermophilus. См., например, Swarts et al (2014) Nature 507(7491):258-261, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). «Система TtAgo» представляет собой все необходимые компоненты, включая, например, гидовые ДНК, для расщепления ферментом TtAgo. «Рекомбинация» относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами, включая, но не ограничиваясь этим, донорный захват посредством негомологичного соединения концов (НГСК) и гомологичную рекомбинацию. В контексте данного изобретения «гомологичная рекомбинация (ГР)» относится к особенной форме такого обмена, которая имеет место, например, во время репарации двухцепочечных разрывов в клетках посредством механизмов направляемой гомологией репарации. Для этого процесса необходима гомология нуклеотидных последовательностей, чтобы использовать «донорную» молекулу для матричной репарации молекулы-«мишени» (т.е. молекулы, в которой образовался двухцепочечный разрыв), а сам процесс известен под названиями «некроссоверной конверсии генов» или «конверсии генов на коротких участках», так как он приводит к переносу генетической информации от донора к мишени. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, такой перенос может включать коррекцию несоответствий гетеродуплекса ДНК, образующегося между разорванной мишенью и донором, и/или «зависимый от синтеза отжиг цепей», в котором донор применяют для воссоздания генетической информации, которая становится частью мишени, и/или связанные процессы. Такая специализированная ГР часто приводит к изменению последовательности молекулы-мишени так, что часть или вся последовательность донорного полинуклеотида встраивается в полинуклеотид-мишень.
[0042] Связывающие домены «цинковые пальцы» или ДНК-связывающие домены TALE можно «сконструировать» так, чтобы они связывали заданную нуклеотидную последовательность, например, путем конструирования (изменения одной или более аминокислот) распознающей спиральной области белка «цинковые пальцы» природного происхождения или путем конструирования повторяемых RVD (вариабельных двойных остатков белка) TALE. Следовательно, сконструированные белки «цинковые пальцы» или TALE являются белками неприродного происхождения. Неограничивающими примерами способов конструирования белков «цинковые пальцы» или TALE являются разработка и селекция. «Разработанный» белок «цинковые пальцы» или TALE представляет собой белок, не существующий в природе, чья конструкция/состав основана, главным образом, на рациональных критериях. Рациональные критерии для разработки включают применение правил проведения замен и компьютеризованных алгоритмов для обработки информации, хранящейся в базах данных существующих конструкций ZFP и данных по связыванию. Полученный в процессе «селекции» белок «цинковые пальцы» или TALE представляет собой белок, не существующий в природе, получение которого является результатом, главным образом, эмпирического процесса, такого как фаговый дисплей, ловушка взаимодействия или гибридная селекция. См., например, патенты США № 8586526; 6140081; 6453242; 6746838; 7241573; 6866997; 7241574 и 6534261; также см. WO 03/016496.
[0043] Термин «последовательность» относится к нуклеотидной последовательности любой длины, которая может представлять ДНК или РНК; может быть линейной, кольцевой или разветвленной и может быть как одноцепочечной, так и двухцепочечной. Термин «донорная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая вставлена в геном. Донорная последовательность может быть любой длины, например, от 2 до 10000 нуклеотидов в длину (или любое промежуточное или превышающее целое число), предпочтительно от около 100 до 1000 нуклеотидов в длину (или любое промежуточное целое число), более предпочтительно от около 200 до 500 нуклеотидов в длину.
[0044] «Участок-мишень» или «последовательность-мишень» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая определяет часть нуклеиновой кислоты, с которой связывается связывающая молекула в случае наличия условий, достаточных для связывания.
[0045] «Экзогенная молекула» представляет собой молекулу, которая обычно не присутствует в клетке, но которую можно вносить в клетку при помощи одного или более генетических, биохимических или других методов. «Обычное присутствие в клетке» определяют по отношению к конкретной стадии развития и условий окружающей среды клетки. Таким образом, например, молекула, которая присутствует только во время эмбрионального развития мышц, является экзогенной молекулой по отношению к взрослой мышечной клетке. Аналогично, молекула, индуцируемая тепловым шоком, является экзогенной молекулой по отношению к не испытывающей тепловой шок клетке. Экзогенная молекула может содержать, например, функциональную версию нефункциональной эндогенной молекулы или нефункциональную версию нормально функционирующей эндогенной молекулы.
[0046] Экзогенная молекула может быть, помимо прочего, небольшой молекулой, например, полученной посредством комбинаторного химического процесса, или макромолекулой, такой как белок, нуклеиновая кислота, углевод, липид, гликопротеин, липопротеин, полисахарид, любым модифицированным производным вышеперечисленных молекул или любым комплексом, содержащим одну или более вышеперечисленных молекул. Нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК, могут быть одно- или двухцепочечными; могут быть линейными, разветвленными или кольцевыми; и могут быть любой длины. Нуклеиновые кислоты включают те, которые способны образовывать двойные спирали, а также образующие тройные спирали нуклеиновые кислоты. См., например, патенты США № 5176996 и 5422251. Белки включают, но не ограничиваются этим, ДНК-связывающие белки, транскрипционные факторы, хроматин-ремоделирующие факторы, метилированные ДНК-связывающие белки, полимеразы, метилазы, деметилазы, ацетилазы, деацетилазы, киназы, фосфатазы, интегразы, рекомбиназы, лигазы, топоизомеразы, гиразы и геликазы.
[0047] Экзогенная молекула может быть молекулой того же типа, что и эндогенная молекула, например, экзогенный белок или нуклеиновая кислота. Например, экзогенная нуклеиновая кислота может включать инфицирующий вирусный геном, плазмиду или эписому, внесенную в клетку, или хромосому, которая обычно не присутствует в клетке. Способы внесения экзогенных молекул в клетки известны специалистам в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, липид-опосредованный перенос (т.е. применение липосом, включая нейтральные и катионные липиды), электропорацию, прямую инъекцию, клеточное слияние, бомбардировку частицами, совместное осаждение фосфатом кальция, опосредованный ДЭАЭ-декстраном перенос и опосредованный вирусным вектором перенос. Экзогенная молекула также может быть молекулой того же типа, что и эндогенная молекула, но быть полученной от вида, отличного от того, от которого получена клетка. Например, человеческая нуклеотидная последовательность может быть внесена в клеточную линию, изначально полученную от мыши или хомяка.
[0048] В противоположность этому эндогенная молекула представляет собой молекулу, которая обычно присутствует в конкретной клетке на конкретной стадии развития и конкретных условиях окружающей среды. Например, эндогенная нуклеиновая кислота может включать хромосому, геном митохондриона, хлоропласта или другой органеллы или эписомальную нуклеиновую кислоту природного происхождения. Дополнительные эндогенные молекулы могут включать белки, например, транскрипционные факторы и ферменты.
[0049] «Слитая молекула» представляет собой молекулу, в которой слиты, предпочтительно ковалентным образом, две или более молекулы-субъединицы. Молекулы-субъединицы могут быть молекулами одного химического типа или могут быть молекулами разных химических типов. Примеры слитых молекул первого типа включают, но не ограничиваются этим, слитые белки (например, продукт слияния между ДНК-связывающим доменом ZFP или TALE и одним или более активационными доменами) и слитые нуклеиновые кислоты (например, нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, описанный выше). Примеры слитых молекул второго типа включают, но не ограничиваются этим, продукт слияния между образующей тройную спираль нуклеиновой кислотой и полипептидом и продукт слияния между компонентом, связывающимся с малой бороздой, и нуклеиновой кислотой.
[0050] Экспрессия слитого белка в клетке может являться результатом доставки в клетку слитого белка или доставки в клетку полинуклеотида, кодирующего слитый белок, при этом происходит транскрипция полинуклеотида и трансляция транскрипта для получения слитого белка. В экспрессию белка в клетке также могут быть вовлечены транс-сплайсинг, расщепление полипептидов и лигирование полипептидов. Способы доставки полинуклеотидов и полипептидов в клетки представлены в другом месте данного описания.
[0051] «Домен мультимеризации» (также называемый «доменом димеризации» или «доменом белкового взаимодействия») представляет собой домен, включенный в состав амино-, карбокси- или амино- и карбокси-концевых областей ZFP TF или TALE TF. Эти домены обеспечивают возможность мультимеризации множественных единиц ZFP TF или TALE TF так, что более длинные участки доменов, содержащих тринуклеотидные повторы, становятся предпочтительно связанными мультимеризованными ZFP TF или TALE TF по сравнению с более короткими участками с длиной, соответствующей дикому типу. Примеры доменов мультимеризации включают лейциновые молнии. Домены мультимеризации также могут регулироваться небольшими молекулами, при этом домен мультимеризации принимает правильную конформацию, чтобы обеспечить взаимодействие с другим доменом мультимеризации только в присутствии небольшой молекулы или внешнего лиганда. Таким образом, экзогенные лиганды можно применять, чтобы регулировать активность этих доменов.
[0052] В контексте настоящего изобретения «ген» включает область ДНК, кодирующую генный продукт (см. выше), а также все области ДНК, которые регулируют выработку генного продукта, вне зависимости от того, являются ли такие регуляторные последовательности смежными с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями. Соответственно, ген включает, но не обязательно ограничен этим, промоторные последовательности, терминаторы, трансляционные регуляторные последовательности, такие как участки связывания рибосом и участки внутренней посадки рибосом, энхансеры, сайленсеры, изоляторы, граничные элементы, точки начала репликации, участки присоединения к матриксу и регуляторные области локусов.
[0053] «Генная экспрессия» относится к преобразованию информации, содержащейся в гене, в генный продукт. Генный продукт может представлять собой прямой продукт транскрипции гена (например, мРНК, тРНК, рРНК, антисмысловую РНК, рибозим, структурную РНК или любой другой тип РНК) или белок, получаемый в результате трансляции мРНК. Генные продукты также включают РНК, которые были модифицированы посредством такого процесса как кэпирование, полиаденилирование, метилирование и редактирование, и белки, которые были модифицированы, например, посредством метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинирования, АДФ-рибозилирования, миристилирования и гликозилирования.
[0054] «Модулирование» генной экспрессии относится к изменению активности гена. Модулирование экспрессии может включать, но не ограничивается этим, активацию генов и репрессию генов. Для модулирования экспрессии можно применять редактирование генома (например, расщепление, изменение, инактивацию, случайную мутацию). Инактивация гена относится к любому снижению генной экспрессии по сравнению с клеткой, которая не содержит описанный в данном документе ZFP или белок TALE. Таким образом, инактивация гена может быть частичной или полной.
[0055] «Представляющая интерес область» является любой областью клеточного хроматина, такой как, например, ген или некодирующая последовательность в пределах гена или прилегающая к гену, в которой необходимо связывание экзогенной молекулы. Целью связывания может являться направленное расщепление ДНК и/или направленная рекомбинация. Представляющая интерес область может присутствовать, например, в хромосоме, эписоме или геноме органеллы (например, митохондрии, хлоропласта) или инфицирующем вирусном геноме. Представляющая интерес область может находиться в кодирующей области гена, в транскрибируемых некодирующих областях, таких как, например, лидерные последовательности, трейлерные последовательности или интроны, или в нетранскрибируемых областях как выше, так и ниже кодирующей области. Размер представляющей интерес области может составлять от одной пары нуклеотидов до 2000 пар нуклеотидов в длину или любое целочисленное значение пар нуклеотидов.
[0056] «Эукариотические» клетки включают, но не ограничиваются этим, клетки грибков (таких как дрожжи), клетки растений, клетки животных, клетки млекопитающих и клетки человека (например, Т-клетки).
[0057] Термины «функциональная связь» и «функционально связанный» (или «связанный функциональным образом») используются взаимозаменяемо в отношении взаимного расположения двух или более компонентов (таких как элементы последовательности), когда компоненты расположены так, что оба компонента функционируют нормально, и допускается возможность, что по меньшей мере один из компонентов может опосредовать функцию, которая оказывает влияние на по меньшей мере один из других компонентов. В качестве иллюстрации, транскрипционная регуляторная последовательность, такая как промотор, функционально связана с кодирующей последовательностью, если транскрипционная регуляторная последовательность регулирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на присутствие или отсутствие одного или более транскрипционных регуляторных факторов. Транскрипционная регуляторная последовательность в общем случае связана в цис-форме с кодирующей последовательностью, но не обязательно должна быть непосредственно смежной с ней. Например, энхансер представляет собой транскрипционную регуляторную последовательность, которая функционально связана с кодирующей последовательностью, даже если они не являются смежными.
[0058] По отношению к слитым полипептидам термин «функционально связанный» может относиться к факту, что каждый из компонентов в связке выполняет такую же функцию по отношению к другому компоненту, какую бы он выполнял, если бы они не были связаны подобным образом. Например, в случае слитого полипептида, в котором ДНК-связывающий домен ZFP или TALE слит с активационным доменом, ДНК-связывающий домен ZFP или TALE и активационный домен находятся в функциональной связи, если в слитом полипептиде часть ДНК-связывающего домена ZFP или TALE способна связывать свой целевой участок и/или свой участок связывания, в то время как активационный домен способен оказывать повышающую регуляцию на генную экспрессию. ZFP, слитые с доменами, способными регулировать генную экспрессию, вместе называются «ZFP-TF» или «транскрипционные факторы «цинковые пальцы»», в то время как TALE, слитые с доменами, способными регулировать генную экспрессию, вместе называются «TALE-TF» или «транскрипционными факторами TALE». Когда слитый полипептид, в котором ДНК-связывающий домен ZFP слит с расщепляющим доменом («ZFN» или «нуклеаза «цинковые пальцы»»), ДНК-связывающий домен ZFP и расщепляющий домен находятся в функциональной связи, если в слитом полипептиде часть ДНК-связывающего домена ZFP способна связывать свой целевой участок и/или свой участок связывания, в то время как расщепляющий домен способен расщеплять ДНК вблизи целевого участка. Когда слитый полипептид, в котором ДНК-связывающий домен TALE слит с расщепляющим доменом («TALEN» или «TALE-нуклеаза»), ДНК-связывающий домен TALE и расщепляющий домен находятся в функциональной связи, если в слитом полипептиде часть ДНК-связывающего домена TALE способна связывать свой целевой участок и/или свой участок связывания, в то время как расщепляющий домен способен расщеплять ДНК вблизи целевого участка. В случае слитого полипептида, в котором ДНК-связывающий домен Cas слит с активационным доменом, ДНК-связывающий домен Cas и активационный домен находятся в функциональной связи, если в слитом полипептиде часть ДНК-связывающего домена Cas способна связывать свой целевой участок и/или свой участок связывания, в то время как активационный домен способен оказывать повышающую регуляцию на генную экспрессию. Когда слитый полипептид, в котором ДНК-связывающий домен Cas слит с расщепляющим доменом, ДНК-связывающий домен Cas и расщепляющий домен находятся в функциональной связи, если в слитом полипептиде часть ДНК-связывающего домена Cas способна связывать свой целевой участок и/или свой участок связывания, в то время как расщепляющий домен способен расщеплять ДНК вблизи целевого участка.
[0059] «Функциональный фрагмент» белка, полипептида или нуклеиновой кислоты представляет собой белок, полипептид или нуклеиновую кислоту, чья последовательность не идентична полноразмерному белку, полипептиду или нуклеиновой кислоте, но который сохраняет такую же функцию, что и полноразмерный белок, полипептид или нуклеиновая кислота. Функциональный фрагмент может иметь большее, меньшее или такое же число остатков, что и соответствующая нативная молекула, и/или может содержать одну или более аминокислотных или нуклеотидных замен. Способы определения функции нуклеиновой кислоты (например, кодирующей функции, способности гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой) хорошо известны в данной области техники. Аналогично, способы определения функции белка также хорошо известны. Например, ДНК-связывающую функцию полипептида можно определить методом связывания на фильтрах, сдвига электрофоретической подвижности или иммунопреципитации. Расщепление ДНК можно оценить методом гель-электрофореза. См. Ausubel et al., выше. Способность белка взаимодействовать с другим белком можно оценить, например, путем совместной иммунопреципитации, методом двухгибридного анализа или комплементации, как генетической, так и биохимической. См., например, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; патент США № 5585245 и PCT WO 98/44350.
[0060] «Вектор» способен переносить генные последовательности в клетки-мишени. Как правило, «векторная конструкция», «экспрессионный вектор» и «вектор для генного переноса» означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией представляющего интерес гена, которая может переносить генные последовательности в клетки-мишени. Таким образом, термин включает клонирующие и экспрессионные векторы, а также интегрирующие векторы.
[0061] «Репортерный ген» или «репортерная последовательность» относится к любой последовательности, которая вырабатывает белковый продукт, который легко определить предпочтительно, но не обязательно, при помощи рутинного анализа. Подходящие репортерные гены включают, но не ограничиваются этим, последовательности, кодирующие белки, которые опосредуют устойчивость к антибиотикам (например, устойчивость к ампициллину, устойчивость к неомицину, устойчивость к G418, устойчивость к пуромицину), последовательности, кодирующие окрашенные или флуоресцентные, или люминесцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок, усиленный зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, люциферазу) и белки, которые опосредуют усиленный рост клеток и/или амплификацию генов (например, дигидрофолатредуктазу). Эпитопные метки включают, например, одну или более копий FLAG, His, myc, Tap, HA или любую выявляемую аминокислотную последовательность. «Экспрессионные метки» включают последовательности, которые кодируют репортеры, которые могут быть функционально связаны с необходимой генной последовательностью с целью отслеживания экспрессии представляющего интерес гена.
ДНК-связывающие домены
[0062] В описанных в данном документе способах применяют композиции, например Htt-моделирующие транскрипционные факторы, содержащие ДНК-связывающий домен, который специфически связывается с целевой последовательностью в гене Htt, в частности, который связывается с аллелем мутантного Htt, содержащим множество тринуклеотидных повторов. В раскрытых в данном документе композициях и способах можно применять любой ДНК-связывающий домен.
[0063] В определенных вариантах реализации изобретения Htt-модулирующий транскрипционный фактор или его ДНК-связывающий белок содержит белок «цинковые пальцы». Выбор целевых участков; ZFP и способы разработки и конструирования слитых белков (и кодирующих их полинуклеотидов) известны специалистам в данной области техники и подробно описаны в патентах США № 6140081; 5789538; 6453242; 6534261; 5925523; 6007988; 6013453; 6200759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496.
[0064] В определенных вариантах реализации изобретения ZFP могут избирательно связываться с аллелем мутантного Htt или последовательностью Htt дикого типа. Целевые участки Htt, как правило, содержат по меньшей мере один цинковый палец, но могут содержать несколько цинковых пальцев (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более пальцев). Обычно ZFP содержат по меньшей мере три пальца. Определенные ZFP содержат четыре, пять или шесть пальцев, в то время как некоторые ZFP содержат 8, 9, 10, 11 или 12 пальцев. ZFP, которые содержат три пальца, как правило, распознают целевой участок, который содержит 9 или 10 нуклеотидов; ZFP, которые содержат четыре пальца, как правило, распознают целевой участок, который содержит от 12 до 14 нуклеотидов; в то время как ZFP, содержащие шесть пальцев, могут распознавать целевые участки, которые содержат от 18 до 21 нуклеотида. ZFP также могут представлять собой слитые белки, которые содержат один или более регуляторных доменов, которые могут быть доменами активации или репрессии транскрипции. В некоторых вариантах реализации изобретения слитый белок содержит два связанных вместе ДНК-связывающих домена ZFP. Таким образом, эти белки «цинковые пальцы» могут содержать 8, 9, 10, 11, 12 или более пальцев. В некоторых вариантах реализации изобретения два ДНК-связывающих домена связаны посредством удлиняемого гибкого линкера так, что один ДНК-связывающий домен содержит 4, 5 или 6 цинковых пальцев, а второй ДНК-связывающий домен содержит дополнительные 4, 5 или 5 цинковых пальцев. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер представляет собой стандартный межпальцевый линкер так, что совокупность пальцев составляет один ДНК-связывающий домен, содержащий 8, 9, 10, 11 или 12 или более пальцев. В других вариантах реализации изобретения линкер представляет собой атипичный линкер, такой как гибкий линкер. ДНК-связывающие домены слиты по меньшей мере с одним регуляторным доменом и могут рассматриваться как имеющие архитектуру «ZFP-ZFP-TF». Конкретные примеры этих вариантов реализации изобретения могут называться «ZFP-ZFP-KOX», которая содержит два ДНК-связывающих домена, связанных гибким линкером и слитых с репрессором KOX, и «ZFP-KOX-ZFP-KOX», в которой два слитых белка ZFP-KOX слиты вместе посредством линкера.
[0065] В альтернативном варианте ДНК-связывающий домен может быть получен из нуклеазы. Например, известны последовательности распознавания хоминг-эндонуклеаз и мегануклеаз, такие как I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. См. также патент США № 5420032; патент США № 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs. Кроме того, ДНК-связывающая специфичность хоминг-эндонуклеаз и мегануклеаз может быть использована для связывания целевых участков неприродного происхождения. См., например, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; патентную публикацию США № 20070117128.
[0066] «Двурукие» белки «цинковые пальцы» представляют собой такие белки, в которых два кластера ДНК-связывающих доменов «цинковые пальцы» разделены промежуточными аминокислотами так, что два домена «цинковые пальцы» связываются с двумя несмежными целевыми участками. Примером двурукого типа связывающего белка «цинковые пальцы» является SIP1, в котором кластер из четырех цинковых пальцев расположен в амино-конце белка, а кластер из трех цинковых пальцев расположен в карбокси-конце (см. Remacle et al, (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084). Каждый кластер цинковых пальцев в этих белках способен связываться с уникальной целевой последовательностью, а промежуток между двумя целевыми последовательностями может содержать много нуклеотидов. Двурукие ZFP могут содержать функциональный домен, например, слитый с одним или обоими ZFP. Таким образом, очевидно, что функциональный домен может быть присоединен к внешней части одного или обоих ZFP (см. Фигуру 1C) или может быть расположен между ZFP (присоединен к обоим ZFP) (см. Фигуру 4).
[0067] Конкретные примеры нацеленных на Htt ZFP раскрыты в патентной публикации США № 20130253040, которая в полном объеме и во всех смыслах включена в данный документ посредством ссылки, а также в Таблицу 1, ниже. В первой колонке этой таблицы приведено ссылочное название (номер) для ZFP, которое соответствует названию в 1 колонке Таблицы 2. «F» означает палец, а следующий за «F» номер означает, какой именно палец (например, «F1» означает 1 палец).
Таблица 1: Нацеленные на Htt белки «цинковые пальцы»
SBS № | Конструкция | |||||
F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | |
18856 | RSDDLSR (SEQ ID NO: 1) |
RNDNRTK (SEQ ID NO:2) | RSDDLTR (SEQ ID NO:3) | RSDDRKT (SEQ ID NO:4) | RSADLTR (SEQ ID NO:5) | QSSDLRR (SEQ ID NO:6) |
25920 | RSAALSR (SEQ ID NO: 7) |
RSDALAR (SEQ ID NO: 8) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSSDLRR (SEQ ID NO: 6) |
НД |
25921 | WRSCRSA (SEQ ID NO: 11) |
DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
QRTHLTQ (SEQ ID NO: 13) |
RSAHLSR (SEQ ID NO: 14) |
TSGHLSR (SEQ ID NO: 15) |
НД |
25923 | RSDDLSR (SEQ ID NO: 1) |
RNDNRTK (SEQ ID NO: 2) |
WRSCRSA (SEQ ID NO: 11) |
RSDNLAR (SEQ ID NO: 16) |
QSGHLSR (SEQ ID NO: 17) |
НД |
25922 | RSAALSR (SEQ ID NO: 7) |
RSDALAR (SEQ ID NO: 8) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
32468 | RSDNLAR (SEQ ID NO: 16) |
WRGDRVK (SEQ ID NO: 20) |
DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
TSGSLTR (SEQ ID NO: 21) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
RSDDRKT (SEQ ID NO: 4) |
32501 | RSDALSR (SEQ ID NO: 23) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
RSDHLSR (SEQ ID NO: 24) |
QSSDLTR (SEQ ID NO: 25) |
TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
31809 | RSDDLSR (SEQ ID NO: 1) |
RNDNRTK (SEQ ID NO: 2) |
RSDDLTR (SEQ ID NO: 3) |
RSDDRKT (SEQ ID NO: 4) |
RSDDLTR (SEQ ID NO: 3) |
QSSDLRR (SEQ ID NO: 6) |
32528 | QSGHLQR (SEQ ID NO: 27) |
TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
VRSRLRR (SEQ ID NO: 30) |
30580 | RSDNLAR (SEQ ID NO: 16) |
WRGDRVK (SEQ ID NO: 20) |
DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
RSDALAR (SEQ ID NO: 8) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
RSDDRKT (SEQ ID NO: 4) |
30929 | DRSTLRQ (SEQ ID NO: 32) |
DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
QSSTRAR (SEQ ID NO: 33) |
RSDTLSE (SEQ ID NO: 34) |
HRRSRWG (SEQ ID NO: 35) |
НД |
32538 | DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
RRDTLRS (SEQ ID NO: 36) |
RSDHLST (SEQ ID NO: 37) |
QSAHRIT (SEQ ID NO: 38) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
32567 | RSDHLSE (SEQ ID NO: 39) |
QNAHRKT (SEQ ID NO: 40) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
29627 | DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
LRQDLKR (SEQ ID NO: 42) |
DRSHLTR (SEQ ID NO: 43) |
DRSNLTR (SEQ ID NO: 44) |
RSDHLST (SEQ ID NO: 37) |
QSAHRIT (SEQ ID NO: 38) |
29628 | TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
LKQMLAV (SEQ ID NO: 45) |
RSDSLSA (SEQ ID NO: 46) |
DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
RSDALST (SEQ ID NO: 47) |
DRSTRTK (SEQ ID NO: 48) |
29631 | QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
DRSALAR (SEQ ID NO: 49) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QSGHLSR (SEQ ID NO: 17) |
RSDVLSE (SEQ ID NO: 50) |
TSGHLSR (SEQ ID NO: 15) |
29632 | RSDTLSE (SEQ ID NO: 34) |
KLCNRKC (SEQ ID NO: 51) |
TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
HRTSLTD (SEQ ID NO: 52) |
RSAHLSR (SEQ ID NO: 14) |
QSGNLAR (SEQ ID NO: 53) |
29637 | DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
QSGNLAR (SEQ ID NO: 53) |
DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
LKHHLTD (SEQ ID NO: 54) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
YRWLRNN (SEQ ID NO: 55) |
29638 | RSDHLSQ (SEQ ID NO: 56) |
RSAVRKN (SEQ ID NO: 57) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
WSTSLRA (SEQ ID NO: 58) |
НД |
25917 | DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
QRTHLTQ (SEQ ID NO: 13) |
RSSHLSR (SEQ ID NO: 59) |
TSGSLSR (SEQ ID NO: 60) |
TRQNRDT (SEQ ID NO: 61) |
НД |
25916 | DQSTLRN (SEQ ID NO: 62) |
RSAALSR (SEQ ID NO: 7) |
RSDALAR (SEQ ID NO: 8) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
НД |
33074 | RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
33080 | QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
33084 | QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
RSDTLSE (SEQ ID NO: 34) |
RRWTLVG (SEQ ID NO: 63) |
НД | НД |
33088 | QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
RSAVLSE (SEQ ID NO: 64) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
НД |
30643 | RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
30648 | RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
30645 | RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
НД |
30640 | QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
НД |
30657 | RSDTLSE (SEQ ID NO: 34) |
RRWTLVG (SEQ ID NO: 63) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
30642 | QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
НД |
30646 | RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
НД |
32220 | RSDVLSE (SEQ ID NO: 50) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
HRSTRNR (SEQ ID NO: 41) |
НД | НД | НД |
32210 | QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QWSTRKR (SEQ ID NO: 65) |
НД | НД | НД |
32215 | RSDNLRE (SEQ ID NO: 66) |
RSDNLSE (SEQ ID NO: 9) |
KRCNLRC (SEQ ID NO: 10) |
НД | НД | НД |
30658 | QSSDLSR (SEQ ID NO:18) | HRSTRNR (SEQ ID NO:41) | QSSDLSR (SEQ ID NO:18) | HRSTRNR (SEQ ID NO:41) | QSSDLSR (SEQ ID NO:18) | НД |
32218 | QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
НД | НД | НД | НД |
32427 | ERGTLAR (SEQ ID NO:22) | TSGSLTR (SEQ ID NO:21) | RSDNLAR (SEQ ID NO:16) | DPSNRVG (SEQ ID NO:67) | RSDDLSK (SEQ ID NO:68) | DNSNRIK (SEQ ID NO:69) |
32653 | RSDHLSE (SEQ ID NO: 39) |
QSGHLSR (SEQ ID NO: 17) |
RSDDLTR (SEQ ID NO: 3) |
YRWLLRS (SEQ ID NO: 70) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
RKDALVA (SEQ ID NO: 71) |
32677 | QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
RRADLSR (SEQ ID NO: 72) |
DRSHLTR (SEQ ID NO: 43) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
LAQPRNK (SEQ ID NO: 73) |
33560 | ERGTLAR (SEQ ID NO:22) | QSGSLTR (SEQ ID NO:74) | RSDNLAR (SEQ ID NO:16) | DDSHRKD (SEQ ID NO:75) | RSDDLSK (SEQ ID NO:68) | DNSNRIK (SEQ ID NO:69) |
33583 | DRSNLSR (SEQ ID NO:12) | HKQHRDA (SEQ ID NO:76) | DRSDLSR (SEQ ID NO:31) | RRTDLRR (SEQ ID NO:77) | RSANLAR (SEQ ID NO:78) | DRSHLAR (SEQ ID NO:19) |
32685 | RSDHLSA (SEQ ID NO: 79) |
RSADRTR (SEQ ID NO: 80) |
RSDVLSE (SEQ ID NO: 50) |
TSGHLSR (SEQ ID NO: 15) |
RSDDLTR (SEQ ID NO: 3) |
TSSDRKK (SEQ ID NO: 81) |
32422 | RSANLAR (SEQ ID NO: 78) |
RSDDLTR (SEQ ID NO: 3) |
RSDTLSE (SEQ ID NO: 34) |
HHSARRC (SEQ ID NO: 82) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
DRSNLTR (SEQ ID NO: 44) |
32428 | RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
DNSSRTR (SEQ ID NO: 83) |
DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
HKQHRDA (SEQ ID NO: 76) |
DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
RRTDLRR (SEQ ID NO: 77) |
32430 | RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
VRSRLRR (SEQ ID NO: 30) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
TSGSLTR (SEQ ID NO: 21) |
RSDNLAR (SEQ ID NO: 16) |
DPSNRVG (SEQ ID NO: 67) |
32432 | RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
VRSRLRR (SEQ ID NO: 30) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
TSGSLTR (SEQ ID NO: 21) |
RSDHLSA (SEQ ID NO: 79) |
RSADLSR (SEQ ID NO: 84) |
32714 | RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
DNSSRTR (SEQ ID NO: 83) |
ERGTLAR (SEQ ID NO: 22) |
QSGNLAR (SEQ ID NO: 53) |
DRSHLTR (SEQ ID NO: 43) |
RNDDRKK (SEQ ID NO: 85) |
32733 | DRSNLSR (SEQ ID NO: 12) |
QKVTLAA (SEQ ID NO: 86) |
RSAHLSR (SEQ ID NO: 14) |
TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
DRSDLSR (SEQ ID NO: 31) |
RRSTLRS (SEQ ID NO: 87) |
30901 | DRSALSR (SEQ ID NO: 88) |
QSGSLTR (SEQ ID NO: 74) |
QSSDLSR (SEQ ID NO: 18) |
LKWNLRT (SEQ ID NO: 89) |
RSDNLAR (SEQ ID NO: 16) |
LKWDRQT (SEQ ID NO: 90) |
31952 | QSGALAR (SEQ ID NO:91) | RSDDLTR (SEQ ID NO:3) | DRSALSR (SEQ ID NO:88) | RSDHLTQ (SEQ ID NO:92) | QSGDLTR (SEQ ID NO:28) | WSTSLRA (SEQ ID NO:58) |
31921 | RSDSLLR (SEQ ID NO:93) | RSDDLTR (SEQ ID NO:3) | QSGDLTR (SEQ ID NO:28) | RRDWLPQ (SEQ ID NO:94) | DRSNLSR (SEQ ID NO:12) | RSDDRKT (SEQ ID NO:4) |
30906 | DRSHLSR (SEQ ID NO: 95) |
TSGNLTR (SEQ ID NO: 26) |
QSGDLTR (SEQ ID NO: 28) |
DRSHLAR (SEQ ID NO: 19) |
RSDVLST (SEQ ID NO: 29) |
VRSRLRR (SEQ ID NO: 30) |
[0068] Последовательности и расположение целевых участков этих белков приведены в Таблице 2. Нуклеотиды в целевом участке, которые контактируют с распознающими спиралями ZFP, обозначены заглавными буквами; неконтактирующие нуклеотиды обозначены маленькими буквами.
Таблица 2: Целевые участки на человеческом и мышином Htt
SBS # | Целевой участок |
18856 | AcGCTGCGCCGGCGGAGGCGggggccgcg (SEQ ID NO:96) |
25920 | gcGCTCAGCAGGTGGTGaccttgtggac (SEQ ID NO:97) |
25921 | atGGTGGGAGAGACTGTgaggcggcagc (SEQ ID NO:98) |
25923 | tgGGAGAGacTGTGAGGCGgcagctggg(SEQ ID NO:99) |
25922 | atGGCGCTCAGCAGGTGGTGaccttgtg (SEQ ID NO:100) |
32468 | agCCGGCCGTGGACTCTGAGccgaggtg (SEQ ID NO:101) |
32427 | cgCACTCGcCGCGAGgGTTGCCgggacg (SEQ ID NO:102) |
32501 | gtGGCGATGCGGGGGGCGTGgtgaggta (SEQ ID NO:103) |
31809 | acGCTGCGCCGGCGGAGGCGgggccgcg (SEQ ID NO:96) |
32528 | ccGGGACGGGTCCAaGATGGAcggccgc (SEQ ID NO:104) |
30580 | agCCGGCCGTGGACTCTGAGccgaggtg (SEQ ID NO:101) |
30929 | ccGTCCCGGCAGCCCCCacggcgccttg (SEQ ID NO:105) |
30658 | ctGCTGCTGCTGCTGCTgctggaaggac (SEQ ID NO:106) |
32538 | cgGGTCCAAGATGGACGGCCgctcaggt (SEQ ID NO:107) |
32567 | ctGCTGCTGCTGCTGGAAGGacttgagg (SEQ ID NO:108) |
29627 | tcAGATGGGACGGCGCTGACctggctgg (SEQ ID NO:109) |
29628 | ctGCCATGGACCTGAATGATgggaccca (SEQ ID NO:110) |
29631 | gtGGTCTGGGAGCTGTCGCTgatgggcg (SEQ ID NO:111) |
29632 | ccGAAGGGCCTGATtCAGCTGttacccc (SEQ ID NO:112) |
29637 | aaCTTGCAAGTAACaGAAGACtcatcct (SEQ ID NO:113) |
29638 | ctTGTACAGCTGTGAGGgtgagcataat (SEQ ID NO:114) |
25917 | gcCATGGTGGGAGAGACtgtgaggcggc (SEQ ID NO:115) |
25916 | ctCAGCAGGTGGTGACCttgtggacatt (SEQ ID NO:116) |
33074 | agCAGCAGcaGCAGCAgCAGCAGcagca (SEQ ID NO:117) |
33080 | caGCAGCAgCAGCAGcaGCAGCAgcagc (SEQ ID NO:118) |
33084 | tgCTGCTGctGCTGCTgctgctggaagg (SEQ ID NO:119) |
33088 | ctGCTGCTgCTGctGCTGCTgctggaag (SEQ ID NO:120) |
30643 | caGCAGCAGCAGCAgCAGCAGcagcagc (SEQ ID NO:118) |
30648 | agCAGCAGCAGCAGCAGCAGcagcagca (SEQ ID NO:117) |
30645 | caGCAGCAGCAgCAGCAGcagcagcagc (SEQ ID NO:118) |
30640 | caGCAGCAGCAGCAGCAgcagcagcagc (SEQ ID NO:118) |
30657 | ctGCTGCTGCTGCTgCTGCTGgaaggac (SEQ ID NO:106) |
30642 | caGCAGCAGCAGCAGCAgcagcagcagc (SEQ ID NO:118) |
30646 | caGCAGCAGCAgCAGCAGcagcagcagc (SEQ ID NO:118) |
32220 | ctGCTGCTgCTGctgctgctgctggaagg (SEQ ID NO:121) |
32210 | caGCAGCAGCAgcagcagcagcagcagc (SEQ ID NO:118) |
32215 | agCAGCAGCAGcagcagcagcagcagca(SEQ ID NO:117) |
32218 | tGCTGCTgctgctgctgctgctggaagg_ (SEQ ID NO:122) |
32653 | ggCTGGCTTTTGCGGGAAGGggcggggc (SEQ ID NO:123) |
32677 | gaATTGACaGGCGGAtGCGTCGtcctct (SEQ ID NO:124) |
33560 | cgCACTCGcCGCGAGgGTTGCCgggacg (SEQ ID NO:102) |
33583 | gcGGCGAGtGCGTCCCGTGACgtcatgc (SEQ ID NO:103) |
32685 | atTCTGCGGGTCTGGCGTGGcctcgtct (SEQ ID NO:104) |
32422 | gtGACGTCATGCCGGCGGAGacgaggcc (SEQ ID NO:105) |
32428 | gtGCGTCCCGTGACGTCATGccggcgga (SEQ ID NO:106) |
32430 | gcCGCGAGgGTTGCCGGGACGggcccaa (SEQ ID NO:107) |
32432 | ccGCGAGGGTTGCCGGGACGggcccaag (SEQ ID NO:108) |
32714 | caTCGGGCagGAAGCCGTCATGgcaacc (SEQ ID NO:109) |
32733 | tcCTGCCCGATGGGACAGACcctgaaga (SEQ ID NO:110) |
30901 | gtACTGAGcAATGCTGTAGTCagcaatc (SEQ ID NO:111) |
31952 | ccTGTCCAgAGGGTCGCGGTAcctccct (SEQ ID NO:112) |
31921 | tgCCGGACCTGGCAGCGGCGgtggtggc (SEQ ID NO:113) |
30906 | ccGGGACGGGTCCAaGATGGAcggccgc (SEQ ID NO:104) |
[0069] В определенных вариантах реализации изобретения ДНК-связывающий домен включает природный или сконструированный (неприродного происхождения) ДНК-связывающий домен TAL-эффектора (TALE). См., например, патент США № 8586526, в полном объеме включенный в данный документ посредством ссылки.
[0070] Известно, что патогенные бактерии растений рода Xanthomonas вызывают множество заболеваний важных сельскохозяйственных растений. Патогенность Xanthomonas зависит от консервативной системы секреции III типа (T3S), которая инжектирует более 25 разных эффекторных белков в клетку растения. Среди этих инжектируемых белков есть подобные активаторам транскрипции эффекторы (TALE), которые имитируют растительные активаторы транскрипции и манипулируют растительной транскриптомой (см. Kay et al (2007) Science 318:648-651). Эти белки содержат ДНК-связывающий домен и транскрипционный активационный домен. Одним из наиболее хорошо изученных TALE является AvrBs3 из Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (см. Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 и WO2010079430). TALE содержат центральный домен тандемных повторов, при этом каждый из повторов содержит приблизительно 34 аминокислоты, которые являются ключевыми для ДНК-связывающей специфичности этих белков. Кроме того, они содержат последовательность ядерной локализации и кислый транскрипционный активационный домен (обзор см. в Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Кроме того, было обнаружено, что два гена фитопатогенной бактерии Ralstonia solanacearum, обозначаемые brg11 и hpx17, являются гомологичными с семейством AvrBs3 Xanthomonas в штамме GMI1000 биовара 1 и штамме RS1000 биовара 4 R. solanacearum (См. Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Эти гены на 98,9% идентичны по нуклеотидной последовательности друг другу, но отличаются делецией в 1575 п.о. в повторяемом домене hpx17. При этом оба генных продукта обладают менее чем 40% идентичности последовательностей с белками семейства AvrBs3 Xanthomonas.
[0071] Специфичность этих TALE зависит от последовательностей, находящихся в тандемных повторах. Повторяемая последовательность содержит приблизительно 102 п.о., а повторы, как правило, на 91-100% гомологичны друг с другом (Bonas et al, ibid). Полиморфизм повторов обычно локализован в позициях 12 и 13, при этом наблюдается точное соответствие между идентичностью гипервариабельных двойных остатков в позициях 12 и 13 с идентичностью смежных нуклеотидов в целевой последовательности TALE (см. Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 и Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Экспериментально был определен код распознавания ДНК этих TALE, причем БХ-последовательность в позициях 12 и 13 приводит к связыванию с цитозином (C), NG связывается с T, NI с A, C, G или T, NN связывается с A или G, а NG связывается с T. Эти ДНК-связывающие повторы были собраны в белки с новыми комбинациями и количеством повторов для создания искусственных транскрипционных факторов, которые способны взаимодействовать с новыми последовательностями, патент США № 8586526 и публикация США № 20130196373, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки, описывают TALE с N-кэпированными полипептидами, С-кэпированными полипептидами (например, +63, +231 или +278) и/или новые (атипичные) RVD.
[0072] Типовые TALE описаны в патентной публикации США № 20130253040, в полном объеме включенной посредством ссылки, и приведены ниже в Таблице 3.
[0073] Мишени и числовые обозначения для исследуемых TALE TF приведены ниже в Таблице 3. Числовые обозначения обозначены «SBS№», указана специфичность в отношении Смысловой или Антисмысловой цепи («С/А»), а также мишень, число повторяемых единиц или RVD и тип С-конца.
Таблица 3: Htt-специфические TALE-TF
SBS№ | С/А | Мишень (5'-3') | SEQ ID NO | RVD | C терм |
102449 | S | gcAGCAGCAGCAGCAGCAGca | 114 | 17 | +63 |
102450 | S | gcAGCAGCAGCAGCAGca | 115 | 14 | +63 |
102451 | S | gcAGCAGCAGCAGca | 116 | 11 | +63 |
102452 | S | gcAGCAGCAGca | 117 | 8 | +63 |
102453 | A | ctGCTGCTGCTGCTGCTGCtg | 118 | 17 | +63 |
102454 | A | ctGCTGCTGCTGCTGCtg | 119 | 14 | +63 |
102455 | A | ctGCTGCTGCTGCtg | 120 | 11 | +63 |
102456 | A | ctGCTGCTGCtg | 121 | 8 | +63 |
102457 | S | gcAGCAGCAGCAGCAGCAGca | 114 | 17 | +231 |
102458 | S | gcAGCAGCAGCAGCAGca | 115 | 14 | +231 |
102459 | S | gcAGCAGCAGCAGca | 116 | 11 | +231 |
102460 | S | gcAGCAGCAGca | 117 | 8 | +231 |
102462 | A | ctGCTGCTGCTGCTGCtg | 119 | 14 | +231 |
102463 | A | ctGCTGCTGCTGCtg | 120 | 11 | +231 |
102464 | A | ctGCTGCTGCtg | 121 | 8 | +231 |
102466 | S | gcAGCAGCAGCAGCAGca | 115 | 14 | +278 |
102467 | S | gcAGCAGCAGCAGca | 116 | 11 | +278 |
102468 | S | gcAGCAGCAGca | 117 | 8 | +278 |
102469 | A | ctGCTGCTGCTGCTGCTGCtg | 118 | 17 | +278 |
102470 | A | ctGCTGCTGCTGCTGCtg | 119 | 14 | +278 |
102471 | A | ctGCTGCTGCTGCtg | 120 | 11 | +278 |
102472 | A | ctGCTGCTGCtg | 121 | 8 | +278 |
[0074] В определенных вариантах реализации изобретения ДНК-связывающие домены включают домен димеризации и/или мультимеризации, например, суперспираль (СС) и димеризующиеся цинковые пальцы (DZ).
См.
патентную публикацию США № 20130253040.
[0075] Недавно появились убедительные доказательства существования РНК-опосредованного пути геномной защиты у архей и многих бактерий, которое, как предполагается, соответствует эукариотическому пути РНКи (обзор см. в Godde and Bickerton, 2006.
J. Mol. Evol
. 62: 718-729; Lillestol
et al
., 2006.
Archaea
2: 59-72; Makarova
et al
., 2006.
Biol. Direct
1: 7.; Sorek
et al
., 2008.
Nat. Rev. Microbiol
. 6: 181-186). Предполагается, что известный как система CRISPR-Cas или прокариотическая РНКи (пРНКи) путь происходит из двух эволюционно и часто физически связанных генных локусов: локуса CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), который кодирует РНК-компоненты системы, и локуса cas (CRISPR-ассоциированный), который кодирует белки (Jansen
et al
., 2002.
Mol. Microbiol
. 43: 1565-1575; Makarova
et al
., 2002.
Nucleic Acids Res
. 30: 482-496; Makarova
et al
., 2006.
Biol. Direct
1: 7; Haft
et al
., 2005.
PLoS Comput. Biol
. 1: e60). Локусы CRISPR в микроорганизмах-хозяевах содержат комбинацию CRISPR-ассоциированных (Cas) генов, а также некодирующие РНК-элементы, способные программировать специфичность CRISPR-опосредованного расщепления нуклеиновых кислот. Отдельные белки Cas не обладают значительным сходством последовательностей с белковыми компонентами эукариотического аппарата РНКи, но имеют аналогичные прогнозируемые функции (например, связывание РНК, нуклеазные, геликазные и т.д.) (Makarova
et al
., 2006.
Biol. Direct
1: 7). CRISPR-ассоциированные (
cas
) гены часто связаны с группами повтор CRISPR-спейсер. Было описано более сорока разных белковых семейств Cas. Среди этих белковых семейств Cas1 оказался распространенным среди разных систем CRISPR/Cas. Конкретные комбинации генов
cas
и повторных структур использовали для определения 8 подтипов CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern и Mtube), некоторые из которых связаны с дополнительным генным модулем, кодирующим ассоциированные с повторами загадочные белки (RAMP). В одном геноме может находиться более одного подтипа CRISPR. Спорадическое распределение подтипов CRISPR/Cas позволяет предположить, что данная система подвергается горизонтальному переносу генов во время эволюции микроорганизмов.
[0076] CRISPR II типа, изначально описанная в S. pyogenes, является одной из наиболее хорошо охарактеризованных систем и делает нацеленный двухцепочечный разрыв в ДНК в ходе четырех последовательных этапов. Во-первых, некодирующая РНК, пре-crРНК-матрица и tracrРНК транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrРНК гибридизируется с повторяемыми областями пре-crРНК и опосредует процессинг пре-crРНК в зрелые crРНК, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности, при этом процессинг осуществляется при помощи специфической в отношении двойной спирали РНКазы III в присутствии белка Cas9. В-третьих, зрелый комплекс crРНК:tracrРНК направляет Cas9 к ДНК-мишени посредством уотсон-криковского спаривания оснований между спейсером на crРНК и протоспейсером на ДНК-мишени, следующим за мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM), что является дополнительным требованием для распознавания мишени. Кроме того, также должна присутствовать tracrРНК, так как она спаривается с crРНК в 3' конце, а эта ассоциация запускает активность Cas9. И наконец, Cas9 опосредует расщепление ДНК-мишени, чтобы создать двухцепочечный разрыв в протоспейсере. Активность системы CRISPR/Cas состоит из трех этапов: (i) вставка чужеродных последовательностей ДНК в матрицу CRISPR для предотвращения будущих атак в процессе, называемом «адаптацией», (ii) экспрессия релевантных белков, а также экспрессия и процессинг матрицы с последующей (iii) РНК-опосредованной интерференцией с чужеродной нуклеиновой кислотой. Таким образом, в бактериальной клетке несколько так называемых белков «Cas» связаны с природной функцией системы CRISPR/Cas.
[0077] Системы CRISPR II типа были обнаружены во многих бактериях. Поиск BLAST по общедоступным геномам, проведенный Fonfara et al ((2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590), обнаружил ортологи Cas9 в 347 видах бактерий. Кроме того, эта группа демонстрировала in vitro CRISPR/Cas расщепление ДНК-мишени с применением ортологов Cas9 из S. pyogenes, S. mutans, S. therophilus, C. jejuni, N. meningitides, P. multocida и F. novicida. Таким образом, термин «Cas9» относится к РНК-направляемой ДНК-нуклеазе, содержащей ДНК-связывающий домен и два нуклеазных домена, при этом ген, кодирующий Cas9, может происходить из любой подходящей бактерии.
[0078] Белок Cas9 содержит по меньшей мере два нуклеазных домена: один нуклеазный домен аналогичен эндонуклеазе HNH, в то время как другой напоминает домен эндонуклеазы Ruv. Домен HNH-типа отвечает за расщепление цепи ДНК, которая комплементарна crРНК, в то время как домен Ruv расщепляет некомплементарную цепь. Нуклеазу Cas 9 можно сконструировать так, чтобы только один из нуклеазных доменов был функциональным, что приводит к созданию никазы Cas (см. Jinek et al, ibid). Никазы можно создавать путем введения специфических аминокислотных мутаций в каталитический домен фермента или путем отсечения части или всего домена так, чтобы он более не был функциональным. Так как Cas 9 содержит два нуклеазных домена, этот подход можно применять к любому домену. Двухцепочечный разрыв в ДНК-мишени можно создавать, используя две таких никазы Cas 9. Каждая из никаз будет расщеплять одну цепь ДНК, а использование двух приведет к созданию двухцепочечного разрыва.
[0079] Необходимость в комплексе crРНК-tracrРНК можно обойти путем применения сконструированной «единичной гидовой РНК» (sgРНК), которая содержит шпильку, обычно образуемую посредством отжига crРНК и tracrРНК (см. Jinek et al (2012) Science 337:816 и Cong et al (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143). В S. pyrogenes сконструированный продукт слияния tracrРНК:crРНК или sgРНК направляет Cas9 для расщепления ДНК-мишени, когда между ассоциированными с Cas РНК и ДНК-мишенью образуется двухцепочечный гетеродимер РНК:ДНК. Эту систему, содержащую белок Cas9 и сконструированную sgРНК, содержащую последовательность PAM, использовали для направляемого РНК редактирования генома (см. Ramalingam, ibid) и для in vivo редактирования генома эмбрионов рыб данио (см. Hwang et al (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227), причем эффективность редактирования была сходна с ZFN и TALEN.
[0080] Первичными продуктами локусов CRISPR являются короткие РНК, которые содержат внедряющиеся направляющие последовательности и называются гидовыми РНК или прокариотическими сайленсинг-РНК (psiРНК) на основании их предполагаемой роли в пути (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579). РНК-анализ свидетельствует о том, что расщепление транскриптов локуса CRISPR происходит в пределах повторяемых последовательностей с высвобождением промежуточных продуктов РНК от ~60 до 70 нуклеотидов, которые содержат индивидуальные внедряющиеся направляющие последовательности и фланкирующие повторяемые фрагменты (Tang et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541; Tang et al., 2005. Mol. Microbiol. 55: 469-481; Lillestol et al. 2006. Archaea 2: 59-72; Brouns et al. 2008. Science 321: 960-964; Hale et al, 2008. RNA, 14: 2572-2579). В архебактерии Pyrococcus furiosus эти промежуточные РНК дополнительно процессируются до многочисленных стабильных зрелых psiРНК от ~35 до 45 нуклеотидов (Hale et al. 2008. RNA, 14: 2572-2579).
[0081] Необходимость в комплексе crРНК-tracrРНК можно обойти путем применения сконструированной «единичной гидовой РНК» (sgРНК), которая содержит шпильку, обычно образуемую посредством отжига crРНК и tracrРНК (
см.
Jinek
et al
(2012)
Science
337:816 и Cong
et al
(2013)
Sciencexpress
/10.1126/science.1231143). В
S. pyrogenes
сконструированный продукт слияния tracrРНК:crРНК или sgРНК направляет Cas9 для расщепления ДНК-мишени, когда между ассоциированными с Cas РНК и ДНК-мишенью образуется двухцепочечный гетеродимер РНК:ДНК. Эту систему, содержащую белок Cas9 и сконструированную sgРНК, содержащую последовательность PAM, использовали для направляемого РНК редактирования генома (см. Ramalingam,
ibid
) и для
in vivo
редактирования генома эмбрионов рыб данио (см. Hwang
et al
(2013)
Nature Biotechnology
31 (3):227), причем эффективность редактирования была сходна с ZFN и TALEN.
[0082] Химерные или sgРНК можно сконструировать так, чтобы они содержали последовательность, комплементарную любой необходимой мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения длина гидовой последовательности составляет около или более чем около 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения длина гидовой последовательности составляет менее чем около 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержат 22 основания комплементарности с мишенью и формы G[n19], за которыми следует прилегающий к протоспейсеру мотив (PAM) формы NGG или NAG для использования с системой CRISPR/Cas S. pyogenes. Таким образом, в одном способе sgРНК можно сконструировать путем применения известной мишени ZFN в представляющем интерес гене посредством (i) выравнивания последовательности распознавания гетеродимера ZFN со стандартной последовательностью из релевантного генома (человека, мыши или конкретного вида растений); (ii) выявления спейсерной области между полусайтами ZFN; (iii) выявления локации мотива G[N20]GG, который расположен наиболее близко к спейсерной области (когда один или более таких мотивов перекрываются со спейсером, выбирают мотив, которые является более центральным по отношению к спейсеру); (iv) применения такого мотива в качестве основы sgРНК. Преимуществом этого метода есть то, что он основан на проверенных нуклеазных мишенях. В альтернативном варианте sgРНК можно сконструировать так, чтобы они были нацелены на любую представляющую интерес область, просто путем определения подходящей целевой последовательности, которая соответствует формуле G[n20]GG. Наряду с областью комплементарности sgРНК могут содержать дополнительные нуклеотиды для расширения до хвостовой области tracrРНК-части sgРНК (см. Hsu et al (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647). Длина хвостов может составлять от +67 до +85 нуклеотидов или любое промежуточное число, при этом предпочтительная длина составляет +85 нуклеотидов. Также можно применять усеченные sgРНК, «tru-gРНК» (см. Fu et al, (2014) Nature Biotech 32(3): 279). В tru-gРНК длина комплементарной области уменьшена до 17 или 18 нуклеотидов.
[0083] Кроме того, также можно применять альтернативные последовательности РАМ, при этом последовательность РАМ может представлять собой NAG в качестве альтернативы NGG (Hsu 2014,
ibid
) с применением Cas9
S. pyogenes
. Дополнительные последовательности РАМ также могут включать те, в которых отсутствует исходный G (Sander and Joung (2014)
Nature Biotech
32(4):347). Кроме последовательностей РАМ кодируемого
S. pyogenes
Cas9, можно использовать другие последовательности РАМ, специфические в отношении белков Cas9 из других бактериальных источников. Например, приведенные ниже последовательности РАМ (на основе материалов Sander and Joung,
ibid
, и Esvelt
et al
, (2013)
Nat Meth
10(11):1116) являются специфическими в отношении таких белков Cas9:
Вид PAM
S. pyogenes NGG
S. pyogenes NAG
S. mutans NGG
S. thermophilius NGGNG
S.thermophilius NNAAAW
S. thermophilius NNAGAA
S. thermophilius NNNGATT
C. jejuni NNNNACA
N. meningitides NNNNGATT
P. multocida GNNNCNNA
F. novicida NG
[0084] Таким образом, подходящую целевую последовательность для применения с системой CRISPR/Cas S. pyogenes можно выбрать в соответствии со следующими критериями: [n17, n18, n19 или n20](G/A)G. В альтернативном варианте последовательность РАМ может соответствовать критерию G[n17, n18, n19, n20](G/A)G. Для белков Cas9, полученных из отличных от S. pyogenes бактерий, можно использовать те же критерии, при этом чередующиеся РАМ замещены последовательностями РАМ S. pyogenes.
[0085] Наиболее предпочтительно выбирать целевую последовательность с наибольшей вероятностью специфичности, что позволяет избежать потенциальных нецелевых последовательностей. Эти нежелательные нецелевые последовательности можно выявить, рассматривая следующие признаки: i) сходство в целевой последовательности, за которой следует последовательность РАМ, для которой известно, что она функционирует вместе с применяемым белком Cas9; ii) сходная целевая последовательность с менее чем тремя несовпадениями по сравнению с необходимой целевой последовательностью; iii) сходная целевая последовательность по ii), в которой все несовпадения находятся скорее в дистальной области РАМ, чем в проксимальной области РАМ (существуют свидетельства того, что нуклеотиды 1-5, непосредственно прилегающие или проксимальные к РАМ, иногда называемые «затравочной» областью (Wu
et al
(2014)
Nature Biotech
doi:10.1038/nbt2889), являются наиболее критическими для распознавания, следовательно, предполагаемые нецелевые участки с несовпадениями, расположенными в затравочной области, с наименьшей вероятно могут распознаваться sgRNA); и iv) сходная целевая последовательность, в которой несовпадения не разделены последовательно или разделены более чем четырьмя нуклеотидами (Hsu 2014,
ibid
). Таким образом, проводя анализ числа потенциальных нецелевых участков в геноме, в котором используется какая-либо система CRIPSR/Cas, с применением вышеприведенных критериев, можно определить подходящую целевую последовательность для sgRNA.
[0086] В определенных вариантах реализации изобретения белок Cas может представлять собой «функциональное производное» белка Cas природного происхождения. «Функциональное производное» нативной последовательности полипептида представляет собой соединение, имеющее общее качественное биологическое свойство с нативной последовательностью полипептида. «Функциональные производные» включают, но не ограничиваются этим, фрагменты нативной последовательности и производные нативной последовательности полипептида и ее фрагменты, при условии, что они обладают общей биологической активностью с соответствующей нативной последовательностью полипептида. Подразумевающаяся в данном документе биологическая активность представляет собой способность функционального производного к гидролизу субстрата ДНК на фрагменты. Термин «производное» включает варианты аминокислотной последовательности полипептида, его ковалентные модификации и продукты слияния. В некоторых аспектах функциональное производное может иметь одно биологическое свойство белка Cas природного происхождения. В других аспектах функциональное производное может иметь подгруппу биологических свойств белка Cas природного происхождения. Подходящие производные полипептида Cas или его фрагмента включают, но не ограничиваются этим, мутанты, продукты слияния, ковалентные модификации белка Cas или его фрагмента. Белок Cas, который включает белок Cas или его фрагмент, а также производные белка Cas или его фрагмента, можно получить из клетки или синтезировать химическим путем, или путем комбинирования этих двух процедур. Клетка может представлять собой клетку, которая естественным образом вырабатывает белок Cas, или клетку, которая естественным образом вырабатывает белок Cas и генетически сконструирована так, чтобы вырабатывать эндогенный белок Cas при более высоком уровне экспрессии или чтобы вырабатывать белок Cas из экзогенно внесенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует Cas, который одинаков или отличается от эндогенного Cas. В некоторых случаях клетка не вырабатывает белок Cas естественным образом и генетически сконструирована так, чтобы вырабатывать белок Cas.
[0087] Типовые нуклеазные системы CRISPR/Cas, нацеленные на конкретные гены, раскрыты, например, в предварительной заявке на патент США № 61/823689.
[0088] Таким образом, нуклеаза содержит ДНК-связывающий домен, который специфически связывается с целевым участком в любом гене, в который необходимо вставить донор (трансген) в комбинации с нуклеазным доменом, который расщепляет ДНК.
Слитые молекулы
[0089] ДНК-связывающие домены можно сливать с любыми дополнительными молекулами (например, полипептидами) для применения в описанных в данном документе способах. В определенных вариантах реализации изобретения в указанных способах применяют слитые молекулы, содержащие по меньшей мере одну ДНК-связывающую молекулу (например, ZFP, TALE или единичную гидовую РНК) и гетерологичный регуляторный (функциональный) домен (или его функциональный фрагмент).
[0090] В определенных вариантах реализации изобретения функциональный домен содержит транскрипционный регуляторный домен. Обычные домены включают, например, домены транскрипционных факторов (активаторы, репрессоры, коактиваторы, корепрессоры), сайленсеры, онкогены (например, представителей семейств myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos и т.д.); ферменты для репарации ДНК и связанные с ними факторы и модификаторы; ферменты для перестройки ДНК и связанные с ними факторы и модификаторы; хроматин-ассоциированные белки и их модификаторы (например, киназы, ацетилазы и деацетилазы); и ДНК-модифицирующие ферменты (например, метилтрансферазы, топоизомеразы, геликазы, лигазы, киназы, фосфатазы, полимеразы, эндонуклеазы) и связанные с ними факторы и модификаторы. См., например, публикацию США № 20130253040, в полном объеме включенную в данный документ посредством ссылки.
[0091] Подходящие домены для осуществления активации включают активационный домен VP16 ВПГ (см., например, Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)), ядерные гормональные рецепторы (см., например, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)); субъединицу p65 ядерного фактора каппа B (Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) и Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), или искусственные химерные функциональные домены, такие как VP64 (Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), и дегрон (Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447). Дополнительные типовые активационные домены включают Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2 и CTF1 (Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992), а также p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A и ERF-2. См., например, Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; и Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504. Дополнительные типовые активационные домены включают, но не ограничиваются этим, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5,-6,-7 и -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP и TRAB1. См., например, Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; и Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353.
[0092] Типовые репрессионные домены включают, но не ограничиваются этим, KRAB A/B, KOX, TGF-бета-индуцибельный ранний ген (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, представителей семейства DNMT (например, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb и MeCP2. См., например, Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; и Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342. Дополнительные типовые репрессионные домены включают, но не ограничиваются этим, ROM2 и AtHD2A. См., например, Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; и Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27.
[0093] Слитые молекулы конструируют способами клонирования и биохимической конъюгации, как хорошо известно специалистам в данной области техники. Слитые молекулы содержат ДНК-связывающий домен и функциональный домен (например, транскрипционный активационный или репрессионный домен). Также слитые молекулы необязательно содержат сигналы ядерной локализации (такие как, например, полученные из среднего Т-антигена SV40) и эпитопные метки (такие как, например, FLAG и гемагглютинин). Слитые белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) сконструированы так, чтобы трансляционная рамка считывания сохранялась среди компонентов продукта слияния.
[0094] Продукты слияния между полипептидным компонентом функционального домена (или его функционального фрагмента) с одной стороны и небелковым ДНК-связывающим доменом (например, антибиотиком, интеркалятором, компонентом, связывающимся с малой бороздой, нуклеиновой кислотой) с другой конструируют способами биохимической конъюгации, известными специалистам в данной области техники. См., например, каталог Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Были описаны способы и композиции для получения продуктов слияния между компонентом, связывающимся с малой бороздой, и полипептидом. Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935.
[0095] Слитая молекула может быть приготовлена с фармацевтически приемлемым носителем, как известно специалистам в данной области техники. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985; и принадлежащую тем же авторам WO 00/42219.
[0096] Функциональный компонент/домен слитой молекулы можно выбрать из множества разных компонентов, способных влиять на транскрипцию гена после связывания слитой молекулы с целевой последовательностью посредством ее ДНК-связывающего домена. Следовательно, функциональный домен может включать, но не ограничиваться этим, различные домены транскрипционных факторов, такие как активаторы, репрессоры, коактиваторы, корепрессоры и сайленсеры.
[0097] В определенных вариантах реализации изобретения слитый белок содержит ДНК-связывающий домен и нуклеазный домен для создания функциональных компонентов, которые способны распознавать свою нуклеотидную мишень посредством своих сконструированных (ZFP или TALE) ДНК-связывающих доменов, а созданные нуклеазы (например, нуклеазы «цинковые пальцы» или нуклеазы TALE) приводят к разрезанию ДНК вблизи ДНК-связывающего участка вследствие нуклеазной активности.
[0098] Таким образом, описанные в данном документе способы и композиции широко применимы и могут включать использование любой представляющей интерес нуклеазы. Неограничивающие примеры нуклеаз включают мегануклеазы, TALEN и нуклеазы «цинковые пальцы». Нуклеаза может содержать гетерологичные ДНК-связывающие и расщепляющие домены (например, нуклеазы «цинковые пальцы»; TALEN; ДНК-связывающие домены мегануклеаз с гетерологичными расщепляющими доменами) или, в альтернативном варианте, можно изменить ДНК-связывающий домен нуклеазы природного происхождения так, чтобы он связывал выбранный целевой участок (например, мегануклеаза, которая была сконструирована, чтобы связываться с участком, отличным от когнатного участка связывания).
[0099] Нуклеазный домен можно получить из любой нуклеазы, например, любой эндонуклеазы или экзонуклеазы. Неограничивающие примеры подходящих нуклеазных (расщепляющих) доменов, которые можно сливать с доменами, связывающими ДНК Htt, как описано в данном документе, включают домены из любого рестрикционного фермента, например, рестрикционного фермента типа IIS (например, FokI). В определенных вариантах реализации изобретения расщепляющие домены представляют собой расщепляющие полудомены, для расщепляющей активности которых необходима димеризация. См., например, патенты США № 8586526; 8409861 и 7888121, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки. В общем случае для расщепления необходимы два слитых белка, если слитые белки содержат расщепляющие полудомены. В альтернативном варианте можно использовать один белок, содержащий два расщепляющих полудомена. Два расщепляющих полудомена могут быть получены из одной эндонуклеазы (или ее функциональных фрагментов) или каждый расщепляющий полудомен может быть получен из отдельной эндонуклеазы (или ее функциональных фрагментов). Кроме того, целевые участки для двух слитых белков предпочтительно расположены по отношению друг к другу так, чтобы связывание двух слитых белков со своими соответствующими целевыми участками располагало расщепляющие полудомены в такой взаимной пространственной ориентации, которая позволяет расщепляющим полудоменам образовывать функциональный расщепляющий домен, например, путем димеризации.
[00100] Нуклеазный домен, полученный из любого домена мегануклеаз (хоминг-эндонуклеаз), обладающего расщепляющей активностью, также можно применять с описанными в данном документе нуклеазами, включая, но не ограничиваясь этим, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII.
[00101] В определенных вариантах реализации изобретения нуклеаза содержит компактный TALEN (cTALEN). Они представляют собой одноцепочечные слитые белки, связывающие ДНК-связывающий домен TALE с доменом нуклеазы TevI. Слитый белок может действовать как никаза, локализованная областью TALE, или может создавать двухцепочечный разрыв в зависимости от того, где расположен ДНК-связывающий домен TALE по отношению к нуклеазному домену мегануклеазы (например, TevI) (см. Beurdeley et al (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782).
[00102] В других вариантах реализации изобретения TALE-нуклеаза представляет собой мега-TAL. Такие мега-TAL нуклеазы представляют собой слитые белки, содержащие ДНК-связывающий домен TALE и расщепляющий домен мегануклеазы. Расщепляющий домен мегануклеазы активен в виде мономера и для его активности не требуется димеризация. (См. Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224).
[00103] Кроме того, нуклеазный домен мегануклеазы также может демонстрировать ДНК-связывающую функциональность. Любые TALEN можно использовать в комбинации с дополнительными TALEN (например, одной или более TALEN (cTALEN или FokI-TALEN) с одной или более мега-TAL) и/или ZFN.
[00104] Кроме того, расщепляющие домены могут содержать одно или более изменений по сравнению с диким типом, например, для образования облигатных гетеродимеров, которые снижают или устраняют нецелевые расщепляющие эффекты. См., например, патенты США № 7914796; 8034598; и 8623618, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки.
[00105] Описанные в данном документе нуклеазы могут создавать двух- или одноцепочечные разрывы в двухцепочечной мишени (например, гене). Создание одноцепочечных разрывов («ников») описано, например, в патенте США № 8703489, включенном в данный документ посредством ссылки, который описывает, как мутация каталитического домена одной из нуклеаз приводит к получению никазы.
[00106] Таким образом, нуклеазный (расщепляющий) домен или расщепляющий полудомен может быть любой частью белка, которая сохраняет расщепляющую активность или которая сохраняет способность мультимеризоваться (например, димеризоваться) с образованием функционального расщепляющего домена.
[00107] В альтернативном варианте сборка нуклеаз может проходить in vivo в целевом участке нуклеиновой кислоты при помощи технологии так называемых «расщепленных ферментов» (см., например, патентную публикацию США № 20090068164). Компоненты таких расщепленных ферментов могут экспрессироваться на отельных экспрессионных конструкциях или могут быть связаны в одной открытой рамке считывания, в которой индивидуальные компоненты разделены, например, саморасщепляющимся пептидом 2A или последовательностью IRES. Компоненты могут представлять собой индивидуальные связывающие домены «цинковые пальцы» или домены связывающего домена нуклеиновой кислоты мегануклеазы.
[00108] Перед применением можно проводить скрининг нуклеаз в отношении активности, например, в хромосомной системе на основе дрожжей, как описано в публикации США № 20090111119. Нуклеазные экспрессионные конструкции легко можно сконструировать, используя известные в данной области техники способы.
[00109] Экспрессия слитых белков может находиться под управлением конститутивного промотора или индуцибельного промотора, например, промотора галактокиназы, который активируется (дерепрессируется) в присутствии раффинозы и/или галактозы и репрессируется в присутствии глюкозы. В определенных вариантах реализации изобретения промотор сам регулирует экспрессию слитого белка, например, посредством включения высокоаффинных связывающих участков. См., например, заявку на патент США № 61955002, поданную 18 марта 2014 г.
Доставка
[00110] Белки и/или полинуклеотиды (например, ZFP, TALE, CRISPR/Cas), а также композиции, содержащие белки и/или полинуклеотиды, описанные в данном документе, можно доставлять в клетку-мишень любым подходящим способом, включая, например, инъекцию белков, применение мРНК и/или применение экспрессионной конструкции (например, плазмиды, лентивирусного вектора, AAV вектора, Ад вектора и т.д.).
[00111] Способы доставки описанных в данном документе белков, включая белки «цинковые пальцы», описаны, например, в патентах США № 6453242; 6503717; 6534261; 6599692; 6607882; 6689558; 6824978; 6933113; 6979539; 7013219; и 7163824, содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00112] Можно применять любые векторные системы, включая, но не ограничиваясь этим, плазмидные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы; герпесвирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы и т.д. См. также патенты США № 8586526; 6534261; 6607882; 6824978; 6933113; 6979539; 7013219; и 7163824, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки. Кроме того, очевидно, что любые из этих векторов могут содержать одну или более последовательностей, кодирующих ДНК-связывающие белки. Таким образом, когда в клетку вносят один или более белков ZFP, TALE или CRISPR/Cas, последовательности, кодирующие белки ZFP, TALE или CRISPR/Cas, могут находиться в одном векторе или в разных векторах. Когда применяют несколько векторов, каждый вектор может содержать последовательность, кодирующую один или несколько ZFP, TALE или систем CRISPR/Cas.
[00113] Для внесения нуклеиновых кислот, кодирующих сконструированные ZFP, TALE или системы CRISPR/Cas, в клетки (например, клетки млекопитающих) и целевые ткани можно применять традиционные методы переноса генов на вирусной и невирусной основе. Такие методы также можно применять для внесения нуклеиновых кислот, кодирующих ZFP, TALE или системы CRISPR/Cas, в клетки in vitro. В определенных вариантах реализации изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие ZFP, TALE или системы CRISPR/Cas, вносят в целях in vivo или ex vivo генной терапии. Невирусные векторные системы доставки включают ДНК-плазмиды, оголенные нуклеиновые кислоты и нуклеиновые кислоты в комплексе со средством доставки, таким как липосома или полоксамер. Вирусные векторные системы доставки включают ДНК- и РНК-вирусы, которые после доставки в клетку характеризуются эписомальным или интегрированным геномами. Обзор процедур генной терапии см. в Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., в Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
[00114] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают электропорацию, липофекцию, микроинъекцию, биолистику, применение виросом, липосом, иммунолипосом, конъюгатов поликатион или липид:нуклеиновая кислота, оголенных ДНК, оголенных РНК, искусственных вирионов и усиленное препаратами поглощение ДНК. Также для доставки нуклеиновых кислот можно применять сонопорацию с использованием, например, системы Sonitron 2000 (Rich-Mar). В предпочтительном варианте реализации изобретения одну или более нуклеиновых кислот доставляют в виде мРНК. Также предпочтительным является применение кэпированных мРНК для повышения трансляционной эффективности и/или стабильности мРНК. В особенности предпочтительными являются кэпы ARCA (антиреверсивный аналог кэпа) или их варианты. См. патенты США US7074596 и US8153773, включенные в данный документ посредством ссылки.
[00115] Дополнительные типовые системы доставки нуклеиновых кислот включают предоставляемые Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) и Copernicus Therapeutics Inc, (см., например, US6008336). Липофекция описана, например, в патентах США №. 5049386; 4946787; и 4897355), а реагенты для липофекции продаются на коммерческой основе (например, Transfectam™ и Lipofectin™, и Lipofectamine™ RNAiMAX). Катионные и нейтральные липиды, которые подходят для эффективной липофекции полинуклеотидов с распознаванием рецепторов, включают описанные у Felgner, в WO 91/17424, WO 91/16024. Доставку можно осуществлять в клетки (ex vivo введение) или целевые ткани (in vivo введение).
[00116] Получение комплексов липид:нуклеиновая кислота, в том числе нацеленных липосом, таких как иммунолипидные комплексы, хорошо известно специалисту в данной области техники (см., например, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патенты США № 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).
[00117] Дополнительные способы доставки включают применение упаковки предназначенных для доставки нуклеиновых кислот в средства доставки EnGeneIC (EDV). Эти EDV специфическим образом доставляются в целевые ткани при помощи биспецифических антител, в которых одно плечо антитела имеет специфичность в отношении целевой ткани, а другое имеет специфичность в отношении EDV. Антитело доставляет EDV к поверхности клетки-мишени, а затем EDV попадает в клетку путем эндоцитоза. После попадания в клетку происходит высвобождение содержимого (см. MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
[00118] Применение систем на основе ДНК- или РНК-вирусов для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих сконструированные ZFP, TALE или системы CRISPR/Cas, использует преимущества хорошо отработанных процессов нацеливания вируса на конкретные клетки в организме и переноса вирусной нагрузки в ядро. Вирусные векторы можно вводить непосредственно пациентам (in vivo) или их можно применять для обработки клеток in vitro и вводить модифицированные клетки пациентам (ex vivo). Традиционные системы на вирусной основе для доставки ZFP, TALE или систем CRISPR/Cas включают, но не ограничиваются этим, векторы для переноса генов на основе ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины и вируса простого герпеса. Интеграция в геном хозяина возможна при применении методов переноса генов с использованием ретровирусов, лентивирусов и аденоассоциированных вирусов и часто приводит к длительной экспрессии вставленного трансгена. Кроме того, высокую эффективность трансдукции наблюдали во многих разных типах клеток и целевых тканях.
[00119] Тропизм ретровирусов может быть изменен путем включения чужеродных оболочечных белков, что расширяет потенциальную целевую популяцию клеток-мишеней. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы, которые способны трансдуцировать или инфицировать неделящиеся клетки и, как правило, вырабатывают высокие вирусные титры. Выбор ретровирусной системы переноса генов зависит от целевой ткани. Ретровирусные векторы состоят из цис-действующих длинных концевых повторов с пакующей емкостью до 6-10 т.п.о. чужеродной последовательности. Минимального количества цис-действующих ДКП достаточно для репликации и упаковки векторов, которые затем используются для интеграции терапевтического гена в клетку-мишень, чтобы обеспечить стойкую экспрессию трансгена. Широко применяемые ретровирусные векторы включают векторы на основе вируса лейкоза мышей (ВЛМ), вируса лейкоза гиббонов (ВЛГ), вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинаций (см., например, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
[00120] В применениях, в которых предпочтительной является временная экспрессия, можно использовать системы на основе аденовирусов. Векторы на основе аденовирусов способны обеспечивать очень высокую эффективность трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. С такими векторами получали высокие титры и высокие уровни экспрессии. Этот вектор может быть получен в больших количествах в относительно простой системе. Аденоассоциированные вирусные («AAV») векторы также применяют, чтобы трансдуцировать клетки целевыми нуклеиновыми кислотами, например, при in vitro получении нуклеиновых кислот и пептидов или для in vivo и ex vivo процедур генной терапии (см., например, West et al., Virology 160:38-47 (1987); патент США № 4797368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Конструирование рекомбинантных AAV векторов описано в большом количестве публикаций, включая патент США № 5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); и Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
[00121] На данный момент в клинических исследованиях для переноса генов доступно по меньшей мере шесть подходов на основе вирусных векторов, которые включают комплементацию дефективных векторов генами, вставленными в хелперные клеточные линии для получения трансдуцирующего агента.
[00122] pLASN и MFG-S являются примерами ретровирусных векторов, которые использовали в клинических исследованиях (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN был первым терапевтическим вектором, применяемым в исследованиях генной терапии. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Для упакованных векторов MFG-S наблюдали эффективность трансдукции в 50% и выше. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
[00123] Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (рAAV) являются перспективными альтернативными системами доставки генов на основе дефективного и непатогенного парвовирусного аденоассоциированного вируса 2 типа. Все векторы получены из плазмиды, в которой сохранены только 145 п.о. инвертированных концевых повторов AAV, фланкирующих экспрессионную кассету трансгена. Эффективный перенос генов и стабильная доставка трансгенов благодаря интеграции в геном трансдуцированной клетки являются ключевыми характеристиками этой векторной системы. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Другие серотипы AAV, включая AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, и AAV rh10 и псевдотипированные AAV, такие как AAV2/8, AAV2/5 и AAV2/6, также можно применять в соответствии с настоящим изобретением.
[00124] Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусные векторы (Ад) можно получать при высоких титрах и легко инфицировать большое количество разных типов клеток. Большинство аденовирусных векторов сконструировано так, чтобы трансген замещал гены Ад E1a, E1b и/или E3; впоследствии дефектный по репликации вектор размножается в человеческих клетках 293, которые обеспечивают функцию удаленного гена в транс-форме. Ад-векторы могут трансдуцировать множество типов тканей in vivo, включая неделящиеся дифференцированные клетки, такие как клетки печени, почек и мышц. Традиционные Ад-векторы имеют большую несущую емкость. Пример применения Ад-вектора в клиническом исследовании включает полинуклеотидную терапию для противоопухолевой иммунизации путем внутримышечной инъекции (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Дополнительные примеры применения аденовирусных векторов для переноса генов в клинических исследованиях включают Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).
[00125] Пакующие клетки применяют для формирования вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые пакуют аденовирус, и клетки ψ2 или клетки PA317, которые пакуют ретровирус. Применяемые в генной терапии вирусные векторы обычно получают при помощи продуцирующей клеточной линии, которая пакует нуклеиновую кислоту вектора в вирусную частицу. Векторы, как правило, содержат минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в хозяина (в случае применения), при этом другие вирусные последовательности заменены экспрессионной кассетой, кодирующей предназначенный для экспрессии белок. Отсутствующие вирусные функции обеспечиваются в транс-форме пакующей клеточной линией. Например, применяемые в генной терапии AAV векторы, как правило, содержат только последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) из AAV генома, которые необходимы для упаковки и интеграции в геном хозяина. Вирусная ДНК пакуется в клеточную линию, которая содержит хелперную плазмиду, кодирующую другие AAV гены, а именно rep и cap, но в которой отсутствуют последовательности ИКП. Клеточная линия также инфицируется аденовирусом в качестве хелпера. Хелперный вирус стимулирует репликацию AAV вектора и экспрессию AAV генов из хелперной плазмиды. Хэлперная плазмида не пакуется в больших количествах вследствие отсутствия последовательностей ИКП. Заражение аденовирусом можно снизить, например, при помощи тепловой обработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV.
[00126] Во многих применениях генной терапии желательно, чтобы вектор для генной терапии доставлялся с высокой степенью специфичности в конкретный тип ткани. Соответственно, вирусный вектор можно модифицировать так, чтобы он имел специфичность в отношении данного типа клеток, путем экспрессии лиганда в виде слитого белка с вирусным оболочечным белком на внешней поверхности вируса. Лиганд выбирают так, чтобы он обладал аффинностью в отношении рецептора, который, как известно, присутствует у представляющего интерес типа клеток. Например, в Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), сообщалось, что вирус мышиного лейкоза Молони можно модифицировать так, чтобы он экспрессировал человеческий херегулин, слитый с gp70, при этом рекомбинантный вирус инфицирует определенные клетки рака молочной железы человека, экспрессирующие рецептор человеческого эпидермального фактора роста. Этот принцип можно распространить на другие пары вирус-клетка-мишень, в которых клетка-мишень экспрессирует рецептор, а вирус экспрессирует слитый белок, содержащий лиганд для рецептора клеточной поверхности. Например, можно сконструировать нитевидный фаг так, чтобы он представлял фрагменты антитела (например, FAB или Fv), имеющие специфическую аффинность связывания в отношении практически любого выбранного клеточного рецептора. Хотя вышеприведенное описание относится главным образом к вирусным векторам, такие же принципы можно применять к невирусным векторам. Такие векторы можно сконструировать так, чтобы они содержали конкретные последовательности поглощения, которые поддерживают поглощение конкретными клетками-мишенями.
[00127] Векторы для генной терапии можно доставлять in vivo путем введения отдельному пациенту, как правило, путем системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной или внутричерепной инфузии) или местного применения, как описано ниже. В альтернативном варианте векторы можно доставлять в клетки ex vivo, например, в клетки, эксплантированные из организма отдельного пациента (например, лимфоциты, аспираты костного мозга, образцы биопсии тканей), или универсальные донорные гемопоэтические стволовые клетки с последующей реимплантацией клеток в организм пациента, обычно после отбора клеток, в которые был включен вектор.
[00128] В определенных вариантах реализации изобретения описанные в данном документе композиции (например, полинуклеотиды и/или белки) доставляют непосредственно in vivo. Композиции (клетки, полинуклеотиды и/или белки) можно вводить непосредственно в центральную нервную систему (ЦНС), включая, но не ограничиваясь этим, прямую инъекцию в головной или спинной мозг. Можно проводить нацеливание на один или более участков головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим, гиппокамп, черное вещество, базальное ядро Мейнерта (БЯМ), полосатое тело и/или кору. В альтернативном варианте или дополнительно к доставке в ЦНС композиции можно вводить системно (например, путем внутривенной, внутрибрюшинной, внутрисердечной, внутримышечной, интратекальной, подкожной или внутричерепной инфузии). Способы и композиции для доставки описанных в данном документе композиций непосредственно субъекту (включая доставку непосредственно в ЦНС) включают, но не ограничиваются этим, прямую инъекцию (например, стереотаксическую инъекцию) при помощи набора игл. Такие способы описаны, например, в патентах США № 7837668; 8092429, описывающих доставку композиций (включая экспрессионные векторы) в головной мозг, и патентной публикации США № 20060239966, в полном объеме включенных в данный документ посредством ссылки.
[00129] Специалистам в данной области техники хорошо известен способ еx vivo трансфекции клеток для диагностики, исследований или для генной терапии (например, посредством повторной инфузии трансфицированных клеток в организм-хозяина). В предпочтительном варианте реализации изобретения клетки выделяют из организма субъекта, трансфицируют нуклеиновой кислотой ZFP, TALE или системы CRISPR/Cas (генной кДНК или мРНК) и повторно инфузируют в организм субъекта (например, пациента). В предпочтительном варианте реализации изобретения одну или более нуклеиновых кислот доставляют в виде мРНК. Также предпочтительным является применение кэпированных мРНК для повышения трансляционной эффективности и/или стабильности мРНК. В особенности предпочтительными являются кэпы ARCA (антиреверсивный аналог кэпа) или их варианты. См. патенты США US7074596 и US8153773, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки. Специалистам в данной области техники хорошо известны различные типы клеток, подходящие для ex vivo трансфекции (см., например, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)) и перечисленные в ней ссылки в отношении обсуждения того, как выделять и культивировать клетки, полученные от пациентов).
[00130] В одном варианте реализации изобретения в ex vivo процедурах трансфекции клеток и генной терапии используют стволовые клетки. Преимуществом применения стволовых клеток является то, что они могут дифференцироваться в другие типы клеток in vitro или могут быть внесены в организм млекопитающего (например, как доноры клеток), где они прививаются в костном мозге. Известны способы дифференцировки клеток CD34+ in vitro в клинически важные типы иммунных клеток с применением таких цитокинов, как GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (см. Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).
[00131] Стволовые клетки выделяют для трансдукции и дифференцировки при помощи известных способов. Например, стволовые клетки выделяют из клеток костного мозга путем пэннинга клеток костного мозга антителами, которые связывают нежелательные клетки, такие как CD4+ и CD8+ (Т-клетки), CD45+ (пап-В-клетки), GR-1 (гранулоциты) и Iad (дифференцированные антигенпрезентирующие клетки) (см. Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).
[00132] В некоторых вариантах реализации изобретения также можно применять стволовые клетки, которые были модифицированы. Например, нейрональные стволовые клетки, которым была придана устойчивость к апоптозу, можно использовать в качестве терапевтических композиций, в которых стволовые клетки содержат также ZFP TF согласно изобретению. Устойчивость к апоптозу может возникать, например, вследствие выключения BAX и/или BAK при помощи BAX- или BAK-специфических TALEN или ZFN (см. патент США № 8597912) в стволовых клетках, или тех, которые разрушаются каспазой, опять же, при помощи специфических в отношении каспазы-6 ZFN. Эти клетки можно трансфицировать ZFP TF или TALE TF, которые, как известно, регулируют мутантный Htt или Htt дикого типа.
[00133] Векторы (например, ретровирусы, аденовирусы, липосомы и т.д.), содержащие нуклеиновые кислоты терапевтических ZFP, можно вводить непосредственно в организм для трансдукции клеток in vivo. В альтернативном варианте можно вводить оголенную ДНК. Введение осуществляют любым из путей, обычно применяемых для приведения молекулы в максимальный контакт с клетками крови или ткани, включая, но не ограничиваясь этим, инъекцию, инфузию, местное применение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот доступны и хорошо известны специалистам в данной области техники и, хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, конкретный путь часто обеспечивает более незамедлительную и более эффективную реакцию, чем другой путь.
[00134] Способы внесения ДНК в гемопоэтические стволовые клетки раскрыты, например, в патенте США № 5928638. Векторы, применимые для внесения трансгенов в гемопоэтические стволовые клетки, например, клетки CD34+, включают аденовирус типа 35.
[00135] Векторы, применимые для внесения трансгенов в иммунные клетки (например, T-клетки), включают неинтегрирующиеся лентивирусные векторы. См., например, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222.
[00136] Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, применяемым для введения композиции. Соответственно, существует широкий ряд доступных подходящих составов фармацевтических композиций, как описано ниже (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).
[00137] Как указано выше, раскрытые способы и композиции можно применять в любом типе клеток, включая, но не ограничиваясь этим, прокариотические клетки, клетки грибков, клетки простейших, клетки растений, клетки насекомых, клетки животных, клетки позвоночных, клетки млекопитающих и клетки людей. Подходящие для экспрессии белка клеточные линии известны специалистам в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, COS, CHO (например, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (например, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, клетки насекомых, такие как Spodoptera fugiperda (Sf), и клетки грибков, такие как Saccharomyces, Pischia и Schizosaccharomyces. Также можно применять потомство, варианты и производные этих клеточных линий.
[00138] Предназначенное для введения эффективное количество будет варьироваться от пациента к пациенту и в зависимости от режима введения и места введения. Соответственно, эффективные количества наилучшим образом определит лечащий врач, который вводит композиции, а соответствующие дозировки легко может определить специалист в данной области техники. По прошествии достаточного времени для интеграции и экспрессии (как правило, 4-15 дней, например) анализ уровней терапевтического полипептида в сыворотке или других тканях и их сравнение с исходным уровнем до введения определит, является ли вводимое количество слишком низким, соответствующим правильному диапазону или слишком высоким. Подходящие схемы для начального и последующих введений также варьируются, но обычно состоят из начального введения, за которым в случае необходимости следуют повторные введения. Повторные введения можно осуществлять с различными интервалами в диапазоне от ежедневных до ежегодных или каждые несколько лет. В определенных вариантах реализации изобретения
[00139] Для доставки ZFP при помощи аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов непосредственно в головной мозг человека можно применять диапазон дозировок 1×1010-5×1012 (или любую промежуточную величину) векторного генома на полосатое тело. Как указано, дозировки могут варьироваться в случае разных структур головного мозга или разных протоколов доставки.
Применения
[00140] Описанные в данном документе Htt-связывающие молекулы (например, ZFP, TALE, системы CRISPR/Cas, TtAgo и т.д.) и кодирующие их нуклеиновые кислоты можно использовать во множестве разных применений. Эти применения включают терапевтические способы, в которых Htt-связывающую молекулу (включая нуклеиновую кислоту, кодирующую ДНК-связывающий белок) вводят субъекту и применяют для модуляции экспрессии гена-мишени в организме субъекта. Модуляция может иметь форму репрессии, например, репрессии мутантного mHtt, с которым связано течение болезни БХ. В альтернативном варианте модуляция может иметь форму активации, когда активация экспрессии или повышение экспрессии эндогенного клеточного гена может снизить интенсивность болезненного состояния. В дополнительных вариантах реализации изобретения модуляция может представлять собой расщепление (например, одной или более нуклеазами), например, для инактивации гена мутантного Htt. Как указано выше, в случае таких применений Htt-связывающие молекулы или, скорее, кодирующие их нуклеиновые кислоты, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции.
[00141] Htt-связывающие молекулы или кодирующие их векторы, одни или в комбинации с другими подходящими компонентами (например, липосомами, наночастицами или другими известными в данной области техники компонентами), можно готовить в виде аэрозольных препаратов (т.е. чтобы их можно было распылять) для введения путем ингаляции. Аэрозольные препараты можно вносить в находящиеся под давлением приемлемые пропелленты, такие как дихлордифторметан пропан, азот и тому подобные. Препараты для парентерального введения, например, внутривенным, внутримышечным, интрадермальным и подкожным путями, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые обеспечивают изотоничность препарата с кровью предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Композиции можно вводить, например, путем внутривенной инфузии, перорально, местно, внутрибрюшинно, интравезикально или интратекально. Препараты соединений могут быть представлены в однодозовых или многодозовых запечатанных емкостях, таких как ампулы или флаконы. Растворы и суспензии для инъекций можно готовить из стерильных порошков, гранул и таблеток наподобие описанных ранее.
[00142] Вводимой пациенту дозы должно быть достаточно, чтобы со временем вызвать у пациента благоприятный терапевтический ответ. Дозу определяют, исходя из эффективности и Kд конкретной применяемой Htt-связывающей молекулы, клетки-мишени и состояния пациента, а также массы тела и площади поверхности тела пациента, лечение которого проводят. Размер дозы также определяют по наличию, природе и степени каких-либо вредных побочных эффектов, которые сопутствуют введению конкретного соединения или вектора конкретному пациенту.
[00143] В случае других применений эффективность описанных в данном документе молекул анализируют при помощи методов выявления для определения количества белка mHTT в организме пациента, например, в таких образцах, как цереброспинальная жидкость (ЦСЖ). Например, ультрачувствительный метод иммуноанализа, описанный в Wild et al. (2014) J. Neurol Neurosurg Psychiatry 85:10, можно применять для выявления (и/или количественной оценки) в образцах, полученных от пациента, наличия белка мутантного Htt, связанного с БХ. В некоторых вариантах реализации изобретения выявление изменений в уровнях mHtt в ЦСЖ обеспечивает диагностическое средство для определения прогрессирования БХ у субъекта в ответ на БХ-терапию, описанную в данном документе (например, при помощи ZFP, TALE и т.д.).
[00144] Для проведения диагностического анализа можно использовать любой подходящий формат, включая методы иммуноанализа. Например, можно проводить иммобилизацию захватывающих реагентов (например, антител, рецепторов и тому подобного) на планшете ИФА. В альтернативном варианте применяют выявляющие реагенты с ультрачувствительной иммунодетекцией на чипе для количественной оценки известными в данной области техники методами, такими как сканирование с магнитными частицами (см., например, Cornaglia et al (2014) Anal Chem 86(16):8213-23). Выявляющий реагент приводят в контакт с образцом, в котором предполагают наличие мутантного Htt, в условиях, в которых возможно связывание, и проводят количественную оценку известными в данной области техники методами.
[00145] Следовательно, так как уровни mHTT связаны с тяжестью заболевания, и при прогрессировании заболевания происходит повышение концентрации уровней, выявление mHtt в ЦСЖ или других полученных от пациента образцах позволяет отслеживать эффективность терапии Htt-связывающей молекулой при БХ, а также помогает изучать воздействие лечения на нейропатобиологию БХ и может применяться при проведении клинических исследований модифицирующих течение заболевания терапевтических средств против БХ, описанных в данном документе.
[00146] Следующие примеры относятся к типовым вариантам реализации настоящего изобретения, в которых Htt-модулятор содержит белок «цинковые пальцы» или систему CRISPR/Cas. Очевидно, что они приведены исключительно в иллюстративных целях и что возможно применение других Htt-модуляторов, включая, но не ограничиваясь этим, TALE-TF, дополнительные ZFP, ZFN, TALEN, дополнительные системы CRISPR/Cas, хоминг-эндонуклеазы (мегануклеазы) со сконструированными ДНК-связывающими доменами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: ZFP-TF восстанавливают фенотипы культивируемых БХ-нейронов
[00147] Различные исследования показали наличие фенотипических изменений, связанных с экспандированными CAG-повторами в клетках, полученных от пациентов с БХ, таких как уменьшение внутриклеточных уровней АТФ и повышение чувствительности к отсутствию факторов роста. См., например, Jung-Il et al. (2012) Biochemical Journal 446(3):359-371; HD IPSC Consortium (2012) Cell Stem Cell 11(2):264-278; An et al. (2012) Cell Stem Cell 11(2):253-263.
[00148] Соответственно, мы оценивали, восстанавливает ли экспрессия аллель-специфического ZFP-репрессора Htt такие фенотипы в полученных от пациентов нейронах. Вкратце, лентивирусные векторы для Venus (GFP) и ZFP-TF 33074-KOX-2A-Venus получали так, как описано в данном документе и патентной публикации США № 20130253040. Расщепляемый пептид 2A делает возможной экспрессию Venus (GFP) и ZFP из одного вектора, а ZFP-экспрессирующие клетки можно выявить по экспрессии GFP. Лентивирусные экспрессионные конструкции представляли третье поколение самоинактивирующихся ЛВ на основе ВИЧ. Экспрессионные векторы 33074 конструировали путем вставки ZFP-TF с линкером 2A и GFP-Venus ниже промотора ЦМВ. Экспрессионная конструкция GFP содержит только GFP-Venus ниже промотора ЦМВ. Рекомбинантные ЛВ готовили путем временной трансфекции клеток 293T с применением липофектамина 2000 (Life Technologies). Вирусные супернатанты собирали через 48 и 72 часа после трансфекции и фильтровали через 0,45-мкм фильтр перед 300-кратным концентрированием путем центрифугирования при 4°C (препаративная ультрацентрифуга Optima L-80K, Beckman Coulter) при 50000× g в течение 90 мин. Затем вирусный осадок пересуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Lonza) и хранили при -80C. Вирусные титры определяли путем инфицирования клеток 293T и измеряли методом проточной цитометрии, проводя анализ экспрессии GFP-VENUS.
[00149] БХ-ЭСК пассировали с аккутазой и культивировали на покрытых матригелем планшетах в среде Е8 (Life Technologies). Нейральные стволовые клетки получали, используя среду для нейральной индукции StemPro (Life Technologies). Вкратце, ЭСК высевали на покрытый geltrex 6-луночный планшет с 200000 клеток/лунку и по достижению 10-20% конфлюэнтности среду меняли на среду для нейральной индукции StemPro. Среду меняли каждые 2 дня, а на 7 день НСК собирали и размножали. Для культивирования БХ-НСК и не-БХ-НСК (HIP™ Globalstem) использовали среду StemPro NSC SFM (Life Technologies). НСК пассировали с аккутазой на покрытых geltrex планшетах. Дифференцировку нейронов индуцировали заменой среды на среду для нейральной дифференцировки, состоящую из нейробазальной среды с бессывороточной добавкой B-27 и GlutaMAX™ (Life Technologies). Среду меняли каждые 3-4 дня.
[00150] Дифференцированные нейроны трансдуцировали лентивирусными векторами для Venus (GFP) и ZFP-TF 33074-KOX-2A-Venus при МЗ 500. После этого супернатант замещали свежей средой для нейральной дифференцировки и поддерживали культуры до 21 дня.
[00151] Внутриклеточные уровни АТФ для культивируемых нейронов, полученных от пациента с БХ (CAG17/48) или нормального субъекта, измеряли при помощи люминесцентного анализа CellTiter-Glo® (Promega), число клеток в каждом образце определяли при помощи анализа ApoLive-Glo® (Promega). Вкратце, внутриклеточные уровни АТФ в нейронах измеряли при помощи люминесцентного анализа CellTiter-Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Люминесценцию (ОСЕ) измеряли через 30 мин на микропланшет-ридере Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2, а полученные значения нормировали относительно числа клеток в лунку, используя анализ ApoLive-Glo (Promega) и измеряя флуоресценцию (У.Е.). Затем значения уровней АТФ на лунку для разных клеток/типов обработки нормировали относительно уровня ложно-инфицированных БХ-нейронов.
[00152] Как показано на Фигуре 1, ложно-инфицированные или инфицированные ленти-GFP БХ-нейроны имели значительно сниженные внутриклеточные уровни АТФ по сравнению с не-БХ (нормальными) нейронами. В противоположность этому, инфицирование ленти-33074-KOX-2A-GFP приводило к ~60% повышению внутриклеточных уровней АТФ, указывая на то, что управляемая ZFP репрессия аллелей мутантного Htt нормализует нарушенный энергетический метаболизм этих клеток.
[00153] Гибель клеток БХ- и не-БХ-нейронов, индуцированную отсутствием факторов роста, определяли, используя метод ник-концевого мечения dUTP при помощи терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL). Вкратце, нейроны инфицировали ЛВ в трех повторностях, как описано выше для анализа АТФ. Клетки культивировали в течение 12 дней, затем среду меняли на свежую нейробазальную среду без каких-либо добавок (факторов роста). Клетки держали в этой не содержащей факторов роста среде в течение 48 часов. Анализ TUNEL проводили, используя набор для фрагментации ДНК ApoBrdU Red (BioVision). Нейроны фиксировали 4% параформальдегидом на льду в течение 15 мин. Апоптоз оценивали, подсчитывая TUNEL-положительные клетки в соответствии с рекомендациями производителя (набор для фрагментации ДНК ApoBrdU Red, BioVision). Проточную цитометрию применяли для определения апоптоза по окрашиванию анти-BrdU-Red и трансдукции ЛВ по GFP.
[00154] Как показано на Фигуре 2, через 48 часов отсутствия факторов роста БХ-нейроны (ложно-инфицированные) демонстрировали более высокий уровень гибели клеток (~50%), чем не-БХ-нейроны (~20%). В то время как инфицирование ленти-GFP не влияло на уровень гибели клеток в БХ-нейронах, инфицирование ленти-33074-KOX-2A-GFP приводило к значительному снижению доли нейронов среди апоптотических клеток (от ~50% до 20%).
[00155] Таким образом, управляемая ZFP репрессия мутантного Htt снижает чувствительность БХ-нейронов к отсутствию факторов роста.
Пример 2: ZFP-TF предотвращают и обращают агрегацию мутантного Htt у мышей Q175
[00156] Исследовали in vivo эффективность аллель-специфического репрессора мутантного Htt ZFP-TF (ZFP-30640 и 30645) на мышиной модели Q175 с генным нокином (Menalled et al. (2012) PLoS One 7(12):e49838), в которой экзон 1 аллеля мышиного Htt был замещен последовательностью экзона 1 человеческого Htt, которая содержит экспандированный CAG-повтор (~179 CAG). Патологическая агрегация мутантного Htt начинает выявляться в стриатуме мышей Q175 в возрасте 2 месяцев и продолжает повышаться с возрастом; агрегация становится хорошо сформировавшейся к возрасту 6 месяцев.
[00157] Чтобы исследовать, могут ли ZFP предотвращать накопление мутантного Htt в стриатуме, 2-месячным мышам Q175 проводили одностороннюю инъекцию в полосатое тело AAV-ZFP или AAV-GFP в качестве отрицательного контроля (2×1010 векторный геном/полосатое тело); экспрессией ZFP и GFP управлял промотор человеческого синапсина 1.
[00158] Через два месяца после инъекции (в возрасте 4 месяцев) получали образцы головного мозга, готовили срезы и проводили иммуногистохимический анализ, чтобы оценить экспрессию ZFP и Htt. Экспрессию ZFP выявляли при помощи антитела против эпитопной метки FLAG, а агрегацию мутантного Htt выявляли при помощи анти-Htt антитела (mEM48). Типовые изображения, полученные для мыши, которой инъецировали AAV-30645, показаны на Фигурах 3A-3H. В контралатеральной части полосатого тела, куда не проводили инъекцию, агрегация мутантного Htt (mEM48) была легко выявляема; в той части полосатого тела, куда проводили инъекцию AAV-30645, наблюдали только очень низкий уровень агрегации мутантного Htt в ZFP-экспрессирующих клетках (различаемых по положительному окрашиванию FLAG).
[00159] Как показано на Фигуре 3I, когда оценивали число агрегатов ядерного Htt на клетку для клеток FLAG(+) и GFP(+) в ипсилатеральной части полосатого тела мышей, которым инъецировали AAV-ZFP и AAV-GFP, соответственно, а затем нормировали относительно числа агрегатов на клетку в контралатеральной части полосатого тела, куда не проводили инъекцию, как ZFP-30640, так и 30645 значительно снижали (>90%) число агрегатов ядерного Htt (P<0,001, критерий Краскела-Уоллиса и множественное сравнение Данна).
[00160] Как показано на Фигуре 3J, когда интенсивность окрашивания ядерного mEM48 в ZFP- или GFP-экспрессирующих клетках нормировали относительно интенсивности в нейронах из контралатеральной части полосатого тела, наблюдали 50-60% уменьшение в интенсивности ядерного mEM48 в ипсилатеральной части полосатого тела, куда проводили инъекцию ZFP (P<0,001). Как показано на Фигуре 3K, плотность агрегатов околоядерного мутантного Htt в ZFP- или GFP-экспрессирующих клетках нормировали относительно плотности в нейронах из контралатеральной части полосатого тела, наблюдали 45-70% уменьшение в плотности агрегатов околоядерного Htt в части полосатого тела, куда проводили инъекцию ZFP (P<0,01).
[00161] Эти результаты показывают, что в случае проведения инъекции в 2-месячном возрасте ZFP-TF предотвращали агрегацию мутантного Htt в стриатуме мышей Q175 в возрасте 4 месяцев.
[00162] Чтобы исследовать, могут ли ZFP обращать хорошо сформировавшуюся агрегацию Htt, 6-месячным мышам Q175 проводили одностороннюю инъекцию в полосатое тело AAV-GFP-2A-ZFP; расщепляемый пептид 2А делает возможной экспрессию GFP и ZFP из одного вектора, а ZFP-экспрессирующие клетки можно выявлять по экспрессии GFP. В возрасте 8 месяцев получали образцы головного мозга, готовили срезы и проводили иммуногистохимический анализ, чтобы оценить агрегацию Htt. Типовые изображения, полученные для мыши, которой инъецировали AAV-GFP-2A-ZFP, показаны на Фигуре 4A. Антитело к DARPP-32, которое представляет собой стриатум-специфический белок, использовали, чтобы метить полосатое тело. В контралатеральной части полосатого тела, куда не проводили инъекцию, наблюдали высокий уровень агрегации мутантного Htt (выявляемого при помощи антитела mEM48); в ипсилатеральной части полосатого тела, куда проводили инъекцию AAV-GFP-2A-ZFP, наблюдали уменьшение агрегации мутантного Htt.
[00163] Кроме того, оценивали число агрегатов ядерного Htt на клетку для клеток GFP(+) в ипсилатеральной части полосатого тела мышей, которым инъецировали AAV-GFP-2A-ZFP и AAV-GFP, а затем нормировали относительно числа агрегатов на клетку в контралатеральной части полосатого телаполосатого тела, куда не проводили инъекцию. Как показано на Фигуре 4B, доставка GFP-2A-30640 приводила к ~20% снижению числа агрегатов ядерного Htt (P<0,001, критерий Краскела-Уоллиса и множественное сравнение Данна), доставка GFP-2A-30645 также приводила к небольшому снижению числа агрегатов ядерного Htt на клетку.
[00164] Интенсивность окрашивания ядерного mEM48 в клетках GFP(+) из ипсилатеральной части полосатого тела мышей, которым инъецировали AAV-GFP-2A-ZFP и AAV-GFP, также нормировали относительно интенсивности в нейронах из контралатеральной части полосатого тела. Как показано на Фигуре 4C, наблюдали приблизительно 20% уменьшение (P<0,001) в интенсивности ядерного mEM48 в части полосатого тела, куда инъецировали GFP-2A-30645. Также наблюдали приблизительно 10% уменьшение в интенсивности ядерного mEM48 в части полосатого тела, куда инъецировали GFP-2A-30640.
[00165] Определяли плотность агрегатов околоядерного мутантного Htt в клетках GFP(+) в ипсилатеральной части полосатого тела мышей, которым инъецировали AAV-GFP-2A-ZFP и AAV-GFP, и нормировали относительно плотности в нейронах из контралатеральной части полосатого тела. Как показано на Фигуре 4D, наблюдали 30-50% уменьшение (P<0,001) в плотности агрегатов околоядерного мутантного Htt в части полосатого тела, куда инъецировали ZFP.
[00166] Эти результаты показывают, что в случае проведения инъекции в 6-месячном возрасте ZFP-TF обращали существующую до этого агрегацию мутантного Htt в стриатуме мышей Q175 уже через 2 месяца. Более значительное уменьшение агрегации мутантного Htt ожидается, если экспрессия ZFP будет длиться более 2 месяцев перед проведением анализа головного мозга мышей.
[00167] Вместе эти данные демонстрируют, что репрессоры аллеля мутантного Htt, доставляемые в головной мозг субъектов с БХ, приводят к повышению уровней внутриклеточной концентрации АТФ в БХ-нейронах, снижению апоптоза в БХ-нейронах и предотвращают и снижают количество существующих агрегатов Htt.
Пример 3: Эффективность обработки ZFP-TF
[00168] Проводили диагностическое исследование на субъектах, обрабатываемых Htt-связывающей молекулой (например, ZFP-TF, TALE-TF и т.д.), которая является специфической в отношении аллеля мутантного Htt. Субъектов с БХ обрабатывали Htt-связывающими молекулами, как описано в данном документе. ЦСЖ получали от субъектов стандартными методами (например, методом люмбарной пункции), а затем известными в данной области техники методами выявляли и количественно оценивали белок mHtt (см. Wild et al, ibid). Уровни белка mHtt в ЦСЖ снижались после проведения терапии, как описано в данном документе.
Пример 4: ZFP-TF предотвращает и снижает агрегацию мутантного Htt у мышей Q175 и повышает экспрессию гена DARPP32.
[00169] Оценивали in vivo эффективность другого аллель-специфического репрессора мутантного Htt ZFP-TF (ZFP-33074) на мышиной модели Q175 с генным нокином (Menalled et al. (2012) PLoS One 7(12):e49838), в которой экзон 1 аллеля мышиного Htt был замещен последовательностью экзона 1 человеческого Htt, которая содержит экспандированный CAG-повтор (~179 CAG). Патологическая агрегация мутантного Htt начинает выявляться в стриатуме мышей Q175 в возрасте 2 месяцев и продолжает повышаться с возрастом; агрегация становится хорошо сформировавшейся к возрасту 6 месяцев.
[00170] Чтобы исследовать, могут ли ZFP предотвращать накопление мутантного Htt в стриатуме, 2-месячным мышам Q175 проводили одностороннюю инъекцию в полосатое тело AAV-ZFP-2A-GFP или AAV-GFP в качестве отрицательного контроля (2×1010 векторного генома/полосатое тело); экспрессией ZFP и GFP управлял промотор человеческого синапсина 1. Саморасщепляемый пептид 2А делает возможной экспрессию GFP и ZFP из одного вектора, а ZFP-экспрессирующие клетки можно выявлять по экспрессии GFP.
[00171] Через два месяца после инъекции (в возрасте 4 месяцев) получали образцы головного мозга, готовили срезы и проводили иммуногистохимический анализ, чтобы оценить экспрессию Htt. Трансдуцированные клетки метили GFP, средние шипиковые нейроны (СШН) метили антителом DARPP32, а агрегацию мутантного Htt выявляли при помощи анти-Htt антитела (mEM48).
[00172] Как показано на Фигуре 5A, в AAV-трансдуцированных СШН (меченых GFP и антителом DARPP32), число агрегатов или включений ядерного Htt на клетку было значительно снижено благодаря ZFP 33074 (P<0,001). На Фигуре 5B показано, что плотность агрегатов внеядерного мутантного Htt в AAV-трансдуцированных клетках была значительно снижена в обработанной ZFP части полосатого тела. (P<0,0001). На Фигуре 5C показано, что интенсивность окрашивания ядерного mEM48 (мутантный Htt) была значительно снижена у обработанных ZFP мышей (P<0,001).
[00173] Эти результаты показывают, что в случае проведения инъекции в 2-месячном возрасте ZFP 33074 предотвращает агрегацию мутантного Htt в стриатуме мышей Q175.
[00174] Чтобы исследовать, могут ли ZFP снижать агрегацию Htt после того, как она формируется в стриатуме Q175, 6-месячным мышам Q175 проводили одностороннюю инъекцию в полосатое тело AAV-GFP-2A-ZFP или AAV-GFP. В возрасте 10 месяцев получали образцы головного мозга, готовили срезы и проводили иммуногистохимический анализ.
[00175] На Фигуре 6А показано, что в AAV-трансдуцированных СШН (меченых GFP и антителом DARPP32), число агрегатов/включений ядерного Htt на клетку было значительно снижено благодаря ZFP 33074 (P<0,001). На Фигуре 6В показано, что плотность агрегатов внеядерного мутантного Htt в AAV-трансдуцированных клетках была значительно снижена в обработанной ZFP части полосатого тела. (P<0,0001). На Фигуре 6С показано, что интенсивность окрашивания ядерного mEM48 (мутантный Htt) была значительно снижена у обработанных ZFP мышей (P<0,001).
[00176] На Фигуре 7А показано, что у 10-месячных мышей Q175 снижена экспрессия маркера СШН DARPP32 (P<0,05) по сравнению с мышами дикого типа того же возраста, что позволяет предположить дегенерацию СШН у этих мышей. На Фигуре 7В показано, что, когда мышей Q175 инъецировали AAV-ZFP-2A-GFP в возрасте 6 месяцев и анализировали в отношении экспрессии DARPP32 в возрасте 10 месяцев, было обнаружено значительное повышение экспрессии DARPP32 у обработанных ZFP 33074 мышей по сравнению с обработанными контролем мышами.
[00177] Вместе эти результаты демонстрируют, что в случае проведения инъекции в 6-месячном возрасте ZFP 33074 способен снижать экспрессию и агрегацию мутантного Htt при наличии существующих агрегатов. Кроме того, ZFP 33074 способен восстанавливать экспрессию DARPP32, что позволяет предположить наличие защиты СШН. ДНК-связывающий домен (ДСД), который привлекает ZFP к экспандированному CAG-повтору, является необходимым, так как контрольный вектор, в котором отсутствовал ДСД (ZFP ΔДСД) не оказывал влияние на агрегацию мутантного Htt или экспрессию DARPP32.
Пример 5: CRIPSR/Cas-TF предотвращает и снижает агрегацию мутантного Htt в БХ-нейронах
[00178] sgРНК для применения в системе CRISPR/Cas получают синтетически известными в данной области техники способами (см. Hsu et al (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647 или Sternberg et al, (2014) Nature 507: 62). sgРНК сконструированы так, как описано выше, и предназначены для нацеливания на последовательность в mHtt. Например, sgРНК могут иметь одну из следующих последовательностей, в которых подчеркнуты последовательности РАМ:
5' GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3' SEQ ID NO:122
5'GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3' SEQ ID NO:123
5'GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3' SEQ ID NO:124
5'GCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3' SEQ ID NO:125
[00179] Транскрипционные факторы CRISPR/Cas получают в соответствии с известными в данной области техники способами (см., например, Perez-Pinera (2013) Nature 10(10):973 и Qi and Arkin (2014) Nature Reviews Microbiology 12:341). Вкратце, используют дефектный нуклеазный белок Cas9 и сливают его с репрессионным доменом (т.е. KRAB).
[00180] Культивируемые БХ-нейроны трансфицируют слитым белком Cas9(нуклеаза)-KRAB, кодирующим мРНК (20 мкг/мл) и sgРНК, как описано выше, при этом sgRNA вносят при помощи мРНК- (например, 2-4 мкг) или ДНК-экспрессионного вектора (например, 400 нг - 800 нг) путем электропорации с применением BTX ECM830. Клетки собирают через 5 дней и проводят количественный анализ Taqman для измерения экспрессии mHtt. Кроме того, с клетками проводят дополнительные описанные выше эксперименты, чтобы измерить внутриклеточные уровни АФТ и проанализировать апоптоз. Данные показывают, что специфические в отношении мутантного mHtt транскрипционные факторы CRISPR/Cas с применением sgРНК могут репрессировать экспрессию mHtt и уменьшать степень фенотипических характеристик, появляющихся вследствие агрегации белка mHtt.
Пример 6: Уменьшение двигательных дефектов
[00181] Животным (например, мышам) вводят описанные в данном документе репрессоры Htt и регулярно исследуют их хватательную реакцию, являющуюся хорошо изученным двигательным дефектом, демонстрируемым этими животными (Mangiarini et al. 1996 Cell 87, 493-506). Вкратце, каждое животное извлекают из его домашней клетки и помещают на крышу клетки. Затем наблюдатель аккуратно, плавным движением тянет животное назад и вверх, пока животное не оказывается подвешенным приблизительно в 12 дюймах (30,5 см) над поверхностью. Затем животное оценивают в течение 30 секунд. Если наблюдается хватательная реакция только передних конечностей, животному приписывают оценку 1. Если наблюдается хватательная реакция только задних конечностей, животному приписывают оценку 2. Если наблюдается хватательная реакция задних и передних конечностей, но не в одно время, животному приписывают оценку 3. Полная хватательная реакция, определяемая как одновременное сильное сжатие задних и передних конечностей, оценивается в 4. После 30 секунд в подвешенном состоянии животное возвращают в клетку. Для каждой группы обработки, а также для однопометных животных дикого типа того же возраста определяли долю животных, которые демонстрировали полную хватательную реакцию (оценка 4) при каждом еженедельном наблюдении.
[00182] По сравнению с контролем (отсутствие репрессоров Htt) описанные в данном документе репрессоры Htt улучшали хватательную реакцию, являющуюся хорошо изученным двигательным дефектом.
[00183] Все упоминаемые в данном документе патенты, патентные заявки и публикации в полном объеме и во всех смыслах включены в данный документ посредством ссылки.
[00184] Хотя изобретение было довольно подробно описано при помощи иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, для специалистов в данной области техники очевидно, что возможна практическая реализация различных изменений и модификаций без отступления от сущности и объема изобретения. Соответственно, вышеприведенные описание и примеры не должны считаться ограничивающими.
Claims (29)
1. Способ уменьшения экспрессии мутантного гена хантингтина (mHTT) для уменьшения или предотвращения образования агрегатов Htt у субъекта с болезнью Хантингтона (БХ), включающий
введение в стриатуму субъекта полинуклеотида, кодирующего репрессор мутантного аллеля Htt (mHtt), где репрессор включает белок «цинковые пальцы» (ZFP), обозначенный 30640, 30645 или 33074,
где
(i) ZFP, обозначенный 30640, содержит 5 цинк-пальцевых доменов, упорядоченных от F1 до F5, причем каждый цинк-пальцевой домен содержит распознающую спиральную область как изложено ниже:
F1: QSSDLSR (SEQ ID NO:18);
F2: QWSTRKR (SEQ ID NO:65);
F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:18);
F4: QWSTRKR (SEQ ID NO:65) и
F5: QSGDLTR (SEQ ID NO:28);
(ii) ZFP, обозначенный 30645, содержит 5 цинк-пальцевых доменов, упорядоченных от F1 до F5, причем каждый цинк-пальцевой домен содержит распознающую спиральную область как изложено ниже:
F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:9);
F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:10);
F3: QSSDLSR (SEQ ID NO:18);
F4: QWSTRKR (SEQ ID NO:65) и
F5: QSGDLTR (SEQ ID NO:28);
(iii) ZFP, обозначенный 33074, содержит 6 цинк-пальцевых доменов, упорядоченных от F1 до F6, причем каждый цинк-пальцевой домен содержит распознающую спиральную область как изложено ниже:
F1: RSDNLSE (SEQ ID NO:9);
F2: KRCNLRC (SEQ ID NO:10);
F3: QSGDLTR (SEQ ID NO:28);
F4: QSGDLTR (SEQ ID NO:28);
F5: RSDNLSE (SEQ ID NO:9) и
F6: KRCNLRC (SEQ ID NO:10),
где полинуклеотид содержит аденоассоциированный вирусный вектор (AAV), введенный в 2x1010 векторных геномов, и также где репрессор транскрипционного фактора снижает экспрессию mHtt по меньшей мере на 85% в БХ-нейронах в стриатуме субъекта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что энергетический метаболизм в среднем шипиковом нейроне субъекта повышен и/или восприимчивость к апоптозу уменьшена в среднем шипиковом нейроне.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что происходит повышение внутриклеточных уровней АТФ в среднем шипиковом нейроне.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что у субъекта уменьшены двигательные дефекты.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что двигательный дефект включает хватание.
6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий определение уровней mHtt у субъекта.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что уровни mHtt определяют в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ).
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461990521P | 2014-05-08 | 2014-05-08 | |
US61/990,521 | 2014-05-08 | ||
US201462051724P | 2014-09-17 | 2014-09-17 | |
US62/051,724 | 2014-09-17 | ||
PCT/US2015/029748 WO2015171932A1 (en) | 2014-05-08 | 2015-05-07 | Methods and compositions for treating huntington's disease |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016147932A RU2016147932A (ru) | 2018-06-08 |
RU2016147932A3 RU2016147932A3 (ru) | 2018-12-25 |
RU2691102C2 true RU2691102C2 (ru) | 2019-06-11 |
Family
ID=54393014
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016147932A RU2691102C2 (ru) | 2014-05-08 | 2015-05-07 | Способы и композиции для лечения болезни хантингтона |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11110154B2 (ru) |
EP (1) | EP3139966B1 (ru) |
JP (1) | JP2017515819A (ru) |
KR (1) | KR102380324B1 (ru) |
CN (1) | CN106413760B (ru) |
AU (1) | AU2015255877B2 (ru) |
BR (1) | BR112016025849A2 (ru) |
CA (1) | CA2947035A1 (ru) |
HK (1) | HK1232141A1 (ru) |
MX (1) | MX2016014565A (ru) |
NZ (1) | NZ725542A (ru) |
RU (1) | RU2691102C2 (ru) |
WO (1) | WO2015171932A1 (ru) |
Families Citing this family (77)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0923225A2 (pt) | 2008-12-02 | 2016-10-04 | Chiralgen Ltd | metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo |
BR112012000828A8 (pt) | 2009-07-06 | 2017-10-10 | Ontorii Inc | Novas pró-drogas de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas |
WO2012039448A1 (ja) | 2010-09-24 | 2012-03-29 | 株式会社キラルジェン | 不斉補助基 |
EP3248982A1 (en) | 2011-07-19 | 2017-11-29 | Wave Life Sciences Ltd. | Thiosulfonate reagents for the synthesis of functionalized nucleic acids |
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
SG11201500243WA (en) | 2012-07-13 | 2015-04-29 | Shin Nippon Biomedical Lab Ltd | Chiral nucleic acid adjuvant |
RU2015104762A (ru) | 2012-07-13 | 2018-08-31 | Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. | Хиральный контроль |
PT2872485T (pt) | 2012-07-13 | 2021-03-05 | Wave Life Sciences Ltd | Grupo auxiliar assimétrico |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US20150166985A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting von willebrand factor point mutations |
EP3095461A4 (en) | 2014-01-15 | 2017-08-23 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator |
US10322173B2 (en) | 2014-01-15 | 2019-06-18 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
JPWO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
KR20230152178A (ko) | 2014-01-16 | 2023-11-02 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 디자인 |
CA2956224A1 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
WO2016033246A1 (en) | 2014-08-27 | 2016-03-03 | Caribou Biosciences, Inc. | Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency |
CN113699113A (zh) | 2014-09-16 | 2021-11-26 | 桑格摩治疗股份有限公司 | 用于造血干细胞中核酸酶介导的基因组工程化和校正的方法和组合物 |
CN112410339A (zh) | 2014-11-14 | 2021-02-26 | 沃雅戈治疗公司 | 调节性多核苷酸 |
JP2017535266A (ja) | 2014-11-14 | 2017-11-30 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症(als)を治療する組成物および方法 |
MX2017014446A (es) | 2015-05-12 | 2018-06-13 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulacion de expresion genica mediada por nucleasa. |
US9957501B2 (en) | 2015-06-18 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
CA2991301A1 (en) | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
MA43072A (fr) | 2015-07-22 | 2018-05-30 | Wave Life Sciences Ltd | Compositions d'oligonucléotides et procédés associés |
IL258030B (en) | 2015-09-23 | 2022-08-01 | Sangamo Therapeutics Inc | Htt suppressing factors and their uses |
US20190225955A1 (en) | 2015-10-23 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
EP3380622A4 (en) | 2015-11-23 | 2019-08-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING IMMUNITY |
US20170202931A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of neurologic disease |
EP3881857A1 (en) | 2016-02-18 | 2021-09-22 | The Penn State Research Foundation | Generating gabaergic neurons in brains |
MA45270A (fr) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Wave Life Sciences Ltd | Compositions d'oligonucléotides et procédés associés |
AU2017267665C1 (en) | 2016-05-18 | 2023-10-05 | Voyager Therapeutics, Inc. | Modulatory polynucleotides |
JP7220080B2 (ja) | 2016-05-18 | 2023-02-09 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | ハンチントン病治療組成物及び方法 |
WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
EP3500271A4 (en) * | 2016-08-19 | 2020-05-13 | Bluebird Bio, Inc. | GENOME EDITING ACTIVATORS |
SG10201913948PA (en) | 2016-08-24 | 2020-03-30 | Sangamo Therapeutics Inc | Engineered target specific nucleases |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
PE20190568A1 (es) | 2016-08-24 | 2019-04-22 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas |
US10960085B2 (en) | 2016-09-07 | 2021-03-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modulation of liver genes |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
WO2018075736A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
US20210285010A1 (en) * | 2016-10-31 | 2021-09-16 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for impeding transcription of expanded microsatellite repeats |
WO2018102665A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
IL269458B2 (en) | 2017-03-23 | 2024-02-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
CA3061612A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
SG11201909870SA (en) | 2017-05-05 | 2019-11-28 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
AU2018261003A1 (en) | 2017-05-05 | 2019-11-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating Huntington's Disease |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
EP3697906A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
CN112585276A (zh) | 2018-04-05 | 2021-03-30 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 产生表达重组受体的细胞的方法和相关组合物 |
CA3095084A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Juno Therapeutics, Inc. | T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods |
CN112313246A (zh) | 2018-04-18 | 2021-02-02 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于调节亨廷顿蛋白(htt)的锌指蛋白组合物 |
US11690921B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-07-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery of target specific nucleases |
JP2021532736A (ja) * | 2018-06-06 | 2021-12-02 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California | 神経幹細胞組成物および神経変性障害を処置するための方法 |
CN113226333A (zh) * | 2018-10-02 | 2021-08-06 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于调控Tau蛋白的方法和组合物 |
WO2020146805A1 (en) | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
EP3911349A4 (en) * | 2019-01-15 | 2023-01-18 | Sangamo Therapeutics, Inc. | HTT REPRESSORS AND THEIR USES |
MX2021011426A (es) | 2019-03-19 | 2022-03-11 | Broad Inst Inc | Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos. |
BR112021021200A2 (pt) | 2019-05-01 | 2021-12-21 | Juno Therapeutics Inc | Células expressando um receptor quimérico de um locus cd247 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos |
MX2021013219A (es) | 2019-05-01 | 2022-02-17 | Juno Therapeutics Inc | Celulas que expresan un receptor recombinante de un locus de tgfbr2 modificado, polinucleotidos relacionados y metodos. |
CN114286710A (zh) * | 2019-06-28 | 2022-04-05 | 宾州研究基金会 | 治疗亨廷顿病的方法和材料 |
US20210130828A1 (en) | 2019-11-01 | 2021-05-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Gin recombinase variants |
JP2023525304A (ja) | 2020-05-08 | 2023-06-15 | ザ ブロード インスティテュート,インコーポレーテッド | 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物 |
CN115835873A (zh) | 2020-05-13 | 2023-03-21 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 用于产生表达重组受体的供体分批细胞的方法 |
CN116234558A (zh) | 2020-06-26 | 2023-06-06 | 朱诺治疗学有限公司 | 条件性地表达重组受体的工程化t细胞、相关多核苷酸和方法 |
CA3189338A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-20 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Cationic lipids for use in lipid nanoparticles |
KR20230090367A (ko) | 2020-11-04 | 2023-06-21 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 변형된 불변 cd3 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 쇄 유전자좌로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포 및 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 |
WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
WO2024100604A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for manufacturing engineered immune cells |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100120900A1 (en) * | 2005-06-28 | 2010-05-13 | Medtronic, Inc. | Methods And Sequences To Preferentially Suppress Expression of Mutated Huntingtin |
US20130253040A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-26 | c/o Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for treating huntington's disease |
US20130336947A1 (en) * | 2010-10-15 | 2013-12-19 | Fundació Privada Centre De Regulació Genómica | Peptides and uses |
Family Cites Families (80)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4217344A (en) | 1976-06-23 | 1980-08-12 | L'oreal | Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres |
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4186183A (en) | 1978-03-29 | 1980-01-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis |
US4261975A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
US4485054A (en) | 1982-10-04 | 1984-11-27 | Lipoderm Pharmaceuticals Limited | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) |
US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US4774085A (en) | 1985-07-09 | 1988-09-27 | 501 Board of Regents, Univ. of Texas | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators |
US5422251A (en) | 1986-11-26 | 1995-06-06 | Princeton University | Triple-stranded nucleic acids |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5176996A (en) | 1988-12-20 | 1993-01-05 | Baylor College Of Medicine | Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
AU7979491A (en) | 1990-05-03 | 1991-11-27 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5420032A (en) | 1991-12-23 | 1995-05-30 | Universitge Laval | Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence |
US5792632A (en) | 1992-05-05 | 1998-08-11 | Institut Pasteur | Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
CA2681922C (en) | 1994-01-18 | 2012-05-15 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
WO1995025809A1 (en) | 1994-03-23 | 1995-09-28 | Ohio University | Compacted nucleic acids and their delivery to cells |
US5585245A (en) | 1994-04-22 | 1996-12-17 | California Institute Of Technology | Ubiquitin-based split protein sensor |
ATE407205T1 (de) | 1994-08-20 | 2008-09-15 | Gendaq Ltd | Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna |
GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
US5928638A (en) | 1996-06-17 | 1999-07-27 | Systemix, Inc. | Methods for gene transfer |
US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
US6342345B1 (en) | 1997-04-02 | 2002-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation |
GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
US6140081A (en) | 1998-10-16 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for GNN |
US7013219B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
AU776576B2 (en) | 1999-12-06 | 2004-09-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
DE60143192D1 (de) | 2000-02-08 | 2010-11-18 | Sangamo Biosciences Inc | Zellen zur entdeckung von medikamenten |
US20020061512A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-05-23 | Kim Jin-Soo | Zinc finger domains and methods of identifying same |
US6855314B1 (en) * | 2000-03-22 | 2005-02-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells |
WO2001088197A2 (en) | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for interaction trap assays |
JP2002060786A (ja) | 2000-08-23 | 2002-02-26 | Kao Corp | 硬質表面用殺菌防汚剤 |
US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
GB0108491D0 (en) | 2001-04-04 | 2001-05-23 | Gendaq Ltd | Engineering zinc fingers |
EP1421177A4 (en) | 2001-08-20 | 2006-06-07 | Scripps Research Inst | ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN |
US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
ATE347593T1 (de) | 2002-01-23 | 2006-12-15 | Univ Utah Res Found | Zielgerichtete chromosomale mutagenese mit zinkfingernukleasen |
WO2003080809A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
US7074596B2 (en) | 2002-03-25 | 2006-07-11 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues |
EP1581610A4 (en) | 2002-09-05 | 2009-05-27 | California Inst Of Techn | USE OF CHIMERIC NUCLEASES TO STIMULATE GENE TARGETING |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US20060239966A1 (en) | 2003-10-20 | 2006-10-26 | Tornoee Jens | In vivo gene therapy of parkinson's disease |
US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
EP2207033B1 (en) * | 2004-04-15 | 2014-06-18 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Neural proteins as biomarkers for nervous system injury and other neural disorders |
US20060063231A1 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
CA2607104A1 (en) | 2005-05-05 | 2006-11-16 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences |
EP2341135A3 (en) | 2005-10-18 | 2011-10-12 | Precision Biosciences | Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
WO2007139898A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Variant foki cleavage half-domains |
JP5551432B2 (ja) | 2006-05-25 | 2014-07-16 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 遺伝子不活性化のための方法と組成物 |
US7837668B2 (en) | 2006-10-10 | 2010-11-23 | Ceregene, Inc. | Needle assembly for use in delivering precise dosages of proteinaceous pharmaceutical compositions and methods for use of same |
US9284366B2 (en) * | 2006-11-02 | 2016-03-15 | The General Hospital Corporation | Anti-acetylated huntingtin antibodies and uses therof |
ATE489465T1 (de) | 2007-04-26 | 2010-12-15 | Sangamo Biosciences Inc | Gezielte integration in die ppp1r12c-position |
EP2014769B1 (en) * | 2007-06-18 | 2010-03-31 | Commissariat à l'Energie Atomique | Reversible siRNAa-based silencing of mutated and endogenous wild-type huntingtin gene and its application for the treatment of Huntington's disease |
ES2500515T3 (es) | 2007-06-19 | 2014-09-30 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Síntesis y utilización de análogos de fosforotioato antiinversos de la caperuza de ARN mensajero |
EP2188384B1 (en) | 2007-09-27 | 2015-07-15 | Sangamo BioSciences, Inc. | Rapid in vivo identification of biologically active nucleases |
US8597912B2 (en) | 2008-06-10 | 2013-12-03 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for generation of Bax-and Bak-deficient cell lines |
CA2734235C (en) | 2008-08-22 | 2019-03-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
CA2745031C (en) | 2008-12-04 | 2018-08-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
EP2727600B1 (en) * | 2009-07-28 | 2019-03-27 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Zinc finger fusion proteins for repressing a huntington gene |
US8586526B2 (en) | 2010-05-17 | 2013-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | DNA-binding proteins and uses thereof |
EP4328304A2 (en) | 2010-02-08 | 2024-02-28 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Engineered cleavage half-domains |
US9567573B2 (en) | 2010-04-26 | 2017-02-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a Rosa locus using nucleases |
KR102209330B1 (ko) | 2011-09-21 | 2021-01-29 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 이식 유전자 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물 |
US9222105B2 (en) | 2011-10-27 | 2015-12-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modification of the HPRT locus |
WO2013074999A1 (en) | 2011-11-16 | 2013-05-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified dna-binding proteins and uses thereof |
US9873894B2 (en) | 2013-05-15 | 2018-01-23 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treatment of a genetic condition |
EP3929279A1 (en) | 2014-03-18 | 2021-12-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression |
-
2015
- 2015-05-07 CN CN201580024010.1A patent/CN106413760B/zh active Active
- 2015-05-07 JP JP2016566652A patent/JP2017515819A/ja active Pending
- 2015-05-07 WO PCT/US2015/029748 patent/WO2015171932A1/en active Application Filing
- 2015-05-07 AU AU2015255877A patent/AU2015255877B2/en active Active
- 2015-05-07 EP EP15789214.2A patent/EP3139966B1/en active Active
- 2015-05-07 BR BR112016025849A patent/BR112016025849A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-05-07 NZ NZ725542A patent/NZ725542A/en unknown
- 2015-05-07 RU RU2016147932A patent/RU2691102C2/ru active
- 2015-05-07 US US14/706,747 patent/US11110154B2/en active Active
- 2015-05-07 KR KR1020167031778A patent/KR102380324B1/ko active IP Right Grant
- 2015-05-07 MX MX2016014565A patent/MX2016014565A/es unknown
- 2015-05-07 CA CA2947035A patent/CA2947035A1/en active Pending
-
2017
- 2017-06-13 HK HK17105818.0A patent/HK1232141A1/zh unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100120900A1 (en) * | 2005-06-28 | 2010-05-13 | Medtronic, Inc. | Methods And Sequences To Preferentially Suppress Expression of Mutated Huntingtin |
US20130336947A1 (en) * | 2010-10-15 | 2013-12-19 | Fundació Privada Centre De Regulació Genómica | Peptides and uses |
US20130253040A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-26 | c/o Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for treating huntington's disease |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GARRIGA-CANUT et al. Synthetic zinc finger repressors reduce mutant huntingtin expression in the brain of R6/2 mice.// Proc Natl Acad Sci USA., 2012, vol. 109, no. 45, рр. E3136-45. * |
MOCHEL et al. Energy deficit in Huntington disease: why it matters.// J Clin Invest., 2011, vol. 121, no. 2, pp 493-9. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20170005811A (ko) | 2017-01-16 |
CN106413760B (zh) | 2020-01-14 |
NZ725542A (en) | 2024-02-23 |
CN106413760A (zh) | 2017-02-15 |
WO2015171932A1 (en) | 2015-11-12 |
RU2016147932A (ru) | 2018-06-08 |
AU2015255877B2 (en) | 2020-03-26 |
AU2015255877A1 (en) | 2016-11-10 |
KR102380324B1 (ko) | 2022-03-30 |
EP3139966A1 (en) | 2017-03-15 |
RU2016147932A3 (ru) | 2018-12-25 |
US11110154B2 (en) | 2021-09-07 |
CA2947035A1 (en) | 2015-11-12 |
EP3139966B1 (en) | 2020-11-18 |
JP2017515819A (ja) | 2017-06-15 |
MX2016014565A (es) | 2017-05-23 |
US20150335708A1 (en) | 2015-11-26 |
EP3139966A4 (en) | 2018-01-03 |
BR112016025849A2 (pt) | 2017-10-17 |
HK1232141A1 (zh) | 2018-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2691102C2 (ru) | Способы и композиции для лечения болезни хантингтона | |
AU2020204035B2 (en) | HTT Repressors And Uses Thereof | |
KR20210069692A (ko) | 조작된 유전자 조정제 | |
JP2021500079A (ja) | 希少疾患の処置のための方法および組成物 | |
JP7292204B2 (ja) | タウモジュレーターならびにその送達のための方法および組成物 | |
US20230382962A1 (en) | Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene | |
US20220064237A1 (en) | Htt repressors and uses thereof | |
CN110214184B (zh) | τ蛋白调节剂以及用于其递送的方法和组合物 | |
RU2789459C2 (ru) | Модуляторы тау и способы и композиции для их доставки |