WO2020179931A1 - ハイスループット遺伝子編集技術 - Google Patents

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弘嗣 淺原
遼太 栗本
隆英 松島
大樹 堤
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a gene editing method, and more particularly to a method of performing gene editing of tissue stem cells in a short period of time.
  • Genome editing is a technique that uses a site-specific nuclease to modify the target gene.
  • the nuclease ZFN, TALEN, CRISPR / Cas9 and the like are used. Compared with conventional genetic engineering and gene therapy, it has a very wide range of applications, and the development of therapeutic methods that apply genome editing technology is also underway (Non-Patent Document 1).
  • CRISPR for example, CRISPR Therapeutics (Switzerland) is developing a treatment method (CTX001) for sickle cell anemia using genome editing (Non-patent documents 2 and 3).
  • CRISPR for example, CRISPR Therapeutics (Switzerland) is developing a treatment method (CTX001) for sickle cell anemia using genome editing (Non-patent documents 2 and 3).
  • Sickle cell anemia is caused by mutations in the HBB gene that give instructions to make hemoglobin, a molecule within red blood cells that carries oxygen. In sickle cell anemia, this mutation results in a hemoglobin deficiency that reduces the oxygen transport function of red blood cells.
  • CTX001 aims to increase the production of fetal hemoglobin (HbF) in the erythrocytes of patients by altering genes using gene editing technology.
  • Fetal hemoglobin is a type of hemoglobin that occurs naturally in newborns and is later replaced by adult hemoglobin. However, at times fetal hemoglobin may persist in adults, protecting people from sickle cell anemia and ⁇ -thalassemia.
  • hematopoietic stem cells which are bone marrow-derived cells that give rise to the red blood cells and white blood cells that make up the blood, are taken from the patient and then genetically modified to produce high levels of fetal hemoglobin. .. More specifically, a genetic modification that disrupts the BCL11A gene, which is a transcriptional repressor of HbF, is performed. It is believed that such treated cells are then returned to the patient's body to produce large amounts of fetal hemoglobin-containing red blood cells in the patient's body, thereby overcoming the hemoglobin deficiency caused by the disease. ing.
  • the present inventors have developed a method for producing gene-edited undifferentiated tissue stem cells within a short period of time by applying genome editing technology. By using this method, it is possible to provide a method for treating and / or preventing a disease using gene-edited undifferentiated tissue stem cells.
  • the present invention more specifically includes the following aspects.
  • a method for producing a gene-edited tissue stem cell which comprises a step of editing a gene sequence of a target gene in the tissue stem cell, and a step of selecting a tissue stem cell having a gene sequence edited.
  • Aspect 2 The method of embodiment 1, further comprising the step of adding a tag to the gene sequence of the target gene and/or activating gene expression of the target gene in tissue stem cells.
  • Aspect 3 The method of aspect 1 or 2, wherein the tissue stem cells are tissue stem cells isolated from a patient.
  • Aspect 4 The method according to any one of aspects 1 to 3, wherein the gene sequence is edited ex vivo.
  • Aspect 14 The method according to any of aspects 1 to 13, wherein the genetically engineered tissue stem cells are cells for use in the treatment of a disease.
  • the disease is a blood disorder or an immune disorder.
  • Blood or immune disorders are ADA deficiency, X-linked severe combined immunodeficiency (SCID), other SCID, Wiskott-Aldrich syndrome, chronic granulomatosis, leukocyte adhesion deficiency, familial hemophagocytic syndrome, X-linked 16.
  • the target gene is selected from the group consisting of ADA, IL2RG, WAS, CYBB, INTGB2, UNC13D, CD40L, SAP/SH2D1A, BTK, STAT3, and hemoglobin.
  • a therapeutic agent for a blood disease or an immune disease which comprises hematopoietic stem cells within 48 hours after isolation from a living body, in which the gene sequence of the target gene has been edited.
  • Blood or immune disorders are ADA deficiency, X-linked severe combined immunodeficiency (SCID), other SCID, Wiskott-Aldrich syndrome, chronic granulomatosis, leukocyte adhesion deficiency, familial hemophagocytic syndrome, X-linked Hyper-IgM syndrome, X-linked lymphoproliferative disorder, X-linked agammaglobulinemia, Hyper-IgE syndrome, sickle cell disease, and ⁇ -thalassemia, therapeutic agent according to aspect 18, selected from the group consisting of ..
  • Aspect 20 20.
  • a method for producing gene-edited tissue stem cells The process of editing the gene sequence of a target gene in tissue stem cells, The process of adding a tag to the gene sequence of a target gene, Including the step of activating the gene expression of the target gene in the tissue stem cell and the step of selecting the tissue stem cell whose gene sequence has been edited.
  • a method in which the step of editing the gene sequence of a target gene in a tissue stem cell and the step of adding a tag to the gene sequence of the target gene are simultaneously performed using a CRISPR / Cas system or a TALEN system.
  • the target gene is a gene that is not constantly expressed in tissue stem cells. Only in cells in which the gene sequence of the target gene has been edited and the tag has been added, the target protein labeled with the tag is produced by the step of activating the gene expression of the target gene, and the gene sequence is edited using the tag.
  • 21. The method of aspect 21, wherein the tissue stem cells are screened.
  • 21 or 22 wherein the histiocytes are histiocytes isolated from a patient, and the genetically engineered histiocytes are sorted within 48 hours of isolation of the cells from the patient.
  • tissue stem cells can be produced within a short period of time. Then, using such tissue stem cells, it becomes possible to treat and/or prevent diseases which have been difficult to intervene.
  • FIG. 1 is an electrophoretogram of the PCR product treated with T7 endonuclease I (T7EI) produced in Example 1 (1% agarose gel). From left to right, marker lanes, DNA treated with T7EI, DNA not treated with T7EI.
  • FIG. 2 shows the sequencing results of the truncated PCR products generated in Example 1 (FASMAC, Big Dye terminator v3.1, 3130xl Genetic Analyzer). Upper: Sequence result of uncut DNA. Bottom: Sequence result of cleaved DNA.
  • FIG. 3 is an electropherogram of a PCR product generated in Example 2 (1% agarose gel).
  • FIG. 4 shows the sequencing results of the PCR products produced in Example 2. It can be seen that the tag sequence was introduced into the target site.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting of the protein extracted from the mutated Nano-Glo positive cells in Example 4 with the Flag antibody. It can be seen that the tag sequence is introduced and functions as a peptide tag.
  • FIG. 6 shows the sequencing results of the PCR products produced in Example 4. It can be seen that the mutation was introduced into the target sequence at the target site.
  • FIG. 7 shows the result of Lytic Detection in Example 5.
  • FIG. 8 shows the results of sequencing the mutagenized cells cloned in Example 6. It can be seen that the target sequence has been mutated.
  • FIG. 9 shows the result of Lytic Detection in Example 6. It can be seen that the activation increases the Luciferase activity of HiBIT, the mutation is introduced, and the change is coordinated by the activation of the gene.
  • FIG. 10 shows the sequencing results of the PCR products after the mutation was restored in Example 6. It can be seen that the target sequence has overlapping waveforms and contains cells that have returned the mutation.
  • FIG. 11 shows the result of agarose gel electrophoresis of the PCR product generated in Example 7.
  • FIG. 12 shows the sequencing results of the PCR products produced in Example 7. The results shown in FIGS. 11 and 12 show that the target tag sequences overlap at the target site, and it can be seen that the tag sequences were introduced with an efficiency of about 50%.
  • FIG. 13 is a fluorescence micrograph of cells in which GFP1-10 was introduced using AAV after the introduction of mutation in Example 7. It is found that there are cells in which GFP-11 was introduced into cells and bound to AAV-derived GFP1-10 to obtain GFP fluorescence.
  • a part of the embodiment of the present invention relates to a method for producing a gene-edited tissue stem cell, which can accurately select a gene-edited tissue stem cell at the single cell level in a short period of time.
  • the method of the present invention comprises a step of editing a gene sequence of a target gene in a tissue stem cell, a step of selecting a tissue stem cell having an edited gene sequence, and optionally a step of adding a tag to the gene sequence of the target gene. And / or include the step of activating gene expression of the target gene in tissue stem cells.
  • Genome editing is a technique for introducing mutations (substitutions, insertions, deletions) into arbitrary genome sequences using artificial restriction enzymes that can specifically cleave target sites in the genome.
  • NHEJ Non-Homologous End Joining
  • Base pair deletion and insertion occur.
  • the target gene is finally Knock-out due to frame shift or the like.
  • HDR Homology Dependent Repair
  • editing of a gene sequence can be either knockout that disrupts the gene (Knock-out) or knock-in that replaces / inserts the sequence to be introduced / modified, but is preferable.
  • Knock-out knock-out that disrupts the gene
  • knock-in that replaces / inserts the sequence to be introduced / modified, but is preferable.
  • a Knock-in using a desired template sequence whereby, for example, a sequence variation that causes a disease or the like is corrected to a normal sequence or a harmless sequence.
  • the main editing tools that can be used for editing the gene sequence of the target gene include, for example, ZFN system (Zinc Finger Nucleases), TALEN system (Transcription Activator Like Effector Nucleases), and CRISPR.
  • ZFN system Zinc Finger Nucleases
  • TALEN system Transcription Activator Like Effector Nucleases
  • CRISPR. / Cas system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR Associated Protein 9 and the like can be mentioned.
  • These systems are highly specific genome editing composed of a nuclease responsible for breaking the DNA duplex of the genome, a guide molecule that guides the nuclease to a target site on the genome, and optionally template DNA. It is a tool.
  • the template DNA may be single-stranded DNA or double-stranded DNA.
  • the ZFN system (see, for example, Kim, Y. G., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1156-1160.) is easy to use for the DNA binding domains of many transcription factors. It is an artificial chimeric protein composed of two functional domains, Zinc-Finger, which is one of the DNA-binding motifs present in, and the FokI nuclease domain, and is a genome using a pair of ZFNs designed to sandwich the target sequence. Make an edit. In the ZFN system, the DNA binding domain Zinc-Finger recognizes a specific gene sequence on the target gene, and the DNA cleavage domain FokI nuclease causes double-strand break with high specificity.
  • the TALEN system Similar to ZFN, the TALEN system (see, for example, Cermak T, et al., 2011, Nucleic Acids Res 39: e82) also has a FokI nuclease domain in the DNA binding domain (TAL effector (TALE)) that recognizes arbitrary base sequences. Is an artificial chimeric protein in which The DNA-binding domain of TALEN recognizes 15 to 20 bases, and uses a pair of TALENs designed for each of the sense strand and antisense strand so as to sandwich a spacer of 14 to 20 bases that is the target sequence of FolI. Perform heavy chain cleavage. According to the TALEN system, a target sequence more specific than ZFN can be cleaved, and theoretically any genomic sequence can be targeted. The TALEN system is also said to be superior to the CRISPR / CAS system in suppressing off-target mutations.
  • TALE TAL effector
  • the CRISPR/CAS system centered on CRISPR/CAS9 (see Cong, L. et al., 2013, Science, 339, 819-823.) is used for recognizing proteins and DNA by ZFN and TALEN described above. , Whereas complementary binding of RNA and DNA is used for target sequence recognition.
  • a guide RNA complex of crRNA and tracrRNA or sgRNA obtained by single-stranding them
  • Cas9 nuclease responsible for double-strand breaks to the target sequence and CAS9-RNA.
  • the complex cleaves a DNA sequence complementary to the guide RNA.
  • RNA-dependent DNA nuclease Cpf1 is used in the V-type CRISPR / CAS system.
  • the V-type CRISPR / CAS-based guideRNA is composed only of crRNA. Since the guideRNA and the nuclease exist separately and function in the CRISPR / Cas system, it is very convenient in that it is possible to introduce multiple mutations by introducing a plurality of guideRNAs.
  • components used in the CRISPR/CAS system Cas9gRNA, Cas9 protein, Cas9 plasmid, Cas9 carrier DNA, buffer, etc.
  • components used in the CRISPR/Cas12a system Cas12a ( Cpf1) gRNA, Cas12a (Cpf1) protein, Cas12a (Cpf1) carrier DNA, buffer, etc.
  • CRISPR direct http://crispr.dbcls.jp
  • CRISPR direct http://crispr.dbcls.jp
  • RNA for example, mMessage mMachine (trademark) T7 UTRA Transcription Kit (Ambion, AM1345), MEGAclear (trademark) Transcription Clean-Up Kit (Ambion, AM1908) and the like can be used.
  • tracrRNA 100 ⁇ M, IDT, 1072532
  • Nuclease-free Duplex Buffer 11-01-03-01
  • sgRNA using gRNAvector the target sequence is introduced by the inverse PCR method to prepare gRNA template DNA.
  • RNA can be synthesized using mMessagemMachine(TM) T7UTRA Transcription Kit (Ambion, AM1345) and purified using MEGAclear(TM) Transcription Clean-Up Kit (Ambion, AM1908) to obtain 100 ⁇ M.
  • TM messagemMachine
  • MEGAclear(TM) Transcription Clean-Up Kit Ambion, AM1908
  • nuclease is used as the recombinant protein
  • SpCas9 IDT, 1074182
  • cpf1 IDT, 1081069
  • nuclease is used as RNA, for example, it is described in the literature (Nishimasu H, et al. Science. 2018; 361: 1259-1262. Esvelt KM, et al. Nat Methods.
  • RNA can be synthesized in AM1345) and purified by the ethanol precipitation method.
  • a guide molecule-nuclease complex, or a guide RNA and/or nuclease expression plasmid or a virus in which the expression plasmid is packaged is introduced into a target cell and guided in the target cell.
  • the molecule-nuclease complex, or guide RNA and/or nuclease may be expressed, or the nuclease or guide molecule-nuclease complex may be introduced into a target cell as mRNA or protein, and guide RNA as RNA. May be good.
  • an agent that induces expression may act on the target cells.
  • nuclease or guide molecule-nuclease complex is used as mRNA or protein, and guide RNA is used as RNA. It is preferable to introduce as.
  • the method for introducing these RNA, protein, plasmid, or package virus is not particularly limited, and methods known to those skilled in the art can be used, but non-limiting examples include calcium phosphate precipitation, lipofection, polymer capsules, Examples include fine particle guns, microinjections, and electroporation. Electroporation is generally used because of its balance of simplicity and introduction efficiency.
  • Electroporation for introducing RNA, protein, and DNA into cells can be performed using, for example, Nepa21 pulse generator (NepaGene).
  • Nepa21 pulse generator NepaGene
  • For power transmission for example, two rectangular electric pulses (225V, 2ms width, 50ms interval) are transmitted, followed by five pulses (30V, 50ms width, 50ms interval).
  • 2 ml of HBSS+ medium can be added to the electroporated mixture, and the mixture can be washed by centrifugation at 800 rpm for 3 minutes.
  • the cells may be cultured for about 24 hours using the medium used for collecting hematopoietic stem cells.
  • by detecting the GFP signal or the like at the single cell level it is possible to select cells in which gene editing has been performed accurately.
  • RNA and protein under sterilization As an animal experiment facility.
  • SPF section As a means for efficiently extracting cells into which a mutation has been introduced, a device for detecting and selecting a luminescent tag can be suitably used.
  • the method according to the present invention includes a step of selecting cells in which the target gene is edited from a pool of tissue stem cells at the single cell level after editing the target gene in the target cell.
  • Examples of the method for selecting cells in which the target gene has been edited include a method based on the nucleic acid sequence of the edited target gene and a method based on the expression of the edited target gene. From the perspective of accurately selecting cells that can normally express the edited target gene at the single cell level, a method based on the expression of the target gene, for example, by detecting the expression of the transiently activated target gene. It is preferable to carry out.
  • a system utilizing the detection of fluorescence or phosphorescence can be used for the detection of the expression of the activated target gene.
  • the target gene is often a gene expressed when a tissue stem cell differentiates into each corresponding tissue cell and exerts various functions. That is, in many cases, the target gene is a gene that is not constantly expressed in tissue stem cells. Therefore, in order to select cells in which the target gene has been edited based on the expression of the target gene, it is required to transiently activate the expression of the target gene.
  • the method of the invention may further comprise the step of activating gene expression of the target gene in tissue stem cells. Such activation of gene expression can be transient. By this step, only cells that have been edited so that the target gene can be normally expressed can be selected at the single cell level. By this step, it is also possible to exclude cells in which unintended editing, such as off-target mutation, has occurred in the step of editing the gene sequence.
  • an activation tool for transiently activating a target gene for example, a method of acting a transcription activator (VP64 etc.) on a promoter region existing upstream of the target gene can be mentioned.
  • a method that can be performed substantially simultaneously with the step of editing the target gene described above or the step of tagging the target gene described below is preferable.
  • activation tools include CRISPRa (CRISPR activation) system and TALEN effector system.
  • the CRISPRa system (see, for example, Silvana Konermann et al. Nature. 2015; Jan 29;6(7536):583-588) is simply a deadCas9 (dCas9) nuclease that lacks DNA cleavage activity and a transcriptional activator.
  • dCas9-transcriptional activator complex fused with (VP16, VP64, etc.) and a guide RNA that targets the promoter site of the target gene
  • the dCas9-transcriptional activator complex is introduced at the transcription start site of the target gene. It is a system that induces the body and activates the expression of target genes.
  • an expression vector of dCas9-transcriptional activator complex and guideRNA, virus particles packaged with the expression vector, or the like may be introduced into a target cell, or the dCas9-transcriptional activator complex may be used as a protein.
  • Guide RNA may be introduced into target cells as RNA, respectively, but in this embodiment, dCas9-transcriptional activator complex is used as a protein and guide RNA is used as RNA from the viewpoint of rapid activation and safety. More preferably, it is introduced into target cells.
  • a TAL effector system or the like in which a TAL DNA binding domain targeting the promoter region of the target gene is fused with a transcriptional activity factor (VP16, VP64, etc.).
  • a transcriptional activity factor VP16, VP64, etc.
  • http://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale can be used.
  • http://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale can be used.
  • refer to the method described in the literature (Matsubara, Y, et al. Sci Rep, 4: 5043, 2014) and set the TAL effector to TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https://tale-nt.cac.cornell.edu/).
  • the method for detecting the expression of the target gene can be appropriately selected depending on the characteristics of the target gene, and examples thereof include a method using an antibody reactive with a membrane protein and a method for detecting a secretory protein by its enzymatic activity.
  • tissue stem cells whose gene sequence has been edited can be selected using a tag added to the gene sequence.
  • a tag sequence that is expressed only when the target gene is edited into the target normal gene, it is possible to accurately select only cells that normally express the target gene at the single-cell level. Can be done.
  • tag sequences are not particularly limited, but are peptide or polypeptide tags (FLAG, HA, His, Myc, V5, S, Trx, etc.), reporter genes (Luciferase, etc.), fluorescent proteins (GFP, etc.). RFP, Venus, etc.), etc.
  • the Venus sequence is created by introducing a homologous gene of the target gene into pVenus vector, using the method described in the literature (Matsubara, Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014) as a template DNA. be able to.
  • a tag can be detected using a labeled antibody, fluorescence, luminescence, or the like.
  • small molecules such as peptides (FLAG, HA, etc.) that cause less damage to cells, the HiBiT system (Promega) described later, and the like are preferable from the viewpoint of live cell detection and mutation introduction efficiency.
  • the tag is a small molecule such as a peptide from the viewpoint of suppressing an unexpected effect on the target cell.
  • tags include the HiBiT system (Promega) and the like. This system uses an 11-amino acid peptide tag (HiBiT) as a tag and uses a luciferase fragment (LgBiT) that binds to the tag for detection, so the effect on target cells is minimal and the target cells are highly sensitive. Can be detected.
  • the tagging tool for adding such a tag sequence to the target gene sequence is not particularly limited, and may be the same as the above-mentioned editing tool, for example.
  • the tagging tool comprises guide RNA targeting the target gene, Cas nuclease, and template DNA for tag sequence insertion.
  • Such a tagging tool can also be introduced into a target cell by the same method as the above-mentioned editing tool and activation tool.
  • the position where the tag is introduced can be any site at the N-terminal, C-terminal, or central portion of the target gene. From the viewpoint that the expression of intact protein of the target gene can be detected, it is also preferable to introduce it on the C-terminal side.
  • “combined” means performing the steps from editing to selection in a short period of time during which the target tissue stem cells can be maintained in vitro.
  • the activation tool (activation tool), the editing tool (correction tool), and the tagging tool (tagging tool) can be introduced into the target cell substantially at the same time.
  • the genome editing technology that combines the activation tool (activation tool), the editing tool (correction tool), and the tagging tool (tagging tool) is referred to as "ACT genome editing”.
  • ACT genome editing for example, ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas-based editing tools that target the editing site of the target gene and the translation region (C-terminal or N-terminal, or within the translation region) of the target gene are targeted.
  • ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas-based tagging tools and ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas-based activation tools that target the promoter site of the target gene are introduced into the target cells substantially simultaneously. ..
  • the same system may be used for the editing tool and the tagging tool. By doing so, the introduction of multiple mutations (editing and tagging of the target gene) and the expression of the edited target gene can be performed in an extremely short time. As a result, it is possible to accurately select a tissue stem cell in which a target gene is precisely edited in a short period of time.
  • the "short period” may be a period in which the target tissue stem cells can be maintained in vitro, but is preferably 1 week or less, more preferably 3 days or less (72 hours or less), for example 2 days or less ( 48 hours or less, 36 hours or less, 24 hours or less, or 18 hours or less).
  • “substantially simultaneously” means within a few hours (for example, within 2 or 3 hours), and considering the ease of work, it is possible to introduce an activation tool, an editing tool, and a tagging tool at the same time. Although preferable, the order of introduction may be changed or the time may be shifted to improve the efficiency/accuracy of gene editing/gene expression.
  • all components used for activation tools, editing tools, and tagging tools may be introduced into cells in a single electroporation, or time may be required after introducing components used for editing tools and tagging tools. You may open the space and introduce the components used for the activation tool.
  • tissue stem cell whose gene sequence has been edited within 2 days, preferably within 24 hours after isolation of the cell from a patient.
  • the method of selecting the tissue-edited cells that have undergone gene editing at the single cell level includes, but is not limited to, the limiting dilution method and the cell sorter method.
  • the tissue stem cells having the edited gene sequence may be selected using the tag added to the gene sequence.
  • the tag may constitute part or all of a system that emits fluorescence or phosphorescence.
  • the tag for example, the HiBiT system of Promega Corp. (Wisconsin, USA) can be used as described above.
  • tissue stem cells In the methods according to the invention, gene sequence editing is usually performed ex vivo in isolated tissue stem cells.
  • Tissue stem cells also called tissue-specific stem cells or somatic stem cells
  • tissue-specific stem cells are based on the site of origin of the cells, for example, skin system (epidermal stem cells, hair follicle stem cells, etc.), digestive system (pancreatic (common) stem cells, hepatic stem cells, etc.) ), Myeloid (hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells (including muscle satellite cells, etc.), etc.), nervous system (nerve stem cells, retinal stem cells, etc.), etc.
  • tissue stem cells to which the method according to the present invention can be applied are not particularly limited, but are particularly effective in the myeloid system, particularly hematopoietic stem cells, because of the pathophysiology of the disease, the established transplantation method, and the tissue colonization of the transplanted cells. is there.
  • Tissue stem cells may be obtained by isolating them from the cells of each tissue from which they are derived, or by inducing differentiation from more undifferentiated pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • isolation from cells of each tissue from which it is derived is preferable.
  • hematopoietic stem cells can be obtained isolated from bone marrow, cord blood, and peripheral blood. Such an isolation method is not particularly limited, and a method known to those skilled in the art can be used. The method for obtaining hematopoietic stem cells is described in, for example, the literature (Bak RO, et al. Nat Protoc.
  • the bone marrow fluid is centrifuged (1500 rpm, 5 minutes, 4 ° C) to remove the upper sperm, and 1 mL of erythrocyte lysis medium (TakaraBio, 786-649) and RPMI-1640 medium (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , 189-02025) Add 9 ml, further centrifuge (1500 rpm, 5 minutes, 4 ° C) to remove erythrocytes, and select cells washed with HBSS + medium by lineage negative selection using an antibody.
  • MagniSort TM Human Hematopoietic Lineage Depletion Kit (Thermofisher Scientific, 8804-6836-74) can be used.
  • mice hematopoietic stem cells Extraction of mouse hematopoietic stem cells is described, for example, in the literature (Ema H, et al. Nat Protoc. 2006; 1 (6): 2979-87, Gundry MC, et al. Cell Rep. 2016; 17: 1453-61, Hetzel M. , et al. Blood. 2018;131(5):533-545). Specifically, bilateral femurs and tibias of mice are collected and collected in a 6 cm dish containing about 6 ml of HBSS + medium containing 2% fetal bovine serum (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 082-09365).
  • Both epiphyses are dissected, a 25 G needle is placed in the cut fragment, extruded with HBSS + medium, and cells are collected through a 70 ⁇ m nylon cell strainer (FALCON, 352350).
  • Erythrocyte lysing medium (Takara Bio, 786-649) 1 mL and RPMI-1640 medium (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 189-02025), 10% fetal bovine serum, were removed by centrifugation (1500 rpm, 5 minutes, 4 ° C). Red blood cells are removed by adding 9 ml of serum and further centrifuging (1500 rpm, 5 minutes, 4°C).
  • the cells washed with HBSS+ medium are subjected to lineage negative selection using an antibody.
  • administer 2 ⁇ l of the following antibody per 1.0 ⁇ 10 7 cells Biotin anti-mouse Ter-119 / Erythroid Antibody (BioLegend, 79748), Biotin anti-mouse CD11b Antibody (BioLegend, 79749), Biotin anti- mouse Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) Antibody (BioLegend, 79750), Biotin anti-mouse NK-1.1 Antibody (BioLegend, 108703), Biotin anti-mouse CD45R / B220 Antibody (BioLegend, 79752), Biotin anti -mouse CD127(IL-7R ⁇ ) Antibody (BioLegend, 135005), Biotin anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend, 79751)).
  • the culture medium was StemSpan TM SFEM medium (STEM CELL Technologies, 09600), L-glutamine (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 073-05391), mouse stem cell factor (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 196-15581). , Thrombopoietin (R & D, 488-TO-005), insulin-like growth factor-2 (Cosmo Bio, 100-14), fibroblast growth factor (Fuji Film Wako Pure Chemicals, 062-06041) at 200 mmol/L, 100 ng, respectively. Adjust to the final concentration of / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ng / ml, 100 ng / ml, 1 mM.
  • Extraction of human hematopoietic stem cells can be performed, for example, by literature (Bak RO, et al. Nat Protoc. 2018;13(2):358-376, Forraz N, et al. Stem Cells. 2004;22(1):100-108. .) The described method can be used as a reference.
  • human bone marrow fluid is centrifuged (1500 rpm, 5 minutes, 4° C.) to remove the supernatant, and 1 mL of red blood cell lysing medium (Takara Bio, 786-649) and RPMI-1640 medium (Fuji Film Wako Pure) Drugs, 189-02025), add 9 ml of 10% fetal bovine serum, and further centrifuge (1500 rpm, 5 minutes, 4 ° C) to remove erythrocytes. Cells washed with HBSS + medium are subjected to lineage negative selection using an antibody.
  • MagniSort TM Human Hematopoietic Lineage Depletion Kit (Thermofisher Scientific, 8804-6836-74) is used. Wash with HBSS + medium, suspend in 100 ⁇ l of culture medium per 1 ⁇ 10 6 cells, and incubate at 37 ° C. under 5% CO 2 (1 to 24 hours).
  • the culture medium used IL-6 (PeproTech, 200-06), StemRegenin1 (CellagenTech, C7710), UM171 (StemCell Technologies, 72914), Flt3L (PeproTech) using StemSpan (trademark) SFEMII culture medium (StemCell Technologies, 9655).
  • the tissue stem cells are preferably tissue stem cells isolated from the patient.
  • tissue stem cells isolated from the patient By using a patient-derived tissue stem cell, the problem of GVHD due to the presence or absence of a donor or transplantation can be avoided even when the tissue stem cell having a gene edited by the method of the present invention is used for treating a patient. Further, since the pretreatment is mild, there is an advantage that the burden on the patient is small.
  • the method according to the present invention may further include a step of expanding the selected tissue stem cells, if necessary.
  • the basal medium includes inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins, fatty acids, etc.
  • the basal medium includes SFEM medium, SFEMII, D-MEM, MEM, RPMI1640, BME, D-MEM / Examples include F-12, Glassgow MEM, Hanks liquid, mTeSR1 and the like.
  • the culture medium should contain stem cell factor, basic fibroblast growth factor (bFGF), leukocyte migration inhibitory factor (LIF), interleukin, insulin-like growth factor, transferrin, heparin, heparan sulfate, collagen, fibronectin, progesterone. , Selenite, B27-supplement, N2-supplement, ITS-supplement, antibiotics and the like may be added. In addition, serum or plasma may be added to the medium. It is preferable to select each component in a grade compatible with transplantation into a patient.
  • a tissue stem cell having a gene sequence edited and optionally expanded by the method according to the present invention can be transplanted to a patient.
  • it is possible to perform gene editing on a tissue stem cell isolated from a patient and transplant it into a patient in an extremely short time. It can also be applied to cells that are difficult to maintain in an undifferentiated state in vitro, such as tissue stem cells (satellite cells).
  • tissue stem cells tissue stem cells (satellite cells).
  • advantages such as the need to increase the expression level of the target gene due to stress, and the possibility of rapid treatment in response to changes in the patient's condition.
  • One aspect of the invention also relates to a therapeutic or prophylactic agent comprising tissue stem cells in which the gene sequence of the target gene has been edited for use in the treatment of a disease.
  • the therapeutic/prophylactic agent according to the present invention contains a tissue stem cell having a gene sequence edited in an amount effective for treating a disease.
  • Tissue stem cells with edited gene sequences can be, in particular, within 72 hours, within 48 hours, within 36 hours, within 24 hours, or within 18 hours after isolation from living organisms.
  • the amount of tissue stem cells for obtaining a therapeutic effect is appropriately set by those skilled in the art in consideration of an administration route, an administration form, a target disease, a treatment target, a treatment target site, etc. in order to obtain an appropriate therapeutic response. be able to.
  • a daily dose of 1 x 10 5 to 2 x 10 6 cells per kg patient body weight is administered.
  • the administration may be a single dose, multiple doses, or continuous infusion. Administration may be started at a low dose and gradually increased to the target dose in consideration of the therapeutic effect. In addition, as a matter of course, the amount may be changed to an amount outside the above range depending on the condition and urgency of the treatment target.
  • the route of administration may be local administration or systemic administration, and examples thereof include parenteral delivery such as intravenous, intraportal, intramuscular, intraperitoneal, intratarget tissue, subcutaneous, or intradermal administration.
  • parenteral dosage forms such as injections, suspensions, infusions, and medical hydrogels.
  • the therapeutic agent according to the present embodiment may include an optional additional component in addition to the tissue stem cell having the edited gene sequence.
  • additional ingredients include pharmaceutically acceptable diluents, carriers, other additives, etc., such as saline, isotonic solutions, buffers, soothing agents, stabilizers, preservatives. , Antioxidants and the like.
  • the therapeutic agent according to the present embodiment may be used alone, or may be used in combination with another drug effective for treating the target disease.
  • the tissue stem cell whose gene sequence has been edited can be a hematopoietic stem cell, a mesenchymal stem cell, or a hepatic stem cell.
  • one aspect of the present invention is a method for treating or preventing a disease, which comprises administering a tissue stem cell in which the gene sequence of a target gene has been edited to a patient in need of treatment.
  • one aspect of the present invention relates to the use of genetically engineered tissue stem cells in the manufacture of a medicament for use in a method of treating or preventing a disease. The characteristics of these tissue stem cells are as described above.
  • the genome editing technique using the method according to the present invention can be widely applied not only to genetic diseases as long as it is a disease in which regulation of target gene expression in cells derived from tissue stem cells is involved.
  • the method of the present invention is effective for all inherited forms regardless of autosomal dominant inheritance, autosomal recessive inheritance, X-linked recessive inheritance, and X-linked dominant inheritance, and in particular, the conventional gene transfer has poor therapeutic effect. Suitable for application to autosomal dominant recessive diseases.
  • the method of the present invention may be particularly effective for a single gene disease, particularly for a disease caused by a deletion mutation/frame shift or a gene mutation corresponding thereto.
  • -Immune deficiency syndrome eg ADA deficiency, X-linked severe combined immunodeficiency (SCID), other SCID, Wiskott-Aldrich syndrome, chronic granulomatosis, leukocyte adhesion deficiency, familial hemophagocytic syndrome, X-linked Hyper IgM syndrome, X-linked lymphoproliferative disease, X-linked agammaglobulinemia, Hyper-IgE syndrome, etc.
  • -abnormal Hb disease eg, sickle cell disease, ⁇ -thalassemia, etc.
  • -metabolic disease eg, Gaucher Diseases, mucopolysaccharidosis, X-linked adrenal white dystrophy, metachromatic white dystrophy, marble bone disease, etc.-Others include fanconi anemia, Schwachman-Diamond syndrome, Kostmann syndrome, etc. (eg, Richard A. Morgan et
  • Table 1 below shows an example of a disease that can be a target of the method or therapeutic agent according to the present invention and its target gene.
  • the method according to the present invention can obtain a gene-edited tissue stem cell in an extremely short period of time, and thus can be a non-physiological cell population in which highly proliferative cells are concentrated by long-term culture.
  • blood and immune disorders for which no cure has been established to date such as chronic granulomatous disease, Wiskott-Aldrich syndrome, and Hyper-IgE syndrome, for which long-term engraftment is considered useful. It is preferably applied to diseases that cause the onset of dominant negative.
  • Example 1 Introduction of gene mutation into mouse hematopoietic stem cells Mutation was introduced into a target gene site using a CRISPR / Cas9 system in mouse hematopoietic stem cells extracted from wild-type mouse femur. Collection of mouse hematopoietic stem cells is described in the literature (Ema H, et al. Nat Protoc. 2006; 1 (6): 2979-87, Gundry MC, et al. Cell Rep. 2016; 17: 1453-61, Hetzel M, et. al. Blood. 2018;131(5):533-545).
  • mice bilateral femurs and tibias of mice were collected and collected in a 6 cm dish containing about 6 ml of HBSS + medium containing 2% fetal bovine serum (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 082-09365). Bilateral epiphyses were dissected, a 25 G needle was placed in the cut fragment, extruded with HBSS + medium, and cells were collected through a 70 ⁇ m nylon cell strainer (FALCON, 352350).
  • HBSS + medium containing 2% fetal bovine serum
  • the antibody was reacted on ice for 60 minutes, washed, and then suspended in 500 ⁇ l of 0.5% fetal bovine serum + 1% PBS solution per 1.0 ⁇ 10 7 cells, and 50 ⁇ l of Dynabeads TM M-280 Streptavidin (Invitrogen, 11205D) was added. Added. Further, the reaction was allowed to proceed for 60 minutes on ice, and negative cells to which no antibody was bound were collected using a magnetic stand.
  • the target gene was IL2RG, and the sgRNA mixture and Cas9 recombinant protein were introduced by electroporation.
  • Interleukin 2 receptor ⁇ chain (Il2rg) is the causative gene of X-linked severe combined immunodeficiency disease (X-SCID).
  • sgRNA was created using Alt-RTM (IDT).
  • Alt-RTM crRNA 100 ⁇ M, IDT, custom synthetic product (https://sg.idtdna.com/jp/site/)) containing the target sequence (aggattgatgttcaggcttc; SEQ ID NO: 1), tracrRNA (100 ⁇ M, IDT, 1072532) ) And Nuclease-free Duplex Buffer (IDT, 11-01-03-01) were mixed in 3.58 ⁇ l, 3.58 ⁇ l, and 7.84 ⁇ l, respectively, and cooled at 95 ° C. for 5 minutes at room temperature.
  • SpCas9 IDT, 1074182
  • RNA and protein For details of the cell culture and the method of introducing RNA and protein, a nuclease recombinant protein (3.69 ⁇ l at 10 mg / ml) was added to an RNA mixture of sgRNA (100 ⁇ M), and the mixture was left at room temperature for 20 minutes. To this, 1.0 ⁇ 10 6 mouse hematopoietic stem cells and 7.7 ⁇ l of template DNA (1 mg/ml) were mixed and diluted to 100 ⁇ l with OptiMEM medium (ThermoFisher Scientific, 31985070). This cell, RNA, protein, and oligo DNA mixture was electroporated using a Nepa21 pulse generator (Nepa Gene).
  • Nepa21 pulse generator Nepa21 pulse generator
  • Power transmission was performed using two rectangular electric pulses (225V, 2ms width, 50ms interval), followed by 5 pulses (30V, 50ms width, 50ms interval). 2 ml of HBSS + medium was added to the electroporated mixture, and the mixture was centrifuged at 800 rpm for 3 minutes for washing.
  • Genomic DNA was extracted 24 hours after the mutation was introduced (DNeasy Blood&Tissue Kit, Qiagen, 69504), and PCR amplification was performed on a genomic DNA sequence of about 500 bp flanking the target site (Quick Taq (registered trademark) HS DyeMix, Toyobo, DTM-101).
  • a Forward primer gagctatctgtctttaggcctggag; SEQ ID NO: 2
  • a Reverse primer caacctggcctacatagtgagctc; SEQ ID NO: 3 were used.
  • FIG. 1 shows that the PCR product treated with this T7 endonuclease I was electrophoresed on a 1% agarose gel and shows that a DNA mismatch was formed at the target site, that is, a mutation was introduced.
  • Figure 2 shows the sequencing results of the truncated PCR products (FASMAC, Big Dye terminator v3.1, 3130xl Genetic Analyzer). The base sequence: gagctatctgtctttaggcctggag (SEQ ID NO: 4) was used as a primer for sequencing.
  • the PCR product after cleavage (bottom of FIG. 2) is different from the PCR product before cleavage (top of FIG. 2), and the sequence after the target site is difficult to read, indicating that the PCR product is cleaved at the same site.
  • Example 2 Introduction of tag sequence into target gene
  • tag sequence mutation was introduced into the target gene site using the CRISPR / Cas9 system.
  • the target gene is IL2RG, and the sgRNA mixed solution containing the target sequence (aggattgatgttcaggcttc; SEQ ID NO: 5), Cas9 recombinant protein, and template DNA (tgcatagcccttactggcctcccccatcatttattctctgaagcccctacagaccatagataccacatacatacatagcataccattg) are introduced by the template sequence (tgcatagccctcatactation).
  • Genomic DNA is extracted 24 hours after the introduction of the mutation (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, 69504), the Forward primer (gtgagcggctggcggctgtt; SEQ ID NO: 7) is contained in the tag sequence, and the Reverse primer (caacctggcctacatagtgagctc; SEQ ID NO: 8) is located about 300 bp downstream.
  • the Forward primer gtgagcggctggcggctgtt; SEQ ID NO: 7
  • the Reverse primer caacctggcctacatagtgagctc; SEQ ID NO: 8
  • was designed and PCR amplified (Quick Taq® HS DyeMix, Toyobo, DTM-101).
  • As for the PCR conditions after 2 minutes at 94 ° C, 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds / 60 ° C for 30 seconds / 68 ° C for 30 seconds were performed.
  • FIG. 3 shows the PCR product electrophoresed on a 1% agarose gel.
  • FIG. 4 shows the sequencing results of this PCR product.
  • the primer at the time of sequencing the nucleotide sequence: caacctggcctacatagtgagctc (SEQ ID NO: 9) was used. These indicate that the tag sequence was introduced at the target site.
  • Example 3 In the ACT Genome Editing Activation, refer to the method described in the literature (Matsubara, Y, et al. Sci Rep, 4: 5043, 2014) and use the TAL effector as the TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https: // tale-). With reference to nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale), it is introduced into a mammalian expression vector (pcDNA-TAL-VP-64 (Addgene, 47107)) by the Golden Gate method.
  • sgRNA is prepared using Alt-RTM (IDT), Alt-RTM crRNA containing the target sequence (100 ⁇ M, IDT, custom synthetic product (https://sg.idtdna.com/) jp/site/)), tracrRNA (100 ⁇ M, IDT, 1072532), Nuclease-free Duplex Buffer (IDT, 11-01-03-01) at 3.58 ⁇ l, 3.58 ⁇ l and 7.84 ⁇ l, respectively, and mix at 95°C. Place under 5 minutes and cool at room temperature.
  • IDTT Alt-RTM
  • Alt-RTM crRNA containing the target sequence 100 ⁇ M, IDT, custom synthetic product (https://sg.idtdna.com/) jp/site/)
  • tracrRNA 100 ⁇ M, IDT, 1072532
  • Nuclease-free Duplex Buffer IDT, 11-01-03-01
  • RNA is synthesized with mMessage mMachine (trademark) T7 UTRA Transcription Kit (Ambion, AM1345) and purified using MEGAclear TM Transcription Clean-Up Kit (Ambion, AM1908) to 100 ⁇ M.
  • mMessage mMachine trademark
  • MEGAclear TM Transcription Clean-Up Kit MEGAclear TM Transcription Clean-Up Kit
  • RNA When using nuclease as RNA, use the method described in the literature (Nishimasu H, et al. Science. 2018;361:1259-1262. Esvelt KM, et al. Nat Methods. 2013;10(11):1116-1121.).
  • mMessage mMachine TM T7 UTRA Transcription Kit (Ambion, AM1345) using SpCas9, SpCas-9-NG, dCas9, M-NMn-VP64 (Addgene # 80425, # 41816, # 48676) on the vector as template DNA.
  • RNA is synthesized in the above and purified by the ethanol precipitation method.
  • the above-mentioned tools for activation, correction, tagging RNA and recombinant protein are simultaneously introduced into cells by electroporation to select cells for which the target gene has been edited and repaired. That is, as the correction, sgRNA and SpCas9 targeting the target mutation site of the target gene and the template DNA are used to introduce the mutation. Furthermore, as Tagging, a labeled sequence is introduced using sgRNA targeting the C-terminal side of the protein translation region, SpCas9 or SpCas9-NG, and template DNA.
  • the mutation site of the target gene is accurately edited by activation of the target gene, which is induced by M-NMn-VP64 or TAL effector by sgRNA targeting the promoter region of the target gene.
  • Cells that can be produced as proteins are selected based on the signal of the labeled sequence.
  • the marker sequence the above-mentioned HiBit sequence, HA sequence, GFP sequence, Venus sequence, or the like is used.
  • the Venus sequence is created by introducing a homologous gene of the target gene into pVenus vector, using the method described in the literature (Matsubara, Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014) as a template DNA. ..
  • RNA and protein For details on cell culture and the method of introducing RNA and protein, add nuclease (3.69 ⁇ l of recombinant protein 10 mg/ml, 2 ⁇ l of 250 ng/ ⁇ l of RNA) to the RNA mixture (100 ⁇ M) of sgRNA, and allow it for 20 minutes at room temperature. deep. To this, 7.7 ⁇ l of 1.0 ⁇ 10 6 cells of tissue stem cells and template DNA (1 mg/ml) were mixed, and diluted with OptiMEM medium (ThermoFisher Scientific, 31985070) to make 100 ⁇ l. This cell, RNA, protein, and oligo DNA mixture is electroporated using a Nepa21 pulse generator (Nepa Gene).
  • Nepa21 pulse generator Nepa21 pulse generator
  • Power transmission involves two rectangular electrical pulses (225V, 2ms width, 50ms interval) followed by five pulses (30V, 50ms width, 50ms interval).
  • the cells are cultured for 24 hours using the medium used for collecting tissue stem cells.
  • cells that have been accurately genetically edited are selected by detection at the single cell level such as GFP signal.
  • Example 4 Target gene mutation introduction (Correction) and tagging insertion (Tagging) into human fetal kidney cancer cells
  • a human fetal renal cell carcinoma cell line (293FTcell cell (ThermofisherScientific)
  • the target mutation was introduced into the target gene site using the CRISPR / Cas9 system
  • the HiBIT (Flag addition) sequence was introduced as the tag sequence. ..
  • the target gene is RBP (TruB1), and a sgRNA mixed solution containing the target sequence (CTGCGCTGTCTCTAGAGTCCCT; SEQ ID NO: 10, CAAAAGTATGGCCGCTTCTG: SEQ ID NO: 11), Cas9 recombinant protein, and template DNA (GACCATTAGGAGGAGGAGGGCACACTAGAGGTGAAACAAATCAGAG) are introduced.
  • Nano-Glo registered trademark
  • HiBiT Lytic Detection System Promega N3030
  • Proteins were extracted from these representative cells (RIPA buffer, Nacalaitesk 16488-34), and Western blotting was performed using Flag antibody (MBL, FLA-1).
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting with Flag antibody.
  • the tag sequence is often inserted in some cells, indicating that it functions as a peptide tag.
  • Geno DNA is extracted (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, 69504), Forward primer (GTTTTGAAAATGCCATCCCC; SEQ ID NO: 14) is placed about 200 bp upstream of the mutation introduction site, and Reverse primer (SEQ ID NO: 14) is placed about 300 bp downstream.
  • AGAAATAGCTACTTTTATGT; SEQ ID NO: 15) was designed and PCR amplification was performed (Quick Taq (registered trademark) HS DyeMix, Toyobo, DTM-101). The PCR conditions were 94°C for 2 minutes, and 94°C for 30 seconds/60°C for 30 seconds/68°C for 30 seconds for 30 cycles.
  • Figure 6 shows the sequencing results of one of these PCR products (FASMAC, BigDye terminator v3.1, 3130xl Genetic Analyzer).
  • the forward primer (SEQ ID NO: 14) was used as a primer for sequencing. It is shown that the mutation is introduced into the target sequence at the target site.
  • Example 5 Mutation of target gene into human renal cell carcinoma cells (Correction) and tagging (Tagging) Introducing the desired mutation (exon2 removal) into the target gene site using the CRISPR / Cas9 system and introducing the HiBIT sequence as a tag sequence into a human fetal renal cell carcinoma cell line (293FTcell cell (ThermofisherScientific)). Immediately after that, a stop codon was introduced.
  • the target gene is RBP (TruB1), and the sgRNAGGCAGGAGCAGGAGCAAGGAAGGAAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAAGACAGAGACAGAAGACAGAGACAGAAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGAGACAGA
  • Nano-Glo registered trademark
  • HiBiT Lytic Detection System Promega N3030
  • FIG. 7 shows the result of Lytic Detection. It is shown that the Luciferase activity is increased in the knocked-in cells.
  • Example 6 Target gene mutation introduction (Correction), tagging (Tagging) and activation (Activation) into human fetal renal cell carcinoma cells
  • the target mutation was introduced into the human fetal kidney cancer cell line (293FTcell cells (Thermofisher Scientific)), and the HiBIT sequence was introduced as a tag sequence, followed by activation. I did.
  • the target gene was STAT3, and a mutant STAT3 cell line was first established.
  • an sgRNA mixed solution containing a complementary strand of the target sequence (GTTGTGGTGATCTCCAACAT; SEQ ID NO: 19), a Cas9 recombinant protein, and a template DNA for introducing a mutation (CCCAGCTCAGTCCCCACTCCCTCCGCAGACCCACTCCTTGCCAGTTGTGTAGATCTCCAACATCTGTCAGATGCCAAATGCCTGGGCGTCCATCCCCTGGTA.
  • FIG. 8 shows the sequence result at this time.
  • Forward primer GCAGCAGGTGTGGTTTATGG; SEQ ID NO: 21
  • Reverse primer ACCATCCCTCATCTAAACAA
  • sgRNA for undoing the mutation similar to SEQ ID NO: 19
  • sgRNA for tag sequence addition TGCGCTACCTCCCCCATGTG; including SEQ ID NO: 23 as a target sequence
  • Cas9 set recombinant protein, the template DNA for returning the mutation
  • template DNA for introducing ShishishieijishitishieijitishishishieishitishishishishijishieijieishishishieishitishititijishishieijititijitijijitijieitishitishishieieishieitishitijitishieijieitijishishiAAATGCCTGGGCGTCCATCCTGTGG SEQ ID NO: 24
  • tag sequence a
  • the STAT3 gene was activated. SgRNAs targeting 1000 bp, 500 bp, and 200 bp upstream of the transcription initiation factor of the STAT3 gene (UUGUUGAGUAGGAGAAUCUC; SEQ ID NO: 26, UUUAAAAAAUGAGUGUGGCA; SEQ ID NO: 27, UCAAGGCCACCCUGGGCAAC; SEQ ID NO: 28) and dCas9-VP64 vector (addgene, #)
  • the mRNA obtained from 47107 was introduced using Fugene HD Transfection reagent (Promega, E2311), and 24 hours later, Nano-Glo emission detection was performed using Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System (Promega N3030).
  • RNA was synthesized using dCas9-VP64 vector as a template and mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Invitrogen, AM1345), and purified using MEGA Clear Transcription clean kit (Invitrogen, AM1908).
  • FIG. 9 shows the result of Lytic Detection. It is shown that the HiBIT Luciferase activity is increased by activation, mutation is introduced, and the change is emphasized by gene activation.
  • FIG. 10 shows the sequence result at this time. It shows that the target sequence has overlapping waveforms and includes cells in which the mutation has been reverted.
  • Example 7 Introduction of tag sequence with gene mutation repair of mouse hematopoietic stem cells
  • SCID mouse hematopoietic stem cells extracted from the femur of CB-17 / Icr-SCID mouse (Claire Japan) having a Prkdc gene mutation
  • CRISPR / Cas9 Using the system, the target gene mutation was repaired and the tag sequence was introduced into the target gene.
  • the target gene is Prkdc, and sgRNA for repairing mutations (gcuuagcguauuuuauguug; including SEQ ID NO: 29), sgRNA for tag sequence addition (acaccacagacuuuacaucc; including SEQ ID NO: 30), Cas9 recombinant protein, and for repairing mutations.
  • template DNA for introducing (Jieitishieitijijieititishieieijieieieitieieieitijitieieishijijieieieieitieitijitieieishijijieieieieititijishitieitijishitieieijieijieieiagttagcaggggccaacccagctgt SEQ ID NO: 31) and tag sequence; a (Shieijieishishishishieieitieitishititijijishieijijieishititijijijieieijijieitijijijieijishishishitijijieitijishijijijieishishieishieitijijitijishitijishieishijieishijieishijitijitijitieishijitijieieishijishishijishishijijishieitishieishieishieishieish
  • Genomic DNA was extracted 48 hours after the mutation was introduced (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, 69504), PCR amplification was performed using the Forward primer (CAAACTTTGAATTCACAGTCATGAGTGAC; SEQ ID NO: 33) and Reverse primer (GAGGTCCTCTCGGAGACAGAATG; SEQ ID NO: 34) ( QuickTaq (registered trademark) HS DyeMix, Toyobo, DTM-101). As for the PCR conditions, after 2 minutes at 94 ° C, 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds / 60 ° C for 30 seconds / 68 ° C for 30 seconds were performed.
  • FIG. 11 shows the PCR product electrophoresed on a 1% agarose gel.
  • FIG. 12 shows the sequencing results of this PCR product.
  • the forward primer (SEQ ID NO: 33) was used as a primer for sequencing. These confirmed the overlap of the target tag sequence at the target site, indicating that the tag sequence was introduced with an efficiency
  • GFP1-10 was introduced into the cells 48 hours after the introduction of the mutation using an adeno-associated virus, and the cells were observed 24 hours later.
  • GFP1-10 SEQ ID NO: 35
  • AAVpro trademark registration
  • Helper Free System Takara, 6673
  • FIG. 13 shows the fluorescence of this cell. It is shown that GFP-11 was introduced into the cells, and there were cells that obtained GFP fluorescence by binding to GFP1-10 derived from AAV.
  • the present invention enables an early and fundamental treatment method for blood, immune diseases, etc., which until now has not been sufficiently treated.

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Abstract

本発明の目的の一つは、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を短期間の内に製造する方法を提供することである。また、本発明の目的の一つは、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を用いた疾患の治療および／または予防方法を提供することである。　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、および遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程を含み、場合により、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、および／または組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程をさらに含む方法により、遺伝子編集のされた組織幹細胞を製造する。そして、そのようにして製造された組織幹細胞を疾患の治療／予防に利用する。

Description

ハイスループット遺伝子編集技術
　本発明は、遺伝子編集方法に関し、詳細には、組織幹細胞の遺伝子編集を短期間に行う方法に関する。
　ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して、標的遺伝子を改変する技術である。ヌクレアーゼとしては、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9などが用いられている。従来の遺伝子工学、遺伝子治療と比較して、非常に応用範囲が広く、ゲノム編集技術を応用した治療法の開発も進められている（非特許文献1）。
　例えば、CRISPR Therapeutics社（スイス）は、ゲノム編集を利用した鎌状赤血球貧血の治療法（CTX001）の開発を行っている（非特許文献2および3）。鎌状赤血球貧血は、酸素を運搬する赤血球内の分子であるヘモグロビンを作るための指示を与えるHBB遺伝子の変異によって引き起こされる。鎌状赤血球貧血では、この変異の結果、ヘモグロビンの欠損が生じ、赤血球の酸素運搬機能が低下する。
　CTX001は、遺伝子編集技術を利用して、遺伝子を変化させ、患者の赤血球中の胎児ヘモグロビン（HbF）の産生を増加させることを狙っている。胎児ヘモグロビンは、新生児に天然に存在するヘモグロビンの一種で、後に成人型のヘモグロビンに置き換えられる。しかしながら、時として、胎児ヘモグロビンが成人においても存続することがあり、鎌状赤血球貧血やβ-サラセミアから人々を守っている。
　治療のためには、血液を構成する赤血球および白血球を生じさせる骨髄由来の細胞である造血幹細胞が患者から採取され、それから、高レベルの胎児ヘモグロビンを産生することができるように遺伝子が改変される。より具体的には、HbFの転写リプレッサーであるBCL11A遺伝子を破壊する遺伝子改変が行われる。このような処理を施された細胞はそれから、患者の体に戻され、患者の体内で胎児ヘモグロビンを含有する赤血球を大量に産生し、それにより、疾患によって引き起こされるヘモグロビン欠乏症を克服できると考えられている。
　しかしながら、血液・免疫・癌などの疾患治療においては、組織幹細胞への遺伝子編集の効率の問題、細胞選択の困難さなど多くの問題点が残っており、未だ、遺伝子編集技術の医療応用には不十分な点も多い。
Dunbar et al., Gene therapy comes of age. Science. 2018;359:175-184. DOI: 10.1126/science.aan4672 Antony et al., CRISPR/Cas9 system: A promising technology for the treatment of inherited and neoplastic hematological diseases, Adv Cell Gene Ther. 2018;1:e10. DOI: 10.1002/acg2.10 Lin MI, et al. CRISPR/Cas9 Genome Editing to Treat Sickle Cell Disease and B-Thalassemia: Re-Creating Genetic Variants to Upregulate Fetal Hemoglobin Appear Well-Tolerated, Effective and Durable. Blood. 2017;130:284.
　本発明は、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を短期間の内に製造する方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を用いた疾患の治療および／または予防方法を提供することも目的の一つとする。
　本発明者らは、ゲノム編集技術を応用することにより、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を短期間の内に製造するための手法を開発した。本手法を用いることで、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を用いた疾患の治療および／または予防方法を提供することができる。本発明は、より具体的には以下の態様を包含する。
［態様１］
　遺伝子編集のされた組織幹細胞の製造方法であって、組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、および遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程を含む、方法。
［態様２］
　標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、および／または組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程をさらに含む、態様1記載の方法。
［態様３］
　組織幹細胞が患者から単離された組織幹細胞である、態様1または2記載の方法。
［態様４］
　遺伝子配列の編集がex vivoで行われる、態様1～3のいずれか記載の方法。
［態様５］
　遺伝子配列の編集がCRISPR/Cas系またはTALEN系を用いて行われる、態様1～4のいずれか記載の方法。
［態様６］
　標的遺伝子が組織幹細胞中では定常発現しない遺伝子である、態様1～5のいずれか記載の方法。
［態様７］
　遺伝子発現の活性化がCRISPRa系またはTALENエフェクター系を用いて行われる、態様2～6のいずれか記載の方法。
［態様８］
　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を遺伝子配列に付加したタグを利用して選別する、態様2～7のいずれか記載の方法。
［態様９］
　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程と、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程とが同時に行われる、態様2～8のいずれか記載の方法。
［態様１０］
　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を該細胞を患者から単離してから24時間以内に選別する、態様1～9のいずれか記載の方法。
［態様１１］
　選別した組織幹細胞が未分化状態を維持している、態様1～10のいずれか記載の方法。
［態様１２］
　選別した組織幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、態様1～11のいずれか記載の方法。
［態様１３］
　選別した組織幹細胞を患者に移植する工程をさらに含む、態様1～12のいずれか記載の方法。
［態様１４］
　遺伝子配列の編集された組織幹細胞が疾患の治療に用いるための細胞である、態様1～13のいずれか記載の方法。
［態様１５］
　疾患が血液疾患または免疫疾患である、態様14記載の方法。
［態様１６］
　血液疾患または免疫疾患が、ADA欠損症、X連鎖性重症複合免疫不全症（SCID）、その他のSCID、Wiskott-Aldrich症候群、慢性肉芽腫症、白血球粘着不全症、家族性血球貪食症候群、X連鎖性 Hyper IgM症候群、X連鎖性リンパ増殖性疾患、X連鎖性無γグロブリン血症、Hyper-IgE症候群、鎌状赤血球症、およびβ-サラセミアからなる群より選択される、態様15記載の方法。
［態様１７］
　標的遺伝子が、ADA、IL2RG、WAS、CYBB、INTGB2、UNC13D、CD40L、SAP/SH2D1A、BTK、STAT3、およびヘモグロビンからなる群より選択される、態様1～16のいずれか記載の方法。
［態様１８］
　標的遺伝子の遺伝子配列が編集された、生体から単離後48時間以内の造血幹細胞を含む、血液疾患または免疫疾患の治療剤。
［態様１９］
　血液疾患または免疫疾患が、ADA欠損症、X連鎖性重症複合免疫不全症（SCID）、その他のSCID、Wiskott-Aldrich症候群、慢性肉芽腫症、白血球粘着不全症、家族性血球貪食症候群、X連鎖性 Hyper IgM症候群、X連鎖性リンパ増殖性疾患、X連鎖性無γグロブリン血症、Hyper-IgE症候群、鎌状赤血球症、およびβ-サラセミアからなる群より選択される、態様18記載の治療剤。
［態様２０］
　標的遺伝子が、ADA、IL2RG、WAS、CYBB、INTGB2、UNC13D、CD40L、SAP/SH2D1A、BTK、STAT3、およびヘモグロビンからなる群より選択される、態様18または19記載の治療剤。
［態様２１］
　遺伝子編集のされた組織幹細胞の製造方法であって、
　　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、
　　標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、
　　組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程、および
　　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程
を含み、
　　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程と、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程とが、CRISPR/Cas系またはTALEN系を用いて同時に行われる、方法。
［態様２２］
　標的遺伝子が組織幹細胞中では定常発現しない遺伝子であり、
　標的遺伝子の遺伝子配列の編集とタグの付加が行われた細胞においてのみ、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程によってタグで標識された目的タンパク質が産生し、該タグを用いて遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する、態様２１に記載の方法。
［態様２３］
　組織細胞が患者から単離された組織幹細胞であり、遺伝子配列の編集された組織幹細胞を該細胞を患者から単離してから48時間以内に選別する、態様２１または２２に記載の方法。
　本発明によれば、遺伝子編集のされた未分化状態の組織幹細胞を短期間の内に製造することができる。そして、そのような組織幹細胞を用いて、これまで介入の困難であった疾患の治療および／または予防を行うことも可能となる。
図1は、実施例1において生成された、T7エンドヌクレアーゼI（T7EI）で処理したPCR産物の電気泳動図である（1%アガロースゲル）。左から右へ、マーカーレーン、T7EIで処理したDNA、T7EIで処理していないDNA。 図2は、実施例1において生成された、切断されたPCR産物のシークエンス結果を示している（FASMAC、Big Dye terminator v3.1、3130xl Genetic Analyzer）。上段：未切断のDNAのシークエンス結果。下段：切断されたDNAのシークエンス結果。 図3は、実施例2において生成された、PCR産物の電気泳動図である（1%アガロースゲル）。左から右へ、マーカーレーン、未編集のゲノム由来のPCR産物、ゲノム編集後のゲノム由来のPCR産物、ゲノム編集後のゲノム由来のPCR産物。 図4は、実施例2において生成された、PCR産物のシークエンス結果を示している。標的部位にタグ配列が導入されたことがわかる。 図5は、実施例4において変異導入したNano-Glo陽性の細胞から抽出したタンパク質のFlag抗体によるウェスタンブロットの結果を示している。タグ配列が導入され、ペプチドタグとして機能していることがわかる。 図6は、実施例4において生成されたPCR産物のシークエンス結果を示している。標的部位において目的の配列へ変異導入されたことがわかる。 図7は、実施例5におけるLytic Detectionの結果を示している。Knock inした細胞においてLuciferase活性が上昇していることを示している。 図8は、実施例6においてクローニングした変異導入細胞のシークエンス結果を示している。目的の配列へ変異導入されたことがわかる。 図9は、実施例6におけるLytic Detectionの結果を示している。活性化によってHiBITのLuciferase活性が上昇しており、変異が導入され、遺伝子の活性化によってその変化が協調されていることがわかる。 図10は、実施例6において変異を戻した後のPCR産物のシークエンス結果を示している。目的配列に波形の重なりがあり、変異を戻した細胞が含まれていることがわかる。 図11は、実施例7において生成されたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示している。標的部位にタグ配列が導入されたことがわかる。 図12は、実施例7において生成されたPCR産物のシークエンス結果を示している。図11および図12の結果は、標的部位に目的のタグ配列の重なりがあることを示しており、約50％程度の効率でタグ配列が導入されたことがわかる。 図13は、実施例7において変異導入後にAAVを用いてGFP1-10を導入した細胞の蛍光顕微鏡写真である。細胞内にGFP-11が導入され、AAV由来のGFP1-10と結合することでGFPの蛍光を得た細胞が存在することが分かる。
　本発明の一部の実施形態は、遺伝子編集のされた組織幹細胞を、短期間で一細胞レベルで正確に選択することが可能な遺伝子編集のされた組織幹細胞の製造方法に関する。本発明の方法は、組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程を含み、さらに場合により、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、および／または組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程を含む。各工程について、以下に詳細に説明する。
［組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程］
　ゲノム編集とはゲノムの標的部位を特異的に切断できる人工制限酵素を用いて任意のゲノム配列に変異（置換、挿入、欠失）を導入する技術である。制限酵素により標的部位の二重鎖切断が生じると、鋳型DNAの非存在下では、細胞の修復機構であるNHEJ（Non-Homologous End Joining）によるゲノム修復の際、末端同士の連結時のエラーにより、塩基対の欠損、挿入が生じる。その結果フレームシフト等により最終的に標的遺伝子がKnock-outされる。一方、鋳型DNAの存在下では修復機構であるHDR（Homology Dependent Repair）によって標的部位への鋳型配列の置換・挿入が生じる（Knock-in）。
　本発明に係る方法において、遺伝子配列の編集は、遺伝子を破壊するノックアウト（Knock-out）または導入・改変を行いたい配列を置換・挿入するノックイン（Knock-in）のいずれでもあり得るが、好ましくは、所望の鋳型配列を用いたKnock-inであり、それにより、例えば、疾患等の原因となる配列変異が正常な配列または無害な配列に訂正される。
　本発明に係る方法において、標的遺伝子の遺伝子配列の編集に利用できる主な編集ツール（Correction tool）としては、例えば、ZFN系（Zinc Finger Nucleases）、TALEN系（Transcription Activator Like Effector Nucleases）、及びCRISPR/Cas系（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR Associated Protein 9）等が挙げられる。これらの系は、ゲノムのDNA二重鎖の切断を担うヌクレアーゼと、該ヌクレアーゼをゲノム上の標的部位に誘導するガイド分子と、場合により鋳型DNAと、から構成される、特異性の高いゲノム編集ツールである。鋳型DNAは一本鎖DNAであっても、二本鎖DNAであっても良い。
　ZFN系（例えば、Kim, Y. G., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160.を参照）は、簡単には、多くの転写因子のDNA結合ドメインに存在するDNA結合モチーフの一つであるZinc-Fingerと、FokIヌクレアーゼドメインという2つの機能ドメインで構成された人工キメラタンパク質であり、標的配列を挟み込む様に設計された一対のZFNsを用いてゲノム編集を行う。ZFN系では、DNA結合ドメインであるZinc-Fingerが標的遺伝子上の特異的な遺伝子配列を認識し、それによりDNA切断ドメインであるFokIヌクレアーゼが高い特異性で二重鎖切断を引き起こす。
　TALEN系（例えば、Cermak T, et al., 2011, Nucleic Acids Res 39: e82を参照）も、ZFNと同様、任意の塩基配列を認識するDNA結合ドメイン（TALエフェクター（TALE））にFokIヌクレアーゼドメインを融合させた人工キメラタンパク質である。TALENのDNA結合ドメインは15～20塩基を認識し、FolIの標的配列となる14～20塩基のスペーサーを挟み込むようにセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計された一対のTALENsを用いて二重鎖切断を行う。TALEN系によれば、ZFNより特異的な標的配列の切断が可能となり、理論上任意のゲノム配列を標的とすることができる。TALEN系はオフターゲット変異の抑制という点でCRISPR/CAS系よりも優れているとも言われている。
　CRISPR/CAS9を中心とするCRISPR/CAS系（例えばCong, L. et al., 2013, Science, 339, 819-823.を参照）は、前述のZFN及びTALENが標的配列の認識にタンパク質とDNAの相互作用を用いているのに対し、RNAとDNAの相補的結合を標的配列の認識に用いる。II型CRISPR/CAS系では、簡単には、guideRNA（crRNAとtracrRNAの複合体またはそれらを一本鎖化したsgRNA）によって、二重鎖切断を担うCas9ヌクレアーゼが標的配列に誘導され、CAS9-RNA複合体がguide RNAと相補的なDNA配列を切断する。V型CRISPR/CAS系では、RNA依存性DNAヌクレアーゼCpf1が用いられる。V型CRISPR/CAS系のguideRNAはcrRNAのみから構成される。CRISPR/Cas系は、guideRNAとヌクレアーゼとが別々に存在して機能するため、複数のguideRNAの導入による多重変異の導入が可能であるという点で利便性に優れる。例えば、Integrated DNA Technologies（IDT）社から、CRISPR/CAS系において利用されるコンポーネント（Cas9 gRNA、Cas9タンパク質、Cas9プラスミド、Cas9 キャリアDNA、バッファー等）およびCRISPR/Cas12a系において利用されるコンポーネント（Cas12a（Cpf1）gRNA、Cas12a（Cpf1）タンパク質、Cas12a（Cpf1）キャリアDNA、バッファー等）を購入することができる。sgRNAの設計ツールとしては、例えばCRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp）を用いることができる。RNAの合成及び精製のためには、例えば、mMessage mMachine(商標) T7 UTRA Transcription Kit（Ambion, AM1345）、MEGAclear(商標) Transcription Clean-Up Kit（Ambion, AM1908）等を用いることができる。
　例えば、Alt-RTM（IDT社）を用いてguideRNAを作成する場合、標的配列を含むAlt-RTM crRNA（100μM、IDT社）、tracrRNA（100μM、IDT社、1072532）、Nuclease-free Duplex Buffer（IDT社、11-01-03-01）をそれぞれ3.58μl、3.58μl、7.84μlで混和し、95℃下で5分おき、室温で冷却して使用することができる。gRNA vector（Addgene No.41824）を用いたsgRNAの作成においては、インバースPCR法により標的配列を導入し、gRNA鋳型DNAを作成する。mMessage mMachine(商標) T7 UTRA Transcription Kit（Ambion, AM1345）にてRNAを合成し、MEGAclear(商標) Transcription Clean-Up Kit（Ambion, AM1908）を用いて精製し、100μMとすることができる。組換えタンパク質としてヌクレアーゼを用いる場合、SpCas9（IDT社、1074182）、cpf1（IDT社、1081069）を10mg/mlに希釈し、使用することができる。RNAとしてヌクレアーゼを用いる場合は、例えば、文献（Nishimasu H, et al. Science. 2018;361:1259-1262. Esvelt KM, et al. Nat Methods. 2013;10(11):1116-1121.）記載の方法を参考として、ベクター上のSpCas9、SpCas-9-NG、dCas9、M-NMn-VP64（Addgene # 80425、#41816、#48676）を鋳型DNAとしてmMessage mMachine(商標) T7 UTRA Transcription Kit（Ambion, AM1345）にてRNAを合成し、エタノール沈殿法により精製することができる。
　以上、ZFN系、TALEN系、及びCRISPR/Cas系について簡単に記載したが、これらの系の改良型や、その他の任意のゲノム編集ツールも本発明に用いることができる。特異性の観点では、遺伝子配列の編集は、CRISPR/Cas系またはTALEN系を用いて行われることが好ましい。
　これらのゲノム編集ツールを用いる際には、ガイド分子－ヌクレアーゼ複合体、又はguide RNA及び／若しくはヌクレアーゼの発現プラスミド又は該発現プラスミドがパッケージされたウイルスを標的細胞に導入して、標的細胞内でガイド分子－ヌクレアーゼ複合体、又はguide RNA及び／若しくはヌクレアーゼを発現してもよいし、あるいはヌクレアーゼ又はガイド分子－ヌクレアーゼ複合体をmRNAまたはタンパク質として、またguide RNAをRNAとして、標的細胞にそれぞれ導入してもよい。発現プラスミド等を導入する場合は発現を誘導する作用物質を標的細胞に作用させてもよい。プラスミド導入によりヌクレアーゼを発現し続けることによるオフターゲットリスクや、転写・翻訳にかかるタイムラグ、変異導入の効率化の観点では、ヌクレアーゼ又はガイド分子－ヌクレアーゼ複合体をmRNAまたはタンパク質として、またguide RNAをRNAとして導入することが好ましい。これらのRNA、タンパク質、プラスミド、又はパッケージウイルスの導入方法は特に限定されず当業者に知られている方法を用いることができるが、非限定的な例としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリマーカプセル、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が挙げられる。簡便性と導入効率のバランスから、エレクトロポレーションが一般的である。
　細胞にRNA、タンパク質、DNAを導入するためのエレクトロポレーションは例えば、Nepa21 pulse generator（Nepa Gene）を用いて行うことができる。送電は、例えば、2つの矩形電気パルス（225V、2ms幅、50ms間隔）、続いて5パルス（30V、50ms幅、50ms間隔）を行う。エレクトロポレーションを行なった混合液に2mlのHBSS＋培地を加え、800rpmで3分間遠心し洗浄することができる。この細胞を造血幹細胞採取の際に用いた培地を用いて24時間程度培養してもよい。更に、GFPシグナルなどの一細胞レベルでの検出によって、遺伝子編集が的確に行われた細胞を選別することができる。
　組織幹細胞を取り扱う際には、滅菌下でRNA及びタンパク質を用いるのに適した作業スペース、動物実験施設としてSPF区を有していることが望ましい。また、変異が導入された細胞を効率的に抽出するための手段としては、発光性タグを検出して、選別するための機器が好適に利用され得る。
［遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程］
　本発明に係る方法は、標的細胞における標的遺伝子の編集後、組織幹細胞のプールから標的遺伝子が編集されている細胞を一細胞レベルで選別する工程を含む。標的遺伝子が編集されている細胞を選別する方法としては、編集された標的遺伝子の核酸配列に基づく方法や編集された標的遺伝子の発現に基づく方法が挙げられる。編集された標的遺伝子を正常に発現可能な細胞を一細胞レベルで正確に選択する観点では、標的遺伝子の発現に基づく方法、例えば一過性に活性化された標的遺伝子の発現を検出することにより行うことが好ましい。活性化された標的遺伝子の発現の検出には、例えば蛍光または燐光の検出を利用する系を用いることができる。
［組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程］
　標的遺伝子は、多くの場合、組織幹細胞が対応する各組織細胞に分化して様々な機能を発揮する際に発現する遺伝子である。すなわち、多くの場合、標的遺伝子は組織幹細胞中では定常発現しない遺伝子である。このため、標的遺伝子の発現に基づき標的遺伝子の編集された細胞を選択するためには、標的遺伝子の発現を一過的に活性化することが求められる。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程をさらに含み得る。このような遺伝子発現の活性化は、一過的なものであり得る。この工程により、標的遺伝子が正常に発現し得るように編集されている細胞のみを一細胞レベルで選別することができる。この工程により、上記遺伝子配列を編集する工程において意図しない編集、例えばオフターゲット変異等が生じた細胞を除外することもできる。
　標的遺伝子を一過的に活性化する活性化ツール（activation tool）としては、例えば、標的遺伝子の上流に存在するプロモーター領域に転写活性化因子（VP64など）を作用させる方法が挙げられる。一実施形態では、上述の標的遺伝子を編集する工程、又は後述の標的遺伝子をタグ化する工程と実質的に同時に行うことが可能な方法が好ましい。
　このような活性化ツールとしては、CRISPRa（CRISPR activation）系、TALENエフェクター系が挙げられる。
　CRISPRa系（例えば、Silvana Konermann et al. Nature. 2015 Jan 29;6(7536):583-588を参照）は、簡単には、DNA切断活性を欠失させたdeadCas9（dCas9）ヌクレアーゼと転写活性因子（VP16、VP64等）を融合させたdCas9－転写活性因子複合体と、標的遺伝子のプロモーター部位を標的とするguide RNAとを導入することにより、標的遺伝子の転写開始点にdCas9－転写活性因子複合体を誘導し、標的遺伝子の発現を活性化させるシステムである。CRISPRa系としては、dCas9－転写活性因子複合体及びguide RNAの発現ベクター、又は該発現ベクターをパッケージしたウイルス粒子等を標的細胞に導入してもよいし、dCas9－転写活性因子複合体をタンパク質として、guide RNAをRNAとしてそれぞれ標的細胞に導入してもよいが、本実施形態では、迅速な活性化と安全性の観点で、dCas9－転写活性因子複合体をタンパク質として、guide RNAをRNAとしてそれぞれ標的細胞に導入することがより好ましい。
　また、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするTAL DNA結合ドメインを転写活性因子（VP16、VP64等）に融合させたTALエフェクター系等を用いることも好ましい。TALエフェクター系の設計ツールとしては、例えば http://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale を用いることができる。例えば、文献（Matsubara,Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014）記載の方法を参考に、TALエフェクターをTAL Effector Nucleotide Targeter 2.0（https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale）を参考にして、Golden Gate法によって哺乳類発現ベクター（pcDNA-TAL-VP-64（Addgene、47107））に導入し作成する。CRISPRa系を活性化ツールとして用いる場合、上記編集ツールと同様の方法により設計することができる。
　これらの活性化ツールは、上記編集ツールと同様の手法で標的細胞に導入することができる。
［標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程］
　標的遺伝子の発現を検出する方法は、標的遺伝子の特性によって適宜選択することができ、例えば膜タンパク質に反応性の抗体を用いた方法、分泌タンパク質をその酵素活性により検出する方法等が挙げられる。
　一実施形態では、遺伝子配列の編集された組織幹細胞を遺伝子配列に付加したタグを利用して選別することができる。例えば、標的遺伝子に、標的遺伝子が目的とする正常遺伝子に編集された場合にのみ発現するタグ配列を付加することにより、標的遺伝子を正常に発現する細胞のみを一細胞レベルで正確に選択することができる。このようなタグ配列としては、特に限定されるものでないが、ペプチドもしくはポリペプチドタグ（FLAG、HA、His、Myc、V5、S、Trx等）、レポーター遺伝子（Luciferase等）、蛍光タンパク質（GFP、RFP、Venus等）等が挙げられる。Venus配列は、文献（Matsubara,Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014）記載の方法を参考とし、pVenus vectorに標的遺伝子の相同遺伝子を導入することで作成し、鋳型DNAとして使用することができる。このようなタグを、標識抗体や蛍光もしくは発光等を用いて検出することができる。本発明では、生細胞検出や変異導入効率の観点から、細胞へのダメージの少ないペプチド等の小分子（FLAG、HA等）や後述のHiBiTシステム（Promega）等が好ましい。
　一実施形態において、標的細胞における不測の影響を抑える観点では、タグがペプチド等、なるべく小分子であることが好ましい場合がある。このようなタグの非限定的な例としては、HiBiTシステム（Promega）等が挙げられる。このシステムは、タグとして11アミノ酸のペプチドタグ（HiBiT）を用い、検出に該タグに結合するルシフェラーゼ断片（LgBiT）を用いるため、標的細胞における影響が最小限であり、かつ、標的細胞を高感度に検出することができる。
　このようなタグ配列を標的遺伝子配列に付加するためのタグ化ツール（Tagging tool）は特に限定されず、例えば、上述の編集ツールと同じであってもよい。一実施形態では、タグ化ツールは、標的遺伝子を標的とするguide RNA、Casヌクレアーゼ、及びタグ配列挿入用鋳型DNAを含む。このようなタグ化ツールも、上記編集ツール及び活性化ツールと同様の手法で標的細胞に導入することができる。なお、タグを導入する位置は、標的遺伝子のN末端、C末端、中央部分の任意の部位であり得る。標的遺伝子のインタクトなタンパク質の発現を検出し得るという観点ではC末端側に導入することも好ましい。
［ACTゲノム編集］
　一部の実施形態では、上記の組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程と、組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程と、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程とを組み合わせて行う。本明細書において「組み合わせて行う」とは、標的の組織幹細胞を体外で維持し得る短期間の間に編集から選択までの工程を行うことを意味する。
　このために、一実施形態では、活性化ツール（activation tool）と、編集ツール（correction tool）と、タグ化ツール（tagging tool）とを実質的に同時に標的細胞に導入することができる。このように活性化ツール（activation tool）、編集ツール（correction tool）およびタグ化ツール（tagging tool）を組み合わせたゲノム編集技術を本願では「ACTゲノム編集」と呼ぶ。ACTゲノム編集では、例えば、標的遺伝子の編集部位を標的とするZFN、TALEN、またはCRISPR/Cas系の編集ツールと、標的遺伝子の翻訳領域（C末端側もしくはN末端、または翻訳領域内）を標的とするZFN、TALEN、またはCRISPR/Cas系のタグ化ツールと、標的遺伝子のプロモーター部位を標的としたZFN、TALEN、またはCRISPR/Cas系の活性化ツールとを実質的に同時に標的細胞に導入する。ここで、編集ツールとタグ化ツールとは同じ系を使用してもよい。このようにすることにより、多重変異の導入（標的遺伝子の編集とタグ化）と、編集された標的遺伝子の発現とを極めて短時間に行うことができる。その結果、標的遺伝子が的確に編集された組織幹細胞を短期間の間に正確に選択することができる。
　ここで「短期間」とは、標的の組織幹細胞を生体外で維持し得る期間であればよいが、好ましくは1週間以下、より好ましくは3日以下（72時間以下）、例えば2日以下（48時間以下、36時間以下、24時間以下、または18時間以下）である。また、「実質的に同時」とは数時間以内（例えば2もしくは3時間以内）を意味し、作業の簡便さを考慮すれば活性化ツールと編集ツールとタグ化ツールを同時が導入することが好ましいが、遺伝子編集・遺伝子発現の効率・正確性を向上させるために導入する順番を変更したり、時間をずらしたりしてもよい。例えば、活性化ツールと編集ツールとタグ化ツールに用いられる全てのコンポーネントを1回のエレクトロポレーションで細胞に導入してもよいし、編集ツールとタグ化ツールに用いられるコンポーネントを導入した後に時間を空けて活性化ツールに用いられるコンポーネントを導入してもよい。
　従来のゲノム編集技術では、CRISPR/Cas系等を用いて遺伝子編集を行った場合であっても、遺伝子編集後に一細胞クローニングを行い、各クローンについてPCR等によりジェノタイピングを行って目的の遺伝子が編集された細胞を選別する必要があり、目的の細胞を得るまで数日から数週間程度の期間が必要であった。また、目的の遺伝子内に薬剤耐性遺伝子等を挿入すれば薬剤耐性株の選別により簡便に目的細胞を取得できるが、薬剤耐性遺伝子等の外来DNAの挿入をゲノムDNAとドナーベクターとの相同組換えによって行う場合、一般的に極めて低効率である等の問題もあった。しかし本実施形態に係る方法によれば、編集・タグ化・活性化を実質的に同時に行うことにより、目的の遺伝子が編集された細胞のみを、組織幹細胞を生体外で維持できる期間内に極めて短時間で高効率に選別することが可能となる。
　一実施形態では、本発明の方法によれば、遺伝子配列の編集された組織幹細胞を該細胞を患者から単離してから2日以内、好ましくは24時間以内に選別することが可能である。
　遺伝子編集のされた組織幹細胞を一細胞レベルで選択する方法としては、限界希釈法、セルソーター法等が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子配列の編集された組織幹細胞は、遺伝子配列に付加したタグを利用して選別されてもよい。一部の実施形態において、タグは蛍光または燐光を発する系の一部または全部を構成していてもよい。タグには、例えば、上述のように、プロメガ社（米国ウィスコンシン州）のHiBiTシステムを利用することができる。
［組織幹細胞］
　本発明に係る方法において、遺伝子配列の編集は、通常単離した組織幹細胞においてex vivoで行われる。
　組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）は細胞が由来する部位に基づき、例えば、皮膚系（表皮幹細胞、毛包幹細胞等）、消化器系（膵（共通）幹細胞、肝幹細胞等）、骨髄系（造血幹細胞、間葉系幹細胞（筋サテライト細胞等を含む）等）、神経系（神経幹細胞、網膜幹細胞等）等に分類することができる。本発明に係る方法を適用し得る組織幹細胞は特に限定されないが、疾患の病態、確立された移植方法、さらに移植細胞の組織定着性等の理由から、骨髄系、特に造血幹細胞において、特に有効である。
　組織幹細胞は、由来する各組織の細胞から単離して取得しても、ES細胞、iPS細胞等のより未分化な多能性幹細胞から分化誘導して取得してもよいが、本発明に係る方法においては、安全性等の観点から、由来する各組織の細胞から単離することが好ましい。例えば、造血幹細胞は、骨髄、臍帯血、末梢血から単離して得ることができる。このような単離方法は特に限定されず、当業者に知られている方法を用いることができる。造血幹細胞の取得方法は、例えば、文献（Bak RO, et al. Nat Protoc. 2018;13(2):358-376、Forraz N, et al. Stem Cells. 2004;22(1):100-108.）記載の方法を参考とすることができる。具体的には、例えば、骨髄液を遠心（1500rpm、5分、4℃）により上精を除去し、赤血球溶解培地（Takara Bio、786-649）1mL と RPMI-1640培地（富士フィルム和光純薬、189-02025）9mlを加え、さらに遠心（1500rpm、5分、4℃）を行うことで赤血球を除去し、HBSS＋培地により洗浄した細胞を、抗体を用いてlineage negative selectionにより選別する。Lineage negative selectionには、MagniSort(商標) Human Hematopoietic Lineage Depletion Kit（Thermofisher Scientific、8804-6836-74）を用いることができる。
　マウス造血幹細胞の抽出は、例えば、文献（Ema H, et al. Nat Protoc.2006;1(6):2979-87、Gundry MC, et al. Cell Rep.2016;17:1453-61、Hetzel M, et al. Blood.2018;131(5):533-545）記載の方法を参考として行うことができる。具体的には、マウスの両側大腿骨と脛骨を採取し、6ml程度の2%ウシ胎児血清入りHBSS＋培地（富士フィルム和光純薬、082-09365）を入れた6cmディッシュへ回収する。両側骨端を切離し、切断断片に25Gの針を入れて、HBSS＋培地で押し出し、70μm nylonセルストレイナー（FALCON、352350）を通し細胞を回収する。遠心（1500rpm、5分、4℃）により上精を除去し、赤血球溶解培地（Takara Bio、786-649）1mLとRPMI-1640培地（富士フィルム和光純薬、189-02025）、10%ウシ胎児血清9mlを加え、さらに遠心（1500rpm、5分、4℃）を行うことで赤血球を除去する。HBSS＋培地により洗浄した細胞を、抗体を用いてlineage negative selectionを行う。抗体は、1.0×107細胞当たり、以下の抗体を2μlずつ投与する（Biotin anti-mouse Ter-119/Erythroid Antibody（BioLegend、79748）、Biotin anti-mouse CD11b Antibody（BioLegend、79749）、Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1) Antibody（BioLegend、79750）、Biotin anti-mouse NK-1.1 Antibody（BioLegend、108703）、Biotin anti-mouse CD45R/B220 Antibody（BioLegend、79752）、Biotin anti-mouse CD127(IL-7Rα) Antibody（BioLegend、135005）、Biotin anti-mouse CD3 Antibody（BioLegend、79751））。氷上で60分抗体反応し、洗浄後、1.0×107細胞当たり、500μlの0.5% ウシ胎児血清＋1% PBS溶液で懸濁し、50μlのDynabeads(商標) M-280 Streptavidin（Invitrogen、11205D）を追加する。さらに氷上で60分反応させ、磁気スタンドを用いて抗体の結合していない陰性細胞を回収する。HBSS＋培地にて洗浄を行い、1×106細胞当たり100μlの培養液で懸濁し、37℃、5％CO2下で培養（1時間から24時間）する。培養液は、StemSpan(商標) SFEM培地（STEM CELL Technologies、09600）を用いて、L-グルタミン（富士フィルム和光純薬、073-05391）、マウス幹細胞因子（富士フィルム和光純薬、196-15581）、トロンボポエチン（R＆D、488-TO-005）、インスリン様成長因子-2（コスモバイオ、100-14）、線維芽細胞成長因子（富士フィルム和光純薬、062-06041）をそれぞれ200mmol/L、100ng/ml、50μg/ml、100ng/ml、100ng/ml、1mMの最終濃度となる様に調整する。
　ヒト造血幹細胞の抽出は、例えば、文献（Bak RO, et al. Nat Protoc. 2018;13(2):358-376、Forraz N, et al. Stem Cells. 2004;22(1):100-108.）記載の方法を参考として行うことができる。具体的には、例えば、ヒト骨髄液を遠心（1500rpm、5分、4℃）により上精を除去し、赤血球溶解培地（Takara Bio、786-649）1mLとRPMI-1640培地（富士フィルム和光純薬、189-02025）、10%ウシ胎児血清9mlを加え、さらに遠心（1500rpm、5分、4℃）を行うことで赤血球を除去する。HBSS＋培地により洗浄した細胞を、抗体を用いてlineage negative selectionを行う。Lineage negative selectionは、MagniSort(商標) Human Hematopoietic Lineage Depletion Kit（Thermofisher Scientific、8804-6836-74）を用いる。HBSS＋培地にて洗浄を行い、1×106細胞当たり100μlの培養液で懸濁し、37℃、5％CO2下で培養する（1時間から24時間）。培養液は、StemSpan(商標) SFEM II培地（StemCell Technologies、9655）を用いて、IL-6（PeproTech、200-06）、StemRegenin1（CellagenTech、C7710）、UM171（StemCell Technologies、72914)、Flt3L（PeproTech、300-19）、トロンボポエチン（PeproTech、300-18）、ヒト幹細胞因子（PeproTech、300-07）をそれぞれ100ng/ml、0.75μM、35nM、100ng/ml、100ng/ml、100ng/mlの最終濃度となる様に調整する。
　特に、組織幹細胞は、患者から単離された組織幹細胞であることが好ましい。患者由来の組織幹細胞を用いることにより、本発明の方法により遺伝子の編集された組織幹細胞を患者の治療に用いる場合も、ドナーの有無や移植によるGVHDの問題を回避することができる。また、前処置が軽度であるため患者への負担が少ないという利点もある。
　本発明に係る方法は、選別した組織幹細胞を必要により増殖させる工程をさらに含んでもよい。
　組織幹細胞の培養・増殖には、細胞の未分化状態維持及び増殖のために当技術分野で知られている成分及び条件を用いることができる。例えば、基本培地（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸等を含む）としては、SFEM培地、SFEM II、D-MEM、MEM、RPMI 1640、BME、D-MEM／F-12、Glasgow MEM、ハンクス液、mTeSR1等が挙げられる。必要に応じて、培地に、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、白血球遊走阻止因子（LIF）、インターロイキン、インスリン様成長因子、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、B27-サプリメント、N2-サプリメント、ITS-サプリメント、抗生物質等を添加してもよい。また、培地には、血清又は血漿を添加してもよい。各成分は、患者への移植に適合するグレードのものを選択することが好ましい。
　一実施形態では、本発明に係る方法により選別し、必要により増殖させた遺伝子配列の編集された組織幹細胞を患者に移植することができる。特に、本発明によれば、患者から単離された組織幹細胞に遺伝子編集を施し極めて短時間で患者に移植することが可能となるため、様々な組織幹細胞、中でも肝細胞や骨格筋の内在性組織幹細胞（サテライト細胞）等の生体外で未分化な状態での維持が困難な細胞にも適用することができる。また、ストレスにより標的遺伝子発現量の増加が必要となる等、患者の状態変化に応答した迅速な治療が可能になり得る等の利点もある。
［治療剤］
　本発明の一態様は、疾患の治療に用いるための標的遺伝子の遺伝子配列が編集された組織幹細胞を含む治療剤または予防剤にも関する。
　本発明に係る治療・予防剤は、疾患の治療に有効な量の遺伝子配列の編集された組織幹細胞を含む。遺伝子配列の編集された組織幹細胞は特に、生体から単離後72時間以内、48時間以内、36時間以内、24時間、または18時間以内のものであり得る。治療効果を得るための組織幹細胞の量は、適切な治療応答を得るために、投与経路、投与形態、標的となる疾患、治療対象、治療標的部位等を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
　投与レジメンの非限定的な例としては、患者体重kgあたり1日用量1×105～2×106細胞を投与する。投与は、単回投与もしくは複数回投与であってもよく、または連続注入であってもよい。投与は、低用量から開始し、治療効果を考慮して標的用量まで漸増してもよい。また、当然ながら、治療対象の状態及び緊急性に応じて、上記の範囲外の量に変更してもよい。投与経路は、局所投与であっても全身投与であってもよく、例えば、静脈内、門脈内、筋肉内、腹腔内、標的組織内、皮下、若しくは皮内投与等の非経口送達が挙げられる。投与形態としては、注射剤、懸濁剤、点滴剤、医療用ハイドロゲル等の非経口剤形が挙げられる。
　本実施形態に係る治療剤は、遺伝子配列の編集された組織幹細胞に加えて、任意の追加成分を含んでもよい。非限定的な追加成分の例としては、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、そのほかの添加剤等、例えば、生理食塩水、等張液、緩衝剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤等が挙げられる。
　本実施形態に係る治療剤は、単独で用いてもよいし、標的疾患の治療に有効な他の薬剤と組み合わせて用いてもよい。
　本実施形態において、遺伝子配列の編集された組織幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、または肝幹細胞であり得る。
　また、別の観点からは、本発明の一態様は、処置を必要とする患者に対して、標的遺伝子の遺伝子配列が編集された組織幹細胞を投与することを含む、疾患の治療方法または予防方法に関する。さらに、本発明の一態様は、疾患の治療方法または予防方法に用いるための医薬の製造における、遺伝子配列が編集された組織幹細胞の使用に関する。これらの組織幹細胞の特徴は上に述べたとおりである。
［標的となり得る疾患群］
　本発明に係る方法を用いたゲノム編集技術は、組織幹細胞由来の細胞における標的遺伝子発現の調節が関与する疾患であれば、遺伝子疾患に限らず、幅広く適用することができる。本発明の方法は常染色体優性遺伝、常染色体劣性遺伝、X連鎖性劣性遺伝、X連鎖性優性遺伝を問わず、全ての遺伝形式に有効であり、特に、従来の遺伝子導入では治療効果が乏しい常染色体優性遺伝病への適用に適している。
　目的遺伝子の補充・付加を行う従来の遺伝子治療においては、異常遺伝子が残ること、正常遺伝子の組み込み部位が制御不能であること、導入遺伝子の発現調節が困難であること等の課題があり、適用し得る疾患も限られていた。しかし、本発明の方法は、異常遺伝子や特定遺伝子の機能消失、異常遺伝子の変異の修復、がん化を生じない安全な部位への遺伝子導入、遺伝子の発現調節等が可能となる。さらに標的遺伝子が正常に編集された細胞を患者の生体内で安定的に維持できるため、治療効果の長期的な維持が期待される。
　中でも、本発明の方法は、単一遺伝子疾患、特には欠失変異／フレームシフトや、それに準じる遺伝子変異に起因する疾患に特に有効であり得る。
　本発明に係る方法または治療剤の標的となり得る疾患としては、 
－　免疫不全症候群：例えば、ADA欠損症、X連鎖性重症複合免疫不全症（SCID）、その他のSCID、Wiskott-Aldrich症候群、慢性肉芽腫症、白血球粘着不全症、家族性血球貪食症候群、X連鎖性Hyper IgM症候群、X連鎖性リンパ増殖性疾患、X連鎖性無γグロブリン血症、Hyper-IgE症候群等
－　異常Hb症：例えば、鎌状赤血球症、β-サラセミア等
－　代謝疾患：例えば、ゴーシェ病、ムコ多糖症、X連鎖性副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、大理石骨病等
－　その他、ファンコニ貧血、Schwachman-Diamond症候群、Kostmann症候群
等が挙げられる（例えば、Richard A. Morgan et al., 2017, Cell Stem Cell, 21, 574-590を参照）。
　本発明に係る方法または治療剤の標的となり得る疾患及びその標的遺伝子の一例を下記表1に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　なかでも、本発明に係る方法は、極めて短期間で遺伝子編集のされた組織幹細胞を得ることができるため、長期間培養によって増殖能の高い細胞が濃縮された非生理的な細胞集団となる可能性や、分化が進むことによって定着性が低下する可能性、培養による細菌・ウイルス・マイコプラズマ増殖の可能性をそれぞれ減ずることで、より効率的かつ安全に変異導入細胞の組織定着率を上昇させることが期待される。これらの理由から、現在まで治療法が確立されていない血液疾患・免疫疾患、例えば、長期間生着が有用と考えられる慢性肉芽腫症やWiskott-Aldrich症候群、さらにはHyper-IgE症候群のようにドミナントネガティブによる発症をきたす疾患に適用することが好ましい。
　以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
例１：マウス造血幹細胞への遺伝子変異導入
　野生型マウス大腿骨より抽出したマウス造血幹細胞に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子部位への変異導入を行った。マウス造血幹細胞の採取は、文献（Ema H, et al. Nat Protoc.2006;1(6):2979-87、Gundry MC, et al. Cell Rep.2016;17:1453-61、Hetzel M, et al. Blood.2018;131(5):533-545）記載の方法を参考にして行った。具体的には、マウスの両側大腿骨と脛骨を採取し、6ml程度の2%ウシ胎児血清入りHBSS＋培地（富士フィルム和光純薬、082-09365）を入れた6cmディッシュへ回収した。両側骨端を切離し、切断断片に25Gの針を入れて、HBSS＋培地で押し出し、70μm nylonセルストレイナー（FALCON、352350）を通し細胞を回収した。遠心（1500rpm、5分、4℃）により上清を除去し、赤血球溶解培地（Takara Bio、786-649）1mLとRPMI-1640培地（富士フィルム和光純薬、189-02025）、10%ウシ胎児血清9mlを加え、さらに遠心（1500rpm、5分、4℃）を行うことで赤血球を除去した。HBSS＋培地により洗浄した細胞に対し、抗体を用いてlineage negative selectionを行った。抗体は、1.0×107細胞当たり、以下の抗体を2μlずつ投与した（Biotin anti-mouse Ter-119/Erythroid Antibody（BioLegend、79748）、Biotin anti-mouse CD11b Antibody（BioLegend、79749）、Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1) Antibody（BioLegend、79750）、Biotin anti-mouse NK-1.1 Antibody（BioLegend、108703）、Biotin anti-mouse CD45R/B220 Antibody（BioLegend、79752）、Biotin anti-mouse CD127(IL-7Rα) Antibody（BioLegend、135005）、Biotin anti-mouse CD3 Antibody（BioLegend、79751））。氷上で60分抗体を反応させ、洗浄後、1.0×107細胞当たり、500μlの0.5%ウシ胎児血清＋1% PBS溶液で懸濁し、50μlのDynabeads(商標) M-280 Streptavidin（Invitrogen、11205D）を追加した。さらに氷上で60分反応させ、磁気スタンドを用いて抗体の結合していない陰性細胞を回収した。
　標的遺伝子はIL2RGとし、sgRNA混合液、Cas9組換えタンパク質をエレクトロポレーションによって導入した。インターロイキン2受容体γ鎖（Il2rg）は、X連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）の原因遺伝子である。sgRNAは、Alt-RTM（IDT社）を用いて作成した。標的配列（aggattgatgttcaggcttc；配列番号１）を含むAlt-RTM crRNA（100μM、IDT社、カスタム合成品（https://sg.idtdna.com/jp/site/））、tracrRNA（100μM、IDT社、1072532）、Nuclease-free Duplex Buffer（IDT社、11-01-03-01）をそれぞれ3.58μl、3.58μl、7.84μlで混和し、95℃下で5分おき、室温で冷却した。Cas9組換えタンパク質には、SpCas9（IDT社、1074182）を10mg/mlに希釈して使用した。細胞培養とRNAおよびタンパク質の導入方法の詳細としては、sgRNAのRNA混合液（100μM）に、ヌクレアーゼ組換えタンパク質（10mg/mlでは3.69μl）を加え、室温で20分おいた。これに1.0×106細胞のマウス造血幹細胞と鋳型DNA（1mg/ml）を7.7μl混和し、OptiMEM培地（ThermoFisher Scientific、31985070）で希釈し、100μlとした。この細胞、RNA、タンパク質、オリゴDNA混合液に、Nepa21 pulse generator（Nepa Gene）を用いてエレクトロポレーションを行なった。送電は、2つの矩形電気パルス（225V、2ms幅、50ms間隔）、続いて5パルス（30V、50ms幅、50ms間隔）を行った。エレクトロポレーションを行なった混合液に2mlのHBSS＋培地を加え、800rpmで3分遠心し洗浄した。
　変異導入24時間後にゲノムDNAを抽出し（DNeasy Blood & Tissue Kit、Qiagen、69504）、標的部位を挟んだ500bp程度の長さのゲノムDNA配列についてPCR増幅を行なった（Quick Taq(登録商標) HS DyeMix、Toyobo、DTM-101）。Forwardプライマー（gagctatctgtctttaggcctggag；配列番号２）、Reverseプライマー（caacctggcctacatagtgagctc；配列番号３）を用いた。PCRの条件は、94℃ 2分の後、94℃ 30秒／60℃ 30秒／68℃ 30秒を30サイクル行なった。このPCR産物を精製し、NEBuffer2（New England BioLab、B7002）内で95℃ 5分処理して変性を行った。この後に室温にて緩徐にアニーリングを行うことで、変異導入部位が存在するところでDNAミスマッチが形成される。これを、ミスマッチを含むDNAのみを認識して切断するT7エンドヌクレアーゼI（T7EI）（New England BioLab、M0302S）で37℃ 15分処理することで、DNAミスマッチ切断を行った。図1はこのT7エンドヌクレアーゼIで処理したPCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動したものであり、標的部位でのDNAミスマッチの形成、即ち変異導入が得られたことを示している。図2は切断されたPCR産物のシークエンス結果を示す（FASMAC、Big Dye terminator v3.1、3130xl Genetic Analyzer）。シークエンス時のプライマーは塩基配列：gagctatctgtctttaggcctggag（配列番号４）を用いた。切断後のPCR産物（図2下）は切断前のPCR産物（図2上）と異なり、標的部位以降の配列が判読困難となっており、同部位で切断されていることを示している。
例２：標的遺伝子へのタグ配列の導入
　野生型マウス大腿骨より抽出したマウス造血幹細胞に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子部位へのタグ配列変異導入を行った。標的遺伝子はIL2RGとし、標的配列（aggattgatgttcaggcttc；配列番号５）を含むsgRNA混合液、Cas9組換えタンパク質、タグ配列を導入するための鋳型DNA（tgcatagcccttactggcctcccccatgttattctctgaagccggaagccgtgagcggctggcggctgttcaagaagattagctgaacatcaatcctttgatggaacctcaaagtcctatagtcctaagtgac；配列番号６）をエレクトロポレーションによって導入した。変異導入24時間後にゲノムDNAを抽出し（DNeasy Blood & Tissue Kit、Qiagen、69504）、タグ配列内にForwardプライマー（gtgagcggctggcggctgtt；配列番号７）を、300bp程度下流にReverseプライマー（caacctggcctacatagtgagctc；配列番号８）を設計し、PCR増幅を行なった（Quick Taq(登録商標) HS DyeMix、Toyobo、DTM-101）。PCRの条件は、94℃ 2分の後、94℃ 30秒／60℃ 30秒／68℃ 30秒を30サイクル行なった。図3はこのPCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動したものである。図4はこのPCR産物のシークエンス結果を示す。シークエンス時のプライマーは塩基配列：caacctggcctacatagtgagctc（配列番号９）を用いた。これらは標的部位にタグ配列が導入されたことを示している。
例３：ACTゲノム編集
　Activationにおいては、文献（Matsubara,Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014）記載の方法を参考に、TALエフェクターをTAL Effector Nucleotide Targeter 2.0（https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/single-tale）を参考にして、Golden Gate法によって哺乳類発現ベクター（pcDNA-TAL-VP-64（Addgene、47107））に導入し作成する。
　CorrectionとTaggingにおいては、Alt-RTM（IDT社）を用いてsgRNAを作成する場合、標的配列を含むAlt-RTM crRNA（100μM、IDT社、カスタム合成品（https://sg.idtdna.com/jp/site/））、tracrRNA（100μM、IDT社、1072532）、Nuclease-free Duplex Buffer（IDT社、11-01-03-01）をそれぞれ3.58μl、3.58μl、7.84μlで混和し、95℃下で5分おき、室温で冷却する。
　gRNA vector（Addgene No.41824）を用いたsgRNAの作成においては、インバースPCR法により標的配列を導入し、gRNA鋳型DNAを作成する。mMessage mMachine(商標) T7 UTRA Transcription Kit（Ambion, AM1345）にてRNAを合成し、MEGAclear(商標) Transcription Clean-Up Kit（Ambion, AM1908）を用いて精製し、100μMとする。組換えタンパク質としてヌクレアーゼを用いる場合、SpCas9（IDT社、1074182）、cpf1（IDT社、1081069）を10mg/mlに希釈し、使用する。
　RNAとしてヌクレアーゼを用いる場合、文献（Nishimasu H, et al. Science. 2018;361:1259-1262. Esvelt KM, et al. Nat Methods. 2013;10(11):1116-1121.）記載の方法を参考として、ベクター上のSpCas9、SpCas-9-NG、dCas9、M-NMn-VP64（Addgene #80425、#41816、#48676）を鋳型DNAとしてmMessage mMachine(商標) T7 UTRA Transcription Kit（Ambion, AM1345）にてRNAを合成し、エタノール沈殿法により精製する。
　次に、以上の、Activation、Correction、TaggingのRNAおよび組換えタンパク質のツールをエレクトロポレーションによって同時に細胞に導入することで、標的遺伝子の編集修復が行われた細胞を選別する。即ち、Correctionとして標的遺伝子の標的変異部位を標的としたsgRNAとSpCas9、及び鋳型DNAを用いて変異導入を行う。さらに、Taggingとしてタンパク質翻訳領域のC末端側を標的としたsgRNAとSpCas9あるいはSpCas9-NG及び鋳型DNAを用いて標識配列の導入を行なう。これらがうまく作動した場合に限り、標的遺伝子のプロモーター領域を標的としたsgRNAによりM-NMn-VP64あるいはTALエフェクターによって誘導された、標的遺伝子の活性化により標的遺伝子の変異部位が的確に編集され、タンパク質として産生できるようになった細胞が、標識配列のシグナルに基づき選別される。標識配列として、前述のHiBit配列、HA配列、GFP配列、またはVenus配列等を用いる。Venus配列は、文献（Matsubara,Y, et al. Sci Rep, 4 : 5043, 2014）記載の方法を参考とし、pVenus vectorに標的遺伝子の相同遺伝子を導入することで作成し、鋳型DNAとして使用する。
　細胞培養とRNAおよびタンパク質の導入方法の詳細として、sgRNAのRNA混合液（100μM）に、ヌクレアーゼ（組換えタンパク質10mg/mlでは3.69μl、RNAでは250ng/μlで2μl）を加え、室温で20分おく。これに1.0×106細胞の組織幹細胞と鋳型DNA（1mg/ml）を7.7μl混和し、OptiMEM培地（ThermoFisher Scientific、31985070）で希釈し、100μlとする。この細胞、RNA、タンパク質、オリゴDNA混合液に、Nepa21 pulse generator（Nepa Gene）を用いてエレクトロポレーションを行なう。送電は、2つの矩形電気パルス（225V、2ms幅、50ms間隔）、続いて5パルス（30V、50ms幅、50ms間隔）を行う。エレクトロポレーションを行なった混合液に2mlのHBSS＋培地を加え、800rpm 3分で遠心し洗浄する。この細胞を組織幹細胞採取の際に用いた培地を用いて24時間培養する。更に、GFPシグナルなどの一細胞レベルでの検出によって、遺伝子編集が的確に行われた細胞を選別する。
例４：ヒト胎児腎癌細胞への目的遺伝子変異導入（Correction）とタグ標識挿入（Tagging）
　ヒト胎児腎癌細胞株（293FTcell細胞（ThermofisherScientific））に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子部位への目的とする変異の導入とタグ配列としてHiBIT（Flag付加）配列の導入を行った。標的遺伝子はRBP（TruB1）とし、標的配列（CTGCGCTGTCTAGAGTCCCT；配列番号１０、CAAAAGTATGGCCGCTTCTG：配列番号１１）を含むsgRNA混合液と、Cas9組換えタンパク質、タグ配列を導入するための鋳型DNA（GACCAAGAGGAAAAAGCAGACTTTGAAAATTGGGCATGGAGGGACTCTAGTGAGCGCAGCCCGAGGAGTTCTGGTTGTTGGAATTGGAAGCGGAACAAAAA；配列番号１２、CAGCGTGCACCTCCACGATGAAACAGGTCTGGGCTACAAAAGTATGGCCGCTTCTGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCCGCTTCTGAGGCGGCGGTGGTGTCTTCGCCGTCTTTGAAAACAG；配列番号１３）をエレクトロポレーションによって導入した。
　変異導入後、Nano-Glo（登録商標） HiBiT Lytic Detection System（Promega N3030）を用いてNano-Gloの発光を検出し、陽性となった細胞のみ培養を継続することで濃縮を行なった。これらの代表的な細胞からタンパク質を抽出（RIPA buffer、Nacalaitesk 16488-34）し、Flag抗体（MBL, FLA-1）を用いてウェスタンブロットを行なった。図5はFlag抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。一部の細胞においてよくタグ配列が挿入され、ペプチドタグとして機能していることを示す。
　この細胞からクローニングを行い、ゲノムDNAを抽出し（DNeasy Blood & Tissue Kit、Qiagen、69504）、変異導入部位上流200bp程度上流にForwardプライマー（GTTTTGAAAATGCCATCCCC；配列番号１４）を、300bp程度下流にReverseプライマー（AGAAATAGCTACTTTTATGT；配列番号１５）を設計し、PCR増幅を行なった（Quick Taq(登録商標) HS DyeMix、Toyobo、DTM-101）。PCRの条件は、94℃ 2分の後、94℃ 30秒／60℃ 30秒／68℃ 30秒を30サイクル行なった。図6はそのうちの一つのPCR産物のシークエンス結果を示す（FASMAC、Big Dye terminator v3.1、3130xl Genetic Analyzer）。シークエンス時のプライマーはForwardプライマー（配列番号１４）を用いた。標的部位において目的の配列へ変異が導入されていることを示す。
例５：ヒト胎児腎癌細胞への目的遺伝子変異導入（Correction）とタグ標識挿入（Tagging）
　ヒト胎児腎癌細胞株（293FTcell細胞（ThermofisherScientific））に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子部位への目的とする変異の導入(exon2の除去)とタグ配列としてHiBIT配列の導入し、直後に終止コドンの導入を行った。標的遺伝子はRBP（TruB1）とし、標的配列（TCCCCTTTTCCTCCCAAGTT；配列番号１６、TTTCTCTCATAGAAGCTGGA：配列番号１７）の相補鎖を含むsgRNA混合液と、Cas9組換えタンパク質、タグ配列を導入するための鋳型DNA（CTAGTAATGAGGTCATAGTCTCTTAACATGTAAAGTTTGTATAATACTTTGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTTAATAGAAGCTGGAATGCCTTCTCCAGAATGGACCAAGAGGAAAAAGCAGAC；配列番号１８）をエレクトロポレーションによって導入した。
　変異導入後、Nano-Glo（登録商標） HiBiT Lytic Detection System（Promega N3030）を用いてNano-Gloの発光検出を行なった。図７はLytic Detectionの結果を示す。ノックインした細胞においてLuciferase活性が上昇していることを示している。
例６：ヒト胎児腎癌細胞への目的遺伝子変異導入（Correction）とタグ標識挿入（Tagging）と活性化（Activation）
　ヒト胎児腎癌細胞株（293FTcell細胞（ThermofisherScientific））に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子部位への目的とする変異の導入とタグ配列としてHiBIT配列の導入し、その後に活性化を行なった。標的遺伝子はSTAT3とし、はじめに変異型STAT3の細胞株を樹立した。この際、標的配列（GTTGTGGTGATCTCCAACAT；配列番号１９）の相補鎖を含むsgRNA混合液と、Cas9組換えタンパク質、変異を導入するための鋳型DNA（CCCAGCTCAGTCCCCACTCCCTCCGCAGACCCACTCCTTGCCAGTTGTGTAGATCTCCAACATCTGTCAGATGCCAAATGCCTGGGCGTCCATCCTGTGGTA；配列番号２０）をエレクトロポレーションによって導入した。
　変異導入後、限界希釈法によって変異導入された細胞をクローニングした。クローニングした変異導入細胞のゲノムDNAを抽出し、シークエンスによって変異導入を確認した。図８はこの際のシークエンス結果である。この際のPCRにおいては、Forwardプライマー（GCAGCAGGTGTGGTTTATGG；配列番号２１）、Reverseプライマー（ACCATCCCTCATCTAAACAA；配列番号２２）を用い、PCRの条件は、94℃ 2分の後、94℃ 30秒／60℃ 30秒／68℃ 30秒を30サイクル行なった。Forwardプライマーを用いてシークエンスを行なった。
　ここで得られた変異細胞に対して、変異を元に戻すためのsgRNA（配列番号１９と同様）とタグ配列付加のためのsgRNA（標的配列としてTGCGCTACCTCCCCCATGTG；配列番号２３を含む）と、Cas9組換えタンパク質、変異を戻すための鋳型DNA（CCCAGCTCAGTCCCCACTCCCTCCGCAGACCCACTCCTTGCCAGTTGTGGTGATCTCCAACATCTGTCAGATGCCAAATGCCTGGGCGTCCATCCTGTGG；配列番号２４）とタグ配列を導入するための鋳型DNA（CCCTCACCTTTGACATGGAGTTGACCTCGGAGTGCGCTACCTCCCCCATGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTGAGGAGCTGAGAACGGAAGCTGCAGAAAGATACGACTGAGGCGCCTACC；配列番号２５）をエレクトロポレーションによって導入した。変異導入後、STAT3遺伝子の活性化を行なった。STAT3遺伝子の転写開始因子より上流1000bp、500bp、200bpの部位をそれぞれ標的とするsgRNA（それぞれUUGUUGAGUAGGAGAAUCUC；配列番号２６、UUUAAAAAAUGAGUGUGGCA；配列番号２７、UCAAGGCCACCCUGGGCAAC；配列番号２８）とdCas9-VP64 vector（addgene, #47107）から得られたmRNAをFugene HD Transfection reagent（プロメガ, E2311）を用いて導入し、24時間後にNano-Glo（登録商標） HiBiT Lytic Detection System（Promega N3030）を用いてNano-Gloの発光検出を行なった。mRNAは、dCas9-VP64 vectorを鋳型とし、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra(Invitrogen, AM1345)を用いてRNAを合成し、MEGA Clear Transcription clean kit(Invitrogen, AM1908)を用いて精製した。図９はLytic Detectionの結果を示す。活性化によってHiBITのLuciferase活性が上昇しており、変異導入がなされ、遺伝子の活性化によってその変化が強調されていることを示す。
　さらに、この細胞をForwardプライマー（GCAGCAGGTGTGGTTTATGG；配列番号２１）、Reverseプライマー（ACCATCCCTCATCTAAACAA；配列番号２２）を用いてPCR法を行い、その産物を、Forwardプライマーを用いてシークエンスすることで、変異を戻す効率を調べた。図１０はこの際のシークエンス結果である。目的配列に波形の重なりがあり、変異を戻した細胞が含まれていることを示す。
例７：マウス造血幹細胞の遺伝子変異修復とのタグ配列の導入
　Prkdc遺伝子変異を有するC.B-17/Icr-SCIDマウス（日本クレア）の大腿骨より抽出したSCIDマウス造血幹細胞に対して、CRISPR/Cas9系を用いて標的遺伝子変異の修復と、標的遺伝子へのタグ配列導入を行った。標的遺伝子はPrkdcとし、変異を修復するめのsgRNA（gcuuagcguauuuuauguug；配列番号２９を含む）とタグ配列付加のためのsgRNA（acaccacagacuuuacaucc；配列番号３０を含む）と、Cas9組換えタンパク質、変異を修復するための鋳型DNA（gatcatggattcaagaaataaatgtaacggaaaagaattggtatccacaacataaaatacgctatgctaagagaaagttagcaggggccaacccagctgt；配列番号３１）とタグ配列を導入するための鋳型DNA（cagaccccaatatccttggcaggacttgggaaggatgggagccctggatgCGGGACCACATGGTGCTGCACGAGTACGTGAACGCCGCCGGCATCACATAAtaaagtctgtggtgtcaccaatcataaagcattctgtctccgagaggacc；配列番号３２）をエレクトロポレーションによって導入した。タグ配列として、GFP-11を用いた。
　変異導入48時間後にゲノムDNAを抽出し（DNeasy Blood & Tissue Kit、Qiagen、69504）、Forwardプライマー（CAAACTTTGAATTCACAGTCATGAGTGAC；配列番号３３）、Reverseプライマー（GAGGTCCTCTCGGAGACAGAATG；配列番号３４）を用いてPCR増幅を行なった（Quick Taq(登録商標) HS DyeMix、Toyobo、DTM-101）。PCRの条件は、94℃ 2分の後、94℃ 30秒／60℃ 30秒／68℃ 30秒を30サイクル行なった。図１１はこのPCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動したものである。図１２はこのPCR産物のシークエンス結果を示す。シークエンス時のプライマーはForwardプライマー（配列番号３３）を用いた。これらは標的部位に目的のタグ配列の重なりを認めており、約50%程度の効率でタグ配列が導入されたことを示している。
　さらに、変異導入後48時間後の細胞に対して、アデノ随伴ウイルスを用いてGFP1-10を導入し、24時間後に細胞の観察を行った。アデノ随伴ウイルスの作成及び導入は、AAVpro（商標登録） Helper Free System (Takara, 6673)を用いてpAAV-CMV(Takara, 6673)へGFP1-10（配列番号３５）を導入して使用した。図１３はこの細胞の蛍光を示す。細胞内にGFP-11が導入され、AAV由来のGFP1-10と結合することでGFPの蛍光を得た細胞が存在することを示す。
　本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
　本発明は、今まで治療法が十分なかった血液、免疫疾患などの根本的治療法を早期に可能にするものである。

Claims (23)

  1. 　遺伝子編集のされた組織幹細胞の製造方法であって、
    　　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、および
    　　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程
    を含む、方法。
  2. 　標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、および／または
    　組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程
    をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 　組織幹細胞が患者から単離された組織幹細胞である、請求項1または2記載の方法。
  4. 　遺伝子配列の編集がex vivoで行われる、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 　遺伝子配列の編集がCRISPR/Cas系またはTALEN系を用いて行われる、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 　標的遺伝子が組織幹細胞中では定常発現しない遺伝子である、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 　遺伝子発現の活性化がCRISPRa系またはTALENエフェクター系を用いて行われる、請求項2～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を遺伝子配列に付加したタグを利用して選別する、請求項2～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程と、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程とが同時に行われる、請求項2～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を該細胞を患者から単離してから24時間以内に選別する、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  11. 　選別した組織幹細胞が未分化状態を維持している、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 　選別した組織幹細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 　選別した組織幹細胞を患者に移植する工程をさらに含む、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 　遺伝子配列の編集された組織幹細胞が疾患の治療に用いるための細胞である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. 　疾患が血液疾患または免疫疾患である、請求項14記載の方法。
  16. 　血液疾患または免疫疾患が、ADA欠損症、X連鎖性重症複合免疫不全症（SCID）、その他のSCID、Wiskott-Aldrich症候群、慢性肉芽腫症、白血球粘着不全症、家族性血球貪食症候群、X連鎖性 Hyper IgM症候群、X連鎖性リンパ増殖性疾患、X連鎖性無γグロブリン血症、Hyper-IgE症候群、鎌状赤血球症、およびβ-サラセミアからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
  17. 　標的遺伝子が、ADA、IL2RG、WAS、CYBB、INTGB2、UNC13D、CD40L、SAP/SH2D1A、BTK、STAT3、およびヘモグロビンからなる群より選択される、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 　標的遺伝子の遺伝子配列が編集された、生体から単離後48時間以内の造血幹細胞を含む、血液疾患または免疫疾患の治療剤。
  19. 　血液疾患または免疫疾患が、ADA欠損症、X連鎖性重症複合免疫不全症（SCID）、その他のSCID、Wiskott-Aldrich症候群、慢性肉芽腫症、白血球粘着不全症、家族性血球貪食症候群、X連鎖性 Hyper IgM症候群、X連鎖性リンパ増殖性疾患、X連鎖性無γグロブリン血症、Hyper-IgE症候群、鎌状赤血球症、およびβ-サラセミアからなる群より選択される、請求項18記載の治療剤。
  20. 　標的遺伝子が、ADA、IL2RG、WAS、CYBB、INTGB2、UNC13D、CD40L、SAP/SH2D1A、BTK、STAT3、およびヘモグロビンからなる群より選択される、請求項18または19記載の治療剤。
  21. 　遺伝子編集のされた組織幹細胞の製造方法であって、
    　　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程、
    　　標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程、
    　　組織幹細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程、および
    　　遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する工程
    を含み、
    　　組織幹細胞中の標的遺伝子の遺伝子配列を編集する工程と、標的遺伝子の遺伝子配列にタグを付加する工程とが、CRISPR/Cas系またはTALEN系を用いて同時に行われる、方法。
  22. 　標的遺伝子が組織幹細胞中では定常発現しない遺伝子であり、
    　標的遺伝子の遺伝子配列の編集とタグの付加が行われた細胞においてのみ、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する工程によってタグで標識された目的タンパク質が産生し、該タグを用いて遺伝子配列の編集された組織幹細胞を選別する、請求項２１に記載の方法。
  23. 　組織細胞が患者から単離された組織幹細胞であり、遺伝子配列の編集された組織幹細胞を該細胞を患者から単離してから48時間以内に選別する、請求項２１または２２に記載の方法。
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